CN1559615A - 超声微泡造影剂定位控释方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种将超声微泡造影剂作为基因的运载工具，对基因进行定位控释而使基因在靶向组织进行转染的方法。携基因的超声微泡造影剂包括将基因粘附于造影剂微泡的表面和/或将基因包裹于微泡造影剂内的情况。对进行静脉注射的微泡造影剂或携基因的微泡造影剂，用声像图监控造影剂到达靶组织显影后，用一定能量的超声波破坏微泡，并用声像图和超声组织定征方法监控基因转染、表达情况。本发明具有无创、操作简便、靶向性好、转染率高、安全、可以多次重复使用等优点。

Description

超声微泡造影剂定位控释方法

技术领域

本发明涉及将超声微泡造影剂作为基因的运载工具，并用声像图引导，用一定能量超声波定位触发进行基因转染，提供了一种用声像图及超声组织定征方法进行定位和监控的基因靶向转移的方法。

背景技术

超声微泡造影剂作为一种新型声学造影剂在器官、组织的超声显像中发挥了巨大的作用。随着超声技术如二次谐波、触发显像等的发展和造影剂制备技术的完善，造影剂可大大提高对各种组织病变的诊断率，常规用于诊断的超声频率超过1MHz。

基因转染是指噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入细胞的过程。目前基因转移方法常见的有病毒介导的基因转移方法和非病毒转移方法如：DNA直接注射法、脂质体介导的DNA转移法、受体介导的DNA转移方法、颗粒轰击技术、磷酸钙转染法、电穿孔法等。常用的载体为病毒载体和质粒载体。但目前仍存在不少尚未解决的问题，如缺乏安全、有效、有组织特异性和靶向性的基因转移系统，缺乏稳定的表达和转录后的宿主反应等。现有的基因转移技术如：以病毒为载体，虽然基因的转染率高，但存在安全性和机体对病毒产生免疫反应等问题；质粒等非病毒载体，虽然安全，但转染率低。采用静脉注射的基因转染存在靶向性差的缺点，到达特定组织的基因量少，转染率低；而基因局部注射导入则存在适用范围有限及有创等问题。而将微泡造影剂作为新的基因运载工具，将特定的基因与微泡造影剂结合起来，通过外周血管注射，以超声破坏携基因的微泡，进行微泡在特定组织的定位释放，提供一种新的基因转移方法，具有无创、操作简便、靶向性好、转染率高、安全且重复性好的优点。目前尚无携基因或靶向基因的超声微泡造影剂的合成及其定位释放方法学的研究，无用声像图和组织定征方法监控其在组织的释放和表达情况的方法学。

发明内容

本发明要达到的目的是：将微泡造影剂作为基因的运载体，即将基因粘附于微泡造影剂的表面或/和包裹于造影剂内，通过声像图引导定位，用一定能量超声波在特定组织破坏微泡，实现微泡在靶组织的定向释放，并用声像图和超声组织定征的方法监控其在组织释放和作用情况。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

1、直接采用微泡造影剂或将微泡造影剂与基因结合：将微泡造影剂与基因结合的方法包括：

(1)、将基因粘附于微泡造影剂的表面：将选定的基因与脂质微泡造影剂按体积份数以3-10∶10的比例混合(使混合物中基因的量约为0.1-1mg/ml)，此时由于静电吸附作用使基因粘附于微泡表面。

(2)、将基因包裹于微泡内：而将低温下为液态的氟碳气体与基因按体积份数比为3-5∶1混合后，在声振过程中形成由脂质材料包裹氟碳液体和基因的微球，在温度升高至37℃-45℃条件下变为微泡。用PBS清洗掉未裹入的基因，所得到的即为包裹入的携基因的微泡造影剂。

2、对微泡造影剂或携基因的微泡造影剂进行定位超声控释：

对进行静脉注射微泡造影剂或携基因的微泡造影剂，用声像图监控造影剂到达靶组织显影后，用一定能量的超声波破坏微泡：当采用微泡造影剂时，超声能量为20-800KHz，0.25-2.5W/cm²，作用时间1-3分钟，微泡破坏后产生“空化效应”、“声孔效应”，可直接作用于局部肿瘤组织，达到定向作用的目的；当采用携基因的微泡造影剂时，超声能量为1MHz，0.25-2.5w/cm²，作用时间为1-3分钟。由于微泡破坏后可释放其所携带的目的基因，达到其定位释放作用。同时，微泡破坏后的“空化效应”、“声孔效应”可致微血管破裂、增加血管通透性，可使基因在局部的转染率明显提高。

超声破坏微泡后可用声像图监控携基因的微泡造影剂到达靶组织及其转染、表达的情况。微泡释放即刻、一段时间，用超声诊断仪或专利号为4111751.0的“超声图像定量分析诊断仪”进行超声组织定征监控，观察其靶组织回声强度的变化。此方法无创、简便、可以反复使用。

本发明所涉及的微泡造影剂为可直接获得的国外已上市的造影剂如美国生产的Sonovue、Optison、Albunex、德国生产的Levovist等产品或自制的声学造影剂。将购得的造影剂或自制造影剂用于与基因粘附的方法，而基因的包裹主要用自制的造影剂来制作。

上述携带基因的微泡造影剂的制作方法如下：

1、基因粘附于造影剂的表面  采用冻融超声法将脂质材料包裹生物活性气体制作微泡造影剂。其中，脂质材料主要有卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺，将以上材料按重量份数比为1∶3∶3的比例用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入适量水相溶剂：0.9％氯化钠溶液∶丙二醇∶甘油＝8∶1∶1，振荡洗膜，形成脂质体混悬液。冷冻过夜。解冻后，即可用声振仪以最大输出功率的25-35％振荡适当时间(60-120s)，同时经三通管在下方缓慢充入氟碳气体(如全氟丙烷、全氟丁烷等)，氟碳气体的量为0.4-0.6ml，形成脂质氟碳微气泡。用微孔滤膜(孔径10μm)滤除粒径较大的微泡。并采用库尔颗粒计数仪进行脂质微泡造影剂的浓度测定，用显微镜进行粒径大小测定(2-6μm)。将一定量的选定基因与微泡溶液在低温约4℃的条件下以体积比为3-10∶10混合1-2小时，使混合液中基因的量为0.1-1mg/ml。由于静电吸附作用使基因粘附于造影剂微泡表面，由于造影剂带正电荷，而基因带负电荷，异种电荷相互吸引，基因载体则粘附于微泡的表面。

2、基因粘附和包裹于微泡内  采用特殊的氟碳材料，如全氟戊烷、全氟丁烷、全氟丙烷或混合气体，其在低温(4℃)时为液体，在温度升高条件下(37℃-45℃)时为气体，在低温条件(4℃)下将氟碳液体与选定的基因以体积比为3-5∶1混合，形成氟碳液体与基因的混合物，采用脂质材料作为微泡的外壳，主要有卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺，将以上材料按质量比1∶3∶3的比例用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入适量水相溶剂：0.9％氯化钠溶液∶丙二醇∶甘油＝8∶1∶1振荡洗膜，形成脂质体混悬液；冷冻过夜；解冻后，用声振仪以最大输出功率的25-35％声振适当时间(60-120s)，同时经三通管在下方缓慢冲入氟碳液体与基因的混合物约4-6ml，形成脂质体氟碳造影剂(外壳为脂质体，内包裹实心的氟碳液体和目的基因)。此时可有少量的基因粘附于造影剂的表面，形成的为含两种结合方法的造影剂。采用此方法，可将基因较均匀地包裹于脂质体微球内。当包裹基因的脂质体微球进入血液循环后，液体转变为气体，形成具有声学活性的包裹基因的微泡造影剂。

3、基因包裹于微泡内  将上述2中所形成的造影剂在无菌条件下用一定量的PBS溶液冲洗3遍，使粘附于表面的基因脱落下来，即得到包裹于微泡的携基因造影剂。

对上述微泡造影剂或携基因的微泡造影剂增强靶向聚集作用而采取的措施是：在微泡表面连接上针对特定组织抗原的相应抗体或针对特定受体的配体，可大大提高微泡的靶向作用。如抗CD34、抗ICAM、抗E-选择素、抗P-选择素等，将各种抗体在声振过程中混合入液体中，可形成具有靶向作用的超声微泡造影剂。

本发明不涉及新的基因及其制备过程，所选用的基因为可在商业上获得的现有基因产品，包括各种生长因子如：血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等；标记基因如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、β-半乳糖苷酶基因等；各种肿瘤治疗基因如自杀基因、抑癌基因(P53、P16、RB等)、反义癌基因(反义MYC、NEU、K-ras等)、免疫基因等。

发明产生的有益效果如下：

将不同的基因通过粘附或/和包裹的方式与微泡造影剂结合，由于微泡与基因带异种电荷，可通过静电吸附的方式将基因粘附于微泡的表面。而通过将基因与低温下液态的气体混合，声振后将基因包裹于微泡里面，也实现了微泡与基因的结合，将基因粘附于微泡表面或包裹于微泡里面后可减少基因在到达组织前的破坏。用一定能量超声波在特定组织破坏微泡，其产生的“空化效应”、“声孔效应”可引起微血管通透性增高，可明显增强基因在局部的转染、表达和作用。并且低频超声破坏微泡后可产生一定的生物学效应，在肿瘤组织发挥其生物作用。用声像图和超声组织定征方法，可监测基因在组织表达后的作用和微泡对肿瘤组织作用。此方法具有无创、操作简便、靶向性好、转染率高、安全且可重复使用的优点。

附图说明

附图1为显微镜下观察微泡造影剂形态示意图；

附图2为超声监控微泡在组织的显影，A图为可见微泡到达左室心肌后，在左室心肌显影，B图为用一定能量的超声破坏微泡，可实现微泡的定位释放。并可进行超声组织定征检测；

附图3为超声波“空化效应”、“声孔效应”对体外培养细胞细胞膜作用实验的电镜观测对照图。其中A图中箭头所指处为超声破坏微泡后使体外培养细胞的细胞膜上出现的可逆性小孔；而B图为单纯超声作用后的细胞和C图中细胞未进行超声破坏对照组则无明显差别。

附图4为超声微泡造影剂介导VEGF基因转染大鼠心肌后，免疫组化染色图片检测VEGF在心肌的表达(放大倍数×400)示意图。图A：显示用超声破坏携VEGF基因的微泡后大鼠心肌组织有大量VEGF表达的阳性颗粒；图B：显示单纯超声作用后大鼠心肌组织VEGF阳性颗粒较少；图C：显示对照组大鼠心肌组织VEGF阳性颗粒更少。

附图5为超声微泡造影剂携腺病毒载体转染肝脏后荧光显微镜下观察载体的表达示意图。用超声破坏携腺病毒载体的微泡，荧光显微镜下有更多绿色荧光表达(图A)；单纯静脉注射腺病毒载体(图B)表达很少；对照组(图C)无表达。

具体实施方式

实例1：本发明用于基因的粘附的微泡造影剂的合成

将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺按重量份数比为1∶3∶3的比例用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入0.9％氯化钠溶液，丙二醇和甘油(0.9％氯化钠溶液∶丙二醇∶甘油＝8∶1∶1)，振荡洗膜，形成脂质体混悬液。冷冻过夜。解冻后，用声振仪以最大输出功率的30％振荡80s，同时经三通管在下方缓慢充入全氟丙烷气体0.6ml，形成脂质氟碳微气泡。用微孔滤膜滤除粒径较大的微泡。并采用库尔颗粒计数仪进行脂质微泡造影剂的浓度测定，用显微镜进行粒径大小测定。测得微泡的大小为2-4um，浓度为8.2×10⁸。

实例2：基因粘附于微泡造影剂的检测

将实例1中所合成的微泡造影剂的脂质外壳进行荧光标记，而基因用碘化丙锭(PI)进行染色。3ml微泡造影剂与1ml基因在4℃混合2h，用免疫荧光方法检测发出两种荧光的微泡数，即为粘附了基因的微泡数。

实例3：基因包裹于微泡造影剂的制作

在4℃下将全氟丙烷的液体与绿色荧光蛋白基因以体积比为3∶1混合，形成氟碳液体与基因的混合物，采用脂质材料卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺按重量份数比1∶3∶3的比例用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；按比例加入适量水相溶剂：体积份数比为0.9％氯化钠溶液∶丙二醇∶甘油＝8∶1∶1振荡洗膜，形成脂质体混悬液；冷冻过夜；解冻后，用声振仪以最大输出功率的35％声振适当时间120s，同时经三通管在下方缓慢冲入氟碳液体与基因的混合物约6ml，形成脂质体氟碳造影剂(外壳为脂质体，内包裹实心的氟碳液体和选定的基因)。用10mlPBS溶液洗涤3次，得到包裹了基因的微泡造影剂。

实例4：携带VEGF基因的微泡造影剂的制备

将pcD₂VEGF₁₂₁基因(由北京大学医学部心血管病基础研究所提供，该质粒含CMV启动子和PolyA尾。经碱裂解法提取质粒、PEG-8000纯化，分别根据内切酶图谱和260、280nm光吸收进行鉴定和定量)1ml(6mg/ml)与实例1中的3ml微泡造影剂在4℃下混合2h，使VEGF基因粘附于微泡的外壳。形成的混合物中pcD₂VEGF₁₂₁基因的浓度为1.5mg/ml。

实例5：携带腺病毒载体的微泡造影剂的制备

将1ml腺病毒载体(AdEasy)(含有绿色荧光素蛋白基因，由重庆医科大学病毒性肝炎研究所提供)与1ml实例1中的微泡造影剂在4℃混合2小时，形成的混合物中腺病毒滴度为2×10⁷pfu/ml。

实例6：超声波“空化效应”对体外培养细胞细胞膜的作用

将体外培养的血管平滑肌细胞制成单细胞悬液，摇匀后平均分为1.2ml，移入无菌聚乙稀试管内。分为对照组、单纯超声辐照组和造影剂+超声辐照组三组。试管内加入微泡造影剂“全氟显”的量为50μl，用一定能量(665KHz、0.5w/cm²)的超声波辐照20s，立即和继续培养24小时后，用扫描电镜观察细胞膜结构有无改变。结果显示超声破坏微泡后可使体外培养细胞的细胞膜上出现可逆性小孔(“声孔效应”所致)，而单纯超声作用后的细胞和对照组则无明显差别。此可能为超声破坏微泡促进细胞基因转染的机制。

实例7：超声破坏微泡对毛细血管通透性的影响

15只健康雄性Wistar大鼠分为三组，第一组经静脉输入含有伊文思蓝(Evans blue)的微泡造影剂，并采用超声波(20KHz、声强为0.5W/cm²)辐照约2min，破坏心肌组织内造影剂；第二组采用超声照射，同时经静脉单纯输入伊文思蓝溶液；第三组单纯经静脉输入伊文思蓝作为对照。照射完毕2小时后放血处死大鼠，采用分光光度法测量各组大鼠心肌组织中伊文思蓝含量(作为反映血管通透性的指标)。结果表明超声波触发破坏微泡造影剂后能使心肌组织毛细血管通透性增加，使基因可更容易进入靶组织发挥作用，此可能是超声微泡增强基因转染的主要机制之一。

实例8：采用超声微泡造影剂定位控释方法对VEGF基因进行转染的实验

大鼠冠状动脉左前降支结扎后，建立大鼠心肌梗塞模型。将实例1中混合物1.33ml(含pcD2VEGF121基因2mg)，经尾静脉输入体内，用诊断超声在大鼠胸壁监测到微泡显影后，用一定能量(1MHz，0.5W/cm²)的超声波在大鼠胸壁照射至微泡消失，时间约2分钟。进行基因转染。转基因后14天，取受损局部心肌组织，用ABC法VEGF免疫组织化学染色，观察VEGF蛋白表达，以CD34标记，免疫组织化学监测心肌组织中血管新生情况，并计数微血管密度(MVD)。结果表明用超声微泡造影剂作为VEGF基因载体，能明显增强VEGF基因在大鼠心肌中的表达，并可促进缺血心肌组织中的血管新生。

实例9：采用超声微泡造影剂定位控释方法对腺病毒载体的转染和表达的实验

昆明小白鼠尾静脉输入实例4中含腺病毒载体的造影剂1ml，用诊断超声在肝脏表面监测造影剂的显影后，用一定能量(655kHz，0.5W/cm²)的超声波在小鼠肝脏照射至微泡消失，行基因转染。转基因后14天，取肝组织在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。结果显示超声触发破坏携带腺病毒的微泡造影剂，可有效提高腺病毒载体在肝细胞的感染率。

实例10：不同转染方法的比较实验

用实例1中所合成的微泡造影剂0.5ml与含绿色荧光蛋白基因的0.5ml质粒(重庆医科大学病毒性肝炎研究所提供)混合后，用培养的HepG₂细胞进行基因的转染实验，一组用采用超声微泡造影剂定位控释方法破坏微泡(超声能量为1MHz，0.5W/cm²)，一组用脂质体转染，3天后荧光显微镜下比较两种转染方法后基因的表达情况，结果显示两种方法均可促进基因的转染，两种方法具有可比性。

实例11：超声破坏微泡对肿瘤的作用

建立兔VX₂肝癌模型，经耳缘静脉缓慢输入实例1中所合成的造影剂0.1ml，同时用低频超声(20KHz，2.5W/cm²)间歇作用3分钟，作用的频率为1∶1。作用后取肿瘤组织观察其显微和超微结构的改变。结果表明低频超声破坏微泡后可使肿瘤组织的微血管栓塞。

Claims (4)

1、一种超声微泡造影剂定位控释方法，其特征是：方法包括的内容如下：

(1)、直接采用微泡造影剂或将微泡造影剂与基因结合构成携带基因的微泡造影剂：其中，将微泡造影剂与基因结合构成携带基因的微泡造影剂方法包括：

a、将基因粘附于微泡造影剂的表面：将选定的基因与脂质微泡造影剂按体积份数比以3～10∶10的比例混合，使混合物中基因的量为0.1～1mg/ml，通过静电吸附作用使基因粘附于微泡表面；

或b、将基因包裹于微泡内：将低温下为液态的氟碳气体与基因按体积份数比以3-5∶1混合后，在声振过程中形成由脂质材料包裹氟碳液体和基因的微球，在温度升高至37℃--45℃条件下变为微泡，用PBS清洗掉未裹入的基因，所得到的即为包裹入的携基因的微泡造影剂；

(2)、对微泡造影剂或携基因的微泡造影剂进行定位超声控释，方法是：

对进行静脉注射的微泡造影剂或携基因的微泡造影剂，用声像图监控造影剂到达靶组织显影后，用一定能量的超声波破坏微泡：

a、当只采用微泡造影剂时，超声能量为20～800KHz，0.25～2.5W/cm²，作用时间1～3分钟；

或b、当采用携基因的微泡造影剂时，超声能量为1MHz，0.25～2.5w/cm²，作用时间为1～3分钟。

2、一种制备如权利要求1所述携带基因的微泡造影剂的方法，其特征是方法包括：

(1)、将基因粘附于造影剂微泡的表面：采用冻融超声法将脂质材料包裹生物活性气体制作微泡造影剂，其中，将脂质材料用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入适量水相溶剂，振荡洗膜，形成脂质体混悬液，冷冻过夜，解冻后，即可用声振仪以最大输出功率的25-35％振荡60-120s，同时经三通管在下方缓慢充入氟碳气体，氟碳气体的量为0.4-0.6ml，形成脂质氟碳微气泡，用孔径为10μm的微孔滤膜滤除粒径较大的微泡，并采用库尔颗粒计数仪进行脂质微泡造影剂的浓度测定，用显微镜进行粒径大小测定为2-6μm，将选定的基因与微泡溶液在低温4℃的条件下以体积份数比为3～10∶10混合1～2小时，使混合液中基因的量为0～3mg/ml；基因载体则粘附于微泡的表面；

或(2)、将基因粘附和包裹于造影剂微泡内：采用在4℃低温时为液体的氟碳材料，在4℃低温条件下将氟碳液体与选定的基因以体积份数比为3～5∶1混合，形成氟碳液体与基因的混合物；将脂质材料用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入适量水相溶剂，振荡洗膜，形成脂质体混悬液；冷冻过夜；解冻后，用声振仪以最大输出功率的25-35％声振适当时间(60-120s)，同时经三通管在下方缓慢冲入氟碳液体与基因的混合物约4-6ml，通过温度升至37℃～45℃将其变为气体，形成携带有基因的微泡型脂质体氟碳造影剂；

或(3)、将基因包裹于造影剂微泡内  将(2)中所形成的微泡型脂质体氟碳造影剂在无菌条件下用一定量的PBS溶液冲洗3遍，使粘附于表面的基因脱落下来，即得到包裹于微泡的携基因造影剂。

3、根据权利要求2所述的制备如权利要求1所述携带基因的微泡造影剂的方法，其特征是：脂质材料为卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺，它们之间按重量份数比为1∶3∶3混合。

4、根据权利要求2所述的制备如权利要求1所述携带基因的微泡造影剂的方法，其特征是：氟碳材料为全氟戊烷、或全氟丁烷、或全氟丙烷气体。

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