JP2852127B2 - 安定なタンパク質:リン脂質組成物及び方法 - Google Patents

安定なタンパク質:リン脂質組成物及び方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、溶融球状態に遷移することが可能なタンパ
ク質の二次及び三次構造を安定化させるために有用なタ
ンパク質:リン脂質構造に関する。より特定的には本発
明は、高い安定性を有しており、G−CSF製剤及び新規
G−CSF送達ビヒクルで使用することが可能なG−CSF:
リン脂質組成物に関する。
数種のタンパク質が溶融球状態(MGS)に遷移するこ
とは報告されている。Van der Goot,F.G.,Nature 35
4,408−410(1991)。溶融球状態のタンパク質は天然タ
ンパク質と同様の二次構造を示すが、固定した三次構造
を欠く。Pitsynら,FEBS Letters 262:1,20−24(199
0)。場合により、この状態への遷移に伴い、それまで
隠されていたタンパク質の疎水性領域が露出する。重要
な疎水性残基露出させることにより、MGSはタンパク質
の凝集及び沈殿における中間体となり得る。MGSコンフ
ォーメーションは、遠UV領域における円二色性を芳香族
側鎖のスペクトル(近UV円二色性及び蛍光)と比較する
ことにより検出することができる。溶融球状態は遠UV円
二色性変化の不在下で芳香族基のスペクトル変化を示し
(Bychkovaら,FEBS Letters 238:231−234(198
8))、ある種のタンパク質による膜浸透に関与し得る
(Bychkovaら,FEBS Letters 238:231−234(1988);V
an der Goot,F.G.,Nature 354,408−410(199
1))。
凝集前にMGSに遷移することが知られている2種のタ
ンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)及び
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)で
ある。これらの2種のタンパク質は所定の規定条件下で
安定化させることができるが、タンパク質の二次及び三
次構造を安定化させることによりこれらの材料の貯蔵寿
命を延長することが必要とされている。
ヒト組換えG−CSFは、感染を防除するために使用さ
れる白血球の1種である好中球を選択的に刺激する。現
在では、組換えG−CSFであるFilgrastimが治療用とし
て利用可能である。種々の条件下のG−CSFの構造は広
く研究されている(Luら,J.Biol.Chem.Vol.267,8770−8
777(1992))。G−CSFは疎水性であるため、貯蔵寿命
を延長するように調合することは困難である。ある種の
疎水性タンパク質の調合物は、長期貯蔵中に二量体及び
高次凝集物(高分子)を形成するため、活性を失う。貯
蔵中に脱アミド化及び酸化等の他の化学変化が生じる恐
れもある。更に、G−CSF調合者は変性から保護しなけ
ればならず、特にタンパク質の二次及び三次構造の安定
姓を維持するように注意しなければならない。
ヒトGM−CSFはマクロファージ及び顆粒球祖先細胞のi
n vitro増殖に持続的に必要な22kDa糖タンパク質であ
る。ヒトGM−CSFは更に、顆粒球及びマクロファージを
形成するこれらの祖先細胞の不可逆的関与を制御する。
その他、成熟細胞型の機能的活性の調節(Goughら,Natu
re,309,763−767(1984))や、認識された化学誘引物
質に向かう走化性の増加(Williamsら,Hematology,第4
版(1990))等の生物活性もある。GM−CSFは更に単球
の産生を刺激し、従って単球減少症等の単球疾患の治療
に有用であり得る。
ヒトGM−CSFは多くの起源から入手及び精製すること
ができる。組換えヒトGM−CSFの製造手順はBurgessら,B
lood,69:1,43−51(1987)により既に記載されている。
参考資料として本明細書の一部とする米国特許第5,047,
504号(Boone)により、商業規模量の非グリコシル化形
態のGM−CSFを原核宿主細胞発現産物として製造するこ
とが可能になった。
G−CSF及びGM−CSF等のタンパク質を操作するために
過去に試みられている1つの方法はリポソームの使用で
ある。リポソームは、非水溶性極性脂質、特にリン脂質
により形成される完全に閉鎖した脂質二重層膜である。
リポソーム小胞は単一膜二重層(単ラメラ)でもよい
し、多重膜二重層(多重ラメラ)でもよい。二重層は親
水性(極性)「ヘッド」領域と疎水性(非極性)「テー
ル」領域とを有する2つの脂質単分子層から構成され、
疎水性テールは二重層の中心に向いており、親水性ヘッ
ドは水相に向いている。リポソームの安定性、剛性及び
浸透性は、リン脂質組成の変化、温度変化、ステロール
の配合又は帯電両親媒性分子の組込みにより変化し得
る。リポソームの基本構造は当業者に公知の種々の方法
により形成することができる。
リポソームはその形成プロセスにおいて水性チャンネ
ルに水溶質をトラップし、可変速度で放出することがで
きる。リポソームが酵素を細胞に導入してその代謝を変
化させ得ることが発見させて以来(Gregoriadis,New E
ngl.J.Med.295,704−710,765−770(1976))、リポソ
ームは目的薬剤送達という課題に対する解答として期待
される。その結果、リポソームの疎水性層又は疎水性コ
アの内側に封鎖された薬剤、ビタミン及びタンパク質の
遅放性デポー製剤としてリポソームを使用する開発研究
に医薬業界で関心が高まっている。
リポソームを薬剤キャリヤーとして使用するように試
みた研究者はいくつかの問題に遭遇したため、その使用
成果は限られていた。例えば、リポソームはトラップし
た抗原への強力な免疫付加物として作用することが知ら
れており、異種発生起源の酵素又は他のタンパク質をリ
ポソームにトラップする場合には注意が必要である。更
に、薬剤の拡散速度を制御することは困難である。これ
は、リポソームの固有の不安定性と、所定の薬剤の拡散
を助長する所定の血液成分の存在とに起因する。更に、
その性質によりリポソームにトラップしにくい物質もあ
り、従って、このような物質は循環中に迅速に拡散す
る。最後に、細胞又は肝臓もしくは脾臓以外の臓器に標
的するという問題もあった。リポソーム、リポソームに
組込まれた物質及び薬剤キャリヤーとしてのリポソーム
の使用に関連する問題の優れた論文は、Drug Carriers
in Biology and Medicine,第14章,287−341(Acad
emic Press,N.T.,1979)に所収のGregory Gregoriaid
is著“Liposomes"に報告されている。
リポソームを薬剤キャリヤーとして使用する試みにつ
いては多数のものが報告されているが、ペプチド及び/
又はタンパク質の構造を安定化させることにより治療用
ペプチド又はタンパク質の貯蔵寿命を延長することを目
的としたリポソームの使用については殆ど開示されてい
ない。国際特許出願第PCT/US90/05163号(発明の名称
“Therapeutic Peptides and Proteins",Hostetler
ら)には、空気/水界面におけるポリペプチド及び/又
はタンパク質の蓄積を阻止し、容器表面へのポリペプチ
ド及び/又はタンパク質の吸着を阻止するために、ポリ
ペプチド及び/又はタンパク質を可溶化する医薬的に許
容可能な希釈剤としての空のリポソームの使用が開示さ
れている。Hostetlerらは、負に帯電したリン脂質を約5
0モル%まで添加し得ること、及び天然リン脂質である
ホスファチジルコリンが好適リポソームであることを開
示している。しかしながら、Hostetlerらは、ポリペプ
チド及び/又はタンパク質の構造を安定化させる希釈剤
については報告していない。
国際特許出願第PCT/US91/07694号(発明の名称“Prep
aration and Characterization of Liposomal For
mulations of Tumor Necrosis Factor",Hungら)に
は、表面と会合するか又はリポソーム内に閉じ込められ
た親脂性修飾腫瘍壊死因子(TNF)分子が記憶されてい
る。リポソーム親脂性TNF分子は高いin vivo安定性を
有することが報告されている。安定性とは、TNF−リポ
ソームから系統へのTNFのiv vivo漏出の減少又は減少
傾向の意であった。好適リポソームは中性脂質であっ
た。Hungらは、賦形剤がタンパク質の構造に安定化効果
を有するようなTNF組成物については開示していない。
タンパク質(例えばG−CSF)を負に帯電した脂質小
胞と接触させ、熱誘導凝集、変性、活性損失及び二次構
造の変性に対してタンパク質を直接安定化させることに
ついては文献から何ら予想することができない。高温を
要する調剤手順で有用であり且つ新規送達ビヒクル(例
えばPEG化G−CSFの傾向投与)として使用可能な組成物
が必要とされている。本発明はこのような組成物を提供
する。
発明の要約 本発明は、疎水性賦形剤(例えばリゾリン脂質又は他
のリポソーム)を溶融球状態のタンパク質に付加し、タ
ンパク質の二次及び三次構造を直接安定化させてタンパ
ク質を熱誘導凝集、変性及び活性損失から保護すること
に関する。特に、本発明は安定なG−CSF:リン脂質組成
物に関する。驚くべきことに、好適G−CSF組成物は10
〜95℃で数回循環させることができ、冷却すると、タン
パク質二次構造を完全に回復する。組成物は、高温を要
する調剤手順に有用であると共に、新規G−CSF送達ビ
ヒクルで使用できるという二重の利点を有する。
好適態様によると、タンパク質:リン脂質複合体は、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジ
ミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、ジ
パルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、卵
ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチ
ジルエタノールアミン(DOPI)、卵ホスファチジルエタ
ノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸(DOP
A)、ジミリストイルホスファチジン酸(DMPA)、ジパ
ルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、ジオレオイルホ
スファチジルセリン(DOPS)、ジミリストイルホスファ
チジルセリン(DMPS)、ジパルミトイルホスファチジル
セリン(DPPS)、卵ホスファチジルセリン、リゾホスフ
ァチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノール
アミン、リゾホスファチジルセリンから選択される負に
帯電したリポソームを含む。負に帯電した不飽和リン脂
質であるDOPGが特に好適である。更に本発明によると、
pHは3.0〜7.5に維持され、脂質:タンパク質比は少なく
とも10:1である。
本発明の好適態様は更に、タンパク質:リン脂質複合
体における化学的に修飾されたタンパク質の使用、並び
に等張性調節剤、緩衝剤及びpH調節剤の1種以上の使用
を含む。当業者に理解されるように、本発明はこれらの
付加的要素を種々に組み合わせた安定なタンパク質:リ
ン脂質組成物を包含する。
図面の簡単な説明 図1は、DOPG小胞の存在下(曲線1)及び不在下(曲
線2)におけるrhG−CSFの蛍光発光スペクトルを示す。
rhG−CSFの濃度は0.2mg/mlとした。DOPG:rhG−CSF比
(曲線1)は100:1(モル:モル)とした。
図2は、rhG−CSF蛍光に及ぼす脂質:タンパク質比の
増加の作用を示す。F0は初期蛍光(脂質なし)であり、
Fは指定モル比の脂質:rhG−CSFに達するために脂質を
添加した後の蛍光を表す。図2(a)はDOPG:rhG−CSF
の混合物のF/F0(n)及び最大発光波長(Δ)を示す。
図2(b)はDOPC:rhG−CSFの混合物のF/F0(n)及び
最大発光波長(Δ)を示す。
図3は、DOPG小胞の不在下(●)及び存在下(○)で
KIによるrhG−CSF蛍光の消光のStern−Volmerプロット
を示す。消光実験は、KIのアリコートをrhG−CSF(0.2m
g/ml)及びDOPG:rhG−CSF(100:1モル)に加えることに
より実施した。
図4は、ピレンデカン酸の添加後のrhG−CSFトリプト
ファン蛍光の消光を示す。発光波長は327nmであった。D
OPG:rhG−CSF比は100:1(モル)とした。
図5は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるrhG
−CSFのF強度変化の比較を示すグラフである。各場合
に脂質:タンパク質比は100:1(モル)とした。
図6は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるrhG
−CSFの発光最大のシフトの比較を示すグラフである。
各場合に脂質:タンパク質比は100:1(モル)とした。
図7は、rhG−CSFのCD(曲線1)に及ぼすDMPC(曲線
2)、DMPG(曲線3)及びDMPA(曲線4)の効果を示
す。各場合に脂質:タンパク質比は水中、50:1(モル)
(pH6.0)とした。
図8は、rhG−CSF(曲線1)又はDOPG:rhG−CSF(14
0:1モル)(曲線2)のCDに及ぼす温度増加の効果を示
す。rhG−CSF濃度は水中、80μg/ml(pH6.0)とした。
温度は10〜90℃を100℃/時の速度で走査した。
図9は、rhG−CSF(曲線1)及びDOPG:rhG−CSF(45:
1モル)(曲線2)の示差走査熱量測定サーモグラムを
示す。サンプル中のrhG−CSFの濃度は1mg/ml(pH7.0、
水中)とした。走査速度は90℃/時とした。
図10は、rhG−CSF(曲線1)及びDOPG:rhG−CSF(14
0:1モル)(曲線2)のCDに及ぼす温度サイクルの効果
を示す。サンプルは、矢印により示すように95℃に迅速
に加熱し、10℃に冷却した。サンプル中のrhG−CSF濃度
は80μg/ml(pH6.0)とした。
図11は、rhG−CSF(曲線1)及びDMPG:rhG−CSF(15
0:1モル)(曲線2)のCDに及ぼす温度サイクルの効果
を示す。サンプルは、95℃に加熱し、10℃に冷却した。
サンプル中のrhG−CSF濃度は80μg/ml(pH6.0)とし
た。
図12は、rhG−CSF(曲線1)及びDPPG:rhG−CSF(15
0:1モル)(曲線2)のCDに及ぼす温度サイクルの効果
を示す。サンプルは、95℃に加熱し、10℃に冷却した。
サンプル中のrhG−CSF濃度は80μg/ml(pH6.0)とし
た。
図13は、凍結乾燥中に種々の脂質がrhG−CSFを安定化
させる能力を示すグラフである。脂質:タンパク質比は
各場合に100:1とした。骨髄アッセイにおけるin vitro
活性の保持に基づいて安定性を判定した。rhG−CSF単独
では凍結乾燥プロセスに耐えられないので、脂質の不在
下の未処理rhG−CSFを対照として使用した。
図14は、rhG−CSFのin vivo活性に及ぼす種々の脂質
の効果を示す。ハムスターの皮下注射後に活性(WBCカ
ウント)を測定した。rhG−CSF用量は100μg/kgとし、
脂質:タンパク質比は100:1とした。
図15は、rhG−CSFのin vivo活性に及ぼす種々の脂質
の効果を示す。ハムスターの皮下注射後に活性(WBCカ
ウント)を測定した。rhG−CSF用量は100μg/kgとし、
脂質:タンパク質比は50:1とした。
図16は、種々のpHのDOPGの不在下及び存在下における
CHO−G−CSFのF強度変化の比較を示すグラフである。
各場合に脂質:タンパク質比は100:1(モル)とした。
図17は、種々のpHのDOPGの不在下及び存在下における
CHO−G−CSFの発光最大のシフトの比較を示すグラフで
ある。各場合に脂質:タンパク質比は100:1(モル)と
した。
図18は、PEG−G−CSF(−)及びDMPG:PEG−G−CSF
(17:1モル)(−−−)のCDに及ぼす温度サイクルの効
果を示す。サンプルは90℃に加熱し、10℃に冷却した。
図19(a)は、PBS(pH7.0)中のGM−CSFのCDに及ぼ
す温度サイクルの効果を示す。10℃のGM−CSF(−)
と、90℃に加熱した後に10℃に冷却したGM−CSF(−−
−)とを比較した。図19(b)は、DPPG:PEG−G−CSF
(17:1モル)のCDに及ぼす温度サイクルの効果を示す。
10℃のDPPG:MG−CSF(−)と、90℃に加熱した後に10℃
に冷却したDPPG:MG−CSF(−−−)とを比較した。
詳細な説明 本発明の組成物は以下の説明で詳細に説明し、後記実
施例に具体的に説明する。実施例は本発明の種々の態様
を示し、種々のタンパク質:リン脂質組成物の安定性及
び生物活性試験の結果を報告する。驚くべきことに、タ
ンパク質と脂質小胞の相互作用はタンパク質のタンパク
質構造を直接安定化させ、脂質の不在下ではタンパク質
の変位をもたらすような条件下であってもタンパク質に
安定化効果を及ぼした。
本発明の実施においては、溶融球状態に遷移すること
が可能な種々のタンパク質を使用できる。使用し得るタ
ンパク質の例としては種々の造血因子を含むサイトカイ
ンを挙げることができ、例えば上記G−CSF、GM−CSF、
M−CSF、インターフェロン(α、β及びγ)、インタ
ーロイキン(1−11)、エリトロポエチン(EPO)、繊
維芽細胞成長因子、幹細胞因子、神経成長因子、BDNF、
NT3、血小板由来成長因子及び腫瘍成長因子(α、β)
が挙げられる。他のタンパク質もMGSに遷移することが
可能である。該当タンパク質がMGSに遷移することが可
能な場合には、当該タンパク質を負に帯電したリポソー
ム小胞と接触させると、安定化効果が得られる。
一般に、本発明の実施において有用なG−CSFは哺乳
動物から純粋単離された天然種でもよいし、化学的合成
産物でもよいし、ゲノムもしくはcDNAクローニング又は
遺伝子合成により得られる外来DNA配列の原核又は真核
宿主発現産物でもよい。適切な原核宿主としては、種々
の細菌(例えば大腸菌)細胞が挙げられる。適切な真核
宿主としては、酵母(例えばS.cerevisiae)及び哺乳動
物(例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル)細胞が
挙げられる。使用する宿主に依存して、G−CSF発現産
物を哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化して
もよいし、グルコシル化しなくてもよい。本発明による
と、このような形態のG−CSFのいずれをも任意に使用
することができるが、商業的実用性が最大であるという
理由で特に大腸菌に由来する組換えG−CSFが好適であ
る。
本発明で使用するために化学的に修飾するG−CSFも
同様に、天然ヒトG−CSF(nhG−CSF)でもよいし、組
換え核酸プロセス(例えば原核又は真核宿主細胞発現)
の産物でもよい。一般に、予想される化学的修飾はG−
CSF分子自体に化学的部分を結合することである。タン
パク質修飾及び融合タンパク質に関する研究論文の1例
は、Francis,Focus on Growth Factors :4−10
(May 1992)(Mediscript,Mountview Court,Friern
Barnet Lane,London N20 OLD,英国刊)である。例
えば、ポリエチレングリコール分子と結合したG−CSF
を製造するための材料及び方法を記載したヨーロッパ特
許出願明細書第0401384号(発明の名称“Chemically M
odified Granulocyte Colony Stimulating Facto
r")を参照されたい。結合は、タンパク質との直接結合
でもよいし、活性物質への橋として機能する部分と結合
してもよい。結合に最も安定であるという理由で共有結
合が好適である。化学的修飾により、G−CSFの効果を
制御、抑制又は延長することができる。これは例えば、
化学的に修飾されたG−CSFが循環に達するまでに要す
る時間を制御する効果を有する。化学的修飾物質の1例
はポリエチレングリコール組成物及びその誘導体であ
る。
本発明の実施においては、投与後に効力を発揮する任
意の化学的に修飾されたG−CSF調製物を使用すること
ができる。効力は当業者に認められるように、公知方法
により決定することができる。PEG化G−CSF、特に大腸
菌に由来するPEG化G−CSF、より特定的には大腸菌に由
来するトリ−テトラPEG化G−CSFが好適である。
G−CSFは、2.5〜5.0のpH範囲では三次構造が緩んだ
り、α螺旋含有量が増加するなどのコンフォーメーショ
ン変化が生じるという事実にも拘わらず、酸性条件下で
最も安定であると報告されている。Narhiら,J.Protein
Chem.10,359−367(1991)。このコンフォーメーショ
ン変化は溶融球状態(MGS)の特徴である。従って、MGS
に遷移することが可能な他のタンパク質を取り扱う際と
同様に、G−CSFを取り扱う調合者は凝集及び変性が生
じないように二次及び三次構造の熱誘導変性から保護し
なければならない。
本発明で有用なGM−CSFは、哺乳動物から純粋単離さ
れた天然形態でもよいし、ゲノムもしくはcDNAクローニ
ング又は遺伝子合成により得られた外来DNA配列の原核
又は真核宿主発現産物でもよい。適切な原核宿主として
は種々の細菌(例えば大腸菌)細胞が挙げられる。適切
な真核宿主としては酵母(例えばS.cerevisiae)及び哺
乳動物(例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル)細
胞が挙げられる。使用する宿主に依存して、GM−CSF発
現産物を哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化
してもよいし、グリコシル化しなくてもよい。本発明に
よると、このような形態のGM−CSFのいずれをも任意に
使用することができるが、商業的実用性が最大であると
いう理由で特に大腸菌に由来する組換えGM−CSFが好適
である。
本発明の組成物で有用な脂質小胞は該当タンパク質と
相互作用することが可能な負に帯電したリポソームであ
る。使用可能な特定リポソームとしては、ジオレオイル
ホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジミリストイル
ホスファチジルグリセロール(DMPG)、ジパルミトイル
ホスファチジルグリセロール(DPPG)、卵ホスファチジ
ルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミン(DOPE)、卵ホスファチジルエタノールアミ
ン、ジオレオイルホスファチジン酸(DOPA)、ジミリス
トイルホスファチジン酸(DMPA)、ジパルミトイルホス
ファチジン酸(DPPA)、ジオレオイルホスファチジルセ
リン(DOPS)、ジミリストイルホスファチジルセリン
(DMPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPP
S)、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグ
リセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リ
ゾホスファチジルセリンが挙げられる。使用する特定リ
ポソームに依存してリポソームの量は異なる。
タンパク質:リン脂質組成物は好ましくは、溶液のpH
を所望の範囲に維持するために緩衝剤を含有する。好適
緩衝剤としては、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、
及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。これらの緩衝剤
の混合物も使用し得る。組成物中で有用な緩衝剤の量は
使用する特定緩衝剤及び溶液のpHに大幅に依存する。例
えば酢酸塩はpH6よりもpH5のほうが有効な緩衝剤である
ので、pH5の溶液中ではpH6の場合よりも少量の酢酸塩を
使用する。本発明の組成物の好適pH範囲はpH3.0〜7.5で
ある。
本発明の組成物は更に、溶液を等張にし、注射適合性
を増すように等張性調節剤を含有し得る。最適な等張性
調節剤は0〜150mMの濃度範囲の塩化ナトリウムであ
る。
本発明は、医薬的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶
化剤、乳化剤、アジュバント及び/又はキャリヤーと共
に有効量の本発明のポリペプチド生成物を含有する医薬
組成物も包含する。このような組成物はタンパク質の物
理的状態、安定性及び生体利用性に影響を与える。例え
ば、参考資料として本明細書の一部とするRemingtons
Pharmaceutical Sciences,第18版,1435−1712(Mack
Publishing Co.,Easton,PA.,1990)を参照されたい。
特定例におけるタンパク質の有効量は、必要な治療効
果、治療する疾病又は疾病の重篤度、被験者の健康状態
等を含めて当業者が考慮する種々の因子に依存する。
大腸菌に由来するrhG−CSFを使用する好適態様による
と、使用するリポソーム小胞は、10mMの酢酸ナトリウム
を含有するpH4.5でDOPG:G−CSF比50:1のDOPGである。
大腸菌に由来するrhGM−CSFを使用する好適態様によ
ると、使用するリポソーム小胞は、リン酸緩衝液(PB
S)中pH7.0でDMPG:GM−CSF比17:1のDMPGである。
化学的に修飾(PEG化)された大腸菌由来rhG−CSFを
使用する好適態様によると、rhG−CSFをトリ−テトラPE
G化し、使用するリポソーム小胞は、pH4.5でDMPG:PEG−
G−CSF比17:1のDMPGである。
特定のタンパク質:脂質組成物及び治療方法について
本発明を記載したが、本発明の範囲から逸脱することな
く種々の関連組成物及び治療方法が存在し得ることは当
業者に自明である。
以下、実施例により本発明の種々の態様を詳細に説明
する。
実施例1 組換えヒトG−CSF(rhG−CSF)を脂質小胞に組み込
む可能性を試験するために初期実験を実施した。rhG−C
SFは組換えDNA技術を使用して製造し、Souzaの米国特許
第4,810,643号に記載されているようにヒトG−CSFをコ
ードするDNA配列で大腸菌をトランスフェクトした。rhG
−CSFは希塩酸中の4mg/ml溶液(pH4.0)として調製し
た。全脂質はAvanti Polar Lipids(Alabaster,Ala)
から入手し、クロロホルム中100mg/mlの最終濃度で窒素
下に−20℃で貯蔵した。
G−CSF:リン脂質複合体の調製 G−CSFと組み合わせるための脂質小胞を調製するた
めに、適当な脂質30μモルをガラス管に分配し、窒素ガ
ス流を使用して乾燥し、薄膜を形成した。脂質膜を少な
くとも2時間減圧脱水し、クロロホルムを完全に除去し
た。脂質膜を1mlの蒸留脱イオン水(ddH2O)、リン酸緩
衝液(pH7.2,Gibco/BRL“D−PGS")又は150mM NaClで
水和した。次にサンプルを浴型音波処理装置(laborato
ry Supplies,Hicksville,N.Y.)で音波処理した。サン
プルが透明になるまで(通常10〜15分間)音波処理を続
けた。サンプルを使用時まで窒素下に4℃で貯蔵した。
最終脂質濃度は30mMとした。あるいは、脂質300μモル
を窒素下に乾燥し、上述のように脱水することにより脂
質小胞を調製してもよい。乾燥脂質膜は上述のような適
当な水溶液10mlで水和した。次に、卓上乳化機(Microf
luidics Model 110S,Microfluidics,Inc.Cambridge,M
A)を10,000psiで運転してサンプルを微細流動化した。
サンプルを乳化機で10サイクル循環させた。微細流動化
したサンプルをその後、上述のように4℃で貯蔵した。
(上述のような)G−CSFを(上述のような)特定脂
質と混合することにより、G−CSF:リン脂質複合体を調
製した。混合は、渦形成、撹拌又は温和な振盪により行
った。種々の脂質:G−CSFモル比のサンプルを調製して
タンパク質の膜挿入及び安定化を評価した。例えば、脂
質:G−CSFモル比40:1で濃度0.2mg/ml G−CSFの3mlサ
ンプル(水中)を調製するには、G−CSFストック150μ
lに脂質(音波処理により水中で調製した30mMストッ
ク)44μlを加え、水を加えて最終サンプル容量3mlと
する。(必ずしも必要ではないが)5分間のインキュベ
ーションが推奨され、本実施例ではサンプルの使用又は
アッセイ前にこれを使用した。
微量流動化前にG−CSFに水和脂質を加えてもよい。
その後、上述のように混合物を微量流動化し、G−CSF
を脂質膜に組込む。
G−CSF:リン脂質複合体の分析 1.トリプトファン発光スペクトル rhG−CSFには局所環境条件に易感受性の2つのトリプ
トファン残基が存在する。従って、rhG−CSFをピロソー
ムと接触させる際のrhG−CSFトリプトファン蛍光を決定
する分析を実施した。蛍光発光最大のブルーシフトは、
トリプトファンがより疎水性の環境にあり、従ってrhG
−CSFが脂質膜に包埋されたことを示す。トリプトファ
ン蛍光分析の優れた研究報告の1例は、Lakowicz著Prin
ciples of Fluorescence Microscopy,第11章(Plenu
m Press,New York,1983)である。
サンプルを280nmで励起し、1nm/秒の速度で1nmの増分
で発光を285nmから420nmまで走査することにより、(上
述のような)G−CSF:脂質複合体のトリプトファン蛍光
をアッセイした。サンプル容量は3mlとし、G−CSFの最
終濃度は全サンプルで0.2mg/mlとした。脂質:G−CSF比
は変化させた。全蛍光測定は、PTI Alphascan蛍光量計
(South Brunswick,NJ)を使用して実施した。全測定
は25℃で実施し、この温度は循環水浴と接続した水ジャ
ケット付きキュベットホルダーを使用することにより維
持した。発光スペクトルを集め、PTIから販売されてい
るデータソフトウェアを使用して分析した。
DOPGから構成される小さな単カメラ小胞の存在下及び
不在下のrhG−CSFの蛍光スペクトルを図1に示す。rhG
−CSFはDOPG小胞の不在下では334nmで発光最大を有す
る。100:1脂質:タンパク質比のDOPGの存在下では、rhG
−CSFトリプトファン蛍光は327nmへの蛍光発光最大のブ
ルーシフトと、蛍光強度の劇的な増加を示す。DOPGの存
在下における蛍光発光の低波長は、トリプトファンが天
然タンパク質よりも疎水性の環境に存在することを示唆
するものである。図2から明らかなように、蛍光シフト
はDOPG:G−CSFのモル比に依存し、DOPG:G−CSF比が10:1
に達すると膜挿入を検出することができる。
2.ヨウ化物消光実験 ヨウ化物はトリプトファン蛍光の有効な衝突性消光剤
であるが、脂質膜に浸透することはできない。従って、
残基がバルク水性溶媒に暴露されると、ヨウ化物により
トリプトファン蛍光の有効な消光が起こり、タンパク質
トリプトファンが水性溶媒から封鎖されると、ヨウ化物
消光からの保護が生じる。これらの実験では、G−CSF
及びDOPG:G−CSF組成物(脂質:タンパク質比100:1)を
使用した。サンプルの初期読み取り(F0)を行って記録
した後、添加量を増加しながらヨウ化カリウム(KI)
(5Mストック)を加えた後に蛍光強度を測定した。サン
プル及びKI溶液はいずれもLeeら,Biochem.Biophys.Act
a,984:174−182(1989)及びLe Doanら,Biochem.Bioph
ys.Acta,858:1−5(1986)に記載されているように1mM
Na2SO3(最終濃度)を含有するように調製した。Na2S
O3を加えるのは、I2が形成されないようにし、タンパク
質及び膜の非極性領域に分割しないようにするためであ
る。Stern−Volmerの式(F0/F=1+KKI[KI])(式
中、F0及びFは夫々濃度[KI]のKIの不在下及び存在下
におけるサンプルの蛍光強度であり、KKIはG−CSFトリ
プトファン残基のKI消光のためのStern−Volmer消光定
数である)によりデータを分析した。Lehrer,S.,Bioche
mistry 10:3254−3263(1979)。
データのStern−Volmerプロットを図3に示す。DOPG
小胞の不在下では、rhG−CSF蛍光はKIにより有効に消光
される。DOPGの存在下では、データのStern−Volmerプ
ロットは線形であり、ヨウ化物が2つのトリプトファン
に接近しにくいことを示す。データは、DOPGの不在下で
ヨウ化物に接近可能なトリプトファン残基がDOPGの存在
下ではヨウ化物に接近不能になることを示す。従って、
このトリプトファンを含むrhG−CSFの部分をDOPG二重層
に包埋しなければならない。
3.エネルギー転移測定 先に示したように、このプローブの励起スペクトルは
トリプトファンの発光スペクトルに有意にオーバーラッ
プするので、トリプトファン供与体とピレンデカン酸等
の脂質可溶性蛍光受容体との間にはエネルギー転移が生
じ得る。Friereら,Biochemistry 22:1675−1680(198
3)。タンパク質が脂質膜に挿入するならば、トリプト
ファンからピレンへのエネルギー転移によりトリプトフ
ァン蛍光の消光が生じる。この実験では、種々の量のピ
レンデカン酸(テトラヒドロフラン中30μg/mlストッ
ク)の添加前(F0)及び添加後(F)に種々のG−CSF:
脂質複合体のトリプトファン発光強度を記録した。ピレ
ンデカン酸添加中にサンプルを連続的に撹拌し、ピレン
デカン酸とサンプルの混合を助長した。F/F0の比はG−
CSFトリプトファンと疎水性エネルギー受容体ピレンデ
カン酸の間に生じるエネルギー転移の量に比例する。
図4は、添加したピレンデカン酸の関数としてDOPG
(脂質:タンパク質比100:1)の存在下におけるrhG−CS
Fの消光プロフィルを示す。消光は非常に低いピレンデ
カン酸濃度(<1モル%)で生じるので、膜構造及び挙
動に及ぼす蛍光プローブの効果は最小である。ピレンデ
カン酸は脂質二重層に迅速に分割すると予想することが
できるので、このデータは、rhG−CSFがトリプトファン
からピレン受容体への有効なエネルギー転移を可能にす
るために十分な深さまでDOPG膜に包埋されていることを
示す。rhG−CSFの存在下及び不在下でピレンデカン酸で
標識したDOPG小胞の励起スペクトルを試験することによ
り、エネルギー転移を確認した。
上記分析から明らかなように、rhG−CSFはDOPG等の不
飽和リン脂質と密接に相互作用し得る。DOPG小胞の存在
下では、rhG−CSFトリプトファンは水溶液蛍光消光剤か
ら保護されるが、疎水性蛍光プローブへのエネルギー転
移を介して消光を受ける可能性がある。データをまとめ
ると、rhG−CSFはDOPGから構成される膜に挿入すること
ができる。10:1比(脂質:G−CSF)に達すると、膜挿入
を検出可能であるが、この数はタンパク質の挿入部分の
周囲の脂質の数に相当し得る。
実施例2 本実施例では、上述のようなF/F0強度及び発光最大の
比較を使用して、rhG−CSFが他のリン脂質と相互作用す
る能力を判定した。各場合に、脂質:rhG−CSFのモル比
は100:1とした。
図5は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるrhG
−CSFのF/F0データを示す。図6は同一組成の発光最大
データを示す。図5及び図6のデータから明らかなよう
に、DOPG以外に、rhG−CSFはDMPG、DPPGにも挿入するこ
とができ、より低効率ではあるが、ホスファチジルエタ
ノールアミン(PE)及びホスファチジルセリン(PS)に
も挿入することができる。更に、NG−DOPE(PEヘッド基
の負電荷を高めたDOPEサンプル)はDOPEよりもrhG−CSF
の挿入を改善できることが判明した。
DOPE、DMPC及びDPPCは中性脂質であり、これらの小胞
はrhG−CSFの発光最大にも蛍光強度にも全くではないに
しても殆ど影響を与えておらず、これらのリン脂質との
間に相互作用は生じなかったと思われる(図5及び6、
並びに図7、曲線2参照)。
上記データから明らかなように、溶融球状態に遷移す
ることが可能なタンパク質は種々の脂質小胞に挿入する
ことができる。しかしながら、このrhG−CSF:脂質相互
作用は負に帯電した脂質小胞を使用した場合にしか生じ
ない。負に帯電した脂質小胞のうちでは負電荷の高い小
胞のほうが強いrhG−CSF相互作用を生じると思われる。
実施例3 本実施例では、タンパク質安定性に関するrhG−CSF:D
OPG相互作用の効果を決定した。Peltier型サーモスタッ
ト付きセルホルダー及び磁気撹拌機を備えるJasco J
−720装置で円二色性測定を実施した。80μg/mlの最終r
hG−CSF濃度(pH6.0)を使用して222nmでの円二色性を
測定した。Microcal MC−2熱量計を使用して示差走査
熱量測定を実施した。rhG−CSF(水中1mg/ml)又はDOP
G:rhG−CSF(水中45:1モル/モル)のサンプルを90℃/
時の速度で走査した。データを保存し、Microcalソフト
ウェアを使用して分析した。
温度増加の関数として円二色性(222nm)を測定する
ことにより、G−CSFのα螺旋の温度誘導変化を測定す
ることができる。pH6.0でのrhG−CSFの熱誘導変性を図
8に示す。曲線は、〜60〜70℃でかなり急な遷移が生じ
ることを示しており、α螺旋の損失が生じると予想され
る。この遷移後、rhG−CSFは溶液から不可逆的に沈殿す
る。変性温度範囲は、示差走査熱量測定により決定した
pH7.0でのrhG−CSFの溶融温度(図9)に類似する。
他方、DOPG:rhG−CSFサンプルは温度増加と共にα螺
旋の漸次損失を示し、rhG−CSF単独の場合とは異なり、
DOPG:rhG−CSFの温度誘導変性は協同的ではないように
思われる(図8参照)、この推論は、示差走査熱量測定
により示される溶融遷移の欠如からも立証される(図
9)。特筆すべき点として、DOPG:rhG−CSFサンプルは9
5℃に加熱後にα螺旋を回復することができ、95℃と10
℃の間で繰り返し循環させることができ、冷却後には螺
旋を完全に回復する(図10参照)。同一条件下でrhG−C
SF単独では不可逆的に変性し、溶液から沈殿する。
G−CSF円二色性に及ぼすDMPG及びDPPGの効果も試験
した。150:1の脂質:rhG−CSF比を使用した処、DOPGの場
合と同様に、DMPG及びDPPGもrhG−CSFの二次構造を安定
化させることが判明した(図11〜13)。
以上のデータから明らかなように、rhG−CSFとDOPG、
DMPG及びDPPGとの相互作用の結果として、rhG−CSF単独
では不安定な条件下でタンパク質の安定性を強化するこ
とができる。相互作用はrhG−CSFの二次及び三次構造を
直接安定化させる。
実施例4 本実施例では、rhG−CSFの生物活性に関するrhG−CS
F:DOPG相互作用の効果を判定した。Zseboら,Immunobiol
ogy 172:175−184(1986)に記載されているようにマ
ウス骨髄細胞によるG−CSF依存性[3H]−チミジン取
り込みを使用してrhG−CSFのin vitro活性をアッセイ
した。全活性アッセイは3回繰り返して実施した。in
vivo活性はハムスターの皮下注射(rhG−CSF容量100μg
/kg)及び白血球(WBC)カウントの測定により定量し
た。
1.in vitro活性 A.DOPGの不在下及び存在下におけるrhG−CSFの比活性を
定量した。熱処理したrhG−CSF及びDOPG:rhG−CSFサン
プルも試験した。結果を表1に要約する。
表1 サンプル 比活性(U/mg/タンパク質) rhG−CSF 0.66±0.09 rhG−CSF(加熱) 検出不能 DOPG:rhG−CSFb 0.61±0.11 DOPG:rhG−CSFb(加熱) 0.52±0.08 サンプルはアッセイ実施前に水浴中で85℃で10分間
インキュベートした。
bDOPG:rhG−CSF比50:1(モル/モル)。
表1に示すように、DOPG二重層への挿入はrhG−CSFの
生物活性に悪影響を与えない。85℃に10分間加熱後、rh
G−CSFは検出可能な活性をもたず、タンパク質は沈殿す
る。同様の処理後、DOPG:rhG−CSFは非加熱rhG−CSFの
活性の〜85%を維持し、冷却後に二次構造を完全に回復
する。
B.種々の脂質が凍結乾燥中にrhG−CSFを安定化させる能
力も試験した。種々の脂質と組み合わせたrhG−CSFのサ
ンプルを凍結乾燥し、(上述のように)活性をアッセイ
した。DOPG、DMPG及びDPPGをrhG−CSFと混合すると、凍
結乾燥後にrhG−CSF生活性の〜100%を維持することが
できる(図14)。rhG−CSF単独では凍結乾燥プロセスに
耐えることができなかった。
2.in vivo活性 脂質の不在下及び存在下におけるrhG−CSFの活性(WB
Cカウント)を定量した。0日目に皮下注射(rhG−CSF
用量100μg/kg)後に活性を測定した。5種の異なる脂
質:rhG−CSF複合体をアッセイした処、各場合とも脂質:
rhG−CSF複合体はin vivo活性を維持した(図15及び1
6)。
以上の試験から明らかなように、負に帯電した脂質二
重層への挿入はrhG−CSFの生物活性に悪影響を与えな
い。更に、脂質の保護効果は凍結乾燥プロセス中にrhG
−CSFを保護すると思われる。
実施例5 本実施例では、化学的に修飾されたG−CSF(PEG化G
−CSF(PEG−G−CSF))及び真核宿主細胞発現産物と
して得られたG−CSF(CHO−G−CSF)が負に帯電した
脂質小胞と相互作用する能力を試験した。CHO−G−CSF
については、(上記実施例1に記載したような)F/F0
度及び発光最大の比較を使用して判定した。各場合とも
脂質:タンパク質のモル比100:1とした。PEG−G−CSF
では円二色性分析に基づいて判定した。
使用したCHO−G−CSFは組換えDNA技術を用いて製造
し、Souzaの米国特許第4,810,643号に記載されているよ
うにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、ヒト
G−CSFをコードするDNA配列でトランスフェクトした。
CHO−G−CSFはPBS(pH7.0)中0.6mg/ml溶液として調製
した。CHO−G−CSFはrhG−CSFと同様にDOPGと相互作用
することが判明し、各サンプルはDOPGの存在下で蛍光強
度の増加を示すと共に、DOPGの存在下で発光最大のブル
ーシフトを示した(図17及び18)。従って、DOPG相互作
用はG−CSFの組換え形態の何らかの独自性に起因する
ものではない。
これらの実験で使用したPEG−G−CSFは、大腸菌に由
来するトリ−テトラPEG化G−CSF(PEG6000を使用)で
あった。上記手順を使用してDMPG:PEG−G−CSF(17:1
モル/モル)サンプルを調製した。DMPG:PEG−G−CSF
サンプルは加熱後に二次構造を完全に回復することが判
明した(図19)。PEG分子の存在にも拘わらず、誘導体
化タンパク質は天然タンパク質と同様に脂質と相互作用
することが可能であった。
以上のデータから明らかなように、G−CSFと負に帯
電した脂質小胞との相互作用に関連する安定化効果は、
原核宿主細胞発現産物として得られるrhG−CSFのみに固
有ではない。MGSに遷移することが可能な化学的に修飾
されたタンパク質でも、リポソーム小胞(ここではPEG
−G−CSF:DMPG)と接触すると、同様に安定化効果を示
した。
実施例6 本実施例では、GM−CSFに及ぼすDMPG及びDPPGの効果
を試験した。GM−CSFはBooneの米国特許第5,047,504号
に記載されているような組換えヒトGM−CSFを用い、リ
ン酸緩衝溶液(PBS,pH7.0)中1mg/ml溶液として調製し
た。17:1の脂質:GM−CSF比を使用し、上述のような円二
色性分析を使用して熱安定性を測定した。DMPG及びDPPG
はGM−CSFの良好な熱安定性をもたらし、即ち加熱後に
二次構造を回復した(図20a及び20b)。
以上のデータは、溶融球状態に遷移することができ、
負に帯電した脂質小胞と相互作用してタンパク質に良好
な熱安定性を与えることが可能なタンパク質の別の例を
提供するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平3−34920(JP,A) 特開 昭63−258424(JP,A) 特開 昭63−299(JP,A) 特表 平5−505173(JP,A) 特表 平4−506207(JP,A) 特表 平2−502192(JP,A) 国際公開93/18749(WO,A1) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) A61K 9/127 A61K 47/24 A61K 38/00 - 38/58 CA(STN) REGISTRY(STN)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】溶融球状態に遷移することが可能なタンパ
    ク質を負に帯電したリポソーム小胞と接触させて形成さ
    れたリポソーム−タンパク質複合体を含有する医薬用組
    成物であって、pH3.0〜7.5であり10:1〜150:1の脂質−
    タンパク質比を有し、前記リポソーム−タンパク質複合
    体が前記タンパク質の二次構造の変性に対し直接安定化
    されており、前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホス
    ファジルグリセロール(DOPG)、卵ホスファチジルグリ
    セロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミ
    ン(DOPE)、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオ
    レオイルホスファチジン酸(DOPA)、ジパルミトイルホ
    スファチジン酸(DPPA)、ジオレオイルホスファチジル
    セリン(DOPS)、ジミリストイルホスファチジルセリン
    (DMPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPP
    S)、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグ
    リセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン及び
    リゾホスファチジルセリンからなる群から選択される前
    記組成物。
  2. 【請求項2】前記タンパク質がサイトカインである請求
    項1に記載の組成物。
  3. 【請求項3】前記サイトカインが造血因子である請求項
    2に記載の組成物。
  4. 【請求項4】前記造血因子がG−CSF及びGM−CSFからな
    る群から選択される請求項3に記載の組成物。
  5. 【請求項5】前記造血因子がG−CSFである請求項3に
    記載の組成物。
  6. 【請求項6】G−CSFが天然ヒトG−CSFであるか又は、
    原核もしくは真核宿主細胞発現産物として得られる請求
    項5に記載の組成物。
  7. 【請求項7】G−CSFが化学的に修飾されたG−CSFであ
    る請求項5に記載の組成物。
  8. 【請求項8】化学的に修飾されたG−CSFがPEG化G−CS
    Fである請求項7に記載の組成物。
  9. 【請求項9】医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する
    請求項1に記載の組成物。
  10. 【請求項10】前記タンパク質が大腸菌に由来するrhG
    −CSFであり、前記リポソーム小胞がDOPGであり、前記
    組成物が50:1のDOPG:rhG−CSF比を有しており、pH4.5を
    有しており、10mM酢酸ナトリウムを含有する請求項1に
    記載の組成物。
  11. 【請求項11】医薬用のリボソーム−タンパク質組成物
    を製造する方法であって、溶融球状態に遷移することが
    可能なタンパク質を負に帯電したリポソーム小胞と接触
    させて、pH3.0〜7.5であり10:1〜150:1の脂質−タンパ
    ク質比を有する前記リポソーム−タンパク質組成物を得
    ることを含み、前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホ
    スファチジルグリセロール(DOPG)、卵ホスファチジル
    グリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノール
    アミン(DOPE)、卵ホスファチジルエタノールアミン、
    ジオレオイルホスファチジン酸(DOPA)、ジパルミトイ
    ルホスファチジン酸(DPPA)、ジオレオイルホスファチ
    ジルセリン(DOPS)、ジミリストイルホスファチジルセ
    リン(DMPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン
    (DPPS)、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジ
    ルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン
    及びリゾホスファチジルセリンからなる群から選択され
    る前記方法。
  12. 【請求項12】前記タンパク質がサイトカインである請
    求項11に記載の方法。
  13. 【請求項13】前記サイトカインが造血因子である請求
    項12に記載の方法。
  14. 【請求項14】前記造血因子がG−CSF及びGM−CSFから
    なる群から選択される請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項15】前記造血因子がG−CSFである請求項13
    に記載の方法。
  16. 【請求項16】G−CSFが天然ヒトG−CSFであるか又
    は、原核もしくは真核宿主細胞発現産物として得られる
    請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項17】G−CSFが化学的に修飾されたG−CSFで
    ある請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項18】化学的に修飾されたG−CSFがPEG化G−
    CSFである請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項19】前記組成物が医薬的に許容可能なキャリ
    ヤーを含有する請求項11に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7972593B2 (en) 2004-06-10 2011-07-05 Saint Louis University Delivery of therapeutic agents to the bone

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874075A (en) * 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US7863238B2 (en) 2004-06-10 2011-01-04 Saint Louis University Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids
JP2006248978A (ja) * 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
RU2555357C2 (ru) 2008-04-08 2015-07-10 Мерк Патент Гмбх Композиции, содержащие циклические пептиды, и способы их применения
CN104507953B (zh) * 2012-05-31 2018-05-18 新加坡科技研究局 通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法
JP6139781B2 (ja) * 2014-04-04 2017-05-31 国立大学法人大阪大学 リゾリン脂質受容体を活性化する物質を含有する薬剤送達促進剤

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4208527A1 (de) * 1992-03-17 1993-09-23 Max Planck Gesellschaft Liposomen mit negativer ueberschussladung
JPH06247842A (ja) * 1993-02-23 1994-09-06 Green Cross Corp:The リポソーム組成物の製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7972593B2 (en) 2004-06-10 2011-07-05 Saint Louis University Delivery of therapeutic agents to the bone

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