CN113811335A - 冻干产品和充气微泡的悬浮液 - Google Patents

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Abstract

通过重构冻干产品制造充气微泡的悬浮液的方法和根据所述方法获得的悬浮液，其中冻干产品已经受热处理。

Description

冻干产品和充气微泡的悬浮液
技术领域
本发明涉及通过重构冻干产品制造充气微泡的悬浮液的新方法和根据所述方法获得的悬浮液。
发明背景
近年来，造影剂的快速发展产生了许多不同的组合物和制剂，它们可用于人或动物体的器官和组织的造影增强成像及其治疗处理中。
一类特别适用于造影增强超声成像(“CEUS”成像)的造影剂包括分散在水性介质中的纳米级和/或微米级气泡悬浮液。气体通常被截留或封装在包含例如乳化剂、油、增稠剂或糖的膜层中。这些稳定化的气泡(分散在合适的生理溶液中)在本领域中一般用各种术语来指代，通常取决于用于制备它们的稳定化材料；这些术语包括例如“微球”、“微气泡”、“微胶囊”或“微珠”，在此整体指代为“充气微泡”(或“微泡”)。
超声造影剂(“USCA”)可根据各种制造方法生产。这些方法之一，参见例如WO94/09829，要求将两亲性材料(诸如磷脂和/或脂肪酸)和冻干保护性化合物(例如聚乙二醇)溶解在有机溶剂中；然后通常在装入小瓶后接着使获得的混合物经受冻干，以除去溶剂并获得冻干产品。另一种方法，参见例如WO2004/069284，要求制备水和与水不混溶的有机溶剂的微乳液，所述乳液包含两亲性材料和冻干保护性化合物。接着使乳液(当分配到小瓶中时)经受冻干步骤以除去水和溶剂。
接着在其底部含有粉末形式的冻干固体产品的小瓶的顶部空间填充合适的气体(例如氟化气体)并最终密封用于储存。使用前，通过将合适的液体(例如盐水)引入小瓶并轻轻摇动小瓶以溶解冻干产品来容易地制备微泡的水性悬浮液。
可根据以上方法制造的市售USCA是来自Bracco的
Figure BDA0003348364720000011
(或美国的
Figure BDA0003348364720000021
)。
申请人现已观察到，可通过在制造冻干固体产品的方法结束时引入最终的受控热处理(即加热)来改进由冻干产品重构的充气微泡(特别是微气泡)悬浮液的特性。
发明内容
根据一方面，本发明涉及适用于制备稳定化充气微泡的悬浮液的冻干组合物的制造方法，所述组合物包含：(i)能够稳定所述气体微泡的两亲性材料和(ii)冻干保护性组分；该方法包括：
a.制备在溶剂中包含所述两亲性材料和所述冻干保护性组分的液体混合物；
b.冻干液体混合物以除去所述溶剂，并得到包含所述两亲性材料和所述冻干保护性组分的冻干产品；和
c.加热所述冻干产品。
优选地，所述加热步骤包括在高于35℃、更优选至少38℃的温度下加热所述产品。加热温度优选低于50℃，更优选低于48℃。
在某些实施方案中，加热步骤在环境压力下执行。
优选地，加热步骤持续至少8小时，更优选持续至少12小时。
根据另一方面，本发明涉及根据上述制造方法获得的冻干产品。
根据另一方面，本发明涉及通过重构根据上述制造方法制备的冻干产品而获得的充气微泡的悬浮液，所述悬浮液通过在生理上可接受的气体存在下，在温和搅拌下将所述产品与药学上可接受的液体载体混合而获得。
根据另外的方面，本发明涉及制造由两亲性材料稳定的充气微泡的悬浮液的方法，其包括：
a.根据以上示出的制造方法制备冻干产品；和
b.通过在生理上可接受的气体存在下，在温和搅拌下将所述产品与药学上可接受的液体载体混合来重构所述产品，以获得充气微泡的悬浮液。
本发明的详细描述
用于制备充气微泡的可注射悬浮液的合适方法包括在合适的生理上可接受的气体存在下用水性载体重构包含能够稳定所述微泡(例如通过在液-气界面形成稳定性层)的两亲性材料的冻干产品。
冻干产品通常通过冻干在合适的溶剂中包含所述两亲性材料和冻干保护性组分的液体混合物而获得。
经历冻干过程的液体混合物可根据本领域已知的方法获得，公开于例如WO94/09829或WO2004/069284中。
制备用于冻干的液体混合物
例如，根据WO94/09829公开的方法，将两亲性材料与合适的冻干保护性组分一起分散到有机溶剂(例如叔丁醇、二恶烷、环己醇、四氯二氟乙烯或2-甲基-2-丁醇)中。接着将含有两亲性材料和冻干保护性组分的分散体进行冻干以除去有机溶剂，从而获得冻干产品。
根据WO2004/069284中公开的替代方法，包含两亲性材料的组合物可在搅拌下分散在水和与水不混溶的有机溶剂的乳液中，优选与冻干保护性组分混合。
合适的与水不混溶的有机溶剂包括例如支链或直链烷烃、烯烃、环烷烃、芳烃、烷基醚、酮、卤代烃、全氟烃或它们的混合物。
乳液可通过在两亲性材料存在下将水性介质和溶剂经受本领域已知的任何合适的乳液产生技术而获得，诸如例如超声、摇动、高压均质化、微混合、膜乳化、高速搅拌或高剪切混合。冻干保护性组分可在乳液形成之前或之后加入，例如以包含此类冻干保护性组分的水溶液的形式。如此获得的微乳液含有被两亲性材料包围并稳定的溶剂微滴，接着根据常规技术冻干该微乳液以获得冻干材料，接着可将该冻干材料用于制备充气微泡的悬浮液。
两亲性材料
根据优选的实施方案，适用于制备以上液体混合物的两亲性材料包含磷脂。磷脂，作为其他两亲性分子，一般能够在最终的充气微泡的悬浮液的气-水界面处形成稳定性材料膜(通常以单分子层的形式)，这些材料在本领域中也称为“成膜”材料。
磷脂通常含有至少一个磷酸酯基团和至少一个、优选两个亲脂性长链烃基。
合适的磷脂的实例包括甘油与一个或优选两个(相同或不同)脂肪酸残基以及与磷酸的酯，其中磷酸残基又与亲水基团结合，诸如例如胆碱(磷脂酰胆碱，PC)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸，PS)、甘油(磷脂酰甘油，PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺，PE)、肌醇(磷脂酰肌醇)。仅具有一个脂肪酸残基的磷脂的酯在本领域中通常称为磷脂的“溶血”形式或“溶血磷脂”。磷脂中存在的脂肪酸残基通常为长链脂肪酸，通常含有12至24个、优选14至22个碳原子；脂族链可含有一个或多个不饱和度或优选为完全饱和的。包含在磷脂中的合适的脂肪酸的实例是例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选地，采用诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸的饱和脂肪酸。
磷脂的另外实例为磷脂酸，即甘油磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂，诸如鞘磷脂，即其中甘油二酯与脂肪酸的残基被神经酰胺链取代的那些磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即1,3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯；糖脂，诸如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；糖脂；硫酸脑苷脂和鞘糖脂。
如本文所用，术语“磷脂”包括可单独采用或作为混合物采用的天然存在的、半合成的或合成制备的化合物。
天然存在的磷脂的实例为天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)，诸如通常的大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
半合成磷脂的实例为天然存在的卵磷脂的部分或完全氢化的衍生物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
优选的磷脂的实例是例如二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐、二花生酰磷脂酰甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二花生酰磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二花生酰磷脂酰乙醇胺(DAPE)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生酰磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)、二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)、二花生酰磷脂酰肌醇(DAPI)、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)。
合适的磷脂还包含通过将诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)的亲水聚合物连接到其上而改性的磷脂。优选的聚合物改性磷脂包括“聚乙二醇化磷脂”，即与PEG聚合物结合的磷脂。聚乙二醇化磷脂的实例是聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(简称“PE-PEG”)，即其中亲水性乙醇胺结构部分与可变分子量(例如300至20000道尔顿，优选500至5000道尔顿)的PEG分子连接的磷脂酰乙醇胺，诸如DPPE-PEG(或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG)。例如，DPPE-PEG5000指代连接有平均分子量为约5000的PEG聚合物的DPPE。DPPE-PEG5000的实例是甲氧基封端的PEG衍生物1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]。
在一个实施方案中，磷脂可带有反应性结构部分，接着该反应性结构部分可与带有合适的活性组分(例如靶向配体)的相应反应性结构部分反应，以将所述活性组分结合到微泡上。合适的反应性结构部分的实例包括例如能够与结合到活性组分的氨基反应的反应性基团，诸如异硫氰酸酯基团(将形成硫脲键)、反应性酯(形成酰胺键)、醛基(用于形成亚胺键以还原为烷基胺键)；能够与结合到活性组分的巯基反应的反应性基团，诸如卤代乙酰基衍生物或马来酰亚胺(形成硫醚键)；能够与结合到活性组分的羧基反应的反应性基团，诸如胺或酰肼(形成酰胺或烷基酰胺键)。优选地，带有反应性结构部分的两亲性化合物是带有亲水聚合物的脂质，诸如前面提到的那些，优选聚乙二醇化磷脂，例如DPPE-PEG2000，诸如DPPE-PEG2000-马来酰亚胺。
特别优选的磷脂为DAPC、DSPC、DPPC、DMPA、DPPA、DSPA、DMPG、DPPG、DSPG、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最优选的为DPPG、DPPS和DSPC。
也可使用磷脂的混合物，诸如例如DPPE和/或DSPE(包括聚乙二醇化衍生物)、DPPC、DSPC和/或DAPC与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、乙基-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。
磷脂可方便地与任何其他化合物、优选两亲性化合物混合使用。例如，诸如胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、没食子酸丙酯或抗坏血酸棕榈酸酯的脂质，诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸的脂肪酸和它们的衍生物，或丁基化羟基甲苯和/或其他非磷脂(两亲性)化合物可任选地添加到一种或多种上述磷脂中，例如以优选低于50wt％、更优选至多25wt％或更低的比例。特别优选脂肪酸作为与磷脂混合的额外的化合物。可用于根据本发明的组合物的脂肪酸(其可以是饱和的或不饱和的)包含由羧酸结构部分封端的C10-C24脂族链，优选C14-C22并且更优选C16-C20脂族链。合适的饱和脂肪酸的实例包括羊蜡酸(正癸酸)、月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)、花生酸(正二十烷酸)、山萮酸(正二十二烷酸)和正二十四烷酸。优选的饱和脂肪酸为肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸，更优选棕榈酸。不饱和脂肪酸的实例包括肉豆蔻油酸(顺-9-十四碳烯酸)、棕榈油酸(顺-9-十六碳烯酸)、智人酸(sapienicacid)(顺-6-十六碳烯酸)、油酸(顺-9-十八碳烯酸)、亚油酸(顺-9,12-十八碳二烯酸)、亚麻酸(顺-9,12,15-十八碳三烯酸),巨头鲸鱼酸(顺-11-二十碳烯酸),顺-11,14-二十碳二烯酸,顺-5,8,11-二十碳三烯酸,顺-8,11,14-二十碳三烯酸、顺-11,14,17-二十碳三烯酸、花生四烯酸(顺-8,11,14,17-二十碳四烯酸)和芥酸(顺-13-二十二碳烯酸)。
根据一个实施方案，两亲性材料的混合物包含DSPC、DPPG和棕榈酸的混合物。
根据替代的实施方案，所述两亲性材料包含DSPC、DPPE-PEG5000和棕榈酸的混合物，任选地还包含靶向配体。
靶向配体
根据本发明的组合物和微泡可任选地包含靶向配体。
术语“靶向配体”在其含义内包括具有或能够促进本发明的组合物的微泡针对活体内的任何生物或病理位点的靶向活性(例如包括选择性结合)的任何化合物、结构部分或残基。靶向配体可连接的靶点包括组织，诸如例如心肌组织(包括心肌细胞)、膜组织(包括内皮和上皮)、层、结缔组织(包括间质组织)或肿瘤；血块；以及受体，诸如例如神经递质、抗原、补体片段、免疫球蛋白和肽激素的细胞表面受体，和类固醇激素的细胞质受体。
靶向配体可以是合成的、半合成的或天然存在的。可用作靶向配体的材料或物质包括例如但不限于蛋白质，包括抗体、抗体片段、受体分子、受体结合分子、糖蛋白和凝集素；肽，包括寡肽和多肽；肽模拟物；糖类，包括单糖和多糖；维生素；类固醇、类固醇类似物、激素、辅因子、生物活性剂，以及遗传物质，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。
靶向配体可以是与微泡的其他组分混合的化合物本身，或者可以是与用于形成微泡的两亲性分子(通常为磷脂)结合的化合物。
在一个优选的实施方案中，靶向配体可通过共价键与形成微泡的稳定性包膜的两亲性分子(例如磷脂)结合。在这种情况下，如上文详细示出的，需要存在于两亲性分子上的特定反应性结构部分将取决于要与其偶联的特定靶向配体。为了共价结合期望的靶向配体，至少部分的形成微泡包膜的两亲性化合物应由此包含合适的反应性结构部分，并且含有互补官能团的靶向配体将根据已知技术连接到其上，例如通过将其添加到包含微泡的两亲性组分的分散体中。优选地，两亲性化合物是带有亲水聚合物的脂质，诸如前面提到的那些，优选聚乙二醇化的磷脂(例如DSPE-PEG2000)。在这种情况下，靶向配体与亲水聚合物(例如DSPE-PEG2000-NH2)上的合适反应性结构部分连接，任选地通过连接基(linker)连接。在制备微泡之前，可将两亲性化合物与期望的靶向配体结合，并且这样获得的结合可用于制备微泡。或者，靶向配体可在微泡制备中(例如WO2004/069284中描述的方法的中间微乳液制备中)连接至各自的两亲性化合物。作为另一个替代，结合可发生在形成的包含带有反应性结构部分的两亲性材料的微泡上。
根据替代的实施方案，靶向配体也可通过物理和/或静电相互作用合适地与微泡缔合。例如，对互补结构部分具有高亲和力和选择性的官能性结构部分可被引入两亲性分子，而互补结构部分将连接到靶向配体。例如，亲和素(或链霉亲和素)结构部分(对生物素具有高亲和力)可与磷脂(或与聚乙二醇化磷脂)共价连接，而互补的生物素结构部分可并入合适的靶向配体(例如肽或抗体)内。生物素标记的靶向配体将因此通过亲和素-生物素偶联体系与微泡的亲和素标记的磷脂缔合。或者，可为磷脂和靶向配体两者提供生物素结构部分，并接着通过亲和素(其为能够桥接两个生物素结构部分的双官能组分)彼此偶联。在上面引用的US 6,139,819中还公开了磷脂和肽的生物素/亲和素偶联的实例。或者，范德华相互作用、静电相互作用和其他结合过程可将两亲性分子与靶向配体相缔合或结合。
或者，可用适合与诸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L的免疫球蛋白(Ig)的Fc域特异性偶联的蛋白质修饰磷脂。根据替代的实施方案，靶向配体可以是与形成微泡的组分混合、最终并入微泡结构的化合物，诸如例如在国际专利申请WO98/18501或99/55383中公开的脂肽。
或者，可首先制造微泡，其包含具有能够与靶向配体的相应互补结构部分相互作用的合适结构部分的化合物(脂质或聚合物修饰的脂质)；此后，将期望的靶向配体添加到微泡悬浮液中，以与微泡上的相应互补结构部分结合。
微泡可指向的合适的特定靶点的实例是例如纤维蛋白和活化血小板上的GPIIbIIIa结合受体。纤维蛋白和血小板事实上通常存在于“血栓”中，即可能在血流中形成并导致血管阻塞的凝块。合适的结合肽公开于例如以上引用的US 6,139,819中。对纤维蛋白靶向特异的另外的结合肽公开于例如国际专利申请WO 02/055544中。
其他重要靶点的实例包括易损斑块中的受体和肿瘤特异性受体，诸如激酶结构域(KDR)和VEGF(血管内皮生长因子)/KDR复合物。适用于KDR或VEGF/KDR复合物的结合肽公开于例如国际专利申请WO 03/74005、WO 03/084574和WO2007/067979中。在一个实施方案中，靶向肽是如WO2007/067979中描述的二聚肽-磷脂缀合物(脂肽)。
冻干保护性组分
如本文所定义，冻干保护性组分是具有冷冻保护和/或冻干保护作用的化合物。合适的冻干保护性组分包括例如碳水化合物，例如单糖、二糖或多糖，诸如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、棉子糖、环糊精、葡聚糖、壳聚糖及其衍生物(例如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖)；多元醇，例如糖醇，诸如山梨醇、甘露醇或木糖醇等；或亲水聚合物，例如聚氧化亚烷基二醇，诸如聚乙二醇(例如PEG2000、PEG4000或PEG8000)或聚丙二醇。根据一个实施方案，所述冻干保护性组分为聚乙二醇，优选PEG4000。如本文所用，PEG4000在本领域具有其正常含义，表示具有约4000g/mol的分子量的聚乙二醇，一般在所述值附近具有+/-10％的变化。
冻干过程
对于冻干过程，通常将含有两亲性材料和冻干保护性组分(例如根据前述制造过程中的任一种获得)的液体混合物取样到装载入冻干器的玻璃小瓶(例如DIN8R或DIN20R)中。
冻干过程通常包括初始步骤(初级干燥)，其中将小瓶快速深度冷却(例如在-35℃至-70℃的温度下)以冷冻混合物的一种或多种液体，并接着经受真空(例如0.1-0.8mbar)；在初级干燥期间，通过升华除去基本上全部的冷冻的一种或多种液体(例如水和/或溶剂)，通常至多液体总量的约95％，优选至多约99％。在初级干燥后，可在次级干燥期间进一步除去残留液体(包括可能的间隙水)，次级干燥通常在高于室温的温度下在真空下进行(优选通过保持在初级干燥期间施加的相同真空)。次级干燥期间的温度优选不高于35℃。当一种或多种液体的残留含量达到期望的最小值，例如相对于残留冻干产品的总质量，少于3wt％(优选少于1wt％)的水，或例如少于0.01wt％，优选小于0.08wt％的一种或多种残留溶剂时，可停止次级干燥。
在完成冻干过程(即停止加热并除去真空)后，冻干产品可在环境压力下经历根据本发明的额外的热处理步骤。如本文所用，术语“环境压力”是指大气压力值的正常值(即在海平面约103.12kPa，通常在95和104kPa之间)。优选地，在用合适的在生理上可接受的气体将包含冻干产品的小瓶的顶部空间饱和，并接着塞住(例如用诸如丁基橡胶的橡胶塞子)和密封(例如用诸如铝的金属压接密封件)小瓶后，对密封小瓶进行热处理。在这种情况下，优选将小瓶从冻干器中取出并引入合适的烘箱中进行热处理。或者，可对打开的小瓶(优选将其保存在冻干器中)进行这样的热处理，接着用气体将其饱和并接着塞住/密封。
合适的生理上可接受的气体的实例包括例如氟化气体，诸如SF6、C3F8、C4F10，任选地与空气或氮气混合。
在一个实施方案中，气体SF6与包含如上定义的DSPC、DPPG和棕榈酸的两亲性材料的混合物组合使用。
在另一个实施方案中，气体C4F10或C4F10与氮气的混合物与包含DSPC、DPPE-PEG5000和棕榈酸、任选地还包含如上定义的靶向配体的两亲性材料的混合物组合使用。
其他组分
其他组分，例如赋形剂或添加剂，可存在于用于制备微泡的干燥制剂中，或者可与用于其重构的水性载体一起加入，而不必参与(或仅部分参与)微泡的稳定性包膜的形成。这些包括例如pH调节剂、渗透压调节剂、粘度增强剂、乳化剂、填充剂等，并且可以常规量使用。
充气微泡的悬浮液
接着可通过在温和搅拌下用生理上可接受的(水性)载体重构冻干产品来制备充气微泡的悬浮液。合适的生理上可接受的(水性)载体包括例如注射用水、盐水或葡萄糖溶液，任选地包含如上示出的赋形剂或添加剂。
热处理
根据本发明，冻干产品(在冻干过程结束时包含在各个小瓶中)有利地经历热处理的额外的最终步骤。
如前所述，优选对已含有生理上可接受的气体的密封小瓶中的冻干产品执行热处理；或者，可对小瓶中的冻干产品执行热处理，接着再用气体填充小瓶并密封。在第一种情况下，热处理可在冻干设备内或优选在单独的加热装置(例如烘箱)中完成。在第二种情况下，加热步骤优选在冻干设备内执行；然后，用期望的气体使气氛饱和并密封小瓶。
如申请人所观察到的，相对于由未经历这种热处理的冻干产品获得的悬浮液，冻干产品的所述热处理令人惊讶地导致在冻干产品重构时获得的充气微泡的悬浮液的改进的特性。
申请人特别观察到这种处理导致所获得的微泡的耐压性增加。
冻干产品优选在高于35℃(例如36℃)的温度、更优选在38℃或更高的温度下加热。热处理的最高温度一般取决于冻干产品中包含的材料。例如，该温度应低于用作冻干添加剂的材料的熔点，该材料是形成冻干产品大部分质量的组分(通常是形成微泡的稳定性层的活性组分重量的50至超过600倍)。例如，PEG4000具有53-58℃的熔化温度。根据一个实施方案，加热温度优选为50℃或更低。热处理的优选温度为38℃至45℃。
热处理的持续时间一般取决于处理温度；通常，温度越高，加热的持续时间越短。由于形成充气微泡包膜的材料(特别是磷脂)如果在在过长的时间里经受过高的温度可能会经历降解反应(对重构的微泡的特性可产生负面影响)，不应不必要地延长加热的持续时间。虽然约8小时的持续时间可能足够(特别是与高于45℃、例如48℃的温度组合)，但是优选执行12小时、直至例如20小时、更优选14至18小时的热处理的持续时间。虽然在特定情况下可以很好地应用更长的持续时间(特别是组合低于45℃、优选低于42℃的温度)，但申请人已观察到，最终的充气微泡的特性也只是略有改进(如果根本没有进一步改进)；因此，就工业规模的制造经济而言，这种延长的持续时间在大多数情况下是不必要的，并且一般是不方便的。
在某些实施方案中，冻干产品包含与冻干保护性组分混合的如上定义的磷脂和脂肪酸的混合物。已证明本发明的热处理对于改进包含这种组分的混合物的充气微泡的特性特别有效。
根据一个实施方案，冻干产品包含与冻干保护性组分(例如聚乙二醇，诸如PEG4000)组合的DSPC、DPPG和棕榈酸。所述冻干产品优选在约40℃至48℃，特别是约45℃(+/-3℃)的温度下加热至少8小时，优选约18小时(+/-4小时)。
根据本发明的另一个实施方案，冻干产品包含与冻干保护性组分(例如聚乙二醇，诸如PEG4000)组合的DSPC、DPPE-PEG5000和棕榈酸。所述冻干产品在约36℃至45℃、特别是约39℃(+/-3℃)的温度下加热至少8小时，优选约15小时(+/-5小时)。
根据另外的实施方案，所述DSPC、DPPE-PEG5000和棕榈酸的混合物还包含例如WO2007/067979中描述的靶向脂肽。
如上所述，根据本发明的冻干产品的热处理导致充气微泡的耐压性增加。有利地，具有增加的耐压性的微泡一旦被注射，一般在血流中显示增加的时间持久性。
充气微泡的耐压性可通过确定经验参数“Pc50”或“临界压力”来评估。
如实验部分详细解释的，充气微泡的悬浮液的Pc50确定了施加的超压值(相对于大气压)，在该值下，微泡的悬浮液的吸光度下降到在大气压下测量的悬浮液吸光度的一半，所述施加的超压导致微泡群体相对于初始(在大气压下)群体显著降低。事实上，微泡的悬浮液吸光度的降低与充气微泡初始数量的降低有关，由此初始的乳状悬浮液(高浓度的微泡)在压力增加下变得越来越透明(由于微泡塌陷而降低的浓度)。Pc50值越高，微泡的耐压性越高。对于超声诊断应用，至少12kPa、优选至少13kPa(约100mmHg)、更优选至少14kPa(105mmHg)的最小Pc50值对充气微泡是可取的。对于超声治疗应用，一般需要更长的血流持久时间，至少55kPa(约412mmHg)的最小Pc50值是可取的，优选至少70kPa(约525mmHg)，更优选至少80kPa(约600mmHg)，而更高的Pc50值甚至是更优选的。
通常，相对于由未受到此类热处理的冻干产品获得的重构的悬浮液的Pc50，根据本发明的冻干产品的热处理允许将重构的微泡悬浮液的Pc50增加至少5kPa、优选至少8kPa、更优选至少10kPa。Pc50的这种增加可至多15kPa，并且在一些实施方案中至多25kPa。
根据一个实施方案(例如当冻干产品包含DSPC、DPPG、棕榈酸和PEG4000时)，由根据本发明的经受热处理的冻干产品重构的微泡悬浮液具有至少20kPa、优选至少22kPa并且更优选至少25kPa的Pc50值。
根据另一个实施方案(例如当冻干产品包含与例如聚乙二醇、诸如PEG4000的冻干保护性组分组合的DSPC、DPPE-PEG5000和棕榈酸时)，由根据本发明的经受热处理的冻干产品重构的微泡悬浮液具有至少75kPa、优选至少80kPa并且更优选至少90kPa的Pc50值。
药物试剂盒、施用和使用方法
含有冻干产品的小瓶可有利地包装在双组分诊断和/或治疗试剂盒中，优选用于通过注射施用。该试剂盒优选包含含有冻干产品的小瓶和含有用于重构的生理上可接受的水性载体的第二容器(例如注射器筒)。
本发明的微泡可用于多种诊断和/或治疗技术，特别包括超声。
因此，本发明的一个方面涉及由本发明的经受热处理的冻干产品重构的微泡悬浮液在诊断方法中的用途。
诊断方法包括其中充气微泡的使用允许增强动物(包括人)体的一部分的可视化的任何方法，包括用于临床前和临床研究目的的成像。可在超声应用中采用多种成像技术，例如包括基波和谐波B模式成像、反相脉冲成像以及基波和谐波多普勒成像；如果期望，可使用三维成像技术。
根据本发明的微泡通常可以每千克患者约0.01至约1.0μL气体的浓度施用，取决于例如它们各自的组成、待成像的组织或器官和/或选择的成像技术。这个一般的浓度范围当然可以根据特定的成像应用而变化，例如当信号可在非常低的剂量下观察到时，诸如在彩色多普勒或功率脉冲反转中。
在一个实施方案中，所述诊断方法包括：
(i)向患者施用通过重构根据本发明的方法获得的冻干产品而获得的充气微泡的悬浮液；和
(ii)检测来自所述患者的关注区域的超声信号。
根据一个实施方案，所述充气微泡的悬浮液包含DSPC、DPPG、棕榈酸和PEG4000。
冻干产品的重构优选通过在生理上可接受的气体(例如SF6)存在下，在温和搅拌下将其分散到生理上可接受的水性载体中来进行。
所述微泡的悬浮液具有优选至少20kPa、更优选至少22kPa并且甚至更优选至少25kPa的Pc50值。
在一个实施方案中，所述诊断方法包括心脏的超声成像，特别是使左心室腔不透明并改进具有次优的超声心动图的成年患者左心室心内膜边界的描绘。
在另一个实施方案中，所述诊断方法包括肝脏的超声成像，特别是用于表征成人和儿科患者的肝脏局灶性病变。
在另外的实施方案中，所述诊断方法包括尿路的超声成像，特别是用于评估儿科患者中疑似或已知的膀胱输尿管反流。
在所述诊断方法的另一个实施方案中，所述充气微泡的悬浮液包含DSPC、DPPE-PEG5000、棕榈酸、任选的靶向脂肽和PEG4000。优选地，靶向脂肽是例如WO2007/067979中描述的VEGF/KDR靶向脂肽。
其他可能的诊断成像应用包括闪烁扫描、光成像和X射线成像，包括X射线相衬成像。
本发明的另一方面涉及由本发明的经受热处理的冻干产品重构的微泡的悬浮液在治疗处理方法中的用途。
治疗技术包括对患者的任何治疗方法(如上定义)，其包括组合使用超声和充气微泡(本身(例如在超声介导溶栓、高强度聚焦超声消融、血脑屏障透化、免疫调节、神经调节、放射增敏中)，或与治疗剂组合(即超声介导递送，例如用于将药物或生物活性化合物递送至选定位点或组织，例如在肿瘤治疗、基因治疗、传染病治疗、代谢疾病治疗、慢性疾病治疗、退行性疾病治疗、炎症疾病治疗、免疫或自身免疫疾病治疗中或作为疫苗的用途中))，由此充气微泡的存在本身可提供治疗效果或能够增强应用的超声波的治疗效果，例如通过自身或通过各种物理方法(包括例如超声介导递送)的特定激活，在体外和/或体内发挥或负责发挥生物效应。
根据本发明的微泡通常可以以每千克患者约0.01至约5.0μL气体的浓度施用以用于治疗目的，取决于例如它们各自的组成、治疗对象的类型、待治疗的组织或器官和/或所应用的治疗方法。
在一个实施方案中，所述超声治疗处理方法包括：
(i)向患者施用通过重构根据本发明的方法获得的冻干产品而获得的充气微泡的悬浮液；
(ii)确定将经受治疗处理的所述患者的关注区域，所述关注区域包含所述充气微泡的悬浮液；和
(iii)施加超声波束以治疗性处理所述关注区域；
由此通过在所述关注区域中存在所述充气微泡的悬浮液来增强所述超声治疗处理。
在一个实施方案中，所述充气微泡的悬浮液包含DSPC、DPPE-PEG5000、棕榈酸、任选的靶向脂肽和PEG4000。
冻干产品的重构优选通过在生理上可接受的气体(例如C4F10和氮气的混合物)存在下，在温和搅拌下将其分散到生理上可接受的水性载体中来进行。
所述微泡的悬浮液具有优选至少84kPa、更优选至少88kPa并且甚至更优选至少90kPa、至多例如约105kPa的Pc50值。
在另外的实施方案中，本发明的充气微泡的悬浮液可有利地用于分离细胞的方法中，通常通过浮力(也称为浮力激活细胞分选，“BACS”)。该方法可用于在生理液体(例如血液或血浆)中将期望类型的细胞与其他细胞分离。在一个实施方案中，分离方法包括用能够与待分离的期望细胞上特异性(和选择性)受体结合的合适的标记抗体标记所述细胞。然后将本发明的微泡加入待分离的细胞(包括带有标记抗体的细胞)悬浮液中；一旦与细胞悬浮液混合，微泡通过配体与结合抗体/细胞构建体的标记残基缔合，从而允许通过浮力分离细胞(参见例如WO 2017/117349)。例如，标记抗体是生物素化的抗体，其中生物素残基能够与充气微泡上的各个结构部分诸如亲和素、中性亲和素或链霉亲和素残基缔合。改进的耐压性允许在用于分离细胞的多种方法中使用本发明的微泡。
以下实施例将有助于进一步示出本发明。
实施例
材料
DSPC：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
DPPG-Na:1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰-(1'-rac-甘油)(钠盐)。
DPPE-PEG5000：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)。
PEG4000：聚乙二醇(分子量为4000g/mol)。
耐压测量(Pc50)
使用内部开发的压力浊度计评估充气微泡的耐压性。简而言之，将微泡悬浮液引入分光光度计样品池(密闭并连接到加压系统)。连续记录悬浮液的光密度(700nm处的吸光度)，同时以约4mmHg/s(533Pa/s)的速率将施加到该池中样品的压力从大气压力(760mmHg，101.3kPa)线性增加到两巴(2280mmHg，303.9kPa)的超压。
表征每个悬浮液的Pc50参数(“临界压力”)确定微泡悬浮液的吸光度下降到其初始值的一半时的超压(相对于大气压)。
实施例1
冻干产品的制备(批次1a-1b)
使用WO 94/09829的工作实施例中示出的程序制备两个不同的批次(1a-1b)，每个批次由几个含有冻干产品的小瓶组成。
简而言之，首先将重量比为4.75/4.75/1的DSPC、DPPG-Na和棕榈酸以约5g/L的浓度溶解在己烷/乙醇(8/2,v/v)中，并在真空下蒸发溶剂。将固体残留物与PEG4000以约0.017:1的重量比混合，在约60℃将混合物溶解在叔丁醇中，并用澄清溶液填充各自的DIN8R小瓶(相应体积含有约25mg混合物)。然后将小瓶在-45℃快速冷却，并接着经受真空以通过升华除去冷冻溶剂。然后升高温度(高于室温，不高于35℃)并蒸发剩余的溶剂，直至最终的量低于0.5wt％。在冻干过程结束时，冻干器的周围环境在大气压下被SF6饱和，并且塞住并密封小瓶(含有与SF6接触的固体冻干产品)。
这两批用于后续的热处理实验。
实施例2
冻干产品的制备(2a-2h)
使用WO2004/069284的工作实施例中示出的程序制备8个不同的批次(2a-2h)，每个批次由几个含有冻干产品的小瓶组成。
简而言之，制备含有约90mg/L的DSPC、7mg/L的棕榈酸、60mg/L的DPPE-PEG5000和100g/L的PEG4000的环辛烷和水(约1.5/100v/v)的乳液(Megatron MT3000，Kinematica；10,000rpm)并取样到DIN8R小瓶中(每个小瓶约1mL)。
如实施例1中所描述的，将小瓶在-50℃在真空下冷却，并随后进行冻干，然后在室温以上进行次级干燥，直至完全除去水和溶剂(小于0.5wt％)。在冻干过程结束时，用C4F10/N2的35/65混合物饱和小瓶的顶部空间，并且塞住并密封小瓶。
不同的批次(1a到1h)用于后续的热处理实验。
实施例3
热处理对根据实施例1制造的批次的影响
根据实施例1制备的不同批次的小瓶受到不同的热处理，并观察对充气微泡的重构悬浮液特性的影响。
实验3.1
批次1a的小瓶经受48℃的加热温度，持续8小时至一周的时间(每组五个小瓶)。随后将小瓶中的产品用5mL盐水重构，并测量悬浮液中微泡的特性。结果报告在下表1中：
表1：批次1a
Figure BDA0003348364720000181
从以上结果可推断，相对于未经处理的冻干样品，热处理8小时后可观察到耐压性显著增加。这种耐压性随时间略有增加，在处理一周后达到最大值。然而，如申请人所观察到的，太长的加热时间(例如在24小时之后并且特别是在48小时以上)可对充气微泡的其他特性产生负面影响，诸如它们的总数、气体的总体积和/或它们的平均尺寸。
实验3.2
在第二个实验中，将批次1b的小瓶在40℃、45℃和49℃的温度加热12、16或20小时的时间段(每组三个小瓶，共27个小瓶)。随后用5mL盐水重构小瓶中的产品，并测量悬浮液中微泡的特性。结果报告在下表2中：
表2：批次1b
Figure BDA0003348364720000191
从以上数据可以推断，冻干产品的热处理(相对于约14kPa的初始值)获得了耐压性的显著增加。虽然在49℃的处理通常可观察到Pc50的更高增加，然而在此温度下的处理可对重构的充气微泡的其他特性产生负面影响，特别是对平均尺寸值。
实施例4
热处理对根据实施例2制造的批次的影响
根据实施例2制备的不同批次(2a-2h)的小瓶受到不同的热处理，并观察对重构的充气微泡的悬浮液的特性的影响。
实验4.1
批次2a的小瓶经受40℃或45℃的加热温度16小时，或不加热。随后用5mL盐水重构小瓶中的产品，并测量悬浮液中微泡的特性。结果报告在下表3中:
表3：批次1a
Figure BDA0003348364720000201
从以上数据可推断，对于根据实施例2的程序制造的批次，在热处理时也获得了耐压性的显著增加。
实验4.2
批次2b的小瓶经受40℃的加热温度，持续16至88小时的时间，或不加热。随后用5ml盐水重构小瓶中的产品，并测量悬浮液中微泡的特性。结果报告在下表4中：
表4：批次2b
Figure BDA0003348364720000202
从以上数据可以推断，在40℃热处理后，耐压性显著增加。一般认为16小时的处理持续时间是足够的，也避免较长的热处理对微泡的其他特性造成的可能的负面影响(例如，重构悬浮液中大尺寸微泡的增加)。
实验4.3
批次2c-2g的小瓶经受40℃的加热温度，持续16小时的时间，或不加热。然后用5ml盐水重构小瓶中的产品，并测量悬浮液中微泡的特性。结果报告在下表5中：
表5：批次2c-2g(40℃，16小时)
Figure BDA0003348364720000211
从上表可以推断，对于由不同批次重构的微泡的悬浮液，在冻干产品的热处理之后获得超过15kPa或更高、并且至多约25kPa的耐压性增加。
实验4.4
批次2h的小瓶受到38℃的热处理，持续2至24小时的时间。然后用5mL盐水重构小瓶中的产品，并测量悬浮液中微泡的特性。结果报告在下表6中：
表6：批次2h
Figure BDA0003348364720000221
从上表可推断，在38℃将冻干材料加热长达8-12小时的增加的时间后，重构悬浮液中微泡的耐压性增加。该材料的进一步加热(16或24小时)基本上不会进一步增加耐压性。

Claims (24)

1.制造适用于制备稳定化充气微泡的悬浮液的冻干组合物的方法，所述组合物包含：(i)两亲性材料和(ii)冻干保护性组分；所述方法包括：
a.制备在溶剂中包含所述两亲性材料和所述冻干保护性组分的液体混合物；
b.冻干所述液体混合物以除去所述溶剂并得到冻干产品；和
c.完成步骤b的所述冻干后，加热所述冻干产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体混合物包含分散在有机溶剂中的所述两亲性材料和所述冻干保护性组分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体混合物包含分散在与水不混溶的溶剂和水的水性乳液中的所述两亲性材料和所述冻干保护性组分。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述加热步骤在高于35℃的温度下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述加热步骤在38℃或更高的温度下进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述加热步骤在40℃或更高的温度下进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述两亲性材料包含磷脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述两亲性材料还包含脂肪酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述两亲性材料包含DSPC、DPPG和棕榈酸。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述两亲性材料包含DSPC、DPPE-PEG5000和棕榈酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述冻干保护性组分为聚乙二醇。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述冻干保护性组分为PEG4000。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述加热步骤在40℃至48℃的温度下进行至少8小时。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述加热步骤在36℃至45℃的温度下进行。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c中的所述加热执行至少8小时。
16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤c中的所述加热执行至少12小时。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c中的所述加热在环境压力下执行。
18.根据前述权利要求1至17中任一项所述的方法获得的冻干产品。
19.充气微泡的悬浮液的制造方法，其包括在生理上可接受的气体存在下，在温和搅拌下用药学上可接受的液体载体重构根据权利要求1至17中任一项所述的方法获得的冻干产品。
20.根据权利要求19所述的制造方法获得的充气微泡的悬浮液。
21.诊断方法，其包括：
(i)向患者施用根据权利要求20所述的充气微泡的悬浮液；和
(ii)检测来自所述患者的关注区域的超声信号。
22.根据权利要求21所述的方法，其包括心脏的超声成像。
23.根据权利要求21所述的方法，其包括肝脏的超声成像。
24.根据权利要求21所述的方法，其包括尿路的超声成像。
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