CN1182373A - 用于超声对比增强的含磷脂的稳定气乳剂 - Google Patents

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Abstract

一种包括用气体或气体混合物渗透过的干燥、空心、粒状及近似微球形材料的形成气乳剂组合物,它在水成液中溶解时形成包含许多其四周被至少第一及第二表面活性剂层所包围着的气泡的一种气乳剂,其中第一表面活性剂基本上是由一种至少有一个包含至少10碳原子酰基链的磷脂或磷脂混合物所组成,和构成至少约5%(重)的总表面活性剂,而其中第二表面活性剂可以是或可以不是磷脂,而且是比第一表面活性剂更易水溶的表面活性剂;包括制备这种微气泡的器具;以及使用这种微泡作为对比剂的方法。

Description

用于超声对比增强的含磷脂的稳定气乳剂
发明背景
发明领域
本发明涉及用于超声对比增强及其它场合、稳定及寿命长的气乳剂的一种制备方法，以及这样制备的气乳剂组合物。
技术背景
超声技术提供了一种重要而更为经济的、用于离子化辐射成象的替代方法。现可使用的许多传统成象技术有如磁共振成像(MRI)、计算机化X射线断层术(CT)、及正电子放射X射线断层术(PET)等，但这些方法每种都使用了极为昂贵的设备。此外，CT及PET还利用了离子化辐射技术。超声成象技术与这些方法不同，是相对较廉的。而且超声成象技术也不使用离子化辐射。
超声成像可用于组织密度和组成有差异的场合，它们通过这些组织对声波起反射作用。在组织密度或密实性有明显变异之处，诸如在组织界面处，图像尤为清晰。在密实组织、骨架系统，及各种器官及/或肿瘤之间的界面处，应用超声技术易于成象。
因此，在许多成象技术应用中未用对比增强剂也能较好地进行超声成象；但是，对于另外一些应用场合，诸如观察血流，人们一直努力地在研制这种能够增强对比的试剂。在灌注法成象领域中，对这种对比剂应用得特别多。这种超声对比剂能够改善心脏肌肉、肾脏、肝脏及其它组织的血流成象。从而有利于对相关成象组织进行研究、诊断、手术及治疗。血池对比剂也可以根据血容量进行成象(如肿瘤及灼伤组织)，并能够仅仅通过增强材料循环的方法帮助观察胎盘及胎儿。
已被提出的超声对比增强剂有各种各样。最成功的试剂一般都是由能够通过静脉注射的小气泡分散体所组成。最典型的是，将气泡注射进入待成象活体的血流中。由气泡在血流中提供一种密度不同而且密实性比周围流体组织及血液高许多的实体目标。结果使这些气泡易于超声成象。对于交叉血管，气泡应当直径低于10μm而被称为微气泡。在液体中微气泡可以用各种方法形成。简单的实例就是剧烈搅拌，或强制气体通过小孔进入液体。在没有另外的成分时，气体会直接与浓缩介质(即裸露气泡)接触。但是，由于被截留气体扩散至周围的液体中，这些气泡有迅速收缩的趋势。此外，已有人指出“裸露”的微气泡会产生诸如补体激活等有害反应。(见，例如，K.A.Shastri et al.(1991)UnderseaBiomed.Res.，18，157)。对有关延长微气泡寿命提高利用率的试验，都集中注意在添加能封闭气泡的稳定剂方面，以阻止气体扩散进入周围液体。
大多数微气泡组合物都达不到那怕是能持续几秒钟的对比增强作用，更不用说持续几分钟了。这样就大大地限制了它们的实用性。因此有人曾经以各种方法构造过微气泡，以图增加它们的有效对比增强的持续时间。也曾探索过各种各样的方法，如使用在初期构成悬浮液的明胶或清蛋白的微球，并在其固化时截留气体。但是，一般都已证明，包囊气体的固相壳是过于脆弱或易于渗透气体，以致不能使气体在体内达到能够令人满意的保留时间。此外，厚壳(如清蛋白、蔗糖、或其它各种材料)还降低了气泡的可压缩性，从而降低了在它们短存留时间内的回声生成性(echogencity)。在注射时能够释放气体或会沸腾(如Qauy，PCT/US/94/00422)的固体颗粒和乳液细滴，会有使血液被气体或蒸气过饱和的危险。在有少数成核位处，这会导致少量形成栓塞的大气泡，而不是想象的大量小气泡。此外，以这种方式在体内产生的气泡也将会是“裸露”的，因此会产生前述补体激活的问题。
对于应用表面活性剂作为气泡分散的稳定剂，也曾进行过探索。表面活性剂都是那些在极性物与非极性物界面之间易于形成界面层的材料。它们的“表面活性”行为源于有易于与极性物质结合的亲水区域(通常包括常被称为“头”的一端)，和易于与非极性物结合的疏水区域(通常包括常被称为“尾”的另一端)两者的同时存在。一旦界面建立，界面层就具有极性/非极性界面的特征。在有表面活性剂存在时，就可以通过可包含各种各样表面活性剂材料的界面层，使气体与液体分隔开来。
有些含有表面活性剂的对比增强剂的是以另一种方式截留气泡，如以脂质体的水成核心。脂质体属于多多少少像球形的“袋”，由四周被一层或多层同心、封闭的磷脂双分子层所束缚的水成核心组成。磷脂是细胞膜的天然成分，也是众所周知的表面活性剂。在Unger的USP5,334,381中，是通过几种不同的机理产生含气泡的脂质体。Ryan等人的USP 4,900,540也披露了含有气体或气体前体的磷脂脂质体。推测可能是，被截留在脂质体内的气泡缓慢地泄漏出来，从而增加对比剂的效能。可以注意到的是，表面活性剂的这种用途并没涉及在气/液界面处有表面活性剂界面层的存在。反而是，小气泡都被截留于本身被单层或多层脂质体结构所结合的较大量的水成液中。
含表面活性剂的对比剂可以另一种途径利用脂质体。例如，Schneider等人在USP5,380,519及5,271,928中，描述了从冻干脂质体制备微气泡。按照该披露，用冻干脂质体悬浮物产生的干粉制剂在水中再组成的方法，在充水脂质体悬浮液中产生一种气泡的分散体。这样制备的微气泡被描述为一种四周被“相当短暂”的表面活性剂外膜包围。虽然一般都认为，这样短暂的表面活性剂层不会持久，微气泡因此也不会稳定较长的时间，Schneider等人推论认为，是在邻近区域充水脂质体中或来自邻近区域充水脂质体的成层的表面活性剂稳定了以微气泡形式存在于系统中的气体。
易于理解的是，与脂质体相关的对比增强剂要求先形成脂质体，于是就限制了稳定表面活性剂的主成分应是能够生成脂质体的类型。此外，脂质体的制备还涉及极为复杂的和费时的生产过程。
甚至在有稳定化合物或结构存在条件下，由于四周表面活性剂的表面张力作用，被截留在气泡中的气体是处于增压条件下的，如Laplace方程所描述(ΔP＝2γ/r)。由于气体从高压区域(气泡中)运动到低压环境(或处于四周液体未被这种增压气体所饱和，或者成为直径较大、压力较低的气泡)，这种增压更有利于气泡收缩及消失。
Quay在PCT/US92/07250中对此有关问题提出了一种设想。Quay构成气泡所用气体是以气体处于体温(37℃)下与空气相比，其水中溶解度较低、密度较高、在溶液中的气体扩散系数较低为根据而选择的。尽管降低水溶解度及扩散系数能够影响气体离开气泡的速率，但是Quay的气泡仍然还有许多问题。构成非常小的气泡(如直径3.5μm)需要输入的能量高。对于原位使用的场所，还必须提供十分复杂的制备气泡系统，这也是一个缺点。此外，Quay的气体选择判据是不正确的，因为它们没有考虑某些气泡收缩的主要原因，也就是气泡表面张力的影响和表面活性剂及气体渗透的影响，而这些错误均会导致引入某些不适宜的气体和排出某些最佳适用气体的后果。
因此，在组合物技术及这种组合物的制备方法方面有必要提供或应用一种寿命更长、生物可适应及易于制备的对比增强剂，和提供更优质的超声成象对比增强剂。
发明概述
按照本发明，提供了一种气乳剂超声对比增强介质，其内加入有作为气泡稳定剂的表面活性剂混合物。至少一种这样的表面活性剂是疏水磷脂或磷脂混合物。至少提供一种第二表面活性剂，它可以是或也可以不是磷脂或磷脂的混合物，但是要比作为第一表面活性剂的磷脂或磷脂组合物更为亲水。这种磷脂稳定的气乳剂在体内具有更长的使用期。
在本发明的一个实施方案中，气乳剂组合物制备的方法为，首先将亲水单体或聚合物或其组合物、第一及第二表面活性剂、和发泡剂分散在水成液中。第一表面活性剂是磷脂或磷脂的混合物，它具有至少一个包括至少10碳原子的酰基链，及构成至少约5％(重)的总表面活性剂，和第二表面活性剂是比所述第一表面活性剂更易水溶的。
然后对此分散体进行喷雾干燥，汽化发泡剂和造成一种干燥、空心、粒状及近似微球的材料。将此干燥粒状材料暴露于至少第一种气体中，接着将其溶解于一种液体中从而构成一种水成液气乳剂的组合物，由于此组合物包含的气泡四周被第一及第二表面活性剂层所包围，其稳定性与脂质体不相关。
第二表面活性剂可以由于各种各样的材料构成。某些具体实例包括脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物、非离子烷基葡糖苷类及聚山梨酸酯类。制备特别适宜的气乳剂，是在第二表面活性剂中包括一种有一个或多个酰基链磷脂或磷脂混合物的时候，其中各酰基链包含不多于14个碳原子。因此，亲水单体或聚合物或其组合物可以是淀粉。
渗透进入干燥粒状材料的气体或气体的组合物也可以从各种各样的物质中加以选择，包括空气、氮气、二氧化碳或其它通常在血液中存在有的气体，也可以是诸如碳氟化合物等的有机材料。优选地是，所提供气体之一的蒸气压在37度C时要低于760mmHg。特别优选的实施方案用的是经碳氟化合物饱和了的氮气。
本发明还包括几种容纳渗入气体的干燥颗粒气乳剂形成组合物的容器，和用于将含有磷脂的气乳剂组合物引入至目标物或部分身体或体腔中对目标物或身体部分或体腔进行成象和至少对其部分身体进行超声成象的方法。
附图简述
图1为一双室长颈瓶透视图，瓶内装形成微气泡的制剂，上室中有水溶液和下室中有固体及气体配料。
图2为图1长颈瓶的说明，其中的水成液与用于产生微气泡的固体配料混合，以备病人使用。
图3是一逆向双室长颈瓶的透视图，内装微气泡形成制剂，下室中有水成液，而上室中有固体及气体配料。
图4是图3的说明，其中水成液是已与用于产生微气泡的固体配料混合，以备病人使用。
发明详述
这里所指的微气泡，是指气体在水介质中的气泡，直径在0.5～300μm之间，优选为不超过约200、100或50μm。微气泡在气/液界面间可以有或可以没有一层界面层或覆盖层。即使有，覆盖层也是单分子或多分子层厚的。另外，微气泡可以被双分子层(如单层的脂质体的情况)阻隔，也可以被好几层双分子层(多层状的泡囊)阻隔。微气泡可以四周被多种耐久壳状结构所包围，如变性蛋白质。因为乳剂一般定义为由两种或多种互不混溶的液体被表面活性剂界面所稳定的一种分散物，本发明的气体分散体基本上是气乳剂，此乳剂的不连续相是气体，而不是液体。因此，这里所用的术语气乳剂，指的是在水介质中有许多气体微气泡的分散体。
对于血管内的应用，最佳气泡大小受两种受关注的竞争因素所决定。虽然较小的气泡对通过细小血管及毛细血管的循环有效，但是对超声的回声生成性与气泡大小却十分相关。因此在血管超声对比增强方面，适宜的微气泡的直径，优选地是约1-10μm，特别优选的是3-5μm。
本发明提供一种气体分散体或气乳剂，其中气泡在体内具有较长的存留期，适用于作为超声及磁共振成象(MRI)对比增强剂。一般的超声对比增强剂对动脉系统的对比增强能力仅表现在仅约一次通过上或表现在仅约几秒至几分钟的时间内，因此对于跟踪静脉注射的病人它不能持续存活到通过主动脉。相反，按照本发明制备的对比剂，在跟踪静脉注射病人的整个循环系统中可通过多路连续显示出被测定对比增强的活体。气泡存活几分钟是易于显示的。这种延长对比增强的能力在进行超声时有突出的优点。此外，本发明的对比增强剂可构成优质的成象；例如，清楚、生动，而且可以得到血流清晰的心、肝及肾脏图像。因此可以对末梢血管施用量少和无毒的剂量，并可用于增强对全身体的成象。
虽已指出，气泡用作静脉超声对比剂是最有效的超声分散体，但它们主要实际缺点却是所需悬浮通过微血管的小气泡(一般直径低于5微米)寿命极短。这样短的寿命是由于泡内气体增压所致，这是由于表面张力对气泡作用的结果。气泡直径减小时，已升高的内压再增加。内部压力增加，迫使泡内气体溶解，由于气体被迫进入溶液，又致使气泡消失。拉普拉斯(Laplace)方程ΔP＝2γ/r表示了通过气泡周边表面或膜对气泡所施与的压力(此处ΔP指气泡内气体的增压，γ是气泡膜的表面张力，及r是气泡半径)。Laplace压力反比于气泡半径；因此，在气泡收缩时，随着气体扩散出气泡的速率及气泡收缩的速率增加，Laplace压力增如。
在一组实施方案中，本发明考虑的气体分散组合物，其内含有某些性能优于其它表面活性剂及其它含磷脂组合物的磷脂表面活性剂。在一组优选实施方案中，组合物包含两种或多种根据有助于产生大量微气泡的和有助于能使气泡与液体在气/液界面的表面张力减少得最合适而加以选择的表面活性剂。此外，至少一部分微气泡中的气体最好是由水溶解度低的气体构成。现已发现，要改善对气体的截留，采用与水溶解度高的第二表面活性剂结合的磷脂作为稳定表面活性剂的组合物是特别有益的。
气乳剂的稳定性与用作乳化剂的表面活性剂降低表面张力的性质十分相关。磷脂，由于已知其功能是肺表面活性剂的主要成分，在这方面是最为有效的。尽管其特性未必能对本发明气体分散体起到稳定的作用，但它们也易于形成诸如双层膜及脂质体的成层结构。气乳剂稳定性的另一决定因素是气体本身，如下所述，它具有通过气体渗透效应起到稳定作用的能力。这样的结合就得到了令人惊奇地稳定和实际有用的微气泡。
按照本发明气体分散组合物的制备，可以采用喷雾干燥包含磷脂的第一表面活性剂的水分散体的方法，优选地是至少有一种另外的辅助表面活性剂(这里也称为“第二表面活性剂”)，和一种亲水单体或聚合物或其组合物。水成液的起始材料可以任选地包括盐类及/或一种发泡剂。按照本发明通过喷雾干燥这样的溶液，就制得了干燥、空心、粒状及近似微球形的材料。
令人惊奇的发现是，预形成的球形空腔包含有水溶性成分(如羟乙基淀粉，盐类)及较水溶的表面活性剂(例如Pluronic F-68、Tween 20、二辛酰基磷脂酰基胆碱(例如dioctonoyl phosphotidyl choline))及一种磷脂(如蛋黄磷脂)，如果它是经喷雾干燥所形成的物理形态，在再脱水时就能够形成明显稳定的微气泡。这种表面活性剂不必以脂质体或其它成层形式存在。这可能是由于在渗滤通过溶解表面活性剂和结构剂后，水首先接触球形空腔(0.5-10微米直径)内表面的结果，形成了理想尺寸(空腔大小)的气泡，初期其周围被饱和表面活性剂溶液所包围，并因此具有最佳最大充填表面活性剂的覆盖层。这些气泡在体内甚至在充满水可溶性气体时(如空气或氮气)都是十分稳定的。
本方法，以及由此得到的干燥和再组成产物，将通过下述内容更为详尽地加以说明。
I、制备一种含磷脂的前体分散体：
为了下一步的喷雾干燥，先制备第一种水成液，内含一种疏水磷脂作为第一表面活性剂和含有至少另外一种更亲水的表面活性剂。优选地是，疏水磷脂具有至少一个酰基链，其总碳原子数至少约10个(如癸酰基磷脂)。在有些实施方案中，磷脂第一表面活性剂需有约10或14至约20或24个碳原子的酰基链。例如，可以使用二棕榈酰基磷脂酰基胆碱(包含两个酰基链，每个链为16碳原子)。可以对酰基链进行加氢或氟化。其它磷脂头端基团也可加以考虑。例如，磷脂酰基丝胺酸、磷脂酰基甘油醇、或磷脂酰基乙醇胺都具有适合于本发明的性质。这些磷脂的组合物也可以包括“第一表面活性剂”，因为它能够自然衍生出诸如卵磷脂或大豆卵磷脂产物，或肺表面活性剂类。此外，磷脂第一表面活性剂可以用其它的高度水不溶性表面活性剂来补充，如蔗糖的二、三及四酯类。胆固醇也可以补充第一表面活性剂，而且也发现，在添加胆固醇对磷脂的比例在约0.01～0.5(重/重)的范围内，对促进稳定性是有用的。尽管不饱和酰基团也是在本发明范围之内的，但优选地，磷脂酰基链仍是饱和的。提供的第一表面活性剂，优选地范围是约溶液的0.005％～20％(重量/体积)，最优选的是溶液的0.02％～10％(重量/体积)范围。
疏水第一表面活性剂的主要作用在于使所形成微气泡的表面张力减小至平衡值以下。在截留比较不水溶的渗透稳定气体时(将详述于下)，要求第一表面活性剂的水溶解度非常低，因为只有在表面活性剂扩散比所截留的气体慢很多时才有可能使表面张力降至平衡值以下。为了使表面活性剂有适当低的溶解度，采用长酰基链(即包含10个以上的碳原子)的磷脂是特别优选的。
第二表面活性剂，优选地是更为亲水和比包含第一表面活性剂的长链磷脂扩散得更快的。在稳定气体分散体配方中，这种第二表面活性剂的作用似乎与用水再组成时溶解的速率较快和截留气体更有效有关，因此在再组成的初期阶段有利于产生气泡，这一点以下将进一步描述。用这种方法，第二表面活性剂的较快扩散速率，有助于在再组成时产生包围气体的较持久和连续的膜。
本发明中，优选的第二表面活性剂可以选自以下物质的组合：磷脂、胆碱磷酸、溶血磷脂(lysophospholipids)、非离子表面活性剂、中性或阴离子表面活性剂、氟化表面活性剂，这些表面活性剂可以是中性的或阴离子的及这些乳化剂或发泡剂的组合物。用作第二表面活性剂的有些特殊表面活性剂实例，包括聚氧乙烯及聚氧丙烯的嵌段共聚物(此类化合物的实例如Pluronic，如Pluronic F-68)蔗糖酯、脂肪醇、脂肪胺氧化物、透明质酸脂肪酯、透明质酸脂肪酯盐、十二烷基聚(乙烯氧基)乙醇、壬基酚氧聚(乙烯氧基)乙醇、衍生淀粉、羟乙基淀粉脂肪酸酯、脂肪酸盐、商业食用植物淀粉、葡聚糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯、白明胶、血清白蛋白、及其组合物。
也可考虑作为第二表面活性剂的有聚氧乙烯脂肪酸酯，如聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯脂肪醇酯、聚氧乙烯化山梨聚糖脂肪酸酯、甘油聚乙烯乙二醇羟硬脂酸酯、甘油聚乙烯乙二醇蓖麻醇酸酯、乙氧基化豆油甾醇、乙氧基化蓖麻油、及其氢化衍生物。此外，非离子烷基葡糖苷类诸如Tweens、Spans及Brijs也都是在本发明范围之内的。Span类包括山梨聚糖四油酸酯、山梨聚糖四硬脂酸酯、山梨聚糖三硬脂酸酯、山梨聚糖三棕榈酸酯、山梨聚糖三油酸酯、及山梨聚糖二硬脂酸酯。Tween类包括聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖三棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯。Brij系是另外一类有用的材料，包括聚氧乙烯10硬脂基醚。阴离子表面活性剂，特别是具有6-24个碳原子的脂肪酸类(或其盐)，也可以使用。一种适用阴离子表面活性剂的实例是油酸，或其盐，油酸钠。阳离子表面活性剂及其盐，如十二烷基三甲基氯化铵，也是可以考虑用作为第二表面活性剂。
前述广为应用的第二表面活性剂，也是可加考虑的。的确，实际上任何表面活性剂，一般只要其水溶解度及扩散系数高于一般长链磷脂包括用作第一表面活性剂的(包括那些仍在开发的)，均可用于本发明。对于某种给定场合，最佳表面活性剂可以通过经验分析加以确定，勿需过多试验。因此，要实施本发明方法，应当根据如生物适应性这样的性质选择表面活性剂。现已发现，采用比第一磷脂更亲水的链较短的磷脂作为辅助表面活性剂是有益的。作为一个特例的是，可以向一种有12-14碳原子酰基链的第一磷脂中加入作为辅助表面活性剂的具有八个或十个碳原子的酰基链的第二磷脂。
现已发现特别有益的是，采用包含12碳原子酰基链的磷脂作为第一，或第二表面活性剂。例如，12碳原子酰基链的磷脂可以包括第一表面活性剂，和蔗糖酯或Pluronic化合物可以包括第二表面活性剂。另外一种选择是，有16碳原子酰基链的磷脂可以包括第一表面活性剂，而有12碳原子酰基链的磷脂可以包括第二表面活性剂。
除气泡形成及性质保持优良外，用磷脂作为第一及辅助表面活性剂两者所形成的微气泡，注射后在体内的代谢消除方面具有优异的性质，并可使如补体激活之类体内不良反应减至最少，这对于已有技术的微气泡却会是个问题。内含12或14碳原子酰基链的磷脂气乳剂组合物，在这方面看来是特别有好处的。
可以相信，含磷脂微气泡不仅比含非磷脂表面活性剂的微气泡有更好的生物适应性，而且比脂质体也有更好的生物适应性。也就是说，它们明显地避开了网状内皮系统，比脂质体更为有效，因而不必快速地使之从循环中清除。
正如对有关第一表面活性剂所指出那样，第二或辅助表面活性剂可以包括上述表面活性剂的组合物。优选地是，在喷雾干燥之前，使用的第二表面活性剂在0.005％～20％(重量/体积)范围。但并未要求该混合物中要以第一表面活性剂为主。或者第一、或者第二表面活性剂皆可占具其中较多摩尔数或重量。一般地说，溶液中总表面活性剂量为溶液量的约0.01～20％(重量/体积)。
在制备上述表面活性剂水成液之后，就添加发泡剂，优选地是，添加如氟里昂113的碳氟化合物，以产生粗悬浮物。发泡剂可以是任何在喷雾干燥时可转变为气体的材料。这样发泡剂就被分散遍及到表面活性剂溶液中，例如可以使用市场上供应的在约5000～15000psi下的微流化器(microfluidizer)。本发明一组优选实施方案中，用的是一种高压均质器，产生一种在含磷脂的表面活性剂溶液中的氟里昂113传统乳剂。这种方法形成的传统乳剂包含覆盖有单分子层表面活性剂的水不溶性氟里昂亚微滴珠。用这种或其它方法的分散体在此领域中都是很普通的和人所皆知的。
在待进行喷雾干燥的溶液中引入发泡剂，由于形成较大量的空心微球，会造成每克喷雾干燥粉发出较强的超声信号。在溶液进入喷雾干燥器内，这些滴珠与干燥器内的热空气流混合时，发泡剂就成为雾化滴珠内构成蒸气汽泡制剂的核心。适宜的发泡剂是那些在干燥液滴温度升高(大约100℃)下能使雾滴内的溶液被气体或蒸气所过饱和的试剂。适宜的试剂包括：
1、与水成液混溶有限的被溶解的低沸点溶剂(100℃以下)，如用于室温下饱和水溶液的二氯甲烷、丙酮及二硫化碳。
2、一种气体，如CO2或N2，用于室温或升压(如3bar)下对溶液进行饱和。再用1大气压及100℃的气体对液滴进行过饱和。
3、不混溶低沸点(100℃以下)液体的乳剂，该低沸点液体诸如氟里昂113、全氟戊烷、全氟己烷、全氟丁烷、戊烷、丁烷、FC-11、FC-11B1、FC-11B2、FC-12B2、FC-21、FC-21B1、FC-21B2、FC-31B1、FC-113A、FC-122、FC-123、FC132、FC-133、FC-141、FC-141B、FC-142、FC-151、FC-152、FC-1112、FC-1121及FC-1131等。
在表面活性剂溶液中加入发泡剂量约为表面活性剂溶液量的0.5～10％(体积)。已发现大约3％(体积)的发泡剂产生一种能够形成适宜微气泡的喷雾干燥粉末。在喷雾干燥过程中发泡剂基本上都全被汽化，因此在最后的喷雾干燥粉末中残存的发泡剂不会超过痕量。
前体水成液优选地包括亲水单体或聚合物或其组合物。它可以与表面活性剂溶液进行组合，或更为优选地是，它配制成一种单独的溶液并在刚要喷雾干燥之前与表面活性剂前体溶液进行组合。其亲水部分例如可以是碳水化合物，如葡萄糖、乳糖或淀粉。聚合物诸如PVA或PVP类也可以考虑用于本发明。也已发现各种淀粉或衍生淀粉也是特别适用的。特别优选地用于形成微气泡的淀粉包括那些分子量大于约500,000道尔顿的淀粉，或等价值(DE)低于约12的右旋糖。DE值是淀粉水解度的一种定量尺度。它是与右旋糖标准100相比表示其能力降低多少的一种尺度。DE值越大，淀粉水解程度越高。这类优选淀粉包括食品工业市场供应类型的食用级植物淀粉，包括National Starch and Chemical Co.，(Bridgewater，NJ)公司的以食品商标销售的N-LOK及CAPSULE的那些淀粉；衍生淀粉，诸如羟乙基淀粉(市售的由Du Pont Pharmaceuticals公司提供的商标为HETASTARCH及HESPAN；日本东京Ajinimoto公司的M-羟乙基淀粉)。(要注意的是，短链淀粉喷雾干燥好，而且可以用于产生微气泡，但不是优选的，因为它们的分子量低于约500,000，不能使微气泡稳定。然而，在本发明中却可以应用，因为在应用中不要求有另外的稳定作用)。在此前体溶液的实施方案中，亲水单体或聚合物范围在约溶液的0.1～10％(重量/体积)，并发现约为溶液的1～5％(重量/体积)是特别适用的。
在此前体溶液的实施方案中，任选的其它成分包括各种盐类或水相中的其它试剂。这些试剂包括传统粘度改进剂、缓冲剂如磷酸缓冲液或其它传统生物适应缓冲剂、或pH调节剂如酸或碱、渗透剂(用于等渗性、超渗透性或过渗透性)，是可能有利的。优选溶液pH为约7，而且是等渗透性的。对于这些另外的配料，每种一般含量都要低于溶液的5％(重量/体积)。适宜盐类的实例包括磷酸钠(单碱基及双碱基两种)、氯化钠、磷酸钙及其它生理可接受的盐类。
II、喷雾干燥
有表面活性剂/发泡剂的乳剂优选地是与如上所述类型的亲水单体/聚合物及盐的溶液组合一起的，经喷雾干燥形成干燥、空心、近似微球形结构的粉末。市场供应的喷雾干燥器都是本领域技术人员所熟知的，对于任何特定的前体溶液适宜的设定条件是易于按标准通过经验分析加以确定的，以下述实施例作为适当的参考。
在以下实施例I-VII及IX-XII中用的“Niro移动式喷雾干燥器”，是用一双流压缩空气喷嘴雾化含表面活性剂的溶液，高速压缩空气喷射使表面活性剂溶液破碎成为直径2～20微米的液滴。接着再将这些雾滴从干燥室上部注入热空气流中(一般为200～375℃)。於是表面活性剂雾滴几乎瞬间被加热至它们的沸点约100℃。尽管汽化冷却的作用阻碍了它们上升到更高的温度，但此温度也仍然高于磷脂玻璃转化温度，并在其它许多表面活性剂如Poloxamer 188及蔗糖硬脂酸酯等的熔点之上。
液滴表面上的水汽化非常地快，引起溶于雾化溶液中化合物的积累。在溶液含如羟乙基淀粉(HES)类的亲水聚合物时，其表面上就形成了一层凝胶层。在凝胶层之下，形成蒸汽气泡，使凝胶球膨胀。如前所简述，包含少量如二氯乙烷的可溶挥发性溶剂，或如氟里昂113的挥发性不混溶溶剂的发泡剂，成为早期形成汽泡的成核中心，导致更多的蒸汽膨胀及形成壁更薄的空心球体。
在干燥过程中，水，或以液态穿过凝胶层的孔移动至球体表面，并在表面汽化，或成为蒸汽态穿过同样的凝胶层的孔离开球体。导致截留于HES凝胶中的水全部汽化。在此干燥过程期间，汽化及汽化冷却都是缓慢的，而且球体温度上升也是与喷雾干燥室出口温度相应的，一般在100～120℃。随着脱水的进行，凝胶球体收缩，产生出空心孔隙性的球粒，直径约在1～10μm，壳厚约0.2μm。喷雾干燥器出口空气流夹带着这些球粒进入旋风分离器，通过离心作用力使粉末与空气流分离，而直接进入一种产品容器。
由于种种原因，此干燥球形表面活性剂/聚合物组合物复合结构的特征在于是无序的和基本上不具备成层形的。首先，在喷雾干燥之前，构成带发泡剂的乳剂均质化过程就将表面活性剂沉积为单分子层。因为干燥在不到一秒钟之内发生，快速地将表面活性剂截留在浓缩的聚合物(如HES)凝胶中，使表面活性剂保持了几乎是干燥前的物理状态。此外，在喷雾干燥过程中，较低水溶性的表面活性剂(蔗糖硬脂酸酯，长链磷脂等)是在更易水溶性的表面活性剂存在下被加热至其熔点或玻璃转化温度以上的，从而使它们组合进入到了亲水聚合物的基质中。这就导致了更为无序的表面活性剂结构。
这种喷雾干燥组合物，包括充气空心微球，是本发明的一种重要产品。这种产品具有明显优于含冻干脂质体前体的优点。可以认为，本发明微气泡前体材料的球形结构起到了快速和均匀形成较不溶或较不可压缩的非牛顿粘弹性的表面活性剂膜的作用，这就是本发明优选微气泡的特征。
在完成喷雾干燥之后，用适宜气体将微球装入一种容器中。这种气体充填微球，经再组成后就变成了截留于微气泡内的气体。
微球的各种单个成分优选地包括按下述比例的最后喷雾干燥产物，以％(重)计：
第一磷脂表面活性剂                          0.05％～90％
第二表面活性剂                              0.05～90％
亲水结构材料                                1～99％
盐类、缓冲剂等等                            0～90％在特别优选实施方案中，此组合物具有下述比例，以％(重)计：
第一磷脂表面活性剂                          0.1％～10％
第二表面活性剂                              0.1～10％
亲水结构材料                                10～60％
盐类、缓冲剂等等                            10～60％
最为优选地是，第一表面活性剂的数量(最有利的是磷脂)至少约为总表面活性剂数量的1％，优选至少3％、4％、或5％，和最优选至少约7％、8％、或10％(重)。也可以很好地构成占总表面活性剂总量的25％、50％、75％或95％，对于没有第二表面活性剂的实施方案，也可以考虑，但不是优选的。
本发明另一实施方案中，前体溶液的组合物是制备成一种形成脂质体的喷雾干燥粉末。这种前体溶液，例如可以具有像Schneider等人的USP5,380,519中的组成，在此引入以作为参考。我们发现，这里描述的喷雾干燥方法用于含磷脂溶液形成微气泡前体，优于Schneider等人用冷冻干燥法，而且得到的微气泡似乎比由冷冻干燥材料形成的微气泡稳定得更多。因此，按照本发明在这方面可以考虑的是，可以按照Schneider等人的做法，采用喷雾干燥方法制备干燥的形成脂质体的前体，然后经再组成形成微气泡，用于回声测深成象技术。
III、再组成及气体选择
在水介质再组成时，在某些优选实施方案中对壳提供结构的亲水单体或聚合物，以及可能存在盐和任何缓冲剂等等，都迅速溶解，留下的是气乳剂或分散体，其内包含四周由遗留表面活性剂层所包围的许多气泡。第一磷脂表面活性剂，及更为亲水的辅表面活性剂都被设想为起到不同的作用。
没有任何特定的理论运作限制，第二表面活性剂(或辅助表面活性剂)是明显有助于水溶性结构材料的溶解，并在再组成时又可非常快速扩散，瞬间“愈合”壳溶解时出现的表面活性剂的自由间隙。现已发现，在对部分含有与较疏水表面活性剂结合的较水溶表面活性剂的微球粉进行重组成时，每毫升的增强剂可产生非常大量的气泡，比仅含单一的疏水表面活性剂的重组成粉未多了许多。尽管较亲水的第二表面活性剂在从干燥、空心球体转变为被表面活性剂层包围的气泡过程有明显的重要作用，但是，人们认为，更为疏水的第一磷脂仍然是气泡形成之后最有效的稳定剂。
因此这样产生的气体分散体基本上不同于以前的含磷脂对比增强组合物。如上所述，Ryan及Unger的含气脂质体不涉及在气泡的气/液界面处有表面活性剂层，但涉及截留在脂质体水成核心中实质上裸露的气泡。这可能是与本发明的气乳剂或微气泡分散体有所区别的，其中看来(未受任何理论运作的限制)是，小气泡四周是被比较持久和不易消失的表面活性剂层所包围，表面活性剂层按亲水头端基团与水溶液结合的方向，而疏水尾端基团则是与被分散的气泡相结合方法排列。
此外，与Schneider等人的相对照，本发明的气体分散体不要求有脂质体或其它成层表面活性剂结构的溶液存在。事实上，按照本发明可以制备出具有极好体内稳定性的气体分散体，其中所用的表面活性剂是不能形成脂质体的。溶液中没有成层表面活性剂结构并未显著影响本发明对比剂的效能。另外却观察到，在气泡中有碳氟化合物渗透稳定剂气体的存在，会大大地增加本发明分散体的稳定性，而碳氟化合物渗透稳定剂的存在，对于由冻干脂质体所产微气泡的稳定性的影响却很小。这些性能上的差异进一步地表明(再强调一次，未受任何理论运作限制)本发明气泡中的气体是被比较持久和不易于消失的表面活性剂层所截留，此表面活性剂层是以表面活性剂的亲水头端基的方向与水成液结合，而以其疏水尾端基方向与分散的气泡结合。
可以用前述水介质喷雾干燥的微球粒再组成方法，来产生含有空气、氮气或其它通常血液中有的气体的适宜气泡。也已发现，在再组成之前使较不水溶的气体如碳氟化合物渗透进入干燥微球粒中，气泡的寿命可得以延长。在此情况下，本发明需利用第一气体或任选的一般血液或血浆中原有的气体(“主调节气”)与另外一种或多种起调节气泡内渗透压作用的第二气体(“气体渗透剂或试剂”或“第二气体”)的组合。通过调节气泡的渗透压，气体渗透剂(这里定义为一种单一的或混合的化学品整体)对气泡内的压力产生作用，以阻止气泡收缩。可任选地是，此调节剂气体可以不是血液或血浆中原有气体。但是，在血液中的气体或周围其它流体扩散进入到气泡内的时候，该调节剂气体必须能够稀释及维持气体渗透剂或试剂的分压，使之低于气体渗透剂或试剂的蒸气压。在水介质中，水蒸气未被看成是一种有疑问的“气体”。同样，当微气泡是处于非水介质中时，那种介质的蒸气则未被认为是一种“气体”。
我们发现，添加气体渗透剂，例如添加具有降低穿过气泡表面的膜渗透性的，或降低外连续相的液相溶解度的，由此可以延长所形成的气泡寿命。
在所选择的气乳剂内，通过截留气体的组合可以达到这样的结果，优选地是，用一种主调节剂气体或稀释气体的混合物使气体渗透剂稀释至其分压低于气体渗透剂蒸气压，直至调节剂气体随外部介质一般有的气体变化为止。气体渗透剂或试剂一般都是较疏水或较不易穿透的气泡膜，而且还要有促使气体渗透压大于50、75或100乇能力的。一种优选实施方案中，气体渗透剂的蒸气压优选的是在37℃下低于约760乇；优选地是低于约750、740、730、720、710或700乇；在有些实施方案中，低于约650、600、500、或400乇。在优选实施方案中，主调节剂气体蒸气压在37℃下是至少660乇，和气体渗透剂的蒸气压在37℃下至少100乇。
第一气体或第二气体的摩尔比分别为1∶100、1∶75、1∶50、1∶30、1∶20、或1∶10至约1000∶1、500∶1、250∶1、100∶1、75∶1、或50∶1；和在37℃时第一气体的蒸气压至少约(760-x)mm Hg，其中x为第二气体在37℃时的蒸气压；第一及第二气体各自蒸气压在37℃时大于约75或100mm Hg。
按照本发明的一组优选实施方案制备的气乳剂或气体分散体的气泡，也可以有另外一种有利特性。在一组这样的实施方案中，应用非渗透气体与渗透稳定气体(或气体渗透剂)的混合物来稳定在气泡生成时或刚生成后所得气泡的尺寸分布。在气泡生成时，较小气泡中Laplace压力较高，引起通过液相扩散成为较低Laplace压力的大气泡。致使平均尺寸分布随时间增加至毛细尺寸极限的5微米以上。这被称为歧化。当使用非渗透气体(如空气)与渗透蒸气(如C6F14)的混合物时，由于空气离开气泡，较小气泡容积略有减小，浓缩了渗透气体，并增加了它的渗透压力，从而阻碍了气泡进一步收缩，而同时较大气泡容积略有增加，稀释了渗透气体，又阻碍了气泡的进一步长大。
采用血液极易溶解的气体混合物(如87.5％(体)的CO2)及渗透气体混合物(如28％C6F14蒸气+72％空气)的另一优点是，在注射后由于CO2进入血液而损失，气泡迅速收缩。注射时，气泡容积由于CO2损失而减小85％。这样的CO2损失，相当于气泡直径减小一半。因此，就可以采用简单机械方法制备较大直径的气泡(如9μm)，使在注射之后的气泡大小收缩在5微米以下。一般地说，这样的气乳剂在制备初期时第一气体对第二气体存留比例至少为1∶1，优选为至少3∶2、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、或10∶1。在微气泡膜属于对第一气体比对第二气体更易渗透之时(如，此膜对各个气体渗透性的比例至少约2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、或10∶1，优选地甚至更高，如20∶1、40∶1、或100∶1)，气泡从它们原有的第一直径快速有利地收缩(如在1、2、4、或5分钟时间内)至平均第二直径为它们原有直径的75％或更低。而后，在包含气乳剂连续相的水介质中有至少一种较易膜渗透的气体存在时，气泡优选地被稳定在或约在第二直径下至少1分钟、优选为2、3、4、或5分钟之久。在一组优选实施方案中，通过气体渗透压差的稳定作用，气泡尺寸维持在约5或6微米至1微米之间至少达1、2、3、4、或5分钟之久。外部液体中的气体张力优选地是至少约700mm Hg。此外，对于较不易膜渗透的气体也要在微气泡中产生这样渗透压差。
如上所述，气体渗透剂优选地是渗透通过气泡表面比调节剂弱的气体。气体渗透剂属于在血液或血浆中较少溶解的，也是优选的。因此，现在可以理解，气体渗透剂可以是室温或体温下为气体，或通常可以在体温下为液体的，只要在用于提供所需渗透效应的温度下它具有足够的分压或蒸气压。
因此，碳氟化合物或其它室温或体温下不是气体的化合物均可使用，只要它们具有足够的蒸气压，优先地是，在体温下至少50或100乇，或更优选为至少约150或200乇。应当注意的是，在气体渗透剂是气体混合物时，测量的有关蒸气压指的是混合物的蒸气压，而不必是混合气体渗透剂单个组分的蒸气压。
同样也重要的是，在使用全氟碳化合物作为气泡内的渗透剂时，个别全氟碳化合物在气泡中的分压及体温下不得凝结。主调节剂气体可以迅速离开气泡，引起气泡收缩和第二气体渗透剂浓缩，这与主调节剂气体和气体渗透剂的相对浓度有关。这种收缩可以持续发生，直至气体渗透压等于气泡外部压力(动脉最大绝压)加上气泡的Laplace压力减去血液的空气张力，或减去空气饱和张力(基本上是一个大气压)为止。因此，所得气体混合物的凝结分压在37C时必须在渗透剂平衡分压以上，如前所述。
符合适宜溶解度及蒸气压判据的某些化合物，现列于表1中：
全氟丙烷，C3F8
全氟丁烷，C4F10
全氟环丁烷，C4F8
全氟戊烷，C5F12
全氟环戊烷，C5F10
全氟甲基环丁烷，C5F10
全氟己烷，C6F14
全氟环己烷，C6F12
全氟甲基环戊烷，C6F12
全氟二甲基环丁烷，C6F12
全氟庚烷，C7F16
全氟环庚烷，C7F14
全氟甲基环己烷，C7F14
全氟二甲基环戊烷，C7F14
全氟三甲基环丁烷，C7F14
全氟三乙胺N(C2F5)3
人们都会了解，本领域一般技术人员都易于断定，适用于本发明的其它化合物是否不能满足如上所述的溶解度及蒸气压两项判据要求。反之，也会理解，某些化合物即使能够补偿其它类型的不足和具有优异不溶解性或高的蒸气压，也要被认为是不在溶解度或者在蒸气压优选范围之内。
应当注意的是，对于医用气体，包括调节剂气体和气体渗透剂，都应当是生物可适应的，或者在生理上不是有害的。最终，含气相微气泡会衰减和气相会以溶解气体或以凝结液体亚微滴的形式释放进入血液。需要明白的是，气体主要是通过肺部呼吸，或通过呼吸与网状内皮系统中的其它途径相结合的方式排出体外的。
令人惊奇的发现是，PFC类如C4F10(作为一种组合的调节剂气体及气体渗透剂)与用C6F14饱和的蒸气(作为主气体渗透剂)的混合物，可以使气泡稳定的时间比它们单独成分所稳定的时间更长。这是由于C4F10在体温下是(因此，能够起到调节剂气体及气体渗透剂的两种作用)一种膜渗透性有些降低的气体，和在体温下它在C6F14中是仅略有溶解的。在这种情况下，两剂的气体渗透压加在一起，导致气泡保留时间延长，超过了仅是空气/C6F14的混合物。可能是，保留时间较长的且分子量较高的C6F14组分的凝结温度上升，对较高的最大气体渗透压产生了影响。PFC类的其它混合物应用起来也会类似。优选的PFC混合物比例需在1∶10～10∶1，并包括诸如全氟丁烷/全氟己烷和全氟丁烷/全氟戊烷这样的混合物。这些优选氟化学品可以是分支链的或直链的。
如前所述，我们也发现了，非渗透性气体与气体渗透剂组合的混合物在注射前后都起到了稳定气泡尺寸分布的作用。在产生气泡的时候，较小气泡Laplace压力较高，引起通过液相扩散为Laplace压力较低的较大气泡。这样就使得平均尺寸分布随时间增加到毛细张力的极限5微米之上。这就是所谓歧化。
然而，调节剂气体混合物(如空气或二氧化碳)与气体渗透剂(如C6F14)一起使用时，由于调节剂气体之一离开气泡，较小气泡容积略微减小，致使渗透气体浓缩，渗透压增加，因而阻碍了进一步收缩。另一方面，较大气泡容积将略有增加，稀释了渗透气体，又阻碍了其进一步长大。
因此，我们发现，使用较为疏水和较低膜渗透性的气体，气泡衰减速率可以降低。因此，由于气泡衰减速率降低，微气泡的半存留期得以延长，对比增强范围扩大。
制备所需气体，是要使之渗透到放置在长颈瓶里的干燥微球中的，长颈瓶是置于真空室内以便真空抽出空气。再用所需气体或组合气体替换空气(优选的气体组合物是在13℃下用全氟丁烷饱和了的氮气)。於是此气体扩散进入球体的空隙。加压或真空循环均有助于扩散。接着再将长颈瓶卷曲密封，优选地是用伽玛辐射灭菌。
需要理解的是，可以制备一些能用于本发明微气泡制备的器具。这些器具包括上述形成微气泡用的封闭气体、液体及表面活性剂的容器。此容器可以装盛所有消毒干燥的组分，和用同一容器的第二室装盛消毒液体及气体于一室之内。适用的双室长颈瓶容器，例如可以是由WheatonGlass Co.，(Millville，NJ)公司提供的，其商标为WHEATON RS177FLW或S-1702FL的容器。这种容器见图1-4说明。由图1及图2可以看出，所示Wheaton容器5有一个上室20，可以装盛水溶液25，和一个下室30，可以装盛干燥的配料35及干燥气体。有一个瓶塞10，用于隔离顶室与外环境，和有一个密封15，用于分隔上室20和下室30，下室30内装有喷雾干燥(粉末状的)空心微球35及气体渗透剂。压下瓶塞10对较不压缩液体加压，推进密封15向下进入下室30。使水溶液25流入下室30，以溶解粉末35，形成内含截留气体渗透剂的稳定微气泡45。多余的气体渗透剂40从下室30流入上室20。这样的安排方便用户，而且还有另外意想不到的优点，即密封住了在下室之中的少量水不可渗透的气体渗透剂，由厚的水成液层(0.5～1.25英寸)包住内室的密封件，和能够将水成液引入下室而使粉末室压力上升不致超过约10％的优点。因而没有必要设置压力排放口(相反，对于传统的溶质再组成是在带有针头及注射器的单室瓶内进行，没有排放口会产生明显的能使微气泡消失的内室压力)。
另外，逆向双室瓶也可用于制备微气泡。参见图3及图4，采用如上所述的同样长颈瓶，但不同的是，瓶塞50是延长了的，在压下时瓶塞可推动内密封15。在这种微气泡制备方法中，喷雾干燥的空心微球35和气体渗透剂40是装在上室20中的。水溶液25和气体渗透剂40是装在下室30内的。当瓶塞50压下时，它就可推移密封15，使喷雾干燥空心微球在有气体渗透剂40存在下与水溶液25混合。采用这种形成微气泡方法的优点在于，水相可以首先滴入并可经加压釜或其它方法进行消毒，然后再注入喷雾干燥微球。这样就防止了在消毒之前水溶液中微生物生长的可能。
虽然已经说明了一种特殊的双室容器，但是其它适用的机构也是已知的和市场有供应的。例如，诸如B-D HYPAK液体/干燥5+5ml双室预充填注射系统(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ；USP 4,613,326中有所描述)的双室玻璃注射器，可以有利地用于再组成喷雾干燥粉末。这种系统的优点包括：
1、使用方便；
2、水不溶气体渗透剂是在一侧用水溶液室密封在内，而另一侧是在弹性体的极小区域内密封着注射针；以及
3、一种诸如Monoiect #305(Sherwood Medical，St.Louis，MD)的过滤注射针在生产时可以装在注射器上，以确保不注入未溶固体。这种双室注射器构成微气泡的使用描述于实施例XIV中。
对于此领域一般技术人员可以理解的是，能够使喷雾干燥粉末与水成液结合于消毒手段之中的其它双室再组成系统，也都是在本发明之范围内的。在这种系统中，如果可将水相插放在水不溶渗透剂气体与环境之间，以延长产品储存寿命，是特别有利的。在生成微气泡所需材料不易存在于容器中时，就可用此器具的其它部件来包装它，优选地是，采用适合促进其易于与器具的其它部件相组合的形式或容器。
本发明特别应用微气泡的实施例包括：心脏、心肌组织灌注成象，和心脏及其组织在应激反应及运动测试时灌注特性的确定，或由于心肌不全灌注缺陷或改变的确定。同样，在口服或静脉注射给药以增加组织血流后，可以观察心肌组织。再则，也可以增强观察由于或受到各种干扰时心肌组织的改变，如冠状组织静脉移植、冠状动脉成形术(coronaryangioplasty)、或使用血栓溶解剂(thrombolytic agent)(TPA或链激酶(streptokinase))。由于可以很方便地通过末梢血管施用这些对比剂，以增强对整个循环系统的观察，它们都将有助于对一般血管病理的诊断，和有助于对胎盘组织生育力进行超声监测的能力。
然而，应当强调的是，这些原理已经应用于超声成象以外的范围。的确，本发明范围甚为广泛，可包括含磷脂气乳剂应用于任何系统，包括非生物场合中的应用。
还需理解的是，在本发明的微气泡配方中可以包括其它的成分。例如，渗透剂、稳定剂、螯合剂、缓冲剂、粘度调节剂、空气溶解度改进剂、盐类、以及糖类等均可加入，以改善微气泡的悬浮，达到最长的寿命和对比增强的效能。这些诸如对消毒、等渗性、以及生理适应性的考虑，可以控制这些传统添加物在可注射组合物中的应用。这些试剂的应用是可以被本领域的一般技术人员所理解的，而且其特定的质量、比例及制剂类型均可根据经验加以确定，无需过多试验。
本发明各种实施方案都展现了令人惊奇的优点。喷雾干燥的淀粉制剂，特别是在淀粉分子量超过约500,000时，可以延长它在体内的稳定性。蔗糖脂肪酸酯如蔗糖单硬脂酸酯，以及嵌段共聚合物如Pluronic F-68(HLB值12以上)可以使粉末在它们再水合时立即形成气泡。喷雾干燥制剂，具有结构试剂如淀粉、淀粉衍生物，或糊精等，要求的表面活性剂总剂量要比类似发声(comparable sonicated formulations)制剂的总量少很多。对气体渗透剂采用以水附加密封的双室瓶，可延长保留时间，并更方便使用。带有结构剂(如淀粉和糊精)、疏水磷脂、及更易于水溶的辅助表面活性剂的喷雾干燥制剂，可以使气乳剂在体内的半存留期大大延长。
本发明的任何微气泡制剂均可施用于脊椎动物，如鸟类、或哺乳动物，作为对比剂用于脊椎部分的超声成象。优选地是，脊椎动物在于人，和被成象部分在于脊椎动物的血管分布。在本实施方案中，是按脊椎动物体重为基准计，将少量微气泡(如0.1ml/Kg[2mg/Kg喷雾干燥粉末])经血管内引入至动物体内。微气泡其它剂量如约0.005ml/Kg至约1.0ml/Kg也可以使用。心脏、动脉、静脉及其它富血器官如肝、肾等均可应用本技术进行超声成象。
参照下述实施例可以更为充分地理解前述内容。然而这些实施例都是实施本发明的优选方法的示范举例，而并非对本发明范围或对所附权利要求的限制。
实施例1
含磷脂溶液的喷雾干燥
用注射用水制备1升下述水溶液：2.0％(重量/体积)的Maltrin M-100麦芽糊精(Grain Processing Corp.，Muscatinc，IA)，0.95％(重量/体积)氯化钠(Mallinckrodt. St. Louis，MD)，1.0％ Suprionic F-68(Serva，Heidelberg，Germany)，1.0％(重量/体积)的Ryoto蔗糖硬脂酸酯S-1670(Mutsubishi Kasei Food Corp.，Tokyo，Japan)，和0.5％氢化磷脂LipoidE-100-3(Lipoid，Ludwigshafen，Germany)
然后在装有双流雾化器的Niro雾化器移动式喷雾干燥器(NiroAtomizer，Copenhagen，Denmark)中对这种溶液进行喷雾干燥，采用了下述设定条件：
热空气流速        39.5CFM
入口空气温度      245℃
出口空气温度      100℃
雾化空气流量      350升/分钟
液体加料速率      1升/小时
干燥空心球形产物直径在约1～15μm之间，并按照这种干燥器的标准收集于旋风分离器中。称取若干等分量的粉末(250mg)放入10ml的管状瓶中，抽空，并于13℃下用全氟己烷饱和了的氮气搅动，和密封。氮气是令其通过浸在13℃水浴中三个装满全氟己烷的洗气瓶而加以饱和的。
在用5ml注射用水进行再组成时，通过光学显微镜可以观察到许多气泡，大小范围在1～20微米。在一段相当长的时间内能够观察到许多约1微米气泡的事实，说明其附加稳定性是由于在配方中包含有磷脂作为一种另外的非牛顿粘弹性表面活性剂而获得的结果。
实施例II
磷脂与蔗糖酯气乳剂的对比
用注射用水制备下述4种溶液各1升：
溶液1：
3.9％(重量/体积) m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.25％(重量/体积)氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)，
2.83％(重量/体积)磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.42％(重量/体积)磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
溶液2：
2.11％(重量/体积)Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
0.32％(重量/体积)Ryoto蔗糖硬脂酸酯S-1670(Mitsubishi-Kasei
                 Food Corp.，Tokyo，Japan)
0.16％(重量/体积)Ryoto蔗糖硬脂酸酯S-570(Mitsubishi-Kasei
                 Food Corp.，Tokyo，Japan)
溶液3：
3.6％(重量/体积) m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积) 氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％            磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积)磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
溶液4：
0.15％(重量/体积)Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
0.45％(重量/体积)氢化卵磷脂酰基胆碱EPC-3(Lipoid，Ludwig-
                   shafen，Germany)
将溶液2及溶液4加入高剪切混合器中并于冰浴中冷却。取1升的溶液2及4配制为3.0％(体积/体积)的1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EMScience，Gibbstown，NJ)的粗悬浮液。用微流化器(MicroflluidicsCorporation，Newton，MA；M-110F型)使这些悬浮液在10,000psi及5℃下乳化5次。将所得的乳液4加到溶液3中，并将所得的乳液2加到溶液1中。再将配方1及2混合物(含有蔗糖酯表面活性剂)和配方3及4混合物(含有磷脂表面活性剂)放在装有双流体雾化器的Niro雾化移动喷雾干燥器(Niro Atomizer，Copenhagen，Denmark)中进行喷雾干燥，所用设定条件如下：
配方1及2混合物：
热空气流速               31CFM
入口空气温度             370℃
出口空气温度             120℃
雾化空气流量             290升/分钟
乳液加料速率             1.5升/小时
配方3及4混合物：
热空气流速               31CFM
入口空气温度             325℃
出口空气温度             120℃
雾化空气流量             290升/分钟
乳液加料速率             1.5升/小时
干燥空心球形产物直径在约1～15μm之间，并按照这种干燥器的标准在旋风分离器中收集。称取若干等分量的粉末(250mg)放入10ml的管状瓶中，并于13℃下用全氟己烷饱和了的氮气搅动，和密封。氮气是令其通过浸在13℃水浴中充满全氟己烷的三个洗气瓶而加以饱和的。
用5ml注射用水重组装长颈瓶，再插入在18号针作为在水注入时压力释放排出口。将1毫升所得微气泡悬浮液静脉注射入约3Kg重装戴测量仪的兔子中，监测其颈动脉的多普勒测速仪(Doppler)信号。将10MHz流量套(Triton Technology Inc.，San Diego，CA；ES-10-20型)连接在系统6多普勒测速仪流量模块上(Triton Technology Inc.)，发送RF多普勒信号至LeCroy 9410示波器(LeCroy，Chestnut Ridge，NY)。由示波器计算的信号均方根(RMS)伏特被传送至计算机，和将得到的曲线经拟合得到回声信号峰强度及血液中微气泡半保留期。对比前信号低于0.1伏特RMS。
尽管在蔗糖酯制剂产生初期超声离散信号由于微气泡浓度较高而高于磷脂制剂信号的29％，但令人惊奇地是，磷脂制剂的保留时间基本上都是较长的。在140秒内，蔗糖酯配方的信号衰减至原有信号的30％，而对于磷脂配方，在信号水平衰减至30％的之前已持续了550秒，说明采用磷脂作为非牛顿粘弹性表面活性剂的配方有较长的保留时间。
实施例III
水不溶磷脂与水不溶磷脂/水溶性表面活性剂(Poloxamer 188)微气泡对比
按照实施例II制备下述乳液各1升用于喷雾干燥：
制剂A：水不溶磷脂制剂
3.6％(重量/体积)   m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)   氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)，
2.6％(重量/体积)   磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积)  磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积)，氢化卵磷脂EPC3(Lipoid，Ludwigshafen，
                   Germany)
3.0％(体积/体积)   1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113：EM Science，
                   Gibbstown，NJ)
制剂B：水不溶磷脂/水溶Poloxamer 188制剂
3.6％(重量/体积)   m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)   氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)   磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积)  磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积)  氢化卵磷脂EPC3(Lipoid，Ludwigshafen，
                   Germany)
0.45％(重量/体积)  Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
3.0％(体积/体积)   1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                   Gibbstown，NJ)
在用水5ml再组成100mg制剂A喷雾干燥粉末时，观察到每毫升约有2,000万个微气泡，大小范围在1～20微米之间。在用水5ml再组成100mg的制剂B喷雾干燥粉末时，观察到每毫升有约31,500万个气泡(比制剂A多1575％)，大小范围在1～20微米。
往微气泡制剂的水不溶表面活性剂中添加较水溶的表面活性剂[HLB(Poloxamer 188)＝29.0]，显著地增加了形成的气泡浓度，得到了更为有效的超声对比剂。HLB值是一个在0～40间用于选择乳化剂与被乳化物质的数字。HLB是乳化行为的一种标志，它与分子中的亲水及亲脂部分间的平衡相关(Rosen，M.，(1989)，Surfcants and Interfacial Phenomena，Second Edition，John Wiley&Sons，New York，pp326-329)。
实施例IV
水不溶磷脂与水不溶磷脂/水溶性(聚山梨酸酯20(Polysorbate 20))微气泡对比
按照实施例II 制备下述乳液各1升用于喷雾干燥：
制剂A：水不溶磷脂制剂
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St. Louis，MO)，
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积) 氢化卵磷脂EPC-3(Lipoid，Ludwigshafen，
                  Germany)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
制剂B：水不溶磷脂/水溶性(聚山梨酸酯20(Polysorbate 20))制剂
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积) 氢化卵磷脂EPC-3(Lipoid，Ludwigshafen，
                  Germany)
0.15％(重量/体积) 聚山梨酸酯20(Polysorbate 20)(ICI，Wilmington，
                  DE)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
在用水5ml再组成100mg制剂A喷雾干燥粉末时，观察到每毫升约有2,000万个微气泡，大小范围在1～20微米之间。在用水5ml再组成100mg的之间B喷雾干燥粉末时，观察到每毫升有约25,000万个气泡(比制剂A多1150％)，大小范围在1～20微米。
总之，在微气泡制剂的水不溶表面活性剂，氢化磷脂胆碱中，添加较水溶的表面活性剂，聚山梨酸酯20[HLB＝16.7]，显著地增加了形成的气泡浓度，得到更为有效超声对比剂。
实施例V
用磷脂结合物制备的气乳剂
按照实施例II的方法制备下述乳剂各1升用于喷雾干燥：
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)，
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.22％(重量/体积) 二棕榈酰基磷脂酰胆碱(Genzyme，Cambridge，
                  MA)
0.31％(重量/体积) 二辛酰基磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids
                  Alabaster.AL)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
用50ml水再组成时，观察到每毫升5,100个气泡，大小范围1～20微米。经确定这种微气泡制剂的回声生成信号为0.0029(1/秒)。
将1微升这种制剂注入至2.5Kg新西兰白兔的耳静脉。再用装有5MHz传感器的Acuson 128XP-5超声扫描仪对此兔子进行描成象。经灌注，其血管及心室的回声生成性强烈，并持续数分钟。此外，心肌和实体器官如肝脏及肾脏的回声生成性是均匀强烈的和持续数分钟。值得注意的是，门静脉及肝静脉的回声生成性是等强度的，显示由肝网状内皮组织吞噬细胞吸收的最少，造成血管内保留时间的延长。
实施例VI
由混合长链/短链磷脂制备的气乳剂的生物适应性
按照实施例II制备下述乳剂各1升用于喷雾干燥：
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)，
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.22％(重量/体积) 二棕榈酰基磷脂酰胆碱(Syngena Ltd.，Cambridge，
                  MA)
0.31％(重量/体积) 二辛酰基磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids
                  Alabaster，AL)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
对于这些二棕榈酰基磷脂酰胆碱/二辛酰基磷脂酰胆碱的比例，表面活性剂所形成的仅仅是混合胶束。在用5ml水进行再组成时，观察到每毫升中有约5,100万个气乳液滴，大小在1～20微米范围。对兔子给药剂量在5mg/Kg时气乳剂回声信号的第一级衰减常数测定为0.0029(1/秒)。这相当于血管内半保留时间为4分钟
气乳剂补体激活(complement actviation)的测定，用的是由QuidelCorp.，公司(San Diego，CA)提供的C3a体内诊断器具。在气乳剂与负对比(盐水)之间未见差异，表示气乳剂并没有激活补体。众所周知，裸露微气泡才激活补体。
检测样品                                 [C3a](ng/ml)
酵母聚糖(正对照)                            43403
盐水(负对照)                                 604
气乳剂                                       412
也测定过气乳剂在给药剂量20mg/Kg时被麻醉狗的血液动力学改变。未见其主动脉压及肺动脉压改变。这些结果显示使用气乳剂至10-100倍于临床相关剂量未见血液动力学效应。
时间(分钟)     主动脉           肺动脉
              压力(mm Hg)    压力(mm Hg)
0              109.4             13.3
1              109.2             14.2
2              110.4             14.1
5              115.0             14.3
10     117.9           15.7
60     111.0           13.2
90     120.9           13.6
因此，同样的气乳剂制剂均具有极佳的效能。
实施例VII
补充胆固醇的含磷脂气乳剂
用注射用水制取各1升半下述溶液。溶液1含淀粉和盐类，溶液2含溶解于氟里昂113与乙醇的混合物中的磷脂及胆固醇。将溶液2加到高剪切混合器中并于冰浴中冷却。加入1升半水在剧烈搅拌下制得一种1，1，2-三氯三氟乙烷(氟里昂113)的粗悬浮液。将此悬浮液与按实施例II描述的溶液2进行乳化。再将得到的乳剂加到溶液1中得到下述供喷雾干燥的配方物：
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，st.Louis，MO)，
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallnckrodt，St.Louis，MO)
0.22％(重量/体积) 二棕榈酰基磷脂酰胆碱(Genzyme Cambridge，
                  MA)
0.31％(重量/体积) 二辛酰基磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids
                  Alabaster，AL)
0.05％(重量/体积) 胆固醇(Sigma，St.Louis，MO)
2.4％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(EM Science，Gibbstown，NJ)
0.6％(体积/体积)  乙醇(Spectrum Chemical，Gardena，CA)
然后将此乳剂在装有双流体雾化器的Niro雾化器移动喷雾干燥器(Niro Atomizer，Copenhagen，Denmark)中进行喷雾干燥，采用了下述设定条件：
热空气流速             31CFM
入口空气温度           325℃
出口空气温度           120℃
雾化器空气流量         290升/分钟
乳液加料速率           1.5升/小时
干燥空心球形产物直径在约1～15μm之间，并按这种干燥器的标准收集于旋风分离器中。按实施例II，称取若干等分量的粉末(100mg)放入10ml的管状瓶中，并于13℃下用全氟己烷饱和了的氮气搅动，和密封。用5ml水再组装长颈瓶，再插入在18号针作为在注入水时释放压力的排放口。取剂量0.25mg/Kg的所得微气泡悬浮液，静脉注入约3Kg重的装戴测量仪的兔子中，按实施例II再监测其颈动脉的多普勒测速仪信号。注射后1分钟的信号为0.71伏，衰减常数0.010秒-1。注射后第一个60分钟时取血液动力学样。血小板计数未见可检测滴，也未见按实施例VI的可检测补体激活。
实施例VIII
再组成的冻干脂质体的体内效能
制备一种形成脂质体的溶液，其总类脂体浓度50mg/ml，采用氢化大豆卵磷脂(S PC-3，卵磷脂，Ludwigshafen，Germany)及联十六烷基磷酸酯(Sigma，St.Louis，MO)，摩尔比为9∶1。按照Szoka及Papahadjopoulos(在Proc.Nat.Acad.Sci 75 USA(1078)，4194中)的逆相蒸发法(Reverse-PhaseEvaporation Method)，将表面活性剂溶于120ml的乙醚/氯仿(体积比)1∶1的溶液中。加入40ml去离子水。此混合物在0～4℃下用3mm的探针声波发生器(50 W Vibra Cell，Sonics & Materials Nc.，Danbury CT)进行声波处理10分钟以形成乳液。在旋转蒸发器中于负压之下脱去溶剂，并于65℃通过1.0微米聚碳酸酯过滤器，构成一种脂质体的分散液，然后在10ml的超声长颈瓶中使1ml的脂质体溶液馏份与4ml的15％麦芽糖溶液(Sigma，St.Louis)混合，在-30℃下冷冻和冻干(FTS Systems，StoneRidge，NY)。给长颈瓶充入氮气或充入用全氟己烷在13℃下饱和了的氮气。用5ml水再组成冻干的粉末达到下述浓度：
12.0％(重量/体积)麦芽糖(Sigma，St.Louis，MO)
0.928％(重量/体积)氢化大豆卵磷脂SPC-3，(卵磷脂，Ludwigshafen，
                  Germany)
0.072％(重量/体积)联十六烷基磷酸酯(Sigma，St.Louis，MO)
将1ml的所得微气泡悬浮液静脉注射入约3Kg重装戴测量仪的兔子中，监测其劲动脉多普勒测速仪的超声信号。将10Mhz流量套(TritonTechnology Inc.，San Diego，CA；ES-10-20型)连接在系统6多普勒测速仪流量模块上(Triton Technology Inc.)，发送RF多普勒信号至LeCroy 9410示波器(LeCroy，Chestnut Ridge，NY)。示波器计算的信号的均方根伏特数被传送至计算机，和得到的曲线经拟合得到回声生成信号峰强度及血液中微气泡半保留期。对比前信号低于0.1RMS伏特。
对于充氮气或全氟己烷的含脂质体制剂，均未表明兔子标本中有明显的或持续的回声生成性。
实施例IX
全氟己烷初期对冷冻干燥脂质体制剂及喷雾干燥气乳液制剂超声效能的影响
按照实施例II制备下述乳液各1升用于喷雾干燥：
制剂A：蔗糖酯微气泡制剂
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt. St.Louis，MO)，
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积) 蔗糖酯11025003(Alliance Pharmaceutical Corp.，
                  San Diego.CA)
1.95％(重量/体积) Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
制剂B：磷脂微气泡制剂
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积) 二棕榈酰基磷脂酰胆碱(Genzyme Cambridge，
                  MA)
0.15％(重量/体积) Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
制剂C：冷冻干燥脂质体制剂
应用由Szoka及Papahadjopoulos所述的逆相蒸发法(REV)(见实施例VIII)，制备约40ml的脂质体分散液，内含氢化大豆卵磷脂及联十六磷酸酯(摩尔比9∶1)，在水中总脂质浓度50mg/ml。该制剂综述于下：干粉配方  注射再组成
                                  ％(重)  ％(重量/体积)
氢化大豆卵磷脂(Lipoid SPC-3，     7.14      0.928
Lipoid，Ludwigshafen，Germany)
联十六烷基磷酸酯                  0.55      0.072
(Sigma，St.Louis，MO)
麦芽糖(Sigma，St.Louis，MO)       92.3      12.0
注射用水                                    5.0ml
上述各制剂均制备两瓶：一瓶充以全氟己烷-氮气混合物；另一瓶仅含氮气。用5ml水再组成样品(共6瓶)，并用一脉冲多普勒测速仪信号增强兔标本评价效能。对兔子施用制剂A、B及C的药剂量分别为每公斤兔重5mg干粉。
60秒时对含非全氟己烷的制剂A、B、及C的回声生成信号分别为0.040、0.142、及0.005V；60秒时对它们各含全氟己烷制剂的回声生成信号为1.232、0.826及0V。总之，加有全氟己烷充气步骤的均未显著增加冻干脂质体制剂的超声效能(这里定义为60秒时回声生成信号)。然而，含全氟己烷喷雾各蔗糖酯微气泡及磷脂微气泡制剂的效能却增加分别为2980％及482％。因此，在本发明气乳剂与由冻干脂质体制得的微气泡制剂之间在结构及行为方面均存在着基本差异。
实施例X
Schneider等人在USP 5,380,519实施例4中描述的含水不溶磷脂的喷雾干燥分散液的效能
按Schneider等人的USP 5,380,519中实施例4所描述，用喷雾干燥下述乳液制备含部分磷脂及联十六烷基磷酸酯制剂。表面活性剂不是成层(被转化为脂质体)的如在Schneider实施例中那样。
用注射用水制备下述溶液备各1升，溶液1含淀粉和盐类，溶液2含表面活性剂。将溶液2加到高剪切混合器中并于冰浴中冷却。用1升溶液2配制1，1，2-三氯三氟乙烷(氟里昂113)的粗悬浮液。将此悬浮液用微流化器(Microfluidics Corporation，Newton，MA；M-110F型)在10,000psi及5℃下乳化5次。将所得的乳液加到溶液1中，得到下述进行喷雾干燥的配方物：
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.058％(重量/体积)联十六烷基磷酸酯(Sigma，St.Louis，MO)
0.742％(重量/体积)磷脂PC-3(Lipoid，Ludwigshafen，Germany)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
然后将此乳液在装有双流体雾化器的Niro雾化器移动喷雾干燥器(Niro Atomizer，Copenhagen，Denmark)中进行喷雾干燥，采用了下述设定条件：
热空气流速             31CFM
入口空气温度           325℃
出口空气温度           120℃
雾化器空气流量         290升/分钟
乳液加料速率           1.5升/小时
干燥空心球形产物直径在约1～15微米之间，并按对这种干燥器的标准收集于旋风分离器中。按实施例II，称取若干等分量的粉末(100mg)加到10ml的管状瓶中，并按上述实施例中的方法用仅有氮气或氮气加全氟己烷(PFH)搅动，和密封。
用5ml水再组装长颈瓶，再插入18号针作为在水注入时释放压力的排放口。按前述实施例的方法，将1ml的所得微气泡悬浮液静脉注射入约3Kg重装戴测量仪的兔子中，监测其劲动脉多普勒测速仪的超声信号。
观察有PFH和无PFH两种情况下的信号。含PFH的制剂60秒时产生信号0.08伏，200秒时信号0.02伏。仅有氮气的制剂60秒时信号为0.2伏，200秒时信号0.04伏。因为此配方不含较易水溶的表面活性剂，信号远远低于前面的实施例。然而，喷雾干燥方法确实使此非成层物态的表面活性剂混合物具有产生可检测信号，与Schneider等人的实施例4中的成层配方不同，如上述实施例VIII中所述。这种配方也不同于这种应用的其它实施例，在于添加全氟己烷使所得信号减弱而没有使之大大增强。
实施例XI
含非碳氟化合物的微气泡
以相同方法经喷雾干燥下述乳剂制备两种制剂(A：混合磷脂及B：磷脂+Poloxamer 188)。
用注射用水制备下述溶液各1升：溶液1含淀粉和盐类，溶液2含表面活性剂。将溶液2加到高剪切混合器中并于冰浴中冷却。用1升溶液2配制1，1，2-三氯三氟乙烷(氟里昂113)的粗悬浮液。将此悬浮液用微流化器(Microfluidics Corporation，Newton，MA；M-110F型)在10,000psi及5℃下乳化5次。将所得的乳剂加到溶液1中，得到下述进行喷雾干燥的配方物：
配方A(混合磷脂)：
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.22％(重量/体积) 二棕榈酰基磷脂酰胆碱(Genzyme Cambridge，
                  MA)
0.31％(重量/体积)，二辛酰基磷脂酰胆碱(Genzyme Cambridge，MA)
3.0％(体积/体积)  1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM Science，
                  Gibbstown，NJ)
配方B(磷脂+Poloxamer 188)：
3.6％(重量/体积)  m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)  氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)  磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积) 磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.15％(重量/体积) Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
0.45％(重量/体积)，磷脂PC-3(Lipoid，Ludwigshafen，Germany)
3.0％(体积/体积)1，1，2-三氯三氟乙烷(EM Science，Gibbstown，NJ)
然后将此乳剂在装有双流雾化器的Niro雾化器移动喷雾干燥器(NiroAtomizer，Copenhagen，Denmark)中进行喷雾干燥，采用了下述设定条件：
热空气流速        31CFM
入口空气温度      325℃
出口空气温度      120℃
雾化器空气流量    290升/分钟
乳液加料速率      1.5升/小时
干燥空心球形产物直径在约1～15微米之间，并按这种干燥器的标准收集于旋风分离器中。称取若干等分量的粉末(100mg)放入10ml的管状瓶中，并仅用氮气搅动，和密封。
用注射用水5ml再组装长颈瓶，再插入18号针作为在水注入时释放压力的排出口。将1毫升所得微气泡悬浮液静脉注射入约3Kg重的装载测量仪的兔子中，监测其颈动脉的多普勒测速仪(Doppler)信号。将10Mhz流量套(Triton Technology Inc.，San Diego，CA：ES-10-20型)连接在系统6多普勒测速仪流量模块上(Triton Technology Inc.)，发送RF多普勒信号至LeCroy 9410示波器(LeCroy，Chestnut Ridge，NY)。再将计算的示波器信号的均方根(RMS)伏特值传送至计算机，和将得到的曲线拟合得到回声生成信号峰强度及血液中微气泡半保留期。
用两种配方均观察到显著信号。配方A在60秒时产生0.25伏的信号，200秒时产生0.13伏的信号。配方B在60秒时产生0.3伏的信号，在200秒时产生0.2伏信号。非磷脂配方以同样方式处理时仅仅产生背景信号。
如上所述，这可能是由于水穿滤通过溶解的表面活性剂及结构剂后，首先接触球腔(0.5～10微米直径)内表面的结果，导致形成了着所需气泡尺寸(球腔尺寸)，和初期气泡四周被饱和表面活性剂溶液所包围，因此也就具有最佳最大充填表面活性剂的覆盖层，进而增强了对气体的截留。这样的气泡甚至用水溶性气体(如空气或氮气)充满时在体内就非常稳定。
实施例XII
磷脂酰基链长度对超声回声生成的影响
按照实施例II制备下述乳液个1升用于喷雾干燥：
配方A：二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱制剂：
3.6％(重量/体积)   m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)   氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)   磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积)  磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积)  二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(Genzyme Cambridge，
                   MA)
0.15％(重量/体积)  Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
3.0％(体积/体积)   1，1，2-三氯三氟乙烷(Freon 113；EM  Science，
                   Gibbstown，NJ)
配方B：二硬脂酰基磷脂酰胆碱制剂：
3.6％(重量/体积)   m-HES羟乙基淀粉(Ajinimoto，Tokyo，Japan)
3.0％(重量/体积)   氯化钠(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
2.6％(重量/体积)   磷酸钠，双碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.39％(重量/体积)  磷酸钠，单碱基(Mallinckrodt，St.Louis，MO)
0.45％(重量/体积)  二硬脂酰基磷脂酰胆碱(Genzyme Cambridge，
                   MA)
0.15％(重量/体积)  Poloxamer 188(BASF，Parsipany，NJ)
3.0％(体积/体积)   1，1，2-三氯三氟乙烷(EM Science，Gibbstown，NJ)
以5ml水再组成后，用脉冲多普勒测速仪信号增强兔标本按实施例II方法测定的回声生成信号与时间关系，评价两种制剂的效能。对兔给用药剂量为每公斤兔重给干剂粉5mg。
                                  时间(秒)
                   20   60  100  200  300  400  500  600配方A：回声生成信号(V)0.8  0.6  0.5  0.4  0.4  0.4  0.3  0.2配方B：回声生成信号(V)0.5  0.4  0.2  0.2  0.1  0.1  0.1  0.1
回声生成信号是时间的函数，含二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)制剂的平均大于含二硬脂酰基磷脂胆碱(DSPC)制剂的。DMPC的两个脂肪酸酯链含碳原子14个，而DSPC的两个脂肪酸酯链长为18个碳原子。两种磷脂化合物间的这种链长差异造成了液态晶相变温度不同的凝胶。在上述这样的相变温度下，烃链都处于熔融状态，而磷脂形成了液晶相。这样的相变温度在水中对于DSPC为55.5℃，而对DMPC为23.5℃。
因此，使用在注射后(兔体温＝约37.5℃)为液晶态的磷脂第一表面活性剂会有好处的。
实施例XIII
应用双室瓶生成微气泡
称取800mg的喷雾干燥粉末，置于20ml的Wheaton RS-177FLW双室瓶(见图1)的下室中。于13℃下用全氟己烷饱和过的氮气冲洗此瓶，而后插入内室密封。用10ml消毒注射用水充满上上室。再插入上室瓶塞以消除所有上室中的空气泡。下压上瓶塞时，迫使内室密封进入下室，使水流入下室并再组成该粉末(见图2)。用光学显微镜显示，有许多的微气泡生成。这种方法说明这样的装填形式方便，避免了在水相加入至粉末上时压力的增加，而免除了排出口。
实施例XIV
应用双室注射器生成微气泡
称取100mg的喷雾干燥粉末，加入到5ml+5ml HYPAK液/干双室注射器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中并摇荡入粉末室(针底端)。再将内室密封置于刚刚在旁通管之上。再于注射器上装上有5μm过滤器的针头。接着再通过真空室内的装备，抽真空及在13℃下往此室再充填气体渗透剂、全氟己烷饱和了的氮气，将气体渗透剂充入装有粉末的室内。过滤器注射针可以用于对装粉末室进行抽空和再充气。再将密封针套戴在针头上。往液室充填注入4ml注射用水，将柱塞塞上，用作暂时排出口(在玻璃注射器筒与柱塞之间插入金属丝以排出所有气泡)。
脱去针套，释放装粉室内积累的压力，进行再组成。然后下压柱塞，迫使内室密封进入到旁管位置，使水沿内室密封流进入装粉室。当所有的水流进装粉室内，即停止移动柱塞。摇动注射器使粉末溶解。再握住注射器、针头朝上，再下压柱塞，驱赶多余气体和任何大气泡。接着再往下压柱塞直到极限，驱赶含大量稳定的微气泡的溶液(以光学显微镜观察)。
以上说明详细列举了本发明某些优选实施方案，并描述了所考虑的最好模式。然而，需要理解的是，不管前述正文看起来是如何详细，本发明均可以任何方式实施和本发明都应当被认为是与所附各项权利要求以及与此相关的任何内容相一致的。

Claims (49)

1、一种形成气乳剂的方法，包括如下步骤：
提供一种容器，其内含有干燥、空心、粒状及近似微球形的材料，包括至少第一和第二表面活性剂、亲水单体或聚合物或其组合物，以及气体或气体混合物，所述的第一表面活性剂包括一种具有至少一个包含至少10碳原子酰基链的磷脂或磷脂混合物，和构成至少约5％(重)的总表面活性剂，所述的第二表面活性剂是比所述第一表面活性剂更易水溶的；
加入一种水成液至所述的容器中；
将该微球形材料基本上溶解于所述水成液中，从而在该容器中形成一种气乳剂，所述气乳剂包括四周被所述第一及第二表面活性剂层所包围的该气体或气体混合物的气泡。
2、按照权利要求1的方法，其中所述第二表面活性剂包括脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸或酸类的糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物、非离子烷基葡糖苷、聚山梨酸酯、或其组合物。
3、按照权利要求1的方法，其中所述的第二表面活性剂包括一种每个酰基链包含不多于14个碳原子的磷脂、磷脂混合物、磷酯胆碱、或溶血磷脂胆碱。
4、按照权利要求1的方法，其中所述的第一表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链且包含至少一个12～18碳原子链的磷脂酰胆碱，所述的第二表面活性剂包括具有一个或多个酰基链且至少一个6～12碳原子链的磷脂酰胆碱。
5、按照权利要求1的方法，其中所述的亲水单体或聚合物或其组合物包括淀粉或衍生淀粉。
6、按照权利要求1的方法，其中所述的气体或气体混合物包括一种碳氟化合物或碳氟化合物混合物。
7、按照权利要求1的方法，其中所述的气体或气体混合物包括一种与第二气体的混合的非碳氟化合物第一气体，所述的第二气体的蒸气压在37℃时低于760mm Hg。
8、按照权利要求7的方法，其中所述第一气体基本上是由氮或空气所组成，以及所述第二气体基本上是由全氟己烷组成。
9、一种形成气乳剂气体组合物的方法，包括如下步骤：
分散一种包含亲水单体或聚合物或其组合物的水溶液和第一及第二表面活性剂，其中所述第一表面活性剂基本上是由具有至少一个包含至少10碳原子酰基链的磷脂或磷脂混合物所组成，并构成至少约5％(重)的总表面活性剂量，所述的第二表面活性剂是比第一表面活性剂更易水溶的；以及
喷雾干燥所述分散体，以制得干燥、空心、粒状及近似微球形的材料，在它们与含水介质结合时，形成一种回声生成的气乳剂，其内包含有四周被所述第一及第二表面活性剂层所包围的许多气泡。
10、按照权利要求9的方法，还包括在容器中用气体或气体混合物封闭所述微球形材料的步骤，其中的气体或气体混合物包括一种碳氟化合物或碳氟化合物混合物。
11、按照权利要求9的方法，其中亲水单体或聚合物构成约为所述干燥微球材料的1～99％(重)，以及总表面活性剂构成约为所述干燥微球形材料的0.05～90％(重)。
12、按照权利要求9的方法，其中水成液分散体另外还包括一种发泡剂。
13、按照权利要求12的方法，其中所述的发泡剂包括一种选自氯仿、氟里昂113、全氟己烷及二氧化碳的物质。
14、按照权利要求9的方法，其中第二表面活性剂包括脂肪酸、脂肪酸的盐、脂肪酸或酸类的糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物、非离子烷基葡糖苷、聚山梨酸酯、或其组合物。
15、按照权利要求9的方法，其中第二表面活性剂包括一种每个酰基链上包含不多于14个碳原子的磷脂、磷脂的混合物、磷脂胆碱、或溶血磷脂。
16、按照权利要求9的方法，其中第一表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链、至少一个链具有12～18个碳原子的磷脂酰基胆碱，所述的第二表面活性剂包括具有一个或多个酰基链且至少有一个6～12碳原子链的磷脂酰胆碱。
17、按照权利要求9的方法，其中所述的亲水单体或聚合物或其组合包括淀粉或衍生淀粉。
18、按照权利要求10的方法，其中所述的气体或气体混合物包括一种与第二气体混合的非碳氟化合物第一气体，所述的第二气体的蒸气压在37℃时低于760mm Hg。
19、按照权利要求18的方法，其中所述第一气体基本上是由氮或空气所组成，以及所述第二气体基本上是由全氟己烷组成。
20、一种气乳剂形成组合物，包括：
一种容器；
一种在所述容器中的干燥、空心、粒状及近似微球形的材料，包括至少有第一和第二表面活性剂，及数量足够的亲水单体或聚合物或其组合物，以赋予所述微球形材料结构整体性；其中所述第一表面活性剂基本上是由具有至少一个包含至少10碳原子酰基链的磷脂或磷脂混合物所组成，以及构成至少约为总表面活性剂的5％(重)，其中所述的第二表面活性剂是比所述第一表面活性剂更易水溶的；以及
一种在所述容器中浸渍进入该微球材料中的气体或气体混合物。
21、按照权利要求20的组合物，其中所述第二表面活性剂包括脂肪酸、脂肪酸的盐、脂肪酸或酸类的糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物、非离子烷基葡糖苷、聚山梨酸酯、或其组合物。
22、按照权利要求20的组合物，其中第二表面活性剂包括一种在每个酰基链上包含不多于14个碳原子的磷脂、磷脂混合物、磷脂胆碱、或溶血磷脂。
23、按照权利要求20的组合物，其中第一表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链、至少一个链具有12～18碳原子的磷脂酰基胆碱，所述的第二表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链并至少有一个6～12碳原子链的磷脂酰胆碱。
24、按照权利要求20的组合物，其中所述的气体或气体混合物包括碳氟化合物或碳氟化合物混合物。
25、按照权利要求20的组合物，其中所述的气体或气体混合物包括一种与第二气体混合的非碳氟化合物第一气体，所述的第二气体的蒸气压在37℃时低于760mm Hg。
26、按照权利要求25的组合物，其中所述第一气体基本上是由氮或空气所组成，以及所述第二气体基本上是由全氟己烷组成。
27、按照权利要求20的组合物，其中所述的亲水单体或聚合物包括淀粉或衍生淀粉。
28、一种气乳剂超声对比介质，包括：
一种包含至少有4碳原子的碳氟化合物或碳氟化合物混合物气体或气体混合物的气泡，其四周被表面活性剂层所包围，此表面活性剂包括第一及第二表面活性剂，所述第一表面活性剂基本上是由具有至少一个酰基链并包含至少10碳原子的磷脂或磷脂混合物所组成，并构成至少约5％(重)的总表面活性剂量，其中所述的第二表面活性剂是比所述第一表面活性剂更易水溶的。
29、按照权利要求28的对比介质，其中所述第二表面活性剂包括脂肪酸、脂肪酸的盐、脂肪酸或酸类的糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物、非离子烷基葡糖苷、聚山梨酸酯、或其组合物。
30、按照权利要求28的对比介质，其中所述第二表面活性剂包括一种每个酰基链包含不多于14个碳原子的磷脂、磷脂混合物、磷脂胆碱、或溶血磷脂。
31、按照权利要求28的对比介质，其中所述第一表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链、至少一个链具有12～18碳原子的磷脂酰基胆碱，所述的第二表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链且至少有一个6～12碳原子链的磷脂酰基胆碱。
32、按照权利要求28的对比介质，其中所述的气体或气体混合物包括一种与第二气体混合的非碳氟化合物第一气体，所述的第二气体的蒸气压在37℃时低于760mm Hg。
33、按照权利要求32的对比介质，其中所述第一气体基本上是由氮或空气所组成，以及所述第二气体基本上是由全氟己烷组成。
34、一种气乳剂形成组合物，包括：
一种容器；
一种属于亲水单体或聚合物或其组合物的喷雾干燥的分散体，及第一和第二表面活性剂，其中所述第一表面活性剂基本上是由具有至少一个且包含至少10碳原子酰基链的磷脂或磷脂的混合物所组成，并构成至少约5％(重)总表面活性剂量，所述的第二表面活性剂是比第一表面活性剂更易水溶的，以及
一种在所述容器中浸渍进入所述喷雾干燥材料的气体或气体混合物。
35、按照权利要求34的组合物，其中所述第二表面活性剂包括脂肪酸、脂肪酸的盐、脂肪酸或酸类的糖酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物、非离子烷基葡糖苷、聚山梨酸酯、或其组合物。
36、按照权利要求34的组合物，其中所述第二表面活性剂包括一种每个酰基链包含不多于14个碳原子的磷脂、磷脂混合物、磷脂胆碱、或溶血磷脂。
37、按照权利要求34的组合物，其中所述第一表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链、至少一个链具有12～18碳原子的磷脂酰基胆碱，所述的第二表面活性剂包括一种具有一个或多个酰基链且至少有一个6～12碳原子链的磷脂酰胆碱。
38、按照权利要求34的组合物，其中所述的气体或气体混合物包括一种碳氟化合物或碳氟化合物的混合物。
39、按照权利要求34的组合物，其中所述气体或气体混合物包括一种与第二气体混合的非碳氟化合物第一气体，所述第二气体的蒸气压在37℃时低于760mm Hg。
40、按照权利要求39的组合物，其中所述第一气体基本上是由氮或空气所组成，所述第二气体基本上是由全氟己烷组成。
41、按照权利要求34的组合物，其中水成液分散体另外包括一种发泡剂。
42、按照权利要求41的组合物，其中所述发泡剂包括一种选自由氯仿、氟里昂113、全氟己烷及二氧化碳构成组合中的物质。
43、一种制备超声对比介质的方法，包括将权利要求34的组合物基本上溶解于一种水成液中，从而在所述容器中构成一种气乳剂，所述气乳剂包括含有所述气体或气体混合物的气泡，气泡四周被所述第一及第二表面活性剂层所包围。
44、一种制备超声对比介质的方法，包括将权利要求40的组合物基本上溶解于一种水成液中，从而在所述容器中构成了一种气乳剂，所述气乳剂包括含有所述氮气或空气及全氟己烷的气泡，气泡四周被所述第一及第二表面活性剂层所包围。
45、一种使目标物或身体成象的方法，包括如下步骤：
将权利要求20中的形成气乳剂组合物基本上溶解于一种水成液中，以产生一种气乳剂；
将所述气乳剂引入至所述目标物或身体内；以及
对至少部分所述目标物或身体进行超声成象。
46、一种使目标物或身体成象的方法，包括如下步骤：
将权利要求28的超声对比介质引入至所述目标物或身体中；以及
对至少部分所述目标物或身体进行超声成象。
47、一种使目标物或身体成象的方法，包括如下步骤：
将权利要求33的超声对比介质引入至所述目标物或身体中；以及
对至少部分所述目标物或身体进行超声成象。
48、一种使目标物或身体成象的方法，包括如下步骤：
基本上将权利要求34中的形成气乳剂组合物溶解于一种水成液中，以产生一种气乳剂；
将所述气乳剂引入至所述目标物或身体内；以及
对至少部分所述目标物或身体进行超声成象。
49、一种使目标物或身体成象的方法，包括如下步骤：
将权利要求44的超声对比介质引入至所述目标物或身体中；以及
对至少部分所述目标物或身体进行超声成象。
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