CN109364271B - 超声造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超声造影剂及其制备方法和药物制剂。所述超声造影剂为中空微泡结构，所述中空微泡结构的壳体包括可生物降解聚合物和脂质，且所述脂质修饰可生物降解聚合物。所述超声造影剂是以含有可生物降解聚合物与脂质作为油相，然后制备水包油包水的复乳液，最后除去复乳液中的溶剂。所述药物制剂以本发明超声造影剂为药物载体。所述超声造影剂的中空微泡结构壳体具有良好的柔顺性和弹性，从而赋予所述超声造影剂良好的超声响应性和超声造影效果，结构稳定，而且可以进行超声爆破，并且安全无毒，安全性好。所述超声造影剂制备方法工艺条件易控，条件温和、能够保证制备的超声造影剂结构和性能稳定，制备的效率，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种医疗检测试剂技术领域，具体涉及一种超声造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，分子影像技术由于其能够为活体组织的疾病诊断和监控提供重要的信息而得到广泛的关注。在众多成像模式中，超声成像作为一种无创伤的生物医学成像模式，由于其具有成像和诊断安全及时、价格低廉、轻便快捷、运用广泛等优点而具有重要的研究价值。
作为目前医学影像诊断中最为常用的方法，超声诊断技术是利用超声波在人体组织界面发生的反射和散射信号强弱差异显示生物体内部组织器官结构功能的正常和异常信息，从而达到疾病诊断目的的技术。虽然超声成像方法对于一些疾病引起的组织结构变化具有很好的诊断和定位效果，然而不同生物组织之间回波信号的不同常常会妨碍诊断的准确性，而且病变组织与正常组织声学性质相差不明显，使得器官结构显影不佳，容易造成误诊或漏诊。
为了更好地得到特定组织的准确信息，人们通常采用加入超声成像造影剂的方法来实现。超声造影利用与人体软组织回声特性明显不同，或声特性阻抗显著差别的物质注入体腔内、管道内或血管内，增强对脏器或病变的显示，以及血流灌注信息，从而提高诊断的正确性、精确度和灵敏度。
常规超声造影剂一般为包裹有气体的微泡，直径为1-10μm，注射于血管或管腔内，其产生特性声阻抗差异极大的液-气界面，明显增强后散射强度，此外其弹性外壳能产生丰富的二次谐波信号，通过造影谐波成像技术，选择性地接收二次谐波明显提高了信号的信噪比，改善了造影增强图像的质量。与CT、MRI等检测技术相比，超声微泡造影剂在人体微小血管和组织灌注检测与成像方面具有显像效果好、实时高帧频伪像少、无辐射损伤、相对廉价、适用面广以及便于床边检查等无法比拟的优点。
按照制备材料和方法的不同，超声微泡造影剂的发展经历了第一代游离微气泡超声造影剂、包裹空气的第二代超声造影剂，以Bracco公司的SonoVue(声诺维)为代表的第三代微泡造影剂，其内含低溶解度低弥散性的气体，如六氟化硫，提高了微泡在血液中的稳定性，使得超声显影效果明显增强，可用于组织灌注造影。上述制备微泡造影剂的膜层材料多采用蛋白质、磷脂及多糖等，这些材料制备的微泡普遍存在体内稳定性欠佳，血浆中半衰期短等问题。
近年来研究表明高分子材料制备的微泡造影剂具有更好的体内稳定性，而且生物相容性好，可生物降解，是一种更有潜力的成膜材料，已经成为目前超声造影剂研究的热点。如在公布的一种微囊式超声造影剂中，其是通过调节膜乳化过程参数控制制备的造影剂的粒径的大小并优化微囊的粒径分布，得到粒径分布均一的微囊超声造影剂，然后通过注射、静脉灌注等方式送入体内，在超声的作用下振动，改变组织的超声特性，增大病变组织与正常组织之间、运动部分与静止部分之间的对比度，起到超声显影的效果。
但是在临床应用中发现，采用高分子材料制备超声微泡造影剂虽然稳定性高，抗压性能好，但部分高分子材料，如聚(丙交酯-乙交酯)共聚物制备的造影剂外壳较硬，弹性相对差，低机械指数的二次谐波成像超声造影难以显影，需要较高的声学输出才能引起微泡的非线性振动，产生增强的对比成像，但同时也增强了背景组织回声信号，导致信噪比明显降低，造影效果不佳。另外，采用高分子材料制作的微泡在超声场中的空化效应弱，不能被低能量超声所击碎，倘若加大超声能量又会造成正常组织损伤。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种超声造影剂及其制备方法，以解决现有造影剂特别是高分子材料超声微泡造影剂存在的造影剂外壳较硬，弹性相对差，空化效应弱，造影效果不佳的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种药物制剂，以解决现有药物制剂的活性成分不能够通过造影剂进行负载的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种超声造影剂。所述超声造影剂为中空微泡结构，所述中空微泡结构的壳体包括可生物降解聚合物和脂质，且所述脂质修饰可生物降解聚合物。
本发明的另一方面，提供了一种超声造影剂的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：
将可生物降解聚合物与脂质溶解于有机溶剂中，配制成油相；
将所述成油相与水或含有易分解生成气体的物质的水溶液进行第一次乳化处理，获得油包水的初乳液；
将所述初乳液与水相进行第二次乳化处理，获得水包油包水的复乳液；
将所述复乳液所含的所述有机溶剂进行除去，收集沉淀物，对所述沉淀物洗涤处理后进行冻干处理。
本发明的又一方面，提供了一种药物制剂。药物制剂包括活性成分和用于负载所述活性成分的药物载体，所述药物载体为本发明超声造影剂或由本发明制备方法制备的超声造影剂。
与现有技术相比，本发明超声造影剂为中空微泡结构，且采用含有可生物降解聚合物与脂质的混合物作为中空微泡的壳体，这样所述脂质起到有效修饰可生物降解聚合物的作用，从而使得中空微泡的壳体柔顺性好，超声响应性好，使二次谐波成像造影模式下的低机械指数超声能穿过中空微泡的壳体，中空微泡腔体内的气体产生明显背向散射，达到良好的超声造影效果，其共振产生的谐振频率在诊断超声频率接收范围内，符合超声造影剂的要求；另外，所述中空微泡的壳体含有可生物降解聚合物可被修饰，使其携带功能成分，而且所含脂质修饰可生物降解聚合物，赋予中空微泡的壳体良好的弹性，有效提高中空微泡结构的机械指数，进行超声爆破可使所述中空微泡结构破裂，可达到微泡靶向破裂释放药物的效果，从而扩展了所述超声造影剂的应用范围；其次，所述壳体所含的可生物降解聚合物和脂质安全无毒，安全性好，而且结构稳定，在体内循环稳定好。
本发明超声造影剂制备方法将脂质与可生物降解聚合物的混合物作为油相成分，并采用乳化方法形成水包油包水的乳液，当除去油相有机溶剂和水后，使得制备的超声造影剂具有中空微泡结构，且脂质与可生物降解聚合物的混合物作为中空微泡的壳体，从而使得脂质起到有效修饰可生物降解聚合物的作用，从而使得中空微泡的壳体柔顺性好，超声响应性好，中空微泡腔体内的气体产生明显背向散射，达到良好的超声造影效果；而且所含脂质修饰可生物降解聚合物，赋予中空微泡的壳体良好的弹性，有效提高中空微泡结构的机械指数，进行超声爆破可使造影剂破裂，可达到微泡靶向破裂释放药物的效果，从而扩展了所述超声造影剂的应用范围；另外，所述超声造影剂制备方法工艺条件易控，条件温和、能够有效保证制备的超声造影剂结构和性能稳定，且有效提高了制备的效率，降低了生产成本。
本发明药物制剂由于是采用本发明超声造影剂作为活性成分的载体，基于所述超声造影剂具有的如上述有点，因此，可以实现活性成分靶向释放。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例超声造影剂的制备方法工艺流程示意图；
图2本发明实施例1-3提供的超声造影剂扫描电镜图；其中，图2-A为实施例1制备的DPPC-PLA超声造影剂进行扫描电镜照片；图2-B为实施例2制备的DSPE-PLC超声造影剂进行扫描电镜照片；图2-C为实施例3制备的 DSPC-PLGA超声造影剂进行扫描电镜照片；
图3本发明实施例1-3提供的超声造影剂体内超声显影效果图；其中，图3-A为空白组未添加造影剂时的显影效果图，图3-B、图3-C、图3-D分别为实验组添加实施例1、2、3制备的微泡超声造影剂的超声显影效果图，图3-E为对照组添加市售Sonovue造影剂时的显影效果图；
图4本发明实施例3提供的超声造影剂体外显影和爆破图；其中，图4-A 为启动爆破模式之前的体外显影效果图，图4-B启动爆破模式后的体外显影效果图；
图5本发明实施例3提供的超声造影剂体内随时间推移的超声显影效果图；
图6本发明实施例4提供的DOX-DSPC-PLGA超声造影剂在不同声压作用下DOX累积释放率曲线图；
图7本发明实施例3中DSPC修饰的PLGA的FTIR图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例说明书中所提到的各组分的质量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间质量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书各组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
一方面，本发明实施例提供了一种超声造影剂。所述超声造影剂为中空微泡结构，如图2所示。该中空微泡结构的壳体包括可生物降解聚合物和脂质，且脂质与可生物降解聚合物吸附结合，从而实现脂质修饰可生物降解聚合物。这样，由于脂质与可生物降解聚合物混合，使得所述脂质起到有效修饰可生物降解聚合物的作用，赋予所述中空微泡的壳体柔顺性好，超声响应性好，而且赋予所述壳体良好的弹性，进行超声爆破可使造影剂破裂。另外，由于所述壳体含有可生物降解聚合物，因此，所述壳体还可以被修饰，使得壳体携带功能成分。
在一实施例中，控制所述壳体中的可生物降解聚合物与脂质的质量比为 [5-20]：1，具体可以但不仅仅为20:1。通过控制两者的质量比例，从而提高脂质对可生物降解聚合物的修饰作用，从而提高所述壳体的柔顺性、弹性和稳定性，从而提高所述超声造影剂的超声响应性和超声造影效果以及微泡靶向破裂的效果。
其中，所述可生物降解聚合物可以包括脂肪族聚内酯；在具体实施例中，所述脂肪族聚内酯的数均分子量为3000-500000，如所述脂肪族聚内酯可以包括聚乳酸、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯-己内酯)共聚物、聚(乙交酯-己内酯)共聚物中的至少一种。所述脂质可以包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺中的至少一种。选用上述的脂质和生物降解聚合物，能够提高所述脂质对生物降解聚合物的修饰作用，从而进一步提高两者的协同作用，从而赋予所述壳体良好的弹性，进行超声爆破可使造影剂破裂。而且，上述脂质和生物降解聚合物安全无毒。
在进一步实施例中，在所述中空微泡结构的中空腔体内还含有易分解生成气体的物质；这样，在超声成像过程中，所述易分解生成气体的物质能够分解产生气体，从而将所述超声造影剂的中空微泡结构壳体撑薄，使二次谐波成像造影模式下的低机械指数超声能穿过微泡外壳，微泡内部的气体产生明显背向散射，提高超声造影效果，其共振产生的谐振频率在诊断超声频率接收范围内，符合超声造影剂的要求。所述易分解生成气体的物质在所述中空微泡结构腔体内的含量应该保证其分解气体的量不破坏也即是撑破所述壳体的完整性，因此，所述易分解生成气体的物质与所述壳体中可生物降解聚合物的质量比值可以控制在1:(2-25)。在具体实施例中，所述易分解生成气体的物质包括碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸钠中的至少一种。
进一步，在另一实施例中，在所述中空微泡结构的所述壳体表面还附有稳定剂。该稳定剂是在所述超声造影剂制备过程中，促使可生物降解聚合物与脂质混合物形成油相包膜也即是形成中空微泡结构的壳体过程中残留成分，其中，所述稳定剂可以包括聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠中的至少一种。
另外，经过对所述超声造影剂进行如电镜扫描等分析得知，所述超声造影剂的粒径为0.8-3μm。而且所述超声造影剂的粒径可以根据临床的需要进行选用和调整。
因此，由上文所述可知，所述超声造影剂通过脂质对可生物降解聚合物修饰，使得两者协同作用，赋予所述超声造影剂中空微泡结构，并赋予所述中空微泡的壳体柔顺性好，使二次谐波成像造影模式下的低机械指数超声能穿过中空微泡的壳体，中空微泡腔体内的气体产生明显背向散射，达到良好的超声响应性和超声造影效果；而且可生物降解聚合物被进行修饰，赋予其携带功能成分如大分子或蛋白质等药物，而且所含脂质修饰可生物降解聚合物，赋予中空微泡的壳体良好的弹性，进行超声爆破可使造影剂破裂，可达到微泡靶向破裂释放药物的效果，扩展了所述超声造影剂的应用范围。所述壳体所含的可生物降解聚合物和脂质安全无毒，安全性好，而且结构稳定，在体内循环稳定好。
另外，所述超声造影剂可以通过静脉注射送入体内被检测的部位，在超声的作用下振动，改变组织的超声特性，如背向散射系数、衰减系数、声速及非线性效应。
另一方面，在上文所述超声造影剂的基础上，本发明实施例还提供了一种超声造影剂的制备方法。所述超声造影剂的制备方法工艺如图1所示，其包括如下步骤：
S01：将可生物降解聚合物与脂质溶解于有机溶剂中，配制成油相；
S02：将步骤S01中配制的所述成油相与水或含有易分解生成气体的物质的水溶液进行第一次乳化处理，获得油包水的初乳液；
S03：将步骤S02中配制的所述初乳液与水相进行第二次乳化处理，获得水包油包水的复乳液；
S04：将步骤S03中配制的所述复乳液所含的所述有机溶剂进行除去，收集沉淀物，对所述沉淀物洗涤处理后进行冻干处理。
其中，在所述步骤S01中，作为本发明的一实施例中，所述油相中的质量体积浓度控制为10-150mg/mL，具体可以但不仅仅为50mg/mL，且控制所述可生物降解聚合物与脂质的质量比为[5-20]：1，具体可以但不仅仅为20:1。通过对油相浓度和可生物降解聚合物与脂质比例的控制和优化，使得所述油相能够形成稳定的油相包覆膜层，并最终形成稳定的中空微泡结构和完整的中空微泡壳体。所述油相中的有机溶剂应该选用能够有效溶解可生物降解聚合物与脂质的有机溶剂，优选易挥发的有机溶剂，如在具体实施例中，所述有机溶剂可以包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的至少一种。另外，所述可生物降解聚合物和脂质的可以选用的种类如上文超声造影剂中所述的可生物降解聚合物和脂质的可以选用的种类，为了节约篇幅，在此不再赘述。
所述步骤S02中，水或含有易分解生成气体的物质的水溶液构成第一水相，因此，将步骤S01中的油相与该第一水相进行乳化处理后，形成乳液。在本步骤中，控制所述油相与该第一水相的混合比例，使得乳化处理形成的乳液为油包水的乳液，也即是步骤S02中所述的初乳液。
一实施例中，当所述第一水相是含有易分解生成气体物质的水溶液时，所述含有易分解生成气体物质的水溶液的质量体积浓度为15-75mg/mL具体可以但不仅仅为60mg/mL。其中，所述易分解生成气体物质如上文超声造影剂中所述的事实含超声造影剂易分解生成气体物质，可以是包括碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸钠中的至少一种。在另一实施例中，控制所述油相与所述水或含有易分解生成气体物质的水溶液也即是第一水相的体积比为[1-20]：1，具体可以但不仅仅为5：1，使得两者按照该比例进行乳化处理，提高形成的油包水初乳液的稳定性。
另外，在一实施例中，所述步骤S02中的第一次乳化处理的条件为：所述超声的功率可为60-190W，具体可以但不仅仅为130W，时间为60-300秒，如可以但不仅仅为120秒。所述第一次乳化处理的温度优选在冰浴条件进行。
所述步骤S03中，由于步骤S02中制备的初乳液是油包水，因此，所述初乳液在所述步骤S03中充当为油相，这样，所述初乳液与所述水相进行乳化处理后，形成乳液。在本步骤中，控制所述初乳液与所述水相的混合比例，使得乳化处理形成的乳液为水包初乳液微粒的乳液，也即是步骤S03中所述的水包油包水的复乳液。
一实施例中，控制所述初乳液与所述水相的体积比为1：[5-50]，具体可以但不仅仅为1：5，使得两者按照该比例进行乳化处理，提高水包油包水的所述复乳液的稳定性。其中，所述水相为含有稳定剂的水溶液。在一实施例中，所述水相的质量百分含量，如稳定剂的含量可为1.0％-5.0％，具体可以但不仅仅为4％。所述稳定剂如上文超声造影剂中所述的稳定剂，可以是包括聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠中的至少一种。
另外，在一实施例中，所述步骤S03中的第二次乳化处理的条件为：搅拌的速度为10000-40000转/分，具体可以但不仅仅为30000转/分，时间为1-10 分钟，如3分钟。
所述步骤S04中，对所述复乳液进行除去有机溶剂和冻干处理，是为了除去所述复乳液所含的有机溶剂和水。一实施例中，将所述复乳液所含的与有机溶剂进行除去的方法包括：将所述复乳液于200-1200转/分的搅拌速度下搅拌处理2-6小时。通过该除去有机溶剂的方法，一方面能够有效保证微乳结果的稳定，同时能够有效使得所述有机溶剂挥发。
上述步骤S03和步骤S04中的除去有机溶剂可以在常温如室温下进行。
由上述可知，所述超声造影剂制备方法采用乳化方法形成水包油包水的乳液，最终使得制备的超声造影剂具有中空微泡结构，且脂质与可生物降解聚合物的混合物作为中空微泡的壳体，从而使得脂质起到有效修饰可生物降解聚合物的作用，从而使得中空微泡的壳体柔顺性好，超声响应性好，中空微泡腔体内的气体产生明显背向散射，达到良好的超声造影效果；而且赋予中空微泡的壳体良好的弹性，有效提高中空微泡结构的机械指数，进行超声爆破可使造影剂破裂，可达到微泡靶向破裂释放药物的效果，从而扩展了所述超声造影剂的应用范围；另外，所述超声造影剂制备方法工艺条件易控，条件温和、能够有效保证制备的超声造影剂结构和性能稳定，且有效提高了制备的效率，降低了生产成本。其次，制备的超声造影剂的粒径大小可以通过调节制备过程参数来调节。
又一方面，在上文所述超声造影剂及其制备方法的基础上，本发明实施例还提供了一种药物制剂。所述药物制剂包括活性成分和用于负载所述活性成分的药物载体。
其中，所述药物制剂所含的所述药物载体为上文所述的所述超声造影剂或由上文所述的制备方法制备的超声造影剂。这样，由于如上文所述，所述超声造影剂为中空微泡结构，且壳体中含有可生物降解聚合物。因此，所述药物制剂所含的活性成分可以是吸附或者接枝或键合在所述壳体的可生物降解聚合物上，当然可以是被包覆于所述中空微泡结构的腔体内。又由于如上文所述的超声造影剂壳体中含有脂质，所述脂质能够与所述可生物降解聚合物发挥协同作用，起到修饰可生物降解聚合物的作用，赋予中空微泡的壳体良好的弹性，有效提高中空微泡结构的机械指数，进行超声爆破可使所述超声造影剂破裂，从而使得所述超声造影剂能够靶向破裂，从而实现靶向释放活性成分，也既是实现靶向给药的效果，而且所述药物载体无毒安全。
所述药物制剂所含的所述活性成分可以根据临床具体病灶选择，如在一实施例中，所述活性成分可以包括阿霉素、紫杉醇、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、活性蛋白、多肽、疫苗、基因中的至少一种。
另外，所述药物制剂可用于皮下移植或静脉内注射，用于活性成分在体内的缓释、超声成像及超声控释。
以下通过多个具体实施例来举例说明本发明实施例超声造影剂及其制备方法。
实施例1
本发明实施例提供了一种DPPC-PLA超声造影剂及其制备方法。所述 DPPC-PLA超声造影剂为中空微泡结构，其中，所述中空微泡结构的壳体包括 DPPC-PLA的混合物，在中空微泡结构的中空腔体内被包覆有碳酸氢铵。
所述DPPC-PLA超声造影剂的制备方法：
S11：将0.1g PLA(数均分子量为10,000)与2.0mg DPPC溶解于1mL二氯甲烷中，配制成油相；
S12：向所述油相中加入0.2ml 6wt％碳酸氢铵水溶液，充分混合后，在190W 的功率下超声240秒，制得油包水的初级乳液；
S13：在30,000转/分的搅拌速度下，将上述得到的初级乳液滴入至4wt％聚乙烯醇(数均分子量为30000)水溶液中，高速搅拌3分钟，获得水包油包水的复乳液；
S14：将复乳液倒入含有10mL蒸馏水的烧杯中，在室温下800转/分的速度下搅拌3小时，4000转/分离心分离10min并用蒸馏水清洗离心固体沉淀，重复三次，取固体沉淀冷冻干燥得到白色产物，也既是微泡DPPC-PLA超声造影剂。所得超声造影剂避光、干燥、低温保存。
实施例2
本发明实施例提供了一种DSPE-PLC超声造影剂及其制备方法。所述 DSPE-PLC超声造影剂为中空微泡结构，其中，所述中空微泡结构的壳体包括 DSPE-PLC的混合物，在中空微泡结构的中空腔体内被包覆有碳酸氢铵。
所述DSPE-PLC超声造影剂的制备方法：
S21：将0.15g PLC(数均分子量为5,000)与1.5mg DSPE溶解于2mL二氯甲烷中，配制成油相；
S22：向所述油相中加入0.2ml 6wt％碳酸氢铵水溶液，充分混合后，在150W 的功率下超声300秒，制得油包水的初级乳液；
S23：在40,000转/分的搅拌速度下，将上述得到的初级乳液滴入至5wt％聚乙烯醇(数均分子量为70000)水溶液中，高速搅拌3分钟，获得水包油包水的复乳液；
S24：将复乳液倒入含有10mL蒸馏水的烧杯中，在室温下800转/分的速度下搅拌3小时，5000转/分离心分离10min并用蒸馏水清洗离心固体沉淀，重复三次，取固体沉淀冷冻干燥得到白色产物，也既是微泡DSPE-PLC超声造影剂。所得超声造影剂避光、干燥、低温保存。
实施例3
本发明实施例提供了一种DSPC-PLGA超声造影剂及其制备方法。所述 DSPC-PLGA超声造影剂为中空微泡结构，其中，所述中空微泡结构的壳体包括DSPC-PLGA的混合物，在中空微泡结构的中空腔体内被包覆有碳酸氢铵。
所述DSPC-PLGA超声造影剂的制备方法：
S31：将0.05g PLGA(数均分子量为30,000，聚合比例50∶50)与2.5mg DSPC溶解于1mL二氯甲烷中，配制成油相；
S32：向所述油相中加入0.2ml 6wt％碳酸氢铵溶液，充分混合后，在130W 的功率下超声120秒，制得油包水的初级乳液；
S33：在30,000转/分的搅拌速度下，将上述得到的初级乳液滴入至4wt％聚乙烯醇(数均分子量为70000)水溶液中，高速搅拌3分钟，获得水包油包水的复乳液；
S34：将复乳液倒入含有10mL蒸馏水的烧杯中，在室温下800转/分的速度下搅拌3小时，5500转/分离心分离10min并用蒸馏水清洗离心固体沉淀，重复三次，取固体沉淀冷冻干燥得到白色产物，DSPC-PLGA超声造影剂。所得超声造影剂避光、干燥、低温保存。
实施例4
本发明实施例提供了一种DOX-DSPC-PLGA超声造影剂及其制备方法。所述DOX-DSPC-PLGA超声造影剂为中空微泡结构，其中，所述中空微泡结构的壳体包括DSPC-PLGA的混合物，在中空微泡结构的中空腔体内被包覆有DOX。
所述DOX-DSPC-PLGA超声造影剂的制备方法：
S41：将0.05g PLGA(数均分子量为30,000，聚合比例50∶50)与2.5mg DSPC溶解于1mL二氯甲烷中，配制成油相；
S42：向所述油相中加入0.2ml 6wt％碳酸氢铵与1mg阿霉素(DOX)混合溶液，充分混合后，在130W的功率下超声120秒，制得油包水的初级乳液；
S43：在30,000转/分的搅拌速度下，将上述得到的初级乳液滴入至4wt％聚乙烯醇(数均分子量为70000)水溶液中，高速搅拌3分钟，获得水包油包水的复乳液；
S44：将复乳液倒入含有10mL蒸馏水的烧杯中，在室温下800转/分的速度下搅拌3小时，5500转/分离心分离10min并用蒸馏水清洗离心固体沉淀，重复三次，取固体沉淀冷冻干燥得到红色产物，DOX-DSPC-PLGA超声造影剂。所得超声造影剂避光、干燥、低温保存。
相应实验
1.对实施例1-3提供的超声造影剂扫描电镜分析：
实施例1-3提供的超声造影剂扫描电镜图片如图2所示，其中，实施例1 制备的DPPC-PLA超声造影剂进行扫描电镜照片如图2-A所示。由图2-A可知，微泡DPPC-PLA超声造影剂为平均粒径为3微米的微囊。实施例2制备的 DSPE-PLC超声造影剂进行扫描电镜照片如图2-B所示。由图2-B可知，微泡 DSPE-PLC超声造影剂为平均粒径为2微米的微囊。实施例3制备的 DSPC-PLGA超声造影剂进行扫描电镜照片如图2-C所示。由图2-C可知，微泡DSPC-PLGA超声造影剂为平均粒径为0.5微米的微囊。综合图2可知，本实施例超声造影剂为中空结构的微泡，且可以通过改变制备方法中脂质种类、油相聚合物的浓度、外水相、油相、内水相用量比，可以得到不同粒径大小的中空微泡结构微泡，因此可以根据需要自由调整微泡的粒径大小并优化其粒径分布。且从每个图片中可以看出，本发明实施例制备的超声造影剂的粒径比较均一。
2.对实施例1-3提供的超声造影剂进行体外显影：
实验方法：取实施例1-3提供的超声造影剂加入生理盐水稀释，装入琼脂糖制备的仿体内，采用Vevo2100成像系统进行超声造影，在二次谐波成像超声造影模式下观察；
空白组：生理盐水；
实验组：实施例1-3制备的相同浓度的超声造影剂溶液
实验结果：观测的超声显影效果如图3所示。其中，图3-A为空白组，图 3-B、图3-C、图3-D分别为实验组添加实施例1、2、3制备的微泡超声造影剂的超声显影效果图，图3-E为对照组添加市售Sonovue造影剂时的显影效果图，实施例3微泡超声造影剂的超声显影效果与图3-D相同。另外，本发明实施例超声造影剂均达到了较好的超声显影效果，中空结构的微泡在超声作用下可以超声显影，说明本发明实施例超声造影剂中所含的脂质修饰的聚合物壳体具有柔顺性好。另外本发明实施例超声造影剂的粒径大小、材料种类、材料的亲水亲油影响微泡的显影效果。因此，可以通过改变制备条件以及材料类型，满足不同超声造影情况的需求。
3.对实施例1-4提供的超声造影剂进行体外爆破实验：
实验方法：取实施例1-4提供的超声造影剂加入生理盐水稀释，装入琼脂糖制备的仿体内，采用Vevo2100成像系统进行超声造影，在二次谐波成像超声造影模式下观察；
实验结果：其中，实施例3超声造影剂体外显影和爆破超声造影如图4所示，由图4可知，见仿体内回声明显增强，呈密集细点状回声，如图4-A所示；启动爆破模式将微泡击破，仿体内回声瞬间降低，呈无回声，如图4-B所示。另外观察其他实施例，如实施例1-2、4超声造影剂的体外爆破实验跟图4所示的结果近似，因此，本发明实施例超声造影剂中空微泡结构壳体柔顺性好和弹性好，超声造影效果和超声爆破效果好。
4.对实施例1-4提供的超声造影剂进行体内显影实验：
实验方法：将1％戊巴比妥钠70mg/kg腹腔麻醉小鼠后，仰卧位固定，脱毛。使用Vevo2100成像系统(MS250探头，探头频率18-22MHz)，采用自身前后对照方法，常规基波扫查获得小鼠肝声像图。造影时将显像模式调为二次谐波，经尾静脉团注0.1ml稀释后实施例1-4制备的超声造影剂。观察肝造影后的显像时间和显像效果。
实验结果：经谐波模式下观察可知，其中，注射实施例3制备的微泡3S 后，肝血管内出现造影剂充填，5S后肝实质回声出现增强，几分钟后肝实质回声明显增强，25min后仍可见增强，如图5所示。另外观察其他实施例，如实施例1-2、4超声造影剂的体外爆破实验跟图5所示的结果近似，说明本发明所述方法制备的脂质修饰的聚合物微泡可用作超声造影剂。
5.对实施例4提供的超声造影剂的体外药物释放实验：
实验方法：取上述实施例4微泡DOX-DSPC-PLGA超声造影剂分成4组进行分别予0.39MPa、0.46MPa、0.51MPa的声压辐照进行分组，辐照时间2min，对照组不给予超声能量，其他步骤相同，具体实验步骤如下：
(1)将透析袋剪成20cm/段，放入100℃水中煮沸；
(2)分别取5mg DOX-DSPC-PLGA微泡冻干粉溶于5ml PBS缓冲液 (pH＝7.4)；
(3)将上述溶液装入透析袋中，两端封闭；
(4)将各组透析袋给予相应的超声处理，对照组不输出超声；
(5)将100ml PBS缓冲液倒入250ml烧杯中，再将装有DOX-DSPC-PLGA 溶液的透析袋放入烧杯中；
(6)容器放入恒温振荡器中，37℃，100rpm震荡；
(7)分别于12h，24h，48h，72h，96h，120h不同时间点从烧杯PBS缓冲液中取样1ml，每次取样后再向烧杯中补1ml PBS；
(8)采用高效液相色谱法检测样品，根据标准曲线计算各组的浓度和药物累积释放量，分别计算各组在不同时间点的DOX累计释放率(％)，绘制时间- 药物累积释放率曲线。
实验结果：测得实施例4微泡DOX-DSPC-PLGA超声造影剂在不同声压作用下，药物累积释放率曲线如图6所示。由图6可知，随着时间推移，DOX 的含量是逐渐增加了，说明了所述微泡DOX-DSPC-PLGA在超声爆破下可发生破裂，可达到微泡靶向破裂释放药物的效果。
6.将实施例1-4提供的脂质修饰可降解聚合物进行采用FTIR(红外光谱) 测试试验：
实验方法：将实施例1中DPPC修饰的PLA、实施例2中DSPE修饰的PLC、实施例3中DSPC修饰的PLGA分别与共聚物少许与溴化钾混合压片(共聚物与溴化钾的质量比为1：99)，用Nicolet MX-1红外光谱仪检测；
实验结果：实施例3中DSPC修饰的PLGA的FTIR图如图7所示，由图7 可知，DSPC修饰的PLGA同时具有PLGA和DSPC的特征吸收峰，在1760cm-1为PLGA结构中C＝O伸缩振动峰，2850cm-1和2925cm-1为C-H DSPC分子的伸缩振动峰，在3300-3600cm-1的OH伸缩振动峰明显加强，表明DSPC已连接到PLGA分子上。另外，检测得到的实施例1、2中被脂质修饰聚合物的FTIR 图与图7具有相同的规律，均表明相应的脂质已连接到相应聚合物分子上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种药物制剂，包括阿霉素和用于负载阿霉素的药物载体，其特征在于：所述药物载体为超声造影剂；
所述超声造影剂为中空微泡结构，在中空微泡结构的中空腔体内被包覆有阿霉素，所述中空微泡结构的壳体由可生物降解聚合物和脂质组成，且所述脂质修饰可生物降解聚合物；
所述可生物降解聚合物为脂肪族聚内酯；
所述脂质为二硬脂酰磷脂酰胆碱；
所述可生物降解聚合物与脂质的质量比为20：1；
所述脂肪族聚内酯为聚(丙交酯-乙交酯)共聚物；所述聚(丙交酯-乙交酯)共聚物的数均分子量为30000，聚合比例为50：50。
2.一种权利要求1所述的药物制剂的制备方法，其特征在于，所述药物制剂中所述超声造影剂的制备方法包括如下步骤：
将可生物降解聚合物与脂质溶解于有机溶剂中，配制成油相；
将所述成油相与水或含有易分解生成气体物质的水溶液进行第一次乳化处理，获得油包水的初乳液；
将所述初乳液与水相进行第二次乳化处理，获得水包油包水的复乳液；
将所述复乳液所含的所述有机溶剂进行除去，收集沉淀物，对所述沉淀物洗涤处理后进行冻干处理。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述油相中的质量体积浓度为10-150mg/mL，和/或
所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在配制所述初乳液的步骤中，所述油相与所述水或含有易分解生成气体的物质的水溶液的体积比为[1-20]：1，且所述含有易分解生成气体物质的水溶液的质量体积浓度为15-75mg/mL；和/或
所述第一次乳化处理的条件为：所述超声的功率可为60-190W，时间为60-300秒。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在配制所述复乳液的步骤中，所述初乳液与所述水相的体积比为1：[5-50]；和/或
所述水相包括稳定剂，且所述稳定剂在所述水相中的质量百分含量为1.0％-5.0％；和/或
所述第二次乳化处理的条件为：搅拌的速度为10000-40000转/分，时间为1-10分钟。
6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于：将所述复乳液所含的与有机溶剂进行除去的方法包括：将所述复乳液于200-1200转/分的搅拌速度下搅拌处理2-6小时，使得所述有机溶剂挥发。
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