CN102836446A - 体内相转变肿瘤靶向纳米泡及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体为一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡及其制备方法和用途。纳米泡以偶联肿瘤靶向因子的聚磷酸酯-聚酯共聚物为包膜材料,以可在体内发生液-气相转变的全氟戊烷为泡心填充物质,采用预复乳-中空膜管乳化方法制备。纳米泡进入体内后,液态全氟戊烷在体温下发生液-气相转变,形成含气纳米泡,通过靶向因子与肿瘤细胞的特异性结合,纳米泡富集在肿瘤病灶部位,从而改善肿瘤病灶超声成像效果。纳米泡可以负载MRI对比剂,改善肿瘤病灶MRI成像效果。纳米泡还可以负载抗肿瘤药物,用于肿瘤的靶向治疗,是一类诊疗一体化的新型多功能影像学纳米对比剂。
Description
发明领域
本发明内容属于生物医药技术领域。涉及一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡及其膜制备方法和用途,纳米泡采用预复乳-中空膜管乳化方法制备,可用于肿瘤病灶的超声成像、MRI成像诊断以及肿瘤的靶向治疗,是一类诊疗一体化的新型多功能影像学纳米对比剂。
背景技术
微泡是一类能够显著增强医学超声检测信号的超声成像对比剂,微泡内气体和周围活体组织之间高的声阻抗差使微泡产生强反射,导致血液中的背向散射增强(在彩色和频谱多普勒模式下可高达27dB),从而达到增强超声图像效果的目的(JM Correas,et al.Ulreasound contrast agents:properties,principles of action,tolerance,and artifacts.Eur.Radiol.,2001,11:1316-1328.)。第一代微泡超声成像对比剂是含有自由气泡的生理盐水或乳液,以空气或氧气为主要成分,由于自由气体扩散很快而迅速失去声反射性,使其应用范围受到限制,仅能短暂地在右心系统超声显影。第二代微泡超声成像对比剂是以内部包裹空气的人血清白蛋白微泡和糖类微泡为代表,采用超声声振法制备,由于微泡外以固化的人血清白蛋白或糖类物质包膜,具有一定的稳定性,可实现左心系统超声显影,从而具有临床实用价值并实现商品化。1993年和1994年,Molecular Biosystems公司的 包含空气声振白蛋白微泡产品首先在日本和美国上市,先灵葆雅公司包含空气的糖类微泡 和 产品也随后上市。但是,第二代微泡超声成像对比剂存在超声增强效果弱、血循环中持续时间短等缺点,2000年后逐渐退出市场。近十年来,随着表面活性剂、磷脂、 聚电解质等新型微泡包膜材料和低扩散系数惰性气体(如氟碳类气体、氟硫类气体等)的应用,出现了第三代微泡超声成像对比剂。这类微泡较第二代微泡产品血液循环系统的稳定性有了一定提高,超声声波反射性能更强,可通过冠脉循环实现心肌超声显影。这类产品有Molecular Biosystems公司的 先灵葆雅公司的 Bracco公司的Sono 以及ImaRx Pharmaceutical公司的 Sonus Pharmaceutical公司的 等产品。
上述商品化的微泡超声对比剂一般采用冷冻干燥等方法将包膜材料制成粉末,再向包装瓶内灌充惰性气体,使气体渗透到包膜材料粉末的空心结构中。使用时向瓶中注入注射用水,进行机械振荡产生微泡。这种制备方法难以准确控制微泡粒径大小,粒径分布非常宽,导致声衰减明显,微泡血液循环时间短,体内有效超声增强时间有待进一步延长。而且,上述微泡超声成像对比剂均为微米尺度(1~10μm),属于血池显影,仅对血管丰富的器官有较好的显影增强效果,无法穿越血管内皮进入组织间隙,增强血管外病灶组织超声显像效果。
近年来,纳米尺度含气微泡—纳米泡作为新型超声成像对比剂的研究引起人们的重视。纳米泡具有纳米尺度的粒径,可以穿越血管内皮进入组织间隙,使血管外靶组织(如肿瘤组织)显像成为可能。中国发明专利“超声敏感载药纳米泡,200810166862.6”公开了一种超声敏感载药纳米泡,但其实质上是采用透析法结合超声共振法制备的载氟碳化合物的聚合物胶束,并不是真正意义上的包膜纳米泡,且没有动物在体试验或细胞试验数据证明其作用效果。中国发明专利“一种多功能超声造影剂及其制备方法,201010505467.3”公开了一种能够增强超声、CT和MRI成像的含壳核结构纳米粒的脂质乳剂,但其实质是载液体氟碳化合物和纳米磁球的脂质乳剂,不是真正意义上的包膜纳米泡,也不具有靶向性。该脂质乳剂采用传统的薄膜水化-分散乳化-超声制备工艺,难以准确控制粒径,粒径分布宽,制备工艺重现性差。中国发明专利“超声磁共振联合造影剂及其制备方法,200610097375.X”公开了一种包载常规磁共振磁 造影剂和氟碳气体的高分子微球,采用超声波声振空化法制备,其粒径为1~5μm,未给出粒径分布数据。其靶向修饰只是简单的物理混合过程,同样也没有动物在体试验或细胞试验数据证明其作用效果。
目前,已公开的超声微泡多采用白蛋白、磷脂、淀粉、纤维素等天然材料制备,或采用聚丙交酯(PLA)、乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等可生物降解高分子材料制备。前者制备的微泡存在体内抗压性差、声衰减明显、稳定性差等缺点,后者存在亲水性差、体内降解时间长、分子中缺乏活性位点难以靶向修饰等问题。已公开的超声微泡制备方法主要有声振空化法、机械匀化法、薄膜水化法、冷冻干燥法、喷雾干燥法以及乳液聚合法等(戴志飞等,仿生膜材料与技术,科学出版社,2010年)。但这些方法在实际应用中存在许多问题,如:难以得到纳米尺度的微泡,制得的微泡粒径大且粒径均一性差,制备工艺重现性差,制备过程中剧烈的机械作用和/或高温可能导致多肽、蛋白质、抗体等靶向因子失去生物活性等。
同时,随着医学影像学的发展,对影像对比剂提出了更高的要求,能够同时应用于超声、MRI等不同影像学技术,尤其用于肿瘤等重大疾病影像学早期诊断和靶向治疗的诊疗一体化的新型多功能影像学纳米对比剂,将在临床上有良好的应用前景。同时,有必要发展新的纳米对比剂制备技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡,该纳米泡粒径均一可控,体内外稳定性好,载药性能好;本发明还提供了该纳米泡的制备方法和用途,其制备条件温和,能够避免制备中蛋白质、抗体等靶向因子变性,制备工艺重现性好,是用于肿瘤影像学诊断和靶向治疗的诊疗一体化的新型多功能纳米对比剂。
本发明提供的一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡,其特征在于,该纳米泡以可在体内发生液-气相转变的全氟戊烷为泡心填充物质,以肿瘤靶向因子修饰 的可生物降解的聚磷酸酯-聚酯共聚物为包膜材料,其中,按质量百分比计,聚磷酸酯-聚酯共聚物比例为1.0~30.0wt%,肿瘤靶向因子为0.1~10.0wt%,液态全氟戊烷为0.1~5.0wt%,余量为超纯水;
所述聚磷酸酯-聚酯共聚物中,聚磷酸酯为亲水链段,聚酯为疏水链段,基本化学结构式为:
—R1:—CH2-CH2—或—CH2-CH2-CH2—
—R2:—CH2—、—CH(CH3)—或—CH2-(CH2)3-CH2—
—X:—OR′,R′为C1~C10烷基;
所述聚磷酸酯-聚酯共聚物的数均分子量为2000~60,000,聚磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:5~5:1。
本发明提供的一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡的制备方法,其特征在于,
第1步将聚磷酸酯-聚酯共聚物作为包膜材料溶于乙酸乙酯和四氢呋喃的混合溶剂(1:1)中,成为油相1(O1相),液态全氟戊烷作为油相2(O2相),在冰浴中以高剪切(剪切速率5000~30000rpm)混合两相,使O2相均匀分散在O1相中;
第2步将上述两相在冰浴的磁力搅拌下逐渐滴加入水相(W相)中,得到稳定预复乳即O2/O1/W;
第3步将预复乳转入储液仓中,以30~300psi压力的氮气将预复乳循环压过中空膜管,压过中空膜管的次数1~20次,直至得到粒径均一的O2/O1/W复乳;
第4步将O2/O1/W复乳倾入生理盐水中,低于25℃室温下磁力搅拌,通过萃取除去有机溶剂,得到载液态全氟戊烷的纳米泡水分散体。
本发明所提供的体内相转变肿瘤靶向纳米泡的一种用途,其特征在于,所 述纳米泡中加入MRI对比剂,用于MRI成像,MRI对比剂的质量百分比为0.01~3.0wt%,优选0.1~1.5wt%。
本发明所提供的体内相转变肿瘤靶向纳米泡的另一种用途,其特征在于,所述纳米泡用于抗肿瘤药物靶向输送,所负载的抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素、他莫昔芬、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环磷酰胺、或铂类药物在内的临床用的抗肿瘤药物。
本发明由于采用新型功能高分子材料和预复乳-中空膜管乳化方法制备纳米泡,与现有超声成像包膜微泡及其制备方法相比,显示出以下技术进步:
(1)聚磷酸酯-聚酯两亲嵌段共聚物具有生物相容性好,聚磷酸酯链段活性位点多,易于与靶向因子偶联等优点,且亲水性聚磷酸酯链段可有效避免纳米泡被网状内皮系统(RES)清除。通过选择适宜的分子量、聚磷酸酯/聚酯嵌段比和磷酸酯侧链,可以调控其力学性能、降解时间和亲水/亲脂性等。从而制备力学性能适宜(韧性好、抗压性适中)、稳定性好、亲水/亲脂性和降解时间适宜的纳米泡对比剂。
(2)与常规超声微泡对比剂比较,纳米泡可以穿越肿瘤血管内皮,并在靶向因子作用下特异性靶向肿瘤病灶。液态全氟戊烷在体温下发生液-气相转变,形成含气纳米泡,并在超声作用下聚集合并为微泡,增强肿瘤病灶的超声成像效果。还可以负载常规MRI对比剂,提高微小肿瘤病灶MRI成像的准确性和灵敏性,改善肿瘤影像学早期诊断效果。
(3)采用预复乳-中空膜管乳化方法可以实现对纳米泡粒径的精确调控,制得的纳米泡粒径高度均一,单分散性好,体内外稳定性好,血液循环时间长,可以实现肿瘤病灶的重复检查、动态监测及疗效评估。
(4)预复乳-中空膜管乳化方法制备条件温和,能够避免在制备中破坏多肽、蛋白质、抗体等靶向因子的生物活性。
(5)通过控制膜乳化工艺参数,预复乳-中空膜管乳化方法制备工艺重现性好,不同批次纳米泡的粒径、PDI值波动极小,且制备工艺可以按比例放大,易于实现大规模制备。
附图说明
图1是纳米泡的粒径和粒径分布图。
图2是4℃时纳米泡TEM图。
图3是4℃时载超顺磁性纳米Fe3O4纳米泡TEM图。
图4是纳米泡4℃条件下放置稳定性试验结果。
图5是37℃体温条件下纳米泡粒径随时间变化结果。
图6是37℃体温条件下纳米泡TEM图像。
图7是体外连续超声不同时间纳米泡超声成像图,其中,7a为1min,7b为15min,7c为60min。
图8是纳米泡增强裸鼠肝癌超声成像图。
图9是载纳米氧化铁纳米泡、空白纳米泡与水体外MRI成像比较,其中,9a为载纳米氧化铁纳米泡,9b为空白纳米泡,9c为水;
图10是纳米泡VX2肝癌模型兔在体MRI成像结果,10a为未注射纳米泡,10b为注射纳米泡;
图11是载抗肿瘤药物纳米泡体外药物释放曲线(37℃)。
具体实施方式
下面通过借助实施例更加详细地说明本发明,但以下实施例仅是说明性的,本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。
本发明所制备的纳米泡以肿瘤靶向因子修饰的可生物降解聚磷酸酯-聚酯两亲嵌段共聚物为包膜材料,以可在体内发生液-气相转变的全氟戊烷为泡心填充物质,采用预复乳-中空膜管乳化方法制备。其中,按质量百分比计,聚 磷酸酯-聚酯共聚物比例为1.0~30.0wt%,肿瘤靶向因子为0.1~10.0wt%,液态全氟戊烷为0.1~5.0wt%,余量为超纯水。优选聚磷酸酯-聚酯共聚物比例为3.0~10.0wt%,肿瘤靶向因子为0.5~5.0wt%,液态全氟戊烷为0.5~3.0wt%。纳米泡粒径范围为30~1000nm,多分散指数(PDI)≤0.35,优选粒径为100~400nm,PDI≤0.15。
纳米泡经注射进入体内后,液态氟碳化合物在体温下发生液-气相转变,形成含气纳米泡,通过靶向因子与肿瘤细胞的特异性结合,纳米泡富集在肿瘤病灶部位,从而改善肿瘤病灶超声成像效果。纳米泡可以负载常规MRI对比剂,提高微小肿瘤病灶MRI成像的准确性和灵敏性,改善肿瘤影像学早期诊断效果。纳米泡还可以负载抗肿瘤药物,用于肿瘤的靶向治疗,作为抗肿瘤药物靶向输送材料,是一类新型的诊疗一体化的多功能影像学纳米对比剂。
上述纳米泡包膜基质材料为聚磷酸酯-聚酯两亲嵌段共聚物,其中,聚磷酸酯为亲水链段,聚酯为疏水链段。共聚物数均分子量为2000~60,000,聚磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:5~5:1。优选共聚物数均分子量5000~30,000,聚磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:3~3:1。其基本化学结构式为:
-R1:-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-
—R2:—CH2—、—CH(CH3)—或—CH2-(CH2)3-CH2—
-X:-OR′(R′为C1~C10烷基)
亲水链段聚磷酸酯为聚乙基磷酸烷基酯(C1~C10烷基)或聚丙基磷酸烷基酯(C1~C10烷基),如聚乙基/丙基磷酸甲酯、聚乙基/丙基磷酸乙酯、聚乙基/丙基磷酸丙酯、聚乙基/丙基磷酸异丙酯、聚乙基/丙基磷酸丁酯、聚乙基/丙基磷酸异丁酯、聚乙基/丙基磷酸戊酯、聚乙基/丙基磷酸异戊酯、聚乙基/丙基磷酸己酯、聚乙基/丙基磷酸庚酯、聚乙基/丙基磷酸辛酯或聚乙基/丙基磷酸葵酯 等。
疏水链段聚酯链段为聚D,L-丙交酯、聚L-丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物或聚ε-己内酯。
上述聚磷酸酯-聚酯两亲嵌段共聚物中—X可进一步通过氨解反应、醇解反应或卤化反应被取代为—NH2、—OH或—卤素等。
上述聚磷酸酯-聚酯两亲嵌段共聚物可通过—X基团化学偶联肿瘤特异性靶向因子实现肿瘤靶向,肿瘤特异性靶向因子为叶酸、乳铁蛋白、乳铁蛋白受体单链抗体、转铁蛋白、转铁蛋白受体单链抗体、甲胎蛋白(AFP)受体单抗、RGD肽或各种癌细胞的单克隆抗体等。
上述纳米泡泡心填充物质为全氟戊烷(C5F12),全氟戊烷常温下为液体,沸点29.5℃,在体内发生液-气相转变成为气体。
上述纳米泡负载的MRI对比剂为临床使用的常规MRI对比剂,包括超顺磁性纳米Fe3O4、超顺磁性纳米Fe2O3、钆化合物(如Gd-DTPA、Gd-DOTA或Gd-BOPTA等)或锰化合物(Mn-DPDP、卟啉锰等)等。MRI对比剂可占纳米泡水分散体总质量的0.05~3.0wt%,优化用量为0.1~1.5wt%。
上述纳米泡负载的抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素、他莫昔芬、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环磷酰胺、或铂类药物(顺铂、卡铂或奥沙利铂)等临床常用的抗肿瘤药物。
在上述纳米泡水分散体可添加注射剂常用的添加剂,如防腐剂叠氮钠、硫柳汞、苯酚等,添加剂可占纳米泡水分散体总质量的0~2.0wt%。
上述纳米泡采用预复乳-中空膜管乳化方法制备,中空膜管由聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜等有机材料或α-Al2O3陶瓷、ZrO2-Al2O3-TiO2陶瓷或SPG陶瓷等无机材料制备,本发明优选聚丙烯腈、聚砜或SPG陶瓷制备的膜管。中空膜管微孔孔径为0.1~2.0μm。
纳米泡的基本制备过程如下:
第1步将聚磷酸酯-聚酯共聚物作为包膜材料溶于乙酸乙酯和四氢呋喃的混合溶剂(1:1)中,成为油相1(O1相),液态全氟戊烷作为油相2(O2相),在冰浴中以高剪切(剪切速率5000~30000rpm)混合两相,使O2相均匀分散在O1相中;
第2步将上述两相在冰浴的磁力搅拌下逐渐滴加入水相(W相)中,得到稳定预复乳即O2/O1/W;
第3步将预复乳转入储液仓中,以30~300psi压力的氮气将预复乳循环压过中空膜管,压过中空膜管的次数1~20次,直至得到粒径均一的O2/O1/W复乳;
第4步将O2/O1/W复乳倾入生理盐水中,室温下磁力搅拌,通过萃取除去有机溶剂,得到载液态全氟戊烷的纳米泡水分散体。
上述优选制备工艺参数为:第1步中,高剪切的剪切速率10000~20000rpm;第3步中,氮气压力90~180psi,过膜次数3~8次。
下面以实施例方式对本发明中的相转变肿瘤靶向纳米泡及其预复乳-中空膜管乳化制备方法和用途进行说明。本发明中所公开的内容,本领域技术人员可最大限度的应用,因此,本发明所优选的具体实施方案应被理解为仅是举例说明,而非以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)制备共聚物
参照文献方法(S.Penczek,et al.Poly J.Chem.,2001,75:117-181;K.W.Leong,et al.J.Control.Rel.,2003,92:39-48.),合成聚磷酸酯-聚酯两亲嵌段共聚物。
采用2-氯-氧-1,3,2-二氧五环磷酸酯和乙醇合成乙基磷酸乙酯,将0.29mol2-氯-氧-1,3,2-二氧五环磷酸酯溶于250mL干燥处理的苯中,降温至-5℃,将0.29mol乙醇与0.29mol三乙胺的混合物在搅拌下缓慢滴加入苯溶液中,滴加 过程中保持温度为–5℃。滴加完毕,室温下反应1.5h。过滤除去副产物,蒸馏得乙基磷酸乙酯。以三异丁基铝为引发剂,进行乙基磷酸乙酯和D,L-丙交酯共聚反应。将聚合单体和引发剂(聚合单体与引发剂的摩尔比为2000:1)装入洁净的安瓶中,真空条件下干燥3h,将安瓶熔封,置于140℃油浴中反应72h。将聚合产物溶于二氯乙烷和乙酸中,溶液用饱和氯化钠溶液洗涤3次,除去残余的引发剂,加入硫酸钠干燥处理。溶液倾入乙醚中得到白色的沉淀物,真空干燥至恒重,得产物聚乙基磷酸乙酯-聚D,L-丙交酯共聚物。采用凝胶渗透色谱GPC(Viscotek GPC/SEC多检测器凝胶渗透色谱系统,Malvern公司)测得合成的产物数均分子量为14000,磷酸酯和聚酯链段嵌段比为2:1。
(2)制备叶酸偶联的共聚物
参照文献(H.S.Yoo,et al.J.Control.Rel.,2004,96:273-283.)方法,将叶酸与聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物进行化学偶联。首先,将聚乙基磷酸乙酯-聚D,L-丙交酯共聚物进行氨解反应,得聚乙基磷酰胺-聚D,L-丙交酯共聚物。将叶酸溶于二甲亚砜和三乙胺的混合溶剂中,搅拌下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),室温反应2过夜,过滤,除去副产物,得叶酸活性酯。将聚乙基磷酰胺-聚D,L-丙交酯共聚物分散在pH为7.4的磷酸钠缓冲溶液中,加入叶酸活性酯溶液,叶酸活性酯与共聚物质量比为1:30,室温下搅拌反应24h,得偶联产物,将偶联产物过Sephadex G25柱进行分离,即得叶酸偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物。
(3)采用预复乳-中空膜管乳化方法制备纳米泡
称取制备得到的叶酸偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物0.3g溶于15mL乙酸乙酯和四氢呋喃的混合溶剂(1:1)中(O1相),加入液态全氟戊烷1.5mL(O2相),在冰浴中以15000rpm的速率高剪切混合两相,使O2均匀分散在O1相中;将上述两相在冰浴磁力搅拌下逐渐滴加入75mL水相中,得到稳定的预复乳;将预复乳转入膜乳化装置的储液仓中,以160psi压力的氮气将预 复乳循环压过微孔孔径为0.6μm的SPG陶瓷膜管,过膜次数5次,得到粒径均一的复乳;将复乳倾入500mL生理盐水中,20℃室温下磁力搅拌,通过溶剂萃取除去有机溶剂;超纯水离心(8000rpm,3min)洗涤3次,得纳米泡水分散体,置于4℃冰箱保存。
采用激光粒度仪(Zetasizer/Nano ZS90,Malvern公司)4℃时测定纳米泡粒径,测得平均粒径为247.6nm,PDI为0.105,Zeta电位为-23.6±0.4mV。图1为激光粒度仪测得的纳米泡粒径和粒径分布图。采用透射电子显微镜(Tecnai G220,荷兰FEI公司)4℃时表征其微观形貌,结果见图2,纳米泡的粒径约为250nm,泡壁厚度约10nm,泡壁边界清晰。由激光粒度仪测试结果和TEM表征结果可知,纳米泡呈规则的圆泡形结构,单分散性好,粒径均一。
实施例2
(1)制备共聚物
采用2-氯-氧-1,3,2-二氧五环磷酸酯和异丙醇同实施例1方法合成乙基磷酸异丙酯,以乙基磷酸异丙酯和L-丙交酯为聚合单体进行共聚反应,得到聚乙基磷酸异丙酯-聚L-丙交酯共聚物。GPC测得合成的产物数均分子量为26000,磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:2。
(2)制备乳铁蛋白偶联的共聚物
参考文献(M.Elfinger,et al.Biomaterials,2007,28(23):3448-3455;K.Hu,et al.J.Control.Rel.,2009,134(1):55-61.)方法将乳铁蛋白与聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物进行化学偶联。首先,将聚乙基磷酸异丙酯-聚L-丙交酯共聚物进行氨解反应,得聚乙基磷酰胺-聚L-丙交酯共聚物。将其分散在pH为5.6的磷酸钠缓冲溶液中,加入EDC和NHS,室温下振荡反应2h,过Sephadex G25柱,除去未反应的EDC和NHS。将乳铁蛋白溶解于pH7.4的磷酸盐缓冲溶液,加入到活化的聚氨基磷酸酯-聚丙交酯共聚物溶液中,乳铁蛋白与共聚物质量比 为1:3。室温下反应24h,得偶联产物,将偶联产物过Sephadex G25柱,除去游离的乳铁蛋白,即得乳铁蛋白偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物。
(3)制备纳米泡
同实施例1方法,采用预复乳-中空膜管乳化方法制备乳铁蛋白偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物纳米泡,以120psi压力的氮气将预复乳循环压过微孔孔径为1.0μm的SPG陶瓷膜管,过膜次数8次。采用激光粒度仪4℃时测定纳米泡粒径,测得其平均粒径为343.1nm,PDI为0.075,Zeta电位为-17.2±0.3mV。
实施例3
(1)制备共聚物
采用2-氯-氧-1,3,2-二氧五环磷酸酯和乙醇同实施例1方法合成乙基磷酸乙酯,以乙基磷酸乙酯和乙交酯-丙交酯低聚物为聚合单体进行共聚反应,合成得到聚乙基磷酸乙酯-聚乙交酯-丙交酯共聚物。GPC测得合成的产物数均分子量为17500,磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:4。
(2)制备RGD肽偶联的共聚物
同实施例2的方法制备RGD肽偶联的聚乙基磷酸乙酯-聚乙交酯-丙交酯共聚物。
(3)制备纳米泡
采用预复乳-中空膜管乳化方法制备RGD肽偶联的聚乙基磷酸乙酯-聚乙交酯-丙交酯共聚物纳米泡。将实施例1的中空膜管换为1.5μm聚砜膜管,乳液过膜压力为90psi,过膜次数10次,其它制备过程同实施例1,制得的纳米泡4℃时平均粒径为578.3nm,PDI为0.334,Zeta电位为-30.1±0.7mV。
实施例4
(1)制备共聚物
采用2-氯-氧-1,3,2-二氧六环磷酸酯和正己醇同实施例1方法合成丙基磷 酸己酯,以丙基磷酸己酯和D,L-丙交酯为聚合单体进行共聚反应,合成得到聚丙基磷酸己酯-聚D,L-丙交酯共聚物。GPC测得合成的产物数均分子量为9200,磷酸酯和聚酯链段嵌段比为3:1。
(2)制备甲胎蛋白(AFP)受体单抗偶联的共聚物
同实施例2的方法制备AFP受体单抗偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物。
(3)制备纳米泡
同实施例1方法,采用预复乳-中空膜管乳化方法制备AFP受体单抗偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物纳米泡,以150psi压力的氮气将预复乳循环压过微孔孔径为0.4μm的SPG膜管,过膜次数6次。采用激光粒度仪4℃时测定纳米泡粒径,测得其平均粒径为142.6nm,PDI为0.135,Zeta电位为-12.7±0.3mV。
实施例5
采用2-氯-氧-1,3,2-二氧六环磷酸酯和乙醇同实施例1方法合成丙基磷酸乙酯,以丙基磷酸乙酯和D,L-丙交酯为聚合单体进行共聚反应,得到聚丙基磷酸乙酯-聚D,L-丙交酯共聚物。GPC测得合成的产物数均分子量为3800,磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:1。
将实施例1的中空膜管换为0.1μm聚丙烯腈膜管,乳液过膜压力为280psi,过膜次数2次,其它制备过程同实施例1,制得的纳米泡4℃时平均粒径为73.5nm,PDI为0.320,Zeta电位为-31.2±0.5mV。
实施例6
采用2-氯-氧-1,3,2-二氧五环磷酸酯和乙醇合成乙基磷酸乙酯,以乙基磷酸乙酯和ε-己内酯为聚合单体进行共聚反应,得到聚乙基磷酸乙酯-聚己内酯共聚物。GPC测得合成的产物数均分子量为55000,磷酸酯和聚酯链段嵌段比为5:1。
将实施例1的中空膜管换为2.0μm的SPG陶瓷膜管,乳液过膜压力为50 psi,过膜次数18次,其它制备过程同实施例1,制得的纳米泡4℃时平均粒径为832.9nm,PDI为0.085,Zeta电位为-23.5±0.9mV。
实施例7
制备载超顺磁性纳米Fe3O4纳米泡
按照实施例2制备乳铁蛋白偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物作为纳米泡包膜材料,将包膜材料与0.06g油溶性超顺磁性纳米Fe3O4一同溶于有机溶剂中,其它制备条件与实施例2一致,制得载MRI对比剂超顺磁性纳米Fe3O4的纳米泡。激光粒度仪4℃时测得载纳米Fe3O4纳米泡平均粒径为291.5nm,PDI为0.220,Zeta电位为-29.4±2.35mV。采用透射电子显微镜4℃时表征其微观形貌,结果见图3。由TEM表征结果可知,纳米Fe3O4均匀载附于纳米泡的泡壁和内层。
实施例8
纳米泡放置稳定性试验
将实施例1制备的纳米泡置于4℃冰箱中保存,每隔一定时间取样采用激光粒度仪测定其粒径和PDI值,评价纳米泡4℃条件下放置稳定性,试验结果见图4。由试验可知,纳米泡在4℃条件下放置6个月其粒径变化(RSD≤5%)和PDI变化(RSD≤5%)均非常小,表明纳米泡在4℃条件下具有良好的稳定性。
实施例9
37℃条件下纳米泡粒径随时间变化试验
将实施例1制备的纳米泡置于37℃恒温水浴中,每隔一定时间取样采用激光粒度仪测定其粒径,考察纳米泡体温条件下粒径随时间的变化趋势,试验结果见图5。由试验可知,体温条件下全氟戊烷发生气化,纳米泡逐渐膨胀,6min开始粒径逐渐变大,至35min粒径趋于稳定。采用透射电子显微镜(Tecnai G220,荷兰FEI公司)表征37℃条件下纳米泡的微观形貌,结果 见图6,由于全氟戊烷气化,纳米泡膨胀为粒径约700nm,泡壁变薄,边界模糊。
实施例10
纳米泡体外超声成像试验
将实施例1制备的纳米泡置于超声仪,进行纳米泡体外超声成像试验。
仪器型号:GE Logiq7超声仪,4C探头。主要测试参数:MI:0.10,TIs:0.0,Thyroid,B模式,Frq:5.0MHz,Gn:76,E/A:0/0,Map:k/0/0,D:11.0cm,DR:120,FR:14Hz,AO:20%,Triq:0-1.5s,Tch:Fnd.。
试验结果:37℃超声条件下,纳米泡快速发生液-气相转变,形成含气纳米泡,产生非常强且稳定的体外超声成像效果。如图7所示,A、B、C分别为纳米泡1min、15min和60min超声成像图。试验结果表明,纳米泡在持续超声60min下超声图像仍然清晰,低温冰浴后再次超声仍可清晰成像。同样条件下市售SonoVue微泡仅能维持成像时间约10min。试验还表明,随纳米泡浓度的增加超声信号强度增强。
实施例11
纳米泡裸鼠在体超声成像试验
将实施例1制备的纳米泡尾静脉注射至肝癌模型裸鼠,进行纳米泡在体超声成像试验。
仪器型号:GE LOGIQ 9型彩色多普勒超声仪。主要测试参数:线阵探头,频率9MHz,MI 0.50,采用编码反向谐波成像技术(pulse inversion harmonic imaging,PIHI)。
试验结果:试验动物为肝癌模型裸鼠,由图8可知,肝癌模型裸鼠尾静脉注射纳米泡造影剂后,肿瘤超声信号明显增强,显示了纳米泡良好的肿瘤靶向功能。
实施例12
纳米泡体外MRI成像试验
将实施例2制备的纳米泡(空白纳米泡)和实施例7制备的载超顺磁性纳米氧化铁纳米泡,37℃条件下进行体外MRI成像试验。
仪器型号:西门子Trio 3.0T磁共振仪,腕关节线圈。主要测试参数:SE序列,FoV read:120mm,层厚:1.5mm,TR:200ms,TE1-7:20ms,40ms,60ms,80ms,100ms,120ms,140ms.
试验结果:MRI成像结果如图9所示。采用多回波序列扫描,测得载纳米氧化铁纳米泡、空白纳米泡和水的平均R2值分别为:78.6,456.1,1198.9s-1。表明载纳米氧化铁纳米泡能够显著降低体外MRI横向弛豫率,延长横向弛豫时间。空白纳米泡也具有一定的降低MRI横向弛豫率的功能。
实施例13
纳米泡VX2肝癌模型兔在体MRI成像试验
将实施例7制备的纳米泡进行VX2肝癌模型兔在体MRI成像试验。
仪器型号:西门子Avanto 1.5T磁共振仪,腹部线圈。主要测试参数:T2WI:haste序列,FoV read:240mm,层厚:4.0mm,TR:800ms,TE:67ms。T1WI:SE序列,FoV read:240mm,层厚:4.0mm,TR:500ms,TE:9.2ms。
纳米泡MRI在体肿瘤成像结果如图10所示。试验结果:试验动物为VX2原位肝癌移植模型兔,在体MRI成像结果表明,未注射纳米泡的对照组,动物肝癌组织T2WI呈高信号,T1WI呈低信号,对微小肿瘤病灶显影不清晰。试验组兔耳缘静脉注射纳米泡5mL,成像结果显示兔肝癌组织T2WI呈高信号增强,T1WI呈低信号微增强,使直径约0.5cm的小肿瘤显影增强,并使原来较大的肿瘤边界更加清晰,显示了纳米泡良好的肿瘤靶向功能。
实施例14
以实施例1制备的叶酸偶联的聚磷酸酯-聚丙交酯共聚物为包膜材料,将0.1g阿霉素与包膜一同溶于有机溶剂中,按照实施1条件制备载抗肿瘤药物阿霉素的肿瘤靶向纳米泡。激光粒度仪4℃时测得载药纳米泡平均粒径为224.0nm, PDI为0.127,Zeta电位为-25.1±0.66mV。Minipore超滤管方法测得其药物包封率为97.2%。
建立小鼠肝癌H22模型,分4组,每组9只,按2.5mg/kg体重剂量分别静脉注射生理盐水、阿霉素注射液、空白纳米泡混悬液、载阿霉素纳米泡混悬液。在肿瘤部位进行超声辐照治疗,辐照时间为3分钟,间隔3分钟,重复3次,超声强度为2.5W/cm2,隔天治疗一次,连续7次。治疗结束后第三天处死小鼠,取出瘤块称重计算抑瘤率。结果发现,相同剂量条件下,载阿霉素纳米泡混悬液组抑瘤率(74.5%)明显高于阿霉素注射液组(48.6%),同时,不载药空白纳米泡混悬液也有一定的抑瘤效果(37.2%)。表明本发明的纳米泡可以负载抗肿瘤药物用于肿瘤的靶向治疗。
实施例15
载抗肿瘤药物纳米泡37℃体外药物释放试验
按照实施例1的方法分别制备载不同理化性质抗肿瘤药物靶向纳米泡(A:紫杉醇;B:多西他赛;C:阿霉素;D:5-氟尿嘧啶)。采用Franz扩散池进行载抗肿瘤药物纳米泡体外释放实验。选用硝酸纤维素半透膜为渗透膜,释放介质为含0.5%Tween-80的PBS(pH 7.4),准确称量3g左右的载抗肿瘤药物纳米泡样品置于扩散池的供给室,释放介质置于接收池,半透膜固定在供给室和接收池之间。整个装置置于37±0.1℃的恒温水浴中,用封口胶密封供给室,开启电磁搅拌器以300r/min的速度搅拌。高效液相色谱法测定不同时间点释放介质中药物的浓度,由浓度测试结果推算得药物累积释放百分率。载不同抗肿瘤药物纳米泡累积释放百分率见图11。结果表明,纳米泡对不同理化性质的抗肿瘤药物均具有明显的缓释效应,药物持续释放时间可长达15天。
以上所述为本发明的较佳实施例而已,但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改,都落入本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡,其特征在于,该纳米泡以可在体内发生液-气相转变的全氟戊烷为泡心填充物质,以肿瘤靶向因子修饰的可生物降解的聚磷酸酯-聚酯共聚物为包膜材料,其中,按质量百分比计,聚磷酸酯-聚酯共聚物比例为1.0~30.0wt%,肿瘤靶向因子为0.1~10.0wt%,液态全氟戊烷为0.1~5.0wt%,余量为超纯水;
所述聚磷酸酯-聚酯共聚物中,聚磷酸酯为亲水链段,聚酯为疏水链段,基本化学结构式为:
—R1:—CH2-CH2—或—CH2-CH2-CH2—
—R2:—CH2—、—CH(CH3)—或—CH2-(CH2)3-CH2—
—X:—OR′,R′为C1~C10烷基;
所述聚磷酸酯-聚酯共聚物的数均分子量为2000~60,000,聚磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:5~5:1。
2.根据权利要求1所述的体内相转变肿瘤靶向纳米泡,其特征在于,聚磷酸酯-聚酯共聚物比例为3.0~10.0wt%,肿瘤靶向因子为0.5~5.0wt%,液态全氟戊烷为0.5~3.0wt%。
3.根据权利要求1所述的体内相转变肿瘤靶向纳米泡,其特征在于,纳米泡粒径范围为30~1000nm,优选范围为100~400nm,多分散指数PDI≤0.35,优选值为PDI≤0.15。
4.根据权利要求1所述的体内相转变肿瘤靶向纳米泡,其特征在于,所述聚磷酸酯-聚酯共聚物的数均分子量为5000~30,000,聚磷酸酯和聚酯链段嵌段比为1:3~3:1。
5.根据权利要求1至4中任一所述的体内相转变肿瘤靶向纳米泡,其特征在于,所述聚磷酸酯为聚乙基磷酸烷基酯(C1~C10烷基)或聚丙基磷酸烷基酯(C1~C10烷基),包括聚乙基/丙基磷酸甲酯、聚乙基/丙基磷酸乙酯、聚乙基/丙基磷酸丙酯或聚乙基/丙基磷酸异丙酯等;所述聚酯链段为聚D,L-丙交酯、聚L-丙交酯、聚乙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物或聚ε-己内酯;所述肿瘤靶向因子包括叶酸、乳铁蛋白、乳铁蛋白受体单链抗体、转铁蛋白、转铁蛋白受体单链抗体、甲胎蛋白AFP受体单抗、RGD肽或其它各种癌细胞的单克隆抗体。
6.一种体内相转变肿瘤靶向纳米泡的制备方法,其特征在于,
第1步将聚磷酸酯-聚酯共聚物作为包膜材料溶于乙酸乙酯和四氢呋喃的混合溶剂中,成为油相1即O1相,液态全氟戊烷作为油相2即O2相,在冰浴中以高剪切混合两相,使O2相均匀分散在O1相中;所述高剪切是指剪切速率为5000~30000rpm;
第2步将上述两相在冰浴的磁力搅拌下逐渐滴加入水相中,得到稳定预复乳即O2/O1/W,其中,W相是指水相;
第3步将预复乳转入储液仓中,以30~300psi压力的氮气将预复乳循环压过中空膜管,压过中空膜管的次数1~20次,直至得到粒径均一的O2/O1/W复乳;
第4步将O2/O1/W复乳倾入生理盐水中,低于25℃室温下磁力搅拌,通过萃取除去有机溶剂,得到载液态全氟戊烷的纳米泡水分散体。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,第1步中,高剪切的剪切速率10000~20000rpm;第3步中,氮气压力90~180psi,过膜次数3~8次。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于,所述中空膜管由包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯或聚砜在内的有机材料制备,或者为包括α-Al2O3陶瓷、ZrO2-Al2O3-TiO2陶瓷或SPG陶瓷在内的无机材料制备,其中,中空膜管的制备材料优选聚丙烯腈、聚砜或SPG陶瓷,中空膜管微孔孔径为0.1~2.0μm。
9.一种权利要求1所述体内相转变肿瘤靶向纳米泡的用途,其特征在于,所述纳米泡中加入MRI对比剂,用于MRI成像,MRI对比剂的质量百分比为0.01~3.0wt%,优选0.1~1.5wt%。
10.一种权利要求1所述体内相转变肿瘤靶向纳米泡的用途,其特征在于,所述纳米泡用于抗肿瘤药物靶向输送,所负载的抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素、他莫昔芬、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环磷酰胺、或铂类药物在内的临床用的抗肿瘤药物。
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