DE69738406T2

DE69738406T2 - Verbesserungen in oder an Kontrastmitteln

Info

Publication number: DE69738406T2
Application number: DE69738406T
Authority: DE
Inventors: Jonny Ostensen; Sigmund Frigstad; Morten GE Healthcar Eriksen; Pal Rongved
Original assignee: GE Healthcare AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1996-10-21
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2017-10-22
Also published as: US20010002993A1; EE03749B1; SK52099A3; KR20000052652A; BR9712370A; EP1264604A2; US20040141921A1; IL129423A0; IL129423A; CA2269319A1; US6375931B2; DE69721331T2; EP1264604B1; EE9900158A; AP9901511A0; EP1264604A3; ATE238073T1; WO1998017324A2; AU4714797A; RU2204415C2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Ultraschallbildgebung, genauer gesagt, auf die Verwendung neuer Kontrastmittelpräparate bei der Ultraschallbildgebung, zum Beispiel der Visualisierung von Gewebeperfusion.
Bekanntermaßen sind Kontrastmittel, die Dispersionen von Mikrobläschen von Gasen umfassen, aufgrund der geringen Dichte und der leichten Komprimierbarkeit der Mikrobläschen besonders effiziente Rückstreuer von Ultraschall. Solche Mikrobläschendispersionen ermöglichen, sofern entsprechend stabilisiert, die hoch effektive Ultraschallvisualisierung beispielsweise des Gefäßsystems und der Gewebemikrogefäßanordnung, oftmals in vorteilhaft niedrigen Dosen.
Die Verwendung von Sonographie zur Messung der Blutperfusion (d. h. des Blutflusses pro Gewebemasse-Einheit) ist beispielsweise bei der Tumordetektion, Tumorgewebe, das typischerweise eine andere Gefäßanordnung aufweist, als gesundes Gewebe, und für Studien des Myokards, z. B. zur Detektion von Myokardinfarkten, von besonderem Wert. Ein Problem bei der Anwendung existierender Ultraschallkontrastmittel in Studien über die Herzperfusion ist, dass der Informationsgehalt der erhaltenen Bilder durch Dämpfung, verursacht durch Kontrastmittel in den Herzkammern, geschwächt wird.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Ultraschallvisualisierung eines Patienten, insbesondere der Perfusion im Myokard und anderen Geweben, mittels Gas-enthaltender Kontrastmittelpräparate, die das steuerbare und vorübergehende Wachstum der Gasphase in vivo nach der Verabreichung fördern, erreicht und/oder verstärkt werden kann. Daher können solche Kontrastmittelpräparate beispielsweise dazu verwendet werden, die steuerbare und vorübergehende Retention der Gasphase, zum Beispiel in Form von Mikrobläschen, in der Gewebemikrogefäßanordnung zu fördern, wobei die Konzentration an Gas in einem solchen Gewebe und demgemäß seine Echogenität, z. B. bezogen auf den Blutpool, verstärkt wird.
Es ist davon auszugehen, dass sich die Verwendung von Gas als ein deponierter Perfusionstracer deutlich von existierenden Vorschlägen bezüglich intravenös verabreichbarer Mikrobläschen-Ultraschallkontrastmittel unterscheidet. Daher wird es allgemein für notwendig empfunden, das Mikrobläschenwachstum zu vermeiden, da dies, sofern nicht gesteuert, zu potentiell gefährlicher Gewebeembolisation führen kann. Demgemäß muss/müssen die verabreichte Dosis eingeschränkt und/oder Gasmischungen mit Zusammensetzungen, die so gewählt sind, dass das Bläschenwachstum in vivo durch Inhibierung des Hineindiffundierens von Blutgasen in die Mikrobläschen minimiert wird, verwendet werden (siehe z. B. WO-A-9503835 und WO-A-9516467 ).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auf der anderen Seite ein Verfahren zum Erzeugen verstärkter Herzbilder bereitgestellt, worin eine Zusammensetzung, umfassend eine dispergierte Gasphase, zusammen mit einer Zusammensetzung, die mindestens eine Substanz umfasst, die ein Gas oder einen Dampfdruck besitzt oder fähig ist, dieses/diesen in vivo zu erzeugen, das/der ausreichend ist, um ein steuerbares Wachstum der dispergierten Gasphase zu fördern durch dort Hineindiffundieren von Molekülen aus Gas oder Dampf, das/der von der Substanz, die hierin kurz als eine „diffundierbare Komponente" bezeichnet wird, erhalten wird, verabreicht wird, obgleich davon auszugehen ist, dass zusätzlich oder alternativ andere Transportmechanismen als die Diffusion in die Ausführung der Erfindung involviert sein können, wie hierin nachstehend ausführlicher erörtert wird.
Diese gemeinsame Verabreichung einer eine dispergierte Gasphase-enthaltenden Zusammensetzung und einer Zusammensetzung, die eine diffundierbare Komponente mit einem geeigneten Grad an Flüchtigkeit umfasst, kann früheren Vorschlägen bezüglich der Verabreichung flüchtiger Substanzen allein, beispielsweise in Form von phasenverschobenen Kolloiden, wie in WO-A-9416739 beschrieben, gegenübergestellt werden. Daher ermöglichen die Kontrastmittelpräparate zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Steuerung von Faktoren wie der Wahrscheinlichkeit und/oder Geschwindigkeit des Wachstums des dispergierten Gases durch die Wahl geeigneter Bestandteile der zusammen verabreichten Zusammensetzungen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, wohingegen die Verabreichung der zuvor genannten phasenverschobenen Kolloide allein zur Erzeugung von Mikrobläschen führen kann, die ungesteuert und ungleichmäßig wachsen, möglicherweise zu einem Ausmaß, bei dem zumindest ein Teil der Mikrobläschen eine potentiell gefährliche Embolisation beispielsweise der Myokardgefäßanordnung und des Gehirns verursachen kann (siehe z. B. Schwarz, Advances in Echo-Contrast [1994(3)], S. 48–49).
Überdies ist herausgefunden worden, dass die Verabreichung phasenverschobener Kolloide allein nicht zu einer zuverlässigen oder konsistenten In-vivo-Verflüchtigung der dispergierten Phase unter Erzeugung von Gas oder Dampfmikrobläschen führen kann. Grayburn et al. schlagen in J. Am. Coll. Cardiol. 26(5)[1995], S. 1340–1347 vor, dass die Voraktivierung von Perfluorpentanemulsionen erforderlich sein kann, um eine Myokardeintrübung in Hunden bei effektiven Bildgebungsdosen, die gering genug sind, um hämodynamische Nebenwirkungen zu vermeiden, zu erreichen. Eine Aktivierungstechnik für solche kolloiden Dispersionen, die das Anlegen hypobarer Kräfte daran umfasst, wird in WO-A-9640282 beschrieben; typischerweise umfasst diese das teilweise Füllen einer Spritze mit der Emulsion und das anschließende kraftvolle Abziehen und dann Freisetzen des Kolbens der Spritze zur Erzeugung einer vorübergehenden Druckänderung, die die Bildung von Gasmikrobläschen in der Emulsion verursacht. Dies ist eine von Natur aus etwas beschwerliche Technik, die keine konsistenten Aktivierungsgrade ergibt.
In US-A-5536489 wird dargelegt, dass Emulsionen aus wasserunlöslichen gasbildenden Chemikalien wie Perfluorpentan als Kontrastmittel für die ortsgerichtete Bildgebung verwendet werden können, wobei die Emulsionen nur eine signifikante Anzahl bildverstärkender Gasmikrobläschen beim Anlegen von Ultraschallenergie an die spezielle Stelle im Körper, die abgebildet werden soll, erzeugen. Unsere eigene Forschung hat gezeigt, dass Emulsionen aus flüchtigen Verbindungen wie 2-Methylbutan oder Perfluorpentan weder in vitro noch in vivo detektierbare Echoverstärkung ergeben, wenn sie mit Energieniveaus ultraschallbehandelt werden, die ausreichen, um unter Verwendung von Zweikomponenten-Kontrastmitteln gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeprägte Kontrastwirkungen zu erhalten.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen verstärkter Herzbilder eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Patienten bereitgestellt, das die Schritte:

i) Injizieren eines physiologisch akzeptablen wässerigen Mediums mit darin dispergiertem Gas in das Gefäßsystem des Patienten;
ii) vor, während oder nach der Injektion des wässerigen Mediums das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend eine diffundierbare Komponente, die in vivo in das dispergierte Gas diffundieren kann, um so zumindest vorübergehend seine Größe zu vergrößern und
iii) das Erzeugen eines Ultraschallbildes von zumindest einem Teil des Patienten umfasst.

Dieses Verfahren gemäß der Erfindung kann vorteilhaft bei der Visualisierung der Gewebeperfusion in einem Patienten verwendet werden, wobei der Anstieg der Größe des dispergierten Gases dazu genutzt wird, eine Anreicherung oder vorübergehende Retention von Gas in der Mikrogefäßanordnung eines solchen Gewebes herbeizuführen, wodurch seine Echogenität verstärkt wird.
In der Gasdispersion kann irgendein biokompatibles Gas vorliegen, wobei der Ausdruck „Gas", wie hierin verwendet, alle Substanzen (einschließlich Mischungen) umfasst, die zumindest teilweise, z. B. im wesentlichen oder vollständig, in gasförmiger (einschließlich Dampf-) Form bei der normalen menschlichen Körpertemperatur von 37°C vorliegen. Das Gas kann daher zum Beispiel Luft; Stickstoff; Sauerstoff; Kohlendioxid; Wasserstoff; ein inertes Gas, wie Helium, Argon, Xenon oder Krypton; ein Schwefelfluorid, wie Schwefelhexafluorid, Dischwefeldecafluorid oder Trifluormethylschwefelpentafluorid; Selenhexafluorid; ein gegebenenfalls halogeniertes Si-Ian, wie Methylsilan oder Dimethylsilan; einen Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts (z. B. enthaltend bis zu 7 Kohlenstoffatome), zum Beispiel ein Alkan wie Methan, Ethan, ein Propan, ein Butan oder ein Pentan, ein Cycloalkan wie Cyclopropan, Cyclobutan oder Cyclopentan, ein Alken wie Ethylen, Propen, Propadien oder ein Buten oder ein Alkin wie Acetylen oder Propin; einen Ether wie Dimethylether; ein Keton; einen Ester; einen halogenierten Kohlenwasserstoff mit niedrigem Molekulargewicht (z. B. enthaltend bis zu 7 Kohlenstoffatome) oder eine Mischung von beliebigen der vorstehenden umfassen. Vorteilhafterweise sind zumindest einige der Halogenatome in halogenierten Gasen Fluoratome; daher können biokompatible halogenierte Kohlenwasserstoffgase beispielsweise aus Bromchlordifluormethan, Chlordifluormethan, Dichlordifluormethan, Bromtrifluormethan, Chlortrifluormethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortetrafluorethan, Chlortrifluorethylen, Fluorethylen, Ethylfluorid, 1,1-Difluorethan und Perfluorkohlenstoffen ausgewählt sein. Repräsentative Perfluorkohlenstoffe umfassen Perfluoralkane wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropane, Perfluorbutane (z. B. Perfluor-n-butan, gegebenenfalls in Beimischung mit anderen Isomeren wie Perfluor-iso-butan), Perfluorpentane, Perfluorhexane oder Perfluorheptane; Perfluoralkene wie Perfluorpropen, Perfluorbutene (z. B. Perfluorbut-2-en), Perfluorbutadien, Perfluorpentene (z. B. Perfluorpent-1-en) oder Perfluor-4-methylpent-2-en; Perfluoralkine wie Perfluorbut-2-in; und Perfluorcycloalkane wie Perfluorcyclobutan, Perfluormethylcyclobutan, Perfluordimethylcyclobutane, Perfluortrimethyl-cyclobutane, Perfluorcyclopentan, Perfluormethylcyclopentan, Perfluordimethylcyclopentane, Perfluorcyclohexan, Perfluormethylcyclohexan oder Perfluorcycloheptan. Andere halogenierte Gase umfassen Methylchlorid, fluorierte (z. B. perfluorierte) Ketone wie Perfluoraceton und fluorierte (z. B. perfluorierte) Ether wie Perfluordiethylether. Die Verwendung perfluorierter Gase, zum Beispiel Schwefelhexafluorid und Perfluorkohlenstoffe wie Perfluorpropan, Perfluorbutane, Perfluorpentane und Perfluorhexane, kann aus Sicht der anerkannt hohen Stabilität im Blutstrom von Mikrobläschen, die solche Gase enthalten, besonders vorteilhaft sein. Andere Gase mit physiko-chemischen Merkmalen, durch die sie überaus stabile Mikrobläschen im Blutstrom bilden, können ebenso von Nutzen sein.
Das dispergierte Gas kann in irgendeiner bequemen Form beispielsweise unter Verwendung irgendeiner geeigneten Gas-enthaltenden Ultraschallkontrastmittelformulierung als Gas-enthaltende Zusammensetzung verabreicht werden. Repräsentative Beispiele für solche Formulierungen umfassen Mikrobläschen aus Gas, stabilisiert (z. B. zumindest teilweise eingekapselt) durch eine Koaleszenz-resistente Oberflächenmembran (zum Beispiel Gelatine, wie beispielsweise in WO-A-8002365 beschrieben), ein filmbildendes Protein (zum Beispiel ein Albumin wie humanes Serumalbumin, wie in US-A-4718433 , US-A-4774958 , US-A-4844882 , EP-A-0359246 , WO-A-9112823 , WO-A-9205806 , WO-A-9217213 , WO-A-9406477 oder WO-A-9501187 beschrieben), ein Polymermaterial (zum Beispiel ein synthetisches biologisch abbaubares Polymer, wie in EP-A-0398935 beschrieben, eine elastische synthetische Grenzflächenpolymermembran, wie in EP-A-0458745 beschrieben, einen mikropartikulären biologisch abbaubaren Polyaldehyd, wie in EP-A-0441468 beschrieben, ein mikropartikuläres N-Dicarbonsäurederivat einer Polyaminosäure – po lycyclisches Imid, wie in EP-A-0458079 beschrieben, oder ein biologisch abbaubares Polymer, wie in WO-A-9317718 oder WO-A-9607434 beschrieben), ein nicht-polymeres und nicht-polymerisierbares Wand-bildendes Material (wie beispielsweise in WO-A-9521631 beschrieben) oder ein oberflächenaktives Mittel (zum Beispiel ein oberflächenaktives Mittel auf der Basis eines Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymers wie Pluronic, ein polymeres oberflächenaktives Mittel, wie in WO-B-9506518 beschrieben, oder ein filmbildendes oberflächenaktives Mittel wie ein Phospholipid, wie beispielsweise in WO-A-9211873 , WO-A-9217212 , WO-A-9222247 , WO-A-9428780 , WO-A-9503835 oder WO-A-9729783 beschrieben).
Andere verwendbare Gas-enthaltende Kontrastmittelformulierungen umfassen Gasenthaltende Feststoffsysteme, zum Beispiel Mikropartikel (insbesondere Aggregate von Mikropartikeln), in denen Gas enthalten oder anderweitig damit assoziiert ist (zum Beispiel adsorbiert auf der Oberfläche und/oder enthalten in Hohlräumen, Höhlen oder Poren, wie beispielsweise in EP-A-0122624 , EP-A-0123235 , EP-A-0365467 , WO-A-9221382 , WO-A-9300930 , WO-A-9313802 , WO-A-9313808 oder WO-A-9313809 beschrieben). Es wird erkennbar sein, dass die Echogenität solcher mikropartikulären Kontrastmittel direkt von dem enthaltenen/assoziierten Gas und/oder von Gas (z. B. Mikrobläschen), das aus dem Feststoffmaterial (beispielsweise bei der Auflösung der mikropartikulären Struktur) freigesetzt wurde, abgeleitet werden kann.
Gasmikrobläschen und andere Gas-enthaltende Materialien wie Mikropartikel haben bevorzugt eine anfängliche durchschnittliche Größe, die 10 μm nicht übersteigt (z. B. von 7 μm oder weniger), damit sie nach der Verabreichung, z. B. durch intravenöse Injektion, frei durch das Lungensystem fließen können. Es können jedoch auch größere Mikrobläschen eingesetzt werden, wenn diese beispielsweise eine Mischung aus einem oder mehreren relativ blutlöslichen oder anderweitig diffundierbaren Gasen wie Luft, Sauerstoff, Stickstoff oder Kohlendioxid mit einem oder mehreren im wesentlichen unlöslichen und nicht-diffundierbaren Gasen wie Perfluorkohlenstoffen enthalten. Das Hinausdiffundieren des löslichen/diffundierbaren Gasgehalts nach der Verabreichung wird dazu führen, dass die Mikrobläschen schnell auf eine Größe schrumpfen, die durch die Menge an vorhandenem unlöslichem/nicht- diffundierbarem Gas bestimmt wird, und die so gewählt wird, dass die resultierenden Mikrobläschen durch die Lungenkapillaren des Lungensystems fließen können.
Da das gemäß der Erfindung verabreichte dispergierte Gas durch die Interaktion mit der diffundierbaren Komponente in vivo wachsen kann, kann die minimale Größe der Mikrobläschen, Feststoff-assoziiertem Gas usw., wie verabreicht, wesentlich kleiner sein als die Größe, die üblicherweise zur Bereitstellung einer signifikanten Interaktion mit Ultraschall für notwendig erachtet wird (typischerweise ca. 1–5 μm bei herkömmlich eingesetzten Bildgebungsfrequenzen); die dispergierten Gaskomponenten können daher Größen von beispielsweise nur 1 nm oder darunter haben. Die Erfindung kann demgemäß die Verwendung Gas-enthaltender Zusammensetzungen, die bisher zur Verwendung als Ultraschallkontrastmittel vorgeschlagen worden sind, beispielsweise aufgrund der geringen Größe der dispergierten Gaskomponente, ermöglichen.
Beim Einsatz Phospholipid-enthaltender Zusammensetzungen gemäß der Erfindung, z. B. in Form Phospholipid-stabilisierter Gasmikrobläschen, umfassen repräsentative Beispiele für verwendbare Phospholipide Lecithine (d. h., Phosphatidylcholine), zum Beispiel natürliche Lecithine wie Eigelblecithin oder Sojabohnenlecithin, halbsynthetische (z. B. teilweise oder vollständig hydrierte) Lecithine und synthetische Lecithine wie Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin oder Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidinsäuren; Phosphatidylethanolamine; Phosphatidylserine; Phosphatidylglycerole; Phosphatidylinositole; Cardiolipine; Sphingomyeline; fluorierte Analoga von beliebigen der vorstehenden; Mischungen von beliebigen der vorstehenden und Mischungen mit anderen Lipiden wie Cholesterol. Die Verwendung von Phospholipiden, die vorwiegend (z. B. mindestens 75%) Moleküle umfassen, die jeweils eine Nettogesamtladung, z. B. eine negative Ladung, tragen, wie beispielsweise in natürlich vorkommenden (z. B. abgeleitet von Sojabohnen oder Eigelb), halbsynthetischen (z. B. teilweise oder vollständig hydrierten) und synthetischen Phosphatidylserinen, Phosphatidylglycerolen, Phosphatidylinositolen, Phosphatidinsäuren und/oder Cardiolipinen, wie beispielsweise in WO-A-9729783 beschrieben, ist besonders von Vorteil.
Repräsentative Beispiele für Gas-enthaltende mikropartikuläre Materialien, die gemäß der Erfindung verwendbar sind, umfassen Kohlenhydrate (zum Beispiel Hexosen wie Glucose, Fructose oder Galactose; Disaccharide wie Saccharose, Lactose oder Maltose; Pentosen wie Arabinose, Xylose oder Ribose; α-, β- und γ-Cyclodextrine; Polysaccharide wie Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Amylopectin, Glycogen, Inulin, Pulullan, Dextran, Carboxymethyldextran, Dextranphosphat, Ketodextran, Aminoethyldextran, Alginate, Chitin, Chitosan, Hyaluronsäure oder Heparin und Zuckeralkohole, einschließlich Alditole wie Mannitol oder Sorbitol), anorganische Salze (z. B. Natriumchlorid), organische Salze (z. B. Natriumcitrat, Natriumacetat oder Natriumtartrat), Röntgenstrahlen-Kontrastmittel (z. B. irgendeines der kommerziell erhältlichen Carbonsäure- und nicht-ionischen Amid-Kontrastmittel, die typischerweise mindestens eine 2,4,6-Triiodphenylgruppe mit Substituenten wie Carboxyl, Carbamoyl, N-Alkylcarbamoyl, N-Hydroxyalkylcarbamoyl, Acylamino, N-Alkylacylamino oder Acylaminomethyl an der 3- und/oder 5-Stellung enthalten, wie in Metrizoesäure, Diatrizoesäure, Iotalaminsäure, Ioxaglinsäure, Iohexol, Iopentol, Iopamidol, Iodixanol, Iopromid, Metrizamid, Iodipamid, Megluminiodipamid, Megluminacetrizoat und Meglumindiatrizoat) und Polypeptide und Proteine (z. B. Gelatine oder Albumin wie humanes Serumalbumin).
Andere Gas-enthaltende Materialien, die gemäß der Erfindung verwendbar sind, umfassen Gas-enthaltendes Material, stabilisiert durch Metalle (wie beispielsweise in US-A-3674461 oder US-A-3528809 beschrieben), Gas-enthaltendes Material, stabilisiert durch synthetische Polymere (wie beispielsweise in US-A-3975194 oder von Farnand in Powder Technology 22 [1979], S. 11–16 beschrieben), kommerziell erhältliche Mikrokügelchen vom Typ Expancel^®, z. B. Expancel 551 DE (siehe z. B. Eur. Flask. Neves 9(5)[1982], S. 39, Nonwovens Industry [1981], S. 21 und Mat. Plast. Elast. 10 [1980], S. 468), kommerziell erhältliche Mikrokügelchen vom Typ Ropaque^® (siehe z. B. J. Coatings Technol. 55(707)[1983], S. 79), mikro- und nano-große Gas-enthaltende Strukturen wie Zeolithe, anorganische oder organische Aerogele, nano-große Hohlraum-enthaltende chemische Strukturen wie Fullerene, Klathrate oder Nanoröhrchen (wie beispielsweise von G. E. Gadd in Science 277 (5328)[1997], S. 933–936 beschrieben), und durch natürliche oberflächenaktive Mittel stabilisierte Mikrobläschendispersionen (wie beispielsweise von d'Arrigo in „Stable Gas-in-Liquid Emulsions, Studies in physical and theoretical chemistry” 40 – Elsevier, Amsterdam [1986] beschrieben).
Gemäß der Erfindung kann ein breiter Bereich diffundierbarer Komponenten verwendet werden, einschließlich Gase/Dämpfe, flüchtige Flüssigkeiten, flüchtige Feststoffe und Präkursoren, die beispielsweise nach der Verabreichung Gas erzeugen können, wobei die Grundvoraussetzung ist, dass die Komponente in vivo ausreichend Gas- oder Dampfdruck besitzen sollte oder erzeugen kann (z. B. mindestens 10 Torr), damit sie das Hineindiffundieren von Gas oder Dampfmolekülen in das dispergierte Gas fördern kann. Es wird erkennbar sein, dass gemäß der Erfindung nach Bedarf Mischungen aus zwei oder mehr diffundierbaren Komponenten eingesetzt werden können; Verweise hierein auf „die diffundierbare Komponente" sind dahingehend zu interpretieren, dass solche Mischungen eingeschlossen sind. Dem ähnlich sollen Verweise auf die Verabreichung einer diffundierbaren Komponente die Verabreichung von zwei oder mehr dieser Komponenten, entweder als Mischungen oder als mehrfache Verabreichungen, umfassen.
Die Zusammensetzung, die die diffundierbare Komponente umfasst, kann irgendeine geeignete Form annehmen und kann durch irgendein geeignetes Verfahren verabreicht werden, wobei der Verabreichungsweg zum Teil von dem Bereich des Patienten abhängig ist, der untersucht werden soll. So kann beispielsweise die orale Verabreichung einer geeigneten Zusammensetzung, die eine diffundierbare Komponente umfasst, besonders nützlich sein, wenn die vorübergehende Retention von Gas im Gewebe der Magen-Darm-Wand gefördert werden soll. In repräsentativen Ausführungsformen solcher Anwendungen kann die Gasdispersion intravenös in Dosen, die denen ähneln, die bei der Echokardiographie verwendet werden, injiziert werden, und die diffundierbare Komponente kann als eine oral verabreichbare Emulsion, z. B. eine Perfluorkohlenstoff-in-Wasser-Emulsion, formuliert werden, wie hierin nachstehend ausführlich beschrieben, zum Beispiel in einer Dosis von 0,2–1,0 μl Perfluorkohlenstoff/kg. Nach der Verabreichung und Verteilung der beiden Zusammensetzungen kann das Wachstum der Gasdispersion im Kapillarblutpool in der Magen- oder Darmwand den Konturkontrast aus diesen Regionen verstärken. Es wird zu erkennen sein, dass die umgekehrte Kombination einer oral verabreichbaren Gasdispersion und intravenös injizierbaren diffundierbaren Komponente bei der Bereitstel lung eines Konturkontrasts von der Innenwand oder Mukosa des Magen-Darm-Systems von Nutzen sein kann.
Es kann von Vorteil sein, wenn solche Zusammensetzungen oral verabreichbarer Gasdispersionen oder diffundierbarer Komponenten zur Einführung chemischer Gruppen oder Substanzen, die die Adhäsion an die Wand des Magen-Darm-Traktes fördern, zum Beispiel durch Beimischung mit der Zusammensetzung oder durch Anlagerung an eine Komponente davon, z. B. ein oberflächenaktives Mittel oder eine andere stabilisierende Komponente, verwendet werden, da dies das Wachstum der dispergierten Gasphase stimuliert, indem der Kontakt mit der diffundierbaren Komponente verstärkt wird. Beispiele für solche die Adhäsion fördernden Gruppen/Substanzen sind zuvor beispielsweise in bezug auf Magen-Darm-Röntgen-Kontrastmittel beschrieben worden und umfassen Acrylester, wie in WO-A-9722365 beschrieben, Iodphenolsulfonatester, wie in US-A-5468466 beschrieben, und iodierte Phenylester, wie in US-A-5260049 beschrieben.
Die Inhalation geeignet flüchtiger diffundierbarer Komponenten kann beispielsweise zur Förderung des Wachstums der verabreichten Gasdispersion, unmittelbar nachdem sie durch die Lungenkapillaren geflossen ist, verwendet werden, so dass beispielsweise das Gas dann vorübergehend in den Kapillaren des Myokards zurückgehalten wird. In solchen Ausführungsformen kann das Wachstum des dispergierten Gases durch eine Erhöhung des Lungendrucks der diffundierbaren Komponente, z. B. durch einen Überschuss von bis zu 0,5 bar, zum Beispiel durch die Verwendung eines Atemgeräts oder indem der Patient gegen einen Widerstand ausatmet, weiter gesteigert werden.
Die intramuskuläre oder subkutane Injektion geeignet formulierter Zusammensetzungen diffundierbarer Komponenten, die beispielsweise eine physiologisch akzeptable Trägerflüssigkeit beinhaltet, kann vorteilhaft zum Beispiel eingesetzt werden, wenn speziell die Wirkung der Komponente auf einen bestimmten Zielbereich des Patienten eingeschränkt werden soll. Ein Beispiel für eine Zusammensetzung zur subkutanen Injektion umfasst Nanopartikel wie sie für die Lymphangiographie verwendet werden. Die subkutan injizierte diffundierbare Komponente kann von dem Lymphsystem aufgenommen werden, wo sie das Wachstum einer intravenös injizier ten Gasdispersion herbeiführt, wodurch die Bildgebung der Lymphknoten erleichtert wird. Die umgekehrte Kombination einer subkutan injizierten Gasdispersion und einer intravenös injizierten diffundierbaren Komponente kann ähnlich eingesetzt werden.
Die intravenöse Injektion geeignet formulierter Zusammensetzungen der diffundierbaren Komponente, die beispielsweise eine physiologisch akzeptable Trägerflüssigkeit beinhaltet, ermöglicht eine bemerkenswerte Vielseitigkeit im Betrieb der Erfindung, da, wie nachstehend ausführlich erörtert wird, die Bestandteile der Zusammensetzungen der Gasdispersion und der diffundierbaren Komponente so gewählt werden können, dass Parameter wie der Beginn und die Geschwindigkeit des Wachstums des dispergierten Gases und somit der Teile des Körpers, in denen die Gewebeechogenität durch eine vorübergehende Retention von Gas, zum Beispiel in der Mikrogefäßanordnung, verstärkt werden kann, gesteuert werden.
Geeignete topische Formulierungen können kutan angewendet werden, um so die transkutane Absorption der diffundierbaren Komponente zu fördern. Eine solche Verabreichung kann bei der Bildgebung und/oder Therapie der Haut, Subkutis und benachbarter Regionen und Organe, zum Beispiel beim Targeting des peripheren Kreislaufes der Körperextremitäten, wie der Beine, Anwendung finden.
Diffundierbare Komponenten zur oralen Verabreichung oder durch Injektion können zum Beispiel als Lösungen in oder Mischungen mit Wasser und/oder einem oder mehreren wassermischbaren und physiologisch akzeptablen organischen Lösungsmittel(n), wie Ethanol, Glycerol oder Polyethylenglycol; Dispersionen in einem wässerigen Medium, zum Beispiel als die Ölphase oder ein Bestandteil der Ölphase einer Öl-in-Wasser-Emulsion; Mikroemulsionen, d. h. Systeme, in denen die Substanz effektiv im hydrophoben Inneren oberflächenaktiver Mizellen in einem wässerigen Medium gelöst ist; oder in Verbindung mit Mikropartikeln oder Nanopartikeln, dispergiert in einer geeigneten Trägerflüssigkeit, die beispielsweise auf den Oberflächen von Mikropartikeln oder Nanopartikeln adsorbiert und/oder in Hohlräumen, Höhlen oder Poren von Mikropartikeln oder Nanopartikeln enthalten oder in Mikrokapseln eingekapselt ist, formuliert werden.
Soll eine diffundierbare Komponente als eine Lösung verabreicht werden, wird der daraus in vivo stammende Partialdruck von der Konzentration der Komponente, z. B. im Blutstrom, und dem entsprechenden Druck des reinen Komponentenmaterials, beispielsweise gemäß dem Raoult'schen-Gesetz in einem System, das Idealzustand erreicht, abhängen. Wenn die Komponente daher über eine geringe Wasserlöslichkeit verfügt, sollte sie in reiner Form bei normaler Körpertemperatur wünschenswerterweise einen ausreichenden Dampfdruck, z. B. mindestens 50 Torr, bevorzugt mindestens 100 Torr, aufweisen. Beispiele für relativ wasserunlösliche Komponenten mit hohen Dampfdrücken umfassen Gase wie die, die vorstehend als mögliche Mikrobläschengase aufgelistet wurden.
Repräsentative Beispiele für stärker wasserlösliche/wassermischbare diffundierbare Komponenten, die folglich niedrigere Dampfdrücke bei Körpertemperatur zeigen, umfassen aliphatische Ether wie Ethylmethylether oder Methylpropylether; aliphatische Ester wie Methylacetat, Methylformiat oder Ethylformiat; aliphatische Ketone wie Aceton; aliphatische Amide wie N,N-Dimethylformamid oder N,N-Dimethylacetamid und aliphatische Nitrile wie Acetonitril.
Bevorzugt wird jedoch eine im wesentlichen mit Wasser nicht mischbare diffundierbare Komponente, formuliert als eine Emulsion (d. h., eine stabilisierte Suspension) in einem geeigneten wässerigen Medium, eingesetzt, da in solchen Systemen der Dampfdruck in der wässerigen Phase der diffundierbaren Komponente im wesentlichen dem des reinen Komponentenmaterials selbst in stark verdünnten Emulsionen gleichen wird. In solchen Ausführungsformen kann die diffundierbare Komponente zum Beispiel als ein Teil einer gesetzlich geschützten pharmazeutischen Emulsion, wie Intralipid^® (Pharmacia), formuliert werden.
Die diffundierbare Komponente ist in solchen Emulsionen bei der Verarbeitungs- und Lagertemperatur, die zum Beispiel nur –10°C sein kann, wenn die wässerige Phase ein geeignetes Frostschutzmaterial enthält, vorteilhafterweise eine Flüssigkeit, während sie bei Körpertemperatur ein Gas ist oder einen wesentlichen Dampfdruck zeigt. Geeignete Verbindungen können beispielsweise aus den verschiedenen Listen emulgierbarer niedrigsiedender Flüssigkeiten, die in der vorstehend genannten WO-A-9416379 , deren Inhalte hierin durch Verweis aufgenommen sind, angegeben sind, ausgewählt werden. Spezielle Beispiele emulgierbarer diffundierbarer Komponenten umfassen aliphatische Ether wie Diethylether; polycyclische Öle oder Alkohole wie Menthol, Kampher oder Eucalyptol; heterocyclische Verbindungen wie Furan oder Dioxan; aliphatische Kohlenwasserstoffe, die gesättigt oder ungesättigt und geradkettig oder verzweigt sein können, wie beispielsweise in n-Butan, n-Pentan, 2-Methylpropan, 2-Methylbutan, 2,2-Dimethylpropan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, 1-Buten, 2-Buten, 2-Methylpropen, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 2-Methyl-1-buten, 2-Methyl-2-buten, Isopren, 1-Penten, 1,3-Pentadien, 1,4-Pentadien, Butenin, 1-Butin, 2-Butin oder 1,3-Butadiin; cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe wie Cyclobutan, Cyclobuten, Methylcyclopropan oder Cyclopentan; und halogenierte Kohlenwasserstoffe niederen Molekulargewichts (die beispielsweise bis zu 7 Kohlenstoffatome enthalten). Repräsentative halogenierte Kohlenwasserstoffe umfassen Dichlormethan, Methylbromid, 1,2-Dichlorethylen, 1,1-Dichlorethan, 1-Bromethylen, 1-Chlorethylen, Ethylbromid, Ethylchlorid, 1-Chlorpropen, 3-Chlorpropen, 1-Chlorpropan, 2-Chlorpropan und t-Butylchlorid. Vorteilhafterweise sind zumindest einige der Halogenatome Fluoratome, wie beispielsweise in Dichlorfluormethan, Trichlorfluormethan, 1,2-Dichlor-1,2-difluorethan, 1,2-Dichlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, 1,1,2-Trichlor-1,2,2-trifluorethan, 2-Brom-2-chlor-1,1,1-trifluorethan, 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyldifluormethylether, 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethylether, teilweise fluorierten Alkanen (z. B. Pentafluorpropanen wie 1H,1H,3H-Pentafluorpropan, Hexafluorbutanen, Nonafluorbutanen wie 2H-Nonafluor-t-butan und Decafluorpentanen wie 2H,3H-Decafluorpentan), teilweise fluorierten Alkenen (z. B. Heptafluorpentenen wie 1H,1H,2H-Heptafluorpent-1-en und Nonafluorhexenen wie 1H,1H,2H-Nonafluorhex-1-en), fluorierten Ethern (z. B. 2,2,3,3,3-Pentafluorpropylmethylether oder 2,2,3,3,3-Pentafluorpropyldifluormethylether), und stärker bevorzugt Perfluorkohlenstoffe. Beispiele für Perfluorkohlenstoffe umfassen Perfluoralkane wie Perfluorbutane, Perfluorpentane, Perfluorhexane (z. B. Perfluor-2-methylpentan), Perfluorheptane, Perfluoroctane, Perfluornonane und Perfluordecane; Perfluorcycloalkane wie Perfluorcyclobutan, Perfluordimethyl-cyclobutane, Perfluorcyclopentan und Perfluormethylcyclopentan; Perfluoralkene wie Perfluorbutene (z. B. Perfluorbut-2-en oder Perfluorbuta-1,3-dien), Perfluorpentene (z. B. Perfluorpent-1-en) und Perfluorhexene (z. B. Perfluor-2-methylpent-2-en oder Perfluor-4-methylpent-2-en); Perfluorcycloalkene wie Perfluorcyclopenten oder Perfluorcyclopentadien; und perfluorierte Alkohole wie Perfluor-t-butanol.
Solche Emulsionen können auch mindestens ein oberflächenaktives Mittel enthalten, um die Dispersion zu stabilisieren; dieses kann dasselbe oder ein anderes oberflächenaktives Mittel als das zur Stabilisierung der Gasdispersion verwendete sein. Die Beschaffenheit eines solchen oberflächenaktiven Mittels kann Faktoren wie die Geschwindigkeit des Wachstums der dispergierten Gasphase signifikant beeinflussen. Im allgemeinen kann ein breiter Bereich oberflächenaktiver Mittel verwendet werden, beispielsweise ausgewählt aus den umfassenden Listen, die in EP-A-0727225 angegeben sind, dessen Inhalte hierin durch Verweis aufgenommen sind. Repräsentative Beispiele verwendbarer oberflächenaktiver Mittel umfassen Fettsäuren (z. B. geradkettige gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, die beispielsweise 10–20 Kohlenstoffatome enthalten) und Kohlenhydrat- und Triglyceridester davon, Phospholipide (z. B. Lecithin), Fluor-enthaltende Phospholipide, Proteine (z. B. Albumine wie humanes Serumalbumin), Polyethylenglycole und oberflächenaktive Mittel auf der Basis von Blockcopolymeren (z. B. Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymeren wie Pluronics, gestreckte Polymere wie Acyloxyacylpolyethylenglycole, zum Beispiel Polyethylenglycolmethylether-16-hexadecanoyloxyhexadecanoat, worin zum Beispiel die Polyethylenglycoleinheit ein Molekulargewicht von 2300, 5000 oder 10000 hat) und Fluor-enthaltende oberflächenaktive Mittel (wie beispielsweise unter den Markennamen Zonyl und Fluorad vermarktet oder wie in WO-A-9639197 , dessen Inhalte hierin durch Verweis aufgenommen sind, beschrieben). Besonders nützliche oberflächenaktive Mittel umfassen Phospholipide, die Moleküle mit einer negativen Nettogesamtladung umfassen, wie natürlich vorkommende (wie beispielsweise von Sojabohnen oder Eigelb abgeleitet), halbsynthetische (z. B. teilweise oder vollständig hydriert) und synthetische Phosphatidylserine, Phosphatidylglycerole, Phosphatidylinositole, Phosphatidinsäuren und/oder Cardiolipine.
Die Tröpfchengröße der dispergierten diffundierbaren Komponente in Emulsionen, die zur intravenösen Injektion vorgesehen sind, sollte bevorzugt kleiner als 10 μm, z. B. kleiner als 7 μm, und größer als 0,1 μm sein, um so den ungehinderten Durchfluss durch das Lungensystem zu erleichtern.
Wie erwähnt, können auch mit Wasser nicht mischbare diffundierbare Komponenten als Mikroemulsionen formuliert werden. Solche Systeme sind aufgrund ihrer thermodynamischen Stabilität und aufgrund der Tatsache, dass die diffundierbare Kompo nente in der Praxis nicht einheitlich durch die wässerige Phase verteilt ist, von Vorteil; die Mikroemulsionen erscheinen daher als Lösungen, können, was den Partialdruck der dispergierten Phase angeht, jedoch die Eigenschaften von Emulsionen zeigen.
Gaspräkursoren, die verwendet werden können, umfassen alle biokompatiblen Komponenten, die in vivo zur Gaserzeugung fähig sind, das heißt, bei Körpertemperatur und physiologischem pH. Repräsentative Beispiele umfassen anorganische und organische Carbonate und Bicarbonate und Stickstoff-erzeugende Substanzen wie Pyrazoline, Pyrazole, Triazoline, Diazoketone, Diazoniumsalze, Tetrazole und Azide. Es ist davon auszugehen, dass in solchen Systemen das schließlich erzeugte Gas die tatsächliche diffundierbare Komponente ist.
Um die maximale Verflüchtigung der diffundierbaren Komponente nach der Verabreichung sicher zu stellen und das Wachstum des dispergierten Gases zu verstärken, was beides endotherme Verfahren sind, kann es von Vorteil sein, die Temperatur der Lösung oder Suspension der diffundierbaren Komponente und/oder der Gasdispersion vor der Verabreichung zu manipulieren und/oder exotherm reaktive Bestandteile einzuführen; die Verwendung solcher Bestandteile, die unter dem Einfluss von Ultraschallstrahlung exotherm reagieren, kann besonders vorteilhaft sein.
Das Wachstum der dispergierten Gasphase in vivo kann zum Beispiel mit der Ausdehnung eines Einkapselungsmaterials (wenn dies über ausreichende Flexibilität verfügt) und/oder mit der Absonderung überschüssigen oberflächenaktiven Mittels aus dem verabreichten Material in die wachsenden Gas-Flüssigkeit-Grenzflächen verbunden sein. Es ist jedoch auch möglich, dass das Dehnen des Einkapselungsmaterials und/oder die Interaktion des Materials mit Ultraschall seine Porosität deutlich erhöht. Während bisher angenommen wurde, dass eine solche Spaltung des Einkapselungsmaterials durch Hinausdiffusion und Auflösung des dabei ausgesetzten Gases in vielen Fällen zu einem rapiden Verlust der Echogenität führt, haben wir herausgefunden, dass unter Verwendung von Kontrastmittelpräparaten gemäß der vorliegenden Erfindung das ausgesetzte Gas weitgehend Stabilität zeigt. Ohne sich an theoretische Berechnungen binden zu wollen, glauben wir, dass das ausgesetzte Gas, z. B. in Form freigesetzter Mikrobläschen durch die übersättigte Umgebung, erzeugt durch die diffundierbare Komponente, die einen Innendruckgradienten liefert, der der Hinausdiffusionsneigung des Mikrobläschengases entgegenwirkt, beispielsweise gegen das Zusammenfallen der Mikrobläschen stabilisiert werden kann. Durch die freigelegte Gasoberfläche kann das Kontrastmittelpräparat aufgrund des wesentlichen Fehlens von Einkapselungsmaterial außergewöhnlich günstige Akustikeigenschaften zeigen, wie durch hohe Rückstreuung und niedrige Energieabsorption zu erkennen (ausgedrückt z. B. durch hohe Verhältnisse von Rückstreuung:Dämpfung); diese echogene Wirkung kann für einen signifikanten Zeitraum andauern, selbst während der Fortführung der Ultraschallbestrahlung.
Die Stabilisierungswirkung der gemeinsam verabreichten diffundierbaren Komponente kann daher überaus vorteilhaft zur Verstärkung sowohl der Dauer als auch des Ausmaßes der Echogenität existierender Gas-enthaltender Kontrastmittelformulierungen in Fällen, wo diese Parameter ungenügend sind, wenn die Kontrastmittelzusammensetzung allein verabreicht wird, verwendet werden. So ist beispielsweise die Dauer der Wirkung Albumin-basierender Kontrastmittel durch den Zusammenfall des Albumin-Einkapselungsmaterials, entweder im Ergebnis systolischer Druckveränderungen im Herz- oder Venensystem oder als Folge der Ultraschallbestrahlung, oftmals stark eingeschränkt, kann jedoch durch die gleichzeitige Verabreichung mit einer diffundierbaren Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung deutlich verstärkt werden.
In einer repräsentativen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden eine Zusammensetzung, umfassend eine Gasdispersion, und eine Zusammensetzung, umfassend eine Suspension der diffundierbaren Komponente so ausgewählt, dass mindestens ein Teil des dispergierten Gases durch die Lungen fließt und dann nach dem Fließen aus den Lungen durch Hineindiffundieren der diffundierbaren Komponente schnell wächst, so dass es vorübergehend im Myokard zurückgehalten wird und dabei die Ultraschallvisualisierung einer Myokardperfusion ermöglicht. Wenn die Konzentration an flüchtiger diffundierbarer Komponente im Blutstrom abfällt, beispielsweise wenn die Komponente, zum Beispiel durch Entfernung durch die Lungen und Ausatmen durch den Patienten, durch Metabolismus oder Wiederverteilung in anderen Geweben aus dem Blut geklärt wird, wird die diffundierbare Komponente typischerweise aus dem dispergierten Gas ausdiffundieren, das folglich auf seine anfängliche kleinere Größe schrumpfen wird und schließlich wieder frei im Blutstrom fließt, wobei es typischerweise durch das retikuloendotheliale System daraus entfernt wird. Dieses Muster einer vorübergehenden wesentlichen Erhöhung der Echogenität, gefolgt vom Verschwinden einer Kontrastwirkung, unterscheidet sich merklich von jeglichen echogenen Eigenschaften, die eine der beiden Zusammensetzungen zeigte, wenn sie allein verabreicht wurde. Aus Vorstehendem wird deutlich, dass die Steuerung der Retentionsdauer des dispergierten Gases daher durch die entsprechende Einstellung der Dosis und/oder Formulierung der diffundierbaren Komponente erreicht werden kann.
Andere Kapillarsysteme, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf die der Niere, Leber, Milz, Schilddrüse, des Skelettmuskels, der Brust und des Penis können ähnlich bildlich dargestellt werden.
Es wird zu erkennen sein, dass Faktoren wie die Geschwindigkeit und/oder das Ausmaß des Wachstums des dispergierten Gases allgemein durch die entsprechende Auswahl des Gases und eines stabilisierenden Einkapselungsmaterials und spezieller die Beschaffenheit der diffundierbaren Komponente und der Art wie sie formuliert wurde, einschließlich der Beschaffenheit eines eingesetzten oberflächenaktiven Mittels und der Größe der Tröpfchen der dispergierten Phase, wenn die Komponente als eine Emulsion formuliert wird, gesteuert werden können; in diesem letzteren Kontext kann für eine vorgegebene Menge an emulgierter diffundierbarer Komponente eine Verringerung der Tröpfchengröße die Austauschrate der diffundierbaren Komponente bezogen auf die größerer Tröpfchen verstärken, da aus kleineren Tröpfchen mit höheren Verhältnissen von Oberfläche:Volumen eine schnellere Freisetzung stattfindet. Andere Parameter, die eine Steuerung ermöglichen, umfassen die relativen Mengen, in denen die beiden Zusammensetzungen verabreicht werden, und, wenn diese separat verabreicht werden, die Reihenfolge der Verabreichung, das Zeitintervall zwischen den beiden Verabreichungen, und möglicherweise die räumliche Trennung der beiden Verabreichungen. In diesem letzten Zusammenhang wird zu erkennen sein, dass die inhärente Diffundierbarkeit der diffundierbaren Komponente ihre Anwendung in verschiedenen Teilen des Körpers auf eine Vielzahl von Wegen, zum Beispiel durch Inhalation, kutan, subkutan, intravenös, intramuskulär oder oral, erlauben kann, wohingegen die verfügbare Form der Verabreichung für das dispergierte Gas ein wenig eingeschränkter sein kann.
Besonders wichtige Parameter in Bezug auf die diffundierbare Komponente sind ihre Löslichkeit in Wasser/Blut und ihre Diffundierbarkeit (wie beispielsweise durch ihre Diffusionskonstanten ausgedrückt), die ihre Transportgeschwindigkeit durch die Trägerflüssigkeit oder das Blut und ihre Permeabilität durch eine das dispergierte Gas einkapselnde Membran bestimmen. Auch der durch die diffundierbare Komponente in vivo erzeugte Druck wird ihre Diffusionsgeschwindigkeit in das dispergierte Gas sowie ihre Konzentration beeinflussen. Daher wird gemäß dem Fickschen Gesetz der Konzentrationsgradient der diffundierbaren Komponente bezogen beispielsweise auf den Abstand zwischen den einzelnen Gasmikrobläschen und Emulsionströpfchen, zusammen mit dem Diffusionskoeffizienten der diffundierbaren Substanz in das umliegende flüssige Medium die Austauschrate durch einfache Diffusion bestimmen; der Konzentrationsgradient wird durch die Löslichkeit der diffundierbaren Komponente in dem umliegenden Medium und dem Abstand zwischen den einzelnen Gasmikrobläschen und Emulsionströpfchen bestimmt.
Die effektive Transportgeschwindigkeit der diffundierbaren Komponente kann nach Bedarf durch das Einstellen der Viskosität der Zusammensetzung der dispergierten Gasphase und/oder der Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente, zum Beispiel durch Einführung von einem oder mehrerer biokompatibler Viskositätsverstärker wie Röntgenstrahlenkontrastmittel, Polyethylenglycolen, Kohlenhydraten, Proteinen, Polymeren oder Alkoholen in die Formulierung, gesteuert werden. Es kann zum Beispiel von Vorteil sein, die beiden Zusammensetzungen als einen Bolus mit relativ hohem Volumen gemeinsam zu injizieren (z. B. mit einem Volumen von mindestens 20 ml im Fall eines 70 kg schweren menschlichen Patienten), da so das vollständige Vermischen mit den Bestandteilen des Blutes (und somit das Einsetzen des Wachstums des dispergierten Gases) bis nach dem Eintritt in den rechten Ventrikel des Herzens und die Lungenkapillaren verzögert wird. Die Verzögerung des Wachstums des dispergierten Gases kann durch den Einsatz einer Trägerflüssigkeit, die in bezug auf Gase und alle anderen diffundierbaren Komponenten, wie vorstehend definiert, z. B. durch Abkühlen, untersättigt ist, erhöht werden.
Wie oben erwähnt, können in die Ausführung der Erfindung andere Transportmechanismen als Diffusion involviert sein. So kann der Transport beispielsweise auch mittels hydrodynamischem Durchfluss in dem umliegenden flüssigen Medium stattfinden; dies kann in Gefäßen und Kapillaren wichtig sein, in denen ein Durchfluss mit hoher Scherrate stattfinden kann. Der Transport der diffundierbaren Komponente in das dispergierte Gas kann auch als ein Ergebnis der Kollisions- oder Beinahe-Kollisionsverfahren, z. B. zwischen Gasmikrobläschen und Emulsions-tröpfchen, stattfinden, was zum Beispiel zur Adsorption der diffundierbaren Komponente an der Mikrobläschenoberfläche und/oder Penetration der diffundierbaren Komponente in die Mikrobläschen, d. h. einer Form von Koaleszenz, führt. In solchen Fällen haben der Diffusionskoeffizient und die Löslichkeit der diffundierbaren Komponente eine minimale Wirkung auf die Austauschrate, wobei die Teilchengröße der diffundierbaren Komponente (z. B. die Tröpfchengröße, wenn diese als eine Emulsion formuliert wird) und die Kollisionsfrequenz zwischen Mikrobläschen und Tröpfchen die grundlegenden Faktoren sind, die die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Mikrobläschenwachstums steuern. So wird zum Beispiel für eine vorgegebene Menge an emulgierter diffundierbarer Komponente eine Verringerung der Tröpfchengröße zu einer Erhöhung der Gesamtanzahl an Tröpfchen führen und so die Austauschrate durch Verringerung des mittleren Zwischenteilchenabstandes zwischen den Gasmikrobläschen und Emulsionströpfchen verstärkt und so wiederum die Wahrscheinlichkeit für eine Kollision und/oder Koaleszenz erhöht werden. Es ist davon auszugehen, dass die Austauschraten, die während der Kollisionsverfahren verlaufen, deutlich verstärkt werden können, wenn die Gasmikrobläschen und Emulsionströpfchen der diffundierbaren Komponente durch das Anlegen von Ultraschallenergie zusätzlich oszillatorisch bewegt werden. Die Kinetiken der Kollisionsverfahren, die durch eine solche Ultraschallenergie induziert werden, können sich von den Kinetiken für den Transport der diffundierbaren Komponente in der Trägerflüssigkeit und/oder im Blut beispielsweise dahingehend unterscheiden, dass spezielle Energieniveaus notwendig sein können, um eine Koaleszenz kollidierender Gasmikrobläschen und Emulsionströpfchen zu initiieren. Demgemäß kann es von Vorteil sein, die Größe und daher die Masse der Emulsionströpfchen so zu wählen, dass sie ausreichend Kollisionskraft mit den oszillierenden Mikrobläschen zur Induktion von Koaleszenz erzeugen.
Wie ebenfalls oben erwähnt, ist die Permeabilität eines Materials, das die dispergierte Gasphase einkapselt, ein Parameter, der die Wachstumsrate der Gasphase beeinflussen kann, und es ist daher wünschenswert, eine diffundierbare Komponente zu wählen, die schnell in ein solches Einkapselungsmaterial (das zum Beispiel ein Polymer oder eine oberflächenaktive Membran, z. B. eine Schicht oder eine oder mehrere Doppelschichten eines Membran-bildenden oberflächenaktiven Mittels wie eines Phospholipids sein kann) eindringt. Wir haben herausgefunden, dass auch im wesentlichen undurchlässiges Einkapselungsmaterial verwendet werden kann, da scheinbar die Sonifikation, einschließlich Sonifikation bei niedrigeren und höheren Frequenzen, als sie üblicherweise bei der medizinischen Ultraschallbildgebung verwendet werden, (z. B. im Bereich von 10 Hz bis 1 GHz, bevorzugt zwischen 1 kHz und 10 MHz) und entweder mit kontinuierlicher Bestrahlung oder einfachen oder komplexen Impulsmustern, kombinierter Kontrastmittelpräparate, verabreicht gemäß der Erfindung, selbst das Wachstum des dispergierten Gases fördern oder verstärken können. Solch ein Wachstum kann zum Beispiel durch die Ultraschallbestrahlung, die zur Untersuchung verwendet wird, oder durch einleitende lokalisierte Bestrahlung, die beispielsweise dazu dient, eine vorübergehende Retention des Gases in der Mikrogefäßanordnung eines bestimmten Zielorgans zu bewirken, induziert werden. Alternativ kann die Aktivierung des Wachstums des dispergierten Gases durch Anwendung ausreichender Mengen anderer Energieformen, zum Beispiel Schütteln, Vibration, eines elektrischen Feldes, Bestrahlung oder Teilchenbeschuss, z. B. mit neutralen Teilchen, Ionen oder Elektronen, induziert werden.
Ohne uns an theoretische Betrachtungen binden zu wollen, kann es sein, dass die Ultraschallbehandlung zumindest vorübergehend die Permeabilität des Einkapselungsmaterials, die Diffundierbarkeit der diffundierbaren Komponente in die umliegende flüssige Phase und/oder die Häufigkeit von Kollisionen zwischen Emulsionströpfchen und den eingekapselten Mikrobläschen modifiziert. Da die Wirkung unter Verwendung extrem kurzer Ultraschallimpulse (z. B. mit Zeitintervallen von ca. 0,3 μs bei der B-Mode-Bildgebung oder ca. 2 μs bei der Doppler- oder Zweite-Harmonische-Bildgebung) zu beobachten ist, scheint sie kein Beispiel für gerichtete Diffusion zu sein, worin die laufende Ultraschallbestrahlung eine stetige Erhöhung der Gleichgewichtsradien der Gasbläschen erzeugt (siehe Leighton, E. G. – „The Acoustic Bubble", Academic Press [1994], S. 379), und es kann sein, dass die Ultra schallimpulse die Einkapselungsmembran zerstören und so das Wachstum des dispergierten Gases durch Hineindiffundieren der diffundierbaren Komponente in die so freigelegte Gasphase verstärken.
Nach Bedarf kann entweder das dispergierte Gas oder die diffundierbare Komponente eine azeotrope Mischung umfassen oder so gewählt sein, dass in vivo eine azeotrope Mischung gebildet wird, wenn sich die diffundierbare Komponente mit dem dispergierten Gas vermischt. Eine solche Azeotropenbildung kann zum Beispiel effektiv zur Verstärkung der Flüchtigkeit der Verbindungen relativ hohen Molekulargewichts, z. B. halogenierter Kohlenwasserstoffe wie Fluorkohlenstoffe (einschließlich Perfluorkohlenstoffe), die unter Standardbedingungen bei normaler menschlicher Körpertemperatur von 37°C flüssig sind, verwendet werden, so dass sie bei dieser in Gasform verabreicht werden können. Dies hat wesentliche Vorteile im Hinblick auf die effektive echogene Lebenszeit der Kontrastmittel in vivo, die solche azeotropen Mischungen enthalten, da sich Parameter wie die Wasserlöslichkeit, Fettlöslichkeit, Diffundierbarkeit und Druckresistenz von Verbindungen wie Fluorkohlenstoffen bekanntermaßen mit steigendem Molekulargewicht verringern.
Im allgemeinen wird die ausgewiesene natürliche Resistenz azeotroper Mischungen gegen die Abtrennung ihrer Bestandteile die Stabilität der Kontrastmittelkomponenten, die selbige enthalten, sowohl während der Herstellung, Lagerung als auch Handhabung und nach der Verabreichung verstärken.
Azeotrope Mischungen, die gemäß der Erfindung von Nutzen sind, können beispielsweise anhand der Literatur, die sich auf Azeotrope bezieht, durch experimentelle Untersuchung und/oder durch theoretische Vorhersagen, wie beispielsweise von Tanaka in Fluid Phase Equilibria 24 (1985), S. 187–203, von Kittel, C. und Kroemer, H. in Kapitel 10 der Thermal Physics (W. H. Freeman & Co., New York, USA, 1980) oder von Hemmer, P. C. in den Kapiteln 16–22, Statistisk Mekanikk (Tapir, Trondheim, Norwegen, 1970), deren Inhalte hierin durch Verweis aufgenommen sind, beschrieben, ausgewählt werden.
Ein Literaturbeispiel für ein Azeotrop, das effektiv den Siedepunkt einer Komponente höheren Molekulargewichts auf unter normale Körpertemperatur reduziert, ist die 57:43 G./G.-Mischung aus 1,1,2-Trichlor-1,2,2-trifluormethan (Sp. 47,6°C) und 1,2-Difluor-methan (Sp. 29,6°C), beschrieben in US-A-4055049 , mit einem azeotropen Siedepunkt von 24,9°C. Andere Beispiele für Halogenkohlenwasserstoffenthaltende azeotrope Mischungen werden in EP-A-0783017 ; US-A-5599783 ; US-A-5605647 ; US-A-5605882 ; US-A-5607616 ; US-A-5607912 ; US-A-5611210 ; US-A-5614565 und US-A-5616821 offenbart, deren Inhalte hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Simons et al. in J. Chem. Phys. 18(3)(1950), S. 335–346 berichten, dass Mischungen von Perfluor-n-Pentan (Sp. 29°C) und n-Pentan (Sp. 36°C) eine große positive Abweichung vom Raoult'schen Gesetz zeigen; die Wirkung wird bei ungefähr äquimolaren Mischungen am deutlichsten. Es ist herausgefunden worden, dass in der Praxis der Siedepunkt der azeotropen Mischung etwa 22°C oder weniger beträgt. Mischungen von Perfluorkohlenwasserstoffen und unsubstituierten Kohlenwasserstoffen können im allgemeinen nützliche azeotrope Eigenschaften zeigen; starke azeotrope Wirkungen sind bei Mischungen aus solchen Komponenten mit im wesentlichen ähnlichen Siedepunkten beobachtet worden. Beispiele für andere Perfluorkohlenwasserstoff:Kohlenwasserstoff-Azeotrope umfassen Mischungen von Perfluor-n-hexan (Sp. 59°C) und n-Pentan, wo das Azeotrop einen Siedepunkt zwischen Raumtemperatur und 35°C hat, und von Perfluor-4-methylpent-2-en (Sp. 49°C) und n-Pentan, wo das Azeotrop einen Siedepunkt von ungefähr 25°C hat.
Andere potentiell nützliche azeotrope Mischungen umfassen Mischungen von Halothan und Diethylether und Mischungen aus zwei oder mehr fluorierten Gasen, zum Beispiel Perfluorpropan und Fluorethan, Perfluorpropan und 1,1,1-Trifluorethan oder Perfluorethan und Difluormethan.
Bekanntermaßen können fluorierte Gase wie Perfluorethan Azeotrope mit Kohlendioxid bilden (siehe z. B. WO-A-9502652 ). Demgemäß kann die Verabreichung von Kontrastmitteln, die solche Gase enthalten, zur In-vivo-Bildung ternärer oder höherer Azeotrope mit Blutgasen wie Kohlendioxid führen, wodurch die Stabilität des dispergierten Gases weiter verstärkt wird.
Wo die beiden Zusammensetzungen der kombinierten Kontrastmittelpräparate gemäß der Erfindung gleichzeitig verabreicht werden sollen, können sie beispielsweise aus separaten Spritzen über geeignete Kopplungsmittel injiziert oder bevorzugt unter kontrollierten Bedingungen vorgemischt werden, so das ein frühzeitiges Mikrobläschenwachstum vermieden wird.
Zusammensetzungen, die vor der gleichzeitigen Verabreichung gemischt werden sollen, können vorteilhafterweise in geeigneten Doppel- oder Mehrkammervorrichtungen gelagert werden. So können die Zusammensetzung der Gasdispersion oder ein getrockneter Präkursor davon [der z. B. einen lyophilisierten Rest einer Suspension aus den Gasmikrobläschen in einem amphiphiles Material-enthaltenden wässerigen Medium, worin das amphiphile Material insbesondere im wesentlichen überwiegend aus Phospholipid besteht (z. B. zu mindestens 75%, bevorzugt im wesentlichen vollständig), umfassend Moleküle, die jeweils eine Gesamtnettoladung (z. B. eine negative Ladung) aufweisen] in einer ersten Kammer wie einem Glasfläschchen enthalten sein, an das eine Spritze, enthaltend die Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente, dicht angeschlossen wird; wobei der Spritzenauslass z. B. mit einer Membran oder einem Pfropfen verschlossen ist, um ein frühzeitiges Mischen zu verhindern. Die Betätigung des Spritzenkolbens zerreißt die Membran und führt zum Vermischen der Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente mit der Komponente der Gasdispersion oder zum Vermischen mit einem Präkursor und zur Rekonstitution eines Präkursors davon; wobei die Mischung nach dem notwendigen oder gewünschten Schütteln und/oder Verdünnen abgezogen (z. B. durch eine Spritze) und verabreicht werden kann.
Alternativ können die beiden Zusammensetzungen einem einzelnen abgedichteten Glasfläschchen oder einer Spritze, die zum Beispiel durch eine Membran oder einen Pfropfen getrennt sind, gelagert werden; wobei ein Überdruck von Gas oder Dampf an eine oder beide Zusammensetzungen angelegt werden kann. Das Zerreißen der Membran oder des Pfropfens, z. B. durch Einführen einer subkutanen Nadel in das Glasfläschchen, führt zum Vermischen der Zusammensetzungen; dies kann nach Bedarf durch Schütteln per Hand verstärkt werden, wonach die Mischung abgezogen und verabreicht werden kann. Andere Ausführungsformen, in denen zum Beispiel ein Glasfläschchen, enthaltend einen getrockneten Präkursor für die Zusammensetzung der Gasdispersion, mit einer ersten Spritze, enthaltend ein Redispersionsfluid für den Präkursor, und einer zweiten Spritze, enthaltend die Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente, ausgestattet ist, oder in denen ein Glasfläschchen, enthaltend eine Membran-getrennte Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente und einen Präkursor für die Zusammensetzung der Gasdispersion, mit einer Spritze, enthaltend ein Redispersionsfluid für letztere, können ähnlich verwendet werden.
In Ausführungsformen der Erfindung, in denen die Zusammensetzung der Gasdispersion und die Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente vor der Verabreichung gemischt werden, entweder in der Herstellungsstufe oder danach, wird die Mischung typischerweise bei erhöhtem Druck oder verringerter Temperatur gelagert, so dass der Druck der diffundierbaren Komponente nicht ausreicht, für das Wachstum des dispergierten Gases zu sorgen. Die Aktivierung des Wachstums des dispergierten Gases kann einfach durch die Freisetzung von überschüssigem Druck oder durch Erwärmen auf Körpertemperatur, was nach der Verabreichung der Mischung erfolgt, induziert werden, oder es kann nach Bedarf durch das Vorerwärmen der Mischung unmittelbar vor der Verabreichung bewirkt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung, in denen die Zusammensetzung der Gasdispersion und die Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente separat verabreicht werden, kann das Timing zwischen den beiden Verabreichungen zur Beeinflussung des Bereiches des Körpers, in dem das Wachstum der dispergierten Gasphase vorwiegend stattfindet, verwendet werden. Daher kann die diffundierbare Komponente beispielsweise zuerst in die Leber injiziert werden und sich darin konzentrieren, wodurch die Bildgebung dieses Organs bei der anschließenden Injektion der Gasdispersion verbessert wird. Wo es die Stabilität der Gasdispersion gestattet, kann auch diese zuerst in die Leber injiziert werden und sich darin konzentrieren, wobei die diffundierbare Komponente dann zur Verstärkung ihrer Echogenität verabreicht wird.
Die Bildgebungsmodalitäten, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen zwei- und dreidimensionale Bildgebungstechniken wie die B-Mode-Bildgebung (zum Beispiel unter Verwendung der zeitvariablen Amplitude der Signalhülle, erzeugt aus der Grundschwingungsfrequenz des emittierten Ultraschallimpul ses, aus Subharmonischen oder höheren Harmonischen davon oder aus Summen- oder Differenzfrequenzen, abgeleitet von dem emittierten Impuls und solchen Harmonischen, wobei Bilder, erzeugt aus der Grundschwingungsfrequenz oder der zweiten Harmonischen davon bevorzugt sind), die Farb-Doppler-Bildgebung, Doppler-Amplituden-Bildgebung und Kombinationen der letzten beiden Techniken mit irgendeiner der anderen oben beschriebenen Modalitäten. Es ist herausgefunden worden, dass für eine vorgegebene Dosis der Zusammensetzungen der Gasdispersion und der diffundierbaren Komponente die Verwendung des Farb-Doppler-Bildgebungsultraschalls das Wachstum des dispergierten Gases stärkere Kontrastwirkungen während der anschließenden B-Mode-Bildgebung liefert, möglicherweise als ein Ergebnis der eingesetzten höheren Ultraschallintensitäten. Zur Reduktion von Bewegungen können aufeinanderfolgende Bilder von Geweben wie des Herzens oder der Niere mit Hilfe geeigneter Synchronisationstechniken (z. B. Signalgating für das ECG oder Atembewegung des Patienten) gesammelt werden. Nützlicherweise kann auch eine Messung der Veränderungen der Resonanzfrequenz oder Frequenzabsorption, die das Wachstum des dispergierten Gases begleiten, zur Detektion des Kontrastmittels vorgenommen werden.
Es wird angenommen, dass der Gehalt an dispergiertem Gas des kombinierten Kontrastmittelpräparats gemäß der Erfindung möglicherweise in Konzentrationen proportional zur regionalen Geschwindigkeit der Gewebeperfusion vorübergehend im Gewebe zurückgehalten wird. Wenn demgemäß unter Verwendung von Ultraschallbildgebungsmodalitäten wie herkömmlicher oder harmonischer B-Mode-Bildgebung, bei denen die Wiedergabe direkt aus rückkehrenden Signalintensitäten abgeleitet ist, können Bilder von solchem Gewebe als Perfusionskarten interpretiert werden, in denen die wiedergegebene Signalintensität eine Funktion der lokalen Perfusion ist. Dies steht im Gegensatz zu Bildern, erhalten unter Verwendung frei-fließender Kontrastmittel, wo die regionale Konzentration an Kontrastmittel und die entsprechende Rückführungssignalintensität vom eigentlichen Blutgehalt und nicht von der Perfusionsrate des lokalen Gewebes abhängt.
In Herzstudien, in denen Perfusionskarten aus Rückführungssignalintensitäten gemäß dieser Ausführungsformen der Erfindung abgeleitet sind, kann es von Vorteil sein, einen Patienten physisch oder pharmakologisch anzustrengen, um die Unter scheidung und so die Differenz der Bildintensitäten zwischen normal perfundiertem Myokard und allen Myokardregionen, die von stenotischen Arterien versorgt werden, zu verstärken. Aus der Radionucleid-Herzbildgebung ist bekannt, dass eine solche Anstrengung Vasodilatation und erhöhten Blutfluss in gesundem Myokardgewebe induziert, wohingegen der Blutfluss in unter-perfundiertem Gewebe, das von einer stenotischen Arterie versorgt wird, im wesentlichen unverändert bleibt, da die Fähigkeit zur Arteriolenerweiterung bereits durch inhärente Autoregulation, die versucht, den eingeschränkten Blutfluss zu erhöhen, erschöpft wurde.
Der Einsatz von Anstrengung als Körperübung oder pharmakologisch durch Verabreichung adrenerger Agonisten kann bei Patientengruppen, die möglicherweise an einer Herzerkrankung leiden, zu Beschwerden wie Brustschmerzen führen, und daher wird bevorzugt die Perfusion von gesundem Gewebe durch Verabreichung eines gefäßerweiternden Arzneimittels, beispielsweise ausgewählt aus Adenosin, Dipyridamol, Nitroglycerin, Isosorbidmononitrat, Prazosin, Doxazosin, Dihydralazin, Hydralazin, Natriumnitroprussid, Pentoxyphyllin, Amelodipin, Felodipin, Isradipin, Nifedipin, Nimodipin, Verapamil, Diltiazem und Stickstoff(I)-oxid verstärkt. Im Falle von Adenosin kann dies zu einer mehr als vierfachen Erhöhung des Koronarblutflusses in gesundem Myokardgewebe führen, wodurch die Aufnahme und vorübergehende Retention von Kontrastmitteln gemäß der Erfindung stark erhöht werden und so wiederum die Differenz der Rückführungssignalintensitäten zwischen normalem und hypoperfundiertem Myokardgewebe signifikant erhöht wird. Da eine im wesentlichen physische Einschlussmethode involviert ist, ist die Retention der Kontrastmittel gemäß der Erfindung überaus effizient; diese kann mit der Aufnahme von Radionucleidtracern wie Thallium 201 und Technetium-Sestamibi verglichen werden, die durch eine kurze Kontaktzeit zwischen Tracer und Gewebe eingeschränkt ist und so das Aufrechthalten der Vasodilatation für den gesamten Zeitraum der Blutpoolverteilung für den Tracer (z. B. 4–6 Minuten für die Thalliumszintigraphie) zur Sicherstellung einer optimalen Wirkung erfordert. Andererseits leiden die Kontrastmittel der Erfindung nicht unter derartigen Diffusions- oder Transporteinschränkungen, und daher kann ihre Retention in Myokardgewebe beispielsweise auch durch Einstellen der Wachstum-erzeugenden Ultraschallbestrahlung schnell beendet werden, wobei der Zeitraum für die Vasodilatation, die zum Erhalt der bildlichen Darstellung der Herzperfusion gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung erforderlich ist, sehr kurz sein kann, zum Beispiel weniger als eine Minute. Dies wird die Dauer einer möglichen Beschwerde für den Patienten, verursacht durch die Verabreichung gefäßerweiternder Arzneimittel, reduzieren.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass die erforderliche Vasodilatation nur kurz andauern muss, ist Adenosin ein besonders nützliches gefäßerweiterndes Arzneimittel, das sowohl eine endogene Substanz ist als auch eine sehr kurz anhaltende Wirkung hat, was durch eine Blutpool-Halbwertszeit von nur 2 Sekunden ersichtlich wird. Eine Vasodilatation wird demgemäß im Herzen am intensivsten sein, da das Arzneimittel körperfernere Gewebe in weniger als pharmakologisch aktiven Konzentrationen erreichen wird. Es wird angenommen, dass aufgrund dieser kurzen Halbwertszeit während der Herzbildgebung gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung eine wiederholte Injektion oder Infusion von Adenosin notwendig sein wird; beispielsweise kann eine anfängliche Verabreichung von 150 μg/kg Adenosin im wesentlichen gleichzeitig mit der Verabreichung der Kontrastmittelzusammensetzung, 10 Sekunden später gefolgt von der langsamen Injektion weiterer 150 μg/kg Adenosin, z. B. über einen Zeitraum von 20 Sekunden, stattfinden.
Kontrastmittelpräparate zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung können vorteilhaft als Abgabemittel für bioaktive Komponenten wie therapeutische Arzneimittel (d. h. Mittel mit einer vorteilhaften Wirkung auf eine spezielle Krankheit bei einem lebenden Menschen oder einem nicht-menschlichen Tier), insbesondere an den vorgesehenen Stellen, eingesetzt werden. So können zum Beispiel therapeutische Verbindungen in dem dispergierten Gas vorhanden sein, mit einem Teil einer einkapselnden Wand oder Matrix, z. B. mittels kovalenter oder ionischer Bindungen, nach Bedarf durch einen Spacer-Arm, verbunden werden oder physikalisch in einem solchen Einkapselungs- oder Matrixmaterial gemischt werden; wobei die letzte Option insbesondere da anwendbar ist, wo die therapeutische Verbindung und das Einkapselungs- oder Matrixmaterial ähnliche Polaritäten oder Löslichkeiten haben.
Die steuerbaren Wachstumseigenschaften des dispergierten Gases können dazu verwendet werden, seine vorübergehende Retention in der Mikrogefäßanordnung einer angestrebten Zielregion herbeizuführen; wobei die Verwendung von Ultraschallbestrahlung zur Induktion des Wachstums und daher der Retention des Gases und der damit verbundenen therapeutischen Verbindung in einer Zielstruktur besonders vorteilhaft ist. Auch die lokale Injektion der Zusammensetzung der Gasdispersion oder stärker bevorzugt der Zusammensetzung der diffundierbaren Komponente, wie beispielsweise vorstehend beschrieben, kann zur Konzentration des Wachstums des dispergierten Gases in einem Zielbereich genutzt werden.
Die therapeutische Verbindung, die nach Bedarf mit einem ortsspezifischen Vektor mit Affinität für spezielle Zellen, Strukturen oder pathologische Stellen gekoppelt werden kann, kann zum Beispiel im Ergebnis des Streckens oder Brechens des Einkapselungs- oder Matrixmaterials, verursacht durch das Wachstum des dispergierten Gases, Auflösung des Einkapselungs- oder Matrixmaterials oder Desintegration der Mikrobläschen oder Mikroteilchen (z. B. induziert durch Ultraschallbehandlung oder durch eine Umkehrung des Konzentrationsgradienten der diffundierbaren Komponente im Zielbereich) freigesetzt werden. Wo ein therapeutisches Mittel chemisch mit einer einkapselnden Wand oder Matrix verbunden wird, kann die Verbindung oder irgendein damit verbundener Spacer-Arm vorteilhafterweise eine oder mehrere labile Gruppen enthalten, die zur Freisetzung des Mittels aufgespalten werden können. Repräsentative spaltbare Gruppen umfassen Amid-, Imid-, Imin-, Ester-, Anhydrid-, Acetal-, Carbamat-, Carbonat-, Carbonatester- und Disulfidgruppen, die in vivo, z. B. im Ergebnis einer hydrolytischen und/oder enzymatischen Wirkung, biologisch abbaubar sind.
Repräsentative und nicht-einschränkende Beispiele für Arzneimittel, die gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung von Nutzen sind, umfassen Antineoplastika wie Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Busulfan, Chlorambucil, Spiroplatin, Cisplatin, Carboplatin, Methotrexat, Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenin, Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazin, Dactinomycin (Antinomycin D), Daunorubicin, Doxorubicinhydrochlorid, Taxol, Plicamycin, Aminoglutethimid, Estramustin, Flutamid, Leuprolid, Megestrolacetat, Tamoxifen, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase), Etoposid, Interferon a-2a und 2b, Blutprodukte wie Hämatoporphyrine oder Derivate der vorstehenden; biologische Reaktionsmodifikatoren wie Muramylpeptide; Antimykotika wie Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytosin, Miconazol oder Amphotericin B; Hormone oder Hormon-Analoga wie das Wachstumshormon, das Melanophorenhormon, Estradiol, Beclo methasondipropionat, Betamethason, Cortisonacetat, Dexamethason, Flunisolid, Hydrocortison, Methylprednisolon, Paramethasonacetat, Prednisolon, Prednison, Triamcinolon oder Fludrocortisonacetat; Vitamine wie Cyanocobalamin oder Retinoide; Enzyme wie alkalische Phosphatase oder Mangansuperoxiddismutase; Antiallergika wie Amelexanox; Antikoagulationsmittel wie Warfarin, Phenprocoumon oder Heparin; Antithrombotika; Kreislaufarzneimittel wie Propranolol; Stoffwechselverstärker wie Glutathion; Tuberkulosemittel wie p-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Capreomycinsulfat, Cyclosexin, Ethambutol, Ethionamid, Pyrazinamid, Rifampin oder Streptomycinsulfat; Virostatika wie Acyclovir, Amantadin, Azidothymidin, Ribavirin oder Vidarabin; Blutgefäß erweiternde Mittel wie Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythritoltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin oder Pentaerythritoltetranitrat; Antibiotika wie Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradin, Erythromycin, Clindamycin, Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Dicloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Penicillin oder Tetracyclin; entzündungshemmende Mittel wie Diflunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclefenamat, Mefenaminsäure, Naproxen, Phenylbutazon, Piroxicam, Tolmetin, Aspirin oder Salicylate; Antiprotozoenmittel wie Chlorquin, Metronidazol, Chinin oder Megluminantimonat; Antirheumatika wie Penicillamin; Narkotika wie Paregoric; Opiate wie Codein, Morphin oder Opium; kardiale Glycoside wie Deslanesid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin oder Digitalis; Nerven-Muskel-Blocker wie Atracuriummesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid, Tubocurarinchlorid oder Vecuroniumbromid; Sedativa wie Amobarbital, Amobarbitalnatrium, Apropbarbital, Butabarbitalnatrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochlorid, Paraldehyd, Pentobarbital, Secobarbitalnatrium, Talbutal, Temazepam oder Triazolam; Lokalanästhetika wie Bupivacain, Chlorprocain, Etidocain, Lidocain, Mepivacain, Procain oder Tetracain; Allgemeinanästhetika wie Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexitalnatrium oder Thiopental und pharmazeutisch akzeptable Salze (z. B. Säureadditionssalze wie die Hydrochlorid- oder Hydrobromid- oder Basensalze wie Natrium-, Calcium oder Magnesiumsalze) oder Derivate (z. B. Acetate) davon; und radioaktive Chemikalien, die zum Beispiel Beta-Strahler umfassen. Besonders wichtig sind Antithrombotika wie Vitamin K-Antagonisten, Heparin und Mittel mit Heparin-ähnlicher Wirkweise wie Antithrombin III, Dalteparin und Enoxaparin; Blutplättchen-Aggregations-Inhibitoren wie Ticlopidin, Aspirin, Dipyridamol, Iloprost und Abciximab; und thrombolytische Enzyme wie Streptokinase und Plasminogenaktivator. Andere Beispiele für Therapeutika umfassen genetisches Material wie Nucleinsäuren, RNA und DNA natürlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich rekombinante RNA und DNA. DNA, die bestimmte Proteine kodiert, kann zur Behandlung vieler unterschiedlicher Arten von Krankheiten verwendet werden. Beispielsweise können der Tumor-Nekrose-Faktor oder Interleukin-2 zur Behandlung fortgeschrittener Krebsarten bereitgestellt werden; Thymidinkinase kann zur Behandlung von Eierstockkrebs oder Hirntumoren bereitgestellt werden; Interleukin-2 kann zur Behandlung eines Neuroblastoms, eines malignen Melanoms oder Nierenkrebs bereitgestellt werden und Interleukin-4 kann zur Behandlung von Krebs bereitgestellt werden.
Die Kontrastmittelpräparate zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung können als Vehikel für Kontrast-verstärkende Komponenten für andere Bildgebungsmodalitäten als Ultraschall, zum Beispiel Röntgenstrahlen, Lichtbildgebung, Magnetresonanz und stärker bevorzugt szintigraphische Bildgebungsmittel, verwendet werden. Das gesteuerte Wachstum der dispergierten Gasphase kann zur Positionierung solcher Mittel in den vorgesehenen Bereichen im Körper von Patienten, zum Beispiel unter Verwendung von Ultraschallbestrahlung eines Zielorgans oder – gewebes zur Induktion des gewünschten gesteuerten Wachstums und der vorübergehenden Retention des Mittels, das dann unter Verwendung der entsprechenden Nicht-Ultraschall-Bildgebungsmodalität abgebildet wird, verwendet werden.
Die Kontrastmittelpräparate zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung können auch als Vehikel für therapeutisch aktive Substanzen, die nicht notwendigerweise aus dem Präparat freigesetzt werden müssen, damit sie ihre therapeutische Wirkung zeigen, verwendet werden. Solche Präparate können zum Beispiel radioaktive Atome oder Ionen wie Beta-Strahler enthalten, die eine lokalisierte Strahlenemittierungswirkung nach dem Wachstum der dispergierten Gasphase und vorübergehende Retention des Mittels an der Zielstelle zeigen. Es wird erkennbar sein, dass solche Mittel bevorzugt so zu gestalten sind, dass das anschließende Schrumpfen und Einstellen der Retention des dispergierten Gases nicht stattfindet, bis die gewünschte therapeutische Strahlendosis verabreicht worden ist.
Die Kontrastmittelpräparate zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung können ferner von allein therapeutische Eigenschaften zeigen. So kann zum Beispiel das dispergierte Gas auf Kapillaren gerichtet werden, die zu Tumoren führen, und als Zellgift agieren, indem es diese Kapillaren blockiert. So kann durch die Anwendung lokalisierter Ultraschallenergie eine gesteuerte und lokalisierte Embolie erhalten werden; diese ist als solche oder in Kombination mit anderen therapeutischen Maßnahmen wichtig. Die Konzentrationen des dispergierten Gases in den Kapillaren kann auch die Absorption von Ultraschallenergie in der Hyperthermie-Therapie verstärken; diese kann zum Beispiel bei der Behandlung von Lebertumoren angewendet werden. Die Bestrahlung mit einem fokussierten Ultraschallstrahl, z. B. bei 1,5 MHz, mit relativ hoher Energie (z. B. 5 W) kann in solchen Anwendungen geeignet sein.
Es wird erkennbar sein, dass sich die vorliegende Erfindung auf das Verfahren zur Erzeugung von Bildern, umfassend die Verwendung von Präparaten, die ein wässeriges Medium mit darin dispergiertem Gas umfassen, und einer Zusammensetzung, umfassend eine diffundierbare Komponente, als allgemeine gegenständliche Zusammensetzungen, erstreckt.
Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
Beispiel 1 – Herstellungen
a) Perfluorbutan-Gasdispersion
Hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in einer 2%igen Lösung von Propylenglycol in gereinigtem Wasser (20 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt, und die resultierende Dispersion konnte über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen. Portionen von 1 ml wurden in 2-ml-Glasfläschchen überführt, der Dampfraum über jeder Portion wurde mit Perfluorbutangas gespült und die Glasfläschchen wurden 45 Sekunden unter Verwendung eines Espe CapMix^®-Mixers für Dentalmaterialen geschüttelt, was milchig weiße Mikrobläschendispersionen mit einem mittleren Volumendurchmesser von 5,0 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters, ergab (alle Coul ter-Counter-Messungen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Instruments, ausgestattet mit einer 50-μm-Öffnung und mit einem Messbereich von 1–30 μm, durchgeführt; Isoton II wurde als Elektrolyt verwendet).
b) Dispersion einer Gasdispersion aus lyophilisiertem Perfluorbutan
Eine Probe der milchig weißen Dispersion aus Beispiel 1(a) wurde dreimal durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit gewaschen, wonach ein gleiches Volumen einer 10%igen Saccharoselösung zugegeben wurde. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann in destilliertem Wasser erneut dispergiert, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion mit einem mittleren Volumendurchmesser von 3,5 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters, ergab.
c) 2-Methylbutanemuision
Hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in gereinigtem Wasser (20 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion über Nacht auf 0°C abgekühlt. 1 ml der Dispersion wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 200 μl 2-Methylbutan (Sp. 28°C) gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde dann 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde. Der mittlere Volumendurchmesser der Emulsionströpfchen betrug 1,9 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters.
d) Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(c) wurde wiederholt, außer dass das 2-Methylbutan durch Perfluorpentan (Sp. 29°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
e) 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyldifluormethyletheremulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(c) wurde wiederholt, außer dass das 2-Methylbutan durch 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyldifluormethylether (Sp. 55–57°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
f) 2-Brom-2-chlor-1,1,1-trifluorethanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(c) wurde wiederholt, außer dass das 2-Methylbutan durch 2-Brom-2-chlor-1,1,1-trifluorethan (Sp. 49°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
g) 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethyletheremulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(c) wurde wiederholt, außer dass das 2-Methylbutan durch 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethylether (Sp. 49°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
h) Dispersion von Gas-enthaltenden Polymer-/humanes Serumalbumin-Teilchen
Mit humanem Serumalbumin beschichtete Gas-enthaltende Polymerteilchen aus Ethyliden-bis-(16-hydroxyhexadecanoat) und Adipoylchlorid, hergestellt gemäß Beispiel 3(a) von WO-A-9607434 , (100 mg) wurden in einem Mörser zerstoßen und in 0,9% wässerigem Natriumchlorid (10 ml) durch Schütteln auf einem Laborschüttler für 24 Stunden dispergiert.
i) Dispersion von Gas-enthaltenden Polymer-/Gelatine-Teilchen
Gelatine-beschichtete Gas-enthaltende Polymerteilchen aus Ethyliden-bis-(16-hydroxyhexadecanoat) und Adipoylchlorid, hergestellt gemäß Beispiel 3(e) von WO-A-9607434 , (100 mg) wurden in einem Mörser zerstoßen und in 0,9% wässerigem Natriumchlorid (10 ml) durch Schütteln auf einem Laborschüttler für 24 Stunden dispergiert.
j) 2-Methylbutanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(c) wurde wiederholt, außer dass die Emulsion vor der Verwendung 10 Mal verdünnt und bei Nichtgebrauch in einem Eisbad gelagert wurde.
k) Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(d) wurde wiederholt, außer dass die Emulsion vor der Verwendung 10 Mal verdünnt und bei Nichtgebrauch in einem Eisbad gelagert wurde.
l) Perfluorpentanemulsion
Hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in gereinigtem Wasser (20 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion über Nacht auf 0°C abgekühlt. 1 ml der Dispersion wurden in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl Perfluor-n-pentan (Sp. 29°C) gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde dann 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde. Der mittlere Volumendurchmesser der Emulsionströpfchen betrug 2,9 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters.
m) Perfluorbutanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluorbutan (Sp. –2°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
n) Perfluorpentanemulsion, hergestellt durch Ultraschallbehandlung
Hydriertes Phosphatidylserin (500 mg) in gereinigtem Wasser (100 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt, und die resultierende Dispersion konnte über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen. 10 ml der Dispersion wurden in ein 30-ml-Glasfläschchen überführt, in das dann Perfluorpentan (1 ml) gegeben wurde. Die Ultraschallbehandlung der resultierenden Mischung für zwei Minuten ergab eine Dispersion der diffundierbaren Komponente, in der die Tropfen einen mittleren Durchmesser von < 1 μm hatten.
o) Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Volumen an eingesetztem Perfluorpentan auf 60 μl reduziert wurde. Die erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
p) Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Volumen an eingesetztem Perfluorpentan auf 20 μl reduziert wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
q) Perfluorpentan: Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion (1:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch eine Mischung aus 50 μl Perfluorpentan (Sp. 29°C) und 50 μl Perfluor-4-methylpent-2-en (Sp. 49°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert. Der mittlere Volumendurchmesser der Emulsionströpfchen betrug 2,8 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters.
r) Perfluorpentan: 1H,1H,2H-Heptafluorpent-1-enemulsion (1:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch eine Mischung aus 50 μl Perfluorpentan (Sp. 29°C) und 50 μl 1H,1H,2H-Heptafluorpent-1-en (Sp. 30–31°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
s) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert durch Distearoylphosphatidylcholin:Distearoylphosphatidylserin (1:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus Distearoylphosphatidylcholin (50 mg) und Distearoylphosphatidylserin, Natriumsalz (50 mg) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
t) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert durch Distearoylphosphatidylcholin:Distearoylphosphatidylserin (3:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus Distearoylphosphatidylcholin (75 mg) und Distearoylphosphatidylserin, Natriumsalz (25 mg) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
u) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert durch Distearoylphosphatidylcholin:Distearoylphosphatidylglycerol (3:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus Distearoylphosphatidylcholin (75 mg) und Distearoylphosphatidylglycerol, Natriumsalz (25 mg) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
v) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert durch hydriertes Phosphatidylcholin:hydriertes Phosphatidylserin (11:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch 100 mg einer Mischung aus hydriertem Phosphatidylcholin und hydriertem Phosphatidylserin (11:1) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
w) Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion, stabilisiert durch Distearoylphosphatidylcholin:Distearoylphosphatidylserin (3:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus Distearoylphosphatidylcholin (75 mg) und Distearoylphosphatidylserin, Natriumsalz (25 mg) und das Perfluorpentan durch Perfluor-4-methylpent-2-en ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
x) Perfluorpentan:Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion (1:1), stabilisiert durch Distearoylphosphatidylcholin:Distearoylphosphatidylserin (3:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(w) wurde wiederholt, außer dass das Perfluor-4-methylpent-2-en durch eine Mischung aus 50 μl Perfluorpentan und 50 μl Perfluor-4-methylpent-2-en ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
y) Perfluorpentan:Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion (1:1), stabilisiert durch Distearoylphosphatidylcholin:Distearoylphosphatidylglycerol (3:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(x) wurde wiederholt, außer dass das Distearoylphosphatidylserin, Natriumsalz durch Distearoylphosphatidylglycerol, Natriumsalz ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
z) Perfluordecalin:Perfluorbutan-Emulsion
Hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in wässerigem Glycerol (5,11%)/Propylenglycol (1,5%)(20 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion über Nacht auf 0°C abgekühlt. 1 ml der Dispersion wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 ml Perfluordecalin (Sp. 141–143°C), gesättigt mit Perfluorbutan (Sp. –2°C), gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde dann für 60 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde.
aa) Perfluordecalin:Perfluorpropan-Emulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(z) wurde wiederholt, außer dass das mit Perfluorbutan gesättigte Perfluordecalin durch Perfluordecalin, gesättigt mit Perfluorpropan (Sp. –39°C), ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ab) Perfluordecalin:Schwefelhexafluorid-Emulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(z) wurde wiederholt, außer dass das mit Perfluorbutan gesättigte Perfluordecalin durch Perfluordecalin, gesättigt mit Schwefelhexafluorid (Sp. –64°C), ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ac) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert mit Fluorad FC-170C
1 ml einer Dispersion von Fluorad FC-170C (200 mg) in gereinigtem Wasser (20 ml) wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl Perfluor-n-pentan gegeben wurden. Dann wurde das Glasfläschchen 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde.
ad) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert mit Pluronic F68:Fluorad FC-170C
100 μl einer 10%igen Pluronic F68-Lösung wurden zu 200 μl von 1%igem Fluorad FC-170C und 700 μl gereinigtem Wasser gegeben. Die resultierende Mischung wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl Perfluor-n-pentan gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde dann 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde. Eine Probe dieser Emulsion wurde in ein Kunststoff-Glasfläschchen mit Schraubverschluss (2,8 ml) überführt, das dann in einem Wasserbad 2 Minuten (Impulssonifikation: 1 pro Sekunde) ultraschallbehandelt wurde. Der mittlere Volumendurchmesser der ultraschallbehandelten Tröpfchen betrug 0,99 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters.
ae) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert mit Pluronic F68:Fluorad FC-170C und hergestellt durch Homogenisierung
1 ml einer 10%igen Pluronic F68-Lösung wurden zu 2 ml von 1%igem Fluorad FC-170C und 7 ml gereinigtem Wasser gegeben, wonach der resultierenden Mischung 1 ml Perfluor-n-pentan zugegeben wurde. Die so erhaltene Dispersion wurde dann durch Rotor/Stator-Homogenisierung für 2 Minuten bei 23000 U/min homogenisiert. Die resultierende Emulsion wurde in ein Kunststoff-Glasfläschchen mit Schraubverschluss (10 ml) überführt und in einem Wasserbad für 2 Minuten (Impulssonifikation: 1 pro Sekunde) ultraschallbehandelt.
af) Perfluorpentanemulsion
Hydriertes Phosphatidylserin (250 mg) in gereinigtem Wasser (100 ml) wurde 50 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion über Nacht auf 0°C abgekühlt. 1 ml der Dispersion wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl Perfluorpentan gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde.
ag) Dispersion einer Gasdispersion von lyophilisiertem Perfluorbutan
Eine Probe der milchig weißen Dispersion aus Beispiel 1(a) wurde dreimal durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit gewaschen, wonach ein gleiches Volumen einer 10%igen Saccharoselösung zugegeben wurde. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann in destilliertem Wasser erneut dispergiert, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion mit einem mittleren Volumendurchmesser von 2,6 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters, ergab.
ah) Perfluorpropangasdispersion
Das Verfahren aus Beispiel 1(a) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorbutangas durch Perfluorpropangas ersetzt wurde. Die resultierende milchig weiße Mikrobläschendispersion hatte einen mittleren Volumendurchmesser von 2,6 μm, gemessen unter Verwendung eines Coulter-Counters.
ai) Perfluorpentanemulsion
Hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in gereinigtem Wasser (100 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion über Nacht auf 0°C abgekühlt. 1 ml der Dispersion wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl Perfluorpentan gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde.
aj) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert mit Brij 58:Fluorad FC-170C, hergestellt durch Schütteln
Brij 58 (400 mg) wurde zu einer Lösung von 0,1% Fluorad FC-170C (10 ml) gegeben und bei Raumtemperatur eine Stunden gerührt. 1 ml der resultierenden Lösung wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das Perfluorpentan (100 μl) gegeben wurde. Das Glasfläschchen wurde dann für 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde.
ak) Perfluorpentanemulsion, stabilisiert mit Brij 58:Fluorad FC-170C, hergestellt durch Ultraschallbehandlung
Brij 58 (400 mg) wurde zu einer Lösung von 0,1% Fluorad FC-170C (10 ml) gegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Dann wurde Perfluorpentan (1 ml) zugegeben und die resultierende Mischung 2 Minuten ultraschallbehandelt, was eine Emulsion kleiner Tropfen der diffundierbaren Komponente ergab. Die Emulsion wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
al) Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluor-4-methylpent-2-en (Sp. 49°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
am) 1H,1H,2H-Heptafluorpent-1-enemulsion
Das Verfahren von Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch 1H,1H,2H-Heptafluorpent-1-en (Sp. 30–31°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
an) Perfluorcyclopentenemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluorcyclopenten (Sp. 27°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ao) Perfluordimethylcyclobutanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluordimethylcyclobutan (Mischung aus 1,2- und 1,3-Isomeren, Sp. 45°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ap) Emulsion aus einer azeotropen Perfluorhexan:n-Pentan-Mischung
4,71 g (0,014 mol) Perfluor-n-hexan (Siedepunkt 59°C)(Fluorochem Ltd.) und 0,89 g (0,012 mol) n-Pentan (Siedepunkt 36°C)(Fluka AG) wurden in einem Glasfläschchen unter Erhalt einer azeotropen Mischung, die ohne weiteres bei 35°C siedete, gemischt. In einem anderen Glasfläschchen wurde hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in gereinigtem Wasser (20 ml) 5 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion auf Raumtemperatur abgekühlt. 1 ml der Phospholipiddispersion wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl der azeotropen Mischung gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde dann für 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, das eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, bei Nichtgebrauch bei Raumtemperatur gelagert wurde.
aq) Perfluordimethylcyclobutanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluordimethylcyclobutan (> 97% 1,1-Isomer, Rest sind 1,2- und 1,3-Isomere) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ar) Perfluorhexanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluorhexan (Sp. 57°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
as) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert mit fluoriertem oberflächenaktivem Mittel
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin entweder durch perfluoriertes Distearoylphosphatidylcholin (5 mg/ml) oder eine Mischung aus perfluoriertem Distearoylphosphatidylcholin und hydriertem Phosphatidylserin (3:1, Gesamtlipidkonzentration 5 mg/ml) ersetzt wurde. Die so erhaltenen Emulsionen der diffundierbaren Komponente wurden bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
at) 2,2,3,3,3-Pentafluorpropylmethyletheremulsion
Das Verfahren von Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch 2,2,3,3,3-Pentafluorpropylmethylether (Sp. 46°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
au) 2H,3H-Decafluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch 2H,3H-Decafluorpentan (Sp. 54°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
av) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert durch Lysophosphatidylcholin Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch Lysophosphatidylcholin ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
aw) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert durch hydriertes Phosphatidylserin:Lysophosphatidylcholin (1:1)
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus hydriertem Phosphatidylserin und Lysophosphatidylcholin (1:1) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ax) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert durch ein Polyethylenglycol 10.000-basierendes oberflächenaktives Mittel
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass die hydrierte Phosphatidylserindispersion durch eine Lösung von α-(16-Hexadecanoyloxyhexadecanoyl)-ω-methoxypolyethylenglycol 10.000 in Wasser (10 mg/ml) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
ay) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert durch ein Polyethylenglycol 10.000-basierendes oberflächenaktives Mittel
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass die hydrierte Phosphatidylserindispersion durch eine Lösung von α-(16-Hexadecanoyloxyhexadecanoyl)-ω-methoxypolyethylenglycol 10.000 in Wasser (20 mg/ml) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
az) Perfluorbutan-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt von Phosphatidylserin und RGDC-Mal-Polyethylenglycol 2000-distearoylphosphatidylethanolamin
Zu einer Mischung aus Phosphatidylserin (4,5 mg) und Mal-Polyethylenglycol 2000-distearoylphosphatidylethanolamin (0,5 mg) in einem Glasfläschchen wurde eine Lösung von 1,4% Propylenglycol/2,4% Glycerol in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Perfluorbutangas gespült. Das Glasfläschchen wurde für 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt und dann auf einem Rollentisch platziert. Nach der Zentrifugation wurde die unten schwimmende Flüssigkeit durch eine Lösung von RGDC in Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 ausgetauscht, wonach das Glasfläschchen für mehrere Stunden auf dem Rollentisch platziert wurde.
ba) Perfluorbutan-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt von Phosphatidylserin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 2000
Zu einem Glasfläschchen, enthaltend Phosphatidylserin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 2000 (Verhältnis 10:1) wurde eine Lösung von 2% Propylenglycol in Wasser gegeben, was eine Lipidkonzentration von 5 mg/ml ergab. Die Dispersion wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, wonach der Dampfraum mit Perfluorbutangas gespült wurde. Das Glasfläschchen wurde 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt und dann auf einem Rollentisch platziert. Nach dem Waschen durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit wurde ein gleiches Volumen Wasser, enthaltend 10% Saccharose, zugegeben. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann durch Zugabe von Wasser erneut dispergiert, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion ergab.
bb) Perfluorbutan-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000
Zu einem Glasfläschchen, enthaltend Phosphatidylserin und Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000 (Verhältnis 10:1) wurde eine Lösung von 2% Propylenglycol in Wasser gegeben, was eine Lipidkonzentration von 5 mg/ml ergab. Die Dispersion wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, wonach der Dampfraum mit Perfluorbutangas gespült wurde. Das Glasfläschchen wurde 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt und dann auf einem Rollentisch platziert. Nach dem Waschen durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit wurde ein gleiches Volumen Wasser, enthaltend 10% Polyethylenglycol, zugegeben. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann durch Zugabe von Wasser erneut dispergiert, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion ergab.
bc) Perfluorbutan-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 2000
Zu einem Glasfläschchen, enthaltend Phosphatidylserin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 2000 (Verhältnis 10:1) wurde eine Lösung von 2% Propylenglycol in Wasser gegeben, was eine Lipidkonzentration von 5 mg/ml ergab. Die Dispersion wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, wonach der Dampfraum mit Perfluorbutangas gespült wurde. Das Glasfläschchen wurde 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt und dann auf einem Rollentisch platziert. Nach dem Waschen durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit wurde ein gleiches Volumen Wasser zugegeben, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion ergab.
bd) Perfluorbutan-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000
Zu einem Glasfläschchen, enthaltend Phosphatidylserin und Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000 (Verhältnis 10:1) wurde eine Lösung von 2% Propylenglycol in Wasser gegeben, was eine Lipidkonzentration von 5 mg/ml ergab. Die Dispersion wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt, wonach der Dampfraum mit Perfluorbutangas gespült wurde. Das Glasfläschchen wurde 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt und dann auf einem Rollentisch platziert. Nach dem Waschen durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit wurde ein gleiches Volumen Wasser zugegeben, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion ergab.
be) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert mit Phosphatidylserin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 2000
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus hydriertem Phosphatidylserin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 2000 (Verhältnis 10:1) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
bf) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert mit Phosphatidylserin und Distearoylphosphatidyl-ethanolamin-Polyethylenglycol 5000
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine Mischung aus hydriertem Phosphatidylserin und Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000 (Verhältnis 10:1) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
bg) Lyophilisierte Perfluorbutan-gefüllte Mikrobläschen, erneut dispergiert in einer Emulsion
Eine Probe der milchig weißen Dispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bp) beschrieben, wurde dreimal durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit gewaschen, wonach ein gleiches Volumen einer 10%igen Saccharoselösung zugegeben wurde. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann in einer Emulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, kurz vor der Verwendung erneut dispergiert.
bh) Tröpfchen einer avidinylierten Perfluordimethylcyclobutanemulsion
Distearoylphosphatidylserin (4,5 mg) und Biotin-dipalmitoylphosphatidylethanolamin (0,5 mg) wurden in ein sauberes Glasfläschchen abgewogen und 1,0 ml einer Lösung von 2%igem Propylenglycol wurde zugegeben. Nach dem Erhitzen auf 80°C wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. 100 μl Perfluordimethylcyclobutan wurden zugegeben und das Glasfläschchen für 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab. Eine verdünnte Probe der Emulsion (100 ⎕l Emulsion in 1 ml Wasser) wurde mit einem Überschuss Avidin inkubiert und auf einem Rollentisch platziert. Die verdünnte Emulsion wurde dann gründlich mit Wasser gewaschen und durch Zentrifugation konzentriert.
bi) 1H-Tridecafluorhexanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch 1H-Tridecafluorhexan (Sp. 71°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
bj) Perfluorheptanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 1(1) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorpentan durch Perfluorheptan (Sp. 80–85°C) ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert.
bk) Perfluordimethylcyclobutanemulsion mit Phosphatidylserin und fluoreszierendem Streptavidin
Distearoylphosphatidylserin (4,5 mg) und Biotin-dipalmitoylphosphatidylethanolamin (0,5 mg) wurden in ein sauberes Glasfläschchen abgewogen und 1,0 ml einer Lösung von 2%igem Propylenglycol wurde zugegeben. Nach dem Erhitzen auf 80°C wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. 100 μl Perfluordimethylcyclobutan wurden zugegeben und das Glasfläschchen für 75 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^®-Mixers geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Kompo nente ergab. Eine verdünnte Probe der Emulsion (100 μl Emulsion in 1 ml Wasser) wurde mit einem Überschuss fluoreszierendem Streptavidin in Phosphatpuffer inkubiert und auf einem Rollentisch platziert. Die verdünnte Emulsion wurde dann gründlich mit Wasser gewaschen und durch Zentrifugation konzentriert.
bl) Dispersion einer Gasdispersion von lyophilisiertem Perfluorbutan
Eine Probe der milchig weißen Dispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(a) beschrieben, wurde dreimal durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit gewaschen, wonach ein gleiches Volumen einer 10%igen Saccharoselösung zugegeben wurden. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann kurz vor der Verwendung erneut in destilliertem Wasser dispergiert.
bm) Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert durch sterilisiertes Phosphatidylserin
Das Verfahren aus Beispiel 1(aq) wurde wiederholt, außer dass das hydrierte Phosphatidylserin durch eine sterilisierte Lösung von hydriertem Phosphatidylserin ersetzt wurde. Die so erhaltene Emulsion der diffundierbaren Komponente wurde bei Nichtgebrauch bei 0 C gelagert.
bn) Perfluorpropangasdispersion
Das Verfahren aus Beispiel 1(a) wurde wiederholt, außer dass das Perfluorbutangas durch Perfluorpropangas ersetzt wurde.
bo) Dispergiertes Echovist
Echovist-Granulat (Schering AG)(0,25 g) wurde in einer Emulsion (1,15 ml), hergestellt wie in Beispiel 1 (aq) beschrieben, dispergiert.
bp) Perfluorbutangasdispersion
Hydriertes Phosphatidylserin (500 mg) wurde zu einer Lösung von 1,5% Propylenglycol/5,11% Glycerol in Wasser (100 ml) gegeben und 5 Minuten auf 80°C er hitzt, wonach die resultierende Dispersion auf Umgebungstemperatur abkühlen konnte. Portionen von 1 ml wurden in 2-ml-Glasfläschchen überführt, der Dampfraum über jeder Portion wurde mit Perfluorbutangas gespült und die Glasfläschchen wurden 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, wonach die Glasfläschchen auf einem Rollentisch platziert wurden.
bq) Herstellung biotinylierter Perfluorbutan-Mikrobläschen
Distearoylphosphatidylserin (4,5 mg) und Biotin-dipalmitoylphosphatidylethanolamin (0,5 mg) wurden in ein sauberes Glasfläschchen abgewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglycol/2,4% Glycerol wurde zugegeben. Nach dem Erhitzen auf 78°C wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und der Dampfraum mit Perfluorbutangas gespült. Das Glasfläschchen wurde für 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^®-Mixers geschüttelt und dann 16 Stunden auf einem Rollentisch platziert. Die resultierenden Mikrobläschen wurden gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen.
br) Aerogele
Zu einer „Spatelspitze" pyrolysierter Resorcinol-Formaldehyd-Aerogelteilchen (bereitgestellt von Dr. Pekala, Lawrence Livermore National Laborstory) wurden 300 μl Wasser, ein Tropfen eines pH 9-Puffers und 5–10 Tropfen von 1%igem Pluronic F68 gegeben. Die Aerogelteilchen sedimentierten schnell, aggregierten aber nicht.
bs) Kleine Bläschen
Ein Gummischlauch, 8 mm Innendurchmesser und ungefähr 20 cm lang, wurde vertikal in einem Stativ platziert, am unteren Ende verschlossen und mit einer Mikrobläschendispersion, hergestellt gemäß Beispiel 1(a)(außer dass ein Ystral^®-Rotor-Stator-Homogenisator zur Herstellung der Mikrobläschendispersion verwendet wurde) gefüllt. Nach zwei Stunden wurde eine mit einer Kanüle verbundene Spritze nahe dem Boden in den Gummischlauch eingeführt und eine 1-ml-Fraktion der größenfraktionierten Mikrobläschendispersion wurde gesammelt. Die Coulter-Counter- Analyse ergab, dass die so erhaltene Mikrobläschendispersion einen mittleren Durchmesser von 1,2 μm hatte.
bt) Perfluorbutangasdispersion, stabilisiert durch 5% Albumin: 5% Dextrose (1:3)
20% Humanserum wurden mit gereinigtem Wasser auf 5% verdünnt. Eine 5-ml-Probe des verdünnten Albumins wurde mit 5% Glucose (15 ml) weiter verdünnt, und die resultierende Mischung wurde in ein Glasfläschchen überführt. Der Dampfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült, und das Glasfläschchen wurde 80 Sekunden ultraschallbehandelt, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion ergab.
bu) Dispersion von Buckminsterfulleren C₆₀
Buckminsterfulleren C₆₀ wurde zu 2,5% humanem Serumalbumin (1 ml) in einem 2-ml-Glasfläschchen gegeben, das 75 Sekunden unter Verwendung einem CapMix^® geschüttelt wurde.
bv) Schwefelhexafluoridgasdispersion
Stabilisierte Mikrobläschen aus Distearoylphosphatidylcholin:Dipalmitoylphosphatidyl-glycerol (10:1) wurden, wie in Beispiel 5 von WO-A-9409829 beschrieben, hergestellt. So wurden 50 mg Distearoylphosphatidylcholin, 5 mg Dipalmitoylphosphatidylglycerol und 2,2 g Polyethylenglycol 4000 bei 60°C in 22 ml t-Butanol gelöst, und die Lösung wurde schnell auf –77°C abgekühlt und über Nacht lyophilisiert. 100 mg des resultierenden Pulvers wurden in einem Glasfläschchen platziert und der Kopfraum evakuiert und dann mit Schwefelhexafluorid gefüllt. Kurz vor der Verwendung wurde 1 ml gereinigtes Wasser zugegeben, was eine Mikrobläschendispersion ergab.
bw) 2-Methylbutanemulsion
Hydriertes Phosphatidylserin (100 mg) in gereinigtem Wasser (20 ml) wurde 5 Minuten auf 80°C erhitzt und die resultierende Dispersion über Nacht in einem Kühlschrank abgekühlt. 1 ml der Dispersion wurde in ein 2-ml-Glasfläschchen überführt, in das 100 μl 2-Methylbutan gegeben wurden. Das Glasfläschchen wurde 75 Sekun den unter Verwendung eines CapMix^® geschüttelt, was eine Emulsion der diffundierbaren Komponente ergab, die bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert wurde.
bx) Lyophilisierte Perfluorbutangasdispersion in wässerigem Natriumbicarbonat
Eine Probe der milchig weißen Dispersion aus Beispiel 1(a) wurde dreimal durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit gewaschen, wonach ein gleiches Volumen einer 10%igen Saccharoselösung zugegeben wurde. Die resultierende Dispersion wurde lyophilisiert und dann in 0,1 M Natriumbicarbonatlösung erneut dispergiert.
by) Perfluorbutangasdispersion
Eine Perfluorbutangasdispersion wurde wie in Beispiel 1(a) hergestellt. Die Dispersion wurde durch Zentrifugation und Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit dreimal mit gereinigtem Wasser gewaschen, was eine milchig weiße Mikrobläschendispersion ergab.
bz) Perfluorbutangasdispersion mit Eisenoxidteilchen
Zu 1 ml einer Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(by), wurde 1 ml gereinigtes Wasser gegeben. Der pH wurde mit Ammoniumhydroxid auf 11,2 angehoben und die Dispersion 5 Minuten bei 60°C erhitzt. Unbeschichtete Eisenoxidteilchen (0,3 ml, 4,8 mg Fe/ml) wurden zugegeben und die Dispersion wurde 5 Minuten stehengelassen. Der pH wurde mit Salzsäure auf 5,9 gesenkt, was eine braune Dispersion ergab, die nach einer Weile eine Oberschicht mit braunen Teilchen, eine klare nicht-gefärbte unten schwimmende Flüssigkeit aber keinen Niederschlag entwickelte.
ca) Perfluorbutangasdispersion mit Eisenoxidteilchen
Zu 1 ml einer Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(by), wurden 0,3 ml unbeschichteter Eisenoxidteilchen (4,8 mg Fe/ml) bei pH 7 gegeben, was eine braune Dispersion ergab, die beim Stehenlassen eine Oberschicht mit braunen Mik robläschen, eine klare unten schwimmende Flüssigkeit aber keinen Niederschlag entwickelte.
cb) [Vergieich]
Zu 1 ml einer Lösung von hydriertem Phosphatidylserin in gereinigtem Wasser (5 mg/ml) wurden 0,3 ml unbeschichteter Eisenoxidteilchen (4,8 mg Fe/ml) gegeben, was eine braune Dispersion ergab, die beim Stehenlassen einen braunen Niederschlag entwickelte.
cc) Perfluorbutangasdispersion mit Eisenoxidteilchen, beschichtet mit Ölsäure
1,3 mmol FeCl₂·4H₂O (0,259 g) und 2,6 mmol FeCl₃·6H₂O (0,703 g) wurden in 10 ml gereinigtem Wasser gelöst, und 1,5 ml Ammoniumhydroxid wurden zugegeben. Die resultierenden Eisenoxidteilchen wurden fünfmal mit gereinigtem Wasser (25 ml) gewaschen. Verdünntes Ammoniumhydroxid wurde zu den Teilchen gegeben und die Suspension auf 80°C erhitzt. Ölsäure (0,15 g) wurde zugegeben, und die Dispersion wurde 5 Minuten bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Gereinigtes Wasser (10 ml) wurde zugegeben, und der pH wurde mit Salzsäure auf 5,4 gesenkt. Die Dispersion wurde 15 Minuten ultraschallbehandelt, wonach die unten schwimmende Flüssigkeit entfernt und die Teilchen in 2-Methylbutan (5 ml) suspendiert wurden, was eine feine schwarze Dispersion ergab.
25 mg Distearoylphosphatidylcholin und 2,5 mg Dimyristoylphosphatidylglycerol wurden bei 60°C in 11 ml t-Butanol gelöst und 0,1 ml der Eisenoxidteilchen von oben wurden zusammen mit 1,1 g Polyethylenglycol 4000 zugegeben. Die Dispersion wurde 10 Minuten bei 60°C erhitzt, schnell auf –77°C abgekühlt und lyophilisiert. 100 mg des Lyophilisats wurden in ein 2-ml-Glasfläschchen eingeführt, das dann evakuiert und zweimal mit Perfluorbutangas gespült wurde. Das Lyophilisat wurde dann in 1 ml gereinigtem Wasser dispergiert und zweimal durch Zentrifugation unter Entfernung der unten schwimmenden Flüssigkeit und des Niederschlages mit gereinigtem Wasser gewaschen. Nach dem Stehenlassen hatte die resultierende Dispersion eine hellgraue und flotierende Oberschicht.
Beispiel 2 – In-vitro-Charakterisierung des Mikrobläschenwachstums durch Mikroskopie/visuelle Beobachtung

a) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) bei ca. 4°C wurde mit einem Tropfen luftübersättigten gereinigten Wassers bei ca. 4°C auf einem Mikroskopobjektträger, abgekühlt auf ca. 4°C, verdünnt und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war zu beobachten, dass die Mikrobläschen unterschiedliche Größen von 2 bis 5 μm hatten. Die Temperatur wurde dann auf ca. 40°C angehoben, woraufhin eine signifikante Steigerung der Größe der Mikrobläschen zu beobachten war, wobei die größeren Mikrobläschen am größten wurden. Die Anzahl der Mikrobläschen war nach etwa 5 Minuten signifikant reduziert.
b) [Vergleich] Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c), gekühlt in einem Eisbad auf ca. 0°C, wurde auf einem Mikroskopobjektträger, gekühlt auf ca. 0°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war zu beobachten, dass die Ölphasentröpfchen der Emulsion unterschiedliche Größen von 2 bis 6 μm hatten. Die Temperatur wurde dann auf ca. 40°C angehoben. Es war keine Bildung von Mikrobläschen zu beobachten.
c) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a)(0,5 ml) wurde mit gereinigtem Wasser (50 ml) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Teil dieser verdünnten Dispersion (1 ml) wurde mit einem Teil der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c)(100 μl) gemischt. Ein Tropfen der resultierenden Mischung wurde auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mittels eines Heiz-/Kühltisches, platziert und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Deckglases wurde unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches stufenweise auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten und wurde durch Größen- und Verteilungsmessungen unter Verwendung eines Malvern-Mastersizers bestätigt.
d) [Vergleich] Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a)(0,5 ml) wurde mit gereinigtem Wasser (50 ml) verdünnt und in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Ein Teil dieser verdünnten Dispersion (1 ml) wurde mit 100 μl einer 5 mg/ml- Dispersion des hydrierten Phosphatidylserins in gereinigtem Wasser, ebenso bei 0°C, gemischt. Ein Tropfen der resultierenden Mischung wurde auf einem Mikroskopobjektträger, gekühlt auf 0°C, platziert und mit einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war zu beobachten, dass die Mikrobläschen unterschiedliche Größen von 2 bis 5 μm hatten. Die Temperatur wurde dann auf ca. 40°C angehoben, woraufhin eine signifikante Steigerung der Größe der Mikrobläschen zu beobachten war, obgleich die Steigerung weniger stark und nicht so schnell war, wie die in Beispiel 2(c) beobachtete.
e) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyldifluormethyletheremulsion aus Beispiel 1(e) wurde der verdünnten Mikrobläschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/Kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde stufenweise unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
f) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der 2-Brom-2-chlor-1,1,1-trifluorethanemulsion aus Beispiel 1(f) wurde der verdünnten Mikrobläschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/Kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde stufenweise unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
g) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyldifluormethyletheremulsion aus Beispiel 1(g) wurde der verdünnten Mikrobläschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/Kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde stufenweise unter Verwendung des Heiz- /Kühltisches auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
h) Ein Tropfen der Dispersion aus Polymer-/humanes Serumalbumin-Mikroteilchen aus Beispiel 1(h) und ein Tropfen der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(k) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 50°C, platziert und mit einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tröpfchen war ein signifikantes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
i) Ein Tropfen der Dispersion aus Polymer-/humanes Serumalbumin-Mikroteilchen aus Beispiel 1(h) und ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(j) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und mit einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tröpfchen war ein signifikantes, schnelles und starkes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
j) Ein Tropfen der Dispersion aus Polymer-/Gelatine-Mikroteilchen aus Beispiel 1(i) und ein Tropfen der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(k) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 50°C, platziert und mit einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tröpfchen war ein signifikantes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
k) Ein Tropfen der Dispersion aus Polymer-/Gelatine-Mikroteilchen aus Beispiel 1(i) und ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(j) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und mit einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tröpfchen war ein signifikantes, schnelles und starkes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
l) [Vergleich] Ein Tropfen der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(k) wurde auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 50 °C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war keine Mikrobläschenbildung zu beobachten.
m) [Vergleich] Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(j) wurde auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war keine Mikrobläschenbildung zu beobachten.
n) [Vergleich] Ein Tropfen der Dispersion aus Polymer-/humanes Serumalbumin-Mikroteilchen aus Beispiel 1(h) wurde auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war keine signifikante Veränderung zu beobachten.
o) [Vergleich] Ein Tropfen der Dispersion aus Polymer-/Gelatine-Mikroteilchen aus Beispiel 1(i) wurde auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 50°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Es war keine signifikante Veränderung zu beobachten.
p) Ein Tropfen einer Dispersion aus mit humanem Serumalbumin stabilisierten Luftmikrobläschen, hergestellt wie in US-A-4718433 beschrieben, und ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(j) wurden auf einem Mikroskopobjektträger bei 20°C platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
g) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der Perfluordecalin/Perfluorbutanemulsion aus Beispiel 1(z) wurde der verdünnten Mikrobläschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches stufenweise auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
r) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der Perfluordecalin/Perfluorpropanemulsion aus Beispiel 1(aa) wurde der verdünnten Mikrobläschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches stufenweise auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
s) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der Perfluordecalin/Schwefelhexafluoridemulsion aus Beispiel 1(ab) wurde der verdünnten Mikrobläschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/Kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches stufenweise auf 40°C angehoben, woraufhin nach 4 bis 5 Minuten eine Erhöhung der Größe der Mikrobläschen zu beobachten war, obgleich die Erhöhung weniger stark und weniger schnell war, als die in den Beispielen 2(q) und 2(r) beobachtete.
t) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) wurde mit gereinigtem Wasser (1:1) verdünnt und auf 0°C abgekühlt. Ein Tropfen der Pluronic F68-stabilisierten Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(ad) wurde der verdünnten Mikrobiäschendispersion auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 0°C mit einem Heiz-/Kühltisch, zugegeben und mit einem Deckglas, ebenso bei 0°C, abgedeckt. Die Temperatur des Objektträgers wurde unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches stufenweise auf 40°C angehoben. Durch Mikroskopie war ein schnelles und wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
u) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) und ein Tropfen der Brij 58:Fluorad FC-170C-stabilisierten Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(aj) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Nach einer Weile war ein langsames Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
v) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) und ein Tropfen der Brij 58:Fluorad FC-170C-stabilisierten Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(ak) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Nach einer Weile war ein Mikrobläschenwachsturn zu beobachten.
w) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) und ein Tropfen der Perfluor-4-methyl-pent-2-enemulsion aus Beispiel 1(al) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Nach einer Weile war ein langsames Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
x) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) und ein Tropfen der 1H,1H,2H-Heptafluorpent-1-enemulsion aus Beispiel 1(am) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes und schnelles Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
y) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a) und ein Tropfen der Perfluorcyclopentenemulsion aus Beispiel 1(an) wurden auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 40°C, platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes und schnelles Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
z) 400 μl einer Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(b), wurden in ein 2-ml-Glasfläschchen bei Raumtemperatur überführt und zu 100 μl der azeotropen Emulsion von Beispiel 1(ap) gegeben. Ein Tröpfchen der Mikrobläschen/Emulsion-Mischung wurde auf einem Mikroskopobjektträger, gehalten bei 20°C mit einem Heiz-/Kühltisch, platziert. Die Temperatur des Objektträgers wurde unter Verwendung des Heiz-/Kühltisches schnell auf 37°C angehoben. Es war ein wesentliches, spontanes und schnelles Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
aa) Ein Tropfen biotinylierter Mikrobläschen, hergestellt wie in Beispiel 1(bq), wurde zu einem Tropfen der Emulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bh) beschrieben, auf einem Mikroskopobjektträger, erwärmt auf 60°C, zugegeben und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Bei den aggregierten Emulsionströpfchen war ein signifikantes Wachstum der Mikrobläschen und Akkumulation der Mikrobläschen zu sehen.
ab) Mikrobläschen, hergestellt wie in Beispiel 1(bq) beschrieben, können mittels Durchflusszytometrie, z. B. durch den Einsatz einer Emulsion von fluoreszierendem Streptavidin, hergestellt wie in Beispiel 1(bk) beschrieben, hinsichtlich der Detektion der Anhaftung von Streptavidin an die biotinylierten Mikrobläschen analysiert werden.
ac) Ein Tropfen der Echovist-Dispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bo) beschrieben, wurde für die Mikroskopieuntersuchung auf einem Objektträger platziert und unter Verwendung eines Heiz-/Kühltisches bei 37°C gehalten. Die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt und unter einem Mikroskop platziert. Es war ein signifikantes Bläschenwachstum zu beobachten.
ad) Ein Tropfen der Aerogeldispersion aus Beispiel 1(br) wurde zur Mikroskopieuntersuchung auf einem Objektträger platziert und unter Verwendung eines Heiz-/Kühltisches bei 37°C gehalten. Die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt und unter einem Mikroskop platziert. Ein Tropfen 2-Methylbutanemulsion (aus Beispiel 1(c) oben, außer dass 100 μl 2-Methylbutan anstelle von 200 μl verwendet wurden) wurde auf den Rand des Deckglases gegeben, so dass die Emulsion in die Aerogeldispersion eindrang. Nach dem Erhöhen der Temperatur auf ungefähr 60°C ergaben sich Mikrobläschen aus den Aerogelteilchen.
ae) [Vergleich] Ein Tropfen der Aerogeldispersion aus Beispiel 1(br) wurde zur Mikroskopieuntersuchung auf einem Objektträger platziert und unter Verwendung eines Heiz-/Kühltisches bei 20°C gehalten. Die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt und unter einem Mikroskop platziert und die Temperatur auf 60°C angehoben. Es war kein Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
af) Ein Tropfen der Mikrobläschendispersion aus Beispiel 1(bs) wurde zur Mikroskopieuntersuchung auf einem Objektträger platziert. Die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt und unter einem Mikroskop, ausgestattet mit einem Heiz-/Kühltisch, der die Probentemperatur bei 20°C hielt, platziert. Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c) oben wurde auf den Rand des Deckglases gegeben, so dass die Emulsion in die Mikrobläschendispersion eindrang. Während des Mischens war kein Mikrobläschenwachstum zu beobachten. Die Temperatur wurde dann auf 40°C angehoben, woraufhin ein wesentliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten war.
aq) [Vergleich] Ein Tropfen der Mikrobläschendispersion aus Beispiel 1(bs) wurde zur Mikroskopieuntersuchung auf einem Objektträger platziert. Die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt und unter einem Mikroskop, ausgestattet mit einem Heiz-/Kühltisch, der die Probentemperatur bei 20°C hielt, platziert. Als die Temperatur auf 40°C angehoben wurde, war kein Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
ah) Zu Echovist-Granulat (Schering AG) auf einem Mikroskopobjektträger wurde ein Tropfen Lösungsmittel für Echovist-Granulat bei Umgebungstemperatur gegeben. Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurde zugegeben und bei einer Vergrößerung von 100X untersucht. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
ai) Ein Tropfen Levovist^®, hergestellt zur Injektion, und ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurden auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, schnelles und starkes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
aj) Ein Tropfen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(br) und ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurden auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur platziert und bei einer Vergrößerung von 400X untersucht. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, schnelles und starkes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
ak) Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(by), wurde zu einem Tropfen der Buckminsterfulleren C₆₀-Dispersion aus Beispiel 1(bu) auf einem Mikroskopobjektträger bei 40°C gegeben. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, starkes und schnelles Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
al) Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurde zu einem Tropfen der Schwefelhexafluoridgasdispersion aus Beispiel 1(bv) auf einem Mikroskopobjektträger bei 40°C gegeben. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, schnelles und starkes Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
am) Ein Tropfen 0,5 M Salzsäure wurde zu einem Tropfen der Perfluorbutangasdispersion in wässerigem Natriumbicarbonat aus Beispiel 1(bx) auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur gegeben. Beim Vermischen der Tropfen war ein schnelles, starkes und kurzlebiges Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
an) Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurde zu einem Tropfen der Perfluorbutangasdispersion mit Eisenoxidteilchen aus Beispiel 1(bz) auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur gegeben. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, starkes und schnelles Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
ao) Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurde zu einem Tropfen der Perfluorbutangasdispersion mit Eisenoxidteilchen aus Beispiel 1(ca) auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur gegeben. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, starkes und schnelles Wachstum der Mikrobläschen zu beobachten.
ap) [Vergleich] Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurde zu einem Tropfen der Eisenoxidteilchendispersion aus Beispiel 1(cb) auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur gegeben. Es war keine Mikrobläschenbildung zu beobachten.
aq) Ein Tropfen der 2-Methylbutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bw), wurde zu einem Tropfen der Perfluorbutangasdispersion mit den Ölsäure-beschichteten Eisenoxidteilchen aus Beispiel 1(cc) auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstemperatur gegeben. Beim Vermischen der Tropfen war ein signifikantes, starkes und schnelles Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
ar) 1 ml der Mikrobläschendispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bp) beschrieben, wurde mit 50 ml Wasser verdünnt. Ein Tropfen der verdünnten Dispersion wurde zu einem Tropfen Sodawasser auf einem Mikroskopobjektträger bei Umgebungstempe ratur geben. Beim Vermischen der Tropfen war ein spontanes Mikrobläschenwachstum zu beobachten.
as) 0,4 μl einer biotinylierten Mikrobläschendispersion, hergestellt gemäß Beispiel 1(bq), und 0,02 ml der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bh) beschrieben, wurden nacheinander unter Rühren in ein Becherglas, enthaltend 200 ml Isoton bei 37°C, gegeben. Die Mischung wurde 20 Sekunden inkubiert. Ein Strahl gepulsten Ultraschalls (10 kHz Folgefrequenz, 100 μJ in jedem Puls) bei 2,5 MHz wurde durch die Lösung gerichtet, die in scharfem Seitenlicht gegen einen schwarzen Hintergrund betrachtet wurde. Im Strahlenweg war unmittelbar ein heller Streifen größerer Bläschen zu beobachten.
at) Ein Tropfen der Mikrobläschendispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl), wurde zur Mikroskopieüberprüfung auf einem Objektträger platziert. Die Probe wurde mit einem Deckglas abgedeckt und unter einem Mikroskop, ausgestattet mit einem Heiz-/Kühltisch, der die Temperatur bei 20°C hielt, platziert. Ein Tropfen der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(as), wurde auf den Rand des Deckglases gegeben, so dass er in die Mikrobläschendispersion eindringen konnte. Nach dem Erhöhen der Temperatur auf ungefähr 60°C war ein deutliches Mikrobläschenwachstum zu beobachten.

Beispiel 3 – In-vitro-Charakterisierung der Mikrobläschengröße und -verteilung
a) Messungen unter Verwendung eines Malvern-Mastersizers
Das Mikrobläschenwachstum und die Veränderung der Größenverteilung nach dem Mischen mit der diffundierbaren Komponente wurde unter Verwendung eines Malvern-Mastersizers 1002, ausgestattet mit einer 45-mm-Linse und mit einem Messbereich von 0,1–80 μm, analysiert. Die Probenzelle enthielt Isoton 11 (150 ml) und war mit einem temperaturgeregelten Bad, das über einen Temperaturbereich von 9–37°C betrieben werden kann, verbunden. Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a)(110 μl) wurde der Probenzelle zugegeben und nach der Äquilibrierung wurde ein Teil der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c)(500 μl) zugegeben. Die Isoton-II-Lösung wurde durch den Mastersizer und das temperaturgeregelte Bad ge pumpt, so dass sie die Messzelle alle 30 Sekunden passierte. Alle 30 Sekunden wurden für 3 Minuten wiederholte Messungen durchgeführt. Die Temperatur der Isoton-II-Lösung wurde stufenweise angehoben, und es wurden weitere Messungen durchgeführt. Auch die Perfluorbutangasdispersion und die 2-Methylbutanemulsion wurden separat unter Verwendung ähnlicher Bedingungen analysiert.
Die Analyse der Perfluorbutangasdispersion allein zeigte, dass bei 9°C 82% der Mikrobläschen eine Größe unter 9,9 μm hatten; dieser Anteil wurde auf 31% verringert, als die Temperatur auf 37°C angehoben wurde. Diese Temperaturveränderung war begleitet von einer entsprechenden Erhöhung des Anteils an Mikrobläschen in einem Größenbereich von 15–80 μm, von 8% auf 42%.
Nach dem Mischen der Perfluorbutangasdispersion und der 2-Methylbutanemulsion bei 9°C war eine leichte Erhöhung der Mikrobläschengröße zu beobachten. Die Erhöhung der Temperatur auf 25°C führte zu einem starken Mikrobläschenwachstum, wobei etwa 81% der Mikrobläschen Größen im Bereich von 15–80 μm hatten. Eine weitere Temperaturerhöhung führte zu einem Mikrobläschenwachstum auf Größen jenseits des Messbereichs des Instruments.
Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion und der 2-Methylbutanemulsion bei 37°C führte zu einem schnellen Mikrobläschenwachstum; nach einem 30-Sekunden-Meßzyklus hatten 97% der Mikrobläschen Größen im Bereich von 15–80 μm.
b) Messungen unter Verwendung eines Coulter-Multisizers
Das Mikrobläschenwachstum und die Veränderung der Größenverteilung nach dem Mischen mit der diffundierbaren Komponente wurden unter Verwendung eines Coulter-Multisizers II, ausgestattet mit einer 50 μm-Öffnung und mit einem Messbereich von 1–30 μm, analysiert. Die beiden Komponenten jeder Probe wurden der Probenzelle zugegeben, die 200 ml Isoton II, vorerwärmt auf 37°C, bei denen die Messungen durchgeführt wurden, enthielt. Die Größenverteilung der Mischung wurde unmittelbar und 1,5 Minuten nach der Einführung der Proben gemessen. Danach wurde die Probenzelle unter Verwendung eines 2,25 MHz-Transducers, der mit einem Im- Pulserzeuger verbunden war, für 1 Minute Ultraschall ausgesetzt; das Energieniveau betrug 100 μJ.

b)(i) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(I) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 3% auf ungefähr 16%.
b)(ii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorbutanemulsion aus Beispiel 1(m) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 1% auf ungefähr 6%.
b)(iii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(p) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von ungefähr 1% auf ungefähr 4%.
b)(iv) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(af) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von ungefähr 2% auf ungefähr 8%.
b)(v) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentan/Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion aus Beispiel 1(q) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 2% auf ungefähr 4%.
b)(vi) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentan/1H,1H,2H-Hepafluorpent-1-enemulsion aus Beispiel 1(r) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 2% auf ungefähr 4,5%,
b)(vii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(s) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 2% auf ungefähr 13%.
b)(viii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(t) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 2% auf ungefähr 13%.
b)(ix) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(u) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 3% auf ungefähr 15%.
b)(x) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(v) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 3% auf ungefähr 22%.
b)(xi) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(ai) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 3% auf ungefähr 8%.
b)(xii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentan:Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion aus Beispiel 1(x) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 2% auf ungefähr 7,5%.
b)(xiii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentan:Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion aus Beispiel 1(y) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbe handlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 2,5% auf ungefähr 7%.
b)(xiv) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(ac) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum. Die Erhöhung der Größe der Mikrobläschen war stärker und schneller als das in Beispiel 3(b)(xv) beobachtete. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 3,5% auf ungefähr 53%.
b)(xv) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(ae) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 7% auf ungefähr 19%. Eine Ultraschallbehandlung führte zu einem weiteren Mikrobläschenwachstum, was durch eine Erhöhung der Gesamtvolumenkonzentration auf ungefähr 54,5% angezeigt wurde.
b)(xvi) Das Mischen der Perfluorpropangasdispersion aus Beispiel 1(ah) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(l) führte zu einem schnellen Mikrobläschenwachstum, obgleich nicht so stark wie das in Beispiel 3(b)(i) beobachtete. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 3% auf ungefähr 4,5%.
b)(xvii) Das Mischen der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(ag) und der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(o) führte zu einem schnellen und wesentlichen Mikrobläschenwachstum nach der Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration erhöhte sich von 1% auf ungefähr 8%.
b)(xviii) Eine Probe der Perfluorhexanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(ar) beschrieben, hatte eine Gesamtkonzentration an Tröpfchen von 8,6 Vol.-% und die Tröpfchengröße betrug 2,6 μm.
b)(xix) Eine Probe der 2,2,3,3,3-Pentafluorpropylmethyletheremulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(at) beschrieben, hatte eine Gesamtkonzentration an Tröpfchen von 4,3 Vol.-% und die Tröpfchengröße betrug 1,5 μm.
b)(xx) Eine Probe der 2H,3H-Decafluorpentanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(au) beschrieben, hatte eine Gesamtkonzentration an Tröpfchen von 5,6 Vol.-% und die Tröpfchengröße betrug 1,9 μm.
b)(xxi) Eine Probe der Perfluorheptanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bj) beschrieben, hatte eine Gesamtkonzentration an Tröpfchen von 8,5 Vol.-% und die Tröpfchengröße von 2,2 μm.
(c) Messungen unter Verwendung eines Coulter-Multisizers (140 μm Öffnung) Das Mikrobläschenwachstum und die Veränderung der Größenverteilung nach dem Mischen mit Emulsionen der diffundierbaren Komponente wurden unter Verwendung eines Coulter-Multisizers II mit einer 140-μm-Öffnung analysiert. Der Messbereich wurde auf 10–80 μm eingestellt. Die Bläschendispersion und Emulsionströpfchen wurden der Probenzelle, enthaltend 200 ml vorerwärmtes Isoton II, zugegeben. Die Messungen wurden bei 37°C durchgeführt. Die Größenverteilung der Mischung wurde unmittelbar und 3 Minuten nach dem Mischen gemessen. Danach wurde die Probenlösung 1 Minute unter Verwendung eines 2,25 MHz-Transducers, verbunden mit einem Impulserzeuger, ultraschallbehandelt. Das Energieniveau betrug 100 μJ. Die Größenverteilung der Mischung wurde 1 Minute und 3 Minuten nach der Ultraschallbehandlung gemessen.
c)(i) Unmittelbar nach der Zugabe von 182 μl der Heptafluorpent-1-enemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(am) beschrieben, zu 400 μl einer Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, erhöhte sich unverzüglich die Größe der Mikrobläschen und die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 60 Vol.-% innerhalb 1 Minute.
c)(ii) Nach der Zugabe von 70 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(av) beschrieben, zu 330 μl der Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen nach Ultraschallbehandlung deutlich. Die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 14 Vol.-% innerhalb von 3 Minuten.
c)(iii) Nach der Zugabe von 71 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aw) beschrieben, zu 330 μl der Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bi) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen nach Ultraschallbehandlung deutlich. Die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 8,6 Vol.-% innerhalb von 3 Minuten.
c)(iv) Nach der Zugabe von 105 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(ax) beschrieben, zu 300 ul der Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen nach Ultraschallbehandlung deutlich. Die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von 3,2 Vol.-% auf etwa 4,8 Vol.-% innerhalb von 3 Minuten.
c)(v) Nach der Zugabe von 105 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(ay) beschrieben, zu 300 μl der Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen nach Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von 1,5 Vol.-% auf etwa 2,2 Vol.-% innerhalb von 3 Minuten.
c)(vi) Nach der erneuten Dispersion lyophilisierter Perfluorbutanmikrobläschen in der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, beschrieben in Beispiel 1(bg), kam es zu einer umgehenden Erhöhung der Größe der Mikrobläschen. Die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 60 Vol.-% innerhalb 1 Minute.
c)(vii) Unmittelbar nach der Zugabe von 76 μl der 1H-Tridecafluorhexanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bi) beschrieben, zu 400 μl der Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen, und die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 20 Vol.-% innerhalb von 3 Minuten.
c)(viii) Unmittelbar nach der Zugabe von 63 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bm) beschrieben, zu 741 μl der Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen, und die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 2 Vol.-% innerhalb von 3 Minuten.
c)(ix) Nach der Zugabe von 67 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, zu 56 μl der Perfluorpropangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bn) beschrieben, erhöhte sich die Größe der Mikrobläschen nach Ultraschallbehandlung. Die Gesamtvolumenkonzentration im Größenbereich von 10–80 μm erhöhte sich von unwesentlich auf etwa 2,7 Vol.-% innerhalb 1 Minute.

Beispiel 4 – In-vitro-Messungen der Schalldämpfung

a) Eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a)(1 μl) wurde in Isoton II (55 ml) bei 37°C suspendiert, und die Schalldämpfung wurde als eine Funktion der Zeit unter Verwendung zweier Breitband-Transducer mit Mittenfrequenzen von 3,5 MHz und 5,0 MHz in einer Impulsechotechnik gemessen. Nach 20 Sekunden wurde eine diffundierbare Komponente zu der Suspension gegeben, und die Messungen wurden für weitere 120 Sekunden fortgeführt.
a)(i) Unmittelbar nach der Zugabe von 100 μl der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c) erhöhte sich die Dämpfung um einen Faktor von mehr als 4; eine genaue Quantifizierung war nicht möglich, da die Dämpfung den maximalen Wert, der mit diesem System messbar ist, überstieg. Die Wirkung dauerte 50 Sekunden an und war von einer kompletten Änderung der Form der Dämpfungsspektren begleitet, was durch eine deutliche Erhöhung der Größe der Mikrobläschen angezeigt wurde.
a)(ii) Die Zugabe von 20 μl der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c) führte zu einer stufenweisen Erhöhung der Dämpfung, die nach 40 Sekunden ein Maximum zwischen dem drei- und vierfachen des Ausgangswertes erreichte und dann schnell abfiel. Wiederum zeigte eine komplette Veränderung der Form der Dämpfungsspektren eine deutliche Erhöhung der Größe der Mikrobläschen an.
a)(iii) Die Zugabe von 5 μl der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c) führte zu einer stufenweisen Erhöhung der Dämpfung, die nach 30 Sekunden ein Maximum von etwa 50% über dem Ausgangswert erreiche und dann langsam in Richtung des Ausgangswertes abfiel. Eine Verschiebung in Richtung niedrigerer Resonanzfrequenzen in den Dämpfungsspektren zeigte eine mäßige Erhöhung der Größe der Mikrobläschen an.
a)(iv) Die Zugabe von 500 μl der 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyldifluormethyletheremulsion aus Beispiel 1(e) führte zu einer stufenweisen Erhöhung der Dämpfung, die nach 20 Sekunden ein Maximum von etwa 50% über dem Ausgangswert erreiche und dann langsam in Richtung des Ausgangswertes abfiel. Eine Verschiebung in Richtung niedrigerer Resonanzfrequenzen in den Dämpfungsspektren zeigte eine mäßige Erhöhung der Größe der Mikrobläschen an.
a)(v) Die Zugabe von 500 μl der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(d) führte zu einer kleinen Erhöhung der Dämpfung. Eine Verschiebung in Richtung niedrigerer Resonanzfrequenzen in den Dämpfungsspektren zeigte eine kleine Erhöhung der Größe der Mikrobläschen an. Anhand einer Kontrolle wurde festgestellt, dass die Zugabe von 500 μl Wasser keine erkennbare Veränderung der Dämpfung erzeugte.
b) Eine Probe der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c)(100 μl) wurde dem Isoton 11 (55 ml) bei 37°C zugegeben und die Schalldämpfung wie oben in (a) beschrieben gemessen. Nach 20 Sekunden wurde eine Probe der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(a)(1 μl) zu der Suspension gegeben und die Messungen für weitere 120 Sekunden fortgeführt. Nach der Zugabe der Gasdispersion erhöhte sich die Dämpfung schnell, erreichte nach 20 Sekunden den maximalen Messpegel des Systems und fing nach 50 Sekunden an zu fallen. Die Dämpfungsspektren zeigten die Gegenwart riesiger Mikrobläschen an.

Anhand einer Kontrolle wurde festgestellt, dass, wenn 100 μl Wasser anstelle der 2-Methylbutanemulsion verwendet wurden, sich die Dämpfung nach der Zugabe der Gasdispersion schnell erhöhte, nach 40 Sekunden erreichte sie einen stabilen Pegel bei einem Viertel von dem, der unter Verwendung der 2-Methylbutanemulsion gemessen wurde. Die Dämpfung wurde für die restlichen 120 Sekunden des Messzeit raumes bei diesem Pegel gehalten. Die Dämpfungsspektren zeigten die Gegenwart kleiner Mikrobläschen an.
Beispiel 5 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion [Vergleich]
Eine Injektionsspritze, enthaltend eine Menge der Perfluorbutangasdispersion aus Beispiel 1(b), die 2 μl des Gasgehalts entspricht, wurde hergestellt, und die Inhalte wurden unter Verwendung eines Katheters, der in eine Vene der oberen Extremitäten eingeführt wurde, in einen Hund von 20 kg mit offenem Brustkorb injiziert. Die Bildgebung des Herzens wurde mit einem Vingmed CFM-750-Scanner unter Verwendung einer medianen Short-Axis-Projektion durchgeführt. Der Scanner war so eingestellt, dass er Bilder des Tiers einmal am Ende jeder Systole durch Signalgating für das ECG aufnahm. Im rechten Ventrikel war ein paar Sekunden nach der Injektion ein heller Kontrast zu sehen, und ein Kontrast mit ähnlicher Helligkeit erschien im linken Ventrikel etwa 4 – 5 Sekunden später, jedoch mit einer deutlichen Dämpfung, die vorrübergehend die hinteren Teile des Herzens überdeckte. Basierend auf den vom Scanner aufgezeichneten Cine-Loop-Daten wurde eine digitale Offline-Rückstreuintensitätsanalyse durchgeführt. Ein kurzer vorübergehender Peak der Kontrastverstärkung, der etwa 10 Sekunden anhielt, der 3 Sekunden nach dem Einsetzen der Kontrastverstärkung im linken Ventrikel anfing, war in einer repräsentativen Region des vorderen linken Ventrikelmyokards ersichtlich.
Beispiel 6 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer 2-Methylbutanemulsion [Vergleich]
Eine Injektionsspritze, enthaltend 1,0 ml der 2-Methylbutanemulsion aus Beispiel 1(c) wurde hergestellt und die Inhalte wurden wie in Beispiel 5 in das Tier injiziert. Die Bildgebung des Herzens wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Es waren keine Kontrastwirkungen zu erkennen.
Beispiel 7 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer 2-Methylbutanemulsion
Injektionsspritzen wurden hergestellt wie in den Beispielen 5 und 6, und die Inhalte beider Spritzen wurden gleichzeitig über einen Y-Konnektor und den in Beispiel 5 beschriebenen Katheter in den Hund injiziert. Die Bildgebung des Herzens wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Die Echoverstärkung der Ventrikel war ähnlich den Beobachtungen in Beispiel 5. Im linken Ventrikelmyokard gab es einen monotonen Anstieg der Echointensität in den 30 Sekunden nach der Ankunft des Kontrastbolus im Koronarkreislauf. Die Kontrastwirkungen im Myokard waren 5 Minuten später komplett verschwunden.
Beispiel 8 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorpentanemulsion [Vergleich]
Eine Injektionsspritze, enthaltend 0,5 ml der Perfluorpentanemulsion aus Beispiel 1(d), wurde hergestellt, und die Inhalte wurden wie in Beispiel 5 in das Tier injiziert. Die Bildgebung des Herzens wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt. In keinem Bereich des Bildes konnten Anzeichen für eine Echoverstärkung beobachtet werden.
Beispiel 9 – Intensitätsarme In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorpentanemulsion
Injektionsspritzen wurden hergestellt wie in den Beispielen 5 und 8, und die Inhalte der beiden Spritzen wurden gleichzeitig über einen Y-Konnektor und einen Katheter, eingeführt in eine Vene der oberen Extremitäten, in einen Mischlingshund von 20 kg mit offenem Brustkorb injiziert. Die Bildgebung des Herzens wurde mit einem Vingmed CFM-750-Scanner unter Verwendung einer medianen Short-Axis-Projektion durchgeführt. Der Scanner wurde so eingestellt, dass er die Schallmenge durch Verringerung der emittierten Energie auf einen Wert von 1 minimierte (auf einer Skala im Bereich von 0 bis 7) und Bilder nur einmal am Ende jeder Systole durch Signalgating für das ECG des Tiers aufnahm. Die beobachtete Kontrastverstärkung war wie in Beispiel 5 beschrieben, jedoch mit einer etwas längeren Dauer im Myokard.
Beispiel 10 – Intensitätsstarke In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorpentanemulsion
Das Experiment aus Beispiel 9 wurde wiederholt, außer dass die Scannerleistung so eingestellt wurde, dass die Ultraschallexposition der abgebildeten Geweberegion maximiert wurde. Dies erreichte man unter Verwendung einer Kombination aus kontinuierlicher Bildgebung mit hoher Bildfolge und der höchsten Abgabeleistung (7 auf einer Skala im Bereich von 0 bis 7). Nach der Injektion war eine intensive und helle Kontrastverstärkung in beiden Ventrikeln des Herzens erkennbar. In allen Regionen des Myokards war ein stetiger Anstieg der Kontrastverstärkung bis zu einer Verstärkungsintensität nahe dem Maximum des Weißpegels des Bildschirms zu erkennen. Die Dauer des Gewebekontrasts betrug ungefähr 30 Minuten, während Kontrastwirkungen im Blutpool innerhalb von 5 Minuten der Injektion in die Nähe der Grundlinie abfielen, was ein Bild fast ohne Blutpooldämpfung und eine komplette und extrem helle Umfangs-Kontrastverstärkung des Myokards hinterließ. Die Kontrastwirkung im Myokard nahe dem Transducer schien trotz kontinuierlicher intensitätsstarker Ultraschallexposition nicht zu verblassen.
Beispiel 11 – Intensitätsstarke In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 10 wurde wiederholt, außer dass die eingesetzte Perfluorpentanemulsion durch Abkühlen einer Lösung von Polyethylenglycol 10000-methylether-16-hexadecanoyloxyhexadecanoat (200 mg, hergestellt wie in Beispiel 2(k) von WO-A-9607434 ) in gereinigtem Wasser (20 ml), Überführen einer Portion von 1 ml dieser Lösung in ein 2-ml-Glasfläschchen, Zugeben von Perfluorpentan (200 μl), Schütteln des Glasfläschchens für 45 Sekunden unter Verwendung eines CapMix^® hergestellt wurde, und die Emulsion wurde bei Nichtgebrauch bei 0°C gelagert. Die beobachteten Kontrastverstärkungen von Blut und Myokardgewebe waren wie in Beispiel 5 beschrieben.
Beispiel 12 – in-vivo-Bildgebung einer Hundeniere
Es wurden dieselben Substanzen und Injektionsverfahren, die in Beispiel 9 beschrieben wurden, verwendet. Die linke Niere des Hundes wurde unter Verwendung derselben Hochleistungsinstrumenteneinstellungen wie in Beispiel 10 durch die intakte Abdominalwand abgebildet. Die Zentralstrukturen der Niere, die die Versorgungsarterien enthalten, waren in dem Bild enthalten. 20 Sekunden nach der Injektion war der Beginn eines stetigen Anstiegs der Nieren-Parenchym-Kontrastverstärkung zu erkennen, die 1 bis 2 Minuten später eine Intensitätsebene extremer Helligkeit erreichte. Der Transducer wurde 4 Minuten nach der Injektion zur Abbildung der rechten Niere bewegt. Zuerst hatte diese Niere ein normales, nicht-verstärktes Erscheinungsbild. Es war jedoch zu beobachten, dass die Anwendung intensitätsstarken Ultraschalls nach einigen Minuten eine leichte Erhöhung der Echointensität erzeugte, wenn auch nicht auf das in der linken Niere beobachtete Niveau.
Beispiel 13 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer reduzierten Menge einer Perfluorpentan-emulsion
Das Verfahren aus Beispiel 10 wurde wiederholt, außer dass die Dosis der Perfluorpentanemulsion auf ein Drittel verringert wurde. Die Peakintensität der Myokardkontrastverstärkung war mit der in Beispiel 10 beobachteten vergleichbar, die Dauer des Gewebekontrastes wurde jedoch von 30 Minuten auf weniger als 10 Minuten verringert.
Beispiel 14 – Extrathorakale In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 10 wurde in einem extrathorakalen Experiment wiederholt. Die Myokardkontrastverstärkung war mit der in Beispiel 10 beobachteten vergleichbar.
Beispiel 15 – In-vivo-Farb-Doppler-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorpentanemulsion
Das Verfahren aus Beispiel 10 wurde wiederholt, außer dass der Scanner (im Farb-Doppler-Modus) in der ersten Minute nach der Injektion im linken Herzventrikel angewendet wurde, um so das Mikrobläschenwachstum zu initiieren. Danach war die Myokardkontrastverstärkung intensiver als die in Beispiel 10 beobachtete.
Beispiel 16 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion
0,5 ml einer isotonisch rekonstituierten Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(ag), und 66 μl der Perfluor-4-methylpent-2-enemulsion aus Beispiel 1(al) wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, injiziert. Die resultierende Myokardkontrastverstärkung war hinsichtlich der Intensität mit der in Beispiel 10 vergleichbar, hatte jedoch eine Dauer von 6 – 8 Minuten.
Beispiel 17 – In-vivo-Bildgebung einer blutgefüllten Region eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorpentanemulsion
Ein Zweig der Koronararterie des Hundes wurde vorübergehend für 2 Minuten abgebunden, wonach ein Kontrastmittel, wie in Beispiel 10 beschrieben, injiziert wurde. Die Kontrastverstärkung des nunmehr blutgefüllten Myokards war deutlich intensiver als die des umliegenden normalen Gewebes.
Beispiel 18 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
0,5 ml einer isotonisch rekonstituierten Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(ag), und 66 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion aus Beispiel 1(ao) wurden wie in Beispiel 10 injiziert. Die resultierende intensive Myokardkontrastverstärkung war mit der in Beispiel 10 beobachteten vergleichbar.
Beispiel 19 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
0,5 ml einer isotonisch rekonstituierten Perfluorbutangasdispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl), und 66 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion aus Beispiel 1(aq) wurden wie in Beispiel 10 injiziert. Die resultierende intensive Myokardkontrastverstärkung war mit der in Beispiel 16 beobachteten vergleichbar.
Beispiel 20 – In-vivo-„Teilchen-zu-Teilchen"-Targeting
0,02 μl/kg Perfluorbutanmikrobläschen, hergestellt gemäß Beispiel 1(bq), und 0,02 μl/kg der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(bh) beschrieben, wurden gleichzeitig intravenös in einen anästhetisierten Mischlingshund von 20 kg injiziert, während das Herz durch Ultraschall, wie in Beispiel 10 beschrieben, abgebildet wurde. Die Myokardechoverstärkung war ähnlich der in Beispiel 10 beobachteten, außer dass der Dämpfungspeak im linken Ventrikelblut weit weniger deutlich war.
Beispiel 21 – In-vivo-Bildgebung eines Kaninchenherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
Eine Injektionsspritze, enthaltend eine Menge der Perfluorbutanmikrobläschendispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl)(mittlerer Volumendurchmesser 3,0 μm), die 1 μl des Gasgehalts entspricht, und eine weitere Injektionsspritze, enthaltend 105 μl der Perfluordimethylcyclobutanemulsion aus Beispiel 1(aq), wurden hergestellt. Die Inhalte beider Spritzen wurden gleichzeitig unter Verwendung eines Katheters, eingeführt in eine Ohrvene, in ein 5-kg-Kaninchen injiziert. Die B-Mode-Bildgebung des Herzens wurde unter Verwendung eines ATL HDI-3000-Scanners mit einer P5-3-Sonde unter Verwendung einer parasternalen Short-Axis-Projektion am offenen Thorax durchgeführt. Die Ergebnisse waren mit den in Beispiel 18 beobachteten vergleichbar.
Beispiel 22 – Durch Ultraschallbehandlung induzierte Arzneimittelabgabe
Einem anästhetisierten New Zealand Black-Kaninchen von 3 kg wurden intravenös 0,04 ml der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, und gleichzeitig 0,12 ml der Perfluorbutangassuspension, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, injiziert, während die linke Niere mit einem ATL HDI-3000-Scanner einer P5-3-Sonde abgebildet wurde, wobei der Scanner auf die maximale Abgabeleistung eingestellt war. Es waren signifikantes Bläschenwachstum und -akkumulation im Nierenparenchym zu beobachten. Dann wurden 160 mg FITC-Dextran (Mw 2.000.000) in 5 ml Wasser gelöst und intravenös injiziert, und die Ultraschallbildgebung an der gleichen Stelle wurde für weitere 5 Minuten fortgesetzt, wobei nunmehr der Scanner auf den Power-Doppler-Modus eingestellt wurde, um die Schalleistung zu erhöhen. Dann wurde das Tier getötet und beide Nieren entfernt und unter UV-Licht untersucht. Eine erhöhte Menge an Fluoreszenz wurde als 50–100 μm große Flecken im Hohlraum innerhalb der Regionen der linken Niere beobachtet, die in Gegenwart der Mikrobläschen mit Ultraschall behandelt wurden. Mit jedem dieser Flecken war ein Nephron ohne intravaskuläre Fluoreszenz verbunden.
Beispiel 23 – Albunex^® als Gasdispersion
0,3 ml/kg Albunex^® und 1,5 μl/kg der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, wurden intravenös in einen anästhetisierten männlichen Mischlingshund von 20 kg injiziert und durch Ultraschall, wie in Beispiel 10 beschrieben, abgebildet. Die Myokardverstärkung war wie in Beispiel 10 beschrieben.
Beispiel 24 – Targetierte Mikrobläschen bei der Bildgebung eines Kaninchenherzens
0,1 μl/kg Mikrobläschen, hergestellt wie in Beispiel 1(az) beschrieben, wurden intravenös in ein Kaninchen injiziert, während das Herz des Kaninchens durch Ultraschall unter Verwendung eines ATL HDI-3000-Scanners mit einer P5-3-Sonde abgebildet wurde. Es war eine schwache, aber dauerhafte Myokardechoverstärkung erkennbar. Drei Minuten später wurden 1,5 μl/kg der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, injiziert. Es war eine leichte Erhöhung der Echointensität aus dem nicht beschallten Myokard zu beobachten.
Beispiel 25 – In-vivo-Bildgebung eines Rattenherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
Das in Beispiel 19 beschriebene Experiment wurde mit vergleichbaren Ergebnissen an einer Ratte durchgeführt.
Beispiel 26 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluorhexanemulsion
0,1 μl/kg der Perfluorhexanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(ar) beschrieben, und 0,2 μl/kg der Perfluorbutanmikrobläschensuspension, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, wurden gleichzeitig in einen Hund injiziert, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die Myokardkontrastwirkung war mit der in Beispiel 10 beobachteten vergleichbar.
Beispiel 27 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Heptafluorpent-1-enemulsion
0,3 μl/kg der Perfluorbutanmikrobläschensuspension, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, und 0,15 ml der in Beispiel 1(am) beschriebenen Heptafluorpent-1-enemulsion wurden gleichzeitig in einen Hund injiziert, wie in Beispiel 10 beschrieben. Es war eine relativ schwache Myokardkontrastwirkung zu beobachten, die jedoch intensiver war und länger dauerte als die in Beispiel 5 beobachtete.
Beispiel 28 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion, stabilisiert mit sterilisiertem Phospholipid
0,3 μl/kg der Perfluorbutanmikrobläschensuspension, hergestellt wie in Beispiel 1(bl) beschrieben, und 0,3 μl/kg der in Beispiel 1(bm) beschriebenen Perfluordimethylcyclobutanemulsion wurden gleichzeitig in einen Hund injiziert, wie in Beispiel 19 beschrieben. Es war eine Myokardkontrastwirkung zu beobachten, die mit der in Beispiel 19 beschriebenen vergleichbar war.
Beispiel 29 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorpropangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
0,17 ml der Perfluorpropanmikrobläschensuspension, hergestellt wie in Beispiel 1(bn) beschrieben, und 0,3 μl/kg der Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, wurden gleichzeitig in einen Hund injiziert, wie in Beispiel 19 beschrieben. Es war eine Myokardkontrastwirkung zu beobachten, die mit der in Beispiel 19 beschriebenen vergleichbar war.
Beispiel 30 – In-vivo-Bildgebung des Magen-Darm-Traktes eines Hundes mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
20 ml einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben, wurden über einen Magenschlauch einem anästhetisierten Hund verabreicht. Danach wurde eine kleine Menge (Dosisbereich 0,1–0,2 μl Gas/kg) einer Perfluorbutanmikrobläschendispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(a), intravenös injiziert. Ein Ultraschall-Bildgebungs-Transducer wurde an die Abdominalwand angelegt und das lokalisierte Mikrobläschenwachstum im Magenwandkapillarsystem lieferte einen verstärkten Kontrast mit verbesserter Abgrenzung der Mukosakonturen.
Beispiel 31 – In-vivo-Bildgebung des Magen-Darm-Traktes eines Hundes mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion
Eine Perfluorbutanmikrobläschendispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(a), wurde über einen Magenschlauch einem anästhetisierten Hund verabreicht. Die Dispersion konnte sich gleichmäßig im Magenventrikel verteilen, wie durch Ultraschallbildgebung verifiziert wurde. Eine kleine Menge einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion, hergestellt wie in Beispiel 1(aq) beschrieben (Dosisbereich 0,2–1 μl Perfluorkohlenstoff/kg), wurde intravenös injiziert. Der Ultraschalltransducer wurde in der Region von Interesse gehalten; das Mikrobläschenwachstum in den Magenflüssigkeitsschichten proximal zu den Mukosaoberflächen lieferte einen verstärkten Kontrast mit verbesserter Abgrenzung der Mukosakonturen.
Beispiel 32 – In-vivo-Bildgebung eines Hundeherzens mit einer Perfluorbutangasdispersion und einer Perfluordimethylcyclobutanemulsion und gleichzeitig verabreichtem Adenosin
Eine Okklusionsschlinge wurde um den Hauptzweig der linken vorderen absteigenden Koronararterie eines Hundes von 22 kg mit offenem Brustkorb gelegt, und ein Ultraschall-Durchlaufzeit-Flussmeter wurde unmittelbar nach dem Okkluder platziert, der dann so eingestellt wurde, dass er eine stetige 25%ige Flussreduktion von etwa 14 bis 10 ml/min erzeugte. Die Inhalte der drei Spritzen, jeweils enthaltend (i) eine Menge einer Perfluorbutanmikrobläschendispersion, hergestellt wie in Beispiel 1(bl), die 4,4 μl des Gasgehalts entspricht, (ii) eine Menge der Perfluordimethylcyclobutanemulsion aus Beispiel 1(aq), die 33 μl der dispergierten Perfluordimethylcyclobutanphase entspricht, und (iii) 3,0 mg Adenosin, gelöst in 0,9% Salzlösung, wurden dann intravenös als ein gleichzeitiger Bolus injiziert; woraufhin 10 Sekunden später weitere 3,0 mg Adenosin, gelöst in 0,9% Salzlösung, langsam über 20 Sekunden injiziert wurden. Die Bildgebung des linken Ventrikels des Herzens wurde unter Verwendung eines ATL HDI-3000-Scanners mit einer P5-3-Sonde durchgeführt; es kontinuierlich für 1 Minute bei maximaler Leistung ultraschallbehandelt, um das Mikrobläschenwachstum zu induzieren, woraufhin das Myokard unter Verwendung der B-Mode-Bildgebung untersucht wurde. Es war ein deutlich erkennbarer Unterschied der Grauskalaniveaus zwischen stenotischen Flächen (heller als Grundlinienaufzeichnungen) und normalen Flächen (viel heller als Grundlinienaufzeichnungen) zu sehen.

Claims

Verfahren zum Erzeugen verstärkter Herzbilder eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Patienten, dem zuvor ein kombiniertes Präparat verabreicht worden war, das umfasst: i) ein injizierbares wässriges Medium mit darin dispergiertem Gas; und ii) eine Zusammensetzung, umfassend eine diffundierbare Komponente, die mindestens eine Substanz umfasst, die ein Gas oder einen Dampfdruck besitzt oder fähig ist, dieses/diesen zu erzeugen, das/der ausreichend ist, um ein steuerbares Wachstum des dispergierten Gases in vivo zu fördern durch dort Hineindiffundieren von Molekülen aus Gas oder Dampf, das/der von der Substanz erhalten wird, um so zumindest vorübergehend die Größe des dispergierten Gases in vivo zu vergrößern, wobei das Verfahren umfasst Erzeugen eines oder mehrerer Ultraschallbilder mindestens eines Teils des Herzens des Patienten, wobei mindestens ein derartiges Bild erzeugt wird, nachdem der Patient eine Anstrengung, die durch eine Körperübung induziert ist, durchlaufen hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Ultraschall angewandt wird auf den Patienten, um einen Anstieg in der Größe des zuvor verabreichten dispergierten Gases zu induzieren.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Farb-Doppler-Ultraschall eingesetzt wird als der Ultraschall.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das dispergierte Gas umfasst Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff, ein inertes Gas, ein Schwefelfluorid, Selenhexafluorid, ein optional halogeniertes Silan, einen Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts, ein Keton, ein Ester, ein halogenierter Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts oder eine Mischung von beliebigen der vorstehenden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Gas umfasst ein perfluoriertes Keton, perfluorierten Ether oder Perfluorkohlenstoff.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Perluorkohlenstoff umfasst ein Perfluoralkan, Perfluoralken oder Perfluorcycloalkan.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Gas umfasst Schwefelhexafluorid oder ein Perfluorpropan, Perfluorbutan oder Perfluorpentan.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das dispergierte Gas stabilisiert wird durch eine Koaleszenz-resistente Oberflächenmembran, ein filmbildendes Protein, ein Polymermaterial, ein nicht-polymeres und nicht-polymerisierbares Wand-bildendes Material oder ein oberflächenaktives Mittel.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das oberflächenaktive Mittel mindestens ein Phospholipid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei mindestens 75% des oberflächenaktiven Materials Phospholipidmoleküle umfasst, die individuell eine Nettogesamtladung tragen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei mindestens 75% des filmbildenden oberflächenaktiven Materials ein oder mehrere Phospholipide umfasst, ausgewählt aus Phosphatidylserinen, Phosphatidylglycerolen, Phosphatidylinositolen, Phosphatidsäuren und Cardiolipinen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei mindestens 80% der Phospholipide Phosphatidylserine umfassen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung, die die diffundierbare Komponente umfasst, ferner eine Trägerflüssigkeit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die diffundierbare Komponente in einer wässrigen Trägerflüssigkeit in der Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder Mikroemulsion dispergiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die diffundierbare Komponente umfasst einen aliphatischen Ether, polyzyklisches Öl, polyzyklischen Alkohol, heterozyklische Verbindung, aliphatischen Kohlenwasserstoff, cykloaliphatischen Kohlenwasserstoff oder halogenierten Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die diffundierbare Komponente einen Perfluorkohlenwasserstoff umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Perfluorkohlenwasserstoff umfasst ein Perfluoralkan, Perfluoralken, Perfluorcycloalkan, Perfluorcycloalken oder perflorierten Alkohol.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die diffundierbare Komponente umfasst Perfluorpentan, Perfluorhexan, Perfluordimethylcyclobutan oder Perfluormethylcyclopentan.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Emulsion stabilisiert wird durch ein oberflächenaktives Phospholipid.