NO314064B1 - Stabile liposom-cytokin-preparater og fremgangsmåte for fremstilling derav - Google Patents
Stabile liposom-cytokin-preparater og fremgangsmåte for fremstilling derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO314064B1 NO314064B1 NO19952210A NO952210A NO314064B1 NO 314064 B1 NO314064 B1 NO 314064B1 NO 19952210 A NO19952210 A NO 19952210A NO 952210 A NO952210 A NO 952210A NO 314064 B1 NO314064 B1 NO 314064B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- csf
- mgdf
- preparation
- cytokine
- liposome
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 69
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims description 63
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims description 33
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims description 33
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 77
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 77
- DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N [(2r)-3-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N 0.000 claims description 60
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 claims description 31
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 claims description 31
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 21
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 21
- BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 0.000 claims description 19
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 10
- OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 0.000 claims description 9
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 claims description 9
- WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N (2s)-2-amino-3-({[(2r)-2,3-bis(tetradecanoyloxy)propoxy](hydroxy)phosphoryl}oxy)propanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N 0.000 claims description 8
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 claims description 8
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 claims description 8
- KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N Dipalmitoylphosphatidylserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims description 8
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 6
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 5
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims description 5
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 claims description 4
- ZPDQFUYPBVXUKS-YADHBBJMSA-N 1-stearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O ZPDQFUYPBVXUKS-YADHBBJMSA-N 0.000 claims description 4
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 claims description 4
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 claims description 4
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims 25
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims 25
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims 10
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims 3
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 14
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 12
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 10-pyren-1-yldecanoic acid Chemical compound C1=C2C(CCCCCCCCCC(=O)O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 PIMKEUIWMFJVNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 7
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 2
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000001008 Macro domains Human genes 0.000 description 1
- 108050007982 Macro domains Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 206010027905 Monocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011021 bench scale process Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 150000004694 iodide salts Chemical group 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
O ppfinnelsens bakgrunn
Foreliggende oppfinnelse vedrører cytokin-fosfolipidstrukturer som kan anvendes til stabilisering av sekundær- og tertiærstrukturen til cytokiner som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen preparater av cytokin og en fosfolipidliposomvesikkel med forøkt stabilitet, samt fremgangsmåte for fremstilling derav.
Flere proteiner er blitt påvist å gå over i en smeltet, globulær tilstand (MGS). Van der Goot, F.G., Nature 354, 408-410 (1991). Proteiner i den smeltede, globulære tilstand har sekundærstruktur som kan sammenlignes med det naturlig forekommende protein selv om de mangler rigid tertiærstruktur. Pitsyn et al., FEBS Letters 262:1,20-24 (1990). I noen tilfeller ledsages overgang til denne tilstanden av eksponering av tidligere gjemte, hydrofobe områder i proteinet. Ved å eksponere kritiske, hydrofobe rester kan MGS være et mellomprodukt i aggregeringen og ut-fellingen av proteiner. MGS-konformasjonen kan påvises ved å sammenligne den sirkulære dikroisme i det fjerne UV-område med spektrene til aromatiske sidekjeder (nær-UV-sirkulærdikroisme og fluorescens). Den smeltede, globulære tilstand oppviser aromatiske gruppespektrumendringer i fravær av endringer i fjern-UV-sirkulærdikroisme, Bychkova et al., FEBS Letters 255:231-234 (1988), og kan være invol-vert i membrangjennomtrengning av noen proteiner Bychkova et al., FEBS Letters 235:231-234 (1988); Van der Goot, F.G., Nature 354, 408-410 (1991).
To proteiner som er kjent for overgang til MGS før aggregasjon, er granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF) og granulocyttmakrofagkolonistimu-lerende faktor (GM-CSF). Selv om disse to proteinene kan stabiliseres under visse, bestemte betingelser, foreligger det et behov for å forlenge lagringstiden til disse materialene ved å stabilisere sekundær- og tertiærstrukturen til proteinene.
Human, rekombinant G-CSF stimulerer selektivt nøytrofiler, en type hvite blodlegemer som brukes for å bekjempe infeksjon. For tiden er Filgrastim, en rekombinant G-CSF, tilgjengelig for terapeutisk anvendelse. Strukturen til G-CSF under forskjellige tilstander er blitt grundig undersøkt; Lu et al., J. Biol. Chem. vol. 267, 8770-8777 (1992). På grunn av dens hydrofobe karakteristika er G-CSF vanskelig å formulere for forlenget lagringstid. Formuleringer av visse hydrofobe proteiner taper aktivitet på grunn av dannelse av dimeraggregater og aggregater av høyere orden (makroområde) under langvarig lagring. Andre kjemiske endringer, slik som deamidering og oksidasjon, kan også inntre ved lagring. I tillegg må G-CSF-for-mulatoren beskytte mot denaturering, og det må særlig ses til at stabiliteten av proteinets sekundær- og tertiærstruktur opprettholdes.
Human GM-CSF er et 22-kDa glykoprotein som kontinuerlig kreves for proliferasjonen av makrofag- og granulocyttforløperceller in vitro. Den regulerer også disse forløpernes irreversible evne til å danne granulocytter og makrofager. Andre biologiske aktiviteter kan omfatte regulering av funksjonell aktivitet hos modne celletyper; Gough et al., Nature, 309, 763-767 (1984), og økning av kjemotaksis mot anerkjente, kjemiske tiltrekningsmidler; Williams et al., Hematology, 4. utgave
(1990). GM-CSF stimulerer også produksjonen av monocytter og kan således være nyttig ved behandlingen av monocyttsykdommer, slik som monocytopeni.
Human-GM-CSF kan oppnås og renses fra en rekke kilder. Fremgangsmåter for fremstilling av rekombinant human-GM-CSF er tidligere blitt beskrevet av Burgess et al., Blood, 69:1,43-51 (1987). US patentskrift 5 047 504 (Boone) har muliggjort fremstillingen av kommersielle mengder av GM-CSF i ikke-glykosylert form som et produkt av prokaryot vertscelleekspresjon.
En måte som tidligere er blitt prøvd for å arbeide med slike proteiner som G-CSF og GM-CSF, er anvendelsen av liposomer. Liposomer er fullstendig lukkede lipiddobbeltlagsmembraner dannet av vannuoppløselige, polare lipider, særlig fosfolipider. Liposomvesikler kan ha et enkelt membrandobbeltlag (enlamellært) eller kan ha flere membrandobbeltlag (flerlamellært). Dobbeltlaget er satt sammen av to lipidmonolag som har et hydrofilt (polart) "hode"-område og et hydrofobt (ikke-polart) "hale"-område hvor de hydrofobe halene orienterer seg mot midten av dobbeltlaget, mens de hydrofile hodene orienterer seg mot vannfasen. Stabiliteten, rigiditeten og permeabiliteten til liposomer kan endres ved endringer i fosfolipidsammensetning-en, ved endringer i temperatur, ved innlemmelse av en sterol eller ved inkorporering av en ladet amfifil. Liposomers grunnleggende struktur kan lages ved hjelp av mange forskjellige teknikker som er kjent innen faget.
Ved fremgangsmåten for dannelse av liposomer kan de fange inn vann-oppløsninger i de vandige kanalene og frigjøre dem med varierende hastigheter. Etter oppdagelsen av at liposomer kan innføre enzymer i celler og endre deres metabolisme (Gregoriadis, New Engl. J. Med. 295, 704-710, 765-770 (1976)), ble liposomer ansett for å være svaret på etterspørselen etter målrettet legemiddelavlevering. Som et resultat av dette, foregår det ganske mye utviklingsforskning innen den farmasøytiske industri som omfatter bruk av liposomer som sakte frigjørende depoter for legemidler, vitaminer og proteiner som er sekvestrert innenfor liposomets hydrofobe lag eller hydrofobe kjerne.
Vellykket bruk av liposomer som legemiddelbærere har vært begrenset ettersom forskernes forsøk på slik bruk har støtt på flere problemer. For eksempel er liposomer kjent for å virke som sterke, immunologiske hjelpestoffer for innelukkede antigener, og det må utøves forsiktighet når enzymer eller andre proteiner av xenogen opprinnelse innelukkes i liposomene. Diffusjonshastigheten til legemidlet er dessuten vanskelig å regulere. Dette er en funksjon av den iboende ustabilitet hos liposomene og tilstedeværelsen av visse blodkomponenter som akselererer diffusjon av visse legemidler. I tillegg innelukkes noen stoffer i kraft av sin natur dårlig i liposomer og diffunderer derfor hurtig i blodomløpet. Endelig har det vært et problem med mål-retting mot andre celler eller organer enn leveren og milten. En utmerket oversikt over liposomer, stoffer som har vært inkorporert i liposomer og problemene forbundet med bruk av liposomer som legemiddelbærere, er "Liposomes" av Gregory Gregoriaidis, som finnes i Drug Carriers in Biology and Medicine, kapittel 14, 287-341 (Academic Press, N.Y., 1979).
Selv om det har vært rapportert mye vedrørende forsøk på bruk av liposomer som legemiddelbærere, er det beskrevet lite vedrørende bruken av liposomer for det formål å øke lagringstiden til terapeutiske peptider eller proteiner ved å stabilisere strukturen til peptidet og/eller proteinet. I PCT/US90/05163, med tittelen 'Therapeutic Peptides and Proteins", Hostetler et al., beskrives bruk av tomme liposomer som et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel for å oppløseliggjøre poly-peptider og/eller proteiner for å forhindre akkumulering av polypeptidene og/eller proteinene i en grenseflate mellom luft og vann, og for å forhindre adsorpsjon av polypeptidene og/eller proteinene til beholderoverflater. I Hostetler et al. beskrives det at negativt ladet fosfolipid kan tilsettes i opptil ca. 50 mol%, og at fosfatidylcholin, et nøytralt fosfolipid, er det foretrukne liposom. I Hostetler et al. beskrives ikke en for-tynner som er påvist å stabilisere strukturen til et polypeptid og/eller protein.
I PCT/US91/07694, med tittelen "Preparation and Characterization of Liposomal Formulations of Tumor Necrosis Factor", Hung et al., beskrives et lipofilt, modifisert tumornekrosefaktormolekyl (TNF) forbundet til overflaten eller innkapslet i et liposom. De liposomale, lipofile TNF-molekyler rapporteres å ha forøkt stabilitet in vivo. Stabilitet refererer seg til en økning eller en økt tilbøyelighet hos TNF-lipo-somet til å lekke TNF til systemet in vivo. De foretrukne liposomer var nøytrale lipider. Hung et al. beskriver ikke et TNF-preparat hvor eksipiensene har en stabiliserende effekt på strukturen til proteinet.
Det kan ikke utledes noe fra litteraturen vedrørende det å bringe et protein, f.eks. G-CSF, i kontakt med en negativt ladet lipidvesikkel for derved å stabilisere proteinet direkte mot varmeindusert aggregasjon, denaturering, tap av aktivitet og utfolding av sekundærstrukturen. Det foreligger et behov for slike preparater som gir fordelen ved å kunne benyttes i formuleringsprosedyrer som krever høye temperaturer, samt som kan anvendes som nye avleveringsbærere (f.eks. oral administrering av pegylert G-CSF). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike preparater.
O ppsummering av oppfinnelsen
Oppfinnelsen vedrører et preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter et cytokin blandet med en fordannet intakt fosfolipidliposomvesikkel, hvor liposomvesikkelen er sammensatt av negativt ladede fosfolipider, hvor preparatet har minst et forhold på 25:1 (mol:moI) mellom liposom og cytokin, slik at det dannes et liposom-cytokin-kompleks, hvor bare en del av cytokinet er innføyd i lipiddelen av liposomvesikkelen, hvor liposom-cytokin-komplekset er direkte stabilisert mot utfolding av sekundærstrukturen til cytokinet, og hvor preparatet har forbedret lagringstid.
Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et liposom-cytokin-preparat, som er kjennetegnet ved at et cytokin blandes med en fordannet intakt fosfolipid-liposom-vesikkel, hvor liposomvesikkelen er negativt ladet, hvor preparatet har minst et forhold på 25:1 (mohmol) mellom lipsom og cytokin, hvor bare en del av cytokinet er innføyd i lipiddelen av liposomvesikkelen, hvor liposom-cytokin-komplekset er direkte stabilisert mot utfolding av sekundærstrukturen til cytokinet, hvor preparatet har forbedret lagringstid, og liposom-cytokin-preparatet erholdes.
Foreliggende oppfinnelse er således rettet mot tilsetning av fosfolipidliposomvesikler, f.eks. lysofosfolipider eller andre liposomer, til et cytokin under betingelser med smeltet, globulær tilstand som direkte vil stabilisere sekundær-og tertiærstrukturen til proteinet, for derved å beskytte proteinet mot varmeindusert aggregasjon, denaturering og tap av aktivitet. Oppfinnelsen er særlig rettet mot stabile G-CSF-fosfolipid-preparater. Overraskende kan de foretrukne G-CSF-preparater sirkuleres flere ganger mellom 10 og 95°C med full gjenvinning av sekundær protein-struktur etter avkjøling. Preparatene har den doble fordel ved å være anvendbare for formuleringsprosedyrer som krever høye temperaturer, samt bruk i nye G-CSF-avleveringsbærere.
Ved en foretrukket utførelsesform omfatter protein-fosfolipid-komplekset et negativt ladet liposom som er valgt fra: dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG),
eggfosfatidylglyserol, dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE),
eggfosfatidyletanolamin, dioleoylfosfatidinsyre (DOPA),
dimyristoylfosfatidinsyre (DMPA), dipalmitoylfosfatidinsyre (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), eggfosfatidylserin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidyletanolamin, lysofosfatidylserin. DOPG, et negativt ladet, umettet fosfolipid, er spesielt foretrukket. Oppfinnelsen omfatter videre en pH opprettholdt i området 3,0-7,5, og et forhold mellom lipid og protein på minst 10:1.
Ytterligere elementer som gir foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, omfatter bruk av kjemisk modifiserte proteiner i protein-fosfolipid-komplekset, samt bruk av ett eller flere av de følgende: et isotonisitetsregulerende middel, et buffermiddel og et pH-regulerende middel. Som det vil forstås av fagfolk innen teknikken, omfatter oppfinnelsen stabile protein-fosfolipid-preparater med forskjellige kombinasjoner av disse ytterligere elementene.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser fluorescensemisjonsspektret til rhG-CSF i nærvær (kurve 1) og fravær (kurve 2) av DOPG-vesikler. Konsentrasjonen av rhG-CSF var 0,2 mg/ml. DOPG:rhG-CSF-forholdet (kurve 1) var 100:1 (mohmol). Figur 2 viser effekten av å øke forholdet mellom lipid og protein på rhG-CSF-fluorescensen. Fo er startfluorescensen (ikke noe lipid), og F henviser til fluorescensen etter tilsetning av lipid for å oppnå det angitte, molare forhold til lipid:rhG-CSF. Figur 2(a) viser F/F0(n) og maksimale emi-sjonsbølgelengder (A) for blandinger av DOPG:rhG-CSF. Figur 2(b) viser F/F0(n) og maksimale emisjons-bølgelengder (A) for blandinger av DOPC:rhG-CSF. Figur 3 viser Stern-Volmer-plottinger av slukkingen av rhG-CSF-fluorescens ved hjelp av Kl i fravær av (•) og nærvær (o) av DOPG-vesikler. Slukkingsforsøk ble utført ved å tilsette aliquoter av Kl til rhG-CSF (0,2 mg/ml) og DOPG:rhG-CSF (100:1 molar). Figur 4 viser slukking av rhG-CSF-tryptofanfluorescens etter tilsetning av pyrendekansyre. Emisjonsbølgelengden var 327 nm. DOPG:rhG-CSF-forholdet var 100:1 (molar). Figur 5 er en grafisk fremstilling som viser en sammenligning mellom F-styrkeendringer for rhG-CSF i fravær og nærvær av forskjellige lipider. I hvert tilfelle var lipid:protein-forholdet 100:1 (molar). Figur 6 er en grafisk fremstilling som viser en sammenligning mellom endringer i emisjonsmaksima for rhG-CSF i fravær og nærvær av forskjellige lipider.
I hvert tilfelle var lipid:protein-forholdet 100:1 (molar).
Figur 7 viser effekten av DMPC (kurve 2), DMPG (kurve 3) og DMPA (kurve 4) på CD til rhG-CSF (kurve 1). I hvert tilfelle var forholdet mellom lipid og protein 50:1 (molar) i vann, pH 6,0. Figur 8 viser effekten av å øke temperaturen på CD til rhG-CSF (kurve 1) eller DOPG:rhG-CSF (140:1 molar) (kurve 2). rhG-CSF-konsentrasjonen var 80 pig/ml i vann, pH 6,0. Temperaturen ble scannet fra 10-90°C ved en hastighet på 100°C/time. Figur 9 viser differensialscanningskalorimetritermogrammer for rhG-CSF (kurve 1) og DOPG:rhG-CSF (45:1 molar) (kurve 2). Konsentrasjonen av rhG-CSF i prøvene var 1 mg/ml (pH 7,0 i vann). Scanningshastigheten var 90°C/time. Figur 10 viser effekten av temperaturendringer på CD til rhG-CSF (kurve 1) og DOPG:rhG-CSF (140:1 molar) (kurve 2). Prøvene ble hurtig varmet opp til 95°C og avkjølt til 10°C som angitt ved hjelp av pilene. rhG-CSF-konsentrasjonen i prøvene var 80 /ig/ml, pH 6,0. Figur 11 viser effekten av temperaturendringer på CD til rhG-CSF (kurve 1) og DMPG:rhG-CSF (150:1 molar) (kurve 2). Prøvene ble varmet opp til 95°C og avkjølt til 10°C. rhG-CSF-konsentrasjonen i prøvene var 80 ( ig/ m\, pH 6,0. Figur 12 viser effekten av temperaturendringer på CD til rhG-CSF (kurve 1) og DPPG:rhG-CSF (150:1 molar) (kurve 2). Prøvene ble varmet opp til 95°C og avkjølt til 10°C. rhG-CSF-konsentrasjonen i prøvene var 80 fig/ml, pH 6,0. Figur 13 er en grafisk fremstilling som viser forskjellige lipiders evne til å stabilisere rhG-CSF under frysetørking. Lipid:protein-forholdet var 100:1 i hvert tilfelle. Stabilitet var basert på retensjon av aktivitet in vitro i benmargsanalysen. rhG-CSF overlever ikke alene frysetørkingsprosessen, så den anvendte kontroll er ube-handlet rhG-CSF i fravær av lipid. Figur 14 viser effektene av forskjellige lipider på aktiviteten in vivo av rhG-CSF. Aktivitet (WBC-telling) ble målt etter subkutan injeksjon av hamstere. rhG-CSF-dosen var 100/tg/kg med et 100:1 lipid:protein-forhold. Figur 15 viser effektene av forskjellige lipider på aktiviteten in vivo av rhG-CSF. Aktivitet (WBC-telling) ble målt etter subkutan injeksjon av hamstere. rhG-CSF-dosen var 100/xg/kg med et 50:1 lipid:protein-forhold. Figur 16 er en grafisk fremstilling som viser en sammenligning mellom F-styrkeendringer for CHO-G-CSF i fravær og nærvær av DOPG ved varierende pH-verdier. I hvert tilfelle var lipid:protein-forholdet 100:1 (molar). Figur 17 er en grafisk fremstilling som viser en sammenligning mellom endringer i emisjonsmaksima for CHO-G-CSF i fravær og nærvær av DOPG ved varierende pH-verdier. I hvert tilfelle var lipid:protein-forholdet 100:1 (molar).
Figur 18 viser effekten av temperaturendringer på CD til PEG-G-CSF
( ) og DMPG:PEG-G-CSF (17:1 molar) Prøvene ble varmet opp til 90°C og avkjølt til 10°C.
Figur 19 viser: (a) effekten av temperaturendringer på CD til G-CSF i PBS, pH 7,0. GM-CSF ved 10°C ( ) er sammenlignet med GM-CSF som ble varmet opp til 90°C og så avkjølt til 10°C (—); (b) effekten av temperaturendringer på CD til DPPG:PEG-G-CSF (17:1 molar). DPPG:GM-CSF ved 10°C ( ) er sammenlignet med DPPG:GM-CSF som ble varmet opp til 90°C og så avkjølt til 10°C
Nærmere beskrivelse
Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet nærmere i omtalen som følger, og er illustrert ved hjelp av eksemplene som er gitt nedenunder. Eksemplene viser forskjellige aspekter av oppfinnelsen og omfatter resultater av stabilitets- og biologisk aktivitetstesting av forskjellige cytokin-fosfolipid-preparater. Overraskende stabiliserte interaksjonen mellom cytokinene og lipidvesikkelen direkte proteinstrukturen til cytokinet, for derved å utøve en stabiliserende effekt på cytokinet selv under betingelser som fører til denaturering av cytokinet i fravær av lipid.
For bruk ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse har man tenkt på forskjellige cytokiner som er i stand til å gå over i den smeltede, globulære tilstand. Eksempler på cytokiner som det her er tenkt på, er forskjellige hematopoesefaktorer, slik som de tidligere nevnte G-CSF, GM-CSF, M-CSF, interferonene (a, jS og7), interleukinene (1-11), erytropoietin (EPO), fibroblastvekstfaktor, stamcellefaktor, en nervevekstfaktor, BDNF, NT3, blodplateavledet vekstfaktor og tumorvekstfaktor (alfa, beta). Andre cytokiner kan evalueres med hensyn på evne til overgang til MGS. Dersom det aktuelle cytokin er i stand til å gå over til MGS, kan det aktuelle cytokin bringes i kontakt med en negativt ladet liposomvesikkel, og de stabiliserende effekter kan evalueres.
Generelt kan G-CSF som kan anvendes ved utøvelsen av denne oppfinnelsen, være en naturlig forekommende form som er renisolert fra pattedyrorganismer, eller eventuelt et produkt av kjemiske synteseprosedyrer eller av prokaryot eller eukaryot vertsekspresjon av eksogene DNA-sekvenser erholdt ved hjelp av genom-eller cDNA-kloning eller ved hjelp av gensyntese. Egnede prokaryote verter omfatter forskjellige bakterieceller (f.eks. E. coli). Egnede eukaryote verter omfatter gjærceller (f.eks. S. cerevisiaé) og pattedyrceller (f.eks. ovarie fra kinesisk hamster, ape). Avhengig av den anvendte vert kan G-CSF-ekspresjonsproduktet være glykosylert med pattedyr- eller andre eukaryote karbohydrater, eller det kan være ikke-glykosylert. Foreliggende oppfinnelse omfatter bruken av hvilke som helst og alle slike former av G-CSF, selv om rekombinant G-CSF, spesielt E. co/i-avledet, er foretrukket ettersom de kommersielt sett er mest praktiske.
Den G-CSF som skal modifiseres kjemisk for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse, kan også være enten naturlig human-G-CSF (nhG-CSF) eller produktet av en rekombinant nukleinsyreprosess, slik som prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon. Generelt er den kjemiske modifikasjon som man har tenkt på, festingen av en kjemisk rest til selve G-CSF-molekylet. En oversiktsartikkel som beskriver proteinmodifikasjon og fusjonsproteiner, er Francis, Focus on Growth Factors 3:4-10 (mai, 1992) (utgitt av Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK). Se f.eks. EP 0 401 384 med tittelen "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor", som beskriver materialer og metoder for fremstilling av G-CSF som det er festet polyetylenglykolmolekyler til. Festingen kan være ved binding, direkte til proteinet eller til en rest som virker som en bro til det aktive middel. Kovalent binding er foretrukket som den mest stabile for festing. Den kjemiske modifikasjon kan bidra til den regulerte, langvarige eller forlengede effekt av G-CSF. Dette kan f.eks. ha den virkning at det regulerer den tiden som trengs for at den kjemisk modifiserte G-CSF skal nå blodomløpet. Et eksempel på et kjemisk modifikasjonsmiddel er polyetylenglykolpreparater, inkludert derivater derav.
Ved utøvelsen av denne oppfinnelsen har man tenkt på anvendelse av hvilke som helst kjemisk modifiserte G-CSF-preparater som gir virkningsfullhet etter administrering. Virkningsfullhet kan bestemmes ved hjelp av kjente metoder, noe som vil forstås av en som arbeider innenfor feltet. Pegylert G-CSF, spesielt pegylert E. cø/i-avledet G-CSF, og særlig tri-tetra-pegylert E. co//-avledet G-CSF, er foretrukket.
G-CSF er blitt rapportert å være mest stabil under sure betingelser til tross for det faktum at det i pH-området 2,5-5,0 inntrer en konformasjonsendring som omfatter en oppløsning av den tertiære struktur og en økning i innhold av alfa-heliks. Narhi et al., J. Protein Chem. W, 359-367 (1991). Denne konformasjonsendring er karakteristisk for den smeltede, globulære tilstand (MGS). Som i tilfellet med en person som arbeider med utvikling av andre proteiner med evne til overgang til MGS, må en person som arbeider med utvikling av G-CSF, beskytte mot varmeindusert utfolding av sekundær- og tertiærstruktur for å forhindre aggregasjon og denaturering.
Den GM-CSF som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, kan være en naturlig forekommende form som er renisolert fra pattedyrorganismer, eller et produkt av prokaryot eller eukaryot vertsekspresjon av eksogene DNA-sekvenser erholdt ved hjelp av genom- eller cDNA-kloning, eller ved hjelp av gensyntese. Egnede prokaryote verter omfatter forskjellige bakterieceller (f.eks. E. coli). Egnede eukaryote verter omfatter gjær- (f.eks. S. cerevisiaé) og pattedyrceller (f.eks. ovarium fra kinesisk hamster, ape). Avhengig av den anvendte vert kan GM-CSF-ekspresjonsproduktet være glykosylert med pattedyr- eller andre eukaryote karbohydrater, eller det kan være ikke-glykosylert. Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelsen av hvilke som helst eller alle slike former av GM-CSF, selv om rekombinant GM-CSF, spesielt E. co/('-avledet, er foretrukket på grunn av størst kommersiell praktiserbarhet.
Lipidvesiklene som kan anvendes i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, er de negativt ladede liposomer som er i stand til å reagere med det aktuelle protein. Bestemte liposomer som kan anvendes, omfatter dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG), eggfosfatidylglyserol, dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), eggfosfatidyletanolamin, dioleoylfosfatidinsyre (DOPA), dimyristoylfosfatidinsyre (DMPA), dipalmitoylfosfatidinsyre (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), eggfosfatidylserin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidyletanolamin og lysofosfatidylserin. Avhengig av det bestemte liposom som benyttes, vil mengden av liposom kunne variere.
Protein:fosfolipid-preparatene omfatter fortrinnsvis et buffermiddel for å opprettholde pH i oppløsningen innenfor et ønsket område. Foretrukne midler omfatter natriumacetat, natriumfosfat og natriumsitrat. Blandinger av disse buffermid-ler kan også anvendes. Mengden av buffermiddel som kan anvendes i preparatet, avhenger i stor grad av den bestemte buffer som anvendes, og pH i oppløsningen. For eksempel er acetat en mer virkningsfull buffer ved pH 5 enn ved pH 6 slik at mindre acetat kan anvendes i en oppløsning ved pH 5 enn ved pH 6. Det foretrukne pH-område for preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er pH 3,0-7,5.
Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte et isotonisitetsregulerende middel for å gjøre oppløsningen isoton og mer forenlig for injeksjon. Det mest foretrukne middel er natriumklorid i et konsentrasjonsområde på 0-150 mM.
Også omfattet av oppfinnelsen er farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av polypeptidprodukter ifølge oppfinnelsen sammen med farma-søytisk akseptable fortynningsmidler, preserveringsmidler, oppløseliggjøringsmidler, emulgeringsmidler, adjuvanser og/eller bærere. Slike preparater vil påvirke proteinets fysiske tilstand, stabilitet og biologiske tilgjengelighet. Se f.eks. Remington's Pharma-ceutical Sciences, 18. utgave, 1435-1712 (Mack Publishing Co., Easton, PA., 1990). Det som utgjør en effektiv mengde av proteinet i et bestemt tilfelle, vil avhenge av mange forskjellige faktorer som vil bli tatt i betraktning av en velinformert utøver, inkludert det ønskede terapeutiske resultat, alvorligheten av tilstanden eller sykdommen som behandles, individets fysiske tilstand, osv.
Ved en foretrukket utførelsesform som omfatter E. co/z-avledet rhG-CSF, er en anvendt liposomvesikkel DOPG, med et forhold på 50:1 mellom DOPG og G-CSF, ved pH 4,5, inneholdende 10 mM natriumacetat.
Ved en foretrukket utførelsesform som omfatter E. cø/(-avledet rhGM-CSF, er den anvendte liposomvesikkel DMPG, med et forhold på 17:1 mellom DMPG og GM-CSF, ved pH 7,0, i fosfatbufret saltoppløsning (PBS).
Ved en foretrukket utførelsesform som omfatter E. co/i-avledet rhG-CSF som er blitt kjemisk modifisert (pegylert), er rhG-CSF tri-tetra-pegylert, den anvendte liposomvesikkel er DMPG i et forhold på 17:1 mellom DMPG og PEG-G-CSF, ved pH 4,5.
De følgende eksempler vil illustrere nærmere de forskjellige aspekter av foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
Det ble utført innledende forsøk for å undersøke muligheten for å in-korporere rekombinant human-G-CSF (rhG-CSF) i en lipidvesikkel. rhG-CSF ble fremstilt under anvendelse av rekombinant DNA-teknikk hvor E. coli- céller ble transfektert med en DNA-sekvens som koder for human-G-CSF som beskrevet i US patentskrift nr. 4 810 643. rhG-CSF ble fremstilt som en 4 mg/ml oppløsning i fortynnet HC1, pH 4,0. Alle lipider ble erholdt fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, Ala) og ble lagret ved -20°C under nitrogen ved en sluttkonsentrasjon på 100 mg/ml i kloroform.
Fremstilling av G- CSF:fosfolipid- koinplekser
For å fremstille lipidvesikler for kombinasjon med G-CSF ble 30 junol av det aktuelle lipid fylt i et glassrør og tørket til en tynn film under anvendelse av en nitrogengass-strøm. Lipidfilmene ble uttørket i minst to timer under vakuum for å fjerne eventuelle spor av kloroform. Lipidfilmene ble hydratisert i 1 ml av enten destillert, avionisert vann (ddH20), fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,2 (Gibco/BRL "D-PBS") eller 150 mM NaCl. Prøvene ble så sonikert i en sonikator av badtype (Laboratory Supplies, Hicksville, N.Y.). Sonikering ble fortsatt inntil prøvene var optisk klare (vanligvis mellom 10 og 15 minutter). Prøvene ble lagret ved 4°C under nitrogen inntil bruk. Den endelige lipidkonsentrasjon var 30 mM. Alternativt kunne lipidvesiklene fremstilles ved å ta 300 /imol lipid og tørke under nitrogen og uttørke som beskrevet ovenfor. De tørre lipidfilmene ble hydratisert i 10 ml passende, vandig oppløsning som beskrevet ovenfor. Prøvene ble så mikrofluidisert i et emulgerings-apparat i bordskala ("Microfluidics" modell 110S, Microfluidics, Inc., Cambridge, MA) som virket ved 703 kg/cm<2>. Prøvene ble resirkulert gjennom instrumentet i 10 omganger. De mikrofluidiserte prøver ble så lagret ved 4°C som beskrevet ovenfor.
G-CSF:fosfolipid-kompleksene ble fremstilt ved å blande G-CSF (som beskrevet ovenfor) med et bestemt lipid (som beskrevet ovenfor). Blanding ble utført ved vorteksbehandling, omrøring eller forsiktig risting. Forskjellige molforhold mellom lipid og G-CSF ble fremstilt for å evaluere membraninnføyelse og stabilisering av protein. For å fremstille en 3 ml prøve (i vann) som er 0,2 mg/ml G-CSF ved et molforhold på 40:1 mellom lipid og G-CSF, ble f.eks. 150 fil G-CSF-lageroppløsning blandet med 44 pil lipid (30 mM lageroppløsning, fremstilt i vann ved sonikering), og vann tilsettes for å oppnå et endelig prøvevolum på 3 ml. En fem minutters inkubasjon anbefales (men er ikke nødvendig) og ble anbefalt her før prøven ble anvendt eller analysert.
G-CSF kan også kombineres med det hydratiserte lipid før mikrofluidisering. Påfølgende mikrofluidisering av blandingene som beskrevet ovenfor, fører til inkorporering av G-CSF i lipidmembranen.
Analyse av G- CSF:fosfolipidkompleksene
1. Tryptofanemisjonsspektra.
Det er to tryptofanrester i rhG-CSF som er ganske følsomme overfor lokale miljøbetingelser. Analyse ble derfor utført for å bestemme rhG-CSF-tryptofanfluorescensen når rhG-CSF bringes i kontakt med et liposom. Et blått skifte i fluorescensemisjonsmaksimum ville tyde på at tryptofanene er i et mer hydrofobt miljø, og rhG-CSF ble derfor innelukket i lipidmembranene. En utmerket oversikt over tryptofanfluorescensanalyse er Principles of Fluorescence Microscopy, av J. Lakowicz, kapittel 11 (Plenum Press, New York, 1983).
Tryptofanfluorescens for G-CSF:lipidkompleksene (som beskrevet ovenfor) ble analysert ved å eksitere prøvene ved 280 nm og under scanning av emisjonen fra 285 nm til 420 nm i trinn på 1 nm ved en hastighet på 1 nm/sek. Prøvevolumet var 3 ml, og sluttkonsentrasjonen av G-CSF var 0,2 mg/ml for alle prøver. Forholdene mellom lipid og G-CSF varierte. Alle fluorescensmålinger ble utført under anvendelse av et "PTI Alpha-scan" fluorometer (South Brunswick, NJ). Alle målinger ble utført ved 25°C, og denne temperaturen ble opprettholdt gjennom bruken av en kyvetteholder med vannkappe forbundet til et vannbad i omløp. Emisjonsspektra ble tatt opp og analysert under anvendelse av dataprogrammet tilveiebrakt av PTI.
Fluorescensspektrene for rhG-CSF i nærvær og fravær av små, enlamell-ære vesikler sammensatt av DOPG, er vist i figur 1. rhG-CSF har et emisjonsmaksimum på 334 nm i fravær av DOPG-vesikler. I nærvær av DOPG ved et forhold mellom lipid og protein på 100:1 oppviser rhG-CSF-tryptofanfluorescens en blå-endring i fluorescensemisjonsmaksimum til 327 nm og en dramatisk økning i fluorescensstyrke. Den korte bølgelengde til fluorescensemisjonen i nærvær av DOPG tyder på at tryptofanene er i et miljø som er mer hydrofobt enn det naturlig forekommende protein. Som vist i figur 2, avhenger fluorescensskiftingene av molforholdet mellom DOPG og G-CSF, og membraninnføyelsen er påvisbar så snart et forhold på 10:1 mellom DOPG og G-CSF er nådd.
2. Forsøk med jodidslukking.
Jodid er et effektivt støtslukkingsmiddel for tryptofanfluorescens, men kan ikke trenge gjennom lipidmembraner. Effektiv slukking av tryptofanlfuorescens ved hjelp av jodid indikerer derfor eksponering av restene mot hovedmengden av vandig oppløsningsmiddel, mens beskyttelse mot jodidslukking inntrer nårprotein-tryptofaner sekvestreres bort fra den vandige oppløsning. I disse forsøkene ble det brukt G-CSF og et DOPG:G-CSF-preparat (100:1 lipid:proteinforhold). Etter at det var tatt og registrert innledende avlesninger (F0) på prøvene, ble fluorescensstyrke målt etter tilsetning av økende mengder kaliumjodid (Kl) (5 M standardoppløsning). Både prøve- og KI-oppløsningene ble fremstilt slik at de inneholdt 1 mM Na2S03(sluttkonsentrasjon) som beskrevet av Lee et al., Biochem. Biophys. Acta, 954:174-182 (1989) og Le Doan et al., Biochem. Biophys. Acta, 555:1-5 (1986). Tilsetningen av Na2S03forhindrer dannelsen av I2som kan fordele seg i ikke-polare områder av proteiner og membraner. Dataene ble analysert ved hjelp av Stern-Volmer-ligningen
(Fq/F = 1 + KKi[KI]), hvor FQ og F er fluorescensstyrkene til prøver i henholdsvis fravær og nærvær av Kl ved konsentrasjon [Kl]. KKJ er Stern-Volmer-sluk-kingskonstanten for KI-slukking av G-CSF-tryptofanrester; Lehrer, S., Biochemistry 70:3254-3263 (1979).
Stern-Volmer-plottingene av dataene er vist i figur 3.1 fravær av DOPG-vesikler slukkes rhG-CSF-fluorescens effektivt ved hjelp av KJ. I nærvær av DOPG er Stern-Volmer-plottingen av dataene lineær, noe som indikerer at jodid har dårlig til-gang til begge tryptofaner. Dataene viser at tryptofanresten som er jodidtilgjengelig i fravær av DOPG, blir jodidutilgjengelig i nærvær av DOPG. Den delen av rhG-CSF som inneholder dette tryptofanet, må derfor bli innelukket i DOPG-dobbeltlaget.
3. Energioverføringsmålinger.
Som tidligere vist, kan energioverføring inntre mellom tryptofandonorer og lipidoppløselige, fluorescerende akseptorer, slik som pyrendekansyre, ettersom eksitasjonsspektrumet til denne proben signifikant overlapper emisjonsspektrene til tryptofan. Friere et al., Biochemistry 22:1675-1680 (1983). Dersom proteinet innføyes i lipidmembraner, vil energioverføring fra tryptofan til pyren føre til slukking av tryptofanfluorescensen. I dette forsøket ble tryptofanemisjonsstyrken til forskjellige G-CSF:lipid-komplekser målt før (F0) og etter (F) tilsetning av forskjellige mengder pyrendekansyre (30 pig/ml standardoppløsning i tetrahydrofuran). Prøvene ble omrørt kontinuerlig under pyrendekansyretilsetning for å fremme blanding mellom pyrendekansyre og prøven. F/F0-forholdet er proporsjonalt med den energioverførings-mengde som inntrer mellom G-CSF-tryptofaner og den hydrofobe energiakseptor pyrendekansyre.
Figur 4 viser slukkingsprofilen for rhG-CSF i nærvær av DOPG (lipid:protein-forhold 100:1) som en funksjon av tilsatt pyrendekansyre. Slukkingen inntrer ved svært lave pyrendekansyrekonsentrasjoner (<1 moI%) slik at effekten av den fluorescerende probe på membranstrukturen og på oppførselen er minimal. Ettersom pyrendekansyre kan forventes å fordeles hurtig i lipiddobbeltlag, indikerer de foreliggende data at rhG-CSF innelukkes i DOPG-membraner tilstrekkelig dypt til å muliggjøre virkningsfull energioverføring fra tryptofan til pyrenakseptoren. Energi-overføring ble bekreftet ved å undersøke eksitasjonsspektrene til pyrendekansyre-merkede DOPG-vesikler i nærvær og fravær av rhG-CSF.
Analysen ovenfor viser at rhG-CSF kan reagere intimt med et umettet fosfolipid som DOPG. I nærvær av DOPG-vesikler beskyttes et rhG-CSF-tryptofan mot en vannoppløselig fluorescensslukker, men er mottakelig for slukking via energioverføring til en hydrofob, fluorescerende probe. Til sammen viser dataene at rhG-CSF kan innføyes i membraner sammensatt av DOPG. Membraninnføyelse er påvisbar så snart et forhold på 10:1 (lipid:G-CSF) er nådd, og dette tallet kan utgjøre antallet lipider som omgir den innføyde del av proteinet.
Eksempel 2
I dette eksemplet ble evnen til rhG-CSF når det gjelder å reagere med andre fosfolipider, bestemt ved å bruke sammenligninger mellom F/F0-styrke og emisjonsmaksima som beskrevet ovenfor. I hvert tilfelle var molforholdet mellom lipid og rhG-CSF 100:1.
Figur 5 viser F/F0-dataene for rhG-CSF i fravær og nærvær av forskjellige lipider. Figur 6 viser emisjonsmaksimumsdataene for de samme preparatene. Dataene i figur 5 og figur 6 viser at, i tillegg til DOPG, kan rhG-CSF innføyes i DMPG, DPPG og, mindre effektivt, i fosfatidyletanolaminene (PE-ene) og fosfat-idylserinene (PS-ene). I tillegg ble NG-DOPE (DOPE-prøve hvor PE-hodegruppen var gjort mer negativ) funnet å sørge for forbedret innføyelse av rhG-CSF enn DOPE.
DOPC, DMPC og DPPC er nøytrale lipider, og disse vesiklene hadde liten, om noen, effekt på både emisjonsmaksimumet og fluorescensstyrken til rhG-CSF, noe som indikerer at det ikke fant sted noen interaksjon med disse fosfolipidene (se figur 5 og 6, og figur 7, kurve 2).
Dataene ovenfor viser at et protein som er i stand til å gå over til den smeltede, globulære tilstand, kan innføyes i forskjellige lipidvesikler. Denne rhG-CSF:lipidinteraksjon inntrer imidlertid bare når det anvendes en negative ladet lipidvesikkel. Blant de negativt ladede lipidvesikler synes vesiklene med den største negative ladning å gi sterkere rhG-CSF:lipid-interaksjoner.
Eksempel 3
I dette eksemplet ble effekten av rhG-CSF:DOPG-interaksjonen bestemt med hensyn til proteinstabilitet. Sirkulærdikroismemålinger ble gjort på et "Jasco J-720"-instrument utstyrt med en termostatregulert celleholder av Peltier-type og en magnetrører. Sirkulærdikroisme ved 222 nm ble målt under anvendelse av en slutt-rhG-CSF-konsentrasjon på 80/xg/ml, pH 6,0. Differensialscanningskalorimetri-målinger ble gjort under anvendelse av et "Microcal MC-2"-kalorimeter. Prøver av rhG-CSF (1 mg/ml, i vann) eller DOPG:rhG-CSF (45:1 mol/mol, i vann) ble scannet ved en hastighet på 90°C/time. Data ble lagret og analysert under anvendelse av "Microcal"-datamaskinprogrammet.
Temperaturinduserte endringer i alfa-heliskheten til G-CSF kan følges ved å måle sirkulærdikroisme (222 nm) som en funksjon av økende temperaturer. Den varmeinduserte utfolding av rhG-CSF ved pH 6,0 er vist i figur 8. Kurven indikerer at det inntrer en ganske skarp overgang ved ca. 60-70°C, noe som fører til tap av alfa-heliskhet. Etter denne overgangen utfelles rhG-CSF irreversibelt fra oppløsning. Temperaturområdet for utfoldingen er lik smeltetemperaturen til rhG-CSF ved pH 7,0 slik den ble bestemt ved hjelp av differensialscanningskalorimetri som vist i figur 9.
I motsetning til dette oppviser DOPG:rhG-CSF-prøver et gradvis tap av alfa-heliskhet med økende temperatur, og, i motsetning til rhG-CSF alene, synes den temperaturinduserte utfolding av DOPG:rhG-CSF ikke å være kooperativ (se figur 8). Denne konklusjon demonstreres også av mangelen på en smelteovergang som vist ved differensialscanningskalorimetri (figur 9). Bemerkelsesverdig nok kan DOPG:rhG-CSF-prøver gjenvinne alfa-heliskhet etter oppvarming til 95°C og kan sirkuleres gjentatte ganger mellom 95°C og 10°C med full gjenvinning av heliskhet etter avkjøl-ing (se figur 10). rhG-CSF alene utfoldes under disse betingelsene irreversibelt og utfelles fra oppløsning.
Effektene av DMPG og DPPG på G-CSF-sirkulærdikroisme ble også undersøkt. Et forhold mellom lipid og rhG-CSF på 150:1 ble brukt og, slik tilfellet var med DOPG, DMPG og DPPG, stabiliserer også sekundærstrukturen til rhG-CSF (figurene 11-13).
Disse dataene viser at interaksjonen mellom rhG-CSF med DOPG, DMPG og DPPG øker stabiliteten til proteinet under betingelser hvor rhG-CSF alene er ustabil. Interaksjonen sta-biliserer direkte sekundær- og tertiærstrukturen til rhG-CSF.
Eksempel 4
I dette eksemplet ble effekten av rhG-CSF:DOPG-interaksjonen bestemt når det gjelder den biologiske aktivitet av rhG-CSF. Aktiviteten in vitro av rhG-CSF ble analysert under benyttelse av G-CSF-avhengige opptak av [<3>H]-tymidin ved hjelp av murine benmargsceller, som beskrevet i Zsebo et al., Immunobiology 772:175-184
(1986). Alle aktivitetsanalyser ble utført in triplo. Aktivitet in vivo ble bestemt ved hjelp av subkutan injeksjon av hamstere (rhG-CSF-dose på 100 /ig/kg) og målinger av antall hvite blodlegemer (WBC).
1. Aktivitet in vitro
A. Den spesifikke aktivitet av rhG-CSF i fravær og nærvær av DOPG ble bestemt. Varmebehandlede rhG-CSF- og DOPG:rhG-CSF-prøver ble også testet. Resultatene er oppsummert i tabell 1.
Som vist i tabell 1, påvirker ikke innføyelse i DOPG-dobbeltlag den biologiske aktivitet av rhG-CSF på ugunstig måte. Etter oppvarming til 85°C i 10 minutter har rhG-CSF upåvisbar aktivitet, og proteinet utfelles. Etter lignende be-handling bibeholder DOPG:rhG-CSF ca. 85% av aktiviteten til uoppvarmet rhG-CSF og gjenvinner fullstendig sekundærstruktur etter avkjøling.
B. Evnen til forskjellige lipider når det gjelder å stabilisere rhG-CSF under frysetørking, ble også undersøkt. Prøver av rhG-CSF i kombinasjon med forskjellige lipider ble frysetørket og analysert (som beskrevet ovenfor) med hensyn på aktivitet. DOPG, DMPG og DPPG muliggjør, når de blandes med rhG-CSF, ca. 100% bibeholdelse av rhG-CSF-biologisk aktivitet etter frysetørking (figur 14). rhG-CSF alene overlevde ikke frysetørkingsprosessen.
2. Aktivitet in vivo
Aktiviteten (WBC-telling) av rhG-CSF i fravær og nærvær av lipid ble bestemt. Aktivitet ble målt etter subkutan injeksjon (rhG-CSF-dose på 100 jig/kg) på dag 0. Fem forskjellige lipid:rhG-CSF-komplekser ble analysert, og i hvert tilfelle bibeholdt lipid:rhG-CSF-komplekset aktivitet in vivo (figurene 15 og 16).
Undersøkelsene ovenfor viser at innføyelse i negativt ladede lipiddobbeltlag ikke påvirker den biologiske aktivitet av rhG-CSF på ugunstig måte. I tillegg synes det som om lipidets beskyttende effekt beskytter rhG-CSF under fryse-tørkingsprosessen.
Eksempel 5
I dette eksemplet ble kjemisk modifisert G-CSF (pegylert G-CSF (PEG-G-CSF)) og G-CSF erholdt som et produkt av eukaryot vertscelleekspresjon (CHO-G-
CSF), testet med hensyn på deres evne til å reagere med negativt ladede lipidvesikler. For CHO-G-CSF ble bestemmelsene gjort under anvendelse av sammenligninger mellom F/F0-styrke og emisjonsmaksima (som beskrevet i eksempel 1 ovenfor). I hvert tilfelle var molforholdet mellom lipid og protein 100:1. For PEG-G-CSF var bestemmelsen basert på sirkulær dikroismeanalyse.
Den anvendte CHO-G-CSF ble fremstilt under anvendelse av rekombinant DNA-teknikk hvor ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler) ble transfektert med en DNA-sekvens som koder for human-G-CSF som beskrevet i US patentskrift nr. 4 810 643. CHO-G-CSF ble fremstilt som en 0,6 mg/ml oppløsning i PBS, pH 7,0. CHO-G-CSF ble påvist å reagere med DOPG på en lignende måte som rhG-CSF, idet hver prøve oppviste forøkt fluorescensstyrke i nærvær av DOPG, samt en blåskifting i emisjonsmaksimum i nærvær av DOPG (figurene 17 og 18). DOPG-interaksjonen skyldes derfor ikke noen særegenhet i den rekombinante form av
G-CSF.
Den PEG-G-CSF som ble anvendt i disse forsøkene, var tritetrapegylert, E. cø/i-avledet G-CSF (under anvendelse av PEG 6000). Det ble fremstilt DMPG:PEG-G-CSF (17:1 mol/mol) prøver under anvendelse av fremgangsmåter beskrevet ovenfor. DMPG:PEG-G-CSF-prøvene ble funnet å gjenvinne sekundærstruktur fullstendig etter oppvarming (figur 19). Til tross for tilstedeværelsen av PEG-molekylene var det derivatiserte protein i stand til å reagere med lipidet på samme måte som det naturlig forekommende protein.
Dataene ovenfor viser at de stabiliserende effekter forbundet med G-CSF-interaksjon med en negativt ladet lipidvesikkel, ikke er unike bare for rhG-CSF erholdt som et produkt av prokaryot vertscelleekspresjon. Et kjemisk modifisert protein som er i stand til å gå over til MGS og som ble brakt i kontakt med en liposom-vesikkel, her PEG-G-CSF:DMPG, utviste også stabiliserende effekter.
Eksempel 6
I dette eksemplet ble effektene av DMPG og DPPG på GM-CSF undersøkt. GM-CSF var rekombinant human-GM-CSF som beskrevet i US patentskrift nr. 5 047 504, og var fremstilt som en 1 mg/ml oppløsning i fosfatbufret salt-oppløsning (PBS), pH 7,0. Et lipid:GM-CSF-forhold på 17:1 ble brukt, og varmestabilitet ble målt under anvendelse av sirkulærdikroismeanalyse som beskrevet ovenfor. DMPG og DPPG kan føre til bedre varmestabilitet for GM-CSF, dvs. gjenvinning av sekundærstruktur etter oppvarming (figurene 20a og 20b).
Disse dataene gir et annet eksempel på et cytokin som er i stand til å gå over til den smeltede, globulære tilstand, og som reagerer med en negativt ladet lipidvesikkel slik at det fås bedre varmestabilitet for cytokinet.
Claims (42)
1. Preparat,
karakterisert vedat det omfatter et cytokin blandet med en fordannet intakt fosfolipidliposomvesikkel, hvor liposomvesikkelen er sammensatt av negativt ladede fosfolipider, hvor preparatet har minst et forhold på 25:1 (mol:mol) mellom liposom og cytokin, slik at det dannes et liposom-cytokin-kompleks, hvor bare en del av cytokinet er innføyd i lipiddelen av liposomvesikkelen, hvor liposom-cytokin-komplekset er direkte stabilisert mot utfolding av sekundærstrukturen til cytokinet, og hvor preparatet har forbedret lagringstid.
2. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat preparatet har en pH-verdi på 3,0-7,5.
3. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat liposomvesikkelen er valgt fra gruppen bestående av dioleoylfosfatidylglyserol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG), eggfosfatidylglyserol, dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), eggfosfatidyletanolamin, dioleylfosfatidinsyre (DOPA), dimyristoylfosfatidinsyre (DMPA), dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA), dioleylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), eggfosfatidylserin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidyletanolamin og lysofosfatidylserin.
4. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat cytokinet er en hematopoesefaktor.
5. Preparat ifølge krav 4,
karakterisert vedat hematopoesefaktoren er valgt fra gruppen bestående av G-CSF, GM-CSF og MGDF.
6. Preparat ifølge krav 5,
karakterisert vedat hematopoesefaktoren er G-CSF.
7. Preparat ifølge krav 6,
karakterisert vedat G-CSF er en naturlig human G-CSF eller er erholdt som et produkt av prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon.
8. Preparat ifølge krav 6,
karakterisert vedat G-CSF er kjemisk modifisert G-CSF.
9. Preparat ifølge krav 8,
karakterisert vedat den kjemisk modifiserte G-CSF er pegylert G-CSF.
10. Preparat ifølge krav 5,
karakterisert vedat hematopoesefaktoren er MGDF.
11. Preparat ifølge krav 10,
karakterisert vedat MGDF er et naturlig human MGDF eller er erholdt som et produkt av prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon.
12. Preparat ifølge krav 11,
karakterisert vedat MGDF har en aminosyresekvens som omfatter aminosyrene 1-163 i figur 29 (SEQ ID Nos: 1 og 2).
13 Preparat ifølge krav 11,
karakterisert vedat MGDF har en aminosyresekvens som omfatter aminosyrene 1-332 i figur 29 (SEQ ID Nos: 1 og 2).
14. Preparat ifølge krav 10,
karakterisert vedat MGDF er kjemisk modifisert MGDF.
15. Preparat ifølge krav 14,
karakterisert vedat den kjemisk modifiserte MGDF er pegylert MGDF (PEG-MGDF).
16. Preparat ifølge krav 15,
karakterisert vedat PEG-MGDF er pegylert med polyetylenglykol.
17. Preparat ifølge krav 16,
karakterisert vedat PEG-MGDF er monopegylert MGDF (mPEG-MGDF).
18. Preparat ifølge krav 17,
karakterisert vedat PEG-gruppen er bundet til N-enden derav.
19. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat preparatet inneholder en farmasøytisk akseptabel bærer.
20. Preparat krav 1,
karakterisert vedat proteinet er E. coli- av\ edet rhG-CSF, hvor liposomvesikkelen er DOPG, og hvor preparatet har et forhold på 50:1 mellom DOPG og rhG-CSF, har en pH-verdi på 4,5 og inneholder 10 mM natriumacetat.
21. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat proteinet er Æ.cø/i-avledet MGDF som omfatter aminosyrene 1-163 i figur 29 (SEQ ID Nos: 1 og 2), hvor liposomvesikkelen er DMPG, og hvor preparatet har et forhold på 100:1 mellom DMPG og MGDF, har en pH-verdi på 5,0 og innholder 10 mM natriumacetet, 5 % sorbitol.
22. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat proteinet er monopegylert E.coli-avledet MGDF (mPEG-MGDF), hvor liposomvesikkelen er DMPG og hvor preparatet har et forhold på 100:1 mellom DMPG og mPEG-MGDF, har en en pH-verdi på 5,0 og inneholder 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
23. Preparat ifølge krav 1,
karakterisert vedat proteinet er CHO-avledet MGDF som omfatter aminosyrene 1-332 i figur 29 (SEQ ID NOS: 1 og 2), hvor liposomvesikkelen er DMPG, og hvor preparatet har et forhold på 100:1 mellom DMPG og MGDF, har en pH-verdi på 5,0 og inneholder 10 mM natriumacetat, 5 % sorbitol.
24. Fremgangsmåte for fremstilling av et liposom-cytokin-preparat,karakterisert vedat et cytokin blandes med en fordannet intakt fosfolipid-liposom-vesikkel, hvor liposomvesikkelen er negativt ladet, hvor preparatet har minst et forhold på 25:1 (mol:mol) mellom lipsom og cytokin, hvor bare en del av cytokinet er innføyd i lipiddelen av liposomvesikkelen, hvor liposom-cytokin-komplekset er direkte stabilisert mot utfolding av sekundærstrukturen til cytokinet, hvor preparatet har forbedret lagringstid, og liposom-cytokin-preparatet erholdes.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,
karakterisert vedat preparatet har en pH-verdi på 3,0-7,5.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 24,
karakterisert vedat liposomvesikkelen er fremtilt fra et lipid valgt fra gruppen bestående av dioleylfosfatidylglyserol (DOPG), dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG), dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG), eggfosfatidylglyserol, dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE), eggfosfatidyletanolamin, dioleoylfosfatidsyre (DOPA), dimyristoylfosfatidsyre (DMPA), dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), eggfosfatidylserin, lysofosfatidylglyserol, lysofosfatidyletanolamin og lysofosfatidylserin.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 24,
karakterisert vedat cytokinet er en hematopoesefaktor.
28. Fremgangsmåte ifølge krav 27,
karakterisert vedat hematopoesefaktoren er valg fra gruppen bestående av G-CSF, GM-CSF og MGDF.
29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,
karakterisert vedat hematopoesefaktoren er G-CSF.
30. Fremgangsmåte ifølge krav 29,
karakterisert vedat G-CSF er naturlig human GSF eller er erholdt som et produkt av prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon.
31. Fremgangsmåte ifølge krav 29,
karakterisert vedat G-CSF er kjemisk modifisert G-CSF.
32. Fremgangsmåte ifølge krav 31,
karakterisert vedat den kjemisk modifiserte G-CSF er pegylert G-CSF.
33. Fremgangsmåte ifølge krav 28,
karakterisert vedat hematopoesefaktoren er MGDF.
34. Fremgangsmåte ifølge krav 33,
karakterisert vedat MGDF er naturlig human MGDF, eller er erholdt som et produkt av prokaryot eller eukaryot vertscelleekspresjon.
35. Fremgangsmåte ifølge krav 34,
karakterisert vedat MGDF har en aminosyresekvens som omfatter aminosyrene 1-163 i figur 29 ( SEQ ID Nos: 1 og 2).
36. Fremgangsmåte ifølge krav 34,
karakterisert vedat MGDF har en aminosyresekvens som omfatter aminosyrene 1-332 i figur 29 (SEQ ID Nos: 1 og 2).
3 7. Fremgangsmåte i føl ge krav 3 5,
karakterisert vedat MGDF er kjemisk modifisert MGDF.
38. Fremgangsmåte ifølge krav 37,
karakterisert vedat den kjemisk modifiserte MGDF er pegylert MGDF (PEG-MGDF).
39. Fremgangsmåte ifølge krav 38,
karakterisert vedat PEG-MGDF er pegylert med et polyetylenglykol.
40. Fremgangsmåte ifølge krav 39,
karakterisert vedat PEG-MGDF er monopegylert MGDF (mPEG-MGDF).
41. Fremgangsmåte ifølge krav 40,
karakterisert vedat PEG-gruppen er bundet til N-enden derav.
42. Fremgangsmåte ifølge krav 24,
karakterisert vedat preparatet inneholder en farmasøytisk akseptabel bærer.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13241393A | 1993-10-06 | 1993-10-06 | |
| PCT/US1994/011081 WO1995009611A2 (en) | 1993-10-06 | 1994-09-29 | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO952210D0 NO952210D0 (no) | 1995-06-02 |
| NO952210L NO952210L (no) | 1995-08-04 |
| NO314064B1 true NO314064B1 (no) | 2003-01-27 |
Family
ID=22453938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19952210A NO314064B1 (no) | 1993-10-06 | 1995-06-02 | Stabile liposom-cytokin-preparater og fremgangsmåte for fremstilling derav |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0671905B1 (no) |
| JP (1) | JP2852127B2 (no) |
| KR (1) | KR100372006B1 (no) |
| CN (1) | CN1206982C (no) |
| AT (1) | ATE222752T1 (no) |
| AU (1) | AU683698B2 (no) |
| CA (1) | CA2150939C (no) |
| CZ (1) | CZ290029B6 (no) |
| DE (1) | DE69431236T2 (no) |
| DK (1) | DK0671905T3 (no) |
| ES (1) | ES2184768T3 (no) |
| FI (1) | FI116271B (no) |
| HK (1) | HK1010341A1 (no) |
| HU (1) | HUT72326A (no) |
| IL (1) | IL111170A (no) |
| NO (1) | NO314064B1 (no) |
| NZ (1) | NZ274705A (no) |
| PT (1) | PT671905E (no) |
| RU (1) | RU2119791C1 (no) |
| WO (1) | WO1995009611A2 (no) |
| ZA (1) | ZA947782B (no) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874075A (en) * | 1993-10-06 | 1999-02-23 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
| US7863238B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-01-04 | Saint Louis University | Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids |
| US7972593B2 (en) | 2004-06-10 | 2011-07-05 | Saint Louis University | Delivery of therapeutic agents to the bone |
| JP2006248978A (ja) * | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Mebiopharm Co Ltd | 新規なリポソーム製剤 |
| RU2555357C2 (ru) | 2008-04-08 | 2015-07-10 | Мерк Патент Гмбх | Композиции, содержащие циклические пептиды, и способы их применения |
| CN104507953B (zh) * | 2012-05-31 | 2018-05-18 | 新加坡科技研究局 | 通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法 |
| JP6139781B2 (ja) * | 2014-04-04 | 2017-05-31 | 国立大学法人大阪大学 | リゾリン脂質受容体を活性化する物質を含有する薬剤送達促進剤 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4208527A1 (de) * | 1992-03-17 | 1993-09-23 | Max Planck Gesellschaft | Liposomen mit negativer ueberschussladung |
| JPH06247842A (ja) * | 1993-02-23 | 1994-09-06 | Green Cross Corp:The | リポソーム組成物の製造方法 |
-
1994
- 1994-09-29 AU AU79239/94A patent/AU683698B2/en not_active Ceased
- 1994-09-29 EP EP94929959A patent/EP0671905B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 PT PT94929959T patent/PT671905E/pt unknown
- 1994-09-29 ES ES94929959T patent/ES2184768T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 CZ CZ19951438A patent/CZ290029B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 CN CNB941911012A patent/CN1206982C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 RU RU95117866A patent/RU2119791C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 KR KR1019950702281A patent/KR100372006B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 CA CA002150939A patent/CA2150939C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 JP JP7510908A patent/JP2852127B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 DK DK94929959T patent/DK0671905T3/da active
- 1994-09-29 DE DE69431236T patent/DE69431236T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 HU HU9502053A patent/HUT72326A/hu unknown
- 1994-09-29 AT AT94929959T patent/ATE222752T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 NZ NZ274705A patent/NZ274705A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 WO PCT/US1994/011081 patent/WO1995009611A2/en active IP Right Grant
- 1994-10-04 IL IL11117094A patent/IL111170A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-10-05 ZA ZA947782A patent/ZA947782B/xx unknown
-
1995
- 1995-06-02 NO NO19952210A patent/NO314064B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-06-05 FI FI952738A patent/FI116271B/fi active IP Right Grant
-
1998
- 1998-10-17 HK HK98111293A patent/HK1010341A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5874075A (en) | Stable protein: phospholipid compositions and methods | |
| JP4777873B2 (ja) | 親油性薬物送達ビヒクルおよびこれらの使用方法 | |
| JP2010248255A6 (ja) | 親油性薬物送達ビヒクルおよびその使用方法 | |
| JP2010248255A (ja) | 親油性薬物送達ビヒクルおよびその使用方法 | |
| NO314064B1 (no) | Stabile liposom-cytokin-preparater og fremgangsmåte for fremstilling derav | |
| AU688678C (en) | Stable protein:phospholipid compositions and methods | |
| MXPA97007137A (en) | Stable protein compositions: fosfolipidos ymeto |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |