CZ140999A3

CZ140999A3 - Směsný prostředek pro použití jako kontrastní činidlo

Info

Publication number: CZ140999A3
Application number: CZ991409A
Authority: CZ
Inventors: Jonny Ostensen; Morten Eriksen; Sigmund Frigstad; Pal Rongved
Original assignee: Nycomed Imaging As
Priority date: 1996-10-21
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 1999-09-15
Also published as: US6375931B2; DE69721331D1; DE69721331T2; RU2204415C2; CA2269319C; BR9712370A; SK283210B6; AP9901511A0; AP885A; WO1998017324A3; EP1007100A2; WO1998017324A2; EP1264604A3; TR199901544T2; ATE238073T1; ES2197336T3; CA2269319A1; NO991869D0; EE03749B1; US20050118104A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká směsného prostředku pro použití jako kontrastní činidlo' pří zobrazování ultrazvukem, zejména při perfusi tkání.

Dosavadní stavtechniky

Je dobře známo, že kontrastní činidla, tvořená disperzí mikřobublinek plynu jsou zvláště účinné, pokud jde o zobrazování ultrazvukem vzhledem k malé hustotě a snadné stlačitelnosti mikřobublinek. Takové disperze mikřobublinek při příslušné stabilizaci mohou umožnit velmi kvalitní zobrazení pomocí ultrazvuku, například v případě cévního systému, a to obvykle při nízkých dávkách.

Použití ultrazvukového zobrazení při měření prokrvení tkání, to znamená průtoku krve na jednotku hmoty tkáně je cenné například při detekci nádorů vzhledem k tomu, že nádorová tkáň má typicky cévní zásobení odlišné od zdravých tkání a také při sledování srdečního svalu, například pro zjištění infarktu. Problémem, spojeným s použitím známých kontrastních látek pro sledování prokrvené srdečního svalu je skutečnost, že informace, získaná obsahem obrazu je degradována snížením kontrastu, způsobeným přítomností kontrastního činidla v srdečních komorách.

Vynález je založen na zjištění, že při zobrazování ultrazvukem, zejména v případě srdečního svalu a dalších tkání je mošno dosáhnout podstatného zlepšení při použití kontrastních prostředků s obsahem plynu, které vyvolávají zvětšení ·

ΣΤ · · · * ··♦ * ··:

««···· · · · _β φ

- 2 obsahu tohoto plynu po určitou dobu po podání in vivo. Je například možno použít takové kontrastní prostředky k vyvolání kontrolovatelné a dočasné retence plynné fáze například ve formě mikrobublinek v malých cévách tkání a tím zvýšit koncentreci plynu v takové tkáni a současně zvýšit kontrast této tkáně.

Je zřejmé, že takové použití plynu ve formě dočasně uloženého prostředku pro zjištění prokrvení se význačně liší od” existujících návrhů·, podie-nichž se ,nitrožilně podává kon t ras tn í ' látka p’řd z'obr azOvání - u-l-t-r a zvukem.. ve. formě, mikro bublinek. V těchto případech se považuje za nutné vyvarovat se zvětšování bublinek vzhledem k tomu, že v případě, že tento růst není řízen, může potenciálně vést k embolizaci tkání. Může pak být nezbytné omezit podávanou dávku a/nebo použít plynné směsi s takovým složením, aby nebezpečí zvětšování bublinek in vivo bylo co nejmenší inhibici difúze krevních plynů do mikrobublinek, tak jak bylo popsáno například v mezinárodních přihláškách WO 95/03835 a WO 95/16467.

Vynález navrhuje prostředek, tvořený dispergovanou plynnou fází, podávaný současně s prostředkem, obsahujícím nejméně jednu látku, která obsahuje nebo je schopná vytvořit in vivo plyn nebo páru s dostatečným tlakem pro vyvolávání řízeného růstu dispergované plynné fáze difúzí molekul plynu nebo páry z uvedeného prostředku do této fáze, tato fáze bude dále pro jednoduchost označována jako složka, schopná difúze, přestože je zřejmé, že je možno využít i jiný. transportní mechanismus, jak bude dále podrobněji uvedeno.

Toto společné podávání prostředku s obsahem dispergované fáze a prostředku, obsahujícího složku, schopnou difúze s příslušným stupněm těkavosti může kontrastovat s dříve uváděnými návrhy pro podávání těkavých látek jako takových, • ·

- 3 například ve formě koloidl s posunem fáze, tak jak byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 94/16739. Vynález si klade za úkol navrhnout možnost řízení některých faktorů, jako jsou * pravděpodobnost a/nebo rychlost růstu dispergované fáze svolením příslušných složek současně podávaného prostředku, jak * bude dále podrobněji uvedeno, kdežto při podávání koloidů s posunem fáze jako takových, může dojít ke vzniku mikrobublinek s neřízeným a nerovnoměrným růstem, někdy v takovém rozsahu, že alespoň část mikrobublinek může představovat potenciální nebezpečí embolizace například v srdečním svalu nebo mozku, jak je popsáno V publikaci- Schwarz.., ..Advances i_n Echo-Contrast, 1994 (3), 48 až 49.

Bylo rovněž zjištěno, že podávání koloidů s posunem fáze jako takových nemusí vést in vivo k vytvoření dispergované fáze mikrobublinek s obsahem plynu nebo par, jak je popsáno v publikaci Grayburn a další, J. Am. Coli. Cardiol., (5), 1955, 1340 až 1347, V této publikaci se také uvádí, že může být nezbytná předběžná aktivace emulzí perfluorpentanu k dosažení kontrastnosti srdečního svalu u psů při nízkých dávkách, při nichž ještě nedochází k hemodynamickým vedlejším účinkům. Aktivační postup pro takové kolodiní disperze včetně použití podtlaku je popsán v mezinárodní přihlášce WO 96/40282. Postupuje se tak, že se injekční stříkačka částečně naplní emulzí a pak se opakovaně stlačí a uvolní píst stříkačky k vyvolání tlakových změn, které vedou k vytvoření mikrobublinek plynu v emulzi. Jde však o postup, který němusí vést k reprodukovatelné aktivaci.

V US 5 536 489 se uvádí, že je možno použít emulze ve vodě nerozpustných chemických látek, vytvářejících plyn, například perfluorpentan jako kontrastní látky pro zobrazení specifických částí organismu, přičemž emulse vytváří mikrobublinky plynu, zvyšujících kontrast obrazu až při působení ultrazvuku na specifické zobrazované místo v organismu. Dalšími • 9

9 ·* ««· • · ·· ·* · ·

9 · · »··« výzkumy však bylo prokázáno, že emulze těkavých sloučenin, například 2-methylbutanu nebo perfluorpentanu neposkytovaly prokazatelné zvýšení kontrastu obrazu při zobrazování ultrazvukem in vivo ani in vitro při použití energetické úrovně, která je dostatečná pro získání kontrastního obrazu v případě použití směsného prostředku podle vynálezu.

Podstata vynálezu ze se

i) ii) iii) _________Podstatu_vynálezu tvoří směsný prostředek se složkami',' vhodnými pro současné, oddělené nebo následné použití jako kontrastní Činidlo při zobrazování ultrazvukem, prostředek je tvořen ij injekčním vodným prostředím, v němž je dispergován plyn, ii) prostředkem, obsahující složku, schopnou difúze in vivo do dispergovaného plynu za alespoň přechodného zvětšeníjeho objemu.

Prostředek je možno použít k získání kontrastnějších obrazů lidského nebo živočišného organismu. Postupuje se tak, do cévního systému injekčně podá fyziologicky přijatelné vodné prostředí s obsahem dispergovaného plynu, před injekcí, v jejím průběhu nebo po ní se podá prostředek, obsahující složku, schopnou difúze in vivo do uvedeného dispergovaného plynu za alespoň přechodného zvětšení jeho objemu a vytvoří se obraz alespoň části organismu při použití ultrazvuku.

Uvedeným způsobem je možno zjistit prokrvení tkání, přičemž vzestupu objemu dispergovaného plynu se užije k • · • · • · *

- 5 obohacení nebo dočasné retence plynu v malých cévách těchto tkání, čímž současně dojde ke zvýšení echogenity.

* V disperzi plynu může být použit jakýkoliv biologicky kompatibilní plyn, pod pojmem plyn se tedy rozumí jakákoliv » látka včetně'směsí látek, nacházejících se alespoň Částečně, to znamená z části nebo úplně v plynné formě včetně par při i normální teplotě lidského organismu 37 °C. Plyn může tedy například, obsahovat vzduch, dusík, kyslík,,oxid uhličitý,

---------^_vo.dík.,._.inertní plyn, jako helium, ‘ argon,“xěnon'^i: nebo krypton,-=- fluoridy síry, jako hexafluorid nebo dekafΓύοηΤάrTe'bo“~penta---fluorid trifluormethylsíry, fluorid selenový a popřípadě halogenované silany, jako methylsilan nebo dimethylsilan, uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností, například až do ' atomů uhlíku,, například alkany, jako methan, ethan, propan, butan nebo pentan, cykloalkany, jako cyklopropan, cyklobutan, nebo cyklopentan, alkeny, jako ethylen, propen, propadierí nebo buten nebo alkiny, jako acetylen nebo propin, ethery, jako dimethylether, ketony, estery, halogenované uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností například až do 7 atomů uhlíku nebo směsi kterýchkoliv z uvedených složek. S výhodou se v případě halogenovaných plynů užije jako atomů halogenu- ale- i spoň z Části atomu fluoru. Tyto biokompatibilňí uhlovodíky je možno volit například ze skupiny bromchlordifluormethan', chlordisfluormethan, dichlordifluormethan, bromťrifluormethan, chlortrifluormethan, chlorpentafluorethan, dichlortetrafluorethan, chlortrifluorethylen, fluorethylen, ethylfluorid,

1,1-difluorethan a perfluorované uhlovodíky, Z perfluorovaných uhlovodíků je možno uvést například perfluoralkany, jako perfluormethan, perfluorethan, .perfluorprópany , · perfluorbutany, jako perfluor-n-butan, popřípadě ve směsi s dalšími isomery, například s perfluorisobutanem', perfluorpentany, perfluorhexany nebo perfluorheptaný, perfluoralkeny, jako perfluorpropen, perfluorbuteny, jako perfluorbut-2-en, perfluorbutadien, perfluorpenteny, jako pefluorpent• « *

* « ·

- 6 -1-en nebo perfluor-4-methylpent-2-en, perfluoralkiny, jako perfluorbut-2-in a perfluorcykloalkany, jako perfluorcyklobutan, perfluormethylcyklobutan, perfluordimethylcyklobutany, perfluortrimethylcyklobutany, perfluorcyklopentan, perfluormethylcyklopentan, perfluordimethylcyklopentany, per* fluorcyklohexan, perfluormethylcyklohexan nebo perfluorcykloheptan. Další halogenované plyny zahrnují methylchlorid, fluorované a perfluorované ketony, například perfluoraceton .-.w=·a .fluorované, například perfluorované ethery, jako perfluor- , ---------.-^di.e.thy.le_the_r_._Xouži_tí perfluorovaných plynů, například flUdridu sírového a perfluorovaných uhlovodíků, jako perfluorpropanu, perfluorbutanů, perfluorpentanů a perfluorhexanů může být zvláště výhodné vzhledem ke známé stálosti mikrobublinek s obsahem· těchto plynů v krevním proudu. Použity mohou být také další plyny, které mají fyzikálně-chemické· vlastnosti, dovolující tvorbu vysoce stálých mikrobublinek v krevním proudu.

Dispergovaný plyn může být podán v- jakékoliv vhodné formě, například při použití jakéhokoliv vhodného kontrastního prostředku pro zobrazování ultrazvukem s obsahem plynu.

Jako příklad takových prostředků je možno uvést mikrobublinky plynu, stabilizované, například alespoň z Části zapouzdřené membránou, odolnou proti spojování bublinek, například z želatiny podle WO 80/02365, bílkoviny, vytvářející plyn, například albuminu, jako lidského sérového albuminu, membrány tohoto typu byly popsány například v US 4 718 433,, . US 4 774 958, US· 4 844 882, EP' 359 246, WO 91/12823, WO 92/05806, WO 92/17213, WO 94/06477 nebo W0 95/01187. Dále je možno použít polymerní materiály, například syntetický biologicky degradovatelný polymer podle EP 398 935, elastickou membránu se syntetického polymeru podle EP 458 745, biologicky degradovatelný polyaldehyd ve formě mikročástic podle EP 441 468, derivát N-dikarboxylové kyseliny a polyaminokyseliny • ♦

- 7 • 4 * • · 4 • 4 ♦ ·* «444 « «44

4 4 444

4 4 ·1

4 «4 44

4 nebo polycyklického imidu ve formě mikročástic podle EP 458 079, biologicky degradovatelný polymer,, popsaný ve WO 96/07434 nebo WO 93/17718, nep'olymerní a nepolymerovatelný materiál, vytvářející stěny bublinek, například podle. WO 95/21631 nebo může jít o membrány ze smáčedla, například typu sledového kopolymeru polyoxyethylenu a polyoxypropylenu, jako je Pluronic, polymerní smáčedla podle WO 95/06518 nebo smáčedla, vytvářející filmy, jako fosfolipidy, popsané například ve WO 92/11873, WO 92/17212, WO 92/22247, WO 94/28780,' WO 95/03835° nebo WO '97/29783.·

Dalšími použitelnými prostředky typu kontrastních Činidel s obsahem plynu mohou být.pevné systémy, obsahující plyn, například mikročástice, zvláště shluky mikročástic s obsahem plynu nebo může být plyn obsažen spojením s těmito částicemi, například adsorpcí na jejich povrchu a/nebo v dutinách nebo pórech těchto látek, prostředky tohoto typu byly popsány například v EP 122 624,. EP 123'235, .EP 365 457, WO 92/21382, WO 93/0.0930, WO 93/13802, WO 93/13808 nebo WO 93/13809. Je zřejmé, že echogenita takových kontrastních prostředků s obsahem mikročástic může být odvozena přímo od obsaženého plynu a/nebo od plynu, uvolněného z pevného materiálu například ve formě mikrobublinek, například po roz- . puštění mikročástic.

Mikrobublinky plynu a další materiály, obsahující plyn, například mikročástice, mají s výhodou počáteční střední průměr nepřevyšující 10 mikrometrů, například 7 mikrometrů nebo nižší tak,.aby mohly projít po podání například nitrožilní injekcí plicriím systémem. Větší mikrobublinky je možno použít v případě, žé tyto mikrobublinky obsahují ve směsi plyny, poměrně rozpustné v krvi nebo schopné difúze, jako vzduch, kyslík, dusík nebo oxid uhličitý spolu s v podstatě nerozpustnými a difúze neschopnými plyny, jako jsou perfluorované uhlovodíky. Difúze rozpustné nebo difúze schopné • to · ♦ ·· ·<· • ttoto · · * toto toto·· • · · to * · · • to · to to · • to ···* to· * části plynu vyvolá po podání rychlé zmenšení mikrobublinek na průměr, který bude určen množstvím nerozpustného nebo difúze neschopného plynu, toto množství je možno volit tak, aby výsledné mikrobublinky mohly projít plicními kapilárami.

Vzhledem k tomu, že dispergovaný plyn podle vynálezu in vivo zvětšuje svůj objem interakcí s difúze schopnými složkami, může být nejmenší průměr mikrobublinek při podání nižší než průměr, který se obvykle považuje za potřebný k dosaženi' interakce $-^T-'ul trazvukem ,= což -je typicky _T. 1_ až5,jnik-_.

romeťrů^- prf“5ežně Užívaných—frekvene-í-ch-.—BublInky, .di.sp.ergo-_____ váného plynu' tedy mohou mít průměr například 1 nm nebo ještě nižší. Podle vynálezu je tedy možno využít prostředky s obsahem plynu, které až dosud nebyly navrhovány pro použití při. zobrazování ultrazvukem vzhledem k malému rozměru částic dispergovaného' plynu.

V případě, že se podle vynálezu užívají prostředky s obsahem fosfolipidů, například ve formě mikrobublinek plynu, stabilizovaných fosfolipidem, je jako příklady použitelných fosfolipidů možno uvést lecithiny, například fosf atidylcho-· · líny, jako přírodní lecithiny, například lecithin z vaječného žloutku nebo ze sojových bobů, polosyntetické lecithiny, například částečně nebo plně hydrogenované a také syntetické lecithiny, jako dimyristoyrfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatídylcholin nebo distearoylfosfatidylcholin, fosftatidové kyseliny, fosfatidylethanolaminy, fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, kardiolipiny, sfingomyeliny, fluorované analogy kterékoliv z uvedených látek, jejich směsi a směsi s jinými lipidy, například cholesterolem.· Zvláště výhodné může být použití fosfolipidů, které převážně, například nejméně ze 75 % obsahují molekuly, nesoucí náboj, například negativní náboj, jako přírodně se vyskytující lecithiny, odvozené například ze sojových bobů.

ι> η Tj » <Ε ft ftftC flf.C * 0} n n n Γ» «ί * (? ο

ÍKB .1 •i/ ti

Λ;

• /r

- 9 Λ «1 nebo- vaječného· žloutku, pološyntetické · lecithiny, například Částečně' nebo' plně hydrogenované a⁺táké syntetické fosfatidylseriný, fóšfatidylglycéroly, 'fosfatidylinósitoly, fosfát idové kyseliny a/nebo kárdiolipiny, tak jak-byly popsány' 'například ve WO 97/29783.- ’ · u·' 'M ' / •’,u ' Jako příklad'materiálu· ve formě mikročástic s' obsahem ' plynu' pro ^použití 'podlé-vynálezu -je''-možno-uvést' uhlohydráty, 'i,s *ί například hexosy ' jako jsou· glukosa/ 'fruktosá nebo galákto_sa, disacharidý, /jako * jsou'sáchářosa*/ 1'ák'ťósá nebo maltosa, ₂ ' j. ·ψ.ζ , 7 Z— ¹ i- , ». .. yi . ' pentosy,- jako jsou 'érábinósa, -xylosa nebo · ribosa, alfa-', beta- a 'gamma-cýklodex’třiny, ^Tp'olysacharidy, například škrob, hydroxyethylováný derivát škrobu,'amylosa, .amylopektin, glykogen, inulin, pulullan, dextran, karboxymethyldextrah, dextranfósfát,· keťodextran, -aminóethyldexťran, 'alginátý, chitin, 'chitosan·, . kyselina hyaluronová· nebo'heparin a také alkoholy, odvozené od' cukru·, například· alditoly, jako' mannítol nebo sorbitol, ártořg'áhické soli, jako· chlorid sodný/ organióké .soli', jako citronan'-sodný, óctan áodňý nebo^Ýinan“ sodný, kontrastní prostředky pro zobrazování pomocí rtg-záření, může- jít· například o^; běžně·*dodávané·'•kontrastní· prostředky's' obsahem karboxylové kyseliny a neiontovéhčr amidu/ typický š obsahem· nejméně¹¹ jedné 2,4-,6-tri jodfěnylóvé*'skupiný s* •různými substituenty < jako· jsou karbokylová', - karbáínoylová, N-alkýlkarbámoýlová nebo Nlhydroxyalkylkárbamóylová'Skupína·, aoylaminoškupina,, N-aíkyTacýlamihoškupiná nébo acyl^ * ’ aminomethýl v poloze 3 a/ríebo '5/ může tedy jít o^; kyselinu¹metrizoovou, diatriozovou’/ iothalamovou, ioxaglovou,· iohexol, iopentol, íopám-idol, io‘dixahol·, ioprdmid/ metrizamid/ lodi- . pamidj megluminiódipamid,'megluminacetrizoat a meglumindia,f * trizoát·, mimoto je-mbžno použít táké polypeptidy a bílkoviny, například želatinu neboarginin, jako lidský sérový albumin.

ϊ ^: : : * '·····:

*· **·· »» · ♦ « #β

- 10 Další materiály s obsahem plynu, použitelné podle vynálezu zahrnujímateriály, stabilizované kovy a popsané například v US 3 674 461 nebo US 3 528 809, materiály s obsahem plynů, stabilizované syntetickými polymery a popsané například v US 3 975 194 nebo v publikaci Farnand, Powder Technology, 22, 1979, 11 až 16, běžně dodávané mikrokulicky typu Expancel , jako Expancel 551 DE, popsaný například v publikací Eur. Plast. Wews, 9(5), 1982, str. 39, Nonwovens Industry

1981, str. 21 a Mat. Plast. Elast, 10, 1980, str. 468. Běžně R 'dodávané mikrokulicky typu Ropaaue , popsané například v publikaci J. Coatings Technol., 55(707), 1983, str. 79, mikroa nanostruktury s obsahem plynu, jako jsou zeolity, anorganické nebo organické aerogely, chemické nanostruktury s dutinami, jako fullereny, clathráty a podobně, popsané například v publikaci G. E. Gadd·, Science, 277, ('5328), 1997,

933 až 936 a také přírodní disperze mikrobublinek, stabilizované smáčedlem a pospané například v publikaci ďArrígo,

Stable Gas-in-Liquid Emulsions, Studies in physical and theoretical chemistry, 40, Elsevier, Amsterdam^ 1986.

V souvislosti s vynálezem je možno použít širokou škálu složek, schopných difúze včetně plynů a par, těkavých kapalin, těkavých pevných látek a prekursorů, z nichž se může uvolnit plyn například ,po jejich podání, přičemž základním požadavkem je, aby složka obsahovala nebo byla schopná uvolnit in vivo dostatečné množství plynu nebo par pod dostatečným tlakem, například nejméně' 1,3 kPa tak, aby mohlo dojít k difúzi molekul plynu nebo par do dispergovaného plynu. Je zřejmé, že v případě potřeby je možno použít směs dvou nebo většího počtu složek, schopných difúze. Pojem složka, Schopná difúze tedy zahrnuje i tyto směsi. Rovněž údaje,' týkající se podání takové složky zahrnují i podání svrchu uvedenýc směsí takových složek.

4 • 000

0

000 • 0 ·· 00·«

- 11 Prostředek s obsahem složky, schopné difúze může být zpracován na příslušnou formu a podán příslušným způsobem, přičemž způsob podání z části závisí na části organismu, která má být zobrazena. Například perorální podání složky s obsahem plynu, schopného difúze je možno použít v případě, že se požaduje dočasné zadržení plynu ve stěnách zažívací soustavy. Dalším- možným způsobem podání je nitrožilní podání v dávkách, podobných těm, které se běžně užívají při zobrazování ultrazvukem, prostředek může být také zpracován na emulzi^;vhodnou pro .perorální podání, například 'emuTzí^- perfiuo ro váného-vihl.o-vo.dík.u_ve._yod_e jak_ bude dále podrobněji popsáno, například určené pro použití v dávce 0,2 až 1,0 mikrolitrů perfluorovaného uhlovodíku/kg. Po podání a distribuci obou prostředků může růst částic dispergovaného plynu v krevních kapilárách stěny žaludku a střev zvýraznit obraz, získaný z těchto oblastí. Je zřejmé, že je možno použít i obrácenou kombinaci perorálně podaného dispergovaného plynu a nitrožilně podané složky, schopné difúze k získání kontrastního obrysu vnitřní stěny sliznice Zažívací soustavy.

Při použití perorálně podané disperze plynu nebo složky, schopné difúze, může být výhodné zařadit chemické skupiny nebo látky, která podporuje přilnutí ke stěně zažívací soustavy, například spojením s některou se složek této stěny, může jít například o smáčedlo nebo jinou stabilizační skupinu, která může podporovat růst dispergované plynné fáze podporou styku této fáze se složkou, schopnou difúze. Příklady takových skupin nebo látek, podporujících adhesi již byly uvedeny dříve například v případě, kontrastních látek pro zobrazování zažívací soustavy pomocí rtg-záření, jde například o estery kyseliny akrylové, popsané ve WO 97/22365, jodfenolsulfónátové estery podle US 5 468 466 a jodované fenylestery podle US 5 260 049.

• m ·' »Γ· Γ,· V Τ, :Π?.'.·ΤψΓ»· ti ú»tj ·-·* '

CfC CCC]'''' X’

- 12 r * r c» £ ft · ’ flr f· • · ť ť <?

ft- ® . c t oo ^¢^¢, ct

ΟInhalaci.vhodné těkavé složky schopné difúze je možno užít například při podání disperze plynu bezprostředně po průchodu plícními'kapilárami, například tak;· aby pak byl plyn dočasně zadržen.v kapilárách srdečního svalu. V provedeních tohoto typu -je^!.možno růst Částic dispéřgovahéhouply·nu'dále. zvětšiť^zvýsením tlaku' složky, svhopné difúze v plicích, například na hodnotu vyšší než 0,05 MPa, například použitím respiračního přístroje nebo'ták,* že sevyšetřovaná osoba * nechá dýchat proti odporu.' - ' ' '

V případě; .že’ je žádoucí SpéclTičký ome~zi⁷t~úČTne-k— — složky', 'schopné-difúze na'-uřči-toú¹ cílovou oblast- v organismu, může být výhodné použít nitrosvalovou nebo»podkožní injekci příslušně' zpracované- složky, schopné difuze,^:napříkladpoužitím fyziologicky přijatelného kapalnéhonosiče. Jako / příklad prostředku · pro podání podkožní .injekcí je možno * ' uvést prostředek Ve formě nanočástic, tak jak je* užíván'pro lymfanagiografii .-,'P'odkožně vstřiknutá složka· schopná¹ difúze se může dostat- do‘ lýmfatického systému, kde- může· vyvolat⁷' růst ί h* ,k j 4 částic' nitrožilně -podaného dispergovaného^: plynu a-' tak,·- usnad^ nit zobrazení lymfatických uzlin·.''Obdobným¹ způsobem je⁷¹¹ mošno využít také obrácené'podání, kombinace tak, že se podkožně podá disperze plynu a nitrožilně se podá složka schopná di.'I fúze .

Nitrožilhí podání příslušně: zpracovaného prostředku s obsahem složky, schopné, difúze,' například při použití» fyziologicky přijatelného'kapalného nosiče dovoluje nejrůznější kombinace podmínek při realizaci vynálezu, jak bude dále podrobněji uvedeno.· Složky disperze plynu a prostředku s obsahem látky schopné difúze je· možno volit tak, aby bylo možno»řídit začátek a míru růstu částic dispergovaného plynu a také vblit-část organismu, jehož kontury mají být zvýrazněny dočasným zadržením plynů;· například v ka- pilářních cévách.

- 13 • 9 9 *99

9· · *

* 9 · 9

999 999

Prostředky pro místní podání je možno nanášet na pokožku k vyvolání vstřebávání složky, schopné difúze pokožkou. Tento způsob podání je možno použít při zobrazování a/nebo léčení pokožky, podkožní tkáně a přilehlých oblastí a orgánů, například při sledování periferního oběhu v končetinách, například v dolních končetinách.

Složky, schopné difúze mohou být pro perorální nebo injekční podání zpracovány například na roztoky nebo směsi s vodou a/nebo nejméně jedním s vodou mísitelným a fyziologicky přijatelným organickým rozpouštědlem, jako je ethanol, glycerol nebo polyethylenglykol, dále může jít o disperze ve vodném prostředí, například ve formě olejové fáze nebo složky olejové fáze v emulzi typu olej ve vodě, o mikroemulse, to znamená systémy, v nichž je látka rozpuštěná'v hydrofobním vnitřním prostoru mycel smáčedla ve vodném prostředí nebo je možno použít spojení s mikročásticemi nebo nanočásticemi, dispergovanými ve vhodném nosném kapalném prostředí, je například možno adsorbovat tuto složku na povrchy mikročástic nebo nanočástic a/nebo uložit do jejich dutin nebo pórů nebo zapouzdřit do vnitřního prostoru mikročástic nebo nanočástic.

V případě, že má být Složka schopná difúze podána- ve formě roztoku, bude záviset parciální tlak této složky in vivo na koncentraci uvedené složky například v krevním proudu a na odpovídajícím tlaku čistého materiálu složky, například podle Raoultova zákona v systému, který, se blíží ideálním podmínkám. V případě, že složka má nízkou rozpustnost ve vodě·, je žádoucí, aby mela dostatečně vysoký tlak par v čisté formě při běžné teplotě organismu, například nejméně 0,66 kPa, s výhodou nejméně 1,3 kPa. Příkladem složek, které jsou ve vodě poměrně nerozpustné,, avšak mají vysoký tlak par, mohou být svrchu uvedené plyny, vhodné pro mikrobublinky.

•·· «·· • ♦ ·* ···*

- 14 Jako příklady ve vodě vysoce rozpustné nebo s vodou mísitelné složky, schopné difúze, která proto může mít nižší tlak par při teplotě organismu lze uvést alifatické ethery, jako ethylmethylether nebo methylpropylether, alifatické estery, jako methylacetát, methylmravenčan nebo ethylmravenSan, alifatické ketony, jako aceton, alifatické amidy, jako Ν,Ν-dimethylformamid nebo Ν,Ν-dimethylacetamid a alifatické nitrily, jako acetonitril.

-;= V některých případech však může být výhodné použít s vodou- -v-podstatě..němísitelnou_ složku, schopnou difúze a zpracovatelnou na emulzi, to znamená na stabilizovanou suspenzí v příslušném vodném prostředí vzhledem k tomu, Že v takových systémech bude tlak par složky, schopné difúze ve vodné fázi v podstatě rovný tlaku čisté složky, a to i ve' velmi zředěných emulzích. V takových provedeních je možno složku, schopnou difúze zpracovat například jako část běžné farmaceutické emulze, jakou je například Intralipid (Pharmacia).

Složka, schopná difúze je v emulzích tohoto typu s výhodou kapalná při teplotě zpracování a skladování, může při tom jít o nízkou teplotu, například -10 °C v případě, že vodná fáze obsahuje příslušné látky, chránící, proti zmrznutí. Při teplotě organismu se pak složka, schopná difúze, nachází ve formě plynu nebo splňuje požadavky na požadovaný tlak par. Příslušné sloučeniny je možno volitnapříklad se seznamů emulgovatelných kapalin s nízkou teplotou tání, tak jak jsou uvedeny ve svrchu zmíněné přihlášce WO 94/16379. Jako specifické příklady emulgovatelných složek schopných difúze lze uvést alifatické ethery jako diethyletherpolycyklické oleje nebo alkoholy, jako mentol, kafr nebo eukalyptol, heterocyklické látky, .jako furan nebo dioxan, alifatické uhlovodíky s přímým nebo rozvětveným řetězcem, nasycené i nenasycené, jako n-butan, n-pentan, 2-methylpropan, 2-methylbutan, 2,2-dimethylpropan, 2,2-dimethylbutan, 2,3-dimethylbutan, 1-buten, <ť <!< C ίΐ?/' fc- ' PM OiJfll· <11 Ď¹ pc í> «.

- 15 ft β. β# β.·. < C υ <7 C C C ¢: C (»£ flóre, c <ϊ

2-buten, 2-methylpropen, 1,2-butadien, 1,3-butadien, 2-methyl-1-buten, 2-methyl-2-buten, isopren, 1-penten,'1,3-pentadien, .·» * ) * ,

1,4-pentadien, butenyn, 1-butin, 2-buti'ň nebo 1,3-butadiin, ' ' , ¹ J 9 cykloalifatické uhlovodíky, jako cyklobutan, cyklobuten, methylcyklopropan nebo cyklopentan a halogenované uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností, například s obsahem až * ' ' .T-JÍ, . r _r ' _r ' za atomů uhlíku. Jako příklady halogenovaných uhlovodíků lze «* , : ‘ · ' ¹ . ‘V i, uvést dichlormethan, methylbromid, 1,2-dichlorethýlen, 1,1' . ¹ > . .λ ’ ' V β *

-dichlorethan, l-bromethylen, 1-chlorethylen,’ethylbromid, ethylchlorid, 1-chlorpropen, 3-chiorpropen, 1-chlorpropan,

2-chlorpropan a terč·.butylchloridT“S^_výhodou—j-sou-a-tomy— ha--, logenu alespoň z části atomy fluoru a jde tedy o dichlorfluorL. . i methan, trichlorfluormethan, 1,2-dichlor-l,2-difluorethan, i · * ' ' J . í* J. ' * *'

1,2-dichlor-l,1,2,2-tetrafluorethán, 1,1,2-trichlor-l,2,2* ' ' * .J

-difluorethan, 2-brom_2-chlor-l,1,1-trifluorethan,'2-chlor^r '^J . ? , (·. ;

-1,1,2-trifluorethyldifluormethylether, l-chlor-2,2,2-tri* ¹ · 'j _4t ' s ».· fluorethyldifluormethylether, částečně fluorované alkany, í , · , . Λ | například pentafluorpropány, jako ΪΗ,lH,3H-pentáfluorpropan, >.··; ' . , ..t -...--.

hexafluorbutany, nonafluorbutany, jako 2H-rionafluor-terc.- / - - J¹.. . / . * VV ‘ -v i i - , “^t. ' , butan a dekafluorpentany', jako 2H,3H-dekafluorpentan, dále , ·*- · ώ · ? i '» '·. - , J*»^Λ „··, v ; ·. ·* může jít o částečně fluorované alkeny, například' heptafluora ... ' / í . . ^ť ' 5 * ‘ t'· “ ¹ . .

pentany, jako jsou. 1H, 1H, 2H-heptaf luorp’ent-l-en a nonafluor^V * ' - {' 1: ', Ί hexeny,jako 1H,1H,2H-nonafluorhex-l-en, o fluorované ethery, ' - - S ~ lA. - Ί >. k, ^; například 2,2,3,3,3-pentafluorpropylmethýlether nebo 2,2,3,3,3 t ' .i i ‘,·'·’’ · - . ·»* · . · ' ·* /ř

-pentafluorpropylčifluormethylether, zvláště výhodné jsou však perfluorované uhlovodíky. Jako příklady perfluorovaných uhlovodíků je možno uvést perfluoralkany, například perfluor ' <·. -· ' .

butany, perfluorpentany, perfluorhéxany, například perfluor-2-methylpentan, perfluorheptany, pefiuoroktany, perfluoru i í r * Λ , · - _v, <-...

nonany a perfluordekany, perfluórcykloalkany, například per' . , ' ·. ;..... .4 fluorcyklobutan, pefluordimethylcyklobutany, perfluorcyklo- i < ' - ,. , pentan a perfluormethylcyklopentan, dále perfluoralkeny, například perfluorbuteny , jako perfluórbut-2-en nebo perfluorbuta-1,3-dien, perfluorpenteny’, jako perfluorpent-l-en, • · · · • · · * •· ·«· «·« • · ·· »· • · · • · · • * ·

- 16 a perfluorhexeny, například perfluor-2-methylpent-2-en nebo perfluor-4-methylpent-2-en a také perfluorcykloalkeny, například perfluorcyklopenten nebo perfluorcyklopentadiert a perfluorované alkoholy, jako perfluor-terc.butanol.

Emulze tohoto typu mohou také obsahovat nejméně jedno smáěedlo ke stabilizaci disperze. Může jít o totéž smácedlo, jaké je užito ke stabilizaci disperze plynu nebo o odlišné smácedlo. Povaha jekéhokoliv takového smáčedla může podstatně^ ovlivnit například rychlost _:růstu dispergované fáze plynu. Obecně je možno použít širokou škálu smáČedel, tak jak jsou uvedena například v EP 727 225. Representativními příklady použitelných smáěedel mohou být mastné kyseliny, například nasycené nebo nenasycené mastné kyseliny s přímým řetězcem, obsahující například 10 až 20 atomů uhlíku a jejich estery s uhlohydráty a'triglyceridové estery, dále fosfolipidy, například lecithin, fosfolipidy s obsahem fluoru, bílkoviny, například albuminy, jako lidský sérový albumin, polyethylenglykoly a smáčedla na bázi sledových kopolymerů, například sledové kopolymery polyoxyethylenu a polyoxypropylenu, jako Pluronics, prodloužené polymery, například acyloxyacylpolyethylenglykoly, jako polyethylenglykolmethylether-16-hexadekanoyloxyhexadekanoát, například takové, v nichž polyethylenglykolová skupina má molekulovou hmotnost 2300, 5000 nebo 10 000 a také smáčedla s obsahem fluoru, která jsou běžně dodávána například pod obchodními názvy Zonyl a Fluorad nebo jaká byla popsánav^:mez.inárodní přihlášce W0 96/39197. Zvláště vhodnými smácedly jsou například fosfolipidy, obsahující molekuly, nesoucí negativní náboj. Jde například o přírodně se vyskytující fosfotidylseřiny, například ze sojových bobů nebo z vaječného žloutku, semisyntetické, například částečně nebo plně hydrogenované fosfatidylseriny a také syntetické fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, fosfatidové kyseliny a/nebo kardiolipiny.

» * i » » · v « · · φ φ ♦ * · » · · · · » φφ φφφφ φφ · ί· ··· ··»

- 17 Rozměr kapek dispergované složky, schopné difúze v emuulzích určených pro nitrožilní podání by s výhodou měl být nižší než 10, například nižší než 7 mikrometrů a větší než 0,1 mikrometru k dosažení volného průchodu kapek plicním systémem.

Jak již bylo svrchu uvedeno, s vodou němísiťelné složky, schopné difúze je také možno zpracovat na mikroemulze. Takové systémy jsou výhodné vzhledem k jejich termodynamické stabilitě a ke skutečnosti, že.složka, schopná.difúze.je prakticky rovrioměrně^—rozděTena— ve—vodné—fázi.._Z._t.oho.to_, dů-______ vodu mají mikroemulze vzhled roztoků, avšak mohou mít vlastnosti emulzí, pokud běží o parciální tlak dispergované fáze.

Prekursory plynů, které mohou být v rámci vynálezu použity zahrnují jakékoliv biokompatibilní složky, schopné vyvinout plyn in vivo, to znamená při teplotě organismu a fyziologickém pH. Jako příklady je možno .uvést anorganické a organické uhličitany a hydrogenuhličitany a látky, uvolňující dusík, jako pyražoliny, pyrazoly, triazoliny, diazoketony, diazoniové soli, tetrazoly a azidy. Je zřejmé,· že v takových systémech je složkou, schopnou difúze ve skutečnosti vytvořený plyn.

Aby bylo možno zajistit co největší těkavost složky, schopné difúze po jejím podání, a k usnadnění růstu dispergované plynné fáze (v obou případechjde o endothermní pochody), může být výhodné měnit teplotu- roztoku nebo suspenze složky, schopné difúze a/nebo disperze plynu před podáním a/nebo zařadit do těchto prostředků exothermně reaktivní složky. Použití složek, které reagují exothermně pod vlivem ultrazvukového záření může být v těchto případech zvláště výhodné.

· »·' 1 ·

- 18 Růst dispergované plynné fáze in vivo může být například doprovázen expanzí jakéhokoliv zapouzdřujícího materiálu v případě, že je tento materiál dostatečně ohebný a/nebo přemístěním přebytku smáčedla z podaného materiálu na rozhraní mezi zvětšujícími se bublinkami plynu a kapalinou. Je však také možné, že smrštění zapouzdřujícího materiálu a/nebo interakce tohoto materiálu s ultrazvukem může podstatně zvýšit jeho poréznost. Až dosud bylo pozorováno, že rozrušení zapouzdřujícího materiálu vedlo v řadě případů k rychlé-ztrátě ;echogenity difuzí/a„rozpuštěním plynu, v tom^_I’t o^-'pří pádě-však— b-y-lo-p-rokázáno-,—že_. p.ř.i._p.o.už.ití._kpntrast ních_ prostředků v souladu s požadavky vynálezu je takto uvolněný plyn v podstatě stálý. I když není zapotřebí se vázat na teoretické úvahy, je velmi pravděpodobné, že uvolněný plyn., například ve formě volných mikrobublinek může být stabilizován například proti kolapsu těchto mikrobublinek přesyceným okolním-prostředím, vytvořeným v důsledku přítomnosti složky, schopné difúze, která zajistí vznik tlakového, gradientu, působícího proti tendenci plynu pronikat difúzí ven z miíkrobublinek. Uvolněný povrch plynu může vzhledem k ne' Ϊ.

přítomnosti zapouzdřujícího materiálu vyvolat výjimečně příznivé akustické vlastnosti takto pozměněného prostředku, jak je možno prokázat vysokým zpětným odrazem a nízkou absorpcí energie, což je možno vyjádřit poměrem zeslabení a vysokým odrazem. Tento echogenní účinek může být zachován po delší časové období, a to i v průběhu déle trvajícího působení ultrazvuku.

Stabilizační účinek současně podané' složky schopné difúze může tedy znamenat velkou výhodu v tom smyslu, že příznivě ovlivní trvání i stupeň echogenity existujících kontrastních prostředků s obsahem plynu v případě, že hodnoty, získané' při použití tohoto prostředku nejsou uspokojivé při samotném podání tohoto prostředku. Bylo například pozorováno, « 9

9 · 9

9·9 999 • 9

99

9

- 19 I 9 t 9

99*9 že trvání účinku kontrastních prostředků na bázi albuminu je často závažně omezena kolapsem zapouzdřujícího albuminového materiálu, a to v důsledku změn systolického krevního tlaku v srdci nebo v žilním systému nebo v důsledku působení ultrazvuku, tento nedostatek je však možno z větší části vyrovnat současným podáním složky, schopné difúze podle vynálezu.

V jednom z výhodných provedení vynálezu je možno volit- prostředek, -tvořený disperzí plynu..a prostředek..obsa-_ 'huj'í’C'í^—'S'l^_ožku-;--schopnou'“d-i-fuze- ve—formě- suspenze, -tak.,—že.____ alespoň část dispergovaného plynu projde plícemi a pak se částice plynu po .průchodu plícemi rychle zvětšují difúzí složky, schopné difúze do vnitřního prostoru částic, prostředek je pak-zachycen v srdečním svalu a dovoluje jeho zobrazení ultrazvukem. V průběhu snižování koncentrace těkavé složky, schopné difúze v krevním proudu, například při odstranění této složky z krve například v plicích nebo vydechováním, metabolismem nebo redistribucí do jiných tkání dojde v typických případech k difúzi složky, schopné, difúze ven z částic ven z dispergovaného plynu a tyto částice se tedy smršťují na svůj počáteční malý rozměr a pak jsou z krevního proudu odstraněny působením retikuloendotheliálního systému. Toto přechodné podstatné zvýšení echogenity s následným vymizením tohoto kontrastního účinku je zcela odlišné od echogenních vlastností, které je možno pozorovat v případě, že je jedna z obou složek podána samostatně. Z toho, co bylo uvedeno je zřejmé, že je možno řídit trvání . retence dispergovaného plynu úpravou ..dávky á/nebo složení složky, schopné difúze.

Podobně je možno zobrazit i další kapilární systémy, například v ledvinách, játrechj slezině, štítné žláze, kosterních svalech, mléčné žláze a penisu.

4 4 4 • 4 4 ♦

444 444 • · ·

44

Je zřejmé, že určité faktory, jako rychlost a/nebo rozsah růstu částic dispergovaného plynu je obecně možno řídit příslušným výběrem plynu a zapouzdřujícího stabilizačního materiálu a zvláště volbou povahy složky, schopné difúze a způsobu jejího zpracování včetně povahy jakéhokoliv použitého smáčedla a rozměrů kapiček dispergované fáze v případě, že je složka zpracována na emulzi. V tomto posledním případě při daném množství emulgované složky, schopné difúze může snížení průměru kapiček zvýšit rychlost pre-

malých kapiček, které mají vyšší poměry povrchové plochy k objemu. Dalšími parametry, které je možno využít k řízení celého postupu jsou relativní množství obou podaných prostředků a v případě, že jsou tyto prostředky podávány odděleně také pořadí jejich podání, časový interval mezi podáním obou prostředků a popřípadě i vzdálenost místa podání těchto dvou prostředků v organismu. Je zřejmé, že schopnost difúze v případě složky, schopné difúze může dovolit podání této složky v různých částech organismu různým způsobem, například pomocí inhalace, vstřebáváním pokožkou, může také jít o podání podkožní, nitrožilní, nitrosvalové nebo perorální. Formy prostředku s dispergovaným plynem jsou již omezené různými parametry.

Zvláště důležitými parametry v případě složky, schopné difúze, je rozpustnost této složky ve vodě a/nebo v krvi a její schopnost difúze (vyjádřená například konstantami difúze) , která bude určovat rychlost transportu v nosné kapalině nebo krvi a také permeabilita jakoukoliv membránou, zapouzdřující dispergovaný plyn. Tlak, vytvářený složkou, schopnou difúze in vivo, je dalším faktorem, který může ovlivnit rychlost difúze do dispergovaného plynu, stejně jako koncentrace uvedené složky. To znamená, že v souladu s Fickovým zákonem bude koncentrační gradient složky, schopné • 4

4 • 4 4 4 4 4 i

idifúze relativně například ke vzdáelnosti mezi jednotlivými bublinkami plynu a kapičkami emulze spolu s koeficientem difúze složky, schopné difúze v okolním kapalném prostředí určovat rychlost přenosu jednoduchou difúzí. Koncentrační gradient je určován rozpustností složky, schopné difúze v okolním prostředí a vzdáleností mezi jednotlivými mikrobublinkami plynu a kapičkami emulze.

Účinná rychlost transportu složky, schopné difúze může být v případě potřeby řízena'úpravou viskozity prostředku s” dispergovanou plynnou fá'ž'í á/něbo š'lóžením sTožkyschopné difúze, například přidáním jedné nebo většího počtu biologicky kompatibilních látek, zvyšujících viskositu, například kontrastních látek pro zobrazování rtg-zářením, polyethylenglykolů, uhlohydrátů, bílkovin, polymerů nebo alkoholů. Může být například výhodné současně vstřiknout oba prostředky v relativně velkém objemu (například v objemu nejméně 20 ml v případě člověka s hmotností 70 kg) vzhledem k tomu, že v tomto případě dojde k oddálení úplného promísení složek s krví a tím i k oddálení nástupu růstu částic dispergovaného plynu až do vstupu do pravé srdeční komory a do plicních kapilár. Toto zpoždění růstu částic dispergovaného plynu je možno zvětšit použitím nosné kapaliny, která není dostatečně nasycena plyny a jinými složkami, schopnými difúze, například v důsledku svého předchozího zchlazení;

Jak již bylo svrchu uvedeno, může se jevů, které by- ly svrchu popsány, účastnit i jiný mechanismus transportu než difúze. Transport může například vzniknout v důsledku hydrodynamického proudu v obklopujícím kapalném prostředí.. Tento způsob může být důležitý v cévách a kapilárách, v nichž může docházet k vysokému střihovému proudění. K transportu složky, schopné difúze do dispergovaného plynu může dojít také v důsledku kolize mezi mikrobublinkami plynu a kapičkami emulze, což například může vést k adosrpci složky, • · • · • · · ··· • * • · ·

- 22 schopné difúze na povrch mikrobublinek a/nebo průnik složky, schopné difúze do mikrobublinek formou spojování. V takových případech mají koeficient difúze a rozpustnost složky, schopné difúze minimální' vliv na rychlost přenosu, na velikost Částic složky, schopné difúze, například na rozměr kapiček v případě emulze a na frekvenci kolize mezi mikrobublinkami a kapkami emulze, které jsou základními faktory, řídícími rychlost a rozsah růstu mikrobublinek. Například pro dané množství emulgované složky, schopné difúze povede snížení průměru kapiček ke zvětšenícelkového počtu kapiček a může tak'zvýšiti rychlost přenosu- snížením střední 'vzdáienos-t-imezi mikrobublinkami plynu a kapičkami emulze, čímž dochází ke zvýšení pravděpodobnosti kolize a/nebo splývání obou útvarů Je zřejmé, že rychlost přenosu v průběhu kolize může být značně zvýšena dalším oscilačním pohybem mikrobublinek plynu a kapíček emulze složky, schopné difúze, například působením energie ultrazvuku. Kinetika postupu, při němž dochází ke kolizi, vyvolané energií ultrazvuku se může lišit od kínetiky transportu složky, schopné difúze v nosné kapalině a/nebo krví například v tom smyslu, že může být zapotřebí specifické úrovně energie k zahájení kolize nebo splývání mikrobublinek plynu a kapiček emulze složky, schopné difúze.

Z toho vyplývá, že může být výhodné zvolit rozměr a hmotnost kapiček emulze tak, aby se v průběhu kolize vytvářela dostatečná síla při oscilaci mikrobublinek a mohlo dojít ke splývání mikrobublinek s kapičkami emulze.

ití v ·

Jak již bylo svrchu uvedeno, je permeabilita jakéhokoliv materiálu, použitého k zapouzdření dispergované fáze plynu parametrem, který může ovlivnit rychlost růstu částic plynné fáze a z tohoto důvodu může být žádoucí svolit složku, schopnou difúze, která snadno prochází do zapouzdřujícího materiálu, kterým může být například membrána, vytvořená z polymeru nebo smáčedla, například jednoduchá vrstva ···· ·· · ···*' ϊ • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · 0 0 * · 4 400 00» 7 • 04 0 0 · 0* 1·····« · · Β · · * nebo jedna nebo větší počet dvouvrstev smáčedla, tvořícího membránu, například fosfolipidu. Bylo však zjištěno, že je také možno použít v podstatě nepermeabilní zapouzdřující materiál vzhledem ktomu, že růst částic dispergovaného plynu může být vyvolán nebo podporován také působením ultrazvuku včetně ultrazvuku s nižšími nebo vyššími frekvencemi, než jaké se běžně užívají v lékařství při zobrazování ultrazvukem (například v rozsahu 10 Hz až 1 GHz, s výhodou v rozmezí 1 kHz tinuálně gováňéfio vynálezu působením ultrazvuku, použitého k zobrazování nebo předběžným ozářením, sloužícím například k dosažení dočasné retence plynu v kapilárních cévách specifického cílového orgánu. Další možností aktivace růstu částic dispergovaného plynu je aplikace dostatečného množství jiných forem energie, například protřepáváním, vibrací, působením elektrického pole, ozářením nebo· bombardováním proudem určitých částic, například proudem neutrálních částic, iontů nebo elektronů.

až 10 MHz), přičemž ultrazvuk muže být použit konnebo ve formě pulsů, nebo mohou růst- částic disper= plynů Vyvolat kombinace' prost řádků',' podaných-poďle. Růst částic plynu tedy může být například vyvolán

I když není zapotřebí se vázat na jakékoliv teoretické -) úvahy, je pravděpodobné, že v průběhu ozáření ultrazvukem dochází k alespoň přechodné modifikaci permeability zapouz* dřujícího materiálu a také schopnosti difúze složky, schopné difúze v obklopující kapalné fázi a/nebo k modifikaci frekvence kolizí mezi kapičkami emulze a zapouzdřenými mikrobublinkami. Vzhledem k tomu, že tento účinek je možno pozorovat při použití velmi krátkých pulzů ultrazvuku (například s trváním 0,3 mikrosekund při zobrazování způsobem B nebo 2 mikrosekundy při zobrazování podle Dopplera nebo pomocí druhé harmonické), nejde pravděpodobně o příklad rektifikované difúze, v níž by ozáření ultrazvukem vyvolalo

9

99 999

9

- 24 ··*· rovnoměrný vzestup poloměru plynových bublinek (viz publikaci Leighton E. G. , The Acoustic Bubble, Academie Press, 1994, str. 379) a je pravděpodobné, že pulzy ultrazvuku rozruší zapouzdřující membránu a tak usnadní růst částic dispergované fáze plynu difúzí složky, schopné difúze do vnitřního prostoru plynné fáze.

V případě potřeby může být buď dispergovaná fáze plynu nebo složka, schopná difúze tvořená azeotropní směsí nebo je možno tyto prostředky volit tak, že se azeotropní směs tvoří„in vivo,v. průběhu smísení složky, ‘schopné difúze's dispergovaným plynem. Taková tvorba azeotropní směsi muže” být ‘ například využita ke zvýšení těkavosti sloučenin s poměrně vysokou molekulovou hmotností, například halogenovaných uhlovodíků, jako fluorovaných uhlovodíků, včetně perfluorovaných uhlovodíků, které jsou za běžných podmínek při teplotě lidského organismu 37 °C kapalné tak, aby bylo možno je podávat při této teplotě v plynném stavu. Tento postup má velké výhody vzhledem k tomu, že prodlužuje životnost kontrastního prostředku in vivo v důsledku přítomnosti azeotropní směsi, protože je známo, že některé parametry, jako rozpustnost ve vodě, rozpustnost v tucích, schopnost difúze a odolnost proti tlaku se u sloučenin typu fluorovaných uhlovodíků snižuje se zvyšující se molekulovou hmotností.

Obecně je tedy možno uvést, že známá přirozená odolnost azeotropních směsí k oddělení jejich složek bude přispívat ke stálosti kontrastního prostředku v průběhu přípravy, skladování i následného podávání.

Azeotropní směsi pro toto použití je možno vybírat z literatury na základě předběžných pokusů a/nebo teoretických předpovědí. Jde například o publikace Tanaka, Fluid Phase Equilibria 24, 1985, 187 až 203, Kittel C. a Kroemer Η., kapitola 10, publikace Thermal Physics (W. H. Freeman and • »

- 25 and Co., New York, USA, 1980) nebo Hemmer P. C., kapitoly 16 až 22, Statistisk Mekanikk, Tapir, Trondheim, Norsko, 1970.

,, Jedním z literatury známým příkladem azeotropní směsi, která účinně snižuje teplotu varu složky s vyšší molekulovou ,_t hmotností na hodnotu pod teplotou organismu je směs, obsahující v hmotnostním poměru 50 : 43 dvě Složky, 1,1,2-trichlor-1,2,2-trifluormethan s teplotou varu 47,6 °C a 1,2-difluormethan s teplotou varu 29,6 °C, popsaná v US 4 055 049, směs má azeotropní teplotu, varu.. 24,9 ,θΟ. Další příklady azeotrop----- ..:.7,1 Víčir-smes£-”šTdbsáhem ..hálo.genov.aný.ch'_.úhl.o.v.o.díků. .jsou. .uvedeny_____7 v EP 783017, US 5 599 783, US 5 605 647, US 5 605 882, US 5 607 616, US 5 607 912, US 5 611 210, US 5 614 565 a US 5 616 821.

V publikaci Simons a další, J. Chem. Phys., 18(3), 1950·., 335 až 346 se uvádí, že směs perfluor-n-pentanu s teplotou varu 29 °C a n-pentanu s teplotou varu 36 °C má velkou kladnou odchylku od Raoultova zákona. Tento účinek je nejvyjádřenější pro přibližně ekvimolární .směs, praktická' teplota varu směsi je přibližně 22 °C nebo nižší. Směsi perfluorovaných uhlovodíků a nesubstituovaných uhlovodíků mají obecně ·· užitečné azeotropní vlastnosti. Zvláště silné azeotropní účinky byly pozorovány u směsí, jejichž složky mají blízké * teploty varu. Příkladem dalších azeotropních směsí perfluorovaných uhlovodíků a uhlovodíků může být směs perfluor-n-hexanu s teplotou varu 59' °C a n-pentanu, kde azeotropní směs má teplotu' varu mezi teplotou místnosti a 35 °C a směs perfluor-4-methylpent-2-enu s teplotou varu 49 °C a n-pentanu, která má teplotu varu přibližně 25 °C.

Další použitelné azeotropní směsi jsou směs halothanu a diethyletheru a směsi dvou nebo většího počtu fluorovaných plynů, jako perfluorpropanu a fluorethanu, perfluor- 26 • · « • · ···« propanu a 1,1,1-trifluorethanu nebo také perfluořethanu a difluormethanu.

Je známo, že fluorované plyny, například perfluorethan '* mohou tvořit aseotropní směsi s oxidem uhličitým, jak bylo popsáno například ve WO 95/02652. V důsledku toho vede podáΐ ní kontrastních prostředků s obsahem takových plynů in vivo ke tvorbě ternárních nebo vyšších azeotropních směsí s krev. nimi plyny, například oxidem uhličitým, čímž se dále zvyšuje stabilita dispergovaného plynu.

V případě, že oba prostředky, tvořící kombinovanou kontrastní látku podle vynálezu mají být podány současně, například ve formě injekce z oddělených injekčních stříkaček _1:..

spojovacím vedením- nebo po předběžném smísení, dochází k tomu za řízených podmínek, tak, aby nedošlo k předčasnému růstu mikrobublinek.

Prostředky, které jsou určeny ke smísení před současným podáním mohou být s výhodou skladovány v příslušném balení se dvěma nebo větším počtem oddílů. Disperze plynu nebo sušeného prekurzoru, například obsahující lyofilizovaný zbytek suspenze mikrobublinek plynu ve vodném prostředí s obsahem amfifilního materiálu, zvláště v případě, že je amfifilní materiál tvořen v podstatě fosfolipidem, převážně, to znamená nejméně ze 75 % obsahujícím molekuly s celkovým, například negativním nábojem mohou být uloženy .do prvního oddílu, například lahvičky, s níž je spojena injekční stříkačka, obsahující složku, schopnou difúze. Výstup z injekční stříkačky je uzavřen například membránou nebo zátkou k zábraně předběžného smísení. Působením pístu stříkačky se membrána rozruší a složka, schopná difúze se smísí se složkou, tvořenou disperzí plynu nebo s jejím- prekurzorem,' načež se po případném protřepání a/nebo ředění směs injekční stříkačkou podává.

to · • ·

- 27 ·· ·«·♦

Je také možno oba prostředky skladovat oddělené membránou nebo zátkou v téže lahvičce nebo injekční stříkačce. Je. den nebo oba z těchto prostředků mohou být pod tlakem plynu nebo par; Rozrušením membrány nebo zátky, například pomocí injekční jehly je mošno smísit oba prostředky. Toto míšení může být urychleno ručním protřepáváním,· po němž se směs vyjme z lahvičky a podává. Podle dalšího odlišného provedení může například lahvička obsahovat sušený prekurzor prostřed¹ ku s dispergovaným plynem a je opatřena první injekční stříkačkou, obsahující. kapalinu pro. opětnou disperzi, prekurzoru, .TTve”7^,d-ruhé-7s-ťří'kačcé^j.e7.ulo.žeh7.p.ro.s..t.ř.e.dek';;7obs_áhuj.ícÍ7^,;_složku_·, schopnou difúze. Podle dalšího možného provedení se do lahvičky uloží při oddělení membránou prostředek s obsahem *

složky, schopné difúze a sušený prekurzor pro prostředek s dispergovaným plynem a lahvička je opatřena injekční stříkačkou, obsahující kapalinu pro redispergování tohoto sušeného prekurzoru.

V provedeních vynálezu, při nichž se prostředek s dispergovaným plynem a prostředek, obsahující složku, schopnou difúze mísí před podáním, bude v průběhu výroby a při skladování směs typicky udržována za zvýšeného tlaku nebo při nižší teplotě tak, aby tlak složky, schopné difúze, nebyl dostatečný k růstu částic dispergovaného plynu. Aktivaci růstu částic dispergovaného plynu, je pak mošno jednoduchým způsobem vyvolat uvolněním zvýšeného tlaku nebo zahřátím na tělesnou teplotu, k němuž dochází podáním směsi nebo je možno směs předehřát těsně před podáváním.

V těch provedeních vynálezu,’při nichž se prostředek s dispergovaným plynem a prostředek, obsahující složku,, schopnou difúze, podávají odděleně, je možno použít Časového intervalu mezi podáním obou prostředků k ovlivnění Části organismu, v níž převážně dojde k růstu částic prostředku • 4 4 44«

- 28 s dispergovanou fází plynu. Složku, schopnou difúze je například možno podat injekčně a nechat koncentrovat v játrech, čímž se dosáhne výraznějšího zobrazení tohoto orgánu po následném injekčním podání prostředku s dispergovaným plynem. Tam, kde to stálost prostředku s dispergovaným- plynem dovolí je také možno nejprve injekčně podat tento prostředek a nechat jej koncentrovat v játrech a pak teprve podat prostředek, obsahující složku, schopnou difúze ke zvýraznění obrazu.

..._s.₌.· Zařízení, ..která .je možno p.oužít.pro. zobrazování _zahrnu-_ 111^70.irozměrněji - trojrozměrné¹postupy,-· napríklad-běžryý^ B- _ * j' postup (například s použitím amplitudy signálu, vytvořeného v zařízení a měnící se s časem, od subharmonických až do vyšších harmonických nebo je možno využít součet nebo rozdíl frekvencí, odvozených od vyslaného pulzu a takových harmonických, dále je možno využít zobrazení, vytvořeného při použití základní frekvence nebo s výhodou její druhé harmonické ), dále je možno využít zobrazování pomocí Dopplerovy amplitudy nebo Dopplerova barevného- zobrazování a kombinace těchto dvou postupů s kterýmkoliv ze svrchu uvedených způsobů. Pro danou dávku dispergovaného plynu á složky, schopné difúze je možno při použití Dopplerova barevného zobrazení pomocí ultrazvuku k vyvolání růstu Částic dispergovaného plynu získat silnější kontrast při následném zobrazování běžných B-způsobem, pravděpodobně v důsledku vyšší intenzity použitého ultrazvuku. Aby bylo možno snížit vliv pohybů, je možno vytvořit postup na obrazy tkáně, například srdce nebo ledviny při použití vhodné synchronizační techniky, například spojením s ECG nebo s respiračními pohyby vyšetřované osoby. K detekci kontrastního prostředku může být vhodné také měření změn rezonanční frekvence nebo měření absorpce, těmito jevy je doprovázen růst částic dispergovaného plynu.

Je zřejmé, že dispergovaný plyn z kombinovaných kontrastních prostředků podle vynálezu bude dočasně zachycen

- 29 • 9 *99 9* 999 • · 9 · 9 · «9 9999 99 9 99 ve tkáni v koncentraci, která je úměrná prokrvení tkáně. Při použití běžného zobrazování, které je přímo závislé na intenzitě odraženého signálu je možno obrazy takových tkání interpretovat jako mapy prokrvení, v nichž je pozorovaná intenzita signálu funkcí místního prokrvení. Tato skutečnost znamená podstatný rozdíl ve srovnání s obrazy, získanými při použití kontrastních látek, volně unášených krevním proudem, kde míst ní koncentrace kontrastního prostředku a odpovídající intenzita odraženého signálu odpovídá na okamžitém obsahu, krve spíše než na'prokrvení příslušné tkáně.. ..... - . .

V případě srdečního svalu, v němž mapa- prokrvení je’ odvozena od intenzity odraženého signálu, může být výhodné podrobit vyšetřovanou osobu fyzickému nebo farmakologickému. stresu ke zvýraznění rozdílů prokrvení a tím i v kontrastu zobrazení mezi normálně prokrvenými částmi srdečního svalu, a částmi, které jsou zásobeny zúženými tepnami. Jak je známo ze zobrazování srdce pomocí radioaktivních látek, takový stres vyvolá rozšíření cév a zvýšené prokrvení zdravé srdeční tkáně, kdežto průtok krve v nedostatečně zásobené tkáni,' zásobené zúženou tepnou zůstává beze změny, protože kapacita pro rozšíření cév je již vyčerpána autoregulací, snažící se v

zvýšit nedostatečný průtok krve.

Použití stresu, jako tělesného svíceni nebo farmakologicky podáním adrenergních látek může vyvolat u některých vyšetřovaných osob, potenciálně- trpících srdečním, onemocněním bolest na hrudníku a je tedy výhodnější zvýšit prokrvení zdravé tkáně podáním látek, rozšiřujících cévy, například ze skupiny adenosin, dipyridamol, nítroglycerin, isosorbidmononitrát, prazosin, doxazosin, dihydralazin,. hydralazin, nitroprussid sodný, pentoxyfyllin, amelodipin, felodipin, isradipin, nifedipín, nimodipin, verapamil, diltiazem a oxid dusný. V případě adenosinu může dojít až ke čtyřnásobnému vzestupu průtoku koronárními cévami ve zdravém srdečním * φ • φ

- 30 φ φ φ * · · • φ · •· φφφφ • * φφφ* φ φ φφφφ φ · · ·Φ φφ* * φ · · svalu, čímž podstatně zvýší příjem a dočasná retence kontrastních prostředků a tím se zvýší i rozdíl v intenzitě odraženého signálu mezi normální a nedostatečně zásobenou tkání srdečního svalu. Vzhledem k tomu, že zachycení- kontrastního prostředku v místě zobrazení je v podstatě fyzikální postup, je tento postup vysoce účinný, zejména ve srovnání s příjmem radioak* tivních látek, například thalia nebo technecia, který je omezen malou dobou kontaktu mezi radioaktivním prvkem a tkání, takže může být zapotřebí udržovat vasodilataci po celou dobu vyšetření, například 4 až 6 minut při scintigrafii s použitím thalia,yaby_ bylo dosaženo optimálního výsledku. Kontrastný prostředky podle vynálezu netrpí takovým omezením difúze nebo transportu a vzhledem k tomu, že jejich retenci v srdeční . tkáni je také možno rychle ukončit, například vypnutím ultrazvuku, použitého k vyvolání růstu částic, je potřebné období vasodilatace k dosažení prokrvení srdečního svalu velmi krátké, například méně než 1 minuta. Tímto způsobem je možno zkrátit nepříjemné vedlejší účinky, které může u-vyšetřovaných osob vyvolat'podání vasodilatačních látek.

Vzhledem k tomu, že požadovaná vasodilatace může být pouze krátkodobá, je adenosin zvláště vhodnou vasodilatační látkou vzhledem k tomu, že běží o endogenní sloučeninu s

A velmi krátkým účinkem, jak je možno prokázat poločasem v krevním oběhu, který má hodnotu pouze 2 sekundy.' K nejintení zivnější vasodilataci dojde v srdečním svalu vzhledem k tomu, že do- vzdálenějších tkání se sloučenina dostane již v koncená traci nižší, než je účinná koncentrace. Je zřejmé, že vzhledem ke krátkému poločasu může být zapotřebí injekci opakovat nebo v průběhu vyšetření srdce použít infuzi adenosinu. Jako příklad je možno uvést počáteční podání 150 mikrogramů/kg adenosinu v podstatě současně s kontrastními prostředky a po 10 sekundách ještě pomalou injekci téže dávky adenosinu, například v průběhu 20 sekund.

ft » · ft ftft • •ft

- 31 ftft · · · · · • · ♦ · · · ·* ··· ftft ft ftft • · ft ft ·

Kombinace kontrastních prostředků podle vynálezu může být s výhodou užita také pro aplikací biologicky aktivních látek, například některých léčiv do cílených tkání.· To může být výhodné zejména u-některých specifických onemocnění člověka i jiných živočichů. Látky s biologickým účinkem mohou být přítomny například v dispergovaném plynu, mohou být vázány na Část zapouzdřující stěny nebo matrice například kovalentními nebo iontovými vazbami, v případě potřeby delšími vaznými řetězci, nebo mohou být tyto látky fyzikálně smíšeny se· zapouzdřujícím materiálem nebo s materiálem matrice.

'Tato p'0'sTe'dn r -možnost-je- -z v-l-á-Š tě- -vhodná - v- p-ří-p-adě-,— -Ž e”úč iňná— látka a zapouzdřující materiál nebo materiál .matrice mají podobnou polaritu nebo rozpustnost.

Řiditelný růst částic dispergovaného plynu je možno využít k jeho dočasné retenci v kapilárách cílové, oblasti. Použití ultrazvuku- k vyvolání růstu částic a tím- zadržení plynu a s ním spojené účinné látky v cílové struktuře je zvláště výhodné. Ke koncentraci částic dispergovaného plynu v cílové oblasti je možno použít místní injekce prostředku s dispergovaným plynem nebo s výhodou prostředku, který obsahuje složku, schopnou difúze.

Biologicky účinná látka,, která může být vázána na specifický vektor s afinitou pro specifické buňky, struktury nebo pathologicky změněné tkáně může být uvolněna například v důsledku smrštění nebo rozrušení materiálu, vytvářejícího zapouzdřující stěny nebo materiálu matrice v důsledku růstu Částic dispergovaného plynu, rozpouštěný zapouzdřujícího materiálu' nebo materiálu matrice nebo rozpadu mikrobublinek nebo mikročástic, například působením ultrazvuku nebo obrácením koncentračního gradientu složky,, schopné difúze, v cílové tkáni. V případě, že látka s biologickým účinkem je • * · * * * · · ··· »·· • · ·· »·

- 32- chemicky vázána na zapouzdřující stěnu nebo na matrici, může spojení nebo jakýkoliv spojovací řetězec s výhodou obsahovat jednu nebo větší počet labilních skupin, které je možno odštěpit k uvolnění účinné látky. Jako příklad odštěpítel ných skupin je mošno uvést amidové, imidové, íminové, esterové, anhydridové, acetalové,. karbamátové, karbonátové a disulfidové skupiny, které jsou biologicky degradovatelné in vivo například v důsledku hydrolýzy a/nebo působením enzymů.

Jako příklady látek s biologickým účinkem..vhodných pro poúžiťT v kombinovaných-prostředcíeh podle .vynálezu je... možno uvést látky s protinádorovým účinkem, jako jsou vincristin, vínblastin, vindesin, busulfan, chlorambucil, spiroplatin, cisplatin, carboplatin, methotrexat, adriamycin, mitomycin, belomycin, cytosinarabinosid, arabínosyladenin, merkaptopurin, mitotan, prokarbazin, dactinomycin (antinomycin D) , daunorubicin, doxorubicínhydrochlorid, taxol, pl.icomycin, aminoglutethimid, estramustin, flutamid, leuprolid, megestrolacetát, tamoxifen, testolakton, trilostan, amsacrin (m-AMSA), asparagináza (L-asparagináza), etoposid, interferon alfa-2alfa. a 2beta, krevní deriváty, například hemato- poryriny'nebo jejich deriváty, látky, modifikující biologickou odpověď, například muramylpeptidy, antifungální látky, například ketoconazol, nystatin, griseofulvin, flucytósin, miconazol nebo amfotericin B, hormony nebo analogy hormonů, jako jsou růstový hormon, hormon, stimulující melanocyty, estradiol, beclomethasondipropionát, betamethason,. kortisonacetát, dexamethason, flunisolid, hydrokortison, methylprednisolon, paramethasonacetát, prednisolon, prednison, triamcinolon, nebo fludrokořtísonacetát, vitamíny, jako kyanokobalamin nebo retionidy, enzymy, jako alkalická fosfatáze nebo dismutáza superoxidu manganu, antialergické látky, jako amelexanox, antikoagulační látky, jako warfarin, phenprocoumon nebo heparin, antithrombotické látky, látky pro léčení *· · · · · *··* * · · · · · · · ··» ···' ··· · · * · * ·*···· ·· · *« ,a

- 33 poruch oběhu, jako propranolol, metabolické potenciátory, jako glutathion, antituberkulotika, jako kyselina p-aminosalicylová, isoniazid, capreomycínsulfát, cyklosexin, etham-. butol, ethionamid, pyrazinamíd, rifampin nebo streptomycinsulfát, protivirové látky, jako acyclovir, amantadin, azidothymidin, ribavirin nebo vidarabin·, látky, rozšiřující cévy, jako diltiazem, nifedipin, verapamil, eřythritoltetranitrát, isosorbiddinitrát, nitroglycerin nebo pentaerythritoltetranitrát, antibiotika, jako dapson, chloramfenokol, neomycin, cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cephradin, erythromycin, clindamycin, lincomycin, amoxicillin, ampicillin, becampicillin, karbenicillin, dicloxacillin, cyclacillin, picloxacillin, hetacillin, methicillin, nafcillin,' penicillin nebo teťracyklin, látky s protizánětlivým účinkem, jako diflunisal, íbuprofen, indomethacin, meclefenamát, kyselina mefenamová, naproxen, fenylbútazon, piroxicanr, tolmetin, aspirin nebo salicyláty, látky s účinností proti prvokům, například chlorochin, metronidazol, chinin nebo megluminantimčriát, látky s antirevmatickým účinkem, například penicillamin, narkotika, opiáty, jako kodein, morfin nebo opium, srdeční glykosidy, například déslanesid, digitoxín, digoxin, digi¥ >

talin nebo digitalis, blokátory nervosvalového přenosu, jako atracuriummesylát, gallamintriethiodid, hecafluoreniumbromid, metocurinjodid, pancuroniumbromid, ' sukcinylcholinchlorid, tubokurarinchloríd nebo vecuroniumbromid,· sedativa, jako amobarbital, sodná sůl amobarbitalu, apropbarbital, »

sodná sůl butabarbitalu, chloralhydrát, ethchlorvynol, ethi-_ namát, flurazep&mhydřochloríd, glutethimid, methotrimeprasinhydrochlorid, methyprylon, midazoamhydrochlorid, paraldehyd, pentobarbital, sodná sůl secobarbitalu, talbutal,' temasepam nebo triazolam, místní anestetika, například bupivacain, chlorprocain, etidocain, lidocain, mepivacain, procain nebo tetracain, celková anestetika, například droperidol, etomidat, fentanylcitrát s propetidolem, ketaminhydrochlorid, sodná sůl methohexitalu nebo thiopental a • · · · • ··· «·« • · ·♦ ··

- 34 • * * · · * • · «·.·«· • · · · ♦ Β ·* ···· »· * farmaceuticky přijatelné soli těchto látek, například adiční soli s kysleinami, jako hydrochloridy nebo hydrobromidy nebo soli s bázemi, například soli sodné, vápenaté nebo hořečnaté nebo deriváty těchto látek, například acetáty a také radiochemické látky, například beta-zářiČe. Zvláštní význam mají antithrombotické sloučeniny, například látky, antagonizující vitamin K, hepatin a látky s heparinovým účinkem, například antithrombin III, dalteparin a enoxaparin, inhibitory shlukování krevních destiček, například ticlopirin, aspirin, dipyridamol, iloprost a abciximab a také thrombolytické enzymy , · například streprokináza .a aktivátor plasminogenu. Dalšími příklady mohou být genetické materiály, jako nukleové kyseliny, RNA a DNA přírodního nebo syntetického původu včetně rekombinantní RNA a DNA. Kódovou DNA pro určité bílkoviny je možno využít pro léčení, řady různých onemocnění. Například v případě pokročilých zhoubných nádorů je možno použít faktor nekrosy nádoru nebo interleukin-2.

K léčení nádorů vaječníku a mozkových nádorů je možno použít thymidinkinázu, k léčení neuroblastomu, zhoubného melanomu nebo nádoru ledvin je možno použít interleukin-2 a obecně k léčení nádorových onemocnění je mošno použít in- ₍terleukin-4.

Kombinace kontrastních prostředků podle vynálezu je možno využít také jako. nosných prostředků pro zvýšení kontrastu pomocí určitých skupin pro zobrazování, odlišné od zobrazování ultrazvukem, například pomocí trg-záření, světla, magnetické rezonance a s výhodou scintigrafie. Řízeného růstu částic dispergovaného plynu je možno využít k uložení kontrastních prostředků do požadovaných tkání, například využitím působení ultrazvuku na cílový orgán k vyvolání růstu částic plynu a jejich dočasného zadržení pro zlepšení kontrastu, pak je možno vytvořit obraz na základě principu, odlišného od ultrazvuku.

• 4 4 ’ ·

- 35 4 4 4 4 4 • · 4 4 ·· 44·· 44 • 4 • 4 ' 44·

4

Kontrastní prostředky podle vynálezu je také možno použít jako nosné prostředky pro účinné látky, které nemusí být nezbytně z prostředku uvolněny k dosažení léčebného účinku. Může jít například o radioaktivní látky, jako beta-zářiče, u nichž dochází k emisi záření po dočasném zadržení prostředku v cílové tkáni. Je zřejmé, že takové prostředky by s výhodou měly být konstruovány tak, aby nedocházelo ke smrštění bublinek s přerušením retence plynu, dodukd není dosaženo požadované dávky záření.

’č -Kontrástní.Up.rostředkyúp.qdle vynálezu také- mohou., mít, — . léčebný účinek jako takové. Je například možno uložit dispergovaný plyn do kapilár, které zásobují krví nádory a tak blokovat tyto kapiláry. Je tedy možno aplikovat ultrazvukovou energii místně k získání řízené lokalizované embolizace určitých cév. To může být důležité zejména v kombinaci s dalšími léčebnými zákroky. Koncentrace dispergovaného plynu v kapilárách může rovněž zvýšit absorpci ultrazvukové energie při hyperthermní therapii. Toho je možno využít například v případě léčení nádorů jater. V takových případech se užívá záření s poměrně vysokou energií, například 5 W, zaměřené na určité místo, například ultrazvuku s frekvencí 1,5 MHz.

Je zřejmé, že do oboru vynálezu spadají prostředky, tvořené vodným nosným prostředím s dispergovaným- plynem a prostředky, obsahující složku, schopnou difúze obecně i použití těchto prostředků pro jiné účely než pro zobrazování určitých tkání.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími' příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

* · « • · ·

- 36 • · · • · ♦ • · · »· ·**♦ • t t • A » * A

99 ···

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Přípravy

a) Disperze plynného perfluorbutanu

100 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 2% roztoku propylenglykolu ve 20 ml čištěné vody se zahřeje na 5 minut, na teplotu 80 °C a výsledná disperze se nechá zchladnout přes noc-na teplotu místnosti Pak se podíly., po 1 ml přene—sou- do- lahviěek--^-objěmém~-2-fml.faTzb-ý-vaj.í.c.í'.prosto.r IšeZpro-_ ;; pláchne .perf luorbutanem, načeš se lahvičeky protřepávají 45 sekund v mísícím zařízení pro zubolékařské účely, Espe p

CapMix , čímž vznikne mléčně bílá disperze, mikrobublinek se středním objemovým průměrem 5,0 mikrometrů, měřeno .zařízením Coulter Counter. Všechna měření zařízením Coulter Counter byla provedena při teplotě místnosti při použití přístroje s otvorem 50 mikrometrů a s rozsahem měření 1 až 30 mikrometrů, jako elektrolyt byl užit Isoton II.

b) Dispergování lyofilizované disperze plynného perfluorbutanu .

Vzorek mléčně bílé disperze z příkladu la) byl 3x promyt vždy s odstředěním vzorku a odstraněním infranatantu, načež byl přidán stejný objem 10% roztoku sacharosy. Výsledná disperze byla lyofilizována a pak znovu dispergována v destilované voděčímž. byla získána mléčně bílá disperze mikrobublinek s objemovým středním průměrem 3,5 mikrometrů, měřeno zařízením Coulter Counter.

c) Emulze 2-methylbutanu

100 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 20 ml Čištěné vody se zahřeje na 5 minut na teplotu 80 °C a výsledná ► φ

I Φ • φ φ

- 37 • * · φ · φ φ • φφφφ disperze se chladí přes noc na O °C. Pak se 1 ml disperze přenese do nádobky s objemem 2 ml a s obsahem 200’ mikrolitrů 2-me.thylbutanu s teplotou varu 28 °C. Pak se lahvička 45 sekund protřepává při použití mísícího zařízení CapMix k získání emulze složky, schopné difúze, která se pak do použití uloží pří teplotě 0 C. Střední objemový průměr emulgovaných kapiček byl 1,9 mikrometrů, měřeno přístrojem Coulťer Conter.

rd);_ yy Emulzey perfluorpentanu*- .... -_r ~ .... Opakuje se postup podle příkladu lc) s tím rozdílem, že se 2-methylbutan nahradí .· perf luorpentanem s teplotou varu 29 °C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se do použití' uloží při teplotě 0 °C.

e) Emulze 2-chlor-l,1,2-trifluorethyldifluormethyletheru

Opakuje se způsob podle- příkladu lc) s tím rozdílem,

Φ že se 2-methylbutan nahradí 2-chlor-l,1,2-trifluorethyldifluormethyletherem s teplotou varu 55 až 57 °C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze byla do použití uložena při teplotě 0 °C.

f) Emulze 2-brom-2-chlor-l,1,1-trifluorethanu

Opakuje se způsob podle příkladu lc) s tím rozdílem, že se2-methylbutan nahradí 2-brom-2-chlor-l,1,1-třifluorethanem s teplotou varu 49 °C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití·uloží při teplotě 0 °C,

- 38 • 4 • · * 4

4

g) Emulze l-chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethyletheru

Opakuje se způsob podle příkladu lc) s tím rozdílem, že se 2-methylbutan nahradí l-chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethyletherem s teplotou varu 49 °C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

h)_Disperze polymeru s obsahem plynu/částic lidského _____sérového „albuminu

Částice polymeru s obsahem plynu, opatřené povlakem lidského sérového albuminu a připravené z ethylidenbis(16-hydroxyhexadékanoátu) a adipoylchloridu způsobem podle přikladu 3a) přihlášky WO 96/07434 se v množství'100 mg rozruší v hmoždíři a disperguje v 10 ml 0,9% vodného- roztoku chloridu sodného protřepáváním po dobu 24 hodin na laboratorním třepacím zařízení.

i) Disperze polymeru s obsahem plynu/částic želatiny ·,

100- mg částic polymeru s obsahem plynu, opatřených povlakem.želatiny a připravených z ethylidenbis(16-hydroxyhexadekanoátu) a adipoylchloridu způsobem podle příkladu 3é) přihlášky W0 96/07434 se rozruší ve hmoždíři a disperguje v 10 ml 0,9% vodného roztoku chloridu sodného protřepáváním 24 hodin na laboratorním třepacím zařízení.

j) Emulze 2-methylbutanu

Opakuje se postup podle příkladu lc) s tím rozdílem, že se emulze lOx zředí před použitím a skladuje se v ledové lázni.

• » • · ♦·· »«· ·♦··

- 39 ··

0 0 · · ·· ·

k) Emulze perfluorpentanu

Opakuje se způsob podle příkladu ld) s tím rozdílem, že se emulze, před použitím lOx zředí a skladuje se v ledové lf«íi lázni.

» k

l) Emulze perfluorpentanu

T *

100 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 20 ml čiš- .

,-. ₇.^.těné-vody_se_zahřeje na.5 minut na teplotu 80' °C a vzniklá disperze se přes noc chladí na 0’ °Č. Podíl '1’ml disperze -se-----přenese do lahvičky s objemem 2 ml s obsahem 100 mikrolitrů perfluor-n-pentanu s teplotou varu 29 °C. Pak se lahvička' pj protřepává 75 sekund při použití zařízení CapMix za vzniku emulze složky, schopné difúze, která se do použití uloží při teplotě 0 °C. Objemový střední průměr kapiček emulze byl

2,9 mikrometrů, měřeno přístrojem‘Coulter Counter.

m) Emulze perfluorbutanu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí perfluorbutanem s teplotou va0 o ru -2 C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se do použití uloží při teplotě 0 °C.

«

n) Emulze perfluorpentanu, připravené s použitím * R ultrazvuku

500 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu- ve 100 ml čištěné vody se zahřeje na 5 minut na 80 °C a výsledná disperze se chladí přes noc na teplotu místnosti. Pak se 10 ml disperze přenese do lahvičky s objemem 30 ml a s obsahem 1 ml perfluorpentanu. Vzniklá směs se 2 minuty zpracovává ultrazvukem· za vzniku disperze složky, schopné difúze se středním průměrem kapiček menším než 1 mikrometr.

9 ·

9 9

999

9

- 40 9 9 9 9 • · 9

9 9

9999

99

o) ' Emulze perfluorpentanu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím tozdílem, že se objem použitého perfluorpentanu sníží na 60 mikrolitrů. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se do použití uloží při teplotě 0 °C.

p) Emulze perfluorpentanu

----- Opakuje-se-.způsob podle příkladu .11) s tím tozdílem,_ že se objem použitého perfluorpentanu sníží na 20 mikrolitrů. Takto připravenou emulzi složky, schopné difúze se do použití uloží při teplotě 0 °C.

q) Emulze směsi perfluorpentanu a perfluor-4-methylpent-2-enu v poměru 1 : 1

Opakuje se způsob podle příkladu lij s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí směsí 50 mikrolitrů perfluorpentánu s teplotou varu 29 °C a 50 mikrolitrů perfluor-4-methylpent-2-enu s teplotou varu 49 °C. Takto připravená emulze složky, schopné difúze byla až do použití uložena při teplotě 0 °C. Střední objemový průměr kapiček emulze byl

2,8 mikrometrů, měřeno přístrojem Coulter Counter.

r) Emulze směsi perfluorpentanu a 1H,1H,2H-heptafluorpent-l-enu v poměru 1 : 1

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí směsí 50 mikrolitrů perfluorpentanu s teplotou varu 29 °C a 50 mikrolitrů 1H,1H,2H-heptafluorpent-l-enu s teplotou varu 30 až 31 °C. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

* ♦ « ·

- '41 s) Emulze perfluorpentanu, stabilizovaná směsí distearoylfosfatidylcholinu a distearoylfosfatidylserinu 1:1

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí směsí 50 mg distearoylfosfatidylcholinu a 50 mg sodné soli distearylfosfatidylserinu. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

t) _ Emulze perfluorpentanu, stabilizovaná směsí - distearoylfósfáťidýlchdliriu' a distearoylfosfatidylserinu· ' v poměru 3:1

L

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí směsí 75 mg distearoylfosfatidylcholinu a 25.mg sodné soli distearoylfosfatidylserinu. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 ?C.

u) Emulze perfluorpentanu, stabilizovaná směsí distearoylfosfatidylcholinu a distearoylfosfatidylglycerolu

V poměru 3 : 1

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí směsí 75 mg distearoylfosfátidylcholinu a 25 mg sodné soli distearoylfosfatidylglycerolu. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

v) Emulzeperfluorpentanu, stabilizovaná směsí hydrogenovaného fosfatidylcholinu a hydrogenovaného fosfatldylserinu v poměru 11 : 1

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylsern nahradí 100 mg směsi • · • · • ·

- 42 » · ·· · • · hydrogenovaného fosfatidylcholinu a hydrogenovaného fosfatidylserinu v poměru 11': 1. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

w) Emulze perfluor-4-methylpent-2-enu, stabilizované směsí distearoylfosfatidylcholinu a dístearoylfosfatidylserinu v poměru 3 : 1

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím tozdílem, že se.hydrogenovaný fosfatidyiserin nahradí směsí 75 mg-di- stearoylfosfatidy 1'choi’inu á”2'5 mg sodně soli disťďaroýlfos---------fatidylserinu a perfluorpéntan se nahradí pe'rfluor-4-me thylpent-2-enem. Takto získaná suspenze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

x) Emulze, směsi perfluorpentanu a perfluor-4-methylpent-2-enu v poměru 1:1, stabilizovaná směsí distearoylfosfatidylcholinu a distearoylfosfatidylserinu 1 : 1

Opakuje se způsob podle příkladu iw) s tím rozdílem, že se perfluor-4-methylpent-2-en nahradí směsí 50 mikrolitrů · perfluorpentanu a 50 mikrolitrů perfluor-4-methylpent-2-enu. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

y) Emulze směsi perfluorpentanu a perfluor-4-methylpent-2-enu v poměru 1:1, stabilizovaná směsí distearoylfosfatidylcholinu a dístearoylfosfatidylglycerolu v poměru 3:1

Opakuje se způsob podle příkladu lx) s tím rozdílem, že se Sodná sůl distearoylfosfatidylserinu nahradí distearoylfosfatidylglycerolem ve formě sodné soli. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

- 43 ft · • · · «· ft· · ··♦··· • · · · · · · » ····*· · · ft ·· ··

z) Emulze směsí perfluordekalinu a perfluorbutanu

100 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 20 ml vodného roztoku s obsahem 5,11 % glycerolu a 1,5 % propylenglykolu se zahřeje na 5 minut na teplotu 80 °C a výsledná disperze se chladí přes noc na 0 °C. Pak se 1 ml této disperze přenese do lahvičky s objemem 2 ml, která obsahuje 100 mikrolitrů perfluordekalinu s teplotou varu 141 až 143 °C, nasyceného perfluorbutanem s teplotou varuc-2 °C. LahviČéka se 60 sekund protřepává při použití zařízení CapMix , čímž se ' —zí skáémulze -slo_žky,- schopné· difúzep která-sé-až do-použití—7 uloží při teplotě 0 °C.

aa) Emulze směsi perfluordekalinu a perfluorpropanu

Opakuje se způsob podle příkladu lz) s tím tozdílem, ·, že se perfluordekalin, nasycený perfluorbutanem nahradí perfluordekalinem, nasyceným perfluorpropanem s teplotou v varu -39 °C. Takto vytvořená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

ab) Emulze směsi perfluordekalinu a fluoridu sírového

Opakuje se způsob podle příkladu lz) s tím rozdílem, že se perfluordekalin, nasycený perfluorbutanem nahradí perfluordekalinem, nasyceným fluoridemsírovým s teplotou varu -64 °C. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží .při teplotě 0 °C.

5ac) Emulze perfluorpentanu, stabilizované prostředkem

Fluorad FC-170C ml disperze 200 mg prostředku Fluorad FČ-170C ve 20 ml čištěné vody se přenese do lahvičky s objemem 2 ml, « · · φ • φφ «φφ φ « φ φ φ φ

- 44 • · « φ φ · • * «φφφφ • · ♦ · φ φ ·· φφφφ φφ φ obsahující 100 mikrolitrů perfluor-n-pentenu. Lahvička se pak protřepává 75 sekund při použití zařízení CapMix za vzniku emulze složky, schopné difúze, která se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

ad) Emulze perfluorpentanu, stabilizovaná směsí prostředků Pluronic F68 a Fluorad FC-170C

100 mikrolitrů 10% roztoku Pluronic F68 se přidá ke 200 mikrolitrúm 1% roztoků Fluorad FC170C a 700 mikroiitrům čištěné vody. Výsledná směs'šě přenese do lahvičky š obsahem 2 ml, do níž se předem vloží 100 mikrolitrů perfluor-n-pentanu. Pak se lahvička protřepává 75 sekund při použití zářízení CapMix , čímž se získá emulse složky, schopné difúze, která se až do použití uloží při teplotě 0 °C. Vzorek této emulze se-přenese do lahvičky z plastické hmoty se šroubovacím uzávěrem s objemem 2,8 ml, lahvička se pak zpracovává 2 minuty ve vodní lázni ultrazvukem při použití jednoho pulzu za sekundu. Střední objemový průměr kapek emulze po zpracování ultrazvukem byl 0,99 mikrometrů při měření přístrojem Cóulter Counter.

ae) Emulze perfluorpentanu, stabilizovaná směsí prostředků'

Pluronic F68 a Fluorad FC-170C, připravená homogenizací ml 10% roztoku Pluronic F68 se přidá ke 2 ml 1% roztoku Fluorad FC170C a 7 ml čištěné vody, načež se ke směsi přidá 1 ml perfluor-n-pentanu. Takto připravená disperze se pak homogenizuje s' použitím kombinace rotoru a statoru 2 minuty při 23 000 ot/min. Výsledná emulze se přenese do lahvičky z plastické hmoty s objemem 10 ml, opatřéné Šroubovacím uzávěrem a zpracovává ultrazvukem ve vodní lázni 2 minuty při použití jednoho pulsu za sekundu.

• « * · · ·

- 45 af) Emulze perfluorpentanu

250 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 100 ml čištěné vody se 5 minut zahřívá na 80 °C a výsledná disperze se chladí přes noc na 0 °C. Pak se 1 ml disperze přenese do lahvičky s objemem 2 ml a přidá se 100 mikrolitrů perfluorpentanu. Lahvička se 75 sekund protře.pává při použití září zeμ ní CapMix, Čímž vznikne emulze složky, schopné difúze, která se až do použití uloží při 0 ^UC.

ag) Di sp e řgo vání' lyofiližóváhé “dispěrzě 'plynného'perfluor butanu

Vzorek mléčně bílé disperse z příkladu la) se třikrát promyje vždy s odstředěním a odstraněním, infranatantu- a pak se přidá stejný objem 10% roztoku sacharosy. Výsledná disperze se lyofilisuje a pak se znovu disperguje v destilované vodě, čímž se získá mléčně bílá disperze mikrobublinek s objemovým středním průměrem 2,6 mikrometrů, měřeno pomocí zařízení Coulter Counter.

k .

ah) Disperze plynného perfluorpropanuOpakuje se způsob podle příkladu lh) s tím rozdílem, že se plynný perfluorbutan nahradí plynným perfluorpropanem. Výsledná mléčně bílá disperze mikrobublinek má střední objemový průměr bublinek 2,6 mikrometrů, měřeno pomocí zařízení Coulter Counter.

h ai) Emulze perfluorpentanu

100 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 100 ml čištěné vody se 5 minut zahřívá na 80 °C a. výsledná disperze se chladí přes noc na 0 °C. Pak se 1 ml disperze přenese *· · « · ·

- 46 do lahvičky s objemem 2 ml, načež se přidá 100 mikrolitrů perfluorpentanu. Lahvička se protřepává 75 sekund při použití přístroje CapMix, čímž vznikne emulze složky, schopné difúze, která se až do použití uloží při 0 °C.

aj) Emulze perfluorpentanu, připravená protřepáváním a stabilizovaná směsí Brij 58 a Fluorad FC-170C

400 mg prostředku Brij 58 se přidá k 10 ml 0,1% rozto.ku,Fluorad, FCT^ÓC^a^směs^še^ 1'hodinď mícjhá_při teplotě místností. Pak se 1 mí výsledného roztoku přenese do’ lahvičky s objemem 2 ml, do níž se přidá 100 mikrolitrů perfluorpentanu. Lahvička se pak 75 sekund protřepává při použití pří-_ .stroje CapMix, čímž se získá emulze složky, schopné difúze,, která se až do použití uloží při 0 °C.

ak) Emulze perfluorpentanu, připravená s použitím ultrazvuku a stabilizovaná směsí Brij 58 a Fluorad FC-170C400 mg prostředku Brij 58 se přidá k 10 ml 0,1% roztoku Fluorad FC-170C a směs se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti. Pak se přidá 1 ml perfluorpentanu a výsledná směs se 2 minuty zpracovává ultrazvukem, čímž se získá emulze, malých kapiček složky, schopné difúze. Tato emulze se až do použití uloží při 0 °C.

al) Emulze perfluor-4-methylpent-2-enu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí perfluor~4-methylpent-2-enem s teplotou varu 49 °C. Vzniklá emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0. °C.

• *

4

- 47 ·· 4 4 · · 4 · 4 4

4 4 44 44 4 444*44

444 444 · 4

4444 44 4 44 44 am) Emulze IH, IH, 2H-heptaf luorpent-l-enu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí IH,IH,2H-heptafluorpent-l-enem s teplotou varu 30 až 31 °C. Vzniklá emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

an) Emulze perfluorcyklópentenu

A·^·

UpaKUjě ae zpUSOQ· pOO±e priKJLUuU . Ί \ ±JL/ tíni

Puzdílem, že^- se^perfluorpentan ^nahradí-p-erfluorcykTopentenam ^_s teplO- ---tou varu 27 °C. Vzniklá emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

ao) Emulze perfluordimethylcyklobutanu

Opakuje se^způsob podle příkladu 11) s tím' rozdílem, že se perfluorpentan nahradí perfluordimethylcyklobutanem (užije se směs 1,2- a 1,3-isomerů s 'teplotou varu 45 °C). Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

I .

ap) Emulze azeotropní směsi perfluorhexanu a n-pentanu

4,71 g, 0,014 mol perfluor-n-hexanu s teplotou varu 59 °C (Fluorochem Ltd.) a 0,89 g, 0,012 mol n-pentanu s teplotou varu 36 °C (Fluka AG) se smísí na azeotropní směs, která vře při teplotě 35 °C. V jiné halvičce se 100 mg hydrogénovaného fosfatidylserinu ve 20 ml čištěné vody zahřeje na 5 minut na 80 °C a výsledná disperze se zchladí na teplotu místnosti. Pak se 1 ml disperze fosfolipidu přenese do lahvičky s objemem 2 ml, do níž se přidá 100 mikrolitrů azeotropní směsi. Pak se lahvička 45 sekund protřepává při použití přístroje CapMix.ža vzniku emulze složky, schopné difúze, která se až do použití uloží při 0 °C.

•·* »··

- 48 aq) Emulze perfluordimethylcyklobutanu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím tozdílem, že se perfluorpentan nahradí perfluordimethylcyklobutanem (s obsahem více než 97 % 1,1-isomeru, zbytek tvoří 1,2- a

1,3-isomery), Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

ar) Emulze perfluorhexanu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí perfluorhexanem s teplotou varu 57' °C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

as) Emulze perfluordimethylcyklobutanu, stabilizovaná fluorovaným smáčedlem

Opakuje se způsob podle příkladu lq) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí perfluorovaným distearoyifosfatidylcholinu v množství 5 mg/ml nebo směsí perfluorovaného distearoyifosfatidylcholinu a hydrogenovaného fosfatidylserinu v poměru 3 : 1 pří celkové koncentraci lipidů 5 mg/ml. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

at) Emulze 2,2,3,3,3-pentafluorpropylmethyletheru

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí 2,2,3,3,3-pentafluorpropylmethyletherem s teplotou varu 46 °C. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se uloží až do použití při 0 °C.

• to au) Emulze 2H,3H-dekafluorpentanu·

Opakuje se- způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí 2H,3H-dekafluorpentan s teplotou varu 54 °C. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

av) Emulze perfluordimethylcyklobutanu, stabilizovaná lysofosfatidylcholinem

Opakuje se způsob podle příkladu laq) s· tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradílysofosfatidylcholinem. Takto připravené emulze složkyschopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

aw) Emulze perfluordimethylcyklobutanu·, stabilizovaná směsí hydrogenovaného fosfatidylserinu a lysofosfatidylcho linu v poměru 1 ; 1

Opakuje se způsob podle příkladu laq)*s.tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí směsí hydrogenovaného fosfatidylserinu a' lysofosfatidylcholinu v poměru 1:1. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

ax) Emulze perfluordimethylcyklobutanu, stabilizovaná smáčedlem na bázi polyethylenglykolu 10 000·

Opakuje se způsob podle příkladu lqa) s tím rozdílem, že se disperze hydrogenovaného fosfatidylserinu nahradí roztokem alfa-(hexadekanoyloxyhexadekanoyl)-omega-methoxypolyethylenglykolu 10 000 ve vodě v množství 10 mg/ml. Vzniklá emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

- 50 ay) Emulse perfluordimethylcyklobutanu, stabilizovaná smáčedlem na bázi polyethylenglykolu 10 000

Opakuje se způsob podle příkladu laq) s tím rozdílem, že se disperse hydrogenovaného fosfatidylserinu,nahradí roztokem 'alfa-(16-hexadekanoyloxyhexadekanoyl)omega-methoxypolyethylenglykolu 10 000 ve vodě v množství 20 mg/ml. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při teplotě 0 °C.

1 7 ’Τ ” ** ' ' *- - - az) Mikřobubliňky, plněné- péřfluóřbůtanem,' zapouzdřené - ' fosfatidylserinem a RGDC-Mal-polyethylenglykol 2000-d.isearoylfosf.atidylethanolaminem

Ke směsi 4,5 mg fosfatidylserinu a 0,.5 mg¹ Mal.-polyethylenglykol 2000-distearoylfosfatidylethanolaminu--v lahvičce se přidá 1 ml roztoku s obsahem 1,4 % propylenglykolu a 2,4 % glycerolu ve vodě-. Disperze se zahřívá. 5 minut na 80 °C, zchladí se na teplotu místnosti a propláchne plynným perfluorbutanem. Pak se lahvička protřepává 45 sekund při použití přístroje CapMíx, načež se uloží na rotační -třepačku. Po odstředění se infranatant nahradí roztokem RGDC v pufru s fosfátem sodným o pH 7,5, načež se lahvička opět uloží na několik hodin na rotační třepačku.

ba) Mikřobubliňky, plněné perfluorbutanem a zapouzdřené fosfatidylserinem .a dipalmitoylfosfatidylethanolaminpolyethylengl-ykolem 2000

Do lahvičky s obsahem fosfatidylserinu a-dipalmitoylfosfatidylethanolaminpolyethylenglykolu 2000 v poměru 10 : 1 se přidá 2% roztok propylenglykolu ve vodě až do koncentrace lipidu 5 mg/ml. Disperze se 5 minut zahřívá na 80 °C a pak a β ft ·

ft ft ft · aaa o a a * · • a · » se směs zchladí na teplotu místnosti a prázdný prostor v lahvičce se propláchne plynným perfluorbutanem. Lahvička se 45 sekund protřepává' při použití přístroje CapMix a pak se uloží na rotační třepačku. Po promytí odstředěním a odstraněním infranatantu se přidá stejný objem vody s obsahem 10 % sacharosy. Výsledná disperze se lyofilizuje a v případě potřeby redisperguje přidáním vody za vzniku mléčně bílé disperse mikřobublinek.

bb) Mikrobublinky, naplněné perfluorbutanem a zapouzdřené fosfatidylserinem a distearoylfosfatidylethanolaminpolyethylenglykolem 5000 .

Do lahvičky, obsahující směs fosfatidylserinu a distearoylfosfatidylethanolaminpolye tnylenglykolu5000 v^poměru 10 : 1 se přidá 2% roztok propylenglykolu ve vodě až do koncentrace lipidu 5 mg/ml. Disperze se 5 minut zahřívá na 80 °C a pak se zchladí na teplotu místnosti, načež se prázdný prostor v lahvičce propláchne plynným perfluorbutanem. Lahvička se 45 sekund protřepává s použitím přístroje CapMix a pak se uloží na rotační třepačku. Po promytí odstředěním a odstranění infranatantu se přidá stejný objem vody s ob-sáhem 10 % polyethylenglykolu. Výsledná disperze se lyofilizuje a v případě potřeby redisperguje, čímž se získá mléčně bílá disperze mikřobublinek.

bc) Mikrobublinky, naplněné perfluorbutanem a zapouzdřené směsí fosfatidylserinu a dipalmitoylfosfatidylethanolaminpolyethylenglykolu 2000 ______{_}_________________{_}_____

Do lahvičky, obsahující směs fosfatidylserinu a dipalmitoylfosfatidylethanolaminpolyethylenglykolu 2000 v poměru 10 : 1 se přidá 2% roztok propylenglykolu. ve vodě až do koncentrace lipidu 5 mg/ml. Disperze se 5 minut zahřívá ···· i

- 53 Opakuje se způsob podle příkladu laq) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí směsí hydrogenovaného fosfatidylserinu a distearylfosfatldylethanolaminpolyethylenglykolu 5000 v poměru 10 : 1. Takto připravená emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

bg) . Lyofilizované mikrobublinky, naplněné perfluorbutanem a redispergované v emulzi ml QnnS bií 1 á di οΡιΔρση ririinYOvciritÍ! λλ/Ί 1 δ Ληί 1/1 oHn

*. «-> _l_ L_J px _/ j. 4_J ·_» j tť *· ·*· i Xiixwavl dbp-se-^-ř-i-k-rát -promyje- od-s-t-ředěním^a- odst-raněním- -i-nfranatan- --—* tu,' načež se přidá stejný objem 10% roztoku' sacharosy. Výsledná-disperze se lyofilizuje a pak se redisperguje těsně před použitím v emulzi, připravené způsobem podle příkladu laq).., bh) Kapičky emulzeavidinylovaného perf-luordimethylcyklobutanu

4,5 mg distearoylfosfatidylserinu a 0,5 mg biotindipalmitoylfosfatidylethanolaminu se uloží do čisté lahvičky,, a přidá se 1,0 ml 2% roztoku propylenglykolu. Směs se zahřeje na 80 °C a pak se zchladí na teplotu místnosti. Pak se přidá ještě 100 mikrolitrů perfluordimethylcyklobutanu a lahvička se 75 sekund'protřepává v přístroji CapMix za vzniku emulze složky, schopné difúze. Zředěný vzorek 100 mikrolitrů emulze v 1 ml vody se inkubuje s přebytkem avidinu a uloží na rotační třepačku. Pak se emulse důkladně promyje vodou á zahustí odstředěním.

bi) Emulze lH-tridekafluorhexanu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí ΙΗ-tridekafluorhexanem s tep- .

lotou varu 71 °C. Získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

• * • φ φ «

Φ Sů> Φ • Φ· ΦΦ Φ

Φ’ Φ φ · Φφ

- 54 bj) Emulze perfluorheptanu

Opakuje se způsob podle příkladu 11) s tím rozdílem, že se perfluorpentan nahradí perfluorheptanem s teplotou va4 ru 80 až 85 °C. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží při 0 °C.

* bk) Emulze perfluordimethylcyklobutanu s fosfatidylserinem

*. a fluorescenčním streptavidinem x ... Ar* < - * - » ' -ŤF »!» ·· * ”·^· ' ““ ·· -» 4--1 -4 -h- · T-; —L II τ - -rla. f

--------------------4-,-5 mg--distearoylfosfatidylserinu a 0,5 mg biotindipalmitoylfosfatidyldiethanolaminu se uloží do čisté lahvičky a přidá se 1,0 ml 2% roztoku propylenglykolu. Směs se zahřeje na 80 °C a pak se zchladí na teplotu místnosti. Přidá se 100 mikrolitrů perfluordimethylcyklobutanu a lahvička se protřepává 75 sekund při použití zařízení CapMix za vzniku ' emulze složky, schopné difúze. Zředěný vzorek 100 mikrolitrů emulze v- 1 ml vody se inkubuje s přebytkem fluorescenčního streptavidinu ve fosfátovém pufru a uloží se na rotační třepačce. Pak.se zředěná emulze důkladně promyje vodou a zahus tí se odstředěním-.

, bl) Dispergování lyofilizované disperze plynného perfluor-, butanu

Vzorek mléčně bílé disperze, připravené podle příkladu la) se třikrát promyje odstředěním a odstraněním' infranatan► · tu a pak se přidá, stejný objem 10% roztoku sacharosy. Výsledná disperze se lyofilizuje a těsně před použitím redisperguje v destilované vodě... ...... ,.....

• 9 ·· ΦΦΦ • Φ

Φ

• · • * *

bm) Emulze perfluordimethylcyklobutanu, stabilizovaná sterilizovaným fosfatidylserinem

Opakuje se způsob podle příkladu laq) s tím rozdílem, že se hydrogenovaný fosfatidylserin nahradí sterilizovaným roztokem hydrogenovanéhofosfatidylserinu. Takto získaná emulze složky, schopné difúze se až do použití uloží.při 0 °C.

bn) Disperze plynného perfluorpropanu

.......... - - ...... ~ — *····· μOpakuje se způsob podle příkladu la')S tím·-.rozdílem, že se plynný perfluorbutan nahradí plynným- perfluorpropanem.

bo) Dispergovaný prostředek Echovist

0,25 g.prostředku Echovist ve formě granulátu (Schering AG) se disperguje v 1,15 ml emulze, připravené způsobem podle příkladu laq).

bp) Disperze plynného perfluorbutanu

500 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu se přidá ke 100 ml roztoku 1,5 % propylenglykolu a 5,11 % glycerolu ve vodě a směs se 5 minut zahřívá na 80 °C, načež se nechá zchladnout na teplotu místnosti. Pak se podíly po 1 ml přenesou do lahviček s objemem 2 ml, prázdné prostory lahviček se propláchnou plynným perfluorbutanem, lahvičky se protřepávají 45 sekund na přístroji CapMix a pak se uloží na rotač- ní třepačku.

bg) Příprava mikrobublinek, obsahujících biotinylovaný perfluorbutan

9 9

9

9 9

999 ' «

9·

4,5 mg distearoylfosfatidylserinu a 0,5 mg biotindipalmitoylfosfatidylethanolaminu se uloží do čisté lahvičky a přidá se 1,0 ml roztoku s obsahem 1,4 % přopylenglykolu i Q _x a 2,4 % glycerolu. Směs se zahřeje na 78 C, pak se zchladí na teplotu místnosti a prázdný prostor v lahvičce se propláchne perfiuorbutanem. Lahvička se protřepává 45 sekund při použití přístroje CapMix a pak se uloží na 16 hodin na rotační třepačku. Výsledné bublinky se důkladně promyjí de ionizovanou vodou.

_ — A A, - t, „ ». -4» . 4*- ,_p ,. „ τ _ br) Aerogely

Pyrolyzované částice aerogelu resorcinolu a formaldehydu (Dr. Pekala, Lawrence, Livermore National Laboratory) se smísí s 300 mikrolitry vody, jednou kapkou pufru o pH 9 a 5 až 10 kapkami 1% Pluronic F68. Částice aerogelu se rychle

t.

usazují, avšak nedochází k jejich shlukování.

bs) Malé bublinky

Pryžová trubice s vnitřním průměrem 8 mm a přibližnou délkou 20 cm se vertikálně uloží do stojanu, uzavřeném na spodním konci a naplní disperzí mikrobublinek z příkladu la) s tím rozdílem, že se k přípravě disperze mikrobublinek užije homogenizátor Ystral s rotorem a statorem. Po dvou hodinách se do spodní části pryžové trubice zavede injekční stříkačka, spojená s kanylou a odebere se 1 ml frakce mikrobublinek, frakcionovaných podle velikosti. Přístrojem Coulter Counter bylo prokázáno, že střední průměr mikrobublinek byl tt

1,2 mikrometrů.

bt) Disperze plynného perfluorbutanu, stabilizovaná směsí 5% albuminu a 5% destrosy 1 : 3 • * • » * · · • · · · · · · 9 • · ··.··· « ··· ··· • · · · · · * « ♦* ·♦·· · «· * +

- 57 20% lidské sérum se zředí až na koncentraci 5 % čištěnou vodou. Vzorek 5 ml zředěného albuminu se dále zředí 15 ml 5% glukosy a výsledná směs se přenese do lahvičky. Prázdný prostor lahvičky se propláchne plynným perfluorbutanem a obsah lahvičky se 80 sekund zpracovává ultrazvukem, čímž se získá mléčně bílá disperze mikrobublinek.

bu) Disperze Buckminsterfullerenu Cg₀ __Buckminsterfulleren se^přidá^k. 1 ml ,2,5%. lidského,. .

sérového albuminu v lahvičce s objemem 2 ml a lahvička se 75 sekund protřepává v přístroji CapMix.

by) Disperze plynného fluoridu sírového

Stabilizované mikrobublinky byly připraveny s použitím směsi distearoylfosfatidylcholinu a dipalmitoylfosfatidylglycerolu v poměru 10 : 1 způsobem podle příkladu 5 přihlášky WO 94/09829. Postupuje se tak, že se 50 mg distearoylfosfatidylcholinu, 5 mg dipalmitoylfosfatidylglycerolu a 2,2 g· polyethylenglykolu 40.00 rozpustí ve 22 ml terč .butanolu při teplotě 60 °C, načež se roztok rychle zchladí na -77 °C a přes noc se lyofilizuje. 100 g výsledného prásku se vloží do lahvičky, prázdný prostor se vyčerpá a pak naplní fluoridem sírovým. Těsně před použitím se přidá 1 ml čištěné vody za vzniku disperze mikrobublinek.

bw) Emulze 2-methylbutanu

100 mg hydrogenovaného fosfatidylserinu ve 20 ml čištěné vody se 5 minut zahřívá na 80 °C a výsledná disperze se přes noc chladí v lednici. Pak se 1 ml disperze přenese do lahvičky s objemem 2 ml a přidá se 100 mikrolitrů 2-methylbutanu. Lahvička se 75 sekund protřepává při použití přístroje • · ·· • · ♦ ♦ · · • · · · ····

CapMix za vzniku emulze složky, schopné difúze, která se až do použití uloží při 0 °C bx) Disperze lyofilizovaného plynného perfluorbutanu ve vodném hydrogenuhličitanu sodném

Vzorek mléčně bílé disperze, získané podle příkladu la) se třikrát promyje odstředěním a odstraněním infranatantu, načež se přidá stejný objem 10% roztoku sacharosy. Výsledná disperze se. lyofilizuje a pak redisperguje v 0,1 M roztoku hydrogenuhličitanu sodného'.'. - ’ - by) Disperze plynného perfluorbutanu

Disperze perfluorbutanu se připraví podle příkladu la). Disperze se třikrát promyje čištěnou vodou s odstředěním a odstraněním infranatantu, čímž se získá mléčně bílá disperze mikrobublinek.

bz) Disperse plynného perfluorbutanu s částicemi oxidu šelezitého

K 1 ml disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lby) se přidá 1 ml čištěné vody. Hodnota pH se zvýší na 11,2 přidáním hydroxidu amonného a disperze se na 5 minut zahřeje na 60 °C. Přidá se 0,3 ml nepovlečených částic oxidu železitého, 4,8 mg Fe/ml a disperze se nechá stát 5 minut. Pak se pH upraví kyselinou chlorovodíkovou na 5,9, čímž vznikne hnědá disperze, která se v krátké době rozdělí na horní vrstvu s hnědými částicemi a Čirou nezbarvenou spodní vrstvu, sraženina se nevytvoří.

• · ·· «··· • · · · • * · ♦ ·»· »»» ca) Disperse plynného perfluorbutanu s částicemi oxidu železitého

K 1 ml disperse plynného perfluorbutanu podle příkladu lby) se přidá 0,3 ml nepovlečených částic oxidu želesitého s obsahem 4,8 mg Fe/ml při pH 7, čímž se získá hnědá disperze, která se stáním dělí na horní vrstvu s hnědými mikrobublinkami, čirý ínfranatant, sraženina se netvoří.

cb) Srovnávací příklad

K 1 ml roztoku hydrogenovaného fosfatidylserinu v čištěné vodě (obsah lipidu 5 mg/ml) se přidá o,3 ml nepovlékaných částic oxidu železitého (4 mg Fe/ml) za vzniku hnědé disperze, z níž se stáním vyloučí hnědá sraženina.

cc) Disperze plynného perfluorbutanu s částicemi oxidu železitého, povlékanými kyselinou olejovou

0,259 g, 1,3 mmol FeCl^ . áH^O a 0,703 g, 2,6 mmol FeClg . 614^0 se rozpustí v 10 ml čištěné vody a přidá se

1,5 ml hydroxidu amonného. Výsledné částice oxidu železa se pětkrát promyjí 25 ml čištěné vody. K Částicím se přidá zředěný hydroxid amonný a suspenze se zahřeje na 80 °C. Přidá se 0,15 g kyseliny olejové a disperze se nechá stát 5 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 10 ml čištěné vody a pH se upraví na 5,4 kyselinou chlorovodíkovou. Disperze se 15 minut zpracovává působením ultrazvuku, načež se infranatant odstraní a částice se uvedou do suspenze v 5 ml 2-methylbutanu, . čímž se získá Černě zbarvená disperze.

mg distearoylfosfatidylcholinu a 2,5 mg dimyristoylfosfatidylglycerolu se rozpustí při teplotě 60 °C v 11 ml terč.butanolu a přidá se 0,1 ml svrchu získaných částic ♦

·» · · » · « • · · ·· · ·· ·

- 60 • · ‘ « ·’ · • · · • · · «·» • a ··· oxidu železitého a 1,1 g polyethylneglykolu 4000. Disperze se 10 minut zahřívá na 60 °C,.načež se rychle zchladí na -77 °C a lyofilizuje. Podíl .100 mg lyofilizovaného materiálu se vloží do lahvičky s objemem 2 ml, která se pak vyčerpá a dvakrát propláchne plynným perfluorbutanem. Lyofilizovaný materiál se pak disperguje v 1 ml čištěné vody a dvakrát se promyje čištěnou vodou odstředěním a odstraněním infranatantu a sraženiny. Stáním se disperze rozdělí na světle šedou spodní a plovoucí horní vrstvu.

- -- --Příklad-2 — .......- -- - j- ♦ ~ » .· w — > *

Charakteristika růstu míkrobublinek in vitro při pozorování mikroskopern ,

a) Jedna kapka disperze plynného perfluorbutanu z příkla du la) se při teplotě 4 °C- zředí jednou kapkou čištěné vody,. , přesycené vzduchem, rovněž při teplotě přibližně 4 °C na podložním skle mikroskopu, zchlazeném na 4 °C a pak se disperze pozoruje při zvětšení 400x. Bylo pozorováno, že se velikost míkrobublinek mění v rozmezí 2 až 5 mikrometrů. Pak byla teplota zvýšena přibližně na 40 °C, čímž bylo možno pozorovat podstatné zvětšení míkrobublinek, přičemž nejvíce se zvětšily největší bublinky. Po 5 minutách byl počet mikrobubllnek podstatně snížen.

b) ' Srovnávací příklad

Jedna kapka emulze 2-methylbutanu z. příkladu lc), zchlazené v ledové lázni ha přibližně 0 °C byla uložena na podložní- sklo mikroskopu', zchlazeném na 0 °C a pozorována při zvětšení 400x. Bylo pozorováno, že kapičky olejové fáze měly velikost 2 až 6 mikrometrů. Po zvýšení teploty na 40 °C nebylo mošno pozorovat tvorbu žádných bublinek.

• · « • * · •a ··· • · · ·-· · *·· ···

c) Vzorek 0,5 ml disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí 50 ml čištěné vody a zchladí na O °C. Část 1 ml této zředěné disperze se smísí s podílem 100 mikrolitrů emulze 2-methylbutanu z příkladu lc). Pak se jedna kapka výsledné směsi uloží na podložní sklo mikroskopu, udržované na 0 °C a překryje se krycím sklíčkem, rovněž zchlazeným na 0 °C. Teplota podložního skla se postupně zvýší na 40 °C. V průběhu zahřívání je možno pozorovat rychlé a podstatné zvětšování mikrobublinek, tento jev byl potvrzen měřením při použití zařízení Malvern Mastersizer.

Tíh - . - - - «-Ι»*. , . h _ , . ·· — '

d) Srovnávací příklad

Vzorek 0,5 ml disperze perfluorbutanu z příkladu la)' se zředí 50 ml čištěné· vody· a zchladí v ledové lázni na 0 °C.' Podíl 1 ml této zředěné disperze se smísí se 100 mikrolitry disperze hydrogenovaného fosfatidylserinu s obsahem 5 mg lipidu/ml čištěné vody, rovněž při 0 °C. Pak se jedna kapka směsi uloží na podložní sklo mikroskopu, zchlazené - na 0 °C a pozoruje při zvětšení 400x. Mikrobublinky mely průměr 2 až 5 mikrometrů. Při zvýšení teploty na 40 °C bylo pozorováno zvýšení průměru mikrobublinek, bylo vsak méně výrazné a méně rychlé než v příkladu 2c),

e) Vzorek disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí čištěnou vodou v poměru 1:1a zchladí na 0 °C. Ke zředěné disperzi se na podložním skle mikroskopu, zchlazeném na 0 °C přidá jedna kapka emulze 2-chlor-l,1,2-trifluorethyldifluormethyletheru z příkladu le) a překryje se krycím sklem, rovněž zchlazeným na 0 °C. Teplota podložního skla se postupně zvyšuje na 40 °C, přičemž je možno pozorovat rychlý a podstatný vzestup velikosti mikrobublinek.

V · • ft · ··· ··« • · ft · · · « ftft · ft « « ft · ftft· · ft ft · ft« -ft ft·« «· ft ·

- 62 f) Vzorek disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí čištěnou, vodou v poměru 1:1a zchladí na 0 °C. Na podložním skle, udržovaném na 0 °C se přidá ke zředěné disperzi mikrobublinek jedna kapka emulze 2-brom-2-chlor-j., 1,1-trifluorethanu z příkladu If) a směs se překryje krycím sklem, rovněž s teplotou 0 °C. Teplota podložního skla se postupně, zvyšuje na 40 °C, přičemž je možno pozorovat rychlé a podstatné zvětšení mikrobublinek.

V r, Λ 1 r Λ .«η ^;zoiSK íiiopci.óc peiiiuorbutanu z přikladu laj” se zře — ďí-čištěnou vodou v poměru -1:1a zchladí na 0 °C. Ke zředěné disperzi mikrobublinek se na podložním skle mikroskopu, udržovaném na 0 °C přidá jedna kapka emulse l-chlor-2,2,2ř

-trifluorethyldifluormethylétheru z příkladu lg) a směs se překryje krycím sklem rovněž s teplotou 0 C. Teplota podložního skla se postupně zvyšuje na 40 °C, přičemž je možno pozorovat rychlé a podstatné zvětšení mikrobublinek.

h) Na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 50 °C se uloží jedna kapka disperze mikročástic polymeru a lidského sérového albuminu z příkladu lh) a jedna kapka emulse perfluorpentanu z příkladu lk) a mikrobublinky se pozorují při zvětšení 400x. Po smísení kapek lze pozorovat podstatné zvětšování mikrobublinek.

i

i) Na podložním skle mikroskopu, zahřáté na 40 °C se smísí jedna kapka disperze mikročástic polymeru a lidského sérového albuminu z příkladu lh) a jedna kapka,emulze 2-methylbutanu z příkladu Ij) a směs se pozoruje ve zvětšení 400x.

Po smísení lze pozorovat významné a velmi rychlé zvětšování mikrobublinek.

j) Na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 50 °C se uloží jedna kapka disperse mikročástic polymeru a želatiny z příkladu •

- 63 • · 1 ·» ··«· • · ·· • ♦ ♦ « • ··* ··· * · li) a jedna kapka emulze perluorpentanu s příkladu lk) a směs se sleduje ve zvětšení 400x. Po smísení kapek je možno pozorovat podstatné zvětšení mikrobublinek.

k) Na' podložním skle mikroskopu, zahřátém na 40 °C se smísi jedna kapka disperze mikročástic polymeru a želatiny z příkladu li) a jedna kapka emulze 2-methylbutanu z přikladu Ij) a směs se pozoruje při zvětšení 400x. Po smísení lze pozorovat rychlé a podstatné zvětšení mikrobublinek.

----- * * —. - ·, »

l) Srovnávací příklad

Jedna, kapka emulze perfluorpentanu z příkladu .lk) se uloží na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 50 °C a sleduje se při zvětšení 400x. Není možno pozorovat mikrobublinky.

m) Srovnávací příklad

Jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lj) se uloží na podložní sklo mikroskopu s teplotou 40 °C a sleduje se při zvětšení 400x.Mikrobublinky se nevytvoří.

n.) Srovnávací příklad

Jedna kapka disperze mikročástic polymeru a lidského sérového albuminu z příkladu Ih) se uloží na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 40 °C a sleduje se při zvětšení 400x. Není možno pozorovat žádnou změnu.

o) Srovnávací příklad

Jedna kapka disperze mikročástic. polymeru a želatiny z příkladu li) se uloží na. podložní sklo mikroskopu s teplotou • * • ·

- 64 • toto · ·· ···· ·· °C a sleduje se při zvětšení 400x. Není možno pozorovat žádnou změnu.

p) Jedna kapka disperze mikrobublinek vzduchu, stabilizovaných lidským sérovým albuminem podle US 4 718 433 a jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lj) se uloží na-podložní sklo mikroskopu s teplotou 20 °C a směs se sleduje při zvětšení 400x. Po smísení je možno pozorovat podstatné zvětšení mikrobublinek.

’Γ⁴“ -p· — '*» * . *, .

q) Vzorek disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí čištěnou vodou v poměru 1.: 1 a zchladí na 0 °C. Jedna kapka emulze směsi perf luordekalinu a perf luorbutanu z- příkladu lz) se k disperzi přidá na podložním· skle mikroskopu s teplotou 0 °C a překryje se krycím sklem, rovněž s teplotou 0 °C. Pak se teploty podložního skla postupně zvýší na 40 °C. Je možno pozorovat rychlé a podstatné zvětšování mikrobublinek.

r) Vzorek disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí čištěnou vodou v poměru 1:1a zchladí na 0 °C. Ke zře.A děné disperzi se. na podložním skle mikroskopu s teplotou 0 °C přidá jedna kapka emulze směsi perfluordekalinu a perfluorpropanu z příkladu laa) a směs se překryje krycím sklem, rovněž s teplotou 0 °C. Teplota podložního skla se postupně zvýší na 40 °C, přičemž je možno pozorovat rychlé a podstatné zvětšení mikrobublinek.

s) * Vzorek disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí čištěnou vodou v poměru 1:1a zchladí na 0 C. Jedna kapka emulze směsi perfluordekalinu a fluoridu sírového z příkladu lab) se ke zředěné disperzi přidá na podložním skle mikroskopu s teplotou 0 °C a směs se překryje krycím sklem, rovněž s teplotou 0 °C. Pak se teplota podložního skla postupně <·♦ ·· ·

- 65 ·* ···· zvýší na 40 °C, v průběhu zahřívání lze pozorovat po 4 až minutách zvětšování bublinek, které je však méně podstatné a méně rychlé než v příkladech 2q) a 2r).

t) Vzorek disperze perfluorbutanu z příkladu la) se zředí čištěnou vodou v poměru 1:1a zchladí na 0 °C. Ke zředěné disperzi mikrobublinek se na podložním skle mikroskopu s teplotou 0 °C přidá jedna kapka emulze perfluorpentanu z příkladu lad), stabilizované Pluronic F68 a směs se překryje krycím sklem s teplotou 0 °C. rak se teplota podložního skla .. . postupně' zvyšuje na 40 °C, přičemž je- možno--pozorovatVýchlyč l.’/: a’podstatný-růst mikrobublinek.

u) Jedna kapka disperze perfluorbutanu z příkladu la) a jedna kapka emulze perf luorpentanu, stabilizované směsí ,^+,‘

Brij '58 a-Fluorad FC--170C z přikladu laj) se u-íoží ha podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 40 °C a směs se sleduje při zvětšení 400x. Po krátkém časovém intervalu je' možno po- , zorovat pomalý růst mikrobublinek.

v) Jedna kapka disperze perfluorbutanu z příkladu la) a jedna kapka emulze perfluorpentanu, stabilizované směsí Brij 58 a Fluorad FC-170C z příkladu lak) se uloží na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 40 °C a směs se sleduje při zvětšení 400x. Po chvíli lze pozorovat růst mikrobublinek.

w) Jedna kapka disperze perfluorbutanu z příkladu la) a jedna kapka emulze perfluo.r-4-methylpent-2-enu z příkladu lal.) se. uloží na podložní sklo mikroskopu, zahřátého na 40 °C a směs se sleduje při zvětšení 400x. Po krátkém časovém intervalu lze pozorovat pomalý růst mikrobublinek.

x) Jedna kapka disperze perfluorbutanu z příkladu la) a jedna kapka emulze ΙΗ/fH,2H-heptafluorpent-l-enu z příkladu.

99 99 9

- 66 • · « « · · * • · · · * · •· ··#· ·« · lam) se uloží na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 40 °C a směs se pozoruje při zvětšení 400x. Po smísení kapek je možno pozorovat významné a rychlé zvětšování mikrobublinek.

y) Jedna kapka disperze plynného perfluorbutanu z příkladu la) a jedna kapka emulze perfluorcyklopentanu z příkladu lan) se uloží na podložní sklo mikroskopu, zahřáté na 40 °C a směs se .sleduje při zvětšení 400x. Po smísení kapek je možno pozorovat rychlé a významné zvětšování mikrobublinek.

z) *- 400 mikrolitrů disperze plynného-perfluorbutanu,.z pří-, kladu lb) se přenese do lahvičky s objemem' 2 ml při teplotě místnosti a přidá se 100 mikrolitrů azeotropní emulze z příkladu lap). Jedna kapka směsi se pak uloží na podložní sklo mikroskopu, udržované na 20 °C. Pak se teplota podložního skla rychle zvýší na 37°C. Bylo možno pozorovat významné a rychlé zvětšování mikrobublinek.

aa) Jedna kápka biotinylovaných mikrobublinek z příkladu . lbq) se přidá k jedné kapce emulze z příkladu lbh) na.podložním skle mikroskopu, zahřátém.na 60 °C a směs se pozoruje při zvětšení 400x. Po smísení kapek je možno pozorovat významné zvětšení mikrobublinek a. hromadění mikrobublinek na shlucích kapiček emulze.

ab) Mikrobublinky, připravené podle příkladu lbq) je možno analyzovat průtokovou cytometrí-í, například při .použití emulze fluorescenčního streptavidinu, připravené podle příkladu lbk), čímž je možno· prokázat vazbu streptavidinu na biotinylované mikrobublinky.

ac) Jedna kapka disperze prostředku Echovist, připravené podle příkladu lbo) se uloží na podložní sklo mikroskopu a udržuje na teplotě 37 C. Vzorek se překryje krycím sklem • · · · · ·

- 67 a pozoruje pod mikroskopem. Je možno pozorovat významný růst mikrobublinek.

ad) Jedna kapka disperze aerogelu z příkladu lbr) se uloží na podložní sklo mikroskopu a udržuje na teplotě 37 °C. Vzorek se překryje krycím sklem a uloží pod mikroskope Ke hraně- podložního skla se přidá kapka emulze- 2-methylbutanu (z příkladu lc) s tím rozdílem,že se užije 100 mikrolitrů 2-methylbutanu místo 200 mikrolitrů) tak, že emulze pronikne do disperze .aerogelu. Při zvýšení teploty na přibližně 60 °C dojde v částicí civ^-aerogelu ke ' vzniku' mikrobublinek. - ae) srovnávací: Jedna kapka disperze aerogelu z příkladu lbr) se uloží na podložní sklo mikroskopu a udržuje na teplotě 20 °C. Vzorek se překryje krycím sklem a pozoruje pod mikroskopem, přičemž teplota se zvýší na 60 °C. Nebylo možno pozorovat tvorbu žádných mikrobublinek.

af) Jedna kapka disperze mikrobublinek z příkladu lbs) se uloží na podložní sklo mikroskopu. Vzorek se překryje krycím sklem a uloží do mikroskopu, přičemž teplota vzorku se . udržuje na 20 °C. Pak še k hraně krycího skla přidá jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lc) tak, že emulze pronikne do disperze mikrobublinek. V průběhu míšení není možno pozorovat zvětšování mikrobublinek. Po zvýšení teploty na 40 °C však dochází k významnému zvětšování mikrobublinek.

ag) srovnávací: Jedna kapka disperze mikrobublinek z příkladu lbs) se uloží na podložní sklo mikroskopu. Vzorek se překryje krycím sklem a uloží do mikroskopu, přičemž· teplota vzorku se udržuje na 20 °C. Po zvýšení teploty'na40 °C není možno pozorovat žádné zvětšování mikrobublinek.

ah) Ke granulátu EchovistSchering AG) na podložním skle mikroskopu se přidá jedna kapka rozpouštědla pro granulát · 4 4 4 4

- 68 • · 4 4 4 4 4 4 ··· v * 4

4 4«·· ·· 4 4 4 44

Echovist při teplotě místnosti. Pak se přidá ještě jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lbw) a směs se pozoruje při zvětšení lOOx, Po smísení kapek je možno pozorovat podstatné zvětšování mikrobublinek.

ai) Jedna kapka prostředku Levovist pro injekční podání a jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lbwj se uloží na podložní sklo mikroskopu při teplotě místnosti a pozoruje se při zvětšení 400x. Po smísení kapek j.e možno pozorovat rychlé a významné zvětšování mikrobublinek.

aj) Jedna kapka disperze plynného perfluorbutanu z příkladu 1 br) a jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lbw) se uloží na podložní sklo mikroskopu při teplotě místnosti a pozoruje, se při zvětšení 400x. Po smísení kapek je možno pozorovat rychlé a významné zvětšování mikrobublinek.

ak) Jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lby) se přidá k jedné kapce disperze Buckminsterfullerenu Οθθ z příkladu lbu) na podložním skle mikroskopu při teplotě 40 °C.

Po smísení kapek dochází k významnému a rychlému zvětšování mikrobublinek.

al) Jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lbw) se přidá k jedné kapce disperze plynného fluoridu sírového z příkladu Ibv) na podložním-skle mikroskopu při teplotě 40°C. Po smísení kapek dojde k významnému a rychlému zvětšování mikrobublinek.

am) Jedna kapka.0,5 M kyseliny chlorovodíkové se přidá k jedné kápce disperze plynného perfluobutanu ve 'vodném roztoku hydrogenuhličitanu sodného z příkladu lbx) na podložním skle mikroskopu při teplotě místnosti. Po smísení kapek dojde k rychlému a významnému zvětšování mikrobublinek s krátkou životností..

444 444

- 69 4 4 •4 4«44 an) Jedna kapka emulze 2-methylbutanu, připravené podle příkladu lbw) se přidá k jedné kapce disperze plynného perfluorbutanu s částicemi oxidu železa z příkladu lbz) na podložním skle mikroskopu při teplotě místnosti. Po smísení kapek je možno pozorovat rychlé a významné zvětšování mikrobublinek.

ao) Jedna kapka emulze 2-methylbutanu, připravené podle příkladu lbw) se přidá k jedné kapce disperze plynného perflucrbutanu^ s· částícemi<oxl-du-šeiezi'tého ž'příkladu lca) na podložním skle mikroskopu při teplotě místnosti. Po smísení kapek dochází k rychlému a významnému zvětšení mikrobublinek, ap) srovnávací: Jedna kápka emulze 2-methylbutanu z příkladu lbw) se přidá k jedné kapce disperze částic oxidu železa z příkladu lcb) na podložním skle mikroskopu při teplotě místnosti. Nevzniknou žádné mikrobublinky.

aq) Jedna kapka emulze 2-methylbutanu z příkladu lbw) se přidá k jedné kapce disperze plynného perfludrbuťanu s Částicemi oxidu železa, opatřenými povlakem kyseliny olejové z příkladu lcc) na podložním skle mikroskopu při teplotě místnosti. Po smísení kapek dochází k rychlému a významnému zvětšování mikrobublinek.

ar) 1 ml disperse mikrobublinek, připravené podle příkladu lbp) se zředí 50 ml vody. Pak se jedna kapka zředěné disperze přidá k jedné kapce sodové vody na podložním kle mikroskopu při teplotě místnosti. Po smísení kapek se možno pozorovat spontánní zvětšování mikrobublinek.

as) 0,4 mikrolitrů biotinylované disperze mikrobublinek, připravené podle příkladu lbq) a 0,02 ml emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravené podle příkladu Ibh) se postupně přidá do nádoby, obsahující 200 ml prostředku Isoton s.

* « • ·

teplotou 37 °C za kontinuálního míchání. Směs se inkubuje 20 sekund. Pak se nechá roztokem procházet po jednotlivých pulsech ultrazvuk (10 kHz frekvence, 100 mikroj v každém pulsu) při trvalém průchodu 2,5 MHz roztokem, směs se pozoruje v ostrém postranním světle proti tmavému pozadí.

V dráze paprsku je okamžitě možno pozorovat jasný pás větších bublinek.

at) Jedna kapka disperze mikrobublinek, připravené podle příkladu lbl) se uloží na podložní sklo mikroskopuVzorek se překryje krycím sklem a uloží do mikroskopu, přičemž teplota se udržuje na 20 °C. Pak se na hranu krycího skla přidá jedna kapka emulze perfluordimethylcyklobutanu,,. připravená podle příkladu las) tak, aby emulze mohla proniknout do disperze mikrobublinek. Při zvyšování teploty na přibližně 60 °C je možno pozorovat významné zvětšování mikrobublinek.

Příklad 3

Rozměr mikrobublinek in vitro a distribuce

a) Měření při použití přístroje Malvern Mastersizer

Růst mikrobublinek a změny v '.distribuci jejich velikosti po smísení se složkou, schopnou difúze se analyzuje pomocí přístroje Malvern Mastersizer 1002, opatřeného čoc- kou s průměrem 45 mm a rozsahem měření 0,1. až 80 mikrometrů. Komůrka přístroje obsahuje 150 ml prostředku Isoton II a je spojena s lázní termostatu s nastavitelnou teplotou v rozsahu 9 až 37 °C. Do komůrky pro vzorek se vloží 110 mikrolitrů disperze plynného perfluorbutanu z příkladu la) a po dosažení rovnováhy se přidá podíl 5.00 mikrolitrů emulze 2-methylbutanu z příkladu lc). Roztok Isotonu II se Čerpá' příastrojem Mastersizer s termostatickou lázní tak, aby

- 71 φ · φ φφφ φφφ Φφ φφφ φ φ φφ φφφφ φφ φ ·· φφ prošel měřicí buňkou každých 30 sekund. Toto opakované měření každých 30 sekund se provádí 3 minuty. Pak se teplota Isotonu II zvýší postupně na vyšší hodnoty a provádí se další měření. Za obdobných podmínek se odděleně analyzuje také disperze plynného perfluorbutanu a emulze 2-methylbutanu.

Analýza samotné disperze plynného perfluorbutanu ukázala, že při teplotě 9 °C má 82 % mikrobublinek průměr menší než 9,9 mikrometrů. . Tento podíl.„se ..sníží ..na. 31. %. při zvýšení teploty na 37 °C. Tato teplotní změna byla doprovázena odpovídajícím zvýšením podílu mikrobublinek s průměrem 15 až 80 mikrometrů z 8 na 42 %,

Po smísení disperse plynného perfluorbutanu a emulze 2-methylbutanu při teplotě 9 °C je možno pozorovat mírné zvýšení průměru mikrobublinek. Při zvýšení teploty na 25°C dochází k rychlému zvětšování mikrobublinek, takže přibližně 81 % mikrobublinek má průměr v rozmezí 15 aŽ 80 mikrometrů. Další zvýšení teploty pak vede ke zvětšování mikrobublinek a na průměry, které se již nacházejí mimo rozsah měření použitého přístroje.

Smísení disperze plynného perfluorbutanu a emulze 2-methylbutanu při teplotě' 37 °C vede k rychlému zvětšování mikrobublinek. Po jednom měřicím cyklu po 30 sekundách mělo 97 % mikrobublinek průměr v rozmezí 15 až 80 mikrometrů.

b) Měření s použitím přístroje Coulter Multisizer

Zvětšování mikrobublinek a změny v distribuci jejich rozměru po smísení se složkou, schopnou difúze je možno analyzovat při použití přístroje Coulter Multisizer II, opatřeného otvorem s průměrem 50 mikrometrů a s rozsahem měření

9·«

9

- 72 1 až 30 mikrometrů. Obě složky každého vzorku se uloží do komůrky pro vzorek, obsahující 200 ml prostředku Isoton II, předehřátého na 37 C a měření se provádějí při této teplotě. Distribuce průměru bublinek ve směsi se měří okamžitě a pak 1,5 minuty po vložení vzorku. Pak se na vzorek působí 1 minutu ultrazvukem při použití 2,25 MHz převaděče, spojeného s generátorem pulsů, použitá energie byla 100 mikroJ.

b)(i) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu »lag) a emulze perfluorbutanu z^-přikladu-11) vede k rychlému a.podstatnému zvětšování mikrobublinek po expozici ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýšila z původních 3 % až na přibližně 16 %.

b)(ii) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu, lag) a emulze perfluorbutanu z příkladu lm) vede k rychlému a významnému zvětšování mikrobublinek. Celková objemová koncentrace stoupla z jednoho procenta na přibližně 6 %.

b)(iii) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lp) vede k rychlému a podstatnému zvětšování mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýšila z původní hodnoty přibližně 1 % na přibližně 4 %.

b)(iv) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu laf) vede k rychlému a významnému zvětšování mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýšila z hodnoty přibližně 2 % ná přibližně- 8 %.

b)(v) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu, lag) a emulze směsi perfluorpentanu a perfluor-4-methylpent-2-enu z příkladu lq) vede k rychlému a významnému zvětšení φφφ *

φφ

- 73 φφφ • « φ φφ φφφ · φφ

Φ φφφ mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýšila ze 2 % na přibližně 4 %.

b)(vi) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze směsi' perfluorpentanu a 1H,1H,2H-heptafluorpent-l-enu z příkladu lr) vede’ k rychlému a významnému zvětšení mikrobublinek. Celková objemová koncentrace se zvýšila ze 2 % na přibližně 4,5 %.

b)(vii) Snísení disperze plynného perf luorbutanu z příkladu _τíag) á emulze perfluorpentanu z příkladu Is) vede k rychlému a významnému zvětšování mikrobublinek 'po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýší ze 2 % na přibližně 13 %.

b)(viii) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu 1 ag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lt) vědě k rychlému a významnému růstu mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace mikrobublinek se zvýší ze 2 % na přibližně 13 %.

b)(ix) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lu) vede k rychlému a významnému růstu mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace mikrobublinek se zvýší ze 3 % na přibližně 15 %.

* í

b)(x) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze pěrfluorpetanu z příkladu lv) vede k rychlému a významnému- zvětšení mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová- koncentrace se zvýší ze 3 % na 22 %.

bj(xi) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lai) vede k rychlému a významnému zvětšení mikrobublinek po působení ultra4 4 4

- 74 * ·»·· • 4 4 «44 444

4 »4 zvuku. Celková objemová koncentrace míkrobublinek se zvýší ze 3 % na přibližně 8 %.

b)(xii) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze směsi perfluorpentanu a perfluor-4-methylpent-2-enu z příkladu lx) vede k rychlému a významnému zvětšení míkrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýší ze 2 % na přibližně 7,5 %.

~b).(xiii;) - Smísení disperze-plynného· perf luorbutanu z příkla-_^ du lag) a směsi perfluorpentanu a perfluor-4-methylpent-2-enu z příkladu ly) vede k rychlému a významnému zvětšení míkrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýší ze 2,5 % na přibližně 7 %.

b)(xiv) Smísení disperze plynného- perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lac) vede k rychlému a významnému růstu míkrobublinek. Zvětšování míkrobublinek bylo rychlejší a významnější než jaké bylo pozorováno v příkladu' 3b ) (xv) . Celková objemová koncentrace se zvýšila ze

3,5 % na přibližně 53 %.

b)(xv) Smísení disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lae) vede k rychlému a významnému zvětšování míkrobublinek. Celková objemová koncentrace se zvýšila ze 7 % na přibližně 19 %. Při expozici ultrazvuku dojde k dalšímu zvětšování míkrobublinek, takže celková objemová koncentrace ze zvýší na přibližně 54,5 %.

b)(xvi) Smísení disperze plynného perfluopropanu z-příkladu lah) a emulze perfluorpentanu z příkladu 11) vede k rychlému zvětšení míkrobublinek, i když ne tak velkého jako v příkladu 3b)(i). Celková objemová koncentrace se zvýšila ze 3 % na přibližně 4,5 %.

• · · · * · · · · · · · ' · · · · * ♦ · ···*«· · · » ·· ··

- 75 b)(xvii) Smísení, disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lag) a emulze perfluorpentanu z příkladu lo) vede k rychlému a významnému zvětšení mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace se zvýšila z 1 % na přibližně 8 %.

b)(xviii) Vzorek emulze perfluorhexanu, připravený podle příkladu lar) měl celkovou koncentraci kapek 8,6 % objemových při průměru kapek 2,6 mikrometrů.

b')'(xix) Vzorek- emulze 2,2,3,3,3-pentaf luorp ropy lme thy 1 etheru,, připravený podle příkladu lat) měl celkovou koncentraci kapek

4,3 % objemových a průměr kapek 1,5 mikrometrů.

b)(xx) Vzorek emulze 2H,3H-dekafluorpentanu, připravený podle příkladu lau) měl celkovou koncentraci kapek 5,6 % objemových a průměr kapek 1,9 mikrometrů.

b) (xxi) Vzorek emulze perf luorhep tanu,· připravený podle příkladu lbj) měl celkovou koncentraci kapek 8,5 % objemových a průměr kapek 2,2 mikrometru.

c) Měření s použitím přístroje Coulter Multisizer (velikost otvoru 140 mikrometrů)

Zvětšování mikrobublinek a změny v distribuci jejich průměrů po smísení s emulzí složky, schopné difúze je možno analyzovat při použití přístroje Coulter Multisizer II, opatřeného otvorem velikosti 140 mikrometrů. Rozsah měření byl nastaven na 10 až 80. mikrometrů. Disperze bublinek a kapičky emulze byly uloženy do komůrky pro vzorek, obsahující 200 ml předehřátého Isotonu II. Měření byla prováděna při teplotě 37 °C. Pak byla měřena distribuce průměrů,částic okamžitě a znovu po 3 minutách. Pak byl roztok vzorku vystaven působení • · · • · · ·

Β·> ·*· « * ·· ··

- 76 • · ♦ v » · • · · *· ···· ultrazvuku na 1 minutu při použití 2,25 MHz převaděče, spojeného s generátorem pulsů, energie 100 mikroJ. 1 minutu a 3 minuty po působení ultrazvuku byla měřena distribuce průměrů částic směsi.

c)(i) Po přidání 182 mikrolitrů emulze heptafluorpent-l-enu, připravené podle příkladu lam) ke 400' mikrolitrům'disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lbl) došlo okamžitě ke zvětšení průměrů mikrobublinek a celková objemová koncentrať ce bublinek s průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýšila z nevýznamného 'podílu až na 60*% objemovýchv průběhu-1-minuty

c)(ii)··Po přidání 70 mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravené způsobem podle příkladu lav) ke 330 mikrolitrům disperze plynného perfluorbutanu, připravené způsobem podle příkladů lbl) došlo po působení ultrazvuku k-podstatnému zvětšení mikrobublinek. Celková objemová koncentrace částic s průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýšila v průběhu 3 minut z nevýznamného podílu na 14 % objemových..

c)(iií) Po přidání 71 mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravené podle příkladu law) ke 330 mikrolitrům disperze plynného perfluorbutanu, připravené podle příkladu lbl)· došlo k podstatnému zvýšení velikosti bublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace bublinek S' průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýšila za 3 minuty od nevýznamného podílu na přibližně 8,6 % objemových.

c)(iv) Po přidání 105-mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravené podle příkladu lax). ke 300 mikrolitrům disperze- plynného perfluorbutanu; připravené podle příkladu lbl) došlo po působení ultrazvuku ke zvětšení mikrobublinek. Celková objemová koncentrace bublinek s průměrem 10 až 80 mikrometrů se za 3 minuty, zvýšila z 3,2 % objemových na přibližně 4,8 % objemových.

t * · ♦ r »

- 77 « » to * · · · to to to to to to • 4 toto·· toto 1 • tototo • to toto • · • •«4

c)(v) Po přidání 105 mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravená způsobem podle příkladu lay) ke 300 mikrolitrům disperze plynného perfluorbutanu, připravené podle příkladu lbl) došlo ke zvětšení průměru mikrobublinek po působení ultrazvuku. Celková objemová koncentrace bublinek s průměrem 10· až 80 mikrometrů se zvýšila z 1,5 % objemových v průběhu 3 minut na 2,2 % objemových.

c)(ví)' Po redispergování lyofilizovaných mikrobublinek perfluorbutanu v emulzi perfluordimethylcyklobutanu způsobem podle příkladu lbg) došlo k okamžitému zvýšena, prumeru· mikrobublinek. Celková objemová koncentrace mikrobublinek s průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýšila z nevýznamného podílu v průběhu 1 minuty až na 60 % objemových.

c)(vii) Po přidání 76 mikrolitrů emulze ΙΗ-tridekafluorohexanu, připravené podle příkladu lbi) ke 400 mikrolitrům disperze plynného perfluorbutanu, připravené podle příkladu lbl) okamžitě došlo ke zvětšení objemu mikrobublinek a celková objemová koncentrace bublinek s průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýšila z nevýznamného podílu v průběhu. 3 minut; až na 20 % objemových.

c)(viii) Po přidání 63 mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravené způsobem podle příkladu Ibm) k 741 mikrolitrům disperze plynného perfluorbutanu, připravené způsobem podle příkladu lbl) dojde k okamžitému zvýšení velikosti mikrobublinek, přičemž celková objemová koncentrace mikrobublinek s průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýší z nevýznamného podílu v průběhu 3 minut-až na 2 % objemová.

c)(ix) Po přidání 67 mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu, připravené způsobem podle příkladu láq) k 56 mikrolitrům disperze plynného- perfluorpropanu, připravené

0

4

V 0 04 · 0

- 78 • 00 000 způsobem podle příkladu lbm) dojde po působení ultrazvuku ke zvětšení objemu mikřobublinek. Celková objemová koncentrace mikřobublinek s průměrem 10 až 80 mikrometrů se zvýšila z nevýznamného podílu v průběhu 1 minuty na 2,7 % objemových.

Příklad 4

Měření zeslabení akustického signálu in vitro

a) Vzorek 1 mikrolitr disperze plynného perfluorbutanu z příkladu la) se' uvede do suspenze v 55 ml Isotonu II při teplotě 37 °C a měří se zeslabení akustického signálu v průběhu Sasu při použití dvou převaděčů se střední frekvencí

3,5 MHz a 5,0 MHz při použití ultrazvukových pulsů. Po 20 sekundách se k suspenzi přidá složka, schopná difúze a měření se provádí ještě dalších 120 sekund.

a) (i) Po· přidání 100 mikrolitrů emulze 2-methylbutanu podle příkladu lc) okamžitě dojde- ke zvýšenému zeslabení, které je více než čtyřnásobné. Přesné stanovení nebylo možné vzhledem k tomu, že zeslabení překročilo maximální hodnotu, měřitelnou použitým přístrojem. Tento účinek trval. 50 sekund a byl doprovázen úplnou změnou tvaru spektra zeslabení, což je důkazem podstatného zvětšení objemu mikřobublinek.

a)(ii) Po přidání 20 mikrolitrů emulze 2-methylbutanu z ,· příkladu lc) dojde k postupnému zeslabení, které dosáhne maxima, které je trojnásobkem až čtyřnásobkem počáteční hodnoty po 40 sekundách, načež se zeslabení opět rychle vyrovnává. I v tomto případě dochází k úplné změně tvaru spektra zeslabení, což je průkazem podstatného zvětšení objemu mikrobublinek.

♦ · · * · ··« ·· + • ·

- 79 a)(iii) Po přidání 5 mikrolitrů emulze 2-methylbutanu z příkladu lc) dojde k postupnému vzestupu zeslabení, které dosáhne po 30 sekundách maxima, '50 % původní- hodnoty, načež opět pomalu odeznívá až do dosaženípůvodní hodnoty. Současně dochází k posunu směrem k nižším frekvencím rezonance ve spektru pro zeslabení, což prokazuje mírné zvětšení velikosti. mikrobublinek.

a)(iv) Po přidání 500 mikrolitrů emulze 2-chlor-l,1,2-trifluorethyldifluorméthyletheru z_ příkladu le) ^dojde k postupnému vzestupu zeslabení, které dosáhne maxima přibližně 50 % původní hodnoty po 20 sekundách, načež se zeslabení opět vyrovnává až do dosažení původní hodnoty. Současně dojde k posunu směrem k nižším rezonančním frekvencím ve spektru prozeslabení, což prokazuje mírné zvětšení mikrobublinek.

a) (v) Po přidání 500 mikrolitrů emulze perfluorpentanu podle příkladu ld) dochází, k mírnému vzestupu zeslabení. Posun směrem k nižším rezonančním frekvencím ve spektru pro zeslabení prokazuje malé zvětšení objemu mikrobublinek.

Při kontrolním pokusu nedošlo po přidání 500 mikrolitrů vody k žádné změně v zeslabení signálu.

b) Vzorek 100 mikrolitrů emulze 2-methylbutanu z- příkladu lc) se přidá k 55 ml prostředku Isoton II při teplotě °C a měří se zeslabení akustického signálu stejným způsobem jako v příkladu 4a). Po 20 sekundách se k suspenzi přidá vzorek 1 mikrolitr.disperze plynného perfluorbutanu z příkladu la) a měření se provádí ještě dalších 120 sekund. Dojde rychle k zesílení zeslabení akustického signálu, které dosáhne maximální naměřené hodnoty po 20 sekundách a po 50 sekundách se opět počne vyrovnávat. Spektrum zeslabení prokazuje, -přítomnost velkých mikrobublinek.

4 • 4 . - ΛΟ Při kontrolním pokusu, při němž bylo užito místo emulze 2-methylbutanu 100 mikrolitrů vody, došlo po přidání disperze plynu ke zvýšenému zeslabení signálu. Po 40 sekundách došlo k dosažení stálé hodnoty, která byla rovná čtvrtině hodnoty, naměřená s použitím emulze 2-methylbutanu. Na této úrovni zůstalo zeslabení celých 120 sekund měření. Spektrum pro zeslabení prokazovalo přítomnost malých bublinek.

Příklad.5

-τ •φΗ'.*'·- . . - · «'«Φ «... -H. - -* «· * ' *. * ·»<Γ

Zobrazování psího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu (srovnávací příklad)

Byla připravena injekční stříkačka, obsahující množství disperze plynného perfluorbutanu z příkladu lb), od J» povídající 2 mikrolitrům plynu a obsah byl vstřiknut v otevřeném hrudníku psa s hmotností 20 kg při použití cévky, zavedené do žíly přední končetiny. Srdce bylo zobrazeno s použitím zařízení Vingmed CFM-750 s projekcí ve střední ose. Scanner byl nastaven tak, aby byl získán obraz na konci každého srdečního stahu propojením- s ECG zvířete. V pravé komoře bylo možno několik sekund po injekci pozorovat jasný kontrast, po dalších 4 až 5' sekundách bylo možno pozorovat podobný kontrast v levé komoře, avšak s podstatným zeslabením,' přechodně překrývajícím zadní části srdce. Na základe získaných údajů byla provedena analýza intenzity odraženého ultrazvuku pomocí počítače. V representativní oblasti přední části levé komory bylo možno'pozorovat krátký, přechodný vrchol zesílení kontrastu, trvající přibližně' 10 sekund a začínající 3 sekundy po zvýšení kontrastu.

• ·

- 81 Příklad 6

Zobrazení psího srdce in vivo při použití emulze 2-methylbutanu (srovnávací příklad)

Byla připravena injekční stříkačka, obsahující 1,0 ml emulze 2-methylbutanu. z příkladu lc) a obsah, stříkačky byl zvířeti vstřiknut stejným způsobem jako v příkladu 5. Také zobrazení srdce bylo provedeno stejným způsobem. Nebylo možno pozorovat žádné směny kontrastu.

Příklad 7

Zobrazení psího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze 2-methylbutanu

Stejně jako v příkladu.5 a 6 byly připraveny injekční' stříkačky a obsah obou stříkaček byl současně zvířeti podán do cévky s použitím spojovacího kusu tvaru Y. Srdce bylo zobrazeno obdobným způsobem jako v příkladu 5. Došlo k zesílení kontrastu zobrazení srdečních komor ‘obdobně jako v příkladu 5. V levé srdeční komoře bylo možno pozorovat stálý .vzestup intenzity, který začínal 30 sekund po vstřiknutí kontrastního prostředku do koronárního oběhu. Po 5 minutách došlo k úplnému vymizení tohoto účinku.

Příklad 8

Zobrazení psího srdce in vivo při použití emulze perfluorpentanú (srovnávací' příklad) - , . . . „

Byla připravena injekční stříkačka, obsahující 0,5 ml emulze perfluorpentanu z příkladu ld) a obsah byl zvířeti vstřiknut stejným způsobem jako v příkladu 5. Také srdce bylo zobrazeno stejným způsobem jako v příkladu 5. V Žádné části obrazu nebylo možno pozorovat zvýšení kontrastu.

• · · · · · • · · «·« * « ♦ ····« ·* · ♦ · ·>

- 82 Příklad 9

Zobrazení psího srdce in vívo pří nízké intenzitě a při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluorpentanu

Injekční stříkačky byly připraveny stejně jako v příkladech 5 & 8 a obsah obou stříkaček byl současně vstřiknut v otevřeném hrudníku psu s hmotností 20 kg pomocí spojovacího kusu tvaru Y a cévkv. zavedené do žíly přední končetiny. Zobrazení srdce^bylo'provedeno při použité zařízení Vingmed. - CFM-750 při projekci s krátkou střední osou. Přístroj byl nastaven na minimální výstup akustické energie snížením této energie na hodnotu 1 na škále v rozsahu 0 až 7, obrazy byly získávány na konci každé systoly spojením s.ECG- zvířete. Pozorované zvýšení kontrastu bylo obdobné jako v. příkladu 5 při mírně prodlouženém trvání.

Příklad 10 ' .'

Zobrazení psího srdce in vivo při vysoké intenzitě a při použití disperze plynného perfluorbutanu a- emulze perfluorpentanu

Opakuje se pokus z příkladu 9- s tím rozdílem,.že se zvýší výstup energie až na nejvyšší možný výstup 7 na škále v rozsahu 0 až 7. Po podání injekce je možno pozorovat v obou srdečních komorách velké zvýšení kontrastu i' jasnosti obrazu. Postupné zvýšení kontrastu obrazu je možno pozorovat ve. všech oblastech srdečního svalu až do zvýšení, které se blíží maximální intenzivní bílé barvě na obrazovce. Trvání tohoto zvýšení kontrastu je přibližně 30 minut, načež še tento kontrast v průběhu 5 minut upravuje na původní hodnotu. Pokud jde o celkový krevní oběh, poklesne zvýšení kontrastu až na původní hodnotu do 5 minut po podání injekce a na obrazu je možno

jen obtížně rozeznat cévy, což kontrastuje s velmi dobrým zobrazením srdečního svalu. Kontrastní účinek v srdečním svalu není snížen ani v blízkosti převaděče přes kontinuální působení vysoké energie ultrazvuku.

Příklad 11

Zobrazení psího srdce in vivo při použití vysoké intenzity, disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluorpentanu

Byl opakován způsob podle příkladu 10 s tím rozdílem,/ že použitá emulze perfluorpentanu byla připravena zchlazením roztoku 200 mg polyethylenglykol 10 000, methylether-16-hexadekanoyloxyhexadekanoátu ve 20 ml vody (připraveného . podle příkladu 2k) přihlášky W0-A-96/07434), přenesením po- dílu 1 ml tohoto roztoku do lahvičky s objemem- 2 ml, přidáním 200 mikrolitrů perfluorpentanu, protřepáním lahvičky po dobu 45 sekund v přístroji CapMix a uložením emulze až do použití při teplotě 0°C. Pozorované zesílení kontrastu v krevním oběhu a ve tkáni srdečního svalu bylo obdobné jako v příkladu 5.

Příklad 12

Zobrazení psí ledviny in vivo

Byly použity tytéž látky a tentýž způsob vstřikování jako v příkladu 9. Levá ledvina psa byla zobrazena přes neporušenou břišní stěnu při použití vysoké energie obdobným způsobem·jako v příkladu 10. Obraz zahrnoval * centrální strukturu ledviny s přívodními tepnami. 20 sekund po injekci bylo možno pozorovat zvyšování kontrastu v ledvinové tkáni, nejlepšího zobrazení bylo dosaženo po dalších 1 až 2 minutách.

minuty'.po injekci byl převaděč přemístěn k zobrazení.

• A

A A

AA A A

- 84 pravé ledviny. Ze začátku měla ledvina normální vzhled bez zvýšení kontrastu. Avšak po aplikaci ultrazvuku s vysokou intenzitou došlo po několika minutách ke zvýraznění obrazu, i když nikoliv do úrovně, pozorované na levé ledvině.

Příklad 13

Zobrazení psího srdce in vivo při' použití disperze plynného perfluorbutanu a sníženého množství emulze perfluorpentanu

Opakuje se způsob podle příkladu- 10 s tím rozdílem, že se dávka emulze perfluorpentanu sníží na 1/3. Nejvyšší intenzita zesílení kontrastu v srdečním svalu byla srovnatelná s výsledkem z příkladu 10, avšak trvání tohoto jevu bylo zkráceno z 30 minut na méně než 10 minut.

Příklad 14

I *

Zobrazení psího' srdce in vivo při neporušeném hrudníku při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluorpentanu·.

Způsob podle příkladu 10 byl opakován při uzavřeném neporušeném hrudníku. Výsledek byl srovnatelný s výsledkem, jehož bylo dosaženo v příkladu 10.

Příklad 15

Barevné zobrazení psího srdce in vivo podle Dopplera při použití disperse plynného perfluorbutanu’a emulze perfluorpentanu

Byl opakován způsob podle příkladu- 10 s tím. rozdílem, že zařízení pro barevné zobrazování podle Dopplera bylo

- 85 • *44«

444 ··« • « • 44 «« použito v případě levé srdeční komory již v první minutě po injekci k vyvolání růstu mikrobublinek. Tímto způsobem bylo dosaženo v srdeční tkáni intenzivnějšího kontrastu než bylo mošno pozorovat v příkladu 10.

Příklad 16

Zobrazení psího srdce in vivo při použití disperze,plynného' perfluorbutanu a emulze perfluor-4-methylpent-2-enu

6,5 ml isotonický rekonstituované disperse - plynného perf luorbutanu, připravené podle příkladu lag) a -66 mikrolitrů emulze perfluor-4-methylpent-2-enu z příkladu lal) se vstřikne způsobem'podle příkladu 10. Výsledné zesílení kontrastu ve tkání srdečního svalu bylo srovnatelné s výsledkem z příkladu 10, avšak trvalo 6 až 8' minut.

Příklad 17

Zobrazování hypěrmické oblasti psího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluorpentanu

Větev koronární, arherie circumflexa psa se dočasně podváže na 2 minuty a pak se vstřikne kontrastní prostředek jako v příkladu 10. Kontrastní zobrazení nyní překrvené oblasti srdečního svalu bylo podstatně intenzivnější než zobrazení normální okolní tkáně.

. cc ťecc «

--.86 fc r ř r., é c t c έ ř * i L neí, C<flV c

í, c 09

Příklad 18

Zobrazení psího, srdce'in vivo při použití disperze plynného perf luorbutánu?a' emulze perfluordimethylcyklobutanu' • O,5 mi;isotonicky rekonstituované .disperze^plynného .,* perfluorbutanu připravené podle'příkladu;, lag) ,a: 66 mikró_rlitrů· emulze*perfluordimethylcyklobutanu,z příkladu, 1··. ao) ' se- užije· stejne jakoxv příkladu..10/..·,Výsledný intenzivní-kon trast ve tkáni srdečního·*¹ svalu -je Srovnatelný,· s>výsledkem příkladů .16^. ^r -,·η u , *»< .ú;·' < - vt i · ý V ·· z '· '· · ' - - *'7 *' í* *ř‘ ‘ w ' Ϊ J Γ ·.· ••'T* · — r ' '4 ' ; —* · ·-*· i μ -« ’ *

Příklad 19 ' < < . ·

Zobrazení psího srdce in^? vivo při¹¹ použití disperze plynného; perfluorbutanu a emulze perfluordimethylcyklobutanu

0,6 ml isotonicky rekonstituované disperse plynného perfluorbutanu z příkladu lbl) a 66 mikrolitrů emulze per•ΓΙύοΓά'Ιπιβ.ΐΙτ/ΙονϊίΙοϋαΐ'βηυ z. příkladu, laq) se vstřikne-ste jně; jako v příkladu 10. Výsledné značné- zvýšení kontrastu srďec, ní tkáně je. srovnatelné-s·..výsledkem zypříkladutie., hr-©*~ i ‘ ; V-··

Příklad'20' ^f

,.-L, .lJťj-,: ·;>! _^_{A T} v..'. : L. . , * Zacílení’ částic in vivo . i'K rdjk>t. Jrv !,· 5 J ff! i

1«í fi Ϊ» ' ’· 4 '’.U ' 0,02 mikrolitrů/kg avidinylováných mikrobublinek perfluorbutanu' z příkladu lbqj' a 0',Ó2 miŘrolitrů/kg emulze perfc \ ? 1 , | · y Γ t r * · *·, ’· 4 fluordimethylcyklobutanu ž' příkladů⁷ lbh) se Současně nitro' — - -r · — ' · - --i —. U_ -l_. J—,. L.. 1 _ -jíl. *ji'_ Ai_ _.117ί_ί. jí¹ J- J_ * l - . I ' _f žilně vstříkne anestetizovanému psu s hmotností 20‘kg'álšrdl·'' ce se zobrazí podle příkladů' 10'l· Zesílení kontrastu je ob-^T fy·* · j ¹ * J. t* ) ♦ < . *1 dobtié jako V příkladu 10 s tím rozdílem/ že vrchol kontrastu * / T* ‘ f :

pro levou komorů je. méně'vyjádřen. *' φφφφ φ φ

- 87 φ · φ · · φ φ φφφ · · φ « φ φφ·φ φ φ φ φ φ φ • φ φ φφφ Φφφ φ φ φφ φφ

Příklad 21 ...

Zobrazení králičího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluordimethylcyklobutanu

Připraví se injekční stříkačka s obsahem disperze mikrobublinek perfluorbutanu se středním objemovým průměrem 3,0 mikrometrů podle příkladu lbl), množství odpovídá 1 mikrolitru obsaženého plynu, dále se připraví injekční stříkačka s obsahem 105 mikrolitrů emulze perfluordimethylcyklobutanu 'z^rpříkladu laq); Obsah'obou stříkačeksě sóučášhě⁷' vstřirté”“'' králíkovi s hmotností 5 kg při použití cévky, zavedené do ušní žíly. Zobrazení srdce bylo provedeno při použití přístroje ATL HDI-3000 se sondou P5-3 při otevřeném hrudníku a parasternální projekcí krátké osy. Výsledek je srovnatelný s výsledkem z příkladu 18.

β

Příklad 22

Podávání účinných látek s použitím ultrazvuku

Anestetizovanému králíkovi New Zealand Black s hmotností 3 kg se nitrožilně podá 0,04 ml emulze perfluordimethylcyklobutanu podle příkladu laq) a současně se podá 0,12 ml suspenze plynného perfluorbutanu z příkladu lbl) a levá ledvina se zobrazí přístrojem ATL HDI-3000 se sondou P5-3 při' nastavení na maximální energii. Bylo možno pozorovat významné zvětšení bublinek a jejich nahromadění v ledvině. Pak bylo 160 mg FITC-dextranu s molekulovou hmotností 2 000 000 rozpuštěna v 5 ml vody a podáno nitrožilně a zobrazování ultrazvukem bylo prováděno ještě 5 minut při nastavení podle Dopplera k dosažení maximálního akustického výstupu. Pak bylo zvíře usmrceno a ledviny byly sledovány v ultrafialovém světle. Zvýšená fluorescence byla pozorována v levé ledvině

9 9 9^«

9 9 9 »·»

9 · 9 « » »99» ·« ·

- 88 999 9« 9 jako skvrny s průměrem 50 až 100 mikrometrů ve vazivové tkáni v oblastech, které byly vystaveny ultrazvuku. Se skvrnami byly vždy spojeny nefrony, prosté fluorescence v cévách.

Příklad 23

R

Albunex jako disperze plynu

0,3 ml/kg prostředku Albunex a 1,5 mikrolitrů/kg emulze perfluordimethylcyklobutanu podle příkladu laq) se vstřkně nitrožilně anestetizovanému psímu samci s'hmotností 20 kg a zobrazení se provede stejně jako v příkladu 10. Zesílení kontrastu je obdobné jako v příkladu 10.

‘Příklad 24

Zacílené mikrobublinky při zobrazení králičího srdce.

t

0,1 mikrolitrů/kg mikrobublinek z příkladu laz) se vstřikne nitrožilně králíkovi a současně se pomocí ultrazvuku zobrazuje srdce přístrojem ATL HDI-3000 se sondou P5-3. Bylo možno pozorovat malé, avšak dlouhotrvající zesílení kontrastu. Po 3 minutách bylo vstřiknuto ještě 1,5 mikrolitrů/kg emulze perfluordimethylcyklobutanu z příkladu laq). Bylo možno pozorovat mírný vzestup kontrastu.

Příklad 25

Zobrazení krysího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluordimethylcyklobutanu

Byl opakován pokus z příkladu 19 na krysách se srovnatelnými výsledky.

-'89 -

c. c ccec· <?<·

ΪΤ o

t* e I*' i* piv A'PÍ i* nl·. (» t* ' i»oft ftoř»‘| I* f» r»« (»«

Příklad Í26

Zobrazení_rpsího -srdce -:in'.vivojpri ^použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze; perfluorhexariu < * .

Λ

0,1 mikrolitrů/kg’ emulze perfluorhexanu z příkladu lar) ή ,a 0,2 mikrolitrů/kg'suspenze-· mikrobublinek..perfluorbutanu-·?' ji, íz; příkladu-jlbl )j; sě.<Současně vvstřikne- psovi·· stejně ýjako v pří'kladu'10. Wýsledek je <srovnatelný s ^výsledkem-^Jz příkladu .10..

Příkládí 27 iyi ιι .Zobrazení-psího· srdce in vivo'při'použití disperze plynného -perfluorbutanu a-emulze ,.hep-.tafluorpent^l^enu-- .

0,3 mikrolitrů/kg'suspenze mikrobublinek perfluorbutanu podle příkladu- lbl)..a 0-,15A-ml emulze heptafluorpent-l-enu z příkladu lam) se,'současně vštřikne psovi jako·v příkladu

10..·, Je možno po-zorovat; mírném zvýšení·. kontrastu, které' je', však větší; a. trvá delší-,.dobu- než’ .v-..příkladu 5. .' . - - '· ·' ^ K. t \ ' > .U fcVr.. ρ·..Λν ,.· * . 1«

Příklad 28 ’ -.· =. - -i „V <1 : ' ’ 2 -.

Zobrazení, psího srdce in vivo při použití disperze plenného perfluorbutanu a emulze perfluordimethylcyklobutanu, stabilizované' sterilizovaným fosfolipidem.

m.O.,3'mikrolitrů/kg suspenze mikrobublinek perfluorbutanu z příkladu Ibl) a 0,3 mikrolitrů/kg emulze perfluordimethylcyklobutanu . z /příkladu lb.m) se- současně vštřikne pjsqyi stejně jakojv; příkladu 19. Výsledek.je srovnatelný s výsledkem z příkladu- 19,,.' ' - - -i rut -··/?

• ft ft ·· ftft··

- 90 • « ft * ft • · ft ftft· ··· • ft ftft ftft

Příklad 29

Zobrazení psího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorpropanu a emulze perfluodimethylcyklobutanu

0,17 ml suspenze mikřobublinek perfluorpropanu z příkladu Ibn) a 0,3 mikrolitrů/kg emulze perfluordimethylcyklobutanu z příkladu laq) se současně vstřikne psovi podle příkladu 19. Výsledek je srovnatelný s výsledkem z příkladu 19.

Příklad 30

Zobrazení zažívacího systému psa in vivo při použití plynného perfluorbutanu a emulze perfluordimethylcyklobutanu ml emulze perfluordimethylcyklobutanu podle.příkladu laq) se podá žaludeční sondou anestetizovanému psu. Pak se podá malé množství 0,1 až 0,2 mikrolitrů-plynu/kg disperze mikřobublinek perfluorbutanu z příkladu la) nitrožilně. Převaděč pro zobrazení se uloží na břišní stěnu, lokalizované zvětšení mikřobublinek' v kapilárním systému stěny žaludku zajistí zvýšený kontrast a jasnější obrysy sliznice.

Příklad 31

Zobrazení zažívacího systému psa in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluordime thylcyklobutanu

Disperze mikřobublinek perfluorbutanu z příkladu la) se podá žaludéční sondou anestetizovanému psu a nechá se rovnoměrně rozptýlit v žaludku, což se ověří zobrazením ultrazvukem. Malé množství emulze perfluordimethylcyklobutanu podle příkladu laq) v množství 0,2 až 1 mikrolitr perfluorovaného uhlovodíku/kg se podá nitrožilně. Převaděč

4 ·

-91 .4· · 4 · · · · · · « · 4 »' · * · · 4444»·

4 4 4 · · · ·

4» 4·4· 44 4 ·· ·· se uloží na zobrazovanou oblast, zvětšení mikrobublinek v žaludeční štávě v blízkosti sliznice zajistí zvýšení kontrastu obrysů sliznice.

Příklad 32

Zobrazení psího srdce in vivo při použití disperze plynného perfluorbutanu a emulze perfluordimethylcyklobutanu, podané, současně s adenosinem

P

- - Okludující svorka- se-uloží na-hlavní 'větev'levé’před-” ní sestupné koronární tepny při otevřeném hrudníku psa s hmotností 22 kg a za uzávěr se uloží průtokoměr, který se upraví k dosažení 25% snížení průtoku. (14 až 10 ml/min).

Pak se současně nitrožilně podá obsah tří stříkaček, í) disperze mikrobublinek perfluorbutanu z příkladu lbl) s obsahem 4,4 mikrolitrů plynu, ii) emulze perfluordimethylcyklobutanu· z příkladu laq) s obsahem 33 mikrolitrů dispergované perfluordimethylcyklobutanové fáze a iii) 3,0 mg adenosinu, rozpuštěného v 0,9% roztoku chloridu sodného.

Po 10 sekundách se pomalu v průběhu 20 sekund vstřikne ještě 3,0 mg- adenosinu, rozpuštěného v 0,9% roztoku chloridu sodného. Levá,komora srdeční se zobrazí při použití přístroje ATL HDI-3000 se sondou P5-3, ultrazvuk s maximální energií se nechá procházet 1 minutu k vyvolání růstu mikrobublínek a pak se srdeční sval zobrazí běžným způsobem. Je možno pozorovat zřejmý rozdíl mezi oblastmi, zásobenými zúženými tepnami (oblasti jsou o něco jasnější než šedé základní pozadí) a normálními oblastmi, které jsou daleko jasnější než základní pozadí.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Směsný prostředek pro použití jako kontrastní činidlo- současně, odděleně nebo postupně při zobrazování ultrazvukem, vyznačující se tím, že. je tvořen

i) injekčním vodným prostředím, v němž je -dispergován plyn, ii) prostředkem, obsahujícím složku, schopnou difúze in , '.,vivo. do,.dispergovaného plynu-za alespoň'přechodného ~ ' zvětšení jeho objemu.

2. Směsný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako dispergovaný plyn obsahuje vzduch , dusík, kyslík, oxid uhličitý, vodík, inertní plyn, fluorid sírový, fluorid selenový, silan, případně halogenovaný, uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností, keton, ester, halogenovaný uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností nebo směs kteréhokoliv z uvedených plynů.

3. Směsný prostředek podle nároku 2, vy značující se tím, že plyn obsahuje perfluorovaný keton, perfluorovaný ether nebo perfluorovaný uhlovodík.

4 4 4 » · 4 4 •44444 «4 4 «4 4·

- 93 * je stabilizován povrchovou membránou, odolnou proti spojování bublinek, bílkovinou, tvořící film, polymerním materiálem, nepolymerním a nepolymerovatelným materiálem, vytvářejícím stěny nebo smácedlem.

4 4 · · » » 4 ·«·· ♦ 4 4 · 4 · 4 4 · 4 • « · · · 4 ·· 41 4« t « * t

4. Směsný prostředek podle nároku 3, vyznaču-j í c í s >e t í m , že jako perfluorovaný uhlovodík obsahuje perfluoralkan, perfluoalken nebo perfluorcykloalkan.

5. Směsný prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje fluorid sírový, perfluorpropan, perfluorbutan nebo perfluorpentan.

6. Směsný prostředek podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že dispergovaný plyn ▼ » » r

7. Směsný prostředek podle nároku 6, vy z n a č u jící se tím, že smáčedlo je tvořeno nejméně jedním fosfolipidem.

8. Směsný prostředek podle nároku 7. v₅y. s. n. a ír u jícíse tím, že nejméně .75 % smáčedla je tvořeno molekulami fosfolipidu, nesoucími náboj.

9. Směsný prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že nejméně 75 % smáčedla, tvořícího film je tvořeno jedním nebo větším- počtem fosfolipiců ze skupiny fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinisitoly, fosfatidové kyseliny a kardiolipiny.

10,vyznačující se tím, že prostředek s obsahem složky schopné difúze dále obsahuje kapalný nosič.

10, vyznačující se tím, že prostředek, schopný difúze je zpracován pro podkožní, kožní, nitrosvalové, nitrožilní podání nebo podání inhalací.

. 10. Směsný prostředek podle nároku 9, v y z n a-č uj í C'í se t í m , že nejméně 80 % fosfolipidu je tvořeno fosfatidylserinu.

11. Směsný prostředek podle některého z nároků 1 až

12. Směsný prostředek podle některého z nároků 1 až

13. Směsný prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že složka, schopná difúze je dispergo- 94 ft ft i ft ft » W ft » • ♦ ft · • · · ·»· ftftft • « • ft ftft vána ve vodném kapalném nosiči ve formě emulze nebo mikroemulze typu olej ve vodě.

14. Směsný prostředek podle nároku 13, v y z n a i čující se tím, že složka, schopná difúze je tvořena alifatickým etherem, polycyklickým olejem, polycyklickým alkoholem, -heterocyklickou sloučeninou, alifatickým uhlovodíkem, cykloalifatickým uhlovodíkem nebo halogenovaným uhlovodíkem s nízkou molekulovou hmotností.

15. Směsný prostředek„podle nároku Ι4\.ν y z .n a.- . 4 Čující se tím, že složka, schopná difúze je tvořena perfluorovaným uhlovodíkem.

16. Směsný prostředek podle nároku 15, v y z n a - , čující Se tím, že jako perf luorovaný uhlovodík .<· obsahuje perfluoralkan, perfluoralken, perfluorcykloalkan,.

perfluorcykloalken nebo perfluorovaný alkohol.

17. Směsný prostředek podle nároku 16, v y z n a čující se tím, že složka, schopná difúze je tvořena perfluorpentanem, perfluorhexanem nebo perfluordimethylcyklobutanem.

*

18. Směsný prostředek podle některého z₍ nároků 13 až < 17, vyznačující se tím, že emulze je stabilizována fosfolipidovým smáčedlem.

r

19. Směsný prostředek podle nároku 18, vy z n a čující se tím, že nejméně, 75 % fosfolipidového .smáčedla. je. tvořeno molekulami, nesoucímináboj.

20. Směsný prostředek podle nároku ^vyznačující se tím, že nejméně 75 % fosfolipidového smáčedla se volí ze skupiny fosfatidylseriny, fosfatidyl• Β Β· Β

Β « ··· «ΒΒ ♦ Β • Β «Β glyceroly, fosfatidylínositoly, fosfatidové kyseliny a kardiolipiny.

21. Směsný prostředek podle nároku 20, v y z n a Sující se tím, že nejméně 80 % fosfolipidového smáčedla je tvořeno fošfatidýlseriny.

22. Směsný prostředek podle nároků 1 až 21, v y značující se tím, že dále obsahuje léčivo.

23. Směsný prostředek podle některého z nároků 1 až 21, v y z n a č u j í c'í se t í m, že obsahuje látky, zvyšující kontrast při zobrazování, odlišném od zobrazování ultrazvukem