CN115970010A - 脂质微泡冻干粉组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂质微泡冻干粉组合物及其制备方法，所述组合物包括1重量份DSPC、1重量份DPPG‑Na、100‑240重量份PEG4000和0.1‑0.3重量份棕榈酸。所述冻干粉组合物与生理学可接受的气体形成密封西林瓶，复溶后用于超声造影。本发明通过调整脂质微泡冻干粉组合物的各组分比例以及工艺参数，使其具有复溶微泡粒径分布窄、微泡稳定性高、不易破裂、耐压性能好等多种优势，在造影时图像声学信号更强，靶部位停留时间更长。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂质微泡冻干粉组合物及其制备方法，具体涉及一种用于提高超声图像对比度的超声造影剂，属于医药领域。
背景技术
超声造影剂(ultrasound contrast agent，UCA)是一类经外周静脉注射后，可使血液产生强散射，能够显著增强超声医学检测信号的诊断药物。随着超声医学和临床药理学的迅速发展，超声造影技术已经成为当今医学影像学领域发展最快的技术之一。
注射用六氟化硫微泡(商品名：
)是国内外已上市多年的一款超声造影剂，用于超声造影诊断，具有肝脏造影、心脏造影、泌尿系统造影等多种适应症，应用非常广泛。据文献(Influence of Bubble Size Distribution on the Echogenicityof Ultrasound Contrast Agents，《Investigative Radiology》，Volume 35,Number 11,661–671)显示，超声造影剂微泡的粒径与共振频率相关，一定范围内中心粒径的体积浓度越高，其共振频率越强，即反射的声学信号越强。
其次，国内文献(《压力对造影剂微气泡后散射强度影响的实验研究》(博士论文，作者，华中科技大学2004级潘敏，影像医学与核医学专业))的结论指出，在超声仪器设置条件改变时，不同类型造影剂的后向散射(backscattering)强度变化不一，与微气泡的大小和与之相匹配的共振频率有关。上述文献中显示声诺维适合中心频率为2-7.5MHz的超声探头，但浅表器官如甲状腺、乳腺等使用的线阵探头一般频率为10MHz以上，在高频探头下，微泡容易破裂，因而在甲状腺、乳腺等器官内微泡停留时间较短，使用时较为受限，所以，在浅表器官造影时，需要使用耐压性能更好的造影剂。
再次，使用生理盐水配置声诺维溶液时一般配置5ml，在血池造影时通常使用剂量为2ml，如果第一次图像不清晰，则需要进行二次造影。临床上通常使用已开封的造影剂进行二次造影，声诺维说明书显示，混悬液配置后可在6个小时内使用，但在实际使用时，我们发现配置好的微泡溶液随着时间增加粒子数量下降比较明显(见实施例5数据表格，声诺维配置后多个时间节点的粒子数分布)，二次造影的效果往往不如首次造影。
针对上述问题，本发明对现有造影剂声诺维进行了改良，发明了一种脂质微泡冻干粉组合物，相比声诺维，具有复溶微泡粒径分布窄、微泡稳定性高、耐压性能好等多种优势，使用时可弥补现有技术的不足。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人进行了大量的试验进行改进。在试验过程中发明人惊奇地发现，在冻干制备工艺中，将制备好的密封西林瓶在特定温度下加热一定时间可以增加复溶后微泡的体积浓度，调整PEG4000的处方用量也可以增加微泡的体积浓度，并增加微泡的耐压性，进而提升微泡的声学信号强度，延长微泡的使用时间。因此，本发明的技术方案可以概括如下。
本发明涉及一种脂质微泡冻干粉组合物，所述组合物包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油钠(DPPG-Na)、聚乙二醇4000(PEG4000)以及棕榈酸，其中DSPC为1重量份；DPPG-Na为1重量份，PEG4000为100-240重量份，棕榈酸为0.1-0.3重量份。
优选地，PEG4000为150-200重量份。
更优选地，PEG4000为170-185重量份。
进一步地，本发明涉及一种密封西林瓶，其包含与生理上可接受的气体接触的上述组合物。
优选地，所述气体可以是氟化气体，例如可以为全氟甲烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷以及全氟卤代烷等，更优选地是六氟化硫。
优选地，所述气体可以是低水溶性惰性气体，例如可以为氮气、氩气等。
更进一步地，本发明涉及一种制备密封西林瓶的方法，包括如下步骤：
(1)将DSPC、DPPG-Na、PEG4000以及棕榈酸溶解在溶剂中形成溶液；
(2)将溶液快速填充到西林瓶中，真空冷冻干燥去除溶剂；
(3)向西林瓶中通入氟化气体，密封；
(4)将密封后的西林瓶置于恒温箱中活化12-24小时即得；
优选地，所述PEG4000为100-240重量份，优选为150-200重量份，更优选为170-185重量份。
优选地，所述恒温箱的温度为35-50℃，更优选为45℃。
优选地，步骤(1)的溶剂为正己烷、异丙醇、环己醇、2-甲基-2-丁醇、叔丁醇、正丁醇中的任意一种或多种的混合物。
优选的溶剂为叔丁醇或正己烷和异丙醇的混合物。
进一步地，本发明涉及制备脂质微泡超声造影剂的方法，通过将所述冷冻干燥的粉末组合物在所述气体存在下分散在0.9％生理盐水中，获得微泡悬浮液。
优选地，所述微泡悬浮液的体积浓度≥5×108个/cm3。
进一步地，本发明还涉及上述组合物作为血池超声造影剂、浅表超声造影剂和腔体超声造影剂的用途。
在使用本发明的微泡悬浮液作为超声造影剂进行超声成像时，通过以下步骤实施：
向患者施用有效量的上述微泡悬浮液；
将超声信号传输到所述患者的身体部位；
从所述身体部位收集回声图信号。
本发明的脂质微泡冻干粉末组合物，在使用时，通过注入0.9％生理盐水，使气体分散在乳液中，获得微泡悬浮液。微泡悬浮液的外壳组份为磷脂，包括DSPC与DPPG-Na，其中DSPC分子量为790.2，头部由带正电荷胺基构成，具有亲水功能，尾部是亲脂性的长链，兼有亲水性与亲脂性，是一种基本上电荷中性的磷脂表面活性剂，结构如下：
DPPG-Na分子量为745，含有甘油多羟基头基，尾部为亲脂性长链，中间由磷脂酰基连接，磷脂酰基还连接有钠阳离子，是一种带正电荷的磷脂，结构如下：
脂质微泡冻干粉末组合物加入生理盐水重构的过程中，磷脂由于同时具备亲水性和亲脂性两种基团，亲水基团头部在外，尾部自然向弯曲内聚集，同时将周围的六氟化硫气体包裹在内，自动重组为内部包裹六氟化硫气体的微气泡，组方中的棕榈酸穿插在两种磷脂之间，防止磷脂聚集，起到稳定脂质的作用，棕榈酸是一种高级饱和脂肪酸，结构如下：
PEG4000在处方中的作用是构成冻干粉末的骨架，DSPC、DPPG-Na与棕榈酸经过成膜处理后，磷脂分子排列分布均匀，并得到充分的膨胀，均匀的分散在聚乙二醇骨架中，冷冻干燥结束后，溶剂从骨架中蒸发，生成疏松多孔的脂质微泡冻干粉末，六氟化硫气体嵌入到多孔的结构之中。在加入生理盐水重构的过程中，PEG4000溶解到生理盐水溶液中，磷脂疏水基团向内弯曲聚集，同时将没有及时逃逸，嵌入到疏松多孔的骨架结构之中将六氟化硫包裹在其中，形成包裹六氟化硫气体的微气泡。PEG4000的平均分子量约为4000，其结构如下：
聚乙二醇的骨架结构，进一步说明了发明人的惊奇发现，冻干后进行一定时间的升温保存，可以增加复溶时微泡的体积浓度，是由于温度升高气体膨胀，气体的布朗运动更剧烈，能够深入到细小的疏松多孔微结构之中，与分散均匀的磷脂结合更紧密，在加入生理盐水磷脂重构内卷的过程中，能够捕获并包裹更多六氟化硫气体。其次调整PEG4000的用量，可以使得骨架结构更加致密，形成更多的小孔中心，增大磷脂分布的有效面积，缩小微泡的体积直径，使脂质微泡刚性更强，增加微泡的耐压性，进而提升微泡的声学信号强度。
经实施例的试验数据可知，本发明的脂质微泡冻干粉组合物具有复溶微泡粒径分布窄、微泡稳定性高、耐压性能好等多种优势，在血池造影时图像声学信号更强，靶部位停留时间更长，耐压性更好，适合血池造影、腔体造影和浅表造影等多种使用模式。
附图说明
图1是实施例4中4-D批次样品的脂质微泡造影剂粒度分布；
图2是实施例7的4-D样品经超声造影后得到兔子肾脏造影图像；
图3是实施例7的声诺维样品经超声造影后得到兔子肾脏造影图像；
图4是实施例7的4-D样品经超声造影后得到的兔子输卵管造影图像。
具体实施方式
缩写释义
DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱
DPPG-Na：1,2-棕榈酰磷脂酰甘油钠
PEG4000：聚乙二醇4000
术语说明
声诺维：通用名注射用六氟化硫微泡，该药为意大利博莱科影像公司开发的一款超声造影剂，根据说明书显示每支含有六氟化硫59mg，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)0.19mg、1,2-二棕榈酰磷脂酰甘油钠(DPPG)0.19mg、棕榈酸0.04mg，聚乙二醇4000 24.5mg。
聚乙二醇4000：聚乙二醇是一种高分子聚合物，化学式是HO(CH2CH2O)nH，依分子量不同而性质不同，从无色无臭黏稠液体至蜡状固体。PEG4000即为平均分子量4000的聚乙二醇聚合物，n＝70～85，熔点53～56℃。
微泡：微泡是一类药物制剂，一般由气核和稳定壳膜组成。气泡的包被材料一般是由脂质、聚合物或蛋白质组成，它们具有良好的生物兼容性且静脉注射时比较安全。其中磷脂作为微气泡的壳膜比交联的聚合物硬壳更具柔韧性，超声作用下，更易收缩、破裂、弯曲或再铺展，从而增强微泡对声波的敏感性。
复溶：是指经密封罐装后的超声造影剂冻干粉制剂，在使用时，加入生理盐水振摇溶解的过程。
血池超声造影：指将超声造影剂通过静脉注射的方式进入体循环获得体内器官对比增强超声成像图像的超声造影方式，包括肝腹部器官声造影，心脏超声造影，血管多普勒等。
腔体超声造影：指将超声造影剂通过注射器/导管注入子宫、胆囊、膀胱等腔体器官内获得器官对比增强超声成像图像的超声造影方式。
浅表超声造影：浅表超声造影特指甲状腺、乳腺、腮腺、颌下腺、淋巴结、全身各部位软组织、肌肉、肌腱、皮肤等浅表器官、部位的超声造影检查。
以下结合具体实施例，对本发明进行更详细地阐述。应当指出的是，本发明不仅限于以下实施例。
实施例1直接进行冷冻干燥的冻干组合物的制备
称取DSPC、DPPG、棕榈酸，聚乙二醇-4000溶解于有机溶剂中，按比例(1:1：(0.1-0.3)：(100-240))分装至西林瓶中，加盖溴化丁基橡胶塞半压塞，推入冻干机隔板上，抽真空冷冻干燥24小时，冲入六氟化硫气体，压塞、压盖，制得密封的冻干组合物。
微泡的配置方法：在使用前，向西林瓶中注入生理盐水，振摇直至冻干粉末完全分散成均一的白色乳状液体。
实施例2改变PEG4000用量的冻干组合物的制备及参数检测
参考实施例1的制备方法，使用不同重量份的PEG4000。
| 序号 | 批次 | PEG4000重量份 |
| 1 | 1-A | 100 |
| 2 | 2-A | 120 |
| 3 | 3-A | 135 |
| 4 | 4-A | 150 |
| 5 | 5-A | 160 |
| 6 | 6-A | 173 |
| 7 | 7-A | 185 |
| 8 | 8-A | 200 |
| 9 | 9-A | 220 |
| 10 | 10-A | 240 |
检测前注入5mL0.9％氯化钠溶液复溶，部分六氟化硫被包裹进乳白色混悬微泡中，采用Multisizer 4e库尔特计数器(Beckman Coulter,Inc.)分析微泡数量、体积浓度，试验结果如下：
试验结果表明随着处方中PEG4000用量的增加，微泡体积浓度也随之增加，但在PEG4000用量增加至一定重量份后，体积浓度反而随之下降，由上表可知，PEG4000重量在175-200份时达到最佳体积浓度。
实施例3最佳活化温度的选取
按照实施例1的制备方法，称取DSPC 40mg、DPPG40mg、棕榈酸8mg，聚乙二醇40006.90g(该用量为实施例2中最高体积浓度用量173重量份，6-A批次用量)，溶解分装后冷冻干燥，充入六氟化硫气体，形成密封与西林瓶中的冻干组合物。分4批，在35℃、40℃、45℃、50℃下加热24小时。具体实验设计如下：
检测前注入5mL0.9％氯化钠溶液复溶，部分六氟化硫被包裹进乳白色混悬微泡中，采用Multisizer 4e库尔特计数器(Beckman Coulter,Inc.)分析微泡数量以及体积浓度，试验结果如下：
试验结果显示：35℃热处理体积浓度结果最小，45℃热处理体积浓度最高。
实施例4最佳活化时间的选取
按照实施例1的制备方法，称取DSPC40mg、DPPG40mg、棕榈酸8mg，聚乙二醇40006.90g(该用量为实施例2中最高体积浓度用量)，充入六氟化硫气体，形成密封与西林瓶中的冻干组合物。将上述密封西林瓶置于45℃恒温箱内活化0h、6h、12h、24h、48h小时，具体实验设计如下：
检测前注入5mL0.9％氯化钠溶液复溶，部分六氟化硫被包裹进乳白色混悬微泡中，采用Multisizer 4e库尔特计数器(Beckman Coulter,Inc.)分析微泡数量以及体积浓度，试验结果如下：
说明热处理时间12小时以上，体积浓度达到峰值，超过12小时后，随着热处理时间的增加体积浓度基本不再发生变化。
说明书附图1为4-D批次样品24小时的抽样检测结果。
实施例5与声诺维参数的对比
取市售声诺维药品3支，按说明书配置好溶液，作为对照组，取实施例4中4-D批次的样品3支，作为试验组。分别取对照组、试验组样品，以体积浓度为参数，分别取三支样品加入5mL 0.9％生理盐水溶液溶解，采用Multisizer 4e库尔特计数器(Beckman Coulter,Inc.)分析，记录0min的体积浓度，分别室温常压静置10min、30min、60min后检测，再次检测微泡的粒度分布，试验结果如下：
从上表可以看出，试验组的稳定性要明显优于对照组，10min时两者没有区别体积浓度剩余为90％以上，60min后试验组体积浓度剩余至86.93％，但对照组仅剩余68.16％，60min时试验组比对照组的体积浓度剩余比例要高20％。
实施例6微泡耐压性能研究
压力测试方法：用自制的简易加压装置，取灌装好的密封西林瓶，由注射器推入空气加压，将样品分别暴露于100mmHg、120mmHg、140mmHg、180mmHg过压90秒，释放过压，分别测定微泡的浓度和平均粒径。(加压装置：将水银血压计的一端用胶皮管连接至装有小西林瓶的软木塞密封广口瓶中，西林瓶里盛有被试造影剂，由注射剂通过塞子推入空气加压。根据水银血压计的刻度显示瓶内空气压力。)
取声诺维药品4支，按说明书配置好溶液，作为对照组，实施例4中4-D批次的样品4支，作为试验组。分别取对照组、实验组样品，以体积浓度为参数，分别取四支样品加入5mL0.9％生理盐水溶液复溶，采用Multisizer 4e库尔特计数器(Beckman Coulter,Inc.)分析，记录0min的体积浓度，分别置于120mmHg压力下静置1min、3min、5min、10min，恢复常压、振摇均匀后，再次检测微泡的粒度分布，检测结果如下：
试验结果表明，10分钟内随着时间的延长，试验组与对照组都呈降低趋势，经过120mmHg压力测试10分钟后试验组剩余65.18％、对照组试验剩余48.96％，表明试验组的耐压性能优于对照组。
实施例7超声造影效果研究
试验动物：雌性新西兰白兔，体重2-2.5kg，4～5月龄，健康状态良好；
设备型号：GE E8阴式探头RIC5-9-D，子宫输卵管造影模式(HyCoSy)，MI：0.19，频率：4-9MHz，采用3D实时扫描，监测造影剂的灌注情况。
试验组样品：4-D批次样品1支，注入5mL生理盐水振摇复溶，得到均匀的白色微泡混悬液。
对照组样品：声诺维1支，注入5mL生理盐水振摇复溶，得到均匀的白色微泡混悬液。
家兔肾脏造影：分别取试验组和对照组造影剂0.1mL，经兔子耳缘静脉注射，按上述模式检测肾脏图像显影效果，试验组所得影像结果如说明书附图图2所示，对照组所得影像结果如说明书附图图3所示，二者均能很好地显示家兔肾脏特征。
家兔输卵管造影：取试验组微泡混悬液0.5mL稀释至20mL，经造影导管缓慢推入雌兔子宫腔，经腹超声扫查，所得影像结果如说明书附图图4所示，图像清晰，能够显示兔子宫的正常生理弯曲结构。
Claims (10)
1.一种用于制备脂质微泡超声造影剂的冻干粉组合物，所述组合物包括DSPC、DPPG-Na、PEG4000和棕榈酸，其中DSPC为1重量份；DPPG-Na为1重量份，PEG4000为100-240重量份，棕榈酸为0.1-0.3重量份。
2.如权利要求1所述的冻干粉组合物，其中PEG4000为150-200重量份，PEG4000优选为170-185重量份。
3.一种密封西林瓶，其包含权利要求1或2所述的冻干粉组合物，与生理上可接受的气体。
4.如权利要求3所述的密封西林瓶，其中，所述气体是氟化气体，优选为六氟化硫。
5.如权利要求3所述的密封西林瓶，其中，所述气体是低水溶性惰性气体，优选为氮气、氩气。
6.一种制备权利要求3或4所述的密封西林瓶的方法，包括如下步骤：
（1）将DSPC、DPPG-Na、PEG4000以及棕榈酸溶解在溶剂中形成溶液；
（2）将溶液快速填充到西林瓶中，真空冷冻干燥去除溶剂；
（3）向西林瓶中通入氟化气体，密封；
（4）将密封后的西林瓶置于恒温箱中活化12-24小时即得。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述恒温箱的温度为35-50℃，优选为45℃。
8.一种制备脂质微泡超声造影剂的方法，包括在所述气体存在下将权利要求1或2的冻干粉组合物分散在生理盐水中形成微泡悬浮液。
9.如权利要求8所述的制备方法，其中，所述微泡悬浮液体积浓度≥5×108个/cm3。
10.如权利要求1-9所述的超声造影剂，以及其用于血池造影、腔体造影、以及浅表造影的用途。
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