JP7357078B2 - ガス充填微小胞 - Google Patents
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Description
本発明は、ガス充填微小胞の新規の製剤に関し、それらを調製する方法およびそのような微小胞の使用に関する。
近年における造影剤の迅速な進歩によって、ヒトまたは動物の身体の臓器および組織のコントラスト増強イメージングならびにそれらの治療的処置において有用な複数の異なる組成物および製剤が生産されている。
コントラスト増強超音波イメージング（「ＣＥＵＳ」イメージング）に特に有用である造影剤の１つのクラスには、水性媒体中に分散されたナノおよび／またはマイクロメートルのサイズの気泡の懸濁液が含まれる。ガスは典型的に、例えば乳化剤、油類、増粘剤または糖類を含むフィルム層内にトラップまたは封入される。これらの安定化された気泡（適切な生理学的溶液中に分散される）は一般に当該分野において、典型的にはその調製に用いられる安定化材料によって様々な専門用語で呼ばれ；これらの用語は、例えば、「マイクロスフェア」、「微小気泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」を含み、ここでは包括的に「ガス充填微小胞」（または「微小胞」）と呼ぶ。
超音波造影剤（「ＵＳＣＡ」）は、様々な製造方法によって生産することができる。これらの方法の１つは（例えばＷＯ９４／０９８２９を参照）、両親媒性材料（例えばリン脂質および／または脂肪酸）および凍結乾燥保護化合物（例えばポリエチレングリコール）の、有機溶媒中への溶解を必然的に伴い；得られた混合物はそれから、典型的にバイアル内に充填された後に凍結乾燥に曝されて溶媒が除去されて、凍結乾燥産物が取得される。別の方法は（例えばＷＯ２００４／０６９２８４を参照）、水非混和性有機溶媒と水のマイクロエマルションの調製を必然的に伴い、前記エマルションは、両親媒性材料および凍結乾燥保護化合物を含んでいる。それから、エマルションを（バイアル中への分配の際に）凍結乾燥ステップに曝して、水および溶媒を除去する。
それから、底部に粉末形態の凍結乾燥固形産物を含んでいるバイアルのヘッドスペースに適切なガス（例えばフッ素化ガス）を充填し、最終的に保管のため密封する。使用前に、適切な液体（例えば食塩水）をバイアル中に導入してバイアルを穏やかに振って凍結乾燥産物を溶かすことによって、微小気泡の水性懸濁液が簡単に調製される。
上記方法に従って製造することのできる市販されるＵＳＣＡは、ＢｒａｃｃｏによるＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）（または米国ではＬｕｍａｓｏｎ（登録商標））である。
出願人はここで、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリンとも呼ばれる）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ＰＥＧ５０００（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ５００とも呼ばれる）およびパルミチン酸の、有利な相対モル比での組み合わせを含む、安定したガス充填微小胞の調製に特に適切な新規の製剤を見いだした。その製剤は、超音波を用いた治療的適用での使用に特に有用である。
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１），「ＢＲ３８，ａ Ｎｅｗ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｐｏｏｌ Ａｇｅｎｔ．」Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６，Ｎｕｍｂｅｒ ８，４８６－４９４には、イメージング超音波造影剤として使用するための、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００およびパルミチン酸を含んでいる凍結乾燥組成物の再構成によって得られるリン脂質安定化微小気泡の懸濁液が開示されている。
本発明は、脂質成分（ａ）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、（ｂ）５０００ｇ／ｍｏｌのＭｗを有するポリエチレングリコールとコンジュゲートされた１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００）および（ｃ）パルミチン酸の、混合物を含んでいるガス充填微小胞に関し、ここで前記脂質成分は、それぞれの相対モル比（ａ／ｂ／ｃ）が、６５～８５／４～１０／１２～２２である。好ましくは、モル比は７０～８０／５～９／１５～２１であり、より好ましくは約７２～７６／６～８／１６～２０であり、特に好ましいそれぞれのモル比は、７４（＋／－１）／７．５（＋／－０．５）／１８．５（＋／－１）である。
別の態様は、凍結乾燥保護化合物、好ましくはＰＥＧ４０００との混合で、上記脂質成分を上記それぞれのモル比で含んでいる凍結乾燥製剤の形態での、そのようなガス充填微小胞の前駆体に関する。凍結乾燥保護化合物の量に対する３つの脂質成分の合計量は、重量で０．０８％～０．７５％、好ましくは０．１０％～０．５０％、より好ましくは０．１２％～０．４５％の任意の範囲内であってよい。
一実施態様では、３つの脂質成分の混合物は、凍結乾燥保護化合物の合計量に対して重量で０．０８％～０．３％の量、より好ましくは重量で約０．１０％～０．２０％、さらにより好ましくは重量で０．１２％～０．１８％であり、凍結乾燥保護化合物に対して約０．１６％（ｗ／ｗ）の量が特に好ましい。
別の実施態様では、３つの脂質成分の前記混合物は、凍結乾燥保護化合物の合計量に対して重量で０．３％超～０．５％、好ましくは０．３５％～０．４５％、より好ましくは重量で０．３８％～０．４０％の量である。
別の態様は、生理的に許容できるガス、好ましくはパーフルオロブタン（Ｃ４Ｆ１０）と、より好ましくは窒素との混合（例えば３５／６５ ｖ／ｖ）で、接触している前記凍結乾燥製剤を含む密封されたバイアルに関する。
本明細書において用いられる用語「ＤＳＰＣ」は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（「ジステアロイルホスファチジルコリン」とも呼ばれる）を指し、用語ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００は、５０００ｇ／ｍｏｌのＭｗを有するポリエチレングリコールとコンジュゲートされた１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（「ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン」とも呼ばれる）を指し、より具体的には、メトキシ基末端ＰＥＧ誘導体Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール５０００）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンまたは１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００）を指す。
出願人は、予期せずに、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよびパルミチン酸を含む組成物の脂質成分のそれぞれのモル比を適切に調整することによって、耐圧性の観点でとりわけ改善された特性を有するガス充填微小胞を調製することが可能であることを見いだした。
実施例において詳細に説明されるように、出願人は特に、少なくとも８％、好ましくは少なくとも１２％、より好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは１６％よりも高いが、２２％よりも高くない、好ましくは２１％よりも高くない、より好ましくは２０％よりも高くない、さらにより好ましくは２０％未満のパルミチン酸のモル量（他の２つの成分に対して）を含む組成物を有するガス充填微小胞に、特性の改善（より高い耐圧性を含む）が与えられることを見いだした。特に好ましい実施態様では、前記量は、１８．５％（＋／－１）、より好ましくは１８．５％（＋／－０．５）である。
さらに、また実施例において詳細に説明されるように、出願人は、製剤内に取り込まれる増加する量のＤＰＰＥ－ＰＥＧによって、改善された特性、例えば、サイズ分布を有する微小胞（特に、ＤＶ５０値およびＤＮ値の減少によって特徴付けられる）、および、より少ない量の大きな微小胞（８μｍよりも大きなサイズを有する気泡の数として表される）を得ることが可能になることを観察した。他方で、出願人は、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００のモル量が８％よりも高いと、形成される微小胞の安定化層内にしばしば効果的に取り込まれないことも観察した。さらに、出願人が観察したように、過剰量のＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００を含む製剤は、増加する量の大きな微小胞を有する微小胞を生じさせ得る。したがって、出願人は、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００の相対モル量（他の２つの成分に対して）が、少なくとも４％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも６％、さらにより好ましくは６％よりも高いが、１０％よりも高くない、好ましくは９％よりも高くない、より好ましくは８％よりも高くない、さらにより好ましくは８％未満であるべきであることを決定した。特に好ましい一実施態様では、前記量は、７．４％（＋／－０．５）、より好ましくは７．４％（＋／－０．４）である。
ＤＳＰＣについては、出願人は、他の２つの成分に対するその相対モル量は、上記に説明した相対比も考慮して、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７２％、さらにより好ましくは７２％よりも高いが、８５％よりも高くない、好ましくは８０％よりも高くない、より好ましくは７６％よりも高くない、さらにより好ましくは７６％未満であるべきであることを見いだした。特に好ましい一実施態様では、前記量は、７４％（＋／－１）、より好ましくは７４％（＋／－０．８）である。
本発明の好ましい実施態様は、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸を６５～８５／４～１０／８～２２のそれぞれのモル量で含んでいる組成物である（相対％モル量として表され、合計は１００％である）。好ましくは、モル量は、７０～８０／５～８／１２～２１であり、より好ましくは、約７２～７６／６～９／１５～２０であり、７４（＋／－１）／７．５（＋／－０．５）／１８．５（＋／－１）のモル比が特に好ましい。
上記製剤は、本明細書中に説明される凍結乾燥プロセスに従って、凍結乾燥産物として一般に調製される。凍結乾燥産物は、適切な凍結乾燥保護化合物、好ましくはＰＥＧ４０００を含む。出願人が観察したように、３つの脂質成分に対する凍結乾燥保護化合物（特にＰＥＧ４０００）の量は、相対的に高くあるべきである。特に、凍結乾燥保護化合物の量に対する３つの脂質成分の合計量は、重量で０．０８％～０．７５％、好ましくは０．１０％～０．５０％、より好ましくは０．１２％～０．４５％に変化し得る。出願人が観察したように、この相対的に高い量の凍結乾燥保護化合物は、特にＷＯ２００４／０６９２８４に開示される製造方法に従って調製した場合に、成分の凍結乾燥質量における、製剤の成分の適切に均質な分散を可能にする。
一実施態様によれば、製剤の３つの脂質成分の合計重量は、凍結乾燥保護化合物の合計量に対して、重量で０．０８％～０．３％、好ましくは重量で約０．１０％～０．２０％、より好ましくは重量で０．１２％～０．１８％、さらにより好ましくは約０．１６％である。
別の実施態様によれば、製剤の３つの脂質成分の合計重量は、凍結乾燥保護化合物の合計量に対して、重量で０．３０％超～０．５０％、好ましくは０．３５％～０．４５％、より好ましくは０．３８％～０．４０％である。
出願人が観察したように、この後者の実施態様は、より高い量の微小胞が投与されることが望ましくあり得る特定の治療的適用に有用であり得るガス充填微小胞の高濃度懸濁液を調製するのに特に有用である。実際のところ、より高い量の注入微小胞は、特定の懸濁液の投与容量を増大することによって達成され得るが、それにもかかわらず、より高濃度の微小胞を含んでいる相対的に減少した容量の懸濁液を投与することがより賢明であり得る。原理的に、懸濁液中のより高い量のガス充填微小胞は、再構成される凍結乾燥製剤中の脂質の相対量を増大することによって達成することができる。また、凍結乾燥産物を再構成するための液体の容量を一定に保つことにより、そのようなより高い量の脂質は、再構成された懸濁液において、より高濃度の微小胞を生じさせる。しかしながら、出願人が観察したように、（再構成される凍結乾燥産物中の）脂質成分の量を単純に増加させることは、最終の再構成された懸濁液において、それ相応により多い数の微小胞を必ずしも生じさせ得ない。実際のところ、出願人は、製剤中の脂質成分の量に対する微小胞の数の最適量は、凍結乾燥化合物の量に対する、そのような脂質の量のバランスを適切にとることによって得ることができることを観察した。したがって、特に有利な結果は、製剤の３つの脂質成分の合計重量が、凍結乾燥保護化合物の合計量に対して重量で０．３０％超～０．５０％、好ましくは０．３５％～０．４５％、より好ましくは０．３８％～０．４０％である場合に得ることができる。特定の一実施態様によれば、製剤の３つの脂質成分の合計重量は、１０００μｇ～１３００μｇ、好ましくは１０５０μｇ～１２５０μｇ、より好ましくは１１００μｇ～１２００μｇに変化することができ、凍結乾燥保護化合物（ＰＥＧ４０００）の合計重量は、２２５ｍｇ～３７５ｍｇ、好ましくは２５０～３５０ｍｇ、さらにより好ましくは２７５ｍｇ～３２５ｍｇに変化することができる。
本明細書において用いられる、ＤＮは、微小胞の母集団の数平均直径であり、ＤＶ５０は、微小胞の前記母集団の体積メジアン直径であり、母集団内に含まれる全ガスの半分がＤＶ５０未満の直径を有する微小胞内に存在することを示す。比ＤＶ５０／ＤＮは、母集団の多分散性について一般的な示度を提供し：典型的に、ＤＶ５０／ＤＮ比が低いほど、サイズ分布はより狭くなる。上記のＤＶ５０、ＤＮの値（ならびに、微小胞の合計数または８μｍよりも大きな微小胞の数のような他のパラメーター）は、コールターカウンター（例えば、０．７～２０μｍの測定範囲を有する、３０μｍアパチャーが付いた、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３器具）を用いた測定によって得ることができる。
凍結乾燥保護化合物
本明細書において定義される凍結乾燥保護化合物は、凍結保護（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）および／または溶解保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有する化合物である。適切な凍結乾燥保護化合物は、例えば、炭水化物、例えば、単糖類、二糖類、または多糖類、例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトース、ガラクトース、ラフィノース、シクロデキストリン、デキストラン、キトサンおよびその誘導体（例えばカルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサン）；ポリオール類、例えば糖アルコール類、例えば、ソルビトール、マンニトールまたはキシリトール；または親水性ポリマー、例えばポリオキシアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００またはＰＥＧ８０００）またはポリプロピレングリコールを含む。一実施態様によれば、前記凍結乾燥保護化合物は、ポリエチレングリコール、好ましくはＰＥＧ４０００である。本明細書において用いられるＰＥＧ４０００は、当該分野におけるその通常の意味を有し、約４０００ｇ／モルの分子量を有するポリエチレングリコールを指し、一般に、前記値付近の＋／－１０％の変動を有する。
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ガス充填微小胞の調製
ガス充填微小胞の懸濁液を調製するのに適切な方法は、適切な生理的に許容できるガスの存在下で、（例えば液体－ガス界面で安定化層を形成することによって）前記微小胞を安定化することが可能な脂質成分を含む凍結乾燥産物の、水性担体を用いた再構成を含む。
ガス充填微小胞の懸濁液を調製するのに適切な方法は、適切な生理的に許容できるガスの存在下で、（例えば液体－ガス界面で安定化層を形成することによって）前記微小胞を安定化することが可能な脂質成分を含む凍結乾燥産物の、水性担体を用いた再構成を含む。
凍結乾燥産物は、前記脂質成分および凍結乾燥保護化合物を含む液体混合物を適切な溶媒において凍結乾燥させることによって典型的に得られる。
凍結乾燥プロセスを受ける液体混合物は、当該分野において公知の方法（例えばＷＯ２００４／０６９２８４に開示される）に従って得ることができる。
ＷＯ２００４／０６９２８４に開示されるプロセスに従って、脂質成分を含む組成物を、水非混和性有機溶媒と水のエマルション中に、撹拌下で、好ましくは凍結乾燥保護化合物との混合で、分散させてよい。好ましくは、ＤＳＰＣおよびパルミチン酸を含む有機溶液を最初に調製して、それから、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００および凍結乾燥保護化合物を含む水溶液と一緒に乳化される。
適切な水非混和性有機溶媒としては、例えば、分岐または直鎖のアルカン類、アルケン類、シクロアルカン類（例えばシクロオクタン）、芳香族炭化水素、アルキルエーテル類、ケトン類、ハロゲン化炭化水素、ペルフルオロ化炭化水素またはそれらの混合物が含まれる。
エマルションは、水性媒体および溶媒を、脂質成分および凍結乾燥保護化合物の存在下で、例えば、超音波処理、振とう、高圧均質化、微小混合、膜乳化、高速撹拌または高剪断混合のような当技術分野で知られている任意の適切なエマルション生成技術に曝すことによって得てよい。凍結乾燥保護化合物は、エマルションの形成の前または後のいずれかに、例えば、かかる凍結乾燥保護化合物を含む水溶液として添加することができる。そのようにして得られたマイクロエマルションは、脂質成分によって囲まれて安定化された溶媒の微小滴を含み、それをそれから、従来の技術に従って凍結乾燥させて凍結乾燥材料を取得し、それを、ガス充填微小胞の懸濁液を調製するために用いることができる。
凍結乾燥プロセスについて、脂質成分と凍結乾燥保護化合物とを含むエマルション（例えば、以前に説明した製造プロセスに従って得られる）を、典型的に、ガラスバイアル（例えば、様々な寸法のＤＩＮ／ＩＳＯ８３６２クリンプバイアル）中にサンプリングして、それを凍結乾燥器中に入れる。しかしながら、出願人が観察したように、凍結乾燥されるべき過剰な容量のマイクロエマルションをバイアル内に誘導することは、凍結乾燥プロセス中にバイアルにひび割れを生じさせ得る。したがって、例えば、ＤＩＮ ８Ｒバイアル（およそ１１．５ｍＬの容量）は、好ましくは、２ｍＬ未満の容量のマイクロエマルション、好ましくは１．５ｍＬを超えない容量で満たさなければならない。そのような相対的に少ない容量は、バイアル内に導入することのできる脂質成分の合計量を必然的に制限し、その結果、凍結乾燥産物の再構成の際に得ることのできるガス充填微小胞の数が制限されることとなる。したがって、より多い量の微小胞が単一バイアル内に必要である場合、より大きなキャパシティを有するバイアルを用いるべきである。例えば、ＤＩＮ２０Ｒバイアル（約２５ｍＬのキャパシティを有する）は、凍結乾燥プロセス中にひび割れずに、４ｍＬまでのマイクロエマルション（好ましくは３ｍＬを超えない）で満たされ得る。
凍結乾燥プロセスは一般に、バイアルが急速に深冷されて（ｄｅｅｐ－ｃｏｏｌｅｄ）（例えば－３５℃～－７０℃の温度）、混合物の液体（単数または複数）が凍結され、それから真空（例えば０．１～０．８ｍｂａｒ）に曝される、最初のステップ（一次乾燥）を含み；一次乾燥中に、凍結した液体（単数または複数）（例えば水および／または溶媒）の実質的な全体が、昇華によって、典型的に液体の全量の約９５％まで、好ましくは約９９％までが除去される。一次乾燥後、残留液体（あり得る間隙水を含む）を、典型的に室温よりも高い温度にて真空下で（好ましくは一次乾燥中に適用されたのと同じ真空を維持することによって）行われる二次乾燥中にさらに除去することができる。二次乾燥中の温度は、好ましくは３５℃よりも高くない。二次乾燥は、液体（単数または複数）の残留含有量が、所望の最小値、例えば、残留凍結乾燥産物の総質量に対する水の重量で３％未満（ｌｅｓｓ ３％）（好ましくは１％未満）、または、例えば、残留溶媒（単数または複数）に関して０．０１重量％未満、好ましくは０．０８％未満に到達したときに止めることができる。
凍結乾燥ステップの完了（すなわち加熱ストップおよび真空除去）の後、凍結乾燥産物は、さらなる熱処理ステップを受けることができる。好ましくは、熱処理は、凍結乾燥産物を含んでいるバイアルのヘッドスペースを適切な生理的に許容できるガスで飽和させて、それから栓をして（例えばブチルゴムのようなゴムのストッパーを用いる）、バイアルを密封した後に（例えば、アルミニウムのような金属のクリンプシールを用いる）、密封されたバイアル上で行われる。この場合、バイアルは好ましくは凍結乾燥器から取り出されて、熱処理のために適切なオーブン内に導入される。あるいは、かかる熱処理は、オープンバイアル（好ましくは凍結乾燥器の中に維持される）上で行なうことができ、それから、ガスで飽和させてから、栓／密封される。
適切な生理的に許容できるガスの例は、例えば、ＳＦ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０のようなフッ素化ガスを含み、空気または窒素との混合であってもよい。
好ましくはＣ４Ｆ１０、または、窒素とＣ４Ｆ１０の混合物を、上記に定義したＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００およびパルミチン酸を含む脂質混合物と組み合わせて用いる。
本出願人が観察したように、凍結乾燥産物の上記のさらなる加熱処理によって、凍結乾燥産物の再構成の際に得られるガス充填微小胞の懸濁液の特性が、驚くべきことに、かかる加熱処理を受けない凍結乾燥産物から得られる懸濁液よりも改善される。
出願人は特に、そのような処理によって、得られる微小胞の耐圧が増大されることを観察した。
凍結乾燥産物は、好ましくは３５℃よりも高い温度（例えば３６℃）、より好ましくは３８℃以上の温度で加熱される。加熱処理の最高温度は一般に、凍結乾燥産物内に含まれる材料に依存する。例えば、かかる温度は、凍結乾燥添加剤として用いられる材料の融点よりも低く、それは、凍結乾燥産物の質量の大部分を形成する成分である（典型的に、微小胞の安定化層を形成する活性成分の重量の５０倍から６００倍を超えるまで）。例えば、ＰＥＧ４０００は、５３～５８℃の融解温度を有する。一実施態様によれば、加熱温度は、好ましくは５０℃以下である。加熱処理に好ましい温度は、３８℃～４５℃である。
加熱処理の持続時間は一般に、処理の温度に依存し；典型的に、温度が高ければ高いほど、加熱の持続時間は短くなる。ガス充填微小胞エンベロープを形成する材料（特にリン脂質）は、過剰な温度に曝される時間が長すぎると分解反応を受け得るので（再構成される微小胞の特性に負の結果を及ぼす可能性がある）、加熱処理の持続時間は不必要に長くしない。約８時間の処理持続時間は十分であり得るが（特に、４５℃よりも高い温度、例えば４８℃と組み合わせて）、加熱処理の持続時間は、好ましくは１２時間、例えば２０時間まで、より好ましくは１４～１８時間行われる。特定の場合にはより長い持続時間が適用され得るが（例えば、４５℃未満、好ましくは４２℃未満の温度と組み合わせて）、出願人は、最終的なガス充填微小胞の特性は、さらに改善されるとしてもほんの僅かである（ｏｎｌｙ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｉｆ ｎｏｔ ａｔ ａｌｌ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ）ことを観察しており；したがって、そのような持続時間の増大は、ほとんどの場合において不必要であり、産業規模での製造経済の観点から一般に不都合である。
熱処理は、凍結乾燥保護化合物と上記に定義した脂質成分の混合物を含む凍結乾燥産物を再構成することによって得られるガス充填微小胞の特性を改善するのに特に効果的であることが証明された。好ましくは、前記凍結乾燥産物は、約３６℃～４５℃、特に約３９℃（＋／－３℃）の温度で、少なくとも８時間、好ましくは約１５時間（＋／－５時間）加熱される。
上述のように、凍結乾燥産物の熱処理は、圧力に対するガス充填微小胞の耐性を増大させる。有利に、圧力に対する耐性が増大した微小胞は一般に、注入された時点で血流における時間持続性の増大を示す。
ガス充填微小胞の耐圧性は、実験パラメーター「Ｐｃ５０」または「臨界圧」を決定することによって評価することができる。
実験部分に詳細に説明するように、ガス充填微小胞の懸濁液のＰｃ５０は、微小胞の懸濁液の吸光度が大気圧で測定される懸濁液の吸光度の半分まで低下するのに適用された過剰圧力（大気圧に対して）の値を特定し、前記の適用された過剰圧力は、微小胞の母集団を、最初の母集団（大気圧）に対して実質的に減少させる。実際のところ、微小胞の懸濁液の吸光度の減少は、ガス充填微小胞の最初の母集団の減少に関連し、したがって、最初は乳白色の懸濁液（高濃度の微小胞）は、圧力増加によって次第に透明になる（微小胞の崩壊に起因する濃度減少）。Ｐｃ５０値が高ければ高いほど、微小胞の耐圧性は高くなる。超音波の診断適用のためには、少なくとも１２ｋＰａ（約９０ｍｍＨｇ）の最小Ｐｃ５０値がガス充填微小胞に関して望ましく、好ましくは少なくとも１３ｋＰａ（約１００ｍｍＨｇ）、より好ましくは少なくとも１４ｋＰａ（１０５ｍｍＨｇ）である。超音波の治療適用のためには一般に、血流におけるより長い持続時間が必要であり、少なくとも５５ｋＰａ（約４１２ｍｍＨｇ）の最小Ｐｃ５０値が望ましく、好ましくは、少なくとも７０ｋＰａ（約５２５ｍｍＨｇ）、より好ましくは少なくとも８０ｋＰａ（約６００ｍｍＨｇ）であるが、より高いＰｃ５０値がさらにより好ましい。
典型的に、凍結乾燥産物の熱処理は、微小胞の再構成された懸濁液のＰｃ５０を、そのような熱処理に曝されていない凍結乾燥産物から得られる再構成された懸濁液のＰｃ５０に対して、少なくとも５ｋＰａ、好ましくは少なくとも８ｋＰａ、より好ましくは少なくとも１０ｋＰａ増大させる。Ｐｃ５０のそのような増大は、１５ｋＰａまでであってよく、一部の実施態様では２５ｋＰａまでである。
特に、本明細書において定義した凍結乾燥産物から再構成され、上記に定義した熱処理に曝された微小胞の懸濁液は、少なくとも７５ｋＰａ、好ましくは少なくとも８０ｋＰａ、より好ましくは少なくとも９０ｋＰａ、例えば１１０ｋＰａまで、好ましくは１０５ｋＰａまでの、Ｐｃ５０値を有する。
ガス充填微小胞の懸濁液
それから、生理的に許容できる（水性）担体を用いて、穏やかに撹拌しながら、凍結乾燥産物を再構成することによって、ガス充填微小胞の懸濁液を調製することができる。適切な生理的に許容できる（水性）担体は、例えば、注射用水、食塩水またはグルコース溶液を含み、賦形剤または添加剤、例えばｐＨ調節剤、浸透圧調整剤、増粘剤を含んでもよい。
それから、生理的に許容できる（水性）担体を用いて、穏やかに撹拌しながら、凍結乾燥産物を再構成することによって、ガス充填微小胞の懸濁液を調製することができる。適切な生理的に許容できる（水性）担体は、例えば、注射用水、食塩水またはグルコース溶液を含み、賦形剤または添加剤、例えばｐＨ調節剤、浸透圧調整剤、増粘剤を含んでもよい。
調剤キット、投与および使用方法
凍結乾燥産物を含むバイアルは、二成分の診断および／または治療キットにおいて、好ましくは注入による投与のために、有利にパッケージングすることができる。キットは、凍結乾燥産物を含んでいるバイアル、および、再構成のための生理的に許容できる水性担体を含んでいる第２のコンテナー（例えばシリンジバレル）を好ましくは備える。一実施態様では、バイアルは、約５０～約１５０ｍｇの凍結乾燥産物を含んでいるＤＩＮ８Ｒガラスバイアル（または同等物）であり；好ましくは、凍結乾燥化合物に対する脂質成分の量は、重量で０．１０％～０．３０％である。別の実施態様では、バイアルは、約２５０～３５０ｍｇの凍結乾燥産物を含んでいるＤＩＮ２０Ｒバイアル（または同等物）であり；好ましくは、凍結乾燥化合物に対する脂質成分の量は、重量で０．３０％超～０．５０％である。再構成のための水性担体の容量は、典型的に約５ｍＬである。特定の治療的適用のために、ＤＩＮ２０Ｒバイアル内の凍結乾燥産物の再構成から得られる懸濁液は、懸濁液の持続投与のために、ある容量（例えば５０ｍＬ）の、生理的に許容できる注入用液体（例えば食塩水）と混合され得る。
凍結乾燥産物を含むバイアルは、二成分の診断および／または治療キットにおいて、好ましくは注入による投与のために、有利にパッケージングすることができる。キットは、凍結乾燥産物を含んでいるバイアル、および、再構成のための生理的に許容できる水性担体を含んでいる第２のコンテナー（例えばシリンジバレル）を好ましくは備える。一実施態様では、バイアルは、約５０～約１５０ｍｇの凍結乾燥産物を含んでいるＤＩＮ８Ｒガラスバイアル（または同等物）であり；好ましくは、凍結乾燥化合物に対する脂質成分の量は、重量で０．１０％～０．３０％である。別の実施態様では、バイアルは、約２５０～３５０ｍｇの凍結乾燥産物を含んでいるＤＩＮ２０Ｒバイアル（または同等物）であり；好ましくは、凍結乾燥化合物に対する脂質成分の量は、重量で０．３０％超～０．５０％である。再構成のための水性担体の容量は、典型的に約５ｍＬである。特定の治療的適用のために、ＤＩＮ２０Ｒバイアル内の凍結乾燥産物の再構成から得られる懸濁液は、懸濁液の持続投与のために、ある容量（例えば５０ｍＬ）の、生理的に許容できる注入用液体（例えば食塩水）と混合され得る。
本発明の微小胞は、特に超音波を含む、様々な診断および／または治療技術において用いられ得る。
治療的技術は、患者の任意の治療方法を含み、それは、超音波およびガス充填微小胞の併用を、それ自体として含み（例えば、超音波によって仲介される血栓溶解、高密度焦点式超音波アブレーション、血液脳関門の透過化、免疫調節、神経調節、放射線増感において）、または、治療剤と組み合わせて含み（すなわち、超音波によって仲介される送達、例えば、選択部位または組織への薬物または生体活性化合物の送達のため、例えば、腫瘍治療、遺伝子療法、感染性疾患の療法、代謝疾患の療法、慢性疾患の療法、変性疾患の療法、炎症性疾患の療法、免疫性または自己免疫性疾患の療法において、または、ワクチンとしての使用において）、したがって、ガス充填微小胞の存在は、例えば、生物学的効果をインビトロおよび／またはインビボで与えるか、または与える要因となることによって、それ自体によって、または様々な物理的方法による特定の活性化の際に（例えば超音波によって仲介される送達を含む）、治療的効果自体を提供し得て、または、適用される超音波の治療的効果を増強することができる。
本発明に係る微小胞は典型的に、例えば、それぞれの組成、治療対象のタイプ、治療される組織または臓器および／または用いられる治療的方法に依存して、患者のｋｇあたり約０．０１～約５．０μＬのガスの濃度で治療的目的のために投与することができる。
一実施態様では、超音波の治療的処置の前記方法は、
（ｉ）本発明のプロセスに従って得られる凍結乾燥産物の再構成によって得られるガス充填微小胞の懸濁液を患者へ投与するステップ；
（ｉｉ）治療的処置に曝される前記患者における関心領域を同定するステップ（前記関心領域は、ガス充填微小胞の前記懸濁液を含んでいる）；および
（ｉｉｉ）前記関心領域を治療的に処置するために超音波ビームを適用するステップ；を含み、
それにより、前記超音波の治療的処置は、前記関心領域におけるガス充填微小胞の前記懸濁液の存在によって増強される。
（ｉ）本発明のプロセスに従って得られる凍結乾燥産物の再構成によって得られるガス充填微小胞の懸濁液を患者へ投与するステップ；
（ｉｉ）治療的処置に曝される前記患者における関心領域を同定するステップ（前記関心領域は、ガス充填微小胞の前記懸濁液を含んでいる）；および
（ｉｉｉ）前記関心領域を治療的に処置するために超音波ビームを適用するステップ；を含み、
それにより、前記超音波の治療的処置は、前記関心領域におけるガス充填微小胞の前記懸濁液の存在によって増強される。
微小胞の前記懸濁液は、好ましくは、少なくとも８４ｋＰａ、より好ましくは少なくとも８８ｋＰａ、さらにより好ましくは少なくとも９０ｋＰａ、例えば約１０５ｋＰａまでのＰｃ５０値を有する。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのを助けるであろう。
材料
ＤＳＰＣ：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ジステアロイルホスファチジルコリン）
ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００：１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）
ＰＥＧ４０００＝ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝４０００ｇ／モル）
ＤＳＰＣ：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ジステアロイルホスファチジルコリン）
ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００：１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（アンモニウム塩）
ＰＥＧ４０００＝ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝４０００ｇ／モル）
耐圧性（Ｐｃ５０）の測定
ガス充填微小胞の圧力に対する耐性を、社内で開発した圧力比濁計を用いて評価した。手短には、微小胞懸濁液を、分光光度計サンプルセル内に導入した（加圧システムに気密接続される）。セル内のサンプルに適用される圧力を大気圧（７６０ｍｍＨｇ、１０１．３ｋＰａ、）から２バールの過剰圧力（２２８０ｍｍＨｇ、３０３，９ｋＰａ）まで、約４ｍｍＨｇ／ｓ（５３３Ｐａ／ｓ）の速度で直線的に増加させながら、懸濁液の光学密度（７００ｎｍでの吸光度）を連続的に記録する。
ガス充填微小胞の圧力に対する耐性を、社内で開発した圧力比濁計を用いて評価した。手短には、微小胞懸濁液を、分光光度計サンプルセル内に導入した（加圧システムに気密接続される）。セル内のサンプルに適用される圧力を大気圧（７６０ｍｍＨｇ、１０１．３ｋＰａ、）から２バールの過剰圧力（２２８０ｍｍＨｇ、３０３，９ｋＰａ）まで、約４ｍｍＨｇ／ｓ（５３３Ｐａ／ｓ）の速度で直線的に増加させながら、懸濁液の光学密度（７００ｎｍでの吸光度）を連続的に記録する。
それぞれの懸濁液を特徴付けるＰｃ５０パラメーター（「臨界圧」、ｋＰａで表される）は、微小胞懸濁液の吸光度がその最初の値の半分まで低下する過剰圧力（大気圧に対して）を特定する。
ガス充填微小胞のパラメーターの決定
サイズ分布パラメーター（Ｄｖ５０およびＤｎ、μｍで表される）、微小胞の数（懸濁液の粒子／ｍＬとして表される）、および、８μｍよりも大きな直径を有する微小胞のパーセンテージ（粒子の合計量に対する粒子のパーセンテージとして表される）を、０．７～２０μｍの測定範囲を有する、３０μｍアパチャーが付いた、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３器具を用いて決定した。５０μＬの微小気泡サンプルを、１００ｍｌの食塩水中に室温で希釈して、測定前に３分間平衡化させた。
サイズ分布パラメーター（Ｄｖ５０およびＤｎ、μｍで表される）、微小胞の数（懸濁液の粒子／ｍＬとして表される）、および、８μｍよりも大きな直径を有する微小胞のパーセンテージ（粒子の合計量に対する粒子のパーセンテージとして表される）を、０．７～２０μｍの測定範囲を有する、３０μｍアパチャーが付いた、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３器具を用いて決定した。５０μＬの微小気泡サンプルを、１００ｍｌの食塩水中に室温で希釈して、測定前に３分間平衡化させた。
［実施例１］
ＤＳＰＣ／パルミチン酸／ＤＰＰＥ－ＰＥＧを含んでいる微小胞の調製
（ａ）２５ｍｇのＤＳＰＣ／パルミチン酸混合物（８０／２０モル比）を、シクロオクタン（４ｍＬ）中に、７０℃で５分間溶解させる。
（ｂ）別個に、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００（１６．７ｍｇ、合計脂質成分のモル量に対して７．４％モル）を、蒸留水（１ｍＬ）中に７０℃で溶解させて、１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ４０００溶液（蒸留水（４９ｍＬ）中）をそれに添加した。
（ｃ）水相および有機相を乳化させた（Ｍｅｇａｔｒｏｎ ＭＴ３０００、１０’０００ｒｐｍ、３．５分）。エマルションを１００ｍＬフラスコ（Ｄｕｒａｎ）内に回収して、それから、８０℃で１時間加熱して、最終的に室温まで冷却した（約１時間）。
（ｄ）それから、エマルションを上記１０％ＰＥＧ４０００溶液で５倍に希釈して（すなわち、２１６ｍＬの１０％ＰＥＧ４０００溶液を５４ｍＬのエマルションに添加した）、ＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（０．７５ｍＬ／バイアル）。
ＤＳＰＣ／パルミチン酸／ＤＰＰＥ－ＰＥＧを含んでいる微小胞の調製
（ａ）２５ｍｇのＤＳＰＣ／パルミチン酸混合物（８０／２０モル比）を、シクロオクタン（４ｍＬ）中に、７０℃で５分間溶解させる。
（ｂ）別個に、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００（１６．７ｍｇ、合計脂質成分のモル量に対して７．４％モル）を、蒸留水（１ｍＬ）中に７０℃で溶解させて、１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ４０００溶液（蒸留水（４９ｍＬ）中）をそれに添加した。
（ｃ）水相および有機相を乳化させた（Ｍｅｇａｔｒｏｎ ＭＴ３０００、１０’０００ｒｐｍ、３．５分）。エマルションを１００ｍＬフラスコ（Ｄｕｒａｎ）内に回収して、それから、８０℃で１時間加熱して、最終的に室温まで冷却した（約１時間）。
（ｄ）それから、エマルションを上記１０％ＰＥＧ４０００溶液で５倍に希釈して（すなわち、２１６ｍＬの１０％ＰＥＧ４０００溶液を５４ｍＬのエマルションに添加した）、ＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（０．７５ｍＬ／バイアル）。
エマルション中の相対的ＤＳＰＣ／パルミチン酸／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００モル比は、約７４／１８．５／７．５であった。ＰＥＧ４０００の合計量に対する３つの成分の合計重量は、約０．１６％である。
バイアルを真空下にて－５０℃で冷却して、それから凍結乾燥に曝し、その後に、実施例１において説明されるように、水および溶媒の完全な除去まで（０．５重量％未満）、室温よりも高い温度で二次乾燥させた。凍結乾燥プロセスの最後に、バイアルのヘッドスペースをＣ４Ｆ１０／Ｎ２の３５／６５混合物で飽和させて、バイアルに封をして密封する。
それから、バイアルを３８℃で１６時間加熱した。
それから、バイアル内の産物を、使用前に穏やかに振とうして食塩水（５ｍＬ／バイアル）中に再分散させた。
［実施例２］
異なる濃度のパルミチン酸の効果
同量のＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００を維持して、ＤＳＰＣに対するパルミチン酸の相対モル量を改変することにより（すなわち、それぞれ、０、１０、２０、４０および６０）、実施例１を繰り返した。これは、最終製剤において、約０％、９．３％、１８．５％、３７．１％および５５．６％のパルミチン酸の相対モル量に相当する。
異なる濃度のパルミチン酸の効果
同量のＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００を維持して、ＤＳＰＣに対するパルミチン酸の相対モル量を改変することにより（すなわち、それぞれ、０、１０、２０、４０および６０）、実施例１を繰り返した。これは、最終製剤において、約０％、９．３％、１８．５％、３７．１％および５５．６％のパルミチン酸の相対モル量に相当する。
結果を以下の表１に報告し、１０～２０のパルミチン酸の量は、特に、耐圧性、微小胞の数およびサイズ分布の観点から、改善された特性を微小胞に与えることを示す。全ての特性を考慮すると、ＤＳＰＣに対して約２０％ｗ／ｒのパルミチン酸のモル量を有する製剤が特に好ましい。
［実施例３］
異なる濃度のＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００の効果
同じ量および比のＤＳＰＣ／パルミチン酸を維持することによって、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００のモル量を変化させることにより（脂質成分の合計モル量に対して、０、１％、３％、７．４％、１２％）、実施例１を繰り返した。
異なる濃度のＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００の効果
同じ量および比のＤＳＰＣ／パルミチン酸を維持することによって、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００のモル量を変化させることにより（脂質成分の合計モル量に対して、０、１％、３％、７．４％、１２％）、実施例１を繰り返した。
結果を表２に説明し、約７．４％のＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００の量が、８ミクロンよりも大きな直径を有する微小胞の数（Ｎｂ Ｍｖ＞８μｍ）が減少し、かつ、より狭い分布の製剤を提供することを示す。
上記製剤（ネイティブの微小胞）を、それから２回の洗浄ステップに供して、微小胞の安定化層を形成しない成分を除去した。図１から推測されるように、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００の量は、７．４％の濃度までは、ネイティブの懸濁液および洗浄した懸濁液において実質的に同様であるが（ＤＰＰＥ－ＰＥＧが、微小胞の安定化層内に所望のモル量で取り込まれることを示す）、より高い濃度では、洗浄した懸濁液におけるＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００の量は、ネイティブの懸濁液における量よりもずっと少ない（安定化層は、７．４％に対して過剰すぎるＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００を取り込むことが実質的にできないことを示す）。この理由から、過剰すぎる、例えば１０％よりも多い量は望ましくなく、９％以下、好ましくは８％以下の量が望ましい。
［実施例４］
異なる量のＰＥＧ４０００の効果
実施例１を繰り返したが、ステップ（ｄ）においてエマルションの５倍希釈に使用するＰＥＧ４０００溶液を、異なる濃度で、すなわち、重量で２％、５％、１０％、１５％および２０％で用い；ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量はしたがって、それぞれ約０．７７％、０．３１％、０．１６％、０．１０％および０．０８％であった。
異なる量のＰＥＧ４０００の効果
実施例１を繰り返したが、ステップ（ｄ）においてエマルションの５倍希釈に使用するＰＥＧ４０００溶液を、異なる濃度で、すなわち、重量で２％、５％、１０％、１５％および２０％で用い；ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量はしたがって、それぞれ約０．７７％、０．３１％、０．１６％、０．１０％および０．０８％であった。
結果を表３に説明し、凍結乾燥前のエマルションの５倍希釈のために重量で２％超または２０％未満の濃度でＰＥＧ４０００の溶液を使用することは（ＰＥＧ４０００の合計量に対する３つの成分の合計重量が０．７７％未満かつ０．０８％超である組成物をもたらす）、特に有利な特性（例えば、相対的に狭いサイズ分布、改善された耐圧性、および、特に、大きなサイズの微小胞の数がより少ない）を有するガス充填微小胞の懸濁液を提供することを示す。
［実施例５］
エマルション希釈の効果
実施例１を繰り返したが、ステップ（ｄ）におけるエマルションの希釈を変更した。最初のバッチでは、エマルションを希釈せずにバイアル中にサンプリングした（この場合、ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．７８％であった）。２番目のバッチでは、エマルションを２倍希釈して（５４ｍＬのエマルション＋５４ｍＬのＰＥＧ４０００ １０％溶液）、それからバイアル中にサンプリングした（この場合、ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．３９％であった）。これらの２つのバッチを、エマルションの５倍希釈による実施例１の製剤と比較した（この場合、ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．１６％であった）。結果を表４に説明する。
エマルション希釈の効果
実施例１を繰り返したが、ステップ（ｄ）におけるエマルションの希釈を変更した。最初のバッチでは、エマルションを希釈せずにバイアル中にサンプリングした（この場合、ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．７８％であった）。２番目のバッチでは、エマルションを２倍希釈して（５４ｍＬのエマルション＋５４ｍＬのＰＥＧ４０００ １０％溶液）、それからバイアル中にサンプリングした（この場合、ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．３９％であった）。これらの２つのバッチを、エマルションの５倍希釈による実施例１の製剤と比較した（この場合、ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．１６％であった）。結果を表４に説明する。
表４のデータから推測されるように、凍結乾燥前の１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ４０００溶液を用いたエマルションの２倍希釈によって得られた製剤（ＰＥＧ４０００の量に対する脂質成分の合計重量は０．３９％である）は、希釈なし（脂質の量は０．７８％）または５倍希釈（脂質の量は０．１６％）の場合の製剤に対して改善された特性を有するガス充填微小胞の懸濁液を提供する。さらに、脂質成分のμｇあたりの微小胞の数は、２倍希釈の製剤に関して９．４８・１０６であったが、希釈なしの製剤については、たった６．６８・１０６であり、５倍希釈の製剤については７．７６・１０６であった；これらの結果は、ＰＥＧ４０００に対する脂質成分の比のバランスを適切にとることによって、決定された量の脂質成分によって形成され得る微小胞の数を最適化することが可能であることを示す。
［実施例６］
試験規模の製剤
実施例１を試験規模で繰り返し（材料の量は実験室規模の実験の約５０倍である）、ステップ（ｄ）を１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ４０００溶液を用いたエマルションの２倍希釈によって行なう点が異なった。
試験規模の製剤
実施例１を試験規模で繰り返し（材料の量は実験室規模の実験の約５０倍である）、ステップ（ｄ）を１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ４０００溶液を用いたエマルションの２倍希釈によって行なう点が異なった。
最終エマルションをＤＩＮ２０Ｒガラスバイアル中にサンプリングして（３ｍＬエマルション／バイアル）、バイアルあたり約３００ｍｇのＰＥＧ４０００の合計量および脂質成分の量は各々約０．３９重量％であった。
凍結乾燥および食塩水中の再構成後、以下の結果が決定された：
微小胞の合計数：１３・１０９
微小胞の数／脂質（μｇ）：１．１２・１０７
Ｄｖ５０（μｍ）：３．７
Ｄｎ（μｍ）：１．４８
Ｎｂ Ｍｖ＞８μｍ（％）：０．０６
微小胞の合計数：１３・１０９
微小胞の数／脂質（μｇ）：１．１２・１０７
Ｄｖ５０（μｍ）：３．７
Ｄｎ（μｍ）：１．４８
Ｎｂ Ｍｖ＞８μｍ（％）：０．０６
［実施例７］
凍結乾燥産物の調製（７ａ～７ｈ）
ＷＯ２００４／０６９２８４の実施例において説明される手順を、８個の異なるバッチ（７ａ～７ｈ）を調製するために用いて、それぞれ、凍結乾燥産物を含んでいる数個のバイアルから構成された。
凍結乾燥産物の調製（７ａ～７ｈ）
ＷＯ２００４／０６９２８４の実施例において説明される手順を、８個の異なるバッチ（７ａ～７ｈ）を調製するために用いて、それぞれ、凍結乾燥産物を含んでいる数個のバイアルから構成された。
手短には、約９０ｍｇ／ＬのＤＳＰＣ、７ｍｇ／Ｌのパルミチン酸、６０ｍｇ／ＬのＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００（約７５／１８／７のモル比）および１００ｇ／ＬのＰＥＧ４０００を含むシクロオクタンと水のエマルション（約１．５／１００ ｖ／ｖ）を調製して（Ｍｅｇａｔｒｏｎ ＭＴ３０００，Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ；１０’０００ｒｐｍ、３．５分）、ＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングする（約１ｍＬ／バイアル）。
実施例１に記載のとおりに、バイアルを、真空下にて－５０℃で冷却して、それから、凍結乾燥に曝し、その後に、水および溶媒の完全な除去（０．５重量％未満）まで、室温よりも高い温度で二次乾燥させた。凍結乾燥プロセスの最後に、バイアルのヘッドスペースをＣ４Ｆ１０／Ｎ２の３５／６５混合物で飽和させて、バイアルに栓をして密封する。
異なるバッチ（７ａ～７ｈ）をこの後の加熱処理実験に用いた。
［実施例８］
実施例７に従って製造されたバッチに対する、加熱処理の効果
実施例７に従って調製した様々なバッチ（７ａ～７ｈ）のバイアルを異なる加熱処理に曝して、ガス充填微小胞の再構成された懸濁液の特性に対する効果を観察した。
実施例７に従って製造されたバッチに対する、加熱処理の効果
実施例７に従って調製した様々なバッチ（７ａ～７ｈ）のバイアルを異なる加熱処理に曝して、ガス充填微小胞の再構成された懸濁液の特性に対する効果を観察した。
実験８．１
バッチ７ａのバイアルを、４０℃または４５℃の加熱温度に１６時間曝し、または加熱しなかった。それから、バイアル内の産物を５ｍｌの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表５に報告する。
バッチ７ａのバイアルを、４０℃または４５℃の加熱温度に１６時間曝し、または加熱しなかった。それから、バイアル内の産物を５ｍｌの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表５に報告する。
上記データから推測できるように、実施例７の手順に従って製造されたバッチについても加熱処理によって耐圧性の実質的な増大が得られる。
実験８．２
バッチ７ｂのバイアルを、１６～８８時間の範囲の時間、４０℃の加熱温度に曝し、または加熱しなかった。それから、バイアル内の産物を５ｍｌの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表６に報告する。
バッチ７ｂのバイアルを、１６～８８時間の範囲の時間、４０℃の加熱温度に曝し、または加熱しなかった。それから、バイアル内の産物を５ｍｌの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表６に報告する。
上記データから推測できるように、耐圧性の実質的な増大が、４０℃での加熱処理によって得られる。１６時間の処理の持続時間は、より長い熱処理に起因する微小胞の他の特性に対するあり得る負の効果（例えば、再構成された懸濁液中の大きなサイズの微小胞の増大）を避けるためにも、十分であると一般に考えられる。
実験８．３
バッチ７ｃ～７ｇのバイアルを、１６時間、４０℃の加熱温度に曝し、または加熱しなかった。それから、バイアル内の産物を５ｍＬの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表５に報告する。
バッチ７ｃ～７ｇのバイアルを、１６時間、４０℃の加熱温度に曝し、または加熱しなかった。それから、バイアル内の産物を５ｍＬの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表５に報告する。
上記表から推測されるように、様々なバッチから再構成された微小胞の懸濁液について、１５ｋＰａを超えて約２５ｋＰａまでの耐圧性の増大が凍結乾燥産物の加熱処理後に得られる。
実験８．４
バッチ７ｈのバイアルを、２～２４時間の範囲の時間、３８℃で加熱処理に曝した。それから、バイアル内の産物を５ｍＬの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表６に報告する。
バッチ７ｈのバイアルを、２～２４時間の範囲の時間、３８℃で加熱処理に曝した。それから、バイアル内の産物を５ｍＬの食塩水で再構成して、懸濁液中の微小胞の特性を測定した。結果を以下の表６に報告する。
上記表から推測されるように、３８℃で８～１２時間までの増大する時間、凍結乾燥材料を加熱することによって、再構成された懸濁液中の微小胞の増大する耐圧性が得られる。材料のさらなる加熱（１６または２４時間）は、耐圧性を実質的にさらに増大させない。
Claims (14)
- ガス充填微小胞を調製するための凍結乾燥製剤であって、
以下の脂質成分：
（ａ）ジステアロイル－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、
（ｂ）５０００ｇ／ｍｏｌのＭｗを有するポリエチレングリコールとコンジュゲートされたジパルミトイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００）、および
（ｃ）パルミチン酸
の混合物を含み；
前記脂質成分は、それぞれのモル量ａ／ｂ／ｃが６５～８５／４～１０／８～２２であり、
前記剤はポリエチレングリコール４０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ４０００）をさらに含み、前記脂質成分の混合物はＰＥＧ４０００の重量に対して０．３％超～０．５％の重量を有する、
凍結乾燥製剤。 - 請求項１の凍結乾燥製剤であって、
前記それぞれのモル量が、７０～８０／５～８／１２～２１である、
凍結乾燥製剤。 - 請求項１の凍結乾燥製剤であって、
前記それぞれのモル量が、７２～７６／６～９／１５～２０である、
凍結乾燥製剤。 - 請求項１の凍結乾燥製剤であって、
前記それぞれのモル量が、７４（＋／－１）／７．５（＋／－０．５）／１８．５（＋／－１）である、
凍結乾燥製剤。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤であって、
前記重量が、重量で０．３５％～０．４５％である、
凍結乾燥製剤。 - 請求項１～５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤であって、
前記重量が、重量で０．３８％～０．４％である、
凍結乾燥製剤。 - ガス充填微小胞の懸濁液であって、
前記微小胞が、脂質成分ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよびパルミチン酸の混合物を、６５～８５／４～１０／８～２２のそれぞれのモル量で含み、
前記懸濁液はポリエチレングリコール４０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ４０００）をさらに含み、前記脂質成分の混合物はＰＥＧ４０００の重量に対して０．３％超～０．５％の重量を有する、
懸濁液。 - 請求項７の懸濁液であって、
前記それぞれのモル量が、７０～８０／５～８／１２～２１である、
懸濁液。 - 請求項７の懸濁液であって、
前記それぞれのモル量が、７２～７６／６～９／１５～２０である、
懸濁液。 - 請求項７の懸濁液であって、
前記それぞれのモル量が、７４（＋／－１）／７．５（＋／－０．５）／１８．５（＋／－１）である、
懸濁液。 - 請求項７～１０のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
脂質成分の混合物が、ＰＥＧ４０００の重量に対して０．３５％～０．４５％の重量を有する、
懸濁液。 - 請求項１１に記載の懸濁液であって、
前記重量が、重量で０．３８％～０．４０％である、
懸濁液。 - 請求項１から６のいずれかに記載の凍結乾燥製剤を約２５０ｍｇ～約３５０ｍｇ含む、
密封されたバイアル。 - 超音波治療的処置の方法において使用するための、請求項８～１２のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
前記方法が、
（ｉ）請求項８から１２のいずれかに定義されるガス充填微小胞の懸濁液および治療剤を患者に投与するステップ；
（ｉｉ）治療的処置に曝すべき前記患者における関心領域を同定するステップであって、前記関心領域がガス充填微小胞の前記懸濁液を含んでいる、関心領域を同定するステップ；および
（ｉｉｉ）前記関心領域を治療的に処置するために超音波ビームを適用するステップ；を含み、
それにより、前記超音波治療的処置が、前記関心領域内のガス充填微小胞の前記懸濁液の存在によって増強される、
懸濁液。
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