PT1323434E - Método para imagiologia de diagnóstico da região renal utilizando um agente de contraste e um vasodilatador - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA IMAGIOLOGIA DE DIAGNÓSTICO DA REGIÃO RENAL UTILIZANDO UM AGENTE DE CONTRASTE E UM VASODILATADOR"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a métodos melhorados para imagiologia de diagnóstico. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a métodos melhorados para imagiologia de diagnóstico que envolvem a administração a um doente de um vasodilatador renal e um agente de contraste.

Antecedentes da invenção

Os ultra-sons são uma técnica de imagiologia de diagnóstico de valor, para o estudo de várias áreas do corpo incluindo, por exemplo, a vasculatura, tal como a microvasculatura de tecidos. Os ultra-sons proporcionam algumas vantagens em relação a outras técnicas de diagnóstico. Por exemplo, as técnicas de diagnóstico que envolvem medicina nuclear e raios-X, geralmente resultam numa exposição do doente a radiação electrónica ionizante. Estas radiações podem provocar danos no material subcelular, incluindo o ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) e proteínas. Os ultra-sons não envolvem esta radiação potencialmente prejudicial. Além disso, os ultra-sons são relativamente económicos, em comparação com outras técnicas de diagnóstico, tais como imagiologia por ressonância magnética 1 (MRI) que pode necessitar de equipamento elaborado e dispendioso.

Os ultra-sons envolvem a exposição de um doente a ondas de som. Em geral, as ondas de som dissipam-se devido à absorção pelo tecido corporal, penetram através do tecido ou reflectem-se para fora do tecido. A reflexão das ondas de som para fora do tecido, normalmente, designada por dispersão de retorno ou reflectividade, forma a base para desenvolver uma imagem de ultra-sons. Isto porque as ondas de som se reflectem de forma diferente a partir de diferentes tecidos corporais. Esta reflexão diferencial é devida a vários factores, incluindo os constituintes e a densidade do tecido particular que está a ser observado. As ondas reflectidas diferencialmente são então detectadas, normalmente com um transdutor que pode detectar ondas de som com uma frequência de 1 megahertz (MHZ) a 10 MHZ. As ondas detectadas são integradas, quantificadas e convertidas numa imagem do tecido a ser estudado. A imagiologia de tecido vascularizado envolve geralmente uma análise da diferença de propriedades acústicas entre o sangue e tecidos. Assim, fizeram-se tentativas para desenvolver agentes de contraste que servem para aumentar a diferença acústica entre o sangue e os tecidos envolventes. Isto pode também permitir a medição do fluxo sanguíneo, melhorando deste modo a detecção de doenças associadas com alterações no fluxo sanguíneo. Os agentes de contraste podem servir para melhorar a qualidade e utilidade de imagens que são obtidas com ultra-sons. Alguns exemplos de agentes de contraste incluem, por exemplo, suspensões de partículas sólidas e gotículas de líquidos emulsionados. 2 A reflexão de som a partir de interfaces líquido-gás é extremamente eficaz. Deste modo, algumas bolhas, incluindo algumas bolhas cheias com gás, podem ser muito úteis como agentes de contraste. 0 termo "bolhas", tal como aqui utilizado, refere-se a vesículas que se caracterizam geralmente pela presença de uma ou mais membranas ou paredes, envolvendo um vazio interno que é cheio com um gás ou um seu precursor. Exemplos de bolhas incluem, por exemplo, vesículas que estão envolvidas por monocamadas e/ou bicamadas para formar, por exemplo, vesículas unilamelares, oligolamelares e/ou multilamelares, tais como lipossomas, micelas e semelhantes. Tal como discutido em maior pormenor mais à frente, a eficácia das bolhas como agentes de contraste, depende de vários factores incluindo, por exemplo, o tamanho e/ou elasticidade da bolha. A eficácia das bolhas como agentes de contraste depende de vários factores incluindo, por exemplo, o tamanho da bolha. Tal como é conhecido do especialista na técnica, o sinal que está na gama de frequências de ultra-sons de diagnóstico e que pode ser reflectido para fora de uma bolha é uma função do raio (r6) da bolha (dispersor de Rayleigh). Assim, uma bolha com um diâmetro de cerca de 4 micrómetros (μπι) possui cerca de 64 vezes a capacidade de dispersão de uma bolha com um diâmetro de cerca de 2 μιη. Assim, em termos gerais, quanto maior for a bolha, maior será o sinal reflectido.

No entanto, o tamanho da bolha é limitado pelo diâmetro dos capilares através dos quais a bolha deverá passar. Em geral, os agentes de contraste que compreendem bolhas com um diâmetro maior que cerca de 10 μπι podem ser perigosos, dado que os microvasos podem ficar obstruídos. Deste modo, é preferido que 3 mais de cerca de 90% das bolhas num agente de contraste tenham um diâmetro inferior a 10 μιη, sendo mais preferido mais de cerca de 95% e sendo ainda mais preferido mais de cerca 98%. O diâmetro médio da bolha é também importante e deve ser maior do que cerca de 1 μιη, sendo preferido mais do que cerca de 2 μιη. O diâmetro médio ponderado em volume das bolhas deve ser de cerca de 7 a cerca de 20 μιη. A viabilidade dos agentes de contraste de ultra-sons e métodos que envolvem a sua utilização, actualmente disponíveis, é altamente dependente de uma variedade de factores, incluindo a região particular que se pretende visualizar. Nalgumas circunstâncias, os artefactos de diagnóstico podem tornar a imagem de diagnóstico substancialmente inutilizável.

Além dos ultra-sons, a tomografia computorizada (TC) é uma técnica de imagiologia de diagnóstico de valor, para o estudo de várias áreas do corpo. Na TC, a radiodensidade (densidade electrónica) da matéria é medida e expressa em termos de unidades de Hounsefield (HU). As unidades de Hounsefield que têm o nome do inventor do primeiro dispositivo de varrimento de TC, são uma indicação da absorção relativa de raios-X de TC pela matéria, sendo a absorção directamente proporcional à densidade electrónica da matéria. A água, por exemplo, tem um valor de 0 HU, o ar um valor de -1000 HU e o osso cortical denso, um valor de 1000 HU. Devido à semelhança nas densidades dos vários tecidos do corpo, no entanto, foi necessário desenvolver agentes de contraste que podem ser utilizados para alterar as densidades relativas de diferentes tecidos. Isto resultou numa melhoria global na eficácia de diagnóstico da TC. 4

Na pesquisa de agentes de contraste para TC; os investigadores têm procurado geralmente desenvolver agentes que aumentem a densidade electrónica em certas áreas de uma região do corpo (agentes de contraste positivo). Têm-se desenvolvido compostos de bário e iodo, por exemplo, para este fim. Para o tracto gastrointestinal, utiliza-se sulfato de bário extensivamente, para aumentar a radiodensidade do lúmen do intestino, em análises de TC. Também se utilizam meios de contraste solúveis em água, iodados para aumentar a densidade no tracto gastrointestinal, mas estes não são utilizados tão vulgarmente como os compostos de bário, essencialmente porque as preparações de iodo são mais dispendiosas do que as de bário e são geralmente menos eficazes em aumentar a radiodensidade nesta região do corpo. A utilização de microesferas de baixa densidade como agentes de contraste de TC também foi referida. Ver, e. g., Unger et al. Patente U.S. N° 5205290. Como discutido acima, em relação a métodos de diagnóstico por ultra-sons, a viabilidade dos agentes de contraste de TC e métodos envolvendo a sua utilização, actualmente disponíveis, para imagiologia de regiões do coração, depende grandemente do fluxo sanguíneo através das câmaras do coração em relação ao fluxo sanguíneo nos vasos sanguíneos do próprio tecido do coração. A imagiologia por ressonância magnética (MRI) é outra técnica de imagiologia de diagnóstico que pode ser utilizada para produzir imagens transversais do corpo, numa variedade de planos de varrimento, tais como, por exemplo, axial, coronária, sagital e ortogonal. A MRI utiliza um campo magnético, energia de radiofrequência e gradientes de campo magnético, para se obterem imagens do corpo. As diferenças de contraste ou intensidade de sinal entre os tecidos, reflectem essencialmente os valores de relaxamento TI (longitudinal) e T2 (transversal) e 5 a densidade de protões que corresponde geralmente ao conteúdo de água livre dos tecidos. Estão disponíveis várias abordagens possíveis para alterar a intensidade do sinal numa região de um doente, por utilização de um meio de contraste. Por exemplo, pode-se conceber um meio de contraste para alterar ΤΙ, T2 ou a densidade de protões.

Em termos gerais, a MRI requer a utilização de agentes de contraste. Se a MRI é realizada sem utilização de um agente de contraste, a diferenciação do tecido de interesse dos tecidos envolventes, na imagem resultante, poderá ser difícil. No passado, a atenção focou-se essencialmente em agentes de contraste paramagnéticos, para MRI. Os agentes de contraste paramagnéticos envolvem materiais que contêm electrões desemparelhados. Os electrões desemparelhados actuam como pequenos magnetes no campo magnético principal, para aumentar a velocidade de relaxamento longitudinal (Tl) e transversal (T2) . Os agentes de contraste paramagnéticos compreendem tipicamente iões metálicos, por exemplo, iões de metais de transição que proporcionam uma fonte de electrões desemparelhados. No entanto, estes iões metálicos também são geralmente, altamente tóxicos. Num esforço para diminuir a toxicidade, os iões metálicos são tipicamente quelados com ligandos.

Os óxidos de metais, muito particularmente os óxidos de ferro, também têm sido utilizados como agentes de contraste de MRI. Enquanto que as partículas pequenas de óxido de ferro, por exemplo, com um diâmetro inferior a cerca de 20 nm, podem ter propriedades de relaxamento paramagnético desejáveis, o seu efeito predominante é através da susceptibilidade global. Os nitróxidos são outra classe de agentes de contraste de MRI que também são paramagnéticos. Estes têm um relaxamento 6 relativamente lento e são geralmente menos eficazes do que os iões paramagnéticos.

Os agentes de contraste de MRI existentes têm várias limitações. Por exemplo, um maior ruido de imagem poderá estar associado a alguns agentes de contraste, incluindo agentes de contraste que envolvem metais quelados. Este ruido resulta, geralmente, de movimentos peristálticos intrínsecos e movimentos da acção respiratória ou cardiovascular. Além disso, a intensidade do sinal para agentes de contraste depende geralmente da concentração do agente, bem como da sequência de pulso utilizada. A absorção de agentes de contraste poderá complicar a interpretação das imagens, particularmente na porção distai do intestino delgado, a menos que se utilizem concentrações suficientemente elevadas das espécies paramagnéticas. Ver, e. g., Kornmesser et ai., Magnetic Ressonance Imaging, 6 :124 (1988).

Outros agentes de contraste poderão ser menos sensíveis a variações de sequências de pulso e poderão proporcionar um contraste mais consistente. No entanto, concentrações elevadas de partículas, tais como ferrites, podem provocar artefactos de susceptibilidade magnética que são particularmente evidentes, por exemplo, no cólon, onde ocorre a absorção de fluido intestinal e o material superparamagnético pode ser concentrado. A toxicidade é outro problema que está geralmente associado com agentes de contraste actualmente disponíveis para MRI. Por exemplo, as ferrites causam muitas vezes sintomas de náusea após administração oral, bem como flatulência e um aumento transitório no ferro sérico. 0 ião gadolínio que está complexado em Gd-DTPA, é altamente tóxico na forma livre. Os vários 7 ambientes do tracto gastrointestinal, incluindo maior acidez (pH menor) no estômago e maior alcalinidade (pH mais elevado) nos intestinos, poderá aumentar a probabilidade de desacoplamento e separação do ião livre, a partir do complexo. 0 fluxo sanguíneo poderá afectar a qualidade das imagens obtidas em MRI. Por exemplo, os vasodilatadores coronários têm sido utilizados em conjunto com tálio 201 (201T1) , num esforço para melhorar a visualização de tecido do miocárdio viável, em medicina nuclear. Os vasodilatadores podem melhorar a visualização aumentando o fluxo sanguíneo para o miocárdio, o que permite que ο 201τΐ seja absorvido de forma mais eficaz nas células de miocárdio viáveis. Também se têm utilizado vasodilatadores coronários em combinação com Gd-DTPA, para melhorar a imagiologia de tecido do miocárdio, em imagiologia MRI. Embora o Gd-DTPA possa ser utilizado como um indicador do fluxo sanguíneo, as medições de relaxamento (TI e T2) poderão não ter a sensibilidade necessária, para auxiliar na medição quantitativa do fluxo. Além disso, os agentes de contraste de MRI da técnica anterior possuem geralmente pesos moleculares relativamente baixos, o que permite a sua difusão através da vasculatura. Isto poderá tornar difícil a quantificação do fluxo sanguíneo através da vasculatura, com base na farmacocinética.

Os doentes com hipertensão vascular renal têm normalmente um estreitamento de uma das artérias dos rins, conhecido como estenose da artéria renal. A detecção da hipertensão vascular renal e a distinção entre esta e a hipertensão essencial mais comum é crítica, pois a hipertensão da artéria renal não responde a tratamento médicos convencionais administrados para a hipertensão. A hipertensão da artéria renal pode ser tratada por inibidores da enzima conversora da angiotensina, ou por tratamento cirúrgico. A hipertensão essencial, pelo contrário, é normalmente tratada com diuréticos, bloqueadores beta ou alfa, redutores pós-carga, redutores da pré-carga e ocasionalmente bloqueadores ganglionares. A imagiologia de diagnóstico pode ser utilizada para detectar a estenose renal associada com a hipertensão renal. As técnicas de imagiologia utilizadas para obter imagens da região renal, incluem métodos de cintilação com radionuclidos e métodos de medicina nuclear com radionuclidos. 0 Captopril, um inibidor da ACE, tem sido utilizado em combinação com processos radiológicos e de radiocintilação para detectar estenose na artéria renal. Ver, por exemplo, Nally, et al., Sem. Nucl. Med. XXII; 85-97 (1992), Itoh, et al., Clin. Nucl. Med. 18; 463-471 (1993) and Dondi, et al., J. Nucl. Med. 33; 2040-2044 (1992). A medicina nuclear, no entanto, tem uma resolução espacial fraca, é muito dispendiosa e, como discutido mais à frente, tem a necessidade indesejável de se utilizarem materiais radioactivos. A angiografia é preferida aos métodos nucleares para detecção de hipertensão renal, mas também é dispendiosa e invasiva. As tentativas para utilizar ultra-sons como uma ferramenta de diagnóstico para a hipertensão renal proporcionaram, em geral, até agora, resultados fracos. Ver por exemplo, Postma, et al., Br. J. Radiol. 65:857-860 (1992) e Kliewer, et al., Radiol 189; 779-787 (1993) . São, portanto, necessários métodos de imagiologia de diagnóstico novos e/ou melhorados, particularmente para imagiologia da região renal. São também necessários métodos de imagiologia de diagnóstico novos e/ou melhorados que permitam a quantificação do fluxo sanguíneo na região renal. A presente 9 invenção refere-se a estas, bem como a outras finalidades importantes. 0 documento US-A-5469854 descreve métodos e dispositivos para a preparação de lipossomas cheios com gás, para utilização em agentes de contraste para imagiologia de diagnóstico.

Sumário da Invenção A presente invenção é dirigida, em ptécnica, a novos e/ou melhorados métodos relacionados com a imagiologia de diagnóstico. Especificamente, numa forma de realização, é proporcionado um método para proporcionar uma imagem da região renal de um doente, compreendendo a administração ao doente de uma composição de vesícula compreendendo vesículas de lípido, proteína ou polímero e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilatador renal. 0 doente é depois submetido a análise utilizando imagiologia de diagnóstico para produzir uma imagem visível da região renal do doente.

Outra forma de realização da invenção também se refer a um método para proporcionar uma imagem da região renal de um doente. 0 método compreende administrar ao doente uma composição compreendendo um lípido, proteína ou polímero e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilatador renal. 0 doente é depois submetido a análise utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível da região renal.

Estes e outros aspectos da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir das restantes discussões nesta invenção. 10

Descrição pormenorizada da invenção

Tal como utilizados acima e ao longo da descrição, deve entender-se que os termos seguintes, salvo indicação em contrário, têm os seguintes significados: "Lípido" refere-se a um composto que ocorre naturalmente, sintético ou semi-sintético (também designado por "natural modificado") que é geralmente anfipático. Os lipidos compreendem tipicamente um componente hidrófilo e um componente hidrófobo. Exemplos de lipidos incluem, por exemplo, ácidos gordos, gorduras neutras, fosfatideos, óleos, glicolipidos, agentes tensioactivos, álcoois alifátios, ceras, terpenos e esteróides. "Polímero" ou "polimérico", tal como aqui utilizado, refere-se a moléculas formadas por união química de duas ou mais unidades de repetição. Assim, incluído no termo "polímero" podem estar, por exemplo, dímeros, trímeros e oligómeros. 0 polímero pode ser sintético, ocorrer naturalmente ou semi-sintético. Numa forma preferida, o termo "polímero" refere-se a moléculas que compreendem 10 ou mais unidades de repetição. "Proteína", tal como aqui utilizado, refere-se a moléculas que compreendem e consistem, de um modo preferido, essencialmente de α-aminoácidos com ligações peptídicas. Incluem-se no termo "proteína" as proteínas globulares, tais como albuminas, globulinas e histonas e as proteínas fibrosas, como colagénio, elastinas e queratinas. Também se incluem "proteínas compostas", em que uma molécula de proteína é unida a uma molécula não proteica, tal como nucleoproteínas, mucoproteínas, lipoproteínas e metaloproteínas. 11 "Composição lipídica", "composição de polímero" e "composição de proteína" referem-se a uma composição que compreende um lípido, polímero ou composto proteico, respectivamente, tipicamente num meio aquoso. Exemplos de composições incluem suspensões, emulsões e composições de vesículas. Estas composições aqui descritas podem também compreender um agente bioactivo. "Vesícula" refere-se a uma entidade que se caracteriza geralmente pela presença de uma ou mais paredes ou membranas que formam um ou mais vazios internos. As vesículas podem ser formuladas, por exemplo, a partir de lípidos, incluindo os vários lípidos aqui descritos, ou materiais poliméricos, incluindo os vários materiais poliméricos enumerados acima, ou proteínas, incluindo as várias proteínas enumeradas acima. Os lípidos, polímeros e/ou proteínas podem ser naturais, sintéticos ou semi-sintéticos. As vesículas preferidas são as que compreendem paredes ou membranas formuladas a partir de lípidos. As paredes ou membranas podem ser concêntricas ou de outro tipo. Nas vesículas preferidas, os lípidos podem estar na forma de uma monocamada ou bicamada e os lípidos da mono ou bicamada podem ser utilizados para formar uma ou mais mono- ou bicamadas. No caso de mais que uma mono- ou bicamada, as mono- ou bicamadas podem ser concêntricas, se desejado. Pode-se utilizar lípidos para formar uma vesícula unilamelar (constituída por uma monocamada ou bicamada), uma vesícula oligolamelar (constituída por cerca de duas ou cerca de três bicamadas) ou uma vesícula multilamelar (constituída por mais do que cerca de três monocamadas ou bicamadas). De modo semelhante, as vesículas preparadas a partir de polímeros ou proteínas, podem compreender uma ou mais paredes ou membranas, concêntricas ou de outro tipo.

As paredes ou membranas das vesículas preparadas a partir de 12 lípidos, polímeros ou proteína, podem ser substancialmente sólidas (uniformes) ou podem ser porosas ou semiporosas. As vesículas aqui descritas incluem entidades normalmente designadas por, por exemplo, lipossomas, micelas, bolhas, microbolhas, microesferas, bolhas revestidas com lípidos, proteínas e/ou polímeros, microbolhas e/ou microesferas, microbalões, microcápsulas, aerogeles, vesículas ligadas a clatrato e estruturas hexagonais H de fase II e semelhantes. 0 vazio interno das vesículas pode ser cheio com um líquido (incluindo, por exemplo, um líquido aquoso), um gás, um precursor gasoso e/ou um sólido ou material de soluto, incluindo por exemplo, um vasodilatador e/ou agente bioactivo, como desejado. As vesículas podem compreender também, se desejado, um ligando para orientação para um alvo. Pode-se utilizar a aplicação de ultra-sons de energia elevada, radiofrequência, energia óptica, tal como por exemplo, luz laser e/ou calor, se desejado, para romper as vesículas in vivo e promover, assim, a libertação do gás e/ou precursor gasoso e do agente bioactivo, aprisionados. Assim, as formulações de vesículaes permitem a libertação controlada de um agente bioactivo, tal como um vasodilatador renal, in vivo. A utilização de energia de ultra-sons na ruptura de vesículas que permite assim a libertação de um agente bioactivo, é discutida na patente U.S. N° 5558092, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. "Composição de vesícula" refere-se a uma composição, tipicamente em meio aquoso que compreende vesículas. "Formulação de vesículas" refere-se a uma composição de vesículas que também compreende um agente bioactivo. Vesículas ou espécies de vesículaes adequadas para utilização em 13 formulações de vesículas incluem, por exemplo, vesículas cheias com gás e vesículas cheias com precursores gasosos. "Lipossoma" refere-se a um agrupamento ou agregado esférico ou esferóide de compostos antipáticos, incluindo compostos lipídicos, tipicamente na forma de uma ou mais camadas concêntricas, por exemplo, bicamadas. Também podem ser designados por vesículas de lípidos. Os lipossomas podem ser formulados, por exemplo, a partir de lípidos iónicos e/ou lípidos não iónicos. Os lipossomas que são formulados a partir de lípidos não iónicos podem também ser designados por "niossomas". "Micela" refere-se a entidades coloidais formuladas a partir de lípidos. Nalgumas formas de realização preferidas, as micelas compreendem uma monocamada ou configuração de fase II hexagonal H. Noutras formas de realização preferidas, as micelas podem compreender uma configuração em bicamada. "Aerogel" refere-se a entidades geralmente esféricas ou esferóides que se caracterizam por uma pluralidade de pequenos vazios internos. Os aerogeles podem ser formulados a partir de materiais sintéticos (por exemplo, uma espuma preparada por cozimento de resorcinol e formaldeído), bem como materiais naturais, tais como polissacáridos ou proteínas. "Clatrato" refere-se a uma partícula sólida, semiporosa ou porosa que pode ser associada com vesículas. Numa forma preferida, os clatratos podem formar uma estrutura de tipo gaiola, contendo cavidades que compreendem as vesículas. Uma ou mais vesículas podem ser ligadas ao clatrato. Pode-se associar um material estabilizador, se desejado, ao clatrato, para 14 promover a associação da vesícula ao clatrato. Materiais adequados a partir dos quais os clatratos podem ser formulados incluem, por exemplo, apatites porosas, tais como hidroxiapatite de cálcio, e precipitados de polímeros e iões metálicos, tais como precipitados de ácido algínico com sais de cálcio. "Emulsão" refere-se a uma mistura de dois ou mais líquidos geralmente imiscíveis e está geralmente na forma de um colóide. A mistura pode ser de lípidos que podem estar dispersos de forma heterogénea ou homogénea ao longo da emulsão. Alternativamente, os lípidos podem ser agregados na forma de, por exemplo, agrupamentos ou camadas, incluindo mono- ou bicamadas. "Suspensão" ou "dispersão" refere-se a uma mistura, de um modo preferido finamente dividida, de duas ou mais fases (sólida, líquida ou gasosa), tal como, por exemplo, líquido em líquido, sólido em líquido, gás em líquido etc. que podem permanecer, de um modo preferido, estáveis por períodos de tempo prolongados. "Estrutura de fase II hexagonal H" refere-se a uma agregação geralmente tubular de lípidos em meio líquido, por exemplo meio aquoso, em que a(s) porção (ões) hidrófila (s) dos lípidos está geralmente virada para dentro, em associação com um meio líquido aquoso dentro do tubo. A(s) porção(ões) hidrófoba(s) dos lípidos radiam geralmente para fora e o tubo assume geralmente a forma de um tubo hexagonal. Uma pluralidade de tubos estão em geral empacotados, juntos, na estrutura de fase hexagonal.

As vesículas utilizadas nos métodos da presente invenção contêm, de um modo preferido, um gás ou precursor gasoso. 15 "Vesícula cheia com gás" refere-se a vesículas em que há um gás encapsulado. "Vesícula cheia com precursor gasoso" refere-se a vesículas em que há um precursor gasoso encapsulado. Nalgumas formas de realização preferidas, as vesículas podem ser substancialmente cheias (incluindo completamente) com o gás e/ou precursor gasoso. 0 termo "substancialmente", como utilizado em relação às vesículas cheias com gás e/ou precursor gasoso, significa que mais de cerca de 50% do volume vazio interno da vesícula consiste de um gás e/ou precursor gasoso. De um modo preferido, mais do que cerca de 60% do vazio interno das vesículas substancialmente cheias, consiste de um gás e/ou precursor gasoso, sendo mais preferido mais de cerca de 70%. De um modo ainda mais preferido, mais do que cerca de 80% do vazio interno das vesículas substancialmente cheias, consiste num gás e/ou precursor gasoso, sendo ainda mais preferido, mais do que cerca de 90%. Em formas de realização particularmente preferidas, mais do que cerca de 95% do vazio interno das vesículas consiste de um gás e/ou precursor gasoso. Se desejado, a vesícula substancialmente cheia pode ser completamente cheia (i. e. cheia com cerca de 100% de gás e/ou precursor gasoso). Embora não seja considerada uma forma de realização preferida da presente invenção, as vesículas podem também conter, se desejado, nenhum ou substancialmente nenhum, i. e., menos do que cerca de 50% de gás ou precursor gasoso.

As composições e/ou formulações da invenção podem ser administradas a um doente. Tal como aqui utilizado, "doente" refere-se a animais, incluindo mamíferos e de um modo preferido humanos.

As frases "região interna de um doente" e "região de interesse" refere-se a todo o doente ou a uma área ou região 16 particular do doente. As regiões internas de um doente e as regiões de interesse podem incluir, por exemplo, áreas que são visualizadas por imagiologia de diagnóstico e/ou áreas que são tratadas com um agente bioactivo. A frase "região renal de um doente" refere-se à região do doente definida pelo rim e pela vasculatura que conduz directamente para e do rim e inclui a aorta abdominal. A frase "vasculatura," como aqui utilizada, refere os vasos sanguíneos (incluindo artérias, veias e semelhantes) no organismo ou num órgão ou ptécnica do organismo. A frase "sistema circulatório" refere-se à região cardiovascular e a vasculatura total. "Agente bioactivo" refere-se a uma substância que pode ser utilizada em conjunção com uma aplicação de natureza terapêutica ou de diagnóstico, tal como em métodos para diagnosticar a presença ou ausência de uma doença num doente e/ou em métodos para o tratamento de doença num doente. Tal como aqui utilizado, "agente bioactivo" refere-se também a substâncias que são capazes de exercer um efeito biológico in vitro e/ou in vivo. Os agentes bioactivos podem ser neutros ou carregados positiva ou negativamente. Exemplos de agentes bioactivos adequados incluem agentes de diagnóstico e farmacêuticos (incluindo vasodilatadores, incluindo vasodilatadores renais), moléculas orgânicas ou inorgânicas sintéticas ou naturais, incluindo proteínas, péptidos, vitaminas, esteróides, análogos de esteróides, agentes antitumorais, hormonas, agentes anti- inflamatórios, agentes quimioterapêuticos e material genético, incluindo nucleósidos, nulceótidos e polinucleótidos. De um modo preferido, o agente bioactivo compreende um agente farmacêutico. "Agente farmacêutico" ou "fármaco" refere-se a qualquer agente terapêutico ou profiláctico que pode ser utilizado no 17 tratamento (incluindo a prevenção, diagnóstico, alivio e cura) de uma enfermidade, dor, doença ou lesão num doente. Os péptidos, polipéptidos e polinucleótidos terapeuticamente úteis podem ser incluídos dentro do significado do termo agente farmacêutico ou fármaco. Os agentes farmacêuticos e/ou fármacos preferidos são os vasodilatadores renais. "Agente de diagnóstico" refere-se a qualquer agente que pode ser utilizado em conjunção com métodos para imagiologia de uma região interna de um doente, incluindo a região renal, e/ou em métodos para o diagnóstico da presença ou ausência de uma doença num doente, especialmente doenças cardíacas incluindo, por exemplo, isquemia do miocárdio e enftécnica do miocárdio. Exemplos de agentes de diagnóstico incluem, por exemplo, agentes de contraste para utilização em conjunção com ultra-sons, imagiologia por ressonância magnética ou tomografia computorizada de um doente incluindo, por exemplo, as composições lipídicas e/ou de vesículas aqui descritas. "Material genético" refere-se geralmente a nucleótidos e polinucleótidos, incluindo ácido desoxirribonucleico (ADN) e ácido ribonucleico (ARN). 0 material genético pode ser preparado por metodologia química, sintética, conhecida pelo especialista na técnica, ou por utilização de tecnologia recombinante, ou por combinação das duas. 0 ADN e ARN podem compreender opcionalmente nucleótidos não naturais e podem ser de cadeia simples ou dupla. "Material genético" refere-se também a ADN e ARN de antimensageiro, isto é, uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência específica de nucleótidos no ADN e/ou ARN. 18 "Agente espessante" refere-se a qualquer um de uma variedade de materiais geralmente hidrófilos que, quando incorporados nas composições de lipidos e/ou vesículas aqui descritas, podem actuar como agentes modificadores de viscosidade, agentes emulsionantes e/ou solubilizantes, agentes de suspensão e agentes para aumentar a tonicidade. Considera-se que os agentes espessantes podem ser capazes de auxiliar na manutenção da estabilidade das composições, devido a tais propriedades. "Agente dispersante" refere-se a um agente tensioactivo que quando adicionado a um meio de suspensão de partículas coloidais incluindo, por exemplo, algumas das composições de lipidos e/ou vesículas aqui descritas, pode promover a separação uniforme de partículas. Nalgumas formas de realização preferidas, o agente dispersante pode compreender um composto de siloxano polimérico. "Artefacto de diagnóstico" refere-se geralmente a uma imperfeição, defeito e/ou falha numa imagem de diagnóstico incluindo, por exemplo, imagens de ultra-sons, tomografia computorizada e ressonância magnética que podem impedir e/ou dificultar a visualização de uma região de interesse. Os artefactos de diagnóstico podem manifestar-se como um escurecimento e/ou sombreado indesejado na imagem de diagnóstico. "Artefacto de ultra-sons", "artefacto de tomografia computorizada" e "artefacto de MRI" referem-se especificamente a artefactos de diagnóstico associados com ultra-sons, tomografia computorizada e MRI. 19 "Vesícula ecogénica" refere-se a uma vesícula que pode ser capaz de reflectir ondas de som incluindo, por exemplo, ondas de ultra-sons. As vesículas ecogénicas podem ser particularmente úteis como agentes de contraste, para alterar, por exemplo, as propriedades acústicas de uma região interna de um doente, resultando assim num contraste melhorado em técnicas de imagiologia de diagnóstico, tais como ultra-sons, tomografia computorizada e imagiologia por ressonância magnética. Numa forma preferida, as vesículas ecogénicas podem compreender vesículas cheias de gás. Alternativamente, as vesículas ecogénicas podem compreender vesículas que não contêm nenhum ou contêm, substancialmente, pouco gás ou precursor gasoso e que, em conjunto com bolhas ou glóbulos de um gás ou precursor gasoso, são suspensas num meio líquido na forma dividida. Nestas últimas formas de realização, é contemplado que a ecogenecidade e/ou alteração nas propriedades acústicas de uma região interna de um doente resulte, pelo menos, em ptécnica, da presença do gás ou precursor gasoso dividido. "Videodensidade" ou "Videodensitometria" refere-se à intensidade de dispersão de retorno de uma imagem de ultra-sons e pode ser utilizada para estimar a concentração do agente de contraste, especialmente de agentes de contraste baseados em vesículas, num tecido, por exemplo, tecido renal. Em termos gerais, a análise videodensitométrica envolve a utilização de um sistema de computador que é capaz de digitalizar uma região completa de dados de vídeo analógico, numa imagem digital com 512 x 512 pixels (elementos da figura) . Cada pixel pode ser representado por um, de um total de 256 níveis de cinzento que têm valores numéricos desde 0 até cerca de 255, em que 0 é branco (nenhum contraste) e 255 é preto (contraste total). Estes 20 níveis de cinzento podem também ser referidos como unidades de videodensitometria (VDU). "Clareza" refere-se ao nível de contraste numa imagem de diagnóstico incluindo, por exemplo, imagens de ultra-sons, tomografia computorizada e ressonância magnética, de uma região de interesse. Assim, em conjunção com a imagiologia de diagnóstico da região renal, o termo "clareza" refere-se ao nível de contraste de uma imagem de diagnóstico da região renal, incluindo o tecido do rim e a vasculatura a ele associada. "Imagem de diagnóstico melhorada" refere-se a uma imagem de diagnóstico que pode ser melhorada em relação a imagens de diagnóstico obtidas utilizando um ou mais métodos da técnica anterior e que pode ser obtida com os métodos da presente invenção. As imagens de diagnóstico melhoradas podem manifestar-se por um aumento da clareza na imagem de diagnóstico, eliminação substancial de artefactos de diagnóstico na imagem de diagnóstico e/ou semelhantes. Assim, em conexão com a imagiologia de diagnóstico da região renal, incluindo tecido renal e a vasculatura a ele associada, uma imagem de diagnóstico melhorada pode manifestar-se, por exemplo, por uma maior clareza na imagem de diagnóstico da região renal e/ou uma eliminação substancial da ocorrência de artefactos de diagnóstico na imagem de diagnóstico da região renal. "Clareza aumentada" refere-se a um aumento na clareza de uma imagem de diagnóstico que pode ser obtida com os métodos da presente invenção. De um modo preferido, os aumentos de clareza proporcionados pelos métodos da presente invenção, são, pelo menos, discerníveis a olho nu. Com particular referência à escala de cinzento (cerca de 0 a cerca de 255 VDU ou níveis de 21 cinzento) identificada acima, os métodos da presente invenção proporcionam, de um modo preferido, um aumento no nivel de clareza de, pelo menos, 10 VDU (niveis de cinzento). De um modo mais preferido, de acordo com a forma de realização aqui descrita, os métodos da presente invenção proporcionam uma clareza aumentada superior a cerca de 10 VDU, por exemplo, de cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 VDU. Noutras formas de realização, os presentes métodos podem proporcionar uma clareza aumentada superior a cerca de 100 VDU, por exemplo de cerca de 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ou 150 VDU. Ainda noutras formas de realização, os métodos da presente invenção podem proporcionar uma clareza aumentada superior a cerca de 150 VDU, por exemplo, cerca de 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 ou 200 VDU. Ainda noutras formas de realização, os presentes métodos podem proporcionar uma clareza aumentada superior a cerca de 200 VDU, por exemplo, cerca de 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250 ou 255 CDUs. "Eliminação substancial" refere-se à prevenção ou prevenção substancial da ocorrência de artefactos de diagnóstico numa imagem de diagnóstico. O termo "prevenção substancial", significa que, pelo menos, cerca de 50% dos artefactos podem ser eliminados pelos métodos da presente invenção, em comparação com, pelo menos, um método de diagnóstico da técnica anterior. De um modo preferido, pelo menos, cerca de 60% dos artefactos podem ser eliminados pelos métodos da presente invenção, em comparação com, pelo menos, um método de diagnóstico da técnica anterior, sendo mais preferida uma eliminação de, pelo menos, cerca de 70% dos artefactos. Ainda de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 80% dos artefactos podem ser eliminados pelos métodos da presente invenção em comparação com, pelo 22 menos, um método de diagnóstico da técnica anterior, sendo a eliminação de, pelo menos, cerca de 90% dos artefactos ainda mais preferida. Ainda de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 95% dos artefactos podem ser eliminados pelos métodos da presente invenção em comparação com, pelo menos, um método de diagnóstico da técnica anterior, sendo ainda mais preferida a eliminação de, pelo menos, cerca de 100%.

Os termos "administrada" e "administração", referem-se geralmente à administração a um doente, de um material biocompativel incluindo, por exemplo, composições de lípidos, polímeros ou proteínas e/ou de vesícula e/ou formulações aqui descritas. "Biocompativel" refere-se a materiais que são geralmente não prejudiciais para as funções biológicas e que não irão resultar em nenhum grau de toxicidade inaceitável, incluindo respostas alérgicas e estados patológicos. As composições e os seus componentes (tais como lípidos, proteínas, polímeros, gases, precursores gasosos, vasodilatadores, etc.) utilizados na presente invenção são tipicamente biocompatíveis. "Em combinação com" refere-se à co-administração de um agente bioactivo, tal como um vasodilatador renal, com um lípido, polímero ou proteína e/ou composição de vesícula. 0 termo "co-administração" significa que o agente bioactivo pode ser administrado antes, durante ou depois da administração da composição. Em formas de realização em que o agente bioactivo está incluído na composição, tal como numa formulação, o agente bioactivo pode ser combinado com a composição de vesículas, em qualquer de uma variedade de formas diferentes. Por exemplo, no caso de composições de vesículas, o agente bioactivo pode ser 23 aprisionado no vazio interno da vesícula. Além disso, o agente bioactivo pode ser integrado na(s) camada(s) ou parede(s) da vesícula, por exemplo, ao ser inter-disperso entre os lípidos, proteínas ou polímeros gue constituem a(s) camada(s) ou (parede (s) da vesícula. No caso de composições de lípidos, polímeros e/ou proteínas não de vesículaes, o agente bioactivo pode ser aprisionado entre ou no meio dos componentes de lípido, polímero e/ou proteína. Também se contempla que o agente bioactivo possa estar localizado na superfície da vesícula ou do lípido, polímero e/ou proteína não de vesícula. Neste caso, o agente bioactivo pode interagir quimicamente com a superfície interna ou externa da vesícula, ou do lípido, polímero e/ou proteína não de vesícula e permanecer substancialmente aderido nestes. Esta interacção pode tomar a forma de, por exemplo, interacções electrostáticas, ligações por hidrogénio, forças de van der Waal, ligação covalente ou outra interacção. Além disso, o agente bioactivo pode interagir com a superfície interna ou externa das vesículas, ou com o lípido, polímero e/ou proteína não de vesícula, de um modo limitado. Esta interacção limitada permitiria a migração do agente bioactivo, por exemplo, da superfície de uma primeira vesícula, até à superfície de uma segunda vesícula, ou da superfície de um primeiro lípido, polímero ou proteína não de vesícula, até à superfície de um segundo lípido, polímero ou proteína não de vesícula. "Vasodilatador renal" refere-se a um agente bioactivo que, quando administrado a um doente, provoca ou mantém a dilatação da vasculatura na região renal. Entende-se que inclui agentes que actuam directamente na vasculatura renal, bem como agentes que actuam indirectamente activando ou produzindo, ou provocando a activação ou produção in vivo, de outro agente que actua para provocar ou manter a dilatação da vasculatura na região renal. 24 "Isquémico" refere-se a uma deficiência de sangue, devido a uma constrição funcional ou obstrução efectiva de um vaso sanguíneo. A presente invenção é dirigida, em ptécnica, a composições para utilização em métodos melhorados para imagiologia de diagnóstico incluindo, por exemplo, métodos melhorados para proporcionar uma imagem de uma região interna de um doente, especialmente da região renal de um doente. Os métodos melhorados podem proporcionar imagens de diagnóstico melhoradas, como evidenciado, por exemplo, por uma maior clareza na imagem de diagnóstico e/ou eliminação substancial de artefactos de diagnóstico, na imagem de diagnóstico. Formas de realização da presente invenção envolvem a administração ao doente de um agente de contraste na forma de uma composição de lípido, polímero ou proteína compreendendo um lípido, polímero ou proteína e um gás ou precursor gasoso. Formas de realização da presente invenção também envolvem a administração ao doente de um agente de contraste na forma de uma composição de vesícula compreendendo vesículas e um gás ou precursor gasoso. 0 doente é submetido a análise utilizando imagiologia de diagnóstico, de um modo preferido ultra-sons, para obter uma imagem visível da região. Uma característica importante dos métodos da presente invenção é que, além disso ao agente de contraste, se administra um vasodilatador renal ao doente. É contemplado que o vasodilatador renal proporcione vantagens únicas em conjunção com métodos para imagiologia de diagnóstico, em especial ultra-sons, em relação a métodos para imagiologia de diagnóstico que estavam disponíveis até agora. Neste aspecto, os vasodilatadores renais são capazes de dilatar vasos sanguíneos na região renal de um doente. Isto, por sua vez, pode produzir uma alteração no 25 fluxo sanguíneo do doente, na região renal. Verificou-se surpreendente e inesperadamente que esta alteração no fluxo sanguíneo na região renal pode produzir alterações profundas na qualidade das imagens de diagnóstico da região renal. A presente invenção refere-se, pelo menos, em ptécnica, a explorar esta verificação surpreendente e inesperada, para proporcionar métodos melhorados para imagiologia de diagnóstico da região renal. A presente invenção proporciona um meio simples e eficaz para obter imagens melhoradas da região renal de um doente. A imagiologia de diagnóstico, tal como imagiologia por ultra-sons, da região renal, pode envolver a utilização de um agente de contraste, por exemplo, um agente de contraste compreendendo vesículas cheias com gás que são administradas intravenosamente. Após injecção, o agente de contraste pode ser transportado na corrente sanguínea até à região renal. Deve entender-se, obviamente que no curso normal da circulação sanguínea ao longo do sistema circulatório, o sangue que contém o agente de contraste irá fluir através dos rins e vasculatura associada. Pode-se aplicar energia, por exemplo ultra-sons e gerar-se uma imagem de diagnóstico da região renal. A base para a capacidade de detectar doenças no rim utilizando ultra-sons é a diferença das propriedades acústicas entre o sangue e os tecidos. É esperado que os agentes de contraste aumentem a diferença acústica entre o sangue e os tecidos envolventes, melhorando assim a capacidade de detecção de fluxo sanguíneo e, como resultado, a detecção de doenças envolvendo alterações no fluxo sanguíneo. Ao contrário da medicina nuclear, em que os radionuclidos auxiliam a determinar a função do rim, os ultra-sons determinam o fluxo sanguíneo e a estrutura da vasculatura renal. 26

Verificou-se de forma surpreendente e inesperada que em conjunção com métodos para imagiologia de diagnóstico da região renal que envolve a administração a um doente, de um agente de contraste que compreende lipidos, polímeros ou proteínas e um gás ou precursor gasoso e especialmente um agente de contraste compreendendo vesículas de lipidos, polímeros ou de proteínas e um gás ou precursor gasoso, a administração adicional de um vasodilatador renal pode melhorar, desejavelmente, a imagem de diagnóstico resultante. Apesar dos requerentes não pretenderem estar limitados a nenhuma teoria ou teorias de operação, pensa-se que as imagens de diagnóstico melhoradas podem ser devidas a uma alteração no fluxo sanguíneo renal, provocada pelo vasodilatador renal. Esta alteração no fluxo sanguíneo pode proporcionar imagens de diagnóstico melhoradas que se podem manifestar, por exemplo, por uma maior clareza e/ou eliminação substancial de artefactos de diagnóstico na imagem de diagnóstico. Pensa-se que a administração de um vasodilatador renal a um doente pode aumentar o fluxo sanguíneo e, portanto, a concentração de agente de contraste no tecido renal. Este aumento de agente de contraste no tecido renal pode proporcionar uma maior clareza nas imagens de diagnóstico da região renal e tecido renal que pode resultar numa melhor visualização do tecido. Pensa-se também que a administração de um vasodilatador renal pode aumentar o fluxo sanguíneo (e concentração de agente de contraste) no tecido renal, em relação ao fluxo sanguíneo (e concentração do agente de contraste) na vasculatura associada. Isto pode resultar numa redução ou eliminação substancial de artefactos de diagnóstico em imagens da região renal.

As manifestações físicas, mensuráveis, do fluxo sanguíneo através da artéria renal, são afectados por factores que provocam a dilatação ou constrição da artéria. Além disso, é 27 esperado que a ramificação de uma artéria em técnicariolas mais pequenas, como ocorre nalguns doentes, resulte num volume técnicarial menor e num aumento associado na pressão sanguínea. Pensa-se que os vasodilatadores renais invertem este efeito, aumentando assim o volume sanguíneo. Quando uma artéria renal é ramificada, uma ou mais das ramificações podem ser estenóticas e um segmento de um rim pode ser isquémico. A presente invenção pode ser utilizada no diagnóstico destas condições.

Um outro efeito de um vasodilatador renal é aumentar o fluxo sanguíneo diferencial entre um rim isquémico e um rim não isquémico. Isto por sua vez aumenta a diferença entre a videodensitometria do rim isquémico e o rim não isquémico na imagiologia de diagnóstico. Como discutido a seguir, o nível de dosagem do vasodilatador renal é determinado por vários factores, incluindo o peso corporal do doente, mas é de um modo preferido um nível suficiente para aumentar o fluxo sanguíneo num rim não isquémico.

Em formas de realização preferidas da presente invenção, administra-se um agente de contraste a um doente, faz-se uma imagiologia de ultra-sons da região renal, administra-se um vasodilatador renal e repete-se a imagiologia de ultra-sons. É esperado que um rim não isquémico exiba um aumento mais evidenciado no fluxo sanguíneo, devido ao vasodilatador renal, do que o rim isquémico. De facto, o maior fluxo sanguíneo provocado pelo vasodilatador renal aumenta a diferença na videodensitometria entre um rim isquémico e um rim não isquémico. 0 efeito do agente de contraste é, portanto, aumentado pela utilização do vasodilatador renal. Os renogramas resultantes podem ser analisados comparando a intensidade dos 28 sinais de imagem dos rins e da região renal, antes e depois da administração do vasodilatador renal. 0 grau de aumento no fluxo sanguíneo que pode ser proporcionado utilizando os métodos da presente invenção, pode variar e depende, por exemplo, da composição de lípidos e/ou vesículas particular administrada ao doente, do vasodilatador renal particular administrado ao doente, das dosagens respectivas da composição de lípido/vesícula e do vasodilatador renal administrado ao doente, e semelhantes. Em termos gerais, qualquer aumento no fluxo sanguíneo que é obtido utilizando os métodos da presente invenção pode proporcionar imagens de diagnóstico melhoradas. De acordo com formas de realização preferidas da presente invenção, podem obter-se imagens de diagnóstico melhoradas aumentando o fluxo sanguíneo em mais de cerca de 10%, por exemplo, cerca de 20, 30, 40 ou 50%. De um modo preferido, podem obter-se imagens de diagnóstico melhoradas aumentando o fluxo sanguíneo em mais de cerca de 50%, por exemplo, cerca de 60, 70, 80, 90 ou 100%, sendo mais preferidos aumentos de fluxo sanguíneo de mais de cerca de 100%, por exemplo, cerca de 110, 120, 130, 140 ou 150%. Ainda de um modo mais preferido, podem obter-se imagens de diagnóstico melhoradas, aumentando o fluxo sanguíneo em mais de cerca de 150%, por exemplo, cerca de 160, 170, 180 ou 190%, sendo ainda mais preferido um aumento de cerca de 200%. Nalgumas formas de realização particularmente preferidas, podem obter-se imagens de diagnóstico melhoradas, aumentando o fluxo sanguíneo em mais de cerca de 200%.

De acordo com a presente invenção, as alterações anteriores no fluxo sanguíneo, podem ser obtidas por administração a um doente de um vasodilatador renal. Assim, numa forma preferida, 29 os métodos envolvem a administração a um doente, de um agente de contraste em combinação com um vasodilatador renal. Em termos gerais, o vasodilatador renal utilizado na presente invenção pode ser administrado antes, durante e/ou após a administração do agente de contraste. Como seria evidente para um especialista na técnica, uma vez munido com a presente divulgação, a ordem de administração do agente de contraste e vasodilatador renal, bem como o modo como são administrados, pode ser variado, se desejado, como um meio de modular a imagem de diagnóstico resultante. Assim, os presentes métodos permitem que o especialista na técnica obtenha a informação desejada acerca do doente incluindo, por exemplo, a condição do tecido a ser visualizado, especialmente tecido renal, e o fluxo sanguíneo na região renal, o que poderá proporcionar informação a respeito da saúde global e bem estar do doente. Por exemplo, contempla-se que os presentes métodos possam inicialmente envolver uma administração contínua, ou infusão de um agente de contraste a um doente. Deste modo, poderá proporcionar-se na região renal do doente, um fluxo ou concentração substancialmente constantes de agente de contraste. A administração do vasodilatador renal pode proporcionar um fluxo sanguíneo aumentado na região renal do doente o que, por seu lado, pode proporcionar uma maior clareza na imagem de diagnóstico do tecido renal.

Em formas de realização que utilizam uma administração constante ou infusão de agente de contraste, a velocidade de resposta do doente ao vasodilatador renal pode também proporcionar informação a respeito da presença ou ausência de doença, incluindo doença renal, no doente. Especificamente, o tempo necessário para o doente responder ao vasodilatador renal, como evidenciado, por exemplo, pela velocidade de aumento no fluxo sanguíneo renal, poderá proporcionar informação 30 respeitante à integridade da artéria renal do doente. Assim, um doente substancialmente sem estenose da artéria renal, poderá responder de forma substancialmente mais rápida ao vasodilatador renal, tal como medido por um aumento no fluxo sanguíneo renal. Pelo contrário, um doente com estenose da artéria renal grave, poderá responder ao vasodilatador renal, a uma velocidade muito menor do que a velocidade a que o doente sem estenose responde.

Em formas de realização da presente invenção, os agentes de contraste podem compreender uma composição lipídica compreendendo um lípido e um gás ou precursor gasoso.

Relativamente às composições de lípidos, e especialmente composições de lípidos na forma de composições de vesículas, poderá ser vantajoso preparar as composições de lípidos a uma temperatura abaixo da temperatura de transição de fase de gel para líquido cristalino, dos lípidos envolvidos. Esta temperatura de transição de fase é a temperatura a que a camada bilipidica se converterá de um estado de gel num estado de liquido cristalino. Ver, por exemplo, Chapman et al., J. Biol. Chem. 1974 249, 2512-2521. É geralmente aceite que as vesículas que são preparadas a partir de lípidos que possuem temperaturas de transição de fase do estado de gel para o estado de líquido cristalino mais elevadas tendem a ter uma maior impermeabilidade, a qualquer temperatura particular. Ver Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers (CRC Press, Boca Raton, FL 1990) na p. 139, para as transições de fusão de cadeias principais, de diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas saturadas. As temperaturas de transição de fase do estado de gel para o estado de líquido cristalino de vários lípidos serão facilmente evidentes para os especialistas na técnica e estão descritas, por exemplo em Gregoriadis ed., 31

Liposome Technology, Vol I, 1-18 (CRC Press, 1984) . A tabela seguinte enumera alguns lípidos representativos e as suas temperaturas de transição de fase. TABELA 1

Diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas saturadas: Temperaturas de Transição de Fusão da Cadeia Principal Número de Carbonos nas Temperatura de Transição da Cadeia de Acilo Fase Principal (°C) 1,2-(12:0) -i,o 1,2-(13:0) 13,7 1,2-(14:0) 23,5 1,2-(15:0) 34,5 1,2-(16:0) 1—1 1,2-(17:0) 48,2 1,2-(18:0) 55,1 1,2-(19:0) 61,8 1,2-(20:0) 64,5 1,2-(21:0) 71,1 1,2-(22:0) 74,0 1,2-(23:0) 79, 5 1,2-(24:0) 80,1

Ver, por exemplo, Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers, p. 139 (CRC Press Boca Raton, FL 1990) .

Poderá ser possível aumentar a estabilidade de vesículas formuladas a partir de lípidos, incorporando nas composições 32 lipídicas, pelo menos, uma quantidade menor de, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moles percentuais, com base na quantidade total de lípidos utilizados, de um lipido carregado negativamente. Os lipidos carregados negativamente adequados, incluem, por exemplo, fosfatidilserina, ácido fosfatidico e ácidos gordos. Sem pretender estar cingido a nenhuma teoria ou teorias de operação, é contemplado que estes lipidos carregados negativamente poderão proporcionar uma maior estabilidade, ao contrapor a tendência das vesículas se romperem, fundindo-as umas às outras. Assim, os lípidos carregados negativamente podem actuar para estabelecer uma camada uniforme carregada negativamente na superfície exterior da vesícula que será repelida por uma superfície externa carregada de modo semelhante, noutras vesículas que possam estar próximas da primeira. Deste modo, as vesículas poderão ser menos propensas a ficarem numa proximidade que permita o toque umas com as outras, o que poderia levar à ruptura da membrana ou pele das respectivas vesículas e à consolidação ou fusão das vesículas em contacto, numa vesícula única, grande. Uma continuação deste processo de consolidação irá, obviamente, conduzir a uma degradação significativa das vesículas.

Os materiais lipídicos utilizados em determinadas das composições aqui descritas, especialmente em conjunção com composições de vesícula à base de lípidos, também são de um modo preferido flexíveis. Isto significa que, por exemplo, no caso de composições de vesículas à base de lípidos, as vesículas podem alterar a sua forma, por exemplo, para passar através de uma abertura com um diâmetro que é menor do que o diâmetro da vesícula. 33

Pensa-se que uma grande variedade de lípidos são adequados para incorporação nas composições de lipidos e/ou vesículas. Com referência particular a composições de vesículas, por exemplo, micelas e/ou lipossomas, pode utilizar-se quaisquer dos materiais ou suas combinações que são conhecidos dos especialistas na técnica como adequadas para a sua preparação. Os lipidos utilizados podem ser de origem natural, sintética ou semi-sintética. Como referido acima, os lipidos adequados incluem, geralmente, por exemplo, ácidos gordos, gorduras neutras, fosfatideos, glicolipidos, álcoois alifáticos e ceras, terpenos e esteróides.

Exemplos de lipidos que podem ser utilizados para preparar composições lipidicas incluem, por exemplo, ácidos gordos; lisolípidos; fosfocolinas; fosfatidilcolina com ambos, lipidos saturados e insaturados, incluindo dioleoilfosfatidilcolina; dimiristoilfosfatidilcolina; dipentadecanoilfosfatidilcolina; dilauroilfosfatidilcolina; dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); diestearoilfosfatidilcolina (DSPC); e diaraquidonilfosfatidilcolina (DAPC); fosfatidiletanolaminas, tais como dioleoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) e diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE); fosfatidilserina; fosfatidilgliceróis, incluindo diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG); fosfatidilinositol; esfingolípidos, tais como esfingomielina; glicolipidos, tais como gangliósido GM1 e GM2; glucolípidos; sulfatídeos; glicoesfingolípidos; ácidos fosfatidicos, tais como ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA) ácido diestearoilfosfatidico (DSPA); ácido palmítico; ácido esteárico; ácido araquidónico; ácido oleico; lipidos que têm polímeros biocompatíveis, tais como quitina, ácido hialurónico, polivinilpirrolidona ou polietilenoglicol (PEG), sendo estes 34 último também aqui referidos como "lípidos pegilados", em que os lípidos preferidos que possuem polímeros incluem DPPE-PEG que se refere ao lípido DPPE com um polímero de PEG a ele ligado incluindo, por exemplo, DPPE-PEG5000 que se refere a DPPE tendo ligado a ele um polímero de PEG com um peso molecular médio de cerca de 5000; lípidos possuindo mono-, di-, oligo- ou polissacáridos sulfonados; colesterol, sulfato de colesterol e hemissuccinato de colesterol; hemissuccinato de tocoferol; lípidos com ácidos gordos ligados a éter e éster; lípidos polimerizados (uma grande variedade dos quais são bem conhecidos na técnica); fosfato de diacetilo; fosfato de dicetilo; estearilamina; cardiolipina; fosfolípidos com ácidos gordos de cadeia curta, com cerca de 6 a cerca de 8 carbonos de comprimento; fosfolípidos sintéticos com cadeias de acilo assimétricas, tais como, por exemplo, uma cadeia de acilo de cerca de 6 carbonos e outra cadeia de acilo de cerca de 12 carbonos; ceramidas; lipossomas não-iónicos incluindo niossomas, tais como ésteres de polioxietileno de ácidos gordos, éteres de polioxietileno de álcoois gordos, ésteres polioxietilados de ácidos gordos de sorbitano, glicerol polietilenoglicol oxiestearato, glicerol polietilenoglicol ricinoleato, esteróis de óleo de soja etoxilados, óleo de rícino etoxilado, polímeros de polioxietileno-polioxipropileno e estearatos de polioxietileno de ácidos gordos; ésteres de esterol de ácidos alifáticos, incluindo sulfato de colesterol, butirato de colesterol, isobutirato de colesterol, palmitato de colesterol, estearato de colesterol, acetato de lanosterol, palmitato de ergosterol e n-butirato de fitoesterol; ésteres de esterol de ácidos glicídicos, incluindo glucurónido de colesterol, glucurónido de lanosterol, glucurónido de 7-desidrocolesterol, glucurónido de ergosterol, gluconato de colesterol, gluconato de lanosterol e gluconato de ergosterol; 35 ésteres de ácidos e álcoois de glícidos, incluindo glucorónido de laurilo, glucorónido de estearoilo, glucorónido de miristoilo, gluconato de laurilo, gluconato de miristoílo e gluconato de estearoilo; ésteres de glícidos e ácidos alifáticos, incluindo laurato de sacarose, laurato de frutose, palmitato de sacarose, estearato de sacarose, ácido glucurónico, ácido glucónico e ácido poliurónico; saponinas, incluindo sarsasapogenina, esmilagenina, hederagenina, ácido oleanólico e digitoxigenina; gliceróis, incluindo dilaurato de glicerol, trilaurato de glicerol, dipalmitato de glicerol, glicerol e ésteres de glicerol, tais como tripalmitato de glicerol, diestearato de glicerol, triestearato de glicerol, dimiristato de glicerol e trimiristato de glicerol; álcoois de cadeia longa, incluindo álcool n-decilico, álcool laurilico, álcool miristilico, álcool cetilico e álcool n-octadecilico; 6-(5-colesten-3P-iloxi)-l-tio-P-D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5-colesten-3P-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-l-tio-p-D-galactopiranósido; 6- (5-colesten-3P- iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-l-tio-OC-D-manopiranósido; ácido 12-(((7'-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)-metilamino)-octadecanóico; ácido N-[12-(((7'-dietilaminocumarin-3- il)carbonil)-metilamino)-octadecanoil]-2-aminopalmítico; colesteril)4'-trimetilamónio)butanoato; N-succinildioleoilfosfatidiletanolamina; 1,2-dioleoil-sn- glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; l-hexadecil-2-palmitoil-glicerofosfoetanolamina e palmitoil-homocisteína, e/ou suas combinações.

Se desejado, pode utilizar-se um lípido catiónico, tal como, por exemplo, cloreto de N-[1-(2,3-dioleoíloxi)propil] - 36 Ν,Ν,Ν-trimetilamónio (DOTMA), 1,2-dioleoíloxi-3- (trimetilamónio)propano (DOTAP); e 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamónio)-butanoil-sn-glicerol (DOTB). Quando se utiliza um lipido catiónico nas composições de lipidos, a razão molar entre o lipido catiónico e lipido não catiónico pode ser, por exemplo de cerca de 1:1000 a cerca de 1:100. De um modo preferido, a razão molar entre o lipido catiónico e lipido não catiónico pode ser de cerca de 1:2 a cerca de 1:10, sendo uma razão de cerca de 1:1 a cerca de 1:2,5 mais preferida. De um modo ainda mais preferido, a razão molar entre o lipido catiónico e lipido não catiónico pode ser de cerca de 1:1.

No caso de composições de lipidos que contêm ambos, lipidos catiónicos e não catiónicos, pode utilizar-se uma grande variedade de lipidos como lipido não catiónico. De um modo preferido, este lipido não catiónico compreende um ou mais de entre DPCC, DPPE e dioleoilfosfatidiletanolamina. Em substituição dos lipidos catiónicos enumerados acima, também se pode utilizar nas composições lipidicas, lipidos com polímeros catiónicos, tais como polilisina ou poliarginina, bem como fosfonatos de alquilo, fosfinatos de alquilo e fosfitos de alquilo.

Em formas de realização preferidas, as composições lipidicas compreendem fosfolípidos, em particular um ou mais de entre DPPC, DPPE, DPPA, DSPC, DSPE e DAPC (20 carbonos), sendo o DPPC, DPPE e/ou DPPA especialmente preferidos.

Também se podem utilizar ácidos gordos saturados e insaturados nas composições lipidicas aqui descritas e estes podem incluir moléculas que contêm de um modo preferido desde cerca de 12 carbonos até cerca de 22 carbonos, na forma linear 37 ou ramificada. Também se podem utilizar grupos de hidrocarbonetos que consistem de unidades isoprenóides e/ou grupos prenilo. Exemplos de ácidos gordos saturados que são adequados incluem, por exemplo ácido láurico, miristico, plamitico e esteárico. Ácidos gordos insaturados adequados que podem ser utilizados incluem, por exemplo, ácido lauroleico, fisetérico, miristoleico, linoleico, linolénico, palmitoleico, petroselinico e oleico. Exemplos de ácidos gordos ramificados que podem ser utilizados incluem, por exemplo, ácidos isoláurico, isomiristico, isopalmitico e isoesteárico.

Os métodos da presente invenção também podem envolver composições e vesículas formuladas a partir de proteínas ou seus derivados. As vesículas que são formuladas a partir de proteínas e que seriam adequadas para utilização na presente invenção estão descritas, por exemplo, em Feinstein, patentes U.S. N° 4572203, 4718433 e 4474958 e Cemy et al., patente U.S. N° 4957656. Outras vesículas baseadas em proteínas, além das descritas nas patentes acima referidas, serão evidentes para um especialista na técnica, uma vez munido da presente divulgação.

Além das composições lipídicas e/ou vesículas formuladas a partir de lípidos e/ou proteínas, os métodos da presente invenção também podem envolver composições e/ou vesículas formuladas a partir de polímeros que podem ser de origem natural, semi-sintética (natural modificada) ou sintética, sendo preferidos os polímeros semi-sintéticos e sintéticos. Tal como aqui utilizado, o termo polímero designa um composto consistindo de duas ou mais unidades monoméricas e, de um modo preferido 10 ou mais unidades monoméricas de repetição. A frase polímero semi-sintético (ou polímero natural modificado), tal como aqui utilizada, significa um polímero natural que foi quimicamente 38 modificado de algum modo. Exemplos de polímeros naturais adequados para utilização na presente invenção, incluem polissacáridos que ocorrem naturalmente. Estes polissacáridos incluem, por exemplo, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos (tais como, por exemplo, inulina), levano, fucoidano, carragenano, galactocarolose, ácido péctico, pectinas, incluindo amilose, pululano, glicogénio, amilopectina, celulose, dextrano, dextrina, dextrose, polidextrose, pustulano, quitina, agarose queratano, condroitano, dermatano, ácido hialurónico, ácido agínico, goma xantana, amido e vários outros homopolímeros ou heteropolímeros naturais, tais como os que contêm um ou mais dos seguintes aldoses, cetoses, ácidos ou aminas: eritrose, treose, ribose, arabinose, xilose, lixose, alose, atrose, glucose, manose, gulose, idose, galactose, talose, eritrulose, ribulose, xilulose, psicose, frutose, sorbose, tagatose, manitol, sorbitol, lactose, sacarose, tre-halose, maltose, celobiose, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina e ácido neuramínico, e os seus derivados que ocorrem naturalmente. Exemplos, de polímeros semi-sintéticos incluem carboximetilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose e metoxicelulose. Exemplos de polímeros sintéticos adequados para utilização na presente invenção incluem polietilenos (tais como, por exemplo, polietilenoglicol, polioxietileno e tereftalato de polietileno), polipropilenos (tal como, por exemplo, polipropilenoglicol), poliuretanos (tais como, por exemplo, poli(álcool vinílico) (PVA), poli(cloreto de vinilo) e polivinilpirrolidona), poliamidas incluindo nylon, poliestireno, poli(ácido láctico), hidrocarbonetos fluorados, hidrocarbonetos fluorados (tais como, por exemplo, politetrafluoroetileno), e poli(metacrilato de 39 metilo) e os seus derivados. Preferem-se os polímeros ou copolímeros sintéticos biocompatíveis, preparados a partir de monómeros, tais como ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenoimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxietilo (HEM), ácido láctico, ácido glicólico, ε-caprolactona, acroleína, cianoacrilato, cianometacrilato, bisfenol A, epicloridrina, acrilatos de hidroxialquilo, siloxano, dimetilsiloxano, óxido de etileno, etilenoglicol, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas substituídas em N, metacrilamidas substituídas em N, N-vinil-2-pirrolidona, 2,4-pentadieno-l-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-aminoestireno, p-aminobenzilestireno, estirenossulfonato de sódio, 2-sulfoxietilmetacrilato de sódio, vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo, cloreto de 2-metacriloíloxitrimetilamónio e polivinilideno, bem como as monómeros de reticulação polifuncionais, tais como N,N'-metilenobisacrilamida, dimetacrilatos de etilenoglicol, 2,2'- (p-fenilenodioxi)-dimetacrilato de dietilo, divinilbenzeno, trialilamina e metilenobis-(4-fenil-isocianato), incluindo suas combinações. Os polímeros preferidos incluem poli(ácido acrílico), polietilenoimina, poli(ácido metacrílico), poli(metacrilato de metilo), polissiloxano, polidimetilsiloxano, poli (ácido láctico), poli (ε-caprolactona), resina epoxi, poli (óxido de etileno), poli (etilenoglicol) e polímeros de poliamida (nylon). Copolímeros preferidos incluem polivinilideno-poliacrilonitrilo, polivinilideno-poliacrilonitrilo-polimetil-metacrilato, poliestireno-poliacrilonitrilo e polímeros de poli d, 1 láctido co-glicólido. Um copolímero preferido é polivinilideno-poliacrilonitrilo. Outros monómeros e polímeros biocompatíveis serão facilmente evidentes para os especialistas na técnica, uma vez munidos com 40 a presente descrição. Os métodos para a preparação de vesículas compreendendo polímeros serão facilmente evidentes para os especialistas na técnica, uma vez munidos com a presente divulgação, quando a presente descrição é acoplada com a informação conhecida na técnica, tal como a descrita e referida em Unger, Patente U.S. N° 5205290.

As vesículas derivadas de lípidos, proteínas ou polímeros, para utilização nos métodos da presente invenção, são de um modo preferido de densidade baixa. O termo "densidade baixa" refere-se a vesículas que têm um volume vazio interno (cavidade) que é, pelo menos, 75% do volume total da vesícula. De um modo preferido, as vesículas têm um volume vazio de, pelo menos, cerca de 80%, de um modo mais preferido de, pelo menos, cerca de 85%, de um modo ainda mais preferido de, pelo menos, cerca de 90%, de um modo ainda mais preferido de, pelo menos, 95% e de um modo ainda mais preferido de cerca de 100% do volume total das vesículas.

Como referido acima, as composições e/ou vesículas de lípido, proteína e polímero, utilizadas nos presentes métodos podem também compreender um gás, tal como um gás inerte. O gás pode proporcionar as composições e/ou vesículas de lípido, proteína ou polímero com capacidades de imagiologia melhoradas, tais como reflectividade de ultra-sons, particularmente em conjunção com composições de vesícula em que o gás é aprisionado dentro das vesículas. Isto poderá aumentar a eficácia das composições de vesículas como agentes de contraste.

Os gases preferidos são gases que são inertes e que são biocompatíveis, isto é gases que não são prejudiciais para a função biológica. Os gases preferidos incluem os seleccionados 41 do grupo consistindo de ar, gases nobre, tais como o hélio, rubidio, xénon hiperpolarizado, árgon hiperpolarizado, hélio hiperpolarizado, néon, árgon, xénon, dióxido de carbono, azoto, flúor, gases à base de enxofre, tais como hexafluoreto de enxofre e tetrafluoreto de enxofre, gases fluorados incluindo, por exemplo, gases parcialmente fluorados ou gases completamente fluorados. Exemplos de gases fluorados incluem os gases de fluorocarbonetos, tais como gases de perfluorocarbonetos e as suas misturas. Os gases paramagnéticos, tais como 1702, também podem ser utilizados nas composições de lipidos e/ou vesículas.

Em formas de realização preferidas, o gás utilizado nas composições aqui descritas compreende um gás fluorado. Estes gases fluorados incluem materiais que contêm, pelo menos, um ou mais do que um, átomo de flúor. Preferem-se gases que contêm mais do que um átomo de flúor, sendo mais preferidos os perfluorocarbonetos (isto é fluorocarbonetos totalmente fluorados, em que todos os átomos de hidrogénio no hidrocarboneto correspondente são substituídos por átomos de flúor). De um modo preferido, o gás de perfluorocarboneto é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano, perfluoropentano, perfluoro-hexano, perfluorociclobutano e as suas misturas. De um modo mais preferido, o gás de perfluorocarboneto é perfluoropropano ou perfluorobutano, sendo particularmente preferido o perfluoropropano. Um outro gás preferido é o hexafluoreto de enxofre. Ainda outro gás preferido é o heptafluoropropano, incluindo 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano e o seu isómero, 1,1,2,2,3, 3,3-heptafluoropropano. É contemplado que misturas de diferentes tipos de gases, tais como misturas de um gás de perfluorocarboneto e outro tipo de gás, tal como ar, também 42 possam ser utilizadas nas composições utilizadas nos métodos da presente invenção. Outros gases, incluindo os gases exemplificados acima, serão facilmente evidentes para o especialista na técnica, com base na presente descrição.

Nalgumas formas de realização preferidas, um gás, por exemplo ar ou um gás de perfluorocarboneto, é combinado com um perfluorocarboneto liquido, tal como perfluoropentano, perfluoro-hexano, perfluoro-heptano, brometo de perfluorooctilo (PFOB), perfluorodecalina, perfluorododecalina, iodeto de perfluorooctilo, perfluorotripropilamina e perfluorotributilamina.

Pode também ser desejável incorporar nas composições de lipidos e/ou vesículas, um precursor de uma substância gasosa.

Estes precursores incluem materiais que são capazes de ser convertidos num gás in vivo. De um modo preferido, o precursor gasoso é biocompativel e o gás produzido in vivo é também biocompativel.

De entre os precursores gasosos que são adequados para utilização nas composições de lipidos e/ou vesículas aqui descritas, referem-se os agentes que são sensíveis ao pH. Estes agentes incluem materiais que são capazes de libertar gás, por exemplo, quando expostos a um pH neutro ou ácido. Exemplos destes agentes sensíveis ao pH incluem sais de um ácido que é seleccionado do grupo consistindo de ácidos inorgânicos, ácidos orgânicos e as suas misturas. 0 ácido carbónico (H2C03) é um exemplo de um ácido inorgânico adequado e o ácido aminomalónico é um exemplo de um ácido orgânico adequado. Outros ácidos, incluindo ácidos inorgânicos e orgânicos, serão facilmente 43 evidentes para o especialista na técnica, com base na presente descrição.

Os precursores gasosos que derivam de sais são de um modo preferido seleccionados de entre o grupo consistindo por sais de metais alcalinos, sais de amónio e as suas misturas. De um modo mais preferido, o sal é seleccionado do grupo consistindo de carbonato, bicarbonato, sesquicarbonato, aminomalonato e as suas misturas.

Exemplos de materiais gasosos precursores adequados que são derivados de sais incluem, por exemplo, carbonato de litio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de litio, bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, carbonato de cálcio, bicarbonato de magnésio, carbonato de amónio, bicarbonato de amónio, sesquicarbonato de amónio, sesquicarbonato de sódio, aminomalonato de sódio e aminomalonato de amónio. 0 aminomalonato é bem conhecido na técnica e a sua preparação é descrita, por exemplo, em Thanassi, Biochemistry, vol. 9, N° 3, pág. 525-532 (1970); Fitzpatrick et al., Inorganic Chemistry, Vol. 13, N° 3 pág. 568-574 (1974); e

Stelmashok et al., Koordinatsionnaya Khimiya, Vol. 3, N° 4, pág. 524-527 (1977) .

Além de ou em vez de ser sensível a alterações de pH, os materiais precursores gasosos podem também compreender compostos que são sensíveis a alterações na temperatura. Exemplos de percursores gasosos adequados que são sensíveis a alterações de temperatura são os perfluorocarbonetos, hidrofluorocarbonetos, éteres de hidrocarbonetos, éteres de hidrofluorocarboneto e éteres de perfluorocarboneto. Estes últimos precursores gasosos são exemplificados, por exemplo, por gases anestésicos e do tipo 44 anestésico, por exemplo, haloetano, enflurano, isoflurano, desflurano e sevoflurano. Como o especialista poderá apreciar, um perfluorocarboneto particular pode existir no estado liquido, quando as composições de lipidos e/ou vesículas são primeiro preparadas e pode, assim, ser utilizado como um precursor gasoso. Alternativamente, o perfluorocarboneto pode existir no estado gasoso, quando as composições de lipidos e/ou vesículas são preparadas e pode, assim, ser utilizado directamente como um gás. 0 facto de o perfluorocarboneto ser utilizado como um líquido ou um gás, depende geralmente da sua temperatura de transição de fase líquido/gás ou ponto de ebulição. Por exemplo, um perfluorocarboneto preferido, o perfluoropentano, tem uma temperatura de transição de fase líquido/gás (ponto de ebulição) de 29,5 °C. Isto significa que o perfluoropentano é geralmente um líquido à temperatura ambiente (cerca de 25 °C), mas é convertido num gás dentro do corpo humano, cuja temperatura normal é de cerca de 37 °C, sendo esta temperatura acima da temperatura de transição do perfluoropentano. Assim, em circunstâncias normais, o perfluoropentano é um precursor gasoso. Como outro exemplo, há os homólogos do perfluoropentano, nomeadamente perfluorobutano e perfluoro-hexano. A transição líquido/gás do perfluorobutano é de 4 °C e a do perfluoro-hexano é de 57 °C. Assim, o perfluorobutano poderá ser útil como precursor gasoso, embora mais provavelmente como um gás, enquanto que o perfluoro-hexano pode ser útil como um precursor gasoso, devido ao seu ponto de ebulição relativamente elevado. Como é conhecido pelos especialistas na técnica, o ponto de ebulição efectivo de uma substância pode ser relacionado com a pressão a que a substância está exposta. Esta relação é exemplificada pela lei dos gases ideais, em que PV = nRT, em que P é a pressão, V é o volume, n é o número de moles da substância, R é a constante dos gases e T é a temperatura. A lei 45 dos gases ideais indica que à medida que a pressão aumenta, o ponto de ebulição efectivo também aumenta. Inversamente, à medida que a pressão diminui, o ponto de ebulição diminui.

Pode utilizar-se uma grande variedade de materiais como precursores gasosos sensíveis à temperatura, nas composições aqui descritas. É apenas necessário que o material seja capaz de sofrer uma transição de fase para a fase gasosa, quando submetido à temperatura adequada. Precursores gasosos adequados incluem, por exemplo, hexafluoroacetona, isopropilacetileno, aleno, tetrafluoroaleno, trifluoreto de boro, 1,2-butadieno, 2,3-butadieno, 1,3-butadieno, 1,2,3-tricloro-2-fluoro-l,3-butadieno, 2-metil-l,3-butadieno, hexafluoro-1,3-butadieno, butadiino, 1-fluorobutano, 2-metilbutano, perfluorobutano, 1- buteno, 2-buteno, 2-metil-l-buteno, 3-metil-l-buteno, perfluoro-l-buteno, perfluoro-2-buteno, 4-fenil-3-buten-2-ona, 2- metil-l-buten-3-ino, nitrato de butilo, 1-butino, 2-butino, 2-cloro-l,1,1,4,4,4-hexafluorobutino, 3-metil-l-butino, perfluoro-2-butino, 2-bromobutiraldeído, sulfureto de carbonilo, crotononitrilo, ciclobutano, metilciclobutano octafluorociclobutano, perfluorociclobuteno 3-clorociclopenteno, perfluorociclopentano octafluorociclopenteno, ciclopropano, perfluorociclopropano 1.2- dimetil-ciclopropano, 1,1-dimetil-ciclopropano, 1.2- dimetilciclopropano, etilciclopropano, metilciclopropano, diacetileno, 3-etil-3-metildiaziridina, 1,1,1-trifluorodiazoetano, dimetilamina, hexafluorodimetilamina, dimetiletilamina, bis (dimetilfosfina)amina, perfluoro-hexano, perfluoro-heptano, perfluorooctano, 2,3-dimetil-2-norbornano, perfluorodimetilamina, cloreto de dimetiloxónio, 1,3-dioxolan-2-ona, 4-metil-l,1,1,2-tetrafluoroetano, 1,1,1-trifluoroetano, 1.1.2.2- tetrafluoroetano, 1,1,2-tricloro-l,2,2-trifluoroetano, 46 1.1- dicloroetano, 1,1-dicIoro- 1,2,2,2-tetrafluoroetano, 1.2- difluoroetano, 1-cloro-l, 1,2,2,2-pentafluoroetano, 2-cloro- 1.1- difluoroetano, 1,l-dicloro-2-fluoroetano, 1-cloro-l,1,2,2- tetrafluoroetano, 2-cloro-l,1-difluoroetano, cloroetano, cloropentafluoroetano, diclorotrifluoroetano, fluoroetano, perfluoroetano, nitropentafluoroetano, nitrosopentafluoroetano, perfluoroetilamina, éter etilvinílico, 1,1-dicloroetano, 1.1- dicloro-l,2-difluoroetano, 1,2-difluoroetano, metano, cloreto de trifluorometanossulfonilo, fluoreto de trifluorometanossulfonilo, bromodifluoronitrosometano, bromofluorometano, bromoclorofluorometano, bromotrifluorometano, clorodifluoronitrometano, clorodinitrometano, clorofluorometano, clorotrifluorometano, clorodifluorometano, dibromodifluorometano, diclorodifluorometano, diclorofluorometano, difluorometano, difluoroiodometano, dissilanometano, fluorometano, iodometano, iodotrifluorometano, nitrotrifluorometano, nitrosotrifluorometano, tetrafluorometano, triclorofluorometano, trifluorometano, 2-metilbutano, éter metilico, éter metilisopropilico, lactato de metilo, metilnitrilo, sulfureto de metilo, éter metilvinilico, neopentano, óxido nitroso, éster 2-hidroxitrimetílico do ácido 1,2,3-nonadecanotricarboxílico, l-noneno-3-ino, 1,4-pentadieno, n-pentano, perfluoropentano, 4-amino-4-metilpentan-2-ona, 3-bromopent-l-eno, tetracloroftálico, propano, 1,2-epoxipropano, 2-cloropropano, 1-penteno, 2-penteno (cis e trans), perfluoropent-l-eno, ácido 2,3,6-trimetilpiperidina, 1.1.1.2.2.3- hexafluoropropano, 2,2-difluoropropano, 2-aminopropano, heptafluoro-l-nitropropano, heptafluoro-l-nitrosopropano, perfluoropropano, propeno, hexafluoropropano, 1.1.1.2.3.3- hexafluoro-2,3-dicloropropano, 1-cloropropano, cloropropano-(trans), 2-cloropropano, 3-fluoropropano, propino 47 3, 3, 3-trifluoropropino, 3-fluoroestireno, (di)-decafluoreto de enxofre (S2F10), 2,4-diaminotolueno, trifluoroacetonitrilo, peróxido de trifluorometilo, sulfureto de trifluorometilo, hexafluoreto de tungsténio, vinilacetileno e éter vinílico.

Os perfluorocarbonetos são ambos gases e precursores gasosos preferidos, para utilização em conjunção com as composições utilizadas nos métodos da presente invenção. Incluem-se entre os perfluorocarbonetos, os perfluorocarbonetos saturados, perfluorocarbonetos insaturados e perfluorocarbonetos cíclicos. Os perfluorocarbonetos saturados que são normalmente preferidos, têm a fórmula CnF2n+2, em que n é de 1 a cerca de 12, de um modo preferido de cerca de 2 a cerca de 10, de um modo mais preferido de cerca de 3 a cerca de 8, de um modo ainda mais preferido de cerca de 3 a cerca de 6. Os perfluorocarbonetos adequados incluem, por exemplo, perfluorometano, perfluoroetano, perfluoroproprano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluoropentano, perfluoro-hexano, perfluoro-heptano, perfluorooctano e perfluorononano. De um modo preferido, o perfluorocarboneto é seleccionado de entre o grupo consistindo de perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluoropentano, perfluoro-hexano, perfluoro-heptano e perfluorooctano, sendo o perfluoropropano particularmente preferido. Os perfluorocarbonetos cíclicos que têm a fórmula CnF2n, em que n é de 3 a 8, de um modo preferido 3 a 6, podem também ser preferidos e incluem, por exemplo, hexafluorociclopropano, octafluorociclobutano e decafluorociclopentano. Em termos gerais, os perfluorocarbonetos contendo cerca de 4 carbonos ou menos, são gases à temperatura ambiente, enquanto que os perfluorocarbonetos que contêm de cerca de 5 até cerca de 12 átomos de carbono são líquidos à temperatura ambiente. Em qualquer dos casos, ambos os 48 perfluorocarbonetos líquidos e/ou gasosos podem ser incorporados nas composições da presente invenção.

Além dos perfluorocarbonetos, poderá ser desejável utilizar fluorocarbonetos estáveis que não sejam completamente fluorados. Estes fluorocarbonetos incluem o heptafluoropropano, por exemplo, 1,1,1,2,3,3,3,-heptafluoeopropano e o seu isómero 1,1,2,2,3,3,3,-heptafluoropropano.

Os materiais precursores gasosos podem também ser materiais fotoactivados, tais como o ião diazónio e o aminomalonato. Algumas composições de lípidos e/ou vesículas e em particular as composições de vesículas, podem ser formuladas de modo a que o gás seja formado no tecido alvo, ou por acção do som na composição. Exemplos de precursores gasosos são descritos, por exemplo, na patente U.S. N° 5088499 e 5149319. Outros precursores gasosos, além dos exemplificados acima, serão evidentes para o especialista na técnica, com base na presente divulgação.

As substâncias gasosas e/ou precursores gasosos são de um modo preferido incorporados nas composições de lípidos e/ou vesículas, independentemente da natureza física da composição. Assim, contempla-se que as substâncias gasosas e/ou os seus precursores possam ser incorporados, por exemplo, em composições de lípidos, em que os lípidos são agregados ao acaso, bem como em composições de vesículas, incluindo composições de vesículas que são formuladas a partir de lípidos, tais como micelas e lipossomas. A incorporação das substâncias gasosas e/ou seus precursores, em composições de lípidos e/ou vesículas pode ser conseguida utilizando qualquer um de vários métodos. Por exemplo, no caso de vesículas à base de lípidos, a formulação de 49 vesículas cheias com gás pode ser conseguida, sacudindo ou agitando de outro modo, uma mistura aquosa que compreende um gás ou precursor gasoso e um ou mais lípidos. Isto promove a formação de vesículas estabilizadas, dentro das quais o gás ou precursor gasoso é encapsulado.

Além disso, pode borbulhar-se um gás directamente na mistura aquosa de compostos lipídicos e/ou formadores de vesículas. Alternativamente, pode utilizar-se um método de instilação de gás como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. N° 5352435 e 5228466. Métodos adequados para incorporação de gás ou precursores gasosos em composições de lípidos catiónicos são divulgados também na Patente U.S. N° 4865836. Outros métodos serão evidentes para o especialista na técnica, com base na presente descrição. De um modo preferido, o gás pode ser instilado nas composições de lípidos e/ou vesículas, após ou durante a adição do material estabilizador e/ou durante a formação de vesículas.

Em formas de realização preferidas, as substâncias gasosas e/ou materiais precursores gasosos são incorporados em composições de vesículas, sendo as micelas e lipossomas preferidos. Como discutido em pormenor a seguir, as vesículas em que um gás ou precursor gasoso ou ambos são encapsulados, são vantajosas, na medida em que proporcionam uma melhor reflectividade ín vivo.

Como discutido em maior pormenor mais à frente, é preferido que as composições de lípidos, e especialmente as composições de vesículas, sejam formuladas a partir de lípidos e compostos estabilizadores opcionais, para promover a formação de vesículas estáveis. Adicionalmente, também é preferido que as composições 50 de lípidos e/ou vesículas compreendam também um gás altamente estável. A frase "gás altamente estável" refere-se a um gás que tem uma solubilidade e difusibilidade limitadas, em meio aquoso. Exemplos de gases altamente estáveis incluem perfluorocarbonetos, dado que estes são geralmente menos difusíveis e relativamente insolúveis em meios aquosos. Deste modo, a sua utilização poderá promover a formação de vesículas altamente estáveis.

Nalgumas formas de realização, poderá ser desejável utilizar um composto fluorado, especialmente um composto perfluorocarboneto que pode estar no estado líquido à temperatura de uso das composições de lípidos e/ou vesículas incluindo, por exemplo, a temperatura in vivo do corpo humano, para auxiliar ou melhorar a estabilidade das composições de lípidos e/ou vesículas e especialmente as vesículas cheias com gás. Compostos fluorados adequados incluem, por exemplo, tensioactivos fluorados, tais como tensioactivos fluorados que estão disponíveis no mercado como ZONYL® (DuPont Company,

Wilmington, DE), bem como perfluorocarbonetos líquidos, tais como, por exemplo, brometo de perfluorooctilo (PFOB), perfluorodecalina, perfluorododecalina, iodeto de perfluorooctilo, perfluorotripropilamina e perfluorotributilamina. Em geral, os perfluorocarbonetos compreendendo cerca de seis ou mais átomos de carbono serão líquidos a temperatura normal do corpo humano. De entre estes perfluorocarbonetos, preferem-se o brometo de perfluorooctilo e perfluoro-hexano que são líquidos à temperatura ambiente. 0 gás que está presente pode ser, por exemplo, azoto ou perfluoropropano, ou pode ser derivado de um precursor gasoso que pode também ser um perfluorocarboneto, por exemplo, perfluoro-heptano. No último caso, as composições de lípidos 51 e/ou vesículas podem ser preparadas a partir de uma mistura de perfuorocarbonetos que, para os exemplos dados, seria o perfuoropropano (gás) ou perfuoropentano (precursor gasoso) e brometo de perfluorooctilo (líquido). Embora não pretendendo estar ligado a nenhuma teoria ou teorias de operação, pensa-se que no caso de composições de vesículas, o composto fluorado líquido, pode estar situado na interface entre o gás e a membrana ou parede da superfície da vesícula. Pode-se assim formar uma outra camada estabilizadora do composto fluorado líquido, na superfície interna do composto estabilizado, por exemplo, um lípido biocompatível utilizado para formar a vesícula, e esta camada de perfluorocarboneto pode também impedir que o gás se difunda através da membrana da vesícula. Um precursor gasoso, no contexto da presente invenção, é um líquido à temperatura de fabrico e/ou armazenamento, mas converte-se num gás, pelo menos, na, ou durante o tempo de utilização.

Assim, verificou-se que um composto fluorado líquido, tal como um perfluorocarboneto, quando combinado com um gás ou precursor gasoso normalmente utilizado para produzir as composições de lípidos e/ou vesículas aqui descritas, pode conferir um maior grau de estabilidade que de outro modo não se consegue obter com o gás ou precursor gasoso, sozinhos. Assim, está no âmbito da presente invenção, utilizar um gás ou precursor gasoso, tal como um precursor gasoso de perfluorocarboneto, por exemplo, perfluoropentano, juntamente com um perfluorocarboneto que permanece líquido após administração a um doente, isto é cuja temperatura de transição de fase de líquido para gás é acima da temperatura corporal do doente, por exemplo, o brometo de perfluorooctilo. Os tensioactivos perfluorados, tais como os tensioactivos fluorados ZONYL®, podem ser utilizados para estabilizar as composições de 52 lípidos e/ou vesículas e para actuar, por exemplo, como revestimento para as vesículas. Os tensioactivos perfluorados preferidos são os tensioactivos de fosfocolina parcialmente fluorada. Nestes tensioactivos fluorados preferidos, os compostos de alquilo duplos podem ser fluorados nas cadeias alquilo terminais e os carbonos proximais podem ser hidrogenados. Estes tensioactivos de fosfocolina fluorados podem ser utilizados para produzir as composições de lípidos e/ou vesículas direccionadas para um alvo, utilizadas nos métodos da presente invenção. A respeito das formas de realização que envolvem composições de vesículas, o tamanho das vesículas pode ser ajustado para a utilização final pretendida, particular incluindo, por exemplo, utilização em diagnóstico e/ou terapêutica. 0 tamanho das vesículas pode variar, de um modo preferido desde cerca de 30 nanómetros (30 nm) a cerca de 100 micrómetros (μιη) em diâmetro e todas as combinações e subcombinações de gamas nesta incluídas. De um modo mais preferido, as vesículas têm diâmetros de cerca de 100 nm até cerca de 10 μιη, sendo mais preferidos diâmetros de cerca de 200 nm até cerca de 7 μιη. Em relação a utilizações particulares, por exemplo, utilização intravascular, incluindo imagiologia de ressonância magnética da vasculatura, pode ser preferido que as vesículas não sejam maiores do que cerca de 30 μιη em diâmetro, sendo preferidas vesículas menores, por exemplo, vesículas com não mais do que cerca de 12 μιη de diâmetro. Nalgumas formas de realização preferidas, o diâmetro das vesículas pode ser de cerca de 7 μιη ou menos, sendo mais preferidas as vesículas que têm um diâmetro médio de cerca de 5 μιη ou menos e ainda mais preferidas, as vesículas com um diâmetro médio de cerca de 3 μιη 53 ou menos. É contemplado que estas vesículas menores possam sofrer perfusão nos canais vasculares mais pequenos, tais como a microvasculatura, proporcionando ao mesmo tempo espaço suficiente no canal vascular para permitir que os glóbulos vermelhos ultrapassem as vesículas. Também é contemplado que estas vesículas menores possam ser capazes de viajar através da vasculatura, mais ou menos à mesma velocidade de fluxo que o sangue, não impedindo assim substancialmente o fluxo sanguíneo normal. 0 tamanho das vesículas cheias com gás pode ser ajustado, se desejado, por uma variedade de processos incluindo, por exemplo, agitação, microemulsionamento, agitação em vortex, extrusão, filtração, sonicação, homogeneização, ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, extrusão sob pressão através de poros de tamanho definido e métodos semelhantes.

Como referido acima, as composições aqui utilizadas também podem incluir, em relação à sua preparação, formação e utilização, precursores gasosos que podem ser activados para transitar de um estado líquido ou sólido para um gás, por temperatura, pH, luz e energia (tal como ultra-sons). Os precursores gasosos podem ser convertidos em gás, por armazenamento dos precursores a pressão reduzida. Por exemplo, um frasco armazenado sob pressão reduzida pode criar um espaço livre de perfluoropentano ou perfluoro-hexano gasoso, útil para criar um gás pré-formado antes da injecção. De um modo preferido, os precursores gasosos podem ser activados por temperatura. A seguir apresenta-se uma tabela onde estão enumerados uma série de precursores que sofrem transições de fase de estados líquidos para gasosos, a temperaturas relativamente próximas da temperatura corporal normal (37 °C), 54 ou inferior e o tamanho das goticulas emulsionadas que seria necessário para formar uma vesícula com um tamanho máximo de 10 μιη. TABELA 2

Características Físicas de Precursores Gasosos e Diâmetro de Goticulas Emulsionadas para Formar uma Vesícula de 10 jjm* Composto Peso molecular Ponto de ebulição (°C) Densidade Diâmetro (μτη) de goticulas emulsionadas para preparar uma vesícula de 10 mícron Perfluoropentano 288,04 29,5 1,7326 2,9 1-fluorobutano 76,11 32,5 0,67789 1,2 2-metilbutano (isopentano) 72,15 27,8 0,6201 2,6 2-metil-l-buteno 70,13 31,2 0,6504 2,5 2-metil-2-buteno 70,13 38, 6 0,6623 2,5 l-buteno-3-ino-2- metilo 66,10 34,0 0,6801 2,4 3-metil-l-butino 68,12 29,5 0,6660 2,5 Octafluoro- ciclobutano 200,04 -5,8 1,548 2,8 Decafluorobutano 238,04 -2 1,517 3,0 Hexafluoroetano 138,01 -78,1 1, 607 2,7 55 *Fonte: Chemical Rubber Company Handbook of Chemistry and Physics, Robert C. West e David R. Lide, eds., CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida (1989-1990).

Os perfluorocarbonetos, tal como indicado, são preferidos para utilização como gases ou precursores gasosos, e também como componentes estabilizadores.

Como referido acima, é preferido optimizar a utilidade das composições de lípidos e/ou vesículas, especialmente composições de vesículas formuladas a partir de lípidos, utilizando gases de solubilidade limitada. A frase "solubilidade limitada" refere-se à capacidade do gás se difundir para fora das vesículas, em virtude da sua solubilidade no meio aquoso envolvente. Uma maior solubilidade no meio aquoso impõe um gradiente com o gás na vesícula, de tal modo que este poderá ter tendência para se difundir para fora da vesícula. Uma solubilidade menor em meio aquoso pode, por outro lado, diminuir ou eliminar o gradiente entre a vesícula e a interface, de modo que a difusão do gás para fora da vesícula pode ser impedida. De um modo preferido, o gás aprisionado na vesícula tem uma solubilidade inferior à do oxigénio que é de cerca de 1 ptécnica de gás em cerca de 32 ptécnicas de água. Ver Matheson Gas Data Book, 1966, Matheson Company Inc. De um modo mais preferido, o gás aprisionado na vesícula possui uma solubilidade em água inferior à do ar; e de um modo ainda mais preferido, o gás aprisionado na vesícula possui uma solubilidade em água inferior à do azoto.

Poderá ser desejável, nalgumas formas de realização, formular vesículas a partir de materiais poliméricos substancialmente impermeáveis. Nestas formas de realização, é geralmente desnecessário utilizar um gás que seja também 56 altamente insolúvel. Por exemplo, as composições de vesículas estáveis que compreendem materiais poliméricos substancialmente impermeáveis, podem ser formuladas com gases com solubilidades mais elevadas, por exemplo, ar ou azoto.

Além disso ou em vez dos compostos lipídicos e/ou poliméricos acima discutidos, as composições aqui descritas podem compreender um ou mais materiais estabilizadores. Exemplos destes materiais estabilizadores são, por exemplo, polímeros biocompatíveis. Os materiais estabilizadores podem ser utilizados para auxiliar desejavelmente na formação de vesículas e/ou para assegurar a encapsulação substancial dos gases ou precursores gasosos. Mesmo para gases relativamente insolúveis, não difusíveis, tais como perfluoropropano ou hexafluoreto de enxofre, podem-se obter composições de vesículas melhoradas quando um ou mais materiais estabilizadores são utilizados na formação de vesículas cheias com gás e precursor gasoso. Estes compostos podem auxiliar a melhorar a estabilidade e integridade das vesículas em relação ao seu tamanho, forma e/ou outros atributos.

Os termos "estável" ou "estabilizado", tal como aqui utilizados, significam que as vesículas podem ser substancialmente resistentes à degradação incluindo, por exemplo, perda da estrutura da vesícula ou gás encapsulado ou precursor gasoso, durante um período de tempo útil. Tipicamente, as vesículas utilizadas na presente invenção têm uma vida de armazenamento desejável, retendo muitas vezes, pelo menos, cerca de 90% em volume da sua estrutura original, durante um período de, pelo menos, cerca de duas a três semanas, sob condições ambiente normais. Em formas preferidas, as vesículas são desejavelmente estáveis durante um período de tempo de, pelo 57 menos, cerca de 1 mês, de um modo mais preferido de, pelo menos, cerca de 2 meses, de um modo ainda mais preferido de, pelo menos, cerca de 6 meses, de um modo ainda mais preferido de cerca de dezoito meses e de um modo ainda mais preferido de cerca de 3 anos. As vesículas aqui descritas, incluindo vesículas cheias com gás e precursores gasosos, podem também ser estáveis mesmo sob condições muito adversas, tais como temperaturas e pressões que são acima ou abaixo das que existem em condições ambiente normais. A estabilidade das vesículas aqui descritas pode ser atribuída, pelo menos, em ptécnica, aos materiais a partir dos quais as vesículas são feitas incluindo, por exemplo, os lípidos, proteínas e/ou polímeros acima descritos e não é muitas vezes necessário utilizar materiais estabilizadores adicionais, embora isso seja opcional e possa ser preferido. Estes materiais estabilizadores adicionais e as suas características são descritos em maior pormenor a seguir.

Os materiais a partir dos quais as vesículas são preparadas, são de um modo preferido lípidos, proteínas e/ou polímeros biocompatíveis e de entre estes, preferem-se os lípidos biocompatíveis. Além disso, devido à facilidade de formulação, incluindo a capacidade de preparar vesículas imediatamente antes da administração, estas vesículas podem ser convenientemente preparadas no local.

Formas de realização particularmente preferidas da presente invenção envolvem vesículas que compreendem três componentes: (1) um lípido neutro, por exemplo, um lípido não iónico ou zwiteriónico, (2) um lípido carregado negativamente e (3) um lípido com um material estabilizador, por exemplo, um polímero 58 hidrófilo. De um modo preferido, a quantidade de lipido carregado negativamente será maior do que cerca de 1 porcento molar do lipido total presente e a quantidade de lipido que possui um polimero hidrófilo será maior do que cerca de 1 porcento molar do lipido total presente. Exemplos de lipidos carregados negativamente, preferidos, incluem ácidos fosfatidicos. 0 lipido que tem um polimero hidrófilo será desejavelmente um lipido ligado de forma covalente ao polímero e o polimero terá de um modo preferido um peso molecular médio desde cerca de 400 até cerca de 100 000. Polímeros hidrófilos adequados são seleccionados de um modo preferido do grupo consistindo de polietilenoglicol (PEG), propilenoglicol, poli(álcool vinílico) e polivinilpirrolidona e os seus copolímeros, sendo preferidos os polímeros de PEG. De um modo preferido, o polímero de PEG tem um peso molecular desde cerca de 1000 até cerca de 7500, sendo mais preferidos pesos moleculares desde cerca de 2000 até cerca de 5000. O PEG ou outro polímero pode estar ligado ao lipido, por exemplo, DPPE, através de uma ligação covalente, tal como uma ligação amida, carbamato ou amina. Além disso, o PEG ou outro polímero pode ser ligado a um ligando para orientação para um alvo, ou outros fosfolipidos, com uma ligação covalente incluindo, por exemplo, ligações amida, éster, éter, tioéster, tioamida ou dissulfureto. Quando o polímero hidrófilo é PEG, diz-se que um lipido que tem um polímero deste tipo está "pegilado". Numa forma preferida, o lipido que tem um polimero hidrófilo pode ser DPPE-PEG; incluindo, por exemplo, DPPE-PEG5000 que se refere a DPPE com um polímero de polietilenoglicol de peso molecular médio de cerca de 5000 ligado a ele (DPPE-PEG5000). Outro lipido pegilado adequado é o diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenoglicol 5000 (DSPE-PEG5000). 59

Nalgumas formas de realização preferidas da presente invenção, as composições de lípidos podem incluir 77,5% molar de DPPC, 12,5% molar de DPPA e 10% molar de DPPE-PEG5000. Também se preferem composições que compreendem cerca de 80 até cerca de 90% molar de DPPC, cerca de 5 até cerca de 15% molar de DPPA e cerca de 5 até cerca de 15% molar de DPPE-PEG5000. Especialmente preferidas, são as composições que compreendem DPPC, DPPA e DPPE-PEG5000 numa razão de % molar de 82:10:8, respectivamente. O DPPC é substancialmente neutro, uma vez que a porção fosfatidilo está carregada negativamente e a porção de colina está carregada positivamente. Consequentemente, o DPPA que está carregado negativamente, pode ser adicionado para melhorar a estabilização, de acordo com o mecanismo descrito acima. O DPPE-PEG proporciona um material pegilado, ligado à membrana lipidica ou pele da vesicula pela unidade DPPE, em que a unidade PEG está livre para envolver a membrana ou pele da vesicula e formar, desse modo, uma barreira física a vários agentes enzimáticos ou outros agentes endógenos no corpo, cuja função é degradar estes materiais estranhos. O DPPE-PEG pode proporcionar mais vesículas de um tamanho menor que são seguras e estáveis à pressão, quando combinadas com outros lípidos, tais como DPPC e DPPA, em razões determinadas. Também há a teoria de que o material pegilado, devido à sua semelhança estrutural com a água, pode ser capaz de derrotar a acção dos macrófagos do sistema imunitário humano que teriam de outro modo, a tendência para envolver e remover o objecto estranho. O resultado é um aumento do tempo durante o qual as vesículas estabilizadas podem funcionar como meios de contraste para imagiologia de diagnóstico.

As composições de vesículas podem ser preparadas a partir de outros materiais, além dos materiais acima descritos, desde que as vesículas assim preparadas satisfaçam os critérios de 60 estabilidade e outros, aqui descritos. Estes materiais podem ser básicos e fundamentais e formar a base primária para criar ou estabelecer as vesículas cheias com gás e precursor gasoso, estabilizadas. Por outro lado, poderão ser auxiliares e actuar como agentes subsidiários ou suplementares que poderão potenciar o funcionamento do material ou materiais estabilizadores básicos ou contribuir com alguma propriedade desejada além das conferidas pelo material estabilizador básico.

No entanto, nem sempre é possível determinar se um dado material é um agente básico ou auxiliar, uma vez que o funcionamento do material em questão é determinado empiricamente, por exemplo, pelos resultados produzidos em relação à produção de vesículas estabilizadas. Como exemplos de como estes materiais básicos e auxiliares podem funcionar, verificou-se que a combinação simples de um lípido biocompatível e água, ou solução salina, quando agitados, origina muitas vezes uma solução nebulosa após a autoclavagem para esterilização. Esta solução nebulosa poderá funcionar como um agente de contraste, mas pode ser motivo de objecção estética e poderá implicar instabilidade na forma de partículas de lípido não dissolvidas ou não dispersas. As soluções nebulosas podem também ser indesejáveis quando a matéria de partículas não dissolvidas tem um diâmetro superior a cerca de 7 μιη e é especialmente maior do que cerca de 10 μιη. Os passos de fabrico, tais como filtração em condições estéreis, podem também ser problemáticos com soluções que contêm materiais de partículas, não dissolvidos. Assim, pode-se adicionar propilenoglicol para remover esta nebulosidade, facilitando a dispersão ou dissolução das partículas de lípido. O propilenoglicol pode também funcionar como agente humectante que pode melhorar a formação e 61 estabilização de vesículas, aumentando a tensão superficial na membrana ou pele da vesícula. É possível que o propilenoglicol também possa funcionar como camada adicional que pode revestir a membrana ou pele da vesícula, proporcionando assim estabilização adicional. Como exemplos destes outros materiais estabilizadores básicos ou auxiliares, podem-se utilizar tensioactivos convencionais; ver D'Arrigo patentes U.S. N° 4684479 e 5215680.

Outros materiais estabilizadores auxiliares e básicos incluem agentes como óleo de amendoim, óleo de colza, azeite, óleo de cártamo, óleo de milho, ou qualquer outro óleo vulgarmente conhecido como comestível que é adequado para utilização como composto estabilizador, de acordo com os ensinamentos aqui descritos. Divulgam-se vários estabilizadores auxiliares e básicos, por exemplo, no pedido de Patente com o N° de Série 08/444574, apresentado em 19 de Maio de 1995, cuja descrição é aqui incorporada por referência, na sua totalidade.

Adicionalmente, os compostos utilizados para produzir sistemas de micelas mistos podem ser adequados para utilização como materiais estabilizadores básicos ou auxiliares, e estes incluem, por exemplo, brometo de lauriltrimetilamónio (dodecil-), brometo de cetiltrimetilamónio (hexadecil-), brometo de miristiltrimetilamónio (tetradecil-), cloreto de alquildimetilbenzilamónio (em que alquilo é Ci2, Ci4 ou Ci6), brometo/cloreto de benzildimetildodecilamónio, brometo/cloreto de benzildimetil-hexadecilamónio, brometo/cloreto de benzildimetiltetradecilamónio, brometo/cloreto de cetildimetiletilamónio ou brometo/cloreto de cetilpiridínio.

Também se verificou que as vesículas cheias com gás ou precursor gasoso utilizadas na presente invenção podem ser 62 controladas de acordo com o tamanho, solubilidade e estabilidade ao calor, escolhendo de entre os vários materiais estabilizadores adicionais ou auxiliares, aqui descritos. Estes materiais podem afectar estes parâmetros das vesiculas, especialmente vesiculas formuladas a partir de lipidos, não só pela sua interacção fisica com as membranas, mas também pela sua capacidade de modificar a viscosidade e tensão superficial da superfície das vesículas cheias com gás e precursor gasoso. Assim, as vesículas cheias com gás e precursor gasoso utilizadas na presente invenção podem ser favoravelmente modificadas e posteriormente estabilizadas, por exemplo, por adição de um ou mais de uma grande variedade de (a) modificadores de viscosidade incluindo, por exemplo, hidratos de carbono e os seus derivados fosforilados e sulfonados; poliéteres, de um modo preferido com gamas de peso molecular entre 400 e 100000 e di- e tri-hidroxialcanos e os seus polímeros, de um modo preferido com pesos moleculares na gama entre 200 e 50000; (b) emulsionar e/ou solubilizar agentes incluindo, por exemplo, goma-arábica, colesterol, dietanolamina, monoestearato de glicerilo, álcoois de lanilona, lecitina, mono- e diglicéridos, mono-etanolamina, ácido oleico, álcool oleico, poloxâmero, por exemplo, poloxâmero 188, poloxâmero 184 e poloxâmero 181, polioxietileno 50 estearato, polioxil 35 óleo de rícino, polioxil 10 éter de oleilo, polioxil 20 éter cetoestearílico, polioxil 40 estearato, polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80, diacetato de propilenoglicol, monoestearato de propilenoglicol, laurilsulfato de sódio, estearato de sódio, monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, ácido esteárico, trolamina e cera emulsionante; (c) agentes de suspensão e/ou para aumentar a viscosidade incluindo, por exemplo, goma- arábica, agar, ácido algínico, monoestearato de aluminio, 63 bentonite, magma, carbómero 934P, carboximetilcelulose, cálcio e sódio e sódio 12, carragenano, celulose, dextrano, gelatina, goma de guar, goma de alfarroba, Veegum, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, silicato de magnésio e aluminio, Zeolites®, metilcelulose, pectina, óxido de polietileno, povidona, propilenoglicol, alginato, dióxido de silício, alginato de sódio, tragacanta, goma xantana, a-d-gluconolactona, glicerol e manitol; (d) agentes de suspensão sintéticos, tais como polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), poli (álcool vinílico) (PVA), polipropilenoglicol (PPG) e polissorbato; e (e) agentes para aumentar a tonicidade que estabilizam e aumentam a tonicidade incluindo, por exemplo, sorbitol, manitol, tre-halose, sacarose, propilenoglicol e glicerol.

Como discutido acima, as composições da presente invenção, incluindo vesículas cheias com gás e/ou precursor gasoso, são úteis como agentes de contraste para imagiologia de diagnóstico incluindo, por exemplo, imagiologia por ultra-sons (US) , imagiologia por tomografia computorizada (CT), incluindo angiografia CT (CTA), imagiologia por ressonância magnética (MR) , angiografia por ressonância magnética (MRA), medicina nuclear, imagiologia óptica e elastografia.

Ao realizar o método de imagiologia por ressonância magnética da presente invenção, o agente de contraste pode ser utilizado sozinho, ou em combinação com outros agentes de diagnóstico, terapêuticos ou outros. Estes outros agentes incluem excipientes tais como materiais aromatizantes ou corantes. As técnicas de imagiologia por ressonância magnética que são utilizadas são convencionais e estão descritas, por 64 exemplo, em D.M. Kean e M.A. Smith, Magnetic Resonance Imaging: Principies and Applications, (William e Wilkins, Baltimore 1986) . As técnicas de IMR contempladas incluem, mas não se limitam a, ressonância magnética nuclear (RMN) e ressonância de spin electrónico (RSE). A modalidade de imagiologia preferida é a RMN.

Exemplos de agentes de contraste paramagnéticos, adequados para utilização nas presentes composições incluem, por exemplo, radicais livres estáveis, tais como, por exemplo, nitróxidos estáveis, bem como compostos compreendendo elementos de transição, lantanideos e actinideos que podem, se desejado, estar na forma de um sal, ou podem ser ligados de forma covalente ou não covalente a agentes complexantes, incluindo seus derivados lipofilicos ou macromoléculas proteicas.

Os elementos de transição, lantanideos e actinideos preferidos incluem, por exemplo, Gd (III), Μη (II)) Cu (II), Cr (III) Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) e

Dy(III). De um modo mais preferido, os elementos podem ser

Gd (III), Μη (II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Eu(II) e Dy(III), especialmente Mn(II) and Gd(III) .

Os elementos anteriores podem, se desejado, estar na forma de um sal, incluindo sais inorgânicos, tais como um sal de manganésio, por exemplo, cloreto de manganésio, carbonato de manganésio, acetato de manganésio, e sais orgânicos, tais como gluconato de manganésio e hidroxilapatite de manganésio. Outros exemplos de sais incluem sais de ferro, por exemplo, sulfuretos de ferro e sais férricos, tais como cloreto férrico. 65

Estes elementos também podem, se desejado, ser ligados, por exemplo, através de associação covalente ou não covalente, a agentes complexantes, incluindo seus derivados lipofilicos, ou a macromoléculas proteicas. Os agentes complexantes preferidos incluem, por exemplo, ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 1,4,7,lO-tetraazaciclododecano-Ν,Ν',N",N"'-tetracético (DOTA), ácido 1,4,7, lO-tetraazaciclododecano-Ν,Ν',N"-triacético (DOTA), ácido 3,6,9-triaza-12-oxa-3,6,9-tricarboximetileno-10-carboxi-13-fenil-tridecanóico (B-19036), ácido hidroxibenziletilenodiaminadiacético (HBED), N,N'-bis(piridoxil-5-fosfato)etilenodiamina, N,N'-diacetato (DPDP), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,Ν',N"-triacético (NOTA), ácido 1,4,8,ll-tetraazaciclotetradecano-N,N',N",N"'-tetracético (TETA), criptandos (complexos macrociclicos) e desferrioxamina. De um modo mais preferido, os agentes complexantes são EDTA, DTPA, DOTA, D03A e criptandos, de um modo mais preferido DTPA. Os complexos lipofilicos preferidos incluem derivados alquilados dos agentes complexantes EDTA, DOTA, por exemplo, Ν,Ν'-bis-(carboxidecilamidometil-N-2,3-di-hidroxipropil)-etilenodiamina-N,N'-diacetato (EDTA-DDP); N,N'-bis- (carboxioctadecilamidometil-N-2,3-di-hidroxipropil)-etilenodiamina-Ν,Ν'-diacetato (EDTA-ODP); N,Ν'-Bis(carboxi-laurilamidometil-N-2, 3-di- hidroxipropil) etilenodiamina-N,N'-diacetato (EDTA-LDP); e semelhantes, incluindo os descritos na Patente U.S. N° 5312617, cuja descrição é aqui incorporada para referência, na sua totalidade. As macromoléculas proteicas preferidas incluem, por exemplo, albumina, colagénio, poliarginina, polilisina, poli-histidina, γ-globulina e β-globulina, sendo a albumina, poliarginina, polilisina e poli-histidina mais preferidas. 66

Por conseguinte, os complexos adequados incluem Μη(II)-DTPA, Μη(II)-EDTA, Μη(II)-DOTA, Mn(II)-D03A, Μη (II)-criptandos, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-D03A, Gd(III)-criptandos, Cr (III)-EDTA, Cu(II)-EDTA, ou ferro-desferrioxamina, especialmente Μη(II)-DTPA ou Gd(III)-DTPA.

Os nitróxidos são agentes de contraste paramagnéticos que aumentam ambas as velocidades de relaxamento, TI e T2, em MRI, devido à presença de um electrão desemparelhado na molécula de nitróxido. Como é conhecido dos especialistas na técnica, a eficácia paramagnética de um dado composto, como agente de contraste de MRI, pode ser relacionada, pelo menos, em ptécnica, com o número de electrões desemparelhados no núcleo ou molécula paramagnética e, especificamente, com o quadrado do número de electrões desemparelhados. Por exemplo, o gadolínio tem sete electrões desemparelhados, enquanto que a molécula de nitróxido tem um electrão desemparelhado. Assim, o gadolínio é geralmente um agente de contraste de MRI muito mais forte do que o nitróxido. No entanto, o tempo de correlação efectivo, um outro parâmetro importante para determinar a eficácia dos agentes de contraste, confere um relaxamento potencialmente maior aos nitróxidos. Quando a velocidade de revirar é retardada, por exemplo, ligando um agente de contraste paramagnético a uma molécula grande, este irá revirar mais devagar e transferir, assim, energia de um modo mais eficaz, para apressar a relaxação dos protões da água. No gadolínio, no entanto, o tempo de relaxação de spin electrónico é rápido e irá limitar a extensão em que os tempos de correlação rotacional lentos podem aumentar a relaxação. Para os nitróxidos, no entanto, os tempos de correlação de spin electrónico são mais favoráveis e pode obter-se grandes aumentos na relaxação, retardando o tempo de correlação rotacional destas moléculas. As vesículas cheias de 67 gás da presente invenção são ideais para se obter os objectivos de tempos de correlação rotacional retardados e a melhoria resultante na relaxação. Embora não pretendendo estar ligado a nenhuma teoria de operação particular, é contemplado que, uma vez que os nitróxidos podem ser concebidos para revestir os perímetros das vesículas, por exemplo, preparando os seus derivados de alquilo, os tempos de correlação resultantes podem ser optimizados. Além disso, o meio de contraste resultante da presente invenção pode ser visto como uma esfera magnética, uma configuração geométrica que maximiza a relaxação.

Se desejado, os nitróxidos podem ser alquilados, ou de outro modo derivatizados, tais como os nitróxidos 2,2,5,5-tetrametil-l-pirrolidiniloxilo, radical livre, e 2,2,6,β-tetrametil-l-piperidiniloxilo, radical livre (TMPO).

Exemplos de agentes de contraste superparamagnéticos, adequados para utilização nas composições da presente invenção, incluem óxidos e sulfuretos de metais que têm um domínio magnético, compostos de ferro ou ferrimagnéticos, tais como ferro puro, óxido de ferro magnético, tal como magnetite, γ-Fe203, Fe304, ferrite de manganésio, ferrite de cobalto e ferrite de níquel. Os gases paramagnéticos também podem ser utilizados nas presentes composições, tais como oxigénio 17 gasoso (1702) . Além disso, também se pode utilizar gás xénon, néon ou hélio hiperpolarizado. A imagiologia de corpo inteiro por MR pode ser utilizada para analisar rapidamente o corpo, por exemplo, quanto à presença de uma trombose, e pode aplicar-se ultra-sons, se desejado, para auxiliar na trombólise.

Os agentes de contraste, tais como os agentes de contraste paramagnéticos e supermagnéticos acima descritos, podem ser 68 utilizados como um componente nas composições de lipidos, proteínas, polímeros e/ou vesículas. No caso de composições de vesículas, os agentes de contraste acima referidos podem ser aprisionados no seu vazio interno, administrados como uma solução com as vesículas, incorporados com um material de estabilização adicional ou revestidos na superfície ou membrana da vesícula.

Se desejado, os agentes paramagnéticos ou supermagnéticos podem ser fornecidos como derivados alquilados ou outros, incorporados nas composições, especialmente as paredes lipídicas das vesículas. Em particular, os nitróxidos 2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxilo, radical livre e 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxilo, radical livre, podem formar adições com ácidos gordos de cadeia longa, nas posições do anel que não estão ocupadas pelos grupos de metilo, através de uma variedade de ligações incluindo, por exemplo, uma ligação acetiloxilo. Estas adições são muito passíveis de incorporação em composições de lipidos e/ou vesículas da presente invenção.

Pode utilizar-se misturas de qualquer um ou mais dos agentes paramagnéticos e/ou supermagnéticos na presente composição. Os agentes paramagnéticos e supermagnéticos podem ser também co-administrados separadamente, se desejado.

As composições de lipidos, proteínas, polímeros e/ou vesículas da presente invenção e especialmente as composições de vesículas, podem servir não só como transportadores eficazes dos agentes supermagnéticos descritos acima, mas também podem melhorar o efeito da susceptibilidade dos agentes de contraste. Os agentes de contraste supermagnéticos incluem óxidos de metais, particularmente óxidos de ferro, mas incluindo óxidos de 69 manganésio, como óxidos de ferro, contendo quantidades variáveis de manganésio, cobalto e níquel que têm um domínio magnético. Estes agentes são nano ou micropartículas e têm susceptibilidades globais muito elevadas e velocidades de relaxação transversas. As partículas maiores, por exemplo, partículas com diâmetros de cerca de 100 nm, têm relaxações R2 muito maiores, em comparação com relaxações RI. As partículas menores, por exemplo, partículas com diâmetros de cerca de 10 a cerca de 15 nm, têm relaxações R2 um pouco menores, mas valores de Rl e R2 muito mais equilibrados. Partículas muito menores, por exemplo, partículas de óxido de ferro monocristalinas com diâmetros de cerca de 3 a cerca de 5 nm, têm relaxações R2 menores, mas provavelmente as velocidades de relaxação Rl e R2 mais equilibradas. A ferritina também pode ser formulada para encapsular um núcleo de ferro superparamagnético com uma velocidade de relaxação muito elevada. Verificou-se que as composições de lípidos e/ou vesículas, especialmente as composições de vesículas, incluindo vesículas cheias com gás, podem aumentar a eficácia e segurança destes agentes de contraste de MRI, baseados em óxido de ferro convencional.

Os óxidos de ferro podem ser simplesmente incorporados nas composições de lípidos e/ou vesículas. De um modo preferido, no caso de vesículas formuladas a partir de lípidos, os óxidos de ferro podem ser incorporados nas paredes das vesículas, por exemplo, sendo absorvidos nas superfícies das vesículas, ou aprisionados no interior das vesículas, como descrito na Patente U.S. 5088499, cuja descrição é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Sem pretender estar vinculado a nenhuma teoria ou teorias de operação particulares, pensa-se que as composições da 70 presente invenção, e especialmente as composições de vesículas, aumentam a eficácia dos agentes de contraste superparamagnéticos por vários mecanismos. Primeiro, pensa-se que as vesículas funcionam para aumentar a concentração magnética aparente das partículas de óxido de ferro. Além disso, pensa-se que as vesículas aumentam o tempo de correlação rotacional aparente dos agentes de contraste de MRI, incluindo agentes paramagnéticos e supermagnéticos, de modo que as velocidades de relaxação aumentam. Além disso, as vesículas parecem aumentar o domínio magnético aparente do meio de contraste, de acordo com o modo descrito mais a frente.

Algumas das vesículas da presente invenção e especialmente vesículas formuladas a partir de lípidos, podem ser visualizadas como domínios esféricos flexíveis com susceptibilidades diferentes do meio de suspensão incluindo, por exemplo, a suspensão aquosa do meio de contraste ou sangue, ou outros fluidos corporais, por exemplo, no caso de injecção intravascular ou injecção noutros locais do corpo. No caso de ferrites ou partículas de óxido de ferro, deve ter-se em conta que o contraste proporcionado por estes agentes depende do tamanho da partícula. Este fenómeno é muito comum e é muitas vezes referido como a relaxação "secular" das moléculas de água. Descrito em termos mais físicos, este mecanismo de relaxação depende do tamanho efectivo do complexo molecular de que faz ptécnica um átomo paramagnético ou molécula, ou moléculas paramagnéticas. Uma explicação física pode ser descrita nas seguintes equações de Solomon-Bloemberg que definem as contribuições paramagnéticas como uma função dos tempos de relaxação Ti e T2 de um núcleo com um spin ^ com um raio giromagnético g, perturbado por um ião paramagnético: 71

1/Γ,Μ = (2/15) S(S +1) vW/r* [3τ/(1 + ω,20 + 7V(1 + (o,V)] + (2/3) S(S+1) A2/h2 [τβ/(1 + 6>s20J e 1/T2M = (1/15) S(S + 1) v2g2p2/r6 [4tc + 3tc/(l +ω,2τ{2) + 13τ/(1 +ws2tc2)] + (1/3)S(S+ l)A2/h2[te/(l + <ús2xe2)] em que: S é o número quântico de spin electrónico g é o factor g electrónico β é o magnetão de Bohr; ωΐ e G)s (657 Wi) são as frequências de precessão angular de Larmor para os spins nucleares e spins electrónicos; r é a distância ião-núcleo A é a constante de acoplamento hiperfina; xc e Xe são os tempos de correlação para as interacções dipolar e escalar, respectivamente; e h é a constante de Planck. ver, e. g., Solomom, I. Phys Ver. Vol. 99, pág. 559 (1955) e Bloembergen, N. J. Chem. Phys. Vol., 27, pág. 572, 595 (1957).

Algumas partículas grandes poderão ter um efeito muito maior do que um grande número de partículas muito mais pequenas, essencialmente devido a um maior tempo de correlação. Se se pretendesse produzir partículas de óxido de ferro muito grandes, no entanto, poderia resultar uma toxicidade maior e os pulmões poderiam sofrer uma embolia, ou todo o sistema de cascata do complemento poderia ser activado. Além disso, pensa-se que o tamanho total da partícula não é tão importante como o diâmetro 72 da partícula no seu limite ou superfície exterior. 0 domínio de magnetização ou efeito de susceptibilidade cai exponencialmente a partir da superfície da partícula. Em termos gerais, no caso de mecanismos de relaxação dipolares (através dos espaço), esta queda exponencial exibe dependência de r6 para uma interacção dipolo-dipolo paramagnética. Interpretado à letra, um molécula de água que esteja 4 angstrons distante de um superfície paramagnética será influenciada 64 vezes menos, do que uma molécula de água que esteja a 2 angstrons de distância da mesma superfície paramagnética. A situação ideal em termos de maximização do efeito de contraste seria tornar as partículas de óxido de ferro ocas, flexíveis e tão grandes quanto possível. Não tem sido possível conseguir isto, até agora, e pensa-se que os benefícios eram também desconhecidos até agora. Ao revestir as paredes interna e externa das vesículas com os agentes de contraste, mesmo quando os agentes de contraste individuais, por exemplo, nanopartículas de óxido de ferro ou iões paramagnéticos, são estruturas relativamente pequenas, a eficácia dos agentes de contraste pode ser grandemente melhorada. Ao fazê-lo, os agentes de contraste poderão funcionar como uma esfera efectivamente muito maior, em que o domínio de magnetização efectivo é determinado pelo diâmetro da vesícula e é máximo na superfície da vesícula. Estes agentes têm a vantagem de flexibilidade, nomeadamente, concordância. Enquanto que as vesículas rígidas se podem alojar nos pulmões ou outros órgãos e provocar reacções tóxicas, estas vesículas flexíveis deslizam através dos capilares com muito mais facilidade.

Ao contrário das vesículas flexíveis descritas acima, poderá ser desejável, nalgumas circunstâncias, formular vesículas a partir de materiais substancialmente impermeáveis, tais como materiais poliméricos incluindo, por exemplo, 73 poli(metacrilato de metilo). Isto resultaria geralmente na formação de vesículas que podem ser substancialmente impermeáveis e relativamente não elásticas e quebradiças. Em formas de realização envolvendo imagiologia de diagnóstico, por exemplo, ultra-sons, os meios de contraste que compreendem estas vesículas quebradiças não proporcionariam, geralmente, a reflectividade desejável que as vesículas flexíveis podem proporcionar. No entanto, aumentando a potência de saída nos ultra-sons, as vesículas quebradiças poderão romper, provocando assim emissões acústicas que podem ser detectadas por um transdutor de ultra-sons. A imagiologia por medicina nuclear (NMI) também pode ser utilizada em conjunção com os aspectos de métodos de diagnóstico e terapêuticos da presente invenção. Por exemplo, a NMI pode ser utilizado para detectar gases radioactivos, tais como Xe133 que pode ser incorporado nas presentes composições, além de, ou em vez dos gases acima discutidos. Estes gases radioactivos podem ser aprisionados nas vesículas, para utilização na detecção, por exemplo, de trombose. De um modo preferido, os derivados de quelato bifuncionais são incorporados nas paredes das vesículas e as vesículas resultantes podem ser utilizadas em ambos, NMI e ultra-sons. Neste caso, podem-se incorporar nas paredes das vesículas, isótopos para imagiologia por medicina nuclear, de alta qualidade, de energia elevada, tais como tecnécio99m ou índio111. Podem-se utilizar então câmaras de varrimento gama de todo o corpo, para localizar rapidamente regiões de absorção de vesículas in vivo. Se desejado, também se podem utilizar ultra-sons para confirmar a presença, por exemplo, de um coágulo dentro dos vasos sanguíneos, uma vez que os ultra-sons geralmente proporcionam uma resolução melhorada, em comparação com técnicas de medicina nuclear. A NMI também pode ser 74 utilizada para pesquisar todo o corpo do doente, para detectar áreas de trombose vascular e podem-se aplicar ultra-sons a estas áreas, localmente, para promover a ruptura das vesículas e tratar o coágulo.

Como referido acima, as presentes composições também podem ser utilizadas em conjunção com imagiologia por tomografia computorizada (CT). A CT sofre de vários reveses e é geralmente menos eficaz em comparação com as técnicas de diagnóstico discutidas acima. Apesar de tudo, se uma concentração suficientemente elevada dos presentes meios de contraste e especialmente composições de vesículas cheias com gás, for fornecida à região de interesse, por exemplo, um coágulo de sangue, o coágulo pode ser detectado nas imagens de CT, devido a uma diminuição na densidade global do coágulo. Em geral, poderá ser necessária uma concentração de cerca de 1/10 de 1% de vesículas cheias com gás, ou superior (numa base de volume), para serem fornecidas à região de interesse, incluindo o coágulo de sangue acima referido, a ser detectado por CT.

Além disso, para imagiologia óptica, podem-se incorporar nas presentes composições gases opticamente activos, tais como árgon ou néon. Além disso, podem-se também utilizar materiais opticamente activos, por exemplo, materiais fluorescentes, incluindo derivados de porfirina. A elastografia é uma técnica de imagiologia que geralmente utiliza uma frequência de som muito menor, por exemplo, cerca de 60 KHz, em comparação com os ultra-sons que podem envolver frequências de mais de 1 MHz. Na elastografia, a energia do som é geralmente aplicada ao tecido e a elasticidade do tecido pode ser então determinada. As vesículas à base de lípidos aqui descritas são de um modo preferido altamente elásticas e podem aumentar a elasticidade 75 local do tecido para o qual são direccionadas. Esta maior elasticidade pode então ser detectada por elastografia. Se desejado, a elastografia pode ser utilizada em conjunto com outras técnicas de imagiologia, tais como MRI ou ultra-sons.

Uma grande variedade de métodos estão disponíveis para a preparação de composições de lípidos, proteínas, polímeros e/ou vesículas, tais como micelas e/ou lipossomas. Incluem-se entre estes métodos, por exemplo, a agitação, secagem, instalação de gás, secagem por pulverização e semelhantes. Métodos adequados para preparar composições de vesículas a partir de lípidos estão descritos, por exemplo, em Unger et al., Patente U.S. N° 5469854. Como referido acima, as vesículas são de um modo preferido preparadas a partir de lípidos que permanecem no estado de gel.

Com referência particular à preparação de composições de micelas, proporciona-se a discussão seguinte. As micelas podem ser preparadas utilizando qualquer um de uma variedade de métodos de preparação micelar convencionais que serão evidentes para os especialistas na técnica. Estes métodos envolvem tipicamente, suspensão de um ou mais compostos lipídicos num solvente orgânico, evaporação do solvente, ressuspensão num meio aquoso, sonicação e centrifugação. Os métodos anteriores, bem como outros, são discutidos, por exemplo, em Canfield, et al., Methods in EnzymLogy, Vol. 189, pág. 418-422 (1990); El-Gorab et al., Biochem. Biophys. Acta, Vol. 306, pág. 58-66 (1973); Colloidal Surfactant, Shinoda, K., Nakagana, Tamamushi e Isejura, Academic Press, NY (1963) (especialmente "The Formation of Micelles", Shinoda, Capítulo 1, pág. 1-88); Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Fendler e Fendler, Academic Press, NY (1975). 76

Como referido acima, a composição de vesículas pode compreender lipossomas. Está disponível uma grande variedade de métodos no que se refere à preparação de composições de lipossomas. Assim, os lipossomas podem ser preparados utilizando qualquer um de uma variedade de técnicas de preparação de lipossomas convencionais que serão evidentes para os especialistas na técnica. Estas técnicas incluem, por exemplo, diálise de solvente, prensa francesa, extrusão (com ou sem congelamento-descongelamento), evaporação de fase inversa, congelamento-descongelamento simples, sonicação, diálise de quelatos, homogeneização, infusão de solventes, microemulsificação, formação espontânea, vaporização de solvente, diálise de solvente, técnica de células com prensa francesa, diálise de detergente controlada e outras, envolvendo cada uma a preparação de vesículas de vários modos. Ver, e. g. Madden et al., Chemistry and Physics of Lipids, 1990 53, 37-46. Técnicas de congelação-descongelação adequadas são descritas, por exemplo, no pedido Internacional com o N° de Série PCT/US89/05040, apresentado em 8 de Novembro de 1989. Os métodos que envolvem técnicas de congelação-descongelação são preferidos em relação à preparação de lipossomas. A preparação de lipossomas pode ser realizada numa solução, tal como uma solução salina aquosa, solução de tampão fosfato aquoso ou água estéril. Os lipossomas podem também ser preparados por vários processos que envolvem agitação ou agitação num vortex. Isto pode ser realizado, por exemplo, utilizando um dispositivo de agitação mecânica, tal como Wig-L-Bug™ (Crescent Dental, Lyons, IL) , um Mixomat (Degussa AG, Frankfurt Alemanha), um Capmix (Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH & Co., Seefeld, Oberay, Alemanha), um Silamat Plus (Vivadent, Liechtenstein), ou um

Vibros (Quayle Dental, Sussex, Inglaterra). Também se pode 77 utilizar um equipamento de microemulsificação convencional, tal como um Microfluidizer™ (Microfluidics, Woburn, MA). A secagem por pulverização também pode ser utilizada para preparar as vesículas cheias com gás. Utilizando este processo, os lípidos podem ser previamente misturados num meio aquoso e em seguida secos por pulverização, para produzir vesículas cheias com gás. As vesículas podem ser armazenadas sob um espaço livre de um gás desejado.

Muitas técnicas de preparação de lipossomas que podem ser adaptadas para utilização na preparação de composições de vesículas são discutidas, por exemplo, na Patente U.S. N° 4728578; Pedido de Patente doUK GB 2193095 A; Patente U.S. N° 4728575; Patente U.S. N° 4737323; Pedido de Patente

Internacional com o N° de Série PCT/US85/01161; Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 858, pág. 161-168 (1986);

Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta. Vol. 812, pág. 55-65 (1985); Patente U.S. N° 4 533 254; Mayhew et al., Methods in Enzymology, Vol. 149, pág. 64-77 (1987); Mayhew et al.,

Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 755, pág. 169-74 (1984);

Cheng et al., Investigative Radiology, Vol. 22, pág. 47-55 (1987); Pedido Internacional com o N° de Série PCT/US89/05040; Patente U.S. N° 4162282; Patente U.S. N° 4310505; Patente U.S. N° 4921706; e Liposome Technology, Gregoriadis, G., ed., Vol. I, pág. 29-31, 51-67 e 79-108 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1984) .

As composições de lípidos compreendendo um gás podem ser preparadas agitando uma solução aquosa contendo, se desejado, um material estabilizador, na presença de um gás. O termo "agitação", tal como aqui utilizado, significa qualquer 78 movimento de agitação de uma solução aquosa, de modo a que o gás possa ser introduzido a partir do meio ambiente local na solução aquosa. A agitação é de um modo preferido realizada a uma temperatura abaixo da temperatura de transição de gel para fase de liquido cristalino do lipido. A agitação envolvida na agitação de soluções tem, de um modo preferido, uma força suficiente para resultar na formação de uma composição de lipidos, incluindo composições de vesículas e particularmente composições de vesículas compreendendo vesículas cheias com gás. A agitação pode ser por remoinho, tal como num vortex, movimento lado-a-lado ou movimento para cima e para baixo. Podem-se combinar diferentes tipos de movimento. Além disso, a agitação pode ocorrer agitando o recipiente que contém a solução de lipidos aquosa, ou agitando a solução aquosa no recipiente, sem agitar o próprio recipiente. A agitação pode ser feita manualmente ou por uma máquina. Os agitadores mecânicos que podem ser utilizados incluem, por exemplo, uma mesa agitadora tal como uma mesa agitadora VWR Scientific (Cerritos, CA), bem como qualquer um dos dispositivos agitadores até agora descritos, preferindo-se a Capmix (Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH & Co., Seefeld, Oberay Alemanha). Verificou-se que se podem utilizar alguns modos de agitação ou agitação num vortex para fazer vesículas numa gama de tamanhos preferida. A agitação é preferida e é preferido que a agitação seja realizada utilizando o agitador mecânico Espe Capmix. De acordo com este método preferido, é preferido que seja utilizado um movimento recíproco para produzir as composições de lipidos e, em particular, as composições de vesículas. É ainda mais preferido que o movimento seja recíproco na forma de um arco. É contemplado que a velocidade de reciprocação, bem como o seu arco, são particularmente 79 importantes, no que se refere à formação de vesículas. De um modo preferido, o número de reciprocações ou oscilações de ciclo completo podem ser desde cerca de 1000 até cerca de 20000 por minuto. De um modo mais preferido, o número de reciprocações ou oscilações pode ser desde cerca de 2500 até cerca de 8000 por minuto, sendo ainda mais preferido desde cerca de 3300 até cerca de 5000 reciprocações ou oscilações por minuto. Obviamente, o número de oscilações pode depender da massa dos conteúdos a ser agitados. Em termos gerais, uma maior massa pode requerer menos oscilações. Um outro meio para produzir agitação inclui a acçâo de gás emitido sob velocidade ou pressão elevadas.

Também deve entender-se que, de um modo preferido, com um grande volume de solução aquosa, a quantidade total de força pode ser aumentada de forma correspondente. Uma agitação vigorosa é definida como, pelo menos, cerca de 60 movimentos de agitação por minuto e é preferida. A agitação no vortex a cerca de 60 até cerca de 300 revoluções por minuto é mais preferida. A agitação no vortex a cerca de 300 até cerca de 1800 revoluções por minuto é ainda mais preferida.

Além dos métodos de agitação simples acima descritos, também se podem utilizar métodos mais elaborados. Estes métodos elaborados incluem, por exemplo, processos de instilação de gás para agitação dos cristais líquidos e processos de instilação de gás para secagem por vácuo, tais como os descritos no pedido U.S. co-pendente com o N° de Série 08/076250, apresentado em 11 de Junho de 1993. Embora qualquer uma de várias técnicas possa ser utilizada, as composições de vesículas utilizadas na presente invenção são de um modo preferido preparadas utilizando uma técnica de agitação. De um modo preferido, as técnicas de agitação envolvem agitação com um dispositivo de agitação 80 mecânica, tal como um Espe Capmix (Seefeld, Oberay Alemanha), utilizando, por exemplo, as técnicas descritas no Pedido U.S. co-pendente com o N° de Série 160232, apresentado em 30 de Novembro de 1993. O tamanho das vesículas cheias com gás pode ser ajustado, se desejado, por uma variedade de processos incluindo, por exemplo, microemulsão, agitação no vortex, extrusão, filtração, sonicação, homogeneização, ciclos de congelação e descongelação repetidos, extrusão sob pressão através de poros de tamanho definido e métodos semelhantes. As vesículas cheias com gás preparadas de acordo com os métodos aqui descritos podem variar em tamanho de menos de cerca de 1 μιη, a mais de cerca de 100 μιη. Além disso, após processos de extrusão e esterilização que são discutidos em pormenor a seguir, a agitação ou sacudidela podem proporcionar composições de vesículas que podem conter substancialmente nenhuma ou uma fase lipídica anidra, residual, mínima, no restante da solução. (Bangham, A.D., Standish, M.M. & Watkins, J.C., J. Mol. Biol. Vol. 13, pág. 238-252 (1965). Se desejado, as vesículas podem ser utilizadas tal como são formadas, sem qualquer tentativa de modificação posterior do seu tamanho. Para utilização intravascular, as vesículas têm de um modo preferido diâmetros inferiores a cerca de 30 μιη e, de um modo mais preferido, inferiores a cerca de 12 μπι. Para utilização intravascular direccionada incluindo, por exemplo, ligação a certos tecidos, tal como tecido canceroso, as vesículas podem ser significativamente mais pequenas, por exemplo, com menos de cerca de 100 nm de diâmetro. Para utilização entérica ou gastrointestinal, as vesículas podem ser significativamente maiores, por exemplo, até um milímetro de tamanho. De um modo preferido, as vesículas podem ser 81 dimensionadas de modo a ter diâmetros de desde cerca de 2 μιη até cerca de 100 μιη.

As vesículas cheias com gás podem ser dimensionadas por um processo simples de extrusão através de filtros, em que os tamanhos de poro dos filtros controlam a distribuição de tamanhos das vesículas cheias com gás, resultantes. Utilizando dois ou mais conjuntos de filtros em cascata ou empilhados, por exemplo, um filtro de 10 μηι seguido de um filtro de 8 μπι, as vesículas cheias com gás podem ser seleccionadas para ter uma distribuição de tamanho muito estreita, de cerca de 7 até 9 μηι. Após filtração, estas vesículas cheias com gás podem permanecer estáveis durante mais de 24 horas. O passo de dimensionamento ou filtração pode ser realizado por utilização, por exemplo, de um conjunto de filtros, quando a composição é removida de um frasco estéril antes da utilização, ou, de um modo mais preferido, o conjunto de filtros pode ser incorporado numa seringa, durante a utilização. O método de dimensionamento das vesículas compreenderá então utilizar uma seringa compreendendo um cilindro, pelo menos, um filtro e uma agulha e pode ser realizado por um passo de extracção que compreende extrudir as vesículas de um cilindro, através de um filtro ajustado à seringa, entre o cilindro e a agulha, dimensionando assim as vesículas, antes de estas serem administradas ao doente. O passo de extracção pode também compreender colocar as vesículas na seringa, em que o filtro pode actuar do mesmo modo para dimensionar o tamanho das vesículas à entrada na seringa. Outra alternativa é encher esta seringa com vesículas que já foram dimensionadas por qualquer outro meio, caso em que o filtro pode funcionar para assegurar 82 que apenas as vesículas numa determinada gama de tamanhos, ou do tamanho máximo desejado, são subsequentemente administradas por extrusão a partir da seringa.

Nalgumas formas de realização preferidas, as composições de vesículas podem ser esterilizadas por calor ou esterilizadas por filtração e extrudidas através de um filtro, antes de serem agitadas. Em termos gerais, as composições de vesículas compreendendo um gás podem ser esterilizadas por calor e as composições de vesículas compreendendo precursores gasosos podem ser esterilizadas por filtração. Uma vez formadas as vesículas cheias com gás, estas podem ser filtradas para dimensionamento, como descrito acima. A realização destes passos antes da formação de vesículas cheias com gás e precursores gasosos proporciona vesículas cheias com gás estéreis, prontas para administração a um doente. Por exemplo, um recipiente de mistura, tal como um frasco ou seringa, pode ser cheio com uma composição de lípidos e/ou vesículas filtradas e a composição pode ser esterilizada no recipiente de mistura, por exemplo, por autoclavagem. 0 gás pode ser instilado na composição para formar vesículas cheias com gás, agitando o recipiente estéril. De um modo preferido, o recipiente estéril está equipado com um filtro, posicionado de modo que as vesículas cheias com gás passem através do filtro antes de contactar com o doente. 0 passo de fazer a extrusão da solução de compostos lipídicos através de um filtro, diminui a quantidade de material não hidratado, rompendo quaisquer materiais secos e expondo uma área de superfície maior para hidratação. De um modo preferido, o filtro tem um tamanho de poro de cerca de 0,1 até cerca de 5 μιη, de um modo mais preferido, de cerca de 0,1 até cerca de 83 4 μιη, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 0,1 até cerca de 2 μιη e de um modo ainda mais preferido de cerca de 1 μιη. Um composto não desidratado que é geralmente indesejável, surge como aglomerados amorfos de tamanho não uniforme. O passo de esterilização proporciona uma composição que pode ser facilmente administrada a um doente para imagiologia de diagnóstico incluindo, por exemplo, ultra-sons, MRI ou CT. Nalgumas formas de realização preferidas, a esterilização pode ser realizada por esterilização térmica, de um modo preferido por autoclavagem da solução a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 100 °C e de um modo mais preferido, por autoclavagem de cerca de 100 °C até cerca de 130 °C, de um modo ainda mais preferido de cerca de 110 °C até cerca de 130 °C, de um modo ainda mais preferido de cerca de 120 °C até cerca de 130 °C e de um modo ainda mais preferido a cerca de 130 °C. De um modo preferido, o aquecimento ocorre durante, pelo menos, cerca de 1 minuto, de um modo mais preferido cerca de 1 até cerca de 30 minutos, de um modo ainda mais preferido, de cerca de 10 até cerca de 20 minutos e de um modo ainda mais preferido, cerca de 15 minutos.

Se desejado, os passos de extrusão e aquecimento, como delineados acima, podem ser invertidos, ou pode utilizar-se apenas um dos dois passos. Pode utilizar-se outros modos de esterilização incluindo, por exemplo, exposição a radiação gama.

Além das formas de realização acima referidas, podem-se formular precursores gasosos contidos em vesículas, os quais, por activação, por exemplo por exposição a temperatura elevada, pH variável ou luz, podem sofrer uma transição de fase de, por 84 exemplo, um líquido, incluindo um líquido aprisionado numa vesícula, para um gás, expandindo-se para criar as vesículas cheias com gás aqui descritas. Esta técnica é descrita em pormenor nos pedidos de patente co-pendentes com o N° de série 08/160232, apresentado em 30 de Novembro de 1993 e 08/159687, apresentado em 30 de Novembro de 1993, cujas descrições são aqui incorporadas por referência, na sua totalidade. O método preferido para activar o precursor gasoso é por exposição a uma temperatura elevada. A temperatura de activação ou transição e termos semelhantes, refere-se ao ponto de ebulição do precursor gasoso e é a temperatura à qual ocorre a transição de fase líquida para gasosa, do precursor gasoso. Os precursores gasosos úteis são aqueles materiais que têm pontos de ebulição na gama de cerca de -100 °C até cerca de 70 °C. A temperatura de activação é particular para cada precursor gasoso. Prefere-se uma temperatura de activação de cerca de 37 °C ou cerca da temperatura corporal humana, para precursores gasosos no contexto da presente invenção. Assim, na forma preferida, um precursor gasoso líquido é activado para se tornar num gás a cerca de 37 °C, ou menos. O precursor gasoso pode estar na fase líquida ou gasosa, para utilização nos métodos da presente invenção.

Os métodos para preparar as vesículas cheias com precursor gasoso podem ser realizados abaixo do ponto de ebulição do precursor gasoso, de modo que um líquido é incorporado, por exemplo, numa vesícula. Além disso, os métodos podem ser realizados no ponto de ebulição do precursor gasoso, de modo que é incorporado um gás, por exemplo, numa vesícula. Para precursores gasosos com pontos de ebulição de baixas temperaturas, os precursores líquidos podem ser emulsionados 85 utilizando um dispositivo microfluidizante, arrefecido a uma temperatura baixa. Os pontos de ebulição podem também ser reduzidos utilizando solventes em meios líquidos, para utilizar um precursor na forma líquida. Além disso, podem-se realizar métodos em que a temperatura é aumentada ao longo do processo, em que o processo começa com um precursor gasoso como um líquido e termina com um gás. 0 precursor gasoso pode ser seleccionado de modo a formar um gás in situ no tecido ou fluido alvo, in vivo, aquando da entrada no doente ou animal, antes de utilização, durante o armazenamento, ou durante o fabrico. Os métodos para produzir as vesículas cheias com precursores gasosos activados por temperatura podem ser realizados a uma temperatura abaixo do ponto de ebulição do precursor gasoso. Nesta forma de

realização, o precursor gasoso pode ser aprisionado numa vesícula de tal modo que a transição de fases não ocorre durante o fabrico. Em vez disso, as vesículas cheias com precursor gasoso são fabricadas na fase líquida do percursor gasoso. A activação da transição de fases pode ocorrer em qualquer altura, dado que se deixa que a temperatura exceda o ponto de ebulição do precursor. Além disso, conhecendo a quantidade de líquido numa gotícula de precursor gasoso líquido, pode-se determinar o tamanho das vesículas quando se atinge o estado gasoso.

Alternativamente, os precursores gasosos podem ser utilizados para criar vesículas cheias com gás, estáveis que são pré-formadas antes da utilização. Nesta forma de realização, o precursor gasoso pode ser adicionado a um recipiente que contém uma composição lipídica, a uma temperatura abaixo da temperatura de transição de fase líquido-gás, do respectivo precursor gasoso. À medida que a temperatura aumenta e se forma uma 86 emulsão entre o precursor gasoso e a solução líquida, o precursor gasoso sofre transição do estado líquido para o estado gasoso. Como resultado deste aquecimento e formação de gás, o gás desloca o ar no espaço superior acima da mistura líquida, de modo a formar vesículas cheias com gás que podem aprisionar o gás do precursor gasoso, gás ambiente (e. g.r ar) ou aprisionar em simultâneo o precursor gasoso no estado de gás e ar ambiente. Esta transição de fases pode ser utilizada para uma mistura e formação óptimas do agente de contraste. Por exemplo, o precursor gasoso, perfluorobutano, pode ser aprisionado nas vesículas de lípidos e à medida que a temperatura é aumentada para além do ponto de ebulição do perfluorobutano (4°C), o gás perfluorobutano é aprisionado nas vesículas.

Deste modo, pode seleccionar-se precursores gasosos, para formar vesículas cheias com gás ín vivo, ou podem ser concebidos para produzir vesículas cheias com gás in situ, durante o processo de fabrico, durante o armazenamento ou nalguma altura antes da utilização.

Como outra forma de realização desta invenção, pré-formando o precursor gasoso no estado líquido, numa emulsão aquosa, o tamanho máximo da vesícula pode ser estimado, utilizando a lei dos gases ideais, uma vez efectuada a transição para o estado gasoso. Para os fins de preparação de vesículas cheias com gás a partir de precursores gasosos, pode-se assumir que a fase de gás se forma instantaneamente e que substancialmente nenhum gás nas vesículas acabadas de formar foi eliminado devido a difusão no líquido que é geralmente de natureza aquosa. Assim, a partir de um volume de líquido conhecido na emulsão, pode-se prever um limite superior para o tamanho da vesícula cheia com gás. 87

Em formas de realização da presente invenção, uma mistura de um composto lipídico e de um precursor gasoso, contendo gotículas de líquido de tamanho definido, pode ser formulada de tal modo que ao atingir uma temperatura específica, por exemplo, o ponto de ebulição do precursor gasoso, as gotículas se podem expandir para dentro das vesículas cheias com gás de tamanho definido. 0 tamanho definido pode representar um limite superior para o tamanho efectivo, pois a lei dos gases ideais geralmente não consegue contabilizar factores como a difusão do gás para a solução, perda de gás para a atmosfera e os efeitos de pressão aumentada. A lei dos gases perfeitos que pode ser utilizada para calcular o aumento no volume das bolhas de gás, por transição dos estados líquido para gasoso é como se segue:

PV = nRT em que P é a pressão em atmosferas (atm); V é o volume em litros (L); n é moles de gás; T é a temperatura em graus Kelvin (K); e R é a constante dos gases perfeitos (22,4 L-atm/K-mole).

Conhecendo o volume, densidade e temperatura do liquido na mistura de líquidos pode calcular-se a quantidade, por exemplo, em moles e o volume do precursor líquido que quando convertido num gás, se pode expandir numa vesícula de volume conhecido. 0 volume calculado pode reflectir um limite superior do tamanho da vesícula cheia com gás, assumindo uma expansão instantânea numa 88 vesícula cheia com gás e uma difusão desprezável do gás, ao longo do tempo da expansão.

Assim, para estabilização do precursor no estado liquido, numa mistura em que a gotícula precursora é esférica, o volume da gotícula de precursor pode ser determinado pela equação:

Volume (vesícula esférica) = 4/3 7rr3 em que r é o raio da esfera.

Assim, uma vez estimado o volume e conhecendo a densidade do líquido à temperatura desejada, pode determinar-se a quantidade de precursor gasoso líquido na gotícula. Em termos mais descritivos, pode aplicar-se o seguinte:

Vgás = 4/3 7U (rgás) pela lei dos gases perfeitos,

PV=nRT substituindo obtém-se

Vgás — nRT/Pgás ou, (A) 89

(A) η = 4/3 [7Urgás3]P/RT quantidade n = 4/3 [7UrgáS3P/RT] -PMn convertendo de novo para um volume líquido (B) (B) VUq = [4/3 [7Urgás3]P/RT]-PMn/D] em que D é a densidade do precursor.

Resolvendo para o diâmetro da gotícula líquida, (C) (C) diâmetro/2 = [3/4π [4/3· [7crgàs3] P/RT] PMn/D]1/3 que se reduz a

Diâmetro = 2 [ [rgás3] P/RT [PMn/D] ]1/3

Como outro meio para preparar vesículas com o tamanho desejado para utilização nos métodos da presente invenção e com conhecimento do volume e especialmente do raio das gotículas de líquido, pode utilizar-se filtros de tamanho adequado para dimensionar as gotículas precursoras gasosas à esfera de diâmetro adequado.

Pode-se utilizar um precursor gasoso representativo para formar uma vesícula com um tamanho definido, por exemplo, 10 μηα de diâmetro. Neste exemplo, a vesícula pode ser formada na corrente sanguínea de um humano, em que a temperatura típica 90 será, portanto, de 37 °C ou 310 K. A uma pressão de 1 atmosfera e utilizando a equação (A) poderão ser necessárias 7,54 x 10“7 moles de precursor gasoso para preencher o volume de uma vesículas de 10 μηι de diâmetro.

Utilizando a quantidade de precursor gasoso acima calculada e 1-fluorobutano que possui um peso molecular de 76,11, um ponto de ebulição de 32,5 °C e uma densidade de 0, 7789 g/mL a 20 °C, novos cálculos preveem que possam ser necessárias 5,74 x 10~15 g deste precursor, para uma vesícula de 10 μιη. Extrapolando e com o conhecimento da densidade, a equação (B) prevê ainda que 8,47 x 10“16 mL de precursor líquido possam ser necessários para formar uma vesícula com um limite superior de 10 μιη.

Por fim, utilizando a equação (C) , pode preparar-se uma mistura, por exemplo, uma emulsão, contendo gotículas com um raio de 0,0272 μηι ou um diâmetro correspondente de 0,0544 μπι, para se obter uma vesícula cheia com precursor gasoso, com um limite superior de uma vesícula de 10 μιη.

Uma emulsão com este tamanho particular pode ser facilmente obtida, utilizando um filtro com o tamanho adequado. Além disso, como se pode ver pelo tamanho do filtro necessário para formar gotículas de precursor gasoso de tamanho definido, o tamanho do filtro pode também ser suficiente para remover quaisquer contaminantes bacterianos e, desse modo, pode ser utilizado também como filtração estéril.

Esta forma de realização para preparar vesículas cheias com gás pode ser aplicada a todos os precursores gasoso activados por temperatura. De facto, a depressão do ponto de congelação do 91 sistema solvente, permite utilizar precursores gasosos que podem sofrer transições de fase liquido-gás a temperaturas abaixo de 0 °C. 0 sistema solvente pode ser seleccionado para proporcionar um meio para suspensão do precursor gasoso. Por exemplo, 20% de polipropilenoglicol miscivel em solução salina tamponada, exibe uma depressão do ponto de congelação, bem abaixo do ponto de congelação da água sozinha. Aumentando a quantidade de propilenoglicol, ou adicionando materiais como cloreto de sódio o ponto de congelação pode ser diminuído ainda mais. A selecção de sistemas solvente adequados pode ser determinada também por métodos físicos. Quando as substâncias, sólidas ou líquidas, aqui referidas como solutos são dissolvidas num solvente, tal como tampões à base de água, o ponto de congelação pode ser diminuído por uma quantidade que depende da composição da solução. Assim, tal como definido por Wall, pode-se expressar a depressão do ponto de congelação do solvente pela seguinte equação:

Inx^In (l-xb) = ΔΗ^/RO/TVl/T) em que xa é a fracção molar do solvente; xb é a fracção molar do soluto; AHfus é o calor de fusão do solvente; e T0 é o ponto de congelação normal do solvente. 0 ponto de congelação normal do solvente pode ser obtido resolvendo a equação. Se xb é pequeno em relação a xa, então a equação acima pode ser redefinida como se segue. 92 xb = ΔΗ JR[T-T/r0T] = AHtusAT/RT02 A equação acima assume que a alteração na temperatura ΔΤ é pequena em comparação com T2. Esta equação pode ser simplificada ainda mais, expressando a concentração de soluto em termos de molalidade, m (moles de soluto por mil gramas de solvente). Assim, a equação pode ser redefinida como se segue

Xb = m/[m + 1000/mJ - mMa/1000 em que Ma é o peso molecular do solvente. Assim, substituindo para a fracção Xb; AT = íM“dVl000AHJm ou ΔΤ = K,m, em que

Kf=Mmí/1000AHte

Kf é o ponto de congelação molal e é igual a 1,86 graus por unidade de concentração molal para a água, à pressão de uma atmosfera. A equação acima pode ser utilizada para determinar com precisão, o ponto de congelação molal de soluções de 93 vesículas cheias com precursores gasosos. Deste modo, a equação acima pode ser aplicada para estimar depressões de pontos de congelação e determinar as concentrações adequadas de soluto líquido ou sólido, necessárias para diminuir a temperatura de congelação do solvente, para um valor adequado. Métodos para preparar vesículas cheias com percursores gasosos activados por temperatura, incluem: (a) agitar num vortex e/ou agitar uma mistura aquosa de precursor gasoso e materiais adicionais, como desejado incluindo, por exemplo, materiais estabilizadores, agentes espessantes e/ou agentes dispersantes. Variações opcionais deste método incluem autoclavagem antes de agitação no vortex ou agitação; aquecimento de uma mistura aquosa de precursor gasoso; ventilação do recipiente que contém a mistura/suspensão; agitação ou permissão para que a vesícula cheia com gás precursor se forme espontaneamente e arrefecimento da suspensão de vesículas cheias com precursor gasoso e extrusão de uma suspensão aquosa de precursor gasoso, através de um filtro de cerca de 0,22 μιη. Alternativamente, pode efectuar-se uma filtração durante a administração in vivo das vesículas, utilizando um filtro de cerca de 0,22 μιη; (b) microemulsionamento, em que uma mistura aquosa de precursor gasoso é emulsionada por agitação e aquecida, para formar, por exemplo, vesículas antes da administração a um doente. 94 (c) aquecimento de um precursor gasoso numa mistura, com ou sem agitação, em que as vesículas cheias com o percursor gasoso menos denso podem flutuar até ao topo da solução, expandindo e desalojando outras vesículas no recipiente e ventilando o recipiente para libertar o ar; e (d) utilização em qualquer dos métodos acima, de um recipiente selado, para manter a suspensão aquosa de precursor gasoso e manter a suspensão a uma temperatura abaixo da temperatura de transição de fase do precursor gasoso, seguido de autoclavagem para aumentar a temperatura acima da temperatura de transição de fase, opcionalmente com agitação, ou permitindo que a vesícula de precursor gasoso se forme espontaneamente, em que o precursor gasoso expandido no recipiente reaccional aumenta a pressão no recipiente, e arrefecendo a suspensão de vesículas cheias com gás, após o que também se pode agitar. A liofilização poderá ser útil para remover água e materiais orgânicos, antes do método de instalação de agitação. Os métodos de instalação de secagem podem ser utilizados para remover água das vesículas. Ao pré-aprisionar o precursor gasoso nas vesículas secas (i. e. antes da secagem), o precursor gasoso pode-se expandir para preencher a vesícula após aquecimento. Os precursores gasosos também podem ser utilizados para encher vesículas secas, após terem sido submetidos a vácuo. Dado que as vesículas secas são mantidas a uma temperatura abaixo da temperatura do seu estado gel para líquido cristalino, a câmara de secagem pode ser lentamente cheia com o precursor gasoso neste estado gasoso. Por exemplo pode utilizar-se perfluorobutano para encher vesículas secas a temperaturas acima de 4 °C (o ponto de ebulição do perfluorobutano). 95 Métodos preferidos para preparar as vesículas cheias de precursor gasoso activadas por temperatura, compreendem agitação de uma solução aquosa com um composto lipídico na presença de um precursor gasoso, a uma temperatura abaixo da temperatura de transição de fase do estado líquido para estado gasoso, do precursor gasoso. Isto é de um modo preferido realizado a uma temperatura abaixo da temperatura de transição de fase do estado de gel para o estado de líquido cristalino do lípido. A mistura pode ser em seguida aquecida a uma temperatura acima da temperatura de transição de fase do estado líquido para estado gasoso, do precursor gasoso, o que pode fazer com que o precursor se volatilize e se expanda. 0 aquecimento pode ser então descontinuado e a temperatura da mistura pode ser deixada cair abaixo da temperatura de transição do estado líquido para estado gasoso, do precursor gasoso. A agitação da mistura pode ocorrer durante o passo de aquecimento, ou subsequentemente, após a mistura ser deixada arrefecer.

Outros métodos para preparar vesículas cheias com precursor gasoso podem envolver a agitação de uma solução aquosa de, por exemplo, um lípido e um precursor gasoso e a separação das vesículas cheias com precursor gasoso, resultantes.

Os lipossomas convencionais, cheios, aquosos da técnica anterior, são formados rotineiramente a uma temperatura acima da temperatura de transição de fase dos lípidos utilizados para os fazer, uma vez que são mais flexíveis e assim úteis em sistemas biológicos no estado de líquido cristalino. Ver, por exemplo, Szoka e Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sei. 1978, 75, 4194-4198. Pelo contrário, as vesículas preparadas de acordo com algumas formas de realização preferidas aqui descritas, são 96 cheias com precursores gasosos, o que confere uma maior flexibilidade, dado que os precursores gasosos após a formação de gás são mais compressiveis e manuseáveis, do que uma solução aquosa.

Os métodos de preparação poderão envolver agitação de uma solução aquosa compreendendo um lipido, na presença de um precursor gasoso activável por temperatura. De um modo preferido, a agitação tem uma força suficiente para que se forme uma espuma num periodo de tempo curto, tal como cerca de 30 minutos e de um modo preferido em cerca de 20 minutos e de um modo mais preferido em cerca de 10 minutos. A agitação pode envolver microemulsão, microfluidização, agitação em espiral (tal como no vortex), movimento lado-a-lado ou movimento para cima e para baixo. No caso da adição de precursor gasoso no estado liquido, a sonicação pode ser utilizada além disso aos métodos de agitação acima descritos. Além disso, pode combinar-se diferentes tipos de movimentos. Além disso, a agitação pode ocorrer por agitação do recipiente que contém a solução lipidica aquosa, ou por agitação da solução aquosa no recipiente, sem agitação do próprio recipiente. Adicionalmente, a agitação pode ocorrer manualmente ou por meio de uma máquina. Os agitadores mecânicos que podem ser utilizados incluem, por exemplo, os agitadores mecânicos descritos anteriormente, sendo preferido um Espe Capmix (Seefeld, Oberay Alemanha). Um outro meio para produzir agitação inclui a acção do precursor gasoso emitido sob velocidade ou pressão elevadas.

De acordo com os métodos aqui descritos, um gás, tal como o ar, pode também ser proporcionado pela atmosfera ambiente local. A atmosfera ambiente local pode incluir a atmosfera num recipiente selado, bem como o meio ambiente externo. 97

Alternativamente, por exemplo, um gás pode ser injectado, ou de outro modo adicionado ao recipiente contendo a solução lipídica aquosa, ou na própria solução lipídica aquosa, para proporcionar um gás que não seja o ar. Os gases que são mais leves do que o ar são geralmente adicionados a um recipiente selado, enquanto que os gases que são mais pesados do que o ar podem ser adicionados a um recipiente selado ou não selado. Assim, a presente invenção inclui o co-aprisionamento de ar e/ou outros gases, juntamente com precursores gasosos.

Deste modo, as vesículas cheias com precursor gasoso podem ser utilizadas substancialmente do mesmo modo que as vesículas cheias com gás aqui descritas, uma vez activadas por aplicação aos tecidos de um hospedeiro, em que factores como a temperatura ou pH podem ser utilizados para provocar a produção de gás. É preferido que os precursores gasosos sofram transições de fase do estado líquido para o gasoso a uma temperatura próxima da temperatura do corpo do hospedeiro e sejam, assim, activados, por exemplo, pela temperatura in vivo do hospedeiro, de modo a sofrer transição para a fase gasosa, neste. Isto pode ocorrer quando, por exemplo, o tecido do hospedeiro é tecido humano, com uma temperatura normal de cerca de 37 °C e os precursores gasosos sofrem transição de fase dos estados líquido para gasoso, próximo dos 37 °C.

Como referido acima, as composições de lípidos, proteínas, polímero e/ou vesículas podem ser esterilizadas por autoclave, ou filtração estéril, se estes processos são realizados antes do passo de instilação, ou antes da conversão mediada por temperatura, dos precursores gasosos sensíveis a temperatura, nas composições. Alternativamente, pode incluir-se um ou mais agentes antibacterianos e/ou conservantes, na formulação das 98 composições, tais como benzoato de sódio, sais de amónio quaternários, azida de sódio, metilparabeno, propilparabeno, ácido sórbico, ascorbilpalmitato, hidroxianisolo butilado, hidroxitolueno butilado, clorobutanol, ácido desidroacético, etilenodiamina, monotioglicerol, benzoato de potássio, metabissulfito de potássio, sorbato de potássio, bissulfito de sódio, dióxido de enxofre e sais de mercúrio orgânicos. Esta esterilização que também pode ser conseguida por outros meios convencionais, tais como irradiação, pode ser necessária quando se utilizam vesículas estabilizadas para imagiologia sob condições invasivas, por exemplo, intravascular ou intraespecialistanealmente. Os meios adequados de esterilização serão evidentes para o especialista com base na presente divulgação.

As composições de vesículas que compreendem vesículas formuladas a partir de proteínas ou polímeros, podem ser preparadas por vários processos, como será evidente para os especialistas na técnica, uma vez munidos com a presente descrição. Exemplos de processos incluem, por exemplo, polimerização interfacial, separação de fases e coacervação, preparação centrífuga multi-orifício e evaporação do solvente. Processos adequados que podem ser utilizados ou modificados de acordo com a presente invenção, para preparar vesículas de polímeros, incluem os processos descritos em Garner et al., Patente U.S. N° 4179546, Garner, Patente U.S. N° 3945956, Cohrs et al., Patente U.S. N° 4108806, Japan Kokai Tokyo Koho 62 286534, Patente britânica N° 1044680, Kenaga et al., Patente U.S. N° 3293114, Morehouse et al., Patente U.S. N° 3401475, Walters, Patente U.S. N° 3479811, Walters et al., Patente U.S. N° 3488714, Morehouse et al., Patente U.S. N° 3615972, Baker et al., Patente U.S. N° 4549892, Sands et al., Patente U.S. 99 Ν° 4540629, Sands et al., Patente U.S. N° 4421562, Sands, Patente U.S. N° 4420442, Mathiowitz et al., Patente U.S. N° 4898734, Lencki et al., Patente U.S. N° 4822534, Herbig et al., Patente U.S. N° 3732172, Himmel et al., Patente U.S. N° 3594326, Sommerville et al., Patente U.S. N° 3015128, Deasy, Microencapsulation and Related Drug Processes, Vol 20, Capítulos 9 e 10, pág. 195-240 (Mareei Dekker, Inc., N.Y., 1984), Chang et al., Canadian J. Of Physiology and Pharmacology, Vol 44, pág. 115-129 (1966), e Chang, Science, Vol. 146, pág. 524-525 (1964).

De acordo com um protocolo de síntese preferido, as vesículas de polímero podem ser preparadas utilizando um processo de expansão térmica, tal como, por exemplo, o processo descrito em Garner et al., Patente U.S. N° 4179546, Garner, Patente U.S. N° 3945956, Cohrs et al., Patente U.S. N° 4108806, Patente britânica N° 1044680 e documento Japan Kokai Tokkyo Koho 62 286534. Em termos gerais, o processo de expansão térmica pode ser realizado preparando vesículas de um polímero ou copolímero expansível que pode conter no seu vazio (cavidade) um líquido volátil (precursor gasoso). A vesícula é então aquecida, plastificando a vesícula e convertendo o líquido volátil num gás, fazendo com que a vesícula se expanda até várias vezes o seu tamanho original. Quando o calor é removido, o polímero termoplástico retém, pelo menos, alguma da sua forma expandida. As vesículas produzidas por este processo tendem a ser de uma densidade particularmente baixa e são, portanto, preferidas. O processo anteriormente descrito é bem conhecido na técnica e pode ser designado como um processo de expansão térmica, para preparar vesículas de baixa densidade.

Os polímeros úteis no processo de expansão térmica serão evidentes para os especialistas na técnica e incluem polímeros 100 ou copolímeros termoplásticos, incluindo polímeros ou copolímeros de muitos dos monómeros acima descritos. Polímeros e copolímeros preferidos descritos acima incluem os seguintes copolímeros: polivilideno-poliacrilonitrilo, polivinilideno- poliacrilonitrilo-poli(metacrilato de metilo) e poliestireno-poliacrilonitrilo. Um polímero mais preferido é o polivinilideno-poliacrilonitrilo.

Os líquidos voláteis úteis no processo de expansão térmica serão também bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem: hidrocarbonetos alifáticos, tais como etano, etileno, propano, butano, isobutano, neopentano, acetileno, hexano, heptano; clorofluorocarbonetos, tais como CC13F, CC12F2, CC1F3, CC1F2-CC12F2, cloro-heptafluorociclobutano e 1,2-dicloro-hexafluorociclobutano; tetralquilsilanos, tais como tetrametilsilano, trimetilsilano, trimetilisopropilsilano e trimetil-n-propilsilano, bem como perfluorocarbonetos, incluindo os perfluorocarbonetos acima descritos. Em geral, é importante que o liquido volátil não seja um solvente para o polímero ou copolímero utilizado. Também é preferido que o líquido volátil tenha um ponto de ebulição que é abaixo do ponto de amolecimento do polímero ou copolímero envolvidos. Os pontos de ebulição de vários líquidos voláteis e pontos de amolecimento de vários polímeros e copolímeros, serão facilmente determinados por um especialista na técnica e as combinações adequadas de polímeros ou copolímeros e líquidos voláteis serão facilmente evidentes para o especialista. A título de orientação e tal como um especialista na técnica poderá reconhecer, geralmente à medida que 0 comprimento da cadeia de carbono do líquido volátil aumenta, aumenta também o ponto de ebulição desse líquido. Além disso, pré-aquecendo ligeiramente as vesículas em água, na presença de peróxido de hidrogénio, antes do aquecimento e 101 expansão definitivos, poderá pré-amolecer a vesícula para permitir que a expansão ocorra mais depressa.

Por exemplo, para produzir vesículas de polímeros sintéticos, o vinilideno e acrilonitrilo podem ser copolimerizados num meio de isobutano líquido, utilizando um ou mais dos seguintes processos da literatura anterior, modificados ou não modificados, de modo que o isobutano fica aprisionado dentro das vesículas. Quando estas vesículas são então aquecidas a uma temperatura desde cerca de 80 °C a cerca de 120 °C, o gás isobutano expande-se, o que por sua vez expande as vesículas. Após o calor ser removido, as vesículas de copolímero de polivinilideno e acrilonitrilo expandidas permanecem substancialmente fixas na sua posição expandida. As vesículas de baixa densidade resultantes são extremamente estáveis quer secas quer suspensas num meio aquoso. O isobutano é aqui utilizado meramente como um exemplo de líquido, entendendo-se que outros líquidos que sofrem transições líquido/gás a temperaturas úteis para a síntese destas vesículas e formação das vesículas de densidade muito baixa, por aquecimento, podem substituir o isobutano. De modo semelhante, pode utilizar-se outro monómero que não vinilideno e acrilonitrilo na preparação das vesículas.

Nalgumas formas de realização preferidas, as vesículas que são formuladas a partir de polímeros sintéticos e que podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção, estão comercialmente disponíveis de Expancel, Nobel Industries (Sundsvall, Suécia), incluindo microesferas de EXPANCEL 551 DE . As microesferas de EXPANCEL 551 DE são compostas por um copolímero de vinilideno e acrilonitrilo que têm nelas encapsulado isobutano líquido. Estas microesferas são vendidas como uma composição seca e têm aproximadamente 50 mícrones de 102 tamanho. As microesferas de EXPANCEL 551 DE™ têm uma gravidade específica de apenas 0,02 a 0,05 que está entre um quinto e um vigésimo da densidade da água.

Incluem-se nos métodos descritos nas patentes acima referidas para a preparação de vesículas à base de proteínas, métodos que envolvem sonicação de uma solução de proteína. Numa forma preferida, o material de partida pode ser uma solução aquosa de uma proteína biocompatível solúvel em água que pode ser desnaturada termicamente. A proteína de encapsulação é de um modo preferido sensível ao calor, de modo que pode ser parcialmente insolubilizada, aquecendo durante a sonicação. Proteínas sensíveis ao calor, adequadas, incluem, por exemplo, albumina, hemoglobina, colagénio e semelhantes. De um modo preferido, a proteína é uma proteína humana, sendo a albumina de soro humano (HSA) a mais preferida. A HSA está disponível comercialmente na forma de uma solução aquosa a 5% que é adequada para utilização na preparação de vesículas à base de proteínas. Obviamente, como será evidente para os especialistas na técnica, pode utilizar-se outras concentrações de albumina, bem como outras proteínas que são termicamente desnaturáveis, para preparar as vesículas. Em termos gerais, a concentração de HSA pode variar e pode ser desde cerca de 0,1 até cerca de 25% em peso, e todas as combinações e subcombinações de gamas entre esta. Poderá ser preferido, em determinados métodos para a preparação de vesículas à base de proteínas, utilizar a proteína na forma de uma solução aquosa diluída. Para a albumina, poderá ser preferido utilizar uma solução aquosa que contém desde cerca de 0,5 até cerca de 7,5% em peso de albumina, preferindo-se concentrações inferiores a cerca de 5% em peso, por exemplo, desde cerca de 0,5 até cerca de 3% em peso. 103

As vesículas à base de proteínas podem ser preparadas utilizando equipamento que está disponível no mercado. Por exemplo, numa operação de preparação de alimentos como descrita, por exemplo, em Cerny et al., Patente U.S. N° 4957656, pode utilizar-se tanques de aço inoxidável que são comercializados pela Walker Stainless Equipment Co. (New Lisbon, WI) e filtros de processo que são comercializados pela Millipore (Bedford, MA) . A operação de sonicação pode utilizar quer um permutador de calor quer um recipiente de sonicação de fluxo, em série. 0 equipamento permutador de calor deste tipo pode ser obtido da ITT Standard (Buffalo, NY) . 0 permutador de calor mantém a temperatura de operação para o processo de sonicação, com controlos de temperatura que variam desde cerca de 65 °C até cerca de 80 °C, dependendo da constituição do meio. A frequência de vibração do equipamento de sonicação pode variar numa qama alargada, por exemplo, desde cerca de 5 a cerca de 40 kilohertz (kHz), operando a maioria dos sonicadores disponíveis no mercado, a cerca de 10 ou 20 KHz. O equipamento de sonicação adequado inclui, por exemplo, um Sonics & Materials Vibra-Cell, equipado com uma sonda sonicadora de ponta plana, comercialmente disponível de Sonics & Materials, Inc. (Danbury, CT). A potência aplicada à sonda sonicadora pode variar ao longo de ajustes de potência numa escala de 1 a 10 estabelecida pelo fabricante, tal como com o Sonics & Materials Vibra-Cell Model VL1500. Pode utilizar-se um ajuste de potência intermédio, por exemplo de 5 a 9. E preferido que a frequência de vibração e a potência aplicada sejam suficientes para produzir cavitação no líquido a ser sonicado. Os fluxos de alimentação podem variar entre cerca de 50 mL/min a cerca de 1000 mL/min e todas as combinações e subcombinação de gamas entre esta. Os tempos de residência no 104 recipiente de sonicação podem variar desde cerca de 1 segundo até cerca de 4 minutos e as velocidades de adição do fluido gasoso podem variar desde cerca de 10 centímetros cúbicos (cc) por minuto até cerca de 100 cc/min ou 5% a 25% do fluxo de alimentação e todas as combinações e subcombinações de gamas entre esta.

Pode ser preferido realizar a sonicação de um modo tal que se produza espuma e especialmente espuma intensa, na solução. Em termos gerais, uma espuma intensa e formação de aerossóis são importantes para obter um agente de contraste com uma concentração e estabilidade aumentadas. Para promover a formação de espuma, a potência de entrada na sonda sonicadora pode ser aumentada e o processo pode ser operado sob pressão reduzida, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 5 psi. A formação de espuma pode ser facilmente detectada pela aparência nebulosa da solução e pela espuma produzida. Métodos adequados para a preparação de vesículas à base de proteínas podem envolver a alteração física ou química da proteína, ou derivado de proteína em solução aquosa, para desnaturar ou fixar o material. Por exemplo, as vesículas à base de proteínas podem ser preparadas a partir de uma solução aquosa de HSA a 5%, aquecendo após a formação ou durante a formação do agente de contraste, por sonicação. A alteração química pode envolver desnaturação química ou fixação, ligando a proteína com um aldeído difuncional, tal como o glutaraldeído. Por exemplo, as vesículas podem ser feitas reagir com 0,25 gramas de glutaraldeído aquoso a 50%, por grama de proteína a pH 4,5, durante 6 horas. O glutaraldeído que não reagiu pode ser eliminado da proteína por lavagem. 105 A presente invenção refere-se a métodos para imagiologia de diagnóstico que envolvem a administração a um doente, de um agente de contraste, em combinação com um vasodilatador renal. 0 vasodilatador renal pode ser administrado ao doente antes, durante e/ou após a administração do agente de contraste. Está disponível uma grande variedade de técnicas para a preparação de composições de lípidos e/ou vesículas que compreendem um agente bioactivo, incluindo vasodilatadores renais. Por exemplo, pode preparar-se composições de lípidos e/ou vesículas a partir de uma mistura de compostos lipídicos, agentes bioactivos e gás ou precursor gasoso. Neste caso, as composições de lípidos e/ou vesículas podem ser preparadas como descrito acima, de modo que as composições também compreendem um agente bioactivo. Assim, por exemplo, pode preparar-se micelas na presença de um agente bioactivo. No que se refere às composições de lípidos e/ou vesículas que compreendem um gás, a preparação pode envolver, por exemplo, borbulhar um gás directamente numa mistura de compostos lipídicos e um ou mais materiais adicionais. Alternativamente, as composições de lípidos e/ou vesículas podem ser realizadas a partir de compostos lipídicos e um gás ou precursor gasoso. No último caso, o agente bioactivo pode então ser adicionado à composição de lípido e/ou vesículas, antes de utilização. Por exemplo, pode preparar-se uma mistura aquosa de lipossomas e gás, à qual se pode adicionar o agente bioactivo e que é agitada para proporcionar a composição de lipossomas. A composição de lipossomas que compreende ainda um agente bioactivo pode ser facilmente isolada, uma vez que as vesículas de lipossomas cheias com gás e/ou agente bioactivo, geralmente flutuam até ao topo da solução aquosa. 0 agente bioactivo em excesso pode ser recuperado da solução aquosa remanescente. 106

Como os especialistas na técnica reconhecerão, quaisquer composições de lipidos e/ou vesículas aqui descritas podem ser liofilizadas para armazenamento e ser reconstituídas, por exemplo, com um meio aquoso (tal como água estéril, solução tamponada com fosfato ou solução aquosa salina), com o auxílio de agitação vigorosa. Para prevenir a aglutinação, ou fusão dos lipidos, como resultado de liofilização, poderá ser útil incluir aditivos que impeçam que esta fusão ou aglutinação ocorra. Os aditivos que podem ser úteis incluem sorbitol, manitol, cloreto de sódio, glucose, tre-halose, polivinilpirrolidona e poli(etilenoglicol) (PEG), por exemplo, polímeros de PEG com um peso molecular desde cerca de 400 até cerca de 10 000, sendo preferidos os polímeros de PEG com pesos moleculares de cerca de 1000, 3000 (tal como PEG3350) e 5000. Estes e outros aditivos estão descritos na literatura, tal como na Farmacopeia U.S., USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc. 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, cuja descrição é aqui incorporada por referência na sua totalidade. As preparações liofilizadas têm geralmente a vantagem de ter uma maior vida de armazenamento.

Como referido acima, as composições da presente invenção, incluindo vesículas cheias com gás e/ou precursor gasoso, são úteis como agentes de contraste para imagiologia de diagnóstico incluindo, por exemplo, imagiologia por ultra-sons (US), imagiologia por tomografia computorizada (TC), incluindo angiografia CT (CTA), imagiologia por ressonância magnética (MR), incluindo angiografia por ressonância magnética (MRA), medicina nuclear, imagiologia óptica e elastografia. 107

De acordo com a presente invenção, proporciona-se métodos para imagiologia de uma ou mais regiões de um doente e especialmente a região renal de um doente. A presente invenção também proporciona métodos para o diagnóstico da presença ou ausência de tecido doente num doente, especialmente a presença ou ausência de tecido renal doente. Os métodos da presente invenção envolvem a administração de um meio contraste na forma, por exemplo, de uma composição de lipidos e/ou vesículas, a um doente. Também se administra ao doente um vasodilatador renal. Faz-se a análise do doente utilizando imagiologia de diagnóstico incluindo, por exemplo, imagiologia com ultra-sons, para obter imagens visíveis de uma região interna, de um modo preferido a região renal de um doente. Os métodos também podem ser utilizados para obter imagens de outras regiões internas do doente incluindo, por exemplo, a vasculatura. No varrimento da região renal, é possível incluir a aorta abdominal. Os presentes métodos podem também ser utilizados juntamente com o fornecimento de um agente bioactivo a uma região interna de um doente.

Relativamente ao vasodilatador renal que é utilizado nos métodos da presente invenção, está disponível uma grande variedade de materiais que podem ser adequados para utilização nos métodos da presente invenção e que, quando administrados a um doente, podem conferir um efeito vasodilatador renal, isto é, dilatação de vasos sanguíneos na região renal e, em particular, dilatação da artéria renal. De um modo preferido, o material é capaz de aumentar o fluxo sanguíneo renal, global. 0 material pode actuar directamente para aumentar o fluxo sanguíneo renal, ou pode ser envolvido nas vias bioquímicas em que se produz um aumento no fluxo sanguíneo renal. De um modo mais preferido, o 108 material actua para inibir a enzima de conversão de angiotensina (ACE). A ACE cataliza a conversão do decapéptido relativamente inactivo, angiotensina I, em angiotensina II, um vasoconstritor endógeno potente, e a destruição da bradiquinina, um vasodilatador potente. The Pharmâcological Basis of Therapeutics, Hardman, Joel G. e Limbird, Lee E., eds chefe, 1996, McGraw-Hill, Nova Iorque, N.Y., pág. 743-751. Em doentes com estenose da artéria renal, o fluxo sanguíneo para o rim é reduzido. 0 rim com fluxo sanguíneo reduzido produz renina que aumenta a tensão técnicarial de modo a melhorar o fluxo sanguíneo para o rim. 0 aumento da tensão técnicarial resulta da acção da renina num substrato de globulina no plasma, na circulação vascular. A angiotensina I é produzida nesta interacção e é hidrolisada pela ACEE a angiotensina II. A administração de inibidores da ACE resulta num efeito vasodilatador, particularmente no rim, uma vez que os vasos renais são particularmente sensíveis aos efeitos vasoconstritores da angiotensina II.

Os inibidores de ACE podem ser agrupados de acordo com as suas estruturas químicas. Os inibidores de ACE contendo sulfidrilo incluem o captopril (1- (3-mercapto-2-metil-l-oxopropil)-L-prolina), fentiapril (ácido 2-(2-hidroxifenil)3-(mercapto-l-oxopropil)-4-tiazodinocarboxílico), pivalopril (N-ciclopentil-N-[3-[2,2-dimetil-l-oxopropil) tio]-2-metil-l-oxopropil] - (S) -glicina), zofenopril, (1-[3- (benzoiltio) -2-metil-1-oxopropil]-4-feniltio)-hidroxi-2,2-dimetil-4-(2-oxo-l-[pirrolidinil)-2H-l-benzopirano-6-carbonitrilo L-prolina) e alacepril ((S)-N-[1-[3- (acetiltio)-2-metil-l-oxopropil]L- prolil]-L-fenílalanina). Inibidores de ACE contendo dicarboxilo 109 incluem o enalapril (1-[N-[1-(etoxicarbonil)-3-fenilpropil]-L-alanil]L-prolina), enalaprilato (o ácido dicarboxilico progenitor do enalapril), lisinopril (di-hidrato de (S)-1[N2-(1-carboxi-3-fenilpropil)-L-lisil]-L-prolina), benazepril (ácido 3-[[1-etoxi-carbonil)-3-fenil- (IS)propil]amino]-2,3,4,5-tetra-hidro-2-oxo-lH-l-(3S)benzazepina-l-acético), quinapril (ácido 3S-[2 [R*(R*)]f 3R*]]-2-[2[ [1 -etoxicarbonil) -3- fenilpropil]amino]-1-oxopropil]-1,2,3,4-tetra-hidro-3-isoquinolinocarboxílico], moexipril (ácido 2-[[1-etoxicarbonil]-3-fenilpropil])amino]-1-oxopropil]-1,2,3,4-tetra-hidro-6,1 -dimetoxi-3-isoquinolinocarboxílico [3S-[2R* (R*)],3R*]]-), ramipril (ácido 2S-[ 1 [R* (R*) ] ,2a;3a$, 6a$] ]-1-[2-[ [1- (etoxicarbonil]-3-fenilpropil]amino]1-oxopropil]octa-hidrociclopenta[b]pirrolo-2-carboxílico), espirapril (mistura de ácido 7-[2-[[1-etoxicarbonil)-3-fenilpropil]amino]-1-oxopropil]-lH-indolo-2-carboxílico; ácido [8S-[7[R* (R*), 8R*]] -lH-indolo-2-carboxílico com 3-[2-4-(4-fluorobenzoil)-l-piperidinil]etil]~ 2,4 (1H,3H)-quinazolinodiona), perindopril (ácido 2S-[1-[R, (R*) ] ,2α; 3άβ, 7aP] ] -1- [2- [ [1- (etoxicarbonil Jbutil]amino) -1- oxopropil]octa-hidro-lH-indolo-2-carboxílico), indolapril (ácido 1-[2-[[1-(etoxicarbonil]-3-fenilpropil]amino]-1-oxopropil]octa-hidro-lH-indolo-2-carboxílico;, [2S- [1 [R* (R*) ] ,2a,3a§, 7a$] ] , indalapril ((S)-N- (2,3-di-hidro-lH-inden-2-il]-N-[N-{l- etoxicarbonil)-3-fenilpropil]-L-alanil] glicina e cilazapril (ácido IS- [ [la, 9a (R*) ] ] -9- [ [1-etoxicarbonil) -3- fenilpropil]amino]octa-hidro-10-oxo-6H-piridazino[1,2-a][1,2}diazepina-l-carboxílico mono-hidrato) . Inibidores de ACE contendo fósforo incluem fosinopril ((2a;4§]4-ciclo-hexil-l-[ [ [2-metil-l- (1-oxopropoxi)propoxi] (4- fenilbutil)fosfinil]acetil]-L-prolina). Estes compostos estão descritos, por exemplo, em The Pharmacological Basis of 110

Therapeutics, Hardman, Joel G. e Limbird, Lee E., eds. chefe, 1996, McGraw-Hill, Nova Iorque, N.Y., pág. 743-751, e em The Merck Index, 11a Ed., 1989. Merck & Co. Estes, bem como outros compostos vasodilatadores adequados, serão facilmente evidentes para os especialistas na técnica, uma vez munidos com a presente descrição. Pode utilizar-se os sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos inibidores de ACE, desde que o fornecimento, eficácia e biodisponibilidade do inibidor não sejam comprometidos. Prefere-se para utilização no método da presente invenção, o captopril e enalapril. 0 captopril é preferido para administração oral e a dosagem oral preferida é desde cerca de 25 miligramas até cerca de 50 miligramas, dependendo do peso corporal do doente, de cerca de 0,5 até cerca de 5 horas, de um modo preferido de cerca de 1 até cerca de 2 horas antes da análise do doente. O enalapril é preferido para administração intravenosa. Em geral, o enalapril é injectado desde cerca de 15 minutos até cerca de 2 horas antes da análise do doente.

Se desejado, as composições de lipidos, proteína, polímeros e/ou vesículas aqui descritas, podem ainda compreender um agente para orientação para um alvo, para promover a orientação para tecidos e/ou receptores in vivo incluindo, por exemplo, o tecido renal. Agentes de orientação adequados, métodos para a sua incorporação em composições de lipidos e/ou vesículas e métodos para utilização destas composições direccionadas, estão descritos, por exemplo, no pedido U.S. co-pendente com o N° de série 08/640 464, apresentado em 1 de Maio de 1996 e o pedido U.S. com o N° de série 08/660 032, apresentado em 6 de Junho de 1996.

Como o especialista na técnica reconhecerá, a administração das composições de lipidos e/ou vesículas aqui descritas, bem 111 como dos vasodilatadores renais, pode ser realizada de vários modos, incluindo parentérica, oral ou intraespecialistanealmente. A administração parentérica que é preferida, inclui a administração pelas seguintes vias: intravenosa, intramuscular, intersticial, intra-técnicarial, subcutânea, intraocular; intrassinovial, transepitelial, incluindo transdérmica, pulmonar via inalação, oftálmica, sublingual e bocal; topicamente, incluindo oftálmica, dérmica, ocular, rectal; e inalação nasal por insuflação. A administração intravenosa é preferida entre as vias de administração parentérica. Pode utilizar-se várias combinações de composições de lipidos e/ou vesículas e vasodilatadores renais para alterar as propriedades como desejado, incluindo viscosidade, osmolaridade ou palatabilidade. Ao realizar os métodos de imagiologia da presente invenção, o meio de contraste, incluindo vasodilatador renal, pode ser utilizado sozinho ou em combinação com agentes de diagnóstico, terapêuticos ou outros, adicionais. Estes outros agentes incluem excipientes tais como materiais aromatizantes ou corantes.

As técnicas de imagiologia por CT que são utilizadas são convencionais e são descritas, por exemplo em Computed Body Tomography, Lee, J.KT., Sagel. S.S., e Stanley, R.I., eds., 1983, Ravens Press, Nova Iorque, N. Y., especialmente nos seus dois primeiros capítulos intitulados "Physical Principies and Instrumentation". Ter-Pogossian. M.M., e "Techniques". Aronberg, D. J..

As técnicas de imagiologia por ressonância magnética, em particular direccionadas para a imagiologia da região renal, estão descritas, por exemplo, em Brown et ai., "Magnetic

Resonance Imaging of the Adrenal Gland and Kidney", Topics in 112

Magnetic Resonance Imaging, Vol. 7(2), pág. 90-101 (1995); Krestin, "Magnetic Resonance Imaging of the Kidneys: Current Status", Magnetic Resonance Qutécnicarly. Vol. 10(1), pág. 2-21 (Março 1994); Lee, "Recent Advances in Magnetic Resonance

Imaging of Renal Masses". Canadian Association of Radiologists Journal, Vol. 42(3), pág. 185-9 (Junho de 1991); Lubat et al. "Magnetic Resonance Imaging of the Kidneys and Adrenals", Vol. 2(3), pág. 17-36 (Junho de 1990); Baumgartner et al., "Magnetic Resonance Imaging of the Kidneys and Adrenal Glands". Seminars in Ultrasound, CT and MR. Vol. 10(1), pág. 43-62 (Fevereiro de 1989); Choyke et al., "The Role of MRI in Diseases of the

Kidney", Radiologic Clinics of North America Vol. 26(3), pág. 617-31 (Maio de 1988); e Papanicolaou et al., "Magnetic

Resonance Imaging of the Kidney". Urologic Radiology. Vol. 8(3), pág. 139-50 (1986) .

No que se refere aos ultra-sons, as técnicas de imagiologia por ultra-sons, incluindo imagiologia com segunda harmónica e imagiologia controlada, são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Uhlendorf, "Physics of Ultrasond Contrast Imaging; Scattering in the Linear Range", IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control, Vol. 14(1), pág. 70-79 (1994) e Sutherland, et al., "Color Doppler Myocardial Imaging: A New Technique for the Assessment of Myocardial Function", Journal of the American Society of Echocardiography, Vol. 7(5), pág. 441-458 (1994).

No caso de aplicações de diagnóstico, tais como ultra-sons, CT e MRI, a energia, como a energia de ultra-sons, pode ser aplicada a, pelo menos, uma porção do doente para se obter imagens do tecido alvo. Pode-se então obter uma imagem visível de uma região interna do doente, de um modo preferido a região 113 renal, de modo a poder determinar-se a presença ou ausência de tecido doente.

Os ultra-sons podem ser utilizados quer para fins de diagnóstico quer terapêuticos. Em ultra-sons de diagnóstico, pode aplicar-se ondas de ultra-sons ou um conjunto de pulsos de ultra-sons com um transdutor. Os ultra-sons são geralmente pulsados (intermitentemente) e não continuamente, embora possa ser continuo, se desejado. Assim, os ultra-sons de diagnóstico envolvem geralmente a aplicação de um pulso de ecos, após o que, durante um periodo de audição, o transdutor de ultra-sons recebe sinais reflectidos. Pode utilizar-se harmónicas, ultra-harmónicas e sub-harmónicas. 0 modo de segunda harmónica pode ser utilizado beneficamente, podendo receber-se uma frequência de 2x, em que x é a frequência de incidência. Isto poderá servir para diminuir o sinal do material de ruido de fundo e aumentar o sinal do transdutor, utilizando o meio de contraste da presente invenção que pode ser direccionado para o local desejado. Outros sinais harmónicos, tais como sinais harmónicos impares, por exemplo de 3x ou 5x, podem ser igualmente recebidos utilizando este método. Os sinais sub-harmónicos, por exemplo, x/2 e x/3, também podem ser recebidos e processados de modo a formar uma imagem.

Além do método pulsado, pode aplicar-se ultra-sons em ondas continuas, por exemplo Power Doppler. Isto pode ser particularmente útil quando se utilizam vesículas rígidas, por exemplo, vesículas formuladas a partir de poli(metacrilato de metilo) ou cianometacrilato. Neste caso, pode-se fazer com que a energia relativamente mais elevada do Power Doppler faça ressonância nas vesículas, promovendo assim a sua ruptura. Isto pode criar emissões acústicas que podem ser na gama sub- 114 na mesma harmónica ou ultra-harmónica ou, nalguns casos, frequência que os ultra-sons aplicados. É contemplado que possa haver um espectro de assinaturas acústicas libertadas neste processo e o transdutor utilizado poderá receber as emissões acústicas para detectar, por exemplo, a presença de um coágulo. Além disso, o processo de ruptura da vesícula pode ser utilizado para transferir energia cinética à superfície, por exemplo de um coágulo, para promover a lise do coágulo. Assim, poder-se-á atingir uma trombólise terapêutica durante a combinação de ultra-sons de diagnóstico e terapêuticos. Os espectros de Doppler também podem ser utilizados. Em geral, os níveis de energia de ultra-sons de diagnóstico são insuficientes para promover a ruptura de vesículas e para facilitar a libertação e absorção celular de agentes bioactivos. Como referido acima, os ultra-sons diagnósticos podem envolver a aplicação de um ou mais pulsos de som. As pausas entre os pulsos permitem que os sinais sónicos reflectidos sejam recebidos e analisados. 0 número limitado de pulsos utilizados em ultra-sons de diagnóstico limitam a energia efectiva que é fornecida ao tecido que está a ser estudado.

Os ultra-sons de energia elevada, por exemplo, ultra-sons que são gerados por equipamento de ultra-sons terapêuticos, são geralmente capazes de provocar a ruptura da vesícula. Em geral, os dispositivos para ultra-sons terapêuticos utilizam desde cerca de 10 a cerca de 100% de ciclos de trabalho, dependendo da área de tecido a ser tratada com os ultra-sons. As áreas do corpo que geralmente se caracterizam por maiores quantidades de massa muscular, por exemplo, costas e coxas, bem como tecidos altamente vascularizados, tal como tecido cardiovascular, poderão necessitar de um ciclo de trabalho maior, por exemplo de cerca de 100%. 115

Em ultra-sons terapêuticos, utiliza-se ultra-sons de onda continua para fornecer níveis de energia elevados. Para a ruptura das vesículas, prefere-se ultra-sons de ondas contínuas, embora a energia do som também possa ser pulsada. Quando se utiliza energia do som pulsada, o som será geralmente pulsado em comprimentos de séries de eco desde cerca de 8 a cerca de 20 ou mais pulsos de cada vez. De um modo preferido, os comprimentos de séries de eco são de cerca de 20 pulsos de cada vez. Além disso, a frequência do som utilizada pode variar desde cerca de 0, 025 a cerca de 100 megahertz (MHZ) . Em geral, a frequência para ultra-sons terapêuticos varia de um modo preferido entre cerca de 0,75 e cerca de 3 MHZ, sendo preferido desde cerca de 1 até cerca de 2 MHZ. Além disso, os níveis de energia podem variar desde cerca de 0,5 Watt (W) por centímetro quadrado (cm2) até cerca de 5,0 W/cm2, sendo preferidos níveis de energia desde cerca de 0,5 até cerca de 2,5 W/cm2. Os níveis de energia para ultra-sons terapêuticos envolvendo hipertermia são geralmente desde cerca de 5 W/cm2 até cerca de 50 W/cm2. Para vesículas muito pequenas, por exemplo, vesículas com um diâmetro inferior a cerca de 0,5 μιη, prefere-se geralmente frequências de som mais elevadas. Isto porque as vesículas menores podem ser capazes de absorver energia sónica de modo mais eficaz a frequências de som mais elevadas. Quando se utilizam frequências muito elevadas, por exemplo, superiores a cerca de 10 MHZ, a energia sónica pode penetrar os fluidos e tecidos apenas até uma profundidade limitada. Assim, a aplicação externa de energia sónica pode ser adequada para a pele e outros tecidos superficiais. No entanto, é geralmente necessário para estruturas mais profundas, focar a energia ultra-sónica de modo a que seja de um modo preferido direccionada numa zona focal. Alternativamente, a energia ultra- sónica pode ser aplicada por sondas intersticiais, cateteres de 116 ultra-sons intravasculares e cateteres endoluminais. Estas sondas ou cateteres podem ser utilizados, por exemplo, no esófago, para o diagnóstico e/ou tratamento do carcinoma esofágico. Além das utilizações terapêuticas acima discutidas, as composições aqui descritas podem ser utilizadas no carcinoma do esófago ou nas artérias coronárias, para o tratamento de aterosclerose, bem como em utilizações terapêuticas descritas, por exemplo, na patente U.S. N° 5 149 319, cuja descrição é aqui incorporada por referência, na sua totalidade.

Pode utilizar-se um dispositivo de ultra-sons terapêutico que utiliza duas frequências de ultra-sons. A primeira frequência pode ser definida como x, e a segunda frequência pode ser definida como 2x. Na forma preferida, o dispositivo será concebido de modo que as zonas focais da primeira e segunda frequências convergiam para uma única zona focal. A zona focal do dispositivo pode ser então direccionada para as composições, por exemplo, composições de vesículas, no tecido da região de interesse. Este dispositivo de ultra-sons pode proporcionar uma terapia com segunda harmónica, com aplicação simultânea das frequências x e 2x da energia de ultra-sons. É contemplado que, no caso das vesículas envolvendo ultra-sons, esta terapia com segundas harmónicas possa proporcionar uma ruptura melhorada das vesículas, em comparação com a energia de ultra-sons envolvendo uma única frequência. Além disso, contempla-se que a gama de frequências preferida possa residir nas frequências harmónicas fundamentais das vesículas. Também se pode utilizar uma energia mais baixa com este dispositivo. Um dispositivo de ultra-sons que pode ser utilizado na terapia de segunda harmónica acima referida é descrito, por exemplo, em Kawabata, K. et ai., Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 3, pág. 1-5 (1996), cuja descrição é aqui incorporada por referência, na sua totalidade. 117

No caso das composições de vesículas formuladas a partir de lípidos, a concentração de lípidos necessária para formar a vesícula estabilizada, desejada, pode variar, dependendo, por exemplo, do tipo de lípido utilizado, e pode ser facilmente determinada por experimentação de rotina. Por exemplo, em formas de realização preferidas, a concentração de 1,2-dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) utilizada para formar vesículas estabilizadas de acordo com os métodos da presente invenção, pode ser desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 30 mg/mL de solução salina, de um modo mais preferido desde cerca de 0,5 mg/mL até cerca de 20 mg/mL de solução salina e de um modo ainda mais preferido desde cerca de 1 mg/mL até cerca de 10 mg/mL de solução salina. A concentração de diastearoilfosfatidilcolina (DSPC) utilizada em formas de realização preferidas pode ser desde cerca de 0,1 mg/mL até cerca de 30 mg/mL de solução salina, de um modo mais preferido desde cerca de 0,5 mg/mL até cerca de 20 mg/mL de solução salina e de um modo ainda mais preferido desde cerca de 1 mg/mL até cerca de 10 mg/mL de solução salina.

As dosagens úteis de agente de contraste e vasodilatador renal a serem administradas e o modo particular de administração, podem variar dependendo da idade, peso, e mamífero particular e região deste a ser analisada e do meio de contraste e/ou vasodilatador renal a serem utilizados. Tipicamente, a dosagem pode ser iniciada a níveis inferiores e aumentada até se obter a potenciação do contraste, ou outro efeito desejado. Em relação ao agente de contraste, a dose IV pode ser inferior a cerca de 10 mL para um doente de 70 Kg, sendo preferidas doses menores. A dosagem do vasodilatador renal pode variar, por exemplo, desde cerca de 0,01 até cerca de 118 100 mg/Kg, ou desde cerca de 0,4 até cerca de 10 g ou mais. Em formas de realização preferidas que envolvem a administração de composições que compreendem DPPC, DPPE e DPPE PEG-5000, em combinação com um vasodilatador renal, o vasodilatador renal é de um modo preferido administrado ao doente a uma dosagem desde cerca de 0,01 até cerca de 30 mg/mL, de um modo preferido desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 1 mg/mL, de um modo mais preferido desde cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 0,1 mg/mL.

As composições aqui descritas, e especialmente as composições de vesículas, são úteis como meio de contraste em imagiologia de diagnóstico e podem também ser adequadas para utilização em todas as áreas em que se utiliza imagiologia de diagnóstico. No entanto, as vesículas estabilizadas são particularmente úteis para imagiologia de perfusão.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se métodos de imagiologia da região renal e/ou especificamente para o diagnóstico da presença de tecido doente na região renal. O processo de imagiologia da presente invenção pode ser realizado administrando um agente de contraste e um vasodilatador renal a um doente e em seguida analisando o doente, utilizando, por exemplo, imagiologia por ultra-sons, tomografia computorizada e/ou ressonância magnética, para obter imagens visíveis de uma região interna de um doente e/ou de qualquer tecido doente nessa região. Os métodos podem ser particularmente úteis para proporcionar imagens da região renal, mas também podem ser utilizados de modo mais amplo, tal como na imagiologia da vasculatura da região gastrointestinal, ou de outros modos como serão imediatamente evidentes aos especialistas na técnica. 0 doente pode ser qualquer tipo de animal, mas é de um modo muito preferido um humano. 119 A presente invenção também proporciona métodos para diagnosticar a presença de tecido doente num doente, especialmente tecido doente na cardiovasculatura. Tecido doente incluiu, por exemplo, tecido endotelial que resulta da vasculatura que suporta tecido doente. Como um resultado, a localização e visualização de tecido endotelial numa região do doente que em circunstâncias normais não está associada a tecido endotelial fornece uma indicação de tecido doente na reqião. Além disso, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para diagnosticar a presença ou ausência de doença técnicarial renal incluindo, por exemplo, estenose técnicarial renal. Outras doenças da cardiovasculatura que podem ser visualizadas e/ou diagnosticadas com os métodos da presente invenção serão imediatamente evidentes a um técnico médio na técnica, uma vez munido com a presente descrição.

Como referido acima, a administração das composições descritas aqui pode ser realizada de vários modos, tal como por via intravascular, oral, rectal e semelhantes, utilizando uma variedade de formas de dosagem. Quando a região a ser analisada é a região cardiovascular, a administração do meio de contraste é realizada de um modo preferido por via intravascular incluindo, por exemplo, intravenosa. Quando a região a ser analisada é a região renal, a administração do meio de contraste é realizada de um modo preferido por via oral ou intravascular. Quando a região a ser analisada é a região gastrointestinal, a administração do meio de contraste é realizada de um modo preferido por via oral ou rectal. A administração do vasodilatador renal também pode ser realizada de vários modos, tal como por via intravascular ou oral, dependendo do vasodilatador renal particular, utilizado. Por exemplo, os 120 nitrovasodilatadores, como a nitroglicerina, podem ser administrados IV, bem como transdermicamente. 0 modo ou modos adequados de administração do vasodilatador renal serão facilmente evidentes para o especialista na técnica, uma vez munido com a presente descrição. A administração pode ser continua (constante) ou intermitente (e. g. pulsada), como desejado, por exemplo por infusão intravenosa continua ou por infusão intravenosa intermitente.

Pode utilizar-se várias combinações de lipidos, proteínas, polímeros e/ou vesículas, para modificar o comportamento de relaxação do meio, ou para alterar propriedades como a viscosidade, osmolaridade ou palatabilidade (no caso de materiais administrados oralmente). A ecogenecidade das vesículas e especialmente das vesículas cheias com gás, e a capacidade de ruptura das vesículas à frequência de ressonância máxima, utilizando ultra-sons, permite o fornecimento controlado de agentes bioactivos a uma região interna de um doente. Especificamente, as vesículas podem ser monitorizadas subsequentemente à sua administração a um doente, para determinar a velocidade a que as vesículas chegam, por exemplo, a uma região desejada. Além disso, as vesículas podem ser rompidas utilizando ultra-sons para libertar um agente bioactivo na região.

De acordo com a presente invenção, também se proporcionam métodos para medir o fluxo sanguíneo na região renal de um doente. De acordo com este aspecto da invenção, proporciona-se certas formas de realização que podem envolver primeiro a aplicação à região de interesse, de um pulso substancial de energia ultra-sónica, por exemplo, um pulso de energia ultra- 121 sónica de até cerca de 0,5 W/cm2, de um modo preferido de cerca de 0,1 W/cm2, para proporcionar uma "onda quadrada" de energia. Esta onda quadrada de energia pode proporcionar uma reflectividade substancial e, portanto, uma clareza substancial na imagem de ultra-sons. À medida que a energia de onda quadrada se torna diluída na corrente sanguínea, a clareza da imagem de ultra-sons correspondente decresce de modo semelhante. A observação e análise da velocidade à qual a onda quadrada de energia se torna diluída, pode proporcionar uma indicação da velocidade de fluxo sanguíneo renal.

Noutra forma de realização de um método para medir o fluxo sanguíneo na região renal de um doente, proporciona-se aqui métodos que envolvem geralmente a administração a um doente, de um agente de contraste, de um modo tal que mantenha a concentração do agente de contraste na região renal num nível aproximadamente constante. Isto pode ser conseguido utilizando qualquer um de uma variedade de métodos incluindo, por exemplo, uma injecção intravenosa constante de agente de contraste.

Em formas de realização preferidas da presente invenção, as composições de lípidos e/ou vesículas podem ser administradas por seringa, isto é por injecção intravenosa (IV). Assim, as velocidades de administração de gás e/ou vesículas aqui proporcionadas correspondem geralmente às velocidades de injecção. Tal como será evidente para um especialista na técnica, uma vez munido com a presente descrição, o local no corpo do doente em que as composições de lípidos e/ou vesículas são injectados, pode variar e depende de uma variedade de factores incluindo, por exemplo, a composição de lípidos e/ou vesículas, particular, utilizada, a aplicação contemplada, tal como aplicação de diagnóstico ou terapêutica e a região 122 particular de interesse. Por exemplo, no caso de ultra-sons de diagnóstico do tecido do miocárdio, as composições de lípidos e/ou vesículas podem ser injectadas intravenosamente (IV), por exemplo, no braço de um doente. A administração IV dos agentes de contraste aqui descritos incluindo, por exemplo, as composições de vesículas, pode envolver a administração através de uma seringa. Isto poderá ser conseguido, por exemplo, por um técnico médico adequado que manuseia a seringa ou seringas manualmente. Alternativamente, a administração pode ser realizada mecanicamente, por exemplo, utilizando um dispositivo de infusão constante, tal como um injector mecânico que opera utilizando pressão pneumática ou hidráulica. Os injectores mecânicos adequados que podem ser utilizados nos métodos da presente invenção, incluem uma bomba de seringa Modelo 351, disponível no mercado de Sage Instruments (uma divisão da Orion Research Inc., Boston, MA) um injector de potência MedRad™, comercialmente disponível da Medrad, Inc. (Pittsburgh, PA) ou um Liebel Flarsheim, comercialmente disponível de Liebel Flarsheim Co. (Cincinnati, OH). De um modo preferido, o agente de contraste é administrado durante um período de tempo de, pelo menos, cerca de 1 segundo, de um modo mais preferido de cerca de 5 segundos até cerca de 30 segundos ou mais, dependendo, por exemplo, do agente de contraste particular utilizado, do volume de injecção e semelhantes. No caso dos agentes de contraste baseados em vesículas, o período de tempo de administração pode também depender, por exemplo, da concentração de vesículas no agente de contraste, do tamanho de vesículas e da distribuição do tamanho de vesículas no agente de contraste. A análise da região renal por imagiologia de diagnóstico tal como, por exemplo, imagiologia por ultra-sons, proporciona uma imagem de diagnóstico da região renal. Mantendo 123 a concentração de agente de contraste na região renal substancialmente constante, pode-se proporcionar, desejavelmente, um nivel substancialmente constante de clareza, nesta imagem de diagnóstico. A administração subsequente ao doente, de um vasodilatador renal pode então aumentar o fluxo sanguíneo renal, o que, como discutido acima, pode também aumentar a concentração de agente de contraste no tecido renal.

As imagens obtidas através de imagiologia, tais como de imagiologia por ultra-sons, podem ser analisadas qualitativamente, mas utiliza-se, de um modo preferido, técnicas quantitativas. 0 sinal de videodensitometria pode ser digitalizado e analisado, para determinar alterações na intensidade do sinal. Pode fazer-se várias medições comparativas. Por exemplo, a comparação de videodensitometria dos dois rins pode ser feita para determinar se um rim exibe uma resposta videodensitométrica relativamente menor, indicando a presença provável de hipertensão da artéria renal num rim. Alternativamente, a videodensitometria de um ou ambos os rins pode ser comparada com a da aorta abdominal. Utilizando a videodensitometria da aorta como linha de base, é possível comparar o aumento relativo nos rins, num doente que se pensa ter hipertensão renal, com um aumento convencional ajustado à idade para um doente normal, o que pode proporcionar uma indicação da extensão de qualquer estenose renal. Pode utilizar-se métodos subtractivos, por exemplo, para comparar dois rins no mesmo doente, ou para comparar a videodensitometria antes da potenciação de contraste, por administração do agente de contraste com a videodensitometria após a potenciação de contraste. 124

Para os fins dos métodos descritos de acordo com a presente forma de realização, entende-se que a concentração de vesículas é praticamente proporcional à clareza de uma imagem de diagnóstico, particularmente uma imagem de ultra-sons que por sua vez é aproximadamente proporcional à velocidade do fluxo sanguíneo na região renal. Também para fins dos métodos descritos na presente forma de realização, entende-se que as vesículas seguem, de um modo preferido, uma velocidade de eliminação de primeira ordem. No entanto, outras ordens de velocidade, tal como velocidades de ordem zero, de segunda ou terceira ordem podem também ser aplicadas a estes métodos.

Considerando o exposto, pode obter-se uma indicação da percentagem de aumento no fluxo renal, proporcionado pelo vasodilatador renal, utilizando uma derivação simples: -d[vesículas]/dT = k[vesículas] em que [vesículas] = concentração de vesículas; k = constante de velocidade de um processo de primeira ordem (seg'1); e T = tempo (segundos).

Sabendo também que há de um modo preferido uma correlação entre a concentração de vesículas, a videodensitometria e o fluxo sanguíneo renal, a qual pode ser definida, por exemplo, por uma constante de correlação k, então: -d[vesículas]/dT = k[vesículas] » d[videodensitometria]/dT = k[videodensitometria] em que 125 vídeo em unidades de [videodensitometria] = clareza videodensitometria (VDU's).

Redefinindo a equação acima, obtém-se o seguinte:

-d[videodensitometria]/[videodensitometria] = kdT

Assim,

-J* d[videodensitometria]/[videodensitometria] = S kdT ou

ln [videodensitometriat=o -videodensitometriat] = kT a expansão da equação anterior origina:

[videodensitometriat] = [videodensitometriat=o] = e~kT

Com a medição de uma videodensitometria de linha de base no tempo t = 0 que, na presente forma de realização, se refere à videodensidade de uma imagem de diagnóstico da região renal com uma infusão constante de agente de contraste e a videodensitometria final no tempo T = t que, na presente forma de realização se refere à videodensidade de uma imagem de diagnóstico da região renal após administração de um vasodilatador renal, pode determinar-se uma constante de velocidade para o aumento no fluxo renal, a uma determinada dosagem de vasodilatador renal. 126

Sabendo que o fluxo sanguíneo na região renal é aproximadamente proporcional à videodensitometria, então por substituição obtém-se:

[fluxot] = [fluxot=o] = e~kT

Assim, o aumento relativo (%) no fluxo sanguíneo renal pode ser determinado utilizando uma administração constante de agente de contraste e uma vez munido do conhecimento da alteração na clareza do tecido renal em imagiologia ultra-sónica, após administração de um vasodilatador renal. As variações na correlação entre fluxo, videodensitometria e concentração de microbolhas por unidade de tempo que pode ocorrer, pode afectar a precisão da determinação de aumentos no fluxo sanguíneo renal. No entanto, as correcções de qualquer não linearidade ou não proporcionalidade podem ser incorporadas nos cálculos. Por exemplo, pode-se proporcionar correcções de variações entre concentração de vesícula e quantificação de imagem, por exemplo, utilizando técnicas descritas em Eriksen, M. "Tissue Echo Intensity and Blood Attenuation Changes - The Pitfalls of Video Densitometry", The Second Annual International Symposium on Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Atlantic City, NJ (7 de Maio de 1996) .

Podem utilizar-se técnicas de calibração para melhorar a precisão da correlação dos dados de densitometria com o fluxo sanguíneo. Por exemplo, um método de calibração interna, tal como o descrito em Mor-Avi, V. et al., Ultrasound in Medicine and Biology 19(8), pág. 619-33 (1993) para utilização no cálculo do fluxo sanguíneo do miocárdio, pode ser adaptado para utilização na região renal. Poderão persistir inexactidões devido à não linearidade a concentrações relativamente elevadas 127 de agente de contraste. Alternativamente, pode utilizar-se um método de calibração externo para determinar a relação entre a videodensidade e o volume de agente de contraste num sistema modelo. As imagens obtidas por análise de um doente utilizando o agente de contraste calibrado podem ser processadas para calcular velocidades de fluxo sanguíneo com base no sistema modelo. Com uma técnica de calibração externa, podem-se fazer correcções para compensar as não linearidades na resposta acústica, a concentrações mais elevadas de agente de contraste e as diferenças nas propriedades reológicas entre o agente de contraste e os glóbulos vermelhos no doente.

Os Exemplos 1 e 2 são exemplos efectivos, os Exemplos 3 e 4 são proféticos.

Exemplos Exemplo 1

Este exemplo descreve a preparação de uma composição de vesículas lipidicas para utilização nos métodos da presente invenção. "DPPC" refere-se a dipalmitoilfosfatidilcolina; "DPPE" refere-se a dipalmitoilfosfatidiletanolamina; e "DPPA" refere-se a ácido dipalmitoilfosfatidico. "PEG5000" refere-se ao polímero poli(etilenoglicol) com um peso molecular de cerca de 5000. "DPPE-PEG5000" refere-se a DPPE que está ligado de forma covalente a PEG5000, em que o DPPE e PEG5000 estão presentes numa relação em peso de cerca de 20:80. "PFP" refere-se a gás perfluoropropano. 128 A uma solução de soro fisiológico, propilenoglicol e glicerol (8:1:1) adicionou-se DPPC, DPPE-PEG5000 e DPPA, numa razão molar de 82:8:10. A mistura resultante foi aquecida a cerca de 45 °C e filtrada (0,22 μπι) . A mistura filtrada foi colocada num frasco e deixada arrefecer à temperatura ambiente. O frasco foi colocado sob vácuo, para evacuar qualquer gás, após o que o frasco foi pressurizado com PFP. O frasco foi então selado, colocado num agitador e agitado à temperatura ambiente, para proporcionar uma solução de vesículas cheias com PFP, com um diâmetro médio de cerca de 2,5 μιη. A concentração de vesículas na solução era de cerca de 1,5 x 109 vesículas/mL.

Exemplo 2

Este exemplo descreve a utilização de vesículas preparadas de acordo com o Exemplo 1 na imagiologia de rins num mamífero, para detectar um rim obstruído.

Um cão mongrel fêmea, de 18 kg, foi anestesiado utilizando halotano (C2HBrClF3) . A artéria renal que conduz ao rim esquerdo foi exposta a um obstrutor pneumático de 2 mm (Invivometric, Healdsburg, CA) e ligou-se uma sonda de fluxo Doppler (Trnasonic, Ithaca NY). 0 abdómen foi fechado com suturas e fez-se a imagiologia com ultra-sons, utilizando uma máquina de ultra-sons Acoustic Imaging 5200S, com um transdutor linear de 7,5 MHz (Acoustic Imaging, Phoenix, AZ) transabdominalmente. O obstrutor pneumático foi inflado até a velocidade de fluxo ser reduzida de 44 mL/min para 22 mL/min. As vesículas preparadas de acordo com 129 o Exemplo 1 foram injectadas a uma dose de 0,02 cc/kg (3,0 X 107 vesículas/kg) através de um cateter na veia cefálica e procedeu-se à imagiologia do rim esquerdo (obstruído). Este processo foi então repetido no rim direito (não obstruído). A artéria renal esquerda estava obstruída durante a imagiologia do rim não obstruído. Uma dose de 330 microlitros (μύ) de enalapril (1,25 mg/mL) (Vasotec, Merck, Sharp and Dhome, West Point, PA) foi administrada através do cateter cefálico. Deram-se 30 minutos para o enalapril actuar e em seguida tornou-se a inflar o obstrutor pneumático, para reduzir o fluxo para 22 mL/min. Administrou-se mais uma dose de 0,02 cc/kg (3,0 X 107 vesículas/kg) de vesículas para cada rim e fez-se a imagiologia. Fez-se imagiologia com ultra-sons fundamental, contínua, durante um período de quatro minutos após cada injecção de vesículas. Deixou-se correr um período de dez minutos entre cada injecção, para permitir a eliminação das vesículas da região renal.

As imagens foram então capturadas utilizando um vídeo Panasonic SV 3350 SVHS (Japão) e um computador Macintosh Centris 660AV (Apple Computer, Cupertino, CA) . As imagens capturadas foram analisadas utilizando Image 1.55, um pacote de software de análise de imagem distribuído pela NIH (Bethesda, MD). As regiões de interesse foram seleccionadas a partir do rim obstruído, antes da administração do enalapril ("pré-enalapril") e após a administração do enalapril ("pós-enalapril") e a partir do rim não obstruído, pré-enalapril e pós-enalapril. Os dados são apresentados na tabela a seguir. Um decréscimo na videodensitometria (indicado por um número negativo) significa que a imagem se torna mais escura e um aumento indica um aumento na clareza. O termo "pré-contraste" indica uma medição de 130 videodensitometria recolhida antes da administração das vesículas. 0 termo "pós-contraste" indica uma medição de videodensitometria recolhida após a administração das vesículas. Os dados são apresentados como resultado das subtracções indicadas. Por exemplo, [pré-contraste - pós-contraste] representa a subtracção da medição de videodensitometria após a administração das vesículas, da medição de videodensitometria antes da administração das vesículas. "Pré-enalapril" significa antes da administração do enalapril. "Pós-enalapril" significa após a administração de enalapril

Tratamento Alteração na medição de videodensitometria [pré-contraste - pós-contraste], pré enalapril, rim obstruído 11,84 [pré-contraste - pós-contraste], pós enalapril, rim obstruído 8,59 Rim obstruído [pré-enalapril -pós enalapril] -3,25 [pré-contraste - pós-contraste], pré enalapril, rim não obstruído 31,74 [pré-contraste - pós-contraste], pós enalapril, rim não obstruído 49,20 [pré-enalapril - pós enalapril] Rim não obstruído 17,46

Como se pode ver pelos dados acima, há um aumento mensurável na clareza no rim não obstruído, após a administração do enalapril. No rim obstruído, no entanto, as medições permanecem bastante constantes. 131

Exemplo 3

Este exemplo descreve a utilização de vesículas preparadas de acordo com o Exemplo 1 na imagiologia ultra-sónica para medir o fluxo renal num mamifero.

Um cão de 20 kg é anestesiado utilizando Halotano. A artéria renal é exposta a um obstrutor pneumático de 2 mm, como no Exemplo 2 e liga-se uma sonda de fluxo Doppler à artéria renal, do mesmo modo que no Exemplo 2. As vesículas preparadas de acordo com o Exemplo 1 (6 x 107 vesiculas/cc em solução salina) são pré-aquecidas a 37 °C e são então continuamente injectadas a um fluxo de 1 cc/minuto, através de um cateter, na veia cefálica.

Faz-se imagiologia por ultra-sons no rim, utilizando uma máquina de ultra-sons Hewlett Packard (Hewlett Packard, Boston, MA). Utiliza-se imagiologia de segunda harmónica com transmitância a 2 MHz, recebendo a 5 MHz. Aplica-se então um pulso com uma energia de 1,0 Watts/cm2 intermitentemente, para romper as vesículas. O exemplo é repetido 5 vezes, com intervalos de tempo variáveis (1, 2, 3, 4 e 5 segundos, respectivamente) entre cada pulso de ruptura. A videodensitometria é realizada no indivíduo. Obtém-se o aparecimento do sinal de videodensidade após um pulso de ruptura, designado por "B". O sinal correlaciona-se directamente com o fluxo sanguíneo renal (constante de correlação r = 0,88-0,98). Os sinais de videodensitometria normalizados (y) são calculados utilizando a fórmula y = A(1—10_B/At), em que A é a densidade pico de vídeo e correlaciona-se directamente com a 132 quantidade de sangue no tecido renal e t é o intervalo de tempo entre o pulso de imagiologia e o pulso de ruptura.

Os dados são representados graficamente na Figura 1. "A" representa a videodensidade de pico, ou máxima que ocorre quando o fluxo de sangue forneceu ao tecido renal a quantidade máxima de vesículas, gerando assim o sinal de videodensidade máximo. Após um pulso de ruptura, as vesículas rompem e o sinal cai. À medida que o fluxo sanguíneo fornece mais uma vez vesículas, o sinal de videodensidade reaparece. "B" representa o reaparecimento do sinal de videodensidade. Quanto mais elevado for o sinal, mais vesículas estão na região e, correspondentemente, mais elevada é a velocidade do fluxo sanguíneo. À medida que mais vesículas são transportadas para a região, o sinal B aumenta. 0 sinal é representado nas Figuras como a razão entre o sinal de videodensidade que reaparece B, e o sinal de videodensidade de pico, A, i. e. (B/A). Quanto mais elevada for a velocidade do fluxo sanguíneo, mais elevada é a razão (B/A) para uma dada videodensidade normalizada. Assim, é esperado que a razão (B/A) aumente mais rapidamente na ausência de oclusão.

Os valores de videodensidade normalizados (y) estão no eixo dos y e a razão entre o reaparecimento de videodensidade, B e a videodensidade de pico, A (B/A) está no eixo dos x. Cada gráfico representa um intervalo de tempo diferente (1 a 5 segundos) após o pulso de ruptura. Os dados ilustram a capacidade de medir quantitativamente o fluxo sanguíneo, utilizando imagiologia de ultra-sons pulsada e administração contínua de um vasodilatador renal. 133

Exemplo 4

Este exemplo ilustra a utilização de imagiologia de ultra-sons intermitente, com um vasodilatador renal, para medir o fluxo sanguíneo através do rim de um mamífero com uma artéria renal estenótica. 0 mesmo processo é realizado como no exemplo 3, excepto que se utiliza um cão de 20 kg com uma artéria renal estenótica. Faz-se imagiologia ultra-sónica como no exemplo 3. Deixa-se que as vesículas sejam eliminadas da região renal pela circulação sanguínea, durante uma hora.

Administra-se captopril (10 mg) seguido da administração de vesículas. A imagiologia ultra-sónica é mais uma vez realizada como no Exemplo 3.

Características da invenção 1. Um método para proporcionar uma imagem da região renal de um doente compreendendo (i) administrar ao doente uma composição de vesícula a qual compreende vesículas de lípido, proteína ou polímero e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilatador renal, e (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível da região renal. 2. Um método de acordo com a característica 1, em que as referidas vesículas compreendem vesículas de lípido. 134 3. Um método de acordo com a característica 2, em que a referida composição de vesícula compreende vesículas seleccionadas do grupo consistindo de micelas e lipossomas. 4. Um método de acordo com a caracterí stica 2, em que os referidos lípidos compreendem um fosfolípido. 5. Um método de acordo com a caracterí stica 4, em que os referidos fosfolípidos são seleccionados do grupo consistindo de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e ácido fosfatídico. 6. Um método de acordo com a característica 5, em que a referida fosfatidilcolina é seleccionada do grupo consistindo de dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina. 7. Um método de acordo com a característica 6, em que a referida fosfatidilcolina compreende dipalmitoilfosfatidilcolina. 8. Um método de acordo com a característica 5, em que a referida fosfatidiletanolamina é seleccionada do grupo consistindo de dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, N-succinildioleoilfosfatidiletanolamina e l-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. 9. Um método de acordo com a característica 8, em que a referida fosfatidiletanolamina compreende dipalmitoilfosfatidiletanolamina. 135 10. Um método de acordo com a característica 5, em que o referido ácido fosfatidico compreende ácido dipalmitolilfosfatídico. 11. Um método de acordo com a característica 3, em que o referido lípido compreende ainda um polímero. 12. Um método de acordo com a característica 11, em que o referido polímero compreende um polímero hidrófilo. 13. Um método de acordo com a característica 12, em que o referido polímero hidrófilo compreende polietilenoglicol. 14. Um método de acordo com a característica 1, em que as referidas vesículas compreendem vesículas de proteína. 15. Um método de acordo com a característica 14, em que a referida proteína compreende albumina. 16. Um método de acordo com a característica 1, em que as referidas vesículas compreendem vesículas de polímero. 17. Um método de acordo com a característica 16, em que os referidos polímeros compreendem polímeros ou copolímeros sintéticos que são preparados a partir de monómeros seleccionados do grupo consistindo de ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenoimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, ácido láctico, ácido glicólico, ε-caprolactona, acroleína, cianoacrilato, cianometacrilato, bisfenol A, epicloridrina, acrilatos de hidroxialquilo, 136 siloxano, dimetilsiloxano, óxido de etileno, etilenoglicol, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas N-substituídas, metacrilamidas N-substituídas, N-vinil-2-pirrolidona, 2,4-pentadieno-l-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-amino-estireno, p-aminobenzilestireno, estirenossulfonato de sódio, 2-sulfoxietil-metacrilato de sódio, vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo e cloreto de 2-metacriloíloxitrimetil-amónio. 18. Um método de acordo com a característica 16, em que os referidos polímeros compreendem polímeros ou copolímeros sintéticos seleccionadas do grupo consistindo de poli(ácido acrílico), polietilenoimina, poli(ácido metacrílico) , poli(metacrilato de metilo) , policianometacrilato, polissiloxano, polidimetilsiloxano, poli(ácido láctico) , poli (ε-caprolactona) , resina epoxi, poli(óxido de etileno), poli (etilenoglicol), poliamida, polivinilideno-poliacrilonitrilo, polivinilideno-poliacrilonitrilo-poli(metacrilato de metilo) e poliestireno-poliacrilonitrilo. 19. Um método de acordo com a característica 18, em que os referidos polímeros compreendem um copolímero de polivinilideno-poliacrilonitrilo. 20. Um método de acordo com a característica 1, em que a referida composição compreende um gás e, em que o referido gás compreende um gás fluorado. 21. Um método de acordo com a característica 20, em que o referido gás fluorado é um perfluorocarboneto gasoso. 137 22. Um método de acordo com a característica 21, em que o referido perfluorocarboneto gasoso é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano e perfluorociclobutano. 23. Um método de acordo com a característica 20, em que o referido gás fluorado é seleccionado do grupo consistindo de hexafluoreto de enxofre e heptafluoropropano. 24. Um método de acordo com a característica 1, em que a referida composição compreende um precursor gasoso e o referido precursor gasoso tem um ponto de ebulição superior a cerca de 37°C. 25. Um método de acordo com a característica 24, em que o referido precursor gasoso compreende um precursor gasoso fluorado. 26. Um método de acordo com a característica 25, em que o referido precursor gasoso fluorado compreende um precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto. 27. Um método de acordo com a característica 26, em que o referido precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto é seleccionado do grupo consistindo de perfluoropentano, perfluoro-hexano e perfluoro-heptano. 28. Um método de acordo com a característica 1, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia por tomografia computorizada. 138 29. Um método de acordo com a característica 1, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia por ultra-sons. 30. Um método de acordo com a caracteristica 3, em que as referidas vesículas compreendem vesículas unilamelares. 31. Um método de acordo com a caracteristica 30, em que as referidas vesículas compreendem uma monocamada. 32. Um método de acordo com a caracteristica 31, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos. 33. Um método de acordo com a caracteristica 30, em que as referidas vesículas compreendem uma bicamada. 34. Um método de acordo com a caracteristica 33, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos. 35. Um método de acordo com a caracteristica 3, em que as referidas vesículas são seleccionados do grupo consistindo de vesículas oligolamelares e multilamelares. 36. Um método de acordo com a caracteristica 35, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos. 37. Um método de acordo com a caracteristica 1, em que o referido vasodilatador renal potência a clareza na imagem de diagnóstico. 139 38. Um método de acordo com a característica 1, em que o referido vasodilatador renal elimina substancialmente os artefactos de diagnóstico na imagem de diagnóstico. 39. Um método de acordo com a caracteristica 1, em que a referida composição de vesicula compreende ainda um agente bioactivo adicional. 40. Um método de acordo com a caracteristica 1 compreendendo ainda a aplicação de energia ultra-sónica suficiente para romper as referidas vesículas. 41. Um método de acordo com a caracteristica 40, em que a referida imagiologia por ultra-sons é a imagiologia harmónica pulsada e a referida composição de vesícula é administrada por infusão intravenosa contínua. 42. Um método de acordo com a caracteristica 1, em que o referido vasodilatador renal é um inibidor da enzima de conversão da angiotensina. 43. Um método de acordo com a caracteristica 42, em que o referido vasodilatador renal contém um grupo sulfidrilo. 44. Um método de acordo com a caracteristica 43, em que o referido vasodilatador renal é seleccionado do grupo consistindo de captopril, fentiapril, pivalopril, zofenopril e alacepril. 45. Um método de acordo com a caracteristica 42, em que o referido vasodilatador renal contém dois grupos carboxilo. 140 46. Um método de acordo com a característica 45, em que o referido vasodilatador renal é seleccionada do grupo consistindo de lisinopril, benazepril, quinapril, moexipril, ramipril, espirapril, perindopril, indolapril, pentopril, indalapril, cilazapril, enalapril e enalaprilato. 47. Um método de acordo com a caracteristica 46, em que o referido vasodilatador renal é seleccionada do grupo consistindo de benazepril, enalapril e enalaprilato. 48. Um método de acordo com a caracteristica 42, em que o referido vasodilatador renal contém fósforo. 49. Um método de acordo com a caracteristica 48, em que o referido vasodilatador renal é fosinopril. 50. Um método para proporcionar uma imagem da região renal de um doente compreendendo (i) administrar ao doente uma composição compreendendo um lipido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilator renal, e (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível da região renal. 51. Um método de acordo com a caracteristica 50, em que a referida composição compreende um lipido. 52. Um método de acordo com a caracteristica 51, em que o referido lipido compreende um fosfolípido. 141 53. Um método de acordo com a característica 52, em que o referido fosfolípido é seleccionada do grupo consistindo de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e ácido fosfatidico. 54. Um método de acordo com a característica 53, em que a referida fosfatidilcolina é seleccionada do grupo consistindo de dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina. 55. Um método de acordo com a característica 54, em que a referida fosfatidilcolina compreende dipalmitoilfosfatidilcolina. 56. Um método de acordo com a característica 53, em que a referida fosfatidiletanolamina é seleccionada do grupo consistindo de dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, N-succinildioleoilfosfatidiletanolamina e l-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. 57. Um método de acordo com a característica 56, em que a referida fosfatidiletanolamina compreende dipalmitoilfosfatidiletanolamina. 58. Um método de acordo com a característica 53, em que o referido ácido fosfatidico compreende ácido dipalmitolilfosfatidico. 142 59. Um método de acordo com a característica 51, em que a referida composição de lipido compreende uma composição de vesícula. 60. Um método de acordo com a característica 59, em que a referida composição de vesícula compreende vesículas seleccionadas do grupo consistindo de micelas e lipossomas. 61. Um método de acordo com a característica 59, em que a referida composição de lipido compreende uma emulsão, suspensão ou dispersão. 62. Um método de acordo com a característica 51, em que o referido lipido compreende ainda um polímero. 63. Um método de acordo com a característica 62, em que o referido polímero compreende um polímero hidrófilo. 64. Um método de acordo com a característica 63, em que o referido polímero hidrófilo compreende polietilenoglicol. 65. Um método de acordo com a característica 50, em que a referida composição compreende uma proteína. 66. Um método de acordo com a característica 65, em que a referida proteína compreende albumina. 67. Um método de acordo com a característica 62, em que o referido polímero compreende um polímero ou copolímero sintético o qual é preparado a partir de monómeros seleccionados do grupo consistindo de ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenoimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 143 2-hidroxietilo, ácido láctico, ácido glicólico, ε-caprolactona, acroleina, cianoacrilato, cianometacrilato, bisfenol A, epicloridrina, acrilatos de hidroxialquilo, siloxano, dimetilsiloxano, óxido de etileno, etilenoglicol, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas N-substituidas, metacrilamidas N-substituidas, N-vinil-2-pirrolidona, 2,4-pentadieno-l-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-amino-estireno, p-aminobenzilestireno, estirenossulfonato de sódio, 2-sulfoxietil-metacrilato de sódio, vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo e cloreto de 2-metacriloíloxitrimetil-amónio. 68. Um método de acordo com a caracteristica 67, em que o referido polímero compreende um polímero ou copolímero sintético seleccionado do grupo consistindo de poli(ácido acrílico), polietilenoimina, poli(ácido metacrílico), poli(metacrilato de metilo), policianometacrilato, polissiloxano, polidimetilsiloxano, poli(ácido láctico), poli (ε-caprolactona), resina epoxi, poli(óxido de etileno), poli(etilenoglicol), poliamida, polivinilideno-poliacrilonitrilo, polivinilideno-poliacrilonitrilo-poli(metacrilato de metilo) e poliestireno-poliacrilonitrilo. 69. Um método de acordo com a caracteristica 68, em que o referido polímero compreende copolímero de polivinilideno-poliacrilonitrilo. 70. Um método de acordo com a caracteristica 50, em que a referida composição compreende um gás e, em que o referido gás compreende um gás fluorado. 144 71. Um método de acordo com a característica 70, em que o referido gás fluorado é um perfluorocarboneto gasoso. 72. Um método de acordo com a característica 71, em que o referido perfluorocarboneto gasoso é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano e perfluorociclobutano. 73. Um método de acordo com a característica 70, em que o referido gás fluorado é seleccionado do grupo consistindo de hexafluoreto de enxofre e heptafluoropropano. 74. Um método de acordo com a característica 50, em que a referida composição compreende um precursor gasoso e o referido precursor gasoso tem um ponto de ebulição superior a cerca de 37°C. 75. Um método de acordo com a característica 74, em que o referido precursor gasoso compreende um precursor gasoso fluorado. 76. Um método de acordo com a característica 75, em que o referido precursor gasoso fluorado compreende um precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto. 77. Um método de acordo com a característica 76, em que o referido precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto é seleccionada do grupo consistindo de perfluoropentano, perfluoro-hexano e perfluoro-heptano. 145 78. Um método de acordo com a característica 50, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia por tomografia computorizada. 79. Um método de acordo com a caracteristica 50, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia por ultra-sons. 80. Um método de acordo com a caracteristica 60, em que as referidas vesículas compreendem vesículas unilamelares. 81. Um método de acordo com a caracteristica 80, em que as referidas vesículas compreendem uma monocamada. 82. Um método de acordo com a caracteristica 81, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos. 83. Um método de acordo com a caracteristica 80, em que as referidas vesículas compreendem uma bicamada. 84. Um método de acordo com a caracteristica 83, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos. 85. Um método de acordo com a caracteristica 60, em que as referidas vesículas são seleccionadas do grupo consistindo de vesículas oligolamelares e multilamelares. 86. Um método de acordo com a caracteristica 85, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos. 146 87. Um método de acordo com a característica 50, em que o referido vasodilatador renal potência a clareza na imagem de diagnóstico. 88. Um método de acordo com a caracteristica 50, em que o referido vasodilatador renal elimina substancialmente os artefactos de diagnóstico na imagem de diagnóstico. 89. Um método de acordo com a caracteristica 50, em que a referida composição de vesícula compreende ainda um agente bioactivo adicional. 90. Um método para eliminar substancialmente os artefactos de diagnóstico numa imagem de diagnóstico da região renal de um doente, compreendendo administrar ao doente, em combinação com um agente de contraste, um agente que induz vasodilatação de uma artéria renal. 91. Um método de acordo com a caracteristica 90, em que a imagem de diagnóstico compreende uma imagem de tomografia computorizada. 92. Um método de acordo com a caracteristica 90, em que a imagem de diagnóstico compreende uma imagem de ultra-sons. 93. Um método de acordo com a caracteristica 90, em que os artefactos de diagnóstico compreendem artefactos de tomografia computorizada. 94. Um método de acordo com a caracteristica 90, em que os artefactos de diagnóstico compreendem artefactos de ultra-sons . 147 95. Um método de acordo com a característica 90, em que o referido agente de contraste compreende uma composição de vesícula compreendendo vesículas de lípido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso. 96. Um método de acordo com a característica 95, em que a referida composição de vesícula compreende vesículas de lípido. 97. Um método de acordo com a característica 96, em que as referidas vesículas são seleccionados do grupo consistindo de micelas e lipossomas. 98. Um método de acordo com a característica 95, em que a referida composição compreende um gás e, em que o referido gás compreende um gás fluorado. 99. Um método de acordo com a característica 98, em que o referido gás fluorado é um perfluorocarboneto gasoso. 100. Um método de acordo com a característica 99, em que o referido perfluorocarboneto gasoso é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano e perfluorociclobutano. 101. Um método de acordo com a característica 99, em que o referido gás fluorado é seleccionada do grupo consistindo de hexafluoreto de enxofre e heptafluoropropano. 102. Um método de acordo com a característica 95, em que a referida composição compreende um precursor gasoso e o 148 referido precursor gasoso tem um ponto de ebulição superior a cerca de 37°C. 103. Um método de acordo com a caracteristica 102, em que o referido precursor gasoso compreende um precursor gasoso fluorado. 104. Um método de acordo com a caracteristica 103, em que o referido precursor gasoso fluorado compreende um precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto. 105. Um método de acordo com a caracteristica 104, em que o referido precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto é seleccionado do grupo consistindo de perfluoropentano, perfluoro-hexano e perfluoro-heptano. 106. Um método de acordo com a caracteristica 95, em que o referido agente de contraste compreende uma composição compreendendo um lipido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso. 107. Um método de acordo com a caracteristica 95, em que a referida composição é uma composição lipídica. 108. Um método de acordo com a caracteristica 107, em que a referida composição lipídica é uma emulsão, suspensão ou dispersão. 109. Um método de acordo com a caracteristica 106, em que a referida composição compreende um gás e, em que o referido gás compreende um gás fluorado. 149 110. Um método de acordo com a característica 109, em que o referido gás fluorado é um perfluorocarboneto gasoso. 111. Um método de acordo com a característica 110, em que o referido perfluorocarboneto gasoso é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano e perfluorociclobutano. 112. Um método de acordo com a característica 110, em que o referido gás fluorado é seleccionado do grupo consistindo de hexafluoreto de enxofre e heptafluoropropano. 113. Um método de acordo com a característica 106, em que a referida composição compreende um precursor gasoso e o referido precursor gasoso tem um ponto de ebulição superior a cerca de 37°C. 114. Um método de acordo com a característica 113, em que o referido precursor gasoso compreende um precursor gasoso fluorado. 115. Um método de acordo com a característica 114, em que o referido precursor gasoso fluorado compreende um precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto. 116. Um método de acordo com a característica 115, em que o referido precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto é seleccionado do grupo consistindo de perfluoropentano, perfluoro-hexano e perfluoro-heptano. 150 117. Um método de acordo com a característica 90, em que o referido agente que induz vasodilatação de uma artéria renal é um inibidor da enzima de conversão da angiotensina. 118. Um método de acordo com a característica 117, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina contém um grupo sulfidrilo. 119. Um método de acordo com a característica 118, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina é seleccionado do grupo consistindo de captopril, fentiapril, pivalopril, zofenopril e alacepril. 120. Um método de acordo com a característica 16, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina contém dois grupos carboxilo. 121. Um método de acordo com a característica 120, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina é seleccionado do grupo consistindo de lisinopril, benazepril, quinapril, moexipril, ramipril, espirapril, perindopril, indolapril, pentopril, indalapril, cilazapril, enalapril e enalaprilato. 122. Um método de acordo com a característica 121, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina é seleccionado do grupo consistindo de benazepril, enalapril e enalaprilato. 123. Um método de acordo com a característica 117, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina contém fósforo. 151 124. Um método de acordo com a característica 123, em que o referido inibidor da enzima de conversão da angiotensina é fosinopril. 125. Um método para diagnosticar a presença de doença renal na região renal de um doente compreendendo (i) administrar ao doente uma composição de vesícula a qual compreende vesículas de lípido, proteína ou polímero e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilator renal, e (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível de qualquer doença na região renal do doente. 126. Um método de acordo com a característica 125, em que a doença renal é hipertensão da artéria renal. 127. Um método para diagnosticar a presença de doença renal na região renal de um doente compreendendo (i) administrar ao doente uma composição compreendendo um lípido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilator renal; e (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível de doença na região renal do doente. 128. Um método de acordo com a característica 127, em que a doença renal é hipertensão da artéria renal. 131. Um método para medir o fluxo sanguíneo na região renal de um doente, compreendendo: (i) administrar ao doente uma composição de vesícula a qual compreende vesículas de lípido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso, 152 (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível da região renal, (iii) administrar ao doente um vasodilator renal, (iv) prosseguir a referida análise, e (v) determinar o fluxo sanguíneo a partir de uma relação videodensidade em função do tempo nas imagens obtidas nos passos (ii) até (iv) . 132. Um método de acordo com a característica 131, em que a referida composição de vesícula é administrada ao doente para manter uma concentração essencialmente constante de composição de vesícula na região renal. 133. Um método de acordo com a característica 132, em que a referida administração compreende administração constante. 134. Um método de acordo com a característica 133 compreendendo a administração da referida composição de vesícula utilizando um dispositivo de infusão constante. 135. Um método de acordo com a característica 134, em que o referido dispositivo de infusão constante compreende um injector motorizado. 136. Um método de acordo com a característica 131, em que a referida imagiologia de diagnóstico é seleccionada do grupo consistindo de imagiologia de ultra-sons e imagiologia por tomografia computorizada. 137. Um método de acordo com a característica 136, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia de ultra-sons. 153 138. Um método de acordo com a característica 131, em que as referidas vesículas compreendem vesículas de lípido. 139. Um método de acordo com a característica 138, em que as referidas vesículas compreendem vesículas seleccionadas do grupo consistindo de micelas e lipossomas. 140. Um método de acordo com a característica 138, em que o referido lípido compreende um fosfolípido. 141. Um método de acordo com a característica 140, em que o referido fosfolípido é seleccionado do grupo consistindo de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e ácido fosfatídico. 142. Um método de acordo com a característica 140, em que a referida fosfatidilcolina é seleccionada do grupo consistindo de dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina. 143. Um método de acordo com a característica 142, em que a referida fosfatidilcolina compreende dipalmitoilfosfatidilcolina. 144. Um método de acordo com a característica 141, em que a referida fosfatidiletanolamina é seleccionada do grupo consistindo de dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, N-succinildioleoilfos-fatidiletanolamina e l-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. 154 145. Um método de acordo com a característica 144, em que a referida fosfatidiletanolamina compreende dipalmitoilfosfatidiletanolamina. 146. Um método de acordo com a característica 141, em que o referido ácido fosfatídico compreende ácido dipalmitolilfosfatídico. 147. Um método de acordo com a característica 138, em que o referido lípido compreende ainda um polímero. 148. Um método de acordo com a característica 147, em que o referido polímero compreende um polímero hidrófilo. 149. Um método de acordo com a característica 148, em que o referido polímero hidrófilo compreende polietilenoglicol. 150. Um método de acordo com a característica 131, em que as referidas vesículas compreendem vesículas de polímero. 151. Um método de acordo com a característica 150, em que o referido polímero compreende um polímero ou copolímero sintético o qual é preparado a partir de monómeros seleccionados do grupo consistindo de ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenoimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, ácido láctico, ácido glicólico, ε-caprolactona, acroleína, cianoacrilato, cianometacrilato, bisfenol A, epicloridrina, acrilatos de hidroxialquilo, siloxano, dimetilsiloxano, óxido de etileno, etilenoglicol, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas N-substituídas, metacrilamidas N-substituídas, N-vinil-2-pirrolidona, 155 2,4-pentadieno-l-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-amino-estireno, p-aminobenzilestireno, estirenossulfonato de sódio, 2-sulfoxietil-metacrilato de sódio, vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo e cloreto de 2-metacriloíloxitrimetil-amónio. 152. Um método de acordo com a característica 151, em que o referido polímero compreende um polímero ou copolímero sintético seleccionado do grupo consistindo de poli(ácido acrílico) , polietilenoimina, poli (ácido metacrílico), policianometacrilato, poli(metacrilato de metilo), polissiloxano, polidimetilsiloxano, poli(ácido láctico), poli (ε-caprolactona) , resina epoxi, poli(óxido de etileno), poli (etilenoglicol), poliamida, polivinilideno- poliacrilonitrilo, polivinilideno-poliacrilonitrilo- poli(metacrilato de metilo) e poliestireno- poliacrilonitrilo. 153. Um método de acordo com a característica 152, em que o referido polímero compreende um copolímero de po1ivinilideno-poliacrilonitrilo. 154. Um método de acordo com a característica 131, em que o referido gás compreende um gás fluorado. 155. Um método de acordo com a característica 154, em que o referido gás fluorado é seleccionado do grupo consistindo de um perfluorocarboneto, hexafluoreto de enxofre e heptafluoropropano. 156. Um método de acordo com a característica 154, em que o referido gás fluorado compreende a perfluorocarboneto. 156 157. Um método de acordo com a característica 156, em que o referido perfluorocarboneto gasoso é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano e perfluorociclobutano. 158. Um método de acordo com a característica 131, em que o referido precursor gasoso tem um ponto de ebulição superior a cerca de 37°C. 159. Um método de acordo com a característica 158, em que o referido precursor gasoso compreende um composto fluorado. 160. Um método de acordo com a característica 159, em que o referido composto fluorado compreende a perfluorocarboneto. 161. Um método de acordo com a característica 160, em que o referido perfluorocarboneto é seleccionado do grupo consistindo de perfluoropentano, perfluoro-hexano e perfluoro-heptano. 162. Um método de acordo com a característica 96, em que a referida imagiologia compreende imagiologia por ultra-sons. 163. Um método de acordo com a característica 162 compreendendo ainda o passo de aplicar energia ultra-sónica suficiente para romper as referidas vesículas. 164. Um método de acordo com a característica 162, compreendendo ainda a aplicação de energia ultra-sónica suficiente para romper as referidas vesículas,, em que a referida aplicação ocorre durante os passos (ii) e (iv) . 157 165. Um método de acordo com a característica 164, em que a referida composição de vesícula é administrada por infusão intravenosa contínua. 166. Um método para medir o fluxo sanguíneo na região renal de um doente, compreendendo: (i) administrar ao doente uma composição que compreende um lípido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso, (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível da região renal, (iii) administrar ao doente um vasodilator renal, (iv) prosseguir a referida análise, e (v) determinar o fluxo sanguíneo a partir da relação de videodensidade em função do tempo nas imagens obtidas nos passos (ii) até (iv).

Lisboa, 13 de Agosto de 2007 158

Claims (41)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para proporcionar uma imagem da região renal de um doente compreendendo (i) administrar ao doente uma composição de vesícula compreendendo um lípido, proteína ou polímero, e um gás ou precursor gasoso, em combinação com um vasodilatador renal, e (ii) analisar o doente utilizando imagiologia de diagnóstico para se obter uma imagem visível da região renal.
2. 2. Método de acordo com a Reivindicação 1, em que a referida composição compreende vesículas de lípido, proteína ou polímero.
3. 3. Método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a referida composição compreende um lípido.
4. 4. Método de acordo com a Reivindicação 3, em que o referido lípido compreende um fosfolípido.
5. 5. Método de acordo com a Reivindicação 4, em que o referido fosfolípido é seleccionado do grupo consistindo de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e ácido fosfatídico.
6. 6. Método de acordo com a Reivindicação 5, em que a referida fosfatidilcolina é seleccionada do grupo consistindo de dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina. 1
7. 7. Método de acordo com a Reivindicação 6, em que a referida fosfatidilcolina compreende dipalmitoilfosfatidilcolina.
8. 8. Método de acordo com a Reivindicação 6, em que a referida fosfatidiletanolamina é seleccionada do grupo consistindo de dipalmitoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, N-succinildioleoilfosfatidiletanolamina e l-hexadecil-2- palmitoilglicerofosfoetanolamina.
9. 9. Método de acordo com a Reivindicação 8, em que a referida fosfatidiletanolamina compreende dipalmitoilfosfatidiletanolamina.
10. 10. Método de acordo com a Reivindicação 6, em que o referido ácido fosfatidico compreende ácido dipalmitolilfosfatidico.
11. 11. Método de acordo com a Reivindicação 2, em que a referida composição compreende vesículas de lípido.
12. 12. Método de acordo com a Reivindicação 11, em que as referidas vesículas são seleccionadas do grupo consistindo de micelas e lipossomas.
13. 13. Método de acordo com a Reivindicação 1, em que a referida composição compreende uma emulsão, suspensão ou dispersão de lípidos.
14. 14. Método de acordo com qualquer Reivindicação anterior, em que o referido lípido compreende ainda um polímero. 2
15. 15. Método de acordo com a Reivindicação 14, em que o referido polímero compreende um polímero hidrófilo.
16. 16. Método de acordo com a Reivindicação 15, em que o referido polímero hidrófilo compreende polietilenoglicol.
17. 17. Um método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a referida composição compreende uma proteína.
18. 18. Método de acordo com a Reivindicação 17, em que a referida proteína compreende albumina.
19. 19. Método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o referido polímero compreende um polímero ou copolímero sintético que é preparado a partir de monómeros seleccionados do grupo consistindo de ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenoimina, ácido crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, ácido láctico, ácido glicólico, 8-caprolactona, acroleína, cianoacrilato, cianometacrilato, bisfenol A, epicloridrina, acrilatos de hidroxialquilo, siloxano, dimetilsiloxano, óxido de etileno, etilenoglicol, metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas N-substituídas, metacrilamidas N-substituídas, N-vinil-2-pirrolidona, 2,4-pentadieno-l-ol, acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno, p-amino-estireno, p-aminobenzilestireno, estirenossulfonato de sódio, 2-sulfoxietil-metacrilato de sódio, vinilpiridina, metacrilatos de aminoetilo e cloreto de 2-metacriloíloxitrimetil-amónio.
20. 20. Método de acordo com a Reivindicação 19, em que o referido polímero compreende um polímero ou copolímero sintético 3 seleccionado do grupo consistindo de poli(ácido acrílico), polietilenoimina, poli(ácido metacrílico), poli(metacrilato de metilo), policianometacrilato, polissiloxano, polidimetilsiloxano, poli(ácido láctico), poli (ε-caprolactona), resina epoxi, poli(óxido de etileno), poli(etilenoglicol), poliamida, polivinilideno- poliacrilonitrilo, polivinilideno-poliacrilonitrilo- poli(metacrilato de metilo) e poliestireno- poliacrilonitrilo.
21. 21. Método de acordo com a Reivindicação 20, em que o referido polímero compreende um copolímero de polivinilideno-poliacrilonitrilo.
22. 22. Método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a referida composição compreende um gás e, em que o referido gás compreende um gás fluorado.
23. 23. Método de acordo com a Reivindicação 22, em que o referido gás fluorado é um perfluorocarboneto gasoso.
24. 24. Método de acordo com a Reivindicação 23, em que o referido perfluorocarboneto gasoso é seleccionado do grupo consistindo de perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano e perfluorociclobutano.
25. 25. Método de acordo com a Reivindicação 24, em que o referido gás fluorado é seleccionado do grupo consistindo de hexafluoreto de enxofre e heptafluoropropano.
26. 26. Método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a referida composição compreende um precursor gasoso e o 4 referido precursor gasoso tem um ponto de ebulição superior a cerca de 37°C.
27. 27. Método de acordo com a Reivindicação 26, em que o referido precursor gasoso compreende um precursor gasoso fluorado.
28. 28. Método de acordo com a Reivindicação 27, em que o referido precursor gasoso fluorado compreende um precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto.
29. 29. Método de acordo com a Reivindicação 28, em que o referido precursor gasoso de tipo perfluorocarboneto é seleccionado do grupo consistindo de perfluoropentano, perfluoro-hexano e perfluoro-heptano.
30. 30. Método de acordo com qualquer Reivindicação anterior, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia por tomografia computorizada.
31. 31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 29, em que a referida imagiologia de diagnóstico compreende imagiologia por ultra-sons.
32. 32. Método de acordo com a Reivindicação 11, em que as referidas vesículas compreendem vesículas unilamelares.
33. 33. Método de acordo com a Reivindicação 32, em que as referidas vesículas compreendem uma monocamada.
34. 34. Método de acordo com a Reivindicação 33, em que os referidos lipidos compreendem fosfolipidos. 5
35. 35. Método de acordo com a Reivindicação 32, em que as referidas vesículas compreendem uma bicamada.
36. 36. Método de acordo com a Reivindicação 35, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos
37. • 37. Método de acordo com a Reivindicação 11, em que as referidas vesículas são seleccionados do grupo consistindo de vesículas oligolamelares e multilamelares.
38. 38. Método de acordo com a Reivindicação 37, em que os referidos lípidos compreendem fosfolípidos.
39. 39. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido vasodilatador renal potência a clareza na imagem de diagnóstico.
40. 40. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido vasodilatador renal elimina substancialmente os artefactos de diagnóstico na imagem de diagnóstico.
41. 41. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a referida composição de vesícula compreende ainda um agente bioactivo adicional. Lisboa, 13 de Agosto de 2007 6