ES2965028T3 - Producto liofilizado y suspensión de microvesículas llenas de gas - Google Patents

Abstract

Un método de fabricación de una suspensión de microvesículas llenas de gas mediante la reconstitución de un producto liofilizado y una suspensión obtenida según dicho método, donde el producto liofilizado ha sido sometido a un tratamiento térmico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producto liofilizado y suspensión de microvesículas llenas de gas

Campo técnico

La invención se refiere a un nuevo método de fabricación de una suspensión de microvesículas llenas de gas al reconstituir un producto liofilizado.

Antecedentes de la invención

El rápido desarrollo de agentes de contraste en los últimos años ha generado varias composiciones y formulaciones diferentes, que son útiles en imágenes potenciadas con contraste de órganos y tejidos del cuerpo humano o animal, así como en tratamientos terapéuticos de los mismos.

Una clase de agentes de contraste particularmente útil para imágenes por ultrasonidos potenciadas con contraste (imágenes "CEUS") incluye suspensiones de burbujas de gas de tamaño nano- y/o micrométrico dispersadas en un medio acuoso. El gas típicamente se atrapa o encapsula en una capa de película que comprende, por ejemplo, emulsionantes, aceites, espesantes o glúcidos. Estas burbujas de gas estabilizadas (dispersadas en una solución fisiológica adecuada) se denominan en general en la técnica con diversas terminologías, dependiendo típicamente del material estabilizante empleado para su preparación; estos términos incluyen, por ejemplo, "microesferas", "microburbujas", "microcápsulas" o "microglobos", denominadas globalmente aquí como "microvesículas llenas de gas" (o "microvesículas").

Los agentes de contraste de ultrasonidos ("USCA") pueden producirse de acuerdo con diversos métodos de fabricación. Uno de estos métodos, véase, por ejemplo, el documento WO94/09829, implica la disolución de un material anfífilo (tal como un fosfolípido y/o ácido graso) y de un compuesto protector liofilizante (por ejemplo, polietilenglicol) en un disolvente orgánico; la mezcla obtenida entonces se somete a liofilización, típicamente después de llenarse en viales, para retirar el disolvente y obtener un producto liofilizado. Otro método, véase, por ejemplo, el documento WO2004/069284, implica la preparación de una microemulsión de agua con un disolvente orgánico inmiscible en agua, comprendiendo dicha emulsión un material anfífilo y un compuesto protector liofilizante. La emulsión entonces se somete (tras su distribución en viales) a una etapa de liofilización para retirar el agua y el disolvente.

El espacio superior de los viales, que contienen un producto sólido liofilizado en forma de polvo en el fondo de los mismos, se llena entonces con un gas adecuado (por ejemplo, un gas fluorado) y finalmente se sella para su almacenamiento. Antes de su uso, se prepara fácilmente una suspensión acuosa de microburbujas al introducir un líquido adecuado en el vial (por ejemplo, solución salina) y agitar suavemente el vial para disolver el producto liofilizado.

Un USCA disponible en el mercado que puede fabricarse de acuerdo con el método anterior es SonoVue® (o Lumason® en Estados Unidos), de Bracco.

El documento EP 1228770 A1 describe la preparación de un agente de contraste liofilizado que contiene gas para imágenes de diagnóstico.

El solicitante ahora ha observado que las características de una suspensión de microvesículas llenas de gas (particularmente microburbujas) reconstituida a partir de un producto liofilizado pueden mejorarse al introducir un tratamiento térmico controlado final (es decir, calentamiento) al final del proceso para fabricar el producto sólido liofilizado.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere a un método de fabricación de una composición liofilizada adecuada para la preparación de una suspensión de microvesículas llenas de gas estabilizadas, comprendiendo dicha composición: (i) un material anfífilo que puede estabilizar dichas microvesículas de gas; y (ii) un componente protector liofilizante; que comprende:

a. preparar una mezcla líquida que comprende dicho material anfífilo y dicho componente protector liofilizante en un disolvente;

b. liofilizar la mezcla líquida para retirar dicho disolvente y obtener un producto liofilizado que comprende dicho material anfífilo y dicho componente protector liofilizante; y

c. calentar dicho producto liofilizado;

en donde dicho método es como se define en la reivindicación 1. T

Dicha etapa de calentamiento comprende calentar dicho producto a una temperatura mayor de 35 °C, más preferiblemente al menos 38 °C. La temperatura de calentamiento es preferiblemente menor de 50 °C, más preferiblemente menor de 48 °C.

La etapa de calentamiento se realiza a presión ambiental.

<La etapa de calentamiento dura al menos>8<horas, más preferiblemente al menos 12 horas.>

De acuerdo con un aspecto más, la invención se refiere a un método para fabricar una suspensión de microvesículas llenas de gas estabilizada mediante un material anfífilo, que comprende:

a. preparar un producto liofilizado de acuerdo con el método de fabricación ilustrado anteriormente; y

b. reconstituir dicho producto al mezclarlo con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas fisiológicamente aceptable en agitación suave, para obtener la suspensión de microvesículas llenas de gas.

Descripción detallada de la invención

Un método adecuado para preparar suspensiones inyectables de microvesículas llenas de gas comprende la reconstitución, en presencia de un gas fisiológicamente aceptable adecuado, de un producto liofilizado que comprende un material anfífilo que puede estabilizar dichas microvesículas (por ejemplo, al formar una capa estabilizante en la superficie de contacto de líquido-gas) con un vehículo acuoso.

El producto liofilizado se obtiene típicamente al liofilizar una mezcla líquida que comprende dicho material anfífilo y un componente protector liofilizante en un disolvente adecuado.

La mezcla líquida que experimenta el proceso de liofilización puede obtenerse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, divulgados, por ejemplo, en el documento WO94/09829 o WO2004/069284.

Preparación de mezcla líquida para liofilización

Por ejemplo, de acuerdo con el proceso divulgado por el documento WO94/09829, el material anfífilo se dispersa en<un disolvente orgánico (por ejemplo, ferc-butanol, dioxano, ciclohexanol, tetraclorodifluoroetileno o>2<-metil->2<-butanol)>junto con un componente protector liofilizante adecuado. La dispersión que contiene el material anfífilo y el componente protector liofilizante entonces se somete a liofilización para retirar el disolvente orgánico obteniendo, por tanto, un producto liofilizado.

De acuerdo con el proceso alternativo divulgado en el documento WO2004/069284, una composición que comprende un material anfífilo puede dispersarse en una emulsión de agua con un disolvente orgánico inmiscible en agua en agitación, preferiblemente en mezcla con un componente protector liofilizante.

Disolventes orgánicos inmiscibles en agua adecuados incluyen, por ejemplo, alcanos ramificados o lineales, alquenos, cicloalcanos, hidrocarburos aromáticos, éteres de alquilo, cetonas, hidrocarburos halogenados, hidrocarburos perfluorados o mezclas de los mismos.

La emulsión puede obtenerse al someter el medio acuoso y el disolvente, en presencia del material anfífilo, a cualquier técnica apropiada generadora de emulsión conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, sonicación, agitación, homogeneización a alta presión, micromezcla, emulsificación en membrana, agitación a alta velocidad o mezcla de alto cizallamiento. El componente protector liofilizante puede añadirse antes o después de la formación de la emulsión, por ejemplo, como una solución acuosa que comprende dicho componente protector liofilizante. La microemulsión obtenida de este modo, que contiene microgotas de disolvente rodeadas y estabilizadas por el material anfífilo, entonces se liofiliza de acuerdo con técnicas convencionales para obtener un material liofilizado, que entonces puede usarse para preparar una suspensión de microvesículas llenas de gas.

Material anfífilo

De acuerdo con la invención, los materiales anfífilos útiles para preparar las mezclas líquidas anteriores comprenden un fosfolípido. Los fosfolípidos, como otras moléculas anfífilas, en general pueden formar una película estabilizante de material (típicamente en forma de una capa monomolecular) en la superficie de contacto delimitante de gas-agua en la suspensión final de microvesículas llenas de gas, estos materiales también se denominan en la técnica materiales "formadores de película".

Los fosfolípidos típicamente contienen al menos un grupo fosfato y al menos uno, preferiblemente dos, grupos hidrocarbonados de cadena larga lipófilos.

Ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen ásteres de glicerol con uno o preferiblemente dos residuos (iguales o diferentes) de ácidos grasos y con ácido fosfórico, en donde el residuo de ácido fosfórico se une, a su vez, a un grupo hidrófilo, tal como, por ejemplo, colina (fosfatidilcolinas - PC), serina (fosfatidilserinas - PS), glicerol (fosfatidilgliceroles - PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas - PE), inositol (fosfatidilinositol). Los ásteres de fosfolípidos con solamente un residuo de ácido graso se denominan en general en la técnica las formas "liso" del fosfolípido o "lisofosfolípidos". Los residuos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos en general son ácidos alifáticos de cadena larga, que contienen típicamente de 12 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 14 a 22; la cadena alifática puede contener una o más insaturaciones o está preferiblemente saturada completamente. Ejemplos de ácidos grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behánico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolánico. Preferiblemente, se emplean ácidos grasos saturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido araquídico.

Más ejemplos de fosfolípido son ácidos fosfatídicos, es decir, los diásteres de glicerol-ácido fosfórico con ácidos grasos; esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir, esos análogos de fosfatidilcolina donde el residuo de diáster de glicerol con ácidos grasos se remplaza por una cadena de ceramida; cardiolipinas, es decir, los ásteres de 1,3-difosfatidilglicerol con un ácido graso; glucolípidos tales como gangliósidos GM1 (o GM2) o cerebrósidos; glucolípidos; sulfátidos y glucoesfingolípidos.

Como se usa en este documento, el tármino "fosfolípido(s)" incluye compuestos de origen natural, preparados de forma semisintática o sintática que pueden prepararse de forma individual o como mezclas.

Ejemplos de fosfolípidos de origen natural son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, típicamente, lecitinas de soja o yema de huevo.

Ejemplos de fosfolípidos semisintáticos son los derivados parcial o completamente hidrogenados de las lecitinas de origen natural. Fosfolípidos preferidos son diásteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol o de esfingomielina.

Ejemplos de fosfolípidos preferidos son, por ejemplo, dilauroil-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC), diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2 diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1 -miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1 -palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina (PMPC), 1 -palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1 -estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1 -palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1 -oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidil-glicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido diestearoil fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidil-etanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoilesfingomielina (DPSP), y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidilinositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoilfosfatidilinositol (DOPI).

Fosfolípidos adecuados incluyen además fosfolípidos modificados al ligar un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG), a los mismos. Fosfolípidos modificados con polímero preferidos incluyen "fosfolípidos pegilados", es decir, fosfolípidos unidos a un polímero de PEG. Ejemplos de fosfolípidos pegilados son fosfatidiletanolaminas pegiladas ("PE-PEG" en resumen), es decir, fosfatidiletanolaminas donde el resto de etanolamina hidrófila se liga a una molácula de PEG de peso molecular variable (por ejemplo, de 300 a 20000 dalton, preferiblemente de 500 a 5000 dalton), tales como DPPE-PEG (o DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG o DOPE-PEG). Por ejemplo, DPPE-PEG5000 se refiere a DPPE que tiene fijado al mismo un polímero de PEG que tiene un peso molecular promedio medio de aproximadamente 5000. Un ejemplo de DPPE-PEG5000 es el derivado de PEG terminado en metoxi 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000].

En una realización, los fosfolípidos pueden albergar un esto reactivo que despuás puede hacerse reaccionar con un resto reactivo correspondiente que alberga un componente activo adecuado (por ejemplo, ligando de dirección), para unir dicho componente activo a la microvesícula. Ejemplos de restos reactivos adecuados incluyen, por ejemplo, grupos reactivos que pueden reaccionar con un grupo amino unido a un componente activo tal como grupos isotiocianato (que formarán un enlace tiourea), ásteres reactivos (para formar un enlace amida), grupos aldehído (para la formación de un enlace imina a reducir en un enlace alquilamina); grupos reactivos que pueden reaccionar con un grupo tiol unido a un componente activo, tales como derivados de haloacetilo o maleimidas (para formar un enlace tioáter); grupos reactivos que pueden reaccionar con un grupo carboxílico unido a un componente activo, tales como aminas o hidrazidas (para formar enlaces amida o alquilamida). Preferiblemente, el compuesto anfífilo que alberga el resto reactivo es un lípido que alberga un polímero hidrófilo, tal como los mencionados previamente, preferiblemente un fosfolípido pegilado, por ejemplo, DPPE-PEG2000, tal como DPPE-PEG2000-maleimida.

Fosfolípidos particularmente preferidos son DAPC, DSPC, DPPC, DMPA, DPPA, DSPA, DMPG, DPPG, DSPG, DMPS, DPPS, DSPS y etil-DSPC. Los más preferidos son DPPG, DPPS y DSPC.

También pueden usarse mezclas de fosfolípidos, tales como, por ejemplo, mezclas de DPPE y/o DSPE (incluyendo derivados pegilados), DPPC, DSPC y/o<d>A<p>C con DSPS,<d>P<p>S, D<s>P<a>, DPPA, DSPG, DPPG, etil-DSPC y/o etil-DPPC.

Los fosfolípidos pueden usarse convenientemente en mezcla con cualquier otro compuesto, preferiblemente anfífilo. Por ejemplo, lípidos tales como colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, galato de propilo o palmitato de ascorbilo, ácidos grasos tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico y derivados de los mismos o hidroxitolueno butilado y/u otros compuestos no fosfolipídicos (anfífilos) pueden añadirse opcionalmente a uno o más de los fosfolípidos anteriores, por ejemplo, en proporciones preferiblemente por debajo de un 50 % en peso, más preferiblemente hasta un 25 % o inferior. De acuerdo con la invención, un ácido graso se usa como compuesto adicional en mezcla con fosfolípidos. Ácidos grasos útiles en una composición de acuerdo con la invención, que pueden estar saturados o insaturados, comprenden una cadena alifática C<10>-C<24>terminada por un resto de ácido carboxílico, preferiblemente una cadena alifática C<14>-C<22>y más preferiblemente C<16>-C<20>. Ejemplos de ácidos grasos adecuados incluyen ácido cáprico (n-decanoico), láurico (n-dodecanoico), mirístico (n-tetradecanoico), palmítico (n-hexadecanoico), esteárico (n-octadecanoico), araquídico (n-eicosanoico), behénico (n-docosanoico) y ntetracosanoico. Ácidos grasos saturados preferidos son ácido mirístico, palmítico, esteárico y araquídico, más preferiblemente ácido palmítico. Ejemplos de ácidos grasos insaturados comprenden ácido miristoleico (cis-9-<tetradecenoico), palmitoleico (cis-9-hexadecenoico), sapiénico (cis->6<-hexadecenoico), oleico (cis-9-octadecenoico),>linoleico (cis-9,12-octadecadienoico), linolénico (cis-9,12,15-octadecatrienoico), gondoico (cis-11-eicosenoico),cis-11,14-eicosadienoico, cis-5,8,11-eicosatrienoico, cis-8,11,14-eicosatrienoico,cis-11,14,17-eicosatrienoico, araquidónico (cis-8,11,14,17-eicosatetraenoico) y erúcico (cis-13-docosenoico).

De acuerdo con una realización, la mezcla de materiales anfífilos comprende una mezcla de DSPC, DPPG y ácido palmítico.

De acuerdo con una realización alternativa, dicho material anfífilo comprende una mezcla de DSPC, DPPE-PEG5000 y ácido palmítico, opcionalmente que comprende además un ligando de dirección.

Ligandos de dirección

Las composiciones y microvesículas de acuerdo con la invención pueden comprender opcionalmente un ligando de dirección.

La expresión "ligando de dirección" incluye dentro de su significado cualquier compuesto, resto o residuo que tenga, o que pueda promover, una actividad de dirección (por ejemplo, incluyendo una unión selectiva) de las microvesículas de una composición de la invención hacia cualquier sitio biológico o patológico dentro de un organismo vivo. Dianas con las que el ligando de dirección puede asociarse incluyen tejidos tales como, por ejemplo, tejido miocárdico (incluyendo células miocárdicas y cardiomiocitos), tejidos membranosos (incluyendo endotelio y epitelio), láminas, tejido conjuntivo (incluyendo tejido intersticial) o tumores; coágulos sanguíneos; y receptores tales como, por ejemplo, receptores de superficie celular para hormonas peptídicas, neurotransmisores, antígenos, fragmentos del complemento e inmunoglobulinas y receptores citoplásmicos para hormonas esteroideas.

El ligando de dirección puede ser sintético, semisintético o de origen natural. Materiales o sustancias que pueden servir como ligandos de dirección incluyen, por ejemplo, aunque sin limitación, proteínas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas receptoras, moléculas de unión al receptor, glucoproteínas y lectinas; péptidos, incluyendo oligopéptidos y polipéptidos; peptidomiméticos; sacáridos, incluyendo mono- y polisacáridos; vitaminas; esteroides, análogos esteroideos, hormonas, cofactores, agentes bioactivos y material genético, incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.

El ligando de dirección puede ser un compuestoper seque se mezcla con los otros componentes de la microvesícula o puede ser un compuesto que se une a una molécula anfífila (típicamente un fosfolípido) empleado para la formación de la microvesícula.

En una realización preferida, el ligando de dirección puede unirse a una molécula anfífila (por ejemplo, un fosfolípido) que forma la envuelta estabilizante de la microvesícula a través de un enlace covalente. En dicho caso, el resto reactivo específico que tiene que estar presente en la molécula anfífila dependerá del ligando de dirección particular a acoplar a la misma, como se ilustra en detalle anteriormente. Para unir covalentemente un ligando de dirección deseado, al menos parte del compuesto anfífilo que forma la envuelta de la microvesícula contendrá, por tanto, un resto reactivo adecuado y el ligando de dirección que contiene la funcionalidad complementaria se ligará a la misma de acuerdo con técnicas conocidas, por ejemplo, al añadirlo a una dispersión que comprende los componentes anfífilos de la microvesícula. Preferiblemente, el compuesto anfífilo es un lípido que alberga un polímero hidrófilo, tal como los mencionados previamente, preferiblemente un fosfolípido pegilado (por ejemplo, DSPE-PEG2000). En este caso, el<ligando de dirección se liga a un resto reactivo adecuado en el polímero hidrófilo (por ejemplo, DSPE-PEG>2000<-NH2),>opcionalmente a través de un conector. El compuesto anfífilo puede combinarse con el ligando de dirección deseado antes de preparar la microvesícula, y la combinación obtenida de este modo puede usarse para la preparación de la microvesícula. Como alternativa, el ligando de dirección puede ligarse al compuesto anfífilo respectivo durante la preparación de la microvesícula (por ejemplo, en la preparación de microemulsión intermedia del proceso descrito en el documento WO2004/069284). Como otra alternativa, la unión puede tener lugar sobre la microvesícula formada que comprende un material anfífilo que alberga un resto reactivo.

De acuerdo con una realización alternativa, el ligando de dirección también puede asociarse adecuadamente con la microvesícula mediante interacción física y/o electrostática. Como un ejemplo, puede introducirse un resto funcional que tiene una alta afinidad y selectividad por un resto complementario en la molécula anfífila, mientras el resto complementario se ligará al ligando de dirección. Por ejemplo, un resto de avidina (o estreptavidina) (que tiene alta afinidad por biotina) puede ligarse covalentemente a un fosfolípido (o a un fosfolípido pegilado) mientras el resto de biotina complementario puede incorporarse en un ligando de dirección adecuado, por ejemplo, un péptido o un anticuerpo. El ligando de dirección marcado con biotina, por tanto, se asociará con el fosfolípido marcado con avidina de la microvesícula por medio del sistema de acoplamiento de avidina-biotina. Como alternativa, tanto al fosfolípido como al ligando de dirección se les puede proporcionar un resto de biotina y posteriormente acoplarse entre sí por medio de avidina (que es un componente bifuncional que puede empalmar los dos restos de biotina). Ejemplos de acoplamiento mediante biotina/avidina de fosfolípidos y péptidos también se divulgan en el documento US 6.139.819 citado anteriormente. Como alternativa, interacciones de Van der Waals, interacciones electrostáticas y otros procesos de asociación pueden asociar o unir el ligando de dirección a las moléculas anfífilas.

Como alternativa, el fosfolípido puede modificarse con una proteína adecuada para acoplamiento específico al dominio Fc de inmunoglobulina (Ig), tal como proteína A, proteína G, proteína A/G o proteína L. De acuerdo con una realización alternativa, el ligando de dirección puede ser un compuesto que se mezcla con los componentes que forman la microvesícula, para incorporarse finalmente en la estructura de la microvesícula, tal como, por ejemplo, un lipopéptido como se divulga, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional WO 98/18501 o 99/55383.

Como alternativa, en primer lugar puede fabricarse una microvesícula, que comprende un compuesto (lípido o lípido modificado con polímero) que tiene un resto adecuado que puede interactuar con un resto complementario correspondiente de un ligando de dirección; después de ello, el ligando de dirección deseado se añade a la suspensión de microvesículas, para unirse al resto complementario correspondiente en la microvesícula.

Ejemplos de dianas específicas adecuadas a las que pueden dirigirse las microvesículas son, por ejemplo, fibrina y el receptor de unión a GPIIbIIIa en plaquetas activadas. La fibrina y las plaquetas de hecho están presentes, en general, en los "trombos", es decir, coágulos que pueden formarse en el torrente sanguíneo y provocan una obstrucción vascular. Se divulgan péptidos de unión adecuados, por ejemplo, en el documento US 6.139.819 citado anteriormente. Se divulgan otros péptidos de unión específicos para dirección a fibrina, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/055544.

Otros ejemplos de dianas importantes incluyen receptores en placas vulnerables y receptores específicos de tumor, tales como la región del dominio cinasa (KDR) y el complejo de VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular)/KDR. Se divulgan péptidos de unión adecuados para KDR o el complejo VEGF/KDR, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 03/74005, WO 03/084574 y WO2007/067979. En una realización, el péptido de dirección es un conjugado de péptido dimérico-fosfolípido (lipopéptido) como se describe en el documento WO2007/067979.

Componente protector liofilizante

Como se define en este documento, un componente protector liofilizante es un compuesto con efecto crioprotector y/o lioprotector. Componentes protectores liofilizantes adecuados incluyen, por ejemplo, carbohidratos, por ejemplo, un mono-, di- o polisacárido, tal como sacarosa, maltosa, trehalosa, glucosa, lactosa, galactosa, rafinosa, ciclodextrina, dextrano, quitosano y sus derivados (por ejemplo, carboximetil quitosano, trimetil quitosano); polioles, por ejemplo, alditoles tales como sorbitol, manitol o xilitol; o polímeros hidrófilos, por ejemplo, polioxialquilenglicol tal como polietilenglicol (por ejemplo, PEG2000, PEG4000 o PEG8000) o polipropilenglicol. De acuerdo con la invención, dicho componente protector liofilizante es polietilenglicol, preferiblemente PEG4000. PEG4000, como se usa en este documento, tiene su significado normal en el campo, lo que indica un polietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 4000 g/mol, en general con una variación de /-10 % alrededor de dicho valor.

Proceso de liofilización

Para el proceso de liofilización, la mezcla líquida que contiene el material anfífilo y el componente protector liofilizante (obtenido, por ejemplo, de acuerdo con cualquiera de los procesos de fabricación ilustrados previamente), se muestrea<típicamente en viales de vidrio (por ejemplo, DIN>8<R o DIN20R) que se cargan en un liofilizador.>

El proceso de liofilización en general incluye una etapa inicial (secado principal) donde los viales se ultraenfrían rápidamente (por ejemplo, a temperaturas de -35 °C a -70 °C) para congelar el líquido o los líquidos de la mezcla y<después se someten a vacío (por ejemplo,>0<,>1-0,8<mbar); durante el secado principal, la totalidad sustancial del líquido>o los líquidos congelados (por ejemplo, agua y/o disolventes) se retira por sublimación, típicamente hasta aproximadamente un 95 % de la cantidad total de líquido, preferiblemente hasta aproximadamente un 99 %. Después del secado principal, el líquido residual (incluyendo posible agua intersticial) puede retirarse adicionalmente durante el secado secundario, que se realiza típicamente a una temperatura mayor de la temperatura ambiente, al vacío (preferiblemente manteniendo el mismo vacío aplicado durante el secado principal). La temperatura durante el secado secundario es preferiblemente no mayor de 35 °C. El secado secundario puede detenerse cuando el contenido residual del líquido o los líquidos alcanza un valor mínimo deseado, por ejemplo, menos de un 3 % (preferiblemente menos de<un>1<%) en peso de agua con respecto a la masa total de producto liofilizado residual o, por ejemplo, menos de un>0,01<% en peso, preferiblemente menos de un 0,08 %, para el o los disolventes residuales.>

Después de completarse el proceso de liofilización (es decir, de detener el calentamiento y la retirada del vacío), el producto liofilizado puede experimentar la etapa de tratamiento térmico adicional de acuerdo con la invención, a presión ambiental. Como se usa en este documento, la expresión "presión ambiental" se refiere al valor normal de valores de presión atmosférica (es decir, aproximadamente 103,12 kPa a nivel del mar, típicamente entre 95 y 104 kPa). Preferiblemente, el tratamiento térmico se realiza en el vial sellado, después de saturar el espacio superior de los viales que contienen el producto liofilizado con un gas fisiológicamente aceptable adecuado y después tapando (por ejemplo, con un tapón de caucho, tal como caucho butílico) y sellando (por ejemplo, con un sellante rizado de metal, tal como aluminio) los viales. En este caso, los viales se retiran preferiblemente del liofilizador y se introducen en un horno adecuado para el tratamiento térmico. Como alternativa, dicho tratamiento térmico puede realizarse en el vial abierto (que se mantiene preferiblemente en el liofilizador), que después se satura con el gas y después se tapa/sella.

Ejemplos de gases fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, gases fluorados tales como SF<6>, CsFs, C<4>F<10>, opcionalmente en mezcla con aire o nitrógeno.

En una realización, se usa el gas SF<6>en combinación con una mezcla de materiales anfífilos que comprenden DSPC, DPPG y ácido palmítico, como se define anteriormente.

En otra realización, se usa el gas C<4>F<10>, o una mezcla de C<4>F<10>con nitrógeno, en combinación con una mezcla de materiales anfífilos que comprenden DSPC, DPPE-PEG5000 y ácido palmítico, opcionalmente que comprende además un ligando de dirección, como se define anteriormente.

Otros componentes

Otros componentes, por ejemplo, excipientes o aditivos, pueden estar presentes en la formulación seca para la preparación de las microvesículas o pueden añadirse junto con el vehículo acuoso usado para la reconstitución de la misma, sin estar implicados necesariamente (o solo parcialmente implicados) en la formación de la envuelta estabilizante de la microvesícula. Estos incluyen, por ejemplo, reguladores del pH, ajustadores de la osmolalidad, potenciadores de la viscosidad, emulsionantes, espesantes, etc. y pueden usarse en cantidades convencionales.

Suspensión de microvesículas llenas de gas

La suspensión de microvesículas llenas de gas entonces puede prepararse al reconstituir el producto liofilizado con un vehículo (acuoso) fisiológicamente aceptable, en agitación suave. Vehículos (acuosos) fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, agua para inyección, solución salina o de glucosa, que contiene opcionalmente excipientes o aditivos como se ilustra anteriormente.

Tratamiento por calor

De acuerdo con la invención, el producto liofilizado (contenido en viales respectivos al final del proceso de liofilización) experimenta una etapa final adicional de tratamiento por calor (o tratamiento térmico).

Como se menciona anteriormente, el tratamiento térmico se realiza preferiblemente sobre el producto liofilizado en los viales sellados que ya contienen el gas fisiológicamente aceptable; como alternativa, puede realizarse sobre el producto liofilizado en los viales antes de llenarlos con el gas y sellarlos. En el primer caso, el tratamiento térmico puede conseguirse dentro del aparato liofilizador o preferiblemente en un dispositivo de calentamiento separado (por ejemplo, un horno). En el segundo caso, la etapa de calentamiento se realiza preferiblemente dentro del aparato liofilizante; después de ello, se satura la atmósfera con el gas deseado y los viales se sellan.

Como observa el solicitante, dicho tratamiento por calor del producto liofilizado provoca sorprendentemente características mejoradas de la suspensión de microvesículas llenas de gas obtenida tras reconstituir el producto liofilizado, con respecto a suspensiones obtenidas de productos liofilizados que no experimentan dicho tratamiento por calor.

El solicitante observó, en particular, que dicho tratamiento provoca una resistencia aumentada a la presión de las microvesículas obtenidas.

El producto liofilizado se calienta a una temperatura mayor de 35 °C (por ejemplo, 36 °C), más preferiblemente a una temperatura de 38 °C o mayor. La temperatura máxima del tratamiento por calor en general depende de los materiales comprendidos en el producto liofilizado. Por ejemplo, dicha temperatura será mejor que el punto de fusión del material usado como aditivo liofilizante, que es el componente que forma la mayor parte de la masa del producto liofilizado (típicamente de 50 hasta más de 600 veces el peso de los componentes activos que forman la capa estabilizante de las microvesículas). Por ejemplo, el PEG4000 tiene una temperatura de fusión de 53-58 °C. De acuerdo con una realización, la temperatura de calentamiento es preferiblemente de 50 °C o menor. Temperaturas preferidas para el tratamiento por calor son de 38 °C a 45 °C.

La duración del tratamiento por calor en general depende de la temperatura del tratamiento; típicamente, cuando mayor sea la temperatura, más corta será la duración del calentamiento. Como los materiales que forman la envuelta de las microvesículas llenas de gas (fosfolípidos en particular) pueden experimentar reacción de degradación si se someten a temperaturas excesivas durante un periodo de tiempo demasiado largo (con posibles consecuencias negativas sobre las características de las microvesículas reconstituidas), la duración del tratamiento por calor no se<prolongará innecesariamente. Aunque una duración del tratamiento de aproximadamente>8<horas puede ser suficiente>(particularmente en combinación con temperaturas mayores de 45 °C, por ejemplo, 48 °C), la duración del tratamiento por calor se realiza preferiblemente durante 12 horas, hasta, por ejemplo, 20 horas, más preferiblemente de 14 a 18 horas. Aunque en casos particular pueden aplicarse bien duraciones más largas (particularmente en combinación con temperaturas menores de 45 °C, preferiblemente menores de 42 °C), el solicitante ha observado que las características de las microvesículas llenas de gas final se mejoran más solo ligeramente, si no nada en absoluto; dicha duración aumentada, por tanto, en la mayoría de los casos no es necesaria y generalmente es inconveniente en términos de economía de fabricación a escala industrial. De acuerdo con la invención, el tratamiento por calor se realiza durante un periodo de tiempo de ocho a veinte horas.

De acuerdo con la invención, el producto liofilizado comprende una mezcla de un fosfolípido y de un ácido graso, como se define anteriormente, en mezcla con un componente protector liofilizante. El tratamiento térmico de la invención ha demostrado ser particularmente eficaz para mejorar las características de las microvesículas llenas de gas que comprenden dicha mezcla de componentes.

De acuerdo con una realización, el producto liofilizado comprende DSPC, DPPG y ácido palmítico en combinación con un componente protector liofilizante (por ejemplo, polietilenglicol, tal como PEG4000). Dicho producto liofilizado preferiblemente se calienta a una temperatura de aproximadamente 40 °C a 48 °C, particularmente de aproximadamente 45 °C (+/-3 °C) durante al menos ocho horas, preferiblemente durante aproximadamente 18 h (+/-4 h).

De acuerdo con otra realización de la invención, el producto liofilizado comprende DSPC, DPPE-PEG5000 y ácido palmítico en combinación con un componente protector liofilizante (por ejemplo, polietilenglicol, tal como PEG4000). Dicho producto liofilizado se calienta a una temperatura de aproximadamente 36 °C a 45 °C, particularmente de aproximadamente 39 °C (+/-3 °C) durante al menos ocho horas, preferiblemente durante aproximadamente 15 h (+/-5 h).

De acuerdo con otra realización, dicha mezcla de DSPC, DPPE-PEG5000 y ácido palmítico comprende además un lipopéptido de dirección, por ejemplo, como se describe en el documento WO2007/067979.

Como se menciona anteriormente, el tratamiento térmico del producto liofilizado de acuerdo con la invención provoca una resistencia aumentada de las microvesículas llenas de gas a la presión. Ventajosamente, las microvesículas con resistencia aumentada a la presión en general muestran una persistencia aumentada en el tiempo en el torrente sanguíneo una vez inyectadas.

La resistencia a la presión de las microvesículas llenas de gas puede evaluarse al determinar el parámetro empírico "Pc50" o "presión crítica".

Como se explica en detalle en la parte experimental, el Pc50 de una suspensión de microvesículas llenas de gas identifica el valor de sobrepresión aplicada (con respecto a la presión atmosférica) a la que la absorbancia de una suspensión de microvesículas cae hasta la mitad de la absorbancia de la suspensión medida a presión atmosférica, provocando dicha sobrepresión aplicada una reducción sustancial de la población de microvesículas con respecto a la inicial (a presión atmosférica). De hecho, la reducción de la absorbancia de una suspensión de microvesículas se refiere a la reducción de la población inicial de microvesículas llenas de gas, por lo que la suspensión inicialmente lechosa (alta concentración de microvesículas) cada vez es más transparente a presión creciente (concentración reducida debido al hundimiento de las microvesículas). Cuanto mayores sean los valores de Pc50, mayor será la resistencia de las microvesículas a la presión. Para aplicaciones de diagnóstico por ultrasonidos, es deseable un valor mínimo de Pc50 de al menos 12 kPa para microvesículas llenas de gas, preferiblemente al menos 13 kPa (aproximadamente 100 mmHg), más preferiblemente al menos 14 kPa (105 mmHg). Para aplicaciones terapéuticas por ultrasonidos, que en general necesitan mayor tiempo de persistencia en el flujo sanguíneo, es deseable un valor mínimo de Pc50 de al menos 55 kPa (aproximadamente 412 mmHg), preferiblemente al menos 70 kPa (aproximadamente 525 mmHg), más preferiblemente al menos 80 kPa (aproximadamente 600 mmHg), mientras son incluso más preferidos valores mayores de Pc50.

Típicamente, el tratamiento térmico del producto liofilizado de acuerdo con la invención permite aumentar el Pc50 de<la suspensión reconstituida de microvesículas de al menos 5 kPa, preferiblemente al menos>8<kPa y más>preferiblemente al menos 10 kPa con respecto al Pc50 de una suspensión reconstituida obtenida de un producto liofilizado que no se ha sometido a dicho tratamiento térmico. Dicho aumento de Pc50 puede ser hasta 15 kPa y en algunas realizaciones hasta 25 kPa.

De acuerdo con una realización (por ejemplo, cuando el producto liofilizado comprende DSPC, DPPG, ácido palmítico y PEG4000), una suspensión de microvesículas reconstituida del producto liofilizado sometida a un tratamiento térmico de acuerdo con la invención tiene un valor de Pc50 de al menos 20 kPa, preferiblemente al menos 22 kPa y más preferiblemente de al menos 25 kPa.

De acuerdo con otra realización (por ejemplo, cuando el producto liofilizado comprende DSPC, DPPE-PEG5000 y ácido palmítico en combinación con un componente protector liofilizante, por ejemplo, polietilenglicol, tal como PEG4000), una suspensión de microvesículas reconstituida de un producto liofilizado sometido a un tratamiento térmico de acuerdo con la invención tiene un valor de Pc50 de al menos 75 kPa, preferiblemente al menos 80 kPa y más preferiblemente de al menos 90 kPa.

Kit farmacéutico, administración y métodos de uso

Los viales que contienen el producto liofilizado pueden envasarse ventajosamente en un kit de diagnóstico y/o terapéutico de dos componentes, preferiblemente para su administración por inyección. El kit preferiblemente comprende el vial que contiene el producto liofilizado y un segundo recipiente (por ejemplo, un cilindro de jeringa) que contiene el vehículo acuoso fisiológicamente aceptable para su reconstitución.

Las microvesículas preparadas de acuerdo con el método de la presente invención pueden usarse en una diversidad de técnicas de diagnóstico y/o terapéuticas, incluyendo en particular ultrasonidos.

Una suspensión de microvesículas reconstituida del producto liofilizado sometido a un tratamiento térmico de acuerdo con la invención, por tanto, puede usarse en un método de diagnóstico.

Los métodos de diagnóstico incluyen cualquier método donde el uso de las microvesículas llenas de gas permite potenciar la visualización de una porción o de una parte de un organismo animal (incluyendo seres humanos), incluyendo imágenes con fines de investigación preclínica y clínica. Puede emplearse una diversidad de técnicas de imágenes en aplicaciones de ultrasonidos, por ejemplo, incluyendo imágenes fundamentales y armónicas en modo B, imágenes por inversión de impulso o fase e imágenes fundamentales y armónicas Doppler; si se desea, pueden usarse técnicas de imágenes tridimensionales.

Las microvesículas preparadas de acuerdo con el método de la invención típicamente pueden administrarse en una<concentración de aproximadamente>0,01<a aproximadamente>1,0<pl de gas por kg de paciente, dependiendo, por>ejemplo, de su composición respectiva, el tejido u órgano del que tomarse imágenes y/o la técnica de imágenes elegida. Este intervalo de concentración general, por supuesto, puede variar dependiendo de las aplicaciones de imágenes específicas, por ejemplo, cuando pueden observarse señales a dosis muy bajas tal como en Doppler a color o inversión de impulso de energía.

En una realización, dicho método de diagnóstico comprende

(i) administrar a un paciente una suspensión de microvesículas llenas de gas obtenida por reconstitución de un producto liofilizado obtenido de acuerdo con el proceso de la invención; y

(ii) detectar una señal de ultrasonidos de una región de interés en dicho paciente.

De acuerdo con una realización, dicha suspensión de microvesículas llenas de gas comprende DSPC, DPPG, ácido palmítico y PEG4000.

La reconstitución del producto liofilizado se hace preferiblemente al dispersarlo en un vehículo acuoso fisiológicamente<aceptable, por ejemplo, solución salina, en presencia de un gas fisiológicamente aceptable, por ejemplo, SF>6<, en>agitación suave.

Dicha suspensión de microvesículas tiene preferiblemente un valor de Pc50 de al menos 20 kPa, más preferiblemente al menos 22 kPa e incluso más preferiblemente de al menos 25 kPa.

En una realización, dicho método de diagnóstico comprende imágenes por ultrasonidos del corazón, en particular para opacar la cámara ventricular izquierda y para mejorar la delimitación del límite endocárdico ventricular izquierdo en pacientes adultos con ecocardiogramas subóptimos.

En otra realización, dicho método de diagnóstico comprende imágenes por ultrasonidos del hígado, en particular para la caracterización de lesiones hepáticas focales en pacientes adultos y pediátricos.

En otra realización, dicho método de diagnóstico comprende imágenes por ultrasonidos del aparato urinario, particularmente para la evaluación de sospecha o conocimiento de reflujo vesicoureteral en pacientes pediátricos.

En otra realización de dicho método de diagnóstico, dicha suspensión de microvesículas llenas de gas comprende DSPC, DPPE-PEG5000, ácido palmítico, opcionalmente un lipopéptido de dirección y PEG4000. Preferiblemente, el lipopéptido de dirección es un lipopéptido de dirección a VEGF/KDR, por ejemplo, como se describe en el documento WO2007/067979.

Otras posibles aplicaciones de imágenes de diagnóstico incluyen centelleografía, imágenes ópticas e imágenes de rayos X, incluyendo imágenes de rayos X con contraste de fase.

Una suspensión de microvesículas reconstituida del producto liofilizado sometido a un tratamiento térmico de acuerdo con la invención puede usarse en un método de tratamiento terapéutico.

Las técnicas terapéuticas incluyen cualquier método de tratamiento (como se define anteriormente) de un paciente, que comprende el uso combinado de ultrasonidos y microvesículas llenas de gas tal cual (por ejemplo, en trombólisis mediada por ultrasonidos, ablación por ultrasonidos centrada del alta intensidad, permeabilización de la barrera hematoencefálica, inmunomodulación, neuromodulación, radiosensibilización) o en combinación con un agente terapéutico (es decir, administración mediada por ultrasonidos, por ejemplo, para la administración de un fármaco o compuesto bioactivo a un sitio o tejido seleccionado, tal como en tratamiento tumoral, genoterapia, tratamiento de enfermedades infecciosas, tratamiento de enfermedades metabólicas, tratamiento de enfermedades crónicas, tratamiento de enfermedades degenerativas, tratamiento de enfermedades inflamatorias, tratamiento de enfermedades inmunológicas o autoinmunitarias o en el uso como vacuna), por lo que la presencia de las microvesículas llenas de gas puede proporcionar un efecto terapéutico en sí misma o puede potenciar los efectos terapéuticos de los ultrasonidos aplicados, por ejemplo, al ejercer o ser responsable de ejercer un efecto biológicoin vitroy/oin vivo,en sí mismo o tras activación específica mediante diversos métodos físicos (incluyendo, por ejemplo, administración mediada por ultrasonidos).

Las microvesículas preparadas de acuerdo con el método de la invención típicamente pueden administrarse con fines terapéuticos en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5,0 gl de gas por kg de paciente, dependiendo, por ejemplo, de su composición respectiva, el tipo de sujeto en tratamiento, el tejido u órgano a tratar y/o el método terapéutico aplicado.

En una realización, dicho método de tratamiento terapéutico por ultrasonidos comprende:

(i) administrar a un paciente una suspensión de microvesículas llenas de gas obtenida por reconstitución de un producto liofilizado obtenido de acuerdo con el proceso de la invención;

(ii) identificar una región de interés en dicho paciente a someter a un tratamiento terapéutico, comprendiendo dicha región de interés dicha suspensión de microvesículas llenas de gas; y

(iii) aplicar un haz de ultrasonidos para tratar terapéuticamente dicha región de interés;

por lo que dicho tratamiento terapéutico por ultrasonidos se potencia mediante la presencia de dicha suspensión de microvesículas llenas de gas en dicha región de interés.

En una realización, dicha suspensión de microvesículas llenas de gas comprende DSPC, DPPE-PEG5000, ácido palmítico, opcionalmente un lipopéptido de dirección y PEG4000.

La reconstitución del producto liofilizado se hace preferiblemente al dispersarlo en un vehículo acuoso fisiológicamente aceptable, por ejemplo, solución salina, en presencia de un gas fisiológicamente aceptable, por ejemplo, una mezcla<de C>4<F>10<y nitrógeno, en agitación suave.>

Dicha suspensión de microvesículas tiene preferiblemente un valor de Pc50 de al menos 84 kPa, más preferiblemente<al menos>88<kPa e incluso más preferiblemente de al menos 90 kPa, hasta aproximadamente, por ejemplo, 105 kPa.>

La suspensión de microvesículas llenas de gas preparada de acuerdo con el método de la invención puede usarse ventajosamente en un método para separar células, típicamente por capacidad de flotación (también conocido como clasificación celular activada por flotación, "BACS"). El método puede ser útil para separar un tipo deseado de células de otras células en un líquido fisiológico (por ejemplo, sangre o plasma). En una realización, el método de separación comprende marcar una célula deseada a separar con un anticuerpo marcado adecuado que puede unirse a un receptor específico (y selectivo) en dicha célula. Las microvesículas entonces se añaden a la suspensión de células a separar (incluyendo las que albergan el anticuerpo marcado); una vez mezcladas en la suspensión de células, las microvesículas se asocian a través del ligando con el residuo de marcaje unido a la construcción de anticuerpo/célula permitiendo, por tanto, la separación de las células por capacidad de flotación (véase, por ejemplo, el documento WO 2017/117349). Por ejemplo, el anticuerpo marcado es un anticuerpo biotinilado, donde el residuo de biotina puede asociarse con un resto respectivo, tal como, por ejemplo, un residuo de avidina, neutravidina o estreptavidina en microvesículas llenas de gas. La resistencia mejorada a la presión permite usar las microvesículas preparadas de acuerdo con el método de la invención en una amplia diversidad de métodos para separar células.

Los siguientes ejemplos ayudarán a ilustrar más la invención.

Ejemplos

Materiales

DSPC: 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DPPG-Na: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio)

DPPE-PEG5000: 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000] (sal de amonio)

PEG4000= polietilenglicol (PM = 4000 g/mol)

Medición de la resistencia a la presión (Pc50)

La resistencia de las microvesículas llenas de gas a la presión se evaluó usando un nefelómetro de presión desarrollado propio. En resumen, la suspensión de microvesículas se introdujo en una cubeta de muestra del espectrofotómetro (estanca al aire y conectada a un sistema de presurización). La densidad óptica (absorbancia a 700 nm) de la suspensión se registra de forma continua mientras se aumenta linealmente la presión aplicada a la muestra en la cubeta desde presión atmosférica (760 mmHg, 101,3 kPa) hasta una sobrepresión de dos bar (2280 mmHg, 303,9 kPa), a una tasa de aproximadamente 4 mmHg/s (533 Pa/s).

El parámetro Pc50 ("presión crítica") que caracteriza cada suspensión identifica la sobrepresión (con respecto a la presión atmosférica) a la que la absorbancia de la suspensión de microvesículas cae hasta la mitad de su valor inicial.

Ejemplo 1

Preparación de producto liofilizado (lotes la-lb)

El procedimiento ilustrado en los ejemplos de trabajo del documento WO 94/09829 se usó para preparar dos lotes<diferentes (>1<a->1<b), de los que cada uno consiste en varios viales que contienen el producto liofilizado.>

En resumen, en primer lugar se disolvieron DSPC, DPPG-Na y ácido palmítico en una relación ponderal de 4,75/4,75/1 en hexano/etanol (8/2, v/v) a una concentración de aproximadamente 5 g/l y los disolventes se evaporaron al vacío. El residuo sólido se mezcló con PEG4000 en una relación ponderal de aproximadamente 0,017: 1, la mezcla se disolvió<en ferc-butanol a aproximadamente 60 °C y la solución transparente se usó para llenar viales DIN>8<R respectivos (con>un volumen correspondiente que contenía aproximadamente 25 mg de la mezcla). Los viales entonces se enfriaron rápidamente a -45 °C y después se sometieron a vacío para retirar el disolvente congelado por sublimación. La temperatura entonces se elevó (por encima de la temperatura ambiente, no mayor de 35 °C) y el disolvente restante se evaporó, hasta una cantidad final de menos de un 0,5 % en peso. Al final del proceso de liofilización, el ambiente<del liofilizador se saturó con SF>6<a presión atmosférica y los viales (que contenían el producto liofilizado sólido en contacto con SF>6<) se taparon y sellaron.>

Los dos lotes se usaron para los posteriores experimentos de tratamiento por calor.

Ejemplo 2

Preparación de producto liofilizado (2a-2h)

El procedimiento ilustrado en los ejemplos de trabajo del documento WO2004/069284 se usó para preparar ocho lotes<diferentes (>2<a->2<h), de los que cada uno consiste en varios viales que contienen el producto liofilizado.>

En resumen, se prepara una emulsión de ciclooctano y agua (aproximadamente 1,5/100 v/v) que contenía aproximadamente 90 mg/l de DSPC, 7 mg/l de ácido palmítico, 60 mg/l de DPPE-PEG5000 y 100 g/l de PEG4000<(Megatron MT3000, Kinematica; 10 000 rpm) y se muestreó en viales DIN>8<R (aproximadamente 1 ml/vial).>

Los viales se enfriaron a -50 °C al vacío y después se sometieron a liofilización, seguido de secado secundario por encima de la temperatura ambiente hasta la retirada completa del agua y el disolvente (menos de un 0,5 % en peso), como se describe en el ejemplo 1. Al final del proceso de liofilización, el espacio superior de los viales se satura con una mezcla 35/65 de C<4>F<10>/N<2>y los viales se tapan y sellan.

Los diferentes lotes (1a a 1h) se usaron para los posteriores experimentos de tratamiento por calor.

Ejemplo 3

Efecto del tratamiento por calor sobre lotes fabricados de acuerdo con el ejemplo 1

Los viales de los diversos lotes preparados de acuerdo con el ejemplo 1 se sometieron a diferentes tratamientos por calor y se observó el efecto sobre las características de las suspensión reconstituidas de microvesículas llenas de gas.

Experimento 3.1

<Los viales de lote 1a se sometieron a una temperatura de calentamiento de 48 °C durante un tiempo que varió de>8 horas a una semana (cinco viales para cada grupo). El producto en el vial entonces se reconstituyó con 5 ml de solución salina y se midieron las características de las microvesículas en la suspensión. Los resultados se presentan<en la siguiente tabla>1<.>

Tabla 1:Lote 1a

Como se puede deducir de los resultados anteriores, puede observarse un aumento sustancial en la resistencia a la<presión después de>8<horas de tratamiento por calor, con respecto a las muestras liofilizadas sin tratar. Dicha>resistencia a la presión aumenta ligeramente en el tiempo, hasta un máximo después de una semana de tratamiento. Sin embargo, como observa el solicitante, un tiempo de calentamiento demasiado largo (por ejemplo, después de 24 horas y particularmente por encima de 48 horas) puede influir negativamente en otras características de las microvesículas llenas de gas, tal como su número total, el volumen total de gas y/o su tamaño medio.

Experimento 3.2

En un segundo experimento, los viales de lote 1b se calentaron a temperaturas de 40 °C, 45 °C y 49 °C durante periodos de tiempo de 12, 16 o 20 horas (tres viales para cada grupo, para un total de 27 viales). El producto en el vial entonces se reconstituyó con 5 ml de solución salina y se midieron las características de las microvesículas en la suspensión. Los resultados se presentan en la siguiente tabla 2.

Tabla 2: Lote 1b

Como se puede deducir de los datos anteriores, se obtiene un aumento sustancial en la resistencia a la presión con el tratamiento por calor de los productos liofilizados (con respecto al valor inicial de aproximadamente 14 kPa). Aunque en general puede observarse un mayor aumento de Pc50 para tratamientos a 49 °C, el tratamiento a esta temperatura, sin embargo, puede influir negativamente sobre otras características de las microvesículas llenas de gas reconstituidas, particularmente sobre los valores de tamaño medio.

Ejemplo 4

Efecto del tratamiento por calor sobre lotes fabricados de acuerdo con el ejemplo 2

Los viales de los diversos lotes (2a-2h) preparados de acuerdo con el ejemplo 2 se sometieron a diferentes tratamientos por calor y se observó el efecto sobre las características de las suspensión reconstituidas de microvesículas llenas de gas.

Experimento 41

Los viales de lote 2a se sometieron a una temperatura de calentamiento de 40 °C o 45 °C durante 16 horas o no se calentaron. El producto en el vial entonces se reconstituyó con 5 ml de solución salina y se midieron las características de las microvesículas en la suspensión. Los resultados se presentan en la siguiente tabla 3.

Tabla 3:Lote 1a

Como se puede deducir de los datos anteriores, se obtiene un aumento sustancial en la resistencia a la presión tras<tratamiento por calor también para lotes fabricados de acuerdo con el procedimiento del ejemplo>2<.>

Experimento 4.2

Los viales de lote 2b se sometieron a una temperatura de calentamiento de 40 °C durante un tiempo que varió de 16<a>88<horas, o no se calentaron. El producto en el vial entonces se reconstituyó con 5 ml de solución salina y se midieron>las características de las microvesículas en la suspensión. Los resultados se presentan en la siguiente tabla 4.Tabla 4:Lote 2b

Como se puede deducir de los datos anteriores, se obtiene un aumento sustancial en la resistencia a la presión tras tratamiento por calor a 40 °C. En general una duración del tratamiento de 16 h se considera suficiente, también para evitar posibles efectos negativos provocados por tratamientos térmicos más largos sobre otras características de las microvesículas (por ejemplo, aumento de las microvesículas de tamaño grande en la suspensión reconstituida).Experimento 4.3

Los viales de lotes 2c-2 g se sometieron a una temperatura de calentamiento de 40 °C durante un periodo de 16 horas, o no se calentaron. El producto en el vial entonces se reconstituyó con 5 ml de solución salina y se midieron las características de las microvesículas en la suspensión. Los resultados se presentan en la siguiente tabla 5.

Tabla 5:Lotes 2c-2 40 °C, 16 h

Como se puede deducir de la tabla anterior, para las suspensiones de microvesículas reconstituidas de los diversos lotes, se obtiene un aumento en la resistencia a la presión de más de 15 kPa o más y hasta aproximadamente 25 kPa después de tratamiento por calor de los productos liofilizados.

Experimento 4.4

Los viales de lote 2h se sometieron a una tratamiento por calor a 38 °C durante un tiempo que varió de dos a 24 horas. El producto en el vial entonces se reconstituyó con 5 ml de solución salina y se midieron las características de las<microvesículas en la suspensión. Los resultados se presentan en la siguiente tabla>6<.>

Tabla 6: Lote 2h

Como se puede deducir de la tabla anterior, se obtiene una resistencia de las microvesículas a la presión creciente en<la suspensión reconstituida tras calentamiento del material liofilizado durante un tiempo creciente, hasta>8-12<horas a>38 °C. Más calentamiento del material (16 o 24 horas) no aumenta sustancialmente más la resistencia a la presión.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de fabricación de una composición liofilizada adecuada para la preparación de una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas, comprendiendo dicha composición: (i) un material anfífilo que comprende un fosfolípido y un ácido graso; y (ii) un polietilenglicol como componente protector liofilizante; que comprende: a. preparar una mezcla líquida que comprende dicho material anfífilo y dicho componente protector liofilizante en un disolvente;

b. liofilizar la mezcla líquida para retirar dicho disolvente y obtener un producto liofilizado; y

c. después de completarse la liofilización de la etapa b, calentar dicho producto liofilizado a presión ambiental a una temperatura mayor de 35 °C, durante un periodo de tiempo de ocho a veinte horas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha mezcla líquida comprende dicho material anfífilo y dicho componente protector liofilizante dispersados en un disolvente orgánico.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha mezcla líquida comprende dicho material anfífilo y dicho componente protector liofilizante dispersados en una emulsión acuosa de un disolvente inmiscible en agua y agua.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha etapa de calentamiento se realiza a una temperatura de 38 °C o mayor.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha etapa de calentamiento se realiza a una temperatura de 40 °C o mayor.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fosfolípido comprende dilauroil-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2 diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1 -miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1 -palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina (PMPC), 1 -palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1 -estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1 -palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1 -oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol<( D L p G )>y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidil-glicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido diestearoil fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoil fosfatidil-etanolamina (DSPE), dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoilesfingomielina (DPSP), y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidilinositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoilfosfatidilinositol (DOPI).

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido graso comprende ácido cáprico (n-decanoico), láurico (n-dodecanoico), mirístico (n-tetradecanoico), palmítico (n-hexadecanoico), esteárico (n-octadecanoico), araquídico (n-eicosanoico), behénico (n-docosanoico) o n-tetracosanoico.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho material anfífilo comprende DSPC, DPPG y ácido palmítico.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho material anfífilo comprende DSPC, DPPE-PEG5000 y ácido palmítico.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha etapa de calentamiento se realiza a una temperatura de 40 °C a 48 °C.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha etapa de calentamiento se realiza a una temperatura de 36 °C a 45 °C.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho calentamiento en la etapa c se realiza durante al menos doce horas.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha mezcla líquida se muestrea en viales de vidrio que se cargan en un liofilizador.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende, al completarse la etapa b, saturar el espacio superior de los viales que contienen el producto liofilizado con un gas fisiológicamente aceptable y después tapar y sellar los viales.

15. Un método de fabricación de una suspensión de microvesículas llenas de gas, que comprende obtener un producto liofilizado de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y reconstituir dicho producto liofilizado con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable en presencia de un gas fisiológicamente aceptable en agitación suave.