CN111265675A - 一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂及其制备方法 - Google Patents
一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂，包括一个微泡，所述的微泡为中空结构，所述的微泡内包载气体成分，所述的微泡的壳层由脂质和高分子聚合物材料构成，所述的微泡的壳层采用正电荷进行修饰。本发明还提供了上述用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂的制备方法。本发明的微泡的壳层由脂质和高分子聚合物材料构成，且上述成分均为生物可降解材料。本发明利用细胞膜带负电荷，对微泡壳层进行正电荷修饰，使微泡带正电荷，通过微泡与细胞膜的静电相互作用，快速进入细胞内，提高了对细胞的标记效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医用成像技术领域，涉及一种造影剂，具体来说是一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和胰岛细胞等多种细胞。且间充质干细胞来源广泛，易于从骨髓、脐带、脐带血、胎盘、胎盘羊膜、脂肪组织、月经血液中分离获得。除此之外，间充质干细胞缺乏CD80和CD86，低表达甚至不表达MHCⅡ，免疫原性低。因而间充质干细胞在细胞治疗、再生医学和组织修复等领域具有重要应用价值。
目前，间充质干细胞移植治疗是临床研究的热点。间充质干细胞与细胞或细胞外基质可通过细胞粘附分子配体和细胞粘附分子结合，介导间充质干细胞归巢定植到机体损伤部位，在修复损伤组织和器官的过程中，亦可同步恢复损伤组织和器官的功能。但是，间充质干细胞的治疗效果很大程度上取决于归巢至病变部位的细胞数量。因此，如何让间充质干细胞准确归巢定植在机体损伤部位，并准确获知目标部位间充质干细胞的数量，是临床上进行间充质干细胞移植亟需解决的难题。影像引导间充质干细胞移植或者影像示踪间充质干细胞归巢定植靶区是提高间充质干细胞移植安全性和疗效的可靠方法。相对于CT、MRI和PET等影像技术，超声影像技术具有方便快捷，价格便宜，无电离辐射，非侵入性实时快速成像的特点，在辅助间充质干细胞移植中具有显著优势。但是间充质干细胞与临近组织对比度低，因此超声影像二维灰阶模式难以准确判断间充质干细胞是否归巢定植在目标部位。
超声微泡造影剂可显著增强背向散射和产生丰富的谐波信号，显著提高与临近组织的对比度，增强超声影像的灵敏度。传统微泡的制备多以半乳糖、脂质和蛋白质等作为壳膜材料。目前，已有学者用脂质微泡标记干细胞形成微泡-干细胞复合体用于超声影像示踪干细胞的研究。但这些材料制备的微泡稳定性差，且壳层柔软顺应性好，不利于间充质干细胞内吞，导致标记效率不高。
近些年来，采用高分子聚合物材料作为微泡的壳膜材料，有利于提高微泡的机械强度和稳定性，但微泡壳层柔顺性差，为了产生丰富的谐波信号，需要较高的超声波能量激发，但同时也增强了背景信号，不利于提高图像信噪比。对于血管损伤性疾病，血管壁薄，空间受限，管壁上粘附的间充质干细胞数量有限；且受血流剪切力影响，妨碍了间充质干细胞归巢定植在血管损伤部位；因此，迫切需要一种安全有效、高标记效率且高灵敏度的超声微泡造影剂标记间充质干细胞，用于超声示踪间充质干细胞，了解间充质干细胞归巢定植在血管损伤部位的情况。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂及其制备方法，所述的这种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂及其制备方法要解决现有技术中的超声微泡造影剂用于标记间充质干细胞的灵敏度不高的技术问题。
本发明提供了一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂，包括一个微泡，所述的微泡为中空结构，所述的微泡内包载气体成分，所述的气体成分为空气、氮气、全氟丙烷或者六氟化硫中的任意一种或者两种以上的组合，所述的微泡的壳层由脂质和高分子聚合物材料构成，所述的脂质为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000
(DSPE-PEG2000)中的任意一种或者两种以上的组合，所述的高分子聚合物为聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚(乙交酯-己内酯)共聚物(PGCL)、聚乙交酯(PGA)中的任意一种或者两种以上的组合，所述的微泡的壳层采用正电荷进行修饰。
进一步的，所述的正电荷修饰是指利用聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、壳聚糖中的至少一种阳离子聚合物嫁接在微泡壳层表面，使微泡带正电荷。
进一步的，所述的脂质和高分子聚合物材料的质量比为1:50～1:20。
本发明还提供了上述用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将脂质与高分子聚合物按质量比1:50～1:20充分溶解到有机溶剂中，获得油相；
2)将碳酸氢铵溶液加入到上述步骤1)中进行乳化处理，形成初乳液；
3)将上述步骤2)获得的初乳液加入到聚乙烯醇溶液中，再次进行乳化处理，形成复乳液；
4)将1～3倍于聚乙烯醇溶液体积的去离子水加入到上述步骤3)获得的复乳液中，搅拌混匀；
5)将步骤4)获得乳液在室温下于300-600rpm磁力搅拌2～5h，除去有机溶剂；
6)离心收集沉淀，洗涤至少2～4次后，冷冻干燥24～48h，得到冻干粉；
7)将上述步骤6)获得的冻干粉加入到阳离子聚合物溶液中搅拌，进行正电荷修饰；
8)离心收集沉淀，洗涤，冷冻干燥24～48h，得到用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂。
进一步的，所述的有机溶剂为三氯甲烷。
进一步的，所述的碳酸氢铵溶液的浓度为5～8％(w/v)。
进一步的，所述的聚乙烯醇溶液的浓度为4～6％(w/v)。
本发明的微泡的壳层由脂质和高分子聚合物材料构成，且上述成分均为生物可降解材料。本发明利用细胞膜带负电荷，对微泡壳层进行正电荷修饰，使微泡带正电荷，通过微泡与细胞膜的静电相互作用，快速进入细胞内，提高对细胞的标记效率。
本发明还提供了上述的超声微泡造影剂标记间充质干细胞的方法：将超声微泡造影剂加入到间充质干细胞培养基中，于细胞培养箱中共孵育4h；带正电荷的微泡与带负电荷的细胞膜通过静电相互作用，快速进入细胞内，从而实现微泡对间充质干细胞的标记。
本发明还提供了采用上述的超声微泡造影剂在标记间充质干细胞的过程中形成的微泡-干细胞复合体。
本发明还提供了上述的微泡-干细胞复合体在制备超声示踪间充质干细胞归巢血管损伤部位的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。
本发明所用的间充质干细胞为提取自Sprague-Dawley大鼠骨髓的间充质干细胞。
本发明的一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂的特点是微泡的壳层由脂质和高分子聚合物杂合而成；相比于脂质微泡，杂合微泡抗压能力更强、稳定性更好，且杂合微泡外壳硬度较高，有利于间充质干细胞内吞；相比于高分子聚合物微泡，杂合微泡外壳较软，顺应性更好，有利于产生丰富的谐波信号。并且本发明的超声微泡造影剂带正电荷，可通过静电作用与负电荷细胞膜接触更紧密，有利于间充质干细胞内吞，提高间充质干细胞的标记效率。
本发明实现了干细胞超声可视化，解决超声示踪干细胞归巢血管损伤部位的难题。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明在超声造影剂的成膜材料中杂合脂质和高分子聚合物，整合了高分子聚合物微泡和脂质微泡的优点。相比于高分子聚合物微泡，本发明的杂合微泡壳层较软，在超声作用下顺应性和响应性好，有利于产生较强的超声谐波信号；相比于脂质微泡，本发明的杂合微泡壳层较硬，有利于细胞内吞，且经过正电荷修饰，增强与负电荷细胞膜的相互作用，显著提高细胞的微泡造影剂标记效率。
(2)本发明构建的超声微泡造影剂通过正负电荷相互作用实现细胞内吞，相比于通过配体-受体特异性结合介导的细胞内吞，本发明的超声微泡造影剂具有普遍适用性，易于推广应用；且无需借助昂贵的生物分子充当配体，本发明的超声微泡造影剂制备成本低。
(3)本发明构建的超声微泡造影剂制作工艺简单，生物安全性高，结构稳固，可以稳定标记间充质干细胞，不影响间充质干细胞的细胞活力和多向分化功能。
(4)本发明构建的超声微泡造影剂，可增强背向散射，同时产生丰富的谐波信号，可显著增强标记后的间充质干细胞与临近组织的对比度，实现超声示踪间充质干细胞归巢血管损伤部和指导间充质干细胞移植治疗的目的，有利于增强间充质干细胞移植治疗效果。
附图说明
图1为本发明的超声微泡造影剂的结构示意图。
图2为本发明的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后形成的微泡-干细胞复合体结构示意图A以及超声示踪微泡-干细胞复合体归巢血管损伤部位的示意图B。
图3为本发明实施例2制备的超声微泡造影剂的扫描电镜图(A)、激光共聚焦图(B)和Zeta电势图(C)。
图4为本发明实施例3制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后的激光共聚焦荧光图(A)，以及超声微泡造影剂对间充质干细胞标记前后的超声造影成像图(B、C)。
图5为本发明实施例4制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后，检测间充质干细胞的细胞活力结果。
图6为本发明实施例5制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后，诱导成脂(A)、成骨分化(B)效果图。
图7为本发明实施例6损伤血管的组织切片HE染色图(A)、超声示踪间充质干细胞归巢血管损伤部位的超声造影图(B)及间充质干细胞归巢血管损伤部位的三维激光共聚焦图(C)。
具体实施方式
通过以下具体实施方式将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1
如图1所示，本发明提供了一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂，包括一个微泡1，所述的微泡为中空结构，所述的微泡1内包载气体成分2，所述的气体成分2为空气、氮气、全氟丙烷或者六氟化硫中的任意一种或者两种以上的组合，所述的微泡1的壳层3由脂质5和高分子聚合物材料6构成，所述的脂质5为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)中的任意一种或者两种以上的组合，所述的高分子聚合物材料6为聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚(乙交酯-己内酯)共聚物(PGCL)、聚乙交酯(PGA)中的任意一种或者两种以上的组合，在所述的微泡壳层3采用正电荷4进行修饰。
进一步的，所述的正电荷修饰是指利用聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、壳聚糖中的至少一种阳离子聚合物4嫁接在微泡壳层3表面，使微泡1带正电荷。
进一步的，所述的脂质5和高分子聚合物材料6的质量比为1:50～1:20。
如图2所示，将超声微泡造影剂加入到间充质干细胞培养基中，于细胞培养箱中共孵育4h；带正电荷的微泡与带负电荷的细胞膜通过静电相互作用，快速进入细胞内，从而实现微泡对间充质干细胞的标记(A)。超声微泡造影剂在标记间充质干细胞后形成的微泡-干细胞复合体7，然后超声示踪微泡-干细胞复合体7归巢血管损伤部位(B)。
实施例2
称取50mg PLGA和2.5mg DSPC，共溶于1ml三氯甲烷中，配置成油相。取0.2ml(NH4)HCO3(6％w/v)溶液加入到上述油相中。在冰浴下，用超声细胞破碎仪声振乳化，工作参数为AMPL 50％，工作3s，停2s，共2min；制得初乳。然后加入到5ml聚乙烯醇(4％w/v)溶液中，高速匀浆机以25000rpm匀质3min，再加入10ml去离子水，室温下磁力搅拌3h挥发有机溶剂。2500g离心5min收集沉淀，再用去离子水重悬和离心收集，重复3次。取沉淀物冷冻干燥，得到白色固体粉末。用浓度为0.1mg/ml聚乙烯亚胺溶液重悬上述冻干粉，磁力搅拌3h后，离心收集沉淀，然后冷冻干燥，制得本发明的超声微泡造影剂。
进一步地，为明确脂质与高分子聚合物的空间结构关系，将Rhodamine标记的PLGA和FITC标记的DSPE-PEG(2000)共溶于三氯甲烷中，其余实施步骤同前。通过扫描电子显微镜观察制备的超声微泡造影剂为中空球形结构，粒径为812.5±86.2nm；具体如图3A所述。激光共聚焦显微镜扫查可见，本发明制备的超声微泡造影剂壳层由聚合物(红色荧光)和脂质(绿色荧光)杂合构成；具体如图3B所述。附图3C显示，制备的微泡造影剂带正电荷，Zeta电势为16.7±6.4mV。
实施例3
为了评估实施例1中制备的超声微泡造影剂具有标记间充质干细胞的功能和标记间充质干细胞后具有超声造影成像能力，将骨髓细胞从大鼠骨髓中提取出来，利用差速贴壁法纯化骨髓间充质干细胞，将细胞培养至第3至8代。进一步地，用间充质干细胞培养基重悬微泡，调整浓度至200μg/ml，加入到间充质干细胞培养皿中，然后转移至细胞培养箱中，共孵育4h；洗净游离的超声微泡造影剂，消化离心收集微泡-干细胞复合体。激光共聚焦显微镜扫查可见，制备的超声微泡造影剂(红色荧光)可被干细胞(绿色荧光)内吞；具体如图4A所述。把超声成像仪Vevo2100参数调整为Frequency 18MHz，Power 4％，Contrast Gain30dB，Frame Rate 17，并固定不变。将未标记的干细胞与标记后的干细胞调整至相同浓度2×106个/ml，转入琼脂糖仿体孔中，检测两者的超声造影成像信号，具体如图4B和4C所述，超声图像显示超声微泡造影剂标记的间充质干细胞可产生明显的谐波声学信号(4C)，而未标记的间充质干细胞几乎无谐波声学信号产生(4B)。
实施例4
为了评估实施例2中制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后对其细胞活性的影响，取生长状态良好的第3至8代骨髓间充质干细胞，按3000个细胞/孔的浓度接种于96孔板中，分别设置空白组(间充质干细胞完全培养基)、对照组(间充质干细胞完全培养基和骨髓间充质干细胞)和实验组(间充质干细胞完全培养基、骨髓间充质干细胞和浓度为200μg/ml超声微泡造影剂)，每组含5个复孔，向每孔中加入10μl的CCK8溶液，用酶标仪测定在450nm处的吸光度值，具体如图5所述，显示超声微泡造影剂标记的间充质干细胞的细胞活性在90％以上，即对间充质干细胞进行超声微泡造影剂标记，并不会对间充质干细胞的细胞活性产生明显影响。
实施例5
为了评估实施例2中制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后对其多向分化功能影响，分别设置对照组(骨髓间充质干细胞)和实验组(超声微泡造影剂标记的骨髓间充质干细胞，超声微泡造影剂标记浓度为200μg/ml)，进行成脂诱导分化和成骨诱导分化。成脂和成骨诱导分化实验采用Cyagen公司提供的成脂、成骨诱导分化培养基。诱导分化实验结束后，干细胞成脂诱导分化鉴定采用油红O染色，油红O能特异性地使组织或细胞内的甘油三脂、脂质以及脂蛋白等染色，使脂滴呈橘红色；干细胞成骨诱导分化鉴定采用茜素红染色，茜素红是茜素磺酸钠盐，可与碳酸钙或磷酸钙中的钙盐螯合形成橙色复合物。如图6所示，超声微泡造影剂标记的间充质干细胞在成脂和成骨诱导分化培养基的培养下，可以向成脂(6A)和成骨分化(6B)，即对间充质干细胞进行超声微泡造影剂标记，并不会影响间充质干细胞的分化潜能。
实施例6
为了评估实施例1～2中制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后在大鼠血管损伤模型应用的效果，需制备大鼠颈动脉损伤模型。将大鼠麻醉后仰卧位固定在手术台上，常规颈部备皮、消毒后取颈部正中切口，逐层钝性分离组织，暴露左侧颈动脉，分离血管鞘，将与血管伴行的神经分离；结扎颈外动脉远端及其分支动脉；将颈总动脉近心端和颈内动脉用微型血管夹阻断血流；用显微外科剪刀在颈外动脉远端剪开一小口，将2F球囊导管从开口处插入直至血管夹闭处；充气膨胀球囊至1.5个标准大气压；边旋转边后撤球囊至血管开口处，回缩球囊，再插入至血管夹闭处，过程重复3次。进一步地，为验证血管损伤模型制备成功与否，球囊拉伤的血管和正常的血管将取材做组织切片，并行HE染色观察，具体如图7A所示，颈动脉壁内膜消失，未见明显的内皮细胞覆盖基底膜；说明大鼠颈动脉损伤模型制备成功。
实施例7
为了评估实施例1、实施例2和实施例5中制备的超声微泡造影剂标记间充质干细胞后可被超声示踪归巢大鼠血管损伤部位，将20μl浓度为5×106个/ml的微泡-干细胞复合体悬液从颈外动脉切口处注入至球囊拉伤的血管内，并孵育20min；随后复通血管，恢复血流。超声参数同实施例2，如图7B所述，颈动脉管腔动脉壁上可探及到超声谐波声学信号。进一步地，为证实受损动脉壁上的超声声学信号来自微泡-干细胞复合体，将该段血管离断取材，并沿长轴切开血管，行三维激光共聚焦扫查，如图7C所述，超声微泡造影剂标记的间充质干细胞黏附在动脉壁上，证实动脉壁上的超声声学信号来自微泡-干细胞复合体。
Claims (9)
1.一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂，其特征在于:包括一个微泡，所述的微泡为中空结构，所述的微泡内包载气体成分，所述的气体成分为空气、氮气、全氟丙烷或者六氟化硫中的任意一种或者两种以上的组合，所述的微泡的壳层由脂质和高分子聚合物材料构成，所述的脂质为1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的任意一种或者两种以上的组合，所述的高分子聚合物为聚乳酸、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯-己内酯)共聚物、聚(乙交酯-己内酯)共聚物、聚乙交酯中的任意一种或者两种以上的组合，所述的微泡的壳层采用正电荷进行修饰。
2.根据权利要求1所述的一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂，其特征在于：所述的正电荷修饰是指利用聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、壳聚糖中的至少一种阳离子聚合物嫁接在微泡壳层表面，使微泡带正电荷。
3.根据权利要求1所述的一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂，其特征在于：所述的脂质和高分子聚合物材料的质量比为1:50～1:20。
4.权利要求1所述的一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将脂质与高分子聚合物按质量比1:50～1:20充分溶解到有机溶剂中，获得油相；
2)将碳酸氢铵溶液加入到上述步骤1)中进行乳化处理，形成初乳液；
3)将上述步骤2)获得的初乳液加入到聚乙烯醇溶液中，再次进行乳化处理，形成复乳液；
4)将1～3倍于聚乙烯醇溶液体积的去离子水加入到上述步骤3)获得的复乳液中，搅拌混匀；
5)将步骤4)获得乳液在室温下于300-600rpm磁力搅拌2～5h，除去有机溶剂；
6)离心收集沉淀，洗涤至少2～4次后，冷冻干燥24～48h，得到冻干粉；
7)将上述步骤6)获得的冻干粉加入到阳离子聚合物溶液中搅拌，进行正电荷修饰；
8)离心收集沉淀，洗涤，冷冻干燥24～48h，得到用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂。
5.根据权利要求4所述的一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为三氯甲烷。
6.根据权利要求4所述的一种用于标记间充质干细胞的超声微泡造影剂的制备方法，其特征在于：所述的碳酸氢铵溶液的浓度为5～8％(w/v)；所述的聚乙烯醇溶液的浓度为4～6％(w/v)。
7.一种采用权利要求1所述的超声微泡造影剂标记间充质干细胞的方法，其特征在于：将超声微泡造影剂加入到间充质干细胞培养基中，于细胞培养箱中共孵育；带正电荷的微泡与带负电荷的细胞膜通过静电相互作用，进入细胞内，实现微泡对间充质干细胞的标记。
8.一种采用权利要求1所述的超声微泡造影剂在标记间充质干细胞的过程中形成的微泡-干细胞复合体。
9.权利要求8所述的微泡-干细胞复合体在制备超声示踪间充质干细胞归巢血管损伤部位的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200612 |
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