KR20050096959A - 초음파 조영제 및 그것의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

동결건조된 매트릭스를 제조하는 방법, 및 그것의 복원으로, 인지질에 의해서 주로 안정화된 기체-충전 마이크로버블의 액체 수성 현탁액을 포함하는 각각의 주사가능한 조영제. 방법은 수성 매질, 인지질, 및 물과 섞이지 않는 유기 용매로 에멀젼을 제조하는 것을 포함한다. 에멀젼을 그 후에 동결-건조시키고, 이어서 기체-충전 마이크로버블의 수성 현탁액으로 복원시킨다.
방법은 상대적으로 작은 직경 및 좁은 영역의 크기 분포를 갖는 마이크로버블을 포함하는 현탁액을 얻게 한다.

Description

초음파 조영제 및 그것의 제조방법{ULTRASOUND CONTRAST AGENTS AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}
본 발명은 진단 이미징에 사용되는 기체 함유 조영제를 제조하는 데 유용한 건조 또는 동결건조 제제의 제조 방법 및 상기 기체 함유 조영제의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이러한 방법으로 제조된 건조 제제를 포함하고, 이 제제는 진단 이미징에 유용한 조영제 현탁액을 생성하도록 가공될 수 있다. 본 발명은 용기 또는 본 발명의 건조 제제를 함유하는 두 가지 성분 키트 뿐만 아니라, 본 발명의 건조 제제를 사용하여 제조되는 진단 이미징에 유용한 기체 충전 마이크로버블의 현탁액을 더 포함한다.
최근 몇 년 동안 초음파 조영제의 빠른 발달은 많은 다른 제제를 산출했고, 이 제제는 인체의 기관 및 조직 또는 동물의 몸의 초음파 이미징에 유용하다. 이 제제는 예를 들어서, B-모드 이미지 형성 (후방산란 조직 성질의 공간 분포에 근거함) 또는 도플러 신호 프로세싱 (혈액 또는 액체의 흐름 파라미터를 측정하는데 연속파 또는 초음파 에코의 펄스된 도플러 프로세싱에 근거함) 등을 이용하는 의학적인 초음파 진단 기기의 사용과 관련된 정맥내 또는 동맥속 주사 가능 물질로서 주로 사용되도록 디자인되었다.
초음파 조영제로서 유용한 주사가능한 제제의 부류는 수성매질에 분산된 몇 미크론의 직경을 갖는 기체 기포의 현탁액을 포함한다.
효율적인 초음파 반사체로서의 담체 액체중의 기체 기포의 현탁액의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 초음파 이미징을 향상시키는 초음파 진단 약제학 제제로서 마이크로버블 현탁액의 발달이, 수용액의 신속한 정맥내주사가 용해된 기체가 기포를 생성함으로써 용액 밖으로 나오도록 야기시킨다는 초기의 관찰에 이어 일어났다. 혈액에 대한 음향 임피던스에 현저한 차이로 인해, 이러한 혈관내 기체 기포는 초음파의 우수한 반사체가 된다는 것을 발견했다. 담체 액체중의 기체 기포의 현탁액의 생체 혈류로의 주입은 초음파 검사(진단) 이미징을 증강시켜, 내부 기관의 시각화를 증강시킨다. 기관 및 깊이 위치한 조직의 이미징이 의학적인 진단을 확립하는데 중요할 수 있기 때문에, 제조되고 투여되기 용이하면서도 동시에 비활성화된 종을 최소로 포함하면서 장시간 보존이 가능하고 배포가 용이한 고농도 기체 기포의 안정된 현탁액을 개발하기 위하여 많은 노력이 기울여져왔다.
그러나, 수성 매질내의 자유 기체 기포의 단순한 분산물은, 통상적으로 이러한 기포가 초음파 조영제로서 유용할 정도로 안정되지 않았기 때문에, 실용적인 관심이 제한된다.
따라서, 예를 들어서, 초음파 촬영술 및 다른 초음파 연구를 위한 기체 기포를 안정화시키는 방법, 예를 들어서 유화제, 오일, 농화제 또는 당류를 사용, 또는 다양한 시스템에서의 기체 또는 그것의 전구체의 포획 또는 캡슐화 등이, 관심이 되어 왔다. 이러한 안정한 기체 기포는 통상적으로 당업계에서 "미세소포"로 지칭되며, 두 가지 주 부류로 분류할 수 있다.
안정한 기포 또는 미세소포의 제 1 부류는 통상적으로 당업계에서 "마이크로버블"이라고 지칭되며, 수성 현탁액을 포함하며, 이 현탁액에서 기체의 기포는 기체에서 액체 계면으로 배열되는 표면활성제(즉 양친매성 물질)를 수반하는 매우 얇은 주머니에 의해서 기체/액체 계면에서 위치하게 된다. 미세소포의 두 번째 부류는 통상적으로 당업계에서 "마이크로벌룬" 또는 "마이크로캡슐"이라고 지칭되며, 현탁액을 포함하며, 이 현탁액에서 기체의 기포는 천연 또는 합성 중합체로 만들어진 고형 재질의 주머니에 의해서 둘러싸여 있다. 마이크로벌룬 및 그것의 제제의 예는 예를 들어서, 유럽 특허 출원 EP 0458745에 개시되어 있다. 초음파 조영제의 다른 종류는, 마이크로입자의 세공 내에 포획된 기체 기포를 운반하는, 중합체 또는 다른 고체의 다공성 마이크로입자의 현탁액을 포함한다. 본 발명은 특히 기체 마이크로버블, 즉 양친매성 물질층에 의해서 본질적으로 안정화된 미세소포인 마이크로버블의 수성 현탁액을 포함하는 진단 이미징용 조영제와 관련된다.
전형적으로 마이크로버블 현탁액은 예를 들어서, 동결건조된 리포솜 또는 동결건조 또는 분무건조된 인지질 현탁액 등의 분말화된 양친매성 물질을 공기 또는 다른 기체와 접촉시킨 다음 수성담체와 접촉시킨 다음 교반하여 마이크로버블 현탁액을 생성시키는데 이것은 그 다음에 제조 후 곧바로 투여되어야 한다.
기체 마이크로버블의 수성 현탁액과 그것의 제제의 예는 예를 들어서 미국 특허 제 5,271,928호, 제 5,445,813호, 제 5,413,774호, 제 5,556,610호, 및 제5,597,549호, 제 5,827,504호에서 찾아볼 수 있다.
WO97/29783은 기체 마이크로버블 현탁액을 제조하는 다른 방법을 개시하며, 적합한 인지질 함유 수성 매질에 기체 마이크로버블 분산물을 생성시킨 후, 분산물을 동결건조하여 건조된 복원가능한 제품을 산출하도록 하는 것을 포함한다. 이렇게 제조되어 건조된 제품은 수성 매질에서 복원가능하고 최소의 교반만을 요한다. 상기문헌에서 앞서 언급된 바와 같이, 이렇게 제조된 마이크로버블의 크기는 일정하게 재현될 수 있고, 실제로 복원하는 동안 가해지는 교반 에너지량과 무관하며, 초기의 마이크로버블 분산물에서 형성된 마이크로버블의 크기에 의해서 결정된다. 그렇지만, 본 출원인은, 인지질 함유 수성 매질중에 기체 마이크로버블 분산물을 형성시키는데 적용되는 교반 에너지량은, 작은 직경의 마이크로버블을 얻기 위한 경우에 특히, 과도하게 높을 수 있다는 것을 관찰했다 (예를 들면, 부피 평균 직경이 약 3 ㎛인 기포의 분산물을 얻기 위하여, 10 분 동안 23000 rpm). 이렇게 높은 교반 에너지는 마이크로버블의 수성 분산물중에서 국부적인 과열을 일으키기도 하고, 결과적으로 수성 매질중에 함유된 인지질의 분해를 일으킬 수 있다. 게다가, 과도하게 높은 교반 에너지의 영향은 통상적으로 제어하기 어렵고, 최종 마이크로버블의 조절할 수 없는 크기의 분포를 유발한다. 더 나아가서, 이러한 방법은 마이크로버블이 생성되는 동안 수성 매질로의 기체의 연속적인 흐름을 수반하므로, 그에 따른 기체량의 사용을 요한다.
WO 94/01140은 수성 매질에서 복원가능한 미세소포 현탁액을 제조하는 방법을 또한 개시하며, 이것은 비경구적으로 허용되는 유화제, 비극성 액체 및 지용성 또는 수불용성인 "구조-빌더"를 함유한 수성 에멀젼을 냉동건조시키는 것을 포함한다. 폴록사머 및 인지질이 비경구적으로 허용되는 유화제로서 언급되어있고, 이들 두 가지의 혼합물이 작업 실시예에서 사용되었다. 콜레스테롤은 바람직한 수불용성인 구조-빌더이고, 작업 실시예에서 사용되었다. 그 다음에, 냉동건조된 생성물은 물로 복원되어 기체 충전 미세소포의 수성 현탁액을 산출한다. 따라서, 복원 단계의 결과인 기체 충전 미세소포는 폴록사머와 같은 유화제 및 콜레스테롤과 같은 수불용성인 구조-빌더를 포함하는 다른 물질의 주머니에 의해서 정의된다.
이 방법은 상기에서 4 ㎛보다 더 작은, 바람직하게는 2 ㎛ 보다 작은, 0.5 ㎛까지의 입자 크기를 갖는 에멀젼을 산출한다고 한다. 그렇지만, 본 출원인은 복원 단계가 2 ㎛ 보다 작은 수 평균 직경을 갖는 미세소포를 최종적으로 산출할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 미세소포 집단의 대응하는 크기의 분포가 상대적으로 넓은 영역에 존재한다는 것을 인지했다. 게다가, 상기 방법을 통해서 얻어진, 에멀젼 마이크로입자를 기체 마이크로버블로 전환시키는 단계는 낮은 수율을 초래한다.
본 출원인은 인지질이 상기 에멀젼의 주 유화제로 사용되었고, 상기 방법이 상기 수불용성인 구조-빌더의 실질적인 부재하에서 수행되었을 경우, 마이크로버블 크기가 훨씬 더 좁은 영역에 분포할 수 있다는 것을 최근에 발견했다. 더욱이, 상기 수불용성인 구조-빌더의 실질적인 부재는 에멀젼 마이크로입자에서 기체 마이크로버블로의 전환 수율을 실질적으로 증가시킬 수 있다. 더 나아가서, 본 출원인은 인지질이 에멀젼에 존재하는 본질적으로 유일한 유화제일 경우, 상기 방법이 마이크로버블을 훨씬 더 좁은 영역에 분포하게 하고, 수율을 증가시킬 수 있다는 것을 또한 관찰했다.
본 출원인은 또한 상기 상술된 과정 중에 다소 낮은 교반 에너지를 수성-유기 에멀젼에 적용시킴으로써, 매우 작은 직경을 갖는 마이크로버블 및 크기 분포의 감소를 얻을 수 있다는 것을 발견했다.
발명의 개요
본 발명의 양태는 수성 담체 액체 및 기체와 접촉시 인지질에 의해서 현저히 안정화된 기체 충전 마이크로버블의 현탁액으로 복원가능한 동결건조된 매트릭스를 제조하는 방법과 관련이 되며, 상기 방법은:
a) i) 수성 매질, ii) 물과 실질적으로 비혼화성인 유기용매; iii) 50 중량%의 인지질을 포함하는 양친매성 물질의 유화 조성물 및 iv) 동결건조보호제를 포함하는 수성-유기 에멀젼을 제조하는 단계;
b) 상기 유화된 혼합물을 동결건조시켜 상기 인지질을 포함하는 동결건조된 매트릭스를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 인지질에 의해서 현저히 안정화된 기체 충전 마이크로버블의 액상 현탁액을 포함하는 주사가능한 조영제를 제조하는 방법과 관련되고, 이 방법은:
a) i) 수성 매질, ii) 물과 실질적으로 비혼화성인 유기용매; iii) 50 중량%의 인지질을 포함하는 양친매성 물질의 유화 조성물 및 iv) 동결건조보호제를 포함하는 수성-유기 에멀젼을 제조하는 단계;
b) 상기 유화된 혼합물을 동결건조시켜 상기 인지질을 포함하는 동결건조된 매트릭스를 얻는 단계를 포함한다.
c) 상기 동결건조된 매트릭스를 생적합성 기체와 접촉시키는 단계;
d) 상기 동결건조된 매트릭스를 생리학적으로 허용되는 수성 담체 액체에 용해시킴으로써 복원시켜 상기 인지질에 의해서 현저히 안정화되는 기체 충전 마이크로버블의 현탁액을 얻는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 에멀젼을 제조하는 단계 a)는:
a1) 수성 매질중에 양친매성 물질의 유화 조성물 및 동결건조보호제를 분산시킴으로써 현탁액을 제조하는 단계;
a2) 얻은 현탁액을 유기용매와 혼합하는 단계;
a3) 혼합물을 제어된 교반을 시켜 에멀젼을 얻는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 단계 a3)에 의하여 제어된 교반은 고압 호모지나이저 또는 더 바람직하게는, 로터-스테이터 호모지나이저를 사용해서 얻는다.
본 발명의 더 나아간 양태는 수성 담체 액체에서 인지질을 포함하는 안정화층에 의해서 현저히 안정화된 기체 충전 마이크로버블의 현탁액을 포함하는 주사가능한 조영제와 관련이 있으며, 상기 마이크로버블은 1.70 ㎛ 미만의 수 평균 직경(DN) 을 갖고 부피 메디안 직경(DV50) 은 DV50/DN 의 비가 약 2.00 또는 그 이하인 값을 갖는 것을 특징으로 한다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 양태는 인지질에 의하여 현저히 안정화되는 기체 충전 마이크로버블의 복원가능한 현탁액의 동결건조된 매트릭스를 제조하는 방법과 관련되고, 상기 방법은 i) 수성 매질, ii) 물과 본질적으로 섞이지 않는 유기 용매, iii) 인지질 및 iv) 동결건조보호제를 포함하는 수성-유기 에멀젼을 제조하고 이 에멀젼을 그 직후 동결건조시키는 단계를 포함한다.
수성 매질은 바람직하게 생리학적으로 허용되는 담체이다. 용어 "생리학적으로 허용되는"은 유기체의 건강 또는 정상적인 기능을 실질적으로 변화시키거나 부정적인 영향을 미치지 않으면서 환자에게 선택된 양으로 투여될 수 있는 임의의 화합물, 물질 또는 제제를 포함한다(예: 허용되지 않는 독성 상태를 일으키지 않고, 극심한 또는 조절되지 않는 알레르기 반응 또는 비정상적인 병적 상태 또는 질병 상태를 일으키지 않음).
적합한 수성 액체 담체는, 물, 전형적으로 멸균의 발열원이 없는 물 (동결건조된 중간체 생성물에서의 오염을 최대한 방지하기 위함), 식염수와 같은 수용액 (용이하게 균형을 유지하여 주사용 최종 생성물은 저장성이 없을 수 있다), 또는 소금 또는 당류, 당 알코올, 글리콜 또는 다른 비이온성 폴리올 (예: 글루코스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌, 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)과 같은 하나 이상의 삼투압 조정 물질의 수용액이다.
유기용매
본원에서 사용되는 용어 "물과 실질적으로 비혼화성인"은 상기 용매가 물과 혼합되었을 때, 두 가지의 분리된 상이 형성되는 유기용매를 나타낸다. 물에 비혼화성인 용매는 극성 용매(물 등)와 반대로, 비극성 또는 무극성 용매로서 당업계에 또한 통상적으로 공지되어있다. 통상적으로 물에 비혼화성인 용매는 본질적으로 수불용성이다. 본 발명의 목적에 따라, 수성용매와 함께 유화되기에 적합한 유기용매는 전형적으로 약 10 g/l 미만으로 물에 대한 용해성을 지니는 용매다. 바람직하게는, 상기 용매의 물에 대한 용해도는 약 1.0 g/l 또는 그 이하이고, 바람직하게는 약 0.2 g/l 또는 그 이하이고, 더 바람직하게는 약 0.01 g/l 또는 그 이하이다. 특히 바람직한 용매는 물에 대해서 0.001 g/l 또는 그 이하의 용해성을 갖는 것이다. 특히 불용해성의 유기용매(예: 퍼플루오르화탄소)는 약 1.0ㆍ10-6 g/l (예: 퍼플루오르화탄소, 1.66ㆍ10-6 g/l)까지의 용해도를 가질 수 있다.
유기용매는 바람직하게 동결건조될 수 있다. 즉, 상기 용매는 예를 들어 24-48 시간과 같이, 허용되는 시간 내에 효과적이고 완전한 증발/승화가 이루어지도록 하는, 동결건조화 온도에서, 예를 들어 -30℃ 내지 0℃에서 충분히 높은 증기 압력을 갖는다. 바람직하게는, 유기용매의 증기 압력은 25℃에서 약 0.2 kPa 보다 높다.
유기용매는, 폭넓은 용매의 범위 및 물과 섞이지 않고 동결건조 가능하며, 앞서 언급한 바와 같이, 바람직하게는 실온(25℃)에서 액체로 존재하는 화학물질로부터 선택될 수 있다. 실온보다 더 낮은 끓는 점을 갖는 용매를 사용할 경우, 유화 혼합물을 함유하는 용기가 예를 들어 5℃ 또는 0℃로까지, 상기 용매의 끓는점 이하로 용이하게 냉각시킬 수 있다. 상기 용매가 동결건조화 단계에서 완전히 제거될 것이므로, 동결건조를 통해서 제거할 수 없고 또는 주사가능한 조성물로 사용하도록 허용되지 않은 오염물질을 포함해서는 안된다는 점을 제외하고는 특별한 제한이 존재하지 않는다.
적합한 유기용매는 예를 들어 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸 등의 분지형 또는 바람직하게는 선형 (C5-C10) 알칸과 같은 알칸; 예를 들어 1-펜텐, 2-펜텐, 1-옥텐 등의 (C5-C10) 알켄과 같은 알켄; 예를 들어 시클로펜탄, 시클로헥산, 시클로옥탄, 1-메틸-시클로헥산 등의 하나 또는 두 개의 메틸기로 선택적으로 치환되는 (C5-C8)-시클로알칸과 같은 시클로-알칸; 예를 들어 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 1,2-디메틸벤젠, 1,3-디메틸벤젠 등의 벤젠 및 하나 또는 두 개의 메틸 또는 에틸기로 치환되는 벤젠 유도체와 같은 방향족 탄화수소; 디-부틸 에테르 및 디-이소프로필케톤 등의 알킬 에테르 및 케톤; 클로로포름, 사염화탄소, 2-클로로-1-(디플루오로메톡시)-1,1,2-트리플루오로에탄 (엔플루란), 2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로에탄 (이소플루란), 테트라클로로-1,1-디플루오로에탄과 같은 할로겐화 탄화수소 또는 에테르, 및 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로헵탄, 퍼플루오로메틸시클로헥산, 퍼플루오로옥탄, 퍼플루오로노난, 퍼플루오로벤젠 및 퍼플루오로데칼린, 메틸플루오로부틸에테르, 메틸플루오로이소부틸에테르, 에틸퍼플루오로부틸에테르, 에틸퍼플루오로이소부틸에테르 등 특히 퍼플루오르화 탄화수소, 또는 에테르; 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용매의 양은 통상적으로 에멀젼에 사용되는 물의 양에 대하여 약 1 부피% 내지 약 50 부피%를 포함한다. 바람직하게는 상기 양은 약 1 부피% 내지 약 20 부피%, 더 바람직하게는 2 부피% 내지 15 부피% 및 좀 더 바람직하게는 약 5 부피% 내지 약 10 부피%이다. 필요하다면, 상기 열거된 유기용매의 두 가지 또는 그 이상의 혼합물이 사용될 수 있으며, 유화 혼합물에서의 유기용매의 총량은 상기 범위 내에 존재한다.
동결건조보호 약제
용어 동결건조보호 약제 또는 "동결건조보호제"는 제제가 동결건조될 때 포함된 경우, 예를 들어서, 동결건조에 이용되는 진공으로부터의 손상, 흡수 및 손실 등의 동결건조에 통상적으로 수반되는 것과 같은 냉동 및 진공화의 유독한 영향으로부터 화학적 화합물을 보호하는 화합물을 나타낸다. 더욱이, 동결건조 단계 후에, 바람직하게는 상기 동결건조보호제는 동결건조된 인지질을 지지하는 고형의 매트릭스("벌크")을 야기시킨다.
본 발명은 특정한 동결건조보호제의 사용에 제한되지 않고, 적합한 동결건조보호제의 예는 당류, 단당류, 이당류 또는 다당류, 예를 들어, 글루코스, 갈락토스, 프룩토스, 슈크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 아밀로스, 아밀로펙틴, 시클로덱스트린, 덱스트란, 이뉼린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분(HES), 만니톨, 소르비톨 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리글리콜 등의 당 알코올 등의 탄수화물을 포함한다. 동결건조보호 효과를 지닌 제제의 실질적인 리스트는 Acta Pharm. Technol. 34(3), pp. 129-139 (1988), 본원에 참고문헌으로 수록된 내용에 수록되어 있다. 상기 동결건조보호제는 단일로 또는 하나 이상의 화합물의 혼합물로서 사용될 수 있다.
바람직한 동결건조보호제는 만니톨 및 덱스트란 (특히 분자량 1500 달톤 이상의 것), 이뉼린, 가용성 전분 및 히드록시에틸 전분과 같은 다당류를 포함한다.
만니톨 또는 엑스트란, 이뉼린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 등의 다당류와, 글루코스, 말토스, 락토스, 슈크로스, 트레할로스 및 에리쓰리톨 등의 당류와의 혼합물은 또한 우수한 결과를 제공한다.
이와같이, 본 발명은 사용되는 동결건조보호제의 특정한 양에 제한되지 않는다. 그러나, 동결건조화 전에 에멀젼중에 동결건조보호제의 최적의 중량농도를, 약 1 내지 약 25 %, 바람직하게는 약 2 내지 약 20%, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 10 % 포함한다.
동결건조 생성물에 소망의 "벌크"를 제공하는데 또한 필요하다면, 더 많은 양이 사용될 수도 있다.
바람직하게 동결건조보호제를, 그것의 유화 전에 수성-유기 혼합물에 첨가시키고, 수성-유기 혼합물의 유화의 경우에 동결건조보호제가 존재할 때 이와 같이 수행한다. 대안으로, 동결건조보호제는 이러한 유화 후에 수성-유기 혼합물에 첨가될 수 있다. 첫번째 경우에, 바람직하게 동결건조보호제를 유기용매와 함께 혼합시키기 전에, 수성 매질에 첨가했다. 필요하다면, 예를 들어서, 에멀젼의 조제에 사용되는 액상 및 이렇게 산출된 에멀젼에 동결건조보호제의 부분을 첨가함으로써, 두 가지를 또한 조합할 수 있다. 필요하다면, 또한 글리세롤과 같은 냉동상해방지제를 냉동의 해로운 영향으로부터 화합물을 보호하기 위해서 에멀젼에 더 첨가할 수 있다.
인지질
본 설명 및 청구범위에 의하면, 용어 인지질은 최종 마이크로버블 현탁액에서 기체-물 계면에서 물질의 필름(전형적으로 단분자층의 형성으로)의 형성이 가능케 하는 분자의 양친매성 인지질 화합물을 포함한다는 것을 의도한다. 따라서, 이러한 물질은 또한 "필름-형성 인지질"로서 당업계에서 지칭된다. 마찬가지로, 유화된 혼합물에서, 이러한 양친매성 화합물은 전형적으로 수성 매질 및 본질적으로 수불용성인 유기용매 간의 계면에 배열되어, 유화된 용매 미세방울을 안정화한다. 기체-물 또는 물-용매 계면에서의 이러한 화합물에 의하여 형성되는 필름은 연속적이거나 또는 비연속적일 수 있다. 그러나, 후자의 경우, 필름에서의 비연속성은 현탁된 마이크로버블의 (예: 압력 저항, 유착에 대한 저항 등) 또는 유화된 미세방울의 각각의 안정도를 손상시켜서는 안된다.
본원에서 사용된 용어 "양친매성 화합물"은 수성 매질과 반응할 수 있는 친수성극머리 부분 (예: 극성 또는 이온성기) 및 예를 들어 유기용매와 반응할 수 있는 소수성 유기 꼬리 부분(예: 탄화수소 사슬)을 가진 분자를 가진 화합물을 포함한다. 그러므로, 이러한 화합물은 통상적으로 "계면 활성제"로서 활동한다. 즉, 비혼화성인 두 가지의 액체(예: 물과 오일)의 혼합물, 액체와 기체의 혼합물 (예: 물중에 기체 마이크로버블) 또는 액체와 불용성 입자의 혼합물 (예. 물중에 금속 나노 입자)과 같이 다른 방법으로는 통상적으로 섞일 수 없는 물질의 혼합물을 안정화시킬 수 있는 화합물이다.
양친매성 인지질 화합물은 전형적으로 적어도 하나의 인산염군을 함유하고, 적어도 하나의, 바람직하게는 두 개의 친유성 긴-사슬 탄화수소기를 함유한다.
적합한 인지질의 예는 글리세롤과 하나의 또는 바람직하게는 두개 (동일하거나 또는 서로 다른)의 지방산 및 인산의 잔여물과의 에스테르를 포함하고, 여기서 인산의 잔여물은 콜린 (포스파티딜콜린 - PC), 세린 (포스파티딜세린 - PS), 글리세롤 (포스파티딜글리세롤 - PG), 에탄올아민 (포스파티딜에탄올아민 - PE), 인오시톨 (포스파티딜인오시톨) 등의 기와 같은 친수성기에 차례로 결합했다.인지질과 지방산의 단 하나의 잔여물과의 에스테르는 통상적으로 당업계에서 인지질의 "리소" 형태로 지칭된다. 인지질에 존재하는 지방산의 잔여물은 통상적으로 긴 사슬 지방족산이고, 전형적으로 12 내지 24 개, 바람직하게는 14 내지 22개의 탄소 원자를 함유한다. 지방족 사슬은 하나 이상의 불포화를 함유하거나, 또는 바람직하게는 완전히 포화될 수 있다. 예를 들어서, 인지질에 포함된 적합한 지방산의 예는 라우르 산, 미리스트 산, 팔미트 산, 스테아르 산, 아라키드 산, 베헨 산, 올레 산, 리놀레 산 및 리놀렌 산이다. 바람직하게는, 미리스트 산, 팔미트 산, 스테아르 산 및 아라키드 산 등의 포화 지방산이 사용된다.
인지질의 더 나아간 예는 포스파티드 산이다, 즉 글리세롤-인산과 지방산의 디에스테르; 스핑고마이엘린과 같은 스핑고지질, 즉, 지방산과의 글리세롤 디에스테르의 잔여물이 세라미드 사슬에 의해서 치환된 포스파티딜콜린 유사체; 카르디오리핀, 즉 1,3-디포스파티딜글리세롤과 지방산의 에스테르; 강글리오시드 GM1 (또는 GM2)와 같은 글리코지질 또는 세레브로시드; 글루코지질; 술파티드(sulfatide) 및 글리코스핑고지질이다.
본원에서 사용된 용어 인지질은 자연 발생되었거나, 반합성 또는 합성되어 제조된, 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있는 생성물을 포함한다.
자연 발생의 인지질의 예는 전형적으로 대두 또는 계란 노른자 레시틴과 같은 천연 레시틴(포스파티딜콜린 (PC) 유도체)이다.
반합성된 인지질의 예는 자연 발생의 레시틴의 부분적인 또는 전체적인 수소화 유도체이다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린, 에틸포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드 산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 또는 스핑고마이엘린의 지방산 디-에스테르이다.
예를 들어서, 바람직한 인지질의 예는 디라우로일-포스파티딜콜린 (DLPC), 디미리스토일-포스파티딜콜린 (DMPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린 (DPPC), 디아라키도일-포스파티딜콜린 (DAPC), 디스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일-포스파티딜콜린 (DOPC), 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (에틸-DSPC), 디펜타데카노일-포스파티딜콜린 (DPDPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일-포스파티딜콜린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일-포스파티딜콜린 (PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (SPPC), ), 1-팔미토일-2-올레일포스파티딜콜린 (POPC), 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (OPPC), 디라우로일-포스파티딜글리세롤 (DLPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디아라키도일포스파티딜-글리세롤 (DAPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (DMPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디스테아로일포스파티딜글리세롤 (DSPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디올레오일-포스파티딜글리세롤 (DOPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일 포스파티드 산 (DMPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디팔미토일 포스파티드 산 (DPPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디스테아로일 포스파티드 산 (DSPA), 디아라키도일포스파티드 산 (DAPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 디올레일포스파티딜-에탄올아민 (DOPE), 디아라키도일포스파티딜에탄올아민 (DAPE), 디리놀에일포스파티딜에탄올아민 (DLPE), 디미리스토일 포스파티딜세린 (DMPS), 디아라키도일 포스파티딜세린 (DAPS), 디팔미토일 포스파티딜세린 (DPPS), 디스테아로일포스파티딜세린 (DSPS), 디올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 디팔미토일 스핑고미엘린 (DPSP) 및 디스테아로일스핑고미엘린 (DSSP)이다.
용어 인지질은 변형된 인지질, 예를 들어서 다른 친수성기에 차례로 결합된 친수성기가 있는 인지질을 더 포함한다. 변형된 인지질의 예는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 함께 변형된 포스파티딜에탄올아민, 즉, 친수성 에탄올아민 부분이 예를 들어 즉 DPPE (또는 DSPE)가 PEG 폴리머와 결합된, DPPE-PEG 또는 DSPE-PEG와 같이 300 내지 5000 달톤, 다양한 분자량의 PEG 분자와 결합되어 있는 포스파티딜에탄올아민이다. 예를 들어서, DPPE-PEG2000은 약 2000의 평균 분자량을 갖는 PEG 폴리머에 결합된 DPPE를 나타낸다. 다음에 상술된 바와 같이, 이러한 PEG-변형 인지질은 바람직하게는 비변형 인지질과 배합되어서 사용된다.
중성 및 하전된 인지질 모두 이것의 혼합물 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 충분히 사용될 수 있다. 본원 및 종래기술에서 사용된 바와 같이, "인지질"과 관련된 용어 "하전된"은 개개의 인지질 분자가 총 실전하를 갖고, 양성화 또는 더 빈번히, 음성화 되는 것을 의미한다.
총 음전하를 띠는 인지질의 예는 유도체, 특히 DMPS, DPPS, DSPS와 같은 포스파티딜세린의; DMPA, DPPA, DSPA와 같은 포스파티드 산의; DMPG, DPPG 및 DSPG와 같은 포스파티딜글리세롤과의 지방산 디-에스테르이다. 또한 변형된 인지질, 특히 DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG5000, DPPE-PEG750, DPPE-PEG1000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000,DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG750, DAPE-PEG1000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 또는 DAPE-PEG5000과 같은 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민이 음성으로 하전된 분자로 사용될 수 있다.
또한 리소포스파티딜세린 유도체 (예: 리소-DMPS, -DPPS 또는 -DSPS), 리소포스파티드 산 유도체 (예: 리소-DMPA, -DPPA 또는 -DSPA) 및 리소포스파티딜글리세롤 유도체 (예: 리소-DMPG, -DPPG 또는 -DSPG)와 같은 앞서 인용된 인지질의 리소- 형태는 음성으로 하전된 화합물로서 용이하게 사용될 수 있다.
총 양전하를 띠는 인지질의 예는 에틸포스파티딜콜린의 유도체, 특히 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (에틸-DSPC 또는 DSEPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (에틸-DPPC 또는 DPEPC)와 같은 에틸포스파티딜콜린과 지방산과의 에스테르이다.
바람직하게는, 중성 전하를 가진 것 적어도 하나 및 총 실전하를 가진 것 적어도 하나의, 두 가지 이상의 인지질의 혼합물을 사용한다. 더 바람직하게는, 중성 전하를 가진 것 적어도 하나 및 음성 전하를 가진 것 적어도 하나의, 두 가지 이상의 인지질의 혼합물을 사용한다. 하전된 인지질의 양은 인지질의 총량에 대하여 약 95 중량% 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 80 중량% 내지 약 20 중량%로 다양할 수 있다. (음으로) 하전된 인지질의 인지질의 총 중량에 대하여 5 중량% 내지 20 중량%와 같이 적어도 소량의 존재는 기포 또는 에멀젼의 방울의 응집을 방지하는 것을 도울 수 있다. 그러나, 중성 또는 전하된, 단일의 인지질, 또는 모두 중성 또는 모두 총 실전하를 갖는 두 가지 이상의 인 지질의 혼합물의 사용이 가능하다.
바람직한 인지질은 DAPC, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS, DPPE, DSPE, DSPG, DPPG 및 에틸-DSPC이다. 가장 바람직한 것은 DSPA, DPPS 또는 DSPS이다.
인지질의 바람직한 혼합물은 DPPC, DSPC 또는 DAPC와 DPPS와의 혼합물 (95/5 내지 5/95 w/w), DSPC 또는 DAPC와 DSPA와의 혼합물 (95/5 내지 5/95 w/w), DSPG 또는 DPPG와 DSPC와의 혼합물, 또는 DSPC와 에틸-DSPC와의 혼합물이다. 가장 바람직한 것은 DPPS/DSPC (50/50 내지 10/90 w/w) 또는 DSPA/DSPC (50/50 내지 20/80 w/w)의 혼합물이다.
통상적으로 인지질의 양은 유화된 혼합물의 총 중량에 대하여 약 0.005 내지 약 1.0 중량%가 포함되었다. 물론 더 많은 양이 사용될 수도 있으나, 최종 생성물이 주사가능한 조영제라는 것을 염두에 두고, 안정하고 적합한 생성물을 제공하는데 반드시 필요하지않는 한, 부가제의 과도한 사용은 바람직하지 않다. 통상적으로, 상기 범위의 상한에 나타낸 것보다 더 많은 인지질의 양을 사용할 때, 기포 집단, 기포 크기의 분포 및 기포 안정도의 측면에서 본질적으로 개선됨이 없거나 매우 작은 것으로 관찰되었다. 전형적으로, 유기용매의 더 큰 부피가 사용될 때, 인지질의 더 많은 양이 요구된다. 따라서, 유기용매 양의 부피가 수상의 부피의 약 50%일 때, 약 1%의 인지질의 중량 당 중량 (w/w)의 양은 용이하게 에멀젼에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 인지질의 양은 유화된 혼합물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 1.0 중량%, 더 바람직하게는 약 0.05 중량% 내지 0.5 중량%가 포함된다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해서 제공되는 마이크로버블은 상기에 규정된 대로 인지질에 의해서 현저하게 안정화된다. 특히 기체 충전 마이크로버블을 둘러싼 주머니는 상기에 규정된 바와 같은 인지질 물질의 50% (w/w) 이상, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%로 형성되었다. 용이하게도, 마이크로버블의 안정화 주머니의 본질적 전체는 인지질로 형성되어 있다.
그러나, 다른 양친매성 물질은 유화 조성물의 총 중량의 50% 미만의 양으로, 기체 충전 마이크로버블의 안정화 주머니를 형성하는 인지질과 혼합될 수 있다.
적합한 부가적인 주머니-안정화 양친매성 물질의 예는 예를 들어 리소지질; 팔미틱산, 스테아르 산, 라우르 산, 미리스트 산, 아라키드 산, 아라키도닉 산, 베헨 산, 올레 산, 리놀레 산 또는 리놀렌 산과 같은 지방산 및 그것의 알칼리 또는 알칼리 금속과의 각각의 염; 키틴, 히아루로닉 산, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같이, "페길화 지질"로도 나타내어지는 폴리머를 갖는 지질; 술폰화 단당, 이당, 올리고당 또는 다당을 갖는 지질; 에테르 또는 에스테르-결합 지방산을 갖는 지질; 중합된 지질; 디아세틸 포스페이트; 디세틸 포스페이트; 스테아릴아민; 세라미드; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 (폴리옥시에틸렌 지방산 스테아레이트 등); 폴리옥시에틸렌 지방 알코올; 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르; 폴리옥시에틸화 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀레이트; 에톡실화 대두 스테롤; 에톡실화 캐스터 오일; 에틸렌 옥시드 (EO) 및 프로필렌 옥시드 (PO) 블록 코폴리머; 콜레스테롤 글루쿠로나이드, 라노스테롤 글루코로나이드, 7-디히드로콜레스테롤 글루코로나이드, 에르고스테롤 글루코로나이드, 콜레스테롤 글루코네이트, 라노스테롤 글루코네이트 또는 에르고스테롤 글루코네이트를 포함하는 당산의 스테롤 에스테르; 라우릴 글루코로나이드, 스테아로일 글루코로나이드, 미리스토일 글루코로나이드, 라우릴 글루코네이트, 미리스토일 글루코네이트 또는 스테로일 글루코네이트를 포함하는 당산 및 알코올의 에스테르; 슈크로스 라우레이트, 프룩토스 라우레이트, 슈크로스 팔미테이트, 슈크로스 스테아레이트, 글루쿠로닉 산, 글루코닉 산 또는 폴리우로닉 산을 포함하는 지방산과 당과의 에스테르; 1,2-디팔미토일-sn-3-숙신일글리세롤 또는 1,3-디팔미토일-2-숙신일글리세롤과 같은, 글리세롤과 (C12-C24), 바람직하게는 (C14-C22) 디카르복실 지방산과의 에스테르 및 그것 각각의 알칼리 또는 알칼리-금속 염; 사르사사포게닌, 스미라게닌, 헤데라게닌, 올레아놀릭 산 또는 디지톡시게닌을 포함하는 사포닌; n-데실 알코올, 라우릴 알코올, 미리스틸 알코올, 세틸 알코올 또는 n-옥타데실 알코올을 포함하는 긴 사슬 (C12-C24) 알코올; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)-1-티오-β-D-갈락토피라노시드; 디갈락토실디글리세라이드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥시-1-티오-β-D-갈락토피라노시드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥실-1-티오-β-D-만노피라노시드; 12-(((7'-디에틸아미노쿠마린-3-일)카르보닐)메틸아미노)옥타데칸 산; N-[12-(((7'-디에틸아미노쿠마린-3-일)카르보닐)메틸아미노)옥타데카노일]2-아미노팔미트 산; N-숙신일-디올레일포스파티딜에탄올아민; 1-헥사데실-2-팔미토일글리세로-포스포에탄올아민; 팔미토일호모시스테인; 예를 들어, 스테아릴암모늄 클로라이드, 헥사데실암모늄 클로라이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)와 같은 적어도 하나의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18), 알킬 사슬을 포함하는 알킬암모늄 염; 예를 들어, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DPTAP), 1,2-올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판 (DSDAP)과 같은 하나의 또는 바람직하게는 두 개의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18), 아크릴 에스테르 잔기를 포함하는 제3차 또는 제4차 암모늄 염: 및 혼합물 또는 그것의 조합물을 포함한다.
적은 양의 지방산 및 인지질의 리소 형태는 예를 들어 에멀젼을 가열한 결과물로서 원래의 인지질 생성물의 분해 생성물로서 또한 생성될 수 있다.
바람직한 부가적인 주머니-안정화 양친매성 물질은 예를 들어 상기에 열거된 지방산, 그것의 각각의 염 및 유도체와 같이, 특히 하나 또는 두 개의 선형 (C10-C20)-아실, 바람직하게는 (C14-C18)-아실 사슬 분자 중에 하나 또는 두 개의 지방산 잔기를 포함하는 화합물이다.
특히 바람직한 부가적인 주머니-안정화 양친매성 물질은 총 실전하가 안정화 주머니로 제공되는 것이 가능한 화합물, 즉 총 양 또는 음 실전하를 띠는 화합물이다. 적합한 음 또는 양으로 하전된 화합물의 예는, 예를 들어, 리소-인지질 즉 리소포스파티딜세린 유도체 (예: 리소-DMPS, -DPPS 또는 -DSPS), 리소포스파티드 산 유도체 (예: 리소-DMPA, -DPPA 또는 -DSPA) 및 리소포스파티딜글리세롤 유도체 (예: 리소-DMPG, -DPPG 또는 -DSPG)와 같은 앞서 인용된 인지질의 리소- 형태; 콜릭 산 염, 데옥시콜릭 산 염 또는 글리코콜릭 산 염과 같은 바일 산 염; 예를 들어, 팔미트 산 염, 스테아르 산 염, 1,2-디팔미토일-sn-3-숙신일글리세롤 염 또는 1,3-디팔미토일-2-숙신일글리세롤 염과 같은 (C12-C24), 바람직하게는 (C14-C22) 지방산 염; 예를 들어 스테아릴암모늄 클로라이드, 헥사데실암모늄 클로라이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)와 같은 적어도 하나의 (C10-C20) 알킬 사슬, 바람직하게는 (C14-C18) 알킬 사슬을 포함하는 할로겐 반대이온(예: 클로린 또는 브로민)과의 알칼암모늄 염; 예를 들어, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DPTAP), 1,2-올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판 (DSDAP)과 같은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 (C10-C20) 아실 사슬, 바람직하게는 (C14-C18) 아실 에스테르 잔기를 포함하는 할로겐 반대이온 (예: 클로린 또는 브로민)과의 제3차 또는 제4차 암모늄 염이다.
"표적화하는" 초음파 조영제를 얻고자 한다면, 즉 생체외 또는 생체내 투여 후에 특정한 부위에 선택적으로 결합될 수 있는 마이크로버블을 함유하는 조영제를 원한다면, 본 발명의 방법에 따라서 적합하게 선택된 표적화하는 리간드의 도입함으로써 적어도 변형된 부분이 있는 인지질로부터 직접적으로 또한 출발될 수 있거나, 대안으로, 바람직하게는 보체 작용기능 (예. 아비딘-비오틴 결합)를 함유하는 적합하게 선택된 표적화하는 리간드와 함께 더 나중의 단계에서 결합될 수 있는 가능한 보호된 반응기를 함유하고 있는 부분이 적어도 있는 인지질로부터 출발된다.
그러므로, 이러한 특정한 문맥에서, 용어 "인지질"은 변형된 및 변형되지 않은 인지질을 모두 포함하는 것을 의도하며, 이와같이 표적화하는 리간드 또는 보호 반응기와 인지질의 양친매성 분자가 결합됨으로써 변형된 인지질을 포함한다.
용어 "표적화하는 리간드"는 그것의 의미 내에서, 생체 내의 생물학적인 또는 병리학적인 부위에 대하여 본 발명의 마이크로버블의 표적하는 활동시키거나 또는 활동을 촉진시킬 수 있는 임의의 화합물, 부분 또는 잔여물을 포함한다. 표적하는 리간드로서 역할을 할 수 있는 재료나 물질은, 예를 들어 항체, 항체 단편, 수용체 분자, 수용체 결합 분자, 당단백질 및 렉틴을 포함하는 단백질; 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 펩티드; 펩티도미메틱; 단당 및 다당을 포함하는 당류; 비타민; 스테로이드, 스테로이드 유도체, 호르몬, 코팩터, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생활성작용제 및 유전 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 표적하는 리간드와 관련되는 표적은 예를 들어 심근 조직 (심근 세포 및 심근근육 포함), 막 조직 (내피 및 상피 포함), 척추관절, 결합 조직 (간질 조직 포함) 또는 종양같은 조직; 응혈; 및 예를 들어, 펩티드 호르몬 세포표면 수용체, 신경전달물질, 항원, 보체 단편 및 스테로이드 호르몬 면역글로불린 및 세포질 수용체와 같은 수용체를 포함한다.
적합한 표적 및 표적하는 리간드의 예는, 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 수록된 미국특허 제 6,139,819호에 개시되어 있다.
바람직한 구체예에서, 표적하는 리간드는 공유결합을 통하여 안정화 막을 형성하는 양친매성 분자와 결합할 수 있다.
그러한 경우에, 표적하는 양친매성 분자를 필요로 할 때, 인지질 또는 지질 분자중에서 존재해야 하는 특정한 반응 부분은 결합될 특정의 표적하는 리간드에 달려있을 것이다. 예로서, 표적하는 리간드는 아미노기를 통해서 양친매성 분자와 결합될 수 있다면, 양친매성 분자에 적합한 반응 부분은 이소티오시안산염기 (티오우레아 결합을 형성함), 반응 에스테르 (아미드 결합을 형성함), 알데히드기 (이민 결합을 형성하여 알킬아민 결합으로 환원되도록) 등이 될 수 있다. 표적하는 리간드가 티올기를 통해서 양친매성 분자와 결합될 수 있다면, 양친매성 분자에 적합한 보체 반응 부분은 할로아세틸 유도체 또는 말레이미드(티오에테르 결합 형성)를 포함하며, 그리고 표적하는 리간드가 카르복실기를 통해서 양친매성 분자와 결합될 수 있다면, 양친매성 분자에 적합한 반응 부분은 아민 및 히드라지드 (아미드 또는 알킬아미드 결합 형성)가 될 수 있다. 반응 부분은 직접적으로 인지질 분자에 또는 인지질에 결합된 변형된 부분 (예: PEG)에 결합될 수 있다.
앞서 기재된 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 표적화되는 마이크로버블을 함유한 조영제를 원할 때, 개시 인지질의 적어도 부분은, 적합한 반응 부분을 함유할 것이고, 에멀젼의 생성 이전, 동안 또는 이후에, 또는 가공 단계 바로 직전에 보체 기능을 함유하는 표적하는 리간드는, 보체 기능을 함유하는 표적하는 리간드를 작용하는 인지질/지질을 함유하는 상에 첨가함으로써, 동결건조 전에 임의의 단계에서 그것에 결합될 것이다. 후자의 경우, 필름-형성 인지질 또는 적합하게 작용하는 관련된 지질의 부분을 적어도 함유하는 마이크로버블은, 임의의 소망의 표적하는 리간드와 결합할 수 있고, 동일한 반응 보체기를 공유하므로, 시스템의 유연성을 완전히 이용할 수 있다.
그러나, 표적하는 리간드가 반드시 공유결합을 통하여 양친매성 분자에 결합될 필요는 없다. 표적하는 리간드는 또한 상호작용의 물리적인 및/또는 정전기적인 상호작용의 종류를 통해서 마이크로버블과 적합하게 관련될 수 있다. 예와 같이, 보체 부분이 표적하는 리간드에 연결될 때, 보체 부분의 높은 친화성 및 선택성을 지닌, 기능 부분이 인지질 분자에 도입될 수 있다. 예를 들어서, 보체 비오틴 부분이 예를 들어, 펩티드 또는 항체 등의 적합한 표적하는 리간드에 섞어질 때, 아비딘 (또는 스트렙타비딘) 부분 (비오틴에 대한 높은 친화성을 지님)은 마이크로버블 안정화 인지질에 공유 결합될 수 있다. 따라서, 비오틴-표지 표적하는 리간드는 아비딘-비오틴 결합 시스템 방법에 의하여 아비딘-표지 마이크로버블과 관련될 것이다. 대안 구체예에 의하면, 비오틴-함유 인지질은 마이크로버블의 안정화 주머니를 형성하는 화합물로서 사용될 수 있고, 그 다음에 안정화 주머니에 혼입된 비오틴-함유 인지질은 아비딘 (또는 뉴트라비딘)과 우선 반응하고, 그 다음에 비오틴-함유 리간드와 반응한다. 비오틴/아비딘으로 표지된 인지질 및 펩티드의 예는 또한 앞서 인용된 미국 특허 제 6,139,819호에서 개시되어 있다. 대안으로, 반 데르 발스 상호작용, 정전기 작용 및 다른 회합 방법이 표적하는 리간드를 양친매성 분자에 회합 또는 결합시킬 수 있다.
본 발명의 마이크로버블이 적용될 수 있는 적합한 특정한 표적의 예는 예를 들어, 섬유소, ανβ3 수용체 또는 활성 혈소판중의 GPIIbIIIa 수용체가 될 수 있다. 통상적으로 섬유소 및 혈소판은 사실 "혈전," 즉 혈류에서 형성되고 혈관 막힘을 야기할 수 있는 혈괴에 존재한다. 적합한 결합 펩티드는 예를 들어서, 앞서 인용된 미국 특허 제 6,139,819호에 개시되어 있다. 특별히 섬유소를 표적화하는 결합 펩티드는 본원에서 참고문헌으로 수록된 WO 02/055544에 더 개시되어 있다.
중요한 표적의 다른 예는, 키나아제 도메인 부위 (KDR) 및 VEGF (혈관 내피 성장 인자)/KDR 복합체 등의 취약한 플라크 및 종양 특이적 수용체에 있는 수용체를 포함한다. KDR 또는 VEGF/KDR 복합체에 적합한 결합 펩티드는 예를 들어서, 본원에 참고문헌으로 모두 인용된 국제 특허 출원 WO 03/74005 및 WO 03/084574에 개시되어 있다.
방법
본 발명의 방법의 유화 단계 a)는, 적어도 하나의 인지질이 존재하는 수성 매질 및 코아 용매를, 예를 들어 음파 파쇄, 교반, 고압 균질화, 마이크로믹싱, 막 유화, 예를 들어 로터-스테이터(rotor-stator) 호모지나이저를 사용한 고속 교반 또는 고감도 혼합과 같이, 당 업계에 공지된 적합한 에멀젼-산출 기술에 적용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, Polytron®PT3000 등의 로터-스테이터 호모지나이저가 사용된다. 로터-스테이터 호모지나이저의 교반 속도는 에멀젼의 성분, 에멀젼의 부피 및 에멀젼 함유 용기의 직경 및 에멀젼중의 용매의 미세방울의 소망의 최종 직경에 따라 선택될 수 있다. 통상적으로, 직경 3.5-5 cm의 비이커에 담겨진 50-80 ml 혼합물로 적셔진 직경 약 3 cm의 탐침을 가진 로터-스테이터 호모지나이저를 사용할 때, 약 8000 rpm의 교반 속도가 동결건조 및 동결건조된 매트릭스의 복원 이후, 약 1.8 ㎛ 이하의 직경을 가진 기체 충전 마이크로버블을 산출하도록 충분히 환원된 평균 수 직경을 갖는 미세방울을 얻기에 충분하다고 관찰되었다. 약 14000-15000 rpm의 교반 속도에서, 약 1.0 ㎛ 또는 그 이하의 수 평균 직경을 갖는 기체 충전 마이크로버블을 통상적으로 얻을 수 있고, 약 12000 rpm으로 교반 속도를 증가시킴으로써, 약 1.5 ㎛ 이하의 수 평균 직경을 갖는 기체 충전 마이크로버블을 통상적으로 얻을 수 있다. 통상적으로 약 18000 rpm 이상으로 교반 속도를 증가시킴으로써, 마이크로버블 크기의 미세한 감소를 더 얻을 수 있다는 것이 관찰되었다.
대안으로, 혼합물을 유화하는데 마이크로믹싱 기술이 또한 사용될 수 있다. 공지된 바 대로, 마이크로믹서는 전형적으로 적어도 두 개의 주입구 및 적어도 한 개의 배출구를 포함한다. 따라서, 액상이 제 2 주입구 (예: 2-100 ml/분의 유속에서)를 통해서 주입될 때, 유기용매는 제 1 주입구(예를 들어 0.05-5 ml/분의 유속에서)를 통해서 믹서로 주입된다. 이와 같이 마이크로믹서의 배출구는 수용액을 함유한 용기와 연결되어 있어서, 바로 이어서 상기 용기로부터 끌어내고, 마이크로믹서로 주입된 수성상은 유화된 용매의 증가된 양을 함유한다. 용매의 전 부피를 첨가했을 때, 에멀젼이 완성되도록, 예를 들어 5-120 분 미리 정한 기간 동안 더 마이크로믹서를 통해서 재순환 하에서 용기로부터 에멀젼을 보관할 수 있다.
에멀젼 기술에 따라, 유화 단계 동안 또는 유화 단계 시작 이전에 즉시 유기용매를 서서히 주입할 수 있다. 대안으로, 유화 단계 또는 유화 단계 시작 이전에 즉시 수성 매질을 물과 섞이지 않는 용매에 서서히 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 후자가 유기용매와 혼합되기 전에 인지질은 수성 매질에서 분산된다. 대안으로, 인지질은 유기용매에서 분산될 수 있거나 또는 유화 단계 이전 또는 동안에 수성-유기 혼합물에 따로 첨가될 수 있다.
유화 단계 a)는 용이하게 예를 들어 22℃±5℃ 등의 실온 또는 예를 들어 50℃-60℃(예: 높은 끓는점을 갖는 코아 용매의 경우) 등의 더 높은 온도에서, 또는 예를 들어 0℃-10℃(예: 실온에 가까운 끓는점을 갖는 코아 용매의 경우) 등의 더 낮은 온도에서 수행된다. 바람직하게는 온도는 유기용매의 끓는 온도 이하로, 바람직하게는 상기 온도의 적어도 5℃ 이하로, 더 바람직하게는 적어도 10℃이하로 유지한다. 높은 온도(예: 90℃ 또는 그 이상)에서 혼합물의 연장된 노출은 각각의 리소-유도체의 결과의 형성으로 인지질의 가능한 분해를 야기할 수 있으므로, 높은 온도에서 이렇게 연장된 가열을 피하는 것이 통상적으로 바람직하다.
필요하다면, 그것의 분산을 촉진시키기 위해서, 인지질을 함유한 수성매질을 제어된 열에 쬐게 할 수 있다. 예를 들어서, 인지질 함유 수성 현탁액을 약 15 분 동안 약 60-70℃에서 가열할 수 있고, 그 다음에 에멀젼 단계를 수행하는 온도로 냉각시킬 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 앞서 열거된 것과 같은 부가적인 양친매성 물질은, 인지질을 함유한 유화 혼합물에 또한 주입될 수 있다. 상기 부가적인 양친매성 화합물의 양은, 바람직하게는 양친매성 물질의 총 중량에 대한 약 50 중량% 보다 높지 않고, 더 바람직하게는 약 20 중량%보다 높지 않은, 예를 들어 약 0.1 중량%의 양까지이다.
필요하다면, 수성 매질은 하나 이상의 부형제를 더 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "부형제"는, 에멀젼의 또는 동결건조물질 중간체의 안정도를 증가 및/또는 약제학적으로 허용되고 안정한 최종 조성물의 제공을 위해서 사용된 그러한 부가제와 같은 본 발명에 유용한 임의의 부가제를 나타낸다.
예를 들어, 이 점에 관하여 대표적인 부형제는 점성 증강제 및/또는 인지질 용해 보조제이다.
적합하게 사용될 수 있는 점성 증강제 및 용해 보조제는, 예를 들어 글루코스, 락토스, 사카로오스, 및 덱스트란과 같은 단당 또는 다당류, 이소프로필 알코올 및 부틸 알코올과 같은 지방족 알코올, 글리세롤과 같은 폴리올, 1,2-프로판디올, 및 이와 유사한 물질이다. 그러나, 통상적으로 많이 존재하는 조영제 원제에 흔히 사용되는 점성 증강제와 같은 부가제를 본 발명의 조영제에 인용할 필요가 없다는 것을 통상적으로 발견했다. 대상의 인체에 투여되는 성분의 수를 최소로 유지하면서 조영제의 점성을 최대한으로 낮게 유지하는 것은 본 발명의 더 나아간 이점이다.
앞서 언급한 대로, 본 출원인은 콜레스테롤과 같은 수불용성 구조-빌더를 유화 혼합물에 첨가하는 것이 본질적으로 불필요하다는 것을 발견했다. 실제로 콜레스테롤의 0.05%(w/w 유화 혼합물의 총 중량에 대한 중량 당 중량(w/w))의 양은 미세방울로부터 기체 충전 마이크로소체로의 전환 수율을 극감시키고, 더 나아가서 소체 크기의 폭넓은 분산을 야기시킨다는 것이 관찰되었다. 따라서, 유화 혼합물중의 수불용성 화합물의 양은, 특히 그 구조에서 한 개 또는 두 개의 지방산 잔기를 포함하지 않는 그러한 화합물에서, 바람직하게는 에멀젼의 총 중량에 대한 0.050 중량%보다 낮고, 더 바람직하게는 약 0.030 중량%보다 낮다.
단계 a)에 의하여 생성된 에멀젼은, 수성상(에멀전과 무관함)중에 과도한 인지질을 제거하고, 콜로이드 입자와 같은 원하지 않는 물질뿐만 아니라, 점성 증강제 및 용해 보조제와 같은 선택적 부가제 및 너무 작고/또는 너무 큰 에멀젼 방울을 분리하고 제거하기 위하여, 단계 b)의 동결건조 이전에 한 번 이상의 세척 단계를 용이하게 거칠 수 있다. 이러한 세척은, 기울여 따르기, 부유법, 원심분리, 교차 흐름 여과 등의 기술을 이용하여 에멀젼을 분리시킬 수 있는, 본질적으로 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
만약 세척 단계가 예측되고, 에멀젼 생성 이전에 원래 수성상에서 동결건조보호제가 존재한다면, 상기 세척 단계는 세척으로 부분적으로 제거되는 동결건조보호제의 양을 대체하도록, 하나 이상의 동결건조보호제를 함유한 수성 용액과 함께 수행될 수 있다. 다른 면에서, 유화된 수성-유기 혼합물에 동결건조보호제가 존재하지 않는다면, 동결건조보호제가 유화된 혼합물에 주입되도록 동결건조보호제 함유 수성 용액으로 생성된 에멀젼을 세척할 수 있거나, 또는 대안으로 동결건조보호제가 동결건조 이전에, 세척 단계 이후에 첨가될 수 있다.
필요하다면, 에멀젼 (그 단계 또는 세척 단계 후에)을 최종 가공 현탁액 중의 큰 크기의 마이크로버블의 양을 더 감소시키기 위해서, 동결건조 이전에 한외여과법 또는 마이크로 여과법 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어 5 ㎛ 또는 3 ㎛ 필터를 가진 정밀여과시, 크기가 큰 미세방울은 실제로 필터에 의해서 남게 되고 크기가 작은 나머지 미세방울로부터 분리되어서, 이와 같이 동결건조된 물질의 가공에서 크기가 큰 마이크로버블의 생성을 방지한다. 마이크로 여과는 양압 여과, 진공 여과 또는 인라인(in-line) 여과와 같은 종래의 기술에 따라서 달성될 수 있다. 여과 막은 나일론, 유리섬유, 셀룰로스, 종이, 폴리카보네이트 또는 폴리에스테르 (Nuclepore®)막이 될 수 있다.
대안 구체예에 의하면, 세척 단계를 거치거나 또는 거치지 않거나, 부가적인 양친매성 화합물을 상기 교시에 따라서 에멀젼의 생성 이후에 첨가할 수 있다. 특히 상기 화합물을 안정화 주머니에 첨가하기 위하여, 바람직하게는 교반 및 가열 하에서 (바람직하게는 80℃이하에서, 예: 40℃-80℃, 특히 50-70℃) 소망의 화합물의 수성 현탁액을 생성된 에멀젼에 첨가한다. 에멀젼의 초기의 혼합물에 주입되었다면, 이러한 대안 구체예는, 만약 그렇지 않았다면 최종 생성물의 성질에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는, 안정화 층 양친매성 화합물로 그 다음에 주입되기에 특히 유용하다. 초기 에멀젼의 제조 이후에 안정화 주머니의 부가적인 성분으로서 그 후에 주입되기에 용이할 수 있는 양친매성 화합물의 예는, 예를 들어서, PEG-변형 인지질, 특히 DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG5000, DPPE-PEG750, DPPE-PEG1000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG750, DAPE-PEG1000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 또는 DAPE-PEG5000 등의 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민이다. 유사하게, 반응 부분 또는 표적하는 리간드(예: 비오틴, 말레이미드 또는 말레이미드-펩티드 함유)를 가진 PEG-변형 인지질은, 또한 이러한 방법에 따라서 그 후에 용이하게 주입될 수 있다. 더욱이 이러한 기술은 리포펩티드 또는 폴리메릭 계면 활성제 등의 안정화 층 다른 성분의 조성물을 그 후에 첨가하는데 또한 사용될 수 있다. 에멀젼의 생성 이후에 용이하게 첨가될 수 있는 폴리메릭 계면 활성제의 예는, 예를 들어 Pluronic F68, Pluronic F108, Pluronic F-127 (Sigma Aldrich, 미주리주, 미국) 등의 에틸렌옥시드-프로필렌옥시드 블록 코폴리머; Brij®78 (Sigma Aldrich, 미주리주, 미국)와 같은 폴릭옥시에틸화 알킬 에테르; Myrj®53 또는 Myrj®59 (Sigma Aldrich, 미주리주, 미국)와 같은 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르; Tween®60 (Sigma Aldrich, 미주리주, 미국)과 같은 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르; 또는 Triton®X-100 (Sigma Aldrich, 미주리주, 미국)과 같은 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르이다.
본 출원인은 실제로 본 발명의 방법에 따라서 에멀젼을 제조하는 데, PEG 변형 인지질 (예: DSPE-PEG 또는 DPPE-PEG)의 제한된 양(예: 10 중량% 이하)과 필름 형성 인지질 (예: DPPS 또는 50:50 DAPC/DPPS 혼합물)을 함께 함유한 혼합물의 사용은, 필름 형성 인지질만을 함유한 에멀젼으로부터 얻어진 마이크로버블의 크기 분포에 대하여 최종 생성물에서의 크기의 분포가 본질적으로 넓어짐이 측정됨을 관찰했다. 다른 면에서, 만약 필름 형성 인지질만을 함유한 에멀젼이 먼저 제조되고 그 다음으로 PEG 변형 인지질의 수성 현탁액을 그 후에 얻어진 에멀젼(예: 1 시간 동안 교반 하에서, 약 60℃의 온도에서)에 첨가한다면, PEG 변형 인지질의 상당히 많은 양 (전형적으로 30 중량% 이상)을, 최종 생성물의 크기의 분포에 본질적으로 영향을 끼치지 않으면서, 안정화 주머니에 섞을 수 있다는 것을 관찰했다.
바람직한 구체예에서, 동결건조 단계 이전에 에멀젼을, 제어된 부가적인 가열 처리를 하였다. 바람직하게는 에멀젼의 부가적인 가열을 밀폐된 용기로 옮겨 수행한다. 가열 처리는 약 60℃ 내지 약 125℃, 바람직하게는 약 80℃ 내지 약 120℃를 포함한 온도에서, 약 15 분 내지 약 90 분 동안으로 변화될 수 있다. 통상적으로, 온도가 더 높을 수록, 더 짧은 열 처리 시간을 갖는다. 가열하는 동안, 에멀젼을 교반하에서 선택적으로 유지할 수 있다.
본 출원인의 관찰에 의하면, 이러한 부가적인 열 처리는 인지질의 부분적인 분해(예: 약 100-120℃에서 약 30 분 동안 에멀젼을 가열할 때, 최종 생성물에서 리소지질 약 5-20% w/w의 함량을 가짐)를 야기시키지만, 그럼에도 불구하고 초기의 유화 단계(예: 유기용매의 종류, 유화 기술, 선택적인 세척 단계 등)의 작업 상태와 무관하게, 최종 현탁액중의 마이크로버블의 총 개수의 증가 및 크기의 분포가 본질적으로 좁아지는 큰 이점을 가지고 있다.
그 후에 열 처리된 에멀젼은, 전형적으로 그 이상의 세척 단계가 필요없이 직접적으로 동결건조될 수 있다.
단계 b)에 따라서 에멀젼의 동결건조는, 초기에 에멀젼을 냉동시키고, 그 후에 본질적으로, 통상적으로 공지된 방법 및 설비에 의해서, 냉동 에멀젼을 동결 건조시킴으로써 수행될 수 있다. 건조한 동결건조된 생성물은, 투여 이전에 담체 액체를 첨가함으로써 보통은 복원될 것이므로, 에멀젼은 동결건조 이전에 밀페된 바이알로 용이하게 채워질 수 있어서, 주사가능한 형태로 복원되도록 동결건조된 건조한 생성물의 적합한 양, 예를 들어 단위제형을 각각 포함하는 바이알에 제공된다. 벌크에서 보다 개개의 바이알에서의 에멀젼을 동결건조함으로써, 동결건조된 생성물의 파괴되기 쉬운 벌집 모양의 구조의 취급 및 이러한 구조의 적어도 부분적분해의 위험을 피한다.
동결건조에 이어서, 조영제의 최종 생성에서 마이크로버블을 생성하도록 소망의 기체를 주입함으로써 동결건조기에서 진공상태를 제거할 수 있다. 이것은 소망의 기체로 바이알의 머리공간을 채우고, 그리고 나서 적합한 폐쇄로 바이알을 밀폐하는 것을 가능케 할 것이다. 대안으로, 예를 들어서 기체가 방사능 또는 과분극화 기체일 때, 예를 들어서 투여 직전에, 기체가 나중 단계에서 첨가될 때, 바이알을 진공하에서 보존하고 밀폐할 수 있다.
기체 충전 마이크로버블의 현탁액을 얻도록, 수성 담체 액체에 생성물을 용해시킴으로써 복원시키기 이전에, 이렇게 얻어진 동결건조 생성물을, 적합한 기체의 존재하에 이와 같이 몇 달 동안 안정하게 보관할 수 있다.
임의의 생적합성 기체, 기체 전구체 또는 그것의 혼합물은, 상기 미세소포를 채우도록 사용될 수 있으며, 이 기체를 선택된 양식에 따라서 선택할 수 있다.
예를 들어서 기체는, 공기; 질소; 산소; 이산화탄소; 수소; 일산화질소; 헬륨, 아르곤, 크세논 또는 크립톤 등의 영족 또는 비활성 기체; Xe133 또는 Kr81 등의 방사성 기체; 과분극화 헬륨, 과분극화 크세논 또는 과분극화 네온 등의 과분극화 영족 기체; 저분자량 탄화수소 (예: 탄소 원자를 7개 까지 함유), 예를 들어 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 이소부탄, 펜탄 또는 이소펜탄 등의 알칸, 사이클로부탄 또는 사이클로펜탄 등의 시클로알칸, 프로펜, 부텐 또는 이소부텐 등의 알켄, 또는 아세틸렌 등의 알킨; 에테르; 케톤; 에스테르; 할로겐화, 플루오르화 또는 퍼플루오르화 저분자량 탄화수소(예: 탄소 원자를 7 개까지 함유)와 같은, 할로겐화 기체, 바람직하게는 플루오르화 기체; 또는 앞서 언급한 것의 임의의 혼합물을 포함할 수 있다. 할로겐화 탄화수소를 사용하는 경우, 바람직하게는 적어도 몇몇, 더 바람직하게는, 상기 화합물의 할로겐 원자 모두가 플루오르 원자이다.
특별히 초음파 이미징 분야에서, 플루오르화 기체, 특히 퍼플루오르화 기체는 바람직하다. 플루오르화 기체는, 예를 들어 플루오르화 탄화수소(하나 이상의 탄소 원자 및 불소를 함유한 유기 화합물); 황 헥사플루오라이드; 퍼플루오로아세톤과 같은 플루오르화, 바람직하게는 퍼플루오르화 케톤; 및 퍼플루오로디에틸 에테르와 같은 플루오르화, 바람직하게는 퍼플루오르화 에테르와 같은, 적어도 하나의 플루오르 원자를 함유한 물질을 포함한다. 바람직한 화합물은, SF6 또는 퍼플루오르화탄소(퍼플루오르화 탄화수소)와 같은 퍼플루오르화 기체, 즉 플루오르 원자로 모든 수소 원자가 치환된 경우의 탄화수소이다. 그리고, 이것은, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 수록된 EP 0554 213에 개시된 바와 같이, 특히 안정한 마이크로버블 현탁액을 생성하는 것으로 공지되었다.
용어 퍼플루오르화탄소는 포화, 불포화 및 고리 퍼플루오르화탄소를 포함한다. 생적합성, 생리학적으로 허용되는 퍼플루오르화탄소의 예는 다음과 같다: 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 (예: 퍼플루오로-n-부탄, 퍼플루오로-이소부탄과 같은 다른 이성질체와 함께 선택적으로 혼합됨) 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로헵탄 등의 퍼플루오로알칸; 퍼플루오로프로펜, 퍼플루오로부텐 (예: 퍼플루오로부트-2엔) 또는 퍼플루오로부타디엔 등의 퍼플루오로알켄; 퍼플루오로알킨 (예: 퍼플루오로부트-2-인); 및 퍼플루오로시클로알칸 (예: 퍼플루오로시클로부탄, 퍼플루오로메틸시클로부탄, 퍼플루오로디메틸시클로부탄, 퍼플루오로트리메틸시클로부탄, 퍼플루오로시클로펜탄, 퍼플루오로메틸시클로펜탄, 퍼플루오로디메틸시클로펜탄, 퍼플루오로메틸시클로헥산, 퍼플루오로메틸시클로헥산 및 퍼플루오로시클로헵탄). 바람직한 포화 퍼플루오르화탄소는, 분자식 CnFn +2를 갖고, 여기서 n은 1 내지 12이고, 바람직하게는 2 내지 10이고, 가장 바람직하게는 3 내지 8이고, 더 바람직하게는 3 내지 6이다. 적합한 퍼플루오르화탄소는, 예를 들어서, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12, C6F12, C6F14, C7F14, C7F16, C8F18, 및 C9F20을 포함한다.
특히 바람직한 기체는 SF6 또는 CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10로부터 선택된 퍼플루오르화탄소 또는 그것의 혼합물이다; SF6, C3F8 또는 C4F10은 특히 바람직하다.
어떤 비율로든 상기 기체의 임의의 혼합물을 사용하는 것은, 또한 용이할 수 있다. 예를 들어서, 혼합물은, 질소, 공기 또는 이산화탄소와 같은 통상적인 기체 및 앞서 나타낸 바와 같이, 황 헥사플루오라이드 또는 퍼플루오르화탄소와 같은 안정한 마이크로버블 현탁액을 형성하는 기체를 포함할 수 있다. 적합한 기체 혼합물의 예는, 예를 들어서 본원에서 참고문헌으로 수록된 WO 94/09829에서 찾아볼 수 있다. 하기 조합은 특히 바람직하다: 기체 (B)가 플루오르화된 기체이며, 바람직하게는 SF6, CF4, C2F6, C3F6, C3F8, C4F6, C4F8, C4F10, C5F10, C5F12 또는 그것의 혼합물로부터 선택되었으며, (A)는 공기, 산소, 질소, 이산화탄소 또는 그것의 혼합물로부터 선택된, 기체 (A) 및 (B)의 혼합물. 기체 (B)의 양은 총 혼합물의 약 0.5% 내지 약 95% v/v, 바람직하게는 약 5% 내지 80%로 나타낼 수 있다.
몇몇 경우에 기체 물질의 전구체를 포함하는 것은 바람직할 수 있다 (즉, 생체 내에서 기체로 전환 가능한 물질). 바람직하게는, 기체의 전구체 및 그것으로부터 유도된 기체는 생리학적으로 허용된다. 기체 전구체는, pH-활성화, 광-활성화, 온도 활성화 등이 될 수 있다. 예를 들어서, 특정한 퍼플루오르화탄소는, 온도 활성화 기체 전구체로서 사용될 수 있다. 퍼플루오로펜탄 또는 퍼플루오로헥산과 같은 이러한 퍼플루오르화탄소는, 실온(또는 물질이 생성되고/또는 저장되는 온도에서) 이상이고 체온 이하에서 액체/기체 상전이가 일어난다: 따라서, 이것은 액체/기체 상전이를 거치고 인체내에서 기체로 전환된다. 더 나아가서, 본원에 사용된 용어 "기체"는, 37℃의 정상체온에서 증기 형태의 혼합물을 포함한다. 37℃의 온도에서 액체로 존재하는 화합물은, 따라서 37℃에서 증기상인 혼합물을 얻도록 다른 기체 화합물과의 혼합물중에 제한된 양으로 또한 사용될 수 있다.
초음파 진단용으로, 생적합성 기체 또는 기체 혼합물은, 바람직하게는 공기, 질소, 이산화탄소, 헬륨, 크립톤, 크세논, 아르곤, 메탄, 할로겐화 탄화수소 (퍼플루오르화탄소 및 황 헥사플루오라이드와 같은 플루오르화 기체 포함) 또는 그것의 혼합물로부터 선택할 수 있다. 용이하게, 퍼플루오르화탄소 (특히 C4F10 또는 C3F8) 또는 SF6는, 공기 또는 질소와의 혼합물에서 선택적으로 사용될 수 있다.
MRI용으로, 마이크로버블은 바람직하게는, 과분극화 네온, 과분극화 헬륨, 과분극화 크세논, 또는 그것의 혼합물 등의 과분극화된 영족 기체, 선택적으로, 공기, CO2, 산소, 질소, 헬륨, 크세논, 또는 상기 규정된 임의의 할로겐화 탄화수소와 혼합한 것을 함유할 것이다.
신티그램촬영용으로, 본 발명에 의한 마이크로버블은, 바람직하게는 Xe133 또는 Kr81 또는 그것의 혼합물과 같은 방사능 기체, 선택적으로, 공기, CO2, 산소, 질소, 헬륨, 크립톤, 또는 상기 규정한 바와 같은 임의의 할로겐화 탄화수소와의 혼합한 것을 함유할 것이다.
기체와 접촉하는 동결건조된 조성물은, 그 후에 주사용 발열원이 없는 멸균물과 같이 적합한 멸균 수성 주사가능하고 생리학적으로 허용되는 담체 액체, 식염수 (주사용 최종 생성물이 저장성이 없어지도록 용이하게 평형을 이룰 수 있다)와 같은 수용액, 또는 염 (예: 생리적으로 관용되는 반대이온과 함께 플라즈마 양이온의)과 같이 하나 이상의 삼투성-조정 물질의 수성 용액, 또는 당류, 당 알코올, 글리콜 및 다른 비이온성 폴리올 물질 (예: 글루코스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 예를 들어 온화한 수중교반을 제공하는 것과 같은 최소의 교반만을 요하는 물질의 첨가로 매우 용이하게 복원될 수 있다.
본 출원인이 관찰한 바에 따르면, 이렇게 얻어진 복원된 마이크로버블은, 통상적으로 에멀젼의 미세방울용으로 측정된 수 평균 직경보다 조금 더 낮은 수 평균 직경을 갖는다. 마이크로버블의 평균 수 직경은, 통상적으로 에멀젼 미세방울의 평균 수 직경의 약 60% 내지 약 90%이다. 대부분의 경우, 미세방울의 평균 수 직경의 약 70-75%의 마이크로버블의 평균 수 직경을 관찰했다.
건조 생성물이 바이알에 담겨있을 경우, 이것을 격막으로 용이하게 밀폐하고, 이 격막을 통해서 선택적으로 예비 충전된 주사기를 사용하여 담체 액체가 주입될 수 있다; 대안으로, 건조 생성물 및 담체 액체는, 이중 함 주사기와 같은 이중 함 장치에서 함께 제공될 수 있다. 복원 이후에, 생성물을 혼합시키거나 또는 온화하게 교반하는 것은 용이할 수 있다. 그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라서 안정화된 조영제 중의 기체 마이크로버블의 크기는, 복원된 건조 생성물에 적용되는 교반 에너지의 양과 본질적으로 관련이 없다. 따라서, 일관성있는 마이크로버블 크기를 가진 재생산가능 생성물을 제공하는데, 온화한 수중교반보다 더 강한 것이 필요하지 않을 수 있다.
물 또는 수용액중에 복원되어 생성된 마이크로버블 현탁액은, 적어도 12 시간 동안 안정할 수 있어서, 주입 전에 건조 생성물이 복원되는 시기에 따라서 상당한 유연성을 가지게 된다.
특별한 보존 상태가 필요한 것으로 공지된 과분극화된 기체를 함유하지 않는다면, 동결건조된 잔여물은 그것의 환경의 온도 조절의 필요없이, 보존되고 운반될 수 있으며, 특히 이러한 사용자가 특별한 보존 시설을 필요로 하지 않고 현장에서의 제제로 바로 투여 사용하도록 준비된 현탁액으로 병원 및 의사들에게 제공될 수 있다.
바람직하게는 이러한 경우에는, 두 가지 성분 키트의 형태로 제공될 수 있다.
상기 두 가지 성분 키트는, 두 개의 분리된 용기 또는 이중 챔버 용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는 전자의 경우, 용기는, 종래의 격막으로 밀폐된 바이알이고, 여기서 단계 b)의 동결건조된 잔여물을 함유한 바이알은 선택적으로 예비 충전된 주사기를 사용하여 담체 액체가 주입될 수 있는 격막으로 밀폐한다. 이러한 경우에, 제 2 성분의 용기로서 사용되는 주사기는, 그 다음에 조영제 주입용으로 또한 사용될 수 있다. 후자의 경우, 바람직하게는 이중 챔버 용기가 이중 챔버 주사기이고, 일단 동결건조물질을 복원시키고, 그 다음으로 적합하게 혼합하거나 또는 온화하게 교반시켜, 용기를 조영제 주입용으로 직접적으로 사용할 수 있다. 두 경우에 모두, 충분한 기포 형성 에너지가 용기의 내용물로의 적용을 의도하거나 허용하는 방법이 제공된다. 그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라서 안정화된 조영제중에 기체 마이크로버블의 크기는, 복원된 건조 생성물에 적용되는 교반 에너지의 양과 본질적으로 관련이 없다. 따라서, 균일한 마이크로버블 크기를 가진 재생산가능 생성물을 만드는 데 온화한 교반보다 더 강한 것이 통상적으로 필요하지 않다.
멸균 방법으로 수성 용액과 함께 건조 분말을 조합하는 것이 가능한 다른 두 개-챔버 복원 시스템은, 또한 본 발명의 범위내에 있다는 것이 당업자들에게 이해될 수 있을 것이다. 이러한 시스템에서, 수불용성 기체 및 환경 사이에 액상이 존재할 수 있다면, 생성물의 보존수명을 증가시키는 것은 특히 용이하다. 조영제를 생성하는데 필요한 물질이 용기에 이미 존재하지 않는 경우 (예: 복원되는 동안 인지질에 결합된 표적하는 리간드), 키트의 다른 성분과 함께, 바람직하게는 키트의 다른 성분과 함께 조합이 촉진되도록 적응된 형태 또는 용기로 포장될 수 있다.
특정한 용기, 바이알 또는 연결 시스템은 필요하지 않다; 본 발명은 종래의 용기, 바이알 및 어댑터를 사용할 수 있다. 단지 요구되는 것은, 스토퍼(stopper)및 용기 사이의 양호한 밀폐이다. 그러므로, 밀폐의 질은 가장 중요한 과제가 된다; 밀폐의 질은 낮추는 것은, 원하지 않는 물질이 바이알로 들어오게 할 수 있다. 멸균을 확실하게 할 뿐만 아니라, 안전한 및 적합한 복원을 확실히 수행하기 위해서 진공 유지는, 대기에서 또는 감압하에서 생성물이 막는데 반드시 필요하다. 스토퍼에 관하여는, 폴리(이소부틸렌) 또는 부틸 고무 등의 탄성 중합체에 바탕을 둔 화합물 또는 다성분 제제일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 얻어진 조영제는, 특정의 초음파 및 자기 공명(Magnetic Resonance)을 포함하는 진단 이미징 기술에 다양하게 사용될 수 있다. 가능한 다른 진단 이미징의 적용은, 신티그램촬영, 광 이미징, 및 엑스선 상 조영 이미징을 포함하는 엑스선 이미징을 포함한다.
예를 들어 자화율 조영제 및 과분극화된 기체 기포와 같은 진단 초음파 이미징 및 MR 이미징에서의 사용은, 본 발명의 바람직한 특성을 구성한다. 만약 원하는 3차원-이미징 기술이 사용될 수 있다면, 다양한 이미징 기술은, 예를 들어 기본 및 하모닉(harmonic) B-모드 이미징, 펄스 또는 상 초음파 반전 이미징 및 기본 및 하모닉 도플러 이미징을 포함하는 초음파 적용에서 사용될 수 있다.
토끼, 개 및 돼지의 생체 내에서의 초음파 실험은, 본발명에 따른 조영제가 0.001 ml/kg 체중 만큼 낮은 투여량의 정맥내 주입 후 15-25 dB의 심장근육으로부터의 후방산란 신호 강도의 증가를 야기할 수 있다는 것을 보여주었다. 신호는 색 도플러 또는 파워 펄스 인버젼(power pulse inversion)과 같은, 좀 더 고감도의 기술을 사용하여 훨씬 더 낮은 투여량에서 관찰될 수 있다. 이렇게 낮은 투여량에서, 심장의 심방실과 같은 혈액-충전 구획에서의 감쇠는, 심장 혈관구조에서 관심의 부위의 시각화를 가능케 할 만큼 충분히 낮은 것이 발견되었다. 실험은, 이러한 정맥내로 주입된 조영제가 전 혈액 전체를 통해서 퍼지고, 그로 인하여 모든 혈관 조직의 에코발생을 증강시키고, 재순환된다는 것을 또한 보여준다. 실험에서, 또한 통상적인 도플러 신호 증강 보조제로서 유용하다는 것을 발견했고, 게다가 초음파-전산화 단층촬영 및 생리학적인 유발 또는 간헐 이미징에서 유용할 수 있다.
심초음파 검사와 같은 초음파 적용용으로, 허파 시스템으 통한 자유로운 통과가 가능하도록 하고, 약 0.1-15 MHz의 바람직한 이미징 주파수를 갖는 공명을 달성하기 위해서, 예를 들어 0.5-7 ㎛ 등의 0.1-10 ㎛의 평균 크기를 갖는 마이크로버블이 통상적으로 사용된다. 앞서 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 조영제는, 바람직한 심초음파검사의 범위 내에서의 마이크로버블을 분산할 때, 크기의 분포가 매우 좁게 산출됨으로써, 생체내에의 그것의 안정성뿐만 아니라, 그것의 에코발생을 크게 증강시키고, 혈압측정, 혈류 추적 및 초음파 단층촬영과 같은 적용에 특히 용이한 조영제를 제공해준다.
초음파 적용에 있어서, 본 발명의 조영제는 예를 들어서, 주입된 인지질의 양이 0.1-200 ㎍/kg 체중, 전형적으로 에멀젼의 세척 단계를 거치지 않고 10-200 ㎍/kg, 및 에멀젼이 동결건조 이전에 세척되었다면, 0.1-30 ㎍/kg의 범위에서의 그러한 투여량으로 투여될 수 있다. 이러한 낮은 인지질의 농도의 사용은, 가능한 독부작용을 최소화하는데 본질적으로 용이한 것으로 이해될 것이다. 더 나아가서, 유효투여량에 존재하는 낮은 인지질의 농도는, 역효과없이 관찰 시간을 연장시키도록 투여량의 증가를 가능케 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 방법은, 극히 좁은 영역의 크기의 분포를 보여주는, 기체-충전 마이크로버블의 작은 직경을 얻는 것을 가능케 한다. 따라서, 혼합물의 성분 및 특히 수성-유기 혼합물의 유화 동안 적용되는 교반 에너지의 양을 적합하게 선택함으로써, 소망의 수 평균 직경 및 크기 분포를 갖는 기체-충전 마이크로버블을 얻는 것이 가능하다.
특히, 본 발명에 따른 방법의 활용에 의해서, 상대적으로 작은 평균 치수 및 특히 유용한 좁은 영역의 및 제어된 크기 분포를 특징으로 하는 인지질-안정화 작은 크기의 기체 마이크로버블을 포함하는 조영제를 얻는 것이 가능하다.
당업계에 공지된 대로, 마이크로/나노 입자 치수 및 그것의 각각의 크기 분포는, 가장 흔하게 사용되는 수 평균 직경 DN, 수 메디안 직경 DN50, 부피 평균 직경 DV 및 부피 메디안 직경 DV50으로 파라미터의 수치를 특징으로 할 수 있다. 수치로 직경을, 입자의 평균 수 치수의 표시를 제공하며, 부피의 직경은, 입자의 총 부피가 전 표본집단 내에서 어떻게 분포되느냐 하는 정보를 제공한다. 그렇지 않다면, 작은 부피 입자의 집단 중에서 소수의 큰 부피 입자의 존재는 대응하는 DV 값이 높은 값으로 변화되는 것을 야기할 수 있으므로, 입자의 집단의 분포를 평가할 때 DV50 값을 사용하는 것이 때로는 더 용이하다. DV50은 입자의 총 내부 부피의 절반이 DV50보다 더 작은 직경을 갖는 입자로 존재한다는 것을 나타내는 계산된 값이다. 이는 크기 분포의 평가에 있어서 뜻하지 않게 생성된 큰 부피의 입자의 작용을 감소시킬 수 있다. 명확히, 단일-크기의 입자는 동일한 DN, DN50, DV 및 DV50 값을 나타낸다. 다른 면에서, 입자의 분포의 영역이 넓어짐이 증가하는 것은, 그것의 각각의 비(예: DV/DN 비의 증가)의 대응하는 변화를 가지는 이러한 변화하는 값 사이에서 더 큰 차이를 일으킬 것이다. 예를 들어서, 큰 입자(예를 들어, 8 ㎛ 이상인 직경을 갖는 입자)의 퍼센트가 역시 낮고, 작은 입자 (예: 약 2 ㎛ 의 직경을 갖는 입자)를 주로 함유한 입자의 집단은, 대응하는 더 높은 DV/DN, 또는 DV50/DN 비를 갖고, DN 값과 비교할 때보다 더 높은 DV, 또는 DV50 값을 나타낸다.
따라서 본 발명의 방법은, 1.70 ㎛ 보다 더 작은 수 평균 직경 (DN) 및 DV50/DN 비가 약 2.30 또는 그 이하인, 바람직하게는 2.10 이하인 부피 메디안 직경 (DV50)을 갖는 마이크로버블을 제조하기에 특히 적합하다는 것을 발견했다. 바람직하게는, 상기 DN 값은 약 1.60 ㎛ 또는 그 이하, 더 바람직하게는 1.50 ㎛ 또는 그 이하, 좀 더 바람직하게는 1.30 ㎛ 또는 그 이하이다. 예를 들어 약 1 ㎛ 의 더 낮은 DN 값을 갖는, 또는 예를 들어 0.85 ㎛ 내지 0.80 ㎛까지의 좀 더 낮은 DN 값을 갖는 마이크로버블은, 본 발명의 방법으로 용이하게 얻어질 수 있다. DV50/DN 비는 바람직하게는 약 1.80 또는 그 이하, 더 바람직하게는 약 1.60 또는 그 이하, 좀 더 바람직하게는 약 1.50 또는 그 이하이다. 예를 들어 1.20의 더 낮은 값, 및 예를 들어 1.05의 좀 더 낮은 값의 DV50/DN 비를 갖는 마이크로버블은, 용이하게 얻어질 수 있다.
더 나아가서, 본 발명의 방법에 따라서 얻어진 작은 크기의 좁은 영역에서 분포하는 마이크로버블의 현탁액중에, 특히 약 1.5 ㎛ 이하의 DN 및 약 2.00 이하의 DV50/DN 비를 갖는 마이크로버블에서, 3 ㎛(입자의 총 개수에 대한, 입자의 퍼센트로 나타내어짐)보다 큰 직경을 갖는 마이크로버블의 양은, 전형적으로 현탁액중의 마이크로버블의 총 개수에 대하여 약 3% 이하, 바람직하게는 약 2% 이하, 더 바람직하게는 약 1% 이하라는 것을 관찰했다. 복원된 현탁액중의 마이크로버블의 농도는, 통상적으로 적어도 1x108 입자/ml, 바람직하게는 적어도 1x109 입자/ml이다.
상기 DV50, DN의 값 및 마이크로버블의 개수는, 0.7 내지 20 ㎛의 측정 범위를 갖고, 30 ㎛ 구경에 들어맞는 Coulter Counter Mark II 장치를 사용하여 측정됨으로 나타낸다.
조영제의 이러한 특정한 종류는, 초음파 이미징, 하기에 기술하는 바와 같이, 마이크로버블의 비선형 산란에 의존한 이미징 기술에 특별히 유용하다.
가장 최근의 초음파 조영-이미징 방법은, 초음파 조영제의 비선형 산란 특성을 이용한다. 문헌으로부터(예: Eatock et al., Journal of the Acoustical Society of America, vol.77(5), pp1692-1701, 1985) 비선형 산란은, 공명 크기보다 작거나 또는 그것에 가까운, 마이크로버블용으로만 중요성을 띠는 것으로 공지되었다. 특히, 공명 크기의 절반의 치수를 가진 마이크로버블을 통상적으로 사용할 수 있다. "공명 크기의 절반(half the resonance size)"은, 투과된 초음파(특정한 적용에 있어서 약 60 MHz까지 될 수 있음)의 중심 주파수의 두 배가 되는, 공명 주파수를 갖는 마이크로버블의 크기이다. 마이크로버블-기저 초음파 조영제를 함유하는 부피를 이미징할 때, 마이크로버블에 의한 비선형 산란 레벨에 의해서 조직 에코에 대한 마이크로버블 에코의 감지도는, 증강되고, 탐침 및 관심의 부위 사이에 위치한 마이크로버블에 의해서 야기되는 감쇠에 의하여 감소했다. 투과 경로에 따른 감쇠는, 비선형 기포-반응을 생성시키는 것을 가능케 하는 초음파 에너지를 감소시킨다; 수신 경로에 따른 감쇠는 에코-에너지를 제거하여 초음파 탐침에 도달할 수 있게 할 수 있다. 마이크로버블 크기의 넓은 분포 범위를 포함하는 현탁액의 경우, 공명 크기 및 공명 크기 이상에서, 마이크로버블은, 비선형 에코 신호에 효과적인 방법에 기여하지 않고, 주로 투과-수신 감쇠에 도움을 준다. 그러므로, 비선형 이미징의 전체 음향 반응은, 좁은 폭의 크기의 분포 및 공명 크기의 절반에 가까운 평균 크기를 갖는 마이크로버블의 조정 세트의 사용으로부터 크게 이익을 얻을 수 있다. 바람직하게는, 약 2.30의 또는 그 이하, 더 바람직하게는 2.10 또는 그 이하, 및 좀 더 바람직하게는 2.00 또는 그 이하의, DV50/DN 비에 대응하는 크기의 분포를 갖는 마이크로버블 제제를 사용한다. 바람직하게는, 사용된 마이크로버블 평균 크기는 공명 크기의 절반의 약 ±10%, 더 바람직하게는 공명 크기의 절반의 약 ±5%이다.
따라서, 본 발명의 더 나아간 양태는, 적어도 상기 대상의 부분을 이미징하고, 앞서 상술된 크기 및 크기의 분포를 갖는 기체 충전 마이크로버블을 포함하며 조영-증강시키는 조영제의 양을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 진단 이미징의 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 진단 이미징은, 대응하는 마이크로버블의 공명 크기로부터 결정된, 사전결정된 투과 주파수를 가진 초음파를 발생시키고, 좁은 영역에서의 크기의 분포, 및 공명 크기의 절반에 가까운, 평균 크기를 갖는 기체 충전 마이크로버블을 포함하는 조영제를 투여하는 초음파 장치의 방법에 의해서 상기 대상을 초음파를 조사하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 좁은 영역에서의 크기의 분포 및 마이크로버블의 평균 크기는, 상기와 같이 정의된다. 예를 들어서, Philips의 HDI 5000 초음파 기계 (예: L7-4 탐침 및 Mechanical Index 0.07인 펄스 반전 모드임)를 진단 이미징 방법에 사용할 수 있다. 이러한 방법에 따라서, 상기 대상은 척추이고, 상기 조영제는 혈관구조로 또는 상기 척추 체강내로 주입된다. 상기 조영제는 앞서 기술한 바와 같이, 복원용 기체 및 수성 매질과 접촉하는, 동결건조된 생성물을 포함하는, 키트로서 제공될 수 있다.
다음의 제한되지 않은 실시예는, 본 발명을 더 잘 설명하기 위해서 제공되었다.
하기 물질을 하기 실시예에서 사용했다.
인지질:
DPPS 디팔미토일포스파티딜세린 (Genzyme)IUPAC: 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린
DPPG 디팔미토일포스파티딜글리세롤 나트륨 염 (Genzyme)IUPAC: 1,2 -디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)]
DSPA 디스테아로일 포스파티드 산 나트륨 염 (Genzyme)IUPAC: 1,2 -디스테아로일-sn-글리세로-3-포스패이트
DSPG 디스테아로일포스파티딜글리세롤 나트륨 염 (Genzyme)IUPAC: 1,2 -디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린)
DSPC 디스테아로일포스파티딜콜린 (Genzyme)IUPAC: 1,2 -디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린
DSEPC 디스테아로일에틸포스파티딜콜린 (Avanti Polar Lipids)IUPAC: 1,2 -디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린
DAPC 디아라키도일포스파티딜콜린 (Avanti Polar Lipids)IUPAC: 1,2 -디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린
DSTAP 1,2 -디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판 클로라이드 (Avanti Polar Lipids)
DSPE-PEG2000 PEG2000과 함께 변형된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 나트륨 염 (Nektar Therapeutics)
DSPE-PEG5000 PEG5000과 함께 변형된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 나트륨 염 (Nektar Therapeutics)
DSPE-PEG2000-말레이미드 PEG2000-말레이미드와 함께 변형된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (Avanti Polar lipids)
SATA N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (Pierce)
RGD-4C H-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-NH2 (AnaSpec Inc.)
용매:
Fluka의 퍼플루오로-n-헥산 (C6F14)
Fluka의 퍼플루오로메틸시클로헥산 (CF3-시클로-C6F11)
Fluka의 퍼플루오로-n-헵탄 (C7F16)
Aldrich의 퍼플루오로-n-노난(C9F20)
Aldrich의 퍼플루오로데칼린
Fluka의 시클로헥산
Fluka의 시클로옥탄
Fluka의 n-데칸
Fluka의 n-옥탄
Fluka의 메타 자일렌
Fluka의 디이소프로필 세톤
Fluka의 CCl4
동결건조보호제:
Fluka의 만노스
Fluka의 글루코스
Fluka의 소르비톨
Fluka의 만니톨
Fluka의 말토스
Fluka의 덱스트란 6000
Fluka의 덱스트란 15000
Fluka의 덱스트란 40000
Fluka의 인뉼린
미세방울 및 마이크로버블의 특성
에멀젼 미세방울의 크기의 분포를 측정했다:
a) 에멀젼이 세척 단계를 거칠 때, 쿨터 카운터(Coulter counter)(0.7 내지 20 ㎛의 측정 범위를 갖는 30 ㎛의 구경에 들어맞는 Counter Mark II 장치)의 방법으로 측정했다; 에멀젼 10 ㎕를 식염수 100 ml로 실온에서 희석시켰고, 측정 이전에 3 분 동안 평형화시켰다;
b) 에멀젼이 세척 단계를 거치지 않았다면, 레이져 광 산란 입자 치수측정기 (Malvern Mastersizer, 희석 200x, 초점거리 45 mm, 표준 제공)의 방법으로 측정했다.
마이크로버블의 크기의 분포, 부피 농도 및 개수(동결건조 및 액상과의 복원 후)를 0.7 내지 20 ㎛의 측정 범위를 갖는, 30 ㎛의 구경에 들어맞는 Coulter Counter Mark II 장치를 사용하여 측정했다. 마이크로버블 샘플 50 ㎕를 실온에서 식염수 100 ml로 희석시켰고, 측정 전에 3 분 동안 평형화시켰다.
최종 제제중의 인지질의 양(마이크로버블 현탁액의 에멀젼)은, 다음의 설비를 가지고 HPLS-MS 분석법으로 측정했다: Agilent 1100 LC 크로마토그래피, Maherey Nagel로부터 MN CC 125/2 mm - 5 C8 컬럼, Agilent MSD G1946D 검출기.
동결건조
동결건조 방법론 및 장치는 다음과 같다. 에멀젼 (존재한다면, 세척 단계 이후에 선택적으로)을 -45℃에서 5 분 동안 먼저 냉동시키고, 그 다음에 Christ-Alpha 2-4 냉동-건조기를 사용하여 0.2 mbar의 압력하에서 실온에서 냉동-건조 (동결건조)시킨다.
실시예 1 (제제 1a-1n)
DPPS 10 mg을 약 10% w/w 만니톨 수용액 약 10 ml에 첨가한다; 현탁액을 65℃에서 15 분 동안 가열하고, 그 다음에 실온(22℃)에서 냉각시킨다. 퍼플루오로헵탄 (8% v/v)을 액상에 첨가하고, 고속 호모지나이저 (Polytron T3000, 3 cm의 탐침 직경)를 사용하여 1 분 동안 표 1에 나타낸 속도에서 약 4 cm의 직경의 비이커에서 유화시킨다. 결과의 부피 메디안 직경(DV50) 및 에멀젼의 미세방울의 수 평균 직경(DN)를 표1에 나타내었다. 그 후에 에멀젼을 과도한 인지질을 제거하도록 원심분리(10 분 동안 800-1200 rpm, Sigma centrifuge 3K10)시켰고, 분리된 펠렛(미세방울)을 회수하였고, 10% 만니톨 수용액의 동일한 초기의 부피로 재현탁시켰다.
그 다음에 세척된 에멀젼을 동결건조시키도록 100 ml 벌룬에 수집하고 냉동시켜서, 상기 표준 절차에 따라서 냉동 건조시킨다. 그 후에 동결건조물질을 퍼플루오로-n-부탄 35% 및 질소 65%를 포함한 대기에 노출시키고, 온화하게 수동 교반하여 초기의 것의 두 배의 부피의 물로 분산시킨다. 증류수로 복원한 후에 얻어진 마이크로버블 현탁액을 쿨터 카운터를 사용하여 분석한다. 얻어진 현탁액중의 마이크로버블의 농도는 약 1x109 입자/ml였다. 각각의 마이크로버블의 부피 메디안 직경 (DV50), 부피 평균 직경 (DV), 수 평균 직경 (DN) 및 3 ㎛(마이크로버블의 총 개수에 대한 퍼센트) 이상의 직경을 갖는 마이크로버블의 양을 표 1에 나타내었다. 하나 이상의 예가 동일한 교반 속도에서 수행되었을 때, 표 1에 나타내어진 값은 각각의 파라미터의 계산된 평균값을 나타낸다.
실시예 에멀젼 기체 충전 마이크로버블
교반(rpm) DV50(㎛) DN(㎛) DV50(㎛) DV(㎛) DN(㎛) DV50/DN >3㎛(%)
1a1b1c1d1e1f1g1h1i1j1k1l 8000900010000110001200012500140001450015000155001600017000 4.584.663.043.052.842.792.202.001.882.191.831.40 1.771.941.741.801.691.681.521.381.391.481.321.12 2.923.192.162.171.861.751.391.191.221.241.270.91 3.333.452.533.332.172.052.451.392.201.463.081.03 1.511.531.331.321.241.221.081.011.011.020.990.87 1.932.081.621.651.501.441.291.191.211.221.281.05 5.446.611.881.550.930.650.230.060.060.110.100.01
실시예 2 (제제 2a-2j)
인지질은 DPPS (20% w/w) 및 DSPC (80% w/w)의 혼합물이라는 차이점만이 있고, 인지질의 총량은 변함없이 유지하면서, 실시예 1에서 채택된 것과 동일한 절차를 따른다. 그 결과가 표 2에 요약되어 있다.
실시예 에멀젼 기체 충전 마이크로버블
교반(rpm) DV50(㎛) DN(㎛) DN(㎛) DV(㎛) DN(㎛) DV50/DN >3㎛(%)
2a2b2c2d2e2f2g2h2i2j 6000100001200012500130001350014000145001500016000 8.753.543.042.852.982.912.452.181.941.81 3.071.901.831.761.832.051.671.551.421.38 7.553.002.452.212.251.881.821.581.341.35 9.053.713.733.243.042.462.663.041.962.30 2.271.471.321.271.281.201.161.091.041.03 3.332.041.851.741.761.571.571.441.281.31 21.815.052.151.571.760.870.570.380.310.14
실시예 3 (제제 3a-3p)
표 3에서 기록된 바와 같이, DPPS/DSPC 중량 비가 변화한다는 차이점만을 갖고, 실시예 2에서 채택된 것과 동일한 절차를 따른다. 그 결과가 표 3에 요약되어 있다.
실시예 DPPS/DSPC비 에멀젼 기체 충전 마이크로버블
교반(rpm) DV50(㎛) DN(㎛) DN(㎛) DN(㎛) DV50/DN >3㎛(%)
3a3b3c3d3e3f3g3h3i3j3k3l3m3n3o3p 80/2075/2560/4060/4060/4050/5040/6040/6040/6040/6040/6030/7030/7025/7510/905/95 12000120001100012000140001200011000120001300014000145001100012000110001100011000 2.442.533.532.622.362.813.002.882.612.062.393.123.083.153.724.53 1.541.661.861.601.601.681.721.751.691.431.671.751.811.852.262.23 1.681.732.751.781.592.282.442.071.761.411.642.642.382.463.144.08 1.191.181.451.211.131.301.321.271.161.071.151.371.341.311.471.54 1.411.471.901.471.411.751.851.631.521.311.431.931.781.882.132.65 0.480.624.000.720.362.052.311.450.570.230.492.762.452.154.606.35
실시예 4
다른 중량 비를 갖는, DSPA 및 DPPS의 혼합물이 준비되었다는 차이점만을 갖고, 실시예 2에서 채택된 것과 동일한 절차를 따른다. 그 결과가 표 4에 요약되어 있다.
실시예 DSPA/DPPS비 에멀젼 기체 충전 마이크로버블
교반(rpm) DV50(㎛) DN(㎛) DV50(㎛) DN(㎛) DV50/DN >3㎛(%)
4a4b4c4d 25/7550/5050/5075/25 12000110001200012000 2.612.812.352.50 1.631.861.571.65 1.942.351.842.11 1.241.391.191.27 1.561.691.551.66 1.072.670.741.45
실시예 5 (제제 5a-5i)
DSPA 및 DPPS의, 1/1 w/w 인지질 혼합물이 10% w/w (인지질의 총 중량에 대한)의 팔미틱산과의 혼합물로 사용(총 농도 1.0 mg/ml)되었다는 차이점만을 갖고, 실시예 1에서 채택된 것과 동일한 절차를 따른다. 그 결과가 표 5에 요약되어 있다.
실시예 에멀젼 기체 충전 마이크로버블
교반(rpm) DV50(㎛) DN(㎛) DV50(㎛) DN(㎛) DV50/DN >3㎛(%)
5a5b5c5d5e5f5g5h5i 600080009000100001050011000120001300014000 10.025.315.043.823.363.222.692.282.00 2.642.492.692.021.961.871.611.561.44 6.873.733.202.852.512.311.741.561.30 2.071.621.551.381.321.281.141.071.00 3.322.302.062.071.891.811.531.461.30 18.007.976.222.652.441.410.520.230.26
실시예 6
DSEPC가 인지질로서 사용되었고 퍼플루오로헥산이 유기용매로 사용되었다는 차이점만을 갖고, 실시예 1에서 채택된 것과 동일한 절차를 따른다. 적용된 회전 속도는 11000 rpm이다. 치수, 크기의 분포 및 3 ㎛ 이상의 직경을 갖는 마이크로버블의 퍼센트는 다음과 같다.
DV50(㎛) DV(㎛) DV50/DN > 3 ㎛(%)
1.65 1.11 1.49 0.30
실시예 7 (제제 7a-7l)
DPPS (100 mg)를 인지질로서 함유한, 증류수 (10 ml)를 15분 동안 70℃에서 가열하고, 그 후에 실온에서 냉각시킨다. 다음의 표 6에서 열거된 유기용매 0.8 ml를 1 분 동안 10000 rpm에서 고속 호모지나이저 (Polytron T3000)를 사용하여 이러한 액상으로 유화하였다. 에멀젼을, 15% 덱스트란 15000 용액 10 ml를 첨가하고, 냉동시키고 동결건조시켰다(0.2 mbar, 24 시간). 동결건조 이후, 동결건조기에 공기를 주입한다. 증류수와 함께 복원된 후에 얻어진 마이크로버블 현탁액을 쿨터 카운터를 사용하여 분석한다. 표 6은 마이크로버블의 치수 및 크기의 분포의 결과를 요약했다.
실시예 용매 DV50(㎛) DN(㎛) DV50/DN
7a C6F14 2.77 1.44 1.92
7b CF3-시클로-C6F11 2.24 1.30 1.72
7c C7F16 2.48 1.40 1.77
7d C9F20 2.46 1.36 1.81
7e 퍼플루오로데칼린 3.76 1.52 2.47
7f 시클로헥산 2.61 1.41 1.85
7g 시클로옥탄 2.43 1.35 1.80
7h 데칸 2.01 1.12 1.79
7i 옥탄 2.87 0.96 2.99
7j 메타 자일렌 2.45 1.21 2.02
7k 디이소프로필 세톤 1.83 1.05 1.74
7l CCl4 1.90 1.27 1.50
실시예 8
상기 실시예 7은, 표 7에서 약술한 바와 같이, 유기용매로서 퍼플루오르화 헥산을 사용하였고, 다른 농도에서 다른 동결건조보호제를 사용하여, 동일한 방법론으로 반복하였다. 표 7은 마이크로버블의 치수 및 크기의 분포의 결과를 요약했다.
실시예 동결건조보호제 및 농도 (w/w) DV50(㎛) DN(㎛) DV50/DN
8a8b8c8d8e8f8g8h8j8k8i8l 만노스 5%글루코스 5%소르비톨 5%만니톨 10%만니톨 5%만니톨 4%말토스 5%덱스트란 6000 7.5%덱스트란 15000 5%덱스트란 15000 7.5%덱스트란 40000 7.5%이뉼린 5% 4.352.593.842.222.242.543.423.302.552.772.543.58 1.900.961.401.221.211.450.991.481.311.441.321.43 2.292.702.741.821.851.753.452.231.951.922.292.70
실시예 9 (제제 9a-9e)
실시예 1을 10000 rpm의 속도에서 혼합물을 유화함으로써 반복하였다. 게다가 동일한 실시예를 Pluronic F68 (Polaxamer 188에 대응하는 폴록사머)의 다른 양을 유화 전에 표 8에서 약술한 바와 같이 액상에 첨가함으로써 반복한다. 표 8은 마이크로버블의 크기의 분포 및 전환 수율로 상대적인 실험의 결과를 나타낸다. 에멀젼에서 측정된 미세방울의 개수에 대한 동결건조된 매트릭스의 복원으로 생성된 기체 충전 마이크로버블의 개수의 백분율로서 전환수율을 제공한다.
실시예 Pluronic*(mg/ml) DV50 DN DV50/DN 전환수율(%)
9a9b9c9d9e 00.250.51.02.0 2.424.6413.8512.5915.80 1.381.971.381.491.23 1.752.3610.048.4512.85 28.018.87.33.20.5
*액상의 부피에 따라 조절된 농도
상기 결과는, 인지질의 농도(즉, 혼합물 중의 계면활성제의 총량의 약 33%)의 절반에 대응하는 폴록사머의 농도를 가질 때, 마이크로버블의 전환수율 및 크기의 분포는 부정적인 영향을 받는다는 것을 보여준다.
실시예 10 (제제 10a-10d)
실시예 9를 반복하지만, Pluronic F68을 액상에 첨가하는 것 대신에, 콜레스테롤(Fluka의)의 다른 양을 표 9에서 약술한 바와 같이 유화 전에 액상에 첨가했다. 표 9는, 마이크로버블의 크기의 분포 및 전환 수율(에멀젼의 미세방울으로부터)로 상대적인 실험의 결과를 나타내었다.
실시예 콜레스테롤*(mg/ml) DV50 DN DV50/DN 전환수율(%)
10a10b10c10d 00.100.250.50 2.423.791.3514.02 1.381.311.051.70 1.752.891.288.25 28.017.85.70.8
*액상의 부피에 따라 조절된 농도
상기 결과는, 액상에서 콜레스테롤의 농도 0.050% (w/w)를 갖을 때, 마이크로버블의 전환수율 및 크기의 분포는 매우 부정적으로 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 이것이 마이크로버블의 허용되는 치수 및 크기의 분포를 제공하면서, 0.025%의 농도는 여전히 상당히 낮은 전환 수율을 야기한다.
실시예 11
DPPS 60 mg 및 만니톨 3 g을 함유한 증류수 (30 ml)를 15분 동안 70 ℃까지 가열하고, 그 다음에 실온으로 냉각시켰다.
퍼플루오로헵탄을 고속 호모지나이저 (Polytron®, 12500rpm, 1 분)를 사용하여 액상에서 유화하였다.
부피 메디안 직경 (DV50) 2.3 ㎛ 및 수 평균 직경 (DN) 2.0 ㎛를 나타낼 때, 결과의 에멀젼을 원심분리기로 한 번 세척하고, 증류수중의 만니톨 10% 용액 30 ml로 재현탁하고, 그 다음에 삼등분으로 나누었다 (3 x 10 ml).
제 1 부분 (A)를 다음의 동결건조 단계용과 같은 것에 사용한다. 제 2 부분 (B)를 주사기에 수집하고, 5 ㎛ Nuclepore® 필터(47mm - 폴리카르보네이트)를 통해서 수동-주입한다. 제 3 부분 (C)를 3 ㎛ Nuclepore® 필터(47mm - 폴리카르보네이트)를 통해서 동일한 방법으로 여과시킨다.
에멀젼을 100 ml 벌룬(-45℃, 5 분 동안)에서 냉동시키고, 그 후에 동결건조(0.2 mBar, 72 시간 동안)시킨다.
대기압을, C4F10 및 공기의 35/65 혼합물을 주입하여 복구시킨다. 각각의 동결건조물질을 증류수 (10 ml)에서 분산시켰다. 이렇게 얻어진 마이크로버블 현탁액을 쿨터 카운터를 사용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표에 기록했다.
DV50 DN DV50/DN
파트 A 1.71 1.12 1.53
파트 B 1.65 1.12 1.47
파트 C 1.57 1.09 1.44
상기 결과에서 나타나는 바와 같이, 부가적인 여과 단계는 마이크로버블의 치수를 더 감소시키고, 각각의 크기의 분포를 감소시키는 것을 가능케한다.
실시예 12
11000 rpm의 교반 속도에서, DSPC/DSTAP 7/3 (w/w)의 혼합물 10 mg을 사용함으로써, 실시예 1을 반복했다.
에멀젼 방울 및 마이크로버블의 특성은 다음과 같다:
에멀젼 방울 기체 충전 마이크로버블
DV50 DN DV50 DN >3㎛
2.36 1.48 2.10 1.12 0.63
실시예 13
10000 rpm (실시예 13a)의 속도에서 혼합물을 유화함으로써, 실시예 1의 제조를 반복한다.
약 0.9 mg의 DSPE-PEG2000 (분산된 인지질의 총량의 약 8,3%)을 초기의 수성 현탁액 (실시예 13b)에 더 첨가시킴으로써, 동일한 제조를 반복한다.
두 가지 제조 모두에서, 원심분리기에 의한 세척은 수행되지 않는다.
표 10은 에멀젼 및 마이크로버블 현탁액의 두 가지 모두의 제조의 특성을 나타낸다.
에멀젼 마이크로버블
실시예 DV50(㎛) DN(㎛) DV50(㎛) DN(㎛) DV50/DN 전환수율(%)
13a 3.19 1.66 2.66 1.33 2.00 29.5
13b 4.32 1.43 5.81 1.18 4.92 18.8
상기 결과는, DSPE-PEG의 농도를 10 중량%(인지질의 총량에 대하여) 미만으로 가질 때, 마이크로버블의 전환 수율 및 크기의 분포는 모두 부정적으로 영향을 받는다는 것을 보여준다.
실시예 14
DPPS를 DAPC/DPPS의 1:1 (w/w) 혼합물의 동일한 양을 가지고 치환함으로써, 실시예 11의 제조를 반복한다.
결과의 에멀젼을 원심분리기에 의한 세척을 거치지 않고, 10 ml씩 삼등분으로 나눈다.
DSPE-PEG2000 및 DSPE-PEG5000의 수성 현탁액을 초음파분해(3 mm 초음파분해 탐침, Branson 250 소니파이어(sonifier), 아웃풋 30%, 5 분 동안)하에서 10%의 만니톨 용액 5 ml로 각각의 DSPE-PEG 25 mg을 분산시킴으로써 따로따로 제조한다.
그 다음에 10%의 만니톨 용액의 분취량 2.5 ml를 에멀젼의 제 1 부분에 첨가한다 (실시예 14a)
조제된 DSPE-PEG2000 현탁액의 분취량 2.5 ml를 에멀젼의 제 2 부분에 첨가한다 (실시예 14b)
조제된 DSPE-PEG5000 현탁액의 분취량 2.5 ml를 에멀젼의 제 3 부분에 첨가한다 (실시예 14c)
세 가지 혼합물을 한 시간 동안 저으면서 60℃에서 가열한다. 실온에서 냉각시킨 후에, 미세방울의 크기를 Malvern Mastersizer의 방법으로 측정한다. 결과를 표 11에 기록하였다.
실시예 11의 절차에 따라서, 그 다음에 에멀젼을 동결건조시킨다. C4F10 및 공기의 35/65 혼합물을 주입함으로써 대기압을 복구시킨다. 각각의 동결건조물질을 증류수 (10 ml)로 분산시켰다.
이렇게 얻어진 마이크로버블 현탁액을 쿨터 카운터를 사용하여 분석하였다 (표 11 참조).
그 다음에 마이크로버블 현탁액을 원심분리기 (180g/10 분)에 의해서 증류수와 함께 두 번 세척하고, 상기 과정에 따라서 다시 동결건조시킨다. 건조된 조성물의 DSPE-PEG의 양을 HPLC-MS의 방법으로 측정한다. 결과를 다음의 표 11에 나타내었다.
에멀젼 마이크로버블
실시예 DV50(㎛) DN(㎛) DV50(㎛) DN(㎛) DSPE-PEG(% w/w)
14a 2.6 2.3 1.9 1.1 0.0
14b 2.5 2.3 3.4 1.3 35.5
14c 2.5 2.3 2.2 1.2 37.9
상기 결과로부터 추론할 수 있는 것처럼, 생성된 에멀젼에 DSPE-PEG 현탁액의 이어지는 첨가는, 마이크로버블의 최종 성질에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 안정화 층(이 경우에 안정화 주머니를 형성하는 인지질의 총 중량의 30% 이상)의 조성물중에서 상대적으로 높은 DSPE-PEG의 양을 주입할 수 있게 한다.
유사한 결과를, 다른 PEG 변형 인지질, 특히 DSPE-PEG2000-비오틴 또는 DSPE-PEG2000-말레이미드와 함께, 및 인지질을 갖는 펩티드, 특히 DSPE-PEG2000-말레이미드-SATA-RGD4C와 함께 얻을 수 있다.
인지질을 갖는 후자의 펩티드는, SATA와 함께 RGD-4C 펩티드를 반응하고, SATA의 티올기를 탈보호하고, DSPE-PEG2000-말레이미드와 함께 탈보호된 RGD4C-SATA와 반응함으로써, 공지된 기술에 따라서 제조될 수 있다. "Development of EGF-conjugated liposomes for targeted delivery of boronated DNA-binding agents", by Bohl Kullberg et al., Bioconjugate chemistry 2002, 13, 737-743, (DSPE-PEG-말레이미드 분자중에 EGF 단백질의 삽입을 기술)에 기재된 제조법을 통상적으로 사용할 수 있다.
실시예 15
1:1 (w/w) DPPS/DSPC 혼합물 10 mg을 약 10% (w/w) 만니톨 수용액 10 ml에 첨가했다.
혼합물을 15 분 동안 70℃에서 가열하고, 그 다음에 실온(22℃)에서 냉각시켰다. 시클로옥탄을 마이크로 믹서(표준 슬릿 Interdigidital micro Mixer, 니켈-상-구리 인레이(inlay)를 가진, 40 ㎛ x 300 ㎛인 housing SS 316Ti, Institut fur Microtechnik Mainz GmbH)의 주입구를 통해서 0.2 ml/분의 흐름 속도로 실온에서 20 ml/분으로 순환하는 액상에, 유기용매의 7.4% (v/v)의 총량이 되도록 첨가한다. 유기용매의 첨가를 끝마치고, 에멀젼을 부가적으로 20 분 동안 마이크로믹서에서 재순환시킨다.
그 다음에 에멀젼을 2 ml의 각각의 다섯개의 분취량으로 나누고, 다섯개의 DIN8R 바이알에 주입시킨다. 다섯번째는 가열하지 않고, 표 12에서 나타낸 바와 같이, 네 개의 바이알을 밀폐하고, 60, 80, 100 및 120℃의 온도에서 30 분 동안 각각 가열한다.
그 다음에 에멀젼을 실온으로 냉각시키고, 다음의 절차에 따라서 다섯개의 바이알의 내용물을 동결건조시킨다. 1 ml의 각각의 에멀젼을 DIN8R 바이알에 수집하고, -5℃에서 냉동시킨다; 온도를 1 시간 동안 -45℃보다 더 낮게 하고, 에멀젼을 그 다음에 5 시간 동안 30℃ 및 0.2 mbar에서 최종 건조 단계와 함께, 12 시간 동안 -25℃ 및 0.2 mbar에서 동결 건조(Telstar Lyobeta35 동결건조기)시켰다.
동결건조된 생성물은 그 다음에 퍼플루오로-n-부탄 35% 및 질소 65%를 함유한 대기에 노출시키고, 온화한 수동교반으로 초기의 것의 두 배의 부피의 물에서 분산시켰다. 표 12는 마이크로버블의 최종 현탁액의 특성의 결과를 보여준다.
가열 DV50 DN DV50/DN 에멀젼의 ml 당 마이크로버블의 개수
가열하지 않음 10.45 1.63 6.41 5.34 x 107
60℃ 4.85 1.32 3.67 7.83 x 107
80℃ 5.34 1.29 4.14 8.51 x 107
100℃ 6.96 1.66 4.19 4.92 x 108
120℃ 3.05 1.50 2.03 8.69 x 108
상기 결과로부터, 생성된 에멀젼을 열 처리시키는 것은, 마이크로버블의 총 개수가 또한 증가하는 동안, 최종 마이크로버블 현탁액의 크기의 분산이 좁은 영역에 분포하게 됨이 나타난다. 특히, 100℃ 이상으로 가열온도를 증가시킴으로써, 현탁액중의 마이크로버블의 총 개수의 증가 뿐만 아니라, 에멀젼의 세척 단계없이도 또한 상대적으로 좁은 영역에서 분포하는 마이크로버블의 크기 분포를 얻는 것이 가능하다.
실시예 16
DPPS 10 mg 및 만니톨 1 g을 함유한 증류수 (10 ml)를 15 분 동안 70℃로 가열하고, 그 다음에 실온으로 냉각시킨다. DPPE-MPB(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)부틸아미드] Na 염 - Avanti Polar Lipids)를 첨가한다(4.8 중량% - 0.5 mg). 인지질을 초음파욕(Branson 1210 - 3 분)을 사용하여 액상에서 분산시킨다.
퍼플루오로헵탄 (Fluka로부터, 0.8 ml)은 고속 호모지나이저 (Polytron® T3000, 15000rpm, 1 분)를 사용하여 액상(얼음욕으로 냉각)에서 유화한다.
결과의 에멀젼은, Malvern Mastersizer로 측정된 바와 같이, 2.3 ㎛의 부피 메디안 직경 (DV50) 및 2.1 ㎛의 수 평균 직경 (DN)을 나타내었다.
에멀젼을 원심분리기로 두 번 세척하고, 그 다음에 증류수중의 10% 만니톨 용액 9.5 ml로 재현탁시켰다. 세척된 에멀젼을 냉동시키고(-45℃, 5 분), 그 다음에 동결건조(0.2 mBar 하에서, 24시간 동안)시켰다.
대기압을 C4F10 및 공기의 35/65 혼합물을 주입함으로써 복구시켰다. 동결건조물질을 증류수(20 ml) 중에 분산시키고, 마이크로버블을, 원심분리로 한 번 세척하고, 그 다음에 티오아세틸화 아비딘 3.4 mg, 히드록실아민 용액 400 ㎕ (PBS 50 mM중에 13.92 mg, pH: 7.5)을 함유한, EDTA를 함유 인산염 완충 식염수 4 ml(분자 조성물: 10 mM 인산염, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM EDTA) 중에 재분산시키고, 티오아세틸화 아비딘의 티올기를 탈보호하도록 첨가했다.
두 시간 동안 현탁액을 디스크 로테이터(disk rotator) (Fisher Scientific)에서 역으로 젓는다. 그 다음에 NaOH 1N 150 ㎕를 첨가했다.
이렇게 얻어진 아비딘-표지 마이크로버블을 원심분리 (10000 rpm, 10 분, Sigma 원심분리기 3K10)로 PBS와 함께 두 번 세척했다. 얻어진 마이크로버블 현탁액을 쿨터 카운터를 사용하여 분석하였고, 1.6 ㎛의 직경 DV50 및 1.2 ㎛의 DN을 나타냈다.
표적화되는 마이크로버블 조성물의 효능은 생체 외에서 및 생체 내에서 모두 시험되었다.
생체외 실험:
마이크로버블의 표면에의 아세틸화 아비딘의 효과적인 결합을 시험하기 위하여, 피브린 함유 웰 두 세트를 준비했다. 제 1 세트에는, 피브린 표면만이 존재한다. 제 2 세트에는, 피브린이 비오틴-표제 항피브린 펩티드 (DX-278, WO 02/055544에서 개시됨)와 함께 예비처리되었다. 상기대로 제조된 마이크로버블 현탁액을 웰에 첨가했다 (5x108 마이크로버블/웰). 2 시간 동안 인큐베이션 (뒤집어서) 및 몇 번의 세척 후에, 웰의 두 세트에서 피브린 표면을 광학현미경으로 관찰했다. 비오틴화된 항피브린 펩티드가 없는 웰에서 마이크로버블을 본질적으로 관찰할 수 없었지만, 마이크로버블의 넓은 적용범위를 비오틴화 항피브린 펩티드 함유 웰에서 관찰했다.
생체내 실험:
FeCl3 방법으로 두 토끼의 복부대동맥중에 혈전이 생성되었다(Lockyer et al, 1999, Journal of Cardiovascular Pharmacology, vol 33, pp 718-725).
에코 이미징을 HDI 5000 초음파 기계 (Philips), 펄스 반전 모드, L7-4 탐침, MI: 0.07을 가지고 수행한다.
비오틴화 항체 (활성 혈소판 GPIIB/IIIA 수용체에 특이적 CD41)를 그 다음에 두 마리의 토끼로 정맥내로 주입한다.
30 분 후에, 아비딘-표제 마이크로버블을 포함하는 마이크로버블 현탁액을 제 1 토끼의 정맥내로 주입한다(1x109 마이크로버블/ml). 주입 후 15 분 후에, 혈전의 강한 혼탁화가 현탁액에서 관찰되었다. 주입으로부터 적어도 한 시간 후에 이러한 혼탁화를 여전히 눈으로 볼 수 있다.
아비딘-표제 마이크로버블 없이 마이크로버블 현탁액의 동량을 제 2 토끼의 정맥내로 주입한다. 혈전의 약한 혼탁화만이 관찰되었다.

Claims (40)

  1. 수성 담체 액체 및 기체와 접촉하여, 인지질에 의해서 현저하게 안정화된 기체-충전 마이크로버블의 현탁액으로 복원되는 동결건조 매트릭스를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) i) 물을 포함하는 수성 매질, ii) 물과 실질적으로 비혼화성인 유기 용매, iii) 50 중량% 이상의 인지질을 포함하는 양친매성 물질의 유화 조성물, 및 iv) 동결건조보호제를 포함하는 수성-유기 에멀젼을 제조하는 단계;
    b) 상기 인지질을 포함하는 동결건조된 매트릭스를 얻도록, 상기 유화된 혼합물을 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 인지질에 의해서 현저하게 안정화된 기체-충전 마이크로버블의 액체 수성 현탁액을 포함하는 주사가능한 조영제를 제조하는 방법으로서,
    a) i) 물을 포함하는 수성 매질, ii) 물과 실질적으로 비혼화성인 유기용매; iii) 50 중량% 이상의 인지질을 포함하는 양친매성 물질의 유화 조성물 및 iv) 동결건조보호제를 포함하는 수성-유기 에멀젼을 제조하는 단계;
    b) 상기 인지질을 포함하는 동결건조된 매트릭스를 얻도록, 상기 에멀젼을 동결건조시키는 단계;
    c) 생적합성 기체를 가진 상기 동결건조된 매트릭스를 접촉시키는 단계;
    d) 상기 인지질에 의해서 현저하게 안정화된 기체-충전 마이크로버블의 현탁액을 얻도록, 생성물을 생리학적으로 허용되는 수성 담체 액체에 용해시킴으로써 상기 동결건조된 매트릭스를 복원시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 에멀젼을 제조하는 단계 a)는 다음의 단계: a1) 수성 매질에서 유화 조성물 및 동결건조보호제를 분산시킴으로써 현탁액을 제조하는 단계; a2) 얻어진 현탁액과 유기 용매를 혼합시키는 단계; a3) 에멀젼을 얻도록, 혼합물을 제어된 교반을 시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 10 g/l 이하의 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 1.0 g/l 또는 그 이하의 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 0.2 g/l 또는 그 이하의 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 약 0.01 g/l 또는 그 이하의 수용성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매는 0.001 g/l 또는 그 이하의 용해도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 유기 용매는 분지형 또는 선형 알칸, 알켄, 시클로-알칸, 방향족 탄화수소, 알킬 에테르, 케톤, 할로겐화 탄화수소, 퍼플루오르화 탄화수소 및 그것의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 유기 용매는 펜탄, 헥산, 펩탄, 옥탄, 노난, 데칸, 1-펜텐, 2-펜텐, 1-옥텐, 시클로펜탄, 시클로헥산, 시클로옥탄, 1-메틸-시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 1,2-디메틸벤젠, 1,3-디메틸벤젠, 디-부틸 에테르 및 디-이소프로필케톤, 클로로포름, 사염화탄소, 2-클로로-1-(디플루오로메톡시)-1,1,2-트리플루오로에탄 (엔플루란), 2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로에탄 (이소플루란), 테트라클로로-1,1-디플루오로에탄, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로헵탄, 퍼플루오로노난, 퍼플루오로벤젠, 퍼플루오로데칼린, 메틸플루오로부틸에테르, 메틸플루오로이소부틸에테르, 에틸퍼플루오로부틸에테르, 에틸퍼플루오로이소부틸에테르 및 그것의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용매의 양은 물의 양에 대하여 약 1 부피% 내지 약 50 부피%인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조보호제는 탄수화물, 당 알코올, 폴리글리콜 및 그것의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 전기한 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조보호제는 글루코스, 갈락토스, 프룩토스, 슈크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 아밀로스, 아밀로펙틴, 시클로덱스트린, 덱스트란, 이뉼린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분(HES), 에리쓰리톨, 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌글리콜 및 그것의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 물의 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 25 중량%의 동결건조보호제의 양을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항, 제 2 항, 또는 제 3 항에 있어서, 인지질은 디라우로일-포스파티딜콜린 (DLPC), 디미리스토일-포스파티딜콜린 (DMPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린 (DPPC), 디아라키도일-포스파티딜콜린 (DAPC), 디스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일-포스파티딜콜린 (DOPC), 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (에틸-DSPC), 디펜타데카노일-포스파티딜콜린 (DPDPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일-포스파티딜콜린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일-포스파티딜콜린 (PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (SPPC), ), 1-팔미토일-2-올레일포스파티딜콜린 (POPC), 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (OPPC), 디라우로일-포스파티딜글리세롤 (DLPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디아라키도일포스파티딜-글리세롤 (DAPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (DMPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디스테아로일포스파티딜글리세롤 (DSPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디올레오일-포스파티딜글리세롤 (DOPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일 포스파티드 산 (DMPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디팔미토일 포스파티드 산 (DPPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디스테아로일 포스파티드 산 (DSPA), 디아라키도일포스파티드 산 (DAPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 디올레일포스파티딜-에탄올아민 (DOPE), 디아라키도일포스파티딜에탄올아민 (DAPE), 디리놀에일포스파티딜에탄올아민 (DLPE), 폴리에틸렌글리콜 변형 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE-PEG), 폴리에틸렌글리콜 변형 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민 (DSPE-PEG), 폴리에틸렌글리콜 변형 디올레일포스파티딜-에탄올아민 (DOPE-PEG), 폴리에틸렌글리콜 변형 디아라키도일포스파티딜에탄올아민 (DAPE-PEG), 폴리에틸렌글리콜 변형 디리놀에일포스파티딜에탄올아민 (DLPE-PEG), 디미리스토일 포스파티딜세린 (DMPS), 디아라키도일 포스파티딜세린 (DAPS), 디팔미토일 포스파티딜세린 (DPPS), 디스테아로일포스파티딜세린 (DSPS), 디올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 디팔미토일 스핑고미엘린 (DPSP) 및 디스테아로일스핑고미엘린 (DSSP) 및 그것의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 양친매성 물질의 유화 조성물은, 총실전하를 갖는 인지질 또는 양친매성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 또는 제 13 항에 있어서, 인지질의 양은, 유화된 혼합물의 총 중량에 대하여 약 0.005 중량% 내지 약 1.0 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 인지질의 양은, 유화된 혼합물의 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 1.0 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항, 제 2 항, 또는 제 3 항에 있어서, 인지질은 표적화하는 리간드, 또는 표적화하는 리간드와 함께 반응할 수 있는 보호된 반응기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항, 제 15 항, 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 에멀젼은, 리소지질; 지방산 및 그것의 알칼리 또는 알칼리 금속과의 각각의 염; 폴리머를 갖는 지질; 술폰화 단당, 이당, 올리고당, 또는 다당을 갖는 지질; 에테르 또는 에스테르-결합 지방산을 갖는 지질; 중합된 지질; 디아세틸 포스페이트; 디세틸 포스페이트; 스테아릴아민; 세라미드; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 지방 알코올; 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르; 폴리옥시에틸화 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀레이트; 에톡실화 대두 스테롤; 에톡실화 캐스터 오일; 에틸렌 옥시드 (EO) 및 프로필렌 옥시드 (PO) 블록 코폴리머; 당산의 스테롤 에스테르; 지방산과 당과의 에스테르; 글리세롤과 (C12-C24) 디카르복실 지방산과의 에스테르 및 그것 각각의 알칼리 또는 알칼리-금속 염; 사포닌; 긴 사슬 (C12-C24) 알코올; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)-1-티오-β-D-갈락토피라노시드; 디갈락토실디글리세라이드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥시-1-티오-β-D-갈락토피라노시드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥실-1-티오-β-D-만노피라노시드; 12-(((7'-디에틸아미노쿠마린-3-일)카르보닐)메틸아미노)옥타데칸 산; N-[12-(((7'-디에틸아미노쿠마린-3-일)카르보닐)메틸아미노)옥타데카노일]2-아미노팔미트 산; N-숙신일-디올레일포스파티딜에탄올아민; 1-헥사데실-2-팔미토일글리세로-포스포에탄올아민; 팔미토일호모시스테인; 적어도 하나의 (C10-C20) 알킬 사슬을 포함하는 알킬암모늄 염; (C3-C6) 알킬렌 다리를 통해서 N-원자에 결합된, 적어도 하나의 (C10-C20) 아실 사슬을 포함하는 제3차 또는 제4차 암모늄 염: 및 혼합물 또는 그것의 조합물로부터 선택된 양친매성 물질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 a)의 수성-유기 에멀젼은, 동결건조 단계 b) 이전에 세척 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 a)의 수성-유기 에멀젼은, 동결건조 단계 b) 이전에 미세여과 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 동결 건조 단계 b)이전에 단계 a)에 따라서 얻어진 수성-유기 에멀젼에 양친매성 화합물을 더 포함하는 수성 현탁액을 첨가하여, 상기 양친매성 화합물을 더 포함하는 제 2 수성-유기 에멀젼을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 수성 현탁액 및 상기 수성-유기 에멀젼의 혼합물을 가열하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 혼합물을 약 40℃ 내지 약 80℃의 온도에서 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 양친매성 화합물은, PEG-변형 인지질, 반응 부분을 갖는 PEG-변형 인지질, 또는 표적화하는 리간드를 갖는 PEG-변형 인지질인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항, 제 2 항, 또는 제 23 항에 있어서, 동결건조 단계 b) 이전에 수성-유기 용매를 제어하여 가열하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 제어된 가열은 약 60℃ 내지 125℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 제어된 가열은 약 80℃ 내지 120℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 에멀젼은 밀폐된 바이알에 담겨있는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 생적합성 기체는, 공기; 질소; 산소; 이산화탄소; 수소; 일산화질소; 비활성 기체; (C1-C7) 알칸, (C4-C7) 시클로알칸, (C2-C7) 알켄 및 (C2-C7) 알킨을 포함하는 저분자량 탄화수소; 에테르; 케톤; 에스테르; 할로겐화 (C1-C7) 탄화수소, 케톤 또는 에테르; 또는 앞서 언급한 것의 임의의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 할로겐화 탄화수소 기체는 브로모클로로디플루오로-메탄, 클로로디플루오로메탄, 디클로로디플루오로-메탄, 브로모트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄, 클로로펜타플루오로에탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 그것의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 할로겐화 탄화수소 기체는 퍼플루오르화 탄화수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 퍼플루오르화 탄화수소 기체는, 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로헵탄; 퍼플루오로프로펜, 퍼플루오로부텐, 퍼플루오로부타디엔, 퍼플루오로부트-2-인, 퍼플루오로시클로부탄, 퍼플루오로메틸시클로부탄, 퍼플루오로디메틸시클로부탄, 퍼플루오로트리메틸시클로-부탄, 퍼플루오로시클로펜탄, 퍼플루오로메틸시클로펜탄, 퍼플루오로디메틸시클로-펜탄, 퍼플루오로메틸시클로헥산, 퍼플루오로메틸시클로헥산, 퍼플루오로메틸시클로헥산 및 그것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 생적합성 기체로 충전되고, 인지질을 주로 포함하는 안정화 층을 포함하는 마이크로버블의 주사가능한 수성 현탁액으로서, 상기 마이크로버블은 수 평균 직경(DN)이 1.70 ㎛ 이하이고, DV50/DN 비가 약 2.00 또는 그 이하인, 그러한 부피 메디안 직경(DV50)을 갖는 것을 특징으로 하는 수성 현탁액.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 마이크로버블은 1.60 ㎛ 또는 그 이하의 DN 값, 바람직하게는 1.50 ㎛ 또는 그 이하, 더 바람직하게는 1.30 ㎛ 또는 그 이하를 갖는 것을 특징으로 하는 수성 현탁액.
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 마이크로버블은 약 1.80 또는 그 이하의 DV50/DN 비, 바람직하게는 약 1.60 또는 그 이하, 더 바람직하게는 약 1.50 또는 그 이하를 갖는 것을 특징으로 하는 수성 현탁액.
  38. 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른 수성 현탁액을 포함하는, 진단 이미징에 사용하는 조영제.
  39. 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른 수성 현탁액의 조영을 강화하는 양으로 대상에게 투여하고, 상기 대상의 적어도 한 부분을 이미징하는 것을 포함하는 진단 이미징 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 사전결정된 투과 주파수를 가진 초음파를 생성하는 초음파 장치에 의해, 상기 대상에게 초음파를 조사하는 것을 포함하며, 이 주파수로부터 마이크로버블의 대응하는 공명 크기가 결정되고, 폭이 좁은 크기의 분포 및 공명 크기의 절반에 가까운 평균 크기를 갖는 기체-충전 마이크로버블을 포함하는 조영제를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020057013951A 2003-02-04 2004-02-03 초음파 조영제 및 그것의 제조방법 KR101076053B1 (ko)

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