ES2967186T3 - Composición liofilizada para preparar microvesículas llenas de gas calibradas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere en general al campo de los agentes de contraste para ultrasonidos (USCA). En particular, se refiere a una composición liofilizada que comprende un material anfifílico y un componente protector de liofilización, que puede reconstituirse para preparar una suspensión de microvesículas llenas de gas con tamaño calibrado, útil en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Se refiere además al método para la preparación de dicha composición liofilizada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición liofilizada para preparar microvesículas llenas de gas calibradas

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, al campo de los agentes de contraste por ultrasonidos (USCA, por sus siglas en inglés). En particular, se refiere a una composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, que puede reconstituirse para preparar una suspensión de microvesículas llenas de gas con tamaño calibrado, útil en aplicaciones diagnósticas o terapéuticas. Se refiere, además, al método para la preparación de una composición liofilizada de este tipo.

Antecedentes de la invención

Las microvesículas de tamaño calibrado (CMV, por sus siglas en inglés) son una nueva generación de microburbujas gaseosas que tienen una distribución de tamaño estrecha, calibrada y controlada (tamaños de diámetro medio entre 3 y 8 gm) en comparación con los agentes de contraste por ultrasonidos de microburbujas polidispersas (USCA) disponibles comercialmente. Estas microburbujas de tamaño calibrado están diseñadas para potenciar la sensibilidad de la formación de imágenes y mejorar la eficiencia para administrar fármacos y genes a órganos específicos. Las microvesículas calibradas se pueden producir mediante diversas técnicas: decantación, filtración mecánica, centrifugación, clasificación de burbujas y enfoque de flujo. En particular, la tecnología de enfoque de flujo permite la fabricación de microvesículas calibradas (típicamente con valores de desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés) entre 1,05 y 1,08) de forma altamente reproducible a una tasa de producción razonable (~ 60 millones de burbujas por minuto), con concentraciones aceptables de microvesículas suspendidas (p. ej., entre 3x108 CMV/mL y 4x108 CMV/mL) para usos posteriores.

Ref. 1[documento W02018/041906 A1 - BRACCO SUISSE SA] yRef.2[número de solicitud PCT PCT/EP2019/055325], ambas a nombre de la presente solicitante, describen un método para preparar CMV, tal como microburbujas rellenas de gas, en particular mediante el uso de la técnica de microfluidos. A pesar de que las suspensiones acuosas de microvesículas calibradas son altamente estables a temperatura ambiente durante unas pocas semanas, esta estabilidad puede plantear algunas limitaciones para el desarrollo de un producto farmacéutico, para el cual generalmente es deseable una vida útil más larga. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un procedimiento de almacenamiento a largo plazo. La liofilización, también conocida como criodesecación, es un proceso complejo y desafiante, ampliamente utilizado en la industria farmacéutica, que tiene la ventaja de conservar los productos farmacéuticos en forma seca a lo largo de varios meses. De hecho, los productos liofilizados muestran una mayor estabilidad al almacenamiento y pueden enviarse fácilmente. La liofilización también se utiliza en el campo de las microvesículas llenas de gas para preparar formas farmacéuticas liofilizadas que luego se reconstituyen con un disolvente acuoso en presencia de un gas, para formar una suspensión de microvesículas llenas de gas.

Ref.3[documento US2017/080113 A1 - GE Healthcare] describe la preparación de una suspensión de microburbujas con tamaños ajustados y posterior liofilización con una solución de sacarosa de las mismas.

Ref.4[documento WO97/29782 A1 - NICOMED IMAGING A/S] enseña que precursores de USCA que son estables a temperatura ambiente (TA) se pueden preparar mediante liofilización de microburbujas de C<3>F<8>en presencia de un estabilizador de liofilización, preferiblemente sacarosa.

Ref.5[documento WO 2004/069284 A2 - BRACCO RESEARCH SA [CH]] describe un método para preparar una matriz liofilizada a partir de una emulsión preparada a partir de un medio acuoso, un fosfolípido y un disolvente orgánico inmiscible en agua. Tras la reconstitución de dicha matriz liofilizada, se obtiene un agente de contraste inyectable respectivo.

Hasta ahora, de acuerdo con el conocimiento de la solicitante, una técnica de este tipo no se ha aplicado todavía para preparar una composición liofilizada a partir de una suspensión de microvesículas calibradas.

Como observó la solicitante, una de las cuestiones más desafiantes en la preparación de una composición liofilizada de microvesículas calibradas está relacionada con la necesidad de evitar una modificación sustancial de las características de la suspensión inicial de microvesículas calibradas, tales como concentración, monodispersidad o desviación estándar geométrica. (GSD, por sus siglas en inglés) y/o diámetro medio final.

La solicitante ha descubierto ahora que características iniciales de este tipo pueden conservarse en un grado aceptable después del proceso de liofilización utilizando un componente protector de liofilización adecuado en una concentración adecuada.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, que, tras la reconstitución con una solución farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas biocompatible, proporciona una suspensión de microvesículas llenas de gas calibradas, en donde dicha suspensión reconstituida de microvesículas tiene un valor de desviación estándar geométrica (GSD) de al menos 1,22 o inferior.

El componente protector de liofilización es un polietilenglicol (PEG).

La suspensión reconstituida de microvesículas calibradas se caracteriza por una GSD de al menos 1,22 o inferior, preferiblemente de al menos 1,21, hasta, p. ej., 1,10.

En una realización de la invención, dicha suspensión reconstituida de microvesículas calibradas se caracteriza por una concentración de al menos 2,0 x 108 CMV/mL, preferiblemente 2,1 x 108 CMV/mL, más preferiblemente 2,3 x 108 CMV/mL, hasta 5,5 x 108 CMV/mL.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para preparar una composición liofilizada para la preparación de una suspensión reconstituida de microvesículas calibradas llenas de gas que tienen una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior, de acuerdo con la reivindicación 8.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición liofilizada para preparar una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas que tienen una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior, pudiendo obtenerse dicha composición liofilizada mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un agente de contraste inyectable que comprende una suspensión de microvesículas llenas de gas, en donde dicho procedimiento comprende reconstituir una composición liofilizada como se define arriba, con una solución farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas biocompatible.

Figuras

Figura 1:Representación típica de la distribución del tamaño de partículas.

Figura 2:Una representación esquemática de la porción central de un dispositivo de enfoque de flujo de microfluidos.

Figura 3:Un dibujo esquemático ejemplar de un dispositivo útil para el procedimiento de la tecnología de la invención.

Figura 4:Influencia de la concentración de PEG4000 y PEG8000 en el rendimiento de CMV después de la liofilización a dos temperaturas de congelación diferentes: -40 °C y -60 °C.

Descripción detallada de la invención

La expresión "microvesículas llenas de gas" se refiere generalmente a burbujas de gas unidas, en la interfaz gas/líquido, por una envoltura (película) muy delgada que implica un material anfífilo estabilizador, típicamente un fosfolípido, dispuesto en la interfaz gas-líquido. Dichas microvesículas calibradas llenas de gas son adecuadas como agentes de contraste en técnicas de formación de imágenes por ultrasonido, conocidas como imágenes por ultrasonido con contraste mejorado (CEUS, por sus siglas en inglés), o en aplicaciones terapéuticas, p. ej., en combinación con administración de fármacos mediada por ultrasonido.

A estas burbujas de gas estabilizadas (dispersas en una solución fisiológica adecuada) se las alude generalmente en la técnica con diversas terminologías, dependiendo típicamente del material estabilizante empleado para su preparación; estos términos incluyen, por ejemplo,"microesferas", "microburbujas", "microcápsulas" o "microglobos", a las que se alude aquí globalmente como "microvesículas llenas de gas" (o "microvesículas", en forma abreviada).

El término "calibrado" (cuando se hace referencia a microvesículas llenas de gas) se refiere específicamente a suspensiones de microvesículas con microvesículas altamente calibradas (CMV), que tienen diferentes tamaños entre 3 y 8 pm, caracterizadas por una distribución de tamaños que tiene una desviación estándar geométrica (GSD) de al menos 1,2 o inferior, preferiblemente de al menos 1,1, hasta, por ejemplo, 1,05.

En esta descripción y estas reivindicaciones, el término "calibrado" se utiliza indistintamente con microvesículas" de tamaño controlado", "monodispersas" o "de tamaño mono(d)".

En la presente invención, las microvesículas llenas de gas calibradas se producen preferiblemente utilizando una tecnología de enfoque de flujo de microfluidos, en que se enfoca un hilo de gas entre dos flujos de líquido en un dispositivo de enfoque de flujo y se forman microvesículas calibradas estabilizadas con fosfolípidos que se recogen en el canal de salida. Mediante este enfoque, se fabrican microvesículas calibradas de forma altamente reproducible a una tasa de producción razonable (~ 60 millones de burbujas por minuto) (Fig. 1 y Fig. 2).

Dependiendo de los parámetros del procedimiento de fabricación y del dispositivo, las microvesículas calibradas se pueden obtener con una distribución de tamaño relativamente estrecha alrededor de cualquier diámetro medio deseado, p. ej., de 3 a 8 pm, preferiblemente aproximadamente 4 pm.

La distribución de tamaño de dichas microvesículas calibradas se caracteriza típicamente por un valor de desviación estándar geométrica (GSD) de al menos 1,20 o inferior, preferiblemente de al menos 1,15, hasta, por ejemplo, 1,05.

La concentración de microvesículas calibradas (particularmente tras la producción con enfoque de flujo de microfluidos) está comprendida típicamente entre 3 x108 y 4x108 CMV/mL, preferiblemente cerca de 4 x108 CMV/mL, no inferior a 3 x 108 CMV/mL.

La "desviación estándar geométrica" (GSD) proporciona generalmente un valor adecuado para caracterizar la amplitud de la distribución de tamaños en una población de partículas (microvesículas llenas de gas en el caso específico). Por lo tanto, una población de partículas con una amplia gama de tamaños tendrá un valor de GSD mayor que una en la que los tamaños de las partículas están estrechamente distribuidos alrededor de un valor medio (es decir, relativamente similares en tamaño).

LaFigura 1muestra un ejemplo de un gráfico de distribución de tamaño (por volumen) de una población de microvesículas llenas de gas que se puede obtener con un instrumento analizador de partículas comercial (p. ej., Coulter Counter Multisizer 3, equipado con el software Multisizer 3), determinando el volumen de gas para cada uno de sus canales, correspondiendo cada uno de los canales a un diámetro predeterminado de las microvesículas (p. ej., con incrementos de 0,1 micras). Mediante la determinación del número de microvesículas calibradas llenas de gas en la suspensión, su diámetro respectivo y su distribución de volumen en un intervalo de tamaños seleccionado (p. ej., entre 3 pm y 6 pm para un diámetro medio CMV de 4,5 pm), es posible calcular el GSD de una distribución CMV, utilizando la siguienteEcuación 1:

Y n i( lnXj-lnx)■*

Ec. 1GSD = eNu 1

En que:

n¡= porcentaje de volumen de gas (respecto al total) atrapado en las microvesículas medido para el iésimo canal

X: =volumen de las microvesículas en el iésimo canal, en que

Ec. 1.1.Xi = di3.n/6

(di = diámetro de la microvesícula en el centro del iésimo canal)

x^m edia geométrica del volumen de las microvesículas en el intervalo seleccionado, en que:

x = i o y 2>< j

Ec.1.2.

Entre los diversos dispositivos de medición disponibles comercialmente, el Coulter Counter Multisizer 3, equipado con el software Multisizer 3, es capaz de calcular y proporcionar el valor GSD definido anteriormente.

Por ejemplo, un valor de GSD de 1,2 indica que aproximadamente el 50 % de los CMV están calibrados entre 2,5 y 5 pm, para un diámetro medio de 4 pm; un GSD de 1,05-1,08 (<1,1) indica que aproximadamente el 90-95 % de los CMV tienen tamaños comprendidos entre 2,5 y 5 pm.

La expresión "concentración de microvesículas", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere al número de CMV en una unidad de volumen, determinado usando un aparato contador Coulter, es decir, el número de CMV/mL.

Como observa la solicitante, si bien dichas microvesículas calibradas obtenidas a través de enfoque de flujo de microfluidos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante unas pocas semanas sin impactos sustanciales en sus características principales, después de dicho período de almacenamiento las características de dichas microvesículas (p. ej., concentración y distribución de tamaño) pueden no mantenerse y pueden deteriorarse progresivamente.

Por tanto, la vida útil de suspensiones de microvesículas llenas de gas de este tipo es relativamente corta para un producto farmacéutico y existe la necesidad de desarrollar un procedimiento de almacenamiento a largo plazo, capaz de preservar las características iniciales del CMV, tales como concentración, GSD y diámetro final durante tiempos más prolongados, p. ej., meses o años.

El proceso de liofilización es un enfoque adecuado para obtener microvesículas calibradas en forma seca, con mayor estabilidad en el tiempo y con características iniciales conservadas.

Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que las características iniciales del CMV, tales como concentración, GSD y diámetro final, pueden conservarse sustancialmente después del proceso de liofilización utilizando componentes protectores de la liofilización adecuados.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, la cual tras la reconstitución con una solución acuosa adecuada en presencia de gas biocompatible, proporciona una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas, en donde dichas microvesículas tienen un valor GSD de al menos 1,22 o menos, preferiblemente de al menos 1,21 hasta, p. ej., 1,10.

En la presente descripción y reivindicaciones se utilizan indistintamente los términos “crioconservación” y “liofilización”, así como los términos “crioconservado” y “liofilizado”.

Composición Jiofilizada

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "composición liofilizada" indica cualquier forma de dosificación seca para el almacenamiento a largo plazo de formulaciones de microvesículas llenas de gas obtenidas mediante un proceso de liofilización. Dicha composición liofilizada puede comprender uno o más ingredientes activos y un componente protector de la liofilización.

La expresión "ingrediente activo", tal como se utiliza en esta memoria indica los materiales estabilizantes de microvesículas, p. ej., los materiales anfífilos, que están comprendidos en la composición liofilizada con los componentes protectores de la liofilización.

Componente protector de lajiofilización

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "componente protector de la liofilización" se refiere a un componente adecuado para la liofilización, que se incluye en la suspensión de microvesículas antes del proceso de liofilización de las mismas.

La expresión "componente protector de la liofilización" designa cualquier compuesto añadido para proteger el ingrediente activo durante cualquier fase del proceso de la liofilización. Ejemplos de componentes protectores de la liofilización adecuados son polietilenglicoles (PEG), polioles, sacáridos, tensioactivos, tampones, aminoácidos, complejos quelantes y sales inorgánicas.

De acuerdo con una realización de la invención, dicho componente protector de la liofilización se selecciona entre el grupo de polímeros, polioles y sacáridos.

En una realización preferida de la invención, dicho componente protector de la liofilización es un polímero, preferiblemente un polímero hidrófilo, más preferiblemente un poliglicol.

En una realización aún más preferida, dicho polímero es un polietilenglicol (PEG).

El polietilenglicol (PEG) tiene su significado químico estándar. La fórmula química del PEG es HOCH<2>(CH<2>OCH<2>)mCH<2>OH, en dondemrepresenta el número promedio de grupos oxietileno. Polietilenglicoles típicos están disponibles en una amplia gama de pesos moleculares medios, desde 190-210 g/mol (PEG 200; m=4,2) hasta 7000-9000 g/mol (PEG 8000; m=181,4).

De acuerdo con esta descripción, la expresión "peso molecular" indica la longitud media de las cadenas poliméricas del PEG, con una variabilidad de ± 10 % basado en el peso molecular indicado.

El componente protector de la liofilización es un PEG que tiene un peso molecular comprendido entre 2000 y 10000 g/mol, preferiblemente entre 4000 y 8000 g/mol.

De acuerdo con una realización, el componente protector de liofilización es PEG que tiene una peso molecular de 8000 g/mol (±10 %). De acuerdo con otra realización, el componente protector de la liofilización es PEG que tiene un peso molecular cercano a 4000 g/mol (±10 %).

En una realización de la invención, el componente protector de la liofilización se añade a la suspensión de CMV como una solución que tiene una concentración comprendida entre 100 mg/mL y 300 mg/mL, preferiblemente 120 mg/mL y 250 mg/mL, más preferentemente cerca de 200 mg/mL.

En una realización aún más preferida, la solicitante ha descubierto que es preferible añadir un PEG a la suspensión de CMV como una solución que tiene una concentración de 200 mg/mL, para mejorar la conservación de las características iniciales de la suspensión de CMV reconstituida después del proceso de liofilización.

Otro parámetro que se puede considerar en la selección de un componente protector de la liofilización es la viscosidad. Tal como se utiliza en esta memoria, el término viscosidad se refiere a la viscosidad dinámica (p, unidades Pas) que se caracteriza por la resistencia al flujo laminar de un fluido incompresible (p. ej., la suspensión de CMV antes de la etapa de liofilización o reconstituida a partir del producto liofilizado).

La viscosidad de una suspensión de CMV que comprende un componente protector de la liofilización puede afectar a su procesamiento, p. ej., durante su fabricación, o la administración de la suspensión reconstituida de CMV a partir de la composición liofilizada.

Generalmente, durante el procedimiento de fabricación, se prefieren suspensiones de CMV de menor viscosidad, p. ej., para evitar una sobrepresión excesiva en el dispositivo de enfoque de flujo de microfluidos.

Desde otro punto de vista, la composición liofilizada reconstituida que tiene una viscosidad más baja puede facilitar su administración, especialmente a través de las vías de inyección (p. ej., parenteral e intradérmica).

La viscosidad de una suspensión depende de la concentración y el peso molecular de sus componentes; en particular, en el presente caso, sobre el PEG utilizado como componente protector de la liofilización. Precisamente, concentraciones más altas y/o pesos moleculares más altos del componente PEG aumentan la viscosidad de la suspensión de CMV.

Por ejemplo, las soluciones que comprenden PEG4000 poseen típicamente valores de viscosidad relativamente más bajos (en general, de aproximadamente la mitad y un tercio) con respecto a las soluciones que comprenden una cantidad igual de PEG8000.

La suspensión de CMV que comprende PEG4000, ya sea al 10 % o al 20 %, puede proporcionar algunas ventajas en términos de procesamiento o administración de la suspensión.

En esta descripción y reivindicaciones, el término "poliol" tiene su significado químico convencional; indica cualquier compuesto orgánico con más de dos grupos funcionales hidroxilo, caracterizado por la fórmula general HOCH<2>(CHOH)nCH<2>OH, en que n es un número entero de 1 a 6, preferiblemente de 2 a 4. Polioles adecuados incluyen eritritol, xilitol, sorbitol, lactitol y manitol.

En esta invención, dicho poliol se selecciona preferiblemente del grupo de polioles que tienen una longitud de cadena de carbono de cuatro a seis átomos de carbono.

El término "sacárido" tiene su significado estándar en el campo de la química. Los sacáridos, también denominados hidratos de carbono, son compuestos moleculares formados por solo tres elementos: carbono, hidrógeno y oxígeno. Los sacáridos más simples se denominan monosacáridos y son las unidades de construcción de sacáridos más grandes, tales como disacáridos, trisacáridos y polisacáridos.

Material_anfífilo

Materiales adecuados para formar la capa estabilizadora de la microvesícula llena de gas (es decir materiales estabilizadores de microvesículas) son los conocidos en la técnica. Estos incluyen preferiblemente materiales anfífilos.

La expresión "material anfífilo", tal como se utiliza en esta memoria, incluye compuestos que tienen una molécula con una porción de cabeza polar hidrófila (p. ej., un grupo polar o iónico), capaz de interactuar con un medio acuoso, y una porción de cola orgánica hidrófoba (p. ej., una cadena hidrocarbonada), capaz de interactuar con, p. ej., un disolvente orgánico. Por lo tanto, estos compuestos actúan generalmente como "agentes tensioactivos", es decir, compuestos que son capaces de estabilizar mezclas de materiales que de otro modo serían generalmente inmiscibles, tales como mezclas de dos líquidos inmiscibles (p. ej., agua y aceite), mezclas de líquidos con gases (p. ej., microburbujas de gas en agua) o mezclas de líquidos con partículas insolubles (p. ej., nanopartículas metálicas en agua).

Materiales anfífilos adecuados comprenden, por ejemplo, fosfolípidos; lisofosfolípidos; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidónico o ácido oleico; lípidos que portan polímeros, tales como quitina, ácido hialurónico, polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG), a los que también se alude como "lípidos pegilados"; lípidos que portan mono-, di-, oligo- o poli-sacáridos; colesterol, sulfato de colesterol o hemisuccinato de colesterol; hemisuccinato de tocoferol; lípidos con ácidos grasos enlazados por éter o éster; lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo; fosfato de dicetilo; ceramidas; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno (tales como estearatos de ácidos grasos de polioxietileno), alcoholes grasos de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilado, glicerol, ricinoleato de polietilenglicol, esteroles de soja etoxilados, aceite de ricino etoxilado o copolímeros de bloque de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de esterol de ácidos de azúcar, incluyendo glucurónidos de colesterol, glucurónidos de lanosterol, glucurónido de 7-deshidrocolesterol, glucurónido de ergosterol, gluconato de colesterol, gluconato de lanosterol o gluconato de ergosterol; ésteres de ácidos y alcoholes de azúcar, incluyendo lauril glucurónido, estearoil glucurónido, miristoil glucurónido, gluconato de laurilo, gluconato de miristoilo o gluconato de estearoilo; ésteres de azúcares con ácidos alifáticos, incluyendo laurato de sacarosa, laurato de fructosa, palmitato de sacarosa, estearato de sacarosa, ácido glucurónico, ácido glucónico o ácido poliurónico; saponinas, incluyendo sarsasapogenina, esmilagenina, hederagenina, ácido oleanólico o digitoxigenina; glicerol o monoésteres de glicerol con ácidos grasos, incluyendo monopalmitato de glicerol, monoestearato de glicerol, monomiristato de glicerol o monolaurato de glicerol; alcoholes de cadena larga que incluyen alcohol n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico o alcohol n-octadecílico; 6-(5-colesten-3B-iloxi)-1-tio-B-D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5-colesten-3B-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-B-D-galactopiranósido; 6-(5-colesten-3B-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1-tio-B-D-manopiranósido; ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoico; ácido N-[12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoil]-2-aminopalmítico; N-succinildioleilfosfatidiletanolamina; 1,2dioleil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina o palmitoilhomocisteína; alquilaminas o sales de alquilamonio, que comprenden al menos una cadena alquílica (C<10>-C<20>), preferiblemente (C<14>-C<18>), tales como, por ejemplo, N-estearilamina, N,N'-diestearilamina, N-hexadecilamina, N,N'-dihexadecilamina, cloruro de N-estearilamonio, cloruro de N,N'-diestearilamonio, cloruro de N-hexadecilamonio, cloruro de N,N'-dihexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio terciario o cuaternario que comprenden una o preferiblemente dos cadenas acilo (C<10>-C<20>), preferiblemente (C<14>-C<18>), enlazadas al átomo de N a través de un puente alquileno (C<3>-C<6>), tal como, por ejemplo, 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1.2- oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP); y mezclas o combinaciones de los mismos.

De acuerdo con esta invención, el material anfífilo es un fosfolípido.

El término "fosfolípido" pretende abarcar cualquier compuesto fosfolípido anfífilo, cuyas moléculas sean capaces de formar una película estabilizadora de material (típicamente en forma de una capa monomolecular) en la interfaz límite gas-agua en la suspensión final de microburbujas. Por consiguiente, a estos materiales también se les alude en la técnica como "fosfolípidos formadores de película".

Ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen ésteres de glicerol con uno o preferiblemente dos residuos (iguales o diferentes) de ácidos grasos y con ácido fosfórico, en donde el residuo de ácido fosfórico está unido a su vez a un grupo hidrófilo tal como, por ejemplo colina. (fosfatidilcolinas - PC), serina (fosfatidilserinas - PS), glicerol (fosfatidilgliceroles -PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas - PE), inositol (fosfatidilinositol). A ésteres de fosfolípidos con un solo residuo de ácido graso se les alude generalmente en la técnica como formas "liso" de los fosfolípidos o "lisofosfolípidos". Residuos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos son en general ácidos alifáticos de cadena larga, que contienen típicamente de 12 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 22; la cadena alifática puede contener una o más insaturaciones o preferiblemente está completamente saturada. Ejemplos de ácidos grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Preferiblemente, se emplean ácidos grasos saturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido araquídico.

Ejemplos adicionales de fosfolípidos son los ácidos fosfatídicos, es decir, los diésteres del ácido glicerolfosfórico con ácidos grasos; esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir, aquellos análogos de fosfatidilcolina en los que el residuo de diéster de glicerol con ácidos grasos es reemplazado por una cadena de ceramida; cardiolipinas, es decir, los ésteres de 1.3- difosfatidilglicerol con un ácido graso; glicolípidos tales como gangliósidos GM 1 (o GM2) o cerebrósidos; glucolípidos; sulfátidos y glicoesfingolípidos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "fosfolípidos" incluye productos que se producen de forma natural, semisintéticos o preparados de forma sintética, que pueden emplearse individualmente o como mezclas.

Ejemplos de fosfolípidos que se producen de forma natual son las lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, típicamente, lecitinas de soja o de yema de huevo.

Ejemplos de fosfolípidos semisintéticos son los derivados parcial o totalmente hidrogenados de las lecitinas que se producen de forma natual. Fosfolípidos preferidos son diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol o de esfingomielina.

Ejemplos de fosfolípidos preferidos son, por ejemplo, dilauroil-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC), diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), 1,2 distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina (PM PC), 1-palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina (PSPC), 1 -estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1 -palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1 -oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidilglicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido distearoil fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoil esfingomielina (DPSP) y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroilfosfatidilinositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoilfosfatidilinositol (DOPI).

Fosfolípidos adecuados incluyen, además, fosfolípidos modificados enlazando un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG), a los mismos. Fosfolípidos modificados con polímeros preferidos incluyen "fosfolípidos pegilados", es decir, fosfolípidos unidos a un polímero de PEG. Ejemplos de fosfolípidos pegilados son fosfatidiletanolaminas ("PE-PEG" abreviado), es decir, fosfatidiletanolaminas en las que el resto hidrófilo de etanolamina está enlazado a una molécula de PEG de peso molecular variable (p. ej., de 300 a 20000 dalton, preferiblemente de 500 a 5000 dalton), tales como DPPE-PEG (o DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG o DOPE-PeG). Por ejemplo, DPPE-PEG2000 se refiere a DPPE que tiene fijado al mismo un polímero de PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000.

Fosfolípidos particularmente preferidos son DAPC, DSPC, DPPC, DMPA, DPPA, DSPA, DMPG, DPPG, DSPG, DMPS, DPPS, DSPS y etil-DSPC. Los más preferidos son DPPG, DPPS y DSPC.

También se pueden utilizar mezclas de fosfolípidos, tales como, por ejemplo, mezclas de DPPE y/o DSPE (incluyendo derivados pegilados), DPPC, DSPC y/o DAPC con DSPS, DPPS, DSpA, DPPA, DSPG, DPPG, etil-DSPC y/o etil-DPPC.

Por ejemplo, una mezcla de fosfolípidos puede incluir derivados de fosfatidilcolina, derivados de ácido fosfatídico y fosfatidiletanolamina pegilada, p. ej., DSPC/DPPA/DPPE-PEG, DPPC/DPPA/DPPE-PEG, DSPC/DPPA/DSPE-PEG, DPPC/DPPA/DSPEPEG, DAPC/DPPA/DPPE-PEG, DAPC/DPPA/DSPE-PEG, DSPC/DSPA /DPPE-PEG, DPPC/DSPA/DSPE-PEG, DSPC/DSPG/DPPE-PEG, DPPC/DSPG/DSPE-PEG.

De acuerdo con la presente invención, el fosfolípido se puede utilizar convenientemente en mezclas con cualquiera de los compuestos anfífilo arriba enumerados. Así, por ejemplo, lípidos, tales como colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, galato de propilo o palmitato de ascorbilo, ácidos grasos, tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico y derivados de los mismos o hidroxitolueno butilado y/u otros compuestos no fosfolípidos se pueden añadir opcionalmente a uno o más de los fosfolípidos anteriores, p. ej., en proporciones que varían preferiblemente de cero a 50 % en peso, más preferiblemente hasta 25 %. Por ejemplo, se pueden utilizar ventajosamente mezclas de materiales anfífilos que comprenden fosfolípidos y ácidos grasos, incluyendo DSPC/DPPG/ácido palmítico, DSPC/DPPE-PEG/ácido palmítico, DPPC/DPPE-PEG/ácido palmítico, DSPC/DSPE-PEG/ácido palmítico, DPPC/DSPE-PEG/ácido palmítico, DSPC/DPPE-PEG/ácido esteárico, DPPC/DPpE-PEG/ácido esteárico, DSPC/DSPE-PEG/ácido esteárico o DpPC/DSPE-PEG/ácido esteárico.

Las microvesículas preparadas de acuerdo con la invención pueden comprender opcionalmente un ligando fijador de objetivo.

La expresión "ligando de fijador de objetivo" incluye en su significado cualquier compuesto, resto o residuo que tenga o que sea capaz de fomentar una actividad de fijación de objetivo (p. ej., que incluya una unión selectiva) de las microvesículas de una composición de la invención hacia cualquier sitio biológico o patológico dentro de un cuerpo vivo. Los objetivos con los que se puede asociar el ligando fijador de objetivo incluyen tejidos tales como, por ejemplo, tejido miocárdico (incluyendo células miocárdicas y cardiomiocitos), tejidos membranosos (incluyendo endotelio y epitelio), láminas, tejido conjuntivo (incluyendo tejido intersticial) o tumores; coágulos de sangre; y receptores tales como, por ejemplo, receptores de la superficie celular para hormonas peptídicas, neurotransmisores, antígenos, fragmentos de complemento e inmunoglobulinas y receptores citoplásmicos para hormonas esteroides.

El ligando fijador de objetivo puede ser sintético, semisintético o que se produce de forma natural. Materiales o sustancias que pueden servir como ligandos fijadores de objetivo incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a proteínas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moléculas de receptores, moléculas de unión a receptores, glicoproteínas y lectinas; péptidos, incluyendo oligopéptidos y polipéptidos; peptidomiméticos; sacáridos, incluyendo monosacáridos y polisacáridos; vitaminas; esteroides, análogos de esteroides, hormonas, cofactores, agentes bioactivos y material genético, incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.

El ligando fijador de objetivo puede ser un compuesto anfífilo per se (que se mezcla con los otros componentes de la microvesícula) o un compuesto unido a una molécula anfífila (p. ej., un fosfolípido) empleado para la formación de las microvesículas.

Gas

Gases adecuados comprenden gases fluorados biocompatibles, preferentemente gases perfluorados. Los gases fluorados incluyen materiales que contienen al menos un átomo de flúor tal como, por ejemplo, los hidrocarburos fluorados (compuestos orgánicos que contienen uno o más átomos de carbono y flúor); hexafloruro de azufre; cetonas fluoradas, preferiblemente perfluoradas, tales como perfluoroacetona; y éteres fluorados, preferiblemente perfluorados, tales como perfluorodietil éter. Compuestos preferidos son gases perfluorados, tales como SF6 o perfluorocarbonos (hidrocarburos perfluorados), es decir, hidrocarburos en los que todos los átomos de hidrógeno están reemplazados por átomos de flúor, que se sabe que forman suspensiones de microvesículas llenas de gas particularmente estables.

El término "perfluorocarbono" incluye perfluorocarbonos saturados, insaturados y cíclicos. Ejemplos de perfluorocarbonos biocompatibles y fisiológicamente aceptables son: perfluoroalcanos, tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (p. ej., perfluoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoroisobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos o perfluoroheptanos; perfluoroalquenos, tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (p. ej., perfluorobut-2-eno) o perfluorobutadieno; perfluoroalquinos (p. ej., perfluorobut-2-ino); y perfluorocicloalcanos (p. ej., perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano). Perfluorocarbonos saturados preferidos incluyen, por ejemplo, CF<4>, C<2>F<6>, C<3>F<8>, C<4>F<8>, C<4>F<10>, C<5>F<12>y C<6>F<14>. Gases particularmente preferidos son aquellos que están en forma gaseosa a temperatura ambiente, incluyendo SF6, C<3>F<8>y C<4>F<10>.

Por lo tanto, una realización se refiere a un método para preparar una composición liofilizada para el almacenamiento a largo plazo de microvesículas calibradas llenas de gas, que comprende las etapas de:

a. preparar una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas que comprenden un poliglicol como componente protector de la liofilización;

b. liofilizar la suspensión de microvesículas calibradas.

Preferiblemente, el método de preparación de la etapa a) es la técnica de enfoque de flujo de microfluidos, como se ilustra en laRef.1[documento W02018/041906 A1 - B<r>A<c>CO SUISSE SA] y laRef. 2[número de solicitud PCT PCT/EP2019/055325].

LaFigura 2muestra una representación esquemática de la porción central200de un dispositivo de enfoque de flujo ("chip de microfluidos") útil en el procedimiento de la invención. El chip comprende un primer canal de alimentación201para alimentar el flujo gaseoso201'y dos canales de alimentación ortogonales adicionales202ay202bpara suministrar el flujo de líquido que comprende el material anfífilo.

El flujo de gas y los dos flujos de líquido se dirigen hacia la zona de contacto203y luego a través del orificio calibrado204, mostrado como una línea de puntos en laFigura 2. El orificio calibrado está conectado a un canal calibrado204'que tiene preferiblemente la misma sección transversal que el orificio, que a su vez está conectado a una porción inicial205del canal de salida206. En una realización alternativa (no mostrada) el orificio calibrado204puede ser una boquilla directamente conectada a la porción inicial205del canal de salida206, es decir, sin el canal calibrado intermedio. Las microvesículas203'se forman en el orificio calibrado y se dirigen, a través del canal calibrado204', a la porción inicial205del canal de salida206. El diámetro hidráulico del canal de salida es generalmente mayor que el diámetro hidráulico del orificio calibrado y típicamente aumenta desde el diámetro inicial del orificio calibrado hasta el diámetro final del canal de salida206, correspondiente sustancialmente al diámetro hidráulico de un tubo colector (no mostrado), que conecta el dispositivo de enfoque de flujo a un recipiente, p. ej., un vial sellado para recoger la suspensión de microvesículas.

En la porción inicial205del canal de salida del dispositivo y preferiblemente también en la zona de contacto203y en el orificio calibrado204se controla la temperatura de las microvesículas, tal como se describe en laRef. 1[documento W02018/041906 A1 - BRACCO SUISSE SA] y laRef .2[número de solicitud PCT PCT/EP2019/055325].

Flujo_de_liquido

El flujo de líquido acuoso para preparar las microvesículas llenas de gas calibradas de acuerdo con el método de la invención comprende un material anfífilo (como se definió arriba) en una concentración de, p. ej., 5,0 a 20 mg/mL, preferiblemente de 7,5 a 15 mg/mL, dispersado en un soporte acuoso.

Soportes acuosos adecuados, que son preferiblemente fisiológicamente aceptables, comprenden agua (preferiblemente agua estéril), soluciones acuosas tales como solución salina (que puede ventajosamente equilibrarse de manera que el producto final para inyección no sea hipotónico) o soluciones de una o más sustancias de ajuste de la tonicidad. Las sustancias de ajuste de la tonicidad comprenden sales o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles u otros materiales poliólicos no iónicos (p. ej., glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares), derivados de quitosano, tales como carboximetilquitosano, trimetilquitosano o compuestos gelificantes, tales como carboximetilcelulosa, hidroxietil almidón o dextrano.

En una realización alternativa, se puede añadir una fase oleosa adicional para incorporar sustancias terapéuticas hidrófobas en las microvesículas. Para este fin, se pueden proporcionar dos conductos adicionales en el dispositivo para suministrar la fase oleosa deseada, como se describe, por ejemplo, en laRef. 1[documento W02018/041906 A1 -BRACCO SUISSE SA] y en laRef. 2[número de solicitud PCT PCT/EP2019/ 055325]. Las microvesículas llenas de gas formadas tendrán así una película de aceite dispuesta en la interfaz entre el gas y la capa estabilizadora de material anfífilo, que se pueden cargar con un agente terapéutico deseado. Aceites adecuados pueden incluir cualquier aceite biocompatible que sea líquido a temperatura ambiente, incluyendo, por ejemplo, mono-, di- o tri-ésteres de glicerol con cadenas alquílicas (C<2>-C<18>) saturadas o insaturadas (incluyendo ésteres homo- o hetero-alquílicos), tales como monobutirina de glicerol, monolinoleato de glicerol, 1,2-dihexanoil glicerol, 1,2 dioctanoil glicerol, 1,2-dioleil-sn-glicerol, triacetina, tributirina, tricaproína, tricaprilina, tricaprina y mezclas de los mismos; o aceites naturales, tales como aceite de soja, aceite de oliva, aceite de semilla de cártamo, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete y mezclas de los mismos.

Flujo_de_qas_mixto

Las microvesículas recién formadas comprenden un gas seleccionado entre los previamente indicados. Preferiblemente, el gas es una mezcla de un gas altamente soluble en agua ("gas HS") y de un gas con baja solubilidad en agua ("gas LS"), como se anticipa en laRef.2[número de solicitud PCT PCT/EP2019/055325].

Durante la fase de estabilización, la mayor cantidad del gas altamente soluble se disuelve rápidamente en agua mientras 5 que el poco soluble permanece atrapado en la capa densamente empaquetada de compuestos anfífilos, típicamente con cierta cantidad residual de gas de solubilidad HS disperso en ella.

Ejemplos de gases HS incluyen nitrógeno, aire y dióxido de carbono, siendo este último particularmente preferido debido a su mayor solubilidad en agua.

Gases LS adecuados son gases fluorados, preferentemente gases perfluorados. Gases fluorados son los anteriormente 0 descritos en la presente descripción.

En una realización preferida de la invención, se pueden preparar microvesículas llenas de gas que comprenden CO<2>/C<4>F<10>en una relación de volumen de 80/20 a 90/10, p. ej., 85/15, con un dispositivo mezclador de gases similar al ilustrado esquemáticamente en laFigura 3.

LaFigura 3muestra un ejemplo de un dispositivo de enfoque de flujo de microfluidos utilizado para producir microvesículas 5 calibradas. Un flujo de gas302(que comprende, p. ej., una mezcla de C<4>F<10>y CO<2>) y un flujo de líquido301(que comprende un material anfífilo, p. ej., un fosfolípido, un ácido graso o mezclas de los mismos), se suministran al chip microfluídico303para producir microvesículas a través del orificio304. La suspensión de microvesículas se recoge en un vial305, que preferiblemente está pre-llenado con un gas (p. ej., C<4>F<10>) a presión ambiente. Preferiblemente se usa un dispositivo de ventilación (p. ej., una aguja306) para igualar la sobrepresión generada por el llenado de líquido del vial. Al final de la 0 recogida de la suspensión de microvesículas, preferentemente se retira el dispositivo de ventilación y preferentemente se sella el recipiente para evitar un mayor intercambio gaseoso con la atmósfera exterior.

De acuerdo con una realización preferida de esta invención, después de la fase de recolección, las microvesículas calibradas obtenidas mediante el método de enfoque de flujo de microfluidos se tratan utilizando técnicas de lavado adecuadas, con el fin de eliminar el material anfífilo no ensamblado y posibles compuestos residuales.

5 En la presente descripción, el término "lavado" indica cualquier operación realizada sobre la suspensión de microvesículas recién preparada, finalizada para eliminar (o reducir sustancialmente la cantidad de) material anfífilo no ensamblado y compuestos residuales.

De acuerdo con esta descripción, técnicas de lavado adecuadas comprenden centrifugación, filtración, clasificación de burbujas y decantación.

0 En la presente descripción, la expresión "material anfífilo no ensamblado" indica moléculas anfífilas que, al final del procedimiento de preparación, están presentes en la suspensión de microvesículas calibradas, pero no están formando la capa estabilizadora de las microvesículas llenas de gas.

E En la presente descripción "compuestos residuales" indican cualquier posible sustancia aditiva que se añade a la solución de material anfífilo durante la preparación de microvesículas, tales como ajustadores de tonicidad como se describió 5 anteriormente.

En una realización preferida de esta invención, después de la operación de lavado, se añade un componente protector de la liofilización a la suspensión de microvesículas calibradas.

Alternativamente, el componente protector de la liofilización se puede añadir al flujo de líquido que comprende los compuestos anfífilos, descritos anteriormente, durante la preparación de las microvesículas mediante técnica de 0 microfluidos.

Las características iniciales de CMV se conservan particularmente cuando se utiliza un polietilenglicol como componente protector de la liofilización, caracterizado porque dicho polietilenglicol se añade a la suspensión de CMV en forma de una solución que tiene una concentración total comprendida entre 100 mg/mL y 300 mg/mL, preferiblemente entre 120 mg/mL y 250 mg/mL, más preferiblemente la concentración total de PEG es 200 mg/mL.

5 En una realización preferida de la invención, antes del proceso de liofilización, la suspensión de CMV comprende un polietilenglicol como componente protector de la liofilización en una concentración entre 12 y 25 %, preferiblemente entre 14 y 24 % y aún más preferiblemente entre 18 - 22 % (p/v %).

El componente protector de la liofilización representa la mayor cantidad de la preparación liofilizada final, en la que típicamente es al menos el 90 %, preferiblemente entre el 94 % y el 99,7 %, más preferiblemente el 99,5 % hasta el 99,9 0 % (p/p).

Dichos componentes protectores de la liofilización son los descritos anteriormente en la presente descripción. El uso de polietilenglicoles como componentes protectores de la liofilización ha mostrado resultados ventajosos cuando se utiliza en el proceso de liofilización de las suspensiones de microvesículas calibradas, para preparar una composición liofilizada que luego puede reconstituirse para obtener suspensiones de microvesículas calibradas que tienen características aceptables en términos de concentración y distribución del tamaño, en comparación con los de la suspensión inicial (antes de la liofilización).

Por ejemplo, la adición de un polietilenglicol como componente protector resulta ser la mejor estrategia para preservar sustancialmente el valor de GSD después del proceso de liofilización en comparación con la adición de un poliol o un sacárido. De acuerdo con una realización, se pueden obtener valores de GSD comprendidos entre 1,20 y 1,22 cuando se utiliza un polietilenglicol, en comparación con el uso de un poliol o un sacárido que proporciona microvesículas calibradas caracterizadas por un valor de GSD más alto, hasta 1,34.

En una realización preferida, el uso de un polietilenglicol como componente protector de la liofilización es capaz de mejorar significativamente el rendimiento de microvesículas calibradas después de la reconstitución del producto liofilizado con valores superiores al 60 %, p. ej. 68 %, superiores al obtenido con el uso de un poliol o un sacárido.

En esta descripción y reivindicaciones, el término liofilización tiene su significado estándar en el campo de la tecnología farmacéutica. El procedimiento de liofilización consiste en secar un producto líquido pre-congelado a baja presión o vacío y a baja temperatura. El objetivo principal es elimina líquido del producto con el fin de proporcionar un producto liofilizado adecuado para almacenamiento a largo plazo.

Como observó la solicitante, los parámetros de liofilización se pueden seleccionar para optimizar adicionalmente las características de la suspensión reconstituida de microvesículas (p. ej., rendimiento, tamaño, GSD).

En una realización preferida de la invención, la temperatura de congelación de dicho método para el almacenamiento a largo plazo de microvesículas calibradas llenas de gas, oscila entre -30 °C y -70 °C, preferiblemente entre -30 °C y -60 °C. En una realización aún preferida, la presión negativa aplicada durante el proceso de liofilización es preferiblemente de 0,5 mbar o menos, preferiblemente de 0,2 mbar o menos, p. ej., cerca de 0,1 mbar.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición liofilizada para preparar una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas que tienen una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior, pudiéndose obtener dicha composición liofilizada mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un agente de contraste inyectable que comprende una suspensión de microvesículas llenas de gas, en el que dicho procedimiento comprende reconstituir una composición liofilizada, obtenida como se describió arriba, que comprende un material anfífilo y un componente protector de la liofilización, con una solución farmacéuticamente aceptable en presencia de gas biocompatible.

La composición liofilizada puede entonces reconstituirse con una solución (acuosa) farmacéuticamente aceptable adecuada en presencia de un gas biocompatible, proporcionando así una suspensión de microvesículas llenas de gas calibradas, en donde dichas microvesículas tienen una GSD de al menos 1,22 o inferior, preferiblemente de al menos 1,21 hasta, p. ej., 1,10.

En esta invención, soluciones (acuosas) farmacéuticamente aceptables son agua, típicamente agua estéril, apirógena (para evitar en la medida de lo posible la contaminación en el producto reconstituido final), soluciones acuosas tales como solución salina (que puede ser ventajosamente equilibrada de modo que el producto final para inyección no sea hipotónico), o soluciones acuosas de una o más sustancias ajustadoras de la tonicidad, tales como sales o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles u otros materiales poliólicos no iónicos.

La composición liofilizada se reconstituye típicamente con un volumen de solución acuosa similar al volumen de suspensión que se sometió al proceso de liofilización . Por consiguiente, la concentración de los componentes protectores de la liofilización en la suspensión reconstituida es sustancialmente la misma que la de la suspensión inicial.

Otra realización de la invención se refiere, por lo tanto, a una suspensión de CMV reconstituida que tiene una GSD de al menos 1,22 y un polietilenglicol a una concentración entre 12 y 25 %, preferentemente entre 14 y 24 % y aún más preferentemente entre 18-22 %.

Estas cantidades de componentes protectores de la liofilización son típicamente mayores que las cantidades en las preparaciones de microvesículas llenas de gas de la técnica anterior, que generalmente son inferiores a 10 % (p/p). Sorprendentemente, se encontró que las suspensiones reconstituidas de microvesículas calibradas han mantenido sustancialmente las características iniciales de las microvesículas calibradas, tal como se caracterizaron antes del proceso de liofilización y, por lo tanto, son adecuadas para usos farmacéuticos posteriores.

En una realización de esta invención, dicha suspensión reconstituida de microvesículas calibradas se caracteriza por una concentración de al menos 2,0 x 108 CMV/mL, preferiblemente 2,1 x 108 CMV /mL, más preferiblemente 2,3 x 108 CMV/mL, hasta 5,5 x 108 CMV/mL.

Como se indicó anteriormente, la expresión "concentración de microvesículas" se refiere al número de microvesículas en una unidad de volumen, determinado utilizando un aparato Coulter Counter, es decir, el número de CMV/mL.

Típicamente, la concentración de microvesículas calibradas (%), medida después de la reconstitución de la composición liofilizada de la invención con una solución acuosa adecuada, permite determinar el rendimiento de microburbujas después de dicha reconstitución, en comparación con la concentración de microvesículas medida antes del proceso de liofilización.

En la presente invención, el rendimiento de las microvesículas calibradas después de la reconstitución de la composición liofilizada de la invención es de al menos el 50 %, preferiblemente al menos el 55 %, más preferiblemente al menos el 60 % incluso más preferiblemente al menos el 65 %, hasta, p. ej., 85 %, preferiblemente 90 %, más preferiblemente 95 %, incluso más preferiblemente 100 %.

La expresión "rendimiento de microvesículas calibradas" se refiere a la relación entre la concentración de microvesículas medida antes de la liofilización y la concentración de microvesículas medida después de la reconstitución del producto liofilizado con una solución fisiológicamente aceptable (abreviado "después de la liofilización") (véase laEcuación 2):

Ec. 2:Rendimiento de CMV después de la liofilización (%) = (concentración de CMV después de la liofilización/mL)/(concentración de CMV antes de la liofilización/mL)

Uso

Las microvesículas preparadas de acuerdo con el método de la invención pueden utilizarse en una diversidad de técnicas de diagnóstico y/o terapéuticas, incluyendo en particular Ultrasonidos y Resonancia Magnética.

Métodos de diagnóstico incluyen cualquier método en el que el uso de microvesículas llenas de gas permite potenciar la visualización de una porción o de una parte del cuerpo de un animal (incluidos los seres humanos), incluyendo la formación de imágenes con fines de investigación preclínica y clínica. Se pueden emplear una diversidad de técnicas de formación de imágenes en aplicaciones de ultrasonido, que incluyen, por ejemplo, formación de imágenes en modo B fundamental y armónico, formación de imágenes de inversión de pulso o fase y formación de imágenes Doppler fundamental y armónico; si se desea, se pueden utilizar técnicas de formación de imágenes tridimensionales.

Microvesículas de acuerdo con la invención se pueden administrar típicamente en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 pL de gas por kg de paciente, dependiendo, p. ej., de su composición respectiva, el tejido u órgano del que se van a obtener imágenes y/o de la técnica de formación de imágenes elegida. Por supuesto, este intervalo de concentraciones general puede variar dependiendo de aplicaciones específicas de formación de imágenes, p. ej., cuando las señales pueden observarse en dosis muy bajas, como en un Doppler de color o inversión de pulso de potencia.

En una realización, dicho método de diagnóstico comprende:

(i) administrar a un paciente una suspensión de microvesículas llenas de gas obtenidas mediante la reconstitución de un producto liofilizado obtenido de acuerdo con el procedimiento de la invención; y

(ii) detectar una señal de ultrasonidos de una región de interés en dicho paciente.

De acuerdo con una realización, dicha suspensión de microvesículas llenas de gas comprende un material anfífilo y un componente protector de la liofilización.

La reconstitución del producto liofilizado se realiza preferiblemente dispersándolo en un soporte acuoso fisiológicamente aceptable, p. ej., solución salina, en presencia de un gas fisiológicamente aceptable, p. ej. C<4>F<10>, con agitación suave.

Otras posibles aplicaciones de diagnóstico por formación de imágenes incluyen centellografía, formación de imágenes luminosas y formación de imágenes de rayos X, incluyendo imágenes de contraste de fase de rayos X.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso en un método de tratamiento terapéutico de una suspensión de microvesículas reconstituidas a partir de producto liofilizado de acuerdo con la invención.

Técnicas terapéuticas incluyen cualquier método de tratamiento (como se define arriba) de un paciente que comprende el uso combinado de ultrasonidos y microvesículas llenas de gas, ya sea como tales (p. ej., en trombólisis mediada por ultrasonidos, ablación por ultrasonidos enfocada de alta intensidad, permeabilización de la barrera hematoencefálica, inmunomodulación, neuromudulación, radiosensibilización) o en combinación con un agente terapéutico (es decir, administración mediada por ultrasonidos, por ejemplo para la administración de un fármaco o compuesto bioactivo a un sitio o tejido seleccionado, tal como en el tratamiento de tumores, terapia génica, terapia de enfermedades infecciosas, terapia de enfermedades metabólicas, terapia de enfermedades crónicas, terapia de enfermedades degenerativas, terapia de enfermedades inflamatorias, terapia de enfermedades inmunológicas o autoinmunes o en el uso como vacuna), mediante el cual la presencia de las microvesículas llenas de gas puede proporcionar un efecto terapéutico por sí mismo o es capaz de potenciar los efectos terapéuticos de los ultrasonidos aplicados, p. ej., ejerciendo o siendo responsable de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo, ya sea por sí mismo o tras la activación específica mediante diversos métodos físicos (incluyendo, p. ej., administración mediada por ultrasonidos).

Microvesículas de acuerdo con la invención se pueden administrar típicamente con fines terapéuticos en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5,0 pL de gas por kg de paciente, dependiendo, p. ej., de su composición respectiva, del tipo de sujeto bajo tratamiento, del tejido u órgano a tratar y/o del método terapéutico aplicado.

En una realización, dicho método de tratamiento terapéutico con ultrasonidos comprende:

(i) administrar a un paciente una suspensión de microvesículas llenas de gas obtenidas mediante reconstitución de un producto liofilizado obtenido de acuerdo con el procedimiento de la invención;

(ii) identificar una región de interés en dicho paciente para ser sometida a un tratamiento terapéutico, comprendiendo dicha región de interés dicha suspensión de microvesículas llenas de gas; y

(iii) aplicar un haz de ultrasonidos para tratar terapéuticamente dicha región de interés; por lo que dicho tratamiento terapéutico con ultrasonidos se ve mejorado por la presencia de dicha suspensión de microvesículas llenas de gas en dicha región de interés.

Los siguientes ejemplos ayudarán a ilustrar adicionalmente la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de microvesículas Jlenasde gas.

Las microvesículas de gas se sintetizaron utilizando un dispositivo de enfoque de flujo de microfluidos disponible comercialmente (diseño CU4553.007 N30, Micronit Microfluidics, NL), montado en un soporte de chip disponible comercialmente (Micronit Microfluidics, soporte de chip Fluidic Connect PRO con inserciones 4515). El canal de formación de microvesículas tenía una anchura de 19 pm. El chip y su soporte se colocaron en un baño de agua ópticamente transparente con temperatura controlada que se montó en un microscopio invertido equipado con un objetivo de aumento de 20 veces (Olympus, LMPLAN 20x) y una cámara CCD (Lumenera, LM156M). La temperatura del baño termostático se fijó en 50 °C.

Los materiales anfífilos en el flujo de líquido fueron: DSPC:DPPE-PEG5000 en una relación molar respectiva de 9:1.

Los materiales se añadieron con las relaciones molares anteriores a una concentración de 20 mg/mL a una mezcla de cloroformo/metanol 2:1 (relación en volumen) con agitación a 60 °C hasta la disolución completa del material anfífilo. Luego se evaporó el disolvente a presión reducida y la película obtenida se secó durante la noche a presión reducida. El material seco fue luego redispersado (a concentraciones de 15 mg/mL) en solución salina (NaCl al 0,9 %) a 60 °C con agitación durante 30 minutos. Luego se trató con ultrasonidos la dispersión utilizando un dispositivo de ultrasonidos con punta (Branson Sonifier 250) para dispersar homogéneamente el material. A continuación, las preparaciones se filtraron después utilizando un filtro de policarbonato (tamaño de poro de 0,45 pm), se enfriaron hasta temperatura ambiente y se desgasificaron.

Se prepararon microvesículas llenas de gas que comprendían CO<2>/C<4>F<10>en una relación en volumen de 85/15 con un dispositivo mezclador de gases similar al ilustrado esquemáticamente en laFigura 3. Brevemente, se llenaron dos recipientes de gas con CO<2>y C<4>F<10>, respectivamente. El flujo de gas de cada uno de los gases fue regulado por respectivos controladores de flujo másico: (i) EL-Flow: F200CV-002-RAD-11 -K, para el CO<2>y (ii) Low-AP-Flow: F-200DV-RAD- 11 -Z para C<4>F<10>(ambos controladores de gas de Bronkhorst, Ruurlo, Países Bajos). Los controladores de flujo másico fueron controlados por un programa de software personalizado implementado en Matlab (Mathworks), que se instaló en una computadora personal, con el fin de establecer y mantener la relación de mezcla deseada. Un sensor de presión (PSE530-M5-L; SMC Corp., Tokio, Japón) midió la presión real en la mezcla de gases en el canal de salida que conduce al chip de microfluidos; para la formación de las microvesículas se utilizó una presión de gas de 2 bares. El co-caudal del líquido se controló mediante el uso de un controlador de flujo másico independiente (Mini Cori Flow: M13V141-MAD-11-K-S; Bronkhorst, Ruurlo, Países Bajos). Se utilizó una tasa de co-caudal de alrededor de 150 pL/min para hacer funcionar el dispositivo de enfoque de flujo en el régimen de chorro y producir microvesículas con un diámetro (modo) de alrededor de 4 pm.

Ejemplo 2

Preparación de la composiciónJiofilizada

En primer lugar, se transfirieron 3 mL de la suspensión de microvesículas calibradas obtenida mediante el método de enfoque de flujo de microfluidos, como se describe en el Ejemplo 1, en un tubo Pyrex (tubo Pyrex desechable 12 x 75 mm) sin adición adicional de C<4>F<10>en el tubo. Luego, la suspensión de microvesículas calibradas se centrifugó (Centrífuga Sigma 3-16) durante 6 minutos a 64 g y se extrajo el infranadante mediante una jeringa equipada con una aguja. Los 200 pL restantes de microvesículas lavadas se redispersaron con 3 mL de una solución que comprendía el componente protector de la liofilización como se detalla en los siguientes ejemplos.

Las microvesículas calibradas suspendidas en la solución del componente protector de la liofilización se dividieron luego en partes alícuotas en viales de vidrio DIN8R (1,5 mL de suspensión/vial) y se transfirieron al liofilizador.

Los viales se enfriaron a temperaturas entre -30 °C y -60 °C (como se detalla en los ejemplos posteriores) y se liofilizaron durante aproximadamente 1 hora al vacío. Al final del procedimiento, se obtuvo una composición liofilizada en forma de un sólido seco homogéneo de color blanco. A continuación se llenó el espacio superior con C<4>F<10>puro.

Ejemplo 3

Efecto de los componentesprotectores de laJiofilización_sobre características de microvesícuias calibradas

LaTabla 2enumera los componentes protectores de la liofilización que se investigaron.

Tabla 2Componentes protectores de la liofilización seleccionados, clasificados por clase química

Los materiales anteriores se utilizaron, en diversas concentraciones, en la preparación de la composición liofilizada ilustrada en el Ejemplo 2 a una temperatura de congelación de -60 °C. LaTabla 3ilustra la composición y concentración de los componentes protectores liofilizado investigados (1A, 1B, 2A, 2B, S3-S13).

Tabla 3Composición y concentración de las soluciones evaluadas de componentes protectores de la liofilización

Caracterización

Después del proceso de liofilización, cada una de las composiciones liofilizadas se reconstituyó con 1,5 mL de solución acuosa en presencia de un gas biocompatible, con el fin de obtener una suspensión de microvesículas calibrada y estable. La composición liofilizada se reconstituyó, por lo tanto, con un volumen de solución acuosa similar al volumen de suspensión que se sometió al proceso de liofilización. Por consiguiente, las concentraciones obtenidas de los componentes protectores de la liofilización en la suspensión reconstituida fueron 93,75 mg/mL y 188 mg/mL, respectivamente, partiendo de una solución a una concentración de 100 mg/mL y 200 mg/mL.

Después de la reconstitución, las suspensiones de microvesículas calibradas reconstituidas se dejaron 5 minutos en el banco antes de caracterizarlas utilizando un Coulter Counter Multisizer 3 equipado con un tubo de apertura de 30 pm, para medir el tamaño, la desviación estándar geométrica (GSD), la concentración de microvesículas y el rendimiento tras el proceso de liofilización.

Resultados

Los principales resultados de la caracterización de las suspensiones de microvesículas calibradas reconstituidas se presentan en laTabla 4.

El valor de GSD y la concentración de microvesículas se midieron antes y después del proceso de liofilización para evaluar la eficacia de los componentes protectores de la liofilización en conservar las características iniciales de las microvesículas calibradas.

Tabla 4Valores de rendimiento de GSD, CMV y concentración de suspensiones de vesículas calibradas obtenidas después de la reconstitución de composiciones liofilizadas que comprenden un único componente protector de la liofilización (FD = liofilización).

Considerando el valor de GSD y el rendimiento de las microvesículas después de la liofilización, los resultados mostraron claramente que la adición de polietilenglicoles a la suspensión de microvesículas calibradas, antes del proceso de liofilización, es mucho más efectiva que la adición de polioles o sacáridos en términos de conservación de las características de las microvesículas.

En particular, la liofilización de microvesículas calibradas en soluciones de polietilenglicoles (PEG4000 y PEG8000) permitió mejorar los valores de GSD y/o el rendimiento de las microvesículas.

Además, la adición de soluciones de polietilenglicoles a una concentración de 200 mg/mL a la suspensión de CMV dio mejores resultados que la adición de polietilenglicoles a una concentración de 100 mg/mL. En particular, las suspensiones de CMV que contenían PEG4000 en una concentración de aproximadamente 200 mg/mL (1B) se caracterizaron por una GSD de 1,22 y un notable rendimiento de CMV del 63 %. Aún más ventajosamente, el uso de una solución de PEG8000 a 200 mg/mL (2B) permitió alcanzar una GSD de 1,20 y un rendimiento de CMV del 64 %.

Ejemplo 4

Caracterización de las características de iasmicrovesícuias calibradas después de la liofilización a diferentes temperaturas de congelación.

La preparación de la composición liofilizada se investigó más a fondo evaluando temperaturas de congelación diferentes a las que se enfrían las microvesículas calibradas recién preparadas al comienzo del proceso de liofilización.

El procedimiento de preparación se realizó como se describió previamente en el Ejemplo 2, excepto que los viales se enfriaron a diferentes temperaturas de congelación, como se informa en laTabla 5.

Al final del proceso de liofilización, cada una de las composiciones liofilizadas se reconstituyó con 1,5 mL de solución acuosa en presencia de un gas biocompatible, con el fin de obtener una suspensión de microvesículas calibrada y estable. La composición liofilizada se reconstituyó así con un volumen de solución acuosa similar al volumen de suspensión que se sometió al proceso de liofilización. Por consiguiente, las concentraciones obtenidas de los componentes protectores de la liofilización en la suspensión reconstituida fueron 93,75 mg/mL y 188 mg/mL, respectivamente, partiendo de una solución de componentes protectores de la liofilización a una concentración de 100 mg/mL y 200 mg/mL.

Después de la reconstitución, las suspensiones de microvesículas calibradas reconstituidas se dejaron 5 min en el banco antes de caracterizarlas utilizando un Coulter Counter Multisizer 3 equipado con un tubo de apertura de 30 pm, para medir el tamaño, la desviación estándar geométrica (GSD), la concentración de microvesículas y el rendimiento tras el proceso de liofilización.

LaTabla 5informa sobre los valores de GSD y el rendimiento de CMV de las suspensiones de microvesículas, obtenidas después de la reconstitución de composiciones liofilizadas que comprenden diferentes componentes protectores de la liofilización. Se seleccionaron las formulaciones 2A, 2B y S3A y se testaron diferentes temperaturas de congelación.

Resultados

Los resultados confirmaron que la adición de PEG8000 a la suspensión de microvesículas calibradas permitió mejorar el rendimiento de la liofilización a cualquier temperatura de congelación investigada, en comparación con el uso de sorbitol. Por ejemplo, el uso de PEG8000 a razón de 100 mg/mL fue mucho más ventajoso en términos de rendimiento de GSD y CMV que el uso de sorbitol a razón de 100 mg/mL, que no fue capaz de conservar eficientemente las condiciones iniciales de CMV. De hecho, la suspensión de CMV que contenía sorbitol a razón de aproximadamente 100 mg/mL (S3A) se caracterizó por un bajo rendimiento de CMV, con un valor máximo del 6 %, y por valores elevados de GSD, comprendidos entre 1,27 y 1,38.

Además, estos resultados confirmaron que la suspensión de CMV que contenía PEG8000 a una concentración de aproximadamente 200 mg/mL (2B) se caracterizó por un valor de GSD más bajo y un rendimiento de CMV notablemente mayor en comparación con la suspensión de CMV que contenía PEG8000 a razón de aproximadamente 100 mg/mL (2A). Por ejemplo, en el primer caso se encontró que el rendimiento de CMV estaba comprendido entre 56 y 68 %, mientras que en el último caso se encontró que el mayor rendimiento de CMV era del 45 % a -40 °C. Además, también los valores de GSD fueron más bajos para la formulación 2B, con valores inferiores a 1,20, confirmando el mayor rendimiento de la solución de PEG8000 a 200 mg/mL en la conservación de las características iniciales del CMV.

Tabla 5Valor de GSD, rendimiento de CMV y concentración medidos después de la liofilización (FD) a diferentes temperaturas de congelación.

Ejemplo 5

Efecto _de la_concentración_del componente protector de la_liofilización_sobre las_características_de las_microvesículas calibradas.

También se investigó la concentración del componente protector de la liofilización con el fin de evaluar la eficiencia de la liofilización, en términos de conservación del valor de GSD y el rendimiento de las microvesículas después de la liofilización.

Para este estudio, se seleccionaron PEG4000 y PEG8000 como componentes protectores de la liofilización, ya que evolucionaron como los más prometedores entre los aquí investigados. Para cada una de las formulaciones investigadas se prepararon diferentes soluciones en un intervalo de concentraciones entre 50 mg/mL y 250 mg/mL.

Las microvesículas calibradas suspendidas en las diferentes soluciones de componentes protectores de la liofilización se dividieron en partes alícuotas en viales de vidrio DIN8R (1,5 mL de suspensión/vial) y se transfirieron al liofilizador.

Se investigaron dos temperaturas de congelación diferentes. Los viales se enfriaron a -60 °C y -40 °C, y se liofilizó durante aproximadamente 1 hora al vacío. Al final del procedimiento, se obtuvo una composición liofilizada como un sólido seco homogéneo de color blanco. A continuación se llenó el espacio superior con C<4>F<10>puro.

Resultados

Tabla 6Valores de rendimiento de GSD y CMV de las suspensiones de CMV que contienen diferentes porcentajes de concentraciones de PEG4000, después de la liofilización.

Tabla 7Valores de rendimiento de GSD y CMV de las suspensiones de CMV que contienen diferentes porcentajes de concentraciones de PEG8000, liofilización.

Los resultados demostraron que existe una relación lineal entre el rendimiento final de microvesículas después de la liofilización y la concentración total del componente protector de la liofilización. Como se muestra en laFigura 4, se obtuvo una mejora creciente de la eficiencia de la liofilización utilizando concentraciones de componente protector de la liofilización entre 50 mg/mL y 200 mg/mL tanto para PEG4000 como para PEG8000.

Los resultados anteriores demuestran que un aumento de la concentración de la solución de PEG tiene en general un efecto positivo sobre los valores de GSD y/o los rendimientos de CMV.

Referencias citadas

1. W02018/041906 A1 - BRACCO SUISSE SA

2. Número de solicitud PCT PCT/EP2019/055325

3. US2017/080113 A1 - GE Healthcare

4. WO97/29782 A1 - NICOMED IMAGING A/S

5. W02004/069284 A2 - BRACCO RESEARCH SA [CH]

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición liofilizada que comprende (i) un material anfífilo que comprende un fosfolípido y (ii) un polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular comprendido entre 2000 y 10000 g/mol que, tras la reconstitución con una solución farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas biocompatible, proporciona una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas, en donde dicha suspensión reconstituida de microvesículas tiene un valor de desviación estándar geométrica (GSD) de al menos 1,22 o inferior y en donde dicho polietilenglicol (PEG) tiene una concentración entre 12 y 25 % (p/v%).

2. La composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polietilenglicol (PEG) tiene un peso molecular comprendido entre 4000 y 8000 g/mol.

3. La composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho polietilenglicol (PEG) se selecciona de un PEG que tiene un peso molecular de 4000 g/mol (±10 %) o un PEG que tiene un peso molecular de 8000 g/mol ( ±10%).

4. La composición liofilizada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 precedentes, en donde dicha suspensión reconstituida de microvesículas calibradas se caracteriza por una concentración de al menos 2,0 x 108 microvesículas/mL.

5. La composición liofilizada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 precedentes, en donde dicho polietilenglicol (PEG) tiene una concentración entre 14 y 24 % (p/v%).

6. Una suspensión de microvesículas llenas de gas obtenida reconstituyendo una composición liofilizada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes con una solución farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas biocompatible.

7. Una suspensión de microvesículas llenas de gas de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el componente protector de la liofilización está presente en una concentración entre 12 % y 25 %.

8. Un método para preparar una composición liofilizada para la preparación de una suspensión reconstituida de microvesículas llenas de gas calibradas que tienen una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior, que comprende las etapas de:

a. preparar una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas que comprenden un poliglicol como componente protector de la liofilización, en donde dichas microvesículas calibradas tienen una distribución de tamaño caracterizada por una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior; y

b. liofilizar la suspensión de microvesículas calibradas.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el método de preparación de la etapa a. es la técnica de enfoque de flujo de microfluidos.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho componente protector de la liofilización tiene una concentración total comprendida entre 100 mg/mL y 300 mg/mL, preferiblemente entre 120 mg/mL y 250 mg/mL, más preferiblemente la concentración total es 200 mg/mL.

11. Una composición liofilizada para preparar una suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas que tienen una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior, pudiéndose obtener dicha composición liofilizada mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a. preparar una primera suspensión de microvesículas calibradas llenas de gas mediante un procedimiento de enfoque de flujo de microfluidos, comprendiendo además dicha suspensión un polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular comprendido entre 2000 y 10000 g/mol y en el que dichas microvesículas calibradas tienen una distribución de tamaño caracterizada por una desviación estándar geométrica (GSD) de 1,22 o inferior; y b. liofilizar dicha suspensión.

12. Un procedimiento para la preparación de un agente de contraste inyectable que comprende una suspensión de microvesículas llenas de gas, en el que dicho procedimiento comprende reconstituir una composición liofilizada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 precedentes con una solución farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas biocompatible.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha suspensión de microvesículas calibradas se caracteriza por una GSD de 1,22 o inferior.