JP2005519980A - 治療および診断用途の多価構成物 - Google Patents
治療および診断用途の多価構成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005519980A JP2005519980A JP2003581813A JP2003581813A JP2005519980A JP 2005519980 A JP2005519980 A JP 2005519980A JP 2003581813 A JP2003581813 A JP 2003581813A JP 2003581813 A JP2003581813 A JP 2003581813A JP 2005519980 A JP2005519980 A JP 2005519980A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- seq
- kdr
- binding
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 CCC(C(C)(C)NCC*NC(C)(C)C(C)=NO)=NO Chemical compound CCC(C(C)(C)NCC*NC(C)(C)C(C)=NO)=NO 0.000 description 6
- XLPUHGYFODEUSF-GDAWTGGTSA-N CC(C)(/C(/C)=N/O)NCCCNC(C)(C)/C(/CCC(O)=O)=N/O Chemical compound CC(C)(/C(/C)=N/O)NCCCNC(C)(C)/C(/CCC(O)=O)=N/O XLPUHGYFODEUSF-GDAWTGGTSA-N 0.000 description 1
- VXZVZOLGEKSENF-FWSOMWAYSA-N CC(C)(/C(/C)=N/[N+]([O-])=O)NCC(CNC(C)(C)/C(/C)=N/O)NC(CCCC(O)O)=O Chemical compound CC(C)(/C(/C)=N/[N+]([O-])=O)NCC(CNC(C)(C)/C(/C)=N/O)NC(CCCC(O)O)=O VXZVZOLGEKSENF-FWSOMWAYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
Abstract
本発明は、同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくとも2つの結合部分からなる多価化合物を提供する。具体的には、図36に示されるような治療診断用の組成物およびこれを用いた治療および診断方法を提供する。
Description
本明細書で使用する用語「遺伝子組換え」は、人工的に変化または操作した核酸、外来性の核酸をトランスフェクトした宿主細胞または単離DNAおよび宿主細胞の形質転換の操作によって人工的に発現したポリペプチドを記述するのに用いる。遺伝子組換えは、特に遺伝子工学技術を用いてin vitroで構成したDNA分子を指し、用語「遺伝子組換えの」は特に自然に発生した分子、構成物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを除く、分子、構成物、ベクター、トランスフェクトされた細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記述する形容詞として用いる。
本発明の標的構成物は、単一の標的内の異なる結合部位に結合する2つ以上の結合部分を含む。この結合部分は、同一標的の異なる部位に特異的である。これらは、ペプチド、ペプチド模倣物などであってよく、本明細書に記載の結合ポリペプチドを含むことができる。また、結合部分は小さな結合分子を含む。好ましい実施形態において、結合部分は結合ポリペプチドからなる。こうした標的構成物は、定義において二量体または多量体であり、「多価標的構成物」、「ヘテロ二量体」、「ヘテロ多量体」または「ヘテロマー」と呼ぶことができる。こうした二量体または多量体構成物は、単量体構成物に比して優れた結合能力を示す。構成物が結合ポリペプチドからなる場合、これらポリペプチドの配列は、そのNまたはC末端、または適切に位置したリジン部分のN-エプシロン窒素(または、オキシアミノ付属基などの選択的に誘導体を形成することのできる基、または他の求核基をもつその他の基)で結合するか、1つまたはそれ以上のリンカーを介し、適切な結合化学物質を利用して互いに結合する。この結合化学物質は、アミド、尿素、チオ尿素、オキシムまたはアミノアセチルアミド(クロロまたはブロモアセトアミド誘導体由来)を含むことができるが、これに限定されない。
ヘテロ多量体の修飾または至適化は本発明の適応範囲内にある。特に、修飾または至適化したヘテロ多量体は「ヘテロ多量体」の定義に含まれる。同様に、修飾または至適化した結合ポリペプチドは「結合ポリペプチド」の定義に含まれ、文節「KDRおよびVEGF/KDR複合体結合ポリペプチド」には修飾または至適化したKDRおよびVEGF/KDR結合ポリペプチドが含まれ、文節「cMetおよびcMet/HGF複合体結合ポリペプチド」には修飾または至適化したcMetおよびcMet/HGF結合ポリペプチドが含まれる。特に、本発明のヘテロ多量体に使用するポリペプチド配列は、その力価、薬物動態学的挙動、安定性および/または他の生物学的、物理学的および化学的特性を修飾または至適化することができる。
同じ分類に属するアミノ酸の置換方法(たとえば1つの塩基性アミノ酸を別のものと置換する方法)は、当該業界において既知である。たとえば、ポリペプチド親配列において以下の空間的配置が同じおよび/またはごくわずかなアミノ酸置換によって、結果得られたポリペプチドが上述の特性を同等またはそれ以上に有することを期待することができる。
本発明の適応範囲に入るもう一つの置換は、結合ポリペプチドの骨格内のアミド結合の置換である。たとえば、生物活性を低減または消失させてしまう望ましくないタンパク質分解または血清安定性を低減するその他の分解経路を低減または除去するため、あるいは構造の屈曲性を制限または高めるため、既存の構造を模倣するか、望ましい方法で構造を変化させる官能基を有するペプチドの骨組み内のアミド結合を置換することはよく行われる。こうした変更により、結合親和性が高まるか、薬物動態学的挙動が向上する。ペプチド合成に関与する当該業界においては、こうした知識により下記の2つのアミノ酸を結合させるアミド結合を少しでも変化させて、結果得られるペプチドが同じまたはより高い活性を得られるようにできることが知られている:α-N-メチルアミドまたはペプチドアミド骨格チオアミドを挿入する、カルボニル基を除去して同族の第2級アミンを生成する、あるアミノ酸をアザアミノ酸と置換して、セミカルバゾン誘導体を生成する、E-オレフィンおよび置換型E-オレフィンをアミド結合の代替物として使用する。
本発明の適応範囲内のまた別の方法は、D-アラニンまたはその他のD-アミノ酸を、不安定なペプチド結合の遠位または近位に導入することである。D-アミノ酸の側鎖の置換が置換されるL-アミノ酸のそれに比してわずかではない場合に、こうしたD-アミノ酸の置換は時に行わなければならないものである。これは、キラリティーの差つまり側鎖の方向の差が原因であり、その結果、置換されたL-アミノ酸の側鎖が有していたのとは異なる負荷、疎水性、立体化学的要件をもつ成分を有する標的の結合部位において、当初は明らかにされていなかった領域に到達することができる。
本発明のヘテロ多量体構成物を特殊な方法で応用する場合、ペプチドまたはペプチドの調剤を変更して薬物動態学的および薬力学的挙動を向上させる必要が生じることがあることも知られている。ペプチドの特性は望ましい物理的または化学的特性をもたらすのに前提条件となる成分の付着によって変化することが期待される。ヘテロ多量体が結合ポリペプチドを含む場合、こうした薬物動態学的および薬力学的挙動を変化させる成分は、酸またはアミンを用いて、それぞれアミド結合または尿素結合を介して、ペプチドのNまたはC末端、または好適に位置したリジンまたはリジン誘導体、ジアミノプロピオン酸、オルニチンまたは末端アミノ基または末端アルコキシアミノ基またはヒドラジン基を有するペプチド内のその他のアミノ酸の末端アミノ基に付着させることによって、ペプチドに追加してよい。トランスフェクトする成分は、対象ペプチドおよびその特性の変更に求められる実際の要件に応じて、疎水性、塩基性または非極性のアルキルまたは芳香族であってよい。
本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、結合部分またはリンカー成分のいずれかまたはその両方を、単一または組み合わせて、糖化したアミノ酸残基(セリン、セレオニンまたはアスパラギン残基など)を用いることである。従来の方法を用いて実施することのできる糖化は、可溶性を高め、薬物動態および薬力学を変化させ、グリコシド成分が関与する特異的または非特異的相互作用を介して結合力を高めるために用いることができる。また別の方法では、O-(2-アセタミド-2-デオキシ-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)セリンまたは類似のトレオニン誘導体(DまたはL-アミノ酸のいずれか)などの糖化アミノ酸を、手動または自動固相ペプチド合成中、または手動または自動液相ペプチド合成中に、ペプチドに組み込んでよい。同様に、D-またはL-Nγ-(2-アセタミド-2-デオキシ-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)-アスパラギンを用いることができる。末端の酸素、窒素または硫黄基上で、糖化に用いることのできる好適に官能基化し活性化させた炭水化物成分で糖化したアミノ酸を使用するのが望ましい。こうした炭水化物基は単糖類、二糖類またはそれ以上のオリゴ糖の組み合わせであることができる(Kihlberg, Jan. (2000) Glycopeptide synthesis. In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D. Eds) Oxford University Press, New York, NY Chap.8, pp195-213)。
水溶性またはこうしたペプチドの調製のしやすさを高めることのできる種々の塩を生成することも、本発明の適応範囲内にある。これらはN-メチルグルカミン(メグルミン)、酢酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩などを含むがこれらに限定されない。
本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、環状ポリペプチドの短縮である。本発明による多くのポリペプチドの環状形態では、特に環状の範囲内ではペプチド配列が利用できる立体配座のスペースが制限される。このため、N末端またはC末端領域のいずれかで環の遠位または場合によっては近位の1個以上の残基によってペプチドを短縮することで、短縮したペプチドに同等あるいはより高い生物学的活性をもたせることができる。結合活性の役割を担うある特定のアミノ酸配列、場合によっては3個ほどの小さなアミノ酸配列が、RGDペプチドで明らかにされているように、同定されている。たとえばE.F.Plowら、Blood(1987), 70(1), 110-5; A. Oldbergら、Journal of Biological Chemistry (1988), 263(36), 19433-19436; R. Taubら、Journal of Biological Chemistry (1989 Jun.5), 264(1), 259-65;A. Andrieuxら、Journal of Biological Chemistry (1989 Jun.5), 264(16), 9258-65;および本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許番号第5,773,412号および第5,759,996号を参照されたい。
本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、本発明による結合ポリペプチド内のジスルフィド結合を模したジスルフィド模倣物の置換である。ジスルフィドを含有するペプチドをヘテロ多量体構成物の生成に用いる場合、ジスルフィド結合を置換して、ジスルフィド結合の存在によって時に起こる特定の問題を避けることが必要になる場合がある。ヘテロ多量体の99mTc(または他の放射性核種)を主成分とする放射線治療剤または特定の他のヘテロ多量体構成物を生成する場合、ジスルフィド結合の存在が重大な問題になることがある。ジスルフィド結合の完全性は、過テクネチウム酸イオンの還元およびそれに続く還元されたTc種のTcに適応したキレート基をもつ配列への組み込みに頼った経路を介して、99mTcを組み込むべく設計された手順では、維持するのが困難である。これは、ジスルフィド結合が放射線治療剤のワンステップ調製のためのキットに通常用いられている還元剤によって、容易に還元されてしまうのが原因である。このため、ジスルフィド結合がTcキレート化中に還元されてしまう容易性のために、ジスルフィド結合の模倣物で置換する必要が生じることがある。したがって、本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、本明細書に開示の方法または当該業界で既知の方法を用いて、本発明で用いる結合ポリペプチドの活性およびその他の望ましい特性は維持したまま、模倣物でジスルフィド成分を置換することである。
多数の状況で研究者によってオキシム成分はリンカーとして用いられてきた。最も興味深い研究は、Wahl, F and Mutter, M, Tetrahedron Lett. (1996) 37, 6861-6864)である。アミノアルコール基を含有するアミノ酸(4)およびアルコキシアミノ基を含有するアミノ酸(5)を、ペプチド鎖に組み込むが、これは必ずしもペプチド鎖の末端でなくてもよい。ペプチドを生成した後、側鎖の保護基を除去する。アルデヒド基を露出させ、オキシム結合を形成する。
ランチオニンは環状硫化物であり、そのなかでジスルフィド結合(S-S)が(C-S)結合に取って代わられたものである。このため、還元に対する不安定性がはるかに低く、この結合は塩化第一錫に対して安定である。ランチオニンは多数の方法で調製することができる。
ランチオニンは既知の方法で容易に調製することができる。たとえば、Robeyら(Robey, F.A. and Fields, R.L. Anal Biochem. (1989) 177, 373-377)およびInmanら(Inman, J.K.; Highet, P.F.; Kolodny, N.; and Robey, F.A. Bioconjugate Chem. (1991) 2, 458-463; Ploinsky, A. Cooney, M.C. Toy-Palmer, A. Osapay, G. and Goodman, M.J.Med. Chem. (1992)35, 4185-4194; Mayer, J.P.; Zhang, J.; and Liu, C.F. in: Tam, J.P. and Kaumaya, P.T.P. (eds), "Peptides, Frontiers of Peptide Science", Proceedings of the 15th American Peptide Symposium, June 14-19 Nashville, Tenn. Klumer Academic Pub. Boston. pp291-292; Wakao, Norihiro; Hino, Yoichi; Ishikawa, Ryuichi. Jpn. Kokai Tokkyo Koho (1995), 7 pp. JP 07300452 A2 19951114 Heisei; JP 95-49692 19950309; JP 94-41458 19940311がこの分野では発表されている。Boc自動ペプチド合成機を用いてペプチドを調製し、その後ペプチド末端をブロモ酢酸と結合させることで、優れた収率でブロモアセチル化ペプチドを得ることができる。ペプチドの分解および保護基の除去は、HF/アニソールを用いて行うことができる。ペプチドがシステイン基を含んでいる場合、その活性は低pHで制御することができる。媒質のpHが6〜7まで上昇すると、ペプチドの重合または環化が起こる。重合は高濃度(100mg/mL)で促進するのに対し、環化は低濃度(1mg/mL)で促進する。下記の図1で、6が環化して7になる場合を例示する。
この方法にはいくつかのやり方がある。樹脂結合セリンを用いて、臭素化法-デヒドロ臭素化法-チオール追加配列法またはジスクシニミジルカルボネートで分解した後チオールを追加する方法のいずれかで、樹脂上にランチオニン環を調製する。Ploinskyら、M.J.Med.Chem., 35:4185-4194 (1992); Mayerら、"Peptides, Frontiers of Peptide Science" in Proceedings of the 15 th American Peptide Sympsium, Tam & Kaumaya (eds), June 14-19, 1995, Nashville, Tenn. (Klumer Academic Pub. Boston) pp.291-292。アクリルアミドにチオールを抱合体として追加できることも多数の文献によって明らかにされており、2-メルカプトエタノールをアクリルアミドに追加する場合の参照も記載する。Wakaoら、Jpn. Kokai Tokkyo Koho, JP 07300452 A2 (1995)。
アリールボロン酸およびチロシンの分子内環化によるジアリールエーテル結合
アリールボロン酸とフェノール、アミンおよびヘテロ環状アミンを酢酸銅の存在下、空気中、室温で、ジクロロメタン中で、塩基としてピリジンまたはトリエチルアミンのいずれかを用いて反応させると、非対称なジアリールエーテルおよび関連のアミンが優れた収率(98%)で得られることが報告されている。Evansら、Tetrahedron Lett., 39:2937-2940 (1998); Chanら、Tetrahedron Lett., 39:2933-2936 (1998); Lamら、Tetrahedron Lett., 39:2941-2944 (1998)を参照されたい。フェノールとしてNで保護されたチロシン誘導体を用いる場合も収率は98%と高い。これは、アミノ酸アミド(ペプチド)が成分置換に対して安定であり、高収率が期待できることを示している。ペプチドからラクタムへの分子内環化の容易性、SNAr反応に基づく分子内バイアリールエーテルの生成、高希釈率または樹脂における分子内環化反応の一般性(この場合は偽希釈作用が高希釈率の状況を模倣する)の観点からは、分子内反応の先例が存在する。
用いることのできるまた別の方法は、ビシナルアミノメルカプタン基(通常はたとえばシステインを直線配列の末端に配置することによって得られるか、リジンの側鎖窒素を介して配列につながる)およびアルデヒド基を好適に配置して分子内環化を起こし、チアゾリジンを得て、主鎖の残基で形成された一つの環およびチアゾリジン環を有する二環式ペプチドを形成するものである。上記の図2はその例を示したものである。望ましいアルデヒド基は、リジン成分の側鎖アミノ基の末端に付着することで鎖につながった保護基のないセリンとして存在することのできる、好適に配置されたビシナルアミノアルコール基を過ヨウ素酸ナトリウムで分解することによって生成することができる。場合によっては、望ましいアルデヒド基は、鎖のC末端またはN末端で保護基のあるアルデヒド誘導体を露出することによって生成することができる。この方法の例はBotti, P.; Pallin, T.D. and Tam, J.P. J.Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10018-10034にみることができる。
大環状ペプチドは、頭部から尾部または末端基の環化によるラクタム生成によって調製することができる。基本的な方法は、完全に保護され、アミン保護基およびカルボキシ保護基を選択的に除去することが可能なペプチドを調製することである。直交的保護スキームが作成されている。作成されているスキームのうちでも、アリル、トリチルおよびDde法が最もよく使用されている。Mellorら、"Synthesis of Modified Peptides" in Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach, White and Chan (eds) ([Oxford University Press,, New York, 2000]), Chapt.6, pp.169-178を参照されたい。Dde法は、カルボキシル酸基(Dmabエステル)およびアミノ基(Dde基)の両方に対して類似した保護基を用いることから、最も有益である。いずれの保護基もDMF中で室温にて2〜10%ヒドラジンで除去する。あるいは、Dde法はアミノ基に対して用いることができ、アリル基をカルボキシル基に用いることができる。
Grubbs反応(下記の図4)は、オレフィン結合の複分解/環化に関与するもので、下図に示す。Schusterら、Angewandte. Chem. Int. Edn Engl., 36:2036-2056 (1997); Millerら、J.Am.Chem.Soc., 118:9606-9614 (1996)を参照されたい。
本発明の適応範囲内の他の変更方法には、同等またはより優れた生物学的特性を有するペプチドを得ることが期待できるペプチド配列の操作が含まれる。これらには、アミノ酸の転座(アミノ酸を配列中で交換すること)、元々の配列または改変した元々の配列の位置におけるレトロペプチド、ペプトイド、レトロペプトイド配列および合成ペプチドの使用が含まれる。特異的な残基がペプチドではなくペプトイドであり、結果として完全にペプチドでも完全にペプトイドでもないハイブリッド分子ができる構造も検討することができる。
また、本発明の範囲内の変更方法には、結合部分または結合ポリペプチドの標的配列と検出可能標識または治療薬剤との間にリンカーまたはスペーサーをトランスフェクトすることが含まれる。たとえば、こうしたリンカー/スペーサーを用いることにより、結合ペプチドの関連特性が向上する(たとえば血中安定性が高まるなど)。これらのリンカーには、当該業界でよく知られている置換型または非置換型アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖または脂肪族または芳香族のスペーサーが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によるヘテロ多量体構成物は、イムノ分析(ELISAなど)、種々の疾患の治療に有用な治療薬剤、in vivoにおける診断および治療への使用など、多数の応用がきく。たとえば、本明細書に記載のヘテロ多量体構成物は、in vitroまたはin vivoにおいて、組織を含有する標的の検出および/または画像化にきわめて有用である。たとえば、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合へテロ多量体構成物は、KDRまたはVEGF/KDR複合体を含有する組織の検出および/または画像化にきわめて有用であり、特に上記に説明したとおりVEGFおよびKDRが密接に関与する血管新生の部位の検出および/または画像化にきわめて有用である。KDRまたはVEGF/KDR複合体の分析または画像化に好適なあらゆる方法を用いることができる。同様に、cMetまたはHGF/cMet複合体結合へテロ多量体構成物は、cMetまたはHGF/cMet複合体を含有する組織の検出および/または画像化にきわめて有用であり、特に上記に説明したとおりHGFおよびcMetが密接に関与する腫瘍またはその他の増殖部位の検出および/または画像化にきわめて有用である。cMetまたはHGF/cMet複合体の分析または画像化に好適なあらゆる方法を用いることができる。
しかるべく標識された本発明のヘテロ多量体構成物は、特異的組織または異常細胞を造影するのに、in vivoにおいて診断への応用を行うことができる。本発明によるヘテロ多量体構成物の特に好ましい使用は、標的を発現するか含有する組織を目に見える形で画像化することである。この実施形態において、本発明のヘテロ多量体は診断用検出にふさわしい標識と、任意にはリンカーを介して抱合させる。好適なリンカーは、置換型または非置換型アルキル鎖、アミノ酸鎖(ポリグリシンなど)、ポリエチレングリコール、ポリアミドおよび当該業界で既知のその他の簡単なポリマーリンカーであることができる。好ましくは、他の血清タンパク質よりも標的に対してはるかに高い特異性を示すヘテロ多量体を、使用する検出方法にふさわしい標識と抱合体を形成させるか、結合させる。たとえば、本発明のヘテロ多量体は、リンカーを介して、または介さずに、磁気共鳴造影法(MRI)に好適な常磁性キレート、X線検査、PETまたはシンチグラフィーに好適な放射性標識(必要であれば放射性活性金属には本明細書に記載のようなキレート剤を含む)、超音波検出法に好適な超音波造影剤(安定化したマイクロバブル、マイクロバルーン、ミクロスフェアまたは「リポソーム」を満たすガスとして呼ばれるものなど)、または光学的検査用染料と抱合させることができる。
本発明のヘテロ多量体は、1つ以上の常磁性金属キレートとより有利に抱合体を形成して、MRIに使用する造影剤を形成する。好ましい常磁性金属イオンは原子番号21〜29、42、44または57〜83である。これは、1つおよびより好ましくは5つ以上の不対電子を有し、磁気モーメントが少なくとも1.7ボーア磁子である遷移金属または希土類のイオンを含む。好ましい常磁性金属には、クロム(III)、マンガン(II)、マンガン(III)、鉄(II)、鉄(III)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、プラセオジミウム(III)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、ガドリニウム(III)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、エルビウム(III)、ユーロピウム(III)およびイッテルビウム(III)が含まれるがこれらに限定されない。また、本発明のヘテロ多量体は1つ以上の超常磁性粒子と抱合体を形成することができる。
超音波がある物質を通して伝達される場合、その物質の音波特性はその伝達の速度および物質の密度に依存する。音波特性の変化は、異なる物質(個体、液体、ガス)間の界面において最も顕著となる。超音波造影剤は、造影剤とその周囲の組織との音波的差による高密度な音波反射材である。ガスを含有するまたはガスを生成する超音波造影剤は、液体(血液など)とガスを含有するまたはガスを精製する超音波造影剤との音波的差が大きいことから、特に有用である。その大きさにより、マイクロバブル、マイクロバルーンなどからなる超音波造影剤は、注入後他の検出可能成分よりも長時間血流に留まることができ、このため、標的とされる超音波剤は標的を発現または含有する組織をよりよく画像化することができる。
本発明に従って、KDR、VEGF/KDR複合体、cMetまたはHGF/cMet複合体などの標的の位置を、患者に光学的標識を施したヘテロ多量体構成物を注入した後、in vivoにおける照明画像法で測定するのに、多数の光学的パラメータを用いることができる。画像を作成する上で検出対象となる光学的パラメータには、透過される電磁波、吸収、蛍光または燐光の放出、光線の反射、吸収幅または最大量の変化、および弾力的な散乱線が含まれる。たとえば、生物学的組織は、650〜1000nmの近赤外線(NIR)の波長の光線を対して比較的半透明となる。NIR照射線は、組織の中に数センチまで侵入することができるため、本発明のヘテロ多量体構成物を使用してin vivoにおける標識を含有する組織を画像化することができる。たとえば、KDR、VEGF/KDR複合体、cMetまたはHGF/cMet結合ポリペプチドのヘテロ多量体構成物は、in vivoにおけるKDR、VEGF/KDR複合体、cMetまたはHGF/cMet複合体の光学的画像法に用いることができる。
本発明のヘテロ多量体は、シンチグラフィー、SPECTまたはPET画像検査に適切な放射性核種レポーターまたは放射線療法に適切な放射性核種と抱合体を形成することができる。本発明のヘテロ多量体が、診断用画像検査に有用な放射性核種のキレート剤および放射線療法に有用な放射性核種のキレート剤の両方と抱合体を形成する構成物は、本発明の適応範囲内にある。
本発明による放射活性物で標識したシンチグラフィー用造影剤は、好適な放射活性量を有する形で提供される。Tc-99m放射活性複合体を形成するには、一般に放射活性を約0.01ミリキュリー(mCi)〜100mCi/mLの濃度で含有する溶液中で放射活性複合体を形成するのが好ましい。
本発明のヘテロ多量体構成物は、治療薬剤の活性および/または有効性を、その薬剤の標的に対する親和性を高めるか、標的への貯留時間を長くすることによって、向上させるのに用いることができる。この実施形態において、ヘテロ多量体は治療薬剤と抱合体を形成する。あるいは、上述のように、治療薬剤を含有するリポソームまたはバブルを、本発明のヘテロ多量体と抱合させることができる。この治療薬剤は、上述の放射線治療剤、薬物、化学療法剤または抗癌剤、遺伝材料または遺伝子送達賦形剤などであることができる。この抱合体のヘテロ多量体部分により、この治療薬剤は標的発現/集中部位に「住み着く」ことができ、これらの部位に対する抱合体の親和性が高まることから、抱合体の治療活性はより限局したものとなり、標的部位に集中する。たとえば、ある実施形態において、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、腫瘍で起こるものなど望ましくない血管新生に対して、KDRまたはVEGF/KDR複合体に対する親和性を提供するか向上させ、血管新生を行う内皮細胞上のKDRまたはVEGF/KDR複合体での貯留時間を提供するか延長させることによって、治療薬剤(抗血管新生剤または抗癌剤など)の活性を向上させるのに用いることができる。本発明のこの観点において、ハイブリッド剤は、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合へテロ多量体と治療薬剤を抱合することによって提供される。こうしたヘテロ多量体構成物は、血管新生に起因する疾患、特にヒトを含む哺乳動物における腫瘍の増殖および転移の治療に有用である。治療方法は、治療を必要とする哺乳動物に、治療薬剤と抱合させたKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドのヘテロ多量体構成物の有効量を投与することからなる。また、本発明は、ヒトをはじめとする哺乳動物の血管新生に起因する疾患の治療薬剤の製造にこうした抱合体を用いる方法も提供する。cMetまたはHGF/cMet複合体結合部分からなる本発明のヘテロ多量体構成物は、同様に増殖または血管新生に起因する疾患の治療に用いることができる。
剤が挙げられるが、これらに限定されない。
ペプチド合成およびフルオレセイン標識
陽性ファージ分離株に対応する、選択されたKDRまたはVEGF/KDR結合ペプチドが、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(9-fluorenylmethloxycarbonyl)のプロトコルを用いて、固相合成され、逆相クロマトグラフィーにより浄化された。ペプチドの分子量は、エレクトロスプレー質量分析により確認され、ペプチドは、吸光度280nmで計量された。合成のため、ペプチドが摘出されたファージベクター配列から、2つのN末端アミノ酸および2つのC末端アミノ酸が確保され、-グリシン-グリシン-グリシン-リジン-NH2リンカーが、ペプチドの各々のC末端に付加された。選択されたリジン残基を伴ったペプチドは、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオクロシクロヘックス-1-イリデン)-3-メチルブチル(ivDde)で保護される。ivDdeは、C末端リジンとの選択的なカップリングを可能とし、ペプチド分裂の間は除去されず、結合後に、2%のヒドラジンを加えたDMFの中か、0.5Mのヒドロキシルアミンを加えたpH8の水の中で、除去することができる。
蛍光異方性測定は、384-ウェル・マイクロプレート内で、容量10μLの結合緩衝液(PBS、0.01%Tween-20、pH7.5)内で、テカン・ポラリオン・フルオレセイン・ポラリゼーション・プレート・リーダー(Tecan Polarion fluorescence polarization plate reader)を使用して、実施された。幾つかのケースでは、ヘパリン(0.5μg/mL)または10%のヒト血清を、結合緩衝液に加えた。フルオレセインで標識されたペプチドの濃度は、一定(20nM)に維持され、KDR-Fc(または同様の標的)の濃度は様々に変化させた。結合混合液は、測定の前の10分間、30℃でマイクロプレート内で平衡化された。観察された異方性の変化は、見かけのKDを得るための非線形回帰を介して、以下の等式(1)に適合した。等式(1)から、合成ペプチドおよびHSAが、化学量論で1:1の溶液内において、可逆複合体を形成することが推定される。
本実施例では、以下の方法が用いられた。
ペプチドは、Fmocペプチド合成プロトコルを採用する、AdvancedChemTechACT357またはACT496シンセサイザーを使用して、NovaSynnTGR(Rinkアミド)樹脂(0.2mmol/g)上に、特に、カップリング試薬としてHOBt/DICを使用し、溶剤としてNMPを使用して、合成された。Fmocは、NobsSynTRG(Rinkアミド:ノヴァバイオケム、サンディエゴ、カリフォルニア州から入手)樹脂結合ペプチドを、25%のピペリジンを加えたDMF内で、2度(4分と10分)処理することにより、除去された。すべてのアミノ酸は、NMP(アミノ酸が純粋なNMPに溶けない場合は、DMFが加えられた)内で溶解された。アミノ酸濃度は、0.25Mであって、HOBtおよびDICは、0.5Mであった。
典型的なアミノ酸カップリングサイクル(洗浄ステップを含まない)は、ピペリジン溶液(2.4mL)を、各々のウェルに分配し、4分間混合し、その後全てのウェルを空するこのにより行われた。NMP(320μL)、HOBt溶液(320μL、4当量)、アミノ酸(640μL、4当量)およびDIC(320μL、4当量)溶液が、それぞれのウェルに分配された。カップリング時間は、3時間であり;その後、樹脂は洗浄された。このサイクルは、それぞれのアミノ酸で繰り返された。最後のアミノ酸カップリングの後、樹脂結合ペプチドは、25%ピペリジンにより処理され、Fmoc保護基を除去された。洗浄後、樹脂結合ペプチドは、1.0MのAc2O(ウェル毎に1.2mL)およびDMF中のジイソプロピルエチルアミンにより、任意に混合液の中に様々な量のHOBtを含めて、30分間キャップされた。樹脂は、最初にメタノールで洗浄され、次にジクロロメタンにより洗浄され、乾燥された。樹脂からのペプチドの切断および側鎖保護基の解離は、試薬Bを用いて、4.5時間で成し遂げられた。切断溶液は、収集され、樹脂は、試薬Bの追加分により洗浄した。結合した溶液は、乾燥するまで濃縮された。その残留物に、エーテルを渦巻き状に、またはかき混ぜるように加え、ペプチドを沈殿させた。エーテルの上澄みは、別の容器に移され、固形物が集められた。この過程は、不純物を除去するために2、3回、繰り返された。粗製ペプチドは、DMSOと水の混合液に溶解され、HPLC(カラム:Water'sAssociatesXterraC18、19×50mm;溶液:0.1%TFAを加えた水および0.1%TFAを加えたCH3CN;UV220nm;流量:50〜60mL/min)により精製された。ペプチドを含む溶液は、凍結乾燥され、望ましいペプチドが、白色のふわふわとした凍結乾燥物(>90%の純度)として得られた。
ペプチドは、以下の変更以外は方法1と同様にして合成された。HBTU/HOBt/DIEAをカップリング試薬として、NMPを溶剤として使用した。前述のNovSyn-TGR樹脂から調整された低負荷(〜0.2mmol/g)のFmoc-GGGK(Boc)-NovSyn-TGR樹脂が、0.01mmol規模のペプチド合成のために用いられた。
Fmoc基が除去された後、標準のカップリング過程が、HOBt(720μL、6当量)、アミノ酸(804μL、6.6当量)、HBTU(720μL、6当量)およびDIEA(798μL、13.3当量)の溶液を使用して行われた。混合液は、15分間攪拌され、空にされ、樹脂が洗浄された。前述のように、全てのカップリングを済ませた後、切断および精製を経て、所望の直鎖ペプチドを含む溶液は、凍結乾燥され、ペプチドが、白色のふわふわとした固形物(>90%の純度)として得られた。
ペプチドは、AdvancedChem TechACT496MOSシンセサイザーを方法1のように使用して、合成された。低負荷(〜0.2mmol/g)のFmoc-GGGK(Boc)-NovSyn-TGR樹脂が、ペプチド合成に使用された。カップリング溶剤は、NMP/DMSOが8:2であった。合成は、カップリング時間を3時間とし、0.02mmol規模で、実行された。さらに、粗製の直鎖ペプチドは、前述の方法1と同様に処理された。
ペプチドは、HBTU/DIEAをカップリング試薬、NMPを溶剤として用い、ACT496で方法3を使用して合成された。2、4、6-collidineの1M溶液を基剤として用いた。低負荷(〜0.2mmol/g)のFmoc-GGGK(ivDde)-NovSyn-TGR樹脂が、ペプチド合成に使用された。カップリング時間は、30分とした。粗製の直鎖ペプチドは、前述の方法1と同様に処理された。
ペプチドの合成は、FastMocプロトコル(AppliedBiosystemsInc.)を使用して、0.25mmol規模で行われた。このプロトコルの各々のサイクルにおいて、追加のNMPを加えたDMF中に、0.9mmolのHBTU、2mmolのDIEA、および0.9mmolのHOBtを加えた溶液に、カートリッジ内の1molの乾燥した保護アミノ酸を溶解した。ペプチドは、0.1mmolのNovSyn-TGR(Rink amide)樹脂(樹脂置換0.2mmol/g)を用いて作られた。本プロトコルのカップリング時間は、21分であった。Fmocの除去は、20%のピペリジンを加えたNMP内で行われた。ラストサイクルの最後に、合成されたペプチドは、無水酢酸/DIEA/HOBt/NMPを使用して、アセチル化された。ペプチド樹脂は、洗浄され、さらなる操作のために乾燥されるか、樹脂(試薬Bを使用して)から切断された。一般的に、切断されたペプチドは、前述の方法1と同様に、環化された。
ペプチドは、方法5により調製された。C末端リジン上のivDde保護基は、10%のヒドラジンを加えたDMN内で処理され、選択的に除去された。その後、DIEAの存在するDMF中に、ビオチン-N-hydroxysuddinimidylを加えた溶液で、樹脂は処理された。洗浄後、樹脂は乾燥され、試薬Bを使用して切断された。樹脂は、濾過により取り除かれ、濾過物は、乾燥するまで濃縮された。ビオニチル化されたペプチドは、水を加えていないDMSOに溶解され、DIEAで処理され、ジスルフィドの環化が達成されるまで、4〜6時間、攪拌された。粗製の混合物は、調製用HPLCにより精製された。
遊離アミノ基を含む精製されたペプチド(10mg、方法1〜5により用意された)は、無水DMFまたはDMSO(1mL)に溶解され、(5当量)のビオチン-NHSエステルおよびDIEA(5当量)が加えられた。反応は、HPLCによりモニターされ、反応の完了(1〜2時間)の後、粗製反応混合物は、調製用HPLCにより直接的に精製された。留分は、分析用HPLCにより分析され、純粋な生産物を含む部分が、収集され、所望のビオチニル化ペプチドを得るため、凍結乾燥された。
典型的な実験においては、400mgの樹脂含有ペプチド(ABI-433Aシンセサイザー使用して、かつ、ivDde保護リジンを付加して作られた)が、10%のヒドラジンを加えたDMF(2×20mL)内で処理された。樹脂は、DMF(2×20mL)およびDCM(1×20mL)で洗浄された。樹脂は、DMF(10mL)に再懸濁され、
Fmoc-aminodioxaoctanoic酸(0.4mmol)、HOBt(0.4mmol)、DIC(0.4mmol)、DIEA(0.8mmol)で、4時間混合して処理された。反応後、樹脂は、DMF(2×10mL)およびDCM(1×10mL)で洗浄された。樹脂は、20の%ピペリジンを加えたDMF(2×20mL)内)で、10分間処理された。樹脂は、洗浄され、Fmoc-aminodioxaoctanoic酸とのカップリングおよびFmoc保護基の除去が、もう一度繰り返された。得られた樹脂は、遊離アミノグ基を伴ったペプチドを含み、DMFにビオチン-NHSエステル(0.4mmol、5当量)およびDIEA(0.4mmol、5当量)を加えた溶液内で、2時間、処理された。ペプチド樹脂は、洗浄され、前述のように乾燥され、試薬B(20mL)を用いて、4時間処理された。混合物は、濾過され、濾過物は乾燥するまで濃縮された。残留物は、固形物を生成するまで、エーテルと攪拌され、得られた固形物は、収集され、エーテルで洗浄され、乾燥された。固形物は、無水DMSOに溶解され、pHは、DIEAによりpH7.5に調製された。混合物は、ジスルフィドの環化が達成されるまで、4〜6時間攪拌され、環化反応を、分析用HPLCでモニターした。環化の完了後、DMSO溶液は、25%アセトニトリルの水溶液で希釈され、逆相C-18カラムを直接的に適用した。留分は、分析用HPLCにより分析され、純粋な生産物を含む部分が、収集され、所望のビオチニル化ペプチドを得るため、凍結乾燥された。
方法5により合成された、リジンのエプシロン窒素上にivDde保護基を含むペプチド樹脂は、DMFにヒドラジンを加えた溶液内に(10%ヒドラジン/DMF、2×10mL、10分)混合され、ivDde基を除去された。リジンのエプシロン窒素は、DMN内で、フルオレセイン-5-イソチオシアネート(0.12mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.12mmol)により標識された。混合物は、12時間、攪拌された(フルオレセイン含有の化合物は、光から保護された)。樹脂は、DMF(3×10mL)で洗浄され、CH2Cl2(10mL)で二度洗浄され、窒素下で1時間、乾燥させた。ペプチドは、試薬Bを4時間使用して、樹脂から切断され、溶液は、濾過により収集された。揮発物質は、減圧下で除去され、残留物は、真空下で乾燥された。ペプチドは、エーテルで沈殿され、収集され、沈殿物は、窒素流で乾燥させた。沈殿物は、水(1mg/mL)を加わえられ、混合物のpHは、10%のメグルミン水溶液で、8に調製された。ペプチドの環化は、48時間実行され、溶液は凍結乾燥された。粗製環化ペプチドは、水に溶解され、C18カラム上で、RP-HPLCを用いて、アセトニトリルの水中への直線的勾配により精製された(いずれの相も0.1%TFAを含んだ)。純粋な生成物を含む留分は、収集され、凍結乾燥された。ペプチドは、ES-MSにより特性付けされ、純度は、RP-HPLC(水の中へのアセトニトリルの直線的勾配/0.1%TFA)により測定された。
ペプチドは、まず、0.1mmolのNovaSyn-TGR樹脂(0.2mmol/g置換)で調製された。次に、非保護(ivDde)樹脂が、Fmoc(グリシン)-OH、Fmoc-システイン(Acm)-OHおよびFmoc-セリン(tBu)-OHを組み込むため、プロトコルAに従って処理された。
1.対応するFmoc-アミノ酸4当量、ヒドロキシベンゾトリアゾール4.1当量、HOB4.1当量およびDIC4.1当量で、5時間、処理する。
2.DMF(3×10mL)で洗浄する。
3.20%のピペリジンを加えたDMF(2×10mL、10分)内で処理する。
4.DMF(3×10mL)で洗浄する。
ペプチド(0.005mmol、遊離アミンと共に方法1-5から得られた)を加えたDMF溶液に、S-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシニミドエステル(SATA)(0.0055mmol)を加え、反応混合物は、常温で6時間、攪拌された。揮発物は、真空下で除去され、0.1%のTFAを含んだアセトニトリル-水を使用して、調製用HPLCにより精製された。純粋な生成物を含む留分は、収集され、メルカプト-アセチル化ペプチドを生産するために凍結乾燥された。メルカプト-アセチル化ペプチドは、ESI-MSにより特性付けされ、純度は、アセトニトリルの水中への(両者は、0.1%TFAを含む)直線的勾配を用いた逆相PHLC分析により測定された。
方法5から得られた精製ペプチドは、ジスルフィド環化の後、NMP内で、S-アセチルチオグリコール酸(1.5-10当量)/HOBt(1.5-10当量)/DIC(1.5-10当量)に、室温で2〜16時間、カップリングされた。混合物は、調製用HPLCにより精製され、純粋なペプチドを含む留分は、結合され、凍結乾燥された。ivDde基に保護されたもう1つの樹脂を含む化合物の場合は、保護基除去反応を、2%のヒラジンを加えた
DMSO内で、室温で3時間行った。反応混合物の精製により、純粋なペプチドが産出された。
所望の精製ペプチドは、方法5を使用してSPPSにより調製された。ホモ2量体を調製するために、2量体を作るために必要とされるペプチドの半分は、DMFに溶解され、10当量のN-ヒドロキシスクシニミドエステル・ビス・グルタル酸で処理された。反応の進行は、HPLC分析および質量スペクトル計によりモニターされた。反応が完了すると、揮発物は、真空で除去され、未反応のビス-NHSエステルを除去するため、エチル酢酸で洗浄された。残留物は、乾燥され、無水DMFに再溶解され、2当量のDIEAの存在下、ペプチドのもう一方の半分で処理された。反応は、24時間進められた。混合物は、直接、Waters AssociatesC-18XTerra RP-HPLCカラムに適用され、水中へのアセトニトリル(ともに0.1%TFAを含む)の直線的勾配溶出により、精製された。
前述の方法を利用して、表1のKDRおよびVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドが調製された。表1において、ペプチドのアミノ酸配列内の「J」の文字は、スペーサーまたはリンカー、8-アミノ-3,6-ジオクサオクタノイルを意味する。また、表1において、「C*」の表記は、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を意味する。KDRに結合するビオチニル化ポリペプチドの能力は、以下に述べる試験セットを使用して判定された。
P13-XB(Kd 1.81 nM+/-0.27),P5-XB(Xd 14.87+/-5.07nM,4実験の平均),P6-XB(Kd 10.00+/-2.36nM,4実験の平均),P12-XB(Kd 4.031+/-0.86nM,3実験の平均),およびP12-F-XB(Kd 3.02+/-0.75nM,1実験)。
[実施例2]
ファージ提示法により同定されたペプチドのKDR-発現細胞に結合する能力を確認するビーズ結合分析
以下の実験は、KDR-結合ペプチドの、KDR-発現細胞に結合する能力を判定するために実行された。本実験において、KDR-結合ペプチドP5-BおよびP5-XBおよびP6-BおよびP6-XBは、フルオレセインビーズに共役され、KDR-発現293H細胞に結合する能力が、判定された。実験は、ビーズのような断片をKDR-発現部位に結合するために、両方のペプチド配列を用いることができることを示した。一般的に、P6ペプチドの方が、P5よりも、KDR発現細胞によく結合した。しかし、両ペプチドの結合力は、スペーサーの追加とともに、改善された。
Sigma(V-9134)からの抗-KDR(たとえば、腹水)は、Molecular Probes (F-6347)のキットを使用して、製造者の指示に従いビオチニル化された。
各々のビオチニル化ペプチド(前述のように、50%DMSO内で調製された)の0.2mM原液0.1mが、中性アビジンでコーティングした赤いフルオレセインのミクロスフィア(2μm径、Molecular Probe オーダーメイド)0.1mL、および0.2mLの50mMMES(シグマM-8250)緩衝液で、pH6.0で、回転装置に載せて室温で1時間、培養された。正の制御として、ビオチニル化された抗-KDR抗体は、前述のように中性アビジンでコーティングされたビーズで培養された。ただし、ペプチド溶液の代わりに、PBS(Gibco 14190-13)内で調製されたビオチニル化抗体を0.03mg用いた。ビーズは、必要となるまで、1週間以内であれば4℃で保存できる。
293H細胞は、実施例6に述べるプロトコルを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒/透明96-ウェルプレート(Becton Dikinson #354640)内で実施された。プレートの半分(48ウェル)の細胞は、偽-トランスフェクト(DNA無しで)され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に80〜90%が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでない場合は、分析は中止された。
前記のように調製したビーズのうち0.12mLを、マイクロ遠心分離器で、10分間2000rpmで、室温で回転させた。上澄みは除去され、0.06mLのpH6.0のMESが、加えられた。各々のビーズ溶液は、水浴内で15分間、旋回攪拌され、超音波分離された。1.47mLのDMEMに、1×MEN非必須アミノ酸溶液(NEAA)(GIBCO11140-050)を伴った高ブドウ糖(GIBCO111965-084)、および40%FBS(Hyclone SH30070.02)0.03mLの超音波分離で調製されたビーズが、加えられた。カラム1〜6内で偽-トランスフェクトされた293H細胞、およびカラム7〜12内でKDR-トランスフェクトされた293H細胞を接種された96ウェルプレートは、排水され、DMEM、1×NEAAおよび40%FBSを伴った高ブドウ糖で、一度洗浄された。各々のウェル(ビーズ調製ごとに6つのウェル)に、0.1mLのビーズ溶液が加えられた。室温で30分間培養された後、ウェルは、プレートを逆さにすることにより排水され、Ca++Mg++(GIBCO14040-117)入りの0.1mLのPBSで4回、室温で5分間、いずれも、振ることにより洗浄された。排水後、0.1mLのPBSが、ウェル毎に加えられた。プレートは、Packard Fluoro Count蛍光光度計で、励起550nm/放射620nmで、読み取られた。分析において、非共役中性アビジンビーズは、負の制御として用いられ、一方、ビオチニル化された抗-KDR抗体共役ビーズは、正の制御として使用された。
KDR-トランスフェクト293細胞に結合するためのKDR-結合ペプチドおよび 125 I標識VEGFの競合
以下の実験は、トランスフェクト293H細胞に発現したKDRと結合するために、KDR-結合ペプチドが125I標識VEGFと競合する能力を判定したものである。KDR-結合ポリペプチドP4は、125I標識VEGFと顕著には競合しなかったが、P5-XB、P6およびP12-XBは、125I標識VEGFと非常によく競い合い、125I標識VEGFの結合を、96.29±2.97%および104.48±2.07%阻害した。
293H細胞は、実施例6に述べるプロトコルを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒/透明96-ウェルプレート(Becton Dikinson #354640)で実施された。プレートの半分(48ウェル)の細胞は、偽-トランスフェクト(DNA無しで)され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に80-90%が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでない場合は、分析は中止された。
M199媒体の調製
分析のためM199媒体を調製するために、1つのM199媒体パケット(GIBCO,cat.#31100-035)、20mLの1mMHEPES(GIBCO , cat.#15630-080)、および2gのDIFCOゼラチン(DIFCO , cat. #0143-15-1)が、950mLの2度蒸留した(dd)H2Oに加えられ、溶液のpHは、約4mLの1N NaOHを加えることにより、7.4に調整された。pH調整の後、M199媒体は、水浴の中で37℃に2時間温めて、ゼラチンを溶かし、0.2μmフィルター(Corning , cat. #43109)を使用して濾過殺菌し、後の分析に使用するため、4℃で保管した。
50%DMSO中に、ペプチドP6、P4、P5-XB、およびP12-XB(前述のように調製した)を加えて3mMのペプチド原液が調製された。
25μCiの凍結乾燥した125I標識VEGF(Amersham , cat. #IM274)を、250μLのddH2Oで戻して、原液を製造し、後の使用のために-80℃で保存した。各分析毎に、上記M199媒体原液を希釈して、125I標識VEGFの300pM溶液が、新鮮に製造された。125I標識VEGFの濃度が、その日の独特な物質活性に基づいて、日々計算された。
各96ウェルプレートのために、M199媒体内に10mLの300pM125I標VEGFを加えて、4℃で調製した。各ペプチド溶液(3mM、前述のように調製)は、300pMの125I標識VEGFを伴う300μLのM199媒体内で、1:100および1:10000に希釈され、300pMの125I標識VEGFを含む30μMおよび0.3μMペプチド溶液が調製された。一度、調製されると、使用準備が整うまで、溶液は氷の上に保たれた。300pMの125I標識VEGFを含むM199媒体内のペプチド溶液の希釈は、各実験毎に新鮮に行われた。
細胞は、トランスフェクトの24時間後に使用され、分析用の細胞を調製するために、室温のM199媒体で3回洗浄され、冷蔵庫内に置かれた。15分後、M199媒体は、プレートから除去され、M199媒体内の75μLの300pMの125I標識VEGF(前述のように調製)によって置き換えられた。各々の希釈物が、偽-およびKDRトランスフェクト細胞の3つの別個のウェルに加えられた。4℃で2時間培養された後、プレートは冷たい結合緩衝液で5回洗浄され、やさしく吸着して乾燥させ、顕微鏡で、細胞の消失をチェックされた。100μLの溶解補助溶液(2%のトリトンX-100、10%グリセロール、0.1%のBSA)が、各々のウェルにも加えられ、プレートは室温で30分間培養された。各ウェル内の溶解補助溶液は、ピペットで上げ下げされることにより混合され、1.2mL管に移された。各ウェルは、100μLの溶解補助溶液で2回洗浄され、洗薬が、対応する1.2mL管に加えられた。その後、各1.2mL管は、15.7mm×10cm管に移され、LKB Gamma Counter(125Iウインドウ1分)で計数された。
KDR-結合ペプチドP6、P4、P5-XBおよびP12-XBが、125I標識VEGFのKDRへの結合を、特異的にブロックする能力は、偽-トランスフェクトおよびKDRトランスフェクト細胞内で評価された。P4は、分析において、負の制御として使用された。選択された理由は、P4は、FP分析において、KDRへの弱い結合を阻害するのみであり、したがって、VEGFと置換したり、VEGFとの競合が期待されないからである。KDRへの特異的な結合を計算するため、偽-トランスフェクト細胞への125I標識VEGFの結合は、KDRトランスフェクト細胞から引かれた。したがって、KDR-結合ペプチドによる、125I標識VEGFの293H細胞への結合の阻害が計算される場合、KDR(293H細胞内に存在してもしなくても)以外の部位への125I標識VEGFの結合は、含まれない。
ファージ提示法により同定されたペプチドによるVEGFが誘発するKDR受容体活性化の抑制
ファージ提示法により認定されたKDR-結合ペプチドの、VEGFが誘発するKDRの活性化(リン酸化)を抑制する能力は、以下の分析を用いて評価された。本発明のペプチドの多くが、単量体および/または4量体の構造(P5-D、P6-D、P10-DおよびP11-Dなど)で、KDRの活性化を抑制することが示された。前述したように、KDRの活性化を抑制するペプチドは、抗-血管新生剤として使用され得る。
(Stratgene Cat No.400550)内で2分間、遠心分離により2000xgで、小球形にされ、上澄みは、1.5mLの新たな管に移された。20μgの抗Flk-1抗体(Santa Cruz Biotechnology, Cat No.sc-504)が、各々の管に加えられ、管は、KDRを免疫沈降させるため、4℃で一晩(16〜18時間)、回転装置上で培養された。翌日、40μLのプロテインA-sepharoseビーズが、管に加えられ、回転装置の上で、4℃で1時間培養された。その後、いずれのチューブのビーズも、Picofuge内で2分間遠心分離し、上澄みを捨てて、新たに加えられた1mLのTBST緩衝液(20mMのトリス基剤pH7.5、137mLのNaCl、および0.1mLのTween20)にビーズを分散させることにより、3回洗浄された。遠心分離し、最後の洗浄液を除去した後、40μLのLaemmliSDS-PAGEサンプル緩衝液(Bio-Rad, Cat No.161-0737)を、各々の管に加え、管をキャップして、5分間沸騰させた。冷却後、各管内のビーズは、遠心分離により小球形にされ、免疫沈降したKDRを含む上澄みは、新しい管に移され、即座に使用されるか、後の分析のために−70℃で保管された。
C-6070、1%のACS級メントール、pH11.0)中で、Bio-Rad mini Trans-Blot細胞(Cat No. 170-3930)内のPVDF膜(Bio-Rad, Cat No.162-0174)に、2時間140mAで、電気的にブロットされた。ブロットは、予め2時間加熱して37℃に温めた5%のBlotto-TBS(Pierce Cat No.37530)内で、室温でブロックされた。ブロットは、まず最初に、0.1%のTween 20を加えた5%のBlotto-TBS内で、1:200に希釈された抗-リン酸チロシン抗体(Transduction Labs, Cat No.P11120)で、室温で2時間検査された。結合していない抗体は、0.1%のTween20を含んだD-PBS(D-PBST)で、1回につき5分、4回ブロットを洗浄することにより、取り除かれた。その後、ブロットは、0.1%のTween 20を加えた5%のBlotto-TBS内で、1:25,000に希釈されたHRP-共役の羊の抗-マウス抗体(Amersham Bioscience Cat No.NA931)で、室温で1時間検査され、D-PBSTで4回洗浄された。最後に、ブロットは、表面に散布された2mLの化学発光媒体(ECL Plus, Amersham Biosciences Cat No. RPN2132)で2分間培養され、 プラスチックシートプロテクター(C-Line Products, Cat No.62038)の中に置かれ、X線フィルム(Kodak Bio Max ML, Cat No.1139435)に、様々な長さの時間で晒して、最適なコントラストを得た。
VEGFによるKDRの活性化をブロックすることが可能な媒体を検出する分析の能力は、VEGFと結合したHUVECに一連の化合物を加え、KDRのリン酸化を前述の免疫ブロット法分析で測定することにより、判定された。負および正の制御のとして、未刺激HUVECからの免疫沈降、および、いかなる試験化合物も伴わずにVEGFで刺激したHUVECからの免疫沈降物が、すべての分析において検査された。中和−抗-KDR抗体(R&D Systems Cat No.AF-357)を、VEGFと化合させると、KDRのリン酸化は著しく減少し(図4、上部パネル)、KDRと結合してKDRを活性化させるVEGFの能力を、抗体が妨害し得るということを示した。この結果は、予想されていた。なぜなら、VEGFが誘発するDNA合成をブロックする抗体の能力は、製造者が抗体について実施する品質管理検査の一部だからである。抗-KDR抗体でブロットを再検査したところ(図4、下部パネル)、VEGFのみで処理したレーン(+V)と比較して、VEGF+抗体で処理したレーン(+V+α-KDR)に存在した総KDRは、わずかに少なかったことが分かった。しかしながら、この違いは、抗体で処理されたレーン内において、リン酸化KDRの量が著しく少なかったことを説明するのに充分なほど、大きなものではなかった。
P2-D、P3-D、P6-D、P7-E、P8-D、P9-D、P10-D、P11-D。
P5-E、P14-D、P15-D、P16-D、P17-D、P18-E、P19-E、P20-E、P21-E、P23-D。
Tcで標識したP12-CとKDR−トランスフェクト293H細胞との結合
本実施例では、Tcで標識したP12-CがKDRに対して結合する能力を、KDR−トランスフェクト293H細胞を用いて評価した。本結果は、KDR−トランスフェクト293H細胞に対するTc標識化P12-C結合は、KDRを偽−トランスフェクトした293H細胞に対する結合に比べて有意に優れていたとともに、Tc標識化P12-Cポリペプチドの濃度とともに直線的に結合が増加したことを示している。
250mlのSPPS反応容器に、6.64molのH-Gly-2-Cl-トリチル樹脂(0.84mmol/g、Novabiochem社)を加えた。これを80mlのDMF中で一時間膨張(swelling)させた。各カップリングサイクルにおいて、26.6mmolのDIEA、26.6mmolのFmocアミノ酸(EM Science社)を含むDMF、26.6mmolのHOBT(Novabiochem社)を含むDMF、および26.6mmolのDICを、この樹脂に加えた。DMFの全容積は80mlであった。反応混合物を4時間振盪した。次に、この樹脂をろ過し、DMFで洗浄した(3×80ml)。20%のピペリジンを含むDMF(80ml)溶液をこの樹脂に加え、これを10分間振盪した。この樹脂をろ過して、ピペリジン処理を繰り返した。最終的に、この樹脂をDMF(3×80ml)で洗浄し、次のカップリングサイクルに備えた。最終的なカップリングサイクルでは、HATU/DIEA活性化剤を用いてN,N-ジメチルグリシン(Aldrich)を結合した。すなわち、N,N-ジメチルグリシン(26.6mmol)を含むDMF懸濁液に対して、26.6mmolのHATU(Perseptive Biosystems社)を含むDMF溶液、および53.1mmolのDIEAを加えた。この透明溶液を樹脂に加え、16時間振盪した。合成後、この樹脂をろ過し、DMF(3×80ml)、CH2Cl2(3×80ml)で洗浄し、乾燥した。この樹脂を80mlのAcOH/CF3CH2OH/DCM(1/1/8、v/v/v)と混合し、45分間振盪した。この樹脂をろ過し、ろ液を濃縮してペーストとした。25%MeOH/DCMを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより粗製物を精製して、2.0gの最終生成物を得た。
精製Me2N-Gly-Cys-(Trt)-Ser(tBu)-Gly-OHおよびヒドロキシベンゾトリアゾール(0.0055mmol)の混合物を含むDMF(0.25ml)に、プロピルカルボジイミド(0.0055mmol)を加え、この混合物をRTにて6時間攪拌した。ペプチド(0.0055mol)を含むDMF(0.25ml)を反応混合物に加え、さらに6時間攪拌を続けた。真空下でDMFを除去し、残渣を試薬Bで処理し、3時間攪拌した。減圧下でTFAを除去し、この残留物を、0.1%TFAを含むアセトニトリル−水を用いた調製用HPLCで精製した。純粋な生成物を含む画分を採取し、凍結乾燥することによりペプチドを得た。このペプチドはES-MSにより特定され、その純度はRP-HPLC(アセトニトリル−水/0.1%TFA)のグラジエント(勾配)により測定された。
13mgのグルコヘプトン酸ナトリウムを含む、1.0mlの窒素パージを行なった水に対し、20μg/mlのSnCl22H2O溶液が含まれる窒素パージを行なった1NのHCl 2mlを加えて、錫グルコン酸溶液(stannous gluconate solution)を調製した。50/50エタノール/H2Oに溶解した20〜40μl(20〜40μg)のP12-Cリガンド、生理食塩水に溶解した6〜12mCiの99mTcO4−、および100μlの錫グルコン酸溶液(stannous gluconate solution)を4mlのオートサンプラーバイアルに加えた。この混合物を100℃で22分間加熱した。1ml/分の流量にて、66%H2O(0.1%TFA)/34%ACN(0.085%TFA)を用いて溶出したVydac C18ペプチドおよびタンパク質のカラム(Vydac C18 Paptide and Protein column)によって分析したところ、得られた放射化学的純度(RCP)は10〜47%であった。流量1ml/分、水相として0.1%のTFAを含む水、有機相として0.085%のTFAを含むアセトニトリルを用いたVydac C18カラム(4.6mm×250mm)のHPLCにより反応混合物を精製した。勾配は以下の通り:29.5%有機相(org.)を35分間、85%有機相(org.)へと傾斜を5分以上、10分間放置。99mTc-P12-Cを含む画分(もはやACM保護基を含まないもの)を、5mg/mlのアスコルビン酸および16mg/mlのヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリンを50mMのリン酸緩衝液に溶解したものを含む安定化用緩衝液500μl中に採取した。アセトニトリルを除去するために高速真空装置を用いて混合物を濃縮し、0.1%のHASを50mMのpH=5のクエン酸緩衝液に溶解したもの200μlを加えた。得られた生成物のRCPは100%であった。動物に投与する前に、この化合物を通常の生理食塩水で希釈して、所望の放射性物質濃度(radioconcentration)とした。
アビジンHRPの実施例に記載されたプロトコルを用いて、293H細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトは黒色/透明の96ウェルプレート(Becton Dickinson、カタログ番号354640)で行なわれた。プレートの片側半分(48ウェル)の細胞には(DNAを持たない)偽−トランスフェクト(偽トランスフェクト)が行なわれ、プレートの他の半分の細胞には、KDRcDNAがトランスフェクトされた。トランスフェクト時点において細胞の80〜90%が融合し、翌日の分析時点では全ての細胞が融合していた。それ以外の場合、分析を中止した。
opti-MEMIはInvitrogen社(カタログ番号11058-021)より入手し、ヒト血清アルブミン(HSA)はSigma社(カタログ番号A-3782)より入手した。0.1%HASを含有するopti-MEMIを調製するために、0.1%(w/v)のHASをopti-MEMIに添加し、室温にて20分間攪拌した後、0.2μMのフィルターで、ろ過殺菌を行なった。
Tcで標識したP12-Cの原液(117μCi/ml)を、0.1%HASを含有するopti-MEMI中で1:100、1:50、1:25および1:10となるように希釈し、Tcで標識したP12-Cの最終濃度が1.17、2.34、4.68および11.7μCi/mlである溶液を準備した。
トランスフェクト後、24時間が経過した細胞を使用し、分析に備えるために、室温にて、0.1%HASを含有するopti-MEMI 100μlで1回(1×)、これらの細胞を洗浄した。洗浄後、0.1%HASを含有するopti-MEMIをプレートから除去し、70μlの1.17、2.34、4.68および11.7μCi/mlのTcで標識したP12-C(上記に従って調製)で置き換えた。偽−トランスフェクトおよびKDR−トランスフェクト細胞の3つの異なるウェルに対し、各希釈液を添加した。室温にて1時間の後、4℃にて15分間の培養を行ない、100μlの冷却したバインディング緩衝液ー(0.1%HASを含有するopti-MEMI)で5回洗浄して、静かに滴下、乾燥し顕微鏡下で細胞の損失を調べた(gently blotted dry and checked under microscope for cell loss)。各ウェルに対し、100μlの可溶化溶液(Triton X-100 2%、グリセロール 10%、BSA 0.1%)を加え、プレートを37℃にて10分間培養した。各ウェルの可溶化溶液をピペットで上下して混合し、1.2mlの試験管に移し替えた。各ウェルを100μlの可溶化溶液で一回洗浄し、この洗浄液を対応する1.2mlの試験管に添加した。LKB Gamma Counter(Tc-window、20秒間)で計数するために、1.2mlの各試験管から15.7mm×100cmの試験管へと移し替えた。
Tcで標識したP12-CのKDRに対する特異的結合能を、一過性にトランスフェクトした293H細胞を用いて実証した。図6に示されるように、Tc標識化P12-CとKDR−トランスフェクト293H細胞との結合は、KDRを偽−トランスフェクトした293H細胞との結合に比べて有意に優れていた。KDRに対する特異的結合を計測するために、Tcで標識されたP12-Cと偽−トランスフェクト細胞との結合を、KDR−トランスフェクト細胞との結合からサブトラクトした(差し引いた)。図7に示されるように、Tcで標識されたP12-Cの濃度の増加に伴い、Tcで標識されたP12-CとKDRとの結合が直線的に増加する様子が観察された。Tcで標識したP12-Cの濃度はわずか100pM程度(この分析における試験では、最高濃度でさえ11.7μCi/ml)であり、これは、(アビジンHRP分析を用いて算出したように)P12のKD値である3〜4nM程度に対して非常に低い値であり、結合が飽和状態になっていたとは推測できないと考えられることから、直鎖結合であったことが推測される。
KDR結合ペプチド/アビジンHRP複合体とKDR−トランスフェクト293H細胞との結合
ファージディスプレイにより特定されたペプチドと、一過性にトランスフェクトされた293H細胞内で発現されたKDRとの結合を測定するために、neutravidin HRPと複合化したビオチン化ペプチドと、トランスフェクトされた細胞表面のKDRとの結合を測定する、新規な分析を構築した。本分析は、上述のビオチン化ペプチドをスクリーニングするために使用された。neutravidinには、レクチンと結合する糖鎖部分が存在せず、また、細胞接着レセプターと結合するRYD領域が存在しないことから、ビオチン以外の分子に対して非特異的に結合することがより少ないため、ストレプトアビジンあるいはアビジンの代用としてneutravidin HRPが使用された。
m-RNAおよび5’RACE ready cDNAライブラリーの調製
HUVEC細胞を、175cm2の組織培養フラスコ(Becton Dickinson社、Biocoat、カタログ番号6478)中にて80%コンフルーエンスになるまで培養し、次に10ng/mlのbFGF(Oncogene社、カタログ番号PF003)を加え、24時間KDRの発現を誘発した。Invitrogen社のmicro-fast track 2.0キット(カタログ番号K1520-02)を用いてmRNAを単離した。キットの使用説明書に従い、12μgのmRNA(吸光度260nmで測定)を2個のフラスコから得た。2μgのmRNA、オリゴdTプライマー(5’-(T)25GC-3’)および/またはsmart IIオリゴ(5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTA CGCGGG-3’)にて、モロニーマウス白血病ウィルス(Moloney Murine Leukemia Virus、MMLV)の逆転写酵素を用いて、cDNA産生を目的とした逆転写を行なった。総量を20μlとして反応を行ない、また、反応溶液中には2μlのRNA、1μlのsmart IIオリゴ、1μlのオリゴdTプライマー、4μlの5×first-strand緩衝液(トリスHCl 250mM pH=8.3、KCl 375mM、MgCl2 30mM)、1μlのDTT(20mM、逆転写酵素も共に補給)、dNTP混合物(ddH2O中、各10mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、Stratagene社、カタログ番号200415)、9μlのddH2Oおよび1μlのMMLV逆転写酵素(Clonetech社、カタログ番号8460-1)が含まれていた。逆転写反応を42℃にて90分間行ない、250μlのトリシン-EDTA緩衝液(トリシン 10mM、EDTA 1.0mM)を添加して反応を停止した。逆転写産物である5’RACE ready cDNAライブラリーは−20℃にて3ヶ月間保存することが可能である。DNAおよびRNAの使用のために用いた水はすべて、USBから入手したものであり(カタログ番号70783)、DNAseおよびRNAseフリーであった。
s-KDRをクローニングするために、5’オリゴ(G ATG GAG AGC AAG GTG CTG CTG G)および3’オリゴ(C CAA GTT CGT CTT TTC CTG GGC A)を使用した。これらは、pfuポリメラーゼ(Stratagene社、カタログ番号600135)によるポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)法を用いて5’RACE ready cDNAライブラリー(先の記載に従って調製)からKDRの完全な細胞外領域(約2.2kbps)を増幅するためにデザインされたものである。PCR反応は総量50μlとして行なわれ、反応混合物には2μlの5’RACE ready cDNAライブラリー、1μlの5’オリゴ(10μM)、1μlの3’オリゴ(10μM)、5μlの10×PCR緩衝液[pfu酵素に1%のDSMOおよび8%のグリセロールを加えたものを補給したPCR緩衝液(トリスHCl 200μM pH=8.8、MgSO4 20mM、KCl 100mM、(NH4)2SO4 100mM)]、1μlのdNTP混合物(10mM)および40μlのddH2Oが含まれていた。PCR反応は、94℃にて1分間、68℃にて1分間、および72℃にて4分間を40サイクルとしたプログラムセットを用いて行なわれた。このPCR産物を、容積1の(1 volume of)クロロホルムで抽出することにより精製し、容積3のエタノールおよび容積1/10の3M・酢酸ナトリウムを用いて沈殿させた。PCR産物を17μlのddH2O、2μlの10×Taqポリメラーゼ緩衝液(トリスHCl 100mM pH=8.8、KCl 500mM、MgCl2 15mM、0.01%ゼラチン)に再懸濁し、1μlのTaqポリメラーゼ(Stratagene社、カタログ番号600131)を添加して産物の各末端にA-オーバーハングを作製した。72℃にて1時間培養した後、TOPO-sKDRを得るため、製造業者のプロトコルに従い、修飾された産物を直接invitrogen社のTOPO IIベクター(カタログ番号K4600-01)にクローニングした。Taq(PCR酵素)処理化PCR産物内にA-オーバーハングがあるために、TOPOベクターは、PCR産物のクローニングを容易にすることができる。
KDRの膜透過領域および細胞質領域をクローニングするために、5’オリゴ(TCC CCC GGG ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG)および3’オリゴ(C AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C)を使用した。これらは、pfuポリメラーゼによるポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)法を用いて5’RACE ready cDNAライブラリー(先に記載)からKDRの完全な膜透過および細胞質領域(約1.8kbps)を増幅するためにデザインされたものである。PCRの反応条件およびプログラムは、上述のs-KDRと完全に同一であった。s-KDR配列と全く同様に、このPCR産物を、フェノールクロロホルム抽出を用いて精製し、Taqポリメラーゼによる処理を行ない、そしてinvitrogen社のTOPO IIベクターにクローニングしてTOPO-CYTOを得た。
完全長レセプターを作製するために、細胞外領域および細胞質領域(膜透過領域を伴う)を、それぞれ別々にTOPO-sKDRおよびTOPO-CYTOからPCR法で増幅し、次に連結して完全長レセプターを作製した。TOPO-sKDRから細胞外領域をPCR法により増幅するために、細胞外領域の5’末端にNot1部位を持つオリゴ(A TAA GAA TGC GGC CGC AGG ATG GAG AGC AAG GTG CTG CTG G)、および細胞外領域の3’末端に相補的なオリゴ(TCC CAA GTT CGT CTT TTC CTG GGC ACC)を使用した。同様に、TOPO-CYTOからKDRの細胞質領域(膜透過領域を伴う)をPCR法で増幅するために、5’オリゴ(ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG)、およびNot1部位を持つ3’オリゴ(A TAA GAA TGC GGC CGC AAC AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C)を使用した。双方のPCR産物をNot1で切断し、これをひとつに連結することによって完全長のレセプターを作製した。完全長レセプターをエンコードするcDNAはアガロースゲル上に精製され、pcDNA6/V5−HisCベクターのNot1部位に連結される。DNAの精製および連結(ライゲーション)は先にpsKDR関して記載したように行なった。連結反応はDH5αバクテリアの培養物を形質転換するために使用され、また、インサートの存在と適応について、EcoRI酵素を用いた各クローンの精製プラスミドの制限分析により、個々のクローンが大量に分析された。
293H細胞をInvitrogen社より入手(カタログ番号11631)し、推奨培地に1ml/L pen/strep(Invitrogen社、カタログ番号15140-148)を加えた培地での単層培養によって生育させた。全細胞は、日常的な培養の間は(for everyday culture)抗生物の存在下で生育させたが、トランスフェクト前の16〜20時間は抗生物フリーの培地にこれらを隔離した。
pf-KDRを含む大腸菌DH5αを、グリセロールストックから50μg/mlアンピシリンを含むLBプレート(US biological社製のLBアガー;カタログ番号75851、およびSigma社製のアンピシリン;カタログ番号A2804)にストリークし、これらのプレートを37℃のインキュベータに放置して一晩培養した。翌朝、単一コロニーをプレートから採取して3mlのLB/アンピシリン培地(US biological社製のLB;カタログ番号75852、)で37℃にて培養した。8時間後、3mlの試験管から100μlの細菌培養物を250mlのLB/アンピシリン培地に移し替えて、37℃にて一晩インキュベーションを行なった。Lab-Lineインキュベータシェーカーに設置した500mlの容器(Beckman社、カタログ番号355605)内で220rpmで回転攪拌(circular agitation)を行ないながら細菌を生育させた。翌日、maxi-prep kit(QIAGEN社、カタログ番号12163)を用いて細菌培養物を処理した。通常、250mlの細菌培養物から約1mgのプラスミドDNA(吸光度260nmにて定量)が得られた。
ポリ-D-リジンでコートした96ウェルプレートを使用して、リポフェクタミン2000のプロトコル(Invitrogen社、カタログ番号11668-019)に推奨される方法でトランスフェクトした。96ウェルプレートによるトランスフェクトのために、0.1ml中、1ウェルに対して320ngのKDR DNA(pc-DNA6-fKDR)を使用した。血清を含む培地中でトランスフェクトし、6〜8時間後に細胞からトランスフェクト用試薬の混合物を除去し、標準的な血清含有培地へと置換した。トランスフェクトは、黒色/透明の96ウェルのプレート(Becton Dickson社、カタログ番号354640)で行なわれた。プレートの一方の半分(48ウェル)の細胞には(DNAを持たない)偽−トランスフェクトを行ない、プレートの他方の半分の細胞にはKDR cDNAをトランスフェクトした。トランスフェクト時点において細胞の80〜90%が融合し、翌日の分析時点では全ての細胞が融合していた。そうでなかった場合には、分析を中止した。
先の記載に従い、M199培養液を調製した。
Promega社から入手したセファロース(カタログ番号V2011)を、12,000rpmにて2分間遠心分離器にかけてSoftLink soft releaseアビジンセファロースを調製し、氷温水で2回洗浄を行ない(洗浄の間に遠心分離)、沈殿物を氷温水中に再懸濁して50%スラリーを含むddH2Oを作製した。各実験のために、新鮮なアビジンセファロースの50%スラリーを調製した。
ビオチン化ペプチドP6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XB、ならびに対照ペプチドP1-XB(先の記載に従って調製)を用いて250μM原液を含む50%DMSOを調製するとともに、2mgのneutravidin HRP(Pierce社、カタログ番号31001)を1mlのddH2Oに溶解して33μMのneutravidin HRP原液を調製した。ペプチド原液を−20℃で保存し、一方neutravidin HRP原液を−80℃で保存した。ビオチン化ペプチドの構造を表1に示した。ペプチド/neutravidin HRP複合体を調製するために、10μlの250μMビオチン化ペプチド原液および10μlの33μM neutravidin HRPを、1mlのM199培養液に加えた。この混合物を4℃にて60分間、ローテーターで培養した後、50μlのSoftLink soft releaseアビジンセファロース(ddH2O中に50%スラリーを含む)を加えて余剰のペプチドを除去し、4℃にて30分間、ローテーターで再度インキュベーションを行なった。最後に、室温で12,000rpmにて5分間の遠心分離を行ないsoft releaseアビジンセファロースを沈殿させて、得られた上澄み液を用いて分析を行なった。各実験のために、新鮮なペプチド/neutravidin HRP複合体を調製した。
飽和結合試験用として、M199培養液の1.2mlのアリコートに、120μl、60μl、20μl、10μl、8μl、6μl、4μlおよび1μlのペプチド/neutravidin HRP複合体を加えて、最終濃度がそれぞれ33.33nM、16.65nM、5.55nM、2.78nM、1.67nM、1.11nMおよび0.28nMの複合体を含む希釈液を作製した。
20mlのM199培養液を10mgの凍結乾燥した非標識化neutravidin(Pierce社、カタログ番号31000)に加えてブロッキング溶液を調製した。各実験のために、新鮮なブロッキング溶液を調製した。
トランスフェクトの24時間後、293H細胞の各ウェルを100μlのM199培養液で1回洗浄し、これを80μlのブロッキング溶液を用いて37℃で培養した。1時間後、細胞を100μlのM199培養液で2回洗浄し、これを70μlのP1-XB、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBのペプチド/neutravidin HRP希釈液を用いて室温で2時間半培養した。偽−トランスフェクトおよびKDR−トランスフェクト293H細胞の3種の異なるウェル(2個のプレートは各飽和結合試験に使用された、)に各希釈液を加えた。室温で培養した後、プレートを4℃へと移して、さらに半時間の培養を行なった。次に、氷温のM199培養液で細胞を5回洗浄し、氷温のPBSで1回(この順番で)洗浄した。最終洗浄の後、氷温のTMB溶液100μlを各ウェルに加え、各プレートはエアーインキュベータ内で37℃、30分間培養された。最後に、各ウェルに対して50μlの1Nリン酸を添加してHRP酵素反応を停止し、マイクロプレートリーダー(BioRadモデル3550)を使用して450nmにおける吸光度を測定することにより結合数を定量した。
この分析において、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBペプチド、ならびに対照ペプチドP1-XBとneutravidin HRPの複合体を、先の記載に従い調製し、これらとKDRを、一過性にトランスフェクトした293H細胞との結合能を測定した。ペプチド/neutravidin複合体の調製中、neutravidin中の4ヶ所のビオチン結合部位すべてに結合が起こるようにneutravidin HRPに対して7.5倍過剰のビオチン化ペプチドが用いられた。複合体の形成後、遊離のビオチン化ペプチドとneutravidin HRPと複合体を形成したビオチン化ペプチドとの競合を完全に避けるため、soft releaseアビジンセファロースを用い、余剰の遊離ビオチン化ペプチドを除去した。
実験BはKDR結合配列(P6およびP5)とビオチンの間のスペーサー(X)の影響を調べるためにデザインされた。この実験では、ビオチン化P6およびP5(スペーサーXを含むもの、およびスペーサーXを含まないもの)を試験に供し、陰性対照にはP1(スペーサーXを含むもの、およびスペーサーXを含まないもの、先の記載に従い調製)が使用された。
実験Cでは、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBの結合に対する血清の影響を検討した。この実験では、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBのビオチン化ペプチド/アビジンHRP複合体は、40%ラット血清含有または非含有のM199培養液(上記実験Aに記載)中において試験に供された。本実験は、P6-XBおよびP5-XBでは6.66nM、P12-XBでは3.33nM、およびP13-XBでは2.22nMの単一濃度とした以外は実験Aの記載に従って実施された。
実験Dは、KDRの四量体複合体およびポリペプチドP6-XBおよびP5-XBに結合したVEGF/KDR複合体、とりわけ、少なくとも2個のKDR結合ペプチドを含む構成物、の結合を評価するためにデザインされた。KDR結合ペプチドおよび対照の結合ペプチド(P1-XB)は先に記載の方法により調製された。以下に説明する本実験独自の手順を除き、実験Aに記載のプロトコルを用いてこの実験を実施した。
50%DMSO中で250μMのビオチン化ペプチドP-1-X-B、P6-XBおよびP5-XB原液を調製し、2mgのneutravidin HRP(Pierce社、カタログ番号31001)を1mlのddH2Oに溶解して33μMのneutravidin HRP原液を調製した。ペプチド原液は−20℃で保存し、一方、neutravidin HRP原液は−80℃で保存した。ペプチド/neutravidin HRP複合体を調製するために、総量で5.36μlの250μMビオチン化ペプチド原液(あるいはぺプチド分子がアビジンHRP分子数の4倍とした、ペプチド溶液の混合物)および10μlの33μM neutravidin HRP原液を、1mlのM199培養液に加えた。この混合物を4℃にて60分間ローテーターで培養して、次に50μlのsoft releaseアビジンセファロース(50%スラリーを含むddH2O)を加えて余剰のペプチドを除去し、再び4℃にて30分間ローテーターで培養を行なった。最後に、室温にて5分間、12,000rpmで遠心分離を行ない、soft releaseアビジンセファロースを沈殿させて、得られた上澄み液を分析に使用した。各実験のために、新鮮なペプチド/neutravidin HRP複合体を調製した。
ペプチド/neutravidin HRPの結合を検出するためには、先に記載した手順を用いた。P6-XBおよびP5-XBは多量体の状態(multimeric fashion)でKDRに結合し、293Hトランスフェクト細胞内でKDRに結合するために互いに連携していることが、本実験の結果により立証された。
ホモ二量体の結合の増大率は、表2に示すように約1〜4倍の範囲であったが、一方、ヘテロ二両体の結合は2〜110倍の範囲であり、完全長配列の結合強度に対する相乗効果を示している(表3)。
実験Eは、P6-XBおよびP5-XBがKDRの異なる結合部位に結合していることを確認するためにデザインされた。ペプチドがKDRの同一部位に結合するのであれば、これらはKDRへの結合に関して互いに競合するであろう。一方、ペプチドが異なる部位に結合するのであれば、KDRへの結合に関してペプチド間の競合は起こらないであろう。本実験は、単一濃度のP5-XB/アビジンHRP(3.33nM)溶液を各ウェル中で使用し、さまざまな濃度(0〜2.5μM)のP1-XB、P5-XBおよびP6-XBを加えたが、いずれもアビジンとの複合体を形成しなかった。
ヘテロ二量体構成物の調製
KDR受容体に対する高親和性のペプチド結合剤を得るために、2種の線形ペプチド(P9、P10)を結合し、ヘテロ二量体を形成した。VEGF競合分析において特定された通り、これらの2つのペプチドはKDR上の異なる部位に結合した。従って、ヘテロ二量体中の両ペプチドは同時にひとつのタンパク質分子に結合することが可能であり、結果として総合的な親和性がより高い状態で結合する。ヘテロ二量体の2つの形状は、この二座の結合イベント(bidentate binding event)に対する最良の方向性を特定することを目指して合成される。ペプチドは、C末端のリジン残基を介してtail-to-tailの方向性で結合するか、あるいはN末端のアミノ基を介してhead-to-headの方向性で結合する。
いずれか一方の単量体ペプチドに対する改善された結合親和性に関する分析を行なう目的で、表面プラズモン共鳴(Biacore 3000)を用いて、結合に関する各へテロ二量体の分析を行った。標準的なアミンカップリングの手順により、可溶性のKDR受容体はCM5センサーのチップのデキストラン表面に交差結合(cross-link)した。0.5mg/mlの溶液を、50mMの酢酸塩(pH=6.0)で1:40に希釈して、総KL値が12721となるように固定化した。PBST緩衝液ー(5.5mMのリン酸、pH=7.65、0.15MのNaCl、0.1%のTween-20 (v/v))中で実験を行なった。減衰係数によって定量したペプチド溶液を希釈して1000、500、250、125、62.5および31.3nMの溶液を作製した。(ペプチドの)会合を行なうために、kinjectプログラムを用い、ペプチドを20μl/分で2分間注入した。3分間の解離の後、quickinject(50mMのNaOH、1MのNaCl、15秒間、75μl/分)により、残存するすべてのペプチドをKDR表面から剥離した。単量体P9およびP10を基準品とした。センサーグラムはBIA評価ソフトウェア3.1を使用した国際的な分析技術によって分析された。
ペプチド合成はABI-433Aシンセサイザー(Biosystems Inc.社製を利用、カリフォルニア州フォスターシティー)で、0.25mmolのスケールにてFastMocプロトコルを使用して行なわれた。乾燥条件のNα-Fmoc側鎖保護アミノ酸(requiste dry Nα-Fmoc side-chain protected amino acid)1mmolを、カートリッジ内で0.9mmolのHBTU、2mmolのDIEAおよび0.9mmolのHOBtを含むDMF-NMP混合液を用いて希釈することにより、このプロトコルの各サイクルにおける予備活性化を行なった。NovaSyn TGR(Rink amide)樹脂(0.2mmol/gの置換レベル)によりペプチドを構築した。カップリングを21分間行なった。Fmocの脱保護は、20%のピペリジンを含むNMP中で行なった。最終サイクルにおいて、N末端のFmoc基を除去し、無水酢酸/DIEA/HOBt/NMPを用いて、完全に保護された樹脂結合ペプチドのアセチル化を行なった。
常温にて4.5時間、試薬B(Reagent B)を用ることにより、樹脂からのペプチドの切断、および側鎖の脱保護を行なった。切断された溶液を回収し、追加分の試薬Bアリコートを用いて樹脂を洗浄した。集めた溶液を乾燥するまで濃縮した。円を描くように混ぜながら、あるいは攪拌しながらジエチルエーテルを残渣に加え、ペプチドを沈殿させた。液層をデカントしてから固形物を回収した。この手順を2〜3回繰り返して不純物および切断混合成分の残留物を除去した。
エーテルで沈殿した直鎖ジシステインを含む粗製ペプチドを、水、アセトニトリル水溶液混合物(0.1%TFA)、DMSO水溶液、または100%のDMSO中で再溶解させ、ならびに、アンモニア水溶液、炭酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液またはDIEAを添加して溶液のpHを7.5〜8.5に調整することによって環化した。混合液を空気で16〜48時間攪拌して、トリフルオロ酢酸水溶液でpH=2になるように酸性化し、その後、アセトニトリルの水への勾配を用いた調製用逆相HPLCで精製した。所望の物質を含む画分をプールし、凍結乾燥により精製ペプチドを単離した。
標準的な実験において、ivDdeで保護されたリジンを有する樹脂結合ペプチド400mgを、10%ヒドラジンを含むDMF(1×20ml)で処理した。この樹脂をDMF(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。DMF(10ml)中で樹脂を再懸濁し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(0.4mmol)、HOBt(0.4mmol)、DIC(0.4mmol)、およびDIEA(0.8mmol)で4時間混合しながら処理した。反応後、この樹脂をDMF(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。次に、この樹脂は20%ピペリジンを含むDMF(2×15ml)により、毎回10分間処理された。樹脂を洗浄し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸によるカップリングおよびFmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。
標準的な実験において、ivDdeで保護されたリジンを有する樹脂結合ペプチド400mgを、10%ヒドラジンを含むDMF(2×20ml)で処理した。この樹脂をDMF(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。DMF(10ml)中で樹脂を再懸濁し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(0.4mmol)、HOBt(0.4mmol)、DIC(0.4mmol)、およびDIEA(0.8mmol)で4時間混合しながら処理した。反応後、この樹脂をDMF(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。次に、この樹脂は20%ピペリジンを含むDMF(2×15ml)により、毎回10分間処理された。樹脂を洗浄し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸によるカップリングおよびFmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。
標準的な実験において、Nε-ivDdeで保護されたリジン部分を有する樹脂結合ペプチド400mgを、10%ヒドラジンを含むDMF(2×20ml)で処理した。この樹脂をDMF(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。DMF(10ml)中で樹脂を再懸濁し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(0.4mmol)、HOBt(0.4mmol)、DIC(0.4mmol)、およびDIEA(0.8mmol)で4時間混合しながら処理した。反応後、この樹脂をDMF(2×10ml)およびDCM(1×10ml)で洗浄した。次に、この樹脂は20%ピペリジンを含むDMF(2×15ml)により、毎回10分間処理された。樹脂を洗浄し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸によるカップリングおよびFmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。こうして得られた、遊離アミノ基を持つ樹脂結合ペプチドをDMF(10ml)中に再懸濁し、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸-1,4,7-トリ-t-ブチルエステル(DOTA-トリ-t-ブチルエステル、0.4mmol、5当量)、HOBt(0.4mmol)、DIC(0.4mmol)およびDIEA(0.8mmol)を含むDMF(10ml)の溶液で4時間混合しながら処理した。反応が完了した後、この樹脂をDMF(2×10ml)およびDCM(1×10ml)で洗浄し、試薬B(20ml)で4時間処理した。混合物をろ過し、ろ過液を濃縮乾燥した。残渣をエーテルで攪拌して固形物とし、これを集めてエーテルで洗浄してから乾燥させた。この固形物を無水DMSO中で溶解しDIEAでpH=7.5となるように調整した。混合物を16時間攪拌し、分析HPLCにより観察しながらジスルフィド環化(disulufide cyclization)を行なった。環化が完了した後、反応混合物を25%のアセトニトリルを含む水で希釈し、逆相C-18カラムに直接投入した。アセトニトリルの水への勾配(いずれも0.1%のTFAを含む)を用いて精製を行なった。画分をHPLCにより分析し、これらのうち純生成物を含むものを集めて凍結乾燥し、目的のビオチン化ペプチドを調製した。
先の表5およびその他の本明細書の記載において、記号表記「C*」は、ジスルフィド結合に関与するシスティン残基を指す。通常、本明細書に記載の単量体ペプチドは、環状ジスルフィドペプチドとして調製された後、共に連結することにより二量体を形成する。その結果、システィン残基が「C*」の表記を欠く場合であっても、単量体中の最も近いシスティンに結合したジスルフィド結合が存在することが概して推測される。二量体中の単量体成分もまた、システィン残基が「C*」の表記を含むか否かにかかわらず、概してこのようなジスルフィド結合を含むであろう。しかしながら、単量体を結合させて二量体を形成しし、その後ジ-システィンペプチドの環化を行なうことにより、本願発明の二量体およびその他のヘテロ多量体を代替として調製することができるであろうこと、ならびに、本願発明は、このようなジスルフィド結合が存在するか否かに関して何ら限定することを意図するものではないことを、当業者であれば理解するであろう。
種々のホモ二量体およびヘテロ二量体構成物の調製において、先に実施例8において言及した精製ペプチドの単量体を使用した。
ホモ二量体成分を調製するために、二量体を調製するために必要なペプチドの半量をDMFに溶解し、10当量のグルタル酸 ビス-N-ヒドロキシルスクシンイミジル エステルで処理した。HPLC分析および質量分析により、反応の進捗状況を観察した。反応終了後、真空内で揮発性物質を除去し、残渣を酢酸エチルで洗浄して、未反応のビス-NHSエステルを除去した。残渣を乾燥させて、無水DMF中に再溶解し、2当量のDIEAの存在下、残りの半量のペプチドによる処理を行なった。24時間、この反応を進行させた。混合物を直接YMC逆相HPLCカラムに投入し、アセトニトリルの水への直線勾配(いずれも0.1%のTFAを含む)による溶出により、精製を行なった。
ヘテロ二量体の場合、第一の単量体(「A」)は、グルタル酸のビス-NHSエステルと反応し、余剰分のビス-NHSエステルを洗い流した後(ホモ二量体に関する記載のように)、DIEAの存在下、第二の単量体(「B」)を加えた。反応混合液を調製用逆相HPLCで精製した。通常、グルタル酸 ビス-N-ヒドロキシルスクシンイミジル エステル(0.02mmol、10当量)を含むDMF(0.3ml)をペプチドAおよびDIEA(2当量)を含むDMF(0.5ml)に加えて、この混合物を2時間攪拌した。HPLC分析および質量分析により、反応の進捗状況を観察した。反応終了後、真空内で揮発性物質を除去し、残渣を酢酸エチル(3×1.0ml)で洗浄して、未反応のビス-NHSエステルを除去した。残渣を乾燥させて、無水DMF(0.5ml)中に再溶解し、ペプチドBおよびDIEA(2当量)を含むDMF(0.5ml)で24時間の処理を行なった。混合物を水で希釈(1:1、v/v)してからYMC C-18逆相HPLCカラムに直接投入し、アセトニトリルの水への直線勾配(いずれも0.1%のTFAを含む)による溶出により、精製を行なった。画分をHPLCにより分析し、これらのうち純生成物を含む画分を集めて凍結乾燥し、目的の二量体を得た。以下の二量体はこの方法により調整された(構造、名称、化合物の整理番号):
二量体D5を調製するために、個々のペプチドのカップリング反応後、50μlのヒドラジンが反応混合物に加えられ(リジンNε−アミノ酸を晒すため)、溶液は、2分間攪拌された。反応混合物は、水(1.0mL)で希釈され、pHは、TFRで2に調整された。その後、これを上述の方法で精製した。
1および3の合成
単量体の合成は、25mmol規模で、方法5に記述したやり方で、開始樹脂としてFmoc−GGGK(iV−Dde)NH−PAL−PS樹脂を使用して実行された。ペプチド樹脂は、切断またはさらなる誘導体化を行う前に、自動または手動で洗浄され、乾燥された。
1および3への、ビオチン−jj、リシル、グリチルおよびSerinyl(GalNAc(Ac)3−α−D部の付加は、方法6および8に記述したように、手動SPPSにより実行された。アミノ酸のカップリングは、HOBt/DICを活性剤に用いて(Ser(GalNAc(Ac)3−α−Dの場合を除く)、DMF内で行われた。Fmocの除去は、DMF内の20%のピペリジンで行われた。すべてのカップリングは、5〜16時間継続された。各々のカップリングの後、Kaiser試験で、カップリングの完了を確認した。Ser(GalNAc(Ac)3−α−Dの場合は、HATU/DIEAをカップリング試薬に用いて、DMF内でカップリングを行った。Kaiser試験により、未反応のアミノ酸基が発見された場合は、カップリング処置が繰り返された。N−端末Fmoc基の除去および樹脂からの切断が実行された。粗製ペプチドを、エーテル内に沈殿させ、エーテルで2回洗浄し、真空下で乾燥させた。直鎖粗製ペプチドは、DMSO(40mg/mL)内に溶解され、これにより直接的に環化された。溶液のpHは、水性N−メチルグルカンを加えることにより、8に調整され、溶液は、大気中で、室温で48時間攪拌された。その後ペプチドは、方法1に記述したように、Waters−YMC C−18 ODS調製用カラム(250mm×4.6mm内径)を使用して、勾配HPLCにより精製された。純粋な生産物を含む留分を集めて冷凍乾燥し、所望のペプチドを得た。
無水DMFにグルタル酸bis−NHSエステル(0.122mmol、Pierce Scientific Co.)を加えた溶液に、DMFに4を加えた溶液(40mg、0.0122mmol)を、一滴ずつ垂らすように加えた。ペプチドと結合したトリフルオロ酢酸、および反応の間に形成されたN−hydroxysuccinimideを中和するため、DIEAを加えた。この0.7mLの溶液は、4時間攪拌された。反応は、HPLCおよび質量分析によってモニターされた。DMFは、真空下で除去された。過剰なジエステルを、酢酸エチルを加えることにより除去し、グルタル酸bis−NHSエステルを溶解する間に、ペプチド−モノエステル5を沈殿させた。混合物は、遠心分離機で分離され、液体部分は、別の容器に移された。これを、2回繰り返した。残留物は、真空下に10分間保たれた。残留物は、DMFに溶解され、DMF(pH7)に2を加えた溶液(37mg、0.009mmol)と混合された。混合液は、常温で16時間攪拌された。揮発性物質は、高真空で除去され、酢酸官能基は、残留物を1mLのヒドラジン/MeOH(15/85、v/v)溶液で処理し、常温で2.5時間攪拌することにより、除去された。過剰なヒドラジンを抑えるために、アセトンが加えられ、発揮性物質は、真空で除去された。こうして得られた残留物は、DMSOに溶解され、前述したように、調製用HPLCによって精製され、9mgの純粋な物質を提供した。
上記に同定した二量体ペプチドD−1〜5、D−8〜30、および二量体D−27のペプチド構成要素に関する、HPLC分析データおよび質量分析データを、下記の表6に示す。
HPLC解析システム
システムA:カラム:YMC C−4(4.6×250mm);溶出剤:A:水(0.1%TFA),B:アセトニトリル(0.1%TFA);溶出:初期状態,25%B,直線的勾配25〜60%Bで10分;流量:2.0ml/分;検出:紫外線で220nm。
HUVECおよびKDR−トランスフェクト細胞上のKDRと結合するための 125 I−VEGFとの競合
以下の実験は、トランスフェクト293H細胞に発現したKDRと結合するために、本発明のKDR-結合ペプチド、ホモ二量体およびヘテロ二量体が、125 I−標識VEGF と競合する能力を判定したものである。
293H細胞は、KDRcDNAでトランスフェクトされるか、前述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。細胞は、競合する化合物(10μM、0.3μMおよび0.03μM)の存在下または不在下、125 I−VEGFで培養された。細胞を洗浄した後、結合放射活性が、ガンマカウンターで計量された。VEGF結合の阻害率は、式 [(Y1−Y2)×100/Y1]を用いて計算された。ここで、Y1は、ペプチド不在下における、KDR−トランスフェクト293H細胞への特異的結合であり、Y2は、ペプチド競合物の存在下における、KDR−トランスフェクト293H細胞への特異的結合である。KDR−トランスフェクト293H細胞への特異的結合は、KDR−トランスフェクト293H細胞への結合から、偽−トランスフェクト293H細胞への結合を引くことにより計算される。
図14に示されるように、判定されたすべてのKDR−結合化合物は、KDR−トランスフェクト細胞への結合に関して、125 I−VEGFと競い合うことができた。ヘテロ二量体(D1)は、明らかに、125 I−VEGFと最も効果的に競合した。これは、2つのホモ二量体(D2およびD3)を上回るものであり、D1の優れた結合力を裏づけた。
受容体活性化分析
ヘテロ多量体をはじめとする、本発明のKDR−結合多量体構成物の、VEGFが誘発するKDRの活性化(リン酸化)を阻害する能力は、以下の分析を用いて判定された(上記の実施例4も参照)。
ほぼ融合性のHUVECを入れた皿が、血清も増殖因子も含まない基礎媒体の中に、一晩置かれた。翌日、下記の(c)グループの皿を、KDR−結合ペプチドを含んだ基礎媒体で前処理し、その後、(a)、(b)および(c)のグループの皿の中の細胞は、
(a)添加物無し(負の制御)
(b)5ng/mL VEGF(正の制御)
(c)5ng/mL VEGFおよび競合的/阻害的と見なされるペプチド
を含んだ新しい媒体の中に置かれた。5分間処理した後、各皿からの溶解物が準備された。溶解物から免疫沈降したKDRは、連続して免疫ブロット法により分析された。抗−ホスホチロシン抗体で、リン酸化を分析し、抗−KDR抗体で、総KDR量を分析(サンプルの負荷量を照合するため)した。
図15に示されるように、D1は、10nMで、HUVEC内におけるVEGFが誘発するKDRのリン酸化を、完全にブロックした。ホモ二量体D2およびD3(D1に含まれる別個の結合部分を、それぞれ、単独で2個有している)は、100nMまで、リン酸化に何の影響も与えなかった。このことは、適切なヘテロ二量体を使用することが、受容体−リガンドの相互作用をブロックするには、有益であるということを示している。多くの実験において、D1の本分析におけるIC50は、0.5〜1nMの間で変化した。無関係な結合配列を有するヘ別のテロ二量体D31(下記に構造を示す)は、その高い結合親和力(KDRに対して11nM、Biacoreで測定)にもかかわらず、100nMでは、リン酸化に何の影響も及ぼさなかった。このことは、KDRへの結合を、VEGFと競い合う多量体を構築する場合、KDR結合部分の選択が、重要であるということを示唆してる。D1のKDRへの親和力は、D2のそれよりも10倍高い(SPR分析による)が、活性化分析におけるD1のIC50は、少なくとも100倍低い。このことは、1つの結合分子でKDR上の2つの別個のエピトープを標的とすると、KDR上の単一のエピトープとしか結合しない同じ親和力を有する分子と比して、より大きな立体障害を生み出すことができる、ということを示唆している。同様に、D1内の2つのKDR−結合部分を、受容体活性化分析において、単量体の遊離ペプチド(P12−XBおよびP6−D)として試験したところ、それぞれ、0.1、1マイクロモルのIC50を有していた。これは、この分析におけるD1のIC50よりも100〜1000倍高く、単量体ペプチドのフルオレセイン標識された誘導体のKDよりも14〜30倍高い。このように、VEGFのブロック機能が弱いペプチドであっても、これら2つを含めて二量体を作ると、非常に強力なVEGF−ブロック機能を有する分子とすることができ、これはD1の結合親和力の向上を優に上回るものである。
血清を欠いたHUVECが、1つのウェルにつき100,000細胞、BD Matrigel−coated FluoroBlokの24−ウェル・インサートプレート(#354141)の、上部チェンバーに置かれた。添加物無しの、または異なる誘因剤、たとえばVEGF(10ng/mL)、血清(5%)(VEGFをブロック/阻害する可能性のある化合物を含むまたは含まない)を含む基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。22時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略/移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動/侵略が計量された。
本分析において、VEGFは、内皮細胞の移動を大幅に増加させたが、これは、D1によって強力にブロックされた。5nMのD1で、VEGFの刺激による内皮細胞の移動は、84%ブロックされた(図16参照)。25nMのD1では、移動はほぼ完全にブロックされた。他の実験において、KDRの阻害剤として知られるSU−1498((E)−3−(3,5−Diisopropyl−4−hydroxyphenyl)−2−[(3−phenyl−n−propyl)aminocarbonyl]acrylonitrile]が、本分析で試験された。3ミリモルのSU1498は、VEGFの誘発による移動を、D1ほどにはブロックしなかった(3ミリモルで47%をブロックした)。D7(下記に構造を示す)は、50nMで、VEGFの刺激による移動を、本質的に完全に阻害した。本分析において、VEGFの代わりに血清を用いると、非常に強力な誘引剤となる。しかし、血清による効果は、D1ではあまり減少しなかった。このことは、D1は、VEGFの誘発による内皮細胞の移動を、特異的に阻害するということを示している。
SnCl2・H2O(20mg)を、1mLの1N塩酸に溶解し、この溶液10μLを、1mLの水に10mgのCaNa2DTPA・2.5H2O(Fluka)に溶解することにより調製した、1mLのDTPA溶液に加えた。錫DTPA溶液の pHは、1N水酸化ナトリウムを使用してpH6〜8に調整された。50μgのP12−P(Ac−AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK(PnAO6−NH−(O=)C(CH2)3C(=O)−JJ)−NH2)の入った50μLの10%DMFを、20μLの99mTcO4 −(2.4〜4mCi、Syncor)に混合し、続いて100μLの錫Sn−DTPA溶液を加えた。室温で30分後、放射線化学的純度(RCP)は、93%であった。生成物は、Supelco DiscoveryC16アミドカラム(4×250mm、5μmの孔サイズ)の上で、(A)1g/L酢酸アンモニウムを入れた水、(B)アセトニトリルの水性/有機の勾配を使用して流量0.5mL/分で溶出されて、精製された。以下の勾配が使用された:30.5%B〜35%Bに30分、70%Bに至るまで10分。21.2分の保持時間で溶出した化合物が、1%のアスコルビン酸および0.1%HSAを含む500μLの50mMクエン酸塩緩衝液(pH5.2)の中に集められ、アセトニトリルは、Speed Vacuum(Savant)を使用して除去された。精製後、化合物は>98%のRCPを有していた。
50μgのP12−XDT(Ac−AGPTWCEDDWYYCWLFGTJK(JJ−DOTA)−NH2)が入った50μLの10%DMFを、111InCl3(50μL、400μCi、Mallinckrodt)および100μLの0.2M酢酸アンモニウムまたはpH5.3のクエン酸緩衝液に混合した。85℃で45分加熱された後、HPLCを使用して測定された放射線化学的純度(RCP)は、44%〜52.2%の範囲にあった。111Inで標識された化合物は、VydacC18カラム(4.6×25cm、5ミクロンの孔サイズ)を使用して、以下の条件で、標識されなかったリガンドから分離された。:水相、1g/Lの酢酸アンモニウム(pH6.8);有機相、アセトニトリル。勾配:有機23%〜25%まで30分、有機30%まで2分、10分間の維持。化合物は、維持時間20.8分で溶出し、1%のアスコルビン酸および0.1%のHSAを含む200μLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.2)の中に集められ、アセトニトリルは、Speed Vacuum(Savant)を使用して除去された。精製後、化合物は>93%のRCPを有していた。
ヒスチジン緩衝液は、濃縮水酸化アンモニウムでヒスチジン(Sigma)の0.1M溶液をpH6.25に調整することにより調製された。酢酸アンモニウム緩衝液は、濃縮塩酸(J.T.Baker,Uitra Pure)を使用して、酢酸アンモニウム(99.99%、Aldrich)の0.2M溶液をpH5.5に調整することにより調製された。高純度111InCl3(100μL、1.2mCi、Mallinckrodt)が、D4(50%DMF、10%DMSO、20%アセトニトリルおよび20%水の200につき200μg)に加えられ、続いて300μLのヒスチジン緩衝液が追加された。最終的なpHは5.5であった。85℃で45分間、反応混合物を培養した後、RCPは20%であった。
ジイソプロピルアミンを使用して予めpH8.5〜9.0に調整された30μLのDMFに入ったD5(200μg)を、蒸発されて乾燥された1mCiのモノ−ヨウ化125IBolton−Hunter試薬(NEX−120、Perkin−Elmer)に加えた。ガラスビンはシェイクされ、氷の上で30分間、時々揺らしながら培養された。30分経過後、RCPは23%であった。125I−D5(以下に示す)は、HPLCにより、VydacC18カラム(4.6×250mm、5ミクロンの孔サイズ)を使用して、流量1mL/分で、以下の条件で精製された。水相:0.1%TFAの水;有機相:0.085%TFAのアセトニトリル。勾配:有機30%〜36%まで30分、有機60%まで5分、5分間維持。化合物は、1%のアスコルビン酸および0.1%のHSAを含む、200μLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.2)の中に集められた。アセトニトリルは、Speed Vacuum(Savant)を使用して除去された。結果として得られた化合物は、97%のRCPを有していた。
D11(0.05NのNH4OH/10%EtOHに入った5μLの〜1μg/μL溶液)を、80μLの0.2MのNaOAc緩衝液pH5.6が入れられたガラス挿入マイクロガラスビンに加えた。十分な177Luが、リガンドを運ぶために加えられた。Lu割合は2:1(1−5mCi)まで。ガラスビンは、クリンプ封止され、100℃で15〜20分間加熱され、5分間冷却され、3μLの1%Na2EDTA・2H2Oが入った水で処理された。全ての反応混合物は、Supelco Discovery RPアミドC16カラム(4mm×250mm×5μm)の上に注入された。以下のHPLC条件が使用された:カラム温度=50℃。溶媒A=H2Ow/0.1%TFA。溶媒B=ACNw/0.085%TFA。勾配は、0.6/0.25mL/分A/B=0分〜0.5/0.4mL/分A/B=60分。D11のための維持時間は〜40分;177Lu−D11 1334のための維持時間は〜42分であった。放射能ピークは、pH5.3で、0.1%のヒト血清アルブミン断片Vおよび1.0%アスコルビン酸を含む0.7mLの0.05クエン酸緩衝液内に集められ、混合物は、Savant Speed Vacで遠心沈降され、有機溶媒が除去された。80%を超える放射化学的純度が得られた。
SnCl2・2H2O(20mg)を、1mLの1N塩酸に溶解し、この溶液10μLを、1mLの水に10mgのCaNa2DTPA・2.5H2O(Fluka)に溶解することにより調製した、1mLのDTPA溶液に加えた。D12(100μLの50%DMFに入れられた100μg)を、75μLの0.1M、pH9のリン酸塩緩衝液および60μLの99mTcO4 −(2.4から4mCi、Syncor)に混合し、続いて100μLの錫のSn−DTPA溶液を加えた。40℃で10分後、放射化学的純度(RCP)は16%であった。生成物は、Supelco DiscoveryC16アミドカラム(4×250mm、5μmの孔サイズ)の上で、(A)0.1%TFAの入った水および、(B)0.085%TFAの入ったアセトニトリルの水性/有機の勾配を使用して、流量0.7mL/分で溶出され、精製された。以下の勾配が使用された:30%B〜42%Bが10分、70%Bに至るまで10分。37.1分の維持時間で溶出した化合物は、0.2%HSAを含む500μLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.2)の中に集められ、アセトニトリルは、Speed Vacuum(Savant)を使用して除去された。精製後、化合物は、>90%のRCPであった。
SnCl2・2H2O(20mg)を、1mLの1N塩酸に溶解し、この溶液10μLを、1mLの水に10mgのCaNa2DTPA・2.5H2O(Fluka)に溶解することにより調製した、1mLのDTPA溶液に加えた。D14(100μLの50%DMFに入れられた100μg)を、50μLの99mTcO4 −(6mCi、Syncor)、および125μLの0.1M、pH9のリン酸塩緩衝液に混合し、続いて100μLの錫のSn−DTPA溶液を加えた。40℃で10分後、放射化学的純度(RCP)は21%であった。生成物は、VydacペプチドC18カラム(4.6×250mm)の上で、(A)0.1%TFAの入った水および、(B)0.085%TFAの入ったアセトニトリルによる水性/有機の勾配を使用して、流量1mL/分で溶出され、精製された。以下の勾配が使用された:30%B〜45%Bが40分。34.9分の維持時間で溶出した化合物は、0.2%HSAを含む500μLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.3)の中に集められ、アセトニトリルは、Speed Vacuum(Savant)を使用して除去された。精製後、化合物は、92.5%のRCPであった。
本発明の 125 I−標識ヘテロ多量体とKDR−トランスフェクト細胞との結合
125I−標識D5が、KDR−トランスフェクト293H細胞と結合する能力を試験するために、実験が行われた。この実験では、様々な量の125I−標識D5(1〜4Ci/ml、125I−Bolton−Hunter試薬で標識、HPLCで精製)が、96ウェルのプレート内で、室温で1時間、偽−トランスフェクトおよびKDR−トランスフェクト293H細胞に培養された。KDR−トランスフェクト細胞への結合に、血清が及ぼす効果を評価するため、
結合は、40%のマウス血清を伴う場合と、伴わない場合とで実行された。未結合の化合物を洗浄した後、各ウェル内の細胞を0.5NのNaOHで溶解し、溶解物をガンマカウンターで計側した。
ペプチドヘテロ二量体(D6、以下に示す)は、実施例9において前述したように、グルタル酸bis−NHSエステルを用いて調製された。このヘテロ二量体は、Biacoreを用いてKDR−Fcとの結合を試験され、親和定数は、以下のように測定された。
RLFc2KDR−Fc=1607
RLFc3KDR−Fc=3001
RLFc4KDR−Fc=6319
実験は、PBS緩衝液(5.5mMのリン酸塩、pH7.65、0.15Mの塩化ナトリウム+0.005%のP−20(v/v))内で実施された。D6は、PBS内で250nMに希釈され、また、125、62.5、31.3、15.6、7.8および3.9nMの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。すべてのサンプルは、二重に注入された。会合のため、Kinjectプログラムを使用して、ペプチドを12.5分間、20μL/mimで注入した。10分間の解離を行った後、残ったペプチドは、50mMのNaOH+1MのNaCLを、75μL/mimで12秒間急速に注入することより、KDR表面から引き剥がされた。センサ質量は、BLA評価ソフトウェア3.1、およびシグマプロット6.0の双曲線二重矩形回帰方程式使用して、分析された。ヘテロ二量体の定常状態結合親和力(KD)が、3つすべてのKDR不動化濃度において、測定された(表7)。
シリーズ2: w/VEGF(30ng/mL)
1.標準的な媒体:RPMI+10%FCS+1%抗生物質+1%l−グルタミン+0. 4%BBE
2.負の制御1:RPMI(真性飢餓)
3.負の制御2:RPMI+0.1%BSA+1%l−グルタミン
4.正の制御:抗−VEGF10μg/mlの入ったRPMI+0.1%BSA+1%l−グルタミン
5.0.1μg/mlKDRペプチドの入ったRPMI+0.1%BSA+1%l−グルタミン
6.10μg/mlKDRペプチドの入ったRPMI+0.1%BSA+1%l−グルタミン
プロトコル
1)細胞を、48時間、様々な条件で培養する。
2)10μLのBrdU希釈液(EBMに1:100)を、24時間で、各ウェルに加える。
3)さらに24時間、培養する。
4)培養媒体を、吸い出す。
5)100μLのFixDenatを、各ウェルに加え、室温で30分間、培養する。
6)FixDenat溶液を捨てる。
7)100μLの抗体−溶液(PBS1%BSAおよび抗−BrdU PO)を、各ウェルに加える。
8)室温で90分間、培養する。
9)PBSにより、200μL/ウェル、5分で、3回、洗浄する。
10)基質溶液(TMB)を加え、10〜30分間、培養する。
11)全てをフレキシブルプレートに移す。
12)2MのH2SO4、25μL/ウェルを、加えることにより、反応を止める。
13)反応終了後、5分以内に、450nmで吸光度を読む。
注: バックグラウンド結合は、制御細胞(完全な媒体で培養された;EBM+BulletKit)の4つのウェル内から抗−BrdU抗体を除外し、BrdUに晒されていない細胞を完全に標識することにより、測定された。
BIAcore分析−ペプチド二量体D1およびD7のネズミKDR−Fcとの結合
BIAcoreを用いて、ペプチド二量体D1(P12−GおよびP6−Dの切形によるヘテロ二量体)およびD7(P5−DおよびP6−Dによるヘテロ二量体)の、ネズミKDR−Fcに対する結合定数を測定した。
3つの密度の遺伝子組み換え型のネズミKDR−Fcが、標準的なアミンカップリング処置(0.5mg/mL溶液、1:100または1:40希釈、50mM酢酸塩、pH6.0)によって、C5センサーチップのデキストラン表面に、交差結合した。フローセル1は、参考引き算に用いるため、活性化され、次にブロックされた。最終的な不動化レベルが、得られた:
RLFc2KDR−Fc=2770
RLFc3KDR−Fc=5085
RLFc4KDR−Fc=9265
実験は、PBS緩衝液(5.5mMのリン酸塩、pH7.65、0.15Mの塩化ナトリウム)+0.005%のP−20(v/v))内で実施された。P12−G(制御用)は、PBS内で125nMに希釈され、また、62.5、31.3、15.6、7.8および3.9nMの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。D1およびD7は、PBS内で50nMに希釈され、また、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78および0.39nMの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。すべてのサンプルは、二重に注入された。会合のため、kinjectプログラムを使用して、ペプチドを3分間、30μL/mimで注入した。10分間の解離を行った後、残ったペプチドは、50mMのNaOH+1MのNaCLを、75μL/mimで12秒間急速に注入することより、KDR表面から引き剥がされた。
結合親和力と生物学的能力の相違 生体外分析による検証
以下の実験は、ヘテロ多量体が、同じ標的に対して同様の結合親和力を有する単量体のペプチドよりも、遙かに大きな生物学的能力を発揮するということを示した。
293H細胞は、KDRcDNAでトランスフェクトされるか、実施例6に記述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。細胞は、PG−1(Ac−ERVTTCWPGEYGGVECYSVAY−NH2)(SEQ ID NO:30)またはD1(300、30、3および0.3nMで)の存在下、または不在下、125I−VEGFで培養された。細胞を洗浄した後、結合放射活性をガンマカウンターで計量した。VEGFの結合阻害率が、式[(Y1−Y2)×100/Y]を用いて計算された。ここで、Y1は、ペプチド不在下のKDRトランスフェクト293H細胞への特異的結合であり、Y2は、ペプチドという競合者の存在下におけるKDRトランスフェクト293H細胞への特異的結合である。KDRトランスフェクト293H細胞への特異的結合は、偽-トランスフェクト293H細胞への結合を、KDRトランスフェクト293H細胞への結合から差し引くことにより算出した。
血清を欠いたHUVECが、1つのウェルにつき100,000細胞、BD Fibronecin−coated FluoroBlokの24−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。濃度増加を伴うPG−1またはD1の存在下または不在下におけるVEGF(10ng/mL)を、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。22時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略/移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動/侵略が計量された。VEGFの刺激による移動は、VEGFの不在下で測定された基礎的移動を差し引くことにより得られた。
図26に示されるように、PG−1およびD1は、KDR−トランスフェクト293H細胞への結合に関し、ほぼ同じくらい優秀に、125I−VEGFと競い合った。このことは、PG−1およびD1は、同等の結合親和力、およびVEGFがKDRへ結合するのを阻害する同等の能力を有するということを示している。
PG−1およびD1が、共に、125I−VEGFの結合ブロックする同程度の能力を有している(図26)という事実にもかかわらず、内皮細胞移動分析で検証されたように(図27)、ヘテロ二量体のD1は、単量体のPG−1よりも、遙かによくVEGFの生物学的効力をブロックすることができた。62.5nMまで、PG−1が、VEGFの刺激による移動に何の効力も有さなかったのに対し、D1は、50nMで、VEGFの刺激による移動を、完全にブロックした。これらのデータは、リガンドがその受容体に結合するのを阻害する能力を、単量体が同等に有している場合であっても、ヘテロ多量体の方が、より有効にリガンドの生物学的活性をブロックする、ということを示している。
本発明のTc−標識ヘテロ二量体のKDR−トランスフェクト293H細胞との結合
本実施例においては、KDR−トランスフェクト293H細胞を用いて、Tc−標識D10がKDRと結合する能力が判定された。結果は、Tc−標識D10が、偽−トランスフェクト293H細胞よりも、遙かによくKDR−トランスフェクト293H細胞と結合し、この結合力は、40%のマウス血清の存在下においても維持される、ということを示した。さらに、Tc−標識D10の誘導体であり、そのアミノ酸配列をスクランブルしたD18は、KDR−発現細胞に対して、何の親和力も有さないことがわかった。このことは、D10がKDR−発現細胞に対して特異性を有するということを示している。
99mTc−D10の調製:
SnCl2・2H2O(20mg)を、1mLの1N塩酸に溶解し、この溶液10μLを、1mLの水に10mgのCaNa2DTPA・2.5H2O(Fluka)に溶解することにより調製した、1mLのDTPA溶液に加えた。D10(100μLの50%DMFに入れられた100μg)を、75μLの0.1M、pH9のリン酸塩緩衝液、および50μLの99mTcO4 −(2.4から5mCi、Syncor)に混合し、続いて100μLの錫のSn−DTPA溶液を加えた。室温で15分後、放射化学的純度(RCP)は72%であった。生成物は、Supelco DiscoveryC16アミドカラム(4×250mm、5μmの孔サイズ)の上で、(A)0.1%TFAの入った水および、(B)0.085%TFAの入ったアセトニトリルによる水性/有機の勾配を使用して、流量0.7mL/分で溶出され、精製された。以下の勾配が使用された:30%B〜42%Bが36分、70%Bに至るまで10分。32分の維持時間で溶出した化合物は、0.2%HSAを含む500μLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.2)の中に集められ、アセトニトリルは、Speed Vacuum(Savant)を使用して除去された。精製後、化合物は、>90%のRCPであった。
SnCl2・2H2O(20mg)を、1mLの1N塩酸に溶解し、この溶液10μLを、1mLの水に10mgのCaNa2DTPA・2.5H2O(Fluka)に溶解することにより調製した、1mLのDTPA溶液に加えた。D18(100μLの50%DMFに入れられた100μg)を、50μLの0.1M、pH9のリン酸塩緩衝液、および90μLの99mTcO4 −(14mCi、Syncor)に混合し、続いて100μLの錫のSn−DTPA溶液を加えた。反応は、37℃で20分間、温められた。全ての反応混合物は、Vydac218TP54C18カラム(4.6×250mm、5μmシリカ)の上に注入され、(A)0.1%TFAの入った水および、(B)0.085%TFAの入ったアセトニトリルによる水性/有機の勾配を使用して、流量1.5mL/分で溶出された。以下の勾配が使用された:32%〜39%Bが30分、80%Bに至るまで2分。遊離リガンドが、19分の維持時間で溶出した。24分で溶出した複合体は、0.1%HSAおよび1%アスコルビン酸を含む500μLの50mMクエン酸緩衝液(pH5.3)の中に集められた。アセトニトリルおよび過剰のTFAは、SpeedVacuum(Savant)を40分間使用して除去された。精製後、化合物は、93%のRCPであった。
293H細胞は、実施例6に記述したプロトコルを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒/透明96-ウェルプレート(Becton Dikinson #354640)内で実施された。プレートの半分(48ウェル)の細胞は、偽-トランスフェクト(DNA無しで)され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に80〜90%が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでない場合は、分析は中止された。
opti−MEMIは、Invitrogen(cat.♯11058−021)から得られ、ヒト血清アルブミン(HSA)は、Sigma(cat.♯A−3782)から得られた。0.1%のHSAを伴うopti−MEMIを調製するために、0.1%w/vのHSAをopti−MEMIに加え、室温で20分間かき混ぜ、0.2μMのフィルターを使用して濾過殺菌した。
Tc−標識D10およびD18のストック溶液を、0.1%のHSAを伴ったopti−MEMIの中で希釈し、Tc−標識のヘテロ二量体の最終濃度が、それぞれ、1.25、2.5、5.0および10.0μCi/mLである溶液を得た。希釈液の第2のセットは、希釈剤として、40%のマウス血清/0.1%のHSAを伴ったopti−MEMIの混合液を用いて調製された。
細胞は、トランスフェクトの24時間後、分析で使用する細胞を準備するため、0.1%のHSAを伴った室温の100μLのopti−MEMIで、1回洗浄された。洗浄後、0.1%のHSAを伴ったopti−MEMIをプレートから取り除き、代わりに、1.25、2.5、5.0および10μCi/mLのTc−標識D10またはD18(上述の2つの希釈溶液を用いて調製した)を70μL加えた。各希釈液が、偽−トランスフェクトおよびKDR−トランスフェクト細胞の3つの別個のウェルに加えられた。室温で1時間培養した後、100μLの冷たい結合緩衝液(0.1%のHSAを伴ったopti−MEMI)で、プレートを5回洗浄した。100μLの溶解補助溶液(0.5NのNaOH)を、各々のウェルに加え、7℃で10分間、プレートを培養した。ピペットを上下に動かすことにより、各ウェル内の溶解補助溶液を混ぜ合わせ、1.2mL管に移した。100μLの溶解補助溶液で、各ウェルを1回洗浄し、この洗液を、対応する1.2mL管に加えた。その後、各1.2mL管は、15.7mm×10cm管に移され、LKB Gamma Counterで計数された。
KDR−トランスフェクト293H細胞を用いて、Tc−標識D10およびD18がKDRと特異的に結合する能力が判定された。図28Aに示されるように、Tc−標識D10は、偽−トランスフェクト293H細胞と比較して、遙かによくKDR−トランスフェクト293H細胞と結合した。マウス血清の存在下では、幾分かは結合が阻害されたものの、40%のマウス血清の存在下および不在下において、ほぼ同様の結合を見せた。このTc−標識ヘテロ二量体のKDR発現細胞に対する特異的結合の総数は、Tc−標識単量体ペプチド(実施例5)の特異的結合総数を、遙かに上回った。一方、D18は、偽−トランスフェクト細胞に対しても、KDR−発現細胞に対しても、何の親和力も示さなかった。このことは、D1がKDR−発現細胞に対して特異性を有するということを示している。
Lu−標識ヘテロ二量体のKDR−トランスフェクト293細胞との結合
本実施例においては、KDR−トランスフェクト293H細胞を用いて、Lu−標識D13がKDRと結合する能力が判定された。結果は、Lu−標識D13が、偽−トランスフェクト293H細胞よりも、遙かによくKDR−トランスフェクト293H細胞と結合し、この結合力は、40%のマウス血清の存在下においても維持される、ということを示した。
177Lu−D13の調製:
D13(306μg)を、〜450μLの円錐挿入部を伴った2mLのオートサンプラーガラスビンに加え、0.01N NH4OH(50μL)に溶解した。ここに、安定剤を含む300μLの0.5M酢酸アンモニウムを加えた。177LuCl3のアリコートが6.8μL入った0.05Nの塩酸(39.3mCi)を加え、ガラスビンをクリンプ封止し、37℃で15分間温め、〜5分冷やし、1%Na2EDTA・2H2Oの入った10μLの水を加えた。反応混合物の350μLのアリコートを、Supelco Discovery RFアミドC16カラム(4mm×250mm×5μm)の上に注入した。以下のHPLC条件が使用された:カラム温度=37℃。試薬A=2g/LのNH4OAc緩衝液を含むpH7.0のH2O。試薬B=80%ACN/20%のH2O。勾配は、0.56/0.24mL/分A/B=0分〜0.47/0.33mL/分A/B=30分。D13のための維持時間は〜28分で、177Lu−D13のための維持時間は〜29分であった。放射能ピークは、安定剤を含む1mLの緩衝液に集められ、最終のpH=7.6が、水酸化ナトリウムで調整された。これを、Speed Vaccuum(Savant)で〜40分間、遠心沈降してACNを除去した。単離された生成物のRCPは86%であった。
293H細胞は、実施例6に記述したプロトコルを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒/透明96-ウェルプレート(Becton Dikinson #354640)内で実施された。プレートの半分(48ウェル)の細胞は、偽-トランスフェクト(DNA無しで)され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に80〜90%が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでな
された。プレートの半分(48ウェル)の細胞は、偽-トランスフェクト(DNA無しで)され、
い場合は、分析は中止された。
0.1%のHSAを伴ったopti−MEMIは、実施例18と同様に、調製された。
Lu−標識D13ストック溶液を、0.1%のHSAを伴ったopti−MEMIの中で希釈し、標識されたヘテロ二量体の最終濃度が、それぞれ、1.25、2.5、5.0および10.0μCi/mLである溶液を得た。希釈液の第2のセットは、希釈剤として、40%のマウス血清/0.1%のHSAを伴ったopti−MEMIの混合液を用いて調製された。
本分析は、Tc−標識ヘテロ二量体の代わりに、Lu−標識D13を用いたことを除いて、実施例18に詳細したのと同様に行われた。
一時的にトランスフェクトされた293H細胞を用いて、Lu−標識D13がKDRと特異的に結合する能力が判定された。図29に示されるように、Lu−標識D13は、偽−トランスフェクト293H細胞と比較して、遙かによくKDR−トランスフェクト293H細胞と結合した。マウス血清の存在下では、幾分かは結合が阻害されたものの、40%のマウス血清の存在下および不在下において、ほぼ同様の結合を見せた。
腫瘍マウスにおけるLu−標識ヘテロ二量体による放射線治療
本実施例においては、腫瘍を植え付けたPC3細胞のヌードマウス内における増殖を、Lu−標識D13が阻害する能力について検証する。
177Lu−標識D13は、実施例19と同様に調製された。
供給者の指示通りに増殖させた、ATCCからのPC3細胞が、ヌードマウスの肩甲骨の間の皮下に注射された。腫瘍が100〜400mm3に達したとき、12匹のマウスに500マイクロキュリーのLu−標識D13を静脈注射し、その成長をその後18日間モニターした。20%以上の体重を失った場合、または腫瘍が2000mm3を超えた場合に、マウスは犠牲にされた。処置を施したマウスにおける腫瘍の増加を、未処置のヌードマウス(PC3腫瘍を移植)37匹における腫瘍増加の平均と比較された。
本実験において処置された12匹のマウスのうちの6匹において、処置をしていない腫瘍マウスと比較して、著しいまたは完全な腫瘍増殖の遅延が見られた(図30)。このことは、実験が行われた条件下において、D13は、PC13腫瘍の増加を遅延させる効果を有することを示している。
KDR/VEGF複合体バインダーとの結合のための細胞に基づく分析
本実験においては、KDR/VEGF複合体−結合ペプチドが、選択的にKDR/VEGF複合体と結合する能力を検証する。
本分析に使用する試薬は、指摘された場合を除き、実施例5と同様に調製された。
ビオチニル化ペプチドP30−XB、P31−XB、P32−XBおよびビオチニル化非結合制御ペプチドが、50%のDMSO内で1.25μMのストック溶液を調製するために使用された。33.33nMの125I−ストレプトアビジンのストック溶液は、Amershamから購入した。13.33nMのI−125ストレプトアビジン/100nMのVEGFのストック溶液は、850mlのI−125ストレプトアビジンを、10μMのVEGF22μlおよびM199媒体1275μlと混ぜ合わせることにより調製した。同じ方法で、もう1つのストック溶液を用意したが、こちらには、VEGFを加えなかった。13.33nMのペプチド−125I−ストレプトアビジン複合体溶液±VEGFを調製するために、500μlの125I−ストレプトアビジン(VEGFを伴う、または伴わない)ストック溶液(最後のステップで調製された)が、1.25μMのペプチド溶液(P30−XB、P31−XB、P32−XB、または制御ペプチド)24μlと混合された。混合液を、回転装置上で、4℃で60分間培養し、続いて、50μlのソフトリリース・アビジン−sepharose(ddH2O内の50%のスラリー)を加えて過剰なペプチドを除去し、さらに30分間の培養を、4℃で回転装置上で行った。最後に、12,000rpmの遠心分離を室温で5分間行うことにより、ソフトリリース・アビジン−sepharoseを沈殿させ、得られた上澄みを、分析に使用した。
ペプチド/中性アビジンHRPのKDR−トランスフェクト細胞との結合
本分析では、制御ペプチドおよび被験ペプチド(P30−XB、P31−XB、P32−XB)と、125I−ストレプトアビジンとの複合体(上述のように調製)が、VEGFの存在下または不在下において、一時的にKDRをトランスフェクトした293H細胞と結合する能力を試験した。P30−XBと125I−ストレプトアビジンとの複合体は、VEGFの存在下、偽−トランスフェクト細胞と比較して、KDR−トランスフェクト細胞と特異的に結合した(図31A)が、VEGFを省略した場合はそうではなかった(図31B)。またP30−XBは、蛍光偏光およびSPR(BiaCore)分析で試験したペプチドの中で、最良のKDR/VEGF複合体バインダーであった。表9、U.S.S.N.第60/360,851号、U.S.S.N.第60/440,441号、および、本明細書に参照としてその全内容が組み込まれる同時係属中の「KDR and VEGF/KDR Binding Peptides and Their Use in Diagnosis and Therapy」と題する本願と同日出願のU.S.S.N.第 号を、参照されたい。この実施例は、ペプチド(P30−XB)が、細胞表面に発現したKDR/VEGF複合体と特異的に結合できるということを示している。したがって、診断または治療のために、生体外および生体内で、KDR/VEGF複合体を標的とするために、このペプチドを使用できる可能性がある。KDR/VEGF結合ペプチドは、細胞表面に発現したすべてのKDRを探知するわけではなく、機能的で活動的なKDR受容体のみを探知するので、腫瘍、転移腫瘍、糖尿病性網膜症、乾癬および関節疾患などにおける活発な血管新生を探知し、かつ/または治療するのに有益である。さらに、これらのペプチドは、KDR/VEGF複合体と結合するその他のペプチドと同様に、本発明のヘテロ多量体に、有益に含めることができる。
以下の実験は、VEGFの誘発による培養HUVECの移動を、ヘテロ二量体D24およびD26がブロックする能力を判定した。そして、D26に用いらる糖鎖付加および/または独自のスペーサー構造が、その能力を高めることを実証した。
血清を欠いたHUVECが、1つのウェルにつき100,000細胞、BD fibronectin−coated FluoroBlokの24−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。D24またはD26の存在下または不在下におけるVEGF(10ng/mL)を、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。22時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略/移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動/侵略が計量された。VEGFの誘発による移動は、すべての実験条件につき、ウェルの下部チェンバーに基礎媒体のみをおいた場合の移動を、差し引くことにより計算された。
VEGFは、本分析において、内皮細胞の移動を大幅に増加させたが、これは、D24およびD26の両者によって、強力にブロックされた(図32)。D26は、24よりも10倍強力であった(IC50それぞれ0.5nMおよび5nM)。このことは、D26における糖鎖付加および/または独自のスペーサー特性が、D26のKDRへの結合能力、およびVEGFの効力をブロックする能力を高めた、ということを示している。
以下の実験は、ペプチドTKPPR(KDRを介して、VEGFの効力を高めるVEGF受容体であるNP−1と結合する)の多量体構造であるTK−1(構造を以下に示す)が、VEGFの誘発による培養HUVECの移動の阻害(D6によってもたらされる))を、高める能力について判定した。
血清を欠いたHUVECが、1つのウェルにつき100,000細胞、BD fibronectin−coated FluoroBlokの24−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。様々な濃度のD6、または100nM(不変)のTK−1(WO01/91805A2の記述に従い合成)と組み合わせた様々な濃度のD6の存在下または不在下におけるVEGF(10ng/mL)を、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。22時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略/移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動/侵略が計量された。VEGFの誘発による移動は、すべての実験条件につき、VEGFの不在下において観察された移動を、差し引くことにより計算された。
VEGFは、本分析において、内皮細胞の移動を大幅に増加させた。これはD6(IC50およそ12.5nM)によって強力にブロックされたが、100nMのTK−1単独ではブロックできなかった(図33)。しかしながら、驚くべきことに、TK−1は、D6(IC50およそ2.5nM)と同時に本分析に使用すると、D6の能力をおよそ10倍高めることができた。このことは、TK−1に見られるTKPPR配列(または類似形)を含む化合物は、たとえばD6のような、KDRとの結合においてVEGFと競合する化合物の能力を、高めるために使用できるということを示している。さらに、TKPPR
配列(または類似形)同様、D6に見られるペプチド配列(または類似形)を、1度以上繰り返して有するヘテロ多量体は、本分析において、より高い活動性を有する可能性がある。(TKPPR構造の調製については、本願に参照としてその内容を組み込むU.S.S.N.09/871,974を参照)。
KDRへの結合機能を有するP13−XB断片の同定
以下の実験は、P13−XBの断片が、KDRへの結合機能を維持することができるということを示す。
293H細胞は、KDRcDNAでトランスフェクトされるか、実施例6に記述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。P12−XBを含むストレプトアビジン−HRP複合体は、実施例6と同様に調製された。ストレプトアビジン−HRP複合体と細胞の結合は、実施例6と同様に、0〜250nM、または0〜100nMの競合ペプチド、すなわちP13−XB、F1、F2およびF3の存在下、5.5nMの複合体濃度で行われた。各実験条件において、特異的結合を測定した後、それぞれのペプチドにつきIC50を測定した。
表9に示されるように、F1は、非標的Gly−Gly−Gly−Lys配列(ファージ提示法データに基づいて合成されるほとんどの単量体ペプチドに付加される)、およびAsp−Trp−Tyr−Tyrの結合モチーフ(P12−XBとも共通する)だけで構成されているが、これは、1マイクロモル以下で、P12−XBストレプトアビジン−HRP複合体の結合をIC50阻害できる最も小さな断片であった。驚くべきことに、P13−XB由来のより大きな断片F2は、1マイクロモルでは、充分に複合体の結合を阻害できなかった。しかしながら、可溶化モチーフ(Gly−Arg−Gly)3を後者のペプチドに加えてF3とすると、175nMでIC50複合体の結合に対抗することができた。このことは、Asp−Trp−Tyr−Tyrモチーフを含むP13−XBの断片は、KDRへの結合機能を維持するということを実証している。したがって、標的と結合する能力を維持するこれらの断片(または、本願に開示されたその他の結合ポリペプチドの断片)を、ペプチド全体の代わりに、本発明のヘテロ多量体に使用することが可能である。
単一の標的分子上の2つのエピトープを標的とするヘテロ二量体は、標的分子上の2つのエピトープの1つとしか結合しないホモ二量体よりも、優れた結合力を有する。
以下の実験は、ペプチド増殖因子またはシトキンの生物学的効力をブロックする能力において、ヘテロ二量体構成は、ホモ二量体に優るということを実証するものである。
血清を欠いたHUVECが、1つのウェルにつき100,000細胞、BD fibronectin−coated FluoroBlokの24−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。増加する濃度のホモ二量体D8またはヘテロ二量体D17の存在下または不在下におけるVEGFを、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。22時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略/移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動/侵略が計量された。
VEGFは、本分析において、内皮細胞の移動を大幅に増加させた。これはD17によって強力にブロックされたが、D8ではブロックできなかった(図34)。D17は、VEGFの誘発による移動を、およそ250nMでIC50ブロックしたのに対し、D8は、800nMでも、移動に対し充分な効力を発揮できなかった。D8は、P13−XBにおける標的配列をすべて有しており、一方D17は、KDRに対する親和性の低い(実施例24で検証されたように)P13−XB配列の断端型(図3に示されるように)しか有していないという事実にもかかわらず、である。したがって、同じ標的分子上の2つの異なるエピトープと結合する能力を有するヘテロ二量体は、同じ、またはより強力な標的配列を有するホモ二量体よりも、効果的にリガンドが標的分子に結合するのをブロックすることができる。
ジスルフィド結合をアミド結合に置き換えた環状ペプチドの調製
ポジション6および13におけるCys残基を、一方はカルボキシル基側鎖(GluまたはAsp)、もう一方はアミノ基側鎖[LysまたはDpr(2,3−diaminopropanoic酸)]からなる一対のアミノ酸で置換して、P12−G(非−標的GGGK配列を伴うP12)のジスルフィド結合置換類似型を調製した。P12−G(ジスルフィド結合形成)に含まれるのと同じ配列ポジションを包含するこの環は、側鎖アミノ部および側鎖酸部の縮合によって形成され、P12−Gのジスルフィド結合のように残基6と13とをブリッジする、ラクタム環として得られた。
環状ラクタムペプチド−P33−Lの代表的な合成例
樹脂結合ペプチド1の合成
1の合成は、方法5を用いて、0.25mmol規模で行われた。ペプチド樹脂1は、洗浄され、手作業によるさらなる誘導体化のために、乾燥された。
1(240mg、0.06mmol)にNMM(N−メチル・モルホリン)/HOAc/DMF1/2/10(v/v/v)(65mL)が加えられた。パラジウムtris−triphenylphosphine[Pd(PPh3)4、554.4mg、0.48mmol]が加えられ、光を遮蔽して20時間シェイクされた。樹脂は、濾過され、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム(0.5g)/DIEA(0.5ml)/DMF(100mL)で洗浄され、最後にDMF(3×70mL)で洗浄された。この処置は、ラクタム形成反応を必要とするGlu6およびLys13のカルボキシル基およびアミノ基だけを、反応に晒すために行われた。樹脂上における2の環状化は、HATU(114mg、0.3mmol)、NMM(66μL、0.6mmol)およびDMF(10mL)を用いて、3時間で行われた。Kaiser試験によって、環状化の完了がモニターされた。試薬Bを4時間用いて、ペプチド樹脂3からペプチドを切断した。樹脂は濾過され、濾過物は、ペースト状になるまで乾燥させた。粗製ペプチドをエーテルに沈殿させ、エーテルで2回洗浄した。環状ペプチドは、調製用逆相線状勾配HPLCによって、Water−YMC C−18カラム(250mm×30mm内径)を使用し、溶出液としてH2O内のCH3CN(共に0.1%のTFAを伴う)を用いて、精製された。生成物を含んだ留分の冷凍乾燥物は、8mgのP33−Lを産出した。P34−L、P35−L、P−36−LおよびP37−Lも、同様に調製された。
以下の実験は、P12−Gの化学的に反応するジスルフィド・ブリッジの代わりに用いられた、ラクタムP34−Lは、KDR結合機能を充分に維持するということを、実証した。
293H細胞は、KDRcDNAでトランスフェクトされるか、実施例6に記述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。P12−XBを含むストレプトアビジン−HRP複合体は、実施例6と同様に調製された。ストレプトアビジン−HRP複合体と細胞の結合は、実施例6と同様に、0〜250nMのP12−GまたはP34−Lの存在下、5.5nMの複合体濃度で行われた。各実験条件において、特異的結合を測定した後、それぞれのペプチドにつきIC50を測定した。
表11に示されるように、ジスルフィド・ブリッジの代わりにラクタムを含むP34−Lは、幾分かの親和性を失いはしたものの(IC50につき108nM、これに対しP12−Lは13nM)、KDRへの結合に関し、依然としてP12−XBストレプトアビジン−HRP複合体と対抗することができた。これらのラクタムペプチド(または、本願に開示された結合ポリペプチドの、同じように調製されたラクタム類似型)は、ジスルフィド・ブリッジを含むペプチドの代わりとして、本発明のヘテロ多量体に用いることができる。
3つの密度のcMet−Fc(R&D Systems)は、標準的なアミンカップリング処置(3μM溶液、1:100,1:50または1:20希釈、50mM酢酸塩、pH5.5)によって、C5センサーチップのデキストラン表面に、交差結合した。フローセル1は、参考引き算に用いるため、活性化され、次にブロックされた。最終的な不動化レベルが、得られた:
RLFc2KDR−Fc=2582
RLFc3KDR−Fc=5048
RLFc4KDR−Fc=9721
実験は、PBS緩衝液(5.5mMのリン酸塩、pH7.65、0.15Mの塩化ナトリウム)+0.005%のP−20(v/v)Tween−20)内で実施された。ペプチド二量体を、イオンを除いたH2Oに溶解し、1mg/mLの溶液とした。二量体は、PBS内で50nMに希釈され、また、25、12.5、6.25、および3.125nMの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。すべてのサンプルは、二重に注入された。会合のため、kinjectプログラムを使用して、二量体を3分間、30μL/mimで注入した。10分間の解離を行った後、残ったペプチドは、4MのMgCl2を、50μL/mimで2分間、急速に2回注入することより、cMet表面から引き剥がされた。センサ質量は、BLA評価ソフトウェア3.1を使用して分析された。
号の、表8に示されている。
生体外における細胞増殖分析
D6および関連する類似型が、VEGFの刺激による増殖を阻害する能力について、生体外での効力を判定するために、微小血管の内皮細胞(MVECs、Cascade Biologics、Portland、OR)を用いて、実験を行った。MVECs(継代培養2)を、90%の細胞密度まで発育させ、トリプシン化し、ゼラチンをコーティングした96−ウェルのマイクロタイター・プレート内で、4〜8×103細胞/ウェルの密度で培養した。培養から16〜24時間後、0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むがウシ胎仔血清を欠いた媒体で、細胞を1回洗浄した。BSAを含む新鮮な媒体が、各ウェルに加えられ、細胞はさらに24時間培養された。その後、BSAを含む新たな媒体(D6またはその他の試験物質を伴う、または伴わない)が加えられ、細胞は、さらに48時間37℃で培養された。媒体を取り除き、BSAを含む新たな媒体(BrdUを伴う、または伴わない)を加え、さらに24時間培養し、その後、製造者(Oncogene Cat♯QIA58)の指示に正確に従って、結合レベルを測定した。この結果は、図35に示されている。
生体内における腫瘍増殖の阻害
SW−480ヒト結腸癌細胞に対して、抗−血管新生機能を有すると考えられる試験化合物(二量体D6)の効力を、3つの濃度において、移植腫瘍モデルを用いて測定する方法を提供しつつ、実験状況を記述する。
結腸癌細胞SW−480(ATCC)は、4mMのL−グルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、50mg/mLのゲンタマイシン、250mg/mLのFungizoneおよび熱処理により不活性化したウシ胎仔血清10%を追加した、DulbeccoのModified Eagles Medium(DMEM)内で、95%の空気と5%の二酸化炭素下、37℃で培養された。
種/血統: ハツカネズミ、Crl:NU/NU−nuBRマウス(ヌードマウス)
性別: メス
年齢: 処置開始時において6〜8週間
体重範囲: 体重条件なし
出生地: Gnottobiotic Department at Charles River Laboratories, Wilmington, MA.
数: 本研究のため総数115匹の動物を入手し、注射し、そのうち90匹を研究に使用した。
耳タグ方式を用いて、マウスに一匹ずつ番号を付けた。さらに、檻にも、檻カードを付し、グループ番号、動物番号、研究番号およびIACUCプロトコル番号を記した。
動物は、Midrosoft Excel 97SR−1プログラムを用いて、任意に処置グループに割り当てられた。
マウスは、ガンマ線を照射した齧歯類用の食料を、好きなだけ与えて飼育た。また、水道水を殺菌し、ボトルとシッパー管で、好きなだけ与えた。
マウスは、半剛体のアイソレーターに、グループ毎に収容された。マウスは、5〜10匹用のそこの平らな檻に収容された。かごは、ガンマ線を照射した接触寝具を備えていた。それぞれの檻のマウスの数は、マウスの行動の如何により変更され、変更はアイソレーターの一覧表に記載された。収容檻は、「実験用動物の飼育および使用ガイド」(National Academy Press, Washington, D.C.,1996)およびその後の改訂版に定められた要件を満たした。
メスの胸腺欠損ヌードマウス(Crl:NU/NU−nuBR)、年齢6〜8週間が、本研究に使用された。総数115匹のマウスが、右側面胸部の皮下に、5×106のSW−480ヒト結腸癌細胞を注射された。腫瘍が、およそ150±75mgの目的のウィンドウサイズに達したとき、90匹のマウスが任意に選ばれ、9つのグループに分配された。化合物と媒介物は、腹腔内注射(IP)により、シスプラチンは、皮下注射(IV)により投与された。腫瘍の測定は、手持ち側径器を用いて、週に2回記録された。マウスは、毒性度、病的状態を毎日モニターされた。研究の最終段階において、二酸化炭素の過剰投与によりマウスを安楽死させ、細胞の収集のため検視した。
プロトコルに従い、目盛り付きの側径器で腫瘍の長さと幅を、週に2回研究期間を通じて測定した。測定は、少なくとも3〜4日の間隔を開けて行った。ただし、マウスを安楽死させ、測定を行う場合は、2日以内に測定を行うこともあった。腫瘍の重さは、次の式を用いて計算された:mg=(L×W2)/2。マウスは、グループの腫瘍の平均重量が2回続けて>1000mgになった場合か、腫瘍が潰瘍化し、マウスの移動能力や、食料や水を摂取する能力を損なった場合に、安楽死させた。
1. 予定外の安楽死:
研究中に、予定外の安楽死は、実施されなかった。
研究中に、マウスが死亡することはなかった。
1. 安楽死および検視の指示
グループ1、2、3、4および5(総数50)のマウスは、すべて、グループにおける腫瘍の平均サイズが、2回の測定で続けて>1000mgとなったとき、検視に服した。マウスの検視は、Charles River Laboratories Health Monitoring Laboratory(HM), Wilmington, MAに委ねた。すべてのマウスを、28日という試験物質の投与期間前の、研究日22日目に安楽死させた。試験物質で処置されたグループ3〜8において、腫瘍の平均サイズが、>1000mgに達したためである。すべてのマウスは、人道的に、二酸化炭素の吸入により安楽死させた。
周囲の組織および覆っている皮膚を取り除いて、腫瘍を取り出した。さらに、腎臓も収集した。腎臓部表面の異常は、すべて記載された。
A. 生存中の測定および観察:
1. 診断的観察、病的状態および死亡についての概要:
すべてのマウスは、外見は健康そうであり、研究期間中、正常の限界内にあった。また、試験化合物(D6)は、本研究におけるそれぞれの投与量において、毒性の兆候を示さなかった。
研究期間を通じて、すべてのマウスの触診可能な塊を触診し、腫瘍が成長していくのを確認した。予想通り、未処置のマウスおよび媒介物のみで処置したマウス(グループ1および2)において、腫瘍の成長は最も速く、研究日20日目前に、腫瘍の平均サイズが1000mgに達した。また、シスプラチンで処置マウス(グループ9)の腫瘍は、最も成長が遅く、研究終了日(22日目)の時点で、腫瘍の平均サイズは995mgであった。
本研究のデータは、使用されたモデルの正当性を証明するものであった。すなわち、負の制御であるグループ1および2、正の制御である9は、予想通りの結果を示した。
以下の実施例は、本発明のKDR−結合ヘテロ二量体と共役する超音波造影剤、および造影剤と共役したヘテロ二量体が、生体外においてKDR−発現細胞に、生体内において血管新生組織に、集中する能力について記述する。
200mgのDSPC(distearoylphosphatidylcholine)、275mgのDPPG.Na(distearoylphosphatidylglycerolナトリウムで塩)を、50mlのHexan/イソプロパノール(42/8)の中で60℃で可溶化した。溶液を、真空で蒸発させ、PEG−4000(35.046g)を脂質に加え、混合物を60℃の106.92gのブチルアルコールの中で、水浴で可溶化した。溶液を、1.5mlのガラスビンに詰めた。サンプルを素早く−45℃で凍らせ、冷凍乾燥させた。上部にできた空間の空気を、C4F10/空気(50/50)の混合物で置き換えてから、ガラスビンにキャップをし、クリンプした。冷凍乾燥させたサンプルを、ガラスビン毎に10mlの食塩水(0.9%−NaCl)で戻し、リン脂質安定マイクロバブル懸濁液を得た。
D23(P6の二量体構造およびP12派生の配列)を、上記のように調製したマイクロバブルと、以下の手順に従って共役させた。チオアセチル化ペプチド(200μg)を、20μlのDMSOに溶解し、その後1mlのリン酸緩衝食塩水(PBS)の中で希釈した。この溶液を、18mlのPBS−EDTA(10mM、pH7.5)内に分散したN−MPB−機能化マイクロバブルと混ぜ合わせ、2mlの脱アセチル化溶液(50mMのリン酸ナトリウム、25mMのEDTA、0.5Mのヒドロキシルアミン塩酸、pH7.5)を加えた。容器の上部にできた空間を、C4F10/空気(50/50)で満たし、混合物を、暗闇の中室温で2.5時間、緩やかに揺さぶりながら(回転ホイール)培養した。共役したバブルは、遠心分離器で洗浄された。同様に、D23を構成する単量体ペプチドも、別々に、上記の手順で調製された2つの異なるマイクロバブルと共役させた。
KDR−トランスフェクト293H細胞を用いて、本発明のヘテロ多量体構成物と共役させたリン脂質安定マイクロバブルが、KDR−発現細胞に結合する能力を判定した。
293H細胞は、実施例6に定めたように、KDR DNAでトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞を、上述のように調製したペプチド−共役マイクロバブルの懸濁液で培養した。トランスフェクト細胞を培養するために、小さなプラスチックのキャップを、1〜3.108のペプチド−共役マイクロバブルを含む懸濁液で満たし、キャップを裏返したThermanox(登録商標)カバースリップで覆い、トランスフェクト細胞が共役マイクロバブルと接触するようにした。室温でおよそ20分後、ピンセットでカバースリップを持ち上げ、PBS内で3回濯ぎ、顕微鏡で共役マイクロバブルとの結合を調べた。
デジタルカメラDC300F(Leica)を用いて映像を得て、映像化されたエリアにおける結合マイクロバブルに覆われた表面のパーセンテージを、ソフトウェアQWin(Leica Microsystem AG,Basel,Swizerland)を用いて測定した。表13は、本発明の標的マイクロ気泡とKDRトランスフェクト細胞との結合親和力(映像化された表面のカバー率として表される)を、同じマイクロ気泡と偽−トランスフェクト細胞との結合と比較した結果を示している。
P6派生の配列、およびP12派生の配列が、単量体として別々にリン脂質安定マイクロバブルに付加された場合、この結果物が、生体外において、KDRトランスフェクト細胞とバブルを結合させる程度は、それぞれ異なる(3.5%および16.8%)ものであった。それぞれのペプチド単量体を、同じ量ずつ加えて(ただし総ペプチド負荷は同じ)リン酸化安定型マイクロバブルを調製し、同じシステムで試験した場合、12.9%の結合が達成された。この結合は、2つの平均を少し上回るものであった。しかしながら、二量体D23において、結合は22.9%(同じペプチド負荷で)にまで増加した。これらの結果は、本発明のヘテロ多量体が、結合を増加させ、競合における対抗力を増加させるということを示している。
本発明のヘテロ多量体に共役させたリン脂質安定マイクロバブルが、血管新生組織に集中し、その映像を提供する能力を、周知の血管新生組織モデル(ラットMatIIIモデル)を用いて検証した。
ラットは、MatrigelまたはMatIII細胞の移植前に、Ketaminol(登録商標)/xylazine(Veterinaria AG/Sigma)(50/10mg/ml)の混合物を筋肉注射して麻酔した。映像化実験においては、同じ混合物、および50%のウレタン(1g/kg)を皮下注射することにより麻酔した。
13762MatBIIIに指定されたラット乳腺癌を、ATCC(CRL−1666)から入手し、McCoy’s 5a媒体+10%FCS.1%グルタミンおよび1%pen/strep(Invitrogen cat♯15290−018)の中で成長させた。懸濁液の中の細胞を、収集し、成長媒体の中で洗浄し、計量し、遠心分離し、再びPBSまたは成長媒体の中に、mlにつき1.107細胞懸濁した。腫瘍の誘発のため、0.1ml内の1×1066細胞が、麻酔をしたメスのFisher344ラットの乳房の脂肪体に、注射された。腫瘍は、通常、8日以内に5〜8mmの直径に成長する。
線状プローブを備えた超音波画像化システムATL HDI5000装置を用いて、腫瘍の画像化を行った。低い音響出力(M1=0.05)のB−モードのパルス反転を用いて、血管の内皮細胞内に発現したKDR受容体上に、マイクロバブルを共役したペプチドを蓄積させた。制御実験例として、非共役マイクロバブル、または非特異的ペプチドに共役させたマイクロバブルが、静脈内ボーラスで注入された。線状プローブが、腫瘍を移植したライン上の皮膚に直接取り付けられ、その後30分間、標的バブルの蓄積を続けた。
ここまで本発明を、好ましい実施例を参照に述べてきたが、当業者であれば、本発明の本質的特徴を理解することが容易であり、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を加えて、様々な用途および条件に適合させ得るであろう。また、当業者であれば、通常の創作の範囲内で、本明細書に記載した特定の実施例の等価物を、数多く認識し、実現し得るであろう。こうした等価物は、すべて、本発明の範囲内に包含される。
Claims (110)
- 同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくとも2つの結合部分からなる多価化合物。
- 前記化合物は、複数の結合部分からなる多量体化合物である、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物は、二量体化合物である、請求項1に記載の化合物。
- 結合部分の少なくとも1つは、ポリペプチドからなる、請求項1に記載の化合物。
- 結合部分のすべてが、ポリペプチドからなる、請求項4に記載の化合物。
- 化合物の標的に対する親和性は、ポリペプチドのいずれか1つの標的に対する親和性よりも、およそ60倍大きい、請求項5に記載の化合物。
- 化合物の標的に対する親和性は、ポリペプチドのいずれか1つの標的に対する親和性よりも、およを560倍大きい、請求項5に記載の化合物。
- 各々のポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12よりなる群から選択された、請求項4または5に記載の化合物。
- 各々のポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29よりなる群から選択された、請求項4または5に記載の化合物。
- ポリペプチドは、アミノ酸置換、アミド結合置換、D−アミノ酸置換、糖化アミノ酸、ジスルフィド模倣置換、アミノ酸転座、レトロインヴェルソペプチド、ペプトイド、レトロ−インヴェルソペプトイド、または合成ペプチドを有する、請求項8または9に記載の化合物。
- 標的は、タンパク質である、請求項1に記載の化合物。
- 標的は、受容体または受容体/リガンド複合体である、請求項1に記載の化合物。
- 結合部分は、タンパク質上の異なったエピトープと結合する、請求項11に記載の化合物。
- 結合部分は、受容体/リガンド複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項11に記載の化合物。
- 上記標的は、血管形成に関与する受容体である、請求項11に記載の化合物。
- 上記受容体は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である、請求項12に記載の化合物。
- 標的は、KDRまたはKDR/VEGF複合体からなる、請求項1に記載の化合物。
- 結合部分は、KDR/VEGF複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項17に記載の化合物。
- 上記標的は、増殖異常に関与する受容体である、請求項11に記載の化合物。
- 上記標的は、腫瘍上に発現した受容体である、請求項11に記載の化合物。
- 標的は、肝細胞増殖因子(HGF)受容体(cMet)またはHGF/cMet複合体からなる、請求項21に記載の化合物。
- 結合部分は、cMetまたはHGF/cMet複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項21に記載の化合物。
- 結合部分は、ポリペプチドからなる、請求項22に記載の化合物。
- 結合部分は、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12で構成される群から選択された、請求項18に記載の化合物。
- 結合部分は、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5からなる、請求項18に記載の化合物。
- 結合部分は、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29で構成される群から選択された、請求項22に記載の化合物。
- さらに、少なくとも1つの標識基または治療薬剤を含む、請求項1に記載の化合物。
- 標的が、KDRまたはKDR/VEGF複合体からなる、請求項27に記載の化合物。
- 結合部分は、KDRまたはKDR/VEGF複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項28に記載の化合物。
- 標的は、肝細胞増殖因子(HGF)受容体(cMet)またはHGF/cMet複合体からなる、請求項29に記載の化合物。
- 結合部分は、cMetまたはHGF/cMet複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項28に記載の化合物。
- 結合部分は、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9のシーケンスからなる、請求項27に記載の化合物。
- 結合部分は、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のシーケンスからなる、請求項27に記載の化合物。
- 結合部分は、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29で構成される群から選択された、請求項4または5に記載の化合物。
- 標識基または治療薬剤は、1つ以上の常磁性金属イオンまたは超常磁性微粒子、超音波造影剤、1つ以上の光標識物質、1つ以上の放射性核種を含む、請求項27に記載の化合物。
- 常磁性金属イオンは、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、Pr3+、Cr3+、Co3+、Fe3+、Ti3+、Tb3+、Nd3+、Sm3+、Ho3+、Er3+、Pa4+およびEu2+から選択された、請求項35に記載の化合物。
- さらに、キレート剤を含み、該キーレト剤は、1−置換1,4,7−トリカルボキシメチル1,4,7,10テトラアザシクロドデカン三酢酸(DO3A)である、請求項35に記載の化合物。
- さらに、ガドリニウム(III)を含む、請求項35に記載の化合物。
- 超音波造影剤は、フッ素化ガスを含んだリン脂質安定マイクロバブルまたはマイクロバルーンからなる、請求項35に記載の化合物。
- 標識基または治療薬剤は、さらにキレート剤を含む、請求項35に記載の化合物。
- キレート剤は、DTPA、DOTA、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAMまたはMECAMからなる、請求項40に記載の化合物。
- キレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸、テトラアザシクロドデカン三酢酸、またはこれらのカルボキシメチル置換誘導体からなる、請求項40に記載の化合物。
- 放射性核種は、、18F、124I、125I、131I、123I、77Br、76Br、99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Auまたは199Auである、請求項35に記載の化合物。
- 以下の構造から選択された構造を有する化合物をさらに含む、請求項43に記載の化合物。
ここで、XはCH2またはOであり、
Yは、C1-C10分岐性または非分岐性アルキル基、C1-C10分岐性または非分岐性ヒドロキシまたはポリヒドロキシアルキル基、もしくはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシポリアルコキシアルキル基からなる、C1-C10分岐性または非分岐性アルキル、アリール、アリロキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルまたはアラルキル基であり、Jは、C(=O)-、OC(=O)-、SO2-、NC(=O)-、NC(=S)-、N(Y)、NC(=NCH3)-、NC(=NH)-、N=N-、合成または天然アミノ酸に由来するホモポリアミドまたはヘテロポリアミンであり、nは1〜100である。 - 99mTc、186Reまたは188Reをさらに含む、請求項44または45に記載の化合物。
- 99mTcをさらに含む、請求項46に記載の化合物。
- 177Lu、90Y、153Sm、111Inまたは166Hoをさらに含む、請求項49、50または51に記載の化合物。
- 結合部分と標識基または治療薬剤との間に、さらにリンカーを含む、請求項27に記載の化合物。
- 前記リンカーは、置換アルキル基鎖、非置換アルキル基鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子またはこれらの組み合わせからなる、請求項53に記載の化合物。
- 治療薬剤は、生体活性剤、細胞毒性剤、薬物、化学療法剤または放射線治療剤を含む、請求項27に記載の化合物。
- 上記化合物は、D1、D4、D5、D6、D7、D10、D13、D17、D24、D26およびD31から選択された二量体からなる、請求項3に記載の化合物。
- マイクロバブルまたはマイクロバルーンと共役した請求項1〜41または46〜47のいずれかに記載の化合物からなる、診断用造影剤。
- 上記マイクロバブルまたはマイクロバルーンは、SF6 、フロンおよびペルフルオロカーボンで構成される群から選択された生体適合フッ素化ガスを含む、請求項66に記載の診断用造影剤。
- (a)請求項1〜48または53〜54のいずれかに記載された、化合物からなる調剤を、患者に投与するステップと、
(b)患者への投与後に、化合物を画像化するステップからなる、診断用画像化方法。 - 画像化ステップは、核磁気共鳴画像法、超音波画像法、光学的画像法、音ルミネセンス画像法、光音響画像法または放射性画像法からなる、請求項69に記載の方法。
- 投与ステップは、吸引、経皮吸収、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、または動脈内注射からなる、請求項69に記載の方法。
- 請求項49〜55のいずれかに記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、疾病の治療方法。
- 請求項28、29または32〜33のいずれかに記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、血管新生に関連する疾病の治療方法。
- 請求項30、31または34に記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、過剰増殖に関連する疾病の治療方法。
- 疾病は、新生腫瘍性増殖である、請求項73または74に記載の方法。
- 請求項1〜35のいずれかに記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、疾病の治療方法。
- 改良された結合親和力を有するヘテロ多量体化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)標的上の異なった結合部位に結合する2つ以上の結合部分を有する、標識化された化合物を調製するステップと、
(b)標識化された化合物を、標的と接触させるステップと、
(c)標識化された化合物の解離定数を測定するステップと、
(d)標識化された化合物の解離定数を、1つ以上の個々の結合部分の解離定数と比較するステップからなる方法。 - 上記化合物は、多数の結合部分を有するヘテロ多量体である、請求項77に記載の方法。
- 上記化合物は、ヘテロ二量体である、請求項77に記載の方法。
- 結合部分の少なくとも1つは、ポリペプチドからなる、請求項77に記載の方法。
- 標的は、タンパク質である、請求項77に記載の方法。
- 標的は、受容体または受容体/リガンド複合体である、請求項77に記載の方法。
- 結合部分は、タンパク質上の異なったエピトープと結合する、請求項77に記載の方法。
- 結合部分は、受容体または受容体/リガンド複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項77に記載の方法。
- 上記標的は、血管新生または過剰増殖に関与する受容体である、請求項77に記載の方法。
- 上記受容体は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である、請求項85に記載の方法。
- 標的は、KDRまたはVEGF/KDR複合体からなる、請求項82に記載の方法。
- 結合部分は、KDRまたはKDR/VEGF複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項87に記載の方法。
- 標的は、肝細胞増殖因子(HGF)受容体(cMet)またはHGF/cMet複合体からなる、請求項82に記載の方法。
- 結合部分は、cMetまたはHGF/cMet複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項89に記載の方法。
- 結合部分の少なくとも1つのシーケンスは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:12からなる、請求項77に記載の方法。
- 結合部分は、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、またはSEQ ID NO:29からなる、請求項77に記載の方法。
- 構成要素の結合部分の解離定数よりも、およそ20倍少ない解離定数を有する標識化されたヘテロ多量体化合物を、同定するステップをさらに含む、請求項78に記載の方法。
- 標的は、受容体または受容体/リガンド複合体である、請求項39に記載の化合物。
- 結合部分は、受容体または受容体/リガンド複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項94に記載の化合物。
- 上記標的は、血管新生に関与する受容体である、請求項95に記載の化合物。
- 上記受容体は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である、請求項96に記載の化合物。
- 標的は、KDRまたはKDR/VEGF複合体からなる、請求項97に記載の化合物。
- 結合部分は、KDRまたはKDR/VEGF複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項98に記載の化合物。
- 上記標的は、過剰増殖に関与する受容体である、請求項95に記載の化合物。
- 上記標的は、腫瘍上に発現した受容体である、請求項96または100に記載の化合物。
- 標的は、肝細胞増殖因子(HGF)受容体(cMet)またはHGF/cMet複合体からなる、請求項100に記載の化合物。
- 結合部分は、ポリペプチドからなる、請求項95に記載の化合物。
- ポリペプチドは、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12で構成される群から選択された、請求項103に記載の化合物。
- ポリペプチドは、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5で構成される群から選択された、請求項103に記載の化合物。
- ポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29で構成される群から選択された、請求項103に記載の化合物。
- 同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくともとも2つの結合部分からなる多量体化合物を合成する方法であって、該結合部分の少なくとも1つは、2本の側鎖の間にアミド結合を導入することにより形成された環状ポリペプチドからなる方法。
- 同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくともとも2つの結合部分からなる多量体化合物を合成する方法であって、該結合部分の少なくとも1つは、ポリペプチドと、セリン、トレオニンおよびホモセリンで構成された群から選択された1つ以上の糖化アミノ酸リンカーとからなる方法。
- D1、D4、D5、D9、D10、D11、D12、D13、D14、D15、D16、D17、D18,D19、D20、D21、D22、D23、D24、D25、D26およびD27で構成される群から選択された、同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくともとも2つの結合部分からなる多量体を合成する方法であって、実施例9に記載のステップからなる方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36082102P | 2002-03-01 | 2002-03-01 | |
US44020103P | 2003-01-15 | 2003-01-15 | |
PCT/US2003/006656 WO2003084574A1 (en) | 2002-03-01 | 2003-03-03 | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005519980A true JP2005519980A (ja) | 2005-07-07 |
Family
ID=28794312
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003581813A Pending JP2005519980A (ja) | 2002-03-01 | 2003-03-03 | 治療および診断用途の多価構成物 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1482987B1 (ja) |
JP (1) | JP2005519980A (ja) |
AU (1) | AU2003228276B8 (ja) |
CA (1) | CA2477935C (ja) |
ES (1) | ES2523654T3 (ja) |
HK (1) | HK1071999A1 (ja) |
SI (1) | SI1482987T1 (ja) |
WO (1) | WO2003084574A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014020872A (ja) * | 2012-07-17 | 2014-02-03 | Shimadzu Corp | アフィニティ支持体及びそれを用いた物質の捕捉方法 |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7666979B2 (en) * | 2002-03-01 | 2010-02-23 | Bracco International B.V. | Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same |
US7211240B2 (en) * | 2002-03-01 | 2007-05-01 | Bracco International B.V. | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
CA2513044A1 (en) | 2002-03-01 | 2004-08-05 | Dyax Corp. | Kdr and vegf/kdr binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
US8623822B2 (en) | 2002-03-01 | 2014-01-07 | Bracco Suisse Sa | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
US7261876B2 (en) | 2002-03-01 | 2007-08-28 | Bracco International Bv | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
US7794693B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-09-14 | Bracco International B.V. | Targeting vector-phospholipid conjugates |
US20050250700A1 (en) * | 2002-03-01 | 2005-11-10 | Sato Aaron K | KDR and VEGF/KDR binding peptides |
MXPA05007730A (es) | 2003-02-04 | 2006-01-31 | Bracco Int Bv | Agentes de contraste para ultrasonido y proceso para la preparacion de los mismos. |
US9750821B2 (en) | 2003-12-22 | 2017-09-05 | Bracco Suisse S.A. | Gas-filled microvesicle assembly for contrast imaging |
CN1960707B (zh) | 2004-06-03 | 2012-11-14 | 博莱科瑞士股份有限公司 | 用于治疗和/或诊断用途的脂质集合体 |
CN101005858A (zh) | 2004-08-18 | 2007-07-25 | 伯拉考开发股份有限公司 | 用于反差成像的充气微泡组合物 |
EP1714642A1 (en) | 2005-04-18 | 2006-10-25 | Bracco Research S.A. | Pharmaceutical composition comprising gas-filled microcapsules for ultrasound mediated delivery |
DK2359864T3 (da) * | 2005-12-09 | 2019-07-08 | Bracco Suisse Sa | Målrettende vektor-phospholipid-konjugater |
ATE469660T1 (de) | 2006-09-05 | 2010-06-15 | Bracco Research Sa | Gasgefüllte mikrovesikel mit polymer- modifizierten lipiden |
WO2008075192A2 (en) | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Bracco International Bv | Targeting and therapeutic compounds and gas-filled microvesicles comprising said com ounds |
EP2346532B1 (en) | 2008-10-07 | 2020-10-07 | Bracco Suisse SA | Targeting construct comprising anti-polymer antibody and microvesicles binding to the same |
WO2011080401A1 (en) * | 2009-12-31 | 2011-07-07 | Licentia Ltd | Receptor tyrosine kinase-binding compositions |
US10010630B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-07-03 | Bracco Suisse S.A. | Gas-filled microvesicles |
DK3233136T3 (da) | 2014-12-18 | 2019-05-20 | Bracco Suisse Sa | Formulering med målrettede gasfyldte mikrovesikler |
US11717570B2 (en) | 2019-05-15 | 2023-08-08 | Bracco Suisse Sa | Gas-filled microvesicles |
US20200360289A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Bracco Suisse Sa | Freeze-dried product and gas-filled microvesicles suspension |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001052875A1 (en) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vegf-d/vegf-c/vegf peptidomimetic inhibitor |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69900468T2 (de) * | 1998-05-19 | 2002-07-18 | Avidex Ltd | Löslicher t-zell rezeptor |
ES2320367T3 (es) * | 1999-04-16 | 2009-05-21 | Genentech, Inc. | Variantes del factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares y sus usos. |
EP2014310B8 (en) * | 2002-03-01 | 2012-12-26 | Dyax Corp. | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
US7211240B2 (en) * | 2002-03-01 | 2007-05-01 | Bracco International B.V. | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
CA2513044A1 (en) * | 2002-03-01 | 2004-08-05 | Dyax Corp. | Kdr and vegf/kdr binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
-
2003
- 2003-03-03 ES ES03726024.7T patent/ES2523654T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-03 JP JP2003581813A patent/JP2005519980A/ja active Pending
- 2003-03-03 SI SI200332395T patent/SI1482987T1/sl unknown
- 2003-03-03 WO PCT/US2003/006656 patent/WO2003084574A1/en active Application Filing
- 2003-03-03 AU AU2003228276A patent/AU2003228276B8/en not_active Expired
- 2003-03-03 EP EP03726024.7A patent/EP1482987B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-03 CA CA2477935A patent/CA2477935C/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-06-03 HK HK05104699.1A patent/HK1071999A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001052875A1 (en) * | 2000-01-18 | 2001-07-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vegf-d/vegf-c/vegf peptidomimetic inhibitor |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014020872A (ja) * | 2012-07-17 | 2014-02-03 | Shimadzu Corp | アフィニティ支持体及びそれを用いた物質の捕捉方法 |
JP2015529322A (ja) * | 2012-07-17 | 2015-10-05 | ダニエル・ジェイ・カポン | 親和性支持体およびその同じものを用いて物質を捕捉するための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1071999A1 (en) | 2005-08-12 |
EP1482987A4 (en) | 2007-03-07 |
AU2003228276B2 (en) | 2009-09-03 |
CA2477935C (en) | 2015-01-06 |
EP1482987B1 (en) | 2014-08-13 |
EP1482987A1 (en) | 2004-12-08 |
SI1482987T1 (sl) | 2014-12-31 |
CA2477935A1 (en) | 2003-10-16 |
AU2003228276A1 (en) | 2003-10-20 |
ES2523654T3 (es) | 2014-11-28 |
AU2003228276B8 (en) | 2010-02-18 |
WO2003084574A1 (en) | 2003-10-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7854919B2 (en) | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications | |
US9056138B2 (en) | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications | |
JP5039075B2 (ja) | Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 | |
US9629934B2 (en) | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy | |
US7666979B2 (en) | Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same | |
JP2005519980A (ja) | 治療および診断用途の多価構成物 | |
US20050250700A1 (en) | KDR and VEGF/KDR binding peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050808 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060302 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060330 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081125 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090223 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090302 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090305 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090312 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090525 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090721 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091015 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091029 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100406 |