CN111836650A - 尺寸可控微泡的制备 - Google Patents

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Abstract

一种通过微流体制备技术制备“尺寸可控”充气微泡的悬浮液的方法，该方法包括使用气体流，该气体流包含在水中溶解度高的第一气体和在水中溶解度低的第二气体。

Description

尺寸可控微泡的制备
技术领域
本发明涉及一种特别是通过使用流动聚焦装置制备尺寸可控微泡例如充气微泡的方法。
背景技术
充气微泡通常在超声成像技术中被用作合适的造影剂，称为造影增强超声(CEUS)成像，或者在治疗应用中例如与超声介导的药物递送结合使用。这些微泡的气体通常被包封或封装在稳定包膜中，该稳定包膜包括例如乳化剂、油、增稠剂或糖。这些稳定的气泡(分散在合适的生理溶液中)在本领域中通常以各种术语来指称，通常取决于用于其制备的稳定材料；这些术语包括，例如“微球”、“微气泡”、“微胶囊”或“微气球”，在本文中统称为“充气微泡”(或简称为“微泡”)。
特别令人感兴趣的是充气微泡的含水悬浮液，其中气泡在气/液界面被非常薄的包膜(膜)所束缚，该包膜包含在气-液界面处的稳定的两性材料(通常是磷脂)。这些悬浮液的制备通常通过将粉末状两性材料例如冻干预成型脂类或冻干或喷雾干燥的脂类溶液先与空气或任何其它气体接触，然后再与含水载体混合，同时搅拌产生充气微泡的悬浮液，然后可将其给药，优选在其制备后不久进行。除上述磷脂外，稳定层还可包括其它两性材料，例如脂肪酸。
常规的制备方法通常提供充气微泡悬浮液，其尺寸分布具有相对较高的多分散指数(PDI)，数学上定义为微泡群的标准偏差“s”与平均尺寸“n”之比：PDI＝s/n*100％。例如，通常的制备方法可以提供平均直径为约2-3微米且PDI为约60％的微泡。尽管具有相对较高的PDI(例如60％)的微泡、尤其是充气微泡通常非常适合大多数实际成像技术，但仍然可以针对所述成像技术对这种PDI进行优化。此外，对于某些治疗性超声应用，最好将PDI最小化。
因此，已经开发出了用于制备所谓的“尺寸可控”或“单分散”微泡的方法，即充气微泡制剂，其中PDI低于10％，优选低于5％，甚至更优选低于2％。
制备单分散微泡的合适方法包括，例如使用微流体技术，通常通过使用T形结或流动聚焦装置。简而言之，在流动聚焦装置中，气体组分的流动被通过狭窄孔口的液体组分的流动聚焦。通常，液体组分包含包膜形成材料(通常是表面活性剂，例如脂类，包括磷脂和/或脂肪酸)，其包封气态组分形成所需的充气微泡，充气微泡通过所述包膜形成材料稳定以防止聚结和溶解。
同一申请人的参考文献2涉及一种微流体制备方法，该方法采用受控的温度条件以限制微泡在制备装置出口处的聚结现象，从而保持新鲜形成的微泡的所需可控尺寸。
然而，已经观察到，即使通过上述方法限制聚结现象，在制备过程结束时收集的新鲜形成的充气微泡可能固有地变得不稳定，导致形成较大尺寸的微泡(相对于所需的校准尺寸)，因此在形成的微泡群中PDI增加，并且最终可能在微泡的液体悬浮液的顶部形成不期望的非常大的微泡的泡沫层。如参考文献1所示，上清液泡沫层中包含的此类较大微泡可能持续数小时，直到其最终尺寸减小以达到其最终的稳定尺寸(基本上对应于原始校准尺寸)为止。当使用水中溶解度低的气体(例如SF6、C3F8或C4F10)(这些气体通常用于改善常规造影剂微泡的持久性)时，这种PDI的增加和相关的起泡现象变得尤为重要。如果悬浮液放置足够长的时间(几小时，如果放在密封容器中，通常几天甚至更长)，则PDI的增加和相关的起泡现象在原则上都是可逆的，但这种泡沫的存在在任何情况下都是非常不希望的，因为这会给微泡使用(例如给药)或所产生的微泡悬浮液的后续后处理带来必要的延迟。
因此，为了限制或避免这种PDI增加和起泡现象，仍然需要使用微流体流动聚焦在形成后立即使充气微泡快速稳定的方法。
申请人现在发现，通过在制备过程中使用在水中溶解度低的气体和在水中溶解度高的气体的混合物，可以明显减少所述可能的PDI增加和起泡现象。
参考文献2公开了填充有气体混合物的微泡，特别是59-99.5％的在水中溶解度较高的气体A和41-0.5％的在水中溶解度较低的气体B的混合物。
发明内容
因此，根据第一方面，本发明涉及一种用于制备充气微泡的悬浮液的方法，该方法包括：
-提供(i)气体流和(ii)包含微泡稳定材料的含水液体流；
-将所述气体流和所述液体流通过各自的入口通道引向接触区；
-将来自所述接触区的所述气体流和所述液体流引导经过校准的孔口，以获得包含所述充气微泡的含水悬浮液；和
-将包含所述微泡的所述悬浮液引向出口通道；
其中所述气体流包括第一气体和第二气体，所述第一气体在水中的溶解度高，所述第二气体在水中的溶解度低，所述第二气体在所述气体流中的体积百分比为18％至2％。
优选地，所述第一气体在气体流中的体积百分比为15％或更低，更优选为13％或更低。所述体积百分比优选为至少3％，更优选为至少5％。
高水溶性气体在水中的溶解度(定义为Bunsen系数“α”)优选高于0.01，更优选高于0.1，甚至更优选高于0.5。在水中溶解度低的气体在水中的溶解度优选为0.008或更低，更优选为0.001或更低，甚至更优选为0.0008或更低。特别优选在水中溶解度为0.0005或更低的气体。
在完成制备过程之后，所得的稳定的充气微泡通常包含至少45％的所述第二气体(相对于气体的总体积)，优选至少60％。
微泡稳定材料优选为两性化合物，更优选为磷脂。
附图说明
图1是微流体流动聚焦装置的核心部分的示意图。
图2示出了可用于本发明的流动聚焦方法的微流体装置的示例性示意图(俯视图)。
图3示出了可用于本发明方法的装置的示例性示意图。
图4示出了气体混合器的示意性示例。
图5示出了用于本发明的制备方法的设置的说明性示例。
图6示出了从新鲜形成的到最终稳定的充气微泡的尺寸减小的示意性示例。
图7显示了用100％水不溶性气体制备的新鲜形成的充气微泡的图片，以及在稳定过程中对应尺寸变化的图片。
图8示意性地显示了在制备充气微泡中使用水溶性和水不溶性气体的混合物的效果。
图9示出了在本发明充气微泡的形成过程中温度控制的实验结果。
图10示出了根据本发明用其它两性材料形成充气微泡的过程中温度控制的实验结果。
图11示出了对充气微泡的悬浮液的冷却作用的实验结果。
具体实施方式
根据微流体技术制备的气态微气泡需要在形成后立即快速稳定以防止气体溶解来保持尺寸的单分散性。气体溶解主要由源自气液界面之间表面张力的Laplace压力驱动。通过添加合适的微泡稳定剂(例如两性化合物如磷脂或脂肪酸)，所述化合物的两性分子在气-液界面处形成单层，导致表面压力，从而使微泡稳定。然而特别地，新鲜形成的微泡的气体含量(主要由于新鲜形成的微泡周围两性分子层相对松散堆积，见图6中的A)倾向于部分释放(或溶解)在周围的液体中。虽然在气体溶解过程中气液界面处的磷脂单层被机械压缩，但最终达到磷脂堆积密度足够高的状态，产生的表面压力平衡了表面张力并最终将微气泡稳定在其最终尺寸(图6中的B)。在一些实施方案中，新鲜形成的微泡的初始半径(Ri)约为稳定微泡最终半径(Rf)的两倍。如以上引用的T.Segers的论文所述，通过称为“Ostwald熟化”的现象，溶解的气体负责增加微泡悬浮液的多分散性，形成大的微泡，最终形成泡沫层。
图7A显示了通过使用100％C4F10气体的气体流通过微流体流动聚焦制备获得的新鲜形成的磷脂稳定的微泡的代表性图像；这些新鲜形成的微泡在形成后立即获得，因此具有基本均匀的尺寸分布，如从图像可观察到的。但如图7B所示，在形成后的后续稳定过程中，一些微泡(由白色箭头指示)迅速收缩至其最终稳定的大小，约为新鲜形成的微泡直径的一半，而其它微泡(由黑色箭头指示)通过Ostwald熟化生长，这是由于收缩的微泡使释放在液体悬浮液中的气体向内扩散所致(为完整起见，在图7B中还观察到处于中间收缩或生长阶段的气泡)；因此，观察到微泡的多分散分布，由于存在大尺寸微泡，因此形成泡沫。
如上所述，虽然PDI增加和与微泡生长相关的泡沫形成通常是可逆的(因此最终的悬浮液包含基本上单分散的微泡)，但是泡沫的尺寸稳定和消失可能要花费许多小时。
因此，申请人发现，通过使用如上所定义的合适的气体混合物，可以明显减少或基本上避免这种PDI增加和起泡现象。
特别地，如图8所示，新鲜形成的微泡(图8中的A)包含高度可溶于水的气体(“HS气体”，图8的微泡中以黑色背景表示)和在水中溶解度低的气体(“LS气体”，在图8中以散布在HS气体中的灰点表示)的混合物。在稳定阶段，大量的高溶解度气体迅速溶解在水中，而溶解性差的气体仍被包封在两性化合物的致密堆积层中(图8中的B)，通常会有一些残留量的HS溶解性气体分散在其中。与溶解的LS气体(当微泡用100％的LS气体制备时释放的LS气体)不同，溶解的HS气体不会触发任何Ostwald熟化，因为该气体有利地保持溶解在液相中。如申请人所观察到的，HS气体的溶解度越高，起泡现象和PDI增加越低。
在本说明书和权利要求书中，气体在水中的溶解度由该气体在25℃下测得的Bunsen系数“α”定义。如本领域中已知的，Bunsen系数是无量纲的值，其对应于在测量温度和1bar的分压下被单位体积的纯溶剂吸收的气体的饱和体积(还原至T＝273.15°K，p＝1bar)。
合适的HS气体是Bunsen系数为0.010或更高的那些气体，优选为0.100或更高，甚至更优选为0.500或更高。这些气体还优选具有相对较低的分子量，例如低于80道尔顿。此类气体的示例包括氮气(α＝0.0144，Mw 28.01)、空气(α＝0.0167，Mw 28.96)和二氧化碳(α＝0.7614，Mw44.01)，后者由于其在水中溶解度较高而特别优选。
合适的LS气体是Bunsen系数为0.0080或更低的气体，更优选为0.0010或更低，甚至更优选为0.0008或更低。特别优选在水中的溶解度为0.0005或更低的气体。这些气体还优选具有相对较高的分子量，例如高于120道尔顿，优选高于160道尔顿。
合适的LS气体包括氟化气体，优选全氟化气体。氟化气体包括含有至少一个氟原子的材料，例如氟化烃(含有一个或多个碳原子和氟的有机化合物)；六氟化硫；氟化酮，优选全氟化酮，如全氟丙酮；氟化醚，优选全氟化醚，例如全氟二乙醚。优选的化合物是全氟化气体，例如SF6或全氟化碳(全氟化烃)，即所有氢原子都被氟原子取代的烃，已知它们形成特别稳定的充气微泡悬浮液。
术语全氟化碳包括饱和、不饱和和环状全氟化碳。生物相容、生理上可接受的全氟化碳的实例是：全氟烷烃，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选地与其它异构体如全氟异丁烷混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃，例如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟丁-2烯)或全氟丁二烯；全氟炔烃(例如全氟丁-2-炔)；和全氟环烷烃(例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷)。优选的饱和全氟化碳包括例如CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12和C6F14。特别优选的气体是在室温下呈气态的气体、包括SF6、C3F8、C4F10。
如申请人所观察到的，通过使用18体积％或更少(优选为15％或13％或更少)的LS气体与HS气体混合的气体混合物，新鲜形成的微泡在稳定过程中容易并优选地释放HS气体，而LS气体仍被包封在微泡中。这导致其中包含明显更高量的LS的稳定的充气微泡，LS通常占最终稳定的微泡中所含气体总体积的至少45％，优选至少60％。例如，已经观察到，在某些实施方案中(其中从新鲜的微泡收缩到稳定的微泡体积减少约1/8)，在制备的气体混合物中以13％LS气体的体积含量制备的微泡具有约70％的最终稳定形式的LS气体浓度。类似地，在制备气体混合物中以5％的LS气体的体积含量制备的微泡具有约50％的最终稳定形式的LS气体浓度。
另一方面，已经观察到LS气体的体积应优选为制备气体流总体积的至少2％，以使微泡具有可接受的持久性或耐压值(通常希望如此，以在给药并在血管中承受相对较高的血压时使微泡保持循环)。更优选制备气体流中LS气体的体积应为气体总体积的至少3％，甚至更优选为至少5％。
微泡稳定材料
适合于形成充气微泡稳定层的材料(即微泡稳定材料)是本领域已知的那些。这些优选包括两性材料。用于本发明方法的合适两性材料包括例如：磷脂；溶血磷脂；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；含聚合物脂类，例如壳质、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)(也称为“聚乙二醇化脂类”)；含磺化单糖、二糖、寡糖或多糖的脂类；胆固醇、胆固醇硫酸酯或胆固醇半琥珀酸酯；生育酚半琥珀酸酯；具有醚或酯连接的脂肪酸的脂类；聚合脂类；二乙酰磷酸酯；二鲸蜡磷酸酯；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯、乙氧基化大豆固醇、乙氧基化蓖麻油或环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)嵌段共聚物；糖酸的甾醇酯，包括胆固醇葡糖醛酸苷、羊毛甾醇葡糖醛酸苷、7-脱氢胆固醇葡糖醛酸苷、麦角固醇葡糖醛酸苷、胆固醇葡萄糖酸酯、羊毛甾醇葡萄糖酸酯或麦角固醇葡萄糖酸酯；糖酸和醇的酯，包括月桂基葡糖醛酸苷、硬脂酰基葡糖醛酸苷、肉豆蔻酰基葡糖醛酸苷、月桂基葡萄糖酸酯、肉豆蔻酰基葡萄糖酸酯或硬脂酰基葡萄糖酸酯；糖和脂肪酸的酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡萄糖醛酸、葡糖酸或聚脲醛酸；皂苷，包括沙参皂苷元、异菝葜皂甙元、红景天苷、齐墩果酸或洋地黄毒苷配基；甘油或其与脂肪酸的甘油单酯，包括甘油单棕榈酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯或甘油单月桂酸酯；长链醇，包括正癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或正十八烷醇；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；双半乳糖甘油二酯；6-(5-胆甾烯基-3β-基氧基)己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-(5-胆甾烯-3β-基氧基)己基-6-酰胺基-6-脱氧-1-硫代-β-D-甘露吡喃糖苷；12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基-氨基)十八碳烯酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)十八烷酰基]-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰二油基磷脂酰乙醇胺；1,2-二油基-sn-甘油；1,2-二棕榈酰-sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰-2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油磷酸乙醇胺或棕榈酰基同型半胱氨酸；烷基胺或烷基铵盐，其包含至少一个(C10-C20)、优选(C14-C18)烷基链，例如N-硬脂胺、N,N′-二硬脂胺、N-十六烷基胺、N,N′-双十六烷基胺、N-硬脂基氯化铵、N,N′-二硬脂基氯化铵、N-十六烷基氯化铵、N,N′-双十六烷基氯化铵、二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；叔或季铵盐，其包含一个或优选两个通过(C3-C6)亚烷基桥与N原子相连的(C10-C20)、优选(C14-C18)酰基链，例如1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷(DSTAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷(DPTAP)、1,2-油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵丙烷(DSDAP)；及其混合物或组合物。
根据一个优选实施方案，形成微泡包膜的至少一种化合物是磷脂，任选与任何其它上述材料混合。根据本说明书，术语磷脂旨在涵盖任何两性磷脂化合物，其分子能够形成材料的稳定膜(通常以单分子层的形式)，特别是在最终微泡悬浮液中的气-水界面处。因此，这些材料在本领域中也称为“成膜磷脂”。
两性磷脂化合物通常包含至少一个磷酸根基团和至少一个、优选两个亲脂性长链烃基。
合适的磷脂的例子包括甘油与一个或优选两个(相同或不同)脂肪酸残基以及与磷酸的酯，其中磷酸残基又与亲水基团结合，例如胆碱(磷脂酰胆碱-PC)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰肌醇)。仅具有一个脂肪酸残基的磷脂的酯在本领域中通常被称为磷脂的“溶血”形式或“溶血磷脂”。存在于磷脂中的脂肪酸残基通常是长链脂族酸，通常包含12至24个碳原子，优选14至22个碳原子；脂族链可包含一个或多个不饱和键，或优选完全饱和。磷脂中包括的合适脂肪酸的实例有例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选使用饱和脂肪酸，例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。
磷脂的其它实例有：磷脂酸，即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂，例如鞘磷脂，即那些甘油二酯与脂肪酸的残基被神经酰胺链取代的磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即1,3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯；糖脂，如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；糖脂；硫化物和糖鞘脂。
如本文所用，术语磷脂包括天然存在的、半合成或合成制备的产物，它们可以单独或以混合物形式使用。
天然存在的磷脂的例子是天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)，例如大豆或蛋黄卵磷脂。
半合成磷脂的例子是天然存在的卵磷脂的部分或完全氢化的衍生物。优选的磷脂是磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
优选的磷脂的例子是例如二月桂酰基-磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰-磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰基-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、双十五烷酰基-磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈油酰基-磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈油酰基-2-肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰基-2-油基磷脂酰胆碱(POPC)、1-油基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐、二花生四酰基磷脂酰甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二花生四烯酰基磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二花生四烯酰基磷脂酰己胺(DAPE)、二亚油酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生四烯酰基磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)、二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)、二花生四烯酰基磷脂酰肌醇(DAPI)、二豆蔻酰基磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二油酰基磷脂酰肌醇(DOPI)。
合适的磷脂还包括通过将亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)与其连接而改性的磷脂。优选的聚合物改性的磷脂包括“聚乙二醇化的磷脂”，即与PEG聚合物结合的磷脂。聚乙二醇化磷脂的实例是聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(简称“PE-PEG”)，即其中亲水性乙醇胺部分连接至不同分子量(例如300至20000道尔顿，优选500至5000道尔顿)的PEG分子的磷脂酰乙醇胺，例如DPPE-PEG(或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG)。例如，DPPE-PEG2000是指其上连接有平均分子量约为2000的PEG聚合物的DPPE。
特别优选的磷脂是DAPC、DSPC、DPPC、DMPA、DPPA、DSPA、DMPG、DPPG、DSPG、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最优选的是DPPG、DPPS和DSPC。
也可以使用磷脂的混合物，例如DPPE和/或DSPE(包括聚乙二醇化衍生物)、DPPC、DSPC和/或DAPC与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。
例如，磷脂的混合物可包括磷脂酰胆碱衍生物、磷脂酸衍生物和聚乙二醇化的磷脂酰乙醇胺，例如DSPC/DPPA/DPPE-PEG、DPPC/DPPA/DPPE-PEG、DSPC/DPPA/DSPE-PEG、DPPC/DPPA/DSPE-PEG、DAPC/DPPA/DPPE-PEG、DAPC/DPPA/DSPE-PEG、DSPC/DSPA/DPPE-PEG、DPPC/DSPA/DSPE-PEG、DSPC/DSPG/DPPE-PEG、DPPC/DSPG/DSPE-PEG。
根据本发明一个实施方案，磷脂是微泡稳定包膜的主要成分，占形成充气微泡包膜的组分总量的至少50％(w/w)，优选至少75％。在一些优选实施方案中，基本上全部包膜(即至少90％w/w)可以由磷脂形成。
磷脂可以方便地与任何以上列出的两性化合物混合使用。因此，例如脂类如胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、没食子酸丙酯或抗坏血酸棕榈酸酯，脂肪酸例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸及其衍生物或丁基化羟基甲苯和/或其它非磷脂化合物可以任选地添加至一种或多种前述磷脂中，例如，其比例优选为0-50重量％，更优选至多25％。例如，可以有利地使用包含磷脂和脂肪酸的两性材料的混合物，包括DSPC/DPPG/棕榈酸，DSPC/DPPE-PEG/棕榈酸、DPPC/DPPE-PEG/棕榈酸、DSPC/DSPE-PEG/棕榈酸、DPPC/DSPE-PEG/棕榈酸、DSPC/DPPE-PEG/硬脂酸、DPPC/DPPE-PEG/硬脂酸、DSPC/DSPE-PEG/硬脂酸或DPPC/DSPE-PEG/硬脂酸。
根据本发明的方法制备的微泡可以任选地包含靶向配体。
术语“靶向配体”在其含义内包括具有或能够促进本发明的组合物微泡对活体内任何生物或病理部位的靶向活性(例如包括选择性结合)的任何化合物、部分或残基。可以与靶向配体结合的靶位包括：组织，例如心肌组织(包括心肌细胞和心肌细胞)、膜组织(包括内皮和上皮)、薄片、结缔组织(包括间质组织)或肿瘤；血块；和受体，例如肽激素、神经递质、抗原、补体片段和免疫球蛋白的细胞表面受体以及类固醇激素的细胞质受体。
靶向配体可以是合成的、半合成的或天然存在的。可以用作靶向配体的材料或物质包括但不限于蛋白质，包括抗体、抗体片段、受体分子、受体结合分子、糖蛋白和凝集素；肽，包括寡肽和多肽；拟肽；糖，包括单糖和多糖；维生素；类固醇、类固醇类似物、激素、辅因子、生物活性剂和遗传物质(包括核苷、核苷酸和多核苷酸)。
靶向配体可以是用于形成微泡的两性化合物本身(与微泡其它组分混合)或与两性分子(例如磷脂)结合的化合物。
在一个优选实施方案中，靶向配体可以通过共价键与形成微泡的稳定包膜的两性分子(例如磷脂)结合。为了共价结合所需的靶向配体，形成微泡包膜的两性化合物的至少一部分应因此包含合适的反应性部分，并且包含互补官能度的靶向配体将根据已知技术与其相连，例如通过将其添加到包含微泡的两性组分的分散体中。优选地，两性化合物是含有亲水聚合物的脂类，例如前面提到的那些，优选聚乙二醇化的磷脂。在这种情况下，靶向配体连接至亲水聚合物上的合适的反应性部分。在制备微泡之前，可以将两性化合物与所需的靶向配体结合，并且可以将如此获得的组合物用于微泡制备。或者，可以首先制备微泡，其包含具有能够与靶向配体的相应互补部分相互作用的合适部分的化合物(脂类或聚合物改性的脂类)；之后，将所需的靶向配体加入到微泡悬浮液中，以结合微泡上相应的互补部分。根据另一个实施方案，靶向配体还可以通过物理和/或静电相互作用与微泡适当结合。
含水液体流
用于根据本发明方法制备校准的充气微泡的含水液体流包含分散在含水载体中的浓度为例如5.0-20mg/mL、优选7.5-15mg/mL的两性材料(如上所定义)。
合适的含水载体，其优选是生理学上可接受的，包括水(优选无菌水)、水溶液例如盐水(可以有利地进行平衡以使得注射用的最终产品不是低渗的)或一种或多种张力调节物质的溶液。张力调节物质包括盐或糖、糖醇、二醇或其它非离子多元醇材料(例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)、壳聚糖衍生物如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖或凝胶化化合物如羧甲基纤维素、羟乙基淀粉或葡聚糖。
在替代实施方案中，可以添加另外的油相以将治疗用疏水性物质掺入微泡中。为此，可以在装置中提供两个附加的导管以供应所需的油相，例如参考文献2所述。因此，所形成的充气微泡将在气体和两性材料的稳定层之间的界面处有一层油膜，该油膜可以装载有所需的治疗剂。合适的油可以包括在室温下为液体的任何生物相容性油，包括例如具有饱和或不饱和(C2-C18)烷基链的甘油的单酯、二酯或三酯(包括相同烷基或不同烷基的酯)，例如甘油单丁酸酯、甘油单亚油酸酯、1,2-二己酰基甘油、1,2-二辛酰基甘油、1,2-二油基-sn-甘油、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯及其混合物；或天然油如大豆油、橄榄油、红花籽油、葵花籽油、花生油及其混合物。
混合气体流
根据本发明方法制备校准的微泡的气体流按上述各体积比包含上述气态化合物的混合物。
图4示出了可用于本发明方法的示意性气体混合装置。所述气体混合装置包括两个气体容器401和402，各气体容器分别填充有HS气体和LS气体。各气体的流量分别由相应的质量流量控制器(MCF)403和404调节。MCF由控制单元405控制(例如以诸如LabView、National Instruments或Matlab、Mathworks的编程语言实现并安装在个人计算机上的定制软件程序)以设置和保持所需的混合比。压力传感器406测量包含气体混合物的输出通道中的实际压力，该通道通向其中形成微泡的微流体芯片407。以此方式，可以根据所需的设置控制和调节操作微流体芯片的所需气体流，并且可以相应地调节MCF以维持相同的混合比。如图4所示的装置可用于在通过微流体流动聚焦形成微泡特别需要的条件下精确混合水溶性明显不同的两种气体。以这种方式，可以以可重复的方式以最佳PDI、最佳产率并且不存在形成泡沫的大气泡下制备高度稳定的校准微泡。
有利地，可以使用共同待审申请PCT/EP2017/071788中所述的制备方法，其中控制新鲜形成的微泡温度以限制聚结。
图1示出了可用于本发明方法的流动聚焦装置(“微流体芯片”)的核心部分100的示意图。芯片包括用于(混合)气体流101′进料的第一进料通道101和用于供应包含两性材料的液体流的两个附加的进料通道102a和102b。
该混合气体流和两个液体流被引向接触区103，然后经过校准孔口104，如图1中的虚线所示。校准孔口连接至优选具有与孔口相同横截面的校准通道104′，该校准通道104′又连接至出口通道106的初始部分105。在替代实施方案中(未示出)，校准孔口104可以是直接连接到出口通道106的初始部分105的喷嘴，即其间没有校准通道。微泡103′形成在校准孔口中，并通过校准通道104′引导至出口通道106的初始部分105。出口通道的水力直径通常大于校准孔口的水力直径，并且通常从校准孔口的初始直径增加到出口通道106的最终直径，基本上对应于收集管的水力直径(未显示)，将流动聚焦装置连接到容器，例如用于收集微泡悬浮液的密封小瓶。
通过控制装置的出口通道的初始部分105中以及优选接触区103和校准孔口104中微泡的温度，可以大大减少可能在出口通道的初始部分中发生的不希望的微泡聚结现象。
特别地，出口通道的初始部分优选保持在相对于包含在液体流中并形成微泡稳定包膜的两性材料的转变温度(Tm)低不少于20％的温度下。更优选地，所述温度相对于两性材料的Tm低不少于10％。虽然通常不必使温度过高地高于Tm，但该温度可以足够高，与两性材料的耐热降解性相容；例如，所述温度可以比两性材料的Tm高至多20％，优选高至多10％。在优选实施方案中，所述温度等于或稍高于两性材料的Tm(例如高至多5℃)。温度控制在出口通道的区域中特别有用，其中微泡的含水悬浮液的流动尚未达到基本上恒速，例如，当绝对速度梯度大于约10s-1时。取决于芯片的几何形状，所述区域可以从校准孔口延伸大约0.1-100mm的长度，优选地1.0-50mm，和更优选地2.0-30mm。
有利地，所述温度可以类似地通过将上述指定的参数也施加到接触区和校准孔口(以及如果存在的话，施加到校准通道)来控制。
所施加的受控温度明显降低所形成的微泡之间的聚结。
如实验部分详细显示的，通过将温度保持在两性材料的Tm或附近，通过使用明显浓度更低的两性材料(与未加热时所需的较高浓度相比)，观察到聚结减少。
液体流聚焦装置可以是本领域已知的任何装置，例如参见例如参考文献3中所述。优选地，流动聚焦装置包括芯片，例如参考文献4中所述的芯片。
参考图2的示意图，芯片200可以包括：第一入口通道201，通过该通道供应气体混合物流；以及两个入口通道202′和202″，通过这两个入口通道供应液体流。每个所述入口通道通过相应的管与相应的贮槽连接(未示出)。该芯片还包括出口通道203，该出口通道通过相应的管与用于收集微泡悬浮液的容器连接(未示出)。相对于通道201b和202b的其余部分，入口通道201a和202a接近校准孔口的最后部分的横截面明显减小。该最终部分201a和202a的横截面可以从25变化到1x104μm2，优选从200变化到1x103μm2，有利地基本上对应于校准孔口的横截面。入口通道的初始部分的横截面可在1x103μm2至1x106μm2之间变化，优选地在1x104μm2至1x105μm2之间变化，而它们的长度可以在50mm至1mm之间变化，优选地在2mm至5mm之间。类似地，出口通道(对应于图1中的校准通道)的初始部分203a的横截面也相对减小；其截面通常根据待制备微泡的所需直径来校准(参见例如参考文献4)。例如，为了制备平均直径为5μm的单分散微泡，校准孔口和校准通道的横截面积为约250至2500μm2。有利地，入口通道的横截面和出口通道的横截面以及它们各自的最终和初始部分的横截面基本上相同。校准通道203a的长度可以在大约0.05mm至大约10mm的范围内变化，优选地在1mm至5mm的范围内，而出口通道的总长度可以为至多100mm，优选至多50mm，并且更优选至多30mm。通常，芯片是由两半石英玻璃、熔融石英或任何塑料(例如聚(甲基丙烯酸甲酯)材料制成。可以通过干蚀刻或湿蚀刻每一半的内表面至整个所需深度和宽度来产生所述通道。例如，可以以14μm的恒定深度和15-20μm的宽度蚀刻接近于接触区的各个校准部分的表面，并且以14μm的恒定深度和0.5-1.0mm的宽度蚀刻其余部分的表面。适用于本发明方法的可商购芯片例如可由Dolomite microfluidics(英国Royston)或Micronit(荷兰Enschede)获得。
根据一个优选实施方案，为了保持所形成微泡的单分散性，可以随后将悬浮液迅速冷却至低于两性材料Tm的温度，优选在悬浮液在收集区中的流动已经达到基本恒速后。
参考图3，如上所述，包括流动聚焦装置的核心部分的单元300(例如图2所示的芯片)可以保持在接近或略高于两性材料Tm的所需温度，例如通过恒温浴实现。包含两性材料的气体流和液体流从相应的气体混合装置301(例如如图4中所示的)供应到单元300，并且通过各自的供应管(内径为例如100至1000μm，优选150至250μm)从贮槽302供应到单元300。出口管303将单元300的出口通道(未示出)连接至合适的收集容器304，例如密封小瓶。通常有利的是，在微泡形成后的几秒钟内开始冷却微泡悬浮液，优选在悬浮液流量达到基本恒速后立即开始冷却。通常，所述冷却可在微泡形成后的180秒内开始，优选在60秒内，更优选在10秒内，甚至更优选在2秒内开始。取决于流动聚焦装置的几何形状，通常在微泡形成后几毫秒或更短时间内达到恒定流量；因此，可以在微泡形成后1毫秒开始施加冷却。由于通常微泡悬浮液在形成后不到几毫秒内到达单元300的出口，因此可以有利地对离开单元300的出口管的初始部分进行冷却。因此，出口管的初始部分有利地通过适当的冷却装置305例如换热器进行冷却，以将充气微泡悬浮液的温度降低到形成微泡稳定包膜的两性材料的Tm以下。取决于例如单元300的加热温度、所施加冷却的效率、接触时间等，经受冷却的出口管初始部分的长度可以例如从1cm至100cm变化，优选从5cm至10cm变化。
收集微泡悬浮液的容器304优选是(玻璃)小瓶，通常具有密封盖(例如橡胶塞)。所述容器优选在环境压力下预填充有在制备过程中使用的相同LS气体。优选地将排气装置(例如针头)插入容器中，以平衡由小瓶的液体填充产生的过压。
当在本文中提到两性材料的转变温度Tm时，所述温度可以指单一两性组分或两性组分的混合物。
特别地，当形成稳定包膜的两性材料是不同两性组分的混合物时，所述Tm通常是指所述两性组分混合物的Tm。对于两性材料的混合物，所测得的Tm通常对应于混合物中各组分的Tm的摩尔比加权平均值。
含水脂类混合物的Tm可有利地通过使用差示扫描量热法(DSC)测量。包括磷脂的两性材料(纯的或混合物)的Tm的测量可以通过例如使用DSC-Q2000装置(TA Instruments，New Castle，DE USA)进行。测量诸如转变开始并达到其峰值的温度和转变焓之类的参数以确定Tm。实验部分提供了测量的详细信息。
图5示出了用于生产校准微泡的微流体流动聚焦装置的实例。包含LS气体和HS气体的混合物的气体流502(例如来自图4的混合装置)，和液体流501(包含两性材料，例如磷脂、脂肪酸或其混合物)被供应到微流体芯片503，以通过孔口504产生微泡。将微泡悬浮液收集在小瓶505中，小瓶505优选在环境压力下预填充有LS气体。优选使用排气装置(例如针头506)来平衡由小瓶的液体填充产生的过压。在收集微泡悬浮液结束时，优选移除排气装置，并且优选将容器密封以避免与外部大气的进一步气体交换。
用途
根据本发明方法制备的微泡可用于多种诊断和/或治疗技术中，尤其包括超声和磁共振。
诊断技术包括使用充气微泡以增强动物体(包括人体)的部分或部位可视化的任何方法，包括用于临床前和临床研究的成像。超声应用中可以采用多种成像技术，例如包括基波和谐波B模式成像、振幅调制、脉冲或相位反转成像以及基波和谐波多普勒成像；如果需要，可以使用三维成像技术。
用于诊断用途的微泡可以(例如通过注射)以每kg体重约0.01至约1.0μL气体的浓度给药，这取决于例如它们各自的组成、待成像的组织或器官和/或所选的成像技术。当然，该一般浓度范围可以根据特定的成像应用变化，例如，当信号可以在非常低剂量下观察时，例如在振幅调制和脉冲反转成像中。
其它可能的诊断成像应用包括闪烁显像、光成像和X射线成像，包括X射线相衬成像。
治疗技术包括对患者的任何治疗方法(如上定义)，包括使用微泡本身(例如超声介导治疗缺血性中风、血块溶解等)或与治疗剂联合使用(例如用于生物活性化合物向选定位点或组织的递送，例如用于药物递送、基因治疗或用作疫苗)，并且其能够通过自身或通过各种物理方法(包括例如超声介导递送)进行特异性激活而在体外和/或体内发挥或负责发挥生物学作用。
用于治疗的微泡通常可以以每kg体重约0.01至约5.0μL气体的浓度给药，这取决于例如它们各自的组成、治疗对象的类型、待治疗的组织或器官和/或所采用的治疗方法。
下列实施例将有助于进一步说明本发明。
实施例
材料
Figure BDA0002669257720000181
(1)CordenPharma International，Plankstadt,德国；
(2)F2 Chemicals Ltd,Preston,英国；
(3)Carbagas，Lausanne,瑞士。
实施例1
充气微泡的制备
使用安装在市售芯片梦支架(Dolomite microfluidics，部件号：3000024、3000109、3000021)中的市售微流体流动聚焦装置(Dolomite microfluidics，小液滴芯片，蚀刻深度为14μm，部件号3200136)合成微泡，其中使芯片与气体和液体供应管(PeekUpchurch，外径1/16英寸，内径150μm)密封连接。微泡形成通道的宽度为17μm，长度为135μm。整个通道深度为14μm。将芯片及其支架放置在光学透明的温控水浴中，该水浴安装在配备有20倍放大物镜(Olympus,LMPLAN 20x)和CCD相机(Lumenera，LM156M)的倒置显微镜上。将恒温浴的温度设定为50℃(相当于稍微低于液体流中两性材料混合物的转变温度的温度)。
液体流中的两性材料为：
DSPC：DPPE-PEG5000的对应摩尔比为9:1。通过实验确定混合物的Tm为55℃。
在60℃搅拌下，按上述摩尔比在浓度为20mg/mL下将所述材料添加到2:1(体积比)的氯仿/甲醇混合物中，直到两性材料完全溶解。然后在减压下蒸发溶剂，并将获得的膜在减压下干燥过夜。然后将干燥的材料在搅拌下于60℃的盐水(0.9％NaCl)中再分散(浓度为15mg/mL)30分钟。然后通过使用tip超声仪(Branson Sonifier 250)对分散体进行超声处理以使材料均匀分散。然后制剂使用聚碳酸酯过滤器(孔径为0.45μm)过滤、冷却至室温并脱气。
用类似于图4所示的气体混合装置制备具有可变体积比的HS气体和LS气体的充气微泡。简而言之，将两个气体容器分别充有作为HS气体的CO2和作为LS气体的C3F8。每种气体的气体流量由各自的质量流量控制器调节：(i)EL-Flow：F200CV-002-RAD-11-K，用于HS气体；以及(ii)Low-△P-Flow：F-200DV-RAD-11-Z,用于LS气体(两个气体控制器均来自Bronkhorst,Ruurlo，荷兰)。质量流量控制器由安装在个人计算机上的Matlab(Mathworks)中实现的定制软件程序控制，以设置并保持所需的混合比。压力传感器(PSE530-M5-L；SMCCorp.,东京,日本)测量通向微流体芯片的出口通道中气体混合物中的实际压力。使用1.8巴的气压形成微泡。通过使用单独的质量流量控制器(Mini Cori Flow：M13V14I-MAD-11-K-S；Bronkhorst，Ruurlo，荷兰)控制液体的并流流率。大约140μL/min的液体并流流率用于在射流状态下操作流动聚焦装置，并产生直径(模拟)约为4μm的微泡。
然后将微泡悬浮液收集在用C3F8饱和的密封排气小瓶中。
对于各种制剂，测量在小瓶中收集的液体悬浮液上方形成的泡沫层的相对高度，以液体悬浮液高度的相对百分比表示。结果示于下表I中。
表I：不溶性气体百分比与泡沫高度
制剂编号 体积％C<sub>3</sub>F<sub>8</sub> 泡沫层高度(％)
1 2 1
2 7 1
3 10 1
4 13 2
5 20 4
7 30 7
从上表可以推断，高于20％的LS气体体积大大增加充气微泡含水悬浮液上方的不希望的泡沫形成。另一方面，13％或更低、优选10％或更低的LS气体量大大减少泡沫形成。
实施例2
测定耐压性和LS气体浓度
通过用C4F10代替C3F8作为LS气体重复实施例1的制备。根据以下程序测试了三种含5％C4F10的制剂和两种含13％C4F10气体的制剂的充气微泡的耐压性。耐压性根据吸光度测量值作为静液压过压的函数测定。对应于在0mmHg过压下测得的吸光度50％的静液压过压(以mmHg表示；1mmHg＝133.3帕斯卡)被视为耐压值或Pc50。
使用改进的分光光度计(Jenway 6300，Barloworld Jenway，Stone，英国)在700nm波长处测量吸光度。使用由LabView((National Instruments,Austin,TX)编写的内部开发软件程序控制的比例阀调节的压缩空气(T2000，Marsh Bellofram，Newell，WV)，通过以4.2mmHg/s速度增加的过压，将准静态压缩施加到封装在密封杯中的微泡悬浮液上。
针对具有5％C4F10的三种制剂测得的Pc50在600至780mmHg之间，而针对具有13％C4F10的两种制剂测得的Pc50在705至727mmHg之间，因此显示出不同制剂的耐压性相当。
还根据以下程序测量了最终稳定微泡中LS气体的浓度。将1mL体积的微泡悬浮液注入一个单独的密封小瓶中，超声处理60分钟，以破坏所有微泡并静置1小时。然后通过气相色谱法测量顶部空间中LS气体的量。
用浓度为5％的C4F10和95％的CO2制备的稳定微泡中C4F10的最终浓度为50％，而用浓度为13％的C4F10和87％的CO2制备的微泡中C4F10的最终浓度为70％。
实施例3
两性材料的水分散体的制备
使用具有不同相变温度(Tm)的两性材料的两种混合物：
M1：DSPC：DPPA：DPPE-PEG5000(Tm＝55℃)
M2：DPPC：DPPA：DPPE-PEG5000(Tm＝44℃)
两者的摩尔比均为8:1:1。
在60℃搅拌下，按上述摩尔比在浓度为20mg/mL下将所述材料添加到2:1(体积比)的氯仿/甲醇混合物中，直到两性材料完全溶解。然后在减压下蒸发溶剂，并将获得的膜在减压下干燥过夜。然后将干燥的材料在搅拌下于60℃的甘油、丙二醇和水的混合物(GPW，体积比为5:5:90)中再分散(浓度为5至15mg/mL，如“微泡的制备”部分所述)30分钟。加入TRIS缓冲液(20mM)以将pH值调节至7。然后通过使用tip超声仪(Branson Sonifier 250)对分散体进行超声处理以使材料均匀分散。然后制剂使用聚碳酸酯过滤器(孔径为0.45μm)过滤、冷却至室温并脱气。
转变温度的测量
两性材料(纯DPPC或DSPC和DPPC：DPPA：DPPE-PEG5000或DSPC：DPPA:DPPE-PEG5000的混合物)的转变温度通过使用商用差示扫描量热仪DSC-Q2000和Tzero铝坩埚(TAInstruments，New Castle,DE USA))测定。用铟金属进行系统校准，包括温度和热流量(熔化焓28.71J/g±0.5J/g；熔化起始温度156.6℃±0.25℃)。
根据上面针对DSC测量所述的程序制备两性材料(纯的或混合物)在GPW/TRIS中的分散体(各约30μL，浓度10mg/mL)。
DSC测量通过在20℃至80℃的温度范围内以2℃/min的恒定升温速率进行加热来进行。氮气以50mL/min的流率用作吹扫气体。
结果在下表II中示出。
表II:转变温度
Figure BDA0002669257720000221
实施例4
充气微泡的制备
使用与实施例1中所述相同的微流体芯片合成微泡。使用注射泵(HarvardPHD4400)控制液体的并流流率。使用连接到压力传感器(Omega，DPG1000B-30G)的压力调节器(Omega，PRG101-25)对气体(SF6)进行压力控制。在使用Matlab软件(The MathworksInc.，Natick,MA)的个人电脑上从记录的光学图像中自动检测单个微泡，以离线测量其大小。与实施例1不同，测试了两种不同液体并流流率(45μL/min或55μL/min)，分别以滴流方式或更优选的射流方式操作流动聚焦装置。
将微泡悬浮液收集在密封小瓶中，并在室温下保存。
加热形成的微泡的影响
图9a至9e显示了使用如上所述用浓度范围为5至15mg/mL的两性材料(分别在图9a-9e中示出)在包含微流体芯片的恒温浴的不同温度下(类似于图2所示的)制备的DSPC/DPPA/DPPE-PEG5000悬浮液(Tm为55℃)的液体并流获得的结果。正方形(■)表示在滴流方式下进行的实验，而三角形(▲)表示在更优选的射流方式下进行的实验。
从这些图中可以看出，与射流方式相比，在滴流方式中微泡的聚结百分比(C[％])通常较低。另外，在滴流和射流两种方式下，通过增加温度来减少聚结的有利效果很明显。特别考虑射流方式，对于7.5mg/mL的浓度(图9b)，将温度升高至两性混合物的Tm(55℃)或更高，会导致约10％或更低的微泡聚结。仍然着眼于射流方式，对于浓度为10mg/mL的两性材料(图9c)，同样加热至或高于两性材料的Tm提供小于1％的聚结。通过将两性材料的浓度提高到15mg/mL(图9e)，可以在室温下获得相似的结果。注意，在这种情况下，两性材料的浓度需要增加50％。
因此，这些结果表明，通过将温度保持在两性材料的Tm附近，可以获得聚结降低的效果(与在较低温度下对相同制剂测得的较高聚结相比)。结果进一步表明，通过将温度保持在两性材料的Tm附近，可以通过使用明显浓度更低的两性材料获得类似的聚结百分比(与未加热时所需的较高浓度相比)。
图10显示了使用如上所述用浓度为10mg/mL的两性材料在恒温浴的不同温度下制备的DPPC/DPPA/DPPE-PEG5000悬浮液(Tm为44℃)的液体并流获得的结果。类似地，对于以上讨论的结果，在这种情况下，当加热到接近或高于两性材料的Tm温度时，也获得1％或更小的聚结。
下游冷却悬浮液的影响
为了评估下游冷却对微泡分散性的影响，测试了不同的冷却条件。
根据设置A(先冷却悬浮液)，在微泡形成后3毫秒使悬浮液通过换热器(20℃)，以将悬浮液温度突然降低至Tm以下，尤其是在室温下。因此，将从恒温浴中芯片出来的管通过距芯片出口约0.5毫米后的换热器。
根据设置B(后冷却悬浮液)，在微泡形成后仅3分钟使悬浮液通过相同换热器。因此，在该第二构造中，从芯片出来的管被内径为1mm的管所代替，并且该管在恒温浴中保持约20cm的长度，然后通过换热器。
两种设置均以55、65和75μL/min的流率进行了测试，结果分别如图11a、11b和11c所示(X轴＝以mm为单位的直径，Y轴＝微泡的相对计数(按数字))。在图11a-11c中，虚线示出了后冷却制剂的尺寸分布，而实线示出了先冷却制剂的尺寸分布。从这些图中可以明显看出，与相应的后冷却悬浮液之一相比，先冷却悬浮液的PDI较低。此外，从这些图中可以看出，微泡的平均尺寸随着流速的增加而减小。
用两性材料的其它混合物，尤其是前述的两性材料的那些组合，可以获得类似的结果。
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Claims (16)

1.一种制备充气微泡悬浮液的方法，包括：
-提供(i)气体流和(ii)包含两性微泡稳定材料的含水液体流；
-将所述气体流和所述液体流通过各自的入口通道引向接触区；
-将来自所述接触区的所述气体流和所述液体流引导经过校准的孔口，以获得包含所述充气微泡的含水悬浮液；和
-将包含所述微泡的所述悬浮液引向出口通道；
其中所述气体流包括第一气体和第二气体，所述第一气体在水中的溶解度高，所述第二气体为在水中溶解度低的生物相容性氟化气体，所述第二气体在所述气体流中的体积百分比为18％至2％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一气体在所述气体流中的体积百分比为15％或更低。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一气体在所述气体流中的体积百分比为13％或更低。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二气体的体积百分比为至少5％。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一气体在水中的溶解度(定义为Bunsen系数“α”)高于0.01。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一气体在水中的溶解度高于0.5。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二气体在水中的溶解度为0.008或更低。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二气体在水中的溶解度为0.001或更低。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二气体是全氟化气体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述全氟化气体选自SF6、CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10及其混合物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一气体选自空气、氮气、二氧化碳及其混合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述气体是二氧化碳。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所获得的充气微泡包含最终量为至少45体积％的在水中溶解度低的气体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述在水中溶解度低的气体的最终量为至少60％。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述两性微泡稳定材料是磷脂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述两性材料以5.0至20mg/mL的浓度分散在含水载体中。
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