JP2001527547A - 超音波コントラスト剤として、および、血流への薬剤デリバリーのために有用な微小パーティクル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的に共存可能な物質の外層と生分解性内層を有する殻を有する微小パーティクルが提供される。微小パーティクルの核は薬剤デリバリーに使用するため、あるいは、超音波コントラスト画像診断のための気体、液体または固体を含んでいる。本微小パーティクルは患者の毛細管系を通過することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 超音波コントラスト剤として、および、 血流への薬剤デリバリーのために有用な微小パーティクル 発明の背景 中空の微小パーティクルは、ときに微小バブルあるいは微小球体と呼ばれ、超 音波エネルギーの後方散乱に効果的である。従って、血流中に注入された小さな 微小バブルは超音波エコー画像化(ultrasonic echographic imaging)を増強する ことができ、心臓および血管のような内部構造を視覚化する助けとなる。超音波 コントラスト(unlrasonic contrast)は２つの物質の境界面における音響インピ ーダンスが異なっているときに達成される。従って、物質の音響インピーダンス の差が大きいほど、その境界面からの超音波エコーの強度が大きい。身体組織と 気体との音響インピーダンスの差は非常に大きいため、組織または血液内を循環 する気体含有微小パーティクルは超音波エネルギーの強い後方散乱体である。循 環系で使用するためには、循環系の毛細管を通過するために微小パーティクルは 約10マイクロメートルよりも小さな直径を有する必要がある。微小パーティクル の効果的なエコー生成の下限は約１から２マイクロメートルである。 臓病学においては、微小パーティクルは静脈内注入のために有用であり、心臓 の右区画(right chamber)における超音波コントラストを与え、心臓構造、弁機 能の同定能を高め、心臓内短絡を検出能を高める。しかしながら、心臓の左区画 (left chamber)を視覚化するためには、微小パーティクルはまず肺循環系を迅速 に通過する必要がある。そのようなパーティクルは肺毛細管を通過するために十 分に小さくなければならない。そうでないと、パーティクルは肺内部で捕獲され る。またパーティクルは心臓の左区画における圧力に耐えるために十分な構造的 強度も有していなければならない。 微小パーティクルは、心臓内の容積、壁の動き、および心臓内の疾患の状態を 規定する他の要因の同定ができるようにする。コントラスト剤の使用はまた、ド ップラー超音波技術(Doppler ultrasound techniques)をも容易にする。なぜな ら、血流中を移動する強いエコー源は、通常ドップラー超音波技術で使用される エコー源である赤血球よりも遥かに強いエコー生成性だからである。血液中のコ ントラスト剤は身体領域の血液の存在場所を特定するために使用されることもあ り、または、エコー生成性であるはずの領域にエコー生成が無いことによって血 液が存在しないことを同定するために使用されることもある。心筋への灌流評価 のための微小パーティクルの使用、および、心室を隔てる隔壁を通過するパーテ ィクル流によって冠隔壁(coronary septum)における欠陥を評価するための微小 パーティクルの使用はこのような使用例である。他の例は、凝血塊のような血管 栓、および血管室(vascular chamber)への異常な増大化を超音波コントラストが 存在しないことにより同定するための微小パーティクルの使用である。 コントラスト剤の他の使用法は、梗塞による損傷を評価するためのような、器 官潅流を検査すること、肝臓のような臓器を検査すること、または、正常組織と 腫瘍および嚢腫のような異常な組織とを区別することである。 本発明は、静脈内デリバリーされるが肺循環系を通過し得る、心臓の両方の側 の検査および診断を向上させる、および、上述の他の組織および器官の検査を向 上させるための、微小パーティクルコントラスト剤を提供する。 画像診断法に加えて、本発明による微小パーティクルはまた薬剤デリバリーの ためにも使用され、その場合、薬剤はパーティクルからの拡散、パーティクルの 分解、超音波エネルギーを利用したパーティクルの破壊により、パーティクルか ら放出される。 発明の概要 本発明は微小パーティクルの大部分が約１から１０マイクロメートルの範囲の 直径を有し、生物学的に共存可能な物質を含む外層および生分解性ポリマーを含 む内層を有する、微小パーティクルの組成物を提供する。微小パーティクルは中 空の核を有することがあり、気体または液体のいずれか、または固体の核を含む ことがある。 外層は血流および組織との生物学的共存可能性に基づいて選択されてよいが、 内層は所望の機械的および音響的特性に基づいて選択されるであろう。両層の物 質とも微小パーティクル強度を予め決定するために選択されることがあり、例え ば、所望の共鳴振動数および、超音波放射の画像診断レベルの閾値内における安 定性を与えるために選択されることがある。多層微小パーティクル形成のための 方法および超音波画像診断における使用も提供される。この層は薬剤を含有しデ リバリーする能力によって選択されることもある。 図面の簡単な説明 図１は、実施例７のコントラスト剤のテストにおける、左心房の超音波反射強 度の時間経過のグラフである。 図２は、実施例８のコントラスト剤のテストにおける、左心房の超音波反射強 度の時問経過のグラフである。 図３は、実施例13において作製された朱濾過微小カプセルの容積サイズ分布お よび、懸濁液を濾過した場合のサイズ分布のグラフである。 図４は、実施例18に従ってテストした、異なる壁組成を有する二種類の微小パ ーティクル調製物の共鳴周波数を示したものである。 好ましい実施態様の説明 本明細書で使用する、微小パーティクルの語は、気体または液体で満たされて いてもよい核を有する中空の粒子である、微小カプセル、微小球体および微小バ ブルを含むものを意図している。また、微小パーティクルの語は核が固体物質で あってもよい粒子をも含む。微小パーティクルは必ずしも正確に球体である必要 はないが、一般には球体であり平均直径を有するものとして記述される。微小パ ーティクルが球体でない場合は、その直径は、同じ容積を有し、非-球体微小パ ーティクルとほぼ同じ内部空間容積を有する対応する球体微小パーティクルの直 径として、あるいはそれに関連付けられる。 本発明の微小パーティクルは２層性の殻を有している。殻の外層は、体内の血 液および組織に曝されるであろう表面を規定するものであるから、生物学的に共 存可能な物質または生体物質であろう。殻の内層は生分解性のポリマーであろう 。それらは合成ポリマーであってよく、所望の機械的および音響的特性を殻に与 え るため、あるいは、薬剤デリバリー特性を与えるために調整されてもよい。超音 波コントラスト剤としての使用のためには、微小パーティクルの核は気体、典型 的には空気または窒素を含むことがある。しかしながら、薬剤デリバリー目的の ためには、核は液体または殻の層と異なる固体であってよい。しかしながら、微 小パーティクルを低強度の超音波エネルギーで破壊可能とするために、これらの パーティクルは音響カップリングおよびパーティクル振動(particle oscillatio n)を可能とする気体を含む必要がある。ここでは微小パーティクルは、組成物中 で調整されたものの大部分が、身体の毛細管系を通過するために１から10マイク ロメートルの範囲内の直径を有するように構築されている。 微小パーティクルは外層および内層を有しているため、これらの層は異なる機 能を果たすように整えることができる。血液および組織に暴露される外殻は微小 パーティクルおよび身体との間の生物学的境界面として働く。従って、外殻は典 型的には両親媒性、すなわち、疎水性特性と親水性特性との両方を有する生物学 的に共存可能な物質から作られるであろう。血液共存性物質は特に好ましい。そ のような好ましい物質は、ヒト由来であるかまたはヒトタンパク質と類似した構 造を有する、コラーゲン、ゼラチンまたは血清アルブミンまたはグロブリン、ヒ アルロン酸、ヘパランおよびコンドロイチン硫酸のようなグリコサミノグルカン 、およびこれらの組み合わせまたはこれらの誘導体を含む、生体物質である。ポ リエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコールおよ びその組み合わせまたはその誘導体のような生分解性合成ポリマーもまた使用さ れることがある。外層は典型的には両親媒性であり、電荷および化学的改変が可 能な化学的性質を有している。表面の融通性により、生理学的ｐＨより高い等電 点を有するＡ型ゼラチンを選択する、あるいは、生理学的ｐＨより低い等電点を 有するＢ型ゼラチンを選択することなどにより、外殻の電荷を変化させるような 改変が可能となる。外表面はまた、生物学的共存性を高めるために、PEG化(PEGy lation)、スクシニル化またはアミド化のように化学的に改変されてもよく、選 択した組織への結合のための表面ターゲッティング部分(surface targeting moi ety)に化学的に結合されることもある。ターゲッティング部分は抗体、細胞レセ プター、レクチン、セレクチン(selectin)、インテグリン、またはそのような物 質 のレセプター標的の化学構造体またはアナログであってよい。外層の機械的特性 は、微小パーティクルを左心室を通過するのに適しているようにするため、画像 診断システムの選択した高調波成分に対する特定の共鳴周波数を与えるため、あ るいは、超音波放射の画像診断法の閾値レベルに体する安定性を与えるために、 架橋などにより改変してもよい。 内殻は合成ポリマーであってもよい、生分解性ポリマーであろう。内殻の利点 は、要求される表面特性に縛られずに、外層によっては与えられない、または十 分に与えられない更なる機械的特性または薬剤デリバリー特性を与えること、ま たは、外層によっては十分に与えられない機械的特性を増強することである。例 えば、架橋タンパク質性ヒドロゲルの生物学的共存性外層は、内層として高弾性 率の合成ポリマーを使用することにより物理的に支持され得る。ポリマーはその 弾性率(modulus of elasticity)および伸び率(modulus of elongation)に関して 選択されてよく、これらは所望の機械的特性を規定するものである。典型的な生 分解性ポリマーには、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリ乳酸-ポリグリコー ル酸コポリマー、イプシロン-カプロラクトンのようなラクチドとラクトンのコ ポリマー、デルタ-バレロラクトン、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリア ミド、ポリヒドロキシブチレート、ポリジオキサノン、ポリ-ベータ-アミノケト ン、ポリアンヒドリド、ポリ-(オルト)エステル、ポリグルタミン酸およびポリ アスパラギン酸のようなポリアミノ酸またはポリグルタミン酸およびポリアスパ ラギン酸のエステルが含まれる。多数の生分解性ポリマーに関する参照文献がLa ngerら、(1983)Macromol．Chem．Phys．C23，61-125に引用されている。 内層は外層のみでは与えられない微小パーティクル殻の機械的特性の改変を可 能とする。さらに、内層は外層のみでは十分でないあるいは与えられない薬剤運 搬および／または薬剤デリバリー能を提供することがある。超音波コントラスト 剤としての使用のためには、微小パーティクルの内部気体容積を最大にするため 、内層は典型的には最小限の機械的特性または薬剤運搬／デリバリー特性を満た すために必要である以上の厚さを有しないであろう。微小パーティクルの気体容 積が大きくなるほどエコー特性が良くなる。 微小パーティクル殻の外層および内層を合わせた厚さは一部にはその微小パー ティクルに要求される機械的特性および薬剤運搬／デリバリー特性に依存するで あろうが、典型的には殻の合計の厚さは25から750nmの範囲であろう。 微小パーティクルは殻物質の連続的界面沈着を制御するため乳化法によって調 製されてよい。外層を形成する物質の両親媒性により、安定な油／水エマルジョ ンが調製されることがあり、このエマルジョンは内部相の外部相に対する比が３ ：１に近く、相転移を起こさず、界面活性剤、粘度増強剤または高剪断速度の必 要なく水中に分散して安定な有機相小滴を形成することができる。 ２種の溶液が調製され、第１は外側の生体物質の水性溶液である。第２は、内 層を形成させるために使用されるポリマーの溶液であり、ポリマーに対する溶媒 である相対的に揮発性の水非混和性の液体の溶液、および、そのポリマーに対す る非溶媒である相対的に非揮発性の水非混和性の液体の溶液である。相対的に揮 発性の、水非混和性の溶媒は典型的にはイソプロピルアセテートのようなＣ₅〜 Ｃ₇エステルである。相対的に非揮発性の、水非混和性の非溶媒は典型的には、 デカン、ウンデカン、シクロヘキサン、シクロオクタンその他のようなＣ₆〜Ｃ_{2 0} 炭化水素である。内層のためのポリマーを含む第２の溶液中で、水非混和性溶 媒中のポリマーは完全に溶けるように合わされ、２つの溶媒は撹拌によって混和 性となる。ポリマー溶液（有機相）はゆっくりと生体物質溶液（水性相）に添加 されて液体フォーム(liquid foam)が形成される。典型的には約0.5から10％のポ リマー濃度を有するポリマー有機溶液１部が、約１から20％の生体物質濃度を有 する生体物質水性溶液３部に添加される。このステップで使用する溶液の相対濃 度および有機相の水性相に対する比は最終的な微小パーティクルのサイズおよび 壁厚を本質的に決定するものである。液体フォームは激しく撹拌された後、水中 に分散され、典型的には約30〜35℃に静かに撹拌しながら加温される。特定の理 論に縛られる意図は無いが、フォーム中の生体物質は温水中に分散し、生体物質 エンベロープ内に封じ込めれた有機相中のポリマーのエマルジョンを安定化させ ると考えられている。この生体物質エンベロープを水不溶性にするため、グルタ ルアルデヒドのような架橋剤がこの混合物に添加され、これが生体物質エンベロ ープと反応して水不溶性とし、外殻を安定化させる。他の架橋剤を使用してもよ く、それにはカルボジイミド架橋剤が含まれる。 この時点で内部核はポリマー溶液、異なる揮発性を有する溶媒および非溶媒を 含んでいるため、より揮発性の溶媒が揮発する、あるいは希釈されると、より揮 発性の低い非溶媒の存在下でポリマーが析出する。この工程は界面において生体 物質殻の内側表面に析出物のフィルムを形成させ、したがって、より揮発性の溶 媒が希釈、揮発その他によって濃度が低下した後、微小パーティクルの内部殻を 形成する。次には、微小パーティクルの核は主として有機非溶媒を含むこととな る。次に、微小パーティクルは遠心により単離され、洗浄され、バファー系にて 製剤化され、所望であれば乾燥される。典型的には、凍結乾燥による乾燥は非溶 媒液体核を除去するだけでなく、残存している水も除去し、気体で満たされた中 空の微小パーティクルを生じさせる。 微小パーティクルの表面をさらに改変することが望ましいことがあり、例えば 、マクロファージあるいは肝臓内の網内細胞系(reticuloendothelial system RE S)に対して表面を保護するために改変することが望まれることがある。これは例 えば、負に帯電したパーティクルはマクロファージおよびRESに対して正に帯電 したパーティクルよりも認識をうまく逃れるようであるので、微小パーティクル の表面を負電荷を有するように化学的に改変することによって達成される。また 、表面の親水性は親水性結合体を結合させることにより変化させてもよい。例え ば、単独で、あるいは荷電修飾と共に、表面へのポリエチレングリコールの結合 (PEG化)、またはコハク酸の結合（スクシニル化）のように行ってよい。 生体物質表面はまた、微小パーティクルにターゲッティング特性を与えるため に改変してもよい。表面は抗体または生物学的レセプターで既知の方法によりタ ギングされることがある。例えば、微小パーティクルが腫瘍をターゲットとすべ く処理されそれが中空であるならば、腫瘍の診断を強化するための超音波検出の ために使用することができる。もし微小パーティクルが薬剤で満たされているな らば、それらは腫瘍をターゲットするために使用することができ、その場合、例 えば超音波エネルギーを増大させてパーティクルを破壊することによって、ター ゲット部位において適切な時および場所で薬剤を優先的に放出させることができ る。 微小パーティクルは製造後に大きさを整え、あるいは加工してもよい。これは 、 その脆弱さゆえに形成後は機械的加工を受けられないであろう脂質様微小パーテ ィクルに対する利点である。 調製後であって使用前の微小パーティクルの最終的な製剤は凍結乾燥ケーキの 形態である。微小パーティクルの後の再構成は充填剤とともに凍結乾燥すること により容易になり、充填剤は高度に多孔性で表面積の大きいケーキを与える。充 填剤はまた、除去される水および溶媒の通り道を提供することにより凍結乾燥時 の乾燥速度も増加させる。このことは後の再構成において助けとなる表面積の多 さをも提供する。典型的な充填剤はデキストロース、マンニトール、ソルビトー ルおよびシュークロースのような糖、および、PEGおよびPVPのようなポリマーで ある。 製剤の際またはその後の凍結乾燥物質の再構成の際に微小パーティクルが凝集 することは望ましくない。凝集は外層表面を形成している生体物質の等電点(Pi) よりも少なくとも１から２ｐＨ単位上または下に維持することによって最小限に することができる。表面の電荷は製剤媒液のｐＨによって決定される。従って、 たとえば、生体物質の表面が７というPiを有しており、製剤媒液のｐＨが７より 低いときは、微小パーティクルは正味で正の表面電荷を有するであろう。あるい は、製剤媒液のｐＨが７より大きいときは、微小パーティクルは負の電荷を有す るであろう。製剤媒液のｐＨが外殻に使用されている生体物質のPiに近づく場合 に凝集の最大の可能性が存在している。従って、製剤媒液のｐＨを表面のPiから 少なくとも１から２ユニット高いあるいは低く維持することにより、微小パーテ ィクルの凝集は最小限になるであろう。別法として、微小パーティクルは凝集に 対して安定化させるため表面活性剤を使用してPiまたはその付近で製剤してもよ い。ともかくも、患者に注射する最終的な剤形のバッファー系は生理学的に共存 可能でなければならない。 微小パーティクルの凍結乾燥の際に使用される充填剤はまた注射のための最終 剤形の浸透圧を制御するために使用されることもある。凍結乾燥時の凝集を最小 限にするために生理学的浸透圧以外の浸透圧が望ましいことがある。しかしなが ら、使用のための微小パーティクルの製剤のときには、その微小パーティクルを 再構成するために使用する液体の量を考慮しなければならない。 凝集を避けるため、または製剤に際して微小パーティクルの分散を容易にする ために他の添加剤が加えられることがある。ポロクソマー(poloxomer)（ポリエ チレングリコール-ポリプロピレングリコール-ポリエチレングリコールブロック コポリマー）のような表面活性剤が使用されることもある。媒液分子量ポリエチ レングリコールおよび媒液分子量より小さいポリビニルピロリドンのような水可 溶性ポリマーも微小パーティクルの分散の助けとなることがある。 製剤が薬剤含有核を含むべき場合は、微小パーティクルは薬剤の溶液に浸され てよく、そこで溶液は内部に拡散する。特に、内殻が多孔性の特徴を有している ２層性微小パーティクルの使用は薬剤溶液が中空の核へ迅速に拡散することを可 能にする。微小パーティクルは凍結乾燥などによって再乾燥され、気体で満たさ れた薬剤含有微小パーティクルを作り出すことがある。予め作製したパーティク ルと薬剤の組み合わせにより、薬剤分解につながるかもしれないプロセッシング を避けることができる。薬剤を含む固体核を有する微小パーティクルを供給する ため、微小パーティクルの形成の際に、内層の厚さが増加され内容積のより多く または全部を占有することがある。次に、その後の薬剤含有溶液への浸漬により 、内部の固体核が薬剤を吸収し薬剤の固体貯留体を提供する。あるいは、薬剤は 微小パーティクル形成工程においてバイオポリマーと共に有機相に溶解されるこ とがある。有機溶媒のエバポレーションは微小パーティクルの内部で薬剤をバイ オポリマーと共析出させる。 上述した方法の種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく、 種々の改変が提供されることは勿論であろう。例えば、外層および内層の両方の 壁厚は微小パーティクル形成溶液中の成分の濃度を変化させることにより調整し てよい。微小パーティクルの機械的特性は全体の壁厚および各層の厚さによって も制御されるだけでなく、またその弾性率および延び率によって各層に使用され る物質の選択、および層の架橋の程度によっても制御されることがある。内部ポ リマーの急速な沈着または非常に低い濃度の内部ポリマー含量を含むある種の条 件では内部ポリマー殻の多孔性が観察される。その孔は電子顕微鏡下で観察すれ ば直径が約0.1から２マイクロメートルの範囲である。層の機械的特性も可塑剤 または他の添加剤によっても改変されることがある。殻の機械的強度は、例えば 、 微小パーティクルの内部圧力によって改変されてよい。微小パーティクルの正確 な音響的特徴は殻の機械的特性、厚さを制御すること、および狭いサイズ分布に よって達成されることがある。微小パーティクルは超音波エネルギーによって破 壊されて微小パーティクル内部に捕らわれていた気体を血流中に放出することが ある。特に、機械的特性を適切に調整することにより、パーティクルは画像診断 の出力閾値に対して安定のままであって、一方、出力増加および／または共鳴周 波数に曝されることにより破壊されるように作られることがある。共鳴周波数は 身体画像診断システムの透過周波数(transmitted frequency)の範囲内にするこ とができ、あるいは、そのような周波数の高調波(harmonic)にすることができる 。製剤化工程において微小パーティクルは血液可溶性または血液不溶性気体を含 む、種々の気体を含むように調製されることがある。本発明の特徴は、微小パー ティクル組成物が2MHzより大きい、またはこれに等しい共鳴周波数を有するよう に、典型的には５MHzより大きい、またはこれに等しい共鳴周波数を有するよう に製造されることである。 本発明の微小パーティクルの診断または治療標的は心臓および腫瘍である。 以下の実施例は説明のために提供されるものであり、いかなる意味でも本発明 を限定することを意図したものではない。 実施例１ ゼラチンポリカプロンラクトン微小パーティクルの調製 20ml脱イオン水に溶解した1.0gのゼラチン（275bl、等電点4.89）溶液を約60 ℃にて調製した。この溶液のもともとのｐＨは5.07であった。別に、1.0gのポリ カプロラクトン(M.W.50,000)および6.75mlシクロオクタンを70℃にて撹拌しなが ら42mlイソプロピルアセテートに溶解した。37℃に冷却した後、この有機混合物 を30℃に維持したゼラチン溶液に、ロータリーミキサーを用いた中剪断力ミキシ ング下でゆっくりと加えた。完全に有機相を加えたならば、混合速度を５分間2, 500rpmにあげ、さらに５分間低剪断力で撹拌した。得られたo-wエマルジョンを 撹拌しながら、30℃に維持した1.2mlの25％グルタルアルデヒドを含む350mlの脱 イオン水に加えた。エマルジョンの添加のすぐ後に、槽のpH を4.7に調整した。30分後、pHを8.3に調整した。イソプロピルアセテートが完全 に揮発するまで低剪断ミキシングをおよそ2.5時間続けた。次に0.75gの量のポリ オキサマー188をこの槽に溶かしこんだ。得られた微小パーティクルを遠心によ って回収し0,25％ポリオキサマー188の水性溶液中で２回洗浄した。 微小パーティクルの顕微鏡検査により、有機液体核を封じ込んだ薄壁ポリマー 殻を有する球形カプセルが明らかになった。スライド標品のクマシーブルーＧに よる染色は、ポリマー殻を均一に取り囲む外部タンパク質層の存在を示した。 パーティクルサイズスペクトルをMalvern Microを用いて決定した。メジアン 直径は4.78マイクロメートルであり、スペクトルスパン(spectrum span)は0.94 であった。 実施例２ コントラスト剤製剤の調製 実施例１と類似の方法で調製した微小パーティクルの一定量を25mMグリシン、 0.5％プルロニックf-127、1.0％シュークロース、3.0％マンニトールおよび5.0 ％PEG-3400の水性溶液中に懸濁した。この懸濁液を次に凍結乾燥した。生じた乾 燥粉末を脱イオン水中で再構成し、顕微鏡下で調べたところ微小パーティクルは 気体核を有するようになったことが明らかになった。クマシーブルーＧによる染 色によりカプセルを取り囲む外側タンパク質層が無傷で凍結乾燥工程に耐えたこ とが確認された。 エコー生成性は120ml脱イオン水に分散させた一定量の凍結乾燥微小パーティ クルに2.5および５MHzの両方の音波照射(insonate)することによって確認した。 後方散乱が微小パーティクルに含まれる気体のみによるものであることを保証す るため、測定は微小カプセルの分散後少なくとも15分後に行った。Ｂモード表示 は高いコントラストを示し、この微小パーティクルが気体で満たされていること を示した。実施例３ ゼラチンポリラクチド微小パーティクルの調製 20ml脱イオン水に溶解した1.2gゼラチン(225ブルーム(bloom)、等電点5.1)溶液 をおよそ50℃にて調製した。溶液のｐＨを1M NaOHを用いて6.1に調整した。別に 、0.07gのパラフィン、4.5mlデカン、および0.69gポリDL-ラクチド（CHCl₂中、3 0℃における固有粘度0.69dL/g）を37mlのイソプロピルアセテートに溶かした。 この有機混合物を次にゆっくりと30℃にてロータリーミキサーを用いて中程度の 剪断ミキシング下に維持したゼラチン溶液に入れ込んだ。有機相を完全に取り込 ませたならば、ミキシング速度を２分間2,000rpmに上げ、次に４分間およそ1,00 0rpmに低下させた。得られた液体フォームを30℃に維持した350mlの脱イオン水 と混合し、次に1mlの25％グルタルアルデヒドを滴下して加えた。イソプロピル アセテートが揮発するまで、およそ３時間ロータリーミキシングを続けた。得ら れた微小パーティクルを遠心で回収し、0.25％プルロニックf-127の水性溶液中 で２回洗浄した。 顕微鏡観察によりタンパク質外層と内部有機液体核を有する中空の球状微小パ ーティクルが明らかになった。 微小パーティクルを実施例２と同様な方法で凍結乾燥し、テストした。その結 果は、微小パーティクルが気体状核を有し、強いエコー生成性であることを確認 するものであった。 実施例４ ゼラチンポリカプロラクトン微小パーティクルの調製 20ml脱イオン水に溶解した1.0gゼラチン(225ブルーム(bloom）、等電点5.1)溶 液をおよそ60℃にて調製した。溶液のｐＨは4.8であった。別に、0.57gポリカプ ロラクトン(M.W.50,000)を1.72mlテトラヒドロフランに溶解した。これに、0.07 gのパラフィン、0.475gのクエン酸トリエチル、4.5mlシクロオクタンおよび42ml イソプロピルアセテートを加えた。次にこの有機混合物をゆっくりと30℃にてロ ータリーミキサーを用いて中剪断ミキシング下に維持したゼラチン溶液に 加えた。有機相を完全に取り込ませたならば、ミキシング速度を２分間4,700rpm にあげ、次に４分間2,000rpmに低下させた。次に得られた液体フォームを30℃に て350mlの脱イオン水に撹拌しながら加えた。ゼラチンを架橋するために、1mlの 25％グルタルアルデヒドを滴下して加えた。イソプロピルアセテートが完全に揮 発するまでおよそ３時間ミキシングを続けた。得られた微小パーティクルを遠心 により回収し、0.25％プルロニックf-127溶液中で２回洗浄した。 顕微鏡検査によりタンパク質外層および有機液体内部核を有する分離した球状 のポリマー微小パーティクルが明らかにされた。 この微小パーティクルを凍結乾燥し、実施例２と類似の方法でテストした。こ の結果は、微小パーティクルが気体状核を有し強いエコー生成性であることを確 認するものであった。 実施例５ カルボジイミド架橋のあるゼラチンポリカクロラクトン微小パーティクルの調製 20ml脱イオン水に溶解した1.0gゼラチン(225ブルーム(bloom)、等電点5.1)溶液 をおよそ60℃にて調製した。溶液のｐＨを1M NaOHで5.5に調整した。別に、0.85 gポリカプロラクトン(M.W.80,000)を2.5mlのテトラヒドロフランに溶解した。こ れに撹拌しながら0.07gのパラフィン、4.5mlのシクロオクタンおよび42mlのイソ プロピルアセテートを添加した。次に有機混合物をゆっくりと30℃にてロータリ ーミキサーにより中剪断ミキシング下に維持したゼラチン溶液に入れた。有機相 を完全に取り込ませたならば、ミキシング速度を６分間3,500rpmに上げ、次に４ 分間3,000rpmに低下させた。次に、得られた液体フォームを低剪断ミキシングに て30℃に維持した350mlの0.5M NaCl溶液に分散させた。3.0mlの脱イオン水に溶 解した200mgの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドをゆっく りと加えることによりゼラチン架橋を行った。混合はイソプロピルアセテートが 揮発するまでおよそ３時間続けた。得られた微小パーティクルを遠心によって回 収し、0.25％プルロニックf-127の水性溶液中で２回洗浄した。 顕微鏡検査により、タンパク質外層および有機液体内部核を有する分離した球 状の中空ポリマー微小パーティクルが明らかにされた。実施例６ 表面PEG化微小パーティクルの調製 微小カプセルを実施例１と同様にして調製した。遠心後、クリーム（およそ15 ml）を回収し、65ml脱イオン水、0.5gのメトキシ-PEG-NCO(M.W.5000)および0.50 mlトリエチルアミンの溶液に分散させた。この混合物を一晩室温および緩やかに 撹拌しつつ反応させるままにした後、このカプセルを遠心により回収し、中性に バッファリングした0.25％プルロニックf-127溶液中で３回洗浄した。 実施例７ エコー生成性のイヌでの検討 実施例２の凍結乾燥微小パーティクル１バイアルを水を用いて再構成した。経 食道超音波プローブを麻酔したイヌの食道に心臓の４つの区画像が得られるよう に設置した。微小パーティクル懸濁液をイヌの大腿静脈中に注射した。コントラ スト剤の出現が心臓の右区画の超音波像に明確に示された。続いて、この作用剤 は心臓の左区画に観察され、このことは肺の毛細管系の通過を示す。左心房にお ける超音波反射強度の時間経過をビデオデンシトメトリーによって測定した。こ の作用剤は心臓の左区画におよそ６分間存在して見えていた(図１)。 実施例８ PEG 化微小パーティクルを用いたエコー生成性のイヌにおける検討 実施例６で調製した凍結乾燥微小パーティクル１バイアルを水を用いて再構成 した。経食道超音波プローブを麻酔したイヌの食道に心臓の４つの区画像が得ら れるように設置した。微小パーティクル懸濁液をイヌの大腿静脈中に注射した。 コントラスト剤の出現が心臓の右区画の超音波像に明確に示された。続いて、こ の作用剤は心臓の左区画に観察され、このことは肺の毛細管系の通過を示す。左 心房における超音波反射強度の時間経過をビデオデンシトメトリーによって測定 した。この作用剤は心臓の左区画におよそ１６分間存在して見えていたが(図２) 、 その後のデータは収集していない。 実施例９ アルブミンポリカプロラクトン微小パーティクルの調製 USP等級のヒト血清アルブミン(Alpha Therapeutic社)の25％溶液から脱イオン 水で希釈することにより６％水性溶液を調製した。この溶液を1N HClを用いて3. 49のｐＨに調整した。別に、８質量部のポリカプロラクトン(M.W.50,000)および 45部のシクロオクタンをおよそ70℃にて300部のイソプロピルアセテートに溶解 した。溶解が完結したならば、有機溶液を37℃に下がるままにした。ゆるやかに 撹拌しながら、42.5gの調製した有機溶液をゆっくりと25.0gのアルブミン溶液に 取り込ませ、その間、混合物を30℃に維持した。得られた粗製o-wエマルジョン を次に公称７マイクロメートルの孔サイズを有するステンレススチール焼結金属 フィルター装置を通して循環させた。エマルジョンの再循環を８分間続けた。エ マルジョンを次に撹拌しながら、1.0mlの25％グルタルアルデヒドを含む30℃に 維持した350mlの脱イオン水に加えた。添加の際、槽のｐＨを７から８の間に維 持されるように監視した。最終ｐＨは7.1であった。低剪断ミキシングをイソプ ロピルアセテートが完全に揮発するまでおよそ2.5時間続けた。次に0.75gの量の ポロキサマー188をこの槽に溶かした。得られた微小パーティクルを遠心によっ て回収し、0.25％ポロキサマーの水性溶液中で２回洗浄した。 この懸濁液の顕微鏡検査により、タンパク質外層と有機液体核を備えた薄壁ポ リマー殻を有する球状パーティクルを明らかにした。Malvern Microパーティク ルサイズ分析器によって測定したピーク直径は4.12マイクロメートルであった。 次に懸濁液を実施例２に記載したと同様に凍結乾燥した。得られた乾燥ケーキ を脱イオン水で再構成し、顕微鏡下で調べ、この微小パーティクルが球形で、分 離したもので、気体状核を有していることを明らかにした。 実施例１０ 微小パーティクルのタンパク質含量 微小パーティクルを実施例９によって調製した。遠心後、微小パーティクルを含 むおよそ1mlのクリームを回収し、脱イオン水を用いて10:1に希釈した。希釈し たクリームから、20μlのサンプルを脱イオン水で１ｘ、２ｘおよび４ｘで３重 に調製した。サンプルのタンパク質含量をPierce呈色BCAアッセイおよびウシ血 清アルブミン標準品を使用して決定した。希釈クリームの平均総タンパク質量は 0,441mg/mlと決定された。希釈クリームの総乾燥重量を決定するために、2mlを4 0℃オーブンでそれ以上の重量変化が観察されなくなるまで乾燥させた(およそ16 時間)。４つの反復試験の平均重量は6.45mg/mlであった。微小カプセル壁のタン パク質外層のポリマー内層に対する比の測定値として使用し得るタンパク質のパ ーセント乾燥重量を以下の式で計算した： 平均総タンパク質/ml÷乾燥重量/ml ｘ 100％ タンパク質のパーセント乾燥重量は6.8％と計算された。 実施例１１ アルブミンポリラクチド微小パーティクルの調製 USP等級のヒト血清アルブミン(Alpha Therapeutic社)の25％溶液から脱イオン 水で希釈することにより６％水性溶液を調製した。次にイオン交換樹脂(AG 501- X8、BioRad Laboratories)をこの溶液に、1.0g乾燥重量アルブミンに対して1.5g 樹脂の割合で添加した。３時間後、樹脂を濾過によって除き、溶液のｐＨを4.65 から5.5に調整した。別に、0.41gのd-lラクチド(CHCl₃中の0.69dL/g：30℃にて) および5.63gシクロオクタンを37.5gイソプロピルアセテートに溶解した。次に、 有機溶液をゆっくりと25gの調製したアルブミン溶液に緩やかに撹拌しながら取 り込ませ、その間、混合物を30℃に維持した。得られた粗製o-wエマルジョンを 次に公称７マイクロメートルの孔サイズを有するステンレススチール焼結金属フ ィルター装置を通して循環させた。エマルジョンの再循環を８分間続けた。エマ ルジョンを次に撹拌しながら、1.0mlの25％グルタルアルデヒドを含む、30℃に 維持した350mlの脱イオン水に加えた。添加の際、槽のｐＨを７から８の間に維 持されるように監視した。最終ｐＨは7.0であった。低剪断ミキシングをイソプ ロピルアセテートが完全に揮発するまでおよそ2.5時間続けた。次に0.75gの量の ポロキサマー188をこの槽に溶かした。得られた微小パーティクルを 遠心によって回収し、0.25％ポロキサマーの水性溶液中で２回洗浄した。 この懸濁液の顕微鏡検査により、タンパク質外層と有機液体核を備えた薄壁ポ リマー殻を有する中空の球状パーティクルを明らかにした。この懸濁液をグリシ ン/PEG3350賦形剤溶液で製剤化し、次に凍結乾燥した。得られた乾燥ケーキを脱 イオン水で再構成し、顕微鏡下で検査し、微小パーティクルが球状で、分離して おり、気体状核を有していることを明らかにした。 実施例１２ 微小パーティクル表面のPEG改変 実施例９と同様な方法で微小パーティクルを調製した。遠心後、微小パーティ クルを含有するクリーム（およそ11mlの総収量）の4mlを31mlの脱イオン水に懸 濁した。これに0.3gのメトキシ-peg-NCO5000を含む溶液10mlを加え、ｐＨを8.7 に調整した。混合物をゆっくりと撹拌しながら室温で4.5時間反応させた。この 時間の終わりに、ｐＨは7.9であると測定された。微小パーティクルを遠心で回 収し、ポリオキサマー188の0.25％溶液中で２回洗浄した。この懸濁液をグリシ ン/PEG 3350賦形剤溶液とともに製剤し、次に凍結乾燥した。得られた乾燥ケー キは脱イオン水で再構成し顕微鏡下で観察してこの微小パーティクルが球状で、 分離しており、気体状核を有していることを明らかにした。 実施例１３ 製造後のサイズ分布の改変 微小パーティクルの一定量をまず実施例１と同様な方法で、より広いサイズス ペクトルを与えるような改変を行って調製した。洗浄し、おおざっぱな遠心によ る回収後、微小パーティクル含有クリームを25％のポリオキサマー188の0.25％ 溶液125mlで希釈した。次にこの懸濁液を撹拌型セル（Amicon）にセットした５ マイクロメートルシーブタイプｐｃメンブランフィルター（Nuclepore）を用い て濾過した。残留濃縮液を廃棄し、一方透過液を再度撹拌セルシステム中で３マ イクロメートルシーブタイプフィルターを用いて、濃縮液がおよそ20mlになるま で濾過した。残留濃縮液を0.25％ポリオキサマー188溶液を用いて220mlの 容積に希釈した。３マイクローメートル濾過過程を濃縮液がやはりおよそ20mlに なるまで繰り返した。 図３は未濾過の微小パーティクル懸濁液と５マイクロメートル透過液および３ マイクロメートル濃縮液との容積サイズ分布の比較を示している。この結果は、 Malvern Micronパーティクルサイズ分析器から得られたものだが、使用したフィ ルターの孔サイズによって規定される特定のサイズ範囲に向かって段階的にサイ ズスペクトルが狭くなることを示す。 実施例１４ エコー生成性のイヌにおける代表的な検討 31kgの開胸したオスの雑種犬に実施例４によって作製した1mlの再構成微小パ ーティクル組成物を注射した。これは末梢静脈注射によって循環系にデリバリー した。トリガーされた左心室のハーモニック(harumonic)超音波画像（各心拍ご とに１回）は９分間達成された。心筋におけるトリガー画像化の間コントラスト 効果を見ることができた。これに続く４分間のリアルタイム（30Hz）ハーモニッ ク超音波画像化はバブル破壊を増大させた。左心室の不透明化(opacification) は13分間の画像化時間にわたって維持された。有害な血液動態効果は全く観察さ れなかった。 別の調査において、0.1mlの再構成微小パーティクル剤を同様にして開胸した オスの雑種犬に投与した。トリガーされたハーモニック超音波画像は１分間達成 され、続いてリアルタイム画像化によって４分間の微小パーティクル破壊の増加 が起こった。ここでも有害な血液動態効果は全く観察されず、左心室の不透明化 が顕著で持続した。 実施例１５ アルブミンポリラクチド微小パーティクルの色素装荷 実施例１１と同様にして調製した賦形剤およびラクチド含有微小パーティクル からなる、10ml血清バイアル中の凍結乾燥ケーキを50ml遠心管に入れた。ケーキ を覆うに十分なイソプロピルアルコールを加え、３０秒間浸漬させた。水性プ ルロニックF68溶液（0.25％w/w）を加えて管を満たした。遠心後、上清を取り去 り、さらにリンスした。濾過した飽和ローダミンＢ溶液をこの微小パーティクル に加え、一晩浸漬させた。顕微鏡下で、この微小パーティクルは色素溶液で満た されているように見えた。色素飽和F68溶液を凍結乾燥賦形剤として使用するた めに調製した。この賦形剤の4mlとおよそ２mlの溶液含有微小カプセルとを一緒 にし、得られた混合物を二本の10ml血清バイアルに分けた。このバイアルを-80 ℃で凍結しFTS箱形乾燥器中で凍結乾燥した。両方のバイアルとも、真空ポンプ で５回のポンプダウンパージ(pump-down purge)によりパーフルオロブタンでパ ージした。観察により、幾つかの微小球体は半分赤い液体で満たされ、半分気体 で満たされていることが示された。観察中、これらの微小球体からの色素の漏れ は観察されなかった。微小パーティクルを20mlのF68溶液で真空フィルター上で ４回リンスした。この微小パーティクルをキュベット中に入れ、遠心し、初期ス ペクトルをとった。キュベットを超音波槽中で超音波処理し、遠心し、もうひと つスペクトルをとった。 初期Abs.(553-800) 超音波処理Abs.(553-800) 1.164 1.86 超音波処理後の高い吸光度は、封じ込められていた色素が微小パーティクルの 超音波照射によって放出されたことを示す。 実施例１６ 壁改変アルブミンポリカプロラクトン微小パーティクルの調製 アルブミン被覆微小カプセルを実施例９と同様な方法で、但し、0.20gのパラ フィンもポリカクロラクトンとシクロオクタンと一緒に有機溶液中に溶解して調 製した。 完成した微小バーティクル懸濁液の顕微鏡検査により、球形のパーティクルが パラフィンの添加無しに調製されたパーティクルと実質的に同一の形態、外観を 有していることが明らかになった。実施例１７ ヒト血清アルブミンポリカクロラクトン微小パーティクルの色素装荷 実施例１６によって調製された賦形剤およびパラフィン含有微小パーティクル からなる10ml血清バイアル中の凍結乾燥ケーキを50mlの遠心管に入れた。このケ ーキをメタノールで覆い、３０秒間浸漬させた。次にこの管を0.25%(w/w)プルロ ニックF68水性溶液で満たし、静かに撹拌し、遠心して今や液体で満たされた微 小パーティクルを沈降させた。上清を除去し、管を再びプルロニック溶液で満た した。微小パーティクルをボルテックスにより再懸濁し、再度遠心した。上清溶 液を取り去り、水性F68中の飽和ブリリアントブルーG色素濾過溶液2mlを加えた 。微小パーティクルをおよそ72時間浸漬させた。顕微鏡観察により、微小パーテ ィクルの90〜95％が色素溶液で満たされていることが明らかになった。凍結乾燥 賦形剤を調製した。4mlの賦形剤を微小パーティクル溶液に添加してボルテック スにより混合した。２本の10ml血清バイアルをそれぞれ３mlの溶液で満たし、-8 0℃で凍結した。バイアルをFTSフラスコ凍結乾燥器で凍結乾燥した。両方のバイ アルおよび脱イオン水の一部をパーフルオロブタンで10分間パージした。両方の バイアルとも脱イオン水で再構成し、真空フィルター上で0.25％(w/w)の40mlF68 溶液で２回リンスした。得られた微小パーティクル溶液を3ml部分２つに分けた 。１つの部分を超音波槽で超音波処理しバブルを破壊した。双方の部分をF68溶 液で1/10に希釈し、UV-可視キュベット中に入れた。キュベットを遠心し可視ス ペクトルをとった。 吸光度（605nm−800nm） 超音波処理 0.193 非−超音波処理 0.136 超音波処理後の高い吸光度は、封じ込められていた色素が微小パーティクルの 超音波照射によって放出されたことを示す。実施例１８ 微小パーティクルの音響共鳴 微小パーティクル構築物を音響的にチューニングする方法を示すため、実施例９ および１６に記載した方法によって調製した微小パーティクルを脱イオン水で再 構成し、以下の方法を用いてそれらの音響特性を比較した。 脱気した水で満たしたタンク中に２つの適合する5MHz振動子を向かい合わせに 設置した。水深をおよそ３インチ（約7.6cm）とした。振動子は、一つが発振器 、一つが受器であるが、受信信号を最大にするため６インチ（約15.2cm）離して 設置した。直径２インチ(約5cm)、２cm幅の円形チャンバーをこの２つの振動子 の間に置ぎ、チャンバー中央位置を発振器から３インチ（約7.6cm）に設置した 。チャンバーの２つの円板面を３mil（約7.6μm）ポリエチレンフィルムで覆い 、次にこのチャンバーを脱気した水で満たした。音波は発振器からチャンバーを 通って受器へ伝搬する。音源は超音波発生器からの出力ピーク間増幅１０ボルト のGauss雑音にセットした。受器シグナルは17dbプリアンプおよびオシロスコー プにより増幅した。オシロスコープデジタル電子装置は受けた波形の高速フーリ エ変換(FFT)を行うことができ、それらの分布を表示することができる。ベース ライン読み取りの後、テスト微小パーティクルコントラスト物質を皮下注射器に よってチャンバー内部にデリバリーし、そこでシリンジを前後させて激しく混合 した。テスト後評価の間、FFTデータをテスト物質の伝達関数（transfer functi on)に変換した。 伝達関数(FT)はバブル透過スペクトルデータをバブル無しのスペクトルデータ で割ることによって決定される。すなわち： ＴＦ＝Ｆ(f)_{ハ゛フ゛ル 有り}／Ｔ(f)_{ハ゛フ゛ル 無し} 式中、Ｔ(f)はFFTによって求められる。 コントラスト剤はそのスペクトル分布に依存して音波を選択的に減弱させる、 すなわち、バブル共鳴点において、あるいはその近くにおいては非共鳴点よりも 多くの音エネルギーが吸収される。従って、この手順はこの作用剤の共鳴スペク トル分布を評価ずるために使用することができる。ほぼ同一のサイズ分布を有す るが異なる内殻厚の二種類の作用剤のデータを、同日に同一の装置で同一の設定 で収集した。種々の作用剤量についてその他は一定に保った。 スペクトルアレイを最小値で割ってスペクトルの正規化を行った。従って、ピ ーク値は固有のものとなり、同じグラフにプロットされると２つのグラフを極め て容易に区別できるようになる。これらの正規化データは図４に示した。 図４に示した結果を調べると、殻壁弾性率が増加すると、共鳴周波数が2.3Hz から8.9MHzにシフトさせることができることが明確に示された。したがって、壁 の組成と厚さを制御することによって作用剤共鳴周波数を制御することができる 。 実施例１９ in vivo エコー生成に対する音響特性の影響 空気含有微小パーティクル製剤をin vivo効果に関して評価した。１バイアル の凍結乾燥微小パーティクルを実施例１および２に記載したように調製した(製 剤A)。凍結乾燥微小パーティクルの第２バイアルを実施例１および２に記載した のと類似の方法により調製した。但し、４倍のポリマーを使用し、厚い内壁を有 し、従ってより高い共鳴周波数を有する微小パーティクルを作り出した(製剤Ｂ) 。両方のバイアルとも、使用直前に再構成した。パーティクルサイズ分析から、 双方の製剤ともおよそ４マイクロメートルの平均微小パーティクル直径を有し、 ほぼ同一の微小パーティクル濃度を有していた。In vitroの音響的特徴は製剤A は５MHz付近の共鳴周波数を有し、製剤Bは10MHzより高い共鳴周波数を有してい ることを示した。５MHzの経食道超音波プローブを麻酔した犬の食道に心臓の４ つの像が得られるように設置した。再構成した微小パーティクル懸濁液（製剤A の4ml）をイヌの大腿静脈中に注射した。コントラスト剤の出現は心臓の右およ び左区画の超音波像に明瞭に示された。続いて、4mlの厚い壁の微小パーティク ル懸濁液（製剤B）をイヌの大腿静脈中に注射した。コントラスト剤の出現は今 度も心臓の超音波像に明瞭に示されたが、コントラスト効果は製剤Aの等量注射 に比較してかなり減少した。続く、製剤Aの希釈物の注射は、製剤Ｂに比較して ４倍以上の製剤Aドース効果を示し、超音波画像診断システムの中央付近の共鳴 周波数を有しており、より大きな共鳴周波数ピークを有することを明ら かにした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ショート ロバート イー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95030 ロス ガトス アルメンドラ ア ベニュー 240 (72)発明者 ヤマモト ロナルド ケイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94117 サン フランシスコ ウォーラー ストリート 1321

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約１から10マイクロメートルの範囲内の直径を有し、生物学的に共存可能な 物質の外層と生分解性ポリマーを含む内層を有する微小パーティクルを含む微 小パーティクル組成物。 ２．微小パーティクルの少なくとも大部分が請求項１記載の範囲の直径を有する 、請求項１記載の組成物。 ３．微小パーティクルが中空の核を有する、請求項１記載の組成物。 ４．微小パーティクルが固体核を含む、請求項１記載の組成物。 ５．生物学的に共存可能な物質が血液共存性である、請求項１記載の組成物。 ６．外層が化学的に架橋された両親媒性バイオポリマーを含む、請求項１記載の 組成物。 ７．核が気体を含有する、請求項３記載の組成物。 ８．核が液体を含有する、請求項３記載の組成物。 ９．微小パーティクルが薬剤を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の 組成物。 10．身体の毛細管循環系を通過することができるサイズの、気体で満たされた微 小パーティクルを含む組成物であって、前記微小パーティクルが所定の共鳴周 波数に共鳴するように機械的に調整されている、前記組成物。 11．微小パーティクルがパーティクルサイズ選別によって、前記周波数に共鳴す るように選別されている、請求項10記載の組成物。 12．パーティクル直径が約１から10マイクロメートルの範囲である、請求項11に 記載の組成物。 13．共鳴周波数が２MHz以上である、請求項10記載の組成物。 14．共鳴周波数が５MHz以上である、請求項13記載の組成物。 15．機械的調整が壁厚の選択によって行われる、請求項10記載の組成物。 16．機械的調整が微小パーティクルの壁物質の選択によって行われる、請求項10 記載の組成物。 17．機械的調整が微小パーティクル壁物質の架橋程度の選択によって行われる、 請求項10記載の組成物。 18．機械的調整が微小パーティクルの内部圧力の調整によって行われる、請求項 10記載の組成物。 19．共鳴周波数が身体画像診断システムの透過周波数の範囲にある、請求項10記 載の組成物。 20．共鳴周波数が身体画像診断システムの高調波である、請求項10記載の組成物 。 21．微小パーティクルが、画像診断の超音波照射出力レベル閾値に暴露されたと きに安定に維持され、かつ、前記出力が上昇したときに破壊され得るように機 械的調整がされている、請求項10に記載の組成物。 22．微小パーティクルが、画像診断の超音波照射出力レベル閾値に暴露されたと きに安定に維持され、かつ、微小パーティクルの共鳴周波数付近に暴露された ときに破壊され得るように機械的調整がされている、請求項10に記載の組成物 。 23．微小パーティクルが薬剤を含む、請求項21または22に記載の組成物。 24．微小パーティクルが血液可溶性または血液非可溶性気体を含む、請求項21ま たは22に記載の組成物。 25．身体の毛細管循環系を通過し得るサイズであって、選択した組織に結合する ためのターゲッティング部分を含む、気体で満たされた微小パーティクルを含 む組成物。 26．身体の毛細管循環系を通過し得るサイズであって、表面結合親水性ポリマー を含む、気体で満たされた微小パーティクルを含む組成物。 27．親水性ポリマーがポリエチレングリコールを含む、請求項26記載の組成物。 28．ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、その誘導体、および その組み合わせを含む、請求項26記載の組成物。 29．化学的に荷電された外表面を有する、請求項25または26記載の組成物。 30．外表面がPEG化されている、請求項28に記載の組成物。 31．外表面がスクシニル化されている、請求項29記載の組成物。 32．ターゲッティング部分が、抗体、細胞レセプター、レクチン、セレクチン、 インテグリン、レセプター標的、レセプターアナログ、およびその活性断片か らなる群より選ばれる、請求項25記載の組成物。 33．生物学的に共存可能な物質がタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。 34．生物学的に共存可能な物質が、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブ リン、またはグリコサミノグリカンを含む、請求項１に記載の組成物。 35．生物学的に共存可能な物質がアルブミンを含む、請求項１に記載の組成物。 36．生物学的に共存可能な物質がバイオポリマーを含む、請求項１に記載の組成 物。 37．生物学的に共存可能な物質がゼラチンを含む請求項１に記載の組成物。 38．生分解性ポリマーが合成ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。 39．ポリマーがボリカプロラクトンを含む、請求項38に記載の組成物。 40．ポリマーが、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはそのコポリマーを含む 、請求項38記載の組成物。 41．ポリマーが、カプロラクトンと、乳酸またはグリコール酸とのコポリマーを 含む、請求項38記載の組成物。 42．内層が多孔性である、請求項１記載の組成物。 43．注射に適した媒液中に懸濁可能な多層微小パーティクルを形成させる方法で あって、 （ａ）生物学的に共存可能な物質の第１の水性分散混合液を形成させ、生分解 性ポリマーの第２の溶液と混合物するステップであって、前記第２の溶液が前 記ポリマーに対する相対的に揮発性の水非混和性溶媒および相対的に非揮発性 の水非混和性非溶媒とを含むものである前記ステップ； （ｂ）ステップ（ａ）の混合物を乳化し前記ポリマー溶液を含む内部と前記生 物学的に共存可能な物質を含む外層を有する微小滴を形成させるステップ； （ｃ）前記相対的に揮発性の溶媒を前記微小パーティクルから除去して前記ポ リマーの内層を前記バイオポリマー上に形成させるステップ； （ｄ）前記微小パーティクルを乾燥させ前記非溶媒および残存水を除去するス テップ を含む、前記方法。 44．ステップ（ｃ）において揮発性溶媒がエバポレーションによって除去される 、 請求項43に記載の方法。 45．ステップ（ｃ）において揮発性物質が希釈によって除去される、請求項43に 記載の方法。 46．更に外層を架橋するステップを含む、請求項43に記載の方法。 47．ステップ（ｄ）が凍結乾燥によるものである、請求項43に記載の方法。 48．乾燥後に微小パーティクルに空気以外の気体を装荷するステップを含む、請 求項43に記載の方法。 49．微小パーティクルサイズ選別のステップを含む、請求項43記載の方法。 50．エコー検査のための画像を作り出すための方法であって、 （ａ）患者の毛細管循環系を通過し得る、気体で満たされた微小パーティクル を患者に導入するステップであって、前記微小パーティクルが生物学的に共存 可能な物質を含む外層を有し、生分解性ポリマーを含む内層を含むものである 、前記ステップ； （ｂ）前記患者を適切な超音波照射に暴露するステップ； （ｃ）前記対象における前記微小パーティクルによる超音波の反射、透過、共 鳴および／または周波数および／または変調された振幅を検出するステップを 含む、前記方法。 51．微小パーティクルの少なくとも大部分が約１から10マイクロメートルの範囲 の直径を有する、請求項50記載の方法。 52．医薬的活性な薬剤を患者にデリバリーする方法であって、患者にその患者の 毛細管循環系を通過し得る、生物学的に共存可能な物質を含む外層、生分解性 ポリマーを含む内層を有し、前記医薬的に活性な薬剤を含有する微小パーティ クルを含む組成物をn患者に導入するステップを含む、前記方法。 53．微小パーティクルの少なくとも大部分が約１から10マイクロメートルの範囲 の直径を有する、請求項52記載の方法。 54．さらに、標的組織にまたは器官に局所化した超音波エネルギーを作用させ、 医薬的に活性な薬剤を所望の特定の部位で放出させることを含む、請求項52に 記載の方法。 55．標的器官が心臓である、請求項54に記載の方法。 56．標的組織が腫瘍である、請求項55に記載の方法。