CN1744921A - 超声造影剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备冻干基质，并在重建该基质的基础上获得各个注射用造影剂的方法，该造影剂包含主要由磷脂稳定的充气微气泡的液体水溶性混悬液。该方法包括从一种水溶性介质、磷脂和水不混溶有机溶剂中制备一种乳剂。然后将该乳剂冻干，接着在充气微气泡的水溶性混悬液中重建。该方法能够获得包含具有相对较小直径和较窄粒度分布的微气泡的混悬液。

Description

超声造影剂及其制备方法
本发明涉及一种制备可用于制备含有用于诊断造影的造影剂的气体的干燥或冻干制剂，以及制备所述含造影剂的气体的方法。
本发明还包括了通过此方法制备的干燥制剂，该制剂可被重建从而形成用于诊断造影的造影剂。本发明进一步还包括了使用本发明干燥制剂和包容器或含有本发明干燥制剂的两个组分的试剂盒而制备的充满微气泡的可用于诊断造影的气体混悬液。
发明背景
近年来超声造影剂的迅速发展已孕育出了很多不同的制剂，它们可用于人体或动物体的器官和组织的超声造影。这些造影剂主要是联合使用医学回波描记仪器而用于静脉或动脉内注射，所述仪器可用于例如，B-型造影成像(基于反散射组织特性的空间分布)或多普勒信号处理(基于连续波或超声回波的脉冲多普勒处理从而测定血液或液体流动参数)。
用作超声造影剂的一组注射用制剂包括具有几微米直径分散于水溶性介质的气泡混悬液。
在载体液体中使用气泡混悬液作为有效的超声反射物在本领域中是熟知的。微气泡混悬液作为增强超声成像的超声药物的发展是随早期的观测结果而起，即水性溶液的快速静脉注射可导致溶解气体通过形成气泡而逃逸出溶液。由于它们参照血液的声阻抗存在实质性差异，因此发现这些血管内气泡是极好的超声反射物。将气泡在载体液体中的混悬液注射到活体血液中会大大增强超声回波描记成像，从而增强内部器官的显像。由于器官和深在组织的成像对确立医疗诊断具有决定性作用，因此现已作出很多努力以开发易于制备和给药，包含最小量惰性物质并能长期保藏和分布单一的高浓度气泡的稳定混悬液。
然而，由于游离气泡通常不够稳定从而不能用作超声造影剂，因此这些气泡在水性介质中的单一分散具有有限的现实意义。
因此，例如利用乳化剂、油、增稠剂或糖或通过将气体及其前体包封或包囊到各种体系中，从而稳定用于回波描记术及其他超声研究的气泡的方法也具有意义。本领域中通常将这些稳定的气泡称作“微泡”，并可分为两个主要种类。
第一类稳定的气泡或微泡在本领域中通常是指“微气泡”并包括其中气泡通过一种裹住排列在从气体到液体界面的表面活性剂(即两亲性物质)的极薄气囊而被束缚在气/液界面的水性混悬液。第二类微泡在本领域中通常是指“微气球”或“微胶囊”并包括其中气泡被由天然或合成聚合物形成的固体物质气囊包围的混悬液。微气球及其制备的实例被公开在例如，欧洲专利申请EP 0458745中。其他种类的超声造影剂包括聚合物或其他固体的多孔微粒的混悬液，该混悬液将气泡包封在微粒的孔中。本发明尤其涉及用于诊断性影像学的超声造影剂包括气体微气泡的水溶性混悬液，即通过一层两亲性物质而被基本稳定的微泡。
微气泡混悬液通常可按下方法制备：通过用空气或其他气体接触粉末状的两亲性物质，例如冷冻干燥的成形脂质体或冷冻干燥的或喷雾干燥的磷脂混悬液，然后用水性载体通过搅拌生成微气泡混悬液，该混悬液必须在制备后就立即给药。
气体微气泡及其制备的实例可在例如US 5271928，US 5445813，US 5413774，US 5556610，US 5827504中找到。
WO97/29783公开了另一种制备气体微气泡混悬液的方法，包括在适当的含磷脂水性介质中生成气体微气泡分散体并在其后将该分散体冻干从而获得干燥的重建产品。如此制备的干燥产品在水性介质中只需最小限度的搅拌就可重建。如所述文献中提到的，如此产生的微气泡的尺寸始终是可重现的并实际上不受重建过程中所施用的搅拌能量大小的影响，而是由起始微气泡分散体中形成的微气泡的尺寸决定。然而，本申请人观察到为了在含磷脂水性介质中产生气体微气泡而使用的搅拌能量的大小可以非常高，尤其是要获得直径小的微气泡时(例如，为获得具有约3μm体积平均直径的气泡的分散系，10分钟，23000rpm)。高搅拌能量可测定微气泡的水性分散系中的局部过热现象，这一现象可能续而导致水性介质中所含的磷脂降解。另外，通常过高搅拌能量的影响难以控制并且可能产生终微气泡的不可控制的粒度分布。此外，该方法包括在微气泡产生期间，气体连续流入水性介质，因此需要使用适当量的气体。
WO 94/01140进一步公开了在水性介质中制备可重建的微泡混悬液的方法，其中包括冻干含胃肠外可接受的乳化剂、非极性液体和脂溶性或水不溶性“构造物”的水性乳剂。提到作为胃肠外可接受乳化剂的泊洛沙姆和磷脂，而在操作实例中使用了两者的混合物。胆固醇是优选的水不溶性构造物，它被应用在操作实例中。随后将该冻干产品在水中重建从而获得充气微泡的水性混悬液。因此由重建步骤得到的该充气微泡由不同物质的包封而确定，这些物质包括乳化剂例如泊洛沙姆和水不溶性构造物例如胆固醇。
该方法据说可产生小于4μm粒径的乳剂，优选小于2μm下至0.5μm。然而本申请人已注意到当重建步骤可能最终产生数量平均直径小于2μm的微泡时，该微泡群体相应的粒度分布却还是相对较宽。此外，从根据上述方法获得的乳剂微粒转化为气体微气泡的步骤导致了非常低的产率。
本申请人现已发现如果将磷脂作为上述乳剂的主要乳化剂，并且如果上述方法基本上是在不存在上述水不溶性构造物的情况下进行的，那么可获得一个非常窄的微气泡粒度分布。此外，基本不含所述的水溶性构造物可大大增加从乳剂微粒到气体微气泡的转化产率。本申请人进一步还观察到如果磷脂基本上是乳剂中的唯一乳化剂，那么上述方法可产生更窄的微气泡粒度分布并使产率得到提高。
本申请人还发现了通过在上述方法中对水-有机乳剂使用一个非常低的搅拌能量，就有可能获得具有很小直径并使粒度分布变窄的微气泡。
发明概述
本发明的一方面涉及制备冻干基质的方法，该基质通过接触水性载体液体和气体可重建成主要由磷脂稳定的充气微气泡的混悬液，所述方法包含几个步骤：a)制备一种水-有机乳剂包含i)一种水性介质；ii)一种基本上不与水混溶的有机溶剂；iii)一种包含超过50％重量比的磷脂的两亲性物质的乳化组合物和iv)冻干保护剂；b)冻干所述经乳化的混合物，从而获得包含所述磷脂的冻干基质。
本发明的另一个方面涉及一种制备一种注射用造影剂的方法，该造影剂包含主要由磷脂稳定的充气微气泡的液体水性混悬液，该方法包括几个步骤：a)制备一种水-有机乳剂包含i)一种水性介质；ii)一种基本上不与水混溶的有机溶剂；iii)一种包含超过50％重量比的磷脂的两亲性物质的乳化组合物和iv)一种冻干保护剂；b)冻干所述乳剂，从而获得包含所述磷脂的冻干基质。c)使所述冻干基质与生物相容性气体接触；d)通过将其溶于生理可接受水性载体液体重建所述冻干基质，从而获得主要由所述磷脂稳定的充气微气泡的混悬液。
制备乳剂的步骤a)优选包括：a1)通过将两亲性物质的乳剂组合物和该冻干保护剂分散于水性介质中而制备混悬液；a2)用有机溶剂混合所得混悬液；a3)受控搅拌该混合物，从而获得乳剂。
根据步骤a3)的受控搅拌优选通过使用高压均浆器或更优选转子-定子式均浆器而获得。
本发明的又一个方面涉及一种注射用造影剂，其包含通过在水性载体液体中主要含磷脂的稳定层稳定的充气微气泡的混悬液，其中所述的微气泡具有小于1.70μm的数量平均直径(DN)并且具有可是DV50/DN比例约为2.00或更低的体积平均直径(DV50)。
发明详述
如上所述，本发明的一个方面涉及一种制备主要由磷脂稳定的充气微气泡混悬液的可重建冻干基质的方法，该方法包括制备水-有机乳剂包含i)一种水性介质，ii)一种基本不与水混溶的有机溶剂；iii)一种磷脂和iv)一种冻干保护剂，以及随后冻干所述乳剂。
该水性介质优选生理可接受的载体。术语“生理可接受的”包括任何可以选择剂量在不产生副作用或基本上不改变其生物体健康的或正常功能(例如没有测定出任何不可接受的毒性，不引起任何极度或不可控制的过敏反应的情况或没有测定出任何不正常的病理状态或疾病情况)的情况下施用于患者的化合物、物质或制剂。
适宜的水性液体载体有水，通常为无菌、无热源的水(为了尽可能预防所述中间体冻干产品中的污染)，水溶液例如盐水(其可有利地保持平衡从而不在注射用的终产品出现低渗)，或一种或多种张力调节物质例如盐或糖、糖醇、二元醇或其他非离子多元醇物质(例如，葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。
有机溶剂
此处所用的术语“基本上不与水混溶”是指当所述溶剂与水混合时，形成了两个分开的相的有机溶剂。水不混溶溶剂在本领域终通常被认为是无极性的或非极性溶剂，与极性溶剂相反(例如水)。水不混溶溶剂通常基本上不溶于水。为了达到本发明的目的，适宜与水性溶剂乳化的有机溶剂通常有那些在水中的溶解性小于10g/l的溶剂。所述溶剂在水中的溶解性优选约为1.0g/l或更低，更优选约0.2g/l或更低，再更优选约0.01g/l或更低。特别优选的溶剂是具有水中溶解性为0.001g/l或更低的那些。尤其不溶的有机溶剂(例如全氟化碳)具有下至约1.0·10-6g/l的溶解性(例如全氟辛烷1.66·10-6g/l)。
所述有机溶剂优选可冻干的，即，所述溶剂在冻干温度下具有足够高的蒸气压，例如-30℃至0℃，从而在可接受的时间内，例如24-48小时，产生有效的并且完全的蒸发/升华。该有机溶剂的蒸气压优选在25℃高于约0.2kPa。
如上所述，该有机溶剂可选自广泛种类的溶剂和任何不与水混溶并可冻干的化学个体，并且优选在室温下(25℃)下为液体。如果使用了一种沸点低于室温的溶剂，那么装有该乳化混合物的容器可有利地冷却至所述溶剂的沸点以下，例如低至5℃或0℃。由于在冻干步骤中所述溶剂要完全除去，因此不存在特殊的约束，除了其不会含有通过冻干都不能除去或用于注射用组合物时为不可接受的污染物。
适宜的有机溶剂包括但不局限于烷、例如支链或优选直链(C5-C10)烷，例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷；烯烃，例如(C5-C10)烯烃，例如1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯；环-烷烃，例如任选被一个或两个甲基取代的(C5-C8)环烷烃，例如环戊烷，环己烷，环辛烷，1-甲基-环己烷；芳族烃，例如苯和被一个或两个甲基或乙基取代的苯衍生物，例如苯、甲苯、乙基苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯；烷基醚和酮例如二丁基醚和二异丙基酮；卤代烃或醚，例如氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(异氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷，尤其是全氟化烃或醚，例如全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟甲基环己烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟苯和全氟萘烷、甲基全氟丁基醚、甲基全氟异丁醚、乙基全氟丁基醚、乙基全氟异丁醚；及其混合物。
溶剂量通常包含相对于用于溶剂的水体积的约1％至约50％。所述量优选从约1％至约20％，更优选从约2％至15％，再更优选从约5％至10％。如愿意，可使用上述列举的有机溶剂两种或多种的混合物，有机溶剂在乳化混合物中的总量在上述范围内。
冻干保护剂
术语冻干保护剂或“冻干保护剂”是指当包含在将要冻干的制剂中时，将保护所述化学化合物不受冷冻和真空操作的有害影响的化合物，这些影响诸如那些通常随冻干出现的，例如因在冻干过程中使用真空而产生的受损、吸附和损耗。此外，经过冻干步骤后，所述冻干保护剂优选形成可支持冻干磷脂的固体基质(“大块”)。
本发明不局限于使用特殊的冻干保护剂，适当的冻干保护剂的实例包括但不局限于碳水化合物，例如糖、单-、二-或多-糖，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、直链淀粉、支链淀粉，环糊精、葡聚糖、氨茴酰牛扁碱、可溶淀粉、羟乙基淀粉(HES)，糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇和聚二元醇例如聚乙二醇。具有冻干保护作用的重要清单记载于Acta Pharm.Technol.34(3)，pp.129-139(1988)，在此引用其内容作为参考。所述冻干保护剂可单独或作为一种或多种化合物的混合物形式使用。
优选的冻干保护剂包括甘露醇和多糖例如葡聚糖(尤其分子量超过1500道尔顿的那些)、菊粉、可溶淀粉和羟乙基淀粉。
甘露醇或多糖例如葡聚糖、菊粉、可溶淀粉、羟乙基淀粉与糖例如葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖及赤藓醇的混合物也可产生良好的效果。
同样，本发明不局限于使用任何特别量的冻干保护剂。然而，冻干保护剂在冻干之前的乳剂中的最佳重量浓度包含约1至约25％，优选约2至约20％，更优选约5至约10％之间。
如有必要对冻干产品提供理想的“主体”，也可使用更高剂量。
该冻干保护剂优选在其乳化前加入到水性-有机混合物中，因此在这种情况下该水性-有机混合物的乳化作用是在存在冻干保护剂的条件下展开的。或做为选择，可在其乳化后将该冻干保护剂加入到水性-有机混合物中。在第一种情形下，该冻干保护剂优选在其与有机溶剂混合前被加入到水性介质中。如愿意，还可将两种结合起来，例如通过将部分冻干保护剂加入到用于制备乳剂的水相中，并将部分加入到由此获得的乳剂中。如愿意，还可进一步将防冻剂，例如甘油加入到乳剂中以保护所述化学化合物不受冷冻的有害影响。
磷脂
依照本发明的说明书和权利要求书，术语磷脂包括任何其分子能在最终微气泡混悬液的气-液交界面上形成物质膜(通常以单-分子层形式)的两亲性磷脂化合物。相应地，这些物质在本领域中还指“膜形成磷脂”。同样地，在乳化混合物中，这些两亲性化合物通常排列在水性介质和基本不溶于水的有机溶剂之间的交界面上，由此稳定了经乳化的溶剂微粒。通过这些物质在气-水或水-溶剂界面上形成的膜可为连续的也可是非连续性的。然而在后一情形中，膜的不连续性应例如分别不影响混悬微气泡或乳化微粒的稳定性(例如耐压、抗聚结等)。
在此所用的术语“两亲性化合物”包括具有以下分子的化合物，即具有带一个能够与水性介质相互作用的亲水极性头部分(例如极性或离子基团)和一个能够与例如有机溶剂相互作用的疏水有机尾部分(例如烃链)。因此，这些化合物通常作为“表面活性剂”，即能够稳定通常另外的不混溶物质的混合物，例如两种不混溶液体的混合物(例如水和油)，液体与气体的混合物(例如水中的气体微气泡)或液体与不溶颗粒的混合物(例如水中的金属纳米微粒)。
两亲性磷脂化合物通常包含至少一个磷脂基和至少一个，优选两个，亲脂长链烃基。
适宜的磷脂实例包括带有一个或优选两个(相同或不同)脂肪酸和磷酸残基的甘油酯，其中的磷酸残基相反连于亲水基团上，例如胆碱(卵磷脂-PC)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰肌醇)等基团。仅带有一个脂肪酸残基的磷脂的酯通常在本领域中是指磷脂的“溶血”形式。磷脂中的脂肪酸残基通常为长链脂族酸，通常含有12-24个碳原子，优选14-22；脂族链可含有一个或多种不饱和部分或优选完全饱和。在磷脂中适宜的脂肪酸的实例有，例如，月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选使用饱和脂肪酸例如肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸和花生酸。
磷脂的进一步实例为磷脂酸，即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂类例如鞘脂类，即那些含有脂肪酸的甘油二酯的残基被神经酰胺链代替的卵磷脂类似物；心磷脂，即1，3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯；糖脂例如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；糖脂；硫脂和鞘糖脂。
在此所用的术语磷脂既包括天然存在的、也包括半合成或合成产品，它们既可单独使用也可以混合物的形式使用。
天然存在的磷脂是天然卵磷脂(卵磷脂(PC)衍生物)，例如，通常地，大豆或蛋黄卵磷脂。
半合成的磷脂是天然卵磷脂的局部或全部氢化衍生物。优选的磷脂为卵磷脂，乙基卵磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
磷脂的优选实例有，例如，二月桂酰基-磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基-磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰基-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基-磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、双十五酰基-磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰基-2-油基磷脂酰胆碱(POPC)、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰基-磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐、二花生酰基磷脂酰基-甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰基-磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)、二花生酰基磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、二油基磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)、二花生酰基磷脂酰乙醇胺(DAPE)、二亚油基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生酰基磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰基鞘磷脂(DPSP)和二硬脂酰基鞘磷脂(DSSP)。
术语磷脂进一步还包括修饰的磷脂，例如亲水基团相反连于其他亲水基团的磷脂。修饰磷脂的实例有经聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂酰乙醇胺，即亲水乙醇胺部分连于不同分子量例如300-5000道尔顿的PEG分子的磷脂酰乙醇胺，例如DPPE-PEG或DSPE-PEG，即其上连有PEG聚合物的DPPE(或DSPE)。例如，DPPE-PEG2000是指与平均分子量约为2000的PEG聚合物相连的DPPE。如下所要进行的详细解释，这些PEG-修饰的磷脂优选与非修饰磷脂结合在一起使用。
中性和带电磷脂及其混合物都可令人满意地用于本发明的方法中。此处所用的和在现有技术中的与磷脂相关的术语“带电”是指单独的磷脂分子在整体上带有净电荷，其带正电荷或更常见的负电荷。
整体上带负电的磷脂的实例有，尤其是磷脂酰丝氨酸的脂肪酸二酯的衍生物，例如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸的脂肪酸二酯衍生物，例如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰甘油的脂肪酸二酯衍生物例如DMPG、DPPG和DSPG。还有修饰的磷脂，尤其是PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺，例如DMPE-PEG750、DMPE-PEG1000、DMPE-PEG2000、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG4000、DMPE-PEG5000、DPPE-PEG750、DPPE-PEG1000、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG750、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000、DAPE-PEG750、DAPE-PEG1000、DAPE-PEG2000、DAPE-PEG3000、DAPE-PEG4000或DAPE-PEG5000可作为带负电的分子而被使用。还有上述引证的磷脂的溶血形式，例如溶血磷脂酰丝氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或-DSPS)，溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)可有利地作为带负电的化合物而被使用。
整体上带正电的磷脂的实例有，乙基磷脂酰胆碱的衍生物，尤其是乙基磷脂酰胆碱与脂肪酸的酯，例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC或DSEPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DPPC或DPEPC)。
优选使用两种或多种磷脂的混合物，至少一种带中性电荷和至少一种整体带净电荷。更优选，使用两种或多种磷脂的混合物，至少一种呈中性和至少一种带负电荷。带电荷磷脂的含量可在约占磷脂总重量的95％-约5％的范围内变化，优选按重量计80％-20％。存在至少少量的带(负)电荷磷脂，例如磷脂总重量的5％-20％，可有助于防止气泡或乳剂微滴的聚集。然而，还可以单独使用中性或带电荷的磷脂，或混合使用两种或多种全是中性或全为整体带电荷的磷脂的混合物。
优选的磷脂为DAPC、DPPA、DSPA、DMPS、DPPS、DSPS、DPPE、DSPE、DSPG、DPPG和乙基-DSPC。最优选的是DSPA、DPPS或DSPS。
优选的磷脂混合物为DPPS与DPPC、DSPC或DAPC的混合物(95/5-5/95w/w)，DSPA与DSPC或DAPC(95/5-5/95w/w)的混合物，DSPG或DPPG与DSPC的混合物或DSPC与乙基-DSPC的混合物。最优选的是DPPS/DSPC混合物(50/50-10/90w/w)或DSPA/DSPC(50/50-20/80w/w)。
磷脂的含量通常包括乳化混合物总重量的约0.005-约1.0％重量比。当然可使用更高含量，但是考虑到终产品为注射用造影剂，因此优选不使用过量的添加剂，除非为了获得稳定并适宜的产品而确实有这种必要。通常，使用高于上述平均范围上限数量的磷脂，在气泡数量、气泡粒度分布和气泡稳定性方面，实际上观察不到或观察到可忽略不计的改善。通常，当使用更大体积的有机溶剂时，需要更高含量的磷脂。因此，当有机溶剂的体积达到约50％的水相体积时，可有利地向乳剂中加入约1％w/w的磷脂。磷脂的含量优选占乳化混合物总重量的0.01-1.0％之间，更优选按重量计约0.05％-0.5％。
如上所述，根据本发明的方法生产的微气泡主要是由如上定义的磷脂来稳定的。尤其，包围充气微气泡的包封物是由超过50％(w/w)，优选由至少80％，更优选由至少90％如上定义的磷脂物质构成。适宜地，基本全部的微气泡的稳定包封物都是由磷脂构成。
然而，其他两亲性物质可以少于乳化组合物总重量50％的量与形成充气微气泡的稳定包封物的磷脂混合。
适宜的附加包封物稳定性两亲物质的实例包括，例如，溶血脂质；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亚油酸或亚麻酸，以及它们分别与碱或碱金属形成的盐；带有聚合物的脂质，例如甲壳质、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)，也即为“pegylated脂质”；带有磺化单-双-，寡或多糖的脂质；带有与醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合脂质；二乙酰磷酸酯；磷酸联十六烷酯；硬脂酰胺；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)；聚氧乙烯脂肪醇；聚氧乙烯脂肪醇醚；聚氧乙烯化脱水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯；乙氧基化大豆甾醇；乙氧基化蓖麻油；环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)嵌段共聚物；糖酸的甾醇酯包括胆固醇葡糖苷酸、羊毛甾醇葡糖苷酸、7-脱氢胆固醇葡糖苷酸、麦角甾醇葡糖苷酸、胆固醇葡糖酸酯、羊毛甾醇葡糖酸酯、或麦角甾醇葡糖酸酯；糖酸和醇的酯包括月桂基葡糖苷酸、硬脂酰基葡糖苷酸、肉豆蔻酰基葡糖苷酸、月桂基葡糖酸酯、肉豆蔻酰基葡糖酸酯或硬脂酰基葡糖酸酯；糖与脂肪酸的酯包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸或多糖醛酸；甘油与(C12-C24)，优选(C14-C22)脂肪二羧酸的酯和它们分别与碱或碱金属的盐，例如1，2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰基甘油或1，3-二棕榈酰基-2-琥珀酰基甘油；皂草苷包括萨洒皂草配基、菝葜配基、常春配基、石竹素、或毛地黄毒苷配基；长链(C12-C24)醇，包括n-癸醇，月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、或n-十八醇；6-(5-胆甾烯-3β-基氧)-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；二半乳糖甘油二酯；6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧基-1-硫代-β-D-甘露吡喃糖苷；12-(((7’-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)硬脂酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八酰基]-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰基-二油基磷脂酰乙醇胺；1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油-磷酸乙醇胺；棕榈酰基高半胱氨酸；包含至少一个(C10-C20)，优选(C14-C18)，烷基链的烷基铵盐，例如硬脂酰基氯化铵、十六烷基氯化铵、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)；包含一个或优选两个(C10-C20)，优选(C14-C18)，酰基酯残基的叔或季铵盐例如，1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1，2-油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰基-3-二甲基铵丙烷(DSDAP)：及其混合物或组合物。
少量脂肪酸和溶血形式的磷脂还可构成原始磷脂产品的降解产物，例如由加热乳剂产生。
优选的附加包封物稳定化两亲物质是那些在其分子上包含一个或两个脂肪酸残基，尤其是一个或两个直链(C10-C20)-酰基，优选(C14-C18)-酰基链的物质，例如，上述列举的脂肪酸，它们各自的盐及衍生物。
尤其优选的附加包封物稳定化两亲物质是那些能够将整体净电荷传给稳定的包封物上的物质，即，带有整体正或负净电荷的化合物。适宜的带负电或正电的化合物的实例有，例如溶血磷脂，即，上述引证磷脂的溶血形式，例如溶血磷脂酰丝氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或-DSPS)、溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)；胆汁酸盐例如胆酸盐、脱氧胆酸盐或甘胆酸盐；(C12-C24)，优选(C14-C22)脂肪酸盐，例如，棕榈酸盐、硬脂酸盐、1，2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰基甘油盐或1，3-二棕榈酰基-2-琥珀酰基甘油盐；带卤素反离子(例如氯或溴)包含至少一个(C10-C20)烷基链，优选(C14-C18)烷基链的烷基铵盐，例如硬脂酰基氯化铵、十六烷基氯化铵、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)；带有一个卤素反离子(例如氯或溴)，包含一个或优选两个(C10-C20)酰基链，优选(C14-C18)酰基酯残基的叔或季铵，例如，1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1，2-油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰基-3-二甲基铵-丙烷(DSDAP)。
根据本发明的方法，如果期望获得“靶向”超声造影剂，即含有在体外或体内给药后能选择性结合在特殊位点的微气泡的造影剂，也可直接起始于至少部分通过引入适当选择的靶向配位体而经修饰的磷脂，或作为选择地，并优选地，起始于一种磷脂，至少其部分含有可能受保护的能够在后期与适当选择的具有互补反应机能的靶向配体(例如，卵白素-生物素链)配对的反应基团。
因此，在这种特定情况下，术语“磷脂”是指包括修饰和未修饰的磷脂，因此包括通过将靶向配体或保护性反应基团连接到磷脂的两亲性物质上而被修饰的磷脂。
术语“靶向配体”在其含义范围内包括任何具有或能够提高本发明微气泡对活体内生物或病理位点的靶向能力的化合物、部分或残基。可作为靶向配位体的材料或物质包括，例如，但不局限于，蛋白质，包括抗体、抗体片断、受体分子、受体连接分子、糖蛋白和外源凝集素；肽，包括寡肽和多肽；拟肽；糖，包括单和多糖；维生素；类固醇，类固醇类似物，激素，辅助因子，生物活性剂和遗传物质，包括核苷，核苷酸和多核苷酸。靶向配位体所联合的靶器官包括组织，例如，心肌组织(包括心肌细胞和心肌肌细胞(cardiomyocites))，膜组织(包括内皮组织和上皮组织)，层，结缔组织(包括间质组织)或肿瘤；血块；和受体，例如，肽类激素的细胞表面受体，神经递质，抗原，补体片断，和免疫球蛋白和类固醇激素的细胞质受体。
适宜的靶器官和靶向配位体公开在例如US专利No.6139819中，在此引用作为参考。
在一个优选实施方案中，靶向配位体可通过共价键连接在形成稳定的包封物的两亲性分子上。
在这种情况下，当期望得到靶向两亲性分子时，那么必须在磷脂或脂分子中存在的特定反应部分将依赖于将被配对的具体的靶向配位体。例如，如果靶向配位体可通过氨基连接到两亲性分子上，那么两亲性分子的适宜反应部分可为异硫氰酸酯(它将形成硫脲键)，反应性酯(以形成酰胺键)，醛基(为了形成可被还原成烷基胺键的亚胺键)等；如果该靶向配位体能通过巯基结合到两亲性分子上，那么两亲性分子的适宜互补反应部分包括卤素乙酰衍生物或马来酰亚胺(以形成硫醚键)；如果该靶向配位体可通过羧基结合到两亲性分子上，那么两亲性分子的适宜反应部分可为胺和肼(以形成酰胺或烷基胺键)。该反应部分可直接连接到磷脂分子上或连接到连接在磷脂上的修饰部分(例如PEG)上。
如上所示，在一个优选的实施方案中，当期望得到含靶向微气泡的造影剂时，那么至少起始磷脂的一部分将含有适宜的反应部分，并且含有互补官能度的靶向配位体将在冻干之前的任何步骤中，通过在乳剂形成之前、期间、或之后，或就在重建步骤之前，向含有功能磷脂/脂质的相中加入含互补官能度的靶向配位体而被连接到磷脂上。在后一种情形中，可以充分利用该体系的灵活性，因为含有至少部分成膜磷脂，或部分结合的脂质的微气泡已适当地功能化了，其可结合到任何期望的具有共同反应性互补基团的靶向配位体上。
然而，该靶向配位体不一定必须通过共价键结合到两亲性分子上。该靶向配位体还可通过物理型和/或静电型相互作用而适当地结合到微气泡上。例如，可向磷脂分子中引入具有高亲和力和对互补部分具有选择性的功能部分，而该互补部分将被连于靶向配位体上。例如，卵白素(或抗生蛋白链菌素)部分(对生物素具有高亲和力)可被共价连于微气泡稳定磷脂上而该互补生物素部分可被结合到适当的靶向配位体中，例如肽或抗体。该生物素标记的靶向配位体将因此通过卵白素-生物素偶联体系而与卵白素标记的微气泡结合。根据另一个替换实施方案，含生物素的磷脂可用作形成微气泡稳定包封物的化合物；然后使被结合到稳定包封物中的含生物素的磷脂先与卵白素(或neutravidin)反应，再与含生物素的配位体反应。磷脂和肽的生物素/卵白素标记的实例也公开于上述US 6139819中。作为选择地，van derWaal′s相互作用，静电相互作用和其他结合过程可将靶向配位体联合或连接到两亲性分子上。
本发明微气泡所定向的适宜特异靶器官的实例有，例如，纤维蛋白、活化血小板上的αvβ3受体或GPIIbIIIa受体。纤维蛋白和血小板实际上通常出现在“血栓”中，即可在血液中形成并造成血管阻塞的血块。适宜的连结肽公开在例如以上引述的US 6139819中。其他对纤维蛋白靶向特异性的连结肽公开在例如国际专利申请WO 02/055544中，在此将其引用作为参考。
其他重要的靶器官的实例包括易损斑块和肿瘤特异性受体，例如激酶结构域部位(kinase domin region(KDR))和VEGF(血管内皮生长因子)/KDR复合物。适用于KDR或VEGF/KDR复合物的连结肽公开在，例如，国际专利申请WO 03/74005和WO 03/084574中，在此都被引用作为参考。
方法
可通过用适当的本领域已知的乳剂生成技术处理水性介质和至少存在一种磷脂的核心溶剂而展开本发明方法的乳化步骤a)，上述已知技术例如有，超声、振动、高压均化、微观混合、薄膜乳化、高速搅拌或高剪切力混合，例如用转子-定子式均浆器。例如可使用诸如Polytrone PT 3000这样的转子-定子式均浆器。可根据溶剂组分，乳剂体积及装乳剂的容器直径和所期望的乳剂中乳剂微滴的最终直径而选择该转子-定子式均浆器的搅拌速率。一般而言，已发现，当使用将约3cm直径的探针浸入在装在3.5-5cm直径烧杯中的50-80ml混合物的转子-定子式均浆器时，约8000rpm的转速通常足以获得具有平均数值直径的微滴，这一直径已被充分降低以至在该冻干基质的冻干和重建后能得到具有小于约1.8μm直径的充气微气泡。通过增加搅拌速率至约12000rpm，一般可获得具有小于约1.5μm数量平均直径的充气微气泡，而当搅拌速率为约14000-15000rpm时，通常则获得约1.0μm或更低数量平均直径的充气微气泡。一般而言，已发现通过增加搅拌速度至约18000rpm以上，可进一步轻微降低微气泡尺寸。
作为选择地，还可用微观混合技术乳化该混合物。已知，微观混合器典型地包含至少两个进样口和至少一个出样口。因此通过第一个进样口将该有机溶剂加入到混合物中(例如以约0.05-5ml/分钟的流速)，而通过第二个进样口加入该水相(例如以2-100ml/分钟的流速)。然后使该微观混合器的出样口与含水的容器相连，从而使该水相在随后的瞬间从所述的容器中流出并流入含不断增量的乳化溶剂的微观混合器中。如增加溶剂的整体体积，则在额外预定的时间期间内，例如5-120分钟，通过微观混合器使来自容器的乳剂再循环，以使乳化完全。
根据乳化技术，可在乳化过程中逐渐加入有机溶剂，或在乳化开始之前一次加入。作为选择地，可将该水性介质在乳化过程中逐渐加入与水不混溶的溶剂中，或在乳化开始之前一次加入。优选，在水性介质与有机溶剂混合之前将磷脂分散到水性介质中。作为选择地，可在乳化步骤之前或期间将磷脂分散到有机溶剂中或单独加入水-有机混合物。
适宜在室温下，例如22℃±5℃的温度或更高，例如50℃-60℃(例如，如果核心溶剂的沸点高)，或在较低的温度下，例如，0℃-10℃(例如，当核心溶剂的沸点接近室温)，展开步骤的a)的乳化反应。优选将温度保持在低于有机溶剂的沸点，优选至少低于所述温度5℃，更优选低于10℃。因为如果混合物长期暴露在高温(例如90℃或更高)下，可能导致可能的磷脂降解，续而形成各自的溶血衍生物，通常优选避免在高温下的长时间加热。
如有必要，可对含磷脂的水性介质进行受控加热以促进其分散。例如，可在约60℃-70℃下加热含水性混悬液的磷脂约15分钟，然后将其冷却至室温，在该温度下进行乳化操作。
如前所述，还可向含磷脂的乳化混合物中加入附加的两亲性物质，例如那些在前列举的。所述附加的两亲性化合物的含量优选不高于两亲性物质总重量的约50％，更优选不高于20％重量比，下至例如约0.1％的含量。
如愿意，水性介质中还可进一步含有一种或多种赋形剂。
在此所用的术语“赋形剂”是指可用于本发明的任何添加剂，例如那些用于增加乳剂或冻干中间体稳定性和/或为了提供制可药用、稳定的终组合物的添加剂。
有关这方面的示范赋形剂有，例如，粘度增加剂和/或磷脂的助溶剂。
适合使用的粘度增加剂和助溶剂为，例如单或多糖，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖和葡聚糖，脂族醇，例如异丙醇和丁醇，多元醇，例如甘油、1，2-丙二醇等试剂。然而，我们发现通常没必要向本发明的造影剂中加入诸如粘度增加剂这样通常用于许多现存造影剂制剂中的添加剂。这也是本发明的另一个优势，即对受体施用的组分数量被降到最低，并且尽可能将造影剂的粘度保持很低。
如上所述，本申请人已发现基本上没必要向乳化混合物中加入水不溶性结构剂，例如胆固醇。事实上，已发现，0.05％(相对于乳化混合物总重量的w/w)的胆固醇将显著降低从微滴向充气微泡的转化产率，从而进一步导致气泡粒度的广泛分布。因此水不溶性化合物，尤其那些在其结构中不含一个或两个脂肪酸残基的化合物在乳化混合物中的含量，优选低于乳剂总重量的0.050％重量比，更优选低于约0.030％。
为了除去水相中多余的磷脂(未与乳剂结合)并分离和除去任选的添加剂例如粘度增加剂和助溶剂，以及不期望有的物质例如胶粒，过小或过大乳滴，可有利地在冻干步骤b)之前将根据步骤a)制备的乳剂进行一次或多次洗涤操作。这些洗涤可被本身已知的方式影响，利用诸如滗析、浮集、离心、交流过滤等技术分离乳剂。
如果预计进行洗涤操作，而且如果生成乳剂前就在原始水相中存在冻干保护剂，那么可用含一种或多种冻干保护剂的水溶液进行所述洗涤操作从而弥补在洗涤过程种部分损失的冻干保护剂含量。在另一方面，如果在乳化的水-有机混合物中不存在冻干保护剂，那么为了向乳化混合物中引入冻干保护剂，可用含冻干保护剂的水溶液洗涤形成的乳剂，或，作为选择地，在冻干之前，洗涤后加入冻干保护剂。
如愿意，为了进一步降低大尺寸微气泡在终重建混悬液中的含量，可在冻干之前对该乳剂(就以此或经洗涤之后)进行超滤或微过滤操作。在微过滤过程中，例如用5μm或3μm的过滤器，实际上大尺寸的微滴被过滤器截留并被分离出剩余的小尺寸微滴，由此防止在冻干物质的重建中形成大尺寸微气泡。根据常规技术，例如正过滤、真空过滤或流线过滤可完成微过滤。过滤膜可为尼龙、玻璃纤维、纤维素、纸、聚碳酸酯或聚酯(Nuclepore)膜。
根据一个另选实施方案，根据上述教导，可在形成乳剂之后，经过或不经过洗涤步骤，加入另外的两亲性化合物。尤其，为了向稳定的包封物中加入所述化合物，优选在搅拌和加热(优选至少超过80℃，例如40℃-80℃，尤其50℃-70℃)下，向形成的乳剂中加入期望的化合物的水性混悬液。该另选实施方案尤其可用于向稳定层中后续引入如向初始乳剂混合物中加入便相反会对终产品性质产生负面影响的两亲性化合物。适宜在初始乳剂制备好后，作为稳定包封物的添加成分而被后续加入两亲性化合物的实例有，例如，PEG-修饰的磷脂，尤其PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺，例如DMPE-PEG750、DMPE-PEG1000、DMPE-PEG2000、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG4000、DMPE-PEG5000、DPPE-PEG750、DPPE-PEG1000、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG750、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000、DAPE-PEG750、DAPE-PEG1000、DAPE-PEG2000、DAPE-PEG3000、DAPE-PEG4000或DAPE-PEG5000。同样地，根据这一方法还可适宜地后续加入带有反应部分或靶向配位体(例如含生物素、马来酰亚胺或马来酰亚胺-肽)的PEG-修饰的磷脂。此外，还可将该技术用于向稳定层组合物中后续加入其他成分，例如脂肽或聚合物表面活性剂。在形成乳剂后可适宜地加入的聚合物表面活性剂的实例是，例如，环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物，例如Pluronic F68、Pluronic F108、Pluronic F-127(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙基化烷基醚，例如Brij78(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙烯脂肪酸酯例如Myrj53或Myrj59(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如Tween60(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；或聚乙二醇叔-辛基苯基醚，例如TritonX-100(Sigma Aldrich，Missouri，USA)。
实际上本申请人已发现，根据本发明的方法，使用含有限量(例如低于10％重量比)的PEG修饰的磷脂(例如DSPE-PEG或DPPE-PEG)与成膜磷脂(例如DPPS或50∶50的DAPC/DPPS)的混合物制备乳剂，与由只含成膜磷脂的乳剂制得的微气泡的粒度分布相比，测定出其终产物中的粒度分布具有实质性的增宽。在另一方面，如果先制备只含成膜磷脂的乳剂然后再向所得乳剂(例如在约60℃下搅拌1小时)中加入PEG修饰的磷脂的水性混悬液，就会发现，在稳定的包封物中可在基本不因想终产品粒度分布的情况下混合相当高含量(通常超过30％重量比)的PEG修饰的磷脂。
根据一个优选实施方案，在冻干步骤之前对该乳剂进行附加的受控加热处理。对该乳剂的附加加热优选在密封容器中进行。该加热处理可在约15分钟-约90分钟范围内变化，其温度约为60℃-约125℃，优选约80℃-约120℃。一般而言，温度越高，热处理的时间就越短。加热期间可任选地搅拌乳剂。
正如申请人所发现的，虽然附加加热处理可能导致磷脂的部分降解(例如，当乳剂在约100-120℃下加热约30分钟，终产品中约5-20％w/w的溶血脂质)，但是它具有很大的优点，即不受初始乳化步骤的工作条件(例如有机溶剂的类型、乳化技术、任选的洗涤步骤等)的影响，可使得终产品中的粒度分布变窄并增加了微气泡的总数量。
然后可冻干经热处理的乳剂，通常不需要进行进一步洗涤。
可用本身已知的方法和设备，通过初始冷却该溶剂并接着冻干该冷冻乳剂而进行根据步骤b)的乳剂冻干操作。由于在给药前，正常情况下需要用附加的载体液体重建该干燥、冻干制品，因此在冻干前可有利地将该乳剂装入适于销售的管形瓶中以便使每个管形瓶含有准确的剂量，例如用于重建为注射用形式的冻干制品的单剂量单位。通过在独立的管形瓶中而非大批冻干乳剂，可避免对冻干制品易受损的蜂窝样结构进行处理及至少部分破坏其结构的危险。
冻干后，可通过加入为了在造影剂的终制剂中形成微气泡的所需气体而除去在冷冻干燥器中的真空。这将使管形瓶的顶部充满所需气体，然后再用适当封闭方法密封管形瓶。作为选择地，可将管形瓶置于真空中并密封，而在较晚的阶段加入气体，例如就在给药前，例如当气体为放射性或超极化气体时。
如此获得的含适宜气体的冻干产品由此可在通过将其溶于水性载体以获得充气微气泡的混悬液的重建之前，被稳定地保藏几个月。
可使用任何可填充上述微泡的气体、气体前体或其混合物，该气体的选自依赖于所选的用药程式。
该气体可含有，例如，空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；一氧化二氮；稀有或惰性气体例如氦、氩、氙或氪；放射性气体例如Xe133或Kr81；超极化稀有气体例如超极化氦、超极化氙或超极化氖；低分子量烃(例如含不超过7个碳原子)，例如，诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷的烷烃，诸如环丁烷或环戊烷的环烷烃，诸如丙烯、丁烯或异丁烯的烯烃或炔，诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选氟化气体，例如或卤代、氟化或全氟化低分子量烃(例如含高至7个碳原子)；或任何前述气体的混合物。如使用卤代烃，优选在所述化合物中的至少一些，或更优选全部卤原子都为氟原子。
优选氟化气体，尤其是全氟化气体，尤其是在超声成像领域中。氟化气体包括含至少一个氟原子的物质，例如，氟化烃(含一个或多个碳原子和氟的有机化合物)；六氟化硫；氟化，优选全氟化酮，例如全氟化丙酮；和氟化，优选全氟化的醚，例如全氟乙醚。优选化合物为全氟化气体，例如SF6或全氟化碳(全氟化烃)，即所有的氢原子都被氟原子取代的烃，已知它可形成特别稳定的微气泡混悬液，例如在EP 0554213中公开的，在此将其引用作为参考。术语全氟化碳包括饱和，不饱和和环全氟化碳。生物相容的，生理上可接受的全氟化碳的实例有：全氟烷，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟-n-丁烷，任选于其他异构体例如全氟-异丁烷混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃，例如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟丁-2烯)或全氟丁二烯；全氟炔烃(例如全氟丁-2-炔)；和全氟环烷烃(例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷)。优选饱和的全氟化碳具有通式CnFn+2，其中n为1-12，优选2-10，更优选3-8，再更优选3-6。适宜的全氟化碳包括，例如，CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C6F14、C7F14、C7F16、C8F18和C9F20。
尤其优选的气体为SF6或选自CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10的全氟化碳及其混合物；SF6、C3F8、C4F10尤其优选。
可有利地使用上述任何气体以任何比例的混合物。例如，该混合物可包含常规气体，例如氮气、空气或二氧化碳和形成稳定微气泡混悬液的气体，例如如上所示的六氟化硫或全氟化碳。适当的气体混合物的实例可在例如WO 94/09829中找到，在此将其引用以做参考。以下组合尤其优选：气体(A)和(B)的混合物，其中气体(B)为氟化气体，优选选自SF6、CF4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12或它们的混合物，并且(A)选自空气、氧气、氮气、二氧化碳或它们的混合物。气体(B)的含量为总混合物约0.5％-约95％v/v，优选约5％-80％。
在一些情况中，需要向气体物质中加入前体(即能够在体内转化成气体的物质)。气体前体和从此衍生的气体优选为生理上可接受的。该气体前体可为pH活化的，光活化的，温度活化的等。例如，某些全氟化碳可被用作温度活化的气体前体。这些全氟化碳，例如全氟戊烷或全氟己烷具有高于室温(或该产生或保藏该制剂的温度)，但低于体温的液/气相变温度；因此，它们在人体内经历了液/气相变并转化为气体。此外，此处所用的术语“气体”包括在正常人体温度37℃下蒸汽形式的混合物。因此，在37℃下为液体的化合物还可以有限含量与其他气体化合物混合从而获得在37℃下为蒸汽相的混合物。
用于超声回波描记时，该生物相容气体或气体混合物优选选自空气、氮气、二氧化碳、氦、氪、氙、氩、甲烷、卤代烃(包括氟化气体例如全氟化碳和六氟化硫)或它们的混合物。有利地可使用全氟化碳(尤其是C4F10或C3F8)或SF6，任选地与空气或氮气混合。
当用于MRI时，微气泡优选包含超极化稀有气体例如超极化氖、超极化氦、超极化氙、或它们的混合物，任选地与空气、CO2、氧气、氮气、氦、氙、或任何一个上述定义的卤代烃混合。
当用于闪烁显像时，本发明的微气泡将优选包含放射性气体例如，Xe133或Kr81，或它们的混合物，任选地与空气、CO2、氧气、氮气、氦、kripton、或任何一个上述定义的卤代烃混合。
该冻干组合物与气体接触后，只需要在最小程度搅拌的情况下，例如由手轻微振动产生的，便可很容易通过加入适当的无菌含水注射用和生理可接受的载体液体而被重建，这种载体液体例如无菌无热源注射用水，诸如生理盐水(其有利地处于平衡状态从而使得注射用的终产品不会为低渗)的水溶液，或一种或多种诸如盐(例如含生理耐受的抗衡离子的血浆阳离子的盐)这样的张度调节物质的水溶液，或糖、糖醇、二元醇和其他非离子多元醇物质(例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)。
正如申请人所发现的，如此获得的重建微气泡的数量平均直径通常稍微低于乳剂微滴的数量平均直径。微气泡的数量平均直径通常时乳剂微滴的数量平均直径的约60％-约90％。在多数情况下，只观测到具有微滴约70-75％平均数量直径的微气泡的平均数量直径。当干燥产品置于管形瓶中时，适宜用隔膜密封，通过该隔膜用任选预装注射器可注射该载体液体；作为选择地，可在二元仓设备例如双室注射器中一起提供该干燥产品和载体液体。可有利地在重建后混合或轻轻振动产品。然而，如上所述，在本发明的稳定造影剂中，气体微气泡的尺寸可基本上不受对重建的干产品施用的搅拌能量的大小的影响。相应地，为了获得具有一致微气泡尺寸的可重现产品，不需要不超过轻微手振动的搅拌。
在水或水溶液中重建产生的微气泡混悬液可在至少12小时内保持稳定，因此，对于在注射前何时重建该冻干产品，可允许相当的灵活性。
除非其含有已知需要特殊保藏条件的超极化气体，否则可在不需要对其环境的温度进行控制的情况下，储藏该冻干残余物，尤其，可将其以现场制备成即用可给药的混悬液的制剂形式提供给医院或医生，而不需要这些使用者具有特殊的储藏设备。
在这种情况下优选以其双组分试剂盒的形式提供。
所述双组分试剂盒可包括两个独立的容器或双室容器。在第一种情况下，该容器优选常规的隔膜密封的管形瓶，其中含有步骤b)的冻干残余物的管形瓶用隔膜密封，通过该隔膜用任选预装注射器可注射该载体液体。在这种情况下，使用的作为第二组分容器的注射器还可接着用于注射造影剂。在后一种情况下，该双室容器优选为双室注射器，一旦冻干制品被重建，并随后被适当地混合或轻轻振动，该容器就可直接用于注射造影剂。在这两种情况下，都提供了将充足的形成气泡的能量引入容器的内容物的方式。然而，如上所述，在本发明的稳定造影剂种，气体微气泡的尺寸基本上不受对重建的冻干产品所使用的搅拌能量大小的影响。相应地，为了获得具有一致微气泡尺寸的可重现产品，不需要不超过轻微手振动的搅拌。
可理解的是，对本领域的普通技术人员来说，其他能够将冻干粉末与水溶液以无菌方式混合的两室重建体系也落在本发明的范围内。换言之，如果水相可被插入到水不溶性气泡与环境之间，其尤其有利于延长产品的贮存期限。如果形成造影剂必要的物质不在容器中(例如在重建过程中将连于磷脂的靶向配位体)，它可被包装在试剂盒的另一个组分中，优选以便于与试剂盒中其他组分立即混合的形式或在这样的容器中。
不需要特殊的容器、管形瓶或连接体系；本发明可使用常规容器、管形瓶和适配器。仅有的要求就是在塞子和容器之间的良好密封。因此，密封的质量变成了主要关注的问题；任何密封完整性的降级都会使不期望的物质进入管形瓶。除了确保无菌，真空贮留对于在周围气压或减压下塞阻产品以保安全适当的重建至关重要。至于塞子，其可为基于弹性体的化合物或多组分制剂，例如聚(异丁烯)或丁基橡胶。
通过本发明方法获得的造影剂可用于多种诊断成像技术中，包括尤其是超声和磁共振中。其他可能的诊断成像应用包括闪烁显像，光影像和X射线成像，包括X射线相差造影成像。
它们在诊断超声成像和MR成像中的应用，例如，作为易感性造影剂和超极化气泡，构成了本发明的优选特征。多种成像技术可用于超声应用中，例如包括基谐波和谐波B型成像，脉冲或反相成像和基谐波和谐波多普勒显像；如愿意，还可使用三维成像技术。
兔子、狗和猪的体内超声试验显示在静脉注射0.001ml/kg体重的低剂量后本发明造影剂可增强来自15-25dB心肌的反向散射信号强度。用更灵敏的技术例如彩色多普勒或电力脉冲倒置，可在更低剂量处观察到信号。已发现在这些低剂量处，充血室例如心室中的衰减足够低以至于可目测观察到心肌脉管系统中的兴趣区。试验证明这些将通过全血池分布的静脉注射的造影剂因此增强了所有血管化组织的产生回声性，并进行再循环。还发现它们可用作普通的多普勒信号增强助剂，并还可用于超声计算机断层成像及生理上激发的或间歇成像中。
对于超声应用例如超声心动描记，为了保证肺系中的自由通行并与优选约0.1-15MHz的成像频率产生共振，通常使用具有0.1-10μm，例如0.5-7μm的平均尺寸的微气泡。如上所述，为了获得在有利于超声心动描记范围内的微气泡分散系，可生产具有非常窄粒度分布的本发明造影剂，从而大大增强它们的产生回声性及它们在体内的安全性，并赋予造影剂在诸如血压测量、血流示踪和超声断层成像这样的应用中特殊的优点。
在超声应用中，可以以下剂量施用本发明造影剂，即例如使注射的磷脂在0.1-200ug/kg体重，通常当对乳剂不进行洗涤步骤时10-200ug/kg，及如在冻干前洗涤乳剂，则0.1-30ug/kg的含量范围内。可理解的是，使用如此低水平的磷脂在最小化可能存在的毒副作用方面是相当有利的。此外，在有效剂量中的低水平磷脂可使剂量增加从而在不出现不良影响的情况下延长观测时间。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明的方法使得能够获得小粒径，显示出极窄粒度分布的充气微气泡。因此，通过适当选择混合物的组分及在水-有机混合物的乳化过程中施用特定大小的搅拌能量，就有可能获得具有预期数量平均直径和粒度分布的充气微气泡。
尤其，通过使用本发明的方法，就有可能获得包含磷脂稳定的小粒径气体微气泡，以具有相对较小平均尺度和尤其有益窄和受控的粒度分布为特征的造影剂。
如本领域的技术人员所知，微/纳米颗粒的尺度和它们各自的粒度分布可以参数数量表征，最常用的是数量平均直径DN，数量中位直径DN50，体积平均直径DV和体积中位直径DV50。数量直径提供了颗粒平均数量尺度的指示，而体积直径提供了颗粒整体体积如何在整体数量中分布的信息。由于极少数大体积颗粒在小体积颗粒群体中的存在会导致相应的DV值像高值方向移动，因此，有时使用DV50值评价颗粒群体的分布更加方便。DV50是显示颗粒内部体积总值的一半在具有低于DV50直径的颗粒中的计算值；这就降低了意外形成的大体积颗粒在粒度分布的评估中的影响。显然，单一尺寸的颗粒显示出一致的DN、DN50、DV和DV50值。在另一方面，不断拓宽的颗粒分布将导致各个数值之间出现巨大差异，相应地出现其各个比例的变化(例如DV/DN比例的增加)。例如，主要含小颗粒(例如约2μm的直径)与相反小比例的大颗粒(例如直径超过8μm)的颗粒群体显示出相对于DN值，较高的DV或DV50值，相应地较高的DV/DN或DV50/DN比例。
因此发现本发明的方法尤其适于制备具有低于1.70μm的数量平均直径(DN)和使得DV50/DN比例约为2.30或更低，优选低于2.10的体积中位直径(DV50)的微气泡。所述DN值优选为1.60μm或更低，更优选1.50μm或更低，再更优选1.30μm或更低。用本发明的方法很容易获得具有较低DN值，例如约1μm或更低，例如0.85μm并下至0.80μm的微气泡。DV50/DN比例优选约1.80或更低，更优选约1.60或更低，再更优选约1.50或更低。可很容易地获得具有较低DV50/DN比例，例如1.20及更低，例如1.05的微气泡。
此外，在根据本发明可获得的小尺寸窄分布微气泡的混悬液中，观测到直径大于3μm的微气泡数量(表示为占颗粒总数量的颗粒百分比)，尤其是DN低于约1.5μm而且DV50/DN比例低于约2.00的微气泡，通常低于混悬液中微气泡总数量的约3％，优选低于约2％，更优选低于约1％。在重建混悬液总的微气泡浓度通常为至少1×108颗粒每毫升，优选至少1×109颗粒每毫升。
上述DV50、DN值以及微气泡的数量是指通过设置在30μm孔径，和0.7-20μm的测量发范围的库尔特粒度仪Mark II仪器测量的结果。
这类特殊的造影剂在超声成像中，尤其用于如下解释的依赖于微气泡的非线性散射的成像技术时，尤其有价值。
最近的超声造影成像技术是利用超声造影剂的非线性散射特点。从文献(例如Eatock等，Journal of the Acoustical Society ofAmerica，vol.77(5)，pp1692-1701，1985)中可知，非线性散射只对比共振尺寸小或与其接近的微气泡具有显著意义。尤其可方便地利用具有共振尺寸一半尺度的微气泡。“共振尺寸的一半”是指具有发射超声波的中心频率(其对于特定应用，可具有高达约60MHz)两倍大共振频率的微气泡的尺寸。当对一批含基于微气泡的超声造影剂进行成像时，该微气泡对组织回声的回声的可探测性通过微气泡的非线性散射水平而增强，并通过由位于探针和兴趣区之间的微气泡导致的衰减而降低。沿发射通路的衰减减小了可用于发生非线性气泡感应的超声能量；沿接收通路的衰减消除了能够到达超声探针的回声能量。对于含广泛微气泡粒度分布的混悬液，主要由共振尺寸和大于共振尺寸的微气泡，在不以有效促成非线性回声信号的情况下，促成发射-接收衰减。因此，对非线性成像的整体声学感应大大受益于对具有窄粒度分布和接近共振尺寸一半大平均尺寸的微气泡的标刻度设定的使用。优选使用具有相应于约2.30或更低，优选2.10或更低，更优选2.00或更低的DV50/DN比例的粒度分布的微气泡。使用的微气泡的平均尺寸优选约共振尺寸一半的10％，更优选约共振尺寸一半的5％。
因此，本发明的另一个方面涉及一种诊断成像的方法，其包括对受体施用造影增强含量的包括具有如上说明的尺寸和粒度分布的充气微气泡的造影剂，及对所述受体的至少部分进行成像。尤其，所述的诊断成像包括通过超声仪器以预定发射频率发出的超声波使所述受体接受超声波的作用，由此可测定相应的微气泡共振尺寸，并施用造影剂，其含具有窄粒度分布和接近共振尺寸一半大的平均尺寸的充气微气泡。微气泡的窄粒度分布和平均尺寸优选如上定义。例如，可在诊断成像法中使用Philips的HDI 5000超声仪(例如，以脉冲倒置模式，带L7-4探头和0.07的机械指数)。根据这一方法，所述受体是脊椎动物，并使所述造影剂进入脉管系统或进入所述脊椎动物的体腔。可以试剂盒的形式提供所述造影剂，例如那些在前描述的，包含与用于重建的气体和水性介质接触的冻干产品。
给出以下非限定性实施例以更好说明本发明。
实施例：
下列实施例中使用了以下物质。
磷脂：
DPPS    二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(Genzyme)
        IUPAC：1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DPPG    二棕榈酰基磷脂酰甘油钠盐(Genzyme)
        IUPAC：1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]
DSPA    二硬脂酰基磷脂酸钠(Genzyme)
        IUPAC：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸盐
DSPG    二硬脂酰基磷脂酰甘油钠盐(Genzyme)
        IUPAC：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸)
DSPC    二硬脂酰基磷脂酰胆碱(Genzyme)
        IUPAC：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DSEPC   二硬脂酰基乙基磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids)
        IUPAC：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱
DAPC    二花生酰基磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids)
        IUPAC：1，2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DSTAP   1，2-二硬脂酰基-3-三甲铵-氯化丙烷(Avanti PolarLipids)
DSPE-
PEG2000 由PEG2000修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，
        钠盐(Nektar Therapeutics)
DSPE-
PEG5000 由PEG5000修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，
        钠盐(Nektar Therapeutics)
DSPE-
PEG2000-
马来酰亚胺  由PEG2000马来酰亚胺修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
            (Avanti Polar Lipids)
SATA    N-琥珀酰亚胺基-S-乙硫酰醋酸酯(Pierce)
RGD-4C  H-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-NH2
        (AnaSpec Inc.)
溶剂：
全氟-n-己烷(C6F14)，由Fluka提供
全氟甲基环己烷(CF3-环-C6F11)，由Fluka提供
全氟-n-庚烷(C7F16)，由Fluka提供
全氟-n-壬烷(C9F20)，由Aldrich提供
全氟萘烷，由Aldrich提供
环己烷，由Fluka提供
环辛烷，由Fluka提供
n-癸烷，由Fluka提供
n-辛烷，由Fluka提供
间二甲苯，由Fluka提供
二异丙基紫罗兰酮，由Fluka提供
CCl4，由Fluka提供
冻干保护剂：
甘露糖，由Fluka提供
葡萄糖，由Fluka提供
山梨糖醇，由Fluka提供
甘露醇，由Fluka提供
麦芽糖，由Fluka提供
葡聚糖6000，由Fluka提供
葡聚糖15000，由Fluka提供
葡聚糖40000，由Fluka提供
菊粉，由Fluka提供
微滴和微气泡的特征
测量乳剂微滴的粒度分度：
a)当对乳剂进行洗涤时，用库尔特粒度仪(将Counter Mark II仪器调节在30μm孔径0.7-20μm测量范围)；在室温下用100ml盐水稀释10μl乳剂，并在测量前将乳剂平衡3分钟；
b)如果还没有对乳剂进行洗涤操作，使用激光散射粒子分选机(Malvern Mastersizer，稀释200倍，焦距45mm，标准显示)。
用Counter Mark II仪器，将其调节在30μm孔径，选择0.7-20μm测量范围，测量粒度分布，体积浓度和微气泡的数量(冻干和用水相重建后)。用100ml盐水在室温下稀释50μl的微气泡样品，并在测量前平衡3分钟。
用HPLC-MS分析，以以下设置测定磷脂在最终制品(微气泡混悬液的乳剂)中的含量：Agilent 1100LC色谱仪，源自Maherey Nagel的MN CC 125/2mm-5C8柱，Agilent MSD G1946D检测仪。
冻干
冻干方法和仪器如下。先在-45℃下将乳剂(任选在洗涤步骤之后，如存在)冷冻5分钟，然后在室温和0.2mbar的压力下用Christ-Alpha 2-4冷冻干燥器将其冷冻干燥(冻干)。
实施例1(制品1a-1n)
将10mg的DPPS加入到约10ml的10％(w/w)甘露醇水溶液中；在65℃下加热该混悬液15分钟，然后冷却至室温(22℃)。将全氟庚烷(8％v/v)加入到水相中，然后在约4cm的烧杯中用高速均浆器(Polytron T3000，探针直径为3cm)以表1所示的速度将其乳化1分钟。所得乳剂微滴的体积的中位直径(DV50)和数量的平均粒径(DN)显示在表1中。然后将乳剂离心(800-1200rpm，10分钟，Sigma离心机3K10)从而除去多余的磷脂，回收分离的小丸(微滴)，以初始体积的10％甘露醇水溶液再混悬该乳剂。
然后将洗过的乳剂收集到100ml的用于冻干球形玻璃瓶中，根据上述标准程序将其冷冻然后冷冻干燥。然后将冻干的产品置于含35％全氟-n-丁烷和65％氮气的气体中，接着通过手轻微抖动，将其分散于两倍初始体积的水中。用库尔特粒度仪分析用蒸馏水重建所得的微气泡混悬液。微气泡在所得的混悬液中的浓度约为1×109粒每ml。微气泡的体积的中位直径(DV50)，体积的平均粒径(DV)，数量的平均粒径(DN)，以及直径大于3μm的微气泡含量分别显示在表1中(微气泡总数量的百分比)。如果以相同的搅拌速率下进行了多于一个的实施例，那么表1所示的数值是指每个参数的平均计算值。
表1
  实施例                 乳剂                          充气微气泡
  搅拌(rpm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DN(μm)   DV50/DN   ＞3μm(％)
  1a   8000   4.58   1.77   2.92   3.33   1.51   1.93   5.44
  1b   9000   4.66   1.94   3.19   3.45   1.53   2.08   6.61
  1c   10000   3.04   1.74   2.16   2.53   1.33   1.62   1.88
  1d   11000   3.05   1.80   2.17   3.33   1.32   1.65   1.55
  1e   12000   2.84   1.69   1.86   2.17   1.24   1.50   0.93
  1f   12500   2.79   1.68   1.75   2.05   1.22   1.44   0.65
  1g   14000   2.20   1.52   1.39   2.45   1.08   1.29   0.23
  1h   14500   2.00   1.38   1.19   1.39   1.01   1.19   0.06
  1i   15000   1.88   1.39   1.22   2.20   1.01   1.21   0.06
  1j   15500   2.19   1.48   1.24   1.46   1.02   1.22   0.11
  1k   16000   1.83   1.32   1.27   3.08   0.99   1.28   0.10
  1l   17000   1.40   1.12   0.91   1.03   0.87   1.05   0.01
实施例2(制品2a-2j)
采用与实施例1相同的步骤，仅有区别在于磷脂为DPPS(20％w/w)和DSPC(80％w/w)的混合物，磷脂的含量不变。结果总结在表2中。
表2
  实施例               乳剂                         充气微气泡
  搅拌(rpm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DN(μm)   DV50/DN   ＞3μm(％)
  2a   6000   8.75   3.07   7.55   9.05   2.27   3.33   21.81
  2b   10000   3.45   1.90   3.00   3.71   1.47   2.04   5.05
  2c   12000   3.04   1.83   2.45   3.73   1.32   1.85   2.15
  2d   12500   2.85   1.76   2.21   3.24   1.27   1.74   1.57
  2e   13000   2.98   1.83   2.25   3.04   1.28   1.76   1.76
  2f   13500   2.91   2.05   1.88   2.46   1.20   1.57   0.87
  2g   14000   2.45   1.67   1.82   2.66   1.16   1.57   0.57
  2h   14500   2.18   1.55   1.58   3.04   1.09   1.44   0.38
  2i   15000   1.94   1.42   1.34   1.96   1.04   1.28   0.31
  2j   16000   1.81   1.38   1.35   2.30   1.03   1.31   0.14
实施例3(制品3a-3p)
采用与实施例2相同的步骤，仅有的区别在于DPPS/DSPC重量比例不同，如表3中所记载的。结果总结在表3中。
表3
  实施例   DPPS/DSPC比例               乳剂                       充气微气泡
  搅拌(rpm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50/DN   ＞3μm(％)
  3a   80/20   12000   2.44   1.54   1.68   1.19   1.41   0.48
  3b   75/25   12000   2.53   1.66   1.73   1.18   1.47   0.62
  3c   60/40   11000   3.53   1.86   2.75   1.45   1.90   4.00
  3d   60/40   12000   2.62   1.60   1.78   1.21   1.47   0.72
  3e   60/40   14000   2.36   1.60   1.59   1.13   1.41   0.36
  3f   50/50   12000   2.81   1.68   2.28   1.30   1.75   2.05
  3g   40/60   11000   3.00   1.72   2.44   1.32   1.85   2.31
  3h   40/60   12000   2.88   1.75   2.07   1.27   1.63   1.45
  3i   40/60   13000   2.61   1.69   1.76   1.16   1.52   0.57
  3j   40/60   14000   2.06   1.43   1.41   1.07   1.31   0.23
  3k   40/60   14500   2.39   1.67   1.64   1.15   1.43   0.49
  3l   30/70   11000   3.12   1.75   2.64   1.37   1.93   2.76
  3m   30/70   12000   3.08   1.81   2.38   1.34   1.78   2.45
  3n   25/75   11000   3.15   1.85   2.46   1.31   1.88   2.15
  3o   10/90   11000   3.72   2.26   3.14   1.47   2.13   4.60
  3p   5/95   11000   4.53   2.23   4.08   1.54   2.65   6.35
实施例4
采用与实施例2相同的步骤，仅有的区别在于制备了不同重量比例的DSPA和DPPS的混合物。结果总结在表4中。
表4
  实施例   DSPA/DPPS比例               乳剂                          充气微气泡
  搅拌(rpm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50/DN   ＞3μm(％)
  4a   25/75   12000   2.61   1.63   1.94   1.24   1.56   1.07
  4b   50/50   11000   2.81   1.86   2.35   1.39   1.69   2.67
  4c   50/50   12000   2.35   1.57   1.84   1.19   1.55   0.74
  4d   75/25   12000   2.50   1.65   2.11   1.27   1.66   1.45
实施例5(制品5a-5i)
用实施例1中相同的步骤，仅有的区别在于使用了1/1(w/w)的DPPG和DSPC磷脂混合物(总浓度为1.0mg/ml)与10％w/w(相对于磷脂总重量)棕榈酸的混合物。结果总结在表5中。
表5
  实施例                 乳剂                     充气微气泡
  搅拌(rpm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50/DN   ＞3μm(％)
  5a   6000   10.02   2.64   6.87   2.07   3.32   18.00
  5b   8000   5.31   2.49   3.73   1.62   2.30   7.97
  5c   9000   5.04   2.69   3.20   1.55   2.06   6.22
  5d   10000   3.82   2.02   2.85   1.38   2.07   2.65
  5e   10500   3.36   1.96   2.51   1.32   1.89   2.44
  5f   11000   3.22   1.87   2.31   1.28   1.81   1.41
  5g   12000   2.69   1.61   1.74   1.14   1.53   0.52
  5h   13000   2.28   1.56   1.56   1.07   1.46   0.23
  5i   14000   2.00   1.44   1.30   1.00   1.30   0.26
实施例6
采用与实施例1相同的步骤，仅有的区别在于将DSEPC用作磷脂，并用全氟己烷作为有机溶剂。采用11000rpm的转速。尺寸、粒度分布和直径大于3μm的微气泡的百分比例如下所示。
DV50(μm)   DN(μm)     DV50/DN   ＞3μm(％)
1.65        1.11          1.49        0.30
实施例7(制品7a-71)
在70℃下加热含作为磷脂的DPPS(10mg)的蒸馏水(10ml)15分钟，然后将其冷却至室温。用高速均浆器(Polytron T3000)以10000rpm每分钟的速度，在水相中乳化表6中所示的0.8ml的有机溶剂。将该乳剂加入到10ml的15％葡聚糖15000溶液，冷冻并冻干(0.2mbar，24小时)。冻干后，向冷冻干燥器中通入空气。用库尔特粒度仪分析用蒸馏水重建后获得的微气泡混悬液。表6简要显示了微气泡的尺寸和粒度分布方面的结果。
表6
  实施例   溶剂   DV50(μm)   DN(μm)   DV50/DN
  7a   C6F14   2.77   1.44   1.92
  7b   CF3-环-C6F11   2.24   1.30   1.72
  7c   C7F16   2.48   1.40   1.77
  7d   C9F20   2.46   1.36   1.81
  7e   全氟萘烷   3.76   1.52   2.47
  7f   环己烷   2.61   1.41   1.85
  7g   环辛烷   2.43   1.35   1.80
  7h   癸烷   2.01   1.12   1.79
  7i   辛烷   2.87   0.96   2.99
  7j   间二甲苯   2.45   1.21   2.02
  7k   二异丙基紫罗兰酮   1.83   1.05   1.74
  7l   CCl4   1.90   1.27   1.50
实施例8
用全氟己烷作为有机溶剂，用同样的方法重复实施例7，不同浓度的不同冻干保护剂显示在表7中。表7简要显示了微气泡的尺寸和粒度分布方面的结果。
表7
  实施例   冻干保护剂及浓度(w/w)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50/DN
  8a   甘露糖5％   4.35   1.90   2.29
  8b   葡萄糖5％   2.59   0.96   2.70
  8c   山梨糖醇5％   3.84   1.40   2.74
  8d   甘露醇10％   2.22   1.22   1.82
  8e   甘露醇5％   2.24   1.21   1.85
  8f   甘露醇4％   2.54   1.45   1.75
  8g   麦芽糖5％   3.42   0.99   3.45
  8h   葡聚糖60007.5％   3.30   1.48   2.23
  8j   葡聚糖150005％   2.55   1.31   1.95
  8k   葡聚糖150007.5％   2.77   1.44   1.92
  8i   葡聚糖400007.5％   2.54   1.32   2.29
  81   菊粉5％   3.58   1.43   2.70
实施例9(制品9a-9e)
通过以10000rpm的速率乳化混合物重复实施例1。此外，如表8所示，通过在乳化前向水相中加入不同量的PluronicF68(相当于聚羟亚烃188的泊洛沙姆)，重复实施例1。表8显示了在粒度分布和微气泡转化产率方面的比较试验结果。转化产率是指在冻干基质重建中形成的充气微气泡的数量占乳剂中被测定的微滴数量的百分比。
表8
实施例   Pluronic*(mg/ml) DV50 DN DV50/DN   转化产率(％)
  9a   0   2.42   1.38   1.75   28.0
  9b   0.25   4.64   1.97   2.36   18.8
  9c   0.5   13.85   1.38   10.04   7.3
  9d   1.0   12.59   1.49   8.45   3.2
  9e   2.0   15.80   1.23   12.85   0.5
*浓度是指水相体积。
上述结果显示了当泊洛沙姆浓度相当于磷脂浓度的一半(即约33％混合物中表面活性剂的总重量)时，微气泡的转化产率和粒度分布都受到了负面影响。
实施例10(制品10a-10d)
重复实施例9，然而在乳化之前向有机相中加入不同量的胆固醇(由Fluka提供)而不是向水相中加入PluronicF68，如表9所示。表9中的结果显示了微气泡在粒度分布和转化(从乳剂的微滴)产率方面的比较试验结果。
表9
实施例   胆固醇*(mg/ml) DV50 DN DV50/DN   转化产率(％)
  10a   0   2.42   1.38   1.75   28.0
  10b   0.10   3.79   1.31   2.89   17.8
  10c   0.25   1.35   1.05   1.28   5.7
  10d   0.50   14.02   1.70   8.25   0.8
*浓度是指水相的体积。
上述结果显示了在水相中胆固醇以0.050％(w/w)的浓度，微气泡的转化产率和粒度分布都很大程度地受到了负面影响。然而以0.025％的浓度，却可产生微气泡的可接受的尺寸和粒度分布，但是转化产率仍然很低。
实施例11
在70℃下加热含60mgDPPS和3g甘露醇的蒸馏水(30ml)15分钟，然后将其冷却至室温。用高速均浆器(Polytron，12500rpm，1分钟)在该水相中乳化全氟庚烷。将获得的具有2.3μm体积中位直径(DV50)和2.0μm数量平均粒径的乳剂用离心法洗涤一次，在30ml 10％甘露醇的蒸馏水溶液中将其重悬，然后将其分成3份(3×10ml)。第一份(A)用于接下来的冻干步骤。第二份(B)被收集到注射器中并将其手推注射通过一个5μm的Nuclepore过滤器(47mm-聚碳酸酯)。用同样的方法将第三份(C)过滤通过3μm的Nuclepore过滤器(47mm-聚碳酸酯)。在100ml的球形玻璃瓶中冷冻该乳剂(-45℃5分钟)，然后再将其冷冻干燥(0.2mBar，72小时)。通过加入35/65的C4F10和空气的混合物而重建大气压力。将冻干物分别分散在蒸馏水(10ml)中。用库尔特粒度仪分析如此获得的微气泡混悬液，结果显示在以下表中。
              DV50       DN           DV50/DN
A部分         1.71        1.12          1.53
B部分         1.65        1.12          1.47
C部分         1.57        1.09          1.44
如上结果显示，附加的过滤步骤进一步降低了微气泡的尺寸并降低了各自的粒度分布。
实施例12
通过使用10mg的7/3(w/w)DSPC/DSTAP混合物，以11000rpm的搅拌速度，重复实施例1。
以下显示了乳剂微滴和微气泡的特征：
        乳剂微滴               充气微气泡
  DV50   DN   DV50   DN   ＞3μm(％)
  2.36   1.48   2.10   1.12   0.63
实施例13
通过以10000rpm(实施例13a)乳化混合物，重复实施例1。通过向初始水性混悬液中进一步加入约0.9mgDSPE-PEG2000(约分散磷脂总量的8.3％)而制备同样的制品(实施例13b)。对两中制品都不用离心法进行洗涤。表10显示了乳剂和微气泡混悬液这两种制品的特征。
表10
  实施例          乳剂                           微气泡
  DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DV50/DN   转化产率(％)
  13a   3.19   1.66   2.66   1.33   2.00   29.5
  13b   4.32   1.43   5.81   1.18   4.92   18.8
上述结果显示了DSPE-PEG的浓度低于10％重量比(相对于磷脂总量)时，微气泡的转化产率和粒度分布都受到负面影响。
实施例14
通过用相同量的DAPC/DPPS 1∶1(w/w)混合物代替DPPS，重复实施例11。
不使用离心洗涤，将所得乳剂分为10ml的三份。
通过超声(3mm超声探针，Branson 250超声仪，输出量30％，5分钟)将25mg的各个DSPE-PEG分散在5ml的10％甘露醇溶液中从而分别制备DSPE-PEG2000和DSPE-PEG5000的水性混悬液。
然后将10％甘露醇溶液的2.5ml部分加入到乳剂的第一份(实施例14a)中。
将制备的DSPE-PEG2000的2.5ml部分加入到乳剂的第二份(实施例14b)中。
将制备的DSPE-PEG5000的2.5ml部分加入到乳剂的第三份(实施例14c)中。
在60℃下搅拌加热上述三种混合物1小时。冷却至室温后，用Malvern Mastersizer测量微滴尺寸。结果记载在表11中。
然后按照实施例11的步骤冷冻干燥该乳剂。通过加入35/65的C4F10和空气的混合物而重建大气压力。将冻干物分别分散在蒸馏水(10ml)中。用库尔特粒度仪分析如此获得的微气泡混悬液(参见表11)。
然后用蒸馏水通过离心法(180g/10分钟)将微气泡混悬液洗涤两次，然后根据上述步骤将其冻干。用HPLC-MS法测定DSPE-PEG在干燥组合物中的含量。结果显示在下表11中。
表11
         乳剂                      微气泡
实施例   DV50(μm)   DN(μm)   DV50(μm)   DN(μm)   DSPE-PEG(％w/w)
  14a   2.6   2.3   1.9   1.1   0.0
  14b   2.5   2.3   3.4   1.3   35.5
  14c   2.5   2.3   2.2   1.2   37.9
从上述结果可推知，后来向形成的乳剂中加入DSPE-PEG混悬液使得在不对微气泡最终性质产生负面影响的情况下，能够在稳定层的组合物中加入相对高剂量的DSPE-PEG(在这种情况下超过磷脂总重量的30％形成了稳定包封物)。
用其他PEG-修饰磷脂，尤其是DSPE-PEG2000-生物素或DSPE-PEG2000-马来酰亚胺，及用带磷脂的肽，尤其是DSPE-PEG2000-马来酰亚胺-SATA-RGD4C，可获得相同的效果。可依照已知方法，通过使RGD-4C与SATA反应，使SATA的巯基脱保护并使该脱保护的RGD4C-SATA与DSPE-PEG2000-马来酰亚胺反应而制备后述的带磷脂的肽。该制备方法记载在Bioconjugate chemistry，2002，13，737-743，Bohl Kullberg等的“用于靶向运输硼酸盐化DNA-联合剂的EGF结合脂质体的发展”(描述了EGF蛋白在DSPE-PEG-马来酰亚胺分子中的插入)，可方便地使用。
实施例15
将10mg的1∶1(w/w)DPPS/DSPC混合物加入到约10ml的10％甘露醇水溶液中。
在70℃下将该混合物加热15分钟并将其冷却至室温(22℃)。以0.2ml/分钟的流速通过微观混合器的进样口(标准隙缝Interdigidital微观混合器，带镍-盖-铜嵌体的housing SS316Ti，40μm×300μm，Microtechnik Mainz GmbH研究所)向在室温下以20ml/分钟的速度循环的水相中加入环辛烷，使有机溶剂的总量达到7.4％(v/v)。加完有机溶液后，在该微观混合器中将该乳剂再循环20分钟。
然后将该乳剂分为每2ml的5整份，将它们装入5个管形瓶DIN8R中。密封4个管形瓶，并如表12所示，分别在60、80、100和120℃的温度下加热4个管形瓶30min，而第5个不加热。
然后将乳剂冷却至室温，并根据下述步骤将5个管形瓶的内容物冻干。将每个乳剂的1ml收集入DIN8R管形瓶中，然后在-5℃下冷冻；将温度在1小时期间降到-45℃以下，然后在-25℃，0.2mbar下冷冻干燥该乳剂12小时(Telstar Lyobeta35冷冻干燥器)，最后在30℃，0.2mbar下干燥5小时。
然后将该冻干产品置于含35％全氟-n-丁烷和65％氮的气体中，接着通过手轻微抖动将其分散在两倍于初始体积的水中。表12显示了微气泡终混悬液的特征。
表12
加热 DV50 DN DV50/DN   每ml乳剂中的微气泡数量
  不加热   10.45   1.63   6.41   5.34×107
  60℃   4.85   1.32   3.67   7.83×107
  80℃   5.34   1.29   4.14   8.51×107
  100℃   6.69   1.66   4.19   4.92×108
  120℃   3.05   1.50   2.03   8.69×108
上述结果说明通过对形成的乳剂进行热处理，使得微气泡混悬液出现了较窄的粒度分布，同时增加了微气泡的数量。尤其通过增加加热温度至100℃以上，使得不对乳剂进行任何洗涤操作时，获得了微气泡相对较窄的粒度分别，同时还增加了混悬液中微气泡的数量。
实施例16
在15分钟内将含10mgDPPS和1g甘露醇的蒸馏水(10ml)加热至70℃，然后将其冷却至室温。加入DPPE-MPB(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]钠盐-Avanti Polar Lipids)(4.8％重量比-0.5mg)。用超声浴(Branson1210-3分钟)将该磷脂分散在水相中。
用高速均浆器(PolytronT3000，15000rpm，1分钟)在该水相(用冰浴冷却)中乳化全氟庚烷(0.8ml，购自Fluka)。
用Malvern Mastersizer测得所得乳剂具有2.3μm的体积中位直径(DV50)和2.1μm的数量平均粒径(DN)。
用离心法将该乳剂洗涤两次，然后将其再混悬于9.5ml的10％甘露醇的蒸馏水溶液中。冷冻该乳剂(-45℃，5分钟)，接着冷冻干燥(在0.2mBar下，24小时)。
通过引入35/65的C4F10和空气的混合物重建大气压。将该冻干产品分散在蒸馏水(20ml)中，用离心法冲洗该微气泡一次，然后将其再分散于4ml的含EDTA，含3.4mg硫代乙酰化卵白素的磷酸盐缓冲盐水(摩尔组合物：10mM磷酸盐，2.7mM KCl，137mM NaCl，10mMEDTA)中，加入400μl的羟胺溶液(在PBS50mM中13.92mg，pH：7.5)从而使硫代乙酰化卵白素的巯基脱保护。通过在圆盘旋转器(FisherScientific)上倒转搅拌该混悬液2小时。然后加入150μl的NaOH1N。
用PBS通过离心法(10000rpm，10分钟，Sigma离心机3K10)洗涤所得的卵白素标记的微气泡。用库尔特粒度仪测量获得的微气泡混悬液，得到1.6μm的DV50和1.2μm的DN。
对靶向微气泡组合物的作用进行体内和体外试验。
体外试验：
为了测验乙酰化卵白素对微气泡表面的有效结合，制备两套含孔的纤维蛋白。在第一套中，只存在纤维蛋白表面。在第二套中，用生物素标记的抗纤维蛋白肽(DX-278，公开于WO 02/055544)预处理纤维蛋白。
将如上制备的微气泡混悬液加到孔中(5×108微气泡/孔)。经过2小时的培养(倒置)和数次洗涤后，通过光学显微镜观察到了两套孔中的纤维蛋白表面。在不含生物素化的抗纤维蛋白肽的孔中基本上观察不到微气泡，而在含生物素化的抗纤维蛋白肽的孔中观察到了大量的微气泡覆盖面。
体内试验：
通过FeCl3法使两只兔子的腹主动脉中形成血栓(Lockyer et al，1999，Journal of Cardiovascular Pharmacology，vol 33，pp718-725)。
用HDI 5000超声机(Philips)，以脉冲转化模式，L7-4探针，MI：0.07进行回波成像。
然后对两只兔子静脉注射生物素化抗体(活化血小板的GPIIB/IIIA受体特异性的CD41)。
30分钟后，对第一只兔子静脉注射含卵白素标记的微气泡的微气泡混悬液(1×109个微气泡/ml)。注射15分钟后，观察到混悬液明显的血栓造影。注射后至少1小时后还能看到该造影。
对第二只兔子静脉注射相同剂量的不含卵白素标记的微气泡的微气泡混悬液。只观察到轻微的血栓造影。

Claims (40)

1.制备冻干基质的方法，其基质通过接触水性载体液体和气体可重建成主要由磷脂稳定的充气微气泡的混悬液，所述方法包含几个步骤：a)制备一种水-有机乳剂包含i)一种水性介质包括水；ii)一种基本上不与水混溶的有机溶剂；iii)一种包含超过50％重量比的磷脂的两亲性物质的乳化组合物和iv)冻干保护剂；b)冻干所述经乳化的混合物，从而获得包含所述磷脂的冻干基质。
2.制备注射用造影剂的方法，该造影剂包含主要由磷脂稳定的充气微气泡的液体水性混悬液，该方法包括几个步骤：a)制备一种水-有机乳剂包含i)一种水性介质包括水；ii)一种基本上不与水混溶的有机溶剂；iii)一种包含超过50％重量比的磷脂的两亲性物质的乳化组合物和iv)一种冻干保护剂；b)冻干所述乳剂，从而获得包含所述磷脂的冻干基质；c)使所述冻干基质与生物相容性气体接触；d)通过将其溶于生理可接受水性载体液体重建所述冻干基质，从而获得主要由所述磷脂稳定的充气微气泡的混悬液。
3.根据权利要求1或2的方法，其中制备该乳化剂的步骤a)包括：a1)通过将乳化组合物和冻干保护剂分散于水性介质中而制备混悬液；a2)用有机溶剂混合所得混悬液；a3)受控搅拌该混合物，从而获得乳剂。
4.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述有机溶剂在水中的溶解度小于10g/l。
5.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述有机溶剂在水中的溶解度为1.0g/l或更低。
6.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述有机溶剂在水中的溶解度为0.2g/l或更低。
7.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述有机溶剂在水中的溶解度约为0.01g/l或更低。
8.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述有机溶剂在水中的溶解度为0.001g/l或更低。
9.根据权利要求1的方法，其中的所述有机溶选自支链或直链烷、烯、环-烷，芳族烃、烷基醚、酮、卤代烃、全氟化烃及其混合物。
10.根据权利要求9的方法，其中溶剂选自戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯、环戊烷、环己烷、环辛烷、1-甲基-环己烷、苯、甲苯、乙基苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯、二丁基醚和二异丙基酮、氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(异氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟壬烷、全氟苯、全氟萘烷、甲基全氟丁醚、甲基全氟异丁醚、乙基全氟丁醚、乙基全氟异丁醚及其混合物。
11.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述有机溶剂的含量为约占水量1％-约50％的体积比。
12.根据在前任何一个权利要求的方法，其中所述冻干保护剂选自碳水化合物、糖醇、聚二元醇及其混合物。
13.根据权利要求12的方法，其中的冻干保护剂选自葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、直链淀粉、支链淀粉、环糊精、葡聚糖、氨茴酰牛扁碱、可溶淀粉、羟乙基淀粉(HES)、赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、聚乙二醇及其混合物。
14.根据权利要求12或13的方法，其中所述冻干保护剂的含量为约占水量的1％-约25％重量比。
15.根据权利要求1、2或3的方法，其中磷脂选自二月桂酰基-磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基-磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰基-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基-磷脂酰胆碱(DOPC)、1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、双十五酰基-磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰基-2-油基磷脂酰胆碱(POPC)、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰基-磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐、二花生酰基磷脂酰基-甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰基-磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)、二花生酰基磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、二油基磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)、二花生酰基磷脂酰乙醇胺(DAPE)、二亚油基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、聚乙二醇修饰的二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰基-乙醇胺(DSPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二油基磷脂酰基-乙醇胺(DOPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二花生酰基磷脂酰乙醇胺(DAPE-PEG)、聚乙二醇修饰的二亚油基磷脂酰乙醇胺(DLPE-PEG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生酰基磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰基鞘磷脂(DPSP)和二硬脂酰基鞘磷脂(DSSP)及其混合物。
16.根据权利要求1的方法，其中两亲性物质的乳剂组合物包含磷脂或一种整体带净电的两亲性物质。
17.根据权利要求1、2、3或13的方法，其中磷脂的含量为占所述乳剂混合物总重量的约0.005％-约1.0％重量比。
18.根据权利要求17的方法，其中磷脂的含量为占所述乳剂混合物总重量的0.01％-1.0％重量比。
19.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述磷脂包括靶向配体或能够与靶向配体反应的保护性反应基团。
20.根据权利要求1、2、3、15或16的方法，其中所述乳剂进一步含有选自以下物质的两亲性物质：溶血脂质；脂肪酸及它们分别与碱或碱金属的盐；带聚合物的脂质；带磺化单-双-，寡或多糖的脂质；带有与醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合脂质；二乙酰磷酸酯；磷酸二鲸蜡酯；硬脂酰胺；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯脂肪醇；聚氧乙烯脂肪醇醚；聚氧乙烯化疏水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯；乙氧基化大豆甾醇；乙氧基化蓖麻油；环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)嵌段共聚物；糖酸的甾醇酯；糖与脂族酸的酯；甘油与(C12-C24)脂肪二羧酸的酯和它们分别与碱或碱金属的盐；皂草苷；长链(C12-C24)醇；6-(5-胆甾烯-3β-基氧)-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；二半乳糖甘油二酯；6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脱氧基-1-硫代-β-D-甘露吡喃糖苷；12-(((7’-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)硬脂酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八酰基]-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰基-二油基磷脂酰乙醇胺；1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油-磷酸乙醇胺；棕榈酰基高半胱氨酸；包含至少一个(C10-C20)烷基链的烷基铵盐；包含至少(C10-C20)酰基链通过(C3-C6)烯基桥连于N原子的叔或季铵盐：及其混合物或组合物。
21.根据权利要求1或2的方法，其中在冻干步骤b)之前对步骤a)中的水-有机乳剂进行洗涤操作。
22.根据权利要求1或2的方法，其中在冻干步骤b)之前对步骤a)中的水-有机乳剂进行微过滤操作。
23.根据权利要求1或2的方法，其中进一步包含在冻干步骤b)之前，向在步骤a)中获得的水-有机乳剂中加入包含另外两亲性化合物的水性混悬液，由此获得了第二个包含所述另外的两亲性化合物的水-有机乳剂。
24.根据权利要求23的方法，其中进一步包括加热所述水性混悬液的混合物和所述水-有机乳剂的混合物。
25.根据权利要求23的方法，其中在约40℃-约80℃的温度加热所述混合物。
26.根据权利要求23的方法，其中所述的两亲性化合物为PEG-修饰的磷脂、带反应部分的PEG-修饰的磷脂或带靶向配体的PEG-修饰的磷脂。
27.根据权利要求1、2或23的方法，其中进一步包含，在冻干步骤b)之前，对该水-有机乳剂进行受控加热。
28.根据权利要求27的方法，其中所述的受控加热在约60℃-125℃的温度有效。
29.根据权利要求28的方法，其中所述的受控加热在约80℃-120℃的温度有效。
30.根据权利要求28的方法，其中所述的乳剂被装在密封的管形瓶中。
31.根据权利要求2或3的方法，其中生物相容的气体选自空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；一氧化二氮；惰性气体；低分子量烃，包括(C1-C7)烷，(C4-C7)环烷，(C2-C7)烯和(C2-C7)炔；醚；酮；酯；卤代(C1-C7)烃，酮，醚；或任何上述物质的混合物。
32.根据权利要求31的方法，其中卤代烃气体选自溴氯二氟甲烷，氯二氟甲烷，二氯二氟甲烷，溴三氟甲烷，氯三氟甲烷，氯五氟乙烷，二氯四氟乙烷，及其混合物。
33.根据权利要求31的方法，其中卤代烃气体为全氟化烃。
34.根据权利要求33的方法，其中全氟化烃气体为全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟戊烷，全氟己烷，全氟庚烷，全氟丙烯，全氟丁烯，全氟丁二烯，全氟丁-2-炔，全氟环丁烷，全氟甲基环丁烷，全氟二甲基环丁烷，全氟三甲基环丁烷，全氟环戊烷，全氟甲基环戊烷，全氟二甲基环-戊烷，全氟环己烷，全氟甲基环己烷，全氟甲基环己烷及其混合物。
35.充有生物相容气体并包含主要含有磷脂的稳定微气泡的注射用水性混悬液，其中所述微气泡具有低于1.70μm的数量平均粒径(DN)和使得DV50/DN比例约为2.00或更低的体积中位直径(DV50)。
36.根据权利要求35的水性混悬液，其中所述的微气泡具有1.60μm或更低，优选1.50μm或更低，更优选1.30μm或更低的DN。
37.根据权利要求35的水性混悬液，其中所述的微气泡具有约1.8或更低，优选1.60或更低，更优选1.50或更低的DV50/DN比例。
38.用于诊断成像的造影剂，包含根据权利要求35-37中任何一项的水性混悬液。
39.诊断成像的方法，包含对受体施用根据权利要求35-37中任何一项的造影增强量的水性混悬液，并至少对所述受体的一部分进行成像操作。
40.根据权利要求39的方法，其中包括用可产生超声波的超声仪器以预定的发射频率使受体接受超声波作用，从该超声波作用可测定相应的微气泡共振幅度，并施用包含充气微气泡的造影剂，该微气泡具有较窄的粒度分布和接近共振幅度一半大的平均尺寸。
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