ES2908708T3 - Preparación de micropartículas de tamaño controlado - Google Patents

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Peter Frinking
Anne Lassus
Philippe Bussat
Emmanuel Gaud
Samir Cherkaoui
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Abstract

Un método para preparar una suspensión de microvesículas llenas de gas estabilizadas mediante una capa de material anfifílico que comprende un fosfolípido, comprendiendo dicho método: - proporcionar un primer flujo de fluido y, por separado, un flujo de líquido que comprende dicho material anfifílico, siendo dicho primer flujo de fluido un gas; - dirigir dicho primer flujo de fluido y dicho flujo de líquido a través de respectivos canales de entrada hacia una zona de contacto; - dirigir dicho primer flujo de fluido y dicho flujo de líquido desde la zona de contacto a través de un orificio calibrado para obtener una suspensión que comprende dichas microvesículas; y - dirigir dicha suspensión que comprende dichas microvesículas hacia un canal de salida; en el que una porción inicial de dicho canal de salida se mantiene a una temperatura controlada (ºC) de no menos del 20% menor con respecto a la temperatura de transición del material anfifílico.

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación de micropartículas de tamaño controlado
Campo técnico
La invención se refiere a un método para preparar micropartículas de tamaño controlado, tales como microvesículas llenas de gas, en particular usando un dispositivo de concentración de flujo.
Antecedentes de la invención
Las microvesículas llenas de gas se emplean generalmente como agentes de contraste adecuados en técnicas de formación de imágenes por ultrasonidos, conocidas como formación de imágenes por ultrasonidos de contraste mejorado (CEUS, Contrast Enhanced Ultrasound). El gas de estas microvesículas está normalmente atrapado o encapsulado en una envuelta estabilizante que comprende, por ejemplo, emulsionantes, aceites, espesantes o azúcares. Estas burbujas de gas estabilizadas (dispersadas en una solución fisiológica adecuada) se denominan generalmente en la técnica con diversas terminologías, dependiendo normalmente del material estabilizante empleado para su preparación; estos términos incluyen, por ejemplo, “microesferas”, “microburbujas”, “microcápsulas” o “microbalones”, denominadas de manera global en el presente documento “microvesículas llenas de gas” (o “microvesículas” de manera abreviada).
Son de particular interés las suspensiones acuosas de microvesículas llenas de gas en las que las burbujas de gas están unidas, en la interfaz gas/líquido, mediante una envuelta (película) muy delgada que implica un material estabilizante anfifílico (normalmente un fosfolípido) dispuesto en la interfaz de gas a líquido. Estas suspensiones se preparan normalmente poniendo en contacto materiales anfifílicos en polvo, por ejemplo, liposomas preformados liofilizados o disoluciones de lípidos liofilizados o secados por pulverización, con aire o cualquier otro gas, y entonces con un portador acuoso, al tiempo que se agita para generar una suspensión de microvesículas llenas de gas que entonces puede administrarse, preferiblemente poco después de su preparación. La capa estabilizante puede comprender, además de los fosfolípidos citados anteriormente, también otros materiales anfifílicos, tales como ácidos grasos.
La Ref. 1, da a conocer un método alternativo para la producción de microvesículas llenas de gas que comprende emulsionar un líquido hidrófobo, normalmente un aceite, en una dispersión acuosa del material anfifílico para obtener una emulsión de microgotas llenas de líquido; la emulsión se liofiliza entonces y el residuo liofilizado se reconstituye posteriormente en presencia de un gas y un disolvente acuoso para formar la suspensión de microburbujas.
La Ref. 7 investiga la ruptura del chorro de gas y la formación de microburbujas resultante en un dispositivo de concentración de flujo microfluídico usando formación de imágenes de velocidad ultraalta.
La Ref. 8 describe la producción a gran escala y las pruebas de liposomas catiónicos de DC-colesterol mediante microfluidización.
Las emulsiones acuosas que contienen microgotas llenas de líquido (“microgotas” de manera abreviada) también pueden usarse como portadores de fármacos. Ya sean fármacos hidrófobos o un fármaco hidrófilo pueden incorporarse a una gota recubierta mediante materiales anfifílicos. En el primer caso, el material anfifílico forma una monocapa alrededor de la gota. En el segundo caso se forma una doble capa de material anfifílico (liposoma) alrededor de una gota acuosa. Las microgotas llenas con un líquido con un punto de ebullición Tb relativamente bajo, por ejemplo, perfluoropentano Tb = 29°C, o con una (nano)emulsión de, por ejemplo, nanogotas que contienen fármaco en un aceite con un punto de ebullición bajo, tienen un gran potencial en aplicaciones de administración de fármacos que usan ultrasonidos. Los ultrasonidos pueden usarse para desencadenar la vaporización de gotas de líquido en aplicaciones in vivo, liberando de ese modo su carga.
Los métodos convencionales de preparación proporcionan generalmente suspensiones de microvesículas o microgotas (ambas identificadas en el presente documento como “micropartículas”) que tienen una distribución de tamaños con un índice de polidispersidad (PDI) relativamente alto, definido matemáticamente como la relación entre la desviación estándar “s” y el tamaño medio “n” de la población de micropartículas: PDI = s/n*100%. Por ejemplo, un método de preparación típico puede proporcionar micropartículas con un diámetro medio de aproximadamente 2-3 micrómetros y un PDI de aproximadamente el 60%. Aunque las micropartículas, y particularmente las microvesículas llenas de gas, con un PDI relativamente alto (tal como el 60%) son generalmente muy adecuadas para la mayoría de las técnicas de formación de imágenes actuales, tal PDI puede no obstante optimizarse todavía para dichas técnicas de formación de imágenes. Además, para ciertas aplicaciones de ultrasonidos terapéuticas es preferible minimizar el PDI.
Por tanto, se han desarrollado métodos para preparar las denominadas micropartículas “de tamaño controlado” o “monodispersadas”, es decir preparaciones de microvesículas llenas de gas o microgotas llenas de líquido en las que el PDI es menor del 10%, preferiblemente menor del 5% e incluso más preferiblemente menor del 2%.
Los métodos adecuados para preparar micropartículas monodispersas incluyen, por ejemplo, el uso de técnicas microfluídicas, normalmente usando uniones en T o dispositivos de concentración de flujo. De manera abreviada, en un dispositivo de concentración de flujo, un flujo de un primer componente fluido (por ejemplo, un gas o un aceite) se concentra mediante un flujo de un segundo componente fluido a través de un orificio estrecho. Normalmente, el segundo componente fluido es un fluido líquido que comprende un material de formación de envuelta (normalmente tensioactivos tales como lípidos, incluyendo fosfolípidos y/o ácidos grasos), que atrapa el primer componente fluido para formar las micropartículas deseadas (en forma de microvesículas llenas de gas o gotas de líquido), que se estabilizan frente a la coalescencia y la disolución mediante dicho material de formación de envuelta.
Sin embargo, el solicitante ha observado que, particularmente a altas tasas de flujo (que son necesarias para conseguir altas tasas de formación, por ejemplo, 105 micropartículas por segundo o más), las micropartículas recién formadas pueden chocar con una energía cinética relativamente alta y tales colisiones pueden dar como resultado la coalescencia de las micropartículas. Las consecuencias de tal coalescencia son que las dimensiones de las micropartículas formadas pueden variar aleatoriamente, por ejemplo, dos, tres y hasta n veces el volumen del volumen de las micropartículas deseado. Por tanto, el tamaño y el PDI de la población de micropartículas puede volverse incontrolable.
El solicitante ha encontrado ahora condiciones de preparación adecuadas que pueden aplicarse para limitar la coalescencia de las micropartículas preparadas según métodos microfluídicos.
En términos generales, el solicitante ha observado que controlando la temperatura cerca de la zona en la que se forman las micropartículas, y particularmente sometiendo las micropartículas a una temperatura de alrededor de o por encima de la temperatura de transición (Tm) del/de los material(es) anfifílico(s) que forma(n) la envuelta estabilizante de las micropartículas, puede reducirse sustancialmente el fenómeno de coalescencia.
Además, el solicitante ha observado que un enfriamiento posterior de la suspensión formada por debajo de la temperatura de transición de los materiales anfifílicos puede ayudar adicionalmente de manera ventajosa a mantener el tamaño controlado y el PDI deseados de las micropartículas.
Sumario de la invención
Según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una suspensión de micropartículas en forma de microvesículas llenas de gas, estabilizadas mediante una capa de material anfifílico que comprende un fosfolípido, comprendiendo dicho método:
- proporcionar un primer flujo de fluido y, por separado, un flujo de líquido que comprende dicho material anfifílico, siendo dicho primer fluido un gas;
- dirigir dicho primer flujo de fluido y dicho flujo de líquido a través de respectivos canales de entrada hacia una zona de contacto (en la que dichos respectivos flujos entran en contacto);
- dirigir dicho primer flujo de fluido y dicho flujo de líquido desde la zona de contacto a través de un orificio calibrado para obtener una suspensión que comprende dichas micropartículas; y
- dirigir dicha suspensión que comprende dichas micropartículas hacia un canal de salida;
en el que una porción inicial de dicho canal de salida se mantiene a una temperatura (°C) no menos del 20% menor con respecto a la temperatura de transición del material anfifílico.
Preferiblemente, la porción inicial del canal de salida se mantiene a una temperatura (°C) no menos del 10% menor con respecto a la temperatura de transición del material anfifílico.
Dicha porción inicial del canal de salida se extiende preferiblemente desde la salida del orificio calibrado hasta al menos una zona en la que el flujo de la suspensión acuosa de micropartículas alcanza una velocidad sustancialmente estacionaria.
En una realización preferida, la suspensión fluye desde el orificio calibrado hasta el canal de salida a través de un canal calibrado.
Dependiendo de la geometría del orificio (y canal) calibrado y del canal de salida, dicha porción inicial puede extenderse por al menos 0,1 mm desde la salida del orificio (o canal) calibrado, preferiblemente por al menos 1 mm, más preferiblemente por al menos 2 mm. La longitud de dicha porción inicial puede ser de hasta la longitud total del canal de salida del dispositivo microfluídico, por ejemplo, 100 mm desde la salida del orificio calibrado.
Tal como se usa en el presente documento, el término micropartículas se refiere a microvesículas llenas de gas.
Preferiblemente, la zona de contacto y el orificio calibrado también se mantienen a la temperatura deseada. En tal caso, el canal calibrado opcional entre el orificio calibrado y el canal de salida también se mantiene preferiblemente a dicha temperatura.
Según otro aspecto de la invención, la suspensión obtenida se enfría hasta una temperatura por debajo de la temperatura de transición del material anfifílico en el plazo de un periodo de tiempo relativamente corto tras la formación de las micropartículas. Por ejemplo, la suspensión se enfría en el plazo de 10 segundos desde la formación de las micropartículas, preferiblemente en el plazo de 5 segundos e incluso más preferiblemente en el plazo de 2 segundos. Preferiblemente, la suspensión se enfría a una temperatura (°C) al menos el 5% menor que la Tm, más preferiblemente al menos el 10% menor, hasta, por ejemplo, el 50% de la Tm. En una realización preferida, por ejemplo, para materiales anfifílicos con una Tm mayor que la temperatura ambiente, la temperatura de enfriamiento es la temperatura ambiente (por ejemplo, 22°C), particularmente cuando la suspensión de micropartículas se almacena a temperatura ambiente. En ciertas realizaciones, la temperatura de enfriamiento también puede ser menor, por ejemplo, correspondiendo a la temperatura de almacenamiento cuando la suspensión se almacena a temperaturas menores (por ejemplo, 10°C).
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de la porción de núcleo de un dispositivo de concentración de flujo. La figura 2 muestra una representación esquemática a modo de ejemplo (vista desde arriba) de un chip útil para el proceso de concentración de flujo de la invención.
La figura 3 muestra un dibujo esquemático a modo de ejemplo de un dispositivo útil para el proceso de la invención. La figura 4 ilustra resultados experimentales del control de temperatura durante la formación de microvesículas llenas de gas según la invención.
La figura 5 ilustra resultados experimentales del control de temperatura durante la formación de microvesículas llenas de gas con otros materiales anfifílicos según la invención.
La figura 6 ilustra resultados experimentales del efecto de enfriamiento sobre una suspensión de microvesículas llenas de gas.
Descripción detallada de la invención
La figura 1 muestra una representación esquemática de la porción de núcleo 100 de un dispositivo de concentración de flujo (chip) útil en el proceso de la invención. El chip comprende un primer canal de alimentación 101 para alimentar un primer flujo de fluido 101’ y dos canales de alimentación adicionales 102a y 102b para suministrar el flujo de líquido que contiene el material anfifílico.
El primer flujo de fluido (preferiblemente un gas) y los dos flujos de líquido se dirigen hacia la zona de contacto 103 y entonces a través del orificio calibrado 104, mostrado como una línea discontinua en la figura 1.
Tal como se ilustra en la figura 1, el orificio calibrado está conectado a un canal calibrado 104’ que tiene preferiblemente la misma sección transversal que el orificio, que está conectado a su vez a una porción inicial 105 del canal de salida 106. En una realización alternativa (no mostrada), el orificio calibrado 104 puede ser una boquilla conectada directamente a la porción inicial 105 del canal de salida 106, es decir sin el canal calibrado entremedias. Las micropartículas 103’ se forman en el orificio calibrado y se dirigen, a través del canal calibrado 104’, a la porción inicial 105 del canal de salida 106. El diámetro hidráulico del canal de salida es generalmente mayor que el diámetro hidráulico del orificio calibrado y aumenta normalmente desde el diámetro inicial del orificio calibrado hasta el diámetro final del canal de salida 106, correspondiendo sustancialmente al diámetro hidráulico de un tubo colector (no mostrado), que conecta el dispositivo de concentración de flujo a un recipiente, por ejemplo, un vial sellado.
Tal como se observó por parte del solicitante, debido al aumento del diámetro hidráulico (y particularmente a altas tasas de fabricación, por ejemplo, de aproximadamente 105 micropartículas/s o mayores), la velocidad de la corriente disminuye drásticamente desde una velocidad relativamente alta en la salida del orificio calibrado hasta la velocidad de estado estacionario de la suspensión (que se alcanza normalmente aguas abajo en el canal de salida y en el tubo colector). Este gradiente de velocidad negativo puede provocar que las micropartículas que salen del orificio calibrado choquen con micropartículas que fluyen a una velocidad sustancialmente menor en la porción inicial del canal de salida. Si la temperatura de las microvesículas no es suficientemente alta, estas colisiones pueden provocar un colapso incontrolado de las micropartículas, con el resultado de aumentar de manera indeseable la polidispersidad de la preparación.
Tal como descubrió el solicitante, tal fenómeno de coalescencia no deseado puede reducirse sustancialmente controlando la temperatura de las micropartículas en la porción inicial 105 del canal de salida del dispositivo y preferiblemente también en la zona de contacto 103 y en el orificio calibrado 104.
En particular, según la invención, la porción inicial del canal de salida se mantiene preferiblemente a una temperatura de no menos del 20% menor con respecto a la Tm del material anfifílico contenido en el flujo de líquido y que forma la envuelta estabilizante de las micropartículas. Más preferiblemente, dicha temperatura es no menos del 10% menor con respecto a la Tm del material anfifílico. Aunque en general no es necesario tener una temperatura excesivamente mayor que la Tm, tal temperatura puede ser tan alta como sea necesario, de manera compatible con la resistencia a la degradación térmica de los materiales anfifílicos; por ejemplo, la temperatura puede ser hasta el 20% mayor que la Tm del material anfifílico, preferiblemente hasta el 10% mayor. En realizaciones preferidas, dicha temperatura está a o ligeramente por encima de (por ejemplo, hasta 5°C más) la Tm del material anfifílico. El control de temperatura es particularmente útil en la zona del canal de salida en la que el flujo de la suspensión acuosa de micropartículas no ha alcanzado aún una velocidad estacionaria sustancial, por ejemplo, cuando el gradiente de velocidad absoluta es mayor de aproximadamente 10 s-1. Dependiendo de la geometría del chip, dicha zona puede extenderse por una longitud de desde aproximadamente 0,1 mm hasta 100 mm desde el orificio calibrado, preferiblemente de desde 1,0 hasta 50 mm y más preferiblemente de desde 2,0 hasta 30 mm.
Ventajosamente, la temperatura puede controlarse de manera similar aplicando los parámetros especificados anteriormente también a la zona de contacto y al orificio calibrado (y, cuando esté presente, al canal calibrado).
Tal como se observó por parte del solicitante, la temperatura controlada proporciona una reducción sustancial de la coalescencia entre las micropartículas formadas.
El porcentaje de coalescencia puede determinarse calculando el número total de micropartículas que han experimentado coalescencia a partir de los picos de la distribución de tamaños de las imágenes obtenidas con el microscopio óptico en el canal de salida del dispositivo de concentración de flujo, por ejemplo:
- multiplicando el número total de micropartículas con un volumen igual a dos veces el volumen de las micropartículas formadas inicialmente Vi (segundo pico de la distribución de tamaños) por un factor de dos (dado que las micropartículas que han experimentado coalescencia se originaron a partir de dos micropartículas); y
- sumando este número al número total de micropartículas con tres veces el volumen inicial (tercer pico de la distribución de tamaños) multiplicado por un factor de tres, etcétera hasta el enésimo pico en la distribución de tamaños medida.
Por tanto, el porcentaje de coalescencia puede calcularse normalizando el número total de micropartículas que han experimentado coalescencia con el número total de micropartículas producidas,
Figure imgf000005_0001
En general, un porcentaje de coalescencia de menos de aproximadamente el 10%, preferiblemente de menos de aproximadamente el 5% e incluso más preferiblemente de aproximadamente el 1% o menos es deseable, hasta porcentajes de coalescencia de, por ejemplo, el 0,01%.
Además, la tasa de flujo a la que se hace funcionar el dispositivo también puede afectar a la coalescencia de las micropartículas. En particular, bajo el denominado régimen “de goteo”, como la velocidad de los flujos es relativamente baja (por ejemplo, aproximadamente 45 pl/min para un orificio calibrado de aproximadamente 600 pm2), y el tamaño de las micropartículas es normalmente mayor (correspondiendo normalmente a la sección transversal del orificio calibrado), el fenómeno de coalescencia se reduce relativamente. Por otro lado, bajo el denominado régimen “de chorro”, la velocidad aumentada del flujo (por ejemplo, 55 pl/min o mayor para un orificio calibrado de aproximadamente 600 pm2), asociada con el tamaño de las micropartículas disminuido (normalmente, cuanto más rápida sea la tasa de flujo, menores serán las micropartículas), determinan un aumento en la coalescencia de las micropartículas formadas. Sin embargo, aunque la tasa de formación de micropartículas bajo el régimen de goteo es de aproximadamente 102 - 104 micropartículas por segundo, en el régimen de chorro tal tasa de formación se aumenta hasta normalmente 105 micropartículas por segundo o más. Por tanto, incluso si son desventajosas en términos de coalescencia, las altas velocidades de flujo son necesarias para conseguir tasas de formación aceptables de micropartículas a escala industrial (Ref. 2).
Tal como se muestra en detalle en la parte experimental, al mantener la temperatura a o alrededor de la Tm del material anfifílico, se observa una coalescencia reducida usando concentraciones sustancialmente menores de materiales anfifílicos (en comparación con las concentraciones mayores necesarias cuando no se aplica calentamiento).
El dispositivo de concentración de flujo puede ser cualquiera de aquellos conocidos en la técnica, descrita, por ejemplo, en (véase, por ejemplo, la Ref. 3). Preferiblemente, el dispositivo de concentración de flujo comprende un chip, tal como el descrito, por ejemplo, en la Ref. 4.
Con referencia al dibujo esquemático de la figura 2, el chip 200 puede comprender un primer canal de entrada 201 a través del que se suministra el primer flujo de fluido (preferiblemente un gas) y dos canales de entrada 202’ y 202’’ a través de los que se suministra el flujo de líquido. Cada uno de dichos canales de entrada está conectado a un respectivo depósito a través de respectivos tubos (no mostrados). El chip comprende además un canal de salida 203 conectado a través de un respectivo tubo a un recipiente (no mostrado) adaptado para recoger la suspensión de micropartículas. La sección transversal de la porción final de los canales de entrada 201a y 202a, cerca del orificio calibrado, está sustancialmente reducida con respecto al resto del canal 201b y 202b. La sección transversal de esta porción final 201a y 202a puede variar desde 25 hasta 1U04 pm2, preferiblemente desde 200 hasta 1U03 pm2, ventajosamente correspondiendo sustancialmente a la sección transversal del orificio calibrado. La sección transversal de las porciones iniciales de los canales de entrada puede variar desde 1 U 03 hasta 1 U06 pm2, preferiblemente desde 1 U04 hasta 1 U05 pm2, mientras que su longitud puede variar desde 50 mm hasta 1 mm, preferiblemente desde 2 mm hasta 5 mm. De manera similar, la sección transversal de la porción inicial 203a del canal de salida (correspondiente al canal calibrado en la figura 1) está también relativamente reducida; su sección está generalmente calibrada según el diámetro deseado de las micropartículas que deben prepararse (véase, por ejemplo, la Ref. 4). Por ejemplo, para preparar micropartículas monodispersadas con un diámetro medio de 5 pm, el orificio calibrado y el canal calibrado tendrán un área de sección transversal de aproximadamente 250 a 2500 pm2. Ventajosamente, las secciones transversales de los canales de entrada y la del canal de salida son sustancialmente iguales, así como la de sus respectivas porciones finales e iniciales. La longitud del canal calibrado 203a puede variar desde aproximadamente 0,05 mm hasta aproximadamente 10 mm, preferiblemente desde 1 mm hasta 5 mm, mientras que la longitud total del canal de salida puede ser de hasta 100 mm, preferiblemente hasta 50 mm y más preferiblemente hasta 30 mm. Normalmente, el chip se compone de dos mitades de vidrio de cuarzo, sílice fundida o cualquier material de plástico (por ejemplo, poli(metacrilato de metilo)). Los canales pueden producirse mediante el grabado, ya sea en seco o húmedo, de la superficie interna de cada mitad, para toda la profundidad y anchura deseadas. Por ejemplo, la superficie puede grabarse a una profundidad constante de 14 pm y con una anchura de 15-20 pm para las respectivas porciones calibradas cerca de la zona de contacto y una anchura de 0,5-1,0 mm para las porciones restantes. Chips disponibles comercialmente adecuados para el uso en el proceso de la invención están disponibles, por ejemplo, de Dolomite microfluidics (Royston, Reino Unido) o Micronit (Enschede, Países Bajos).
Según una realización preferida, con el fin de mantener la monodispersidad de las micropartículas formadas, la suspensión puede entonces enfriarse rápidamente hasta una temperatura por debajo de la Tm del material anfifílico, preferiblemente una vez que el flujo de la suspensión en la zona de recogida ha alcanzado una velocidad sustancialmente estacionaria.
Con referencia a la figura 3, una unidad 300 (por ejemplo, un chip tal como se describe en la figura 2) que comprende la porción de núcleo de un dispositivo de concentración de flujo puede mantenerse a la temperatura deseada cerca o ligeramente por encima de la Tm del material anfifílico, tal como se describió anteriormente, por ejemplo, por medio de un baño termostático. El primer flujo de fluido y los flujos de líquido que comprenden el material anfifílico se suministran a la unidad 300 desde respectivos depósitos 301 y 302 a la unidad 300 a través de respectivos tubos de suministro (con un diámetro interno de, por ejemplo, 100 a 1000 pm, preferiblemente desde 150 hasta 250 pm). El tubo de salida 303 conecta el canal de salida (no mostrado) de la unidad 300 (con un recipiente de recogida adecuado 304, por ejemplo, un vial sellado. Tal como se observó por parte del solicitante, es ventajoso empezar el enfriamiento de la suspensión de micropartículas en el plazo de pocos segundos desde la formación de las micropartículas, preferiblemente tan pronto como el flujo de la suspensión alcance una velocidad sustancialmente estacionaria. Normalmente, dicho enfriamiento puede iniciarse en el plazo de 180 segundos desde la formación de las microvesículas, preferiblemente en el plazo de 60 segundos, más preferiblemente en el plazo de 10 segundos e incluso más preferiblemente en el plazo de 2 segundos. Dependiendo de la geometría del dispositivo de concentración de flujo, el flujo estacionario se alcanza generalmente en el plazo de pocos milisegundos o incluso menos después de la formación de las micropartículas; por tanto, el enfriamiento puede aplicarse empezando desde 1 milisegundo tras la formación de las micropartículas. Ya que normalmente la suspensión de micropartículas alcanza la salida de la unidad 300 en el plazo de menos de pocos milisegundos tras la formación, el enfriamiento puede aplicarse ventajosamente a la porción inicial del tubo de salida que sale de la unidad 300. Por tanto, una porción inicial del tubo de salida se somete ventajosamente a enfriamiento mediante medios de enfriamiento adecuados 305, por ejemplo, un intercambiador de calor, con el fin de reducir la temperatura de la suspensión de micropartículas llenas de gas por debajo de la Tm del material anfifílico que forma la envuelta estabilizante de las microvesículas. La longitud de la porción inicial del tubo de salida sometida al enfriamiento puede variar, por ejemplo, desde 1 cm hasta 100 cm, preferiblemente desde 5 cm hasta 10 cm, dependiendo, por ejemplo, de la temperatura de calentamiento de la unidad 300, la eficacia del enfriamiento aplicado, el tiempo de contacto, etcétera.
Temperatura de transición
Cuando en el presente documento se hace referencia a la temperatura de transición (Tm) de un material anfifílico, dicha temperatura puede hacer referencia o bien a un único componente anfifílico o bien a una mezcla de componentes anfifílicos.
En particular, cuando el material anfifílico que forma la envuelta estabilizante es una mezcla de diferentes componentes anfifílicos, se hace referencia a dicha Tm generalmente como la Tm de dicha mezcla de componentes anfifílicos. Para una mezcla de materiales anfifílicos, la Tm medida corresponde generalmente a una media ponderada de relación molar de la Tm de los componentes individuales de la mezcla.
La temperatura de transición Tm de un lípido refleja un cambio en el estado físico del lípido de la fase en gel ordenada a la fase cristalina líquida desordenada. En la fase de gel, las cadenas hidrocarbonadas del lípido están extendidas completamente y empaquetadas estrechamente. En la fase líquida, las cadenas hidrocarbonadas están orientadas aleatoriamente y son similares a un fluido.
La Tm de una mezcla lipídica acuosa puede medirse ventajosamente usando calorimetría diferencial de barrido (DSC). El análisis calorimétrico o térmico permite la medición de flujos de calor relacionados con transiciones de un material en función del tiempo y de la temperatura, y en una atmósfera controlada. La DSC mide la diferencia del flujo de calor entre una muestra y una referencia inerte, calentando o enfriando una muestra a una tasa constante en °C/min. Las mediciones de Tm de materiales anfifílicos (puros o mezclas), incluyendo fosfolípidos, pueden realizarse, por ejemplo, usando un dispositivo DSC-Q2000 (TA Instruments, New Castle, DE, EE. UU.). Parámetros tales como la temperatura a la que empieza la transición y alcanza su pico y la entalpía de la transición se miden para determinar la Tm. Detalles de las mediciones se proporcionan en la parte experimental.
Materiales anfifílicos
Los materiales anfifílicos adecuados para su uso en un método de la invención comprenden, por ejemplo, fosfolípidos; lisofosfolípidos; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidónico o ácido oleico; lípidos que portan polímeros, tales como quitina, ácido hialurónico, polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG), también denominados “lípidos pegilados”; lípidos que portan mono- di-, oligo- o polisacáridos sulfonados; colesterol, sulfato de colesterol o hemisuccinato de colesterol; hemisuccinato de tocoferol; lípidos con ácidos grasos ligados a éter o éster; lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo; fosfato de dicetilo; ceramidas; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno (tales como estearatos de ácidos grasos de polioxietileno), alcoholes grasos de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitano polioxietilados, ricinoleato de glicerol-polietilenglicol, esteroles de soja etoxilados, copolímeros de bloque de aceite de ricino u óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO) etoxilados; ésteres de esterol de ácidos sacáricos incluyendo glucurónidos de colesterol, glucurónidos de lanosterol, glucurónido de 7-deshidrocolesterol, glucurónido de ergosterol, gluconato de colesterol, gluconato de lanosterol o gluconato de ergosterol; ésteres de ácidos sacáricos y alcoholes incluyendo laurilglucurónido, estearoilglucurónido, miristoilglucurónido, gluconato de laurilo, gluconato de miristoílo o gluconato de estearoílo; ésteres de azúcares con ácido alifáticos incluyendo laurato de sacarosa, laurato de fructosa, palmitato de sacarosa, estearato de sacarosa, ácido glucurónico, ácido glucónico o ácido poliurónico; saponinas incluyendo sarsasapogenina, esmilagenina, hederagenina, ácido oleanólico o digitoxigenina; glicerol o monoésteres de glicerol con ácidos grasos, incluyendo monopalmitato de glicerol, monoestearato de glicerol, monomiristato de glicerol o monolaurato de glicerol; alcoholes de cadena larga incluyendo alcohol n-decílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol cetílico o alcohol n-octadecílico; 6-(5-colesten-3p-iloxi)-1 -tio-p-D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5-colesten-3p-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio-p-D-galactopiranósido; 6-(5-colesten-3p-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1-tio-p-D-manopiranósido; ácido 12-(((7’-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoico; ácido N-[12-(((7’-dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)octadecanoil]-2-aminopalmítico; N-succinildioleilfosfatidiletanolamina; 1,2-dioleil-sn-glicerol; 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol; 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; 1 -hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina o palmitoilhomocisteína; alquilaminas o sales de alquilamonio, que comprenden al menos una cadena alquilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), tales como, por ejemplo, N-estearilamina, N,N’-diestearilamina, N-hexadecilamina, N,N’-dihexadecilamina, cloruro de N-estearilamonio, cloruro de N,N’-diestearilamonio, cloruro de N-hexadecilamonio, cloruro de N,N’-dihexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio terciario o cuaternario que comprenden una o preferiblemente dos cadenas acilo (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), ligadas al átomo de N a través de un puente de alquileno (C3-C6), tales como, por ejemplo, 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-diestearoil-3-dimetilamonio-propano (DSDAP); y mezclas o combinaciones de los mismos.
Al menos uno de los compuestos que forman la envuelta de las micropartículas es un fosfolípido, opcionalmente en mezcla con cualquiera de los otros materiales citados anteriormente. Según la presente descripción, el término fosfolípido pretende abarcar cualquier compuesto de fosfolípido anfifílico, cuyas moléculas sean capaces de formar una película estabilizante de material (normalmente en forma de una capa monomolecular), particularmente en la interfaz gas-agua en la suspensión de microvesículas final. Por consiguiente, estos materiales también se denominan en la técnica “fosfolípidos formadores de película”.
Los compuestos de fosfolípido anfifílicos contienen normalmente al menos un grupo fosfato y al menos uno, preferiblemente dos, grupos hidrocarbonados de cadena larga lipófilos.
Los ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen ésteres de glicerol con uno o preferiblemente dos residuos de ácidos grasos (iguales o diferentes) y con ácido fosfórico, estando el residuo de ácido fosfórico a su vez unido a un grupo hidrófilo, tal como, por ejemplo, colina (fosfatidilcolinas - PC), serina (fosfatidilserinas - PS), glicerol (fosfatidilgliceroles - PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas - PE), inositol (fosfatidilinositol). Los ésteres de fosfolípidos con solo un residuo de ácido graso se denominan generalmente en la técnica “liso”-formas del fosfolípido o “lisofosfolípidos”. Los residuos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos son en general ácidos alifáticos de cadena larga, que contienen normalmente desde 12 hasta 24 átomos de carbono, preferiblemente desde 14 hasta 22; la cadena alifática puede contener una o más insaturaciones o preferiblemente está completamente saturada. Ejemplos de ácidos grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Preferiblemente se emplean ácidos grasos saturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido araquídico.
Ejemplos adicionales de fosfolípidos son ácidos fosfatídicos, es decir los diésteres de glicerol-ácido fosfórico con ácidos grasos; esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir aquellos análogos de fosfatidilcolina en los que el residuo de diéster de glicerol con ácidos grasos está reemplazado por una cadena de ceramida; cardiolipinas, es decir los ésteres de 1,3-difosfatidilglicerol con un ácido graso; glicolípidos tales como gangliósidos GM1 (o GM2) o cerebrósidos; glucolípidos; sulfátidos y glicoesfingolípidos.
Tal como se usa en el presente documento, el término fosfolípidos incluye productos o bien que se producen de manera natural, o bien semisintéticos o bien preparados sintéticamente que pueden emplearse o bien individualmente o bien como mezclas.
Ejemplos de fosfolípidos que se producen de manera natural son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, normalmente, lecitinas de haba de soja o de yema de hueco.
Ejemplos de fosfolípidos semisintéticos son los derivados parcial o completamente hidrogenados de las lecitinas que se producen de manera natural. Fosfolípidos preferidos son diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol o de esfingomielina.
Ejemplos de fosfolípidos preferidos son, por ejemplo, dilauroil-fosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoil-fosfatidilcolina (DAPC), diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1 -miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1 -palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina (PMPC), 1 -palmitoil-2-estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1 -estearoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (SPPC), 1 -palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1 -oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidil-glicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidil-etanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoilfosfatidilserina (DMPS), diaraquidoilfosfatidilserina (DAPS), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoilesfingomielina (DPSP) y diestearoilesfingomielina (DSSP), dilauroil-fosfatidilinositol (DLPI), diaraquidoilfosfatidilinositol (DAPI), dimiristoilfosfatidilinositol (DMPI), dipalmitoilfosfatidilinositol (DPPI), diestearoilfosfatidilinositol (DSPI), dioleoil-fosfatidilinositol (DOPI).
Los fosfolípidos adecuados incluyen además fosfolípidos modificados mediante el ligado de un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG), a los mismos. Los fosfolípidos modificados con polímero preferidos incluyen “fosfolípidos pegilados”, es decir fosfolípidos unidos a un polímero de PEG. Ejemplos de fosfolípidos pegilados son fosfatidiletanolaminas pegiladas (“PE-PEG” de manera abreviada) es decir fosfatidiletanolaminas en las que el resto etanolamina hidrófilo está ligado a una molécula de PEG de peso molecular variable (por ejemplo, desde 300 hasta 20000 daltons, preferiblemente desde 500 hasta 5000 daltons), tal como DPPE-PEG (o DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG o DOPE-PEG). Por ejemplo, DPPE-PEG2000 se refiere a DPPE que tiene acoplado a la misma un polímero de PEG que tiene un peso molecular promedio medio de aproximadamente 2000.
Fosfolípidos particularmente preferidos son DAPC, DSPC, DPPC, DMPA, DPPA, DSPA, DMPG, DPPG, DSPG, DMPS, DPPS, DSPS y etil-DSPC. Los más preferidos son DPPG, DPPS y DSPC.
También pueden usarse mezclas de fosfolípidos, tales como, por ejemplo, mezclas de DPPE y/o DSPE (incluyendo derivados pegilados), DPPC, DSPC y/o dA pC con DSPS, d PpS, Ds Pa , DPPA, DSPG, DPPG, etil-DSPC y/o etil-DPPC.
Por ejemplo, una mezcla de fosfolípidos puede incluir derivados de fosfatidilcolina, derivados de ácido fosfatídico y fosfatidiletanolamina pegilada, por ejemplo, DSPC/DPPA/DPPE-PEG, DPPC/DPPA/DPPE-PEG, DSPC/DPPA/DSPE-PEG, DPPC/DPPA/DSPE-PEG, DAPC/DPPA/DPPE-PEG, DAPC/DPPA/DSPE-PEG, DSPC/DSPA/DPPE-PEG, DPPC/DSPA/DSPE-PEG, DSPC/DSPG/DPPE-PEG, DPPC/DSPG/DSPE-PEG.
Según una realización de la invención, el fosfolípido es el componente principal de la envuelta estabilizante de microvesículas, ascendiendo a al menos el 50% (p/p) de la cantidad total de componentes que forman la envuelta de las microvesículas llenas de gas, preferiblemente al menos el 75%. En algunas de las realizaciones preferidas, sustancialmente la totalidad de la envuelta (es decir al menos el 90% p/p) puede estar formada de fosfolípidos.
Los fosfolípidos pueden usarse convenientemente en mezcla con cualquiera de los compuestos anfifílicos listados anteriormente. Por tanto, por ejemplo, lípidos tales como colesterol, ergosterol, fitosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, galato de propilo o palmitato de ascorbilo, ácidos grasos tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico y derivados de los mismos, o hidroxitolueno butilado y/u otros compuestos no de fosfolípido pueden añadirse opcionalmente a uno o más de los fosfolípidos anteriores, por ejemplo, en proporciones que oscilan preferiblemente entre cero y el 50% en peso, más preferiblemente hasta el 25%. Por ejemplo, pueden usarse ventajosamente mezclas de materiales anfifílicos que comprenden fosfolípidos y ácidos grasos, incluyendo DSPC/DPPG/ácido palmítico, DSPC/DPPE-PEG/ácido palmítico, DPPC/DPPE-PEG/ácido palmítico, Ds PC/Ds PE-PEG/ácido palmítico, DPPC/DsPE-PEG/ácido palmítico, DSPC/DPPE-PEG/ácido esteárico, DPPC/DpPE-PEG/ácido esteárico, DsPC/DSPE-PEG/ácido esteárico o DPPC/DSPE-PEG/ácido esteárico.
Las micropartículas preparadas según el método de la invención pueden comprender opcionalmente un ligando de selección como diana.
El término “ligando de selección como diana” incluye dentro de su significado cualquier compuesto, resto o residuo que tiene, o que es capaz de fomentar, una actividad de selección como diana (por ejemplo, incluyendo una unión selectiva) de las micropartículas de una composición de la invención hacia cualquier sitio biológico o patológico dentro de un cuerpo vivo. Las dianas con las que puede asociarse el ligando de selección como diana incluyen tejidos tales como, por ejemplo, tejido miocárdico (incluyendo células miocárdicas y cardiomiocitos), tejidos membranosos (incluyendo endotelio y epitelio), láminas, tejido conjuntivo (incluyendo tejido intersticial) o tumores; coágulos de sangre; y receptores tales como, por ejemplo, receptores de la superficie celular para hormonas peptídicas, neurotransmisores, antígenos, fragmentos de complemento, e inmunoglobulinas y receptores citoplásmicos para hormonas esteroideas.
El ligando de selección como diana puede ser sintético, semisintético o producirse de manera natural. Los materiales o las sustancias que pueden servir como ligandos de selección como diana incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, proteínas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas receptoras, moléculas de unión a receptor, glicoproteínas y lectinas; péptidos, incluyendo oligopéptidos y polipéptidos; peptidomiméticos; sacáridos, incluyendo mono y polisacáridos; vitaminas; esteroides, análogos de esteroides, hormonas, cofactores, agentes bioactivos y material genético, incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.
El ligando de selección como diana puede ser un compuesto anfifílico en sí (que está mezclado con los otros componentes de la microvesícula) o un compuesto unido a una molécula anfifílica (por ejemplo, un fosfolípido) empleada para la formación de las micropartículas.
En una realización preferida, el ligando de selección como diana puede estar unido a una molécula anfifílica (por ejemplo, un fosfolípido) que forma la envuelta estabilizante de las micropartículas a través de un enlace covalente. Con el fin de unirse covalentemente a un ligando de selección como diana deseado, al menos parte del compuesto anfifílico que forma la envuelta de las micropartículas contendrá por tanto un resto reactivo adecuado y el ligando de selección como diana que contiene la funcionalidad complementaria se ligará al mismo según técnicas conocidas, por ejemplo, añadiéndolo a una dispersión que comprende los componentes anfifílicos de las micropartículas. Preferiblemente, el compuesto anfifílico es un lípido que porta un polímero hidrófilo, tal como los mencionados previamente, preferiblemente un fosfolípido pegilado. En este caso, el ligando de selección como diana está ligado a un resto reactivo adecuado sobre el polímero hidrófilo. El compuesto anfifílico puede combinarse con el ligando de selección como diana deseado antes de preparar la microvesícula, y la combinación así obtenida puede usarse para la preparación de la microvesícula. Alternativamente, en primer lugar puede fabricarse una microvesícula, que comprende un compuesto (lípido o lípido modificado con polímero) que tiene un resto adecuado capaz de interaccionar con un resto complementario correspondiente de un ligando de selección como diana; después, el ligando de selección como diana deseado se añade a la suspensión de microvesículas, para unirse al resto complementario correspondiente sobre la microvesícula. Según una realización alternativa, el ligando de selección como diana también puede asociarse de manera adecuada con las micropartículas a través de interacciones físicas y/o electroestáticas.
Flujo de líquido
El líquido usado en el método de la invención comprende un material anfifílico (tal como se definió anteriormente) a una concentración de, por ejemplo, desde 5,0 hasta 20 mg/ml, preferiblemente desde 7,5 hasta 15 mg/ml, preferiblemente dispersado en un portador acuoso.
Los portadores acuosos adecuados, que preferiblemente son fisiológicamente aceptables, comprenden agua (preferiblemente agua estéril), disoluciones acuosas tal como solución salina (que puede estar ventajosamente equilibrada de modo que el producto final para inyección no sea hipotónico), o disoluciones de una o más sustancias de ajuste de la tonicidad. Las sustancias de ajuste de la tonicidad comprenden sales o azúcares, alcoholes sacáricos, glicoles u otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares), derivados de quitosano, tales como carboximetilquitosano, trimetilquitosano o compuestos gelificantes, tales como carboximetilcelulosa, hidroxietilalmidón o dextrano.
En una realización alternativa, puede añadirse una fase de aceite adicional para incorporar sustancias hidrófobas terapéuticas a las microvesículas. Con este propósito, pueden proporcionarse dos conductos adicionales en el dispositivo para suministrar la fase de aceite deseada, tal como se describe, por ejemplo, por la Ref. 5. Por tanto, las microvesículas llenas de gas formadas tendrán una película de aceite dispuesta en la interfaz entre el gas y la capa estabilizante de material anfifílico, que puede cargarse con un agente terapéutico deseado. Los aceites adecuados pueden incluir cualquier aceite biocompatible que sea líquido a temperatura ambiente incluyendo, por ejemplo, mono­ , di- o tri-ésteres de glicerol con cadenas alquilo (C2-C18) saturadas o insaturadas (incluyendo homo- o heteroésteres alquílicos), tal como glicerolmonobutirina, monolinoleato de glicerol, 1,2-dihexanoilglicerol, 1,2-dioctanoilglicerol, 1,2-dioleil-sn-glicerol, triacetina, tributirina, tricaproína, tricaprilina, tricaprina y mezclas de los mismos; o aceites naturales tales como aceite de soja, aceite de oliva, aceite de semilla de cártamo, aceite de girasol, aceite de cacahuete y mezclas de los mismos.
Primer flujo de fluido
En el proceso de la invención, cualquier gas biocompatible, precursor de gas o mezcla de los mismos puede emplearse para la preparación de las microvesículas (identificado a continuación en el presente documento también como “gas formador de microvesículas”).
El gas puede comprender, por ejemplo, aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas noble o inerte tal como helio, argón, xenón o kriptón; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, que contiene hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, propano, butano, isobutano, pentano o isopentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno, buteno o isobuteno, o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; gases halogenados, preferiblemente gases fluorados, tales como o hidrocarburos halogenados, fluorados o perfluorados de bajo peso molecular (por ejemplo, que contienen hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Cuando se usa un hidrocarburo halogenado, preferiblemente al menos algunos de, más preferiblemente todos, los átomos de halógeno en dicho compuesto son átomos de flúor.
Se prefieren los gases fluorados, en particular los gases perfluorados. Los gases fluorados incluyen materiales que contienen al menos un átomo de flúor tal como, por ejemplo, hidrocarburos fluorados (compuestos orgánicos que contienen uno o más átomos de carbono y flúor); hexafluoruro de azufre; cetonas fluoradas, preferiblemente perfluoradas, tal como perfluoroacetona; y éteres fluorados, preferiblemente perfluorados, tal como perfluorodietil éter. Los compuestos preferidos son gases perfluorados, tales como SF6 o perfluorocarburos (hidrocarburos perfluorados), es decir hidrocarburos en los que todos los átomos de hidrógeno están reemplazados por átomos de flúor, de los que se conoce que forman suspensiones de microvesículas llenas de gas particularmente estables.
El término perfluorocarburo incluye perfluorocarburos saturados, insaturados y cíclicos. Ejemplos de perfluorocarburos biocompatibles, fisiológicamente aceptables, son: perfluoroalcanos, tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (por ejemplo, perfluoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tal como perfluoro-isobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos o perfluoroheptanos; perfluoroalquenos, tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (por ejemplo, perfluorobut-2-eno) o perfluorobutadieno; perfluoroalquinos (por ejemplo, perfluorobut-2-ino); y perfluorocicloalcanos (por ejemplo, perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano). Los perfluorocarburos saturados preferidos incluyen, por ejemplo, CF4, C2F6, C3F8 , C4F8, C4F10, C5 F12 y C6F14.
También puede ser ventajoso usar una mezcla de cualquiera de los gases anteriores en cualquier relación. Por ejemplo, la mezcla puede comprender un gas convencional, tal como nitrógeno, aire o dióxido de carbono, y un gas que forma una suspensión de microvesículas estable, tal como hexafluoruro de azufre o un perfluorocarburo tal como se indicó anteriormente. Ejemplos de mezclas de gases adecuadas pueden encontrarse, por ejemplo, en la Ref. 6. Las siguientes combinaciones se prefieren particularmente: una mezcla de gases (A) y (B) en la que el gas (B) es un gas fluorado, seleccionado de entre los ilustrados previamente, incluyendo mezclas de los mismos, y (A) se selecciona de aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono o mezclas de los mismos. La cantidad de gas (B) puede representar desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 95% v/v de la mezcla total, preferiblemente desde aproximadamente el 5% hasta el 80%.
Gases particularmente preferidos son SF6, C3F8 , C4F10 o mezclas de los mismos, opcionalmente en mezcla con aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono o mezclas de los mismos.
En ciertas circunstancias, puede ser deseable incluir un precursor en una sustancia gaseosa (es decir un material que es capaz de convertirse en un gas in vivo). Preferiblemente, el precursor gaseoso y el gas derivado del mismo son fisiológicamente aceptables. El precursor gaseoso puede activarse por pH, fotoactivarse, activarse por temperatura, etc. Por ejemplo, ciertos perfluorocarburos pueden usarse como precursores gaseosos activados por temperatura. Estos perfluorocarburos, tales como perfluoropentano o perfluorohexano, tienen una temperatura de transición de fase líquida/gaseosa por encima de la temperatura ambiente (o la temperatura a la que los agentes se producen y/o almacenan) pero por debajo de la temperatura corporal; por tanto, experimentan una transición de fase líquida/gaseosa y pueden convertirse en un gas dentro del cuerpo humano.
Uso
Las micropartículas preparadas según el método de la invención pueden usarse en una variedad de técnicas de diagnóstico y/o terapéuticas, incluyendo en particular ultrasonidos y resonancia magnética.
Las técnicas de diagnóstico incluyen cualquier método en el que el uso de las microvesículas llenas de gas permita potenciar la visualización de una porción o de una parte de un cuerpo de un animal (incluyendo humanos), incluyendo la formación de imágenes para fines de investigación preclínica y clínica. Una variedad de técnicas de formación de imágenes puede emplearse en aplicaciones de ultrasonidos, por ejemplo, incluyendo formación de imágenes en modo B fundamental y armónica, formación de imágenes por inversión de modulación de amplitud, del pulso o de la fase y formación de imágenes Doppler fundamental y armónica; si se desea pueden usarse técnicas de formación de imágenes tridimensionales.
Las microvesículas para uso diagnóstico pueden administrarse (por ejemplo, mediante inyección) a una concentración de desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1,0 gl de gas por kg de paciente, dependiendo, por ejemplo, de su respectiva composición, el tejido u órgano del que deben formarse imágenes y/o la técnica de formación de imágenes elegida. Este intervalo de concentración general puede naturalmente variar dependiendo de aplicaciones de formación de imágenes específicas, por ejemplo, cuando pueden observarse señales a dosis muy bajas tal como en formación de imágenes por inversión de la modulación de amplitud y del pulso.
Otras aplicaciones de formación de imágenes de diagnóstico posibles incluyen gammagrafía, formación de imágenes por luz y formación de imágenes por rayos X, incluyendo formación de imágenes de contraste de fase por rayos X.
Las técnicas terapéuticas incluyen cualquier método de tratamiento (tal como se definió anteriormente) de un paciente que comprenda el uso de micropartículas o bien tal cual (por ejemplo, tratamiento mediado por ultrasonidos de accidentes cerebrovasculares isquémicos, lisis de coágulos, etc.) o bien en combinación con un agente terapéutico (por ejemplo, para la administración de un compuesto bioactivo a un sitio o tejido seleccionado, tal como en terapia génica o en el uso como vacuna), y que sea capaz de ejercer o sea responsable de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo, ya sea por sí mismo o tras una activación específica mediante diversos métodos físicos (incluyendo, por ejemplo, administración mediada por ultrasonidos).
Las microvesículas para tratamientos terapéuticos pueden administrarse normalmente en una concentración de desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5,0 gl de gas por kg de paciente, dependiendo, por ejemplo, de su respectiva composición, del tipo de sujeto bajo tratamiento, del tejido u órgano que debe tratarse y/o del método terapéutico aplicado.
Los siguientes ejemplos ayudarán a ilustrar adicionalmente la invención.
EJEMPLOS
Materiales
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Ejemplo 1
Preparación de dispersiones acuosas de material anfifílico
Se usaron dos mezclas de materiales anfifílicos con diferentes temperaturas de transición de fase (Tm):
M1: DSPC:DPPA:DPPE-PEG5000 (Tm= 55°C)
M2: DPPC:DPPA:DPPE-PEG5000 (Tm= 44°C)
ambas en una relación molar de 8:1:1.
Los materiales se añadieron con las relaciones molares anteriores a una concentración de 20 mg/ml a una mezcla de cloroformo/metanol 2:1 (relación en volumen) con agitación a 60°C hasta la disolución completa del material anfifílico. El disolvente se evaporó entonces a presión reducida y la película obtenida se secó durante la noche a presión reducida. El material secado se redispersó entonces (a concentraciones de desde 5 hasta 15 mg/ml, tal como se detalla en la parte “preparación de microvesículas”) en una mezcla de glicerol, propilenglicol y agua (GPW, relación en volumen de 5:5:90) a 60°C con agitación durante 30 minutos. Se añadió tampón TRIS (20 mM) para ajustar el valor de pH a 7. La dispersión se sonicó entonces usando un sonicador de punta (Branson Sonifier 250) para dispersar homogéneamente el material. Las preparaciones se filtraron entonces usando un filtro de policarbonato (tamaño de poro de 0,45 gm), se enfriaron hasta temperatura ambiente y se desgasificaron.
Medición de la temperatura de transición
Se determinaron las temperaturas de transición de materiales anfifílicos (DPPC o DSPC puras y mezclas de DPPC:DPPA:DPPE-PEG5000 o DSPC:DPPA:DPPE-PEG5000) usando la calorimetría diferencial de barrido comercial DSC-Q2000, con crisoles de aluminio Tzero (TA Instruments, New Castle, DE, EE. UU.). La calibración del sistema, incluyendo la temperatura y el flujo de calor, se llevó a cabo con metal indio (entalpía de fusión 28,71 J/g ± 0,5 J/g; temperatura de inicio de fusión 156,6°C ± 0,25°C).
Se prepararon dispersiones del material anfifílico (puro o mezclas) en GPW/TRIS según el procedimiento descrito anteriormente para las mediciones de DSC (aproximadamente 30 gl en cada caso, concentración 10 mg/ml).
Se llevaron a cabo mediciones de DSC calentando a una tasa de temperatura constante de 2°C/min a lo largo de un intervalo de temperatura de desde 20°C hasta 80°C. Se usó nitrógeno como gas de purgado a una tasa de flujo de 50 ml/min.
Los resultados se ilustran en la tabla a continuación:
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 2
Preparación de microvesículas llenas de gas
Se sintetizaron microvesículas usando un dispositivo de concentración de flujo microfluídico disponible comercialmente (Dolomite microfluidics, chip de gotas pequeñas, profundidad de grabado de 14 gm, n.° de pieza 3200136), montado en un soporte de chip disponible comercialmente (Dolomite microfluidics, números de pieza: 3000024, 3000109, 3000021) que permite la conexión estanca del chip a los tubos de suministro de gas y de líquido (Peek Upchurch, 1/16 pulgada de D.E., 150 gm de D.I.). El canal de formación de microvesículas tenía una anchura de 17 gm y una longitud de 135 gm. La profundidad de canal global era de 14 gm. El chip y su soporte se pusieron en un baño de agua de temperatura controlada ópticamente transparente que se montó sobre un microscopio invertido equipado con un objetivo de aumento de 20 veces (Olympus, LMPLAN 20x) y una cámara CCD (Lumenera, LM156M). La tasa de flujo conjunto de líquido se controló usando una bomba de jeringa (Harvard PHD4400). La presión del gas (SF6) se controló usando un regulador de presión (Omega, PRG101-25) conectado a un sensor de presión (Omega, DPG1000B-30G). Las microvesículas individuales se detectaron automáticamente a partir de las imágenes ópticas registradas para medir sus tamaños fuera de línea en un PC usando software Matlab (The Mathworks Inc., Natick, MA). Se sometieron a prueba dos tasas de flujo conjunto de líquido diferentes (45 gl/min o 55 gl/min) para hacer funcionar el dispositivo de concentración de flujo bajo el régimen de goteo o bajo el régimen de chorro más preferido, respectivamente.
La suspensión de microvesículas se recogió en un vial sellado y se almacenó a temperatura ambiente.
Efectos de calentar las microvesículas formadas
Las figuras 4a a 4e muestran los resultados obtenidos usando un flujo conjunto de líquido de la suspensión de DSPC/DPPA/DPPE-PEG5000 (T m 55°C) tal como se preparó anteriormente, con concentraciones de material anfifílico que oscilaban entre 5 y 15 mg/ml (fig. 4a-4e, respectivamente) y a diferentes temperaturas del baño termostático que contenía el chip microfluídico (similar al ilustrado en la figura 2). Los cuadrados (■) indican experimentos realizados bajo el régimen de goteo, mientras que los triángulos (▲) indican experimentos realizados bajo el régimen de chorro más preferido.
Como puede observarse en estas figuras, el porcentaje de coalescencia (C [%]) de las microvesículas es generalmente menor en el régimen de goteo en comparación con el régimen de chorro. Además, bajo ambos regímenes, de goteo y de chorro, el efecto ventajoso de reducir la coalescencia aumentando la temperatura es evidente. Considerando en particular el régimen de chorro, para concentraciones de 7,5 mg/ml (fig. 4b) aumentar la temperatura hasta la Tm de la mezcla anfifílica (55°C), o más, da como resultado una coalescencia de microvesículas de aproximadamente el 10% o menos. Concentrándose todavía en el régimen de chorro, el mismo calentamiento hasta o por encima de la Tm del material anfifílico proporciona una coalescencia de menos del 1% para concentraciones del material anfifílico de 10 mg/ml (fig. 4c). Aumentado la concentración del material anfifílico hasta 15 mg/ml (fig. 4e), pueden obtenerse resultados similares a temperatura ambiente. Obsérvese que en este caso es necesario aumentar la concentración del material anfifílico en un 50%.
Por tanto, estos resultados demuestran que manteniendo la temperatura alrededor de la Tm del material anfifílico puede obtenerse una reducción del efecto de coalescencia (en comparación con una coalescencia mayor medida para la misma preparación a temperaturas menores). Los resultados muestran además que manteniendo la temperatura alrededor de la Tm del material anfifílico pueden obtenerse porcentajes de coalescencia similares usando concentraciones sustancialmente menores de materiales anfifílicos (en comparación con las concentraciones mayores necesarias si no se aplica calentamiento).
La figura 5 muestra los resultados obtenidos usando un flujo conjunto de líquido de la suspensión de DPPC/DPPA/DPPE-PEG5000 (Tm 44°C) tal como se preparó anteriormente, con concentraciones de material anfifílico de 10 mg/ml a diferentes temperaturas del baño termostático. De manera similar, con respecto a los resultados discutidos anteriormente, también se obtiene en este caso una coalescencia del 1% o menos cuando se calienta hasta una temperatura cerca de o mayor que la Tm del material anfifílico.
Efectos del enfriamiento aguas abajo de la suspensión
Para evaluar los efectos del enfriamiento aguas abajo sobre la dispersidad de las microvesículas se sometieron a prueba diferentes condiciones de enfriamiento.
Según la configuración A (suspensión enfriada de manera temprana), la suspensión se hizo pasar a través de un intercambiador de calor (a 20°C) 3 ms tras la formación de microvesículas, para reducir repentinamente la temperatura de la suspensión por debajo de la Tm, particularmente a temperatura ambiente. Por consiguiente, el tubo que sale del chip en el baño termostático se hizo pasar a través de un intercambiador de calor tras aproximadamente 0,5 mm de la salida del chip.
Según la configuración B (suspensión enfriada de manera tardía), la suspensión se hizo pasar a través del mismo intercambiador de calor solo 3 minutos tras la formación de microvesículas. Por consiguiente, en esta segunda configuración, el tubo que sale del chip se reemplazó por un tubo con un diámetro interno de 1 mm y este tubo se mantuvo en el baño termostático durante una longitud de aproximadamente 20 cm y entonces se hizo pasar a través de un intercambiador de calor.
Ambas configuraciones se sometieron a prueba a tasas de flujo de 55, 65 y 75 pl/min y los resultados se ilustran en las figuras 6a, 6b y 6c, respectivamente (eje X = diámetro en mm, eje Y = recuento relativo de microvesículas en número). En las figuras 6a-6c, las líneas discontinuas muestran las distribuciones de tamaños de preparaciones enfriadas de manera tardía, mientras que las líneas continuas muestran las distribuciones de tamaños de preparaciones enfriadas de manera temprana. Resulta evidente a partir de estas figuras que el PDI de la suspensión enfriada de manera temprana es menor en comparación con la de la suspensión enfriada de manera tardía correspondiente. Además, puede apreciarse a partir de estas figuras que el tamaño medio de las microvesículas disminuye con una velocidad de flujo creciente.
Pueden obtenerse resultados similares con otras mezclas de materiales anfifílicos, particularmente aquellas combinaciones de materiales anfifílicos ilustradas previamente.
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un método para preparar una suspensión de microvesículas llenas de gas estabilizadas mediante una capa de material anfifílico que comprende un fosfolípido, comprendiendo dicho método:
    - proporcionar un primer flujo de fluido y, por separado, un flujo de líquido que comprende dicho material anfifílico, siendo dicho primer flujo de fluido un gas;
    - dirigir dicho primer flujo de fluido y dicho flujo de líquido a través de respectivos canales de entrada hacia una zona de contacto;
    - dirigir dicho primer flujo de fluido y dicho flujo de líquido desde la zona de contacto a través de un orificio calibrado para obtener una suspensión que comprende dichas microvesículas; y
    - dirigir dicha suspensión que comprende dichas microvesículas hacia un canal de salida;
    en el que una porción inicial de dicho canal de salida se mantiene a una temperatura controlada (°C) de no menos del 20% menor con respecto a la temperatura de transición del material anfifílico.
  2. 2. - El método según la reivindicación 1, en el que la temperatura controlada (°C) es no menos del 10% menor con respecto a la temperatura de transición del material anfifílico.
  3. 3. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha porción inicial se extiende por una longitud suficiente para que la suspensión acuosa alcance una velocidad sustancialmente estacionaria en el canal de salida.
  4. 4. - El método según la reivindicación 3, en el que dicha porción inicial se extiende desde 0,1 mm hasta 100 mm desde el orificio calibrado.
  5. 5. - El método según la reivindicación 3, en el que dicha porción inicial se extiende desde 1 mm hasta 50 mm desde el orificio calibrado.
  6. 6. - El método según la reivindicación 3, en el que dicha porción inicial se extiende desde 2 mm hasta 30 mm desde el orificio calibrado.
  7. 7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la zona de contacto y el orificio calibrado se mantienen también a dicha temperatura controlada.
  8. 8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la suspensión que comprende las microvesículas se enfría posteriormente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición del material anfifílico.
  9. 9. - El método según la reivindicación 8, en el que dicho enfriamiento se efectúa en el plazo de 60 segundos desde la formación de las microvesículas.
  10. 10. - El método según la reivindicación 8, en el que dicho enfriamiento se efectúa en el plazo de 5 segundos desde la formación de las microvesículas.
  11. 11. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la suspensión se enfría a una temperatura (°C) al menos el 5% menor que la temperatura de transición del material anfifílico.
  12. 12. - El método según la reivindicación 11, en el que la suspensión se enfría a una temperatura (°C) al menos el 10% menor que la temperatura de transición del material anfifílico.
  13. 13. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho fosfolípido se selecciona de diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol o de esfingomielina.
  14. 14. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho gas comprende un gas fluorado.
  15. 15. - El método según la reivindicación 14, en el que dicho gas es una mezcla de gases (A) y (B), en la que el gas (B) es un gas fluorado y el gas (A) se selecciona de aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono o mezclas de los mismos.
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