KR20210003737A - 크기-제어 미세소포의 제조 - Google Patents

크기-제어 미세소포의 제조 Download PDF

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길레스 카스퀘이로
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브라코 스위스 에스.에이.
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Abstract

미세유체 제조 기술에 의해 "크기-제어" 기체-충전 미세소포의 현탁액을 제조하기 위한 방법으로서, 이것은 수 용해도가 높은 제1 기체 및 수 용해도가 낮은 제2 기체를 포함하는 기체상 흐름의 사용을 포함한다.

Description

크기-제어 미세소포의 제조
본 발명은 특히 플로우-포커싱 장치(flow-focusing device)를 사용하여, 기체-충전 미세버블(gas-filled microbubbles)와 같은, 크기-제어 미세소포(size-controlled microvesicles)를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
기체-충전 미세소포는 일반적으로 조영 증강 초음파(CEUS) 영상화로서 알려진 초음파 영상화 기술에서, 또는 예를 들어 초음파 매개 약물 송달과 조합된, 치료적 용도에서 적합한 조영제로서 이용된다. 이들 미세소포의 기체는 전형적으로 예를 들어 유화제, 오일, 증점제 또는 당을 포함하는 안정화 외피에 갇히거나 캡슐화된다. 이들 안정화된 기체 버블(적합한 생리학적 용액에 분산된)은 일반적으로 다양한 용어로 본 분야에서 언급되는데, 전형적으로 그것의 제조에 이용된 안정화 물질에 따라, 예를 들어 "마이크로스피어", "마이크로버블", "마이크로캡슐" 또는 "마이크로벌룬"이라는 용어가 사용되며, 전세계적으로 "기체-충전 미세소포"(또는 간단히 "미세소포")라고 언급된다.
특히 관심 있는 것은 기체에 배치된 안정화 양친매성(amphiphilic) 물질(전형적으로 인지질)을 포함하는 매우 얇은 외피(필름)에 의해, 기체/액체 계면에서, 액체 계면에 기체의 버블들이 결합되어 있는 기체-충전 미세소포의 수성 현탁액이다. 이들 현탁액은 전형적으로 분상의 양친매성 물질, 예를 들어 냉동-건조된 전-형성 리포솜 또는 냉동-건조 또는 분무-건조된 액체 용액을 교반하면서 공기나 임의의 다른 기체와 접촉시키고, 이어서 수성 캐리어와 접촉시켜 기체-충전 미세소포의 현탁액을 생성함으로써 제조되며, 이것은 이후 바람직하게 제조 직후에 투여될 수 있다. 안정화 층은, 상기 인용된 인지질들에 더하여, 지방산과 같은 다른 양친매성 물질도 포함할 수 있다.
종래의 제조 방법은 일반적으로 다분산성 지수(PDI)가 비교적 높은 크기 분포를 가진 기체-충전 미세소포 현탁액을 제공하며, 다분산성 지수는 표준 편차 "s"와 미세소포 집단의 평균 크기 "n" 간의 비로서 수학적으로 정의된다(PDI = s/n * 100%). 예를 들어, 전형적인 제조 방법은 약 2-3 마이크로미터의 평균 직경과 약 60%의 PDI를 가진 미세소포를 제공할 수 있다. 비교적 높은 PDI(예컨대 60%)를 가진 미세소포, 및 특히 기체-충전 미세소포는 일반적으로 대부분의 실사화(actual imaging) 기술에 아주 적합하지만, 그럼에도 이러한 PDI는 상기 영상화 기술에 대해 여전히 최적화될 수 있다. 더욱이, 특정한 치료적 초음파 용도에서는 PDI를 최소화하는 것이 바람직하다.
따라서, PDI가 10% 미만, 바람직하게 5% 미만 및 더욱더 바람직하게 2% 미만인 소위 말하는 "크기-제어" 또는 "단분산" 미세소포, 즉 기체-충전 미세소포 제조물을 제조하기 위한 방법이 개발되었다.
단분산 미세소포를 제조하기 위한 적합한 방법은, 예를 들어 전형적으로 T-정션 또는 플로우-포커싱 장치의 사용에 의한, 미세유체(microfluidic) 기술의 사용을 포함한다. 간단히 말해, 플로우-포커싱 장치에서, 기체 성분의 흐름이 좁은 구멍을 통한 액체 성분의 흐름에 의해 포커싱된다. 전형적으로, 액체 성분은 외피 형성 물질(전형적으로 인지질 및/또는 지방산을 포함하는 지질과 같은 계면활성제)을 포함하며, 이것은 기체상 성분을 포착해서 원하는 기체-충전 미세소포를 형성하고, 이것은 상기 외피 형성 물질에 의해 응집 및 용해에 대해 안정화된다.
동일한 출원인에 의한 참고문헌 2는 제조 장치의 출구에서 미세소포의 응집 현상을 제한하기 위해 제어된 온도 조건을 적용하는 미세유체 제조 방법에 관한 것이며, 이로써 새로 형성된 미세소포의 원하는 제어된 크기가 유지된다.
그러나, 상기 방법으로 응집 현상을 제한하더라도, 제조 과정의 종료시 수집된 새로 형성된 기체-충전 미세소포는 본질적으로 불안정하게 될 수 있고, 그 결과 커다란 크기의 미세소포(원하는 조정된(calibrated) 크기에 대하여)가 형성되며, 결과적으로 형성된 미세소포의 집단에서 PDI가 증가하고, 결국에는 미세소포의 액체 현탁액의 상부에 매우 큰 미세소포의 바람직하지 않은 폼 층이 형성될 가능성이 있다. 참고문헌 1에 예시된 대로, 상청 폼 층에 함유된 이러한 대형 미세버블은 이들의 크기가 마침내 감소하여 최종 안정한 크기(실질적으로 원래 조정된 크기에 상응하는)에 도달할 때까지 수 시간 지속될 수 있다. 이 PDI 증가 및 관련된 폼 형성 현상은 종래의 콘트라스트제 미세버블의 지속성을 개선하기 위해 통상 사용되는 SF6, C3F8 또는 C4F10과 같은 낮은 수 용해도를 가진 기체를 사용할 때 특히 유의미해진다.
충분한 시간 시간 동안 현탁액이 방치되는 경우(수 시간, 일반적으로 수 일 또는 그 이상 밀봉된 용기에 유지된다면), PDI 증가 및 관련된 폼 형성 현상은 둘 다 원래 가역적이지만, 이러한 폼의 존재는 어느 경우든 아주 바람직하지 않고, 미세소포의 사용(예를 들어, 투여)이나 생성된 미세소포 현탁액의 후속 후처리를 필수적으로 지연시킨다.
따라서, 이러한 PDI 증가 및 폼 형성 현상을 제한하거나 회피하기 위해, 미세유체 플로우 포커싱을 사용하여 형성한 직후 기체-충전 미세소포를 빠르게 안정화하는 방법이 여전히 필요하다.
본 출원인은 제조 과정에서 낮은 수 용해도를 가진 기체와 높은 수 용해도를 가진 기체의 혼합물을 사용함으로써 상기 가능한 PDI 증가 및 폼 형성 현상이 실질적으로 감소될 수 있다는 것을 발견했다.
참고문헌 2는 기체 혼합물, 특히 비교적 높은 수 용해도를 가진 기체 A 59-99.5%와 비교적 낮은 수 용해도를 가진 기체 B 41%-0.5%의 혼합물로 충전된 미세버블을 개시한다.
제1 양태에 따라서, 본 발명은 기체-충전 미세소포의 현탁액을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이것은:
- (i) 기체상 흐름, 및 (ii) 미세소포-안정화 물질을 포함하는 수성 액체 흐름을 제공하는 단계;
- 상기 기체상 흐름과 상기 액체 흐름을 각각의 입구 채널을 통해서 접촉 구역을 향하여 보내는 단계;
- 상기 기체상 흐름과 상기 액체 흐름을 접촉 구역으로부터 조정 구멍(calibrated orifice)을 통해서 보냄으로써 상기 기체-충전 미세소포를 포함하는 수성 현탁액을 얻는 단계; 및
- 상기 미세소포를 포함하는 상기 현탁액을 출구 채널을 향하여 보내는 단계
를 포함하며, 여기서 상기 기체상 흐름은 제1 기체 및 제2 기체를 포함하고, 상기 제1 기체는 높은 수 용해도를 가지며, 상기 제2 기체는 낮은 수 용해도를 가지고, 상기 기체상 흐름에서 상기 제2 기체의 부피 퍼센트는 18% 내지 2%이다.
바람직하게, 상기 기체상 흐름에서 상기 제1 기체의 부피 퍼센트는 15% 이하, 더 바람직하게 13% 이하이다. 이 부피 퍼센트는 바람직하게 적어도 3%, 더 바람직하게 적어도 5%여야 한다.
매우 수용성인 기체는 바람직하게 0.01 초과, 더 바람직하게 0.1 초과 및 더욱더 바람직하게 0.5 초과의 수 용해도(분젠 계수 "α"로서 정의된다)를 가진다. 낮은 수 용해도를 가진 기체는 바람직하게 0.008 이하, 더 바람직하게 0.001 이하 및 더욱더 바람직하게 0.0008 이하의 수 용해도를 가진다. 0.0005 이하의 수 용해도를 가진 기체가 특히 바람직하다.
제조 과정의 완료 후, 결과의 안정화된 기체-충전된 미세소포는 전형적으로 상기 제2 기체를 적어도 45%, 바람직하게 적어도 60% 함유한다(기체의 전체 부피에 대하여).
미세소포-안정화 물질은 바람직하게 양친매성 화합물, 더 바람직하게 인지질이다.
도 1은 미세유체 플로우-포커싱 장치의 코어 부분의 도식적 표현이다.
도 2는 본 발명의 플로우-포커싱 과정에 유용한 미세유체 장치의 예시적인 도식적 표현(상면도)을 도시한다.
도 3은 본 발명의 과정에 유용한 장치의 예시적인 도식적 도해를 도시한다.
도 4는 기체-혼합장치의 도식적 예를 도시한다.
도 5는 본 발명의 제조 방법을 위한 셋업의 예시적 예를 도시한다.
도 6은 최종적인 안정화된 기체-충전 미세소포로 새로 형성된 것으로부터 크기 감소의 도식적 예를 나타낸다.
도 7은 100% 수-불용성 기체로 제조된 새로 형성된 기체-충전 미세소포의 사진 및 안정화 동안 각각의 크기 변형의 사진을 도시한다.
도 8은 기체-충전 미세소포의 제조에 수용성 및 수-불용성 기체의 혼합물을 사용한 것의 효과를 도시적으로 도시한다.
도 9는 본 발명에 따른 기체-충전 미세소포의 형성 동안 온도 제어의 실험적 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 다른 양친매성 물질을 가진 기체-충전 미세소포의 형성 동안 온도 제어의 실험적 결과를 나타낸다.
도 11은 기체-충전 미세소포의 현탁액에 대한 냉각 효과의 실험적 결과를 나타낸다.
미세유체 기술에 따라서 제조된 기체상 미세버블은 크기 단분산성을 보존하기 위해 형성 직후 기체 용해에 대해 빠르게 안정화되어야 할 필요가 있다. 기체 용해는 기체-액체 계면 사이의 표면 장력으로 인한 라플라스 압력에 의해 주로 추진된다. 적합한 미세소포 안정제(예를 들어, 인지질 또는 지방산과 같은 양친매성 화합물)를 첨가함으로써, 상기 화합물의 양친매성 분자가 기체-액체 계면에서 단층을 형성하고, 그 결과 표면 압력을 가져옴으로써 미세버블이 안정화된다. 특히, 새로 형성된 미세소포의 기체 내용물(특히, 새로 형성된 미세소포 주변에서 양친매성 분자층의 비교적 느슨한 충진으로 인한, 도 6의 A 참조)은 주변 액체로 부분적으로 방출되려는(또는 용해되려는) 경향이 있다. 기체-액체 계면에서 인지질 단층은 기체 용해 동안 기계적으로 압축되지만, 그것은 결국에는 표면 압력을 생성하기에 충분히 높은 지질 충진 밀도를 가진 상태에 도달하고, 표면 장력을 상쇄하여 궁극적으로 미세버블을 그것의 최종 치수로서 안정화한다(도 6의 B). 일부 구체예에서, 새로 형성된 미세소포의 초기 반경(Ri)은 안정화된 미세소포의 최종 반경(Rf)의 약 2배이다. T. Segers의 상기 인용된 논문에 언급된 대로, 용해된 기체는 "오스트발트 숙성"(Ostwald ripening)이라고 알려진 현상을 통해서 미세소포 현탁액의 다분산성의 증가를 초래하며, 이때는 대형 미세소포가 형성되고 궁극적으로 폼 층이 형성된다.
도 7A는 100% C4F10 기체의 기체 흐름을 사용하여 미세유체 플로우 포커싱 제조에 의해 얻어진 새로 형성된 인지질-안정화된 미세소포의 대표 이미지를 도시한다; 이들 새로 형성된 미세소포는 형성 직후 얻어졌으며, 따라서 이 이미지로부터 관찰될 수 있는 대로 실질적으로 균일한 크기 분포를 가진다. 그러나, 도 7B에 예시된 대로, 형성 후의 후속 안정화 동안, 일부 미세소포(흰색 화살표로 표시)는 새로 형성된 미세소포의 직경의 대략 절반인 최종 안정화된 크기로 빠르게 수축하고, 다른 미세소포(검은색 화살표로 표시)는 수축한 미세소포에 의해 액체 현탁액에 방출된 기체의 내부 확산으로 인해 오스트발트 숙성을 통해서 성장한다(완성도를 위해, 중간 수축 또는 성장 단계에서 버블이 도 7B에서 또한 관찰된다); 결과적으로, 미세소포의 다분산 분포가 관찰되며, 결과적으로 커다란 크기의 미세소포의 존재로 인해 폼이 형성된다.
상기 언급된 대로, 미세소포 성장과 관련된 PDI 증가 및 폼 형성은 일반적으로 가역적이지만(따라서 최종 현탁액은 실질적으로 단분산된 미세소포를 함유한다), 크기 안정화 및 폼의 소멸에는 많은 시간이 걸릴 수 있다.
따라서, 본 출원인은 상기 한정된 것과 같은 기체들의 적합한 혼합물을 사용함으로써 이러한 PDI 증가 및 폼 형성 현상이 극적으로 감소되거나 실질적으로 회피될 수 있다는 것을 발견했다.
특히, 도 8에 예시된 대로, 새로 형성된 미세소포(도 8의 A)는 매우 수용성인 기체("HS 기체", 도 8의 미세포소에서 검은색 바탕으로 표시)와 수 용해도가 낮은 기체("LS 기체", 도 8에서 HS 기체에 분산된 회색 점들로 표시)의 혼합물을 포함한다. 안정화 단계 동안, 매우 가용성인 기체는 대부분의 양이 물에 빠르게 용해하지만, 가용성이 나쁜 기체는, 전형적으로 HS 용해성 기체의 일부 잔량이 거기 분산된 채로, 양친매성 화합물의 치밀하게 충진된 층에 포착된 상태로 남게 된다(도 8의 B). 용해된 LS 기체(이것은 미세소포가 100% LS 기체로 제조되었을 때 방출된다)와는 다르게, 용해된 HS 기체는 오스트발트 숙성을 촉발시키지 않으며, 이 기체는 유익하게 액체상에 용해된 상태로 남는다. 본 출원인에 의해 관찰된 대로, HS 기체의 용해도가 높을수록 폼 형성 현상 및 PDI 증가가 저하된다.
본 발명의 설명 및 청구항에서, 기체의 수 용해도는 25℃에서 측정된, 기체의 분젠 계수 "α"에 의해 정의된다. 당업계에 공지된 대로, 분젠 계수는 측정 온도 및 1 bar의 부분 압력에서 순수한 용매의 단위 부피에 의해 흡수되는 기체의 포화 부피에 상응하는 무차원의 값이다(T = 273.15°K, p = 1 bar로 감소).
적합한 HS 기체는 0.010 이상, 바람직하게 0.100 이상 및 더욱더 바람직하게 0.500 이상의 분젠 계수를 가진 기체이다. 이들 기체는 또한 바람직하게 비교적 낮은 분자량, 예를 들어 80 달톤 미만의 분자량을 가진다. 이러한 기체의 예들은 질소(α = 0.0144, Mw 28.01), 공기(α　= 0.0167, Mw 28.96) 및 이산화탄소(α = 0.7614, Mw 44.01)를 포함하며, 후자의 것이 더 높은 수 용해도를 가지기 때문에 특히 바람직하다.
적합한 LS 기체는 0.0080 이하, 더 바람직하게 0.0010 이하 및 더욱더 바람직하게는 0.0008 이하의 분젠 계수를 가진 것들이다. 0.0005 이하의 수 용해도를 가진 기체들이 특히 바람직하다. 이들 기체는 또한 바람직하게 비교적 높은 분자량, 예를 들어 120 달톤을 초과하는, 바람직하게 160 달톤을 초과하는 분자량을 가진다.
적합한 LS 기체는 불화 기체, 바람직하게 과불화 기체를 포함한다. 불화 기체는 적어도 하나의 불소 원자를 함유하는 물질, 예컨대 예를 들어 불화 탄화수소(하나 이상의 탄소 원자와 불소를 함유하는 유기 화합물); 6불화황; 블화된, 바람직하게 과불화된, 케톤, 예컨대 퍼플루오로아세톤; 및 불화된, 바람직하게 과불화된, 에테르, 예컨대 퍼플루오로디에틸에테르를 포함한다. 바람직한 화합물은 과불화 기체, 예컨대 SF6 또는 퍼플루오로카본(과불화 탄화수소), 즉 모든 수소 원자가 불소 원자로 치환된 탄화수소이며, 이들은 특히 안정한 기체-충전 미세소포 현탁액을 형성하는 것으로 알려져 있다.
용어 퍼플루오로카본은 포화, 불포화, 및 환형 퍼플루오로카본을 포함한다. 생체적합성, 생리학적으로 허용되는 퍼플루오로카본의 예들은 퍼플루오로알칸, 예컨대 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄(예를 들어, 퍼플루오로-n-부탄, 선택적으로 퍼플루오로-이소부탄과 같은 다른 이성질체와 혼합된 상태로), 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로헵탄; 퍼플루오로알켄, 예컨대 퍼플루오로프로펜, 퍼플루오로부텐(예를 들어, 퍼플루오로부터-2-엔) 또는 퍼플루오로부타디엔; 퍼플루오로알킨(예를 들어, 퍼플루오로부트-2-인); 및 퍼플루오로시클로알칸(예를 들어, 퍼플루오로시클로부탄, 퍼플루오로메틸시클로부탄, 퍼플루오로디메틸시클로부탄, 퍼플루오로트리메틸시클로부탄, 퍼플루오로시클로펜탄, 퍼플루오로메틸시클로펜탄, 퍼플루오로디메틸시클로펜탄, 퍼플루오로시클로헥산, 퍼플루오로메틸시클로헥산 및 퍼플루오로시클로헵탄)을 포함한다. 바람직한 포화 퍼플루오로카본은, 예를 들어 CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12 및 C6F14를 포함한다. 특히 바람직한 기체는 SF6, C3F8, C4F10을 포함하는, 실온에서 기체상 형태인 것들이다.
출원인에 의해 관찰된 대로, HS 기체와 혼합된 LS 기체의 18 부피% 이하(바람직하게 15% 또는 13% 이하)를 가진 기체의 혼합물을 사용함으로써, 새로 형성된 미세소포는 쉽게 그리고 바람직하게 안정화 동안 HS 기체를 방출하고, LS 기체는 미세소포에 포착된 상태로 남게 된다. 이것은, 전형적으로 최종 안정화된 미세소포에 함유된 기체의 전체 부피의 적어도 45%, 바람직하게 적어도 60%의, 실질적으로 높은 양의 LS가 함유된 안정화된 기체-충전 미세소포를 가져온다. 예를 들어, 특정 구체예에서(새로 형성된 미세소포에서 안정화된 미세소포로의 부피 수축이 약 8배인 경우), 제조의 기체 혼합물에서 LS 기체의 13%의 부피 함량은 최종 안정화된 형태에서 약 70%의 LS 기체의 농도를 가졌다. 유사하게, 제조 기체 혼합물에서 LS 기체의 5%의 부피 함량하에 제조된 미세소포는 최종 안정화된 형태에서 약 50%의 농도를 가졌다.
다른 측면에서, 미세소포의 허용가능한 지속성 또는 압력 저항값을 달성하기 위해, LS 기체의 부피는 바람직하게 제조 기체 흐름의 전체 부피의 적어도 2%여야 한다는 것이 관찰되었다(이것은 일반적으로 투여된 후 혈관에서 비교적 높은 혈압을 받고 있는 미세소포의 순환을 유지하기 위해 바람직하다). 더 바람직하게, 제조 기체 흐름에서 LS 기체의 부피는 기체에서 전체 부피의 적어도 3%, 더욱더 바람직하게 적어도 5%여야 한다.
미세소포-안정화 물질
기체-충전 미세소포의 안정화 층을 형성하기 위한 적합한 물질(즉, 미세소포-안정화 물질)은 당업계에 공지된 것들이다. 이들은 바람직하게 양친매성 물질을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 적합한 양친매성 물질은, 예를 들어 인지질; 라이소인지질; 지방산, 예컨대 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산 또는 올레산; 지질 보유 고분자, 예컨대 키틴, 히알루론산, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)("페길화 지질"이라고도 함); 지질 보유 설폰화 단당, 이당, 올리고당 또는 다당; 콜레스테롤, 콜레스테롤 설페이트 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트; 토코페롤 헤미석시네이트; 에테르 또는 에스테르-결합 지방산을 가진 지질; 중합된 지질; 디아세틸 포스페이트; 디세틸 포스페이트; 세라마이드; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 폴리옥시에틸화 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀리에이트, 에톡실화 대두 스테롤, 에톡실화 피마자유 또는 에틸렌 옥사이드(EO) 및 프로필렌 옥사이드(PO) 블록 공중합체; 콜레스테롤 글루쿠로나이트, 라노스테롤 글루쿠로나이트, 7-디하이드로콜레스테롤 글루쿠로나이트, 에르고스테롤 글루쿠로나이트, 콜레스테롤 글루코네이트, 라노스테롤 글루코네이트, 또는 에르고스테롤 글루코네이트를 포함하는 당 산의 스테롤 에스테르; 라우릴 글루쿠로나이트, 스테아로일 글루쿠로나이트, 미리스토일 글루쿠로나이트, 라우릴 글루코네이트, 미리스토일 글루코네이트, 또는 스테아로일 글루코네이트를 포함하는 당 산 및 알코올의 에스테르; 수크로오스 라우레이트, 프럭토오스 라우레이트, 수크로오스 팔미테이트, 수크로오스 스테아레이트, 글루쿠론산, 글루콘산 또는 폴리우론산을 포함하는 지방산과 당의 에스테르; 사르사사포게닌, 스밀라게닌, 헤데라게닌, 올레아놀산, 또는 디기톡시게닌을 포함하는 사포닌; 글리세롤 모노팔미테이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 모노미리스테이트 또는 글리세롤 모노라우레이트를 포함하는 지방산을 가진 글리세롤 또는 글리세롤 모노에스테르; n-데실 알코올, 라우릴 알코올, 미리스틸 알코올, 세틸 알코올 또는 n-옥타데실 알코올을 포함하는 장쇄 알코올; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드; 디갈락토실-디글리세라이드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥시-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드;6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥실-1-티오-β-D-만노피라노사이드; 12-(((7'-디에틸아미노-쿠마린-3-일)카보닐)메틸아미노)옥타데카노산; N-[12-(((7'-디에틸아미노-쿠마린-3-일)카보닐)메틸아미노)옥타데칸오일]-2-아미노팔미트산; N-석신일디올레일포스파티딜에탄올아민; 1,2-디올레일-sn-글리세롤; 1,2-디팔미토일-sn-3-석신일글리세롤; 1,3-디팔미토일-2-석신일글리세롤; 1-헥사데실-2-팔미토일글리세로-포스포에탄올아민 또는 팔미토일-호모시스테인; 적어도 하나의 (C10-C20), 바람직하게 (C14-C18), 알킬 사슬을 포함하는 알킬아민 또는 알킬암모늄 염, 예컨대 예를 들어 N-스테아릴아민, N,N'-디스테아릴아민, N-헥사데실아민, N,N'-디헥사데실아민, N-스테아릴암모늄 클로라이드, N,N'-디스테아릴암모늄 클로라이드, N-헥사데실암모늄 클로라이드, N,N'-디헥사데실암모늄 클로라이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB); (C3-C6) 알킬렌 브릿지를 통해서 N-원자에 결합된 하나 또는 바람직하게 2개의 (C10-C20), 바람직하게 (C14-C18), 아실 사슬을 포함하는 3차 또는 4차 암모늄 염, 예컨대 예를 들어 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄프로판(DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄프로판(DPTAP), 1,2-올레일-3-트리메틸암모늄프로판(DOTAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄프로판(DSDAP); 및 이들의 혼합물 또는 조합을 포함한다.
바람직한 구체예에 따라서, 미세소포의 외피를 형성하는 화합물 중 적어도 하나는 인지질이며, 선택적으로 나머지 상기 인용된 물질 중 어느 것과 혼합된다. 본 설명에 따라서, 용어 인지질은 임의의 양친매성 인지질 화합물을 포괄하는 것으로 의도되며, 이들의 분자는, 특히 최종 미세소포의 현탁액에서 기체-물 계면에서, 물질의 안정화 필름(전형적으로 단-분자 층 형태의)을 형성할 수 있다. 따라서, 이들 물질은 본 분야에서 "필름-형성 인지질"이라고 언급되기도 한다.
양친매성 인지질 화합물은 전형적으로 적어도 하나의 포스페이트 기와 적어도 하나의, 바람직하게는 2개의 친유성 장쇄 탄화수소 기를 함유한다.
적합한 인지질의 예들은 하나 또는 바람직하게 2개(동일하거나 상이한)의 지방산 잔기 및 인산을 가진 글리세롤의 에스테르를 포함하며, 여기서 인산 잔기는 예를 들어 콜린(포스파티딜콜린 - PC), 세린(포스파티딜세린 - PS), 글리세롤(포스파티딜-글리세롤 - PG), 에탄올아민(포스파티딜에탄올아민 - PE), 이노시톨(포스파티딜이노시톨)과 같은 친수성 기에 결합된다. 오직 하나의 지방산 잔기를 가진 인지질의 에스테르는 일반적으로 본 분야에서 인지질의 "라이소" 형태 또는 "라이소인지질"이라고 언급된다. 인지질에 존재하는 지방산 잔기는 일반적으로 장쇄 지방족 산이며, 전형적으로 12 내지 24개 탄소 원자, 바람직하게 14 내지 22개 탄소 원자를 함유한다; 지방족 사슬은 하나 이상의 불포화를 함유하거나 또는 바람직하게는 완전히 포화된다. 인지질에 포함되는 적합한 지방산의 예들은, 예를 들어 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산이다. 바람직하게, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 아라키드산과 같은 포화 지방산이 이용된다.
인지질의 추가의 예들은 포스파티드산, 즉 글리세롤-인산과 지방산의 디에스테르; 스핑고리피드, 예컨대 스핑고미엘린, 즉 지방산을 가진 글리세롤 디에스테르의 잔기가 세라마이드 사슬로 치환된 포스파티딜콜린 유사체; 카디오리핀, 즉 1,3-디포스파티딜글리세롤과 지방산의 에스테르; 글리코리피드, 예컨대 강글리오사이드 GM1(또는 GM2) 또는 세레브로사이드; 글루코리피드; 설파타이드 및 글리코스핑고리피드이다.
여기 사용된 용어 인지질은 자연발생, 반합성 또는 합성 제조된 생성물을 포함하며, 이들은 단독으로 또는 혼합물로서 이용될 수 있다.
자연발생 인지질의 예들은 천연 레시틴(포스파티딜콜린(PC) 유도체), 예컨대 전형적으로 대두 또는 난황 레시틴이다.
반합성 인지질의 예들은 자연발생 레시틴의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유도체이다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린, 에틸포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 또는 스핑고미엘린의 지방산 디에스테르이다.
바람직한 인지질의 예들은, 예를 들어 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디아라키도일포스파티딜콜린(DAPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(에틸-DSPC), 디펜타데칸오일포스파티딜콜린(DPDPC), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린(SPPC), 1-팔미토일-2-올레일포스파티딜콜린(POPC), 1-올레일-2-팔미토일포스파티딜콜린(OPPC), 디라우로일포스파티딜글리세롤(DLPG) 및 그것의 알칼리금속염, 디아라키도일포스파티딜글리세롤(DAPG) 및 그것의 알칼리금속염, 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG) 및 그것의 알칼리금속염, 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG) 및 그것의 알칼리금속염, 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG) 및 그것의 알칼리금속염, 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG) 및 그것의 알칼리금속염, 디미리스토일포스파티드산(DMPA) 및 그것의 알칼리금속염, 디팔미토일포스파티드산(DPPA) 및 그것의 알칼리금속염, 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디아라키도일포스파티드산(DAPA) 및 그것의 알칼리금속염, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디아라키도일포스파티딜에탄올아민(DAPE), 디리놀레일포스파티딜에탄올아민(DLPE), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디아라키도일포스파티딜세린(DAPS), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디팔미토일스핑고미엘린(DPSP), 및 디스테아로일스핑고미엘린(DSSP), 디라우로일포스파티딜이노시톨(DLPI), 디아라키도일포스파티딜이노시톨(DAPI), 디미리스토일포스파티딜이노시톨(DMPI), 디팔미토일포스파티딜이노시톨(DPPI), 디스테아로일포스파티딜이노시톨(DSPI), 디올레오일포스파티딜이노시톨(DOPI)이다.
적합한 인지질은 또한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(PPT)와 같은 친수성 고분자를 결합시킴으로써 변형된 인지질을 포함한다. 바람직한 고분자-변형 인지질은 "페길화 인지질", 즉 PEG 고분자에 결합된 인지질을 포함한다. 페길화 인지질의 예들은 페길화 포스파티딜에탄올아민(간단히 "PE-PEG"), 즉 친수성 에탄올아민 부분이 다양한 분자량(예를 들어, 300 내지 20000, 바람직하게 500 내지 5000 달톤)의 PEG 분자, 예컨대 DPPE-PEG(또는 DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG 또는 DOPE-PEG)에 결합된 포스파티딜에탄올아민이다. 예를 들어, DPPE-PEG2000은 약 2000의 평균 분자량을 가진 PEG 고분자가 부착된 DPPE를 말한다.
특히 바람직한 인지질은 DAPC, DSPC, DPPC, DMPA, DPPA, DSPA, DMPG, DPPG, DSPG, DMPS, DPPS, DSPS 및 에틸-DSPC이다. 가장 바람직한 것은 DPPG, DPPS 및 DSPC이다.
인지질의 혼합물, 예컨대 예를 들어 DPPE 및/또는 DSPE(페길화 유도체를 포함하는), DPPC, DSPC 및/또는 DAPC와 DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG, 에틸-DSPC 및/또는 에틸-DPPC의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
예를 들어, 인지질의 혼합물은 포스파티딜콜린 유도체, 포스파티드산 유도체 및 페길화 포스파티딜에탄올아민, 예를 들어 DSPC/DPPA/DPPE-PEG, DPPC/DPPA/DPPE-PEG, DSPC/DPPA/DSPE-PEG, DPPC/DPPA/DSPE-PEG, DAPC/DPPA/DPPE-PEG, DAPC/DPPA/DSPE-PEG, DSPC/DSPA/DPPE-PEG, DPPC/DSPA/DSPE-PEG, DSPC/DSPG/DPPE-PEG, DPPC/DSPG/DSPE-PEG를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따라서, 인지질은 미세소포의 안정화 외피의 주 성분이며, 기체-충전 미세소포의 외피를 형성하는 성분의 전체 양의 적어도 50% (w/w), 바람직하게 적어도 75%를 차지한다. 바람직한 구체예의 일부에서, 실질적으로 외피 전체가 인지질로 형성될 수 있다(즉, 적어도 90% w/w).
인지질은 편리하게 상기 열거된 양친매성 화합물 중 어느 것과 혼합될 수 있다.
따라서, 예를 들어 지질, 예컨대 콜레스테롤, 에르고스테롤, 피토스테롤, 시토스테롤, 라노스테롤, 토코페롤, 프로필갈레이트 또는 아스코르빌팔미테이트, 지방산, 예컨대 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 및 이들의 유도체 또는 부틸화 하이드록시톨루엔 및/또는 다른 비-인지질 화합물이 선택적으로 전술한 인지질 중 하나 이상에, 예를 들어 바람직하게 0 내지 50 중량%, 더 바람직하게 최대 25% 범위 비율로 첨가될 수 있다. 예를 들어, DSPC/DPPG/팔미트산, DPPC/DPPE-PEG/팔미트산, DSPC/DSPE-PEG/팔미트산, DPPC/DSPE-PEG/팔미트산, DSPC/DPPE-PEG/스테아르산,DPPC/DPPE-PEG/스테아르산, DSPC/DSPE-PEG/스테아르산 또는 DPPC/DSPE-PEG/스테아르산을 포함하는, 인지질을 포함하는 양친매성 물질과 지방산의 혼합물이 유익하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서 제조된 미세소포는 선택적으로 표적화 리간드를 포함할 수 있다.
용어 "표적화 리간드"는 그것의 의미 안에서 생체 내의 임의의 생물학적 또는 병리학적 부위를 향한 본 발명의 조성물의 미세소포의 표적화 활성(예를 들어, 선택적 결합을 포함하는)을 가지거나, 또는 표적화 활성을 촉진할 수 있는 임의의 화합물, 부분 또는 잔기를 포함한다. 표적화 리간드가 결합될 수 있는 표적은, 예를 들어 심근 조직(심근 세포 및 심근세포를 포함하는), 막성 조직(내피 및 상피를 포함하는), 라미나, 결합 조직(간질 조직을 포함하는) 또는 종양과 같은 조직; 응혈; 및 수용체, 예컨대 예를 들어 펩타이드 호르몬, 신경전달물질, 항원, 보체 단편 및 면역글로불린에 대한 세포-표면 수용체 및 스테로이드 호르몬에 대한 세포질 수용체를 포함한다.
표적화 리간드는 합성, 반합성, 또는 자연발생 리간드일 수 있다. 표적화 리간드로서 작용할 수 있는 재료 또는 물질은, 예를 들어 항체, 항체 단편, 수용체 분자, 수용체 결합 분자, 당단백질 및 렉틴을 포함하는 단백질; 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 펩타이드; 펩타이도미메틱스; 단당류 및 다당류를 포함하는 당류; 비타민; 스테로이드, 스테로이드 유사체, 호르몬, 보조인자, 생물활성제 및 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 물질을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
표적화 리간드는 양친매성 화합물 자체이거나(이것은 미세소포의 나머지 성분과 혼합된다) 또는 미세소포의 형성에 이용된 양친매성 분자(예를 들어, 인지질)에 결합된 화합물일 수 있다.
하나의 바람직한 구체예에서, 표적화 리간드는 공유 결합을 통해서 미세소포의 안정화 외피를 형성하는 양친매성 분자(예를 들어, 인지질)에 결합될 수 있다. 원하는 표적화 리간드를 공유 결합시키기 위해, 미세소포 외피를 형성하는 양친매성 화합물의 적어도 일부는 적합한 반응성 부분을 함유해야 하고, 상보적 관능성을 함유하는 표적화 리간드가 공지된 기술에 따라서, 예를 들어 미세소포의 양친매성 성분을 포함하는 분산물에 그것을 첨가함으로써 거기에 결합될 것이다. 바람직하게, 양친매성 화합물은 지질 보유 친수성 고분자, 예컨대 앞서 언급된 것들, 바람직하게 페길화 인지질이다. 이 경우, 표적화 리간드는 친수성 고분자 상의 적합한 반응성 부분에 결합된다. 양친매성 화합물은 미세소포를 제조하기 전에 원하는 표적화 리간드와 조합될 수 있고, 이렇게 얻어진 조합물이 미세소포의 제조에 사용될 수 있다. 대안으로, 미세소포가 먼저 제조될 수 있으며, 이것은 표적화 리간드의 상응하는 상보적 부분과 상호작용할 수 있는 적합한 부분을 가진 화합물(지질 또는 고분자-변형 지질)을 포함한다; 이후, 원하는 표적화 리간드가 미세소포 현탁액에 첨가됨으로써 미세소포 상의 상응하는 상보적 부분에 결합된다. 대안의 구체예에 따라서, 표적화 리간드는 또한 물리적 및/또는 정전기적 상호작용을 통해서 미세소포와 결합될 수 있다.
수성 액체 흐름
본 발명의 방법에 따라서 조정된(calibrated) 기체-충전 미세소포를 제조하기 위한 수성 액체 흐름은 양친매성 물질(상기 정의된 것과 같은)을 수성 캐리어에 분산된 상태로, 예를 들어 5.0 내지 20 mg/mL, 바람직하게 7.5 내지 15 mg/mL의 농도로 포함한다. 바람직하게 생리학적으로 허용되는, 적합한 수성 캐리어는 물(바람직하게 멸균수), 식염수와 같은 수성 용액(이것은 유익하게는 최종 주사 제품이 저장성(hypotonic)이 되지 않도록 균형이 맞춰질 수 있다), 또는 하나 이상의 장성(tonicity) 조절 물질의 용액을 포함한다. 장성 조절 물질은 염 또는 당, 당 알코올, 글리콜 또는 다른 비-이온성 폴리올 물질(예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 키토산 유도체, 예컨대 카복시메틸 키토산, 트리메틸 키토산 또는 겔화 화합물, 예컨대 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸 녹말 또는 덱스트란을 포함한다.
대안의 구체예에서, 미세소포에 치료적 소수성 물질을 통합시키기 위해 추가의 오일상이 첨가될 수 있다. 이를 위해, 예를 들어 참고문헌 5에 설명된 대로, 원하는 오일상을 공급하기 위한 2개의 추가 도관이 장치에 제공될 수 있다. 따라서, 형성된 기체-충전 미세소포는, 원하는 치료제가 탑재될 수 있는 양친매성 물질의 안정화 층과 기체 사이의 계면에 배치된 오일의 필름을 가질 것이다. 적합한 오일은 실온에서 액체인 임의의 생체적합성 오일을 포함할 수 있으며, 이들은 예를 들어 글리세롤과 포화 또는 불포화 (C2-C18) 알킬 사슬의 모노-, 디- 또는 트리-에스테르(호모- 또는 헤테로-알킬에스테르를 포함하는), 예컨대 글리세롤 모노부티린, 글리세롤 모노리놀리에이트, 1,2-디헥산오일글리세롤, 1,2-디옥탄오일글리세롤, 1,2-디올레일-sn-글리세롤, 트리아세틴, 트리부티린, 트리카프로인, 트리카프릴린, 트리카프린, 및 이들의 혼합물; 또는 천연 오일, 예컨대 콩 오일, 올리브 오일, 홍화씨 오일, 해바라기씨 오일, 땅콩 오일 및 이들의 혼합물을 포함한다.
혼합 기체 흐름
본 발명의 방법에 따라서 조정된 미세소포를 제조하기 위한 기체 흐름은 상기 예시된 각각의 부피비로, 상기 예시된 기체상 화합물의 혼합물을 포함한다.
도 4는 본 발명에 따른 과정에서 유용한 도식적 기체-혼합 장치를 도시한다. 기체 혼합 장치는 2개의 기체 용기(401 및 402)를 포함하고, 각 용기는 HS 기체 및 LS 기체로 충전된다. 각 기체의 흐름은 상응하는 질량 흐름 제어장치(MCF)(403 및 404)에 의해 각각 조절된다. MCF는 제어 유닛(405)(예를 들어, LabView, National Instruments, 또는 Matlab(Mathworks)와 같은 프로그래밍 언어로 실행되고 개인용 컴퓨터에 설치되는 주문제작된 소프트웨어 프로그램에 의해 제어되며, 이로써 원하는 혼합 비율을 설정하고 유지할 수 있다. 압력 센서(406)는 미세소포가 형성되는 미세유체 칩(407)으로 나아가는 기체 혼합물을 함유하는 출구 채널에서 실제 압력을 측정한다. 이 방식에서, 미세유체 칩을 작동시키는 원하는 기체 흐름이 원하는 셋팅에 따라서 제어되고 조절될 수 있으며, 따라서 MCF가 조절되어 동일한 혼합 비율을 유지할 수 있다. 도 4에 예시된 장치는 미세유체 플로우 포커싱에 의한 미세소포의 형성에 특히 필요한 조건하에 실질적으로 상이한 수 용해도를 가진 두 기체를 정확히 혼합하기 위해 사용될 수 있다. 이 방식에서, 고도로 안정한 조정된 미세소포가 폼-형성 대형 버블의 존재 없이 최적의 PDI, 최적의 수율하에 재현가능한 방식으로 제조될 수 있다.
유익하게, 응집을 제한하기 위해 새로 형성된 미세소포의 온도가 제어되는 함께 계류중인 출원 PCT/EP2017/071788에 예시된 제조 방법이 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 과정에 유용한 플로우-포커싱 장치("미세유체 칩")의 코어 부분(100)의 도식적 표현을 도시한다. 칩은 (혼합) 기체상 흐름(101')을 피딩하기 위한 제1 피드 채널(101) 및 양친매성 물질을 함유하는 액체 흐름을 공급하기 위한 2개의 추가 피드 채널(102a 및 102b)을 포함한다.
혼합 기체 흐름과 두 액체 흐름은 접촉 구역(103)을 향해 보내진 다음, 도 1에 점선으로 도시된 조정 구멍(104)을 통과한다. 조정 구멍은, 바람직하게 구멍과 동일한 단면을 가진 조정 채널(104')과 연결되고, 차례로 출구 채널(106)의 초기 부분(105)과 연결된다. 대안의 구체예(미도시)에서, 조정 구멍(104)은 출구 채널(106)의 초기 부분(105)에 직접 연결된, 즉 사이에 조정 채널이 없는, 노즐일 수 있다. 미세소포(103')는 조정 구멍에서 형성되고 조정 채널(104')을 통해서 출구 채널(106)의 초기 부분(105)으로 보내진다. 출구 채널의 수력학적 직경은 일반적으로 조정 구멍의 수력학적 직경보다 크며, 전형적으로 조정 구멍의 초기 직경으로부터 출구 채널(106)의 최종 직경까지 증가하고, 이것은 실질적으로 플로우-포커싱 장치를 용기, 예를 들어 미세소포의 현탁액을 수집하기 위한 밀봉 바이알에 연결하는 수집 튜브(미도시)의 수력학적 직경에 상응한다.
출구 채널의 초기 부분에서 발생할 가능성이 있는 미세소포의 바람직하지 않은 응집 현상은 장치의 출구 채널의 초기 부분(105)에서 그리고 바람직하게는 또한 접촉 구역(103) 및 조정 구멍(104)에서 미세소포의 온도를 제어함으로써 실질적으로 감소될 수 있다.
특히, 출구 채널의 초기 부분은 바람직하게 액체 흐름에 함유되며 미세소포의 안정화 외피를 형성하는 양친매성 물질의 전이 온도(Tm)에 대하여 20% 이상 더 낮은 온도에서 유지된다. 더 바람직하게, 상기 온도는 양친매성 물질의 Tm에 대하여 10% 이상 더 낮다. 일반적으로 온도가 Tm보다 지나치게 더 높을 필요는 없지만, 이러한 온도는 양친매성 물질의 열변성 내성과 양립할 수 있는 정도에서, 필요한 만큼 높을 수 있다; 예를 들어, 온도는 양친매성 물질의 Tm보다 최대 20% 더 높을 수 있고, 바람직하게는 최대 10% 더 높을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 온도는 양친매성 물질의 Tm이거나 또는 약간 위이다(예를 들어, 최대 5℃ 더 높다). 온도 제어는 미세소포의 수성 현탁액의 흐름이 실질적인 정지 속도에 아직 도달하지 않은 출구 채널의 구역에서, 예를 들어 절대 속도 구배가 약 10 s-1을 초과할 때 특히 유용하다. 칩의 기하구조에 따라, 상기 구역은 조정 구멍으로부터 약 0.1mm 내지 100mm, 바람직하게 1.0 내지 50mm 및 더 바람직하게 2.0 내지 30mm의 길이만큼 연장될 수 있다.
유익하게, 온도는 또한 접촉 구역 및 조정 구멍(그리고 존재한다면 조정 채널)에 상기 특정된 변수를 적용함으로써 유사하게 제어될 수 있다.
적용된 제어된 온도는 형성된 미세소포 중에서 응집의 실질적인 감소를 제공한다.
실험 부문에 상세히 나타낸 대로, 양친매성 물질의 Tm으로 또는 근처로 온도를 유지함으로써, 실질적으로 더 낮은 농도의 양친매성 물질을 사용함에 의해 감소된 응집이 관찰된다(가열이 적용되지 않는 경우 필요한 더 높은 농도와 비교하여).
플로우-포커싱 장치는, 예를 들어 참고문헌 3에 설명된, 본 분야에 공지된 것들 중 어느 것일 수 있다. 바람직하게, 플로우-포커싱 장치는, 예를 들어 참고문헌 4에 설명된 것과 같은 칩을 포함한다.
도 2의 도해를 참조하면, 칩(200)은 기체 혼합물 흐름이 공급되는 제1 입구 채널(201) 및 액체 흐름이 공급되는 2개의 입구 채널(202' 및 202")을 포함할 수 있다. 상기 입구 채널의 각각은 각각의 튜빙(미도시)을 통해서 각각의 저장소와 연결된다. 칩은 각각의 튜빙을 통해서 미세소포의 현탁액을 수집하도록 된 용기(미도시)에 연결된 출구 채널(203)을 더 포함한다. 조정 구멍에 가까이 있는, 입구 채널(201a 및 202a)의 최종 부분의 단면은 채널(201b 및 202b)의 나머지에 대하여 실질적으로 감소된다. 이 최종 부분(201a 및 202a)의 단면은 25 내지 1·104 μm2, 바람직하게 200 내지 1·103 μm2로 가변적일 수 있으며, 유익하게는 조정 구멍의 단면에 실질적으로 상응한다. 입구 채널의 초기 부분의 단면은 1·103 내지 1·106 μm2, 바람직하게 1·104 내지 1·105 μm2로 가변적일 수 있고, 이들의 길이는 50mm 내지 1mm, 바람직하게 2mm 내지 5mm로 가변적일 수 있다. 유사하게, 출구 채널의 초기 부분(203a)의 단면(도 1에서 조정 채널에 상응하는)도 또한 상대적으로 감소된다; 그것의 단면은 일반적으로 제조될 미세소포의 원하는 직경에 따라서 조정된다(예를 들어, 참고문헌 4 참조). 예를 들어, 5μm의 평균 직경을 가진 단분산 미세소포를 제조하기 위해, 조정 구멍 및 조정 채널은 약 250 내지 2500 μm2의 단면적을 가질 것이다. 유익하게, 입구 채널의 단면과 출구 채널의 단면은 실질적으로 동일하며, 또한 이들 각각의 최종 및 초기 부분의 단면도 실질적으로 동일하다. 조정 채널(203a)의 길이는 약 0.05mm 내지 약 10mm로 가변적일 수 있고, 출구 채널의 전체 길이는 최대 100mm, 바람직하게 최대 50mm 및 더 바람직하게 최대 30mm일 수 있다. 전형적으로, 칩은 석영 유리, 융합 실리카, 또는 임의의 플라스틱(예를 들어, 폴리(메틸메타크릴레이트)) 재료로 절반씩 2개로 이루어진다. 채널은 전체적인 원하는 깊이와 너비에 맞춰 각 절반의 내부 표면을 건식 또는 습식 에칭함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 표면은 접촉 구역에 가까운 각각의 조정 부분에 대해 15-20μm의 너비로, 나머지 부분에 대해 0.5-1.0mm의 너비로 하고, 길이는 14μm로 일정하게 에칭될 수 있다. 본 발명의 과정에서 사용하기 위한 적합한 상업적으로 이용가능한 칩은, 예를 들어 Dolomite microfluidics(영국 로이스톤) 또는 Micronit(네덜란드 엔스헤데)로부터 이용할 수 있다.
바람직한 구체예에 따라서, 형성된 미세소포의 단분산성을 유지하기 위해, 현탁액은, 바람직하게는 일단 수집 구역에서 현탁액의 흐름이 실질적으로 정지 속도에 도달한 다음, 양친매성 물질의 Tm 아래의 온도로 빠르게 냉각될 수 있다.
도 3을 참조하면, 플로우-포커싱 장치의 코어 부분을 포함하는 유닛(300)(예를 들어, 도 2에 설명된 것과 같은 칩)은, 예를 들어 항온조에 의해 상기 설명된 대로 양친매성 물질의 Tm 근처이거나 약간 위의 원하는 온도에서 유지될 수 있다. 기체 흐름과 양친매성 물질을 포함하는 액체 흐름은 각각의 공급 튜빙(예를 들어, 100 내지 1000μm, 바람직하게 150 내지 250μm의 내경)을 통해서 각각의 기체-혼합 장치(301)(예를 들어, 도 4에서 예시된 것과 같은) 및 저장소(302)로부터 유닛(300)으로 공급된다. 출구 튜빙(303)은 유닛(300)의 출구 채널(미도시)을 적합한 수집 용기(304), 예를 들어 밀봉 바이알에 연결한다. 미세소포의 형성으로부터 수 초 이내에, 바람직하게는 현탁액의 흐름이 실질적으로 정지 속도에 도달하자마자 미세소포의 현탁액의 냉각을 시작하는 것이 일반적으로 유익하다. 전형적으로, 상기 냉각은 미세소포의 형성으로부터 180초 이내, 바람직하게 60초 이내, 더 바람직하게 10초 이내 및 더욱더 바람직하게 2초 이내에 개시될 수 있다. 플로우-포커싱 장치의 기하구조에 따라, 정지 흐름은 일반적으로 미세소포 형성 후 수 밀리초 이내에 또는 심지어 더 적은 시간 이내에 도달된다; 따라서, 냉각은 미세소포의 형성 후 1 밀리초로부터 시작하는 것이 적용될 수 있다. 전형적으로 미세소포의 현탁액이 형성 후 수 밀리초 미만 이내에 유닛(300)의 출구에 도달하기 때문에, 냉각은 유익하게 유닛(300)을 빠져나오는 출구 튜빙의 초기 부분에 적용될 수 있다. 따라서, 출구 튜빙의 초기 부분은 유익하게 적합한 냉각 수단(305), 예를 들어 열 교환기에 의해 냉각이 행해지며, 이로써 기체-충전 미세소포의 현탁액의 온도가 미세소포의 안정화 외피를 형성하는 양친매성 물질의 Tm 아래로 감소한다. 냉각되는 출구 튜빙의 초기 부분의 길이는, 예를 들어 유닛(300)의 가열 온도, 적용된 냉각 효율, 접촉 시간 등에 따라, 예를 들어 1cm 내지 100cm, 바람직하게 5cm 내지 10cm로 가변적일 수 있다.
미세소포 현탁액이 수집되는 용기(304)는 바람직하게 일반적으로 밀봉 마개(예를 들어, 고무 스토퍼)를 가진 (유리) 바이알이다. 상기 용기는 바람직하게 주변 압력에서 제조 과정에서 사용된 동일한 LS 기체로 사전충전된다. 바이알의 액체 충전에 의해 발생되는 초과압력를 상쇄하기 위해 환기 장치(예를 들어, 바늘)가 바람직하게 용기에 삽입된다.
양친매성 물질의 전이 온도(Tm)가 여기 언급될 때, 상기 온도는 단일 양친매성 성분 또는 양친매성 성분들의 혼합물로 언급될 수 있다.
특히, 안정화 외피를 형성하는 양친매성 물질이 상이한 양친매성 성분들의 혼합물일 때, 상기 Tm은 일반적으로 양친매성 성분들의 상기 혼합물의 Tm으로서 언급된다. 양친매성 물질의 혼합물에 대해, 측정된 Tm은 일반적으로 혼합물의 개별 성분의 Tm의 몰 비 가중 평균에 상응한다.
수성 지질 혼합물의 Tm은 유익하게 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 측정될 수 있다. 인지질을 포함하는 양친매성 물질(순수한 또는 혼합물)의 Tm의 측정은, 예를 들어 DSC-Q2000 장치(TA Instruments, 미국 델러웨이 뉴캐슬)를 사용하여 수행될 수 있다. Tm을 결정하기 위해 전이가 시작되고 그것의 피크에 도달하는 온도 및 전이 엔탈피와 같은 변수가 측정된다. 측정의 상세한 내용은 실험 부분에 제공된다.
도 5는 조정된 미세소포의 생성에 사용된 미세유체 플로우 포커싱 장치의 예를 도시한다. LS 기체와 HS 기체의 혼합물을 포함하는 기체 흐름(502)(예를 들어, 도 4의 혼합 장치로부터)과 액체 흐름(501)(양친매성 물질, 예를 들어 인지질, 지방산 또는 이들의 혼합물을 포함하는)이 미세유체 칩(503)에 공급되고, 구멍(504)을 통해서 미세소포가 생성된다. 바람직하게 주변 압력에서 LS 기체로 사전충전된 바이알(505)에 미세소포 현탁액에 수집된다. 바이알의 액체 충전에 의해 발생되는 초과압력을 상쇄하기 위해 환기 장치(예를 들어, 바늘(506))가 바람직하게 사용된다. 미세소포 현탁액의 수집이 끝나면 환기 장치는 바람직하게 제거되고, 외부 대기와의 추가의 기체 교환을 피하기 위해 용기는 바람직하게 밀봉된다.
사용
본 발명의 방법에 따라서 제조된 미세소포는 특히 초음파 및 자기공명을 포함하는 여러 가지 진단 및/또는 치료 기술에서 사용될 수 있다.
진단 기술은 기체-충전 미세소포의 사용이 전임상 및 임상 연구 목적의 영상화를 포함하여 동물(인간을 포함하는) 신체의 일부 또는 부분의 시각화의 증강을 허용하는 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어 펀더멘탈 및 하모닉 B-모드 영상화, 진폭 변조, 펄스 또는 상 반전 영상화 및 펀더멘탈 및 하모닉 도플러 영상화를 포함하는 여러 가지 영상화 기술이 초음파 용도에서 이용될 수 있다; 원한다면 3-차원 영상화 기술이 사용될 수 있다.
진단적 사용을 위한 미세소포는, 예를 들어 각각의 조성, 영상화될 조직이나 장기 및/또는 선택된 영상화 기술에 따라 체중 kg 당 약 0.01 내지 약 1.0μL의 농도로 투여(예를 들어, 주사에 의해)될 수 있다. 물론 이 일반적인 농도 범위는 구체적인 영상화 적용에 따라, 예를 들어 진폭 변조 및 펄스 반전 영상화와 같이 매우 낮은 용량에서 신호가 관찰될 수 있는 경우에는 변할 수 있다.
가능한 다른 진단 영상화 용도는 신티그래피, 광 영상화, 및 엑스선 조영 영상화를 포함하는 엑스선 영상화를 포함한다.
치료 기술은 미세소포 그대로(예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 응혈 용해 등의 초음파 매개 치료) 또는 그것과 치료제와의 조합(예를 들어, 약물 송달, 유전자 요법 또는 백신으로서의 사용에서와 같은, 선택된 부위 또는 조직에 생물활성 화합물의 송달)의 사용을 포함하는 환자의 임의의 치료 방법(상기 정의된 것과 같은)을 포함하며, 이것은 스스로 또는 다양한 물리적 방법(예를 들어, 초음파 매개 송달을 포함하는)에 의한 특정한 활성화시에 시험관내 및/또는 생체내에서 생물학적 효과를 발휘할 수 있거나 발휘하는 것을 책임질 수 있다.
치료적 치료를 위한 미세소포는 전형적으로, 예를 들어 각각의 조성, 치료중인 대상의 타입, 치료될 조직이나 장기 및/또는 적용된 치료 방법에 따라 체중 kg 당 약 0.01 내지 약 5.0μL의 농도로 투여될 수 있다.
아래의 실시예는 본 발명을 더 예시하는 것을 도울 것이다.
실시예
재료
Figure pct00001
실시예 1
기체-충전 미세소포의 제조
기체 및 액체 공급 튜빙(Peek Upchurch, 1/16 인치 O.D, 150μm I.D)과 칩의 누출방지(leak tight) 연결을 허용하는 상업적으로 이용가능한 칩 홀더(Dolomite microfluidics, 부품번호: 3000024, 3000109, 3000021)에 장착된, 상업적으로 이용가능한 미세유체 플로우-포커싱 장치(Dolomite microfluidics, 소형 액적 칩, 14 m 식각 깊이, 부품번호: 3200136)를 사용하여 미세소포를 합성했다. 미세소포 형성 채널은 너비 17μm 및 길이 135μm를 가졌다. 전체 채널 깊이는 14μm였다. 칩과 그것의 홀더를 20배 배율 대물렌즈(Olympus, LMPLAN 20x)와 CCD 카메라(Lumenera, LM156M)를 구비한 도립 현미경 상에 장착된 광학적으로 투명한 온도 제어 수조에 배치했다. 항온조의 온도는 50℃로 설정했다(액체 흐름에서 양친매성 물질의 혼합물의 전이 온도보다 약간 낮은 온도에 해당한다).
액체 흐름에서 양친매성 물질은 9:1의 몰비의 DSPC:DPPE-PEG5000였다. 혼합물의 Tm은 55℃인 것으로 실험적으로 결정되었다.
물질들을 60℃에서 교반하면서 2:1(부피비) 클로로폼/메탄올 혼합물에 20 mg/mL의 농도로 상기 몰비로 첨가하고 양친매성 물질을 완전히 용해시켰다. 다음에, 용매를 감압하에 증발시키고 얻어진 필름을 감압하에 하룻밤 건조시켰다. 다음에, 건조된 물질을 30분 동안 교반하면서 60℃에서 식염수(0.9% NaCl)에 다시 분산시켰다(15 mg/mL의 농도로). 다음에, 분산물을 팁 소니케이터(Branson Sonifier 250)를 사용하여 소니케이션해서 물질을 균질하게 분산시켰다. 다음에, 제조물을 폴리카보네이트 필터(0.45μm 기공 크기)를 사용하여 여과하고 실온으로 냉각하고 탈기했다.
도 4에 도식적으로 도시된 것과 유사한 기체-혼합 장치를 사용하여 HS 기체와 LS 기체의 다양한 부피비를 가진 기체-충전 미세소포를 제조했다. 간단히 말해서, 2개의 기체 용기를 HS 기체인 CO2와 LS 기체인 C3F8로 각각 충전했다. 각 기체의 기체 흐름을 각각의 질량 흐름 제어장치로 조절했다: (i) EL-Flow:　F200CV-002-RAD-11-K, HS 기체용 및 (ii) Low-ΔP-Flow: F-200DV-RAD-11-Z, LS 기체용(기체 제어장치는 둘 다 Bronkhorst(네덜란드 루를로)로부터 입수). 질량 흐름 제어장치는 Matlab(Mathworks)에서 실행되는 주문제작 소프트웨어 프로그램에 의해 제어되었으며, 이것을 개인용 컴퓨터에 설치하여 원하는 혼합 비율을 설정하고 유지할 수 있었다. 압력 센서(PSE530-M5-L; SMC Corp., 일본 도쿄)는 미세유체 칩으로 나아가는 출구 채널에서 기체 혼합물의 실제 압력을 측정했다; 1.8 bar의 기체 압력을 미세소포의 형성을 위해 사용했다. 액체 공류(co-flow) 속도는 별도의 질량 흐름 제어장치(Mini Cori Flow: M13V14I-MAD-11-K-S; Bronkhorst, 네덜란드 루를로)를 사용하여 제어했다. 약 140 μL/min의 액체 공류 속도를 사용하여 젯팅 방식으로 플로우-포커싱 장치를 작동시키고 약 4μm의 직경(평균)을 가진 미세소포를 생성했다.
다음에, C3F8로 포화된 밀봉 환기된 바이알에 미세소포 현탁액을 수집했다.
다양한 제조물에 대해, 바이알에 수집된 액체 현탁액 위에 형성된 폼 층의 상대적 높이를, 액체 현탁액의 높이의 상대적 퍼센트로서 측정했다. 결과를 아래 표 1에 나타낸다.
Figure pct00002
상기 표에서 추론 할 수 있는 대로, 20%를 초과하는 LS 기체의 부피량은 기체-충전 미세소포의 수성 현탁액 위에 바람직하지 않은 폼 형성을 실질적으로 증가시킨다. 다른 한편, 13% 이하, 바람직하게 10% 이하의 LS 기체량은 폼 형성을 실질적으로 감소시킨다.
실시예 2
압력 저항 및 LS 기체 농도의 결정
LS 기체인 C3F8를 C4F10으로 대체하여 실시예 1의 제조를 반복했다. 5% C4F10을 사용한 3개의 제조물과 13% C4F10을 사용한 2개의 제조물을 아래의 과정에 따라서 기체-충전 미세소포의 압력 저항에 대해 시험했다. 압력 저항은 정수학적 초과압력의 함수로서 광학적 흡광도 측정으로부터 결정된다. 0 mmHg 초과압력에서 측정된 흡광도 50%에 해당하는 정수학적 초과압력(mmHg 단위로 표시됨; 1 mmHg = 133.3 파스칼)이 압력 저항값, 또는 Pc50으로서 간주된다.
흡광도는 변형된 분광광도계(Jenway 6300, Barloworld Jenway, 영국 스톤)를 사용하여 700nm의 파장에서 측정했다. LabView(National Instruments, 텍사스 오스틴)에서 작성된 인하우스 개발된 소프트웨어 프로그램에 의해 제어되는 비례 밸브(T2000, Marsh Bellofram, 웨스트버지니아 뉴웰)에 의해 조절된 압축 공기를 사용하여, 4.2 mmHg/s의 속도로 증가하는 초과압력을 통해서, 기밀 큐벳에 갇힌, 미세버블의 현탁액에 준-정적 압축을 적용했다.
5% C4F10을 사용한 3개 제조물에 대해 측정된 Pc50은 600 내지 780 mmHg의 범위였고, 13% C4F10을 사용한 2개 제조물에 대해 측정된 Pc50은 705 내지 727 mmHg의 범위였으며, 따라서 상이한 제조물에서 압력에 대해 비슷한 저항을 나타낸다.
또한, 최종 안정화된 미세버블에서 LS 기체의 농도를 아래의 과정에 따라서 측정했다. 1mL 미세소포 현탁액 부피를 별도의 밀봉 바이알에 주사하고, 60분 동안 소니케이션하여 모든 미세소포를 파괴하고, 1시간 동안 방치했다. 다음에, 헤드스페이스에서 LS 기체의 양을 기체 크로마토그래피에 의해 측정했다.
5% C4F10 및 95% CO2의 농도하에 제조된 안정화된 미세버블에서 C4F10의 최종 농도는 50%였고, 13% C4F10 및 87% CO2의 농도하에 제조된 미세버블에서 C4F10의 최종 농도는 70%였다.
실시예 3
양친매성 물질의 수성 분산물의 제조
상이한 상 전이 온도(Tm)를 가진 양친매성 물질의 두 혼합물을 사용했다:
M1: DSPC:DPPA:DPPE-PEG5000 (Tm= 55℃)
M2: DPPC:DPPA:DPPE-PEG5000 (Tm= 44℃)
(둘 다 8:1:1의 몰비)
물질들을 60℃에서 교반하면서 2:1(부피비) 클로로폼/메탄올 혼합물에 20 mg/mL의 농도로 상기 몰비로 첨가하고 양친매성 물질을 완전히 용해시켰다. 다음에, 용매를 감압하에 증발시키고 얻어진 필름을 감압하에 하룻밤 건조시켰다. 다음에, 건조된 물질을 30분 동안 교반하면서 60℃에서 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 물의 혼합물(GPW, 5:5:90의 부피비)에 다시 분산시켰다("미세소포의 제조" 부문에 상세히 설명된 대로, 5 내지 15 mg/mL의 농도로). TRIS 버퍼(20mM)를 첨가하여 pH 값을 pH 7로 조절했다. 다음에, 이 분산물을 팁 소니케이터(Branson Sonifier 250)를 사용하여 소니케이션해서 물질을 균질하게 분산시켰다. 다음에, 제조물을 폴리카보네이트 필터(0.45μm 기공 크기)를 사용하여 여과하고 실온으로 냉각하고 탈기했다.
전이 온도의 측정
양친매성 물질(순수한 DPPC 또는 DSPC, 및 DPPC:DPPA:DPPE-PEG5000의 혼합물 또는 DSPC:DPPA:DPPE-PEG5000의 혼합물)의 전이 온도를 Tzero 알루미늄 도가니(TA Instruments, New Castle, DE USA)에서 상업용 시차 주사 열량계 DSC-Q2000을 사용하여 결정했다. 온도 및 열 유량을 포함하는 시스템 캘리브레이션은 인듐 금속을 가지고 수행했다(융합 엔탈피 28.71 J/g ± 0.5 J/g; 융합 개시 온도 156.6℃ ± 0.25℃).
GPW/TRIS 중의 양친매성 물질(순수한 또는 혼합물)의 분산물을 DSC 측정을 위해 상기 설명된 과정에 따라서 제조했다(각각 약 30μL, 농도 10 mg/mL).
DSC 측정은 20℃ 내지 80℃의 온도 범위에 걸쳐서 2℃/min의 일정한 온도 속도로 가열함으로써 수행했다. 질소를 50mL/min의 유속으로 퍼징 기체로 사용했다.
결과가 아래 표 2에 예시된다:
Figure pct00003
실시예 4
기체-충전 미세소포의 제조
실시예 1에 설명된 것과 동일한 미세유체 칩을 사용하여 미세소포를 합성했다. 시린지 펌프(Harvard PHD4400)를 사용하여 액체 공류 속도를 제어했다. 압력 센서(Omega, DPG1000B-30G)에 연결된 압력 조절장치(Omega, PRG101-25)를 사용하여 기체(SF6) 압력을 제어했다. 개별 미세소포는 기록된 광학 이미지로부터 자동 검출되었고, 이로써 PC에서 Matlab 소프트웨어(The Mathworks Inc., 매사츄세츠 네이틱)를 사용하여 오프라인으로 그것의 크기를 측정할 수 있다. 실시예 1과는 다르게 두 상이한 액체 공류 속도를 시험하여(45 μL/min 또는 55 μL/min), 드립핑 방식 또는 더 바람직한 젯팅 방식하에 플로우-포커싱 장치를 각각 작동시켰다.
밀봉 바이알에 미세소포 현탁액을 수집하고 실온에 보관했다.
형성된 미세소포의 가열 효과
도 9a 내지 9e는 5 내지 15 mg/mL의 범위의 양친매성 물질의 농도하에(각각 도 9a-9e) 미세유체 칩(도 2에 예시된 것과 유사한)을 함유하는 상이한 온도의 항온조에서, 상기 제조된 것과 같은 DSPC/DPPA/DPPE-PEG5000 현탁액(Tm 55℃)의 액체 공류를 사용하여 얻어진 결과를 보여준다. 사각형(■)은 드립핑 방식하에 수행된 실험을 나타내고, 삼각형(▲)은 더 바람직한 젯팅 방식하에 수행된 실험을 나타낸다.
이들 도면에서 관찰될 수 있는 대로, 미세소포의 응집 퍼센트(C[%])는 일반적으로 젯팅 방식과 비교하여 드립핑 방식에서 더 낮다. 또한, 드립핑 방식과 젯팅 방식에서 모두, 온도를 증가시킴으로써 응집이 감소하는 유익한 효과가 드러난다. 특히 젯팅 방식을 고려하면, 7.5 mg/mL의 농도에서(도 9b) 온도를 양친매성 물질의 Tm(55℃) 이상으로 증가시키는 것은 약 10% 이하의 미세소포의 응집을 가져온다. 젯팅 방식에서 또 중요한 점은 양친매성 물질의 Tm 이상으로 가열하는 것이 10 mg/mL의 양친매성 물질의 농도에서(도 9c) 1% 미만의 응집을 제공한다는 것이다. 양친매성 물질의 농도를 15 mg/mL(도 9e)로 증가시킴으로써 유사한 결과가 실온에서 얻어질 수 있다. 이 경우, 양친매성 물질의 농도는 50%만큼 증가될 필요가 있다는 것을 주지한다.
따라서, 이들 결과는 양친매성 물질의 Tm 근처의 온도를 유지함으로써 응집 효과의 감소가 얻어질 수 있다는 것을 증명한다(더 낮은 온도의 동일한 제조물에 대해 측정된 더 높은 응집과 비교하여). 이 결과는 또한 양친매성 물질의 Tm 근처의 온도를 유지함으로써 실질적으로 더 낮은 농도의 양친매성 물질을 사용함에 의해 유사한 응집 퍼센트가 얻어질 수 있다는 것을 보여준다(가열이 적용되지 않은 경우 필요한 더 높은 농도와 비교하여).
도 10은 상이한 온도의 항온조에서 10 mg/mL의 양친매성 물질의 농도하에 상기 제조된 것과 같은 DPPC/DPPA/DPPE-PEG5000 현탁액(Tm 44℃)의 액체 공류를 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다. 상기 논의된 결과와 유사하게, 이 경우에도 양친매성 물질의 Tm 근처나 그보다 높은 온도로 가열했을 때 1% 이하의 응집이 얻어진다.
현탁액의 하류 냉각의 효과
미세소포의 분산성에 대한 하류 냉각의 효과를 평가하기 위해 상이한 냉각 조건을 시험했다.
셋업 A(초기-냉각 현탁액)에 따라서, 미세소포 형성 후 3ms에 현탁액을 열교환기(20℃에서)를 통과시켜 현탁액의 온도를 Tm 아래로, 특히 실온으로 급히 감소시켰다. 따라서, 항온조에서 칩으로부터 빠져나온 튜빙은 칩의 출구로부터 약 0.5mm 뒤에서 열교환기를 통과했다.
셋업 B(후기-냉각 현탁액)에 따라서, 미세소포 형성 후 3분에 현탁액을 동일한 열교환기를 통과시켰다. 따라서, 이 두 번째 구성에서 칩으로부터 빠져나온 튜빙은 내경이 1mm인 튜빙으로 대체되었고, 이 튜빙은 약 20cm의 길이만큼 항온조에서 유지된 후 열교환기를 통과했다.
두 셋업 모두 55, 65 및 75 μL/min의 유속에서 시험했고, 결과는 도 11a, 11b 및 11c에 각각 도시된다(X 축 = 직경(mm), Y 축 = 상대적 미세소포 수). 도 11a-11c에서 점선은 후기-냉각 제조물의 크기 분포를 나타내고, 실선은 초기-냉각 제조물의 크기 분포를 나타낸다. 이들 도면으로부터 초기-냉각 현탁액의 PDI가 상응하는 후기-냉각 현탁액의 PDI와 비교하여 더 낮다는 것이 분명하다. 또한, 이들 도면으로부터 미세소포의 평균 크기는 흐름 속도의 증가에 따라 감소한다는 것이 인정될 수 있다.
양친매성 물질의 다른 혼합물, 특히 앞서 예시된 양친매성 물질들의 조합에서도 유사한 결과가 얻어질 수 있다.
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Claims (16)

  1. 기체-충전 미세소포의 현탁액을 제조하기 위한 방법으로서,
    - (i) 기체상 흐름, 및 (ii) 양친매성 미세소포-안정화 물질을 포함하는 수성 액체 흐름을 제공하는 단계;
    - 상기 기체상 흐름과 상기 액체 흐름을 각각의 입구 채널을 통해서 접촉 구역을 향하여 보내는 단계;
    - 상기 기체상 흐름과 상기 액체 흐름을 접촉 구역으로부터 조정 구멍을 통해서 보냄으로써 상기 기체-충전 미세소포를 포함하는 수성 현탁액을 얻는 단계; 및
    - 상기 미세소포를 포함하는 상기 현탁액을 출구 채널을 향하여 보내는 단계
    를 포함하며,
    여기서 상기 기체상 흐름은 제1 기체 및 제2 기체를 포함하고, 상기 제1 기체는 높은 수 용해도를 가지며, 상기 제2 기체는 낮은 수 용해도를 가진 생체적합성 불화 기체이고, 상기 기체상 흐름에서 상기 제2 기체의 부피 퍼센트는 18% 내지 2%인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 기체상 흐름에서 상기 제1 기체의 부피 퍼센트는 15% 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 기체상 흐름에서 상기 제1 기체의 부피 퍼센트는 13% 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 기체의 부피 퍼센트는 적어도 5%인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기체는 0.01을 초과하는 수 용해도(분젠 계수 "α"로서 정의됨)를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 제1 기체는 0.5을 초과하는 수 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 기체는 0.008 이하의 수 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 제2 기체는 0.001 이하의 수 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 기체는 과불화 기체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 과불화 기체는 SF6, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기체는 공기, 질소, 이산화탄소 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 기체는 이산화탄소인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 기체-충전 미세소포는 낮은 수 용해도를 가진 기체를 적어도 45 부피%의 최종 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 낮은 수 용해도를 가진 기체의 상기 최종 양은 적어도 60%인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양친매성 미세소포-안정화 물질은 인지질인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 양친매성 물질은 5.0 내지 20 mg/mL의 농도로 수성 캐리어에 분산되는 것을 특징으로 하는 방법.
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