JP2852127B2 - 安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法 - Google Patents

安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法

Info

Publication number
JP2852127B2
JP2852127B2 JP7510908A JP51090894A JP2852127B2 JP 2852127 B2 JP2852127 B2 JP 2852127B2 JP 7510908 A JP7510908 A JP 7510908A JP 51090894 A JP51090894 A JP 51090894A JP 2852127 B2 JP2852127 B2 JP 2852127B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
csf
protein
rhg
dopg
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP7510908A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08505403A (ja
Inventor
コリンズ，デイビツド
チヤ，ヨーンシク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AMUJEN
Original Assignee
AMUJEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AMUJEN filed Critical AMUJEN
Publication of JPH08505403A publication Critical patent/JPH08505403A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2852127B2 publication Critical patent/JP2852127B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、溶融球状態に遷移することが可能なタンパ
ク質の二次及び三次構造を安定化させるために有用なタ
ンパク質：リン脂質構造に関する。より特定的には本発
明は、高い安定性を有しており、Ｇ−CSF製剤及び新規
Ｇ−CSF送達ビヒクルで使用することが可能なＧ−CSF:
リン脂質組成物に関する。
数種のタンパク質が溶融球状態（MGS）に遷移するこ
とは報告されている。Van der Goot,F.G.,Nature 35
4,408−410（1991）。溶融球状態のタンパク質は天然タ
ンパク質と同様の二次構造を示すが、固定した三次構造
を欠く。Pitsynら,FEBS Letters 262:1,20−24（199
0）。場合により、この状態への遷移に伴い、それまで
隠されていたタンパク質の疎水性領域が露出する。重要
な疎水性残基露出させることにより、MGSはタンパク質
の凝集及び沈殿における中間体となり得る。MGSコンフ
ォーメーションは、遠UV領域における円二色性を芳香族
側鎖のスペクトル（近UV円二色性及び蛍光）と比較する
ことにより検出することができる。溶融球状態は遠UV円
二色性変化の不在下で芳香族基のスペクトル変化を示し
（Bychkovaら,FEBS Letters 238:231−234（198
8））、ある種のタンパク質による膜浸透に関与し得る
（Bychkovaら,FEBS Letters 238:231−234（1988）;V
an der Goot,F.G.,Nature 354,408−410（199
1））。
凝集前にMGSに遷移することが知られている２種のタ
ンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）及び
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）で
ある。これらの２種のタンパク質は所定の規定条件下で
安定化させることができるが、タンパク質の二次及び三
次構造を安定化させることによりこれらの材料の貯蔵寿
命を延長することが必要とされている。
ヒト組換えＧ−CSFは、感染を防除するために使用さ
れる白血球の１種である好中球を選択的に刺激する。現
在では、組換えＧ−CSFであるFilgrastimが治療用とし
て利用可能である。種々の条件下のＧ−CSFの構造は広
く研究されている（Luら,J.Biol.Chem.Vol.267,8770−8
777（1992））。Ｇ−CSFは疎水性であるため、貯蔵寿命
を延長するように調合することは困難である。ある種の
疎水性タンパク質の調合物は、長期貯蔵中に二量体及び
高次凝集物（高分子）を形成するため、活性を失う。貯
蔵中に脱アミド化及び酸化等の他の化学変化が生じる恐
れもある。更に、Ｇ−CSF調合者は変性から保護しなけ
ればならず、特にタンパク質の二次及び三次構造の安定
姓を維持するように注意しなければならない。
ヒトGM−CSFはマクロファージ及び顆粒球祖先細胞のi
n vitro増殖に持続的に必要な22kDa糖タンパク質であ
る。ヒトGM−CSFは更に、顆粒球及びマクロファージを
形成するこれらの祖先細胞の不可逆的関与を制御する。
その他、成熟細胞型の機能的活性の調節（Goughら,Natu
re,309,763−767（1984））や、認識された化学誘引物
質に向かう走化性の増加（Williamsら,Hematology,第４
版（1990））等の生物活性もある。GM−CSFは更に単球
の産生を刺激し、従って単球減少症等の単球疾患の治療
に有用であり得る。
ヒトGM−CSFは多くの起源から入手及び精製すること
ができる。組換えヒトGM−CSFの製造手順はBurgessら,B
lood,69:1,43−51（1987）により既に記載されている。
参考資料として本明細書の一部とする米国特許第5,047,
504号（Boone）により、商業規模量の非グリコシル化形
態のGM−CSFを原核宿主細胞発現産物として製造するこ
とが可能になった。
Ｇ−CSF及びGM−CSF等のタンパク質を操作するために
過去に試みられている１つの方法はリポソームの使用で
ある。リポソームは、非水溶性極性脂質、特にリン脂質
により形成される完全に閉鎖した脂質二重層膜である。
リポソーム小胞は単一膜二重層（単ラメラ）でもよい
し、多重膜二重層（多重ラメラ）でもよい。二重層は親
水性（極性）「ヘッド」領域と疎水性（非極性）「テー
ル」領域とを有する２つの脂質単分子層から構成され、
疎水性テールは二重層の中心に向いており、親水性ヘッ
ドは水相に向いている。リポソームの安定性、剛性及び
浸透性は、リン脂質組成の変化、温度変化、ステロール
の配合又は帯電両親媒性分子の組込みにより変化し得
る。リポソームの基本構造は当業者に公知の種々の方法
により形成することができる。
リポソームはその形成プロセスにおいて水性チャンネ
ルに水溶質をトラップし、可変速度で放出することがで
きる。リポソームが酵素を細胞に導入してその代謝を変
化させ得ることが発見させて以来（Gregoriadis,New E
ngl.J.Med.295,704−710,765−770（1976））、リポソ
ームは目的薬剤送達という課題に対する解答として期待
される。その結果、リポソームの疎水性層又は疎水性コ
アの内側に封鎖された薬剤、ビタミン及びタンパク質の
遅放性デポー製剤としてリポソームを使用する開発研究
に医薬業界で関心が高まっている。
リポソームを薬剤キャリヤーとして使用するように試
みた研究者はいくつかの問題に遭遇したため、その使用
成果は限られていた。例えば、リポソームはトラップし
た抗原への強力な免疫付加物として作用することが知ら
れており、異種発生起源の酵素又は他のタンパク質をリ
ポソームにトラップする場合には注意が必要である。更
に、薬剤の拡散速度を制御することは困難である。これ
は、リポソームの固有の不安定性と、所定の薬剤の拡散
を助長する所定の血液成分の存在とに起因する。更に、
その性質によりリポソームにトラップしにくい物質もあ
り、従って、このような物質は循環中に迅速に拡散す
る。最後に、細胞又は肝臓もしくは脾臓以外の臓器に標
的するという問題もあった。リポソーム、リポソームに
組込まれた物質及び薬剤キャリヤーとしてのリポソーム
の使用に関連する問題の優れた論文は、Drug Carriers
in Biology and Medicine,第14章,287−341（Acad
emic Press,N.T.,1979）に所収のGregory Gregoriaid
is著“Liposomes"に報告されている。
リポソームを薬剤キャリヤーとして使用する試みにつ
いては多数のものが報告されているが、ペプチド及び／
又はタンパク質の構造を安定化させることにより治療用
ペプチド又はタンパク質の貯蔵寿命を延長することを目
的としたリポソームの使用については殆ど開示されてい
ない。国際特許出願第PCT/US90/05163号（発明の名称
“Therapeutic Peptides and Proteins",Hostetler
ら）には、空気／水界面におけるポリペプチド及び／又
はタンパク質の蓄積を阻止し、容器表面へのポリペプチ
ド及び／又はタンパク質の吸着を阻止するために、ポリ
ペプチド及び／又はタンパク質を可溶化する医薬的に許
容可能な希釈剤としての空のリポソームの使用が開示さ
れている。Hostetlerらは、負に帯電したリン脂質を約5
0モル％まで添加し得ること、及び天然リン脂質である
ホスファチジルコリンが好適リポソームであることを開
示している。しかしながら、Hostetlerらは、ポリペプ
チド及び／又はタンパク質の構造を安定化させる希釈剤
については報告していない。
国際特許出願第PCT/US91/07694号（発明の名称“Prep
aration and Characterization of Liposomal For
mulations of Tumor Necrosis Factor",Hungら）に
は、表面と会合するか又はリポソーム内に閉じ込められ
た親脂性修飾腫瘍壊死因子（TNF）分子が記憶されてい
る。リポソーム親脂性TNF分子は高いin vivo安定性を
有することが報告されている。安定性とは、TNF−リポ
ソームから系統へのTNFのiv vivo漏出の減少又は減少
傾向の意であった。好適リポソームは中性脂質であっ
た。Hungらは、賦形剤がタンパク質の構造に安定化効果
を有するようなTNF組成物については開示していない。
タンパク質（例えばＧ−CSF）を負に帯電した脂質小
胞と接触させ、熱誘導凝集、変性、活性損失及び二次構
造の変性に対してタンパク質を直接安定化させることに
ついては文献から何ら予想することができない。高温を
要する調剤手順で有用であり且つ新規送達ビヒクル（例
えばPEG化Ｇ−CSFの傾向投与）として使用可能な組成物
が必要とされている。本発明はこのような組成物を提供
する。
発明の要約 本発明は、疎水性賦形剤（例えばリゾリン脂質又は他
のリポソーム）を溶融球状態のタンパク質に付加し、タ
ンパク質の二次及び三次構造を直接安定化させてタンパ
ク質を熱誘導凝集、変性及び活性損失から保護すること
に関する。特に、本発明は安定なＧ−CSF:リン脂質組成
物に関する。驚くべきことに、好適Ｇ−CSF組成物は10
〜95℃で数回循環させることができ、冷却すると、タン
パク質二次構造を完全に回復する。組成物は、高温を要
する調剤手順に有用であると共に、新規Ｇ−CSF送達ビ
ヒクルで使用できるという二重の利点を有する。
好適態様によると、タンパク質：リン脂質複合体は、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジ
ミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジ
パルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、卵
ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチ
ジルエタノールアミン（DOPI）、卵ホスファチジルエタ
ノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（DOP
A）、ジミリストイルホスファチジン酸（DMPA）、ジパ
ルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジオレオイルホ
スファチジルセリン（DOPS）、ジミリストイルホスファ
チジルセリン（DMPS）、ジパルミトイルホスファチジル
セリン（DPPS）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスフ
ァチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノール
アミン、リゾホスファチジルセリンから選択される負に
帯電したリポソームを含む。負に帯電した不飽和リン脂
質であるDOPGが特に好適である。更に本発明によると、
pHは3.0〜7.5に維持され、脂質：タンパク質比は少なく
とも10:1である。
本発明の好適態様は更に、タンパク質：リン脂質複合
体における化学的に修飾されたタンパク質の使用、並び
に等張性調節剤、緩衝剤及びpH調節剤の１種以上の使用
を含む。当業者に理解されるように、本発明はこれらの
付加的要素を種々に組み合わせた安定なタンパク質：リ
ン脂質組成物を包含する。
図面の簡単な説明 図１は、DOPG小胞の存在下（曲線１）及び不在下（曲
線２）におけるrhG−CSFの蛍光発光スペクトルを示す。
rhG−CSFの濃度は0.2mg/mlとした。DOPG:rhG−CSF比
（曲線１）は100:1（モル：モル）とした。
図２は、rhG−CSF蛍光に及ぼす脂質：タンパク質比の
増加の作用を示す。F0は初期蛍光（脂質なし）であり、
Ｆは指定モル比の脂質:rhG−CSFに達するために脂質を
添加した後の蛍光を表す。図２（ａ）はDOPG:rhG−CSF
の混合物のF/F0（ｎ）及び最大発光波長（Δ）を示す。
図２（ｂ）はDOPC:rhG−CSFの混合物のF/F0（ｎ）及び
最大発光波長（Δ）を示す。
図３は、DOPG小胞の不在下（●）及び存在下（○）で
KIによるrhG−CSF蛍光の消光のStern−Volmerプロット
を示す。消光実験は、KIのアリコートをrhG−CSF（0.2m
g/ml）及びDOPG:rhG−CSF（100:1モル）に加えることに
より実施した。
図４は、ピレンデカン酸の添加後のrhG−CSFトリプト
ファン蛍光の消光を示す。発光波長は327nmであった。D
OPG:rhG−CSF比は100:1（モル）とした。
図５は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるrhG
−CSFのＦ強度変化の比較を示すグラフである。各場合
に脂質：タンパク質比は100:1（モル）とした。
図６は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるrhG
−CSFの発光最大のシフトの比較を示すグラフである。
各場合に脂質：タンパク質比は100:1（モル）とした。
図７は、rhG−CSFのCD（曲線１）に及ぼすDMPC（曲線
２）、DMPG（曲線３）及びDMPA（曲線４）の効果を示
す。各場合に脂質：タンパク質比は水中、50:1（モル）
（pH6.0）とした。
図８は、rhG−CSF（曲線１）又はDOPG:rhG−CSF（14
0:1モル）（曲線２）のCDに及ぼす温度増加の効果を示
す。rhG−CSF濃度は水中、80μg/ml（pH6.0）とした。
温度は10〜90℃を100℃／時の速度で走査した。
図９は、rhG−CSF（曲線１）及びDOPG:rhG−CSF（45:
1モル）（曲線２）の示差走査熱量測定サーモグラムを
示す。サンプル中のrhG−CSFの濃度は1mg/ml（pH7.0、
水中）とした。走査速度は90℃／時とした。
図10は、rhG−CSF（曲線１）及びDOPG:rhG−CSF（14
0:1モル）（曲線２）のCDに及ぼす温度サイクルの効果
を示す。サンプルは、矢印により示すように95℃に迅速
に加熱し、10℃に冷却した。サンプル中のrhG−CSF濃度
は80μg/ml（pH6.0）とした。
図11は、rhG−CSF（曲線１）及びDMPG:rhG−CSF（15
0:1モル）（曲線２）のCDに及ぼす温度サイクルの効果
を示す。サンプルは、95℃に加熱し、10℃に冷却した。
サンプル中のrhG−CSF濃度は80μg/ml（pH6.0）とし
た。
図12は、rhG−CSF（曲線１）及びDPPG:rhG−CSF（15
0:1モル）（曲線２）のCDに及ぼす温度サイクルの効果
を示す。サンプルは、95℃に加熱し、10℃に冷却した。
サンプル中のrhG−CSF濃度は80μg/ml（pH6.0）とし
た。
図13は、凍結乾燥中に種々の脂質がrhG−CSFを安定化
させる能力を示すグラフである。脂質：タンパク質比は
各場合に100:1とした。骨髄アッセイにおけるin vitro
活性の保持に基づいて安定性を判定した。rhG−CSF単独
では凍結乾燥プロセスに耐えられないので、脂質の不在
下の未処理rhG−CSFを対照として使用した。
図14は、rhG−CSFのin vivo活性に及ぼす種々の脂質
の効果を示す。ハムスターの皮下注射後に活性（WBCカ
ウント）を測定した。rhG−CSF用量は100μg/kgとし、
脂質：タンパク質比は100:1とした。
図15は、rhG−CSFのin vivo活性に及ぼす種々の脂質
の効果を示す。ハムスターの皮下注射後に活性（WBCカ
ウント）を測定した。rhG−CSF用量は100μg/kgとし、
脂質：タンパク質比は50:1とした。
図16は、種々のpHのDOPGの不在下及び存在下における
CHO−Ｇ−CSFのＦ強度変化の比較を示すグラフである。
各場合に脂質：タンパク質比は100:1（モル）とした。
図17は、種々のpHのDOPGの不在下及び存在下における
CHO−Ｇ−CSFの発光最大のシフトの比較を示すグラフで
ある。各場合に脂質：タンパク質比は100:1（モル）と
した。
図18は、PEG−Ｇ−CSF（−）及びDMPG:PEG−Ｇ−CSF
（17:1モル）（−−−）のCDに及ぼす温度サイクルの効
果を示す。サンプルは90℃に加熱し、10℃に冷却した。
図19（ａ）は、PBS（pH7.0）中のGM−CSFのCDに及ぼ
す温度サイクルの効果を示す。10℃のGM−CSF（−）
と、90℃に加熱した後に10℃に冷却したGM−CSF（−−
−）とを比較した。図19（ｂ）は、DPPG:PEG−Ｇ−CSF
（17:1モル）のCDに及ぼす温度サイクルの効果を示す。
10℃のDPPG:MG−CSF（−）と、90℃に加熱した後に10℃
に冷却したDPPG:MG−CSF（−−−）とを比較した。
詳細な説明 本発明の組成物は以下の説明で詳細に説明し、後記実
施例に具体的に説明する。実施例は本発明の種々の態様
を示し、種々のタンパク質：リン脂質組成物の安定性及
び生物活性試験の結果を報告する。驚くべきことに、タ
ンパク質と脂質小胞の相互作用はタンパク質のタンパク
質構造を直接安定化させ、脂質の不在下ではタンパク質
の変位をもたらすような条件下であってもタンパク質に
安定化効果を及ぼした。
本発明の実施においては、溶融球状態に遷移すること
が可能な種々のタンパク質を使用できる。使用し得るタ
ンパク質の例としては種々の造血因子を含むサイトカイ
ンを挙げることができ、例えば上記Ｇ−CSF、GM−CSF、
Ｍ−CSF、インターフェロン（α、β及びγ）、インタ
ーロイキン（１−11）、エリトロポエチン（EPO）、繊
維芽細胞成長因子、幹細胞因子、神経成長因子、BDNF、
NT3、血小板由来成長因子及び腫瘍成長因子（α、β）
が挙げられる。他のタンパク質もMGSに遷移することが
可能である。該当タンパク質がMGSに遷移することが可
能な場合には、当該タンパク質を負に帯電したリポソー
ム小胞と接触させると、安定化効果が得られる。
一般に、本発明の実施において有用なＧ−CSFは哺乳
動物から純粋単離された天然種でもよいし、化学的合成
産物でもよいし、ゲノムもしくはcDNAクローニング又は
遺伝子合成により得られる外来DNA配列の原核又は真核
宿主発現産物でもよい。適切な原核宿主としては、種々
の細菌（例えば大腸菌）細胞が挙げられる。適切な真核
宿主としては、酵母（例えばS.cerevisiae）及び哺乳動
物（例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が
挙げられる。使用する宿主に依存して、Ｇ−CSF発現産
物を哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化して
もよいし、グルコシル化しなくてもよい。本発明による
と、このような形態のＧ−CSFのいずれをも任意に使用
することができるが、商業的実用性が最大であるという
理由で特に大腸菌に由来する組換えＧ−CSFが好適であ
る。
本発明で使用するために化学的に修飾するＧ−CSFも
同様に、天然ヒトＧ−CSF（nhG−CSF）でもよいし、組
換え核酸プロセス（例えば原核又は真核宿主細胞発現）
の産物でもよい。一般に、予想される化学的修飾はＧ−
CSF分子自体に化学的部分を結合することである。タン
パク質修飾及び融合タンパク質に関する研究論文の１例
は、Francis,Focus on Growth Factors ３:4−10
（May 1992）（Mediscript,Mountview Court,Friern
Barnet Lane,London N20 OLD,英国刊）である。例
えば、ポリエチレングリコール分子と結合したＧ−CSF
を製造するための材料及び方法を記載したヨーロッパ特
許出願明細書第0401384号（発明の名称“Chemically M
odified Granulocyte Colony Stimulating Facto
r"）を参照されたい。結合は、タンパク質との直接結合
でもよいし、活性物質への橋として機能する部分と結合
してもよい。結合に最も安定であるという理由で共有結
合が好適である。化学的修飾により、Ｇ−CSFの効果を
制御、抑制又は延長することができる。これは例えば、
化学的に修飾されたＧ−CSFが循環に達するまでに要す
る時間を制御する効果を有する。化学的修飾物質の１例
はポリエチレングリコール組成物及びその誘導体であ
る。
本発明の実施においては、投与後に効力を発揮する任
意の化学的に修飾されたＧ−CSF調製物を使用すること
ができる。効力は当業者に認められるように、公知方法
により決定することができる。PEG化Ｇ−CSF、特に大腸
菌に由来するPEG化Ｇ−CSF、より特定的には大腸菌に由
来するトリ−テトラPEG化Ｇ−CSFが好適である。
Ｇ−CSFは、2.5〜5.0のpH範囲では三次構造が緩んだ
り、α螺旋含有量が増加するなどのコンフォーメーショ
ン変化が生じるという事実にも拘わらず、酸性条件下で
最も安定であると報告されている。Narhiら,J.Protein
Chem.10,359−367（1991）。このコンフォーメーショ
ン変化は溶融球状態（MGS）の特徴である。従って、MGS
に遷移することが可能な他のタンパク質を取り扱う際と
同様に、Ｇ−CSFを取り扱う調合者は凝集及び変性が生
じないように二次及び三次構造の熱誘導変性から保護し
なければならない。
本発明で有用なGM−CSFは、哺乳動物から純粋単離さ
れた天然形態でもよいし、ゲノムもしくはcDNAクローニ
ング又は遺伝子合成により得られた外来DNA配列の原核
又は真核宿主発現産物でもよい。適切な原核宿主として
は種々の細菌（例えば大腸菌）細胞が挙げられる。適切
な真核宿主としては酵母（例えばS.cerevisiae）及び哺
乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル）細
胞が挙げられる。使用する宿主に依存して、GM−CSF発
現産物を哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシル化
してもよいし、グリコシル化しなくてもよい。本発明に
よると、このような形態のGM−CSFのいずれをも任意に
使用することができるが、商業的実用性が最大であると
いう理由で特に大腸菌に由来する組換えGM−CSFが好適
である。
本発明の組成物で有用な脂質小胞は該当タンパク質と
相互作用することが可能な負に帯電したリポソームであ
る。使用可能な特定リポソームとしては、ジオレオイル
ホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジミリストイル
ホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジパルミトイル
ホスファチジルグリセロール（DPPG）、卵ホスファチジ
ルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミン（DOPE）、卵ホスファチジルエタノールアミ
ン、ジオレオイルホスファチジン酸（DOPA）、ジミリス
トイルホスファチジン酸（DMPA）、ジパルミトイルホス
ファチジン酸（DPPA）、ジオレオイルホスファチジルセ
リン（DOPS）、ジミリストイルホスファチジルセリン
（DMPS）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPP
S）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグ
リセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リ
ゾホスファチジルセリンが挙げられる。使用する特定リ
ポソームに依存してリポソームの量は異なる。
タンパク質：リン脂質組成物は好ましくは、溶液のpH
を所望の範囲に維持するために緩衝剤を含有する。好適
緩衝剤としては、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、
及びクエン酸ナトリウムが挙げられる。これらの緩衝剤
の混合物も使用し得る。組成物中で有用な緩衝剤の量は
使用する特定緩衝剤及び溶液のpHに大幅に依存する。例
えば酢酸塩はpH6よりもpH5のほうが有効な緩衝剤である
ので、pH5の溶液中ではpH6の場合よりも少量の酢酸塩を
使用する。本発明の組成物の好適pH範囲はpH3.0〜7.5で
ある。
本発明の組成物は更に、溶液を等張にし、注射適合性
を増すように等張性調節剤を含有し得る。最適な等張性
調節剤は０〜150mMの濃度範囲の塩化ナトリウムであ
る。
本発明は、医薬的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶
化剤、乳化剤、アジュバント及び／又はキャリヤーと共
に有効量の本発明のポリペプチド生成物を含有する医薬
組成物も包含する。このような組成物はタンパク質の物
理的状態、安定性及び生体利用性に影響を与える。例え
ば、参考資料として本明細書の一部とするRemingtons
Pharmaceutical Sciences,第18版,1435−1712（Mack
Publishing Co.,Easton,PA.,1990）を参照されたい。
特定例におけるタンパク質の有効量は、必要な治療効
果、治療する疾病又は疾病の重篤度、被験者の健康状態
等を含めて当業者が考慮する種々の因子に依存する。
大腸菌に由来するrhG−CSFを使用する好適態様による
と、使用するリポソーム小胞は、10mMの酢酸ナトリウム
を含有するpH4.5でDOPG:G−CSF比50:1のDOPGである。
大腸菌に由来するrhGM−CSFを使用する好適態様によ
ると、使用するリポソーム小胞は、リン酸緩衝液（PB
S）中pH7.0でDMPG:GM−CSF比17:1のDMPGである。
化学的に修飾（PEG化）された大腸菌由来rhG−CSFを
使用する好適態様によると、rhG−CSFをトリ−テトラPE
G化し、使用するリポソーム小胞は、pH4.5でDMPG:PEG−
Ｇ−CSF比17:1のDMPGである。
特定のタンパク質：脂質組成物及び治療方法について
本発明を記載したが、本発明の範囲から逸脱することな
く種々の関連組成物及び治療方法が存在し得ることは当
業者に自明である。
以下、実施例により本発明の種々の態様を詳細に説明
する。
実施例１ 組換えヒトＧ−CSF（rhG−CSF）を脂質小胞に組み込
む可能性を試験するために初期実験を実施した。rhG−C
SFは組換えDNA技術を使用して製造し、Souzaの米国特許
第4,810,643号に記載されているようにヒトＧ−CSFをコ
ードするDNA配列で大腸菌をトランスフェクトした。rhG
−CSFは希塩酸中の4mg/ml溶液（pH4.0）として調製し
た。全脂質はAvanti Polar Lipids（Alabaster,Ala）
から入手し、クロロホルム中100mg/mlの最終濃度で窒素
下に−20℃で貯蔵した。
Ｇ−CSF:リン脂質複合体の調製 Ｇ−CSFと組み合わせるための脂質小胞を調製するた
めに、適当な脂質30μモルをガラス管に分配し、窒素ガ
ス流を使用して乾燥し、薄膜を形成した。脂質膜を少な
くとも２時間減圧脱水し、クロロホルムを完全に除去し
た。脂質膜を1mlの蒸留脱イオン水（ddH2O）、リン酸緩
衝液（pH7.2,Gibco/BRL“Ｄ−PGS"）又は150mM NaClで
水和した。次にサンプルを浴型音波処理装置（laborato
ry Supplies,Hicksville,N.Y.）で音波処理した。サン
プルが透明になるまで（通常10〜15分間）音波処理を続
けた。サンプルを使用時まで窒素下に４℃で貯蔵した。
最終脂質濃度は30mMとした。あるいは、脂質300μモル
を窒素下に乾燥し、上述のように脱水することにより脂
質小胞を調製してもよい。乾燥脂質膜は上述のような適
当な水溶液10mlで水和した。次に、卓上乳化機（Microf
luidics Model 110S,Microfluidics,Inc.Cambridge,M
A）を10,000psiで運転してサンプルを微細流動化した。
サンプルを乳化機で10サイクル循環させた。微細流動化
したサンプルをその後、上述のように４℃で貯蔵した。
（上述のような）Ｇ−CSFを（上述のような）特定脂
質と混合することにより、Ｇ−CSF:リン脂質複合体を調
製した。混合は、渦形成、撹拌又は温和な振盪により行
った。種々の脂質:G−CSFモル比のサンプルを調製して
タンパク質の膜挿入及び安定化を評価した。例えば、脂
質:G−CSFモル比40:1で濃度0.2mg/ml Ｇ−CSFの3mlサ
ンプル（水中）を調製するには、Ｇ−CSFストック150μ
ｌに脂質（音波処理により水中で調製した30mMストッ
ク）44μｌを加え、水を加えて最終サンプル容量3mlと
する。（必ずしも必要ではないが）５分間のインキュベ
ーションが推奨され、本実施例ではサンプルの使用又は
アッセイ前にこれを使用した。
微量流動化前にＧ−CSFに水和脂質を加えてもよい。
その後、上述のように混合物を微量流動化し、Ｇ−CSF
を脂質膜に組込む。
Ｇ−CSF:リン脂質複合体の分析 1.トリプトファン発光スペクトル rhG−CSFには局所環境条件に易感受性の２つのトリプ
トファン残基が存在する。従って、rhG−CSFをピロソー
ムと接触させる際のrhG−CSFトリプトファン蛍光を決定
する分析を実施した。蛍光発光最大のブルーシフトは、
トリプトファンがより疎水性の環境にあり、従ってrhG
−CSFが脂質膜に包埋されたことを示す。トリプトファ
ン蛍光分析の優れた研究報告の１例は、Lakowicz著Prin
ciples of Fluorescence Microscopy,第11章（Plenu
m Press,New York,1983）である。
サンプルを280nmで励起し、1nm/秒の速度で1nmの増分
で発光を285nmから420nmまで走査することにより、（上
述のような）Ｇ−CSF:脂質複合体のトリプトファン蛍光
をアッセイした。サンプル容量は3mlとし、Ｇ−CSFの最
終濃度は全サンプルで0.2mg/mlとした。脂質:G−CSF比
は変化させた。全蛍光測定は、PTI Alphascan蛍光量計
（South Brunswick,NJ）を使用して実施した。全測定
は25℃で実施し、この温度は循環水浴と接続した水ジャ
ケット付きキュベットホルダーを使用することにより維
持した。発光スペクトルを集め、PTIから販売されてい
るデータソフトウェアを使用して分析した。
DOPGから構成される小さな単カメラ小胞の存在下及び
不在下のrhG−CSFの蛍光スペクトルを図１に示す。rhG
−CSFはDOPG小胞の不在下では334nmで発光最大を有す
る。100:1脂質：タンパク質比のDOPGの存在下では、rhG
−CSFトリプトファン蛍光は327nmへの蛍光発光最大のブ
ルーシフトと、蛍光強度の劇的な増加を示す。DOPGの存
在下における蛍光発光の低波長は、トリプトファンが天
然タンパク質よりも疎水性の環境に存在することを示唆
するものである。図２から明らかなように、蛍光シフト
はDOPG:G−CSFのモル比に依存し、DOPG:G−CSF比が10:1
に達すると膜挿入を検出することができる。
2.ヨウ化物消光実験 ヨウ化物はトリプトファン蛍光の有効な衝突性消光剤
であるが、脂質膜に浸透することはできない。従って、
残基がバルク水性溶媒に暴露されると、ヨウ化物により
トリプトファン蛍光の有効な消光が起こり、タンパク質
トリプトファンが水性溶媒から封鎖されると、ヨウ化物
消光からの保護が生じる。これらの実験では、Ｇ−CSF
及びDOPG:G−CSF組成物（脂質：タンパク質比100:1）を
使用した。サンプルの初期読み取り（F0）を行って記録
した後、添加量を増加しながらヨウ化カリウム（KI）
（5Mストック）を加えた後に蛍光強度を測定した。サン
プル及びKI溶液はいずれもLeeら,Biochem.Biophys.Act
a,984:174−182（1989）及びLe Doanら,Biochem.Bioph
ys.Acta,858:1−５（1986）に記載されているように1mM
Na2SO3（最終濃度）を含有するように調製した。Na2S
O3を加えるのは、I2が形成されないようにし、タンパク
質及び膜の非極性領域に分割しないようにするためであ
る。Stern−Volmerの式（F0/F＝１＋KKI［KI］）（式
中、F0及びＦは夫々濃度［KI］のKIの不在下及び存在下
におけるサンプルの蛍光強度であり、KKIはＧ−CSFトリ
プトファン残基のKI消光のためのStern−Volmer消光定
数である）によりデータを分析した。Lehrer,S.,Bioche
mistry 10:3254−3263（1979）。
データのStern−Volmerプロットを図３に示す。DOPG
小胞の不在下では、rhG−CSF蛍光はKIにより有効に消光
される。DOPGの存在下では、データのStern−Volmerプ
ロットは線形であり、ヨウ化物が２つのトリプトファン
に接近しにくいことを示す。データは、DOPGの不在下で
ヨウ化物に接近可能なトリプトファン残基がDOPGの存在
下ではヨウ化物に接近不能になることを示す。従って、
このトリプトファンを含むrhG−CSFの部分をDOPG二重層
に包埋しなければならない。
3.エネルギー転移測定 先に示したように、このプローブの励起スペクトルは
トリプトファンの発光スペクトルに有意にオーバーラッ
プするので、トリプトファン供与体とピレンデカン酸等
の脂質可溶性蛍光受容体との間にはエネルギー転移が生
じ得る。Friereら,Biochemistry 22:1675−1680（198
3）。タンパク質が脂質膜に挿入するならば、トリプト
ファンからピレンへのエネルギー転移によりトリプトフ
ァン蛍光の消光が生じる。この実験では、種々の量のピ
レンデカン酸（テトラヒドロフラン中30μg/mlストッ
ク）の添加前（F0）及び添加後（Ｆ）に種々のＧ−CSF:
脂質複合体のトリプトファン発光強度を記録した。ピレ
ンデカン酸添加中にサンプルを連続的に撹拌し、ピレン
デカン酸とサンプルの混合を助長した。F/F0の比はＧ−
CSFトリプトファンと疎水性エネルギー受容体ピレンデ
カン酸の間に生じるエネルギー転移の量に比例する。
図４は、添加したピレンデカン酸の関数としてDOPG
（脂質：タンパク質比100:1）の存在下におけるrhG−CS
Fの消光プロフィルを示す。消光は非常に低いピレンデ
カン酸濃度（＜１モル％）で生じるので、膜構造及び挙
動に及ぼす蛍光プローブの効果は最小である。ピレンデ
カン酸は脂質二重層に迅速に分割すると予想することが
できるので、このデータは、rhG−CSFがトリプトファン
からピレン受容体への有効なエネルギー転移を可能にす
るために十分な深さまでDOPG膜に包埋されていることを
示す。rhG−CSFの存在下及び不在下でピレンデカン酸で
標識したDOPG小胞の励起スペクトルを試験することによ
り、エネルギー転移を確認した。
上記分析から明らかなように、rhG−CSFはDOPG等の不
飽和リン脂質と密接に相互作用し得る。DOPG小胞の存在
下では、rhG−CSFトリプトファンは水溶液蛍光消光剤か
ら保護されるが、疎水性蛍光プローブへのエネルギー転
移を介して消光を受ける可能性がある。データをまとめ
ると、rhG−CSFはDOPGから構成される膜に挿入すること
ができる。10:1比（脂質:G−CSF）に達すると、膜挿入
を検出可能であるが、この数はタンパク質の挿入部分の
周囲の脂質の数に相当し得る。
実施例２ 本実施例では、上述のようなF/F0強度及び発光最大の
比較を使用して、rhG−CSFが他のリン脂質と相互作用す
る能力を判定した。各場合に、脂質:rhG−CSFのモル比
は100:1とした。
図５は、種々の脂質の不在下及び存在下におけるrhG
−CSFのF/F0データを示す。図６は同一組成の発光最大
データを示す。図５及び図６のデータから明らかなよう
に、DOPG以外に、rhG−CSFはDMPG、DPPGにも挿入するこ
とができ、より低効率ではあるが、ホスファチジルエタ
ノールアミン（PE）及びホスファチジルセリン（PS）に
も挿入することができる。更に、NG−DOPE（PEヘッド基
の負電荷を高めたDOPEサンプル）はDOPEよりもrhG−CSF
の挿入を改善できることが判明した。
DOPE、DMPC及びDPPCは中性脂質であり、これらの小胞
はrhG−CSFの発光最大にも蛍光強度にも全くではないに
しても殆ど影響を与えておらず、これらのリン脂質との
間に相互作用は生じなかったと思われる（図５及び６、
並びに図７、曲線２参照）。
上記データから明らかなように、溶融球状態に遷移す
ることが可能なタンパク質は種々の脂質小胞に挿入する
ことができる。しかしながら、このrhG−CSF:脂質相互
作用は負に帯電した脂質小胞を使用した場合にしか生じ
ない。負に帯電した脂質小胞のうちでは負電荷の高い小
胞のほうが強いrhG−CSF相互作用を生じると思われる。
実施例３ 本実施例では、タンパク質安定性に関するrhG−CSF:D
OPG相互作用の効果を決定した。Peltier型サーモスタッ
ト付きセルホルダー及び磁気撹拌機を備えるJasco Ｊ
−720装置で円二色性測定を実施した。80μg/mlの最終r
hG−CSF濃度（pH6.0）を使用して222nmでの円二色性を
測定した。Microcal MC−２熱量計を使用して示差走査
熱量測定を実施した。rhG−CSF（水中1mg/ml）又はDOP
G:rhG−CSF（水中45:1モル／モル）のサンプルを90℃／
時の速度で走査した。データを保存し、Microcalソフト
ウェアを使用して分析した。
温度増加の関数として円二色性（222nm）を測定する
ことにより、Ｇ−CSFのα螺旋の温度誘導変化を測定す
ることができる。pH6.0でのrhG−CSFの熱誘導変性を図
８に示す。曲線は、〜60〜70℃でかなり急な遷移が生じ
ることを示しており、α螺旋の損失が生じると予想され
る。この遷移後、rhG−CSFは溶液から不可逆的に沈殿す
る。変性温度範囲は、示差走査熱量測定により決定した
pH7.0でのrhG−CSFの溶融温度（図９）に類似する。
他方、DOPG:rhG−CSFサンプルは温度増加と共にα螺
旋の漸次損失を示し、rhG−CSF単独の場合とは異なり、
DOPG:rhG−CSFの温度誘導変性は協同的ではないように
思われる（図８参照）、この推論は、示差走査熱量測定
により示される溶融遷移の欠如からも立証される（図
９）。特筆すべき点として、DOPG:rhG−CSFサンプルは9
5℃に加熱後にα螺旋を回復することができ、95℃と10
℃の間で繰り返し循環させることができ、冷却後には螺
旋を完全に回復する（図10参照）。同一条件下でrhG−C
SF単独では不可逆的に変性し、溶液から沈殿する。
Ｇ−CSF円二色性に及ぼすDMPG及びDPPGの効果も試験
した。150:1の脂質:rhG−CSF比を使用した処、DOPGの場
合と同様に、DMPG及びDPPGもrhG−CSFの二次構造を安定
化させることが判明した（図11〜13）。
以上のデータから明らかなように、rhG−CSFとDOPG、
DMPG及びDPPGとの相互作用の結果として、rhG−CSF単独
では不安定な条件下でタンパク質の安定性を強化するこ
とができる。相互作用はrhG−CSFの二次及び三次構造を
直接安定化させる。
実施例４ 本実施例では、rhG−CSFの生物活性に関するrhG−CS
F:DOPG相互作用の効果を判定した。Zseboら,Immunobiol
ogy 172:175−184（1986）に記載されているようにマ
ウス骨髄細胞によるＧ−CSF依存性［3H］−チミジン取
り込みを使用してrhG−CSFのin vitro活性をアッセイ
した。全活性アッセイは３回繰り返して実施した。in
vivo活性はハムスターの皮下注射（rhG−CSF容量100μg
/kg）及び白血球（WBC）カウントの測定により定量し
た。
1.in vitro活性 A.DOPGの不在下及び存在下におけるrhG−CSFの比活性を
定量した。熱処理したrhG−CSF及びDOPG:rhG−CSFサン
プルも試験した。結果を表１に要約する。
表１ サンプル 比活性（U/mg/タンパク質） rhG−CSF 0.66±0.09 rhG−CSF（加熱）ａ 検出不能 DOPG:rhG−CSFb 0.61±0.11 DOPG:rhG−CSFb（加熱）ａ 0.52±0.08 ａサンプルはアッセイ実施前に水浴中で85℃で10分間
インキュベートした。
bDOPG:rhG−CSF比50:1（モル／モル）。
表１に示すように、DOPG二重層への挿入はrhG−CSFの
生物活性に悪影響を与えない。85℃に10分間加熱後、rh
G−CSFは検出可能な活性をもたず、タンパク質は沈殿す
る。同様の処理後、DOPG:rhG−CSFは非加熱rhG−CSFの
活性の〜85％を維持し、冷却後に二次構造を完全に回復
する。
B.種々の脂質が凍結乾燥中にrhG−CSFを安定化させる能
力も試験した。種々の脂質と組み合わせたrhG−CSFのサ
ンプルを凍結乾燥し、（上述のように）活性をアッセイ
した。DOPG、DMPG及びDPPGをrhG−CSFと混合すると、凍
結乾燥後にrhG−CSF生活性の〜100％を維持することが
できる（図14）。rhG−CSF単独では凍結乾燥プロセスに
耐えることができなかった。
2.in vivo活性 脂質の不在下及び存在下におけるrhG−CSFの活性（WB
Cカウント）を定量した。０日目に皮下注射（rhG−CSF
用量100μg/kg）後に活性を測定した。５種の異なる脂
質:rhG−CSF複合体をアッセイした処、各場合とも脂質:
rhG−CSF複合体はin vivo活性を維持した（図15及び1
6）。
以上の試験から明らかなように、負に帯電した脂質二
重層への挿入はrhG−CSFの生物活性に悪影響を与えな
い。更に、脂質の保護効果は凍結乾燥プロセス中にrhG
−CSFを保護すると思われる。
実施例５ 本実施例では、化学的に修飾されたＧ−CSF（PEG化Ｇ
−CSF（PEG−Ｇ−CSF））及び真核宿主細胞発現産物と
して得られたＧ−CSF（CHO−Ｇ−CSF）が負に帯電した
脂質小胞と相互作用する能力を試験した。CHO−Ｇ−CSF
については、（上記実施例１に記載したような）F/F0強
度及び発光最大の比較を使用して判定した。各場合とも
脂質：タンパク質のモル比100:1とした。PEG−Ｇ−CSF
では円二色性分析に基づいて判定した。
使用したCHO−Ｇ−CSFは組換えDNA技術を用いて製造
し、Souzaの米国特許第4,810,643号に記載されているよ
うにチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を、ヒト
Ｇ−CSFをコードするDNA配列でトランスフェクトした。
CHO−Ｇ−CSFはPBS（pH7.0）中0.6mg/ml溶液として調製
した。CHO−Ｇ−CSFはrhG−CSFと同様にDOPGと相互作用
することが判明し、各サンプルはDOPGの存在下で蛍光強
度の増加を示すと共に、DOPGの存在下で発光最大のブル
ーシフトを示した（図17及び18）。従って、DOPG相互作
用はＧ−CSFの組換え形態の何らかの独自性に起因する
ものではない。
これらの実験で使用したPEG−Ｇ−CSFは、大腸菌に由
来するトリ−テトラPEG化Ｇ−CSF（PEG6000を使用）で
あった。上記手順を使用してDMPG:PEG−Ｇ−CSF（17:1
モル／モル）サンプルを調製した。DMPG:PEG−Ｇ−CSF
サンプルは加熱後に二次構造を完全に回復することが判
明した（図19）。PEG分子の存在にも拘わらず、誘導体
化タンパク質は天然タンパク質と同様に脂質と相互作用
することが可能であった。
以上のデータから明らかなように、Ｇ−CSFと負に帯
電した脂質小胞との相互作用に関連する安定化効果は、
原核宿主細胞発現産物として得られるrhG−CSFのみに固
有ではない。MGSに遷移することが可能な化学的に修飾
されたタンパク質でも、リポソーム小胞（ここではPEG
−Ｇ−CSF:DMPG）と接触すると、同様に安定化効果を示
した。
実施例６ 本実施例では、GM−CSFに及ぼすDMPG及びDPPGの効果
を試験した。GM−CSFはBooneの米国特許第5,047,504号
に記載されているような組換えヒトGM−CSFを用い、リ
ン酸緩衝溶液（PBS,pH7.0）中1mg/ml溶液として調製し
た。17:1の脂質:GM−CSF比を使用し、上述のような円二
色性分析を使用して熱安定性を測定した。DMPG及びDPPG
はGM−CSFの良好な熱安定性をもたらし、即ち加熱後に
二次構造を回復した（図20a及び20b）。
以上のデータは、溶融球状態に遷移することができ、
負に帯電した脂質小胞と相互作用してタンパク質に良好
な熱安定性を与えることが可能なタンパク質の別の例を
提供するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−34920（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−258424（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−299（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−505173（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−506207（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−502192（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／18749（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 47/24 A61K 38/00 - 38/58 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】溶融球状態に遷移することが可能なタンパ
    ク質を負に帯電したリポソーム小胞と接触させて形成さ
    れたリポソーム−タンパク質複合体を含有する医薬用組
    成物であって、pH3.0〜7.5であり10:1〜150:1の脂質−
    タンパク質比を有し、前記リポソーム−タンパク質複合
    体が前記タンパク質の二次構造の変性に対し直接安定化
    されており、前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホス
    ファジルグリセロール（DOPG）、卵ホスファチジルグリ
    セロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミ
    ン（DOPE）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオ
    レオイルホスファチジン酸（DOPA）、ジパルミトイルホ
    スファチジン酸（DPPA）、ジオレオイルホスファチジル
    セリン（DOPS）、ジミリストイルホスファチジルセリン
    （DMPS）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPP
    S）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグ
    リセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン及び
    リゾホスファチジルセリンからなる群から選択される前
    記組成物。
  2. 【請求項２】前記タンパク質がサイトカインである請求
    項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】前記サイトカインが造血因子である請求項
    ２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記造血因子がＧ−CSF及びGM−CSFからな
    る群から選択される請求項３に記載の組成物。
  5. 【請求項５】前記造血因子がＧ−CSFである請求項３に
    記載の組成物。
  6. 【請求項６】Ｇ−CSFが天然ヒトＧ−CSFであるか又は、
    原核もしくは真核宿主細胞発現産物として得られる請求
    項５に記載の組成物。
  7. 【請求項７】Ｇ−CSFが化学的に修飾されたＧ−CSFであ
    る請求項５に記載の組成物。
  8. 【請求項８】化学的に修飾されたＧ−CSFがPEG化Ｇ−CS
    Fである請求項７に記載の組成物。
  9. 【請求項９】医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する
    請求項１に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】前記タンパク質が大腸菌に由来するrhG
    −CSFであり、前記リポソーム小胞がDOPGであり、前記
    組成物が50:1のDOPG:rhG−CSF比を有しており、pH4.5を
    有しており、10mM酢酸ナトリウムを含有する請求項１に
    記載の組成物。
  11. 【請求項１１】医薬用のリボソーム−タンパク質組成物
    を製造する方法であって、溶融球状態に遷移することが
    可能なタンパク質を負に帯電したリポソーム小胞と接触
    させて、pH3.0〜7.5であり10:1〜150:1の脂質−タンパ
    ク質比を有する前記リポソーム−タンパク質組成物を得
    ることを含み、前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホ
    スファチジルグリセロール（DOPG）、卵ホスファチジル
    グリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノール
    アミン（DOPE）、卵ホスファチジルエタノールアミン、
    ジオレオイルホスファチジン酸（DOPA）、ジパルミトイ
    ルホスファチジン酸（DPPA）、ジオレオイルホスファチ
    ジルセリン（DOPS）、ジミリストイルホスファチジルセ
    リン（DMPS）、ジパルミトイルホスファチジルセリン
    （DPPS）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジ
    ルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン
    及びリゾホスファチジルセリンからなる群から選択され
    る前記方法。
  12. 【請求項１２】前記タンパク質がサイトカインである請
    求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記サイトカインが造血因子である請求
    項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記造血因子がＧ−CSF及びGM−CSFから
    なる群から選択される請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記造血因子がＧ−CSFである請求項13
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】Ｇ−CSFが天然ヒトＧ−CSFであるか又
    は、原核もしくは真核宿主細胞発現産物として得られる
    請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】Ｇ−CSFが化学的に修飾されたＧ−CSFで
    ある請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項１８】化学的に修飾されたＧ−CSFがPEG化Ｇ−
    CSFである請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記組成物が医薬的に許容可能なキャリ
    ヤーを含有する請求項11に記載の方法。
JP7510908A 1993-10-06 1994-09-29 安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法 Expired - Lifetime JP2852127B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13241393A 1993-10-06 1993-10-06
US08/132,413 1993-10-06
US132,413 1993-10-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08505403A JPH08505403A (ja) 1996-06-11
JP2852127B2 true JP2852127B2 (ja) 1999-01-27

Family

ID=22453938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7510908A Expired - Lifetime JP2852127B2 (ja) 1993-10-06 1994-09-29 安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0671905B1 (ja)
JP (1) JP2852127B2 (ja)
KR (1) KR100372006B1 (ja)
CN (1) CN1206982C (ja)
AT (1) ATE222752T1 (ja)
AU (1) AU683698B2 (ja)
CA (1) CA2150939C (ja)
CZ (1) CZ290029B6 (ja)
DE (1) DE69431236T2 (ja)
DK (1) DK0671905T3 (ja)
ES (1) ES2184768T3 (ja)
FI (1) FI116271B (ja)
HK (1) HK1010341A1 (ja)
HU (1) HUT72326A (ja)
IL (1) IL111170A (ja)
NO (1) NO314064B1 (ja)
NZ (1) NZ274705A (ja)
PT (1) PT671905E (ja)
RU (1) RU2119791C1 (ja)
WO (1) WO1995009611A2 (ja)
ZA (1) ZA947782B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7972593B2 (en) 2004-06-10 2011-07-05 Saint Louis University Delivery of therapeutic agents to the bone

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874075A (en) * 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US7863238B2 (en) 2004-06-10 2011-01-04 Saint Louis University Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids
JP2006248978A (ja) * 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
RU2555357C2 (ru) 2008-04-08 2015-07-10 Мерк Патент Гмбх Композиции, содержащие циклические пептиды, и способы их применения
CN104507953B (zh) * 2012-05-31 2018-05-18 新加坡科技研究局 通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法
JP6139781B2 (ja) * 2014-04-04 2017-05-31 国立大学法人大阪大学 リゾリン脂質受容体を活性化する物質を含有する薬剤送達促進剤

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4208527A1 (de) * 1992-03-17 1993-09-23 Max Planck Gesellschaft Liposomen mit negativer ueberschussladung
JPH06247842A (ja) * 1993-02-23 1994-09-06 Green Cross Corp:The リポソーム組成物の製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7972593B2 (en) 2004-06-10 2011-07-05 Saint Louis University Delivery of therapeutic agents to the bone

Also Published As

Publication number Publication date
CN1117266A (zh) 1996-02-21
FI952738A (fi) 1995-07-31
IL111170A (en) 1999-11-30
CZ290029B6 (cs) 2002-05-15
ATE222752T1 (de) 2002-09-15
IL111170A0 (en) 1994-12-29
NO952210L (no) 1995-08-04
NO952210D0 (no) 1995-06-02
KR960700042A (ko) 1996-01-19
ES2184768T3 (es) 2003-04-16
PT671905E (pt) 2002-12-31
AU683698B2 (en) 1997-11-20
CN1206982C (zh) 2005-06-22
WO1995009611A3 (en) 1995-06-22
DE69431236D1 (de) 2002-10-02
CZ143895A3 (en) 1996-01-17
RU2119791C1 (ru) 1998-10-10
DE69431236T2 (de) 2003-01-02
EP0671905A1 (en) 1995-09-20
FI952738A0 (fi) 1995-06-05
NO314064B1 (no) 2003-01-27
EP0671905B1 (en) 2002-08-28
HU9502053D0 (en) 1995-10-30
AU7923994A (en) 1995-05-01
HUT72326A (en) 1996-04-29
KR100372006B1 (ko) 2003-07-18
JPH08505403A (ja) 1996-06-11
CA2150939A1 (en) 1995-04-13
NZ274705A (en) 1997-12-19
CA2150939C (en) 2001-05-01
FI116271B (fi) 2005-10-31
DK0671905T3 (da) 2002-10-07
WO1995009611A2 (en) 1995-04-13
HK1010341A1 (en) 1999-06-17
ZA947782B (en) 1995-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3856471B2 (ja) 安定なタンパク質：リン脂質の組成物および方法
EP0826063A1 (en) Single-vial formulations of dna/lipid complexes
US8349794B2 (en) Reconstitution medium for protein and peptide formulations
JP2852127B2 (ja) 安定なタンパク質：リン脂質組成物及び方法
Qiu et al. Multivesicular liposome formulations for the sustained delivery of interferon α-2b
AU688678C (en) Stable protein:phospholipid compositions and methods
MXPA97007137A (en) Stable protein compositions: fosfolipidos ymeto
EP0274219A2 (en) Interleukin-2-containing liposome composition and method for the production thereof
JP2000198731A (ja) 毒性の低減されたリポソ―ム