NO331966B1

NO331966B1 - Fremgangsmater for fremstilling av ultralydkontrastmidler

Info

Publication number: NO331966B1
Application number: NO20054089A
Authority: NO
Inventors: Feng Yan; Michel Schneider; Christian Guillot; Philippe Bussat
Original assignee: Bracco Suisse Sa
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2012-05-14
Also published as: DK1590006T3; RU2005127634A; MXPA05007730A; US20110236320A1; US20130101522A1; ATE480263T1; AU2004210221B2; WO2004069284A2; KR20050096959A; NO20054089D0; KR101076053B1; JP4670083B2; CA2512454A1; JP2006520754A; IL169677A; CN1744921A; US20060051297A1; NO20054089L; RU2345793C2; WO2004069284A3

Abstract

Det beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av en lyofilisert matriks og, ved rekon-stituering av denne, et respektiv injiserbart kontrastmiddel omfattende en flytende, vandig suspensjon av gassfylte mikrobobler som er stabilisert overveiende med et fosfo-lipid. Fremgangsmåten omfatter fremstilling av en emulsjon fra et vandig medium, et fosfoli-pid og et vannublandbart, organisk oppløsningsmiddel. Emulsjonen frysetørkes deretter og rekonstitueres så i en vandig suspensjon av gassfylte mikrobobler. Fremgangsmåten tillater å oppnå suspensjoner omfattende mikrobobler med en relativt liten diameter og en snever størrelsesfordeling.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en tørr eller lyofilisert formulering som er brukbar for fremstilling av en gass inneholdende et kontrastmiddel som kan benyttes for diagnostisk billedopptak og en prosess for fremstilling av nevnte gass inneholdende kontrastmiddelet.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer også tørrformuleringer som er fremstilt ved prosessen og som kan rekonstitueres for å danne kontrastmiddelsuspensjoner som er brukbare ved diagnostisk billedopptak. Oppfinnelsen inkluderer videre suspensjoner av gassfylte mikrobobler som er brukbare ved diagnostisk billedopptak, fremstilt ved bruk av tørr-formuleringer ifølge oppfinnelsen, så vel som beholdere eller tokomponentsett som inneholder tørrformuleringen ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsens bakgrunn

Hurtig utvikling av ultralydkontrastmidler har i de senere år generert et antall forskjellige formuleringer som er brukbare ved ultralydbilledopptak av organer og vev i det menneskelige eller animalske legeme. Disse midler er designert for å anvendes primært som intravenøse eller intraarterielle injiserbare stoffer i forbindelse med bruken av medisinsk ekografisk utstyr som benytter for eksempel B-modus billeddannelse (basert på den romlige fordeling av tilbake sprednings vev egenskaper) eller Doppler-signalproses-sering (basert på kontinuerlig bølge- eller pulset Dopplerprosessering av ultralydekkoer for å bestemme blod- eller væskestrømparametere).

En klasse injiserbare formuleringer som er brukt som ultralydkontrastmidler inkluderer suspensjoner av gassbobler med en diameter på få mikron, dispergert i et vandig medium

Bruken av suspensjoner av gassbobler i en bærervæske er som effektive ultralydreflek-torer velkjent i teknikken. Utviklingen av mikroboblesuspensjoner som ekkofarmasøy-tika for å forsterke ultralydbilledopptak fulgte tidlige observasjoner dithen at hurtige, in-travenøse injeksjoner av vandige oppløsninger kan forårsake at oppløste gasser kommer ut av oppløsningen ved å danne bobler. På grunn av den vesentlige forskjell i akustisk impedanse i forhold til blod ble disse intravaskulære gassbobler funnet å være udmer-kede reflektorer forultralyd. Injeksjonen av suspensjonen av gassbobler i en bærervæske inn i blodstrømmen i en levende organisme forsterker sterkt ultralydekkografibilledopp-tak og forsterker således visualiseringen av de indre organer. Fordi billedopptak av organer og dype vev kan være avgjørende for å fastlegge en medisinsk diagnose er mange forsøk viet utvikling av stabile suspensjoner av høyt konsentrerte gassbobler som samtidig vil være enkle å fremstille og å administrere, inneholde et minimum inaktive specier og i stand til lang lagring og enkel fordeling.

Den enkle dispergering av frie gassbobler i det vandige medium er imidlertid av begrenset praktisk interesse fordi disse bobler generelt ikke er stabile nok til å kunne brukes som ultralydkontrastmidler.

Interessen har i henhold til dette ligget ved fremgangsmåter for stabilisering av gassbobler for ekkografi og andre ultralydstudier, for eksempel ved bruk av emulgatorer, oljer, fortykkere eller sukkere, eller ved å fange eller innkapsle gassen eller en forløper for denne i et antall systemer. Disse stabiliserte gassbobler kalles generelt i teknikken "mikrovesikler" og kan deles i to hovedkategorier.

En første kategori av stabiliserte bobler eller mikrovesikler angis generelt i teknikken som "mikrobobler" og inkluderer vandige suspensjoner hvori boblene av gass er bundet ved gass-væskegrenseflaten med en meget tynn omhylling som involverer en surfaktant (det vil si et amfifilisk materiale) som befinner seg på grenseflaten mellom gass og væske. En andre kategori mikrovesikler angis generelt i teknikken som "mikroballonger" eller "mikrokapsler" og inkluderer suspensjoner hvori boblene av gass er omhyllet av en "konvolutt" av fast materiale, dannet av naturlige eller syntetiske polymerer. Eksempler på mikroballonger og fremstilling av disse er for eksempel beskrevet i EP 0458745. En annen type ultralydkontrastmiddel inkluderer suspensjoner av porøse mik-ropartikler av polymerer eller andre faststoffer og som bærer gassbobler fanget i porene i mikropartiklene. Foreliggende oppfinnelse angår spesielt kontrastmidler for diagnostisk billedopptak som inkluderer en vandig suspensjon av gassmikrobobler, dvs. mikrovesikler som er stabilisert i det vesentlige ved et sjikt av amfifilisk materiale.

Mikroboblesuspensjoner fremstilles typisk ved å bringe pulverformige, amfifiliske materialer, for eksempel frysetørkede, på forhånd tildannede liposomer eller frysetør-kede eller spraytørkede fosfolipidsuspensjoner, i kontakt med luft eller en annen gass og så med en vandig bærer, omrøring for å generere mikroboblesuspensjonen som så må administreres kort etter fremstillingen.

Eksempler på vandige suspensjoner av gassmikrobobler og fremstilling derav kan finnes for eksempel i US 5,271,928, US 5,445,813, US 5,413,774, US 5,556,610, 5,597,549, US 5,827,504.

WO 97/29783 beskriver en alternativ prosess for fremstilling av gassmikroboblesus-pensjoner omfattende å generere en gassmikrobobledispersjon i et egnet, fosfolipidhol-dig, vandig medium og så underkaste dispersjonen lyofilisering for å gi et tørket, rekon-stituerbart produkt. De således fremstilte, tørkede produkter kan rekonstitueres i vandig medium og krever kun minimal agitering. Som nevnt i dokumentet er størrelsen for de således genererte mikrobobler konsistent reproduserbar og er i praksis uavhengig av mengden omrøringsenergi som legges på under rekonstitueringen, men bestemmes i stedet av størrelsen av mikroboblene som dannes i den opprinnelige mikrobobledispersjon. Søkeren har videre observert at mengden av omrøringsenergi som legges på for generering av gassmikrobobledispersjonen i det fosfolipidholdige, vandige medium kan være for høy, særlig når det ønskes oppnådd mikrobobler med liten diameter (for eksempel 23000 omdreininger per minutt i 10 minutter for å oppnå en dispersjon av bobler med en volummidlere diameter rundt 3 um). Den høye agiteringsenergi kan bestemme lokal overheting i den vandige dispersjon av mikrobobler, noe som i sin tur kan forårsake nedbryting av fosfolipidene inneholdt i det vandige medium. I tillegg er effektene av for høy agiteringsenergi generelt vanskelige å kontrollere, og kan resultere i en ikke-kon-trollerbar størrelsesfordeling av de endelige mikrobobler. Videre involverer denne prosess en kontinuerlig strøm av gass inn i det vandige medium under genereringen av mikroboblene og krever således bruken av relevante mengder gasser.

WO 94/01140 beskriver en ytterligere prosess for fremstilling av mikrovesikkelsuspen-sjoner som kan rekonstitueres i et vandig medium og som omfatter lyofilisering av vandige emulsjoner inneholdende parenterale aksepterbare emulgatorer, ikke-polare væsker og lipidoppløselige eller vann-uoppløselige "strukturbyggere". Poloxamerer og fosfolipider er nevnt som parenteralt aksepterbare emulgatorer, mens blandinger av disse to benyttes i arbeidseksemplene. Kolesterol er den foretrukne, vann-uoppløselige struktur-bygger som benyttes i arbeidseksemplene. Det lyofiliserte produkt rekonstitueres så i vann for å gi en vandig suspensjon av gassfylte mikrovesikler. De gassfylte mikrovesikler som oppnås fra rekonstitueringstrinnet er således definert ved en omhylling av forskjellige materialer inkludert emulgatorer som poloxamerer og vann-uoppløselige strukturbyggere som kolesterol.

Fremgangsmåten sies å resultere i en emulsjon med partikkelstørrelser lavere enn 4 nm, fortrinnsvis lavere enn 2 nm og helt ned til 0,5 um. Søkeren har imidlertid notert at mens rekonstitueringstrinnet til slutt kan resultere i mikrovesikler med en numerisk midlere diameter på mindre enn 2 um, er den tilsvarende størrelsesfordeling for mikro- vesikkelpopulasjonen ikke desto mindre relativt bred. I tillegg resulterer konverterings-trinnet fra emulsjonsmikropartikler, oppnådd i henhold til prosessen ovenfor, og til gassmikrobobler, i relativt lavt utbytte.

Foreliggende søkere har nå funnet at den meget snevrere fordeling av mikroboblestør-relsen kan oppnås hvis det benyttes et fosfolipid som hovedemulgator i emulsjonen ovenfor, og hvis prosessen gjennomføres i det vesentlige under fravær av de ovenfor nevnte vann-uoppløselige strukturbyggere. I tillegg tillater det vesentlige fravær av nevnte vann-uoppløselige strukturbyggere i det vesentlige å øke konverteringsutbyttet fra emulsjonsmikropartikler til gassmikrobobler. Foreliggende søkere har videre observert at prosessen ovenfor kan resultere i enda snevrere størrelsesfordeling for mikrobobler og i et øket utbytte visse fosfolipider i det vesentlige er den eneste emulgator som er tilstede i oppløsningen.

Foreliggende søkere har også funnet at ved å benytte en heller lav agiteringsenergi på en vandig-organisk emulsjon under prosessen som spesifisert ovenfor, er det mulig å oppnå mikrobobler med meget liten diameter og redusert størrelsesfordeling.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en lyofilisert matriks som, ved kontakt med en vandig bærervæske og en gass, kan rekonstitueres til en suspensjon av gassfylte mikrobobler som er stabilisert overveiende av et fosfolipid, og der metoden omfatter: a) fremstilling av en vandig-organisk emulsjon omfattende i) et vandig medium, ii) et organisk oppløsningsmiddel som i det vesentlige er ublandbart med vann; iii) en emulgerende blanding av amfifiliske materialer omfattende mer enn 50 vektprosent av et fosfolipid og iv) et lyobeskyttende middel; b) lyofilisering av den emulgerte blanding for å oppnå en lyofilisert matriks omfattende fosfolipid.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et injiserbart kontrastmiddel omfattende en flytende, vandig suspensjon av gassfylte mikrobobler som er stabilisert overveiende med et fosfolipid, og som omfatter trinnene:

a) fremstilling av en vandig-organisk emulsjon omfattende i) et vandig medium, ii) et organisk oppløsningsmiddel som i det vesentlige er ublandbart med vann; iii) en emulgerende blanding av amfifiliske materialer omfattende mer enn 50 vektprosent av et fosfolipid og iv) et lyobeskyttende middel; b) lyofilisering av emulsjonen for å oppnå en lyofilisert matriks omfattende fosfolipidet; c) å bringe den lyofiliserte matriks i kontakt med en biokompatibel gass; d) rekonstituering av den lyofiliserte matriks ved oppløsing av den i en fysiologisk

akseptabel, vandig bærervæske, for å oppnå en suspensjon av gassfylte mikrobobler

som er stabilisert overveiende med fosfolipidet.

Fortrinnsvis omfatter trinn a) ved fremstillingen av emulsjonen:

al) fremstilling av en suspensjon ved å dispergere den emulgerende blanding av amfifiliske materialer og det lyobeskyttende middel i det vandige medium;

a2) blanding av den vandige suspensjon med det organiske oppløsningsmiddel;

a3) å underkaste blandingen kontrollert agitering for å oppnå en emulsjon.

Fortrinnsvis oppnås den kontrollerte agitering ifølge trinn a3) ved å benytte en høy-trykkshomogenisør eller mer foretrukket en rotor-statorhomogenisør.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen angår et injiserbart kontrastmiddel omfattende en suspensjon av gassfylte mikrobobler som er stabilisert med et stabiliserende sjikt overveiende omfattende et fosfolipid i en vandig bærervæske, der mikroboblene har en tallmidlere diameter (Dn) på mindre enn 1,7 um og en volummidlere diameter (Dvso) slik at DV5o/Dner rundt 2,00 eller lavere.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som nevnt ovenfor angår ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en lyofilisert matriks av en rekonstituerbar suspensjon av gassfylte mikrobobler som overveiende er stabilisert med et fosfolipid idet metoden omfatter fremstilling av en vandig-organisk emulsjon omfattende i) et vandig medium, ii) et organisk oppløsningsmiddel som i det vesentlige er ublandbart med vann, iii) et fosfolipid, og iv) et lyobeskyttende middel, og så etterfølgende lyofilisering av emulsjonen.

Det vandige medium er fortrinnsvis en fysiologisk akseptabel bærer. Uttrykket "fysiologisk akseptabel" inkluderer enhver forbindelse, ethvert materiale eller enhver formulering som kan administreres, i en valgt mengde, til en pasient uten negativt å påvirke eller vesentlig å modifisere organismens sunne eller normale funksjon (for eksempel uten bestemmelse av noen status av ikke-aksepterbar toksisitet, uten å forårsake eks-treme eller ikke-kontrollerbare allergeniske responser eller uten å bestemme noen anor-mal patologisk tilstand eller sykdomsstatus).

Egnede, vandige væskebærere er vann, typisk sterilt, pyrogenfritt vann (for i størst mulig grad å forhindre kontaminering i det intermediate, lyofiliserte produkt), vandige oppløsninger som saltoppløsning (som med fordel kan balanseres, slik at sluttproduktet for injeksjon ikke er hypotonisk), eller vandige oppløsninger av ett eller flere tonisitet-justerende substanser som salter eller sukkere, sukkeralkoholer, glykoler eller andre ikke-ioniske polyolmaterialer (for eksempel glukose, sukrose, sorbitol, mannitol, glycerol, polyetylenglykoler, propylenglykoler og lignende).

Det organiske oppløsningsmiddel

Som benyttet her betyr uttrykket "i det vesentlige ublandbart med vann", når det gjelder det organiske oppløsningsmiddel, at når oppløsningsmiddelet blandes med vann dannes det to separate faser. Vann-ublandbart oppløsningsmiddel er generelt også kjent i teknikken som apolart eller ikke-polart oppløsningsmiddel i motsetning til polare oppløsningsmidler (som vann). Vann-ublandbare oppløsningsmidler er generelt i det vesentlige uoppløselige i vann. For oppfinnelsens formål er organiske oppløsningsmidler som er egnet for emulgering med det vandige oppløsningsmiddel typisk de oppløsningsmidler som har en oppløselighet i vann som er mindre enn rundt 10 g/l. Fortrinnsvis er oppløseligheten for oppløsningsmiddelet i vann rundt 1,0 g/l eller lavere, helst rundt 0,2 g/l eller lavere og aller helst rundt 0,01 g/l eller lavere. Spesielt foretrukne oppløsningsmidler er de som har en oppløselighet i vann på 0,001 g/l eller lavere. Spesielle, uoppløselige organiske oppløsningsmidler (for eksempel perfluorkarboner) kan ha en oppløselighet helt ned til ljOxlO"6 g/l (for eksempel perfluoroktan, 1,66 x IO"<6>).

Det organiske oppløsningsmiddel er fortrinnsvis lyofiliserbart, dvs. at oppløsningsmid-delet har et tilstrekkelig høyt damptrykk ved lyofiliseringstemperaturene, for eksempel -30°C og 0°C til å tillate en effektiv og fullstendig fordamping/sublimering innen det aksepterbare tidsrom, for eksempel 24 til 48 timer. Fortrinnsvis er damptrykket i det organiske oppløsningsmiddel høyere enn rundt 2 kPa ved 25°C.

Det organiske oppløsningsmiddel kan velges fra et bredt område av oppløsninger og en hvilken som helst kjemisk entitet som er vann-ublandbar og lyofiliserbar, som antydet ovenfor, og som fortrinnsvis er flytende ved romtemperatur (25°C). Hvis det benyttes et oppløsningsmiddel med et kokepunkt lavere enn romtemperatur kan beholderen som inneholder emulgeringsblandingen med fordel avkjøles til under kokepunktet for opp-løsningsmiddelet, for eksempel ned til 5°C eller 0°C. Da oppløsningsmiddelet fullstendig vil fjernes under lyofiliseringstrinnet foreligger det ingen spesielle begrensninger, bortsett fra at det ikke må inneholde kontaminanter som ikke kan fjernes under lyofilisering eller som ikke er akseptable for bruk i et injiserbart preparat.

Egnede organiske oppløsningsmidler inkluderer, men er ikke begrenset til alkaner som forgrenede eller fortrinnsvis rette (C5-Cio)alkaner, for eksempel pentan, heksan, heptan, oktan, nonan, dekan; alkener som (C5-Cio)alkener, for eksempel 1-penten, 2-penten, 1-okten; cykloalkaner som (C5-Cs)cykloalkaner, eventuelt substituert med én eller to me-tylgrupper, for eksempel cyklopentan, cykloheksan, cyklooktan, 1 -metylcykloheksan; aromatiske hydrokarboner som benzen og benzenderivater substituert med én eller to metyl- eller etylgrupper, for eksempel benzen, toluen, etylbenzen, 1,2-dimetylbenzen, 1,3-dimetylbenzen; alkyletere og ketoner slik som dibutyleter og di-isopropylketon; halogenerte hydrokarboner eller etere, slik som kloroform, karbontetraklorid, 2-klor-l-(difiuormetoksy)-1,1,2-trifluoretan (enfluran), 2-klor-2-(difluormetoksy)-1,1,1 -trifluor-etan (isofluran), tetraklor-l,l-difluoretan, og særlig perfluorerte hydrokarboner eller etere som perfluorpentan, perfluorheksan, perfluorheptan, perfluormetylcykloheksan, perfluoroktan, perfluornonan, perfluorbenzen og perfluordekalin, metylperfluorbutyleter, metylperfluorisobutyleter, etylperfluorbutyleter, etylperfluorisobutyleter; og blandinger derav.

Mengden av oppløsningsmiddelet ligger generelt fra rundt 1 til rundt 50 volumprosent, beregnet på mengden vann som benyttes for emulsjonen. Fortrinnsvis er mengden vann fra rundt 1 til rundt 20% og helst fra rundt 2 til rundt 15%, og aller helst fra rundt 5 til rundt 10%. Hvis ønskelig kan en blanding av to eller flere av de ovenfor angitte, orga niske oppløsningsmidler benyttes, idet den totale mengde av organisk oppløsningsmid-del i den emulgerende blanding ligger innenfor området ovenfor.

Lyobeskyttende middel

Uttrykket lyobeskyttende middel eller "lyoprotektant" henviser til en forbindelse som, når den inkluderes i en forbindelse som skal lyofiliseres, vil beskytte de kjemiske forbindelser fra skadelige effekter av frysing og vakuumisering, slik disse ofte ledsager lyofilisering, for eksempel skade, adsorpsjon eller tap fra vakuum som benyttes ved lyofiliseringen. I tillegg resulterer, etter lyofiliseringstrinnet, nevnte lyobeskyttende middel i en fast matriks ("bulk") som understøtter det lyofiliserte fosfolipid.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til bruken av en spesifikk lyoprotektant og

eksempler på egnede slike inkluderer, men er ikke begrenset til karbohydrater som sakkarider, mono-, di- eller polysakkarider, for eksempel glukose, galaktose, fruktose, sukrose, trehalose, maltose, laktose, amylose, amylopektin, cyklodekstrin, dekstran, inulin, oppløselig stivelse, hydroksyetylstivelse (HES), sukkeralkoholer som mannitol, sorbitol og polyglykoler som polyetylenglykoler. En utførlig liste over midler med lyobeskyttende effekter er gitt i Acta Pharm. Technol. 34(3), sidene 129- 139 (1988). De nevnte lyobeskyttende midler kan benyttes alene eller som en blanding av én eller flere forbindelser.

Foretrukne lyoprotektanter inkluderer mannitol og polysakkarider som dekstraner (særlig de med molekylvekter over 1500 dalton), inulin, oppløselig stivelse, og hydroksyetylstivelse.

Blandinger av mannitol og polysakkarider som dekstraner, inulin, oppløselig stivelse, hydroksyetylstivelse med sakkarider som glukose, maltose, laktose, sukrose, trehalose og erytritol, gir også utmerkete resultater.

På samme måte er oppfinnelsen ikke begrenset til noen spesiell mengde av benyttet lyoprotektant. Imidlertid ligger den optimale vektkonsentrasjon av lyobeskyttende midler i emulsjoner før lyofiliseringen mellom rundt 1 og 25%, særlig mellom rundt 2 og 20%, spesielt mellom rundt 5 og rundt 10%.

En høyere mengde kan benyttes hvis det også er nødvendig å tilveiebringe en ønsket "bulk" til det lyofiliserte produkt.

Det lyobeskyttende middel settes fortrinnsvis til den vandig-organiske blanding før emulgering av dette og i dette tilfelle gjennomføres emulgeringen av den vandig-organiske blanding i nærvær av det eller de lyobeskyttende midler. Alternativt kan lyoprotektanten settes til den vandig-organiske blanding etter emulgering av denne. I det først-nevnte tilfelle blir lyoprotektanten fortrinnsvis satt til det vandige medium, før blanding av dette med det organiske oppløsningsmiddel. Hvis ønskelig er det også mulig å kombinere de to, for eksempel ved å sette en del lyobeskyttende middel til den vandige fase som benyttes for fremstilling av emulsjonen, og en del til den således oppnådde emulsjon. Hvis ønskelig kan også kryobeskyttende middel som glycerol videre settes til emulsjonen for å beskytte de kjemiske forbindelser mot frysingens ugunstige effekter.

Fosfolipider

I henhold til foreliggende beskrivelse og krav er uttrykket fosfolipid ment å omfatte enhver amfifilisk, fosfolipidisk forbindelse hvis molekyler er i stand til å danne en film av materiale (fortrinnsvis i form av et monomolekylært sjikt) på gass-vanngrenseflaten i den endelige mikroboblesuspensjon. I henhold til dette angis disse materialer i teknikken også som "filmdannende fosfolipider". I den emulgerte blanding befinner på samme måte disse amfifiliske forbindelser seg typisk ved grenseflaten mellom vandig medium og de organiske oppløsningsmidler som i det vesentlige er uoppløselige i vann og stabiliserer derved de emulgerte oppløsningsmiddelmikrodråper. Filmen som dannes av disse forbindelser ved gass-vann- eller vann-oppløsningsmiddelgrenseflaten kan være enten kontinuerlige eller diskontinuerlige. I sistnevnte tilfelle bør diskontinuiteten i filmen imidlertid ikke være slik at de forringer stabiliteten (for eksempel trykkmotstand, resistens mot koalescens, osv.) for de suspenderte mikrobobler henholdsvis de emulgerte mikrobobler.

Uttrykket "amfifilisk forbindelse" slik det her benyttes inkluderer forbindelser med et molekyl med en hydrofil, polar hodedel (for eksempel en polar eller ionisk gruppe), i stand til å interagere med et vandig medium, og en hydrofob, organisk haledel (for eksempel en hydrokarbonkjede), i stand til å interagere for eksempel med et organisk opp-løsningsmiddel. Disse forbindelser virker således generelt som "overflateaktive midler", det vil si forbindelser som er i stand til å stabilisere blandinger av ellers generelt ublandbare materialer som blandinger av to ublandbare væsker (for eksempel vann og olje), blandinger av væsker med gasser (for eksempel gassmikrobobler i vann) eller blandinger av væsker med uoppløselige partikler (for eksempel metallnanopartikler i vann). Amfifiliske fosfolipidforbindelser inneholder typisk en fosfatgruppe og minst én, fortrinnsvis to, lipofile langkjedehydrokarbongrupper.

Eksempler på egnede fosfolipider inkluderer estere av glycerol med én eller fortrinnsvis to (like eller forskjellige) rester av fettsyrer og med fosforsyre der fosforsyreresten i sin tur er bundet til en hydrofil gruppe som kolin (fosfatidylkoliner - PC), serin (fosfatidyl-seriner - PS), glycerol (fosfatidylglyceroler - PG), etanolamin (fosfatidyletanolaminer - PE), inositol (fosfatidylinositol), og lignende grupper. Estere av fosfolipider med kun én fettsyrerest angis i teknikken generelt som "lyso" formen av fosfolipidet. Fettsyrerester som er tilstede i fosfolipidene er generelt langkjedede, alifatiske syrer, typisk inneholdende fra 12 til 24 karbonatomer og fortrinnsvis fra 14 til 22 karbonatomer; den alifatiske kjede kan inneholde en eller flere umettheter eller fortrinnsvis fullstendig mettet. Eksempler på egnede fettsyrer i fosfolipidene er for eksempel laurin-, myristin-, palmitin-, stearin-, arakidin-, behen-, olje-, linol- og linolensyre. Fortrinnsvis benyttes det mettede fettsyrer som myristin-, palminitin-, stearin- og arakidinsyre.

Ytterligere eksempler på fosfolipider er fosfatidiske syrer, dvs. diesteren av glycerol-fosforsyrer med fettsyrer, sfingolipider som sfingomyeliner, dvs. de fosfatidykolinana-loger der resten av glyceroldiester med fettsyrene er erstattet av en ceramidkjede; kar-diolipiner, dvs. estere av 1,3-difosfatidylglycerol med en fettsyre; glykolipider som gangliosider GM1 (eller GM2) eller cerebrosider; glukolipider; sulfatider og glyko-sfingolipider.

Som benyttet her inkluderer uttrykket fosfolipider ethvert naturlig forekommende, semi-syntetisk eller syntetisk fremstilt produkt som kan benyttes enten alene eller som en blanding.

Eksempler på naturlig forekommende fosfolipider er naturlige lecitiner (fosfatidylkolin (PC) derivater) som typisk soyabønne- eller eggeplommelecitiner.

Eksempler på semisyntetiske fosfolipider er partielt eller fullt hydrogenerte derivater av de naturlig forekommende lecitiner. Foretrukne fosfolipider er fettsyrediestere av fosfatidylkolin, etylfosfatidylkolin, fosfatidylglycerol, fosfatidinsyre, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin eller sfingomyelin.

Eksempler på foretrukne fosfolipider er for eksempel dilauroylfosfatidylkolin (DLPC), dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC), dipalmitoyl-fosfatidylkolin (DPPC), diarakidoyl-fosfatidylkolin (DAPC), distearoyl-fosfatidylkolin (DSPC), dioleoyl-fosfatidylkolin (DOPC), l,2-distearoyl-sn-glycero-3-etylfosfokolin (Etyl-DSPC), dipentadekanoyl-fosfatidylkolin (DPDPC), l-myristoyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (MPPC), l-palmitoyl-2-myristoyl-fosfatidylkolin (PMPC), l-palmitoyl-2-stearoyl-fosfatidylkolin (PSPC), 1-stearoyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (SPPC),), l-palmitoyl-2-oleylfosfatidylkolin (POPC), l-oleyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (OPPC), dilauroyl-fosfatidylglycerol (DLPG) og dennes alkalimetallsalter, diarakidoylfosfatidylglycerol (DAPG) og dennes alkalimetallsalter, dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG) og dennes alkalimetallsalter, dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG) og dennes alkalimetallsalter, distearoylfosfatidyl-glycerol (DSPG) og dennes alkalimetallsalter, dioleoyl-fosfatidylglycerol (DOPG) og dennes alkalimetallsalter, dimyristoylfosfatidinsyre (DMPA) og dennes alkalimetallsalter, diplamitoylfosfatidinsyre (DPPA) og dennes alkalimetallsalter, distearoylfosfa-tidinsyre (DSPA), diarakidoylfofatidinsyre (DAPA) og dennes alkalimetaller, dimyristoylfosfatidyletanolamin (DMPE), dipalmitoylfosfatidyletanolamin (DPPE), distearoylfosfatidyl-etanolamin (DSPE), dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), diarakidoylfos-fatidyletanolamin (DAPE), dilinolelfosfatidyletanolamin (DLPE), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), diarakidoylfosfatidylserin (DÅPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), distearoylfosfatidylserin (DSPS), dioleoylfosfatidylserin (DOPS9, dipalmitoylsfingomyelin (DPSP) og distearoylsfingomyelin (DSSP).

Uttrykket fosfolipid inkluderer videre modifisert fosfolipid, for eksempel fosfolipider der den hydrofile gruppe er bundet til en annen hydrofil gruppe. Eksempler på modifiserte fosfolipider er fosfatidyletanolaminer som er modifisert med polyetylenglykol

(PEG), det vil si fosfatidyletanolaminer der den hydrofile etanolamindel er forbundet til et PEG-molekyl med varierende molekylvekt, for eksempel fra 300 til 5000 dalton, som DPPE-PEG eller DSPE-PEG, det vil si DPPE eller (DSPE) med en PEG-polymer festet dertil. For eksempel henviser DPPE-PEG2000 til DPPE hvortil det er festet en PEG-polymer med en midlere gjennomsnittlig molekylvekt på rundt 2000. Som forklart i detalj nedenfor blir disse PEG-modifiserte fosfolipider fortrinnsvis benyttet i kombina-sjon med ikke-modifiserte fosfolipider.

Både nøytrale og ladede fosfolipider kan på tilfredsstillende måte benyttes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, så vel som blandinger derav. Som benyttet her og i den kjente teknikk betyr uttrykket "ladet" i forbindelse med "fosfolipider" at de individuelle fosfolipidmolekyler bar en total nettoladning, det være seg positive eller, mer hyppig, negativ.

Eksempler på fosfolipider som bærer en total, negativ ladning er derivater, særlig fettsyrediestere eller fosfatidylserin, som DMPS, DPPS, DSPS, av fosfatidinsyre, for eksempel DMPA, DPPA, DSAP; av fosfatidylglycerol som DMPG, DPPG og DSPG. Også modifiserte fosfolipider, særlig PEG-modifiserte fosfatidyletanolaminer som DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG-4000, DMPE-PEG5000, DPPE-PEG750, DPPE-PEG1000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000,DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG750, DAPE-PEG1000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 eller PEG5000, kan benyttes som negativt ladede molekyler. Også lysoformen av de ovenfor angitte fosfolipider som lysofosfatidylserinderivater (for eksempel lyso-DMPS, -DPPS eller - DSPS), lysofosfatidiske syrederivater (for eksempel lyso-DMPA, -DPPA eller -DSPA) og lysofosfatidylglycerolderivater (for eksempel lyso-DMPG, -DPPG eller -DSPG), kan med fordel benyttes som negativt ladet forbindelse.

Eksempler på fosfolipider som bærer en total, positiv ladning er derivater av etylfosfatidylkolin, særlig estere av etylfosfatidylkolin med fettsyrer som 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-etylfosfokolin (etyl-DSPC eller DSEPC), l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-etylfosfokolin (etyl-DPPC eller DPEPC).

Fortrinnsvis benyttes blandinger av to eller flere fosfolipider, idet minste ett med en nøytral ladning og minst ett med en total nettoladning. Mer foretrukket benyttes blandinger av to eller flere fosfolipider der minst ett er nøytralt og minst er negativt ladet. Mengden ladet fosfolipid kan variere fra rundt 95 til rundt 5 vektprosent, beregnet på den totale mengde av fosfolipid, fortrinnsvis fra 80 til 20 vektprosent. Nærværet av i det minste mindre mengder som 5 til 20 vektprosent, beregnet på den totale vekt av fosfolipidet, av et (negativt) ladet fosfolipid, kan understøtte forhindring av aggregering av bobler eller emulsjonsdråper. Det er imidlertid mulig å benytte et enkelt fosfolipid, nøy-tralt eller ladet, eller en blanding av to eller flere fosfolipider, alle nøytrale eller med en total nettoladning.

Foretrukne fosfolipider er DAPC, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS, DPPE, DSPE, DSPG, DPPG og etyl-DSPC. Mest foretrukket er DSPA, DPPS eller DSPS. Foretrukne blandinger av fosfolipider er blandinger av DPPS med DPPC, DSPC eller DAPC (i vektforholdet 95:5 til 5:95), blandinger av DSPA med DSPC eller DAPC (i vektforholdet 95:5 til 5:95), blandinger av DSPG eller DPPG med DSPC eller blandinger av DSPC med etyl-DSPC. Mest foretrukket er blandinger av DPPS/DSPC (i vektforholdet 50:50 til 10:90) eller DSPA/DSPC (i vektforholdet 50:50 til 20:80).

Mengden fosfolipid ligger generelt mellom 0005 og rundt 1,0 vektprosent beregnet på den totale vekt av emulgert blanding. Større mengder kan selvfølgelig benyttes, men tatt i betraktning at sluttproduktet er et injiserbart kontrastmiddel er det foretrukket ikke å benytte for store mengder additiver hvis ikke dette er strengt nødvendig for å oppnå et stabilt og egnet produkt. Generelt er det, når man benytter en mengde fosfolipid som er større enn det som indikeres som øvre grense av det ovenfor angitte område, oppnås som regel ingen eller kun meget neglisjerbar forbedring uttrykt ved boblepopulasjon, boblestørrelsesfordeling og boblestabilitet. Typisk er høyere mengder fosfolipid nød-vendig når høyere volumer organisk oppløsningsmiddel benyttes. Når således volumet av organisk oppløsningsmiddel utgjør rundt 50% av volumet av vannfase, kan en mengde på rundt 1 vektprosent fosfolipid med fordel settes til emulsjonen. Fortrinnsvis ligger mengden fosfolipid mellom 0,01 og 1,0 vektprosent beregnet på den totale vekt av den emulgerte blanding og helst mellom 0,05 og 0,5 vektprosent.

Som nevnt ovenfor blir mikroboblene som produseres i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte stabilisert overveiende med et fosfolipid som definert ovenfor. Generelt dannes omhyllingen som omgir de gassfylte mikrobobler med mer enn 50 vektprosent og fortrinnsvis minst 80%, spesielt minst 90% av et fosfolipidrnateriale som definert ovenfor. Hensiktsmessig er i det vesentlige hele den stabiliserende omhylling av mikroboblene dannet av et fosfolipid.

Andre amfifiliske materialer kan imidlertid blandes med fosfolipidene under dannelse av den stabiliserende omhylling av de gassfylte mikrobobler i mengder mindre enn 50% av den totale vekten av den emulgerende blanding.

Eksempler på egnede, ytterligere omhyllingsstabiliserende, amfifiliske materialer inkluderer for eksempel lysolipider; fettsyrer som palmitin-, stearin-, laurin-, myristin-, arakidin-, arakidon-, behen-, olje-, linol- eller linolensyre og deres respektive salter med alkali- eller jordalkalimetaller; lipider som bærer polymerer som kitin, hyaluronsyre, polyvinylpyrrolidon eller polyetylenglykol (PEG), også angitt som "pegylerte lipider", lipider som bærer sulfonerte mono-, di-, oligo- eller polysakkarider; lipider med eter- eller esterlinkede fettsyrer; polymeriserte lipider, diacetylfosfat; dicetylfosfat; stearylamin; cerimader; polyoksyetylenfettsyreestere (som polyoksyetylenfettsyrestearater); polyoksyetylenfettalkoholer; polyoksyetylenfettalkoholetere; polyoksyetylerte sorbitan-fettsyreestere; glycerolpolyetylenglykolricinoleat; etoksylerte soyabønnesteroler; etoksylerte kastorolje; etylenoksid (EO) og propylenoksid (PO) blokkopolymerer; sterolestere av sukkersyrer inkludert kolesterolglukuronider, lanosterolglukoronider, 7-de-hydrokolesterolglukoronid, ergosterolglukoronid, kolesterolglukonat, lanosterolgluko-nat, eller ergosterolglukonat; estere av sukkersyrer og alkoholer inkludert laurylgluko-ronid, stearoylglukoronid, myristoylglukoronid, laurylglukonat, myristoylglukonat, eller stearoylglukonat; estere av sukkere med alifatiske syrer inkludert sukroselaurat, fruk-toselaurat, sukrosepalmitat, sukrosestearat, glukoronsyre, glukonsyre eller polyuron-syre; estere av glycerol med (C12-C24), fortrinnsvis (C14-C22) dikarboksylfettsyrer og deres respektive salter med alkali- eller jordalkalimetaller som l,2-dipalmitoyl-sn-3-suksinylglycerol eller l,3-dipalmitoyl-2-suksinylglycerol; saponiner inkludert sarsasa-pogenin, smilagenin, hederagenin, oleanolsyre eller digitoksigenin; langkjede (C12-C24)-alkoholer inkludert n-decylalkohol, laurylalkohol, myristylalkohol, cetylalkohol eller n-oktadecylalkohol; 6-(5-kolesten-3 bp-yloksy)-l-tio-p-D-galaktopyranosid; digalaktosyldiglycerid; 6-(5-kolesten-3p-yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksy-1 -tio-p-D-galaktopy-ranosid; 6-(5-kolesten-3p-yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksyl-1 -tio-p-D-mannopyranosid; 12-(((7"dietylaminokoumarin-3-yl)karbonyl)metylamino)oktadekansyre; N-[12-(((7'-dietylammokoumarm-3-yl)karbonyl)metylammo)oktadekanoyl]-2-aminopalmitinsyre; N-suksinyl-dioleylfosfatidyletanolamin; 1 -heksadecyl-2-palmitoylglycerofosfo-etanolamin; palmitoylhomocystein; alkylammoniumsalter omfattende minst én (C10-C20), fortrinnsvis (Cn-Cig), alkylkjede som for eksempel stearylammoniumklorid, heksadecylammoniumklorid, dimetyldioktadecylammoniumbromid (DDAB), heksa-decyltrimetylammoniumbromid (CTAB); tertiære eller kvaternære ammoniumsalter omfattende én eller fortrinnsvis to (C10-C20)- og fortrinnsvis (Ci4-Ci8)-acylesterrester som for eksempel l,2-distearoyl-3-trimetylammoniumpropan (DSTAP), 1,2-dipalmitoyl-3-trimetylammoniumpropan (DPTAP), 1,2-oleoyl-3-trimetylammoniumpropan (DOTAP), l,2-distearoyl-3-dimetylammoniumpropan (DSDAP); og blandinger og kombinasjoner derav.

Små mengder fettsyrer og lysformer av fosfolipidene kan også dannes som nedbryt-ningsprodukter av de opprinnelige fosfolipidprodukter, for eksempel som en konse-kvens av oppvarming av emulsjonen.

Foretrukne, ytterligere omhyllingsstabiliserende, amfifile materialer er de forbindelser som omfatter én eller to fettsyrerester i molekylene, særlig i én eller to lineære (C10-C20)-acyl-, fortrinnsvis (Ci4-Ci8)acylkjeder som for eksempel de ovenfor angitte fettsyrer, deres respektive salter og derivater.

Spesielt foretrukne, ytterligere omhyllingsstabiliserende, amfifile materialer er de materialer som er i stand til å gi en total nettoladning til den stabiliserende omhylling, det vil si forbindelser som bærer en total positiv eller negativ nettoladning. Eksempler på egnede, negativ eller positivt ladede forbindelser er for eksempel lysofosfolipider, det vil si lyso-formen av de ovenfor angitte fosfolipider, for eksempel lysofosfatidylcerin-derivater (som lyso-DMPS, -DPPS eller -DSPS), lysofosfatidinsyrederivater (for eksempel lyso-DMPA, -DPPA eller -DSPA) og lysofosfatidylglycerolderivater (for eksempel lyso-DMPG, -DPPG eller -DSPG); gallesyresalter som kolsyresalter, deoksy-kolsyresalter eller glykokolsyresalter; (C12-C24)- fortrinnsvis (Ci4-C22)fettsyresalter som for eksempelpalmitinsyresalt, stearinsyresalt, l,2-dipalmitoyl-sn-3-suksinylglycerolsalt eller l,3-dipalmitoyl-2-suksinylglycerolsalt; alkylammoniumsalter med et halogenmot-ion (for eksempel klor eller brom) omfattende minst én (Cio-C2o)alkylkjede og fortrinnsvis (Ci4-Ci<g>)alkylkjede, for eksempel stearylammoniumklorid, heksadecylammoniumklorid, dimetyldioktadecylammoniumbromid (DDAB), heksadecyltrimetylammonium-bromid (CTAB); tertiære eller kvaternære ammoniumsalter med et halogen-motion (for eksempel klor eller brom) omfattende én eller fortrinnsvis to (Cio-C2o)acylkjeder, fortrinnsvis (Ci4-Ci8)acylesterrester som for eksempel l,2-distearoyl-3-trimetylammo-niumpropan (DPTAP), l,2-oleyoyl-3-trimetylammoniumpropan (DOTAP), 1,2-distearoyl-3-dimetylammoniumpropan (DSDAP).

Hvis det er ønskelig å oppnå "innsiktede" ultralydkontrastmidler, dvs. kontrasmidler inneholder mikrobobler som selektivt binder til et spesifikt sete etter en in vitro- eller in v/'vo-administrering, i henhold til prosessen ifølge oppfinnelsen, er det også mulig å starte direkte fra et fosfolipid der minst en del er modifisert ved innføring av en egnet, målsøkende ligand eller alternativt, og fortrinnsvis, å gå ut fra et fosfolipid der minst en del inneholder en mulig beskyttet, reaktiv gruppe som er i stand til å kobles på et senere trinn med den egnede, valgte målsøkende ligand inneholdende en komplementær, reaktiv funksjon (for eksempel avidin-bitodidforbindelsen).

I denne foretrukne utførelsesform er derfor uttrykket "fosfolipid" ment å omfatte både modifiserte og ikke-modifiserte fosfolipider for derved å inkludere fosfolipider som er modifisert ved linking av en innsiktende ligand eller en beskyttende reaktiv gruppe til det amfifile molekyl av fosfolipidet.

Uttrykket "innsiktende ligand" inkluderer innen sin betydning enhver forbindelse, del eller rest som har eller som er i stand til å gi en målsøkende aktivitet for mikroboblene ifølge oppfinnelsen mot et hvilket som helst biologisk eller patologisk sete i et levende legeme. Materialer eller stoffer som kan tjene som målsøkende ligander inkluderer for eksempel, men er ikke begrenset til, proteiner inkludert antistoffer, antistoffragmenter, reseptormolekyler, reseptorbindingsmolekyler, glukoproteiner og lektiner; peptider, inkludert oligopeptider og polypeptider; peptidomimetika; sakkarider inkludert mono- og polysakkarider; vitaminer; steroider, steroidanaloger, hormoner, kofaktorer, bioaktive midler og genetiske stoffer inkluder nukleosider, nukleotider og polynukleotider. Mål med hvilke målsøkende ligander kan assosieres inkluderer vev som for eksempel myo-kardialt vev (inkludert myokardiale celler og kardiomyocitter), membranøst vev (inkludert endotel og epitel), laminae, bindevev (inludert interstitialt vev) eller tumorer; blod-klumper; og reseptorer som for eksempel celleoverflatereseptorer for peptidhormoner, neurotransmittere, antigener, komplementfragmenter og immunoglobuliner og cytoplas-miske reseptorer for steroidhormoner.

Eksempler på egnede mål og målsøkende ligander er beskrevet for eksempel i US-patentnr. 6,139,819.

I én foretrukket utførelsesform kan de målsøkende ligander være bundet til de amfifile molekyler som danner den stabiliserende omhylling, via en kovalent binding.

I et slikt tilfelle vil den spesifikke, reaktive del som må være til stede i fosfolipid- eller lipidmolekylet når et målsøkende, amfifilt molekyl er ønsket avhenge av den spesielle, målsøkende ligand som skal kobles dertil. Som et eksempel kan, hvis den målsøkende ligand kan linkes til det amfifile molekyl via en aminogruppe, egnede reaktive deler for det amfifiliske molekyl være isotiocyanatgrupper (som vil danne en tioureabinding), reaktive estere (for å danne en amidbinding), aldehydgrupper (for dannelse av en iminbin-ding som kan reduseres til en alkylaminbinding) osv; hvis den målsøkende ligand kan linkes til det amfifile molekyl via en tiolgruppe kan egnede, komplementære reaktive deler for det amfifile molekyl inkludere haloacetylderivater eller maleimider (for å danne en tioeterbinding); og hvis den målsøkende ligand kan linkes til det amfifile molekyl via en karboksylgruppe kan egnede, reaktive deler for det amfifile molekyl være aminer eller hydraziner (for å danne amid- eller alkylamidbindinger). Den reaktive del kan linkes enten direkte til fosfolipidmolekyl eller til en modifiserende del (for eksempel PEG) som i sin tur er linket til fosfolipidet.

Som antydet ovenfor vil, i en foretrukket utførelsesform, når det ønskes et kontrastmiddel inneholdende innsiktede mikrobobler, minst en del av utgangsfosfolipidet inneholde en egnet, reaktiv del og den innsiktende ligand inneholdende den komplementære funk-sjonalitet vil være linket dertil enten ved et hvilket som helst trinn før lyofiliseringen, ved tilsetning av den innsiktende ligand inneholdende den komplementære funksjona-litet inn i fasen inneholdende de funksjonaliserte fosfolipider/lipider enten før, under eller etter genereringen av emulsjonen, eller akkurat før rekonstitueringstrinnet. I dette tilfelle vil det være mulig fullt ut å eksploatere fleksibiliteten ved systemet da mikroboblene inneholdende i det minste en del av de filmdannende fosfolipider, eller av de assosierte lipider, funksjonalisert på egnet måte, som kan bindes til en hvilken som helst målsøkende ligand og dele den samme reaktive, komplementære gruppe.

Den målsøkende ligand behøver imidlertid ikke nødvendigvis å være bundet til de amfifiliske molekyler via en kovalent binding. De målsøkende ligander kan også hensiktsmessig være assosiert til mikroboblene via fysiske og/eller elektrostatiske typer av interaksjoner. Som et eksempel kan en funksjonell del med en høy affinitet og selektivitet for en komplementær del innføres i fosfolipidmolekylet mens den komplementære del vil forbindes med den målsøkende ligand. For eksempel kan en avidin- (eller streptavi-din-) del (med høy affinitet for biotin) kovalent forbindes med et mikroboblestabilise-rende fosfolipid mens den komplementære biotindel kan inkorporeres i en egnet, målsø-kende ligand, for eksempel et peptid eller et antistoff. Den biotinmerkede, målsøkende ligand vil således assosieres med den avidinmerkede mikroboble ved hjelp av avidin-biotinkoblingssystemet. I henhold til en alternativ utførelsesform kan det biotinholdige fosfolipidet benyttes som en forbindelse for å danne den stabiliserende omhylling av en mikroboble; biotinholdig fosfolipid innarbeidet i den stabiliserende omhylling omsettes så først med avidin (eller neutravidin) og så med en biotinholdig ligand. Eksempler på biotin-avidinmerking av fosfolipider og peptider er også beskrevet i US 6,139,819 supra. Alternativt kan vånder Waals interaksjoner, elektrostatiske interaksjoner og andre assosieringsprosesser assosiere eller binde den målsøkende ligand til de amfifile molekyler.

Eksempler på egnede, spesifikke mål hvortil mikroboblene ifølge oppfinnelsen kan sty-res, er for eksempel fibrin, avp3-reseptor eller GPIIbllla-reseptoren eller aktiverte plater. Fibrin og plater er således generelt til stede i "trombi", dvs. koagula som kan dannes i blodstrømmen og forårsake en vaskulær obstruksjon. Egnede bindingspeptider er for eksempel beskrevet i US 6,139,819 supra. Ytterligere bindingspeptider som er spesifikke for fibrinmålsøking er for eksempel beskrevet i WO 02/055544.

Andre eksempler på viktige mål inkluderer reseptorer i utsatte plakk og tumorspesifikke reseptorer som kinasedomeneområde (KDR) og VEGF (vaskulær endotelial cellevekst - faktor)/KDR-kompleks. Bindingspeptider som er egnet for KDR ellerVEGF/KDR-kom-plekser er beskrevet for eksempel i WO 03/74005 og WO 03/084574.

Prosess

Emulgeringstrinnet a) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres ved å underkaste det vandige medium og kjerneoppløsningsmiddelet, i nærvær av minst ett fosfolipid, en hvilken som helst egnet emulsjonsgenererende teknologis som for eksem pel sonikering, rysting, høytrykkshomogenisering, mikroblanding, membranemulgering, høyhastighetsomrøring eller høyskjærblanding, for eksempel ved bruk av en rotor-stator-homogenisør. For eksempel kan det benyttes en rotor-statorhomogenisør som Polytron<®>PT3000. Omrøringshastigheten for rotor-statorhomogenisereren kan velges avhengig av komponentene i emulsjonen, emulsjonens volum og diameteren for beholderen som beholder emulsjonen og den ønskede sluttdiameter for mikrodråpene av opp-løsningsmiddel i emulsjonen. Generelt er det observert at når man benytter en rotor-statorhomogenisør har en sonde på rundt 3 cm diameter nedsenket i en 50 til 80 ml blanding inneholdt i en 3,5 - 5 cm diameter beholder, er en omrøringshastighet på rundt 8000 omdreininger per minutt karakteristisk tilstrekkelig til å oppnå mikrodråper med en midlere, numerisk diameter som er tilstrekkelig til etter lyofilisering og rekonstituering av den lyofiliserte matriks, gi gassfylte mikrobobler med en diameter på mindre enn rundt 1,8 \ im. Ved å øke omrøringshastigheten til 12000 omdreininger per minutt, er det generelt mulig å oppnå gassfylte mikrobobler med en tallmidlere diameter mindre enn rundt 1,5 jun, mens det med en omrøringshastighet på rundt 14000 til 15000 omdreininger per minutt oppnås gassfylte mikrobobler med en tallmidlere diameter rundt 1,0 (im eller mindre. Generelt er det observert at ved å øke omrøringshastigheten utover rundt 18000 omdreininger per minutt, oppnås lite ytterligere reduksjon av mikroboble-størrelsen.

Alternativt kan det også benyttes en mikroblandingsteknikk for emulgering av blandingen. Som kjent inneholder en mikroblander typisk minst to innløp og minst ett utløp. Det organiske oppløsningsmiddel innføres således i blanderen gjennom et første innløp (ved en strømningshastighet på for eksempel 0,05 til 5 ml/minutt), mens den vandige fase innføres gjennom det andre innløp (ved en strømningshastighet på for eksempel 2 til 100 ml/minutt). Utløpet fra mikroblanderen forbindes så med beholderen inneholdende den vandige fase slik at denne trekkes fra beholderen ved etter hverandre følgende tidspunkter og innføres i mikroblanderen som inneholder økende mengder emulgert oppløsningsmiddel. Når hele volumet av oppløsningsmiddel er tilsatt kan emulsjonen fra beholderen holdes under resirkulering gjennom mikroblanderen ved et ytterligere på forhånd bestemt tidsrom, for eksempel 5 til 120 minutter, for å tillate fullføring av emulgeringen.

Avhengig av emulsjonsteknikken kan det organiske oppløsningsmiddel innføres gradvis under emulgeringstrinnet eller på én gang før dette startes. Alternativt kan det vandige medium gradvis settes til det vannublandbare oppløsningsmiddel under emulgeringstrinnet eller på én gang før start av dette. Fortrinnsvis blir fosfolipidet dispergert i det vandige medium før dette blandes med det organiske oppløsningsmiddel. Alternativt kan fosfolipidet dispergeres i det organiske oppløsningsmiddel eller kan separat settes til den vandige-organiske blanding før eller under emulgeringstrinnet.

Emulgeringen i trinn a) gjennomføres hensiktsmessig ved romtemperatur, for eksempel ved en temperatur ved 22°C ± 5°C, eller ved høyere temperaturer, for eksempel 50°C til 60°C (for eksempel når det gjelder kjerneoppløsningsmidler med høyere kokepunkt) eller ved lavere temperatur, for eksempel 0°C til 10°C (for eksempel når det gjelder kjerneoppløsningsmidler med kokepunkt nær romtemperatur). Temperaturen holdes fortrinnsvis under det organiske oppløsningsmiddels koketemperatur og særlig minst 5°C under denne temperatur, mer spesielt minst 10°C under. Da forlenget eksponering for blandingen til høyere temperaturer (for eksempel 90°C eller mer) kan forårsake mulig nedbrytning av fosfolipidene med etterfølgende dannelse av de respektive lysoderivater, er det generelt foretrukket å unngå slik forlenget oppvarming ved høye temperaturer.

Hvis nødvendig kan det vandige medium inneholdende fosfolipidene underkastes kontrollert oppvarming for å lette dispergeringen derav. For eksempel kan den fosfolipid-hoIdige, vandige suspensjon oppvarmes til rundt 60°C til 70°C i rundt 15 minutter, og så tillates avkjøling til en temperatur der emulgeringstrinnet kan gjennomføres.

Som nevnt tidligere kan ytterligere amfifile materialer som de som er oppført ovenfor, også innføres i emulgeringsblandingen inneholdende fosfolipidet. Mengden av nevnte amfifile forbindelser er fortrinnsvis ikke høyere enn rundt 50 vektprosent i forhold til den totale vekt av amfifilt materiale, særlig ikke nøyere enn 20 vektprosent og helt ned til en vektmengde på for eksempel rundt 0,1 vektprosent.

Det vandige medium kan hvis ønskelig, videre inneholde én eller flere eksipienter.

Som benyttet her henviser uttrykket "eksipient" til et hvilket som helst additiv som er brukbart ifølge oppfinnelsen, for eksempel de som benyttes for å øke stabiliteten i emulsjoner eller lyofilisat-mellomproduktet og/eller for å oppnå farmasøytisk akseptable og stabile sluttpreparater.

Eksempler på eksipienter er i denne forbindelse for eksempel viskositetsforbedrere og/eller oppløselighetshjelpemidler for fosfolipidene.

Viskositetsforbedrere og oppløselighetshjelpemidler som kan være egnet for anvendelse er for eksempel mono- eller polysakkarider som glukose, laktose, sakkarose og dekstraner, alifatiske alkoholer som isopropylalkohol og butylalkohol, polyoler som glycerol, 1,2-propandiol og lignende midler. Generelt er det imidlertid funnet at det er unødven-dig å innarbeide additiver som viskositetsforbedrere som vanligvis benyttes i mange ek-sisterende kontrastmiddelformuleringer, i kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen. Dette er en ytterligere fordel ved oppfinnelsen, da antallet komponenter som administreres til et individs legeme holdes på et minimum og viskositeten for kontrastmidlene holdes så lav som mulig.

Som nevnt ovenfor har søker funnet det i det vesentlige unødvendig å tilsette vann-uoppløselige strukturbyggere som kolesterol til emulgeringsblandingen. Således er det observert at en mengde på 0,05% (på vektbasis beregnet på den totale vekt av emulgerende blanding) av kolesterol dramatisk reduserer konverteringsutbyttet fra mikrodråper til gassfylte mikrovesikler, noe som ytterligere resulterer i en breddispergering av vesik-lenes størrelse. Mengden vann-uoppløselige forbindelser i den emulgerende blanding, særlig av de forbindelser som ikke omfatter én eller to fettsyrerester i strukturen, er således fortrinnsvis mindre enn 0,050% og særlig mindre enn 0,030%, beregnet på vektbasis i forhold til den totale vekt av emulsjonen.

Emulsjoner som produseres i henhold til trinn a) kan fordelaktig underkastes ett eller flere vasketrinn før lyofiliseringen i trinn b), for derved å fjerne overskytende fosfolipider i den vandige fase (ikke assosiert til emulsjonen) og å separere og fjerne eventuelle additiver som viskositetsøkere eller oppløselighetshjelpemidler så vel som uønskede stoffer som kolloide partikler og underdimensjonerte og/eller overdimensjonerte emulsjonsdråper. Slik vasking kan gjennomføres på i og for seg kjent måte, idet emulsjonen separeres ved bruk av teknikker som dekantering, flotering, sentrifugering, krysstrømfil-trering og lignende.

Hvis det bygges inn vasketrinn og hvis et lyobeskyttende middel var tilstede i den opprinnelige, vandige fase før generering av emulsjonen, kan vasketrinnet gjennomføres med vandige oppløsninger inneholdende ett eller flere lyobeskyttende midler for å erstatte mengden av lyobeskyttende middel som delvis er fjernet ved vaskingen. På den annen side kan, hvis ingen lyoprotektant var tilstede i den emulgerte vandig-organiske blanding, den dannede emulsjon vaskes med en lyoprotektantholdig, vandig oppløsning, for å innføre lyoprotektanten i den emulgerte blanding, eller, alternativt, lyoprotektanten kan tilsettes etter vasketrinnet, før lyofilisering.

Hvis ønskelig kan emulsjonen (enten per se eller etter vasketrinnet) underkastes et ultra-filtrerings- eller mikrofiltreringstrinn før lyofilisering, for ytterligere å redusere mengden av store mikrobobler i den endelige, rekonstituerte suspensjon. Under mikrofiltrering, for eksempel med et 5 (im eller 3 jim filter, blir store mikrodråper holdt tilbake av filteret og separert fra resten av de små mikrodråper for derved å forhindre dannelsen av store mikrobobler ved rekonstituering av det lyofiliserte materialet. Mikrofiltrering kan gjennomføres i henhold til konvensjonelle teknikker som positivfiltrering, vakuumfiltre-ring eller in-linefiltrering. Filtreringsmembraner kan være nylon-, glassfiber-, cellulose-, papir-, polykarbonat- eller polyester- (Nuclepore<®>) membraner.

I henhold til en alternativ utførelsesform kan en ytterligere, amfifil forbindelse tilsettes etter dannelse av emulsjoner i henhold til læren ovenfor, enten med eller uten vasketrin-nene. Særlig blir en vandig suspensjon av den ønskede forbindelse satt til den dannede emulsjon, fortrinnsvis under omrøring og oppvarming (fortrinnsvis ved mindre enn , 80°C, for eksempel 40°C til 80°C og særlig 50°C til 70°C) for å addere forbindelsen til den stabiliserende omhylling. Denne alternative utførelsesform er spesielt brukbar for i etterkant i det stabiliserende sjikt å innørt amfifiliske forbindelser som på annen måte negativt kan påvirke egenskapene for sluttproduktet hvis de innføres i utgangslandingen av emulsjonen. Eksempler på amififiliske forbindelser som hensiktsmessig kan innføres i etterkant som ytterligere komponenter av den stabiliserende omhylling etter fremstilling av utgangsblandingen er for eksempel PEG-modifiserte fosfolipider, og særlig PEG-modifiserte fosfatidyletanolaminer som DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG5000, DPPE- PEG750, DPPE-PEG1000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000,DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG750, DAPE-PEGIOOO, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 eller PEG5000. Tilsvarende kan også PEG-modifiserte fosfolipidbærende reaktive deler eller målsøkende ligander (for eksempel inneholdende biotin, maleimid eller maleimid-peptid) hensiktsmessig innføres i etterkant i henhold til denne metode. I tillegg kan denne teknikk også benyttes for i etterkant, til sammensetningen av stabiliserende sjikt, å addere andre komponenter som lipopeptider eller polymere surfaktanter. Eksempler på polymere surfaktanter som hensiktsmessig kan tilsettes etter formulering av emulsjonen er for eksempel etylenoksid-propylenoksid-blokkopolymerer som Pluronic F68, Pluronic F108, Pluronic F-127 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); polyoksyetylerte alkylestere somBrij<®>78 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); polyoksyetylenfettsyreestere som Myrj<®>53 eller Myrj<®>59 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); polyoksyetylensorbitanfettsyreestere som Tween<®>60 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); eller polyetylenglykol-tert-oktylfenyleter som Triton<®>X-100 (Sigma Aldrich, Missouri, USA).

Foreliggende søkere har således observert at bruken av en blanding inneholdende begrensede mengder (for eksempel mindre enn 10 vektprosent) av et PEG-modifisert fosfolipid (for eksempel DSPE-PEG eller DPPE-PEG) sammen med et filmdannende fosfolipid (for eksempel DPPS eller en 50:50 blanding av DAPC:DPDS) for fremstilling av en emulsjon ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte, kan bestemme en vesentlig utvidelse av størrelsesfordelingen av sluttproduktet i forhold til størrelsesfordelingen av mikroboblene som oppnås av en emulsjon som kun inneholder det filmdannende fosfolipid. Hvis på den annen side en emulsjon inneholdende kun filmdannende fosfolipid først fremstilles og så en vandig suspensjon av PEG-modifisert fosfolipid deretter settes til den oppnådde emulsjon (for eksempel under omrøring i 1 time ved en temperatur rundt 60°C) er det observert at en heller høy mengde (typisk mer enn 30 vektprosent) av det PEG-modifiserte fosfolipid kan innarbeides i den stabiliserte omhylling uten vesentlig å påvirke størrelsesfordelingen for sluttproduktet.

I henhold til en foretrukket utførelsesform underkastes emulsjonen en kontrollert ytterligere oppvarmingsbehandling før lyofiliseringstrinnet. Den ytterligere oppvarming av emulsjonen gjennomføres fortrinnsvis i en forseglet beholder. Varmebehandlingen kan variere fra rundt 15 minutter til rundt 90 minutter ved temperaturer fra rundt 60 °C til rundt 125°C og fortrinnsvis fra rundt 80°C til rundt 120°C. Generelt gjelder at desto høyere temperaturen er, desto kortere er tiden for den termiske behandling. Under opp-varmingen kan emulsjonen eventuelt holdes under omrøring.

Søker har videre observert at mens denne ytterligere termiske behandling kan resultere i en delvis nedbrytning av fosfolipidene (for eksempel med et innhold på rundt 5 til 20 vektprosent lysolipider i sluttprodukt, når emulsjonen oppvarmes til rundt 100 til 120°C i rundt 30 minutter) har det ikke desto mindre den store fordel av å tillate en vesentlig innsnevring av størrelsesfordelingen og en økning av det totale antall mikrobobler i sluttsuspensjonen, uavhengig av arbeidsbetingelsene i det opprinnelige emulgerings-trinn (for eksempel typen organisk oppløsningsmiddel, emulgeringsteknikk, eventuelt vasketrinn osv.).

Den termisk behandlede emulsjonen kan så direkte underkastes lyofilisering, typisk uten behovet for ytterligere vasketrinn.

Lyofilisering av emulsjonen ifølge trinn b) kan gjennomføres ved først å fryse emulsjonen og deretter å lyofilisere den frosne emulsjonen, ved per se generelt kjente metoder og innretninger. Fordi det tørkede, lyofiliserte produkt normalt vil rekonstitueres ved tilsetning av en bærervæske før administrering, kan emulsjonen med fordel fylles i forseg-lede vialer før lyofilisering for å gi vialer som hver inneholder den riktige mengde, for eksempel en enkel enhetsdose, eller av lyofilisert, tørket produkt for rekonstituering til injiserbar form. Ved å lyofilisere emulsjonen i individuelle vialer heller enn i bulk, unn-gås håndtering av den delikate bikubelignende struktur av det lyofiliserte produkt, og ri-sikoen for i det minste delvis å bryte denne struktur.

Etter lyofilisering kan vakuumet fjernes i lyofilisøren ved å innføre den ønskede gass for å danne mikroboblene i sluttformuleringen av kontrastmiddelet. Dette vil tillate fyl-ling av det tomme rom av vialene med ønsket gass, hvoretter vialene forsegles med en egnet lukking. Alternativt kan vialen holdes under vakuum og forsegles mens gassen tilsettes på et senere tidspunkt, for eksempel akkurat før administrering, for eksempel når gassen er en radioaktiv eller en hyperpolarisert gass.

Det således oppnådde, lyofiliserte produkt i nærvær av egnet gass kan så lagres stabilt i flere måneder før rekonstituering ved oppløsning i en vandig bærervæske for derved å oppnå en suspensjon av gassfylte mikrobobler.

Enhver biokompatibel gass, gasforløper eller blandinger derav kan benyttes for å fylle mikrovesiklene ovenfor idet gassen er valgt avhengig av den valgte modalitet.

Gassen kan for eksempel omfatte luft; nitrogen; oksygen; karbondioksid; hydroge; dinitrogenoksid; en edel- eller inert gass som helium, argon, xenon eller krypton; en radioaktiv gass som Xe133 eller Kr<81>; en hyperpolarisert edelgass som hyperpolarisert helium, hyperpolarisert xenon eller hyperpolarisert neon; et lavmolekylvekts hydrokarbon (for eksempel inneholdende opptil 7 karbonatomer) som et alkan som metan, etan, propan, butan, isobutan, penten eller isopenten, et cyklo alkan som cyklobutan eller cyklopentan, et alken som propen, buten eller isobuten, eller et alkyn som acetylen; en eter; et keton; en ester; halogenerte gasser, og fortrinnsvis fluorerte gasser som halogenerte, fluorerte eller perfluorerte lavmolekylvekts hydrokarboner (for eksempel inneholdende opptil 7 karbonatomer); eller en blanding av hvilke som helst av disse. Der et halogenert hydrokarbon benyttes er fortrinnsvis minst noen og helst alle halogenatomene i forbindelsen, fluoratomer.

Fluorerte gasser er foretrukket, særlig perfluorerte gasser og særlig på området ultralydbilledopptak. Fluorerte gasser inkluderer materialer som inneholder minst ett fluoratom som for eksempel fluorerte hydrokarboner (organiske forbindelser inneholdende ett eller flere karbonatomer og fluor); svovelheksafluorid, fluorerte og særlig perfluorerte ketoner som perfiuoraceton; og fluorerte, fortrinnsvis perfluorerte etere som perfluordi-etyleter. Foretrukne forbindelser er perfluorerte gasser som SF6eller perfluorkarboner (perfluorerte hydrokarboner), dvs. hydrokarboner der alle hydrogenatomene er erstattet med fluoratomer, som er kjent for å gi spesielt stabile mikroboblesuspensjoner som for eksempel beskrevet i EP 0554213.

Uttrykket perfluorkarbon inkluderer mettede, umettede og sykliske perfluorkarboner. Eksempler på biokompatible, fysiologisk akseptable perfluorkarboner er: perfluoralka-ner som perfluormetan, perfluoretan, perfluorpropaner, perfluorbutaner, (for eksempel perfluor-n-butan, eventuelt i blanding med andre isomerer som perfluorisobutan), per-fluorpentaner, perfluorheksaner eller perfluorheptaner; perfluoralkener, som perfluorpropen, perfluorbutener (for eksempel perfluorbut-2en) eller perfluorbutadien; perfluor-alkyner (for eksempel perfiuorbut-2-yn); og perfluorcykloalkaner (for eksempel perfluorcyklobutan, perfluormetylcyklobutan, perfluordimetylcyklobutaner, perfluortri-metylcyklobutaner, perfluorcyklopentan, perfluormetylcyklopentan, perfluordimetyl-cyklopentaner, perfluorcykloheksan, perfluormetylcykloheksan og perfluorcyklohep-tan). Foretrukne, mettede perfluorkarboner har formelen CnFn+2,der n er fra 1 til 12, for trinnsvis fra 2 til 10 og helst fra 3 til 8, helt spesielt fra 3 til 6. Egnede perfluorkarboner inkluderer for eksempel CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12, CeFi2, CeFu, C7F14, C7Fi6, CsFi8 og C9F20.

Spesielt foretrukne gasser er SF6eller perfluorkarboner valgt blant CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10eller blandinger derav; SF6, C3F8eller C4F10er spesielt foretrukket.

Det kan også være fordelaktig å benytte en blanding av hvilke som helst av gassene

ovenfor i et hvilket som helst forhold. For eksempel kan blandingen omfatte en konvensjonell gass som nitrogen, luft eller karbondioksid, og en gass som danner en stabil mikroboblesuspensjon som svovelheksafluorid eller et perfluorkarbon som antydet ovenfor. Eksempler på egnede gassblandinger kan for eksempel i WO 94/09829. De følgende kombinasjoner er spesielt foretrukket: en blanding av gasser (A) og (B) hvori gass (B) er en fluorert gass og fortrinnsvis valgt blant SF6, CF4, C2F6, C3F6, C3Fg, C4F6, C4F8, C4F10, C5F10, C5F12eller blandinger derav, og (A) er valgt blant luft, oksygen, nitrogen, karbondioksid eller blandinger derav. Mengden av gass (B) kan utgjøre fra rundt 0,5 til rundt 95 volumprosent av den totale blanding, fortrinnsvis rundt 5 til rundt 80 volumprosent.

I enkelte tilfelle kan det være ønskelig å inkludere en forløper for en gassubstans (for eksempel et materiale som kan konverteres til en gass in vivo). Fortrinnsvis er gassforlø-peren og gassen som avledes derfra fysiologisk akseptable. Gassforløperen kan være pH-aktivert, fotoaktivert, temperaturaktivert osv. For eksempel kan visse perfluorkarboner benyttes som temperaturaktiverte gassforløpere. Disse perfluorkarboner som per-fluorpentane eller perfluorheksan har en væske-gassfaseovergangstemperatur over romtemperatur (eller den temperatur ved hvilke midlene produseres og/eller lagres), men under kroppstemperaturen, således undergår de en væske/gassfaseovergang og konverteres til en gass i kroppen. Videre inkluderer "gass" som benyttet her blandinger i damp-form ved den normale kroppstemperatur på rundt 37 °C. Forbindelser som ved en temperatur på 37°C er flytende kan således også benyttes i begrensede mengder i blanding med andre gassforbindelser for å oppnå en blanding som er i damp fase ved 37 °C.

For ultralydekografi er den biokompatible gass eller gassblanding fortrinnsvis valgt blant luft, nitrogen, karbondioksid, helium, krypton, xenon, argon, metan, halogenerte hydrokarboner (inkludert fluorerte gasser som perfluorkarboner og svovelheksafluorid) og blandinger derav. Med fordel kan det benyttes perfluorkarboner (særlig C4F10eller C3F8) eller SF6, eventuelt i blanding med luft eller nitrogen.

For anvendelse ved MRI vil mikroboblene fortrinnsvis inneholde en hyperpolarisert edelgass som hyperpolarisert neon, hyperpolarisert helium, hyperpolarisert xenon eller blandinger derav, eventuelt i blanding med luft, CO2, oksygen, nitrogen, helium, xenon eller et hvilket som helst av de halogenerte hydrokarboner som definert ovenfor.

For anvendelse ved scintigrafi vil mikroboblene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis inneholde radioaktive gasser som Xe<133>eller Kr<81>eller blandinger derav, eventuelt i blanding av CO2, oksygen, nitrogen, helium, krypton eller et hvilket som helst av de halogenerte hydrokarboner som definert ovenfor.

Det lyofiliserte preparat som er i kontakt med gassen kan så lett rekonstitueres ved tilsetning av en egnet steril, vandig, injiserbar og fysiologisk akseptabel bærervæske som sterilt, pyrogenfritt vann for injeksjon, en vandig oppløsning som saltoppløsning (som med fordel kan balanseres slik at sluttproduktet for injeksjonen ikke er hypotonisk), eller en vandig oppløsning av én eller flere tonisitetsjusterende substanser som salter (for eksempel av plasmaktioner med fysiologisk godtagbare motioner), eller sukker, sukkeralkoholer, glukoler og andre ikke-ioniske polyolmaterialer (for eksempel glukose, sukrose, sorbitol, mannitol, glycerol, polyetylenglykoler, propylenglykole og lignende), og som krever kun minimal agitering som for eksempel kan tilveiebringes ved forsiktig håndrysting.

Som foreliggende søker har observert har de således oppnådde, rekonstituerte mikrobobler en tallmidlere diameter som er noe lavere enn den tallmidlere diameter som måles for mikrodråpene i emulsjonen. Den tallmidlere diameter for mikroboblene er generelt fra rundt 60 til rundt 90% av den tallmidlere diameter for emulsjonens mikrodråper. I de fleste tilfelle er det observert tallmidlere diametere for mikroboblene på rundt 70 til 75% av den tallmidlere diameter for mikrodråpene.

Der det tørkede produkt inneholdes i en vial forsegles denne hensiktsmessig med en septum, gjennom hvilken bærervæsken kan injiseres ved bruk av en eventuelt på forhånd fylt sprøyte; alternativt kan det tørkede produkt og bærervæske avgis sammen i en dualkammerinnretning som en dualkammersprøyte. Det kan være fordelaktig å blande eller forsiktig å ryste produktet etter rekonstituering. Som imidlertid angitt ovenfor kan, i de stabiliserte kontrastmidler ifølge oppfinnelsen, størrelsen av gassmikroboblene være i det vesentlige uavhengig av mengden omrøringsenergi som bringes til det rekon stituerte, tørkede produkt. I henhold til dette behøver mer enn forsiktig håndrysting ikke å være nødvendig for å gi reproduserbare produkter med konsistent mikroboblestørrelse.

Mikroboblesuspensjonene som genereres ved rekonstituering i vann eller en vandig oppløsning kan være stabile i minst 12 timer og derved tillate betydelig fleksibilitet hva angår når de tørkede produkter rekonstitueres før injeksjon.

Bortsett fra når de inneholder en hyperpolarisert gass, kjent for å kreve spesielle lag-ringsbetingelser, kan den lyofiliserte rest lagres og transporteres uten behov for tem-peraturkontroll av omgivelsene, og særlig kan det leveres til hospitaler og leger for formulering på stedet til bruksferdige administreringssuspensjoner uten å kreve at slike brukere har spesielle lagringsfasiliteter.

Fortrinnsvis kan det i slike tilfeller leveres i form av et tokomponentkit.

Nevnte tokomponentkit kan inkludere to separate beholdere eller en dualkammerbe-holder. I det førstnevnte tilfelle er beholderen fortrinnsvis en konvensjonell, septumfor-seglet vial der vialen inneholder den lyofiliserte rest fra trinn (B), forseglet med en septum, gjennom hvilken bærervæsken kan injiseres ved bruk av en eventuelt på forhånd full sprøyte. I et slikt tilfelle blir sprøyten som benyttes som beholder for den andre komponent også benyttet for å injisere kontrastmiddelet. I det sistnevnte tilfelle er fortrinnsvis dualkammerbeholderen en dualkammersprøyte og med en gang lyofilisatet er rekonstituert og så hensiktsmessig blandet eller rystet forsiktig, kan beholderen benyttes direkte for injisering av kontrastmiddelet. I begge tilfellene tilveiebringes det midler for å rette eller tillate applikering av tilstrekkelig bobledannende energi til innholdet i beholderen. Som imidlertid angitt ovenfor er, i de stabiliserte kontrastmidler ifølge oppfinnelsen, størrelsen for gassmikroboblene i det vesentlige uavhengig av mengden av agi-tasjonsenergi som legges på det rekonstituerte, tørkede produkt. I henhold til dette er ikke mer enn forsiktig håndrysting generelt nødvendig for å gi reproduserbare produkter med konsistent mikroboblestørrelse.

Det kan erkjennes av fagmannen på området at andre tokammerrekonstitueringssyste-mer som er i stand til å kombinere det tørkede pulver med den vandige oppløsning på steril måte, også ligger innenfor oppfinnelsens ramme. I slike systemer er spesielt fordelaktig hvis den vandige fase kan legges mellom den vannuppløselige gass og omgivelsene for å øke hylletiden for produktet. Der et materiale som er nødvendig for å danne kontrastmiddelet ikke allerede er tilstede i beholderen (for eksempel en målsøkende ligand som skal linkes til fosfolipidet under rekonstituering) kan det pakkes med de andre komponenter i det angjeldende kit, fortrinnsvis i en form eller en beholder tilpasset lett kombinering med de andre komponenter i kitet.

Ingen spesifikke beholdere, vialer eller forbindelsessystemer er krevet, oppfinnelsen kan benyttet konvensjonelle beholdere, vialer og adaptere. Det eneste kravet er en god for-segling mellom propp og beholder. Forseglingens kvalitet blir derfor et hovedanligg-ende, enhver nedbrytning av forseglingsintegriteten kan tillate at uønskede stoffer kommer inn i vialen. I tillegg til å sikre sterilitet, er vakuumretensjon essensiell for produktet som er forseglet ved omgivelses- eller redusert trykk for å sikre sikker og riktig rekonstituering. Hva angår proppene eller korken kan disse være en forbindelse eller en multikomponentformulering basert på en ekstorner som polyisobutylen eller butyl-gummi.

Kontrastmidlene som oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan benyttes i et antall diagnostiske billedopptaksteknikker inkludert særlig ultralyd- og magnetisk resonans. Mulige andre, diagnostiske billedopptaksanvendelser inkluderer scintigrafi, lysbil-ledopptak og røntgenbilledopptak inkludert røntgenfasekontrastbilledopptak.

Deres anvendelse i diagnostisk ultralydbilledopptak og MR-billedopptak, for eksempel som suseptibilitetskontrastmidler og som hyperpolariserte gassbobler utgjør foretrukne trekk ved oppfinnelsen. Et antall billedopptaksteknikker kan benyttes ved ultralydanvendelser, for eksempel inkludert fundamental og harmonisk B-modusbilledopptak, puls- eller faseinversjonsbilledopptak og fundamental og harmonisk Doppler-billedopptak; hvis ønskelig kan det benyttes tredimensjonale billedopptaksteknikker.

In v/vo-ultralydtester i kaniner, hunder og svin har vist at kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen kan gi en økning i tilbakespredt signalintensitet fra myokardium på 15 til 25 dB etter intravenøs injeksjon av doser helt ned til 0,001 ml/kg kroppsvekt. Signaler kan observeres ved enda lavere doser ved bruk av mer sensitive teknikker som farge-Doppler eller energipulsinvertering. Ved disse lave doser er fortynningen i blodfylte rom som hjertekamrene funnet tilstrekkelig lav til å tillate visualisering av områder av interesse i den myokardiale vaskulatur. Tester har også vist at slike intravenøst injiserte kontrast - midler fordeles gjennom hele blodmengden og øker derfor ekogenisiteten for alle vas-kulariserte vev, og at de resirkuleres. De er også funnet brukbare som generelle Doppler-signalforsterkningshjelpemidler og kan i tillegg være brukbare ved ultralyd-styrt tomografi og ved fysiologisk utløste eller intermittente billedopptak.

For ultralydanvendelser som ekkokardiografi og for å tillate fri passasje gjennom det pulmonære system og for å oppnå resonans med de foretrukne billedopptaksfrekvenser rundt 0,1 til 15 MHz, benyttes det generelt mikrobobler med en midlere størrelse på 0,1 til 10 fim, for eksempel 0,5 til 7fim. Som beskrevet ovenfor kan det tilveiebringes kontrastmidler ifølge oppfinnelsen med en meget snever størrelsesfordeling for mikroboble-dispergering i det området som er foretrukket for ekkokardiografi og derved sterkt forsterke ekogenisiteten så vel som sikkerheten in vivo, og derved også å gjøre kontrastmidlene spesielt fordelaktige ved anvendelser som blodtrykksmålinger, blodstrømspo-ring og ultralydtomografi.

Ved ultralydanvendelser kan kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen for eksempel administreres i doser, slik at mengden av fosfolipid som injiseres ligger i området 0,1 til 200 (lg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis 10 til 200 (Ag/kg i fravær av et vasketrinn for emulsjoner og 0,1 til 30 (lg/kg hvis emulsjonen er vasket før lyofilisering. Det vil erkjennes at bruken av så lave nivåer av fosfolipid er av vesentlig fordel ved minimalisering av mulige toksiske bivirkninger. Videre kan de lave nivåer av fosfolipider som er tilstede i effektive doser tillate doseøkninger for å forlenge observeringstidene uten ugunstige virknin-ger.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tillater fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å oppnå gassfylte mikrobobler med liten diameter som viser en ekstremt snever størrelsesfordeling. Ved således egnet å velge komponentene i en blanding og særlig mengden agiteringsenergi som legges på under emulgeringen av den vandig-organiske blanding, er det mulig å oppnå gassfylte mikrobobler med den ønskede numeriske midlere diameter og størrelsesfordeling.

Spesielt er det ved eksploatering av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen mulig å oppnå kontrastmidler omfattende fosfolipidstabiliserte gassmikrobobler med liten størrelse som karakteriseres ved at de har relativt liten midlere dimensjon, og en spesielt brukbar snever og kontrollert størrelsesfordeling.

Som kjent av fagfolk på området kan dimensjonene for mikro/nanopartikler og deres respektive størrelsesfordeling karakteriseres ved et antall parametere der den oftest benyttede er den tallmidlere diameter Dn, tallmediandiameteren Dnso, den volummidlere diametere Dvog volummediandiameteren DVso. Mens talldiameteren gir en indikasjon på den tallmidlere dimensjon for partiklene, gir volumdiametrene informasjon om hvor- dan det totale volum av partiklene er fordelt i hele populasjonen. Da nærværet av meget få, men store volumpartikler i en populasjon av ellers små volumpartikler kan forårsake at den tilsvarende Dv-verdi skiftes mot høye verdier er det enkelte ganger mer hensiktsmessig å benytte Dvso-verdien for å evaluere fordelingen av en partikkels populasjon. DV5o er en beregnet verdi som antyder at halvparten av det totale av partiklenes indre volum er tilstede i partikler med en diameter mindre enn DVso; dette tillater å redusere effektene av utilsiktet tildannede store volumpartikler ved evaluering av størrelsesforde-lingen. Det er klart at monodimensjonerte partikler viser identiske Dn-, Dnso-, Dv- og Dv5o-verdier. På den annen side vil en økning i en utvidelse av partiklenes fordeling resultere i en større differanse mellom disse forskjellige verdier med en tilsvarende vari-asjon i de respektive forhold derimellom (for eksempel økning av Dv:DN-forholdet). For eksempel vil partikkelpopulasjoner inneholdende primært små partikler (for eksempler partikler med en diameter rundt 2 \ im) med ikke desto mindre en liten prosentandel store partikler (for eksempel partikler med en diameter over 8 (im) vise høyere Dv- eller Dvso-verdier sammenlignet med DN-verdien, med tilsvarende høyere Dv:Dn- eller DV5o:DN-forhold.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således funnet spesielt egnet for å fremstille mikrobobler med en tallmidlere diameter (Dn) på mindre 1,70 \ im og en volummediandiameter (Dvso), slik at DV5o:DN-forholdet er rundt 2,30 eller lavere, fortrinnsvis lavere enn 2,10. Fortrinnsvis er DN-verdien 1,60fim eller lavere, helst 1,50 nm eller lavere og aller helst 1,30 (im eller lavere. Mikrobobler med lavere verdier for Dn, for eksempel rundt 1 (im eller sågar lavere, for eksempel 0,85 \ im og ned til 0,80 (im, kan lett oppnås ved oppfinnelsens fremgangsmåte. Dv:DN-forholdet er fortrinnsvis rundt 1,80 eller lavere, helst rundt 1,60 eller lavere og aller helst rundt 1,50 og lavere. Mikrobobler med lavere verdier for Dv:DN-forholdet, for eksempel 1,20 eller lavere, for eksempel 1,05 kan lett oppnås.

Videre er det med suspensjonen av snevert fordelt smådimensjonerte mikrobobler som

oppnås ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte, observert at mengden av mikrobobler med en diameter større enn 3 (im (uttrykt som prosentandel av partikler over det totale antall av partikler), særlig for mikrobobler med en Dn lavere enn rundt 1,5 \ im og et DVso:Dn-forhold mindre enn rundt 2,20, typisk er lavere enn 3% i forhold til det totale antall av mikrobobler i suspensjonen, fortrinnsvis under 2% og aller helst under 1%. Konsentrasjonen av mikrobobler i den rekonstituerte suspensjon er generelt minst lxl0<8>partikler per milliliter, fortrinnsvis minst lxl0<9>partikler per milliliter.

De ovenfor angitte verdier for Dvso, Dn og antallet mikrobobler, er beregnet på målinger foretatt ved bruk av en Coulter Counter Mark II-apparatur utstyrt med en 30 nm apertur med et måleområde på 0,7 til 20fim.

Den spesifikke kategori av kontrastmidler er spesielt verdifull ved ultralydbilledopptak, særlig for opptaksteknikker som er basert ikke-lineær spredning av mikrobobler som forklart nedenfor.

De neste ultralydkontrastbilledopptaksmetoder eksploaterer de ikke-lineære sprednings-karakteristika for ultralydkontrastmidler. Fra litteraturen (for eksempel Eatock et al., Journal of the Acoustical Society of America, vol.77(5), s. 1692-1701 , 1985) er det kjent at ikke-lineær spredning er signifikant kun for mikrobobler som er mindre enn, eller nær resonansstørrelsen. Særlig kan det hensiktsmessig benyttes mikrobobler med dimensjoner som er halvparten av resonansstørrelsen. "Halvparten av resonansstørrel-sen" er den størrelse for en mikroboble med en resonansfrekvens som er lik to ganger senterfrekvensen for den transmitterte ultralydbølge (som for spesielle anvendelser kan være opptil 60 MHz). Ved billedopptak av et volum som inneholder et mikrobobleba-sert ultralydkontrastmiddel, forsterkes detekterbarheten for mikrobobleekkoene mot vevekko ved nivået av ikke-lineær spredning av mikroboblene, og reduseres ved en ut-tynning forårsaket av mikrobobler som er lokalisert mellom sonden og området av interesse. Svekning langs transmiteringsveien reduserer den ultralydenergi som er tilgjenge-lig for å generere ikke-lineær boblerespons; svekning langs mottagerveien fjerner ekko-energi som er i stand til å nå ultralydsonden. Når det gjelder en suspensjon omfattende et bredt spektrum av mikroboblestørrelser, vil mikroboblene ved resonansstørrelse og større enn denne hovedsakelig bidra til transmitterings-mottakssvekning uten å bidra på noen effektiv måte til de ikke-lineære ekkosignaler. Den totale, akustiske respons for ikke-lineært billedopptak trekker derfor i stor grad fordel av bruken av et kalibrert sett av mikrobobler med en snever størrelsesfordeling og en midlere størrelse nær halvparten av resonansstørrelsen. Fortrinnsvis har mikroboblepreparatene en størrelsesfordeling tilsvarende et DV5o:DN-forhold på rundt 2,30 eller lavere, fortrinnsvis 2,10 eller lavere og helst 2,00 eller lavere. Fortrinnsvis er den midlere størrelse for de benyttede mikrobobler rundt ±10% av den halve resonansstørrelse, mer foretrukket rundt ±5% av den halve resonansstørrelse.

De følgende, ikke-begrensende eksempler skal gis for bedre illustrasjon av oppfinnelsen.

De følgende materialer er benyttet i de følgende eksempler.

FOSFOLIPIDER:

Dipalmitoylfosfatidylserin (Genzyme)

DPPS IUPAC: l, 2- dipalmitoyl- sn- glycero- 3- fosfokolin

Dipalmitoylfosfatidylglycerolnatriumsalt (Genzyme)

DPPG IUPAC: l, 2- dipalmitoyl- sn- glycero- 3-[ fosfo- rac-( l- glycerol)]

Distearoylfosfatidinsyrenatriumsalt (Genzyme)

DSPAL IUPAC: l, 2- distearoyl- sn- glycero- 3- fosfat Distearoylfosfatidylglycerolnatriumsalt (Genzyme)

IUPA C: l, 2- distearoyl- sn- glycero- 3- fosfoserin)

DSPC Distearoylfosfatidylkolin (Genzyme)

IUPA C: l, 2- distearoyl- sn- glycero- 3- fosfokolin

DSEPC Distearoyletylfosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids)

IUPA C: l, 2- distearoyl- sn- glycero- 3- etylfosfokolin

DAPC Diarakidoylfosfatidylkolin (Avanti polar Lipids)

IUPAC: l, 2- diarakidoyl- sn- glycero- 3- fosfokolin

DSTAP 1,2-distearoyl-3-trimetylammonium-propanklorid (Avanti

polar Lipids)

DSPE-PEG2000 Distearoylfosfatidyletanolamin modifisert med PEG2000,

natriumsalt (Nektar Therapeutics)

DSPE-PEG5000 Distearoylfosfatidyletanolamin modifisert med PEG5000,

natriumsalt (Nektar Therapeutics)

DSPE-PEG2000- Distearoylfosfatidyletanolamin modifisert med PEG2000-maleimid maleimid (Avanti Polar Lipids)

SATA N-suksinimidyl-S-acetyltioacetat (Pierce)

RGD-4C H-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-NH2

(AnaSpec Inc.)

LØSNINGSMIDLER:

Perfluor-n-heksan {C^u) fra Fluka

Perfluormetylcykloheksan (CF3-cyklo-C6Fn) fra Fluka

Perfluor-n-heptan (C7F16) fra Fluka

Perfluor-n-nonan (C9F20) fra Aldrich

Perfluordekalin fra Aldrich

Cykloheksan fra Fluka

Cyklooktan fra Fluka

n-dekan fra Fluka

n-oktan fra Fluka

metaxylen fra Fluka

diisopropylceton fra Fluka

CCU fra Fluka

LYOPROTEKTANTER:

Mannose fra Fluka

Glukose fra Fluka

Sorbitol fra Fluka

Mannitol fra Fluka

Dextran 6000 fra Fluka

Dextran 15000 fra Fluka

Dextran 40000 fra Fluka

Inulin fra Fluka

KARAKTERISERING AV MIKRODRÅPER OG MIKROBOBLER

Størrelsesfordelingen for emulsjonsmikrodråpene er bestemt:

a) ved hjelp av en Coulter-counter (Coulter Mark II-apparatur utstyrt med 30 nm apertur med et måleområde på 0,7 til 20 nm), når emulsjonen er

underkastet et vasketrinn; 10 ni emulsjon ble fortynnet i 100 ml saltoppløsning ved romtemperatur og tillatt ekvilibrering i 3 minutter før måling;

b) ved hjelp av en laserlysspredningspartikkelsizer (Malvern Mastersizer, for-tynnelse 200x, fokallengde 45 mm, standard presentasjon), hvis emulsjonen

ikke er underkastet et vasketrinn.

Størrelsesfordelingene, volumkonsentrasjonen og antallet mikrobobler (etter lyofilisering og rekonstituering med en vandig fase) ble bestemt ved en Coulter Counter Mark II-apparatur utstyrt med en 30 nm apertur med et måleområde på 0,7 til 20 nm.50 ni av mikrobobleprøvene ble fortynnet i 100 ml saltoppløsning ved romtemperatur og tillatt ekvilibrering i 3 minutter før måling.

Mengde fosfolipider i sluttpreparatet (emulsjon av mikroboblesuspensjon) ble bestemt ved HPLC-MS-analyse med følgende oppsett: Agilent 1100 LC-kromatograf, MN CC 125/2 mm - 5 C8-kolonne fra Maherey Nagel, Agilent MSD G1945D-detektor.

LYOFILISERING

Lyofiliseringsmetodologien og -apparaturen var som følger. Emulsjonen (eventuelt etter vasketrinnet hvis det ble gjennomført) fryses først til -45°C i 5 minutter og fryse-tørkes (lyofiliseres) så ved romtemperatur og et trykk på 0,2 mbar ved bruk av en Crhist-Alpha 2-4 frysetørker.

Eksempel 1 (preparatene la - ln)

10 mg DPPS settes til rundt 10 ml av en 10 vektprosent vandig mannitoloppløsning og suspensjonen oppløses til 65°C i 15 minutter og avkjøles så til romtemperatur (22°C). 8 volumprosent perfluorheptan settes til denne vandige fase og emulgeres i et begerglass med en diameter rundt 4 cm ved bruk av en høyhastighetshomogenisør (Polytron T3000, sondediameter 3 cm) i 1 minutt ved den hastighet som er antydet i tabell 1. Den resulterende volummediandiameter (DVso) og tallmidlere diameter (Dn) for mikrodråpene i emulsjonen er vist i tabell 1. Emulsjonen ble så sentrifugert ved 800 til 1200 omdreininger per minutt i 10 minutter på en Sigmasentrifuge 3K10 for å eliminere over-skuddet av fosfolipid og de separerte pellets (mikrodråper) ble gjenvunnet og resuspen-dert i det samme utgangsvolum av en 10% vandig mannitolopp løsning.

Den vaskede emulsjon samles så i en 100 ml kolbe for lyofilisering, fryses og frysetør-kes i henhold til den ovenfor angitte standardprosedyre. Det lyofiliserte produkt eksponeres så til en atmosfære inneholdende 35% perfluor-n-butan og 65% nitrogen og dispergeres i et vannvolum som er to ganger utgangs volumet ved forsiktig rysting for hånd. Mikroboblesuspensjonen som oppnås etter rekonstituering med destillert vann analyseres ved bruk av en Coulter Counter. Konsentrasjonen av mikrobobler i de oppnådde suspensjoner var rundt lxl0<9>partikler per ml. De respektive verdier for mikro-boblenes volummediandiameter (Dvso), volummidlere diameter (Dv), tallmidlere diameter (Dn) og mengden mikrobobler med en diameter større enn 3 um (prosent av det totale antall mikrobobler) er gitt i tabell 1. Når mer enn ett eksempel er gjennomført ved samme omrøringshastighet henviser verdiene som antydes i tabell 1 til den midlere be-regnede verdi for hver parameter.

Eksempel 2 (preparatene 2a - 2j)

Man benyttet prosedyren som adoptert for eksempel 1 med som eneste forandring at fosfolipidet er en blanding av 20 vektprosent DPPS og 80 vektprosent DSPC, idet den totale mengde fosfolipid forble uforandret. Resultatene er oppsummert i tabell 2.

Eksempel 3 (preparatene 3a - 3p)

Man fulgte samme prosedyre som i eksempel 2 med som eneste forskjell at DPPS/- DSPC-vektforholdet varieres som angitt i tabell 3. Resultatene er oppsummert i tabell 3.

Eksempel 4

Man benyttet den samme prosedyre for eksempel 2 med som eneste forskjell at blandingen av DSPA og DPPS ble fremstilt med forskjellige vektforhold. Resultatene er oppsummert i tabell 4.

Eksempel 5 (preparatene 5a - 5i)

Man fulgte den samme prosedyre som for eksempel 1 med som eneste forskjell at det ble benyttet en 1:1 vektbasert fosfolipidblanding av DPPG og DSPC (totalkonsentrasjon 1,0 mg/ml) i blanding med 10 vektprosent (beregnet på den totale vekt av fosfolipid) av palmitinsyre. Resultatene er oppsummert i tabell 5.

Eksempel 6

Man benyttet prosedyren fra eksempel 1 med som eneste forskjell at DSEPC ble benyttet som fosfolipid og at perfluorheksan ble benyttet som organisk oppløsningsmiddel. Den anvendte omdreiningshastighet var 11000 omdreininger per minutt. Dimensjoner, størrelsesfordeling og prosentandel av mikrobobler med diameter større enn 3 um var som følger:

Eksempel 7 (preparater 7a - 71)

10 ml destillert vann inneholdende 10 mg DPPS som fosfolipid oppvarmes til 70°C i 15 minutter og avkjøles så til romtemperatur. 0,8 ml av et organisk oppløsningsmiddel som spesifisert i den følgende tabell 6 ble emulgert i denne vandige fase ved bruk av en høy-hastighetshomogenisør (Polytron T3000) ved 10000 omdreininger i 1 minutt. Emulsjonen ble satt til 10 ml av en 15% Dextranl5000-oppløsning, frosset og lyofilisert (0,2 mbar, 24 timer). Etter lyofilisering ble luft innført i lyofilisøren. Mikroboblesuspensjonen som ble oppnådd etter rekonstituering med destillert vann ble analysert ved bruk av en Coulter Counter. Tabell 6 oppsummerer resultatene uttrykt ved dimensjoner og stør-relsesfordeling for mikroboblene.

Eksempel 8

Eksempel 7 ovenfor gjentas med den samme metodologi. Ved å benytte perfluorheksan som organisk oppløsningsmiddel og forskjellige lyoprotektive midler ved forskjellige konsentrasjoner som angitt i tabell 7. Tabell 7 oppsummerer resultatene uttrykt ved dimensjoner og størrelsesfordeling for mikroboblene.

Eksempel 9 (preparatene 9a - 9e)

Eksempel 1 gjentas ved å emulgere blandingen ved en hastighet på 10000 omdreininger per minutt. I tillegg ble det samme eksempel gjentatt ved å tilsette forskjellige mengder Pluronic F68 (en poloxamer tilsvarende Poloxamer 188) til den vandige fase før emulgering, som skissert i tabell 8. Tabell 8 viser resultatene av det komparative forsøk uttrykt ved størrelsesfordeling og konverteringsutbytte av mikroboblene. Konverteringsutbyttet gis som prosentualt antall av gassfylte mikrobobler som dannes ved rekonstituering av den lyofiliserte matriks i forhold til antallet mikrodråper som måles i emulsjonen.

Resultatene ovenfor viser at med en konsentrasjon av poloxamer tilsvarende halvparten av konsentrasjonen av fosfolipider (dvs. ca. 33% av den totale mengde av surfaktanter i blandingen) ble både konverteringsutbyttene og størrelsesfordelingen for mikroboblene påvirket negativt.

Eksempel 10 (preparater 10a - 10d)

Eksempel 9 gjentas, men i stedet for å sette Pluronic F68 til den vandige fase settes forskjellige mengder kolesterol (fra Fluka) til den organiske fase, før emulgering, som skissert i tabell 9. Tabell 9 viser resultatene av sammenligningsforsøket uttrykt ved stør-relsesfordeling og konverteringsutbytte (fra mikrodråpene i emulsjonen) av mikrobobler.

Resultatene ovenfor viser at med en konsentrasjon på 0,050 vektprosent kolesterol i den vandige fase blir både konverteringsutbytte og størrelsesfordeling for mikroboblene påvirket meget negativt. En konsentrasjon på 0,025 resulterer fremdeles i et heller lavt konverteringsutbytte, selv om det kan gis akseptable dimensjoner og størrelsesfordeUn-ger for mikroboblene.

Eksempel 11

30 ml destillert vann inneholdende 60 mg DPPS og 3 g mannitol oppvarmes til 70°C i 15 minutter og avkjøles så til romtemperatur. Perfluorheptan emulgeres i denne vandige fase ved bruk av en høyhastighetshomogenisør (Polytron<®>, 12500 omdreininger per minutt, 1 minutt).

Den resulterende emulsjon som viser en volummediandiameter (DVso) på 2,3 um og en tallmidlere diameter (Dn) på 2,0 um vaskes én gang ved sentrifugering, resuspenderes i 30 ml av en 10% oppløsning av mannitol i destillert vann og deles så i tre deler på 10 ml hver.

Den første del (A) benyttes som sådan for det etterfølgende lyofiliseringstrinn. Den andre del (B) samles i en sprøyte og håndsprøytes gjennom et 50 um Nuclepore<®->filter (47 mm - polykarbonat). Den tredje del (C) filtreres gjennom et 3 um Nuclepore®-filter (47 mm polykarbonat) ved samme metode.

Emulsjonene ble frosset i en 100 ml kolbe (-45°C i 5 minutter) og så frysetørket (0,2 mBar, i 72 timer).

Atmosfærisk trykk gjenopprettes ved innføring av en 35:65 blanding C4Fio:luft. De respektive lyofilisater ble dispergert i 10 ml vann. De således oppnådde mikroboblesuspensjoner ble analysert ved bruk av en Coulter Counter og resultatene er angitt i den følg ende tabell:

Som vist ved disse resultater tillater det ytterligere filtreringstrinn og reduserer dimen-sjonen videre for mikroboblene og å redusere den respektive størrelsesfordeling.

Eksempel 12

Eksempel 1 gjentas ved bruk av DSPC:DSTAP 7:3 på vektbasis ved en omrøringshas-tighet på 11000 omdreininger per minutt. Karakterisering av emulsjonsdråpene og mikroboblene var som følger:

Eksempel 13

Prepareringen i eksempel 1 gjentas ved å emulgere blandingen ved en hastighet på 10000 omdreininger per minutt (eksempel 13a).

Den samme fremstilling gjentas ved videre å sette rundt 0,9 mg DSPE-PEG2000 (rundt 8,3% av den totale mengde dispergerte fosfolipider) til den opprinnelige, vandige suspensjon (eksempel 13b).

Ingen vasking ved sentrifugering gjennomføres på noen av de to preparater. Tabell 10 viser karakteriseringen av disse to, både emulsjonen og mikroboblesuspensjonen. Resultatene ovenfor viser at med en konsentrasjon av DSPE-PEG på mindre enn 10 vektprosent, beregnet på den totale mengde fosfolipider, blir både konverteringsutbytter og størrelsesfordeling for mikrobobler, påvirket negativt.

Eksempel 14

Fremstillingene i eksempel 11 gjentas ved å erstatte DPPS med den samme mengde DAPCrDPPS 1:1 påvektbasis.

Den resulterende emulsjon deles i tre porsjoner på 10 ml uten vasking ved sentrifugering.

Vandige suspensjoner av DSPE-PEG2000 og av DSPE-PEG5000 prepareres separat ved å dispergere 25 mg av den respektive DSPE-PEG i 5 ml 10% mannitoloppløsning under sonikering (3 mm sonikeringssonde, Branson 250 sonifier, utgang 30%, i 5 minutter).

En alikvot på 2,5 ml av en 10% mannitoloppløsning settes så til en første del av emulsjonen (eksempel 14a).

En alikvot på 2,5 ml av den fremstilte DSPE-PEG2000-suspensjon settes til en andre del av emulsjonen (eksempel 14b).

En alikvot på 2,5 ml av den fremstilte DSPE-PEG500-suspensjon settes til en tredje del av emulsjonen (eksempel 14c).

De tre blandinger oppvarmes til 60°C under omrøring i én time. Etter avkjøling til romtemperatur blir størrelsen for mikroproduktene bestemt ved hjelp av en Malvert Mastersizer. Resultatene er rapportert i tabell 11.

Emulsjonen blir deretter frysetørket i henhold til prosedyren ifølge eksempel 11. Atmosfærisk trykk gjenopprettes ved innføring av C4Fio:luft 35:65. De respektive lyofilisater dispergeres i 10 ml destillert vann. Den således oppnådde mikroboblesuspensjon analyseres ved bruk av en Coulter Counter (se tabell 11).

Mikroboblesuspensjonene vaskes deretter to ganger med destillert vann ved sentrifugering (180g/10 min) og lyofiliseres igjen i henhold til prosedyren ovenfor. Mengden

DSPE-PEG i det tørkede preparat bestemmes ved hjelp av HPLC-MS. Resultatene er gitt i tabell 11.

Som det kan ses fra resultatene ovenfor tillater etterfølgende tilsetning av en DSPE-PEG-suspensjon til den dannede emulsjon innføring av relativt store mengder av DSPE-PEG i sammensetningen av det stabiliserende sjikt (i dette tilfelle mer enn 30% av den totale vekt av fosfolipider som utgjør den stabiliserende omhylling), uten negativt å påvirke sluttegenskapene for mikroboblene.

Tilsvarende resultater kan oppnås med andre PEG-modifiserte lipider, særlig DSPE-PEG2000-biotin eller DSPE-PEG2000-maleimid, og med peptidholdige fosfolipider, særlig DSPE-PEG2000-maleimid-SATA-RGD4C. Dette sistnevnte peptidbærende fosfolipid kan fremstilles i henhold til kjente teknikker ved å omsette RGD4C-peptidet med SATA, debeskytte tiolgruppen på SATA og omsette det debeskyttede RGD4C-SATA med DSPE-PEG2000-maleimidet. Fremstillingsmetoden som beskrevet i "Development of EGF-conjugated liposomes for targeted delivery of boronated DNA-binding agents", av Bohl Kullberg et al., Bioconjugate chemistry 2002, 13, 737-743, (beskriver innføring av et EGF-protein inn i et DSPE-PEG-maleimidmolekyl), kan hensiktsmessig benyttes.

Eksempel 15

10 mg DPPS:DSPC i vektforholdet 1:1 ble satt til rundt 10 ml av en 10 vektprosent vandig mannitoloppløsning.

Blandingen ble oppvarmet ved 70°C i 5 minutter og så avkjølt til romtemperatur (22°C). Cyklooktan tilsettes i en strømningshastighet på 0,2 ml per minutt via et innløp i en mikromikser (standardsliss Interdigital micro Mixer, med hus SS 316Ti med nikkel-på-kobberinnlegg, 40 um x 300 um, Institut fur Microtechnik Mainz GmbH) til den vandige fase som sirkulerer ved 20 ml per minutt ved romtemperatur, for en total mengde på 7,4 volumprosent organisk oppløsningsmiddel. Etter ferdig tilsetning av organisk oppløsning resirkuleres emulsjonen i mikromikseren i ytterligere 20 minutter.

Emulsjonen deles så i fem alikvoter på 2 ml hver og innføres i fem vialer DIN8R. Fire forsegles og oppvarmes i 30 minutter ved temperaturer på 60, 80, 100 og henholdsvis 120°C, som antydet i tabell 12, den femte oppvarmes ikke.

Emulsjonene avkjøles så til romtemperatur og innholdet i de fem vialer underkastes lyofilisering i henhold til den følgende prosedyre. 1 ml av hver emulsjon samles i en DIN8R-vial og fryses ved -5°C; temperaturen senkes til -45°C i løpet av 1 time og emulsjonen frysetørkes deretter ved -25°C og 0,2 mbar i 12 timer (Teistar Lyobeta35 lyofilisør), med et siste tørketrinn ved 30°C og 0,2 mbar i 5 timer.

Det lyofiliserte produkt eksponeres så for en atmosfære inneholdende 35% perfluor-n-butan og 65% nitrogen og dispergeres i et volum på vann som er to ganger det opprinnelige ved forsiktig rysting for hånd. Tabell 12 viser resultatet av karakteriseringen av de endelige suspensjoner av mikrobobler.

Fra resultatene ovenfor synes det at ved å underkaste den dannede emulsjon en termisk behandling oppnår man en innsnevring av størrelsesfordelingen av den endelige mikroboblesuspensjon, mens samtidig antallet mikrobobler økes. Særlig er det ved å øke opp-varmingstemperaturen til over 100°C mulig å oppnå en relativt snever størrelsesforde- ling av mikrobobler også i fravær av vasketrinn i emulsjonen så vel som en økning i det totale antall mikrobobler i suspensjonen.

Eksempel 16

10 ml destillert vann inneholdende 10 mg DPPS og 1 g mannitol oppvarmes til 70°C i 15 minutter og avkjøles så til romtemperatur. DPPE-MPB(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[4-(p-maleimidfenyl)butyramid]-Na-salt - Avanti Polar Lipids)

(4,8 vektprosent - 0,5 mg) tilsettes. Dette fosfolipid dispergeres i den vandige fase ved bruk av et ultralydbad (Branson 1210-3 minutter).

0,8 ml perfluorheptan fra Fluka emulgeres i denne vandige fase (avkjølt med et isbad) ved bruk av en høyhastighets homogenisør (Polytron<®>T3000,15000 omdreininger per minutt, 1 minutt).

Den resulterende emulsjon viste en volummediandiameter (DVso) på 2,3 um og en tallmidlere diameter (Dn) på 2,1 um, bestemt ved en Malvern Mastersizer.

Emulsjonen vaskes to ganger ved sentrifugering og resuspenderes deretter i 9,5 ml 10% oppløsning av mannitol i destillert vann. Den vaskede emulsjon fryses (-45°C, 5 minutter) og frysetørkes deretter (under 0,2 mBar i 24 timer).

Atmosfærisk trykk gjennopprettes ved innføring av C4Fio:luft 35:65. Lyofilisatet dispergeres i 20 ml destillert vann, mikrobobler vaskes én gang ved sentrifugering og redis-pergeres deretter i 4 ml av en EDTA-holdig fosfatbufret saltoppløsning (molarsammen-setning: 10 mM fosfat, 2,7 mM KC1, 137 mM NaCl, 10 mM EDTA), inneholdende 3,4 mg tioacetylert avidin. 400 (il av en hydroksylaminoppløsning (13,92 mg i PBS 50 mM, pH: 7,5) ble tilsatt for å debeskytte tiolgruppen på det tioacetylerte avidin.

Suspensjonen ble omrørt ved invertering på en skiverotator (Fisher Scientific) i 2 timer. Deretter ble det tilsatt 150 ul IN NaOH.

De således oppnådde avidinmerkede mikrobobler ble vasket to ganger med PBS ved sentrifugering (10000 omdreininger per minutt, 10 minutter, Sigma sentrifuge 3K10). Den oppnådde mikroboblesuspensjon analyseres ved bruk av en Coulter Counter og viser en Dvso-diameter på 1,6 um og en Dn på 1,2 um.

Effektiviteten av innsiktede mikroboblepreparat ble testet på in vitro og in vivo.

In vitro - forsøk:

For å teste den effektive binding av acetylert avidin til overflaten av mikroboblene ble det preparert to sett av fibrinholdige brønner. I det første sett var kun en fibrinoverflate tilstede. I det andre sett var fibrinet forbehandlet med et biotinmerket antifibrinpeptid (DX-278, beskrevet i WO 02/055544). Mikroboblesuspensjonene som ble fremstilt på denne måte ble satt til brønnene (5x10<8>mikrobobler per brønn). Etter 2 timers inkube-ring (opp ned) og flere vaskinger, ble fibrinoverflatene i de to sett av brønner observert ved hjelp av et optisk mikroskop. Mens i det vesentlige ingen mikrobobler kunne observeres i brønnene uten biotinylert antifibrinpeptid, ble en massiv dekning av mikrobobler observert i de biotinylerte antifibrinholdige brønner.

In v/ vo- forsøk:

En trombus ble dannet i den abdominale aorta hos to kaniner ved FeCl3-metoden (Lockyer et al., 1999, Journal of Cardiovascular Pharmacology, bind 33, s. 718 - 725).

Ekkobilledopptak gjennomføres med en HDI 5000 ultralydmaskin (Philips), pulsinver-teringsmodus, L7-4-sonde, MI: 0,07.

Et biotinylert antistoff (CD41 som er spesifikt for GPIIB/IIIA-reseptoren av aktiverte plater) injiseres så intravenøst i de to kaniner.

Etter 30 minutter injiseres mikroboblesuspensjonen omfattende avidinmerkede mikrobobler intravenøst (lxlO<9>mikrobobler per ml) i den første kanin. 15 minutter etter inji-seringen observeres det en sterk opasifisering av trombus for suspensjonen. Opasifise-ringen er synlig minst én time etter injeksjonen.

Den samme mengde mikroboble suspensjon uten avidinmerkede mikrobobler injiseres intravenøst i den andre kaninen. Det observeres kun en lett opasifisering av trombus.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en lyofilisert matriks som, ved kontakt med en vandig bærervæske og en gass, kan rekonstitueres til en suspensjon av gassfylte mikrobobler som er stabilisert overveiende med et fosfolipid,karakterisert vedat den omfatter: a) fremstilling av en vandig organisk emulsjon omfattende i) et vandig medium inkludert vann; ii) et organisk oppløsningsmiddel som i det vesentlige er ublandbart med vann; iii) et emulgerende preparat av amfifiliske materialer omfattende mer enn 50 vektprosent av et fosfolipid; og iv) et lyoprotektivt middel; b) lyofilisering av den emulgerte blanding for å oppnå en lyofilisert matriks omfattende det nevnte fosfolipidet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat trinn a) for fremstilling av emulsjonen omfatter de følgende trinn: al) fremstilling av en suspensjon ved dispergering av den emulgerende blanding og det lyoprotektive middel i det vandige medium; a2) blanding av den oppnådde suspensjon med de organiske oppløsningsmidler; og a3) å underkaste blandingen kontrollert agitering for å oppnå en emulsjon.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det organiske oppløsningsmiddel har en oppløselig-het i vann på mindre enn 10 g per liter.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det organiske oppløsningsmiddel har en oppløselig-het i vann på 1,0 g per liter eller lavere.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det organiske oppløsningsmiddel har en oppløselig-het i vann på 0,2 g per liter eller lavere.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det organiske oppløsningsmiddel har en oppløselig-het i vann på 0,01 g per liter eller lavere.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det organiske oppløsningsmiddel har en oppløselig-het i vann på 0,001 g per liter eller lavere.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det organiske oppløsningsmiddel er valgt blant rette eller forgrenede alkaner, alkener, cyklo alkaner, aromatiske hydrokarboner, alkyletere, ketoner, halogenerte hydrokarboner, perfluorerte hydrokarboner og blandinger derav.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat oppløsningsmiddelet er valgt blant pentan, heksan, heptan, oktan, nonan, dekan, 1 -penten, 2-penten, 1-okten, cyklopentan, cykloheksan, cyklooktan, 1-metyl-cykloheksan, benzen, toluen, etylbenzen, 1,2-dimetylbenzen, 1,3-dimetylbenzen, di-butyleter og di-isopropylketon, kloroform, karbontetraklorid, 2-klor-l-(difluormetoksy)-l,l,2-trifluor-etan (enfluran), 2-klor-2-(difluormetoksy)-l,l,l-trifiuoretan (isofluran), tetraklor-l,l-di-fluoretan, perfluorpentan, perfluorheksan, perfluorheptan, perfluornonan, perfluorbenzen, perfluordekalin, metylperfluorbutyleter, metylperfluorisobutyleter, etylperfluorbutyleter, etylerfluorisobutyleter og blandinger derav.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat mengden organisk oppløsningsmiddel er fra rundt 1 til rundt 50 volumprosent, beregnet på mengden vann.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat det lyoprotektive middel er valgt blant karbohydrater, sukkeralkoholer, polyglykoler og blandinger derav.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat det lyoprotektive middel er valgt blant glukose, galaktose, fruktose, sukrose, trehalose, maltose, laktose, amylose, amylopektin, cyklodekstriner, dextran, inulin, løselig stivelse, hydroksyetylstivelse (HES), erytritol, mannitol, sorbitol, polyetylenglykoler og blandinger derav.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12,karakterisertv e d at mengden lyoprotektivt middel er fra rundt 1 til rundt 25 vektprosent beregnet på vekten av vann.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2,karakterisert vedat fosfolipidet er valgt blant dilauroyl-fosfatidylkolin (DLPC), dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC), dipalmitoyl-fosfatidylkolin (DPPC), diarakidoyl-fosfatidylkolin (DAPC), distearoyl-fosfatidylkolin (DSPC), dioleoyl-fosfatidylkolin (DOPC), l,2-distearoyl-sn-glycero-3-etylfosfokolin (etyl-DSPC), dipen-tadekanoyl-fosfatidylkolin (DPDPC), l-myristoyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (MPPC), 1 -palmitoyl-2-myristoyl-fosfatidylkolin (PMPC), 1 -palmitoyl-2-stearoyl-fosfatidylkolin (PSPC), l-stearoyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (SPPC),), l-palmitoyl-2-oleylfosfatidyl-kolin (POPC), l-oleyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (OPPC), dialuroyl-fosfatidylglycerol (DLPG) og dettes alkalimetallsalter, diarakidoylfosfatidyl-glycerol (DAPG) og dettes alkalimetallsalter, dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG) og dettes alkalimetallsalter, dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG) og dettes alkalimetallsalter, distearoylfosfatidyl-glycerol (DSPG) og dettes alkalimetallsalter, dioleyl-fosfatidylglycerol (DOPG) og dettes alkalimetallsalter, dimyristoyl-fosfatidinsyre (DMPA) og dennes alkalimetallsalter, diplamitoylfosfatidinsyre (DPPA) og dennes alkalimetallsalter, distearoyl-fosfatidinsyre (DSPA), diarakidoylfosfatidinsyre (DAPA) og dennes alkalimetallsalter, dimyristoylfosfatidyletanolamin (DMPE), dipalmitoylfosfatidyletanolamin (DPPE), distearoylfosfatidyl-etanolamin (DSPE), dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), diaraki-doylfosfatidyletanolamin (DAPE), dilinoleylfosfatidyletanolamin (DLPE), polyetylen glykol-modifisert dimyristoyl-fosfatidyletanolamin (DMPE-PEG), polyetylenglykol-modifisert dipalmitoylfosfatidyletanolamin (DPPE-PEG), polyetylenglykol-modifisert distearoylfosfatidyl-etanolamin (DSPE-PEG), polyetylenglykol-modifisert dioleylfosfa-tidyl-etanolamin (DOPE-PEG), polyetylenglykol-modifisert diarakidoylfosfatidyleta-nolamin (DAPE-PEG), polyetylenglykolmodifisert dilinoleylfosfatidletanolamin (DLPE-PEG), dimyristoylfosfatidylserin (DMPS), diarakidoylfosfatidylserin (DÅPS), dipalmitoylfosfatidylserin (DPPS), distearoylfosfatidylserin (DSPS), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dipalmitoylsfingomyelin (DPSP) og distearoylsfingomyelin (DSSP) og blandinger derav.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat emulgeringsblandingen av amfifiliske materialer omfatter et fosfolipid og et amfifilisk materiale med en total nettoladning.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1,2 eller 14,karakterisertved at mengden fosfolipid er fra rundt 0,005 vektprosent til rundt 1,0 vektprosent beregnet på den totale vekt av den emulgerte blanding.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat mengden fosfolipid er fra 0,01 vektprosent til 1,0 vektprosent beregnet på den totale vekt av emulgert blanding.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat fosfolipidet inkluderer en målsøkende ligand eller en beskyttende reaktiv gruppe i stand til å reagere med en målsøkende ligand.

19. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1,2, 15 eller 16,karakterisert vedat emulsjonen videre inneholder et amfifilisk materiale valgt blant lysolipider; fettsyrer og deres respektive salter med alkali eller alkalimetaller; lipidbærende polymerer; lipidbærende sulfonerte mono-, di-, oligo- eller polysakkarider; lipider med eter- eller esterforbundne fettsyrer; polymeriserte lipider; diacetylfosfat; dicetylfosfat; stearylamin; ceramider; polyoksyetylenfettsyreestere; poly oksyetylenfettalkoholer; polyoksyetylenfettalkoholetere; polyoksyetylerte sorbitanfett-syreestere; glycerolpolyetylenglykolricinoleat; etoksylerte soyabønnesteroler; etoksylert ricinusolje; etylenoksid (EO)- og propylenoksid (PO) blokkopolymerer; sterolestere av sukkersyrer; estere av sukkere med alifatiske syrer; estere av glycerol med (C12-C24)-dikarboksylfettsyrer og deres respektive salter med alkali eller alkalimetallsalter; saponiner; langkjede (Ci2-C24)alkoholer; 6-(5-kolesten-3p-yloksy)-l-tio-p-D-galaktopyrano-sid; digalaktosyldiglycerid; 6-(5-kolesten-3p-yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksy-1 -tio-p-D-galaktopyranosid; 6-(5-kolesten-3p-yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksyl-l-tio-p-D-mannopyranosid; 12-(((7'-dietylaminokumarin-3-yl)karbonyl)metylamino)oktadekan-syre; N-[12-(((7'-dietykminokumarin-3-yl)karbonyl)metylamino)oktadekanoyl]-2-aminopalmitinsyre; N-suksinyldioleylfosfatidyletanolamin; 1 -heksadecyl-2-palmitoyl-blycerofosfoetanolamin; palmitoylhomocystein; alkylammoniumsalter omfattende minst én (Cio-C2o)alkylkjede; tertiære eller kvaternære ammoniumsalter omfattende minst én (Cio-C2o)acylkjede forbundet til N-atomet via en (C3-C6)alkylenbro; og blandinger eller kombinasjoner derav.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den vandige organiske emulsjon i trinn a) underkastes et vasketrinn før lyofilisering i trinn b).

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den vandige organiske emulsjon i trinn a) underkastes et mikrofiltreringstrinn før lyofiliseringstrinn b).

22. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den videre omfatter å sette en ytterligere vandig suspensjon omfattende en ytterligere, amfifilisk forbindelse til den vandige organiske emulsjon som er oppnådd i trinn a), før lyofiliseringen i trinn b), for derved å oppnå en andre, organisk vandig emulsjon omfattende nevnte ytterligere amfifiliske forbindelse.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat den videre omfatter oppvarming av blandingen av den vandige suspensjon og den vandige organiske emulsjon.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisert vedat blandingen oppvarmes til en temperatur rundt 40°C til rundt 80°C.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat den amfifiliske forbindelse er et PEG-modifisert fosfolipid, et PEG-modifisert fosfolipid som bærer en reaktiv del eller et PEG-modifisert fosfolipid som bærer en målsøkende ligand.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 22,karakterisertv e d at den videre omfatter, før lyofiliseringstrinn b) å underkaste den vandige organiske emulsjon en kontrollert oppvarming.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisert vedat den kontrollerte oppvarming gjennomføres ved en temperatur fra rundt 60°C til 125°C.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisert vedat den kontrollerte oppvarming gjennomføres ved en temperatur fra rundt 80°C til rundt 120°C.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisert vedat emulsjonen inneholdes i en forseglet vial.

30. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter trinnene: c) å bringe nevnte lyofiliserte matriks i kontakt med en biokompatibel gass; og d) å rekonstituere nevnte lyofiliserte matriks ved oppløsning i en fysiologisk akseptabel, vandig bærervæske for å oppnå en suspensjon av gassfylte mikrobobler som er stabilisert overveiende med nevnte fosfolipid.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30,karakterisert vedat den biokompatible gass er valgt blant luft; nitrogen; oksygen; karbondioksid; hydrogen; dinitrogenoksid; inertgasser; et lavmolekylvekts hydrokarbon, inkludert et (Ci-C7)alkan, et (C4-C7)cykloalkan, et (C2-C7)alken og et (C2-C7)alkyn; en eter; et keton; en ester; et halogenert (Ci-C7)hydrokarbon, -keton eller-eter; eller en blanding av hvilke som helst av de foregående.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31,karakterisert vedat den halogenerte hydrokarbongass er valgt blant bromklordifluormetan, klordifluor-metan, diklordifluormetan, bromtrifluormetan, klortrifluormetan, klorpentafluoretan, di-klortetrafluoretan og blandinger derav.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 31,karakterisert vedat den halogenerte hydrokarbongass er et perfluorert hydrokarbon.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33,karakterisert vedat den perfluorerte hydrokarbongass er et perfluormetan, perfluoretan, et perfluorpropan, et perfluorbutan, et perfluorpentan, et perfluorheksan, et perfluorheptan; perfluorpropen, et perfluorbuten, perfluorbutadien, perfluorbut-2-yn, perfluorcyklobutan, perfluormetylcyklobutan, et perfluordimetylcyklobutan, et perfluortrimetylcyklo -butan, perfluorcyklopentan, perfluormetylcyklopentan, et perfluordimetylcyklopentan, perfluorcykloheksan, perfluormetylcykloheksan, perfluormetylcykloheksan og blandinger derav.

35. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 30 til 34,karakterisert vedat mikroboblene har en tallmidlere diameter (Dn) på mindre enn 1,7 um og en volummediandiameter (DVso) slik at DV5o:DN-forholdet er rundt 2,00 eller lavere.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 35,karakterisert vedat mikroboblene har en DN-verdi på 1,60 um eller lavere, fortrinnsvis 1,50 um eller lavere og helst 1,30 nm eller lavere.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 35,karakterisert vedat mikroboblene har et DV5o:DN-forhold på rundt 1,80 og lavere, fortrinnsvis rundt 1,60 eller lavere, og særlig rundt 1,50 eller lavere.