KR20090120453A - 산화질소-차단된 가교 사량체 헤모글로빈 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카르복사미도메틸화된 가교 헤모글로빈으로서, 이 헤모글로빈의 시스테인 부분이 티올 보호기를 포함하고 그 헤모글로빈이 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖는 카르복사미도메틸화된 가교 헤모글로빈을 함유하는 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 헤모글로빈은 탈산소화, 무내독소 및 무기질이다. 본 발명은 또한 제조 방법, 제조 공정, 및 포유동물의 혈액 용적을 보충하는 것 및 포유동물의 장애를 치료하는 것(여기에서, 산소 전달제가 유익함)을 비롯한 이용 방법을 포함한다.

헤모글로빈, 사량체, 사량체 헤모글로빈, 가교 사량체 헤모글로빈

Description

산화질소-차단된 가교 사량체 헤모글로빈{NITRIC OXIDE-BLOCKED CROSS-LINKED TETRAMERIC HEMOGLOBIN}

본 발명은 산화질소-차단된 가교 사량체 헤모글로빈, 보다 구체적으로는 산화질소(NO)와의 낮은 반응성을 가지며 그리고 생체내 용도에 있어 그 사량체를 안정화하기 위해 가교되어 있는 카르복사미도메틸화된 가교 사량체 헤모글로빈에 관한 것이다. 제조 방법, 및 혈액 용적 증량제(blood volume expansion) 및 산소 전달 치료제(oxygen delivery therapy)로서의 용도도 또한 개시된다.

긴급 상황에서의 혈액 사용에 대한 한계점들 중 하나는, 수혈 반응의 위험을 최소화하기 위해 혈액을 혈액형 검사하고 교차적합 시험을 해야만 한다는 요건이다. 혈액형 검사 및 교차적합 시험은 적어도 10분을 필요로 할 수 있고, 완전한 혈액형 검사 및 교차적합 시험은 1시간까지 소요할 수 있다. 또한, HIV 전파 위험은 혈액의 500,000 단위 중 1인 것으로 평가되었고, 간염 C 전파의 위험은 3,000 단위 중 1인 것으로 평가되었다. 혈액 공급의 안정성 및 혈액 로지스틱스(logistics)는, 감염성 질병 전파의 위험 및 구식형 공급의 위험이 비교적 더 높은 개발도상국에서의 중요 관건이다. 혈액 중 25%까지가 감염성 질병의 존재로 인해 개발도상국에서 폐기된다. 그러므로, 질병 전파를 막고, 생존 가능성을 향상시키기 위한 급속 반응 을 제공하는 혈액 대용물 또는 인공 혈액 조성물을 모색하는 중대 인자들이 있다.

임상적 상황에서의 인공 혈액 사용의 두 측면은 용적 증량제 및 산소 치료제이다. 용적 증량제 제제는 단지 혈액 용적을 증가시키는 불활성이고, 단지 혈액 용적을 증가시키며, 이에 따라 심장이 체액을 효율적으로 펌핑하도록 해준다. 산소 치료제는 인간 혈액의 산소 수송 능력을 모방한다. 산소 치료제는 수송 기작에 기초하여 두 범주: 산소의 단순 용해에 의해 작용하는 퍼플루오로카본 기제의 기작, 및 촉진된 포획 및 방출에 의해 산소를 수송하는 헤모글로빈 단백질 기제의 기작으로 분류될 수 있다. 헤모글로빈-기제의 생성물에서, 적혈 세포(RBC)로부터 분리된 순수 헤모글로빈(Hb)은 불안정성, 신장 독성의 유도, 및 적혈 세포로부터 분리될 때의 부적당한 산소 수송 및 전달 특성을 비롯한 다수의 이유들로 인해 유용하지 않을 수 있다.

헤모글로빈 기제의 산소 치료제는 동물 및 인간 연구 모두에서 다양한 정도의 혈관활성 효과를 발휘하는 것으로 나타났다(Winslow et al., Adv Drug Del Rev 2000, 40:131-42; Stowell et al., Transfusion 2001; 41:287-99; Spahn et al., News Physiol Sci 2001; 16:38-41; Spahn et al., Anesth Analg 1994; 78:1000-21; Kasper et al., Anesth Analg 1996; 83:921-7; [Kasper et al., Anesth Analg 1998; 87:284-91; Levy et al., J Thorac Cardiovasc Surg 2002; 124:35-42). 이 혈관활성은 세포내 NO에 결합할 때의 상기 생성물의 효과(Kasper et al., Anesth Analg 1996; 83:921-7; Dietz et al., Anesth Analg 1997; 85:265-273; Schechter et al., N Engl J Med 2003; 348:1483-5), 내피 방출(Gulati et al., Crit Care Med 1996; 24:137-47) 또는 말초 α-아드레날린성 수용체의 감작화(Gulati et al., J Lab Clin Med 1994; 124:125-33)으로 인한 것일 수 있다. 대안적으로, 증가된 혈관수축 효과는 RBC보다 높은 농도의 상기 생성물의 투여에 대해 2차적인, 산소 방출 속도의 증가로 인한 것일 수 있고, 이는 결과로적으로 혈관수축을 초래한다(Winslow et al., J Intern Med 2003; 253:508-17; McCarthy et al., Biophys Chem 2001; 92:103-17]; Intaglietta et al., Cardiovasc Res 1996; 32:632-43; Vandegriff et al., Transfusion 2003; 43:509-16).

혈압 증가를 유도하는 무기질(stroma-free) Hb 용액의 능력은 공지되어 있다. 일부 가교(crosslinked) Hb 용액이 투여 15 분 내에 용량 의존성 방식으로 25 내지 30%만큼 평균 동맥압을 증가시킬 수 있다는 점과, 그 효과가 5시간만큼 지속될 수 있다는 점이 입증되었다. 혈관수축은 헤모글로빈 기제의 요법제에 의한 NO 소거(scavenging)으로 인한 것일 수 있다(Katsuyama et al., Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 1994; 22:1-7; Schultz et al., J Lab Clin Med 1993; 122:301-308; 이들은 전체 내용이 본원에 참조 인용됨). 혈관수축은 또한 인지질 및 내독소에 의한 헤모글로빈의 오염에 의해 유발될 수 있다. Hb 정제 중의 잔존 인지질 및 내독소 오염이 혈행동태(hemodynamic) 효과를 유발할 수 있긴 하지만(Macdonald et al., Biomater Artif Cells Artif Organs 1990; 18:263-282), 이러한 오염이 상기 생성물 중 일부의 강한 혈관활성 효과를 설명하는 주요 인자일 가망성이 훨씬 더 낮다(Gulati et al., Life Sci 1995; 56:1433-1442).

NO는 구아닐레이트 사이클라제의 활성화 및 cGMP의 생성을 통해, 또는 칼슘 의존성 칼륨 통로의 직접적 활성화를 통해 작용하는 평활근 이완제이다. 유리 Hb의 증가는 NO 결합의 증가를 초래할 수 있다. NO 결합의 증가는 혈관활성 물질에 반응하거나 또는 혈관활성 조절 물질의 결여에 반응하는 혈행동태 변화에 따라 일시적 투약 및 반독 투약을 초래할 수 있다. 일부 환경에서, 산화질소의 결여는 혈압 증가, 및 장기간인 경우 고혈압을 초래할 수 있다. NO는 Hb의 반응성 설프히드릴에 결합할 수 있고, 헴 기에 의한 산소의 수송과 유사한 방식으로 조직으로 수송되거나, 그 조직으로부터 수송될 수 있는 것으로 입증되었다(Jia et al., Nature 1996; 80:221-226).

전모세관 괄약근 이동에 따른 산화질소는 임의의 조직의 세동맥 관류의 조절자이다. 산화질소는 동맥벽 내의 내피에 의해 합성 및 방출되고, 거기에서 그것은 적혈 세포 내 헤모글로빈에 의해 결합될 수 있다. 조직이 높은 산소 수준을 수용하는 경우, 산화질소는 방출되지 않고, 동맥 벽 근육은 수축되어, 혈관 직경을 보다 작게 만들며, 이에 따라 관류 속도를 감소시키고, 또한 심박출량의 변화를 유발한다. 산소 요구량이 증가하는 경우, 내피는 산화질소를 방출하는데, 이는 혈관확장을 유발한다. 동맥 관류의 산화질소 조절은 내피로부터의 방출 후, NO이 확산하는 거리에 걸쳐 작용한다. 산화질소는 또한 특정 염증성 반응을 매개하는데도 필요하다. 예를 들어, 내피에 의해 생성된 산화질소는 혈소판 응집을 억제한다. 궁극적으로, 산화질소가 세포 유리 헤모글로빈에 의해 결합됨에 따라, 혈소판 응집이 증가될 수 있다. 혈소판이 응집함에 따라, 이는 트롬복산 A₂ 및 세로토닌과 같은 강력한 혈관수축 화합물을 방출한다. 이 화합물은 헤모글로빈 소거에 의해 유발되는 감소된 산화질소 수준과 상승효과적으로 작용하여, 유의적 혈관수축을 초래할 수 있다. 산화질소는, 혈소판 응집을 억제하는 것 이외에도, 세포 벽의 호중구 부착을 억제하고, 이는 다시 세포벽 손상을 초래할 수 있다. 산화질소가 적혈 세포 내 헤모글로빈에 결합하기 때문에, 산화질소는 유리 Hb(무기질의 가교 사량체성 Hb)에도 결합할 수 있을 것으로 예상된다.

수 많은 제제에서, 유리 Hb 및 안정화된 헤모글로빈 주입은 혈관의 혈관수축과 연관이 있는 것으로 보이고, 이는 극히 높은 혈압을 초래하게 된다. 그 생산물의 헤모글로빈 부분은 혈관 벽의 내피 안층으로 확산되어, 혈관 벽의 정상적 톤을 유지하는데 필요한 NO에 결합하여 그것을 제거하는 싱크(sink)로서 작용할 수 있다. 이는 혈관 벽의 평활근 세포의 혈관수축을 초래할 수 있다. 유리 Hb 용액은 주위 조직으로 샐 수 있다. 또한, 상이한 분자 크기 헤모글로빈-기제의 치료제의 투여에 후속적으로 일어나는 혈관수축의 정도는 사용된 생성물의 분자 크기와 역관계를 가지는데, 즉 보다 큰 산소 담체를 주입하면 보다 적은 혈관수축 및 고혈압을 초래하게 된다(Sakai, et al. Am J Physiol 2000; 279:H908-15). 보다 작은 크기의 Hb 분자가 투과성이 가장 클 수 있고, 보다 높은 수준의 혈관수축 및 고혈압을 나타낼 수 있다(Faivre-Fiorina et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 1999; 276:H766-70). 토끼 모델에서, 귀 정맥을 통한 유리 Hb의 수혈은 뇌 혈관 허혈 및 사망을 유발하였다. 그러므로, 투여 중에 동맥계에 대한 대부분의 유리 Hb의 투여 영향을 최소화하는 것이 중요하다. 유리 Hb 주입 전에, 베라파밀, 아테노카드, 실 데나필 시트레이트 등과 같은 혈관활성제가 환자에게 투여될 수 있다. 이는 동맥계가 주입 중에 최소로 변화되도록 확실하게 하기 위한 것이다. 산화질소 및 베라파밀은 바람직한 혈관활성 제제이다. 저속 통로 칼슘 차단제 (또는 시클릭 구아노신 일인산염(cGMP)-특이적 포스포디에스테라제 유형 5(PDE5)의 선택적 억제제, 예컨대 실데나필 시트르산염)는 또한 심한 혈관수축의 방지에 도움을 줄 수 있다. 그러나, 보다 느린 주입 속도는 용적에 대한 요구가 급박하고 중대할 때, 외상 환자에게 대해 가능하지 않을 수 있다.

헤모글로빈 기제의 치료제의 NO 소거 성질을 변형하는 한 기작은 상기 분자 상의 NO 결합 부위를 차단하는 것이다. 헤모글로빈의 시스테인 부분 상의 비보호 티올이 NO와 결합할 수 있다. 헤모글로빈 분자 내 티올 또는 설프히드릴 기의 보호는 티올 부위에서 헤모글로빈에 대한 NO 결합을 방지하고, 이에 따라 고혈압 반응을 유발하는 혈관의 급성 혈관활성 반응을 방지할 수 있다. 헤모글로빈 기제의 치료제에 대한 NO 결합의 방지는 또한 이 부류의 치료제가 투여될 때 정상적 혈소판 응집 및 호중구 이동을 간섭하는 것을 방지할 수 있다.

그러므로, 헤모글로빈 기제의 산소 전달 치료제의 바람직한 특성 중 일부는, 무독성, 유해 면역원성 반응의 유도 결여, 만족스러운 산소 운반 및 전달 용량, 조직의 유효한 산소화를 허용하는 적당한 순환 지속성, 긴 반감기, 실온에서의 저장 용량, 질병 전파를 방지하기 위한 바이러스 또는 기타 병원체의 부재, 혈액형 검사를 해야 하는 요건의 제거, 및 이료 보조사, 전선 군인 위생병 등과 같은 제1 대응자에 의한 배치 용량이다. 이들 특성은 실혈에 대한 급속한 안전 반응, 및 조직 대 사 필요량에 대한 즉각적인 지원을 제공함으로써, 생존 가능성을 향상시키게 된다.

본원에 개시된 본 발명은 산화질소(NO)와의 낮은 반응성을 갖는, 탈산소화, 무내독소(endotoxin free), 무기질(stroma free)의 티올-차단(thiol blocked)된 가교(crosslinked) 사량체 헤모글로빈을 제조하기 위한 조성물, 특성 및 방법을 제공하고, 여기서 상기 사량체 구조는 가교에 의해 안정화된다. 특히, 카르복사미도메틸화된 가교 사량체 헤모글로빈은 안정한 NO-차단된 사량체 Hb로서 제공되고, 또한 그것의 제조 방법도 제공된다. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb를 제조하기 위한 공정 및 방법이 개시되고, 또한 혈액 용적 증량제 및 산소 전달 치료제로서의 사용 방법도 개시된다.

발명의 개요

본 발명은 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤 범위의 분자량 분포를 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성(proteinaceous) 철 함유 화합물에 관한 것이며, 여기서 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위(들)에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송한다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 시스테인 부위(들)에서 산화질소에 결합할 수 없다.

본 발명의 또 다른 측면은 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤 범위의 분자량 분포를 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위(들)에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤 범위의 분자량 분포를 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위(들)에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함하고, 상기 화합물은 가교 사량체 헤모글로빈이다.

본 발명의 또 다른 측면은 사량체 헤모글로빈으로서, 헤모글로빈은 헤모글로빈의 시스테인 기에 부착된 티올 보호기를 갖는 것인 사량체 헤모글로빈을 제조하는 공정에 관한 것으로, 상기 공정은 (a) 적혈 세포를 함유하는 조제물로부터 내독소 및 기타 지다당을 제거하는 단계; (b) 적혈 세포를 용해시키는 단계; (c) 용해된 적혈 세포로부터 기질을 제거함으로써 헤모글로빈을 분리하는 단계; (d) 임의적으로, 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 단계; (e) 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 단계, 및 (f) 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 상기 공정은 (a) 임의적으로, 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 단계; 및 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 가교하여, 가교되어 있는 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서는, 사량체 헤모글로빈으로서, 헤모글로빈 내의 시스테인에는 티올 보호기가 부착되어 있는 것인 사량체 헤모글로빈을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 적혈 세포를 함유하는 조제물로부터 내독소를 제거하는 단계; (b) 상기 적혈 세포를 용해시키는 단계; (c) 상기 용해된 적혈 세포로부터 기질을 제거함으로써 헤모글로빈을 분리하는 단계; (d) 임의적으로, 상기 헤모글로빈을 탈산소화하는 단계; (e) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 단계; 및 (f) 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 이루어진다.

본 발명의 또 다른 측면에서는, 가교 사량체 헤모글로빈을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 임의적으로 사량체 헤모글로빈을 제조하는 제조 방법의 생성물로부터 산소를 제거하는 단계; 및 상기 생성물을 가교하는 단계를 포함하는 공정에 의해 이루어진다.

본 발명의 또 다른 측면은 NO-차단된 사량체 헤모글로빈으로서, 헤모글로빈 내의 시스테인에는 티올 보호기가 부착되어 있는 것인 N0-차단된 사량체 헤모글로빈을 제조하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (a) 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 단계; 및 (b) 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 추가 가교된다.

본 발명의 또 다른 측면은 포유동물의 혈액 용적을 보충하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물로서, 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위(들)에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함하는 것인 단백질성 철 함유 화합물 및 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 그 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 가교된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는, 장애를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물로서, 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위(들)에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함하는 것인 단백질성 철 함유 화합물을 포함하는 조성물을 그 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 가교된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는, 기관을 관류시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 생체내 또는 생체외 추가 수행될 수 있는 것으로, 유효량의 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 네이티브, 세포 유리 헤모글로빈에 대한 산소 오프로딩(offloading) 용량을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 산소 전달 능력을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 가교 사량체 헤모글로빈은 실질적으로 산화질소에 대한 그 결합 능력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 가교 사량체 헤모글로빈은 산화질소에 결합할 수 없다. 일부 바람직한 실시양태에서, 가교 사량체 헤모글로빈은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm의 Hg 내의 p50으로 산소를 수송한다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm의 Hg의 p50으로 산소를 수송한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 티올-보호된 헤모글로빈이다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 가교 사량체 헤모글로빈이다. 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것이다. 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의해 변형되었다. 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 포유동물의 것이다. 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 인간 헤모글로빈이다. 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 소(즉, 소(bovine)(속 보스(bos)) 또는 바이손(bison)(속 바이손(Bison)) 또는 돼지 헤모글로빈이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 헤모글로빈은 비발열(non-pyrogenic), 무내독소, 무산소(oxygen free), 무기질, 및 무효소(enzyme free)이고, 음성 면역원성 반응의 유도가 적다.

일부 바람직한 실시양태에서, 산소는 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 가지거나 가지지 않을 수 있는 헤모글로빈으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 산소는 접촉기 막 기술(contractor membrane technology)에 의해 제거된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 단백질성 철 함유 화합물은 장기간 동안 안전하게 저장될 수 있는 티올-차단된 무기질 헤모글로빈이다. 이 티올-차단된 무기질 헤모글로빈은 본 발명의 또 다른 헤모글로빈 조성물을 산출하기 위한, 포장, 선적 및 추가 취급을 견딜 수 있는 안정한 중간체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정한 중간체는 추가로 임의적으로 탈산소화되고, 가교되며, 그리고 정제되어, 과량의 시약 및 반응 부산물, 예를 들어 디브로모 살리실산을 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈이 포장된다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 화합물은 비발열, 무내독소 및 무기질이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질성 화합물은 낮은 점도를 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질성 화합물은 무산소이다.

일부 실시양태에서, 티올 보호기를 제공하는 시약은 4-피리딜메틸 클로라이드, 알콕시알킬클로라이드, 디메톡시메탄, N-(히드록시메틸)아세트아미드, 트리페닐메틸 클로라이드, 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 할로아세트아미드, 요오도아세테이트, 벤질 클로라이드, 벤조일 클로라이드, 디-tert-부틸 디카르보네이트, p-히드록시펜아실 브로마이드, p-아세톡시벤질 클로라이드, p-메톡시벤질 클로라이드, 2,4-디니트로페닐 플루오라이드, 테트라히드로피란, 아세트아미도히드록시메탄, 아세톤, 비스-카르보에톡시에텐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드, tert-부톡시카르보닐 클로라이드, 알킬 이소시아네이트 및 알콕시알킬 이소시아네이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 할로아세트아미드는 요오도아세트아미드이다. 일부 실시양태에서, 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복시메틸의 유도체, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 티올 보호기는 카르복사미도메틸 기이다.

본 발명의 일부 실시양태는 단백질성 철 함유 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태는 본 발명의 단백질성 화합물을 포함하고, 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 함유하는 용기를 제공한다.

일부 실시양태에서, 포유동물은 급성 빈혈증, 빈혈증 관련 증상, 저산소증 또는 허혈을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 산소 수송을 위한 혈액 대용물의 용적 수혈을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 외상 상태로 존재하고, 급성 용적 손실을 앓고 있다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 투여는 임플란트, 주사 또는 수혈에 의해 이루어진다.

본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 포유동물은 빈혈증, 빈혈증 관련 증상, 저산소증 및 허혈을 포함한 장애를 앓고 있다. 빈혈증 및 빈혈증 관련 증상은 신부전, 당뇨병, AIDS, 화학요법, 방사선요법, 간염, G.I. 실혈, 철분 결핍 또는 월경과다에 의해 유발될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 에리트로포이에틴 요법제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 치료하는 장애는 화상, 뇌졸중, 신생(emerging stroke) 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심근 기절 및 동면, 급성 협심증, 불안정성 협심증, 신생 협심증(emerging angima) 또는 경색증에 의해 유발되는 허혈이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 장애는 일산화탄소 중독이다.

본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 포유동물에서 치료하는 장애는 수술후 회복이다. 본 발명의 방법의 일부 다른 실시양태에서, 장애는 당뇨병성 상처 치유(diabetic wound healing)이다. 방법의 또 다른 실시양태에서, 장애는 겸상적혈구 빈혈증이고, 투여는 수술 전에 추가로 행해질 수 있다. 본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 장애는 급성 관상동맥 증후군이다. 본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 장애는 심인성 쇼크이다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 혈액 수혈을 필요로 하는 포유동물에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 포유동물은 외상을 앓고 있다. 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물이 앓고 있는 장애는 환경적 스트레스 또는 신체적 스트레스에 의해 유발되는 산소 전달 용량의 결여이다.

본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 단백질성 철 함유 화합물은 방사선요법과 조합하여 투여된다. 발명의 또 다른 실시양태에서, 방법은 상기 포유동물에게 산소 의존성 약학적 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물에게 단백질성 철 함유 화합물을 투여하는 단계는 시야각(viewing field) 내 조직의 산소화를 유지하면서 생체내 혈관내 공간의 가시화를 허용한다.

참고 인용

본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 각 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 또한 개별적으로 참조 인용되는 것으로 나타내어진 것과 동일한 정도로 본원에 참조 인용된다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 신규 특성은 첨부된 특허청구범위에 구체적으로 나와 있다. 본 발명의 원리를 이용하는, 예시적 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명, 및 이하와 같은 첨부 도면을 참조함으로써, 본 발명의 특성 및 이점을 보다 잘 이해하게 될 것이다:

도 1은 본원에 개시된 바와 같은 방법의 단계를 도시하는 흐름도이다.

도 2는 WBC 용해(lysis)의 저항성을 도시하는 용해 실험의 경시 과정(time course)을 나타낸다.

도 3은 본원에 개시된 전기영동 분리에 사용된 크기 표준물질을 나타낸다.

도 4a는 네이티브 헤모글로빈, dXCMSFH 및 20 KDa 주위 범위 내 크기 표준물질의 전기영동 분리의 중첩을 나타낸다.

도 4b는 전체 전기영동도의 네이티브 헤모글로빈, dXCMSFH 및 크기 표준물질의 전기영동 분리의 중첩을 나타낸다.

도 5는 가교 반응의 생성물의 HLPC 크기 배제 분리를 나타낸다,

도 6은 소 전혈, 무기질 Hb, 가교 헤모글로빈, 및 새(fresh) 인간 혈액에 대한 산소 친화도 곡선을 도시한다.

도 7a-d는 돼지 안전성 시험에서 각각 심박출량, 전신 혈관 저항 및 평균 동맥압을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본원에 사용되는 용어 "무내독소(endotoxin free)" 또는 이의 문법적으로 균등한 용어는 탁도측정 검정 또는 발색 검정과 같은 고감도 검정 기법에 의해 측정되는, 모든 내독소를 완전히 또는 실질적으로 제거하기 위해 또는 그것에의 노출을 감소시키기 위해 처리된 헤모글로빈을 의미한다. 이 방법은 0.05 EU/ml 미만을 검출할 수 있다. 따라서, 무내독소 헤모글로빈은 주사용수(WFI) 내에 존재하는 내독소의 양의 이하를 가질 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "비발열(non-pyrogenic)" 또는 이의 문법적으로 균등한 용어는 IL-8 과다생성, 보체 활성화, 혈소판 활성화, 염증성 반응 또는 발열 반응을 유발하지 않으면서 포유동물에 투여할 수 있는 헤모글로빈을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "무산소(oxygen free)", "탈산소화된(deoxygenated)" 또는 이의 문법적으로 균등한 용어는 헴 주머니에 결합된 모든 산소를 실질적으로 또는 완전히 제거하도록 처리된 헤모글로빈을 의미한다. 이에 따라, 무산소 헤모글로빈은 실질적으로 또는 완전히 보다 높은 에너지의 "긴장" 또는 "T" 입체배치로 존재한다.

본원에 사용되는 용어 "무기질(stroma free)" 또는 이의 문법적으로 균등한 용어는 모든 기질 물질을 실질적으로 또는 완전히 제거하도록 처리 또는 가공됨으로써, 조제물이 적혈 표면 유형 항원에 대해 더 이상 면역반응성을 나타내지 않는데, 이는 RBC 막의 특징이다. 기질은 세포 막 구조 단백질이고, 기질의 제거는 또한 세포 막과 결합된 항원을 제거할 것이다. 그러므로, 무기질 헤모글로빈은 헤모글로빈 단백질을 둘러싼 지질 막의 부분을 여전히 함유하는 용혈된 적혈 세포의 조제물과 관련된 독성 및/또는 발열성 성질이 실질적으로 또는 완전히 결여되어 있고, 이에 따라 분자 안정화 후, 이 안정화된 무기질 헤모글로빈은 수혈 반응 독성 또는 염증성 반응을 유발하지 않고 개체에게 투여될 수 있다.

용어 "NO-차단된 사량체 Hb(N0-blocked tetrameric Hb)"는 본 발명의 무내독소, 무기질, 티올-차단의 사량체 헤모글로빈을 지칭한다. 용어 "안정한 NO-차단된 사량체 Hb"는 본 발명의 가교, 무내독소, 무기질, 티올-차단의 헤모글로빈을 지칭한다.

용어 "dNO-차단된 사량체 Hb"는 본 발명의 탈산소화된 무내독소, 무기질, 티올-차단된 가교 헤모글로빈을 지칭한다. 이 부류의 화합물의 한 실시양태는 "dXCMSFH"이고, 이는 본 발명의 탈산소화된, 무내독소, 무기질의 카르복사미도메틸화된 가교 헤모글로빈의 한 구체예이다.

용어 "dTBSFH"는 본 발명의 탈산소화된 무내독소, 무기질, 티올-차단의 비가교 헤모글로빈을 지칭한다.

용어 "dCMSFH"는 본 발명의 탈산소화된 무내독소, 무기질의 카르복사미도메틸화된 비가교 헤모글로빈을 지칭하고, dTBSFH의 한 구체예이다.

용어 "포유동물"은 인간 및 인간외 동물 모두를 지칭한다.

본 발명의 조성물 및 방법은, 헤모글로빈 분자 내의 하나 이상의 시스테인 부분이 티올 보호기, 예를 들어 카르복사미도메틸 기를 포함함으로써, 시스테인 부분 내의 티올 기가 산화질소(NO)와 결합하기 위해 이용가능하지 않도록 된 티올-보호의 가교 사량체 헤모글로빈(안정한 NO-차단된 Hb)에 관한 것이다. 바람직하게, 헤모글로빈 내의 적어도 2개의 시스테인 부분은 티올(또는 설프히드릴) 보호기로 보호됨으로써, 시스테인 부분 내의 티올 기가 산화질소(NO)과 결합하기 위해 이용가능하지 않게 된다. 본원에 개시된 이 NO-차단 헤모글로빈은 투여 시에 혈관의 혈관활성 반응을 방지한다. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈은 추가로 가교되어, 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50가 되는 산소 전달 용량, 및 연장된 순환 반감기를 제공한다. 바람직하게, 헤모글로빈은 비발열, 무내독소, 무산소 및 무기질이고, 그러므로 본 발명의 티올-보호된 가교 헤모글로빈(안정한 NO-차단된 사량체 Hb)은 높은 산소 교환 용량을 가지고, 네이티브 헤모글로빈보다 작용적으로 우수하다.

I. 헤모글로빈 조성물

1. 헤모글로빈 공급원 및 분자 구조

본원에 사용되는 헤모글로빈 (또는 혈액 또는 이를 단리할 수 있도록 하는 출처인 RBC)은 예를 들어, 인간, 소(속 보스), 바이손(속 바이손), 양(속 오비스(ovis)), 돼지(속 서스(sus)) 공급원, 기타 척추동물과 같은 각종 포유동물 공급원으로부터 수득되거나, 유전자도입에 의해 생성된 헤모글로빈일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 사용되는 무기질 헤모글로빈은 세균에 의해, 또는 더욱 바람직하게는 효모, 포유동물 세포 또는 곤충 세포 발현 벡터 시스템에 의해 합성으로 생성될 수 있다(Hoffman, S. J. et al., 미국 특허 제5,028,588호, 및 Hoffman, et al., WO 90/13645(양자 모두 본원에 참조 인용됨)). 대안적으로, 헤모글로빈은 유전자도입 동물로부터 수득될 수 있고, 그러한 동물은 내인성 헤모글로빈을 발현하기 위해 조작될 수 있다(Logan, J. S. et al. PCT 출원 제PCT/US92/05000호; Townes, T. M. et al., PCT 출원 제PCT/US/09624호(양자 모두 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)). 바람직하게, 본 발명에 사용되는 무기질 헤모글로빈은 바이손, 소 또는 인간 공급원으로부터 단리된다.

종 보스에는 보스 타우루스(bos taurus)(황소 및 들소를 비롯한 서양 소) 및 보스 아에깁티아쿠스(bos aegyptiacus)를 포함한 아속(subgenus) 보스; 보스 프론탈리스(bos frontalis)(가우르(gaur), 가얄(gayal) 또는 인디언 바이손) 및 보스 자바니쿠스(bos javanicus)(반텡(banteng))를 포함한 아속 비보스(bibos); 보스 사우벨리(bos sauveli)(코우프레이(kouprey) 또는 회색 황소)를 포함한 아속 노비보스(novibos); 및 보스 그루니엔스(bos grunniens)(야크; 보스 무투스(bos mutus)이기도 함)를 포함한 아속 포에파구스(poephagus)가 포함된다. 보스 타우루스에는 아프리카 및 아시아산의 유사 유형, 예컨대 보스 인디쿠스(bos indicus), 제부(zebu); 및 보스 프리미제니우스(bos primigenius), 들소가 포함된다. 보스 구루스에는 아종, 보스 가우루스 라오시엔시스(bos gaurus laosiensis), "인디언 바이손"으로도 불리는 보스 가우루스 가우루스(bos gaurus gaurus)(예컨대, 인도 및 네팔산), 보스 가우루스 레아데이(bos gaurus readei), 보스 가우루스 허브배키(bos gaurus hubbacki)(예컨대, 태국 및 말레이지아산), 및 보스 가우루스 프론탈리스(bos gaurus frontalis), 옥내 구아르(gaur) 또는 구아르-소 혼성 교배종이 포함된다.

바이손은 아과 보비나에(bovinae)에 속하는 6가지 종을 포함하는 분류 속이다. 바이손은 아시아산 들소(예컨대, 물 들소) 및 아프리카산 들소(예컨대, 아프리칸 들소)로 불릴 수 있다. 속 바이손에는 바이손 라티프론스(bison latifrons)(긴 뿔을 가진 바이손), 바이손 안티쿠우스(bison antiquus), 바이손 옥시덴탈리스(bison occidentalis), 바이손 프리스쿠스(bison priscus), 바이손 바이손(bison bison), 바이손 바이손 바이손(bison bison bison), 바이손 바이손 아타바스카에(bison bison athabascae), 바이손 보나수스(bison bonasus), 바이손 보나수스 보나수스(bison bonasus bonasus), 바이손 보나수스 카우카시쿠스(bison bonasus caucasicus) 및 바이손 보나수스 헝가로룸(bison bonasus hungarorum)과 같은 종이 포함된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 헤모글로빈은 속 보스 또는 바이손으로부터의 것이다. 임의의 포유동물 종이 헤모글로빈의 공급원으로 사용될 수 있고, 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 이해하여야 한다.

소 Hb는 인간 Hb보다 수득하기 더 쉽고, 더 풍부하다. 전형적으로, 구식형 RBC로부터 추출된 인간 Hb는 Hb-기재 인공 혈액 연구를 위해 사용된다. 그러나, 구식형 RBC는 다량의 활력성 산소 전달 치료제 또는 혈액 대용물을 생산하기에 충분한 양으로 이용가능하지 않다.

헤모글로빈은 동물, 합성 또는 재조합으로부터 유래되었는지의 여부와 상관없이, "천연적으로 존재하는" 헤모글로빈 단백질로 구성될 수 있거나, 돌연변이 헤모글로빈 단백질을 일부 함유하거나 그것으로 전부 구성될 수 있다. 바람직한 돌연변이체 헤모글로빈 단백질에는 더욱 바람직한 산소 결합/방출 특성을 초래하는 돌연변이를 갖는 것들이 포함된다. 그러한 돌연변이체 헤모글로빈 단백질의 예에는 Hoffman, S. L. et al.(미국 특허 제5,028,588호 및 제5,776,890호) 및 Anderson, D. C. et al.(미국 특허 제5,844,090호 및 제5,599,907호)(이들 모두는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)에 의해 제공된 것들이 포함된다.

헤모글로빈(Hemoglobin 또는 haemoglobin)(Hb)은 포유동물 및 다른 동물에서 혈액의 적혈 세포 내에서 산소를 수송하는, 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 단백질성 헴 철-함유 화합물이다. 헤모글로빈은 산소를 폐에서 신체의 나머지, 예컨대 근육에 수송하여, 거기에서 그것은 산소 부하 중 일부를 방출한다. 헤모글로빈 분자는 4개의 구상 단백질 서브유닛의 조립체이다. 각각의 서브유닛은 비-단백질 헴 기와 단단히 결합된 단백질 사슬로 구성된다. 각 개별 단백질 사슬은 "미오글로빈 폴드" 배치로 함께 연결된 세트의 α-나선 구조 세그먼트의 세트로 배치되는데, 이는 소위 이 배치가 헴/글로빈 단백질에 사용되는 동일한 폴딩 모티프이기 때문이다. 이 폴딩 패턴은 헴 기에 강하게 결합하기에 적당한 주머니를 포함한다. 헴 기는 포르피린으로 알려진 복소환 고리 내에 보유된 철 원자로 구성된다. 이 철 원자는 산소 결합 부위이다. 철 원자는 한 평면에 놓여 있는, 고리의 중심에 있는 4개 질소 모두에 동등하게 결합된다. 각 측의 평면에 대해 수직인 2개의 부가적 결합이 철과 함께 형성되어, 제5 및 제6 위치를 형성하고, 이 중 하나는 단백질에 강하게 연결되고, 나머지는 산소 결합을 위해 이용가능하다. 철 원자는 Fe²⁺ 또는 Fe³⁺ 상태로 있을 수 있으나, 페리헤모글로빈(메트헤모글로빈)(Fe³⁺)은 산소에 결합할 수 없다.

성인 인간에서, 우세한 헤모글로빈 유형은, 각기 141개 및 146개 아미노산 잔기로 된, 비공유 결합된 2개의 α 및 β 서브유닛로 구성된, 헤모글로빈 A로 불리는 (4개 부분 단위 단백질을 함유하는) 사량체이다. 이는 α₂ β₂로 표시된다. 서브유닛은 구조적으로 유사하고, 대략 크기가 동일하다. 약 64,000 달톤의 사량체의 총 분자량에 대해, 약 16,000 달톤의 분자량을 가진다. 4개의 폴리펩티드 사슬은 염 다리, 수소 결합 및 소수성 상호작용에 의해 상호 결합된다. α 사슬과 β 사슬 사이에 2종의 접촉, 즉 α₁β₁ 및 α₁β₂가 있다. 그러나, 성인 헤모글로빈은 또한 δ 글로빈 서브유닛을 포함할 수도 있다. δ 글로빈 서브유닛은 α₂β₂와 같이 β 글로빈을 대체하고 α 글로빈과 쌍을 이루어, 헤모글로빈 A2를 형성한다.

소 Hb는 인간 Hb와 구조적으로 유사하다. 소 Hb는 또한 2개의 α 사슬 및 2개의 β 사슬을 포함하고, 유사한 분자량 분포를 가진다.

2. 헤모글로빈의 시스테인의 설프히드릴 기의 보호

헤모글로빈 내의 시스테인 부분의 티올 기가 산화질소에 결합할 수 있고, 혈액 또는 혈관활성 물질의 혈행동태 성질의 일시적 또는 지속적 변화를 초래할 수 있고, 고혈압 반응을 야기할 수 있다. 이러한 발생은 헤모글로빈 내의 시스테인 부분의 티올 기를 보호하여, 이에 수득되는 헤모글로빈이 NO와 결합할 수 없게 됨으로써 막을 수 있다.

소 헤모글로빈은 NO에의 결합과 관련된 단지 2개의 티올 기(각각의 베타 사슬 상의 Cys 93)을 함유한다. 그러므로, 바람직하게 소 Hb에서 2개의 티올 기가 티올 보호기로 보호된다. 인간 헤모글로빈은 6개의 티올 기(α Cys 104, β Cys 93 및 β Cys 112)를 함유하고, 이들 중 적어도 2개(각각의 베타 사슬 상의 Cys 93)은 NO에의 결합과 관련된다. 바람직하게, 이 2개의 티올은 보호되고, 인간 Hb에서 6개 이하의 티올 기는 티올 보호기로 보호될 수 있다.

본 발명의 SFH는 각종 시약들과 반응하여, 헤모글로빈의 시스테인 부분 내 티올기의 보호를 초래할 수 있다. 본 발명의 범주를 제한하지 않고, 작용기의 보호를 위한 당업계에 공지된 모든 시약들, 예를 들어 단 비제한적 예로서 히드록실, 티올 또는 카르복실이 본 발명에 포함된다.

시약의 예의 일부에는 4-피리딜메틸 클로라이드, 알콕시알킬클로라이드, 디메톡시메탄, N-(히드록시메틸)아세트아미드, 트리페닐메틸 클로라이드, 아세틸 클로라이드, 2-클로로아세트산, 아세트산 무수물, 할로아세트아미드, 예컨대 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 클로로아세트아미드 또는 플루오로아세트아미드, 할로아세테이트, 예컨대 요오도아세테이트, 브로모아세테이트, 클로로아세테이트 또는 플루오로아세테이트, 벤질 클로라이드, 벤조일 클로라이드, 디-tert-부틸 디카르보네이트, p-히드록시펜아실 브로마이드, p-아세톡시벤질 클로라이드, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐 플루오라이드, 테트라히드로피란, 아세트아미도히드록시메탄, 아세톤, 비스-카르보에톡시에텐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드, tert-부톡시카르보닐 클로라이드, 알킬 이소시아네이트 및 알콕시알킬 이소시아네이트가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 한 바람직한 실시양태에서, 시약은 할로아세트아미드이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 시약은 요오도아세트아미드이다. 헤모글로빈의 시스테인 부분의 티올 기의 카르복사미도메틸화를 위해 사용될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 시약이 본 발명의 범주 내에 속함을 이해한다

본 발명의 범주를 제한하지 않고, 작용기의 보호를 위한 당업계에 공지된 모든 보호기, 예를 들어 단 비제한적 예로서 히드록실, 티올 또는 카르복실이 본 발명에 포함된다. 보호기의 예들 중 일부에는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 한 바람직한 실시양태에서, 보호기는 카르복사미도메틸이어서, 헤모글로빈의 시스테인 부분 내의 티올 기는 비발열, 무내독소, 무기질의 카르복사미도메틸화된 Hb(CMSFH 또는 안정한 NO-차단 Hb)를 형성하게 된다. 더욱 일반적으로, 헤모글로빈 내의 시스테인(들)의 티올 기의 보호는 비발열, 무내독소, 무기질, 티올-차단의 Hb(TBSFH 또는 NO-차단 Hb)를 형성하게 된다.

3. 사량체 헤모글로빈 내에서 가교에 의한 산소 친화도 조절 및 안정화

소 Hb 및 인간 Hb는 산소 친화도가 조절되는 방식이 상이하다. 정상 성인 인간 헤모글로빈의 사량체성 형태에서, 산소의 결합은 협력적 공정이다. 산소에 대한 헤모글로빈의 결합 친화도는 분자의 산소 포화에 의해 증가된다. 궁극적으로, 헤모글로빈의 산소 결합 곡선은 시그모이드형(sigmoidal), 즉 S-형이다. 이 양성적 협력적 결합은 헤모글로빈 단백질 착체의 입체 배치 변화를 통해 달성될 수 있다. 헤모글로빈 내의 한 서브유닛 단백질이 산소화될 때, 그것은 전체 착체 내 배치 또는 구조 변화를 유도하여, 다른 서브유닛들이 산소에 대한 증가된 친화도를 얻도록 한다.

헤모글로빈이 산소에 결합될 때, 그것은 고에너지 "긴장" 또는 "T" 상태(탈산소화 또는 무산소)에서 저에너지 "이완" 또는 "R" 상태(산소화)로 이동한다. 인간 α 및 β 글로빈 유전자가 코딩되어 시퀀싱되어 있다(Liebhaber et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A) 77:7054-58 (1980); Marotta et al., J. Biol. Chem. 252:5040-43 (1977); 및 Lawn et al., Cell 21-647 (1980): 이들 모두는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)). 인간 T 상태 데옥시헤모글로빈의 사량체성 구조는 6개의 이온성 결합으로부터 증가된 안정성을 가지고, T 상태로 있을 때, 헤모글로빈은 이량체로의 해리가 효과적으로 방지된다. 이 배치에서, 데옥시헤모글로빈 내 (베타 주머니, 인산염 주머니 및 2,3-디포스포글리세레이트 결합 부위로도 알려진) 2개의 베타 사슬 사이의 베타 틈새 접촉 면적은 옥시헤모글로빈 내에서보다 실질적으로 상이하다. T 상태에서의 베타 틈새의 변화된 배치는 2,3-디포스포글리세레이트에 의해 안정화된, 감소된 산소 친화도를 설명하는 것으로 판단된다. 헤모글로빈의 T 상태는 안정하고, 변성에 대해 저항성이 있다.

적혈 세포 내에서, 2,3-디포스포글리세레이트의 인간 헤모글로빈 내 그것의 결합 부위로의 결합은 헤모글로빈의 산소 친화도를 pH 7.2 내지 7.4의 생리학적 범위에서의 산소 수송 및 전달에 필적하는 수준으로 감소시킨다. 2,3-디포스포글리세레이트의 헤모글로빈으로의 결합은 약하고, 헤모글로빈의 산소 친화도를 변형시키기 위해 높은 농도(즉, 1 M 이상에 접근하는 농도)를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 높은 고도에 급격히 순응화되는 사람들에서, 혈액 내 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG)의 농도가 증가되고, 이는 이들 개체가 보다 낮은 산소 분압의 조건 하에 조직으로 보다 많은 양의 산소를 방출하도록 한다.

따라서, 적혈 세포가 무기질 헤모글로빈(SFH)를 생성하도록 파열될 때, 2,3-디포스포글리세레이트는 헤모글로빈에 근접하여 보유되지 않을 수 있고, 헤모글로빈으로부터 해리될 수 있다. 궁극적으로, 추가 변형되지 않는 한, 인간 SFH는 RBC 내 헤모글로빈보다 높은 산소 친화도를 나타낼 수 있다. 대략 27 mm Hg의 네이티브, RBC 결합 헤모글로빈 p50에 비해, 용액 중 무기질 인간 헤모글로빈의 p50는 대략 12 내지 17 mm Hg일 수 있다. 산소에 대한 SFH의 증가된 친화도는 생리학적 조건 하에서의 결합된 산소의 조직으로의 고용량 방출을 방지할 수 있다.

대조적으로, 추가 내부 염 다리를 가지는 소 Hb는 그것의 산소 친화도가 국소 환경의 이온 강도에 의해 영향을 받는다. 소 헤모글로빈은 2,3-DPG가 산소에 대한 p50을 30 mm Hg 내지 40 mm Hg 범위 내로 유지할 것을 요구하지 않는다. 2,3-DPG 결합에 의해 유도되는 경우에 대비한, 이온 강도를 변경함에 의한 친화도 조절에 대한 한 이점은, 충분한 농도의 이온 종이 일반적으로 혈장 내에 존재하는 반면, 2,3-DPG는 단지 RBC 내에만 함유된다는 것이다. 따라서, 무세포 소 Hb의 산소 친화도는 무세포 인간 Hb에 비해 더 용이하게 조절될 수 있다.

일반적 이온성 상호작용에 의한 친화도 조절의 그러한 이점은 그것을 피리독살-5-인산염(PLP)와 반응시킴에 의해 인간 Hb로 다시 구성될 수 있다. PLP는 끝에서 두 번째의 β 사슬 히스티딘 잔기 부근에 음전하를 도입함으로써, 또한 동일한 사슬의 아미노 말단부에서 양전하를 제거함으로써, 인간 Hb를 변형시킨다. 이 부류의 변경된 인간 Hb는 이제 국소 환경 내 하전된 종과 더욱 유사하게 소 Hb에 대응할 수 있고, 산소 친화도에 영향을 미치는 2,3-DPG의 결합에 단독으로 의존하지 않는다,

RBC 내에서는, α 사슬의 이의 상응하는 β 사슬과의 결합이 매우 강하고, 생리학적 조건 하에 해리하지 않는다. 그러나, 하나의 α/β 이량체의 다른 α/β 이량체의 결합은 매우 약하고, RBC 외부에서는, 2개의 이량체는 생리학적 조건 하에서도 해리할 수 있다. 해리 시에, 이량체는 사구체를 통해 여과된다. 신장에 의한 무기질 헤모글로빈(SFH)의 급속 제거(clearing)는 그것의 4차 분자 배치의 결과이다.

마찬가지로 그러한 인간 및 소 헤모글로빈의 제거를 막기 위해, 무세포 헤모글로빈은 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 접합되거나 가교될 수 있다. 그 방법들 중 하나는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 또 다른 분자에 Hb를 접합시켜, Hb 분자 주위에 친수성 차단물을 형성하고, 이와 동시에 그것의 크기를 증가시키고, 이는 다시 그것의 순환 반감기를 증가시킴에 의한 것이다. Hb는 또한 사량체의 αβ 이량체로 해리를 방지하기 위해 분자내 가교되고/되거나, 중합체를 형성하기 위해 분자간 가교될 수 있어, 이는 산소 담체의 크기를 증가시키고, 이에 따라 그것의 순환 반감기를 증가시킨다. 부위-특이적 가교 시약을 이용하여, 분자내 공유 결합이 형성될 수 있고, 이는 Hb를 안정한 사량체로 전환시킬 수 있고, 이에 따라 그것이 αβ 이량체로 해리되는 것이 방지된다. 한편, 비특이적 가교제, 예컨대 글루타르알데히드의 사용은 Hb 사량체 내 또는 Hb 사량체들 사이에 있는 아미노산 잔기들 간의 비특이적 공유 결합을 초래할 수 있다. 이는 각종 분자량 및 산소 친화도의 헤모글로빈 중합체(폴리Hb)의 형성을 초래한다. 다중-알데히드 작용성을 갖는 화학적 시약이 가교제로서 사용될 수 있다. 이에는 글루타르알데히드, 개환 라피노즈 및 덱스트란과 같은 분자들이 포함된다. 알데히드의 경우, 공유 가교제의 형성은 Hb 사량체 내에 존재하는 아미노 기와 반응하는 알데히드의 카르보닐 기에 의해 개시될 수 있다. Hb의 보다 큰 분자로의 중합은 네이티브 사량체성 Hb에 대비 폴리Hb의 혈관내 반감기를 증가시키고, αβ 이량체로의 Hb 해리를 방지할 수 있다. 폴리Hb는 궁극적으로 신장, 림프계 및 세망 내피계(RES) 전반에 걸친 전신 순환으로부터 여과될 수 있다.

헤모글로빈 αβ 이량체를 가교하고 사구체에 의해 요로의 여과를 방지하고, 또한 네이티브 헤모글로빈의 산소 수송 및 전달 성질을 유지하기 위해, 수가지 다른 화학적 제제가 사용될 수 있다. 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트(DBSF)는 헤모글로빈을 가교하기 위한 가교제로 사용되었던 푸마르산의 활성화된 디에스테르이다(Tye, 미국 특허 제 4,529,719호(이는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)). 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트는, 헤모글로빈 내 아스피린에 결합하는 것으로 알려진 부위와 살리실 부분을 결합시킨 후, 알파 사슬 및 베타 사슬과의 푸마레이트 활성 작용기에 의한 가교를 수행함으로써 상기 변화에 영향을 준다. 이는 2개의 이량체를 라이신 잔기와의 가교를 위한 적당한 배향으로 유지시킨다. α 또는 β 사슬을 사량체의 다른 절반의 유사 사슬에 가교하여 헤모글로빈을 형성함으로써, 사량체의 해리를 방지할 수 있고, 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50을 갖는 산소 운반 용량(여기에서, p50 시험은 CO₂의 부재 하에 시험관내 수행됨)을 가지는 본 발명의 안정한 헤모글로빈을 수득하도록 한다. 가교는 또한 대향하는 이량체 쌍 내 비유사 사슬 간에도 가능하다. 따라서, 헤모글로빈의 가교는 변형된 헤모글로빈의 형태를 T 상태로 구속함으로써 산소 친화도의 문제를 해결할 수 잇고, 또한 신장에 의한 급속 여과의 과제를 해결할 수 있다.

헤모글로빈의 산소-결합 용량은 일산화탄소의 존재 하에 감소될 수 있는데, 이는 양 기체가 헤모글로빈 상의 동일 결합 부위에 대해 경쟁하고, 일산화탄소는 산소에 비해 우세하게 결합한다. CO에 대한 헤모글로빈 결합 친화도는 산소에 대한 그 친화도보다 200배 더 크고, 이는 소량의 CO는 산소를 수송하는 헤모글로빈의 능력을 감소시킬 수 있음을 의미한다. 헤모글로빈이 CO와 조합될 때, 그것은 카르복시헤모글로빈으로 불리는 매우 밝은 적색의 화합물을 형성한다. 스며든 공기(즉, 예를 들어 흡연, 자동차 및 노(furnace)의 환경 내)가 0.02%만큼 낮은 CO 수준을 가질 때, 두통 및 메스꺼움이 일어날 수 있고; CO 농도가 0.1%로 증가될 경우, 의식상실이 이어질 수 있다. 심한 흡연자의 경우, 산소-활성 부위의 20%까지 CO에 의해 차단될 수 있다. 헤모글로빈은 또한 일산화황(SO), 이산화질소(NO₂), 산화질소(NO) 및 황화수소(H₂S)에 대한 경쟁적 결합 친화도를 가진다. 헴 기 내의 철 원자는 산소 수송을 지지하는 Fe²⁺ 산화 상태로 있다. Fe³⁺ 상태로의 산화는 헤모글로빈을 산소에 결합될 수 없는 메트헤모글로빈으로 전환시킨다. 이산화질소 및 아산화질소는 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 전환시킬 수 있다.

이산화탄소는 헤모글로빈 상의 상이한 결합 부위를 차지한다. 헤모글로빈은 양자 및 이산화탄소를 결합시켜, 단백질 내 구조 변화를 유발하고 산소의 방출을 용이하게 할 수 있다. 양자는 단백질을 따라 있는 각종 부위들에서 결합하고, 이산화탄소는 α-아미노 기에서 결합하여, 카르바메이트를 형성한다. 역으로, 혈액 내 이산화탄소 수준은 감소되고(즉, 폐 주위), 이산화탄소가 방출되며, 이에 단백질의 산소 친화도가 증가된다. 이러한 산소에 대한 헤모글로빈의 친화도 및 이산화탄소 방출의 조절은 보어(Bohr) 효과로 알려져 있다.

상기 기재된 바와 같이, 헤모글로빈에 결합하는 양자의 변화에 의해 영향을 받는 구조 변화는 이산화탄소 농도가 증가하고 있는 조직 내 산소 오프로딩을 촉진하게, 이에 수득되는 pH는 감소된다. 이는 산소에 대한 헤모글로빈의 친화도에 대한 협력성 곡선의 좌측 편향을 발생시키고, 이에 헤모글로빈의 그램 당 산소의 전달 효율이 더 커지게 된다. 변형된 헤모글로빈에서의 이러한 편향의 증진은 심기능이 좋지 않은 환자에 대한 효과적인 치료 개입을 초래할 수 있고, 이에 따라 심장에 의해 요구되는 일이 적어짐과 동시에 더욱 효과적인 산소화가 제공된다. 부가적으로, 우수한 산소 오프로딩을 수득하도록 변형된 헤모글로빈은 성능 관련 산소화 결여에 처한 환자를 치료하는 데 유용할 수 있다.

II. 카르복사미도메틸화된 가교 헤모글로빈의 제조 방법

본 발명의 실시양태 중 일부에 대한 단계가 도 1에 나와 있다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 단계는 상호간에 독립적으로, 또는 차례대로 수행될 수 있다. 하나 이상의 단계는 본 발명의 방법에서 제거될 수 있다. 본 발명의 헤모글로빈의 제조 방법은, 세정에 의해 적혈 세포를 함유하는 조제물로부터 혈장 단백질 및 내독소를 제거하는 것을 포함하는 단계 101; 적혈 세포를 용해시키는 것을 포함하는 단계 102; 용해된 적혈 세포로부터 막 및 백혈구를 포함한 기질을 제거함으로써 헤모글로빈을 분리하는 것을 포함하는 단계 103; 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 것을 포함하는 단계 104; 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 것을 포함하는 단계 105; 헤모글로빈의 시스테인 기에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 것을 포함하는 단계 106; 헤모글로빈을 가교하는 것을 포함하는 단계 107; 및 생용적합성 완충액 내 헤모글로빈을 평형화하고, 비발열, 무내독소, 무산소, 무기질, 시스테인 보호의 가교 헤모글로빈을 제조하는 것을 포함하는 단계 108을 포함할 수 있다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 단계의 순서는 본 발명에 따른 헤모글로빈의 생성 요건에 따라 변화될 수 있다.

1. 재료 및 장비 제조

소 공급원으로부터의 전혈은 살아있는 공여체 또는 신선하게 도살된 공여체로부터 수득될 수 있다. 수집 시에, 혈액은 전형적으로 혈액이 상당히 응고되는 것을 방지하기 위해 하나 이상의 응고방지제와 혼합된다. 혈액에 대한 적당한 응고방지제는 통상 당업계에 알려진 바와 같고, 이에는 예를 들어, 시트르산나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산 및 헤파린이 포함된다. 혈액과 혼합될 때, 응고방지제는 고체 형태, 예컨대 분말 형태이거나 수용액 중의 것일 수 있다. 혈액 용액 공급원은 새로 수집된 샘플 또는 오래된 샘플로부터의 것일 수 있음을 이해한다. 본 발명의 방법은 혈액 은행으로부터의 만기된 인간 혈액의 사용을 제공된다. 또한, 혈액 용액은 과거 냉동 및/또는 액체 상태로 유지되었다. 혈액 용액은 이 방법에 사용하기 전에 냉동되지 않는 것이 바람직하다.

혈액 용액을 응고방지제에 도입하기 전에, 혈액 용액 내 항생제, 예컨대 페니실린의 수준을 검정할 수 있다. 항생제 수준을 결정하여, 혈액 샘플의 공여체가 항생제로 처리되지 않음을 입증함으로써 감염 유기체로 부담되지 않음을 확인하는 정도를 제공할 수 있다. 대안적으로, 소 내 질병의 결여 또는 소의 치료로부터의 항생제 존재를 모니터링하고 보증하는 무리 관리 프로그램을 사용할 수 있다. 혈액 용액을 응고방지 단계 전 또는 중에, 예를 들어 스트레이닝에 의해 긴장시켜, 큰 응고물 및 입자를 제거할 수 있다. 150 마이크론 필터가 이 작업을 위한 적당한 스트레이너이다.

각종 검정들 중 임의의 검정을 이용하면, 본 발명의 조성물의 비발열성, 예를 들어 단 비제한적 예로서, 인터류킨-6 및 기타 사이토킨 유도(Pool, E. J. et al., J. Immunoassay 19:95-111 (1998); 및 Poole, S. et al., Dev. Biol. Stand. 69:121-123 (1988)); 인간 단핵구상 세포주 검정(Eperon, S. et al., J. Immunol Meth. 207:135-145 (1997)]; 및 Taktak, Y. S. et al., J. Pharm. Pharmacol. 43:578-582 (1991)); 리뮬러스 유주세포 용해물(LAL) 시험(Fujiwara, H. et al., Yakugaku Zasshi 110:332-40 (1990); 및 Martel F. et al., Rev. Fr. Transfus Immunohematol 28:237-250 (1985)) 및 토끼 발열원 시험(Bleeker W. K. et al., Prog. Clin. Biol. Res. 189:293-303 (1985); Simon, S. et al., Dev. Biol. Stand 34:75-84 (1977); 및 Allison, E S. et al., Clin Sci Mol. Med. 45:449-458 (1973))(이들 참조문헌 모두는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)을 입증할 수 있다. 토끼 발열원 시험은, 증진된 LAL-시험이 상기 이전 기법을 대체할 때까지, 바람직한 발열성 검정이었다. 필터, 흡수제, 친화도 물질 등을 포함한, 발열원을 제거하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이도 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 이해된다.

혈청 리파제, 예컨대 리파제 A는 헤모글로빈 분자에 결합된 내독소를 불활성화하지 않는다. 그러므로, 내독소는 헤모글로빈을 대사하는 간세포에 의해 취해질 때, 활성 독소로 남는다. 문헌[Friedman, H. I. et al.]는 이 이론과 일관된, 래트 모델에서의 3개조 간독성을 보고하였고(Friedman, H. I. et al., Lab Invest 39:167-77 (1978) 참조); Colpan et al., 미국 특허 제 5,747,663호는 세포 용해물 용액으로부터 내독소를 감소시키거나 제거하는 공정을 보고하였다. Wainwright et al.(미국 특허 제 5,627,266호)는 고체 지지체에 고정된 내독소 결합 단백질, 및 용액으로부터의 내독소의 제거에서의 상기 분자의 사용을 기재하였다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 내독소로의 오염의 제거는 본 발명의 화학적 공정에 내독소를 도입하는 것을 방지함으로써 확실히 될 수 있다. 전형적으로, 내독소는 내독소 오염수, 비무균 기법 또는 수집 중 세균의 단순 노출 공정을 이용함으로써 우연히 첨가되게 된다. 내독소의 측정은 어려울 수 있고, 표준 LAL 결합 검정은, 초기 수집 내독소가 헤모글로빈에 강하게 결합하기 때문에, 헤모글로빈의 존재 하에 작용하지 않는다. 그러나, 탁도측정 검정 및 발색 검정이 매우 낮은 검출 한도를 허용하는 것으로 확인되었다. 물 및 혈액 수집물은, 헤모글로빈의 제조 단계의 수가 증가하게 되면 독성 수준이 증가할 수 있기 때문에, 내독소의 도입을 위한 가장 유력한 후보일 수 있다. 투석 및 여과 방법을 이용한 제조는, 헤모글로빈을 내독소로 오염될 수 있는 1000 용적의 물/완충액에 노출할 수 있다. 막 시스템을 NaOH 또는 NaOCl로 예비처리하여, 내독소를 감소시키거나 제거할 수 있다. 이어서, 이 물질을 플러슁하여 각종 장치들로부터 세정될 수 있다. 본 발명의 헤모글로빈을 생성하기 위해 사용되는 모든 막 및 장비를 그러한 물질 및 장비 상에 존재할 수 있는 내독소의 제거 또는 소거를 유발하는 데 충분한 방식으로 세정하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 그러한 세정은 내독소를 가지지 않는 것으로 사전 인정된, 헤모글로빈의 희석 용액을 이용하여 본 발명의 헤모글로빈에 접촉될 수 있는 표면 및 장비를 예비 세정함으로써 달성된다. 그러한 용액은 내독소에 결합하고 이에 따라 상기와 같은 막 또는 장비 상에 존재할 수 있는 잔류 내독소를 제거하는 작용을 한다. 예를 들어, Tye, 미국 특허 제 6,894,150호를 참조한다. 세정에 사용되는 헤모글로빈의 희석 용액은 각 사용 후에 폐기된다. 바람직하게, 후속 생성물 내 내독소의 축적을 방지하기 위해, 역류 투석을 이용하여 임의의 철 제거 또는 완충액 평형화를 수행할 수 있다.

2. 단계 101. 혈장 단백질 및 내독소를 제거하기 위한 RBC의 세정

혈액 용액 내 RBC를 임의의 적당한 수단에 의해, 예컨대 투석여과에 의해, 또는 하나 이상의 용액, 예컨대 등장성 용액으로 구분된 희석 및 농도 단계를 조합함으로써 세정하여, 세포외혈장 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 항체(예를 들어, 면역글로불린(IgG))으로부터 RBC를 분리할 수 있다. RBC는 배치 또는 연속 공급 방식으로 세정될 수 있는 것으로 이해된다. 허용가능한 등장성 용액이 당업계에 공지되어 있고, 이에는 용액, 예컨대, 예를 들어 시트르산염/염수 용액, 또는 RBC의 세포 막을 파열하지 않고 전혈의 혈장 부분을 대체하는 pH 및 삼투압을 가지는 PBS가 포함된다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 정제수의 공급원에는 증류수, 탈이온수(DI), 주사용수(WFI) 및/또는 저 발열원수(LPW)가 포함된다. WFI가 바람직하며, 이는 탈이온화된 증류수이다. 물을 정제하는 구체적 방법은 내독소 함량이 낮을 필요가 있다는 요건만큼 중요하지 않다.

본 발명에 사용되는 물 및 시약은 실질적으로 내독소 오염이 없다. 바람직하게, 본 발명에 사용되는 물 및 시약은 내독소 오염이 완전히 없다. 내독소 오염의 위험을 감소시키는 한 방법은, 헤모글로빈 조제물에 노출된 물 및 시약 완충액의 양을 감소시키는 것일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 일부 실시양태 하에서, 헤모글로빈 조제물은 완충액의 평형화 및/또는 반응 생성물의 제거를 위해 역류, 즉 반류 투석을 이용하여 제조된다. 역류 투석 방법이 본 발명에 사용하기에 적당하며, 예를 들어 배리펌(VariPerm) M, bitop, Witten(예를 들어, Schwarz, T. et al., Electrophoresis 15 1118-1119 (1994) 참조), 스펙트럼 라보라토리즈 인코포레이티드(Spectrum Laboratories, Inc.; 미국 캘리포니아주 라구나 힐즈 소재)와 같이 상업적으로 입수가능하다. 중공 섬유 기법은 표준 합성 기법에 비해 내독소 양을 100배 감소시키는 본 발명의 헤모글로빈 조제물을 수득하도록 할 수 있는 것으로 평가된다. 내독소를 제거하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이도 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 이해된다.

적혈구를 수집하는 한 방법에서, 혈액 샘플은 등장성 용액으로 수회 세정할 수 있고, 혈장은 4인치 직경 그릇에서 3,000 rpm으로 원심분리하여 분리할 수 있다. 바람직하게, 사용되는 등장성 용액은 염수 용액이다. 바람직하게, 세포를 3회 이상 세정하고, 각 원심분리 사이에 헹구며, 최종 용적으로서 동등 용적인 등장성 용액 내에 재현탁시킨다. 대안적으로, RBCS의 농축은 접선류 막 상에 여과함으로써 달성될 수 있다.

초음파처리기의 사용은 막을 구(이는 종종 "분진"으로 칭해짐)로 만들기 때문에 바람직하지 않을 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 교반 방법은 자기 교반 막대(직경 0.25") 및 기계식 로커(mechanical rocker) 또는 쉐이커(shaker)(1 내지 2 리터 용기 용량이 사용될 수 있음)를 포함할 수 있다. 이 예시적 프로토콜은 이 시점에서 세포 막의 바람직하지 못한 균열을 방지하기 위해 수집된 세포 상에 작용하는 힘의 제한을 나타내는 장비를 기재하고 있다.

다른 혈액 성분으로부터 RBC를 분리하기 위한, 당업계에 일반적으로 공지된 방법, 예를 들어 침강을 이용할 수 있는 것으로 이해되며, 상기 분리 방법은 다른 혈액 성분, 예컨대 백혈 세포(WBC) 및 혈소판으로부터 RBC를 분리하기 전에, 유의적 양의 RBC, 예컨대 약 30% 미만의 RBC의 세포 막을 파열하지 않는다.

백혈 세포는 수혈된 팩킹된 RBC 내에 존재할 때 인간 수령자에게 발열 반응을 유발할 수 있다. RBC를 통과하나 WBC의 수를 현저하게 감소시킬 수 있는 백혈구 감소 필터를 사용하는 것이 바람직하다. 팩킹된 세포의 단일 인간 단위를 위해 사용되는 것보다 더 큰 원형(prototype)을 사용하여, 백혈구 감소를 평가한다. 약 12시간 동안 세정된 소 적혈구를 예비냉장함은 약 15분 후 여과의 백혈구 감소를 허용한다. 결과가 표 1에 나와 있다. 코울터 카운터(Coulter Counter)

셀(Cell) 및 입자 계수기(Particle Counter)와 같은 기기에 의해 정량화되는 WBC에서의 3 로그 감소는 적혈 세포 현탁액을 백혈구 감소 필터에 통과시킴으로써 달성된다. 이는, RBC가 WBC를 용해시키지 않으면서 WBC의 존재 하에 선택적으로 용해된 후, 후속하여 여과에 의해 제거되는 방법에 대한 대안법이다. 이 선택적 용해는 이하 더욱 충분히 논의된다.

백혈구 감소 필터

샘플	초기 WBC/mm3	용적 조정된 최종 WBC/mm3	제거율 %	Log10 제거
12시간 냉 소(cold bovine)	6.13×103	28	99.6%	3

3. 단계 102 . 적혈구의 용해

Hb의 산소의 수소 및 방출 능력을 유의적으로 손상시키지 않으면서 헤모글로빈을 방출하는 각종 용해 방법, 예컨대 기계적 용해, 화학적 용해, 저장성(hypotonic) 용해 또는 기타 공지된 용해 방법이 사용될 수 있다. 헤모글로빈은 탈이온수 중에 저장성 용해함으로써 적혈구로부터 방출될 수 있다. 바람직하게, 용해는 4 내지 20 용적의 탈이온수에서 달성된다. 한 방법에서, 무혈장 혈액 세포는 NS와 평형화된 후, 4 용적의 탈이온수(DI)로 희석된다. 이는 저장성 용해에 의해 무혈장 혈액 세포의 파열을 초래할 수 있다. 세포는 물의 급속 흡수에 의해 파열된다. 적혈 세포는 약 30초 후에 용해될 수 있고, 반면 WBC는 더욱 저항성이 있다. RBC는 RBC가 용해되도록 한 후, 단 WBC가 용해를 시작하기 전에 수집하고, 부가적 용적의 9% 염수 용액을 첨가하여 전용적으로 0.9% 염수 함량의 총 농도에 도달하도록 한다. 염분의 시한 증가는 WBC의 용해를 방지한다. 기질 및 WBC는 여과에 의해 용해된 RBC로부터 제거된다. 헤모글로빈은 여과액으로서 0.22 μm 필터에 의해 제거될 수 있고, 한편 농축액(retentate)은 기질, 적혈 세포 막 및 비용해 WBC를 농축할 것이다. 도 2는 5분 이하 동안 WBC 용해의 저항성을 보여주는 용해 실험의 경시 과정을 보여준다. 적혈구 용해는 상당한 백혈구 용해가 일어나기 전에 2분 동안 중지될 수 있다.

적혈구 용해의 다른 방법, 예컨대 "저속 저장성 용해" 또는 "냉동 해동"도 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chan et al., J. Cell. Physiol. 85:47-57 (1975)](이는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)을 참조한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포는 등장성 염수 내 적혈 세포를 12 용적의 무내독소 탈이온수와 유동 혼합하고, 세포를 완만히 교반함으로써 용해된다. RBC를 용해하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이도 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 이해한다.

4. 단계 103. 헤모글로빈으로부터의 기질 분리

적혈구의 함량은 순수 헤모글로빈 중 약 98.5%이고, 탄산탈수효소를 포함하는 다른 단백질이 소량으로 있다. 적혈 세포의 막을 고스트(ghost) 또는 기질로 칭하고, 모든 혈액형 항원을 함유한다. Rabiner 등은 용혈된 적혈 세포의 독성 성질 중 일부가 적혈 세포의 막(기질) 및 이의 연관 지질과 관련됨을 처음으로 입증하였다(Rabiner et al., J. Exp. Med. 126:1127 (1967); 전체 내용이 본원에 참조 인용됨). 막은 냉동에 의해 파괴될 수 있어, 혈액에 대한 저장 요건은 기후 조절 냉장을 필요로 할 수 있다. 또한, 혈액 수혈을 통해 전달되는 많은 인간 바이러스성 질병들이 적혈 세포의 기질에 부착될 수 있다. 따라서, 무기질 헤모글로빈("SFH")은 적혈 세포의 세포 막의 면역원성 성질, 예컨대 염증, 응집, 응고, 면역 매개 보체 반응, 혈소판 활성화 등, 및 바이러스성 오염 가능성의 측면에서 유익할 수 있다.

효과적인 무기질 헤모글로빈 혈액 대용물 또는 산소 전달 요법은 종래 혈액 기재 요법에 비해 수가지 이점들을 제공할 수 있다. 유의적으로, 무기질 헤모글로빈 혈액 대용물의 사용으로, 원하지 않는 면역 반응의 정도 및 심각도, 및 간염 및 HIV를 포함한 바이러스성 질병들의 전파 위험을 감소시킬 수 있다. 또한, 적혈구의 제한된 저장 용량과 대조적으로, 무기질 헤모글로빈 혈액 대용물 또는 산소 전달 치료제는 연장된 반감기를 나타내고 덜 엄격한 환경 조절 저장 설비를 필요로 할 수 있다.

기질은 세포 성분을 보유하고 헤모글로빈을 통과시키는 0.65 마이크론 필터를 통한 용혈물의 한외여과에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 세포 파편(debris)은 0.22 마이크론 필터 또는 300,000 달톤 분자량 필터를 통한 후속 여과에 의해 제거될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 한외여과 막은 예를 들어 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)으로부터 상업적으로 입수가능하다. 침강, 석출(Tye, 미국 특허 제4,529,719호), 원심분리 또는 마이크로여과를 포함한, 용해된 RBC 상으로부터 Hb를 분리하는 다른 방법도 이용할 수 있다. 기질을 제거하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이도 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 이해된다.

탄산탈수효소. 탄산탈수효소는 일단 적혈 세포 막이 용해되었으면 투석여과를 통해 제거될 것이며, 이는 본 방법에서 수가지 시점에서 이용된다. 예를 들어, 투석여과 및 완충액 교환이 가교 전, 중 및 후에 일어난다. 탄산탈수효소의 존재는 ELISA에 의해 정량화될 수 있다.

10 ml의 스피닝한 샘플의 현미경관찰 분석은 어떠한 세포 파편도 나타내지 않는다.

인지질 수준 감소. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈에 대한 또 다른 핵심 요소는 존재하는 인지질의 낮은 수준이다. 인지질은 헤모글로빈의 공급원인 적혈 세포의 표면 지질층으로부터 유래된다. 상기 제시된 가공 단계는 원하지 않는 지질을 제거하고, 이에 따라 그것의 존재와 관련된 문제들을 없앤다. 인지질 검정은 당업계에 공지된 바와 같은 HPLC 및/또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 포스파티딜콜린은 검출 한도 미만인 것으로 나타난다.

헤모글로빈의 14% 용액으로의 농축. 상기와 같은 처리 후, 무기질 용혈물을 헤모글로빈의 통과를 허용하지 않는 막에 의해 농축한다. 바람직하게, 무기질 용혈물을 10,000 MW 컷-오프(cut-off)를 갖는 필터를 이용하여 농축한다. 바람직하게, 무기질 용혈물을 1% 내지 25%(g/l) 용액으로 농축한다. 더욱 바람직하게는, 무기질 용혈물을 약 5% 내지 약 20%로 농축한다. 가장 바람직하게는, 무기질 용혈물을 약 6% 내지 약10%로 농축한다. 농축된 용액은 완충액과 평형화될 수 있고, pH가 조정된다. 바람직하게, pH는 7.40의 pH로 조정된다. 약 6.5 내지 약 8.5의 pH가 본 발명에 사용될 수 있다.

임의적으로, 이어서 농축된 Hb 용액은 하나 이상의 병렬 크로마토그래피 칼럼으로 보내어져, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해, 항체, 내독소, 인지질 및 효소, 및 바이러스와 같은 다른 오염물질로부터 헤모글로빈을 추가로 분리할 수 있다. 적당한 매질의 예에는 음이온 교환 매질, 양이온 교환 매질, 소수성 상호작용 매질 및 친화도 매질이 포함된다. 크로마토그래피 칼럼은 비-헤모글로빈 단백질로부터 Hb 를 분리하는 데 적당한 음이온 교환 매질을 함유할 수 있다. 적당한 음이온 교환 매질에는 예를 들어 양이온성 화학적 작용기, 예컨대 디에틸아미노에틸 또는 4급 아미노에틸 기로 유도체화된, 실리카, 알루미나, 티타늄 겔, 가교 덱스트란, 아가로스 또는 유도체화 부분, 예컨대 폴리아크릴아미드, 폴리히드록시에틸-메타크릴레이트 또는 스티렌 디비닐벤젠이 포함된다. 용해된 RBC상 내에 있기 쉬운 다른 단백질 및 오염물질에 비해, 적당한 음이온 교환 매질 및 Hb의 선택적 흡수 및 탈착을 위한 상응 용출액은 당업계의 합당한 기술을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

포스페이트 이온의 제거. Bucci et al.(미국 특허 제5,290,919호)은 유기 인산염, 예를 들어 2,3-디포스포글리세레이트의 제거가, 가교 반응의 부위가 헤모글로빈 내 2,3-디포스포글리세레이트가 차지하는 부위와 동일하기 때문에 인간 용혈물에 필요할 수 있다고 보고하였다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 무기질 인간 Hb 용액은 무기 인산염을 실질적으로 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 필터를 통과한 무기질 인간 Hb(가교 전)는 이어서 포스페이트를 클로라이드로 교환하기 위해 처리될 수 있다. 이 목적을 위해, 무기질 인간 Hb는 미리 제조되어 클로라이드와 평형화된 이온 교환 칼럼을 통해, 산소의 부재 또는 존재 하에 통과될 수 있다. 이 단계의 효능은 총 무기 포스페이트 분석에 의해 측정될 수 있다. 적당한 이온성 수지는 상업적으로 입수가능하고, 이는 본 발명의 범주 내에 속한다. 이온성 수지는 DBSF와의 반응 중에 아스피린이 결합하는 부위에 대해 경쟁할 수 있는 포스페이트를 제거한다. 이어서, 용액을 원하는 범위로 농축할 수 있다. 이 작업은 소 Hb를 이용할 때에는 필요하지 않다.

5. 단계 104. 산소의 제거

티올-차단된 무기질 Hb, 또는 보다 구체적으로는 CMSFH는 조제물 내 존재하는 산소를 제거하는 데 충분한 조건 하에 처리될 수 있다. 본 발명의 한 측면은 CMSFH 조제물로부터 산소를 제거하기 위한 향상된 공정에 관한 것이다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 그러한 탈산소화는 본원에 개시된 단계들 중 임의의 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 탈산소화 단계는 기질 제거 단계, 내독소 제거 단계, 티올 보호 단계, 포스페이트 제거 단계, RBC 용해 단계 또는 헤모글로빈의 가교 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 그러한 탈산소화는 본 발명의 헤모글로빈의 시스테인 부분 내의 티올 기의 보호 전에 수행된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 탈산소화는 헤모글로빈의 가교 전에 수행된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 방법의 단계는 완료를 위해 더 많은 시간을 필요로 할 수 있다. 그러한 경우, 탈산소화된 조건이 바람직할 수 있다.

탈산소화 정도는 기체 크로마토그래프, 지르코늄-기재 검출기(예를 들어, "MOCON" 분석기(모콘(Mocon), 미국 미네소타주 미네폴리스 소재)에 의해서나, pO₂를 측정함으로써, 또는 데옥시헤모글로빈 형성의 특징인 분광 이동을 측정함으로써 측정될 수 있다.

헤모글로빈 내 산소는 진공 또는 진공 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 사용된 CMSFH는 헤모글로빈을 대략 10%(w/v)로 농축하는 데 수행되는 2단계 한외여과의 한외여과로부터의 기질(희석액) 또는 농축액의 제거로 수득된 한외여과액일 수 있다. 수득된 CMSFH의 상기 용액 중 임의의 것은 용액의 온도에서 물의 분압과 동등하기에 충분한 진공을 걸어줌으로써 용이하게 탈산소화될 수 있고, 한편 용액은 용액의 표면 장력보다 큰 힘을 생성하는 데 충분한 속도로 원심분리될 수 있다. 이는 일반적으로 낮은 속도이고, 예비 원심분리 또는 연속 유동 변형법들 중 하나가 충족될 수 있다. 기체 교환을 위해 적당한 표면적이 있을 수 있음과 온도가 유지될 수 있고 용액이 냉동되지 않게 됨을 보증하기 위해, CMSFH의 용기의 기하학을 고려하는 것이 바람직할 수 있다.

Hb 용액으로부터 O₂를 제거하기 위해 접촉기 막 기술이 사용될 수 있다. 접촉기 막 기술은 또한 산소 기체가 질소 기체대신에 사용될 수 있는 산소화를 위해 사용될 수 있다. 그러한 막 중 3개 또는 4개가 보다 높은 산출량을 위해 직렬 부착될 수 있고, 탈산소화 또는 산소화된 헤모글로빈 용액의 상업적 생산을 위해 사용될 수 있다. Hb 농도는 용해된 O₂ 제거 속도에 영향을 미친다. Hb 농도가 저하됨에 따라, O₂ 제거 속도가 증가한다. 실험은 O₂ 농도를 <100 ppb로 저하시키지 않을 수 있다. 그러나, 시스템 기체가 꽉 차도록 하기 위해 혐기성 글로브 박스에서 시험을 수행할 수 있다. 글로브 박스는 환경을 매우 낮은 O₂ 수준(<5 ppb)으로 유지시킬 수 있다. 이 글로브 박스 환경은 O₂가 Hb에 의해 재흡수될 수 없음을 확실히 하는 데 필요한 O₂ 장벽을 제공할 수 있다. 28.5"(<50 mm Hg)보다 큰 Hg 진공이 최적 O₂ 제거를 위해 사용될 수 있다.

상기 기재된 방식으로 제조된 탈산소화, 무내독소, 무기질의 카르복사미도메틸화된 Hb(dCMSFH)는 바람직하게 불활성 환경 하에 유지될 수 있고, 조제물의 pH는 바람직하게 6.0 내지 9.5 범위, 가장 바람직하게는 약 pH 8.3 내지 8.4로 조정될 수 있다. 용액의 pH는 1.0 N 아세트산 또는 1.0 N NaOH를 이용하여 조정될 수 있다. 다른 목적을 위해 희석, 현탁 또는 물(완충액 등 포함)의 첨가가 요망되는 경우, 그러한 물은 탈산소화되고 내독소를 포함하지 않을 수 있다. 모든 후속 단계들은 어떠한 수단이 요망되든지 간에 유지되게 되는 산소의 부재 하에 수행될 수 있다. 상기한 바와 같이, 바람직한 방법은 질소 양성 압력 환경 글로브 박스의 사용을 수반하나, 다른 불활성 기체(예를 들어, 아르곤)를 질소 대신에 균등하게 이용할 수 있다.

6. 단계 105. 헤모글로빈의 시스테인(들)의 설프히드릴의 보호

헤모글로빈의 시스테인을 티올 보호기로 보호하는 단계는 가교 단계 전 또는 가교 단계 후에 수행될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 시스테인 부분 내 티올 기의 보호 단계는 가교 단계 전에 수행된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 헤모글로빈의 탈산소화 단계는 시스테인 부분 내 티올기의 보호 단계 전에 수행된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 탈산소화는 헤모글로빈 내 설프히드릴 기를 보호하기 전에 수행되지 않는다. 작용성 기, 예컨대 비제한적 예로서 히드록실, 티올 또는 카르복실을 보호하기 위한 당업계에 공지된 모든 시약들이 본 발명에 포함된다.

시약의 예 중 일부에는 4-피리딜메틸 클로라이드, 알콕시알킬클로라이드, 디메톡시메탄, N-(히드록시메틸)아세트아미드, 트리페닐메틸 클로라이드, 아세틸 클로라이드, 2-클로로아세트산, 아세트산 무수물, 할로아세트아미드, 예컨대 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 클로로아세트아미드 또는 플루오로아세트아미드, 할로아세테이트, 예컨대 요오도아세테이트, 브로모아세테이트, 클로로아세테이트 또는 플루오로아세테이트, 벤질 클로라이드, 벤조일 클로라이드, 디-tert-부틸 디카르보네이트, p-히드록시펜아실 브로마이드, p-아세톡시벤질 클로라이드, p-메톡시벤질 클로라이드, 2,4-디니트로페닐 플루오라이드, 테트라히드로피란, 아세트아미도히드록시메탄, 아세톤, 비스-카르보에톡시에텐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드, tert-부톡시카르보닐 클로라이드, 알킬 이소시아네이트 및 알콕시알킬 이소시아네이트가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 설프히드릴 보호 헤모글로빈의 한 구체예에서, 시약은 요오도아세트아미드이다. 당업계에 공지된 임의의 시약이 카르복사미도메틸화를 위해 사용될 수 있는 것으로 이해한다.

요오도아세트아미드(IAM)와의 반응의 최적화. 요오도아세트아미드 반응에는 요오드화물 특정 전극으로 행해지는데, 그 이유는 부산물 중 하나가 요오드화물 이온이기 때문이다. 설프히드릴 기 당량 당 2몰 과량이 사용될 수 있다. 표 2는 소 Hb에 대한 요오도아세트아미드 반응의 경시 과정 대 IAM 반응에 사용된 IAM 시약의 몰의 그리드(grid)를 나타낸다. 결과는 Hb의 몰 당 유리 설프히드릴의 양을 보여주고, 소 Hb에 대한 몰 당량의 단위로 표시된다.

소 Hb의 IAM와의 반응. 결과는 잔존 유리 설프히드릴의 당량으로 표시됨.

시간		0	15	30	45	60	75	90	120
	몰 IAM
	2	2	1.0	0.5	0.5
	4					0.5	0.2	0.1	<0.1

7. 단계 106. 반응물로부터의 티올-보호 헤모글로빈의 분리

반응이 완료된 후, 관찰한 요오드화물 진화 속도에 의해 결정되는 바, 과량의 IAM는 링커 아세트산염을 이용한 평형화 및 투석여과에 의해 제거된다.

8. 단계 107. DBSF와의 가교 및 PLP와의 반응

무기질 Hb는 분자내 가교에 의해 α,β 이량체로 해리되는 것이 방지될 수 있어, 사량체의 α,β 이량체로의 해리를 방지하고 그것의 순환 반감기를 증가시킨다. 이는 Hb를 T 상태로 제한하고, 결과적으로 산소에 대한 친화도를 변형시킬 수 있고, 이에 따라 Hb의 산소 수송 성질을 변형시킬 수 있다.

적당한 가교제의 예에는 무엇보다 Hb 단백질을 가교할 다작용제, 예컨대 글루타르알데히드, 숙신디알데히드, 활성화된 형태의 폴리옥시에틸렌 및 덱스트란, α-히드록시 알데히드, 예컨대 글리콜알데히드, N-말레이미도-6-아미노카프로일-(2'-니트로,4'-술폰산)-페닐 에스테르, m-말레이미도벤조산-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 술폰숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르, N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트, 술포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트, 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트, 술포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드, N,N'-페닐렌 디말레이미드, 및 비스-이미데이트 부류, 아실 디아지드 부류 또는 아릴 이할로겐화물 부류에 속하는 화합물이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 당류가 가교제로 사용될 수 있다. 당류의 예에는 단당류(갈락토스, 글루코스, 메틸글루코피라노시드 및 만니톨), 이당류(락토스, 말토스, 셀로비오스, 수크로스 및 트레할로스), 삼당류(라피노스) 및 다당류(분자량이 15,000 및 71,000 Da인 덱스트란)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.

헤모글로빈의 가교는 산소의 부재 하에 수행될 수 있다. 헤모글로빈 분자에 단단히 결합하여 가교 반응을 간섭하는 무기 포스페이트를 제거하여, 수율을 증가시킬 수 있다. 헤모글로빈이 대사될 때, 헤모글로빈 분자에 단단히 결합하여 간 독소가 되는 내독소가 헤모글로빈과 접촉하게 되지 않을 수 있다.

가교제의 적당량은, Hb를 안정화하기 위한 분자내 가교 및 Hb의 중합체를 형성하기 위한 분자간 가교를 허용함으로써, 혈관내 체류(retention)를 증가시킬 수 있는 양일 수 있다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서, 바람직한 분자량 분포 및 산소 결합 성질을 갖는 Hb를 가교하기 위해 각종 전략을 이용할 수 있다. 가교제 및 켄칭제 모두의 유형 및 농도, 가교/중합 반응 시간, 및 환원제의 이용은 모두 분자량 분포, 산소 결합 성질 및 가교 Hb 분산액의 metHb 수준을 조작하기 위해 상기 반응들에서 변형될 수 있는 가능한 변수이다.

pH 조절 및 과다 가교제를 이용한 가교의 최적화. 표 3은 2시간에 걸친 가교제(DBSF)의 몰비 대 pH를 증가시키는 그리드를 나타낸다. 결과는 상이한 pH에서 미반응으로 남은 알파 사슬의 백분율, 및 2시간 기간 종료 시의 DBSF의 당량(몰)을 나타낸다. pH는 NaOH와의 반응에 의해 생성된 산의 적정으로 일정하게 유지된다. 2시간 후, 산의 생성이 오래 전에 중단되었다. 가교의 결과는 잔류 비가교 알파 사슬을 찾으면서 겔 전기영동 분리를 이용하여 결정된다. 2 당량의 DBSF를 사용한, 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈의 생성을 위한 표준 방법에서, 98% 가교 초과가 달성된다.

pH 대 DBSF 몰비. 잔류 비가교 헤모글로빈의 백분율.

	pH	7	7.5	8	8.2	8.4
당량 DBSF
1						21%
1.2						19%
1.5						3%
2.0		38%	11%	2.5%	1.7%	1.5%
2.5						1.7%

본 발명의 일부 실시양태에서, dCMSFH는 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트(DBSF)와 가교된다(Tye, 미국 특허 제4,529,719호(이는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)). DBSF 가교제:dCMSFH의 몰비가 1:1 초과인 dCMSFH 조제물에 DBSF 가교제를 교반 하에 첨가할 수 있다. 바람직하게, DBSF 가교제:dCMSFH의 몰비는 2:1이다. 그러한 첨가 전에, dCMSFH 조제물의 pH는 8.4로 조정되어, 반응 전반에 걸쳐 8.4에서 유지된다. 반응 혼합물의 pH는, 용액이 완충되지 않기 때문에, 산 또는 염기의 첨가에 의해 조심스레 유지된다. 반응이 완료에 도달하도록 허용된다.

SDS 겔 전기영동을 이용한 가교 정도의 측정. SDS는 중성 pH에서 카르복실 기의 음성 변화에 의해 포괄되는 긴 막대를 형성하도록 단백질을 변성시킬 수 있다. 이어서, 단백질을, SDS에 의한 매니폴드 과량의 음성 전하가 네이티브 단백질의 전하 이원성을 작게 할 수 있으므로, 전기영동을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 베크만 코울터 PA-800

은 펩티드 결합에 대해 216 nm에서의 흡광도를 이용함으로써 겔 전기영동의 급속 기록을 제공한다. 도 3에 나와 있는 바와 같이, 관심 분자량 범위, 본 경우에는 10 KDa 내지 100 KDa 범위에 대한 칼럼을 적정하기 위해, 표준 단백질 혼합물을 사용할 수 있다.

SDS 겔 전기영동에서 수행되는(run) 네이티브 헤모글로빈은 2개의 피크를 제공할 수 있고, 그 피크 사이에는 거의 기준선 분리가 있다. 첫 번째 피크는 헤모글로빈의 알파 사슬인 것으로 나타났고, 두 번째는 헤모글로빈의 베타 사슬인 것으로 나타났다. 그것들은, 그 사슬들이 분자 내에 동일한 수로 있기 때문에, 거의 동등한 양으로 일어난다. 이는 도 4a에 도시되어 있고, 이 도면은 도 4b에 나와 있는 중첩된 전기영동도의 확대도이다. 네이티브 헤모글로빈은 파선 추적으로 나타나고(rt13.98 및 rt14.14), 본 발명에 따른 가교 헤모글로빈(dXCMSFH)은 실선 추적으로 나타나고, 크기 표준 분리는 점선 추적으로 나타난다. 도 4a에 나와 있는 중첩된 전기영동도는 용이하게 보도록 하기 위해 약간 파생되어 있다(offset). 도시된 확대된 영역은 네이티브 헤모글로빈의 2개의 알파 및 베타 서브유닛에 대한 관심 영역인 20 KDa 크기 표준 부위에 군집되어 있다. 가교된 물질에 대해 여기에 나와 있는 실험은, 알파 사슬의 대부분이 이미 가교되었으나, 유의량의 베타 사슬은 여전히 미반응으로 남아 있을 때, 공정 내 중간 지점에서 취해진다.

도 4b에서, 전폭 전기영동도의 중첩이 나와 있고, 이 역시 파선 추적으로서 네이티브 헤모글로빈, 실선 추적으로서 가교 실험, 및 점선 추적으로서 크기 표준물질 분리로 되어 있다. 2개의 알파 사슬의 푸마릴 가교는 한 쌍의 펩티드가 함께 구속되도록 하고, 이에 따라 미반응 베타 사슬보다 더 후기의 용출 시간에 나타나게 된다. 약 36,000 내지 45,000 KDA의 보다 높은 분자량에서의 일련의 3개의 새 주요 생성물 피크가 16 내지 17분의 rt에서 도 4b에 나와 있다. 크기 표준이 모두 단일 펩티드 사슬이고 이 반응의 이량체화 생성물에 대한 정량화를 위해 연장될 수 없기 때문에, 생성물 피크가 정량화될 수 없다. 그러나, 3개의 보다 큰 분자량 생성물이 형성되고 있는 것으로 볼 수 있다.

α-α 가교에 부가하여 β-β 가교의 형성이 있다. 소량의 90,000 kDa의 물질이 있고, 이는 보다 적은 수의 분자간 가교의 형성을 가리킬 수 있다.

인간 Hb의 PLP와의 반응. 피리독살-5-포스페이트(PLP)는 많은 헤모글로빈을 변형시키는 능력을 가진다. 인간 헤모글로빈으로부터의 dXCMSFH의 성질이 피리독살-5-포스페이트 반응으로부터 유익할지라도, 소 헤모글로빈으로부터의 dXCMSFH는 이 단계를 필요로 하지 않는다. PLP는 끝에서 두 번째의 β 사슬 히스티딘 잔기 부근에 음 전하를 도입함으로써, 또한 동일한 사슬의 아미노 말단 부분에서 양 전하를 제거함으로써 인간 헤모글로빈을 변형시킨다. 이 전하 변화는 헤모글로빈-DPG(디포스포글리세레이트) 착체와 유사한 새로운 분자 입체배치를 안정화한다. 유의적으로, 이 새로운 입체배치의 헤모글로빈은 적혈 세포 내 네이티브 헤모글로빈의 산소 친화도와 유사한 산소 친화도를 가진다. 생성물은 사량체 당 부착된 1개 또는 2개의 PLP 분자를 가질 수 있다. 이전 PLP-헤모글로빈 조제물에서는, 혈관내 체류 시간이 너무 짧아 그러한 조제물은 소생 체액으로서 허용가능하도록 하지 않았다. 또한, 이들은 삼투압 이뇨를 유발하는 것으로 나타났다.

따라서, 가교 반응이 완료된 후, 인간 Hb을 이용할 경우, 피리독살-5-포스페이트(PLP)를 탈산소화, 무내독소, 무기질의 카르복사미도메틸화된 가교 인간 Hb(dXCMSFH) 조제물에 첨가한다. PLP는 dXCMSFH와 반응한 후, 수소화붕소나트륨으로 환원되어, Benesch 등에 의해 기재된 방법(Benesch et al., Biochemistry 11:3576 (1972) 및 이 문헌내 참조문헌; Benesch et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 70 (9):2595-9 (1974); Benesch et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 63(4):1123-9 (1975); Benesch et al., Methods Enzymol. 76:147-59 (1981); Benesch et al., J. Biol. Chem. 257(3):13204 (1982); 및 Schnackerz et al., J. Biol. Chem. 258(2):872-5(1983)(이들 모두 전체 내용이 본원에 참조 인용됨))으로서, 다만 모든 시약이 내독소 및 산소를 포함하지 않고 반응이 산소의 부재 하에 일어난다는 변화를 가한 방법을 이용하여, dXCMSFH-피리독살-5'-포스페이트(dXCMSFH-PLP)를 형성한다. 이 처리는 소 Hb를 이용할 때 필요하지 않다.

잔류하는 비가교 헤모글로빈의 측정. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여, 총 가교 Hb의 백분율, 가교 사량체의 백분율, 또는 가교 고차원종의 Hb/폴리Hb 분산액의 백분율을 결정할 수 있다. 염, 예컨대 MgCl₂은 임의의 비가교 사량체성 Hb를 α-β 이량체로 해리시면서, 한편 가교 사량체성 Hb는 비변형 상태로 남도록 작용할 수 있다. 이에 따라, 비가교 Hb는 분자내 가교 Hb로부터 분리된 피크로 용출될 수 있다.

다른 방식으로라면 헤모글로빈 2차 구조를 변성시키지 않을 조건 하에서 완충액으로서 0.5 M MgCl₂ 용액을 사용하는, 반응 혼합물의 바이오래드 바이오-실(Biorad Bio-Sil)

SEC-12.5-5 칼럼 상의 크기 배제 HPLC를 이용하여, 미반응 물질의 양을 조사할 수 있는데, 이는 상기 조건 하에서, 평형상태가 32 KDa의 분자량을 갖는 알파베타 이량체에 우세하게 되며, 이는 이 실험에서의 임의의 피크에 대해 보여지는 것보다 더 큰 체류 시간에서 예상될 것이기 때문이다. 도 5에서 보여지는 바와 같이, HPLC 추적은 64 KDa에서 주요 피크를 나타내고 128 KDa에서 비주요 피크를 나타낸다. 후기 용출 시간에는 물질이 없고, 이에 따라 보다 적은 분자량을 갖는 물질이 없다. 이 실험은 미반응 헤모글로빈의 완전 부재를 입증하고, 물질의 대부분이 64 KDa의 분자량을 갖는 Hb의 안정화된 사량체임을 설명한다.

9. 단계 108. 평형화에 의한 헤모글로빈 용액의 제조

탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 투석 여과의 조건 하에 과량의 DBSF 및 반응의 부산물, 예를 들어 디브로모살리실산을 제거하는 링커 락테이트 또는 링커 락테이트 용액과 평형화될 수 있다. 바람직하게, 임의의 이온 제거 또는 완충액 평형화는 후속 생산물 내 내독소의 축적을 방지하기 위해 역류 투석을 이용하여 수행될 수 있다. 평형화 후, 용액은 적당한 주입 용기 내로 무균 여과될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 주입 용기에는 무균 IV 백이 포함될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 바람직한 주입 용기는 기체 교환을 방지할 수 있고(즉, 산소에 대해 불투과성임), dXCMSFH는 산소의 부재 하에 저장될 수 있다. 이는 메트헤모글로빈을 형성하는 헴 산화를 방지하는 것으로 예상된다.

변형된 헤모글로빈에 의한 산소에 대한 친화도의 측정 . 헤모글로빈은 시스템 내 산소의 분압의 함수로서 생리학적 조건 하에 산소에 결합하고 방출하는 능력을 가진다. 본 발명의 헤모글로빈 유도체의 산소 친화도는, 헤목스-분석기(Hemox-Analyzer)(TCS 코포레이션(TCS Corporation)에 의해 제조됨) 또는 문헌(Dolman et al., Anal. Biochem. 87:127 (1978); 이는 전체 내용이 본원에 참조 인용됨)에 기재된 아가미 세포를 이용하여 측정될 수 있다.

헤목스-분석기(TCS 코포레이션에 의해 제조됨)는 헤모글로빈 산소 해리 곡선을 결정하도록 한다. 헤모글로빈 산소 해리 곡선은, 수행하기 재현가능하고, 정확하며, 용이할 수 있다. 헤모글로빈 산소 해리 곡선은 pH, 온도, CO₂ 농도, 헤모글로빈의 종, 인간 헤모글로빈의 변이체, 용혈된 헤모글로빈 등의 변화에 의해 변경될 수 있다. 곡선의 모양 및 X 축에 따르는 곡선의 이동은 헤모글로빈의 산소의 부하 및 비부하 능력을 나타낼 수 있다. 정보는 그것이 생체내 기능의 시험관내 시험이기 때문에, 혈액 및 변형된 헤모글로빈의 연구에 유용할 수 있다. 그것은 헤모글로빈의 산소 부하 및 비부하 능력을 측정할 수 있다. 전체 헤모글로빈 해리 곡선에 대한 간단한 설명은, 헤모글로빈이 산소로 반포화되도록 유발할 수 있는, Hg의 mm로 나타내는 산소의 분압인 O₂에 대한 p50으로 표시될 수 있다.

헤모글로빈에 대한 화학적 변형 또는 헤모글로빈에 대한 유전적 변이체는 p50가 감소되도록 유발할 수 있고, 즉 산소가 임의의 주어진 산소 압력에서 더욱 단단히 결합하도록 할 수 있다. 생체내에서 이는 관류된 조직으로의 보다 적은 산소를 의미한다.

헤목스-분석기는 동맥(산소화됨, 적색) 및 정맥(덜 산소화됨, 청색)인 혈액(헤모글로빈)의 색 변화 및 산소 전극에 의존한다. 작은 희석 샘플이, 정제된 기체가 교반 용액을 통해 천천히 버블링되도록 하는 바닥에 작은 오리피스를 갖고, 또한 산소 전극이 장착된 특수 분광광도측정 세포에서 제조된다. 전체 세포는 37℃로 정확히 온도 조절되어, 신체 온도로 평형화된다. 분광광도계 및 산소 전극의 산출량을 분석하고, 플로팅한다. 플롯 개시 시에, 산소 포화도가 공기 중 산소의 분율(21%)을 초과할 때까지 순수 산소를 샘플을 통해 버블링함으로써 샘플을 완전 산소화하고, 이어서 기체 버블러를 질소로 바꾸어, 산소 제거를 개시한다. 이에 따라 산소 평형 곡선이 생성될 수 있다.

RBC 중 인간 헤모글로빈에 대한 p50은 약 28일 수 있다. RBC가 산소 친화도를 감소시키기 위해 적혈 세포 내 염 다리를 형성하게 되는 2,3-DPG로부터 분리될 때, p50은 약 14로 떨어진다. 소 헤모글로빈에 대한 p50은 적혈 세포 또는 유리 용액 중 어느 곳에서도 pH 및 CO₂ 의 농도에 따라 약 25 내지 약 40이다. 도 6은 본 발명의 소 전혈, 무기질 Hb, 가교 dXCMSFH 및 신선한 인간 혈액에 대한 산소 친화도 곡선을 나타낸다. 가교 헤모글로빈에서, 가교는 헤모글로빈을 긴장 상태로 구속하고, 이에 따라 시그모이드형 곡선을 소실한다. 보다 낮은 pO₂에서, O₂가 조직에 전달될 때, 가교 헤모글로빈은 소 전혈, 무기질 Hb 및 신선한 인간 혈액에 비해 더 많은 산소를 전달한다. 가교 헤모글로빈의 p50은 인간 헤모글로빈 및 소 헤모글로빈의 p50보다 더 크다. 소 전혈에 대한 p50 값은 24.73 mm Hg이고, 무기질 Hb에 대한 p50 값은 21.20 mm Hg이며, 신선한 인간 혈액에 대한 p50 값은 23.72 mm Hg이고, dXCMSFH에 대한 p50 값은 32.43 mm Hg인데, 이는 인간 RBC의 p50 값보다 유의적으로 더 크다. 그러므로, 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 XCMSFH는 헤모글로빈의 그램 당, 산소의 전달에 대한 더 큰 효율을 입증할 수 있다. 본원에 측정되는 바와 같은 상기 수들이 문헌 값과 동일하지 않더라도(즉, 본원에 보고된 23.72 mm Hg에 비해, 인간 혈액 p50 문헌 값은 27 mm Hg임), 본 값은 산소 오프로딩 성능의 좋은 상대 척도이다.

본 발명의 탈산소화, 무내독소, 무기질의 카르복사미도메틸화된 가교 Hb (dXCMSFH)는 긴장 또는 T 상태로 구속되고 정상 인간 적혈 세포 내 헤모글로빈과 유사한 p50을 가지거나, 도 6에 나와 있는 바와 같이 더 높은, 소 헤모글로빈의 안정화된 사량체이다. 따라서, 동등량의 인간 적혈 세포로부터의 헤모글로빈 및 dXCMSFH로부터의 헤모글로빈은 폐를 이탈하는 동일량의 산소를 운반할 수 있다. 그러나, dXCMSFH는 도 6에 나와 있는 데이터에 기초하여, 그것의 정맥 복귀 전에 약간 더 많은 산소를 전달할 수 있다.

III. 분석

1. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈의 물리적 특성

본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 헤모글로빈은 약 65 kDa의 분자량 분포, 20 내지 45 mm Hg의 p50, 290 내지 310 mOsm/Kg의 오스몰 농도를 갖고, 10 내지 22℃에서의 pH가 6.0 내지 7.9이다. 본 발명의 변형된 헤모글로빈은 6.0 내지 20 g/dL의 총 헤모글로빈을 가지고, 메트헤모글로빈 수준은 5% 이하이고, 옥시헤모글로빈 수준은 10% 이하이다. 본 발명의 변형된 헤모글로빈은 0.02 EU/ml 이하의 내독소 수준, 검출 한도 미만의 포스파티딜콜린 수준을 가지고, 무균성 및 외래 유기물의 낮은 수준을 충족한다. 본 발명의 변형된 헤모글로빈은 125 내지 160 mmol/l의 나트륨 이온 수준, 3.5 내지 5.5 mmol/l의 칼륨 이온 수준, 105 내지 120 mmol/l의 클로라이드 이온 수준, 및 0.5 내지 1.5 mmol/l의 칼슘 수준을 가진다. 본 발명의 변형된 헤모글로빈은 0.22% 이하의 N-아세틸 시스테인 수준을 가진다.

2. 분석 방법

물리화학 분석

특히 본원에 개시된 바와 같은 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb 및 dXCMSFH는 그것의 제조 공정의 임의의 단계에서 분석될 수 있다. 헤모글로빈은 예를 들어, 단 비제한적 예로서 기질 제거 후, 내독소 제거 후, 용해 후, 산소 제거 후, 시스테인 부분 내 티올 기 보호 후, 또는 가교 후 등의 시점에서 분석될 수 있다. 헤모글로빈은 순도, 흡광도, 구조, p50, 산화질소 결합 용량, 백혈 세포(WBC) 계수, 헤모글로빈 용액 내 미생물 성장, 가교, 아미노산 분석, 단백질 분석 또는 냉장 또는 저장 효과에 대해 분석할 수 있다. 각종 분석 기법들이 당업계에 공지되어 있고, 이는 모두 본 발명의 범주 내에 속한다. 분석 기법의 예의 일부가 본원에 개시되어 있으나, 본 발명의 범주에 제한되지 않는다.

A. 질량분석법(MS). 광범위한 분석을 허용하는 질량 분석계 및 샘플 도입 기법이 있고, 이들 모두는 본원에 포함된다. 본 발명의 일부 바람직한 실시양태에서, 사용된 기법은 질량분석법이다. 질량 분석계는 3가지 구분된 영역들로 구성될 수 있다: 이온화장치, 이온 분석기 및 검출기 이온화. 이온화 방법에는 전자 충격(EI), 화학적 이온화(CI), 전기분무(ESI), 고속 원자 충격(FAB) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착(MALDI)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 분석기에는 사중극자, 섹터(자기성 및/또는 정전성), 비행 시간(time-of-flight)(TOF) 및 이온 사이클로트론 공명(ICR)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 기타 관련 기법은 예를 들어 이온 이동도 분석법/질량분석법(IMS/MS), 탄뎀 질량분석법(MS/MS), 오비트랩 질량분석법, FTICR 질량분석법, 단일-단계 또는 이중-단계 리플렉트론(RETOF-MS, TOF-MS를 이용한 사다리 시퀀싱), RETOF-MS MALDI를 이용한 포스트-소스(Post-source) 감쇠, 선형 TOF-MS를 이용한 인-소스(In-source) 감쇠, 및 표면-증진된 레이저 탈착 이온화-비행시간(SELDI-TOF)이다. 질량 분석계에 LC 또는 GC가 결합될 수 있다.

B. UV-Vis. 본 발명의 일부 실시양태에서, 광학 흡수 분광법(UV/VIS)을 사용하여 헤모글로빈에 대한 흡광도 범위를 결정하였다. UV/VIS는 단백질과 같은 거대분자의 농도를 결정하는 역할을 한다. 유기 염료를 사용하여, 흡수를 증진시키고 그것을 가시광 범위로 편이시킬 수 있다(예를 들어, 쿠마씨(Coomassie) 블루 시약). 단백질의 상호 간의 상호작용을 지배하는 힘을 이해하는 것은 거대분자 어셈블리, 샤페론-보조 단백질 폴딩 및 단백질 전좌와 같은 공정을 이해하는 것을 돕는다. 공명 라만 분광법(RRS)은 분자 구조 또는 역학을 연구하는 데 사용될 수 있는 도구이다. 공명 라만 산란은 전자 흡수대 내의 여기를 필요로 하고, 대폭적 산란 증가를 초래한다. 이러한 접근법은 상이한 여기 파장을 이용함으로써 거대분자의 특이적 부분을 조사하는 것을 도울 수 있다.

C. 액체 크로마토그래피(LC). 액체 크로마토그래피는 착체 혼합물로부터 단백질, 펩티드 및 기타 분자를 단리하기 위한 도구이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, LC는 본 발명의 제제에 사용된 헤모글로빈 및 부형제의 분리, 정제 및 분석을 위해 사용되었다. LC의 예에는 친화도 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 다이오드 어레이-LC 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피 HPSEC가 포함된다.

겔 투과 크로마토그래피 및 HPSEC 크로마토그래피는 크기에 기초하여 단백질 및 펩티드를 분리한다. 겔 투과 크로마토그래피는 분자 크기의 분석, 혼합물 내 성분의 분리, 또는 거대분자의 조제물로부터의 염 제거 또는 완충액 교환을 위해 사용될 수 있다.

친화도 크로마토그래피는 생체선택적으로 흡착하고 고정화 리간드로부터 화합물을 후속하여 회수하는 공정이다.

이온 교환 크로마토그래피는 단백질의 전체 전하 간의 차이에 기초하여 분자를 분리한다. 그것은 통상 단백질 정제를 위해 사용되나, 펩티드 또는 기타 하전된 분자의 정제를 위해 사용될 수 있다. 용출은 이온성 상호작용을 해체하기 위해 이온성 강도를 증가시킴으로써, 또는 단백질의 pH를 변화시킴으로써 달성될 수 있다.

HPLC는 본 발명의 헤모글로빈의 분리, 정제 및 검출에 사용될 수 있다. 역상 크로마토그래피(RPC)의 사용은 단백질 구조 결정의 공정에 이용될 수 있다. 이 공정의 정상적 절차는 1) 단백질분해 또는 화학적 절단에 의한 단편화; 2) 정제; 및 3) 시퀀싱일 수 있다. 펩티드의 RPC에 대한 통상적 이동상은 예를 들어 단백질/펩티드가 가용화되도록 하고, 대략 230 내지 240 nmm에서의 검출을 허용하며, 단백질/펩티드로부터 용이하게 제거가능한, 즉 증발에 의해 제거가능한, 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)에서 아세토니트릴과 같은 적당한 유기 용매 내 0.1% TFA로의 구배일 수 있다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 이온-교환 크로마토그래피(IEC)의 사용은 본 발명의 헤모글로빈의 구조를 결정할 때, 이용될 수 있다. 크로마토그래피에 노출한 후의 활성의 전체 회수가 달성될 수 있고, SEC 칼럼은 10 내지 1000 킬로달톤의 분획화를 허용할 수 있다. IEC 칼럼을 이용한 구배 용출의 사용은, SEC에 비해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 증가된 부하 용량과 동등한 해상도로 인해 선호될 수 있다. 액체 친화도 크로마토그래피(LAC)에서, 상호작용은 기질, 수용체 등의 의태(mimicry)로 인한 단백질의 결합에 기초할 수 있다. 단백질은 경쟁적 결합제를 도입하거나 해리를 용이하게 할 수 있는 단백질 입체배치를 변경시킴으로써 용출될 수 있다. HPLC는 MS와 결합될 수 있다.

D. 전기영동. 본 발명의 헤모글로빈의 분석을 위해 전기영동이 사용될 수 있다. 전기영동은 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동일 수 있다.

겔 전기영동. 겔 전기영동은 단백질의 분리를 위해 사용될 수 있는 기법이다. 큰(거대) 분자의 분리는 2가지 힘, 즉 전하 및 질량에 의존할 수 있다. 전기영동 중에, 거대분자는 전류가 인가될 때 세공을 통해 강제 이동하게 된다. 그것의 전기장을 통한 이동 속도는 전기장 강도, 분자의 크기 및 모양, 샘플의 상대적 소수도, 및 분자가 이동하는 완충액의 이온성 강도 및 온도에 의존한다. 이 기술을 이용하여, 단일 아미노산만큼 적은 정도의 차이가 있는 단백질 분자를 분리하고 확인하는 것이 가능하다. 또한, 겔 전기영동은 등전점 및 대략적 분자량과 같은 단백질의 중대한 성질을 결정하도록 한다. 전기포커싱 또는 등전 포커싱은, 주변의 pH가 변화함에 따라 분자의 전하가 변화하는 사실을 이용하여, 상이한 분자들을 그것들의 전하 차이에 의해 분리하기 위한 기법이다.

모세관 전기영동. 모세관 전기영동은 분리를 달성하기 위해 완충액으로 충전된 모세관에 걸쳐 높은 전압을 인가하는 것을 수반할 수 있는 한 범위의 분리 기법들의 범위의 총체이다. 변형법에는 분석물 간의 크기 및 전하 차이에 기초한 분리(모세관 구역 전기영동(CZE) 또는 유리 용액 CE(FSCE)로 칭해짐), 계면활성제 미셀을 이용한 중성 화합물의 분리(미셀 전기역학 모세관 크로마토그래피(MECC) 또는 종종 MEKC로도 칭해짐), 겔 망을 통한 용질의 체질(sieving)(모세관 겔 전기영동, GCE), 전기영동 이동도에 기초한 양이온(또는 음이온)의 분리(모세관 등속영동(isotachophoresis), CITP), 및 pH 구배 내 쯔비터이온성 용질의 분리(모세관 등전 포커싱, CIEF)이 포함된다. 모세관 전기크로마토그래피(CEC)는 실리카 겔 정지상으로 충전된 모세관을 가로질러 전압을 인가하는 것을 수반하는 연합 전기역학 분리 기법일 수 있다. CEC에서의 분리 선택도는 전기영동 공정 및 크로마토그래피 공정 모두의 조합일 수 있다. 많은 CE 분리 기법들은 검출기로 용질을 펌핑하는 모세관 내의 용액의 전기적으로 유도된 유동(전기삼투압 유동, EOF)의 존재에 의존한다. GCE 및 CIEF는 단백질과 같은 생체분자의 분리를 위해 중요하다.

E. 핵 자기 공명(NMR). 본 발명의 헤모글로빈의 분석을 위해 NMR이 사용될 수 있다. NMR 분광법은 원자 해상에서 헤모글로빈의 구조를 결정할 수 있다. 또한, NMR와의 시간 의존적 현상, 예컨대 거대분자 내에서의 분자내 역학, 반응 동력학, 분자 인식 또는 단백질 폴딩을 연구하는 것이 가능하다. ¹⁵N, ¹³C 및 ²H와 같은 이종핵이 균일하게 또는 선택적 동위원소 표지화에 의해 단백질에 도입될 수 있다. 이 샘플들로부터의 스펙트럼은 극도로 단순화될 수 있다. 또한, 거대분자의 구조 및 역학에 대한 일부 새 정보를 상기 방법들로 결정할 수 있다.

F. X-선 결정학. 본 발명의 헤모글로빈의 분석을 위해 X-선 결정학이 사용될 수 있다. X-선 결정학은, 결정 내 원자들의 조밀 간격의 격자를 통한 X-선 회절에 의해 생성된 패턴을 기록한 후, 격자의 성질을 나타내도록 분석하는 기법이다. 이는 일반적으로 물질 및 물질의 분자 구조를 이해하도록 한다. 결정 격자의 간격은 브래그 법칙(Bragg's law)을 이용하여 결정될 수 있다. 원자 핵 그 자체보다는, 원자를 둘러싸는 전자가, 들어오는 X-선 광자와 물리적으로 상호작용하는 실체이다. 이 기법은 본 발명의 헤모글로빈의 구조를 결정하기 위해 사용될 수 있다. X-선 회절은 통상적으로 물질의 단일 결정을 이용하여 수행되나, 이것이 이용가능하지 않은 경우, 다른 장비를 필요로 할 수 있는 미세결정성 분말 샘플이 또한 사용될 수 있다.

G. 어레이. 본 발명의 헤모글로빈의 분석을 위해 어레이가 사용될 수 있다. 어레이는 공지된 단백질 표적에 대한 다수 샘플의 병렬 분석을 수행하는 것을 수반한다. 각종 마이크로어레이 플랫폼의 개발은 세포 또는 조직 내 단백질 풍부도, 국소화 및 상호작용의 결정을 가능하게 하고 가속화할 수 있다. 마이크로어레이는 단백질, 항체 또는 펩티드의 특징화된 세트에 대한 단백질 상호작용 및 기능을 확인하도록 하는 플랫폼을 제공한다. 단백질-기재 칩은 작은 표면 상에 단백질을 정렬하고, 형광도-기초한 영상화를 이용하여 조직 내 단백질의 수준을 직접적으로 측정할 수 있다. 단백질은 평평한 고체상 상에 또는 모세관 시스템(미생물 어레이) 내에 정렬될 수 있고, 수가지 상이한 단백질이 이들 어레이에 적용될 수 있다. 이어서, 비특이적 단백질 염색을 사용하여, 결합 단백질을 검출할 수 있다.

H. 아미노산 분석. 일부 실시양태에서, 아미노산 분석(AAA)은 본 발명의 헤모글로빈의 분석에 사용되는 기법이다. AAA는 단백질 내 각 개별 아미노산의 양을 결정하기 위한 공정이다. 아미노산 분석에는 4가지 단계들, 즉 가수분해, 유도체화, 유도체화 아미노산의 분리, 및 데이터 해석 및 계산이 있을 수 있다.

가수분해 단계에서, 기지량의 내부 표준(노르류신)을 샘플에 첨가할 수 있다. 이어서, 적어도 5 nmol의 각 아미노산(즉 10 μg의 단백질)을 함유하는 샘플을 가수분해관에 옮겨, 진공 하에 건조할 수 있다. 관을 HCl 및 소량의 페놀을 함유하는 바이얼에 둘 수 있고, 단백질을 진공 하에 HCl에 의해 가수분해한다. 가수분해를 약 110℃에서 약 24시간 동안 수행한다. 가수분해 후, 샘플을 건조시킬 수 있다.

염기 조건 하에, 유리 아미노산을 예를 들어 페닐이소티오시아네이트(PITC)와 반응시켜, 페닐티오카르바밀(PTC) 아미노산 유도체를 생성시킴으로써, 유도체화를 아미노산 분석기에 상에 자동적으로 수행할 수 있다. 기지량(500 pmol)의 17종 통상의 유리 아미노산을 함유하는 표준용액을 또한 분리된 아미노산 분석기 샘플 스폿 상에 로딩하여, 유도체화할 수 있다. 이는 샘플의 아미노산 함량을 결정하는 데 사용될 수 있는 적정 파일을 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 유도체화 후에, PTC-아미노산을 함유하는 메탄올 용액을 분리를 위해 역상 C18 실리카 칼럼을 이용하여 좁은 구경의 HPLC 시스템으로 옮길 수 있다. 분리를 위해 사용되는 완충액 시스템은 예를 들어 완충액 A로서의 pH 5.45의 50 mM 아세트산나트륨 및 완충액 B로서의 pH 6.1의 70% 아세토니트릴/32 mM 인산염나트륨일 수 있다. 완충액 A 및 완충액 B의 구배를 이용하여, 프로그램을 수행할 수 있다. 아미노산 분석기 시스템에 부착될 수 있는 데이터 분석 시스템을 이용하여, 크로마토그래피 피크 면적을 확인하고 정량화할 수 있다.

대안적으로, 닌히드린을 이용한 무어(Moore) 및 스타인(Stein)의 아미노산 분석의 통상적 방법을 사용할 수 있다.

임상적 화학 분석 방법

A. 산소 수송 . 포화, 불포화 및 메트헤모글로빈 수준을 구축하기 위한 총체적 헤모글로빈 분석을 위해 CO-산소농도계(oximeter)가 사용된다. 본 발명의 헤모글로빈 중, 데옥시헤모글로빈(HHb), 옥시헤모글로빈(O₂Hb), 메트헤모글로빈(MetHb), 카르복시헤모글로빈(COHb), 총 헤모글로빈(tHb), 산소 포화(SO₂%), 산소 함량(O₂Ct) 및 산소 용량(O₂Cap)의 수준을 포함한 산소 수송 시험을 위해 자외선 조명이 사용된다. 한 적당한 기기는 노바 바이오메디칼 인스트루멘테이션(Nova Biomedical Instrumentation)에 의해 제조된다.

B. 전해질. 칼륨, 표준 전해질/화학 분석기를 이용하여 칼슘, 염화나트륨 등과 같은 전해질을 측정한다. 적당한 기기는 무엇보다도 노바 바이오메디칼, 히타치(Hitachi), 로쉐(Roche)에 의해 생산된다.

C. 오스몰 농도. 본 발명의 헤모글로빈의 오스몰 농도도 또한 측정된다. 어는점 저하는 본 발명의 생체적합성 용적 증량제 및 산소 전달제를 생성시키기 위해, 이 분석을 수행하는 데 사용되는 방법이다. 적당한 기기가 어드밴스트 인스트루먼츠 인코포레이트(Advanced Instruments Inc.)로부터 입수가능하고, 0.0 내지 4000 mOsmol/kgH₂O 범위 내의 모든 삼투압 활성 용질을 측정할 수 있다.

D. 탄산탈수효소. 탄산탈수효소를, 폴리스티렌 지지체를 토끼 항-소 CA로 코팅하고, 여기에 샘플 중 CA가 결합하게 되는 이중 샌드위치 ELISA에 의해 검출할 수 있다. 효소 기질 반응은 반응 생성물의 가시광 흡광도에 의해 정량화된다.

E. 인지질 수준 감소. HPLC 및/또는 ELISA에 의해 인지질 검정을 측정할 수 있다. 포스파티딜콜린의 존재를 결정하기 위한 카테고리 II, 정량적 검정에 대한 현 USP 지침에 따라 ELISA 확인 프로토콜을 설계한다. 프로토콜에는 일차도/범위, 정확도 및 정밀도의 확인이 포함된다.

F. 내독소에 대한 검정 . 바로 주입가능한 최종 생성물은 무내독소이어야 한다. 내독소는 사실상 세균 세포 벽으로부터의 물질이고, 낮은 용량으로 수령자에게 고열이 시작되는 것의 원인이 될 수 있고, 반면 보다 높은 수준은 보다 심각한 형태의 증상을 개시할 것이다. 다른 검정들, 예컨대 발색 및 겔-응고보다 LAL(리뮬러스 유주세포 용해물) 동력학-탁도측정 검정을 선택하였는데, 이는 그것이 재현가능한 결과 및 높은 감도를 가지기 때문이다.

통상의 시험을 위해 사용되는 조절 표준내독소(CSE)의 효능은 참조 표준 내독소(RSE), EC5, 로트 F(USPC에 의해 제조됨)을 비교함으로써 결정된다. 참조 내독소 외의 내독소가 통상의 시험에서 스파이크 및 곡선을 생성시키기 위해 사용될 때마다, 상기 비교를 수행할 필요가 있다. 이는 상이한 로트의 CSE가 현저하게 상이한 효능을 가진다는 사실의 결과이다. RSE/CSE 비교는 RSE의 한 바이얼을 동일한 로트의 CSE의 4개 바이얼과 비교하고, 평균 효능을 계산함으로써 수행된다. 표준 곡선은 정량화에 필요한 -0.98 이하의 상관 계수로 3중으로 검정된다. 다수의 CSE 표준 곡선을 가동하고(run), 한 표준 곡선을 이후 시험을 위해 보관한다. LAL 검정으로 시험하는 모든 산물에 대해 억제/증진 연구를 수행한다. LAL 검정은, [케이프 코드 협회(Associates of Cape Cod)]에 의해 제조된 파이로스 키네틱스(Pyros Kinetix)

인큐베이팅 튜브 리더(Incubating Tube Reader)]를 이용하여, [케이프 코드 협회, 미국 02536-4445 메사츄세츠주 이스트 팔마우쓰, 팔마우쓰 테크놀로즈 파크 소재]의 프로토콜을 이용하여 수행한다.

i. 시약 및 장비 제조

동력학-탁도측정 검정을 위해 사용되는 모든 시약들을 하기 2가지 제외 사항과 함께 특정 제조업자의 사업설명서에 따라 사용한다: 1) LAL를 LAL 시약급수(Reagent Water) 대신에 5 ml의 파이로졸(Pyrosol)^TM 재구성 완충액으로 재구성하고, 2) CSE는 정확히 5 ml의 LAL 시약급수로 재구성하지 않는다. LAL을 완충액으로 재구성하는 것을 수행하여, 순수 헤모글로빈 용액에 의한 LAL 검정의 극도의 증진을 달성한다. CSE는 1000 EU/ml의 최종 용액 농도가 얻어지도록 하는 양의 물로 재구성된다. 첨가량은 USPC RSE에 대해 CSE을 표준화하여 결정되고, 케이프 코드 협회에서 권장하는 5 ml 안팎일 수 있다. 이는 일정한 CSE 용액 농도를 산출하고, CSE 로트가 변화할 때마다 내독소 스파이크의 계산을 방지한다. 지시대로 다른 모든 시약들도 사용된다.

모든 유리 용기를 4시간 동안 180℃로 가열함으로써 발열원제거된다(depyrogenated). 모든 희석액 및 용액 전달을 클래식 100 층류식 후드(laminar flow hood) 하에 수행한다. 사용된 모든 피펫 팁은 무균성이고 무발열원성이다.

ii. CSE 효능(Potency)의 결정

RSE의 한 바이얼(정의 상, 10,000 EU/바이얼)을 5 ml의 LAL 시약급수로 재구성하여, 2,000 EU/ml 용액을 산출하였다. 2개의 RSE 곡선을 가동하여 전범위의 현 품질관리(Q.C.) 시험을 커버하였다. 중간 범위 곡선은 하기 농도들(EU/ml)을 포함하였다: 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 및 0.03125. 낮은 범위 곡선은 하기 농도들(EU/ml)로 구성되었다: 0.004, 0.002, 0.001, 0.0005, 0.00025 및 0.0001. 이 곡선을 이벌로 가동하였고, 선형 회귀를 수행하여 곡선의 기울기 및 Y-절편을 결정하였으며, 곡선을 CSE 곡선과 비교하기 위한 목적을 위해 보관하였다.

RSE 곡선을 가동한 후, CSE의 4개의 바이얼(500 ng/바이얼)을 1000 EU/개체의 최종 용액 농도가 산출되도록 하는 양의 물로 재구성하였다. 각 바이얼의 희석액을 각각의 두 범위에서 제조하여, CSE 곡선의 3가지 이상의 농도가 RSE 곡선 상에 직접 속하도록 하였다. 중간-범위 곡선은 하기 농도들(ng/ml)을 포함하였다: 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 및 0.003125. 저-범위 곡선은 하기 농도들(ng/ml)로 구성되었다: 0.004, 0.002, 0.001, 0.0005, 0.00025 및 0.0001. 이 곡선을 이벌로 가동하였고, 개시 시간은 상응하는 RSE 곡선에서 보간하였다(interpolated).

각 CSE 표준에 대한 내독소 농도(EU/ml)를 상응하는 농도(ng/ml)로 나누었다. 원 데이터 상에 별표로 나타낸, RSE 곡선 상에 직접 속하지 않은 임의의 개시 시간은 계산에 포함시키지 않았다. 각 표준에 대한 수득된 EU/ng 효능의 평균을 구하여, 각 범위에서의 CSE 효능을 결정하였다. 이어서, 두 범위 효능의 평균을 구하여, 1.0 내지 0.001 EU/ml의 전 범위를 통한 CSE의 효능을 결정하였다. 이어서, 전체 CSE 효능을 사용하여, 하기 계산에 따라 1000 EU/ml 용액을 수득하기 위해 로트 내 각각의 CSE 바이얼에 첨가하는 LAL 시약의 양을 계산하였다:

iii. 시험 방법

100 μl의 LAL을, 400 μl의 샘플을 함유하는 발열원제거된 10×75 mm 배양관에 첨가한다. 관을 대략 2초 동안 완만히 보어텍싱하고, LAL 장치의 항온배양 모듈에 둔다. 각 관을 이러한 방식으로 개별적으로 첨가한다. 관의 바닥이 기계적 스위치를 가동할 때 각 관에 대해 타이밍을 개시한다. 관을 시험 전반에 걸쳐 37.0±0.5℃에서 항온배양한다. 첫 60초 동안은 판독값을 취하지 않고; 이는 관의 내용물이 온도에 도달하고 공기 버블이 분산되도록 하는 시간을 두기 위한 것이다. 관 삽입 후 60 내지 120초 동안, 각 웰 내 광검출기는 10초 간격의 7가지 판독값을 취한다. 이어서, 판독값들을 평균내고 취하여, 100% 투과도를 나타냈다. 이 영점조준 기간은 관 결함 및 샘플 색상 또는 내인성 탁도로 인한 테이터 오차를 소거한다. 후속 판독값을 매10초 취하여, 투과도로 전환한 후, 광 밀도(OD)로 전환한다. 400 내지 550초 후, 수집한 OD 값을 평균낸 후, 시험을 위한 모든 후속 OD 값에서 뺀다. (이 기준선 보정은 배경의 OD를 보정한다.)

개시 시간, T₀은 샘플을 웰 안에 두고 항온배양할 때부터 20 mAU의 광학 밀도가 전개될 때까지의 초수로 정의된다. 내독소 수준은 개시 시간을 log₁₀(T_o) 대 log₁₀(알려진 내독소 농도)의 보관 표준 곡선과 비교함으로써 결정된다.

LAL 장치로부터 데이터를 수집하기 위해, 소형-프로그래밍화된 컴퓨터를 사용한다. LAL 장치 소프트웨어는 데이터 파일에 OD 값을 저장하고, 개시 시간 보정, 표준에 대한 선형 회귀 및 내독소 농도 결정과 같은 명령 시에 데이터 분석을 수행한다. 모든 인-프로세스(in-process) 샘플을 비스파이킹 및 4-람다 스파이크로의 스파이킹하여 2중으로 시험하고, 이 때 람다는 표준 곡선 상의 최저 표준과 동등하다. 또한, LAL 시약급수 및 비-스파이킹된 LAL 시약급수 내 4-람다 스파이크를 시험한다. 모든 최종 산물 샘플을 비-스파이킹 및 스파이킹으로 하여 3중으로 시험한다.

결과. dXCMSFH 내 내독소의 수준은 1 EU per/ml 미만이다. 공정의 바람직한 실시양태에서, 내독소를 0.01 EU 미만의 수준으로 제거하는 것이 달성되고, 복잡한 용도 및 보다 큰 용적을 허용한다. 이로써 0.1 EU/ml 내지 0.02 EU/ml 미만의 판독값이 초래된다.

V. 제제화

1. 부형제를 포함하는 약학적 조성물, 투여 경로 및 투약량 . 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH을 본 치료가 필요한 포유동물을 치료하는 데 사용하기 위한 통상적 약학적 제제(예를 들어 주사용 용액)에 도입할 수 있다. 약학적 조성물은 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해, 또는 큰 용적의 비경구 용액 등으로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 dXCMSFH는 Hb를 리포좀 내 캡슐화함으로써 제제화될 수 있다. 리포좀 캡슐화는 종종 캡슐화된 치료제의 독성을 감소시키기 위해, 또한 약물 반감기를 증가시키기 위해, 약물 전달에 사용된다. 리포좀-캡슐화 헤모글로빈(LEHb)은 RBC와 생리학적으로 유사한 구조 내에 Hb를 넣음으로써, Hb 해리 및 그것의 혈루 중 급속 클리어란스(clearance)를 방지한다. LEHb 분산액의 반감기는 이중층의 표면 화학, 및 이중층 표면 전하 및 소포 크기 분포에 의존한다. 그러므로, 소포 크기를 감소시키고 소포 표면을 변형시킴으로써, 순환 수명을 유의적으로 증가시킬 수 있다. 리포좀의 폴리에틸렌-글리콜(PEG)과의 표면 접합은 반감기를 연장시킬 수 있다. 세망 내피계(RES)에 의한 리포좀 흡수는, RES의 과부하가 면역계를 저해하기 때문에, LEHb 농도에 영향을 미친다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 다른 인공 혈액 및 산소 전달 치료적 제제로 제제화될 수 있다. 그러한 제제는 dXCMSFH에 부가하여 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비경구 치료적 조성물은 무균 등장성 염수 용액을 포함할 수 있다. 제제는 직접 투여에 적당한 형태, 또는 투여 전에 희석이 요구되는 농축 형태의 것일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 제제는 0.001% 내지 90%(w/v)의 dXCMSFH를 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 dXCMSFH의 세포외 헤모글로빈 용액은 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 17%, 약 8 내지 약 14%, 및 약 10% 헤모글로빈을 함유할 수 있다(%중량/체적). 본 발명의 일부 실시양태에서, dCMSFH의 세포외 헤모글로빈 용액은 용액 내 약 5% 내지 약 7% 헤모글로빈을 함유할 수 있다(% w/v). 본 발명의 일부 실시양태에서, dCMSFH를 함유하는 용액은 약 6.4% 헤모글로빈을 함유한다. 헤모글로빈 %의 선택은 선택된 헤모글로빈 산물의 교질(oncotic) 성질에 의존한다. 본 발명에 사용하기 위해 제형된 헤모글로빈 용액은 정상 교질 내지 고 교질일 수 있다. 헤모글로빈 %은 각 지시에 따라 요망되는 교질 삼투압을 수득하기 위해 조정될 수 있다.

본 발명의 dXCMSFH는 산소 수송을 위해 적혈 세포를 사용하는 임의의 포유동물 내 혈액 대용물 및 산소 전달 치료제로서 유용한 조성물에 사용될 수 있다. 포유동물에는 인간, 가축, 예컨대 소, 고양이, 말, 개, 양, 염소, 돼지 등이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명의 dXCMSFH의 용량은 초기 용량 또는 반복 용량으로부터 적절한 시간에 걸쳐 환자 신체 kg 당, 헤모글로빈 약 1 내지 약 15,000 밀리그램일 수 있다. 산소 전달 조성물 또는 혈액 용적 보충물로서 사용될 때, 투약량은 100 내지 7500 mg/kg 환자 체중, 500 내지 5000 mg/kg 체중, 또는 700 내지 3000 mg/kg 체중일 수 있다. 따라서, 인간 환자에 대한 용량은 1 그램 내지 1000 그램 이상일 수 있다. 필수 유효 용량은 다수의 개별 용량의 투여에 의해 도달되기 때문에, 각 투약 형태의 개별 용량에 함유된 활성 성분의 단위 함량은 그 자체가 유효량을 구성할 필요가 없는 것으로 사료된다. 투약량의 선택은 이용되는 투약 형태, 처리 증상 및 당업자의 결정에 따라 달성되는 특별한 목적에 의존한다.

본 발명에 사용하기 위해, 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 HB 및, 특히 dXCMSFH는 생리학적으로 허용가능한 용액으로 한외여과함으로써 투석 또는 교환될 수 있다. 본 발명의 dXCMSFH는 50 내지 150 g/l로 제제화될 수 있다. 용액은 전혈과 등장성이고 헤모글로빈의 가역적 산소 운반 및 전달 성질을 유지할 수 있는, 생리학적으로 적합성인 전해질 비히클을 포함할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 용액은 예를 들어 생리학적 염수, 염수-글루코스 혼합물, 링거 아세테이트, 링거 용액, 젖산화 링거 용액, 록케(Locke)-링거 용액, 크렙스(Krebs)-링거 용액, 하트만(Hartmann's) 밸런싱된 염수, 헤파린화(heparinized) 시트르산나트륨-시트르산-덱스트로스 용액 및 중합체성 혈장 대용물, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올 및 에틸렌 옥시드-프로필렌 글리콜 축합물을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 각 제제는 약학적으로-허용가능한 담체, 희석제, 충전제, 염 및 당업계에 공지된 기타 물질을 포함하는 불활성 구성성분을 부가적으로 포함할 수 있는데, 이들의 선택은 이용되는 투약 형태, 치료하는 증상, 특히 당업자의 결정에 따라 달성되는 특별한 목적, 및 상기와 같은 첨가제의 성질에 의존한다. 예를 들어, dXCMSFH에 부가한 본 발명의 헤모글로빈 용액은 0 내지 200 mM의 하나 이상의 생리학적 완충액, 0 내지 200 mM의 하나 이상의 탄수화물, 0 내지 200 mM의 하나 이상의 알코올 또는 폴리알코올, 0 내지 200 mM의 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 염, 및 0 내지 1%의 하나 이상의 계면활성제, 0 내지 20 mM의 환원제를 포함할 수 있다. dXCMSFH에 부가한 본 발명의 헤모글로빈 용액은 0 내지 50 mM 글루콘산나트륨, 0 내지 50 mM의 하나 이상의 탄수화물(예를 들어 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 또는 당업자에게 공지된 기타 탄수화물), 0 내지 300 mM의 하나 이상의 염화물 염 및, 임의적으로는 0 내지 0.5% 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tween)^TM [폴리소르베이트(Polysorbate) 80] 및/또는 0 내지 20 mM N-아세틸 시스테인을 포함할 수 있다.

본 발명의 dXCMSFH의 투여는 헤모글로빈 사용 목적에 따라 수초 내지 수시간의 기간 동안 일어날 수 있다. 예를 들어, 심각한 출혈의 치료를 위한 산소 담체로서 사용될 때, 투여의 통상적 경시 과정은 가능한 한 빠르다. 용적 증진제 또는 산소 치료제로서 헤모글로빈 용액에 대한 전형적 주입 속도는 예를 들어 약 100 ml/h 내지 약 3000 ml/h, 약 1 ml/kg/h 내지 약 300 ml/kg/h, 또는 약 1 ml/kg/h 내지 약 25 ml/kg/h일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 투여 속도는 보다 높을 수 있다.

적당한 조성물은 0 내지 20O mM의 하나 이상의 완충액(예를 들어, 아세트산염, 인산염, 시트르산염, 중탄산염 또는 굿(Goode's) 완충액)을 포함할 수 있다. 염화나트륨, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘과 같은 염이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 염은 0 내지 2 M의 농도로 있을 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 말토스, 락토스와 같은 환원 탄수화물, 또는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 만니톨, 이소수크로스 또는 스타키오스와 같은 비환원 탄수화물) 및 하나 이상의 알코올 또는 폴리알코올(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 덱스트란 또는 폴리올)을 포함할 수 있다. 탄수화물 또는 알코올의 농도는 0 내지 2 M일 수 있다.

본 발명의 dXCMSFH는 하나 이상의 계면활성제 및 0 내지 200 mM의 하나 이상의 킬레이트화제(예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 오페난트롤린, 디에틸아민 트리아민 펜타아세트산(펜타아세트산으로도 알려진 DTPA) 등)을 포함할 수 있다. 계면활성제는 조성물 중 0.005 내지 1%일 수 있다. 본 발명의 조성물은 pH가 약 6.0 내지 9.5일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 0 내지 150 mM NaCl, 0 내지 10 mM 인산나트륨, 0.01 내지 0 1% 계면활성제 및/또는 0 내지 50 μM의 하나 이상의 킬레이트화제(pH 6.0 내지 9 5)일 수 있다. 제제는 5 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, 0.025% 내지 0.08% 폴리소르베이트 80, 및/또는 25 μM EDTA(pH 6.0 내지 9.5)를 함유할 수 있다.

제제에 대한 부가적 첨가제는 항세균제, 교질 삼투압 제제(예를 들어, 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜) 및 기타 제형, 허용가능한 염, 당 및 당업자에게 공지된 기타 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 각 제제는 담체, 희석제, 충전제, 염 및 당업자에게 공지된 기타 물질을 포함한 구성성분을 부가적으로 포함할 수 있고, 이들의 선택은 달성하고자 하는 특별한 목적 및 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 상기와 같은 첨가제의 성질에 의존한다. 본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제형될 수 있다. 그러한 제형 방법에는 예를 들어 단순 혼합, 순차적 첨가, 유화, 투석여과 등이 포함된다.

2. 안정한(가교) Hb 및 불안정화된(비가교) Hb 모두를 포함한, 본 발명의 NO-차단된 사량체 Hb의 포장 및 저장. dXCMSFH, dCMSFH 및 dTBSFH를 포함하는, 본 발명의 NO-차단된 사량체 Hb의 각종 실시양태는 통상적이고 바람직하게는 산소 불투과성인 용기(예를 들어, 스테인레스강 탱크, 유리 용기, 산소 불투과성 플라스틱 백 또는 저 산소 투과도 플라스틱 백으로 위에 씌워진 플라스틱 백(여기에서, 산소 스캐빈저가 내부 플라스틱 백과 위에 씌워진 플라스틱 백 사이에 있음)) 내에 저장된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 dXCMSFH, dCMSFH 또는 dTBSFH는 산소의 부재 하에 저장될 수 있다. dXCMSFH, dCMSFH 또는 dTBSFH는 사용 전에 산소화될 수 있는데, 예컨대 다만 단지 예시적으로서 심장 치료법을 위한 카테터 내 사용하기 전에 산소화될 수 있다. 일부 실시양태에서, dXCMSFH, dCMSFH 또는 dTBSFH는 산소 조절 환경 내 산소 투과성 또는 산소 불투과성("무산소성(anoxic)") 용기에 저장될 수 있다. 그러한 산소 조절 환경은 예를 들어 글로브 박스, 글로브 백, 항온배양기 등을 포함할 수 있다. 바람직하게, 산소 조절 환경의 산소 함량은 대기 산소 농도에 비해 낮다(Kandler, R L. et al., 미국 특허 제5,352,773호; 본원에 참조 인용됨) 참조). 본 발명의 일부 실시양태에서, dXCMSFH, dCMSFH 또는 dTBSFH는 밀봉된 타이벡(Tyvek) 또는 마일라르(Mylar)(폴리에틸렌 테레프탈레이트) 백 또는 파우치 내에 포장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 dXCMSFH, dCMSFH 또는 dTBSFH를 동결건조하여 분말로 저장할 수 있다. 조제물을 실온 또는 승온에서(Kandler et al., PCT 공보 제WO 92/02239호; Nho, PCT 공보 제WO 92/08478호(양자 모두 본원에 참조 인용됨)), 또는 더욱 바람직하게는 냉장 하에 저장할 수 있다. 일부 실시양태에서, dCMSFH 또는 dTBSFH는 선적 및 추가 취급을 용이하게 하기 위해 하이클론 바이오프로세스 컨테이너((HyClone Bioprocess Containers)^TM 내에 저장할 수 있다.

팩키지가 산소 불투과성 필름일 경우, 용기는 중합체 필름(예를 들어, 본질적으로 산소-불투과성인 폴리에스테르, 에틸렌 비닐 알코올(EVOH) 또는 나일론) 및 이들의 적층물을 포함한 각종 재료로 제조될 수 있다. 용기가 산소 불투과성 오버랩인 경우, 용기는 중합체 필름(예를 들어, 본질적으로 산소-불투과성인 폴리에스테르, 에틸렌 비닐 알코올(EVOH) 또는 나일론) 및 적층물, 예컨대 투명 적층물(예를 들어 산화규소 또는 EVOH 함유 적층물) 또는 금속 호일 적층물(예를 들어, 은 또는 알루미늄 호일 적층물)을 포함한 각종 재료로 제조될 수 있다. 중합체는 예를 들어 폴리에스테르 층(예를 들어, 48 게이지 폴리에스테르), 나일론 또는 폴리올레핀 층, 예컨대 폴리에틸렌, 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 폴리프로필렌, 또는 이들의 공중합체를 포함한 각종 중합체성 물질일 수 있다.

용기는 바이얼, 실린더, 박스 등을 포함한 각종 구성의 것일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 용기는 백의 형태이다. 한 적당한 백은 1개 이상(예를 들어, 2개)의 시이트를 그 주변부(들)에 연속 결합하여, 충전가능한 중심을 가지는 단단히 밀폐된, 산소 불투과성의 작제물을 형성함으로써 형성될 수 있다. 폴리올레핀, 예컨대 선형 저 밀도, 저 밀도, 중 또는 고 밀도 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 및 이들의 공중합체를 포함하는 적층물의 경우, 백의 주변부를 열을 이용하여 결합 또는 밀봉할 수 있다. 단단히 밀폐된, 산소 및/또는 수분 불투과성 작제물을 생성시키기 위한 적절한 온도 및 백의 모양을 결정하는 것은 당업계 기술 내에 족히 속한다. 용기가 필름, 예컨대 폴리에스테르 필름인 경우, 필름은 각종 적당한 방법들에 의해 본질적으로 산소-불투과성으로 될 수 있다. 필름은 산소 투과성을 감소 또는 소거하기 위해 적층되거나 다른 방식으로 처리될 수 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 산화방지제, 예컨대 아스코르브산염(Wiesehahn, G. P. et al., 미국 특허 제4,727,027호; 및 Kerwin, B. D. et al., 미국 특허 제5,929,031호), 글루타티온, N-아세틸시스테인, 메티오닌, 토코페롤, 부틸 히드록시 톨루엔, 부틸 히드록시 아니졸 또는 페놀계 화합물(Osterber et al., PCT 공보 제WO 94/26286호; 및, Kerwin, B. D. et al., 미국 특허 제 5,929,031호)을 첨가하여, dXCMSFH, dCMSFH 및 dTBSFH를 더욱 안정화할 수 있다(상기 모든 참조문헌은 본원에 참조 인용됨). 대안적으로, 또한 더욱 바람직하게는, 본 발명의 dXCMSFH가 동결건조되어 분말로서 저장되거나, 밀봉된 타이벡 또는 마일라르(폴리에틸렌 테레프탈레이트) 백 또는 파우치 내에 포장될 수 있다. 포장, 예컨대 Kerwin, B. D. et al., 미국 특허 제 5,929,031호가 본원에 참조 인용된다. 일부 실시양태에서, 그러한 저장 용기 내 dXCMSFH, dCMSFH 및 dTBSFH는 조성물의 반감기를 연장하기에 충분한 방사선 또는 기타 무균화 처리에 적용할 수 있다. n-아세틸-시스테인과 같은 산소 스캐빈저가 제제 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 dXCMSFH, dCMSFH 및 TBSFH는 적당한 저장 온도에서 2년 이상의 기간 동안, 바람직하게는 저 산소 환경 하에 저장될 때 2년 이상의 기간 동안 저장될 수 있다. 1년 이상 동안의 저장을 위한 적당한 저장 온도는 약 0℃ 내지 약 40℃이다. 바람직한 저장 온도 범위는 약 0℃ 내지 약 25℃이다. 본 발명의 dXCMSFH, dCMSFH 및 dTBSFH의 제조 공정은 미생물 성장 또는 바이오버든을 최소화하기에 충분한 조건 하에 공정의 단계들을 유지시키는 것, 예컨대 온도를 약 20℃ 미만 및 0℃ 초과로 유지시키는 것을 포함한다.

VI. 이용 방법

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 수령자에게 예를 들어 주입에 의해, 정맥내 또는 동맥내 주사에 의해 또는 기타 수단에 의해 투여될 수 있는 약학적 조성물을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 dXCMSFH 제제는 적혈 세포가 사용되는 임의의 용도에서 혈액 대용물, 혈액 용적 내 용적 증량제 및 산소 관류제로서 유용한 조성물 내에 사용될 수 있다. 한 용도는 혈액 용적이 소실되고 체액 용적 및 산소 전달 용량 모두가 대체되어야 하는 출혈을 치료하기 위해 본 발명의 조성물을 사용한다. 또한, 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 약학적으로 허용가능하게 제조될 수 있기 때문에, 본 발명의 제제는 산소를 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 대형 헤모글로빈 단백질 분자의 존재로 인해 교질 삼투압을 제공하는 단순 용적 증량제로서 작용할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 환자의 혈액을 제거하여 수술 말기에 또는 회복 중에(예를 들어, 급성 정상혈량 혈액희석 또는 혈액보강 등)을 위해 재융합하도록 저장되는 수술 절차 중에 제거되는 혈액의 대한 대체물로서 사용될 수 있다.

혈액 대용물로서의 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH의 전형적 용량은 세포외 헤모글로빈 10 mg 내지 7 그램 이상/환자 체중 킬로그램이다. 따라서, 인간 환자에 대한 전형적 용량은 수그램 내지 350 그램 초과일 수 있다. 필수 유효량이 주사제 등으로서의 복수 투여에 의해 도달될 수 있기 때문에, 각 투약 형태의 개별 용량 내에 함유되는 활성 성분의 단위 함량은 그 자체가 유효량을 구성할 필요가 없다. 투약량의 선택은 이용하는 투약 형태, 치료하는 증상, 및 당 기술분야의 당업자의 결정에 따라 달성하고자 하는 특별한 목적에 의존한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 예를 들어 dXCMSFH의 용액은 포유동물에 투여하기 위해 약 5 중량% 내지 약 25 중량%의 dXCMSFH를 함유할 것이다. 본 발명의 일부 바람직한 실시양태에서, dXCMSFH의 용액은 포유동물에 투여하기 위해 약 7 중량% 내지 약 15 중량%의 dXCMSFH를 함유할 것이다. 본 발명의 일부 다른 바람직한 실시양태에서, dXCMSFH의 용액은 포유동물에 투여하기 위해 10 중량%의 dXCMSFH일 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 포유동물에게 투여하는 용량은 약 7 g의 dXCMSFH를 함유한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 포유동물에게 투여하는 용량은 약 1 g의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH를 함유할 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료적 상황에 사용하기 위한 생산의 예시적 유닛은 500 ml의 0.5 mmol dXCMSFH 용액(약 64 g/L, 즉 용액 중 약 6.4 중량%)을 갖는 용기이다. 다수의 치료적 개입을 위해 산소 전달을 보강하거나 혈액을 대체하기 위해 큰 유닛 용액이 사용될 수 있다. 보다 적은 단위 용액이 표지화 및 진단적 목적을 위해, 및 치료적 개입을 위해 사용될 수 있다. 보다 작은 단위 용액은 한 바람직한 실시양태에서, 최대 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 11 중량%, 12 중량%, 13 중량%, 14 중량%, 15 중량%, 16 중량%, 17 중량%, 18 중량%, 19 중량%, 20 중량%, 21 중량%, 22 중량%, 23 중량%, 24 중량% 또는 25 중량% 이하의 dXCMSFHd인 dXCMSFH 용액을 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용액은 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 11 중량%, 12 중량%, 13 중량% 또는 14 중량%의 dXCMSFH와 같은 낮은 농도로 dXCMSFH를 함유할 수 있다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH의 투여는 헤모글로빈 사용의 목적에 따라 수초 내지 수시간의 기간 동안 일어날 수 있다. 예를 들어, 용적 보강 요법으로서, 투여의 통상적 경시 과정은 가능한 한 빠르다. 산소 전달/관류제 또는 용적 증진제로서의 헤모글로빈 용액에 대한 전형적 주입 속도는 약 100 ml 내지 3000 ml/h일 수 있다. 그러나, 조혈을 자극하기 위해 사용될 때, 투여는 더욱 천천히 이루어질 수 있고, 이에 따라 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH의 투약량이 출혈의 치료에 필요할 수 있는 투약량보다 훨씬 더 적을 수 있기 때문에, 투여 속도가 더욱 느릴 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 빈혈증을 앓고 있는 포유동물에서 부가적 산소 전달 용량을 제공함으로써, 또한 조혈을 자극하고 RBC 생산을 지지하기 위해 유효한 철 보충량을 제공함으로써, 또한 에리트로포이에틴 요법제에 대한 보조제로서 작용함으로써, 신부전, 당뇨병, AIDS, 화학요법, 방사선요법, 간염, G.I. 실혈, 철분 결핍, 월경과다 등에 의해 유발되는 빈혈증을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

마찬가지로, 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 부가적 산소 전달 용량을 요망하는 포유동물(예컨대, 운동선수, 군인, 등산가, 비행가, 흡연 희생자 등)에게 그러한 부가적 산소 전달 용량을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 부가적 산소 전달 용량은 환경적(즉, 예를 들어 높은 고도 및 스모크 흡입) 및 신체적(즉, 예를 들어 급성 성능 요구) 스트레스를 극복하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 본 발명의 화합물 및 조성물이 조직에 산소를 공급할 수 있고, 한편 일산화탄소가 결합된 세포내 헤모글로빈이 제거되게 됨으로써 새 RBC가 생성될 때까지 환자의 산소 요구에 교량 역할을 하게 되므로, 일산화탄소 중독 및 이와 동시 발생하는 저산소증 및 허혈을 치료하는 데 유용하다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 높은 용적의 헤모글로빈을 포유동물에게 투여할 것을 필요로 하는 용도를 위해, 또한 단지 작은 용적의 본 발명의 헤모글로빈을 투여되는 상황에 사용될 수 있다. 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 정상적으로 보다 큰 용적의 혈액이 소실되는 수술 중의 용도에서, 또는 큰 용적의 혈액을 소실한 외상 희생자의 치료에서 사용될 수 있다. 이에는 민간인 사고 및 군사적 상황 모두가 포함될 수 있다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 수의 임상적 용도에 있어 혈액 대용물로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH의 맥관구조 전반에 걸친 분포가 적혈 세포의 점도 또는 크기에 의해 제한되지 않기 때문에, 본 발명의 조성물은 적혈 세포가 투과할 수 없는 부위에 산소를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이 구역에는 적혈 세포 유동에 대한 폐 내의 하류에 위치한 임의의 조직 부위, 예컨대 혈전, 겸상세포 폐쇄, 동맥 폐쇄, 혈관성형 풍선, 외과수술 기기, 산소 기아를 앓고 있거나 저산소성인 조직 등의 하류에 있는 부위가 포함된다.

부가적으로, 뇌 내의 허혈 발병을 포함한 모든 유형의 조직 허혈은 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있다. 그러한 조직 허혈에는 예를 들어 뇌졸중, 신생 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심근 기절 및 동면, 급성 또는 불안정성 협심증, 신생 협심증, 경색증 등이 포함된다. 화상과 같은 신체적 손상으로부터의 조직 회수는 본 발명의 헤모글로빈을 이용한 예비처리에 의해 가속화될 수 있고, 이는 감염 위험을 또한 감소시킬 수 있는 조직의 증가된 관류 및 산소화를 허용한다. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb의 사용은 또한 작은 모세혈관 내 보다 작은 분자의 보다 양호한 분포로 인해 폐 내 산소 흡수가 보다 양호하도록 할 것이다. 미용성형 중 및 후에, 미세 조직층은 미세순환 붕괴를 앓고, 이로써 RBC의 유동이 소실된다. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb의 사용은 조직 대사 및 재성장을 위한 보다 양호한 산소화를 제공하여, 혈관신생의 손실과 더불어 상처를 감소시킨다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 겸상적혈구 빈혈증 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다. 혈관폐쇄 위기에 처한 겸상적혈구 빈혈증 환자는 현재 희석 및 통증 관리와 병행되는 적혈 세포의 수혈에 의해 치료된다. 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 (적혈 세포가 하는 것과 같이) 산소를 전달함으로써 추가 겸상화를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 변형된 적혈 세포에 의해 이미 폐쇄된 혈관을 투과하여, 통증을 보다 잘 경감시키고 조직 손상을 최소화할 수 있다. 또한, 겸상적혈구 빈혈증 개체군에서의 빈번한 수혈은 적혈 세포 및 혈소판에 대한 동종면역을 초래할 수 있는데, 이는 본 발명의 헤모글로빈의 사용에 의해 막을 수 있는 부작용이다. 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 보다 적은 정도의 혈관수축을 나타내거나 전혀 나타내지 않기 때문에, 겸상적혈구 빈혈증 환자의 치료에 있어 유의적 치료 이점을 제공한다. 이는 혈관폐쇄 위기의 치료에 있어 이점이고, 또한 혈관폐쇄 위기의 갑작스러운 개시의 위험이 있는 상황에 처한 겸상적혈구 빈혈증 환자의 다른 치료에 있어 이점이다. 예를 들어, 본 발명의 dXCMSFH는 마취의 위험을 최소화하기 위해 겸상적혈구 빈혈증 환자의 수술전 수혈을 위한 팩킹된 적혈 세포 대신에 사용할 수 있다. 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 또한 뇌졸중의 위험을 최소화하기 위해 주기적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 안정한 NO-차단 Hb, 즉 재산소화된 XCMSFH는 그것의 크기로 인해 관류시킬 수 있고, 벌크형 대형 적혈 세포의 좋지 않은 관류로 인해 확산 시에만 통상 의존하는 조직층에 산소를 전달할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 조성물은 손상 부위 또는 수거된 기관이 중지된 유동 상황 중에 관류시키게 되는 이식 및 급성 관상동맥 증후군(ACS)에서 조직 보호제로서 사용될 수 있다. 이는 관류 손상을 방지하고 구출 및 관류된 조직의 보존을 허용할 수 있고, 이에 정상적 순환이 후속하게 된다. 부가적으로, 이식 절차에서, 기관은 본 발명의 화합물 및 조성물로 플러슁함으로써 제거 전에 네이티브 혈액 제제 및 성분을 제거하고, 상기 논의된 바와 같이 조직 활력성을 계속 지지함으로써, 수거를 위해 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 조성물은 또한 분자 크기 및 산소 전달 용량이, RBC가 크기 또는 강성으로 인해 잘 관류시키지 않을 수 있는, 혈관신생이 잘 되지 않은 영역, 예컨대 예를 들어, 당뇨병성 발 손상, 심 재혈관신생으로부터의 회복 및 수술후 회복, 즉 예를 들어 미용성형 또는 암 절제 유방 재구성에서, 우수한 관류를 산출할 수 있는 상처 치유 시약으로서 이용될 수 있다. 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb의 또 다른 용도는 본 발명의 적절한 사용이 산소 분압의 증가를 허용하고 방사선요법의 보다 효과적인 사용 및 산소 의존성 약학적 제제의 증진을 허용할 수 있는 암 세포의 혈관신생이 잘 되지 않은 종양 조직에서의 용도일 수 있다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 심인성 쇼크에 대한 산화질소의 소분자 억제제로서 사용될 수 있다. 심인성 쇼크는 급성 심근 경색을 나타내는 상당수의 환자를 괴롭히고, 이로써 순환 휴지(shutdown)가 경색증 후에 일어난다. 카테터 또는 우회술을 개재함에도 불구하고, 사망률은 약 50%이다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 사용은 산소화 수준을 심장 및 혈관에 제공하여, 산화질소의 과다 생산을 앞서고 경색증 시기 후로 임상적 개시 30일이 지나도록 생존을 지지할 수 있다. 이 시점 이후에 생존이 크게 증진된다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 철을 함유하고, 이에 따라 MRI(자기 공명 영상화)에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH의 영상화제로서의 용도를 고려한다.

본 발명은 또한 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH를 함유하고, 증가된 산소 전달 용량에 대한 감지된 필요에 대한 대응으로 dXCMSFH를, 예를 들어 순환으로 방출하는 이식가능한 전달 장치(예컨대, 카트리지, 임플란트 등)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 그러한 장치는 dXCMSFH를, 예를 들어 일정 속도로 전달함으로써, (단독으로 또는 에리트로포이에틴과 조합하여) 적혈구생성을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 환자의 산소 전달 용량 필요에 적합한 속도로 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb를 전달하기 위해, 감지 수단(예컨대, 헤모글로빈, O₂ 수준, CO₂ 수준 등의 전자 프로브)에 의해 조절될 수 있다. 그러한 감지 수단은 그 자체가 이식가능할 수 있고 이식된 장치의 일부일 수 있거나, 체외 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 장치는 개체의 혈액 진단을 달성하거나 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 예를 들어 참조 표준물질을 필요로 하는 분석 기기에 대한 그러한 참조 표준물질, 시약 용액, 세포 배양의 기체 함량의 조절로서, 예를 들어 산소를 세포 배양액에 시험관내 전달하고 용액으로부터 산소를 제거함으로써 사용될 수 있는 비약학적 조성물을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 dXCMSFH는 수송 중에 기증된 조직 및 기관을 산소화하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 dXCMSFH는 표면 또는 액체로부터 내독소를 소거하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 본 발명의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb를 함유하는 장치, 예컨대 카트리지, 필터, 비드, 칼럼, 도관 등을 고려한다. 액체, 예컨대 물, 염수, 배지, 알부민 용액 등은 그러한 장치 상에 또는 그러한 장치를 통해 통과시킴으로써 처리되어, 그러한 액체 내에 존재할 수 있는 내독소를 제거하거나 그러한 액체 내에 존재하는 내독소의 농도를 경감시킬 수 있다. 그러한 장치의 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb는 바람직하게 (친화도, 이온 또는 공유 결합 등에 의해서와 같이) 상기와 같은 장치 내에 존재하는 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 탈산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb는, 처리하는 액체에 첨가된 후, 후속하여 (여과 또는 친화도 고정화에 의해서와 같이) 제거될 수 있는 비드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비드는 강자성 또는 상자성 금속의 것일 수 있거나, 그 자체가 자기성일 수 있어, 이들은 자기 수단에 의해 처리된 액체로부터 용이하게 분리될 수 있다.

가교 및 비가교 모두의 탈산소화된 티올-차단 Hb, 즉 dCMSFH, dTBSFH 및 dXCMSFH는 산소의 제거를 필요로 하는 용액으로부터 산소를 제거하기 위해, 및 분석 검정 및 기기를 위한 참조 표준으로서 사용될 수 있다. 가교 및 비가교 모두의 탈산소화된 티올-차단 Hb, 즉, CMSFH, TBSFH 및 XCMSFH는 또한, 산소 수준을 유지시킴으로써 배지 내 세포 성장을 증진시키기 위해 시험관내 사용될 수 있다.

본 발명의 재산소화된 안정한 NO-차단된 사량체 Hb, 및 특히 XCMSFH는 혈관내 공간을 가시화하는 데 사용하기 위해 이용될 수 있다. 혈관 벽의 관찰을 위한 현 광학 기법은 적혈 세포의 수혈의 불투명한 영향으로 인한 비광학 기법으로 격하된다. 본 발명의 안정한 NO-차단 Hb, 즉 XCMSFH는 산소를 전달함으로써 허혈을 방지할 뿐만 아니라, 병리학, 즉 암, 공격받기 쉬운 플라크, 지질 손상, 스텐트 설치 등의 결정을 위해, 적색 파장대 내 가시광을 이용하여, 인시츄(in-situ) 조직층을 가시화하도록 하는 광학적 불투명 안계를 제공함으로써, 예를 들어 표적화된 피처를 설명할 수 있다. 광학 단층 영상 기법(Optical Coherence Tomography)의 사용은 본 발명의 안정한 NO-차단된 사량체 Hb를 이용함으로써 확장될 수 있다. 생체내 일시적 가시장을 생성시키기 위해 현재 간헐적 염수 플러쉬가 이용되나, 우수한 가시화 및 지속적 조사는 국소 구역을 계속 산소화할 수 있는 본 안정한 NO-차단된 사량체 Hb를 사용함으로써 가능할 수 있다.

VII. 실시예

실시예 1

전혈의 초기 가공의 2가지 방법의 비교

재료: 소 혈액 수집: 소 혈액을 100 ml의 6% 나트륨 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 보유하는 1 갤런 수집 용기에 수집하여, 얼음 중 냉각한다.

소 동맥 전혈을 배치(batch) A 및 배치 B로 나눈다. 배치 A는 2200 ml의 전혈로 구성되고, 이를 헤모네틱스(haemonetics) 셀 세이버(Cell Saver) 5로 세정하여, 혈소판, 응고 인자, 세포외 칼륨, 응고방지제 및 세포 기질을 포함하지 않는 농축된 적혈 세포를 수득한다(방법 A). 배치 B는 1800 ml의 전혈로 구성되고, 밀리포어 0.65 μm 필터 상에 세정된다(방법 B).

방법 A. 혈장 단백질의 셀 세이버 5 제거: 헤모네틱스 사의 셀 세이버 5를 사용하여, 새로 수집된 항응고 소 혈액 중 다른 성분들로부터 적혈구를 농축한다. 이 시점에서 백혈구 또는 적혈구 중 하나를 파열하지 않는 것이 바람직할 수 있다.

세포를 150 μm의 조질 필터에 통과시킨 후, 225 ml의 팩킹된 적혈 세포를 보유하는 스피닝 볼(spinning bowl)에서 세정하고, 볼의 바깥측 가장자리에서 중심으로 역류하는 3 리터의 염수로 세정한다. 원심분리가 완만하고, WBC 중 일부를 세정물에서 용출하며, 이는 바람직할 수 있다. 표 4는 500 ml 증분에서의 혈청 단백질 제거의 진행을 보여준다. 그것은 연속 유동 기법이다. 표 4 내 샘플은 볼에 적용된 샘플 용적이다. 진행시킨 후, 280 nm 분광광도측정으로 단백질 농도를 판독하고, 이 때 값은 A₂₈₀ 단위(290 nm에서의 흡광도 단위)로 표시된다. 표 4에서의 데이터 점은 세정 공정 중 나타낸 시점에서 취해진다. 결과는 적혈 세포의 전체 볼을 3 리터의 NS로 세정할 때, 혈청 단백질의 3 로그 초과의 감소가 있음을 가리킨다. 이는 또한 적혈 세포 막에 결합되지 않은 바이러스, 프리온 등의 3 로그 초과 감소를 암시한다. 표 4 내의 모든 값은 희석에 대해 보정된 것이다.

혈장 단백질의 셀 세이버 5 제거

샘플 상태	A280
초기 조 혈장 함유 샘플의 A280	277.35
500 cc NS 후의 여과액의 A280	43.20
1000 cc NS 후의 여과액의 A280	7.69
1500 cc NS 후의 여과액의 A280	0.86
2000 cc NS 후의 여과액의 A280	0.05

방법 B. 혈장 단백질의 밀리포어 0.65 μm 필터 제거율: 배치 B를 150 μm 필터에 통과시킨다. 이어서, 물질을 혈장 단백질은 통과시키나 백혈구 및 적혈구와 같은 세포 성분은 보유하는 접선류 막으로 여과한다. 접선류 막 여과는 보다 느릴 수 있으나, 그것이 단독 수행될 수 있기 때문에 보다 적은 노동을 필요로 할 수 있다. 그것은 스케일업을 위해 더욱 적당할 수 있다. 다른 유형의 큰 규모 원심분리가 사용될 수 있다. 이 연속 투석 여과의 결과가 표 5에 나와 있고, 여기에서 모든 결과는 희석에 대해 보정된 것이다. 이 방법은 혈장 단백질의 3 로그 초과 감소를 나타내고, 이 또한 바이러스, 프리온 등의 유사한 로그 감소를 의미한다.

혈장 단백질의 밀리포어 0.65 μm 필터 제거율

샘플 상태	A280
1000 cc 혈액 중 혈장의 A280	221.6
1000 cc NS 후의 여과액의 A280	82.1
2000 cc NS 후의 여과액의 A280	26.5
3000 cc NS 후의 여과액의 A280	8.07
4000 cc NS 후의 여과액의 A280	2.76
5000 cc NS 후의 여과액의 A280	0.81
6000 cc NS 후의 여과액의 A280	0.29
7000 cc NS 후의 여과액의 A280	0.102

백혈구 손실/제거의 평가: 헤모글로빈의 제조 중에, 임의의 WBC를 제거하여, 헤모글로빈 용액으로부터 과립구 단백질분해 효소를 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 혈장 단백질의 제거 단계에서, WBC를 그것의 용해를 유발하지 않고 제거하는 것이 바람직하다. 셀 세이버 5 기술은 원심분리 중에 유동 담황갈색 코트 내 WBC 중 일부를 제거할 수 있다. 그러나, 접선류 막은 WBC의 모두를 보유할 수 있어, 관찰된 WBC의 손실은 WBC의 세포 용해가 일어났음을 의미할 수 있다. 표 6은 셀 세이버 5 또는 밀리포어 0 65 μm 필터를 이용한 여과 후, WBC의 보존의 평가를 나타낸다. 용적에 대해 적절히 보정되는 경우, 양 방법 모두는 RBC의 존재 하에 백혈구 용해로부터의 적당한 보호를 제공한다.

백혈구 손실/제거의 평가

샘플	초기 WBC	최종 WBC(용적 조정)	회수율 %
셀 세이버 5	5.79×103	6.10×103	100%
밀리포어 0.65 μm	5.79×103	5.63×103	100%

이어서, 배치 A 및 B를 8시간 동안 냉장시키고, 이 때 양 배치 모두를, 역시 바이러스성 물질을 제거하는 박스터 백혈구 감소(Baxter leuko-reducing) 필터에 통과시킨다. 배치 A는 1500 ml의 RBC를 산출하고, 한편 배치 B는 1200 ml의 RBC을 생성시킨다. 샘플을 세정 과정 전반에 걸쳐 각 배치로부터 추출한다.

세포 용해 및 기질 제거: 배치 A로부터의 1500 ml의 RBC를 6000 ml의 탈이온수로 희석한다. 세포를 45초 용해하도록 한 후, 750 ml의 9% N 염수(NS)를 용액에 첨가하여, 존재하는 임의의 백혈구의 용해를 최소화한다. 배치 B로부터의 1200 ml의 RBC를 4800 ml의 탈이온수로 용해시킨다. 이 시점에 배치 B에 염수를 첨가하지 않는다. 그 다음, 양 배치 모두를 0.22 마이크론 펠리콘(Pellicon) 필터 상에 통과시킨다. 일단 헤모글로빈이 여과되어 나오고 분리된 플라스크에 수집하면, 그것을 두 번째 10 K 달톤 펠리콘 필터 상에 통과시킨다. 이는 존재하는 임의의 염수를 여과 제거하여 폐기한다. 순수 헤모글로빈을 원래의 플라스크에 재순환시키고, 원하는 백분율, 예컨대 13.5%(w/v)로 농축한다.

요오도아세트아미드(IAM)로의 헤모글로빈의 설포히드리드 차단(blocking): 샘플을 13.5% Hb로 농축한 후, 산소를 전술된 바와 같이 제거하고, pH를 0.1 M 인산나트륨 완충액을 이용하여 7.4로 조정한다. 잔류 산소는 <10 ppb이다. 2 몰 당량의 IAM/몰 dSFH을 첨가하고, 반응을 1시간 동안 진행시킨다. 반응의 진행을 요오드화물 전극에 의해 모니터링한다. 미반응 IAM을 PBS을 이용한 한외여과에 의해 제거한다. 일단 요오드화물이 제거되면, 중간체 dCMSFH가 안정하고, 산소 장벽 용기에 포장될 수 있고, 실온에서 안전하게 저장될 수 있다.

탈산소화 및 가교: 안정한 중간체 생성물인 dCMSFH를 다시 무산소(<10 ppm) 환경에 두고, 용존 산소를 0.010 ppm 미만의 수준으로 제거한다. 막 접촉기 기술은 10 ppm 미만의 산소 수준을 갖는 조절된 대기 중에서 헤모글로빈을 탈산소화하는 데 이용되는 방법일 수 있다. 폴라로그래픽 용존 산소 프로브를 이용하여 양 배치 모두에 대해 초기 산소 포화 판독값을 취한다. 배치 A는 4 mg/L에서 초기 판독값을 가진다. 배치 B는 7 mg/L에서 초기 판독값을 가진다. 헤모글로빈을 펌핑하고, >28.5 in/Hg의 인가된 진공압에서 600 ml/분의 유속으로 연동 펌프를 이용하여 막 접촉기를 통해 재순환시킨다. 양 배치 모두에 대한 최종 산소 포화 수준은 <0.01 ppm이다. 이어서, 배치를, 가교를 위해 0.5 M NaOH를 이용하여 pH를 8.4로 조정한다. 일단 pH가 조정되면, 2.94 g의 비스-3,5-디브로모살리실 푸마레이트(DBSF)을 배치 A에 첨가하고(설프히드릴 당, 2몰 당량), 한편 1.47 g을 배치 B에 첨가한다(설프히드릴 당, 2몰 당량). 일단 가교가 완료되면, pH를 0.5 M 시트르산을 이용하여 7.4로 다시 조정하고, 배치를 냉장고에서 기밀 용기 내에 저장한다.

표준 샘플 제조와 함께, 벡크만 코울터 PA-800

프로테오믹스(Proteomics) 기기를 이용하여 수행되는 모세관 겔 전기영동 분석을 이용하여 반응을 모니터링하여, 가교 정도를 결정하고, 이로써 반응 경시 과정을 모니터링한다. 사량체의 95% 이상이 가교되면, 반응은 완전하다(데이터 비도시). 샘플을 또한 이중 파장 분광광도측정에 기초하여 혈액 산소 평형 곡선의 기록을 위해 헤목스 분석기에서 평가한다.

종합적 방법 A와 방법 B의 비교: 방법 A 및 방법 B 정제를 병렬 수행하여, 기질을 제거하고 백혈구 용해를 방지하면서 Hb를 방출함에 있어서의 효율을 비교한다. 이 중 어느 방법도 허용가능한 품질의 정제된 물질을 제공할 것이며, 양 방법 모두는 허용가능한 품질의 정제된 물질을 제공할 것이며, 본 발명의 방법에 사용하기 위해 양 방법 모두의 조합이 구상될 수 있다.

실시예 2

백혈 세포의 용해

WBC 용해의 상대적 시간의 결정을 입증한다. WBC 대비 RBC의 우선적 용해는 적혈 세포 용해의 최적화를 허용하여, 용해된 WBC로부터의 프로테아제를 역시 도입하지 않으면서 최대량의 헤모글로빈을 수득한다.

절차: 2000 ml의 전혈을 셀 세이버 5의 100 μ 저장고 필터만을 통해 여과한다. 이어서, 7개 비이커에 200 ml의 혈액을 충전한다. 일단 비이커를 대조군으로 표시한다. 이어서, 다른 6개 비이커를 30초, 및 이어서 1, 2, 3, 4 및 5분의 시점에 용해를 위한 특정 시점으로 할당한다. 대조군 비이커를 개시하고, 910 ml의 0.9% 염수 용액을 첨가한다. 30초, 1, 2, 3, 4 및 5분의 시간 증분에서, 10 ml 샘플을 백혈 세포 분석을 위해 취한다.

나머지 6개 비이커에 대해 800 ml의 탈이온수를 첨가한다. 30초 후, 110 ml의 9% 염수를 첫 번째 비이커에 첨가하여, 용해를 중지시킨다. 대략 30초 동안 교반되도록 둔 후, 백혈 세포 분석을 위해 10 ml 샘플을 취한다. 1분 후, 110 ml의 9% 염수를 이어서 두 번째 비이커에 첨가한다. 다시 30초 동안 교반되도록 둔 후, 10 ml 샘플을 취한다. 나머지 4개 비이커에 대해, 110 ml의 9% 염수를 2, 3, 4 및 5분에 첨가하여, 용해를 중지시킨다. 각 시간 증분 후, 10 ml 샘플을 표준 WBC 정량화를 통한 백혈 세포 분석을 위해 각각으로부터 취한다.

결론: 도 2에서 보는 바와 같이, 백혈 세포의 용해가 2분과 3분 사이에 일어날 수 있다. 따라서, 적혈 세포 용해를 최적화하기 위해, 용해를 2분 시점에 중지할 수 있다. 탈이온수 및 염수의 첨가로 인해, 용적이 증가된다. 표 7에 나와 있는 결과는 희석에 대해 보정된 것이다.

WBC의 상대적 용해 시간의 측정

시간	대조군 (K/mm3) (대조군 비이커)	실험군 (K/mm3) (비이커 1 내지 6)
30초	5.9	5.2
1분	5.4	4.9
2분	5.8	5.0
3분	7.4	4.5
4분	6.8	4.0
5분	5.7	3.4

실시예 3

토끼 안전성 시험

재료: 옥내 토끼를 길러, 표준 동물 축산에 의해 처리한다. dXCMSFH 주입을 위해, 22 또는 24 게이지 카테터를 면도된 국소 마취되어진 귀 정맥을 이용하여, IV 접근을 달성한다. 시린지 펌프를 이용하여 IV 주입을 측량하고, 총 체적은 통상 45 내지 60분에 걸쳐 주어진다. 혈액을 토끼로부터 제거할 때, 그것은 20 내지 22 게이지 카테터를 다른 쪽 귀의 동맥에 삽입함으로써 수행된다. 절차 및 주입은 벨크로 천 랩(Velcro cloth wrap) 유형의 구속을 이용하여 행해진다.

방법: 프로토콜 A: 상기와 같이 주입을 위해 토끼를 준비한다. 투여되는 dXCMSFH는 pH 7.40 완충 NS 중에 TCS 헤목스-분석기에서 결정 시에 O₂에 대한 p50이 28 내지 32이고, 본 발명의 변형된 헤모글로빈에 대해 12% w/v이다. 주입되는 dXCMSFH의 양은 토끼의 평가된 혈액 용적의 10%(56 ml/kg)에 기초한다. 이 양을 주사기에 두고, 45 내지 60분에 걸쳐 펌프에 의해 주입한다. 이어서, IV 카테터를 토끼의 귀로부터 제거하고, 토끼를 우리로 되돌려 보내 관찰한다. 대조군 토끼에게 NO-차단 화학적 변형을 가하지 않은 Hb를 제공한다.

프로토콜 B: 상기와 같이 정맥 및 동맥 접근을 준비한다. 유의적 양, 즉 54 내지 75 cc의 토끼 혈액을 동맥 카테터로부터 제거함과 동시에, 동일 용적의 dXCMSFH를 정맥 접근을 통해 주입한다. 이 절차는 총 시간 12 내지 20분 후에 달성된다. 후속하여 제2일 및 제3일에, 15 cc의 dXCMSFH를, 주입 간의 시간을 4시간으로 하고 각 일일 2회로 하여, 30분 간격으로 헤파린 잠금 정맥 카테터를 통해 주입한다.

결과: 표 8에 나와 있는 바와 같이 대략 1시간에 걸쳐, 프로토콜 A에 따라 스물다섯 마리(25)의 토끼를 주입한다. 이들 토끼 모두는 72시간 초과 및 75시간 이하 생존하고, 어떠한 사망도 없다. 세 마리(3) 토끼에 NO-차단 화학적 변형을 가하지 않은 Hb를 주입한다. 이들 토끼 모두는 표 9에 나와 있는 바와 같이, 주입 개시 7 내지 12시간 내에 사망한다. 네 마리(4) 토끼에게 표 10에 나와 있는 바와 같이 프로토콜 B에 따라 다량의 dXCMSFH를 제공한다. 이들 토끼 모두가 생존하고, 2주 초과 동안 건강하며, 어떠한 후속 사망도 없다. 프로토콜 A 또는 B에서 dXCMSFH로 처리한 토끼는 100% 생존율을 나타내고 현저한 질병율(morbidity)의 표시도 없다. 그러므로, 650 내지 7500 mg/kg의 XCMSFH를 제공한 실험 대상은 실험 프로토콜 A 및 B를 잘 견디고, 한편 추가 변형을 가하지 않은 무세포 Hb를 제공한 처리 군은 125 내지 160 mg/kg의 수준에서 첫 번째 투여 시에 사망한다.

토끼 ID	체중(Kg)	dXCMSFH 용량(mg/Kg)	결과
11	2.47	567	생존
15	2.4	583	생존
13	2.62	534	생존
B7	2.36	636	생존
CO	2.52	476	생존
B3	2.24	670	생존
B1	2.8	714	생존
C02	2.65	566	생존
E03	2.38	630	생존
04	2.1	1143	생존
07	2.26	1062	생존
C8	2.39	1004	생존
MH2	3.12	808	생존
LHD	2.78	647	생존
D03	2.3	783	생존
D01	2.06	874	생존
05	2.29	629	생존
03	2.02	713	생존
01	2.12	679	생존
JSD	2.13	676	생존
D04	2.26	637	생존
MH4	2.51	574	생존
K03	2.27	634	생존
D08	2.28	632	생존
D12	2.42	595	생존

토끼 ID	체중(Kg)	경과 시간(min)	dSFH 용량(mg/Kg)	결과
06	2.04	7	98	사망
10	2.39	12	126	사망
09	2.42	8	83	사망

토끼 ID	체중(Kg)	dXCMSFH(mg)	dXCMSFH 용량(mg/Kg)	결과
B03	3.1	12000	3871	생존
F02	2.79	11500	4122	생존
F01	3.02	13800	4570	생존
F05	2.65	12700	4792	생존

실시예 4

돼지 안전성 시험

재료 및 방법: 체중이 10 내지 16 킬로그램인 12마리 새끼 돼지를 연구하였다. 연구에 포함시키기 전에, 심장 기형 및 대동맥판 직경 측정을 위한 2D 초음파 심장 진단도(echocardiogram)에 의한 비침습성 스크리닝을 수행하였다. XCMSFH 용액의 상단 로딩을 개시하기 전에, 5 mg의 라식스(Lasix) 40 mg/ml 농도를 IV 달성 직후에 각 새끼 돼지에 투여하였다. XCMSFH 용액은 산소에 대한 p50이 32이고, 농도가 12 그램%(120 mg XCMSFH/ml)이었다. 각 새끼 돼지에게 1200 mg XCMSFH/kg 체중을 제공하였다.

뒷다리에서 혈압 커프(cuff)를 이용하여 비침습성 심장 데이터를 수득하였다. 도플러 초음파(USCOM)를 사용하여, 주입 전반에 걸쳐 각종 시점에 박동과 박동 사이의 심박출량을 측정하였다. 분석을 위해 선택된 데이터는 임의의 시점에서 수득된 최량의 초음파 형태를 나타냈다. 상단 로딩 시, 연구 물질의 첨가를 울혈성 심부전을 생성시키는 체액의 상단 경계에 의해 제한하였다.

14.3%의 계산된 혈액 용적(70 ml 혈액/ kg 체중)과 동등한 양을 1시간의 과정을 걸쳐 말초 IV를 통해 주입하였다. 대상 돼지를 마취하거나 진정시키거나 침습 방식으로 모니터링하지 않았다.

결과: 도 7a-d는 체중에 대해 보정된 값인, 주입된 XCMSFH의 함수로서의 심박출량, 전신 혈관 저항, 수축기 혈압 및 이완기 혈압을 순차적으로 나타낸다. 모든 새끼 돼지들은 주입을 잘 견뎠고; 대상의 사망은 없었다. 변수를 상관시키는 최소자승법을 사용하여, 데이터를 평가하였고, 이에 기울기 및 절편이 제공되었다. 주입된 XCMSFH의 양과 무관하게, 임의의 파라미터의 데이터에서의 큰 가변성이 있음은 매우 명백하다. 이는 대상을 진정시키거나 구속하지 않았다는 사실과 관계가 있다. 임의의 실험을 개시하기 전이라도 대상의 파라미터 간에 유의적 변동이 있었으나, 각성, 세척 및 취급이 대부분의 변동을 설명하는 것으로 보였다.

이 연구의 결과는, 이들 지수의 평균(최대, 최소)이 각기 심박출량, 1.12 L/분(2.7, 0.45); 전신 혈관 저항, 7008 dynes.sec/cm⁵(21590-3364); 수축기 혈압, 156.69 mmHg(193-130); 및 이완기 혈압, 95.75 mmHg(113-72)이었음을 보여주었다. 심박출량에 대한 기준선 값은 1.26 L/분(1.62, 0.72); 전신 혈관 저항 9588 dynes.sec/cm⁵(12662-4991); 수축기 혈압 140 mmHg(159-123); 및 이완기 혈압, 84.25 mmHg(111-72)이었다. 심박출량은 약간(<5%) 감소하는 것으로 관찰된 반면, 전신 저항은 대략 30% 증가하였다. 수축기 혈압 및 이완기 혈압 모두는 주입 중에 약간(각각 12% 및 14%) 증가하였다. XCMSFH의 변동된 용량 과부하와 혈행동태 지수 간의 관계가 도 7a-d에 나와 있다. 이들 지수에 대한 XCMSFH의 영향은 최소이나, 이 효과는 전달된 % 용적 과부하에 의존하는 것을 보인다.

이 연구에서, 주입된 XCMSFH의 양과 명백히 독립적인 모든 파라미터들에 대해 유의적 가변성이 나타났다. 이 심장 파라미터의 최소 변화량은 혈액 용적의 증가, 본질적으로 체액이 과부하된 대상으로 인한 것일 수 있다. 이 연구의 결과는, 모든 대상들이 실험에서 남아 생존하였고, 혈관활성과 관련하여 관찰된 심장 파라미터에 최소 변화가 있었음을 가리킨다.

프리온 안전성: 본 발명의 Hb가 프리온임을 확실히 하기 위해 다수의 측정을 취한다. 적당한 동물의 선택이 초기 단계로서, 닫힌 무리군으로부터 동물 단백질을 공급하지 않고 항생제를 제공하지 않으며 30개월령 미만인 동물만을 선택하였다. 오염의 방지를 위한 두 번째 중점은 혈액에 뇌 물질이 혼합되는 것을 막기 위해 세심히 주의하는 것이다. "머쉬룸 스터너(mushroom stunner)" 접근법의 희생 방법은 뇌 물질 오염 가능성을 없애고 이에 따라 수집된 혈액에 프리온 함유 물질의 잠재적 도입을 없애는 것이다. 또한, Hb를 가공할 때, 혈장 단백질을 제거하기 위한 세정 절차는 또한 프리온도 제거할 것이다. 부가적으로, Hb를 300,00 Da 분자량 필터를 통해 여과할 때, 임의의 프리온을 제거할 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 Hb를 폴(Pall) 필터를 통해 가공하여 백혈구를 제거한다. 이 시점에서, 프리온 및 바이러스와 같은 작은 형성체를 제거할 수 있다. 이 주의사항들 모두는 인간 치료제 및 긴급 절차에서 사용하기 위한 본 발명의 Hb의 안전성을 확보하기 위해 조작한다.

탈산소화된 상태 및 산소화된 상태. 본 발명의 NO-차단 및 안정한 NO-차단 사량체 헤모글로빈은 탈산소화된 종으로서 저장하고 수송하기 위해 포장된다. 많은 치료 용도들을 위해, 변형된 헤모글로빈이 탈산소화된 상태로 사용된다. 관류가 필요한 용도에서, 예를 들어 관찰을 위해 생조직의 분야를 청산할 때, 허혈 영역을 관류시킬 때, 또는 이식 전에 생체외 기관을 유지할 때, 변형된 헤모글로빈은 조직 기능을 지지하기 위해 재산소화된 상태로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태를 본원에 나타내고 기재하였으나, 당업자에게는 그러한 실시양태가 단지 예로서 제공된 것임이 명백할 것이다. 다수의 변형, 변화 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않도록 하면서 당업자에게 나타날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 각종 대안양태가 본 발명을 수행함에 있어 이용될 수 있음을 이해하도록 한다. 하기 특허청구범위는 본 발명의 범주를 한정하고 이 청구범위 및 이의 균등양태의 범주 내에 속하는 방법 및 구조가 본원에 포괄되도록 의도된다.

Claims (125)

1. 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성(proteinaceous) 철 함유 화합물로서, 상기 시스테인 부분은 상기 단백질성 화합물이 상기 시스테인 부위에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함하는 단백질성 철 함유 화합물.
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 가교(crosslinked) 사량체 헤모글로빈인 단백질성 철 함유 화합물.
3. 제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 비발열(non-pyrogenic), 무내독소(endotoxin free) 및 무기질(stroma free)인 단백질성 철 함유 화합물.
4. 제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 무산소(oxygen free)인 단백질성 철 함유 화합물.
5. 제2항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것인 단백질성 철 함유 화합물.
6. 제2항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의 해 변형된 것인 단백질성 철 함유 화합물.
7. 제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 인간 헤모글로빈인 단백질성 철 함유 화합물.
8. 제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 소 또는 돼지 헤모글로빈인 단백질성 철 함유 화합물.
9. 제1항에 있어서, 상기 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단백질성 철 함유 화합물.
10. 제1항에 있어서, 상기 티올 보호기가 카르복사미도메틸 기인 단백질성 철 함유 화합물.
11. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 산소 전달 용량을 증가시키는 것인 단백질성 철 함유 화합물.
12. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송하는 것인 단백질성 철 함유 화합물.
13. 제1항의 상기 단백질성 철 함유 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
14. 제1항의 상기 상기 단백질성 철 함유 화합물을 포함한 조성물을 함유하는 용기.
15. 약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물로서, 상기 시스테인 부분은 티올 보호기를 포함하고, 상기 화합물은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송하는 단백질성 철 함유 화합물.
16. 제15항에 있어서, 상기 화합물이 가교 사량체 헤모글로빈인 단백질성 철 함유 화합물.
17. 제15항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 비발열, 무내독소, 무산소 및 무기질인 단백질성 철 함유 화합물.
18. 제16항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것인 단백질성 철 함유 화합물.
19. 제16항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의해 변형된 것인 단백질성 철 함유 화합물.
20. 제15항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 인간 헤모글로빈인 단백질성 철 함유 화합물.
21. 제15항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 소 또는 돼지 헤모글로빈인 단백질성 철 함유 화합물.
22. 제15항에 있어서, 상기 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단백 질성 철 함유 화합물.
23. 제16항에 있어서, 상기 티올 보호기가 카르복사미도메틸 기인 단백질성 철 함유 화합물.
24. 제15항에 있어서, 상기 화합물은 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖는 것인 단백질성 철 함유 화합물.
25. 제1항의 단백질성 철 함유 화합물을 포함하는 조성물.
26. 제25항에 있어서, 상기 화합물이 비발열, 무내독소 및 무기질인 조성물.
27. 제25항에 있어서, 상기 화합물이 무산소인 조성물.
28. 제28항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
29. 제28항에 있어서, 포장(packaging)을 포함하는 조성물.
30. 제2항의 단백질성 철 함유 화합물을 포함하는 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 화합물이 비발열, 무내독소 및 무기질인 조성물.
32. 제30항에 있어서, 상기 화합물인 무산소인 조성물.
33. 제30항에 있어서, 상기 조성물은 디브로모 살리실산을 함유하지 않는 것인 조성물.
34. 제30항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
35. 제30항에 있어서, 상기 조성물은 완충된 것인 조성물.
36. 제30항에 있어서, 상기 조성물은 포장을 포함하는 것인 조성물.
37. 포유동물의 혈액을 보충하는 방법으로서,

    약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물로서, 상기 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위에서 산화질소에 결합할 수 없도록 티올 보호기를 포함하는 것인 단백질성 철 함유 화합물, 및

    약학적으로 허용가능한 담체

    를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계

    를 포함하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 단백질성 철 함유 화합물이 가교 사량체 헤모글로빈인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 비발열, 무내독소, 무산소 및 무기질인 방법.
40. 제38항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것인 방법.
41. 제38항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의해 변형된 것인 방법.
42. 제38항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 인간 헤모글로빈인 방법.
43. 제38항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 소 또는 돼지 헤모글로빈인 방법.
44. 제37항에 있어서, 상기 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카 르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
45. 제37항에 있어서, 상기 티올 보호기가 카르복사미도메틸 기인 방법.
46. 제37항에 있어서, 상기 화합물은 산소 전달 용량을 증가시키는 것인 방법.
47. 제37항에 있어서, 상기 화합물은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송하는 것인 방법.
48. 제37항에 있어서, 상기 투여 단계는 임플란트, 주사 또는 수혈에 의한 것인 방법.
49. 제37항에 있어서, 상기 포유동물은 빈혈증, 빈혈증 관련 증상, 저산소증 또는 허혈을 앓고 있는 것인 방법.
50. 제37항에 있어서, 상기 포유동물은 혈액 수혈을 필요로 하는 것인 방법.
51. 제37항에 있어서, 상기 포유동물은 외상 상태로 존재하는 것인 방법.
52. 가교 헤모글로빈으로서, 상기 헤모글로빈은 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 것인 가교 헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,

    (a) 적혈 세포를 함유하는 조제물로부터 내독소를 제거하는 단계;

    (b) 상기 적혈 세포를 용해시키는 단계;

    (c) 상기 용해된 적혈 세포로부터 기질을 제거함으로써 헤모글로빈을 분리하는 단계;

    (d) 임의적으로, 상기 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 단계;

    (e) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 단계; 및

    (f) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 단계

    를 포함하는 공정에 의해 이루어진 방법.
53. 제52항에 있어서, 상기 시약은 4-피리딜메틸 클로라이드, 알콕시알킬클로라이드, 디메톡시메탄, N-(히드록시메틸)아세트아미드, 트리페닐메틸 클로라이드, 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 할로아세트아미드, 요오도아세테이트, 벤질 클로라이드, 벤조일 클로라이드, 디-tert-부틸 디카르보네이트, p-히드록시펜아실 브로마이드, p-아세톡시벤질 클로라이드, p-메톡시벤질 클로라이드, 2,4-디니트로페 닐 플루오라이드, 테트라히드로피란, 아세트아미도히드록시메탄, 아세톤, 비스-카르보에톡시에텐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드, tert-부톡시카르보닐 클로라이드, 알킬 이소시아네이트 및 알콕시알킬 이소시아네이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 할로아세트아미드가 요오도아세트아미드인 방법.
55. 제52항에 있어서, 상기 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
56. 제52항에 있어서, 상기 티올 보호기가 카르복사미도메틸인 방법.
57. 제52항에 있어서, 상기 공정은

    (a) 임의적으로, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 단계; 및

    (b) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글 로빈을 가교하는 단계

    를 추가로 포함하는 것인 방법.
58. 제52항에 있어서, 상기 산소는 접촉기 막 기술에 의해 제거되는 것인 방법.
59. 제52항 또는 제57항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈이 비발열, 무내독소, 무산소 및 무기질인 방법.
60. 제52항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 시스테인 기에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것인 방법.
61. 제52항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의해 변형된 것인 방법.
62. 제52항 또는 제57항에 있어서, 상기 적혈 세포가 인간 적혈 세포인 방법.
63. 제52항 또는 제57항에 있어서, 상기 적혈 세포가 소 또는 돼지 적혈 세포인 방법.
64. 제52항 또는 제57항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈은 산화질소에 결합할 수 없는 것인 방법.
65. 제52항 또는 제57항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈은 산소 전달 용량을 증가시키는 것인 방법.
66. 제52항 또는 제57항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송하는 것인 방법.
67. 사량체 헤모글로빈으로서, 상기 헤모글로빈 내의 시스테인은 티올 보호기에 부착되어 있는 것인 사량체 헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,

    (a) 적혈 세포를 함유하는 조제물로부터 내독소를 제거하는 단계;

    (b) 상기 적혈 세포를 용해시키는 단계;

    (c) 상기 용해된 적혈 세포로부터 기질을 제거함으로써 헤모글로빈을 분리하는 단계;

    (d) 임의적으로, 상기 헤모글로빈을 탈산소화하는 단계;

    (e) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 단계; 및

    (f) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 단계

    를 포함하는 공정에 의해 이루어진 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 시약은 4-피리딜메틸 클로라이드, 알콕시알킬클로라이드, 디메톡시메탄, N-(히드록시메틸)아세트아미드, 트리페닐메틸 클로라이드, 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 할로아세트아미드, 요오도아세테이트, 벤질 클로라이드, 벤조일 클로라이드, 디-tert-부틸 디카르보네이트, p-히드록시펜아실 브로마이드, p-아세톡시벤질 클로라이드, p-메톡시벤질 클로라이드, 2,4-디니트로페닐 플루오라이드, 테트라히드로피란, 아세트아미도히드록시메탄, 아세톤, 비스-카르보에톡시에텐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드, tert-부톡시카르보닐 클로라이드, 알킬 이소시아네이트 및 알콕시알킬 이소시아네이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 시약이 요오도아세트아미드인 방법.
70. 제67항에 있어서, 상기 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
71. 제67항에 있어서, 상기 티올 보호기가 카르복사미도메틸인 방법.
72. 제67항에 있어서, 상기 공정은

    (a) 임의적으로, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 단계; 및

    (b) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈을 가교하는 단계

    를 추가로 포함하는 것인 방법.
73. 제67항에 있어서, 상기 산소는 접촉기 막 기술에 의해 제거되는 것인 방법.
74. 제67항 또는 제72항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈이 비발열, 무내독소, 무산소 및 무기질인 방법.
75. 제72항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것인 방법.
76. 제72항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의해 변형된 것인 방법.
77. 제67항 또는 제72항에 있어서, 상기 적혈 세포가 인간 적혈 세포인 방법.
78. 제67항 또는 제72항에 있어서, 상기 적혈 세포가 소 또는 돼지 적혈 세포인 방법.
79. 제67항 또는 제72항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 산화질소에 결합할 수 없는 것인 방법.
80. 제67항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈은 산소 전달 용량을 증가시키는 것인 방법.
81. 제67항에 있어서, 상기 사량체 헤모글로빈은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송하는 것인 방법.
82. 헤모글로빈으로서, 상기 헤모글로빈 내의 시스테인은 티올 보호기에 부착되어 있는 것인 헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,

    (a) 상기 헤모글로빈의 시스테인에 티올 보호기를 제공하는 시약을 헤모글로빈 용액에 첨가하는 단계, 및

    (b) 헤모글로빈의 시스테인 기에 부착된 티올 보호기를 갖는 헤모글로빈을 분리하는 단계

    를 포함하는 공정에 의해 이루어진 방법.
83. 가교 사량체 헤모글로빈을 제조하는 방법으로서,

    (a) 임의적으로, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 사량체 헤모글로빈으로부터 산소를 제거하는 단계; 및

    (b) 상기 헤모글로빈을 가교하는 단계

    를 포함하는 공정에 의해 이루어진 방법.
84. 제83항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 시스테인에 부착된 티올 보호기를 갖는 상기 사량체 헤모글로빈이 비발열, 무내독소 및 무기질인 방법.
85. 제83항에 있어서, 상기 가교 사량체 헤모글로빈으로부터 디브로모 살리실산을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
86. 제83항에 있어서, 완충액을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
87. 제83항에 있어서, 상기 가교 사량체 헤모글로빈을 포장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
88. 제83항, 제84항 또는 제85항의 생성물을 함유하는 팩키지.
89. 유효량의 제2항의 생성물을 투여함으로써, 적혈 세포를 필요로 하는 포유동물을 치료하는 방법.
90. 제89항에 있어서, 포유동물은 빈혈증, 빈혈증 관련 증상, 저산소증 또는 허혈에 대해 치료 중인 것인 방법.
91. 제89항에 있어서, 대상은 실혈로 인한 외상에 대해 치료 중인 것인 방법.
92. 장애를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법으로서,

    약 60,000 달톤 내지 약 500,000 달톤의 분자량을 갖고 하나 이상의 시스테인 부분을 갖는 단백질성 철 함유 화합물로서, 상기 시스테인 부분은 단백질성 화합물이 시스테인 부위에서 산화질소에 대한 감소된 결합 능력을 갖도록 티올 보호기를 포함하는 것인 단백질성 철 함유 화합물, 및

    약학적으로 허용가능한 담체

    를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계

    를 포함하는 방법.
93. 제92항에 있어서, 상기 단백질성 철 함유 화합물이 가교 사량체 헤모글로빈 인 방법.
94. 제92항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 비발열, 무내독소, 무산소 및 무기질인 방법.
95. 제92항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 비스-3',5'-디브로모 살리실 푸마레이트와 가교된 것인 방법.
96. 제92항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 피리독살-5'-포스페이트와의 반응에 의해 변형된 것인 방법.
97. 제92항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 인간 헤모글로빈인 방법.
98. 제92항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 소 또는 돼지 헤모글로빈인 방법.
99. 제92항에 있어서, 상기 티올 보호기는 4-피리딜메틸, 아세틸아미노메틸, 알콕시알킬, 트리페닐메틸, 카르복사미도메틸, 아세틸, 벤질, 벤조일, tert-부톡시카르보닐, p-히드록시펜아실, p-아세톡시벤질, p-메톡시벤질, 2,4-디니트로페닐, 이소부톡시메틸, 테트라히드로피라닐, 아세트아미도메틸, 벤즈아미도메틸, 비스-카르보에톡시에틸, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, N-알킬 카 르바메이트 및 N-알콕시알킬 카르바메이트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
100. 제92항에 있어서, 상기 티올 보호기가 카르복사미도메틸 기인 방법.
101. 제92항에 있어서, 상기 화합물은 산소 전달 용량을 증가시키는 것인 방법.
102. 제92항에 있어서, 상기 화합물은 약 20 mm Hg 내지 약 45 mm Hg의 p50으로 산소를 수송하는 것인 방법.
103. 제92항에 있어서, 상기 투여 단계는 임플란트, 주사 또는 수혈에 의한 것인 방법.
104. 제92항에 있어서, 상기 장애는 빈혈증, 빈혈증 관련 증상, 저산소증 및 허혈로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
105. 제104항에 있어서, 상기 빈혈증 및 빈혈증 관련 증상은 신부전, 당뇨병, AIDS, 화학요법, 방사선요법, 간염, G.I. 실혈, 철분 결핍 또는 월경과다에 의해 유발된 것인 방법.
106. 제104항에 있어서, 상기 포유동물에게 에리트로포이에틴 요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
107. 제104항에 있어서, 상기 허혈은 화상, 뇌졸중, 신생 뇌졸중(emerging stroke), 일과성 허혈 발작, 심근 기절 및 동면, 급성 협심증, 불안정성 협심증, 신생 협심증(emerging angima) 또는 경색증에 의해 유발된 것인 방법.
108. 제92항에 있어서, 상기 장애가 일산화탄소 중독인 방법.
109. 제92항에 있어서, 상기 장애가 수술후 회복인 방법.
110. 제92항에 있어서, 상기 장애가 당뇨병성 상처 치유인 방법.
111. 제92항에 있어서, 상기 장애가 겸상적혈구 빈혈증인 방법.
112. 제111항에 있어서, 상기 투여 단계는 수술 전에 행해지는 것인 방법.
113. 제92항에 있어서, 상기 장애가 급성 관상동맥 증후군인 방법.
114. 제92항에 있어서, 상기 포유동물은 혈액 수혈을 필요로 하는 것인 방법.
115. 제92항에 있어서, 상기 포유동물은 외상을 앓고 있는 것인 방법.
116. 제92항에 있어서, 상기 장애가 환경적 스트레스 또는 신체적 스트레스에 의해 유발된 산소 전달 용량의 결여인 방법.
117. 제92항에 있어서, 상기 장애가 심인성 쇼크인 방법.
118. 제92항에 있어서, 상기 투여 단계는 방사선요법과 조합하여 수행되는 것인 방법.
119. 제92항에 있어서, 상기 포유동물에게 산소 의존성 약학적 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
120. 제92항에 있어서, 상기 포유동물에 대한 상기 투여 단계는 생체내 혈관내 공간의 가시화를 허용하는 것인 방법.
121. 제120항에 있어서, 상기 포유동물에 대한 상기 투여 단계 전에 상기 단백질성 철 함유 화합물을 재산소화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
122. 유효량의 제2항의 생성물을 투여하는 단계를 포함하는, 기관을 관류시키는 방법.
123. 제122항에 있어서, 상기 투여 단계는 생체내 수행되는 것인 방법.
124. 제122항에 있어서, 상기 투여 단계는 생체외 수행되는 것인 방법.
125. 제122항에 있어서, 제2항의 상기 생성물을 재산소화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

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