JP5039075B2 - Ｋｄｒおよびｖｅｇｆ／ｋｄｒ結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は２００２年３月１日に出願された米国仮出願第６０／３６０，８５１号および
２００３年１月１５日に出願された米国仮出願第６０／４４０，４１１号に基づく利益を
主張する。

発明の背景
成長中の胚では、主要な血管ネットワークは脈管形成と呼ばれる過程において中胚葉細
胞のｉｎ ｓｉｔｕでの分化により確立される。しかし胚の脈管形成後、胚または成体に
おけるその後のすべての新しい血管の生成は血管新生と呼ばれる過程における現存の血管
からの新しい毛細血管の成長または分離により支配される（Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９９６．Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，４９：１３８−１６２；Ｒｉｓａｕ，
Ｗ．，１９９７．Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６７１−６７４）。血管新生は胚の成長ならび
に正常組織の成長および修復に関与するだけでなく、女性の生殖周期、妊娠の確立および
維持、ならびに創傷および骨折の修復にも関与する。正常な個体において起こる血管新生
に加えて、血管形成事象は多数の病的過程、とりわけ腫瘍増殖および転移、ならびに糖尿
病性網膜症、乾癬、および関節疾患のような、血管増殖が増大する他の状態にも関与する
。過形成性から腫瘍形成性増殖への腫瘍の転換に血管新生は非常に重要であるため、血管
新生の阻害が有効な癌治療となっている（Ｋｉｍ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｎａｔ
ｕｒｅ，３６２；８４１−８４４）。

腫瘍誘発血管新生は腫瘍細胞による前血管新生増殖因子の産生に依存し、それは現存す
る血管を静止および安定に保つ傾向がある他の影響力を圧倒する（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．
ａｎｄＦｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９９６．Ｃｅｌｌ，８６：３５３−３６４）。これらの
前血管新生因子の中で最も性状が解析されているものは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で
ある（Ｎｅｕｆｅｌｄ、Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９９．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１３：９−２
２）。

ＶＥＧＦは低酸素およびいくつかの他の刺激に反応して多様な細胞型により本来産生さ
れる。また、多くの腫瘍も多量のＶＥＧＦを産生し、および／または近くの間質細胞を誘
導してＶＥＧＦを産生させる（Ｆｕｋｕｍｕｒａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｃｅｌ
ｌ，９４：７１５−７２５）。ＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａとも表し、５種の異なるスプライ
スアイソフォームの１２１、１４５、１６５、１８９、および２０６アミノ酸として合成
される。ＶＥＧＦ_１２１およびＶＥＧＦ_１６５はとりわけ腫瘍において産生される主要な
型である（Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，上記を参照されたい）。ＶＥ
ＧＦ_１２１はＶＥＧＦ遺伝子のエキソン６および７によりコードされる塩基性ドメインを
欠失し、ＶＥＧＦ_１６５とは異なり、ヘパリンまたは細胞外マトリックスに結合しない。

ＶＥＧＦファミリーメンバーは主に受容体チロシンキナーゼに結合することにより作用
する。一般に、受容体チロシンキナーゼは１以上の具体的な成長因子に結合できる細胞外
ドメイン、膜貫通ドメイン（通常αヘリックス）、膜近接ドメイン（ここで受容体は、た
とえばリン酸化により調節されてよい）、チロシンキナーゼドメイン（受容体の触媒成分
）、および多くの受容体においてチロシンキナーゼの基質の認識および結合に関与するカ
ルボキシ末端尾部を有する糖タンパク質である。これらはＶＥＧＦに結合することが既知
の３種の内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ：ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥ
ＧＦＲ−２（ＫＤＲまたはＦｌｋ−１）、およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）である。Ｆ
ｌｔ−１およびＫＤＲは主要な高親和性ＶＥＧＦ受容体として同定されている。Ｆｌｔ−
１はＶＥＧＦに対してより高い親和性を有するが、ＫＤＲは内皮細胞でより豊富に発現す
る（Ｂｉｋｆａｌｖｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
，１４９：５０−５９）。さらに、ＫＤＲは血管新生反応を支配すると考えられ、そのた
めより高い治療的および診断的関心事である（Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ ｅｔ ａｌ．，１９
９９，上記を参照されたい）。ＫＤＲの発現は、新生血管、とりわけ強い血管新生反応を
誘発する腫瘍において非常にアップレギュレーションされている（Ｖｅｉｋｋｏｌａ，Ｔ
．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：２０３−２１２）。

ＫＤＲはその成熟型では１３３６アミノ酸からなる。グリコシル化のために、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲル上で約２０５ｋＤａの見かけの分子量として移動する。ＫＤＲはその細胞外
ドメイン中に７つのイムノグロブリン様ドメインを含み、そのうちはじめの３つがＶＥＧ
Ｆ結合において最も重要である（Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，上記を
参照されたい）。ＶＥＧＦ自体は同時に２つのＫＤＲ分子に結合することができるホモ二
量体である。その結果として、２つのＫＤＲ分子が結合時に二量体になり、自己リン酸化
され、はるかに活性になる。次に上昇したキナーゼ活性はＶＥＧＦのＫＤＲ特異的生物学
的作用が介在するシグナル伝達経路を開始する。

上記より、ＫＤＲのＶＥＧＦ結合活性がｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生に重要であるだけ
でなく、内皮細胞においてＫＤＲアップレギュレーションを検出し、またはＶＥＧＦ／Ｋ
ＤＲ結合複合体を検出する能力が、悪性腫瘍増殖検出のような具体的な診断的適用を含む
、血管新生の検出またはモニタリングにおいてきわめて好都合であろうということを理解
することができる。また、腫瘍部位に殺腫瘍剤もしくは血管新生阻害剤を導くか、または
ＫＤＲ、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、または血管新生アゴニストを所望の部位に標的化するような
治療的適用において好都合であろう。

発明の概要
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する内皮細胞上の主要受容体、すなわち
血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２、キナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）および
胎児肝キナーゼ−１（Ｆｌｋ−１）としても公知）を検出し標的にすること、およびＶＥ
ＧＦおよびＫＤＲにより形成される複合体を画像化し標的にすることに有用なポリペプチ
ドおよび組成物に関する。血管新生にＶＥＧＦおよびＫＤＲが関与することは、たとえば
新生物性腫瘍のような血管新生の重要な部位の画像化、たとえば放射線治療薬を含む治療
薬のような物質のそのような部位への標的化、および不適切な血管新生に関連したある種
の疾患状態を含む、そのような状態の治療に、本発明のＶＥＧＦおよびＫＤＲ結合ポリペ
プチドをとりわけ有用にする。

ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する一群のポリペプチド（本明細書では「
ＫＤＲ結合ポリペプチド」または「ＫＤＲ結合部分」およびその相同体として表す）が見
出されている。そのようなＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドは、血管新生
部位において濃縮され、新生物性腫瘍増殖部位を含む活発な血管新生部位を検出し、そし
て画像化するための手段を提供するであろう。そのようなＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ
結合ポリペプチドは、たとえば血管新生を阻害するかまたは促進するための新規治療薬を
提供する。たとえば造影剤としてまたはＫＤＲもしくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ−指向性治療薬
の融合パートナーとしてのそのようなポリペプチドの調製、使用およびスクリーニングが
本明細書に詳細に記載される。

たとえば血管新生を検出し、部位を限定し、測定し、あるいは阻害するための改善され
た物質および方法に関する必要性に答えるために、本発明者らは驚くべくことにＫＤＲま
たはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に特異的に結合する、非天然の７種のポリペプチドファミリ
ーを現在発見している。そのようなポリペプチドの適切な標識は、たとえばＫＤＲ発現内
皮細胞またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体を提示する細胞に高濃度で結合することができる検
出可能な造影剤を提供し、血管新生特異的造影剤を提供する。したがって、本発明のＫＤ
ＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドは、そのような血管新生関連疾患の検出およ
び診断に使用することができる。また、ＶＥＧＦ阻害剤または殺腫瘍剤のような効果的な
物質とそのようなポリペプチドとの結合または融合は、たとえば活発な血管新生部位に結
合物または融合物を「指向」させ、それにより血管新生に関連した病的状態を治療するた
めの効果的な手段を提供することによって病的腫瘍を治療するために使用することができ
る。

本発明はＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドに関し、単量体としての、ま
たは多量体もしくはポリマー構築物での単一結合ポリペプチドの使用、および多量体もし
くはポリマー構築物での１以上の本発明の結合ポリペプチドの使用を含む。本発明に記載
の結合ポリペプチドは、ポリペプチド結合部位を保持するＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ
複合体、またはそのフラグメントを結合し、検出し、または単離することが好都合である
任意の適用において有用である。本明細書に開示された結合ポリペプチドのとりわけ好都
合な用途はｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生を画像化する方法にある。該方法は、血管新生部
位の検出に本発明に記載の特異的結合ポリペプチドの使用を必要とし、ここで結合ポリペ
プチドは核磁気共鳴画像用（ＭＲＩ）造影剤、Ｘ線造影剤、放射線医薬品造影剤、超音波
造影剤、および光造影剤を含む、造影剤として使用するために検出可能に標識されている
。

本明細書に開示されたＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの他の好
都合な使用は、血管新生部位またはＫＤＲを発現する他の組織に、治療薬（治療、放射線
治療、または細胞毒性効果を提供可能な化合物を含む）、または治療薬（薬物、遺伝物質
などを含む）の送達ビヒクルを標的化することである。

２以上のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドを含む構築物は、対応する単
量体結合ポリペプチドに比較して、標的分子への改善された結合能力を示す。たとえば、
実施例５に示すように、本明細書に提供されたＫＤＲ結合ポリペプチドの四量体構築物は
、ＫＤＲを形質移入した２９３Ｈ細胞に結合するための改善された能力を示した。単一分
子構築物中に２以上の結合ポリペプチドを組合わせると、Ｋ_Ｄの減少により示されるよう
に、単量体結合ポリペプチド以上に構築物の結合活性を改善すると考えられる。

さらに、本明細書に示すように、ＫＤＲおよび／またはＫＤＲ／ＶＥＧＦの異なるエピ
トープに特異的な２以上の結合ポリペプチドを含む構築物（たとえば、「ヘテロマー」ま
たは「ヘテロ多量体」構築物、米国特許出願第６０／４４０，２０１号、およびそれと共
に出願された代理人整理番号５０２０３／０１００４号を有する出願を参照されたい。そ
れぞれの内容は本明細書に援用される）を作製した。本明細書に提供される２以上の結合
ポリペプチドを含む構築物は、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ上の複数の部位をブロック
することが予想される。ヘテロマー構築物は、対応する単量体、および同一結合ポリペプ
チドの複数のコピーを含む多量体構築物によりも優れた結合能力を示す。さらに、異なる
エピトープに特異的な２以上の結合ペプチドと対照ペプチドを一緒に含むヘテロマー構築
物もＫＤＲを形質移入した２９３Ｈ細胞に効率的に結合することが可能であった。したが
って、異なるエピトープを認識する２以上の結合ポリペプチドの含有は、Ｋ_Ｄの減少によ
り示されるように、標的分子への構築物の結合活性をさらに改善する。

本明細書に提供される結合ポリペプチドのヘテロマー構築物は受容体チロシンキナーゼ
機能を阻害するための改善された能力を示す。本明細書に記載された実施例に基づき、Ｋ
ＤＲおよび／またはＫＤＲ／ＶＥＧＦの異なるエピトープに特異的な少なくとも２種の結
合ポリペプチドを含む本発明の二量体および他の多量体構築物は、受容体チロシンキナー
ゼの機能を阻害すると予想される。とりわけ、そのような構築物はＶＥＧＦ−２／ＫＤＲ
、ＶＥＧＦ−１／Ｆｌｔ−１およびＶＥＧＦ−３／Ｆｌｔ−４の機能を阻害すると予想さ
れる。

本発明の目的のために、受容体チロシンキナーゼ機能は：受容体のオリゴマー化、受容
体リン酸化、受容体のキナーゼ活性、下流シグナル伝達分子の動員、遺伝子の誘導、細胞
増殖の誘導、細胞遊走の誘導、またはその組み合わせのいずれか１つを含むことができる
。たとえば、本明細書に提供される結合ポリペプチドのヘテロマー構築物は、ＫＤＲ受容
体のＶＥＧＦ誘導リン酸化の阻害により示されるように、ヒト内皮細胞においてＶＥＧＦ
誘導ＫＤＲ受容体活性化を阻害する。さらに、本明細書に提供される結合ペプチドのヘテ
ロマー構築物はＶＥＧＦで刺激される内皮細胞遊走を阻害する。本明細書に示すように、
単一結合構築物によるＫＤＲ上の２以上の異なるエピトープへの標的化は受容体機能を阻
害する構築物の能力を著しく改善する。受容体活性をブロックする能力が弱い結合ペプチ
ドでさえ、ＶＥＧＦ誘導受容体機能をブロックする能力が改善されたヘテロマー構築物を
作製するために使用することができる。

したがって、本発明は２以上の結合ポリペプチドを含む構築物について記載する。一つ
の態様では、多量体構築物は単一結合ポリペプチドの２以上のコピーを含む。他の態様で
は、本発明の多量体構築物は、２以上の結合ポリペプチドを含み、構築物中の少なくとも
２つの結合ポリペプチドはＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ上の異なるエピトープに特異的
である。これらの構築物は本明細書で「ヘテロマー構築物」「ヘテロ多量体」などとも呼
ばれる。また、本発明の構築物は関連のないまたは対照のペプチドを包含してもよい。該
構築物は２以上、３以上、または４以上の結合ポリペプチドを包含してもよい。本明細書
に提供される教示に基づき、当業者は本明細書に提供される結合ポリペプチドを多量体構
築物に組み立て、改善された特性、たとえば標的分子を結合するための改善された能力、
または受容体チロシンキナーゼ機能を阻害するための改善された能力を有する多量体構築
物を選択することができる。そのような改善された特性を有する多量体構築物は本発明に
包含される。

コンセンサス配列１〜１４）は表１〜７に示される具体的ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤ
Ｒ結合ポリペプチドに基づいて決定されている。具体的態様において、本発明のＫＤＲお
よびＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドは１以上のこれらの配列を含む。そのような好ま
しいＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、以下のコンセンサス配列
１〜５から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成る、不変システイン残
基間に環状構造またはループ構造を形成する可能性を有するポリペプチドを包含する：
コンセンサス配列１：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ
_１０−Ｃｙｓ−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４（ＴＮ８）、ここで、
Ｘ_１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔ
ｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_２はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔ
ｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_３はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐもし
くはＶａｌであり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_６はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり
；
Ｘ_７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_８はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔ
ｒｐもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_９はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔ
ｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１０はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１２はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１３はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、
Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒであり；そして
Ｘ_１４はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列２：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ
_１０−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｃｙｓ−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８（ＴＮ１２）
、ここで、
Ｘ_１はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙ
ｒ（好ましくはＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒ）であり；
Ｘ_２はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔ
ｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐ）であ
り；
Ｘ_３はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｒｐ）で
あり；
Ｘ_５はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔ
ｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｕ、ＩｌｅまたはＴｙｒ）であり
；
Ｘ_６はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓ
ｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＧｌｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ_７はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_８はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐ
ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｎまたはＳｅｒ）であり
；
Ｘ_９はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐ
ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｐ）であり；
Ｘ_１０はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくは
ＬｙｓまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ_１１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、
Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｙまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ_１２はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｒｐまたはＴｈｒ）であ
り；
Ｘ_１３はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、
Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｕまたはＴｒｐ）であり；
Ｘ_１４はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＰｈｅ）であり；
Ｘ_１６はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＡｓｐ）であり；
Ｘ_１７はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、
ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＰｒｏまたはＴｙｒ）であり；そして
Ｘ_１８はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、
ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｎ、ＰｒｏまたはＴｒｐ）である、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列３：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｇｌｙ−Ｘ_９−
Ｃｙｓ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３（ＴＮ７）、ここで、
Ｘ_１はＧｌｙもしくはＴｒｐであり；
Ｘ_２はＩｌｅ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＴｈｒもしくはＴｒｐであり；
Ｘ_５はＡｓｎ、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；
Ｘ_６はＧｌｕ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_７はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＭｅｔもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_９はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＬｙｓもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１１はＡｒｇ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１２はＧｌｕ、ＨｉｓもしくはＳｅｒであり；そして
Ｘ_１３はＧｌｕ、Ｇｌｙ、ＴｒｐもしくはＴｙｒである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列４：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ
_１０−Ｘ_１１−Ｃｙｓ−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５（ＴＮ９）、
ここで、
Ｘ_１はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＰｒｏもしくはＴｙｒ（好ましくはＴ
ｙｒ）であり；
Ｘ_２はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏもしくはＴｒｐ（好ましくはＧｌｙまたはＴｒｐ
）であり；
Ｘ_３はＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｈｒもしくはＴｒｐ（好ましくはＰｒｏ）であり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＶａｌ（好ましくはＬｙｓ）で
あり；
Ｘ_６はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＨｉｓもしくはＬｅｕであり；
Ｘ_７はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ま
しくは好ましくはＭｅｔ）であり；
Ｘ_８はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒもしくはＴｈ
ｒであり；
Ｘ_９はＨｉｓ、ＰｒｏもしくはＴｒｐ（好ましくはＰｒｏ）であり；
Ｘ_１０はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＨｉｓま
はｔｒｐ）であり；
Ｘ_１１はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒもしくはＴｒｐであり；
Ｘ_１３はＡｌａ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒ（好ましくはＴｒｐ）であり
；
Ｘ_１４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好
ましくはＨｉｓ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ）であり；そして
Ｘ_１５はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｒｏもしくはＴｒｐ（好ましくは
Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ）である、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列５：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｃｙｓ−Ｘ_１７−Ｘ_１８−Ｘ_１９（
ＭＴＮ１３；配列番号１）、ここで、
Ｘ_１はＡｒｇ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＳｅｒもしくはＴｒｐであり；
Ｘ_２はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｈｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_３はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_５はＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_６はＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_７はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_８はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_１２はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＨｉｓもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１３はＧｌｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_１４はＧｌｕ、Ｌｙｓ、ＰｈｅもしくはＳｅｒであり；
Ｘ_１５はＧｌｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１７はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；
Ｘ_１８はＡｒｇ、Ａｓｎ、ＳｅｒもしくはＴｙｒであり；そして
Ｘ_１９はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＴｙｒである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する。

ＴＮ８ライブラリー（コンセンサス配列１を参照されたい）から単離されたポリペプチ
ドのさらなる解析は、好ましい結合ポリペプチドのサブファミリーを明らかにし、それら
は以下のコンセンサス配列６、７および８に記載される：
コンセンサス配列６：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｔ
ｙｒ−Ｃｙｓ−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４、ここで、
Ｘ_１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、ＳｅｒもしくはＶａｌであり
；
Ｘ_２はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＴｈｒもしくはＳｅｒ（好ましくはＡｓｎ、Ａ
ｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ）であり；
Ｘ_３はＩｌｅ、ＬｅｕもしくはＴｒｐであり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＬｙｓもしくはＳｅｒ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_６はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＴｈｒもしくはＶａｌ（好ましくはＡｓｐまた
はＧｌｕ）であり；
Ｘ_７はＡｓｐもしくはＧｌｕであり；
Ｘ_８はＴｒｐもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_９はＴｈｒもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ）であり；
Ｘ_１２はＧｌｕ、Ｍｅｔ、ＰｈｅもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、
またはＴｙｒ）であり；；
Ｘ_１３はＩｌｅ、ＬｅｕもしくはＭｅｔであり；そして
Ｘ_１４はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｈｅもしくはＴｈｒ（好ましくはＴｈｒまたはＬｅ
ｕ）である、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列７：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｇｌｙ−
Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｃｙｓ−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４（配列番号２）、ここで、
Ｘ_５はＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＨｉｓであり；
Ｘ_６はＨｉｓもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ）であり；
Ｘ_７はＩｌｅ、ＨｉｓもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_９はＩｌｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１０はＧｌｙもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１２はＡｓｐ、ＬｙｓもしくはＰｒｏであり；
Ｘ_１３はＧｌｎ、ＧｌｙもしくはＴｒｐであり；そして
Ｘ_１４はＰｈｅ、ＳｅｒもしくはＴｈｒである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列８：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｇｌｙ−
Ｘ_１０−Ｃｙｓ−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４、ここで、
Ｘ_１はＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ、（好ましくはＴｒｐ、
Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）であり；
Ｘ_２はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＶａｌ（好ましくはＶａｌ、Ｉｌｅ、ま
たはＬｅｕ）であり；
Ｘ_３はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｒｐもしくはＴｈｒ（好ましくはＧｌｕ、Ａｓｐまた
はＧｌｎ）であり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ま
しくはＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ_６はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔ
ｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_８はＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｈｒ、Ｓ
ｅｒまたはＡｓｐ）であり；
Ｘ_１０はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｒｇまたはＬｙｓ）であり；
Ｘ_１２はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、
ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ）で
あり；
Ｘ_１３はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒもしくはＴ
ｈｒであり；そして
Ｘ_１４はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒであ
る、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する。

ＴＮ１２ライブラリー（コンセンサス配列２を参照されたい）から単離されたポリペプ
チドのさらなる解析は、好ましい結合ポリペプチドのサブファミリーを明らかにし、それ
らは以下のコンセンサス配列９〜１２に記載される：
コンセンサス配列９：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｔｒｐ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｃｙｓ−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７(ＴＮ１１、すなわ
ちＴＮ１２ライブラリーから単離された１１量体結合体；配列番号３)、ここで、
Ｘ_１はＳｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＧｌｙ（好ましくはＳｅｒ）であり；
Ｘ_２はＡｒｇ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＴｒｐ（好ましくはＡｒｇ）であり；
Ｘ_３はＡｌａ、Ｇｌｕ、ＩｌｅもしくはＶａｌ（好ましくはＶａｌまたはＩｌｅ）であり
；
Ｘ_５はＡｌａ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ（好ましくはＴｒｐまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ_６はＧｌｕもしくはＬｙｓ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_７はＡｓｐ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｐ、ＴｒｐまたはＴｙｒ
）であり；
Ｘ_８はＰｈｅ、ＰｒｏもしくはＳｅｒ（好ましくはＳｅｒ）であり；
Ｘ_１２はＧｌｎもしくはＧｌｕ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_１３はＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１５はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅもしくはＴｙｒ（好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、
またはＬｅｕ）であり；
Ｘ_１６はＡｒｇ、ＧｌｙもしくはＰｒｏ（好ましくはＡｒｇ）であり；そして
Ｘ_１７はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｙｒ、
Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＶａｌ）である、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列１０：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｇｌｕ−Ｘ_７−Ｓｅｒ
−Ｘ_９−Ｓｅｒ−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８(
ＴＮ１２；配列番号４；)、ここで、
Ｘ_３はＧｌｙもしくはＴｒｐ（好ましくはＴｒｐ）であり；
Ｘ_５はＨｉｓもしくはＴｙｒ（好ましくはＨｉｓ、またはＴｙｒ）であり；
Ｘ_７はＨｉｓ、ＬｅｕもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_９はＡｓｐもしくはＬｅｕ（好ましくはＡｓｐ）であり；
Ｘ_１１はＧｌｙもしくはＶａｌ（好ましくはＶａｌ）であり；
Ｘ_１２はＴｈｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｈｒ）であり；
Ｘ_１３はＡｒｇもしくはＴｒｐ（好ましくはＡｒｇ）であり；
Ｘ_１６はＡｌａもしくはＶａｌ（好ましくはＶａｌ）であり；
Ｘ_１７はＡｓｐもしくはＰｒｏ（好ましくはＰｒｏ）であり；そして
Ｘ_１８はＧｌｙもしくはＴｒｐ（好ましくはＴｒｐ）である、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列１１：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−
Ｘ_１０−Ｇｌｙ−Ｘ_１２−Ｔｒｐ−Ｘ_１４−Ｃｙｓ−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８(ＴＮ１２
；配列番号５)、ここで、
Ｘ_１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、もしくはＳｅｒ（好ましくはＡｓｐ）であり；
Ｘ_２はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、もしくはＳｅｒ（好ましくはＡｓｐ、Ａｓｎ、
またはＳｅｒ）であり；
Ｘ_３はＧｌｙ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｒｐまたはＴｙｒ）であり
；
Ｘ_５はＧｌｕ、ＭｅｔもしくはＴｈｒ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_６はＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＰｈｅ（好ましくはＭｅｔ、Ｌｅｕ、またはＰｈ
ｅ）であり；
Ｘ_７はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、ＴｒｐもしくはＶａｌであり；
Ｘ_８はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_９はＡｓｐもしくはＧｌｕであり；
Ｘ_１０はＬｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＶａｌ（好ましくはＬｙｓ）であり；
Ｘ_１２はＡｒｇ、Ｇｌｎ、ＬｙｓもしくはＴｒｐ（好ましくはＴｒｐ、Ａｒｇ、またはＬ
ｙｓ）であり；
Ｘ_１４はＡｓｎ、Ｌｅｕ、ＰｈｅもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ、Ｐｈｅ、またはＡ
ｓｎ）であり；
Ｘ_１６はＧｌｙ、Ｐｈｅ、ＳｅｒもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ、またはＰｈｅ）で
あり；
Ｘ_１７はＧｌｙ、Ｌｅｕ、ＰｒｏもしくはＳｅｒ（好ましくはＰｒｏまたはＳｅｒ）であ
り；そして
Ｘ_１８はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列１２：Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｘ_３−Ｃｙｓ−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ
_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｃｙｓ−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８(ＴＮ
１２；配列番号６)、ここで、
Ｘ_３はＧｌｕもしくはＬｙｓであり；
Ｘ_５はＧｌｕもしくはＧｌｙであり；
Ｘ_６はＴｒｐもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_７はＳｅｒもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_８はＡｓｎもしくはＧｌｎであり；
Ｘ_９はＧｌｙもしくはＭｅｔであり；
Ｘ_１０はＰｈｅもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１１はＡｓｐもしくはＧｌｎであり；
Ｘ_１２はＬｙｓもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１３はＧｌｕもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_１４はＧｌｕもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_１６はＡｌａもしくはＶａｌであり；
Ｘ_１７はＡｒｇもしくはＴｙｒであり；そして
Ｘ_１８はＬｅｕもしくはＰｒｏである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する。

線状ディスプレイライブラリー（Ｌｉｎ２０）から単離された結合ポリペプチドの解析
は、以下のコンセンサス配列１３および１４のアミノ酸配列を含む好ましい態様の２種の
ファミリーを明らかにした：
コンセンサス配列１３：Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｚ_２（Ｌｉｎ２０）、
ここで、
Ｚ_１は少なくとも１つのアミノ酸のポリペプチドであるか、または存在せず；
Ｘ_１はＡｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｎもしくはＧｌｕ（好ましくはＧｌｎまたはＧｌｕ）であり
；
Ｘ_２はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ（好ましくはＡｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌ
ｕ）であり；
Ｘ_３はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒ（好ましくは
Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＬｅｕ）であり；
Ｘ_４はＡｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、もしくはＶａｌ（好ましくはＴｙｒ、
Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＶａｌ）であり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒ（好
ましくはＴｒｐ、ＴｙｒまたはＬｅｕ）であり；そして
Ｚ_２は少なくとも１つのアミノ酸のポリペプチドであるか、または存在しない、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
コンセンサス配列１４：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ
_９−Ｌｅｕ（Ｌｉｎ２０；配列番号７）；ここで、配列は場合によりＮ末端ポリペプチド
、Ｃ末端ポリペプチド、または両末端において少なくとも１つのアミノ酸のポリペプチド
を有することができ、ここで、
Ｘ_１はＡｓｐ、ＧｌｙもしくはＳｅｒ（好ましくはＧｌｙ）であり；
Ｘ_２はＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_３はＡｌａ、ＳｅｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_７はＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＩｌｅもしくはＶａｌであり；
Ｘ_８はＡｌａ、ＩｌｅもしくはＶａｌ（好ましくはＩｌｅまたはＶａｌ）であり；
Ｘ_９はＡｌａ、Ｇｌｕ、ＶａｌもしくはＴｈｒである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する。

上記コンセンサス配列１を含む好ましい態様には、Ｘ_３がＴｒｐであり、そしてＸ_７〜
Ｘ_１０のアミノ酸配列がＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号８）であるポリペプ
チドが挙げられる。より好ましい構造には、コンセンサス配列１を含むポリペプチドが挙
げられ、ここでＸ_３はＴｒｐであり、そしてＸ_５〜Ｘ_１０のアミノ酸配列はＧｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号９）である。コンセンサス配列１を含む
別の好ましい配列には、Ｘ_３がＴｒｐであり、Ｘ_５〜Ｘ_１０のアミノ酸配列がＧｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号９）であり、そしてペプチドＸ_１３〜
Ｘ_１４がＩｌｅ−Ｔｈｒであるポリペプチドが挙げられる。これらの好ましいポリペプチ
ドの中で、Ｘ_１がＰｒｏであり、そしてＸ_１２がＰｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒの１つであ
るものがさらに好ましい。

上記環状ポリペプチドファミリーの具体的な態様は以下の表１、２、４、５および７に
開示される。
ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ標的を結合させることが見出されたさらなる環状ポリペ
プチドは、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により形成され、たとえば以下の
ような１０アミノ酸から成る環状部分（またはループ）を有する：
Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（配列番号１０）、
Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号１１）、
Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列番号１２）。

さらなる好ましい態様は、以下の表３に示すアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから成るＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤ
Ｒ標的を結合可能な線状ポリペプチドを包含する。

本発明のポリペプチドは、場合によりＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方に結合
した付加的なアミノ酸を有していてもよい。好ましい態様において、１以上、好ましくは
２アミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端フランキングペプチドを有する本発明に記載の
結合ポリペプチドを作製することができ、該アミノ酸は結合ポリペプチドが単離されたフ
ァージ選択物のディスプレイ構築物のフランキングペプチドに対応する。好ましいＮ末端
フランキングペプチドには、Ａｌａ−Ｇｌｙ−（ＴＮ７、ＴＮ８、ＴＮ９配列に最も好ま
しい）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（ＴＮ１０配列に最も好ましい）、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（ＴＮ１
２配列に最も好ましい）、Ａｌａ−Ｇｌｎ−（線状配列に最も好ましい）、およびＳｅｒ
−Ｇｌｙ−（ＭＴＮ１３配列に最も好ましい）が挙げられる。好ましいＣ末端フランキン
グペプチドには、−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ＴＮ７、ＴＮ８、ＴＮ９配列に最も好ましい）、−
Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＴＮ１０配列に最も好ましい）、−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（ＴＮ１２配列に最
も好ましい）、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（線状配列に最も好ましい）、および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
（ＭＴＮ１３配列に最も好ましい）が挙げられる。また、単一の末端アミノ酸を本発明の
結合ポリペプチドに付加してもよく、そして好ましい末端アミノ酸は親ファージディスプ
レイ構築物に対応することになり、たとえば最も好ましくは、Ｎ末端アミノ酸はＧｌｙ−
（ＴＮ７、ＴＮ８、ＴＮ９、ＭＴＮ１３配列に最も好ましい）、Ｓｅｒ−（ＴＮ１０配列
に最も好ましい）、Ａｓｐ−（ＴＮ１２配列に最も好ましい）、およびＧｌｎ−（線状配
列に最も好ましい）から選択され、そして最も好ましいＣ末端アミノ酸は−Ｇｌｙ（ＴＮ
７、ＴＮ８、ＴＮ９、ＭＴＮ１３および線状配列に最も好ましい）、−Ａｌａ（ＴＮ１０
配列に最も好ましい）、および−Ａｓｐ（ＴＮ１２配列に最も好ましい）から選択される
ことになる。そのようなフランキングアミノ酸に対する保存的置換（すなわち、以下の群
から選択されるアミノ酸置換：｛Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ｝、｛Ｇｌｕ、Ａｓｐ｝、｛Ａ
ｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ｝、｛Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ｝）も企図される。

ループ構造を形成する可能性を有するポリペプチドを含有するライブラリー（たとえば
、ＴＮ７、ＴＮ８、ＴＮ９、ＴＮ１０、ＴＮ１２およびＭＴＮ１３と呼ばれるライブラリ
ー）の単離物由来の配列情報および結合データの検索により、ループ構造を形成すること
ができる一連のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを同定する。具体
的な態様において、本発明の環状ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドは、以
下のループコンセンサス配列１５〜２０から選択されるアミノ酸配列を包含するか、ある
いはそれから成る：
ループコンセンサス配列１５：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｃｙｓ
（ＴＮ８）、ここで、
Ｘ_２はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＴｙ
ｒ）であり；
Ｘ_３はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ま
しくはＧｌｕ、ＭｅｔまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ_４はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＡｓｐ）で
あり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔ
ｒｐ、もしくはＴｙｒ（好ましくはＴｒｐまたはＴｈｒ）であり；
Ｘ_６はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔ
ｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｙまたはＴｙｒ）であり；そして
Ｘ_７はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、もしくはＴｙｒ（好ましくはＬｙｓまたはＴｙｒ）である；
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
ループコンセンサス配列１６：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−
Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｃｙｓ（ＴＮ１２）、ここで、
Ｘ_２はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔ
ｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｕ、ＩｌｅまたはＴｙｒ）であり
；
Ｘ_３はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓ
ｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＧｌｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ_４はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐ
ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｎまたはＳｅｒ）であり
；
Ｘ_６はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐ
ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｐ）であり；
Ｘ_７はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＬ
ｙｓまたはＳｅｒ）であり；
Ｘ_８はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔ
ｒｐ、Ｔｙｒ、もしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｙまたはＴｙｒ）であり；
Ｘ_９はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｒｐまたはＴｈｒ）であり
；
Ｘ_１０はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、
Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＶａｌ（好ましくはＧｌｕまたはＴｒｐ）であり；そして
Ｘ_１１はＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、もしくはＶａｌ（好ましくはＰｈｅ）である；
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
ループコンセンサス配列１７：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇｌｙ−Ｘ_６−Ｃｙｓ（Ｔ
Ｎ７）、ここで、
Ｘ_２はＡｓｎ、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；
Ｘ_３はＧｌｕ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_４はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＭｅｔもしくはＴｙｒであり；そして
Ｘ_６はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＬｙｓもしくはＶａｌである；
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
ループコンセンサス配列１８：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−
Ｃｙｓ（ＴＮ９）、ここで、
Ｘ_２はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＶａｌ（好ましくはＬｙｓ）で
あり；
Ｘ_３はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＨｉｓもしくはＬｅｕであり；
Ｘ_４はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（好ま
しくはＭｅｔ）であり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＳｅｒもしくはＴｈ
ｒであり；
Ｘ_６はＨｉｓ、ＰｒｏもしくはＴｒｐ（好ましくはＰｒｏまたはＴｒｐ）であり；
Ｘ_７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｒｐ）で
あり；そして
Ｘ_８はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒもしくはＴｒｐである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する；または
ループコンセンサス配列１９：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｃｙｓ（ＭＴＮ１３；配列番号１３）、ここで、
Ｘ_２はＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_３はＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_４はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＴｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_５はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＰｈｅであり；
Ｘ_９はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＨｉｓもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１０はＧｌｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_１１はＧｌｕ、Ｌｙｓ、ＰｈｅもしくはＳｅｒであり；そして
Ｘ_１２はＧｌｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒもしくはＶａｌである、
ここで、ポリペプチドはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する。

ループコンセンサス配列１５の環状ペプチドの好ましい態様には、以下のループコンセ
ンサス配列２０〜２２を含む、ＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる：
ループコンセンサス配列２０：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｔｙｒ−Ｃｙ
ｓ（ＴＮ８）、ここで、
Ｘ_２はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＬｙｓもしくはＳｅｒ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＴｈｒもしくはＶａｌ（好ましくはＡｓｐまた
はＧｌｕ）であり；
Ｘ_４はＡｓｐもしくはＧｌｕであり；
Ｘ_５はＴｒｐもしくはＴｙｒであり；そして
Ｘ_６はＴｈｒもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ）である；または
ループコンセンサス配列２１：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇｌｙ−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｃｙ
ｓ（ＴＮ８）、ここで、
Ｘ_２はＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＨｉｓであり；
Ｘ_３はＨｉｓもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ）であり；
Ｘ_４はＨｉｓ、ＩｌｅもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_６はＩｌｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌであり；そして
Ｘ_７はＧｌｙもしくはＴｙｒである；または
ループコンセンサス配列２２：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｇｌｙ−Ｘ_７−Ｃｙ
ｓ（ＴＮ８）、ここで、
Ｘ_２はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ま
しくはＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅ）であり；
Ｘ_３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔ
ｙｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_４はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_５はＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｈｒ、Ｓ
ｅｒ、またはＡｓｐ）であり；そして
Ｘ_７はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔ
ｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｒｇまたはＬｙｓ）である。

ループコンセンサス配列１６の環状ペプチドの好ましい態様には、以下のループコンセ
ンサス配列２３〜２６の配列を含む、ＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合
ポリペプチドが挙げられる：
ループコンセンサス配列２３：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｃｙｓ（ＴＮ１１、すなわちＴＮ１２ライブラリーの単離物に基づ
いた１１量体；配列番号１４）、ここで、
Ｘ_２はＡｌａ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ（好ましくはＴｒｐまたはＰｈｅ）であり；
Ｘ_３はＧｌｕもしくはＬｙｓ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_４はＡｓｐ、Ｓｅｒ、ＴｒｐもしくはＴｙｒ（好ましくはＡｓｐ、ＴｒｐまたはＴｙｒ
）であり；
Ｘ_５はＰｈｅ、ＰｒｏもしくはＳｅｒ（好ましくはＳｅｒ）であり；
Ｘ_９はＧｌｎもしくはＧｌｕ（好ましくはＧｌｕ）であり；そして
Ｘ_１０はＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＶａｌである；または
ループコンセンサス配列２４：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｇｌｕ−Ｘ_４−Ｓｅｒ−Ｘ_６−Ｓｅｒ−
Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（ＴＮ１２；配列番号１５）、ここで、
Ｘ_２はＨｉｓもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_４はＬｅｕ、ＨｉｓもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_６はＡｓｐもしくはＬｅｕ（好ましくはＡｓｐ）であり；
Ｘ_８はＧｌｙもしくはＶａｌ（好ましくはＶａｌ）であり；
Ｘ_９はＴｈｒもしくはＶａｌ（好ましくはＴｈｒ）であり；そして
Ｘ_１０はＡｒｇもしくはＴｒｐ（好ましくはＡｒｇ）である；または
ループコンセンサス配列２５：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｇｌｙ
−Ｘ_９−Ｔｒｐ−Ｘ_１１−Ｃｙｓ（ＴＮ１２；配列番号１６）、ここで、
Ｘ_２はＧｌｕ、ＭｅｔもしくはＴｈｒ（好ましくはＧｌｕ）であり；
Ｘ_３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＰｈｅ（好ましくはＭｅｔ、ＬｅｕまたはＰｈｅ
）であり；
Ｘ_４はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、ＴｒｐもしくはＶａｌであり；
Ｘ_５はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＶａｌであり；
Ｘ_６はＧｌｕもしくはＡｓｐであり；
Ｘ_７はＬｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＶａｌ（好ましくはＬｙｓ）であり；
Ｘ_９はＡｒｇ、Ｇｌｎ、ＬｙｓもしくはＴｒｐ（好ましくはＴｒｐ、ＡｒｇまたはＬｙｓ
）であり；そして
Ｘ_１１はＡｓｎ、Ｌｅｕ、ＰｈｅもしくはＴｙｒ（好ましくはＴｙｒ、ＰｈｅまたはＡｓ
ｎ）である；または
ループコンセンサス配列２６：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−
Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｃｙｓ（ＴＮ１２）、ここで、
Ｘ_２はＧｌｕもしくはＧｌｙであり；
Ｘ_３はＴｒｐもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_４はＳｅｒもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_５はＡｓｐもしくはＧｌｎであり；
Ｘ_６はＧｌｙもしくはＭｅｔであり；
Ｘ_７はＰｈｅもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_８はＡｓｐもしくはＧｌｎであり；
Ｘ_９はＬｙｓもしくはＴｙｒであり；
Ｘ_１０はＧｌｕもしくはＴｈｒであり；そして
Ｘ_１１はＧｌｕもしくはＰｈｅである。

ループコンセンサス配列１７の環状ペプチドの好ましい態様には、以下のループコンセ
ンサス配列２７の配列を含む、ＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる：
ループコンセンサス配列２７：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｇｌｙ−Ｘ_６−Ｃｙｓ（ＴＮ
７）、ここで、
Ｘ_２はＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
Ｘ_３はＧｌｕ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＰｈｅであり；
Ｘ_４はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり；そして
Ｘ_６はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＬｙｓまたはＶａｌである。

ループコンセンサス配列１８の環状ペプチドの好ましい態様には、以下のループコンセ
ンサス配列２８の配列を含む、ＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる：
ループコンセンサス配列２８：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−
Ｃｙｓ（ＴＮ９）、ここで、
Ｘ_２はＡｌａ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＶａｌ（好ましくはＬｙｓ）であり；
Ｘ_３はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｅｕであり；
Ｘ_４はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＴｙｒ（好ましくはＭｅｔ）であり；
Ｘ_５はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘ_６はＨｉｓ、ＰｒｏまたはＴｒｐ（好ましくはＰｒｏ）であり；
Ｘ_７はＨｉｓ、Ｌｅｕ、ＴｒｐまたはＴｙｒ（好ましくはＴｒｐまたはＨｉｓ）であり；
そして
Ｘ_８はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＴｒｐである。

ループコンセンサス配列１９の環状ペプチドの好ましい態様には、以下のループコンセ
ンサス配列２９の配列を含む、ＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる：
ループコンセンサス配列２９：Ｃｙｓ−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｃｙｓ（ＭＴＮ１３；配列番号１７）、ここで、
Ｘ_２はＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＴｈｒであり；
Ｘ_３はＡｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＰｈｅであり；
Ｘ_４はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ_５はＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＰｈｅであり；
Ｘ_９はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＴｙｒであり；
Ｘ_１０はＧｌｕ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_１１はＧｌｕ、Ｌｙｓ、ＰｈｅまたはＳｅｒであり；そして
Ｘ_１２はＧｌｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＶａｌである。

本明細書に開示された任意の特定配列、および／または本明細書に記載の任意のコンセ
ンサス配列に適合する任意の具体的配列に使用される、化学的または物理的改変、および
本明細書に記載の任意の配列改変が包含される。

上記のＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドは、場合によりＮ末端およびＣ
末端のいずれかまたは両方に結合する付加的なアミノ酸を有していてもよく、多量体構築
物に改変するか、最適化するか、または使用してよい。さらに、本発明は本明細書に記載
のＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドの相同体を包含する。

本発明の他の側面は、本発明に記載のポリペプチドを検出可能に標識することにより特
定の血管新生造影剤を提供するための上記ポリペプチドの改変に関する。そのような検出
可能な標識には、放射性標識、酵素標識もしくはＭＲ常磁性キレート剤もしくは微小粒子
による標識；超音波バブル、微小粒子、ミクロスフェア、エマルジョンもしくはリポソー
ムへの取込；または光学色素との結合を挙げることができる。

本発明の他の側面では、本発明の結合ポリペプチドを使用して、ＫＤＲまたはＫＤＲ発
現細胞を単離するための方法が提供される。
さらに、本発明のＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、薬剤的に
受容できる組成物中の単独生理活性物質として、または血管新生もしくはたとえばマラリ
ア、ＨＩＶ、ＳＩＶ、サル出血熱等を含む多数の病原体に関連する疾患に関与する状態ま
たは疾患を治療するための他の治療薬と結合して（または組み合わせて）治療薬として使
用することができる。

治療薬として使用する場合、ペプチドの血清滞留時間を延長することが好都合であるか
もしれない。これは、ａ）血清アルブミンのような血清タンパク質上の遊離スルフヒドリ
ル基と反応する、マレイミドのような部分をペプチドに結合させること、ｂ）血清アルブ
ミンのような血清タンパク質に非共有結合的に結合する、脂肪酸のような部分をペプチド
に結合させること、ｃ）血清滞留時間を延長させることが公知のＰＥＧのようなポリマー
をペプチドに結合させること、およびｄ）ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質ま
たは抗体をコードするＤＮＡに、ＫＤＲ結合ペプチドをコードするＤＮＡを融合させ、コ
ードされた融合タンパク質を発現させることにより達成することができる。

本発明のこれらおよび他の側面は以下の詳細な説明を参照することにより明らかになる
であろう。
本発明の他の側面では、標的発現細胞に結合する能力についてファージディスプレイに
より同定されたポリペプチドをスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は、
標準の細胞結合アッセイで評価するには単量体親和性が低すぎるポリペプチドを含むポリ
ペプチドの結合能力の迅速なスクリーニングを可能にする。

定義
以下のセクションにおいて、「組換え体」という用語は、非天然に変換または操作され
た核酸、異種核酸を形質移入された宿主細胞、または単離されたＤＮＡの操作および宿主
細胞の形質転換により非天然に発現されたポリペプチドを説明するために使用される。組
換え体は、遺伝子工学的技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されているＤＮＡ分子
を特に包含し、そして分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドを説明するための形容詞としての「組換え体」という用語の使用は、天然に存在する
そのような分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを特に
除外する。

「バクテリオファージ」という用語は、ＤＮＡコア、および多数の異なるタンパク質分
子の凝集により構築された保護殻を含む細菌ウイルスとして定義される。「バクテリオフ
ァージ」および「ファージ」という用語は、本明細書では互換性がある。

「ポリペプチド」という用語は、ペプチドアミド結合（−Ｃ（：Ｏ）ＮＨ−）により主
鎖（側鎖に対して）を介して結合した２以上のアミノ酸の化合物を表すために使用される
。本明細書では、「ペプチド」という用語は「ポリペプチド」と互換性があるが、通常４
０以下、好ましくは２５以下のアミノ酸を有するポリペプチドを表すために使用される。

本明細書で使用される「結合ポリペプチド」という用語は、他の分子と結合複合体を形
成可能ないずれかのポリペプチドを表す。本明細書で時々使用される同じ意味の用語は「
結合部分」である。「ＫＤＲ結合ポリペプチド」は、血管内皮増殖因子受容体−２（また
はＫＤＲ、Ｆｌｋ−１）とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで複合体を形成するポ
リペプチドであり；「ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチド」は、血管内皮増殖因子
（ＶＥＧＦ）とＫＤＲとのあいだで形成される結合複合体、とりわけ血管新生中に内皮細
胞の表面において形成されると考えられる、ホモ二量体ＶＥＧＦと１つまたは２つのＫＤ
Ｒ分子との複合体とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで複合体を形成するポリペプ
チドである。ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドの具体的な例としては、以
下の表１〜７に提示されるペプチドが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
そしてそのようなペプチドを取り込むハイブリッドおよびキメラポリペプチドを包含する
。また、本明細書に記載のように改変または最適化されたポリペプチドは、ＫＤＲおよび
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの定義内に包含される。

そのような改変の具体的な例は以下に詳細に説明されるが、特性を最適化する、酵素開
裂部位を削除するなどのために親ポリペプチド配列をアミノ酸置換すること；たとえば結
合ポリペプチドを検出可能な画像化標識または他の基質に連結させるためのＣ末端または
Ｎ末端のアミノ酸置換または伸長、その例としては、たとえば精製を補助するためにポリ
ヒスチジン「尾部」を付加することが挙げられる；切断；アミド結合変化；転位；レトロ
インベルソペプチド；ペプトイド；レトロインベルソペプトイド；Ｎ末端もしくはＣ末端
の改変またはリンカー、たとえばポリグリシンまたはポリリジンセグメントの使用；固体
支持体上に本発明の結合ポリペプチドを固定化させるのを補助するか、または蛍光色素を
結合するために、官能基、とりわけヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ_２）官能基もしくはＣ末端
リンカー−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１８）を含むように変換すること
；薬物動態学的改変、構造特性を保持するための構造改変、水溶性を増加させるためもし
くは製剤化し易くするための塩形成などが挙げられる。

本明細書にさらに記載される検出可能な標識に加え、結合ポリペプチドのための他の適
切な基質には、殺腫瘍剤もしくは酵素、リポソーム（たとえば治療薬、超音波適合ガスま
たは両方を負荷したもの）、または固体支持体、ウェル、プレート、ビーズ、チューブ、
スライド、フィルター、もしくはディッシュが挙げられる。さらに、１以上のＫＤＲまた
はＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合ポリペプチドの二量体または多量体が形成されてもよい。そのよ
うな構築物は、たとえば促進されたＫＤＲへの結合能を示すことができる。また、そのよ
うに改変された結合ポリペプチドのすべては、それらがＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ標
的に結合する能力を保持する限り、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチ
ドであると見なされる。

本明細書に記載の結合ポリペプチドの「相同体」は、本明細書に記載のまたは当業者に
公知の改変または最適化技術のいずれかを使用して作製することができる。そのような相
同体ポリペプチドは、アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失または他のそのような改変が
ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体のいずれかに結合するその能力を除去しない限り、
本発明の範囲およびＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの定義内に包
含される。本明細書で使用する「相同性」という用語は、２種のポリマー（すなわち、ポ
リペプチド分子または核酸分子）間の配列相同性の程度を表す。同じ核酸もしくはアミノ
酸残基または実質的に類似した特性を有するもの（すなわち保存的置換）が比較される２
種のポリマーにおいてある配列位置を占める場合、ポリマーはその位置において相同であ
る。たとえば、２種のポリペプチド配列において１００のアミノ酸位置のうち６０アミノ
酸残基が一致するか相同である場合、２種の配列は６０％相同性である。本明細書で表さ
れた相同性％の数字は、２種のポリマー間で可能な最大相同性、すなわち、一致した（相
同性の）位置が最も多くなるように２種のポリマーを並べた場合の％相同性を意味する。
本発明の範囲内のポリペプチド相同体は、本明細書に開示された少なくとも１つのＫＤＲ
またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合配列に少なくとも７０％、好ましくは８０％以上相同性であ
ろう。

「結合」という用語は、結合ポリペプチドが所定の標的を認識し、それに可逆的に結合
するという、本明細書に記載のアッセイを含む標準アッセイによる確定を表す。そのよう
な標準アッセイには、平衡透析、ゲルろ過、および結合によるスペクトル変化のモニタリ
ングを含むが、それらに限定されない。

「特異性」という用語は、ある標的に対して他のものより高い結合親和性を有する結合
ポリペプチドを表す。「ＫＤＲ特異性」という用語は、ＫＤＲに対して他の無関係な標的
より高い親和性を有するＫＤＲ結合部分を表す。「ＶＥＧＦ／ＫＤＲ特異性」という用語
は、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対して所定の標的より高い親和性を有するＶＥＧＦ／ＫＤ
Ｒ複合体結合部分を表す。結合特異性は、２種の試験される標的物質に対する解離平衡定
数（Ｋ_Ｄ）または会合平衡定数（Ｋ_ａ）により特徴付けられるか、または相対的結合強度
の任意の尺度であってもよい。本発明に記載の結合ポリペプチドは、ＫＤＲまたはＶＥＧ
Ｆ／ＫＤＲ複合体に特異的で、好ましくはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対する
Ｋ_Ｄが１０μＭ未満、より好ましくは１．０μＭ未満、最も好ましくは０．５μＭ未満ま
たはずっと低い。

本明細書で使用する「患者」という用語はいずれかの哺乳動物、特にヒトを表す。
「薬剤的に受容できる」担体または賦形剤という用語は、本発明の化合物と一緒に患者
に投与でき、その生物活性または薬理活性を破壊しない、非毒性の担体または賦形剤を表
す。

以下の一般的な略語を、本明細書を通じて使用する：９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル（ｆｍｏｃまたはＦｍｏｃ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、無水酢酸（Ａｃ_２Ｏ）、（４，
４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉ
ｖＤｄｅ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、試薬Ｂ（ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：フェノール：トリ
イソプロピルシラン、８８：５：５：２）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩ
ＥＡ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメ
チルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリ
アゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホス
フェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、固相ペプチド合成（
ＳＰＰＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）、およびＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）。

発明の詳細な説明
本発明は、ＫＤＲまたはＶＥＧＦとＫＤＲとの複合体に結合する新規結合部分を提供す
る。そのような結合部分は、アップレギュレーションされたＫＤＲ発現を示しＶＥＧＦに
結合する、活性化内皮細胞の効率的な検出、画像化および局在化を可能にする。そのよう
な内皮細胞は活発な血管新生に特徴的であり、したがって本明細書に記載のポリペプチド
は血管新生部位の検出、モニタリングおよび局在化の手段を提供する。とりわけ、本発明
の結合ポリペプチドは、適切に標識された場合、腫瘍誘発血管新生の検出、画像化および
局在化に有用である。したがって、結合ポリペプチドは、新生物性腫瘍増殖または他の病
原性血管新生事象の診断および治療のための多様な診断薬および治療薬の作製に使用する
ことができる。さらに、結合ポリペプチド自体を治療薬として使用することができる。

本発明に記載の具体的ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、初め
にファージディスプレイライブラリーのスクリーニング、すなわち表面に外来ペプチドを
発現するように形質転換された組換えバクテリオファージ集団のスクリーニングにより単
離された。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲのような特定の標的に対する新規ポリペプチド
結合部分を単離するために、たとえばファージディスプレイライブラリーを使用して、大
きなペプチドライブラリーをスクリーニングすることは、非常に大量（たとえば、５×１
０^９）の潜在的結合体を試験することができ、好結果の結合体を短期間で単離できる点で
とりわけ好都合である。

ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドのような結合ポリペプチドをス
クリーニングするためのポリペプチドを提示するファージライブラリーを作製するために
、ライブラリーに提示されるペプチドに対する構造テンプレートとして作用するように結
合ドメイン候補が選択される。ファージライブラリーは多数の親ドメインまたはテンプレ
ートの類似体から構成される。結合ドメインテンプレートは天然でも合成タンパク質でも
よく、またはタンパク質の領域もしくはドメインであってもよい。結合ドメインテンプレ
ートは、結合ドメインテンプレートと結合標的とのあいだの公知の相互作用に関する知識
に基づき選択することができるが、このことは重要ではない。実際、ライブラリーのテン
プレートとして作用するように選択されたドメインが標的に対して任意の親和性を有する
ことは少しも重要ではない。その目的は、類似構造をしたポリペプチド（類似体）の多様
性（ライブラリー）を作製できる構造を提供することであり、その類似体の多様性は好ま
しくは所望の結合特性（およびスクリーニングされるいずれか他の特性）を示す１以上の
類似体を包含するであろう。

ライブラリーの多様なアミノ酸配列の基礎となる親結合ドメインまたはテンプレートの
選択において考慮すべき最も重要なことは、多様なペプチドドメインがどのように標的に
提示されるかということ、すなわちどのようなコンホメーションにおいてペプチド類似体
が標的と接触することになるかということである。ファージディスプレイ法において、た
とえば類似体は、類似体をコードする合成ＤＮＡをファージに挿入することにより作製さ
れ、ファージの表面に類似体を提示することになる。多様な異なるポリペプチドを提示す
るＭ１３ファージのようなファージのライブラリーは、たとえば、本明細書に援用される
Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６）および米国特許第５，２２３，４
０９号（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載の技術を使用して作製することができる。

本発明に記載の具体的なポリペプチドの単離において、ＴＮ６／Ｖ１、ＴＮ７／ＩＶ、
ＴＮ８／ＩＸ、ＴＮ９／ＩＶ、ＴＮ１０／ＩＸ、ＴＮ１２／Ｉ、およびＭＴＮ３／１と呼
ばれる７種の環状ペプチド（またはループ）ライブラリー、ならびにＬｉｎ２０と呼ばれ
る線状ライブラリーが使用された。それぞれのライブラリーはＭ１３ファージ上に多様な
ポリペプチドを発現するために構築された。「ＴＮ」表示を有する７種のライブラリーは
、それぞれタンパク質ＩＩＩのアミノ末端の６、７、８、９、１０、１２または１３アミ
ノ酸の、短い多様な外来ペプチドループをＭ１３ファージの表面に提示するように設計さ
れた。該ライブラリーは、ＴＮ６／ＶＩ（潜在的に３．３×１０^１２アミノ酸配列多様性
を有する）、ＴＮ７／ＩＶ（潜在的に１．２×１０^１４アミノ酸配列多様性を有する）、
ＴＮ８／ＩＸ（潜在的に２．２×１０^１５アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ９／ＩＶ
（潜在的に４．２×１０^１６アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ１０／ＩＸ（潜在的に
３．０×１０^１６アミノ酸配列多様性を有する）、ＴＮ１２／Ｉ（潜在的に４．６×１０
^１９アミノ酸配列多様性を有する）、ＭＴＮ１３／Ｉ（潜在的に８．０×１０^１７アミノ
酸配列多様性を有する）、およびＬｉｎ２０（潜在的に３．８×１０^２５アミノ酸配列多
様性を有する）と呼ばれる。

ＴＮ６／ＶＩライブラリーは、１２アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タ
ンパク質結合ループを提示するように構築された。ＴＮ６／ＶＩライブラリーはＸａａ_１
−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｃｙｓ−Ｘ
ａａ_１０−Ｘａａ_１１−Ｘａａ_１２のテンプレート配列を使用した。テンプレートの２、
３、５、６、７、８、１０、および１１番目のアミノ酸はシステイン（Ｃｙｓ）以外の任
意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの１および１２番目のアミノ酸はシステ
イン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）
、メチオニン（Ｍｅｔ）、およびスレオニン（Ｔｈｒ）以外の任意のアミノ酸に変化可能
であった。

ＴＮ７／ＩＶライブラリーは、１３アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タ
ンパク質結合ループを提示するように構築された。ＴＮ７／ＩＶライブラリーはＸａａ_１
−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９−
Ｃｙｓ−Ｘａａ_１１−Ｘａａ_１２−Ｘａａ_１３のテンプレート配列を使用した。テンプレ
ートの１、２、３、５、６、７、８、９、１１、１２、および１３番目のアミノ酸は、シ
ステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。

ＴＮ８／ＩＸライブラリーは、１４アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タ
ンパク質結合ループを提示するように構築された。ＴＮ８／ＩＸライブラリーはＸａａ_１
−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９−
Ｘａａ_１０−Ｃｙｓ−Ｘａａ_１２−Ｘａａ_１３−Ｘａａ_１４のテンプレート配列を使用し
た。テンプレートの１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１２、１３および１４番目
のアミノ酸はシステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。

ＴＮ９／ＩＶライブラリーは、１５アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タ
ンパク質結合ループを提示するように構築された。ＴＮ９／ＩＶライブラリーはＸａａ_１
−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９−
Ｘａａ_１０−Ｘａａ_１１−Ｃｙｓ−Ｘａａ_１３−Ｘａａ_１４−Ｘａａ_１５のテンプレート
配列を使用した。テンプレートの１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、
１４および１５番目のアミノ酸はシステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に変化可能
であった。

ＴＮ１０／ＩＸライブラリーは、１６アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小
タンパク質結合ループを提示するように構築された。ＴＮ１０／ＩＸライブラリーはＸａ
ａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ
_９−Ｘａａ_１０−Ｘａａ_１１−Ｘａａ_１２−Ｃｙｓ−Ｘａａ_１４−Ｘａａ_１５−Ｘａａ_１
６のテンプレート配列を使用した。テンプレートの１、２、１５および１６番目のアミノ
酸は、１０アミノ酸：Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、またはＹの群から選択され
る任意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの３および１４番目のアミノ酸は、
１４アミノ酸：Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、またはＹの群か
ら選択される任意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの５、６、７、８、９、
１０、１１、および１２番目のアミノ酸はシステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に
変化可能であった。

ＴＮ１２／Ｉライブラリーは、１８アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タ
ンパク質結合ループを提示するように構築された。ＴＮ１２／ＩライブラリーはＸａａ_１
−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｘａａ_９−
Ｘａａ_１０−Ｘａａ_１１−Ｘａａ_１２−Ｘａａ_１３−Ｘａａ_１４−Ｃｙｓ−Ｘａａ_１６−
Ｘａａ_１７−Ｘａａ_１８のテンプレート配列を使用した。テンプレートの１、２、１７お
よび１８番目のアミノ酸は、１２アミノ酸：Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、
Ｗ、またはＹの群から選択される任意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの３
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１６番目のアミノ酸はシ
ステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。

ＭＴＮ１３／Ｉライブラリーは、３アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の一定領域に
より分離された等しいサイズ（すなわち８アミノ酸）の２つの可変領域を特徴とする１９
アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タンパク質結合ループを提示するように
構築された。ＭＴＮ１３／ＩライブラリーはＸａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｃｙｓ−Ｘ
ａａ_５−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７−Ｘａａ_８−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１２−Ｘａａ
_１３−Ｘａａ_１４−Ｘａａ_１５−Ｃｙｓ−Ｘａａ_１６−Ｘａａ_１７−Ｘａａ_１８−Ｘａａ
_１８（配列番号１９）のテンプレート配列を使用した。テンプレートの１、２、３、５、
６、７、８、１２、１３、１４、１５、１７、１８、および１９番目のアミノ酸はシステ
イン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。

Ｌｉｎ２０ライブラリーは、２０アミノ酸のテンプレート中に単一線状ペプチドを提示
するように構築された。テンプレートのそれぞれの位置におけるアミノ酸はシステイン（
Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。

本明細書に提供される結合ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加または
切断を包含することができる。そのような改変された結合ポリペプチドはＫＤＲまたはＶ
ＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合することが予想される。たとえば、本明細書に提供される結
合ポリペプチドのいくつかのＮ末端に存在する−ＧＧＧＫリンカーは任意のリンカーであ
る。したがって、末端の−ＧＧＧＫ配列がない以外は同じ配列を有するポリペプチドも本
発明に包含される。さらに、本明細書に提供されるテンプレートおよび配列のループ部分
を含む結合ポリペプチドはＫＤＲおよび／またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合すること
が予想され、やはり本発明に包含される。テンプレートおよび配列のループ部分は、ジス
ルフィド結合を形成すると考えられる２つのシステイン残基の間であって、それらを含む
配列を包含し、それによってペプチドループ構造を生成する。さらに、本発明の結合ポリ
ペプチドは付加的なアミノ酸残基をＮ末端および／またはＣ末端に含むことができる。

ファージディスプレイライブラリーは、ポリペプチドテンプレートのコーディング配列
内に、設計された一連の変異または変化を作製することにより作られ、それぞれの変異配
列は、テンプレート配列中に１以上のアミノ酸変化を有すること以外は、全体的な構造に
おいてテンプレートに対応するペプチド類似体をコードする。新規に変化した（変異した
）ＤＮＡは配列多様性を提供し、そしてそれぞれの形質転換ファージは、ＤＮＡによりコ
ードされる初期のテンプレートアミノ酸配列の１変異体を提示し、極めて多数の異なるが
構造的に関連したアミノ酸配列をファージ集団（ライブラリー）に提示させる。アミノ酸
変化は、少なくとも大部分の置換物において著しい構造変化なしに、結合ペプチドまたは
ドメインの結合特性を変化させると考えられる。変化のために選択されるアミノ酸位置（
可変アミノ酸位置）は、表面のアミノ酸位置、すなわち、ドメインが最も安定なコンホメ
ーションであるとき外部表面（すなわち溶液に曝される表面）に現れるドメインのアミノ
酸配列における位置であることが好ましい。最も好ましくは、変化させるアミノ酸位置は
、置換による効果を最大にするために、隣接するかまたは接近しているであろう。

先に示したように、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６）および米国
特許第５，２２３，４０９号に記載の技術は、選択された親テンプレートに対応する潜在
的な結合体ライブラリーの作製にとりわけ有用である。先に説明した７種のライブラリー
はそのような技術に従って作製され、それらは以下の実施例で説明するように、固定した
標的に対するＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドに関してスクリーニ
ングされた。

代表的なスクリーニングにおいて、ファージライブラリーを標的またはその特定のサブ
コンポーネントに接触させて結合させる。結合体と非結合体の分離を容易にするには、固
体支持体上に標的を固定することが好都合である。標的結合部分を有するファージは固体
支持体上で標的と複合体を形成するが、非結合ファージは溶液に残り、過剰なバッファー
で洗浄することができる。次に結合ファージは、バッファーを極端なｐＨ（ｐＨ２または
ｐＨ１０）に変え、バッファーのイオン強度を変え、変性剤を添加し、または他の公知の
手段により、標的から遊離される。本発明のポリペプチドを示す結合ファージを単離する
ためにタンパク質溶出が行われる。すなわち、あるファージは溶液中でＶＥＧＦを使用し
て標的から溶出され（競合的溶出）；また、ＶＥＧＦと一晩インキュベートしても競合阻
害されない非常に高親和性の結合ファージは、大腸菌細胞に感染させるための依然として
基質に結合したファージを使用することにより、捕捉される。

その後、回収されたファージは、細菌細胞に感染させ、非結合体が枯渇して結合体に富
んだ新規プールを用いて繰り返されたスクリーニング工程により増幅することができる。
少しの結合ファージの回収でさえ、工程を完了させるのに十分である。数ラウンドの選択
後、結合プール中の選択されたファージクローンに由来する結合部分をコードする遺伝子
配列を以下に記載の慣用の方法により決定し、ファージの結合親和性を標的に付与するペ
プチド配列を明らかにする。選択工程を行う場合、集団の配列多様性は所望の結合体が残
るまでそれぞれの選択ラウンドごとに低下する。配列は、少数の関連する結合体、通常そ
れぞれのライブラリーに由来する１千万以上のオリジナル候補から１０〜５０に収束する
。それぞれの選択ラウンドで回収されるファージ数が増加し、そしてもちろん、密接に関
連する配列が回収されることは、スクリーニング中にライブラリーの収束が起こったこと
を示す良い指標である。１組の結合ポリペプチドが同定された後、配列情報を使用して、
付加的な所望の特性を有するメンバーに関してバイアスをかけた他の二次的なファージラ
イブラリーを設計することができる。

ジスルフィド結合ループの形成はそのようなペプチドに対する親和性および特異性を増
すため、その形成は好都合である。しかし、血清中では、遊離システインまたは他のチオ
ール含有分子により、ジスルフィド結合は開裂されるかもしれない。したがって、システ
イン残基を改変して、ジスルフィド架橋を別の反応性の低い結合に置換することが有用で
あるかもしれない。−ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_２−架橋は、硫黄間の二面結合が９０度に近
い、好ましい幾何配置を有するが、正確な幾何配置は他の側鎖の構造および分子の結合状
態により決定される。結合ループの閉鎖架橋の好ましい改変は、全体の結合の長さおよび
角度を可能な限り保持するであろう。そのような代わりとなる適切な架橋には、−ＣＨ_２
−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−Ｃ
Ｈ_２−ＣＨ_２−のようなチオエーテル結合；−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−および−Ｃ
Ｈ_２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ_２−のようなラクタム結合；−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ
Ｈ_２−のようなエーテル結合；−（ＣＨ_２）_ｎ−（ｎ＝４、５、または６）のようなアル
キレンブリッジ；−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ_２−結合、および当該技術分野で公
知の類似した基が挙げられる。

安定なジスルフィド結合の結合ループを含むポリペプチドが最も好ましいが、上記の配
列に由来する線状ポリペプチドは、たとえば一方または両方のシステイン残基の置換によ
り容易に作製することができ、それらはジスルフィド結合を含有するオリジナルポリペプ
チドのＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ結合活性の少なくとも一部を保持できる。Ｃｙｓを
置換するには、アミノ酸Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＡｌａが好ましく、また、ポリペプチド
が溶液中の他の遊離チオール基と二量体化または反応することができる単一Ｃｙｓを残さ
ないように、両方のＣｙｓ残基を置換することが好ましい。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤ
Ｒ結合特性を保持するそのような線状誘導体はすべて本発明の範囲内である。

本発明のポリペプチドの直接合成は、固相ペプチド合成、溶液相合成などを含む慣用の
技術を使用して行うことができる。固相合成が好ましい。本明細書に援用される、Ｓｔｅ
ｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８９）；Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３
）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏ
ｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８４）を参照されたい。

本発明に記載のポリペプチドは、業務としてペプチド合成を提供する会社（たとえば、
ＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，Ｐ
．Ａ．；Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）により商業的に作製することもできる。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のような自動ペプチド合成機も利用
できる。

ポリペプチド化合物は、化学的にまたは組換え技術により単離または合成されると、好
ましくは精製される。精製のためには、アルキル化シリカカラム、たとえばＣ_４−、Ｃ_８
−、またはＣ_１８−シリカを使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ
）を含む、多くの標準法が使用できる。一般に有機物含有量が増加するグラジエント移動
相、たとえば、通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する、水性バッファー中のアセトニト
リルを使用して精製する。イオン交換クロマトグラフィーを使用し、電荷に基づいてペプ
チドを分離することもできる。ポリペプチドの純度は、ＨＰＬＣ上の主要な大ピークの同
定を含む種々の方法により測定することができる。ＨＰＬＣカラムに投入した物質の少な
くとも９５％である単一ピークを生じるポリペプチドが好ましい。ＨＰＬＣカラムに投入
した物質の少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または９９．５％以
上もの単一ピークを生じるポリペプチドがさらにより好ましい。

上記の技術のいずれかを使用して得られたペプチドが本発明の組成物に使用する所望の
ペプチドであることを確かめるために、ペプチド組成の解析を行うことができる。そのよ
うな組成解析は高分解能質量分析法を使用して行い、ペプチドの分子量を決定することが
できる。あるいは、水性酸中でペプチドを加水分解し、ＨＰＬＣまたはアミノ酸分析機を
使用して混合物の成分を分離、同定、および定量することにより、ペプチドのアミノ酸含
量を確かめることができる。順次ペプチドを分解し、アミノ酸を順番に同定するペプチド
配列決定装置もペプチドの配列を決定するために使用することができる。

本発明に記載のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、組換えＤＮ
Ａ技術を用いて、本発明に記載のポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を
利用し、それらを組換え技術により発現させる、すなわち公知の方法で外来核酸分子を導
入し、所望のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを産生するよう宿主
細胞を操作することにより作製することもできる。そのような手順は当業者の能力の範囲
内である（援用されるＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）を参照されたい）。本明細書に記載さ
れるような短いペプチドの組換えによる作製は、直接合成に比べて実用的ではないかもし
れないが、本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分がハイブリッドポリペ
プチドまたは融合タンパク質中に取り込まれている場合、組換えによる作製手段は非常に
好都合である。

本発明の実施において、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対するＫＤＲまたはＶ
ＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分の親和性を、他のタンパク質または標的と比較して測定す
ることは有用な尺度となり、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対する特異性として
表される。結合を定量し親和性を測定するための標準アッセイには、平衡透析、平衡結合
、ゲルろ過、または結合部分とその標的との相互作用の結果生じる多くのスペクトル変化
（たとえば蛍光偏光の変化）のモニタリングが挙げられる。これらの技術は、リガンド（
またはタンパク質）濃度の関数として、結合および遊離リガンドの濃度を測定する。結合
ポリペプチドの濃度（［結合］）は、以下の等式に記載されるように、遊離ポリペプチド
の濃度（［遊離］）およびポリペプチドの結合部位、すなわちＫＤＲまたはＶＥＧＦ／Ｋ
ＤＲ複合体上の結合部位の濃度（Ｎ）に関連する。

［結合］＝Ｎ×［遊離］／（（１／Ｋ_ａ）＋［遊離））
この等式に対するデータの解は、結合親和性の定量的尺度である結合定数Ｋ_ａを生じる
。結合定数Ｋ_ａは解離定数Ｋ_Ｄの逆数である。Ｋ_Ｄは親和性の測定においてより頻繁に報
告される。好ましいＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、ＫＤＲま
たはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対するＫ_Ｄが１ｎＭ〜１００μＭの範囲であり、１０ｎＭ
未満、２０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、１μＭ未満、５μＭ
未満、１０μＭ未満、２０μＭ未満、４０μＭ未満、６０μＭ未満、および８０μＭ未満
のＫ_Ｄを含む。

ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分が造影剤として使用される場合、結合特
異性の他の側面がより重要になるかもしれない：造影剤は動的な系において機能し、そこ
では標的（たとえば活性化内皮上の、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体、）への造影
剤の結合は、画像化手順のあいだ安定な平衡状態であってはならない。たとえば、造影剤
を初めに注入するとき、造影剤の濃度および造影剤−標的複合体の濃度は速やかに増大す
る。しかし、注入後すぐに、循環する（遊離）造影剤は腎臓または肝臓により排除されは
じめ、造影剤の血漿濃度は低下し始める。血漿中の遊離造影剤濃度のこの低下は、最終的
に造影剤−標的複合体の解離を引き起こす。造影剤の有用性は、造影剤の排除速度と造影
剤−標的の解離速度が異なることに依存する。解離速度は排除速度に比べて遅いことが理
想であり、血漿中に造影剤−標的複合体が高濃度でおよび遊離造影剤（バックグラウンド
シグナル）が低濃度であるあいだ、長く画像化を行うことになる。

解離速度の定量的測定は、当該技術分野で公知の以下のいくつかの方法を使用して容易
に行うことができる：光ファイバー蛍光分光法（たとえば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ＆Ｍｉｌｌ
ｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４（７）：１４１７−２１（１９８８）を参照されたい
）、表面プラズモン共鳴（Ｍａｌｍｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ，１９８（１）：５１−７（１９９６）ａｎｄ Ｓｃｈｕｃｋ，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：４９８−５０２（１９９
７）、共鳴ミラー、および回折格子結合平面光導波路（たとえばＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，
Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：４７−５４（１９９５）を参照されたい
）。結合速度を測定するための自動バイオセンサーが市販されている：ＢＩＡｃｏｒｅ表
面プラズモン共鳴センサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ ＳＥ）、ＬＡｓｙ
ｓ共鳴ミラーセンサー（Ｆｉｓｏｎｓ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｅｎｓｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＧＢ）、ＢＩＯＳ−１回折格子結合平面光導波センサー（
Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｎｓｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｚｕｒｉｃｈ ＣＨ）
。

ファージディスプレイで同定されたポリペプチドを標的発現細胞に対する結合能に関し
てスクリーニングする方法：
本発明の他の側面において、ファージディスプレイで同定された結合ポリペプチドを、
標的発現細胞に対する結合能（標的を発現しない細胞には結合しない）に関してスクリー
ニングする方法が提供される。これらの方法は、ファージディスプレイにより同定される
ペプチドのスクリーニングに関連した重大な問題に取り組んでいる：そのように同定され
るペプチドは、慣用のアッセイにおいて、標的発現細胞に対してスクリーニングされるこ
とになる標的に対し十分な親和性をもたないことが多い。しかし、ファージで同定された
特定のペプチドが標的発現細胞に結合する（発現しない細胞には結合しない）のを確かめ
ることは、ｉｎ ｖｉｖｏでの潜在的な標的部分である結合ペプチドを同定する上で情報
の重要な部分となる。該方法は、多価性結合に伴う親和性および結合活性の増大を利用し
、標的発現細胞に低親和性のポリペプチドのスクリーニングを可能にする。

この方法は、通常１以上の結合ポリペプチドを含む多量体構築物の作製およびスクリー
ニングから成る。たとえば、ファージディスプレイにより標的に結合するとして同定され
るポリペプチドは、ビオチン化され、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラア
ビジンと複合体を形成して、四量体構築物を形成する。次にこれらの四量体構築物を、所
望の標的を発現する細胞および発現しない細胞とインキュベートし、四量体構築物の結合
を検出する。結合は当該技術分野で公知のいずれかの検出方法を使用して検出することが
できる。たとえば、結合を検出するためにアビジン、ストレプトアビジンまたはニュート
ラアビジンは検出可能なマーカーに結合させることができる（たとえば、放射性標識、蛍
光標識、または色調が変化する酵素標識、たとえばＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）またはアルカリ性ホスファーターゼ）。

ビオチン化ペプチドは好ましくは、ニュートラアビジン−ＨＲＰと複合体を形成する。
ニュートラアビジンにはレクチン結合炭水化物部分および細胞接着受容体結合ＲＹＤドメ
インがないため、ニュートラアビジンは他の代替物より分子への非特異的結合が低い。Ｈ
ｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４８：１６７−１７１（１９８７
）；Ａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．，１７０：１２３６−４１（１９９０）を参照されたい。

四量体構築物は、本来標的を発現する細胞、または標的を発現するように組換えＤＮＡ
技術により操作されている細胞（たとえば形質移入体、形質転換体など）に対してスクリ
ーニングすることができる。標的を発現するように形質移入されている細胞を使用する場
合、ｍｏｃｋ形質移入細胞（すなわち、標的をコードする遺伝物質なしに形質移入された
細胞）を対照として使用することができる。

四量体複合体は、場合により血清存在下でスクリーニングすることができる。したがっ
て、アッセイを用いて、ペプチドの標的への結合に対する血清の作用を速やかに評価する
ことができる。

本明細書に開示される方法は、２以上の結合ポリペプチドを含有する二量体または多量
体の標的化構築物に使用するために異なる結合ポリペプチドの組み合わせを作製し、評価
する上で特に有用である。ビオチン／アビジン複合体を使用することで、１〜４種の異な
る結合ペプチドを含有する四量体構築物を比較的容易に作製することができる。さらに、
同じ標的上の異なるエピトープに結合する２以上の標的化部分を含むことにより、標的化
構築物の親和性および結合活性の増大が可能であることが見出されている。本明細書に記
載のスクリーニング法は、そのような多量体構築物に含まれるとき増大する親和性を有す
ることができる結合ポリペプチドの組み合わせの同定に有用である。

好ましい態様において、本明細書に記載のスクリーニング法は、本明細書に記載される
ような、ファージディスプレイにより同定されるＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結
合ポリペプチドのスクリーニングに使用することができる。以下の実施例５に詳細に記載
されるように、これらの方法は、ＫＤＲ発現細胞またはＫＤＲを発現するように操作され
ている細胞へのＫＤＲ結合ポリペプチドの特異的結合を評価するために使用することがで
きる。本発明のビオチン化ＫＤＲ結合ポリペプチドとニュートラアビジン−ＨＲＰとの四
量体複合体を作製して、ＫＤＲを発現するように形質移入された細胞およびｍｏｃｋ形質
移入細胞（いかなるＫＤＲも含まない）に対してスクリーニングすることができる。

実施例５に示すように、たとえポリペプチドの単座配位Ｋ_Ｄが２００ｎＭ〜３００ｎＭ
の位数である場合であっても、ＫＤＲ発現細胞に特異的に結合する（ＫＤＲを発現しない
細胞には結合しない）ＫＤＲ結合ポリペプチドを同定するために、アッセイを使用するこ
とができる。アッセイは、本発明の単一ＫＤＲ結合ポリペプチドを４コピー含有するホモ
四量体構築物、および２以上の異なるＫＤＲ結合ポリペプチドを含有するヘテロ四量体構
築物をスクリーニングするために使用することができる。本発明に記載の方法は、多量体
構築物、とりわけＫＤＲの異なるエピトープに結合する２以上のＫＤＲ結合ポリペプチド
を含有する構築物に使用するためのＫＤＲ結合ポリペプチドの組み合わせを評価するのに
とりわけ有用である。

アッセイは、ＫＤＲ結合ポリペプチドに対する血清の効果を評価するために使用するこ
ともできる。実際、本明細書に開示されるスクリーニング方法を使用して、結合が血清に
より著しく影響を受けない配列番号２６４、２９４、および３５６のようなＫＤＲ結合ポ
リペプチドが同定された。

ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの改変または最適化：
説明したように、ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの改変または
最適化は本発明の範囲内であり、改変または最適化されたポリペプチドは「ＫＤＲおよび
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチド」の定義の範囲内に包含される。とりわけ、フ
ァージディスプレイにより同定されるポリペプチド配列を改変してその潜在力、薬物動態
学的挙動、安定性および／または他の生物学的、物理的および化学的特性を最適化するこ
とができる。

アミノ酸残基の置換
たとえば、得られるポリペプチドが上記の特性と類似するかまたは改善された特性を有
すると予想して、親ポリペプチド配列に以下の等配電子的および／または保存的アミノ酸
変化を行うことができる：
アルキル置換された疎水性アミノ酸の置換：分枝、環状および直鎖アルキル、アルケニ
ルまたはアルキニル置換を含むＣ１〜Ｃ１０炭素由来の脂肪族側鎖によって置換されたア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、Ｓ−２−アミノ酪酸、Ｓ−シ
クロヘキシルアラニンまたは他の単純なα−アミノ酸を含む。

芳香族で置換された疎水性アミノ酸の置換：フェニルアラニン、トリプトファン、チロ
シン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾ
チエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、先に記載の芳香族アミノ
酸のアミノ化、アルキルアミノ化、ジアルキルアミノ化、アザ化、ハロゲン化（フルオロ
、クロロ、ブロモ、またはヨード）またはアルコキシ化（Ｃ１〜Ｃ４）置換体を含み、そ
れらの具体例としては：２−、３−または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−、４
−クロロフェニルアラニン、２−、３−または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−
または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−また
は５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−または４’−アミノ−、２’−、３’−
または４’−クロロ−、２、３−または４−ビフェニルアラニン、２’−、３’−または
４’−メチル−２、３または４−ビフェニルアラニン、および２−または３−ピリジルア
ラニンが挙げられる。

塩基性官能基を含有するアミノ酸の置換：アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチ
ン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、先のアミノ酸のアルキル置換、ア
ルケニル置換またはアリール置換（Ｃ１〜Ｃ１０までの分枝、線状または環状）誘導体で
あって、置換基はたとえばヘテロ原子（たとえばα窒素または遠位窒素）、またはプロ−
Ｒ位のα炭素上のいずれであってもよい。実例となる化合物には以下のものが挙げられる
：Ｎ−ε−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−
（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−γ、γ’−ジエチル−ホモアルギニ
ン。アルキル基がα炭素のプロ−Ｒ位を占める、α−メチルアルギニン、α−メチル２，
３−ジアミノプロピオン酸、α−メチルヒスチジン、α−メチルオルニチンのような化合
物も包含される。また、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ここでヘテロ芳香族基は１以
上の窒素、酸素または硫黄原子を単独または組み合わせて有する）カルボン酸、または酸
塩化物、活性エステル、活性アゾリドおよび関連する誘導体のような多くの周知の活性化
誘導体のいずれか、ならびにリジン、オルニチン、または２，３−ジアミノプロピオン酸
から形成されるアミドも包含される。

酸性アミノ酸の置換：アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、２，４−ジ
アミノプロピオン酸のチロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロ
アリール スルホンアミド、オルニチンまたはリジンおよびテトラゾール−置換アルキル
アミノ酸を含む。

側鎖アミド残基の置換：アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンまたはグルタ
ミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む。
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換：セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミ
ノプロピオン酸、およびセリンまたはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含
む。また、上記のそれぞれのカテゴリー内のアミノ酸は同じ群の別のものに置換してもよ
いことが理解される。

アミド結合の置換
特許の範囲内での他の型の改変は、ポリペプチドの骨格内のアミド結合を置換すること
である。たとえば、望ましくないタンパク質分解、または血清安定性を減少させて生物活
性を低下もしくは消失させる他の分解経路を減らすかもしくは除去するため、またはコン
ホメーションの柔軟性を制限するかもしくは増大させるため、所望の方法で、存在するコ
ンホメーションを模倣するかまたはコンホメーションを変化させる官能基でペプチド骨格
内のアミド結合を置換することはよくあることである。そのような改変は、増大した結合
親和性または改善された薬物動態学的挙動を生み出すことができる。ペプチド合成技術の
分野に精通している者は、得られるペプチドが同じかまたは改善された活性を有すること
ができると予想して、２つのアミノ酸を結合するいずれかのアミド結合に対し、以下のよ
うにアミド結合を変化させることができると理解される：α−Ｎ−メチルアミドまたはペ
プチドアミド骨格チオアミドの挿入、同系の第２アミンを生み出すためのカルボニルの除
去、セミカルバゾン誘導体を生み出すためのアザ−アミノ酸による１アミノ酸の置換、な
らびにアミド結合代替物としてのＥ−オレフィンおよび置換したＥ−オレフィンの使用。

Ｄ−アミノ酸の導入
特許の範囲内での他のアプローチは、不安定なペプチド結合に遠位または近位のＤ−ア
ラニンまたは他のＤ−アミノ酸の導入である。この場合、置換されるＬ−アミノ酸に対し
、Ｄ−アミノ酸の側鎖が保存的置換ではないようなＤ−アミノ酸で、そのようなＤ−アミ
ノ酸置換をすることが可能であり、そして時に置換する必要があることが当業者には理解
される。これはキラリティーの違い、したがって側鎖配向性の違いのためであり、置換さ
れたＬ−アミノ酸の側鎖により提供されるものとは荷電、疎水性、立体的必要条件などが
異なる部分を有する標的が、未検討の結合部位領域に接近することを可能にする。

薬物動態学的および薬力学的特性を改善するための改変
具体的な適用におけるＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの使用は
、薬物動態学的および薬力学的挙動を改善するためにペプチドの改変またはペプチドの製
剤化を必要としてよいことも理解される。ペプチドの特性は、所望の物理的または化学的
特性を付与すると考えられる部分の結合により変えられると予想される。そのような部分
は、酸またはアミンを使用してそれぞれアミド結合もしくは尿素結合を介してペプチドに
付加させてよく、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはペプチド中に適切に位置する
リジンもしくはリジン誘導体、２，３−ジアミノプロピオン酸、オルニチン、またはペン
ダントアミン基またはペンダントアルコキシアミンもしくはヒドラジン基を有するペプチ
ド中の他のアミノ酸のペンダントアミノ基に付加させてよい。導入される部分は、目的の
ペプチドおよびその特性を改変するための現存している要件に依存して、親水性、塩基性
、または無極性アルキルもしくは芳香族基である基であってよい。

アミノ酸残基のグリコシル化
本発明の範囲内でのさらに他の改変は、グリコシル化アミノ酸残基（たとえば、セリン
、スレオニンまたはアスパラギン残基）を、単独で、または結合部分（または複数の部分
）もしくはリンカー部分または両方のいずれかにおいて組み合わせて使用することである
。標準状態を使用して行うことができるグリコシル化は溶解度を高めるため、薬物動態学
および薬力学的を変化させるため、またはグリコシド部分を含む特異的または非特異的相
互作用を介して結合を促進するために使用することができる。別の方法では、Ｏ−（２−
アセトアミド−２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シル）セリンまたは類似のスレオニン誘導体（Ｄ−またはＬ−アミノ酸）のようなグリコ
シル化アミノ酸を、手動もしくは自動固相ペプチド合成中に、または手動もしくは自動溶
液相ペプチド合成においてペプチドに取り込むことができる。同様に、Ｄ−またはＬ−Ｎ
^γ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−アスパラギンを使用することができる。グリコシル化に使用すること
ができる適切に官能化および活性化された炭水化物部分の作用により、ペンダント酸素、
窒素または硫黄官能基上でグリコシル化されたアミノ酸の使用が期待される。そのような
炭水化物官能基は単糖、二糖、またはオリゴ糖のより大きな集合体であってよい（Ｋｉｈ
ｌｂｅｒｇ，Ｊａｎ．（２０００）Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ
ｎ；Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｄ
．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ８
章、ｐｐ１９５−２１３）。

また、アノマー炭素での脱離基の活性化を介した、グリコシル化以外の手段によるアミ
ノ酸の炭水化物官能基の付加が期待される。グリコシドへのアミノ酸の結合は炭水化物官
能基のアノマー炭素への結合の形成に限定されない。そのかわり、アミノ酸への炭水化物
部分の結合は、Ｃ−ヘテロ原子、Ｃ−Ｃまたはヘテロ原子−ヘテロ原子（例としてはＳ−
Ｓ、Ｏ−Ｎ、Ｎ−Ｎ、Ｐ−Ｏ、Ｐ−Ｎが挙げられる）結合のために使用される、当該技術
分野で公知の方法によるいずれかの適切で十分に反応性の酸素原子、窒素原子、炭素原子
、または他の炭水化物官能基のペンダント原子を使用するものであってよい。

塩の形成
これらのペプチドの水溶性または形成し易さを増すことができる、異なる塩を形成する
ことも本発明の範囲内である。これらには、Ｎ−メチルグルカミン（メグルミン）、酢酸
塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられるが、それらに限定されない。

構造特性を保持する構造改変
本発明の範囲内でのさらに他の改変は、環状ポリペプチドの切断である。本発明の多く
のポリペプチドの環の性質は、とりわけ環の内部で、ペプチド配列が利用できる立体構造
の空間を限定する。したがって、Ｎ末端またはＣ末端領域のいずれかにおいて、環から遠
位のまたは近位であっても１以上の残基によりペプチドを切断すると、類似または改善さ
れた生物活性を有する短鎖ペプチドを提供することができる。結合活性にかかわるアミノ
酸の特有の配列は、３アミノ酸程度であっても同定され、ＲＧＤペプチドとして表される
（たとえばＰｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７０（１）：１１０−５（１９８７）
；Ｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，２６３（３６）：１９４３３−１９４３６（１９８８）；Ｔａｕｂ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６
４（１）：２５９−６５（１９８９）；Ａｎｄｒｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４（１６）：９２５８−６
５（１９８９）；および米国特許第５，７７３，４１２号および米国特許第５，７５９，
９９６号を参照されたい。これらはそれぞれ本明細書中に援用される。

また、無関係なアミノ酸は取り除くが、実質的に重要な結合残基は含むように大きなペ
プチド環を実質的に短縮できることが文献に示されている。本明細書中に援用される米国
特許第５，５５６，９３９号を参照されたい。

短縮された環状ペプチドは、ジスルフィド結合または適切に位置するカルボン酸基とア
ミノ基とのアミド結合を使用して形成することができる。
さらに、Ｄ−アミノ酸をペプチド配列に添加して、回転特性を安定化することができる
（とりわけグリシンの場合）。別の方法では、α、β、γまたはδジペプチドまたは回転
模倣物（たとえばα、β、γまたはδ模倣物）（そのいくつかは図２６の１、２および３
に図式化されている）を使用して、ペプチド中の構造モチーフおよび回転特性を模倣し、
同時にタンパク質分解に対する安定性を提供し、たとえば立体構造の安定性および溶解度
のような他の特性を促進することができる（構造１：Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒ
ｇ．Ｃｈｅｍ．，６４：２９９８−２９９９（１９９９）；構造２：Ｈａｎｅｓｓｉａｎ
ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｅｐｔｉｄ
ｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｓｃａｆｆｏｌｄ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２３：Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ，Ｗ．Ｍ．Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，編（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔ
ｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，１９９９），１０章，ｐｐ．１６１−１７４；構造３：ＷＯ０１
／１６３５）。

ジスルフィド模倣物の置換
本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチド内のジスルフィド結合に対
するジスルフィド模倣物の置換も本発明の範囲内である。

^９９ｍＴｃを基にした放射性医薬品作製にジスルフィド含有ペプチドを使用する場合、
重大な問題はジスルフィド結合の存在である。過テクネチウム酸イオンの還元、およびそ
の後のＴｃ特異的キレート基を生じる物質への還元Ｔｃ種の取込に依存する経路を介して
^９９ｍＴｃを取り込むように設計された手順中に、ジスルフィド結合の完全性を維持する
ことは困難である。これは、放射性医薬品をワンステップで作製するように考案されたキ
ット製品において一般的に使用される還元剤により、ジスルフィド結合がかなり容易に還
元されるためである。したがって、Ｔｃキレート化中にジスルフィド結合が還元されやす
いことが、ジスルフィド結合の模倣物による置換を必要とするかもしれない。したがって
、本発明の範囲内での他の改変は、本発明のＫＤＲ結合ポリペプチドの活性および他の所
望の特性を維持しながら、本明細書に開示されるかまたは当業者に公知の方法を使用して
ジスルフィド部分を模倣物で置換することである：
１）オキシムリンカー
オキシム部分は多くの状況において研究者らによりリンカーとして使用されている。Ｍ
ｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，の研究（Ｗａｈｌ ａｎｄ Ｍｕｔｔｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３７：６８６１−６８６４（１９９６））は最も興味深いもので
ある。アミノアルコール官能基を含有するアミノ酸４、およびアルコキシアミノ官能基を
含有する５はペプチド鎖に取り込まれるが、必ずしもペプチド鎖の末端ではない（図２７
）。ペプチド形成後、側鎖保護基は除去される。アルデヒド基は暴露され、オキシム結合
が形成される。

２）ランチオニンリンカー
ランチオニンは環状スルフィドであり、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）は炭素−硫黄（Ｃ
−Ｓ）結合により置換される。したがって、還元に対する不安定性はかなり低い。ランチ
オニンは１９７１年以来、多数の方法により作製されている。

ブロモアセチル化ペプチドを使用したランチオニンの作製
ランチオニンは公知の方法により容易に作製することができる。たとえば、Ｒｏｂｅｙ
ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７：３７３−３７７（１９８９）；
Ｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４５８−４６
３（１９９１）；Ｐｌｏｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５：４１８
５−４１９４（１９９２）；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｆｒｏｎ
ｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ”ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ １５^ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｔ
ａｍ＆Ｋａｕｍａｙａ（編），Ｊｕｎｅ １４〜１９，１９９５，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，
Ｔｅｎｎ．（Ｋｌｕｍｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂ．，Ｂｏｓｔｏｎ），ｐｐ．２９
１−２９２；Ｗａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ Ｔｏｋｙｏ Ｋｏｈｏ，
ＪＰ ０７３００４５２ Ａ２（１９９５）を参照されたい。Ｂｏｃ自動ペプチド合成機
を使用したペプチドの作製、その後のペプチド末端とブロモ酢酸とのカップリングにより
十分な収率でブロモアセチル化ペプチドが得られる。ペプチドの開裂および脱保護はＨＦ
／アニソールを使用して行われる。ペプチドがシステイン基を有する場合、その反応性は
低いｐＨにより制御できる。培地のｐＨを６〜７に上げると、ポリマー化または環化のい
ずれかが起こる。ポリマー化は高濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）が好都合であるが、一方環化
は低濃度（１ｍｇ／ｍＬ）が好都合であり、たとえば６は７に環化する（スキーム１：図
２８）。

Ｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，は、Ｂｏｃペプチド合成に使用して配列のどこかにブロモ
アセチルを生じる部分を配置することが可能であるブロモアセチル基の担体としてのＮ^α
−（Ｂｏｃ）−Ｎ^ε−［Ｎ−（ブロモアセチル）−β−アラニル］−Ｌ−リジンの使用を
示した。予備的な実験において、かれらはシステインからブロモアセチル−リジン誘導体
を分離する４〜６アミノ酸を持つペプチドが環化する傾向があることを見出し、この方法
の潜在的な有用性を示した。

アクリルアミドへのシステインチオール付加によるランチオニンの作製
この方法のいくつかの変法を使用することができる。樹脂結合セリンは、ブロム化−デ
ヒドロブロム化−チオール付加の順序を使用するか、またはジスクシニミジルカーボネー
トによる脱水、その後のチオール付加のいずれかにより作製することができる。Ｐｌｏｉ
ｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５：４１８５−４１９４（１
９９２）；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ”ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １
５^ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｔａｍ＆Ｋａｕｍａ
ｙａ（編），Ｊｕｎｅ １４〜１９，１９９５，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，Ｔｅｎｎ．（Ｋｌ
ｕｍｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂ．，Ｂｏｓｔｏｎ）、ｐｐ．２９１−２９２。アク
リルアミドへのチオール共役物付加も詳細に記載され、アクリルアミドへの２−メルカプ
トエタノールの付加について言及されている。Ｗａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｋｏ
ｋａｉ Ｔｏｋｙｏ Ｋｏｈｏ，ＪＰ ０７３００４５２ Ａ２（１９９５）。

３）ジアリールエーテルまたはジアリールアミン結合：アリールボロン酸およびチロシ
ンの分子内環化に由来するジアリールエーテル結合
最近、空気中、周囲温度で、ジクロロメタン中において塩基としてピリジンまたはトリ
エチルアミンを使用した、酢酸銅存在下におけるフェノール、アミンおよびヘテロ環式ア
ミンとアリールボロン酸の反応が十分な収率（９８％の高率）で非対称ジアリールエーテ
ルおよび関連するアミンを提供することが報告されている。Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９：２９３７−２９４０（１９９８）；Ｃｈａ
ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９：２９３３−２９３６（
１９９８）；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９：２９
４１−２９４４（１９９８）を参照されたい。Ｎ−保護チロシン誘導体がフェノール成分
の場合、収率は同様に９８％の高さであった。このことは、アミノ酸アミド（ペプチド）
が形質転換に安定で、収率が高いことを示す。ペプチドからラクタムへの容易な分子内環
化、Ｓ_ＮＡｒ反応に基づいた分子内ビアリールエーテル形成および高度の希釈条件下また
は樹脂上での分子内環化反応の一般性の点から見て、分子内反応に関する先例が存在する
。ここで擬希釈効果は高度な希釈条件を模倣する。

４）システイン部分とペプチドアルデヒドの分子内反応を介したチアゾリジン結合によ
る環状ペプチドの形成
使用可能な別の方法としては、近接アミノメルカプタン官能基（たとえば、通常線状配
列の末端におけるシステインの配置に由来するか、またはリジンの側鎖窒素を介して配列
に結合する）およびアルデヒド官能基の分子内環化が挙げられ、それはチアゾリジンを提
供して二環式ペプチドを形成し、その環の一方は主鎖の残基により形成され、２番目の環
はチアゾリジン環である。スキーム２（図２９）は１つの例を提供する。必要なアルデヒ
ド官能基は、適切に配置された近接アミノアルコール官能基のメタ過ヨウ素酸ナトリウム
開裂により作製可能であり、そしてそれはリジン部分への側鎖アミノ基への付加により鎖
に結合した非保護セリンとして存在することができる。ある場合には、必要なアルデヒド
官能基は、鎖のＣ末端またはＮ末端での保護されたアルデヒド誘導体の暴露により作製さ
れる。この方法の実例はＢｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１
１８：１００１８−１００３４（１９９６）に見出される。

５）樹脂上のカルボキシル基とペンダントアミノ基の分子内環化に基づくラクタム
大環状ペプチドは頭部から尾部への環化またはペンダント基の環化によるラクタム形成
により作製されている。基本的方法は、アミン保護基およびカルボキシル保護基を選択的
に除去することができる、十分に保護されたペプチドを作製することである。直交保護法
が開発されている。開発されているものの中で、アリル、トリチル、およびＤｄｅ法が最
も使用されている。Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ”、ｉｎ Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｃｈ
ａｎ（編）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２
０００），６章，ｐｐ．１６９−１７８を参照されたい。Ｄｄｅ法は、カルボン酸官能基
（Ｄｍａｂエステル）およびアミノ基（Ｄｄｅ基）の両方に対して類似した保護基を使用
するため興味が持たれる。両基は周囲温度でＤＭＦ中２〜１０％ヒドラジンにより除去さ
れる。あるいは、Ｄｄｅはアミノ基に対して使用され、そしてアリル基がカルボキシルに
対して使用されてもよい。

標準ペプチドカップリング試薬（たとえばＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰなど）を使用した分子
内カップリングにより得られるラクタム官能基は、ジスルフィド結合の代替物として作用
することができる。Ｄｄｅ／Ｄｍａｂ法は、スキーム３ａ（図３０）に示す。

したがって、たとえばＤｄｅ保護リジンおよびＤｍａｂエステルを含む線状配列は、低
負荷（約０．１〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）において、Ｔｅｎｔａｇｅｌを基礎にしたＲｉｎ
ｋアミド樹脂上で作製することができる。ヒドラジンによる両官能基の脱保護、続く樹脂
上の環化により所望の生成物が得られる。

アリル法では、スキーム３ｂ（図３１）に示すように、環化を受けることになるペンダ
ントカルボキシル基はアリルエステルとして保護され、そしてペンダントアミノ基はアロ
ック（ａｌｌｏｃ）基として保護される。樹脂上で、両基はＤＭＦ中、Ｎ−メチルモルホ
リンおよび酢酸の存在下、パラジウムトリス−トリフェニルホスフィンによる処理により
選択的に暴露される。残りのパラジウム塩はＤＭＦ中ＤＩＥＡの存在下でジエチルチオカ
ルバメートナトリウムを使用して取り除き、その後ＤＭＦで洗浄する。ラクタム環は、Ｎ
−メチルモルホリンの存在下でＨＡＴＵ／ＨＯＡｔを使用して形成される。上記のように
、他のカップリング試薬も使用することができる。上記のようにペプチドプロセシングが
行われ、所望のペプチドラクタムを提供する。

その後、樹脂からの開裂および精製も行うことができる。ペプチドのＮ末端の官能基化
に関しては、アミノ酸、たとえばトランス−４−（ｉＶ−Ｄｄｅ）メチルアミノシクロヘ
キサンカルボン酸、トランス−４−（ｉＶ−Ｄｄｅ）メチルアミノ安息香酸、またはそれ
らのアロック同族体を使用することができると理解すべきである。さらに別の方法は、樹
脂からの開裂中の分子内ラクタム形成にセーフティーキャッチ法を使用することである。

したがって、たとえばＤｄｅ保護リジンおよびＤｍａｂエステルを含む線状配列は、低
負荷（約０．１〜０．２ｍｍｏｌ／ｇ）において、Ｔｅｎｔａｇｅｌを基礎にしたＲｉｎ
ｋアミド樹脂上で作製することができる。ヒドラジンによる両官能基の脱保護、続く樹脂
上の環化により所望の生成物が得られる。その後、樹脂からの開裂および精製も行うこと
ができる。ペプチドのＮ末端の官能化に関しては、ジアミノ酸、たとえばトランス−４−
（ｉＶ−Ｄｄｅ）メチルアミノシクロヘキサンカルボン酸またはトランス−４−（ｉＶ−
Ｄｄｅ）メチルアミノ安息香酸が必要であると理解すべきである。別の方法は、樹脂から
の開裂中の分子内ラクタム形成にセーフティーキャッチ法を使用することである。

６）オレフィン複分解に基づく環状ペプチド
Ｇｒｕｂｂｓ反応（スキーム４、図３２）はオレフィン結合の複分解／環化を含み、そ
して以下に示すように説明される。Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄ
ｔｅ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｎ．Ｅｎｇｌ．，３６：２０３６−２０５６（１９９７）
；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：９６０６−９
６１４（１９９６）を参照されたい。

出発物質がジオレフィン（１６）である場合、得られる産物は環状化合物（１７）であ
ることは容易に理解される（図３２）。反応は、実際オレフィン官能化ペプチドからの環
状化合物の作製に適用されている。たとえば、Ｐｅｒｎｅｒｓｔｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０：１９４９−５０（１９９７）を参照されたい；ま
たＣｏｖａｌｅｎｔ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ
ｙｌｉｎｄｒｉｃａｌβ−ｓｈｅｅｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ｃｌａ
ｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，５（２）：７８２−７９２（１９９９）
；Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｖａｌｅｎｔｌ
ｙ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｂｙ ｒｉｎｇ−ｃ
ｌｏｓｉｎｇ ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ
．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７（２３）：３２８１−３２８４（１９９８）；Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｙｃｌｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｓ ｕｓｉｎｇ Ｇｒｕｂｂｓ ｏｌｅｆｉｎ ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ，Ｒｉｐｋａ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８（４）：３５７−３７６０（１９９８
）；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｎｇ−ｃｌｏｓｉｎｇ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ
ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｒｉｇｉｄｉｆｉｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃ
ｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．，１１８（４０）：９６０６−９６１４（１９９６）；Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｂｙ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｃａｐｔｕｒｅ，Ｄｅｓｉｇｎ ｏ
ｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｙｌｉｎｄｅｒ ｖｉａ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｂｏｎｄ−Ｐ
ｒｏｍｏｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｌｅｆｉｎ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ
，Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７（４９）：１２３
６４−１２３６５（１９９５）；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ａｌｌｙ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｏｌｅｆｉｎ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７（２１）：５８５５−５８５６（１９９５
）を参照されたい。ジスルフィド結合含有ペプチドの代替物としてのカルバブリッジ環状
ペプチドを作製するために、Ｃ−アリル化アミノ酸またはおそらくＮ−アリル化アミノ酸
のいずれかを作製し、この反応においてそれらを使用することができる。

また、オレフィン基を持つ新規化合物を作製することができる。オレフィン含有テザー
を持つチロシンヒドロキシルの官能化は一選択肢である。リジンε−アミノ基はたとえば
アシル化部分の一部としてのオレフィン含有ユニットの付加物を持つ別の選択肢である。
かわりにリジン側鎖アミノ基がオレフィン含有テザーによりアルキル化される場合、それ
はさらにレポーターの結合点として依然として機能することができる。リジン、オルニチ
ン、またはジアミノプロピオン側鎖アミノ基のアシル化剤としての５−ペンタン酸の使用
は、別の可能性である。オレフィン含有テザーの長さも構造活性関連を調べるために変化
させることができる。

ペプチド配列の操作
本発明の範囲内での他の改変にはペプチド配列の一般的な操作が挙げられ、それは類似
または改善した生物学的特性を有するペプチドを生じると考えることができる。これらに
は、アミノ酸転位（配列中のアミノ酸を交換する）、元の配列または改変した元の配列の
かわりのレトロインベルソペプチドの使用、ペプトイドおよびレトロ−インベルソペプト
イド配列が挙げられる。具体的な残基がペプチドのかわりにペプトイドであり、それらが
完全にペプチドでもなく、完全にペプトイドでもないハイブリッド分子を生じる構造も同
様に考えられる。

リンカー
本発明の範囲内でのさらなる改変には、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプ
チドの標的化配列と検出可能な標識または治療薬間へのリンカーまたはスペーサーの導入
が挙げられる。そのようなリンカー／スペーサーの使用は、結合ペプチドの適切な特性を
改善する（たとえば、血清安定性を増大させる、など）ことができる。これらのリンカー
には、当該技術分野で一般的な、置換、または非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコー
ル誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、または脂肪族もしくは芳香族スペーサーが挙げられ
るが、それらに限定されない。さらにまた、上記の部分の組み合わせであるリンカーを使
用して、ペプチドの特性に特定の利点を与えることができる。リンカーを持つ脂質分子は
結合して超音波バブル、リポソームまたは他の凝集に基づいた構築物を形成することがで
きる。そのような構築物は診断レポーター、治療薬（たとえば、治療のための化学的「弾
頭」）またはこれらの組み合わせの標的化および送達のための物質として使用することが
できる。

ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの多量体構築物
また、本発明の１種以上のＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの
二量体、多量体、またはポリマーを使用する構築物が企図される。実際、二量体および多
量体の形成によって効力の低いペプチドまたは低分子の結合を実質的に増加できるいう十
分な文献報告がある。したがって、二量体および多量体構築物（同種または異種の両方）
は本発明の範囲内である。実際、実施例でより詳細に説明するように、二量体または多量
体構築物中に複数のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチド配列を含むこ
とは本発明の範囲内である。さらに、以下の実施例４で示すように、これらの構築物は単
量体構築物に比べ改善された結合を示すことができる。二量体構築物のポリペプチド配列
は、それらのＮ末端、もしくはＣ末端、または適切に配置されたリジン部分（またはペン
ダントオキシアミノまたは他の求核基のような選択的に誘導体化可能な基を生じる別の官
能基）のＮ−ε窒素に結合可能であるか、または適切な結合化学を使用して１以上のリン
カーを介して一緒になることができる。このカップリング化学には、アミド、尿素、チオ
ウレア、オキシム、またはアミノアセチルアミド（クロロ−またはブロモアセトアミド誘
導体由来）が挙げられるが、それらに限定されない。たとえば、以下の方法のいずれかを
使用して、本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの二量体また
は多量体構築物を作製することができる。

方法Ａ
十分に保護されたＫＤＲ結合ペプチドは、自動または手動Ｆｍｏｃペプチド合成プロト
コールを使用してＥｌｌｍａｎ型セーフティーキャッチ樹脂上で構築することができる。
Ｂａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８（１２）：３０５５
−５６（１９９６）。それとは別に、当該技術分野で公知のペプチド合成の標準法を使用
して、ジ−リジン誘導体を２−クロロトリチル樹脂上で合成することができる。たとえば
、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｇｒａｎｄ，編．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ Ｃｏ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２），３章，ｐｐ．７７−１８３；Ｂａｒｌｏｓ
ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｉｎ
Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｎ，
Ｗ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ、Ｐ．Ｄ．，編（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００），９章，ｐｐ．２１５−２２８を参照されたい
。側鎖保護基を除去せずに、２−クロロトリチル樹脂からのこれの遊離、カルボキシル基
の活性化、およびいずれかのアミン官能化標識基とのカップリングはジ−リジン誘導体を
提供し、そのペンダント窒素原子は暴露されて２種の遊離アミノ基を得ることができる。
先に記載のセーフティーキャッチ樹脂は活性化され、所望するＮ−脱保護標識基−官能化
ジ−リジン誘導体が活性化セーフティーキャッチ樹脂に付加される。ペンダントアミノ基
は、今度は樹脂から離れ、ジ−リジン構造の構成部分であるセーフティーキャッチ樹脂結
合ペプチドのカルボキシ末端によりアシル化される。過剰なセーフティーキャッチ樹脂結
合ペプチドを使用してジ−リジン構築物のアミノ基の完全な反応を保証することができる
。このスキームにおける反応パートナーの比の最適化は収率を最適化する。ＫＤＲ結合ペ
プチド上の保護基はトリフルオロ酢酸を基礎にした開裂プロトコールを使用して取り除く
。

１つの構築物中に２以上のＫＤＲ結合ペプチドが存在する二量体および多量体構築物の
合成は容易に行うことができる。直交保護スキーム（たとえば、１窒素上にアリルオキシ
カルボニル基および他の窒素上にＦｍｏｃ基、または他の窒素上にｉＶ−Ｄｄｅ保護基と
結合したＦｍｏｃ基を使用する）を使用して、上記のジ−リジン誘導体のペンダント窒素
原子を区別することができる。

アミノ基の１つを暴露し、得られた産物を上記の活性化セーフティーキャッチ樹脂結合
ＫＤＲ結合ペプチドと反応させると、結合した単一のＫＤＲ結合ペプチドを有するジ−リ
ジン構築物が提供される。第２の保護基の除去は残っている窒素を暴露する。Ｍｅｌｌｏ
ｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
”ｉｎ Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃ
ｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ、Ｐ．Ｄ．，編（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００），６章，ｐｐ．１６９−１７６も参照
されたい。得られた産物と別のＫＤＲ結合ペプチドを提示する第２のセーフティーキャッ
チ樹脂を反応させて十分に保護されたホモ二量体構築物を提供し、トリフルオロ酢酸によ
り保護基を除去した後、所望する物質を提供する。

方法Ｂ
通常Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコールを使用して、ＫＤＲ結合ペプチドは自動または
手動ペプチドカップリング法によりＲｉｎｋアミド樹脂上に集められる。ペプチドは、た
とえばリジン部分のε−アミノ基のような付加的な求核基を有してよいリンカーまたはリ
ンカー標識基構築物により官能化されたＣ末端またはＮ末端を有してよい。保護基の開裂
は、トリフルオロ酢酸を使用して、ペプチドの性質に依存した適切な調節物質により行う
ことができる。十分に脱保護されたペプチドはその後、市販のグルタル酸ビス−Ｎ−ヒド
ロキシスクシニミドエステル（Ｔｙｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）のような
過剰な二官能求電子試薬と反応する。得られたグルタル酸のモノアミド化、モノ−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシニミジルエステルは次に同じペプチドの付加的な当量、または異なるＫＤ
Ｒ−結合ペプチドの当量で処理する。得られた物質のＨＰＬＣによる精製により適切な標
識基を生じる所望のホモ二量体構築物が得られる。

方法Ｃ
モジュール式スキームを使用して、上記の適切な標識基を生じる二量体またはより重合
した多量体構築物を作製することができる。簡単に説明すると、ｆｍｏｃ−リジン（ｉＶ
−Ｄｄｅ）Ｒｉｎｋアミド樹脂をピペリジンで処理し、ｆｍｏｃ部分を除去する。次に標
識官能基、たとえばビオチン、５−カルボキシフルオレセインまたは、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−ＯＨを窒素原子に結合させる
。樹脂は次にヒドラジンで処理してｉＶ−Ｄｄｅ基を除去する。完全な洗浄後、樹脂をＤ
ＭＦ、ＮＭＰまたはジクロロメタンのような適切な溶媒中で、塩化シアヌル、およびジイ
ソプロピルエチルアミンのようなヒンダード塩基で処理し、樹脂に結合した単官能化ジク
ロロトリアジンを提供する。その後、残余塩素原子のＫＤＲ結合ペプチドの２当量による
順次置換は、樹脂結合ホモ二量体標識基官能化構築物を提供する。Ｆａｌｏｒｎｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９（４１）：７６０７−７６１０（
１９９８）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，５
４（１６）：４０９７−４１０６（１９９８）；Ｓｔａｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１／２）：７５−８０（１９９６）。生じるペプチドは、
状態が保証するので保護されても保護されなくてもよい。保護基の開裂は上記のようなト
リフルオロ酢酸を基礎にした脱保護試薬を使用して行われ、そして所望の物質は高速液体
クロマトグラフィーにより精製される。

これらの方法のそれぞれにおいて、リジン誘導体を順次使用して多量体の多重度を増や
すことができる。ＫＤＲ結合ペプチド間の距離を変化させる足場として作用するために必
要数のマスクされまたは直交保護された窒素原子を有する関連したより堅い分子を使用し
て（互いにおよびレポーターに対してＫＤＲ結合ペプチドの運動および相対的位置を束縛
することにより）構築物の堅さを増すことは、完全にＡ〜Ｃの方法および本明細書に記載
されるすべての他の方法の範囲内である。先に引用された参考文献はそのまま本明細書に
援用される。

ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの用途
本発明に記載のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分はｉｎ ｖｉｔｒｏおよ
びｉｎ ｖｉｖｏでＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の検出および／または画像化、
とりわけ先に説明したように、ＶＥＧＦおよびＫＤＲが密接に関与する血管新生部位の検
出および／または画像化に非常に有用である。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体のア
ッセイまたは画像化のいずれか適切な方法を使用することができる。本発明のＫＤＲおよ
びＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分はまた、血管新生に関連した疾患状態または多数の病
因に関連した状態を含む、多様なそのような疾患状態の治療に役立つ。本発明のＫＤＲお
よびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は、それら自体治療薬として使用してよく、または
血管新生部位を含むＫＤＲ発現細胞に１以上の治療薬（たとえば、化学療法剤、放射線治
療剤、遺伝物質など）を局在化させるために使用できる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ
溶液でのＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の検出には、本発明に記載の結合ポリペ
プチドを検出可能に標識して、たとえば蛍光的に標識、酵素的に標識、または放射性もし
くは常磁性金属で標識して溶液と接触させてよく、その後結合ポリペプチドとＫＤＲまた
はＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体標的間の複合体の形成を検出することができる。例としては、
蛍光標識ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＫＤ
ＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体検出アッセイに使用してよく、ここでペプチドは溶液に
添加され、結合が起きる条件下でＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体が試験される。蛍
光標識ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドとＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤ
Ｒ複合体標的間の複合体は、遊離ペプチドに比較した、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複
合体結合ペプチドから生じる増大した蛍光偏光を測定することにより、検出し、定量する
ことができる。

あるいは、サンドイッチ型「ＥＬＩＳＡ」を使用してもよく、ここでＫＤＲまたはＶＥ
ＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、プラスチックチューブまたはウェルのような固
体支持体上に固定化され、そしてＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体標的を含むと推定
される溶液と固定化結合部分を接触させ、非結合体を洗浄し、複合体形成したポリペプチ
ドをＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体を認識するモノクローナル抗体のような適切な
検出試薬を使用して検出する。モノクローナル抗体は、たとえば放射標識、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼなどのような酵素との結合、蛍光標識などで検出可能に標識され
ていることを含む、当該技術分野で公知の慣用の手段により検出可能である。

溶液中または溶液由来の可溶性ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の検出または精製
のために、本発明の結合ポリペプチドをクロマトグラフィー支持体または他のマトリクス
材料のような固体基質上に固定化し、固定化された結合体を結合ポリペプチド：ＫＤＲ複
合体、または結合ポリペプチド：ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の形成に適切な条件下で、溶液
に負荷するか、または溶液と接触させることができる。溶液の非結合部分はたとえば、抗
ＫＤＲもしくは抗ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体抗体または抗結合ポリペプチド抗体を使用して
検出してよく、またはＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体標識は適切な溶出条件で結合
部分から遊離させてもよい。

血管新生の生物学およびそれを開始し、維持することにおけるＶＥＧＦおよびＫＤＲの
役割は多くの研究者によって検討されていて、研究および開発の活発な分野であり続けて
いる。そのような研究および開発の促進において、大量のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ
複合体を純粋な形状で精製する方法が好ましく、そして上記の通常の精製法を使用した本
発明に記載の結合ポリペプチドはその目的にとりわけ有用である。
ｉｎ ｖｉｖｏ
診断画像法
本発明に記載のポリペプチドのとりわけ好ましい用途は、たとえば生存および転移に血
管新生を必要とする新生物性腫瘍、または他の血管新生活性部位のような、ＫＤＲ発現組
織の肉眼的に判読し易い画像の作製である。本明細書に開示されたＫＤＲおよびＶＥＧＦ
／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、所望によりリンカーを介して、診断用検出に適切な
標識とポリペプチドを結合することにより造影剤に変換させることができる。好ましくは
、他の血清タンパク質よりＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対してより高い特異性
を示すペプチドを、使用することになる検出方法に適切な標識に結合または連結する。た
とえば、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、核磁気共鳴画像法（
ＭＲＩ）に適切な常磁性キレート剤に対するリンカー（またはリンカーなしに）、Ｘ線、
ＰＥＴ、もしくはシンチグラフィーイメージングに適切な放射性標識（放射性金属に対す
るキレート剤を含む）、超音波検出に適切な超音波造影剤（たとえば安定化マイクロバブ
ル、超音波造影剤、ミクロスフェアまたはガス封入「リポソーム」と呼ばれているもの）
、または光学画像化色素と結合することができる。

適切なリンカーは、当該技術分野で公知の置換または非置換アルキル鎖、アミノ酸鎖（
たとえばポリグリシン）、ポリエチレングリコール、ポリアミド、および他の簡単な高分
子リンカーであってよい。

一般に、検出可能に標識されたＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体部分を使用する技
術は、患者の身体外部で検出可能なシグナルを標識が発生するという前提に基づく。たと
えば、検出可能に標識されたＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分が、たとえば
血管新生の検出が望ましい患者に投与される場合、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体
に対するＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分の高親和性が、結合部分を血管新
生部位に結合させ、そして血管新生部位に標識を蓄積させる。血管新生部位に標識した結
合部分が局在するには十分な時間が予想される。標識ペプチドにより発生したシグナルは
使用する標識の型に従って変化するスキャンニング装置により検出され、そしてシグナル
は血管新生部位の画像に変換される。

別の態様において、検出可能な標識または放射線治療用造影剤によりＫＤＲまたはＶＥ
ＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを直接標識するかわりに、本発明のペプチドをたと
えば、アビジン、ビオチン、または検出可能な標識もしくは放射線治療剤に結合する抗体
もしくは抗体フラグメントと結合させることができる。たとえば、１以上のＫＤＲ結合ペ
プチドはＫＤＲ発現細胞にｉｎ ｖｉｖｏで結合するために、ストレプトアビジン（潜在
的に多価結合する）に結合させてよい。非結合標的化構築物が体内から排出された後、標
的化構築物が結合する部位に速やかに濃縮される、ビオチン化された検出可能な標識もし
くは放射線治療用造影剤（たとえば放射性金属と複合体形成したキレート分子）を注入す
ることができる。いくつかの状況におけるこの方法は、検出可能な標識投与後の画像化が
可能になるまでに要する時間を少なくすることができる。それはまた、標的部位でのシグ
ナル対ノイズ比を高め、必要な放射性標識または放射線治療用造影剤の量を減らすことが
できる。これは、たとえば骨髄、腎臓、および肝臓のような正常であるが照射に感受性が
高い身体部位に送達される放射線の線量として放射性標識または放射線治療剤が使用され
る場合、とりわけ有用である。ときどきプレターゲッティング法、または２ステップもし
くは３ステップ法と呼ばれるこの方法は、Ｓ．Ｆ．ＲｏｓｅｂｒｏｕｇｈのＱ．Ｊ．Ｎｕ
ｃｌ．Ｍｅｄ．，４０：２３４−２５１（１９９６）に総説され、これを本明細書に援用
する。

Ａ．核磁気共鳴画像法
本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は好都合には、ＭＲＩで使用す
る造影剤を形成するために１以上の常磁性金属キレート剤と結合することができる。好ま
しい常磁性金属イオンは原子番号２１〜２９、４２、４４、または５７〜８３を有する。
これには、１，およびより好ましくは５以上の不対電子および少なくとも１．７Ｂｏｈｒ
磁子の磁気モーメントを有する遷移金属またはランタン系が挙げられる。好ましい常磁性
金属にはクロム（ＩＩＩ），マンガン（ＩＩ）、マンガン（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（
ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジウム（ＩＩＩ
）、ネオジウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウ
ム（ＩＩＩ）、ジスポジウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）
、ユーロピウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）、クロム（ＩＩＩ）、鉄（Ｉ
ＩＩ）、およびガドリニウム（ＩＩＩ）が挙げられる。３価カチオン、Ｇｄ^３＋は高い緩
和性および低い毒性、さらに患者による金属の望ましくない代謝を最小にするただ１つの
生物学的に好都合な酸化状態で存在するという利点のために、ＭＲＩ造影剤にはとりわけ
好ましい。別の有用な金属は比較的安価なＣｒ^３＋である。Ｇｄ（ＩＩＩ）キレート剤は
１９８８年以来臨床および放射線ＭＲ適用に使用され、現在およそ３０％のＭＲ試験がガ
ドリニウムを基礎にした造影剤を使用する。あるいは、本発明のヘテロ多量体も１以上の
超常磁性粒子と結合することができる。

当業者は、血管新生を検出するために必要な量に従い、そして対象に対する金属の毒性
のような他の因子を考慮して金属を選択するであろう（Ｔｗｅｅｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ（２版）、１巻、Ｐａｒｔａｉ
ｎ ｅｔ ａｌ．，編（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．１９８８），ｐｐ．７９６−
７９７）。一般に、個々の金属の望ましい量はその緩和性に比例し、金属の生体内分布、
薬物動態学および代謝により改変されることになる。

常磁性金属キレート剤（複数のキレート剤）は、常磁性金属のリガンドとして作用し、
それと複合体を形成する１以上の極性基を有する分子である。適切なキレート剤は当該技
術分野で公知であり、メチレンホスホン酸基、メチレンカルボヒドロキサミン酸基、カル
ボキシエチリデン基、またはカルボキシメチレン基を持つ酸が挙げられる。キレート剤の
例としては以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−テトラデカン−１，４，
７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１−置換１，４，７−トリカルボキシメチル−１，
４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（
ＥＤＴＡ）、および１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−１，４，８，
１１−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）。付加的なキレートリガンドには以下のものが挙げられる
：エチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、およびその誘導
体、たとえば５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ、５Ｂｒ−ＥＨＰＧ、５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ、５ｔ−Ｂｕ
−ＥＨＰＧ、および５ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；ベンゾジエチレントリアミンペンタ酢酸
（ベンゾ−ＤＴＰＡ）およびその誘導体、たとえばジベンゾ−ＤＴＰＡ、フェニル−ＤＴ
ＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ、ベンジル−ＤＴＰＡ、およびジベンジルＤＴＰＡ；ビス−
２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）およびその誘導体；
少なくとも３炭素原子、より好ましくは少なくとも６、および少なくとも２つのヘテロ原
子（Ｏおよび／またはＮ）を含む大環状化合物のクラス（その大環状化合物はヘテロ環成
分において一緒になった１環、または２もしくは３環から構成されてよい）、たとえばベ
ンゾ−ＤＯＴＡ、ジベンゾ−ＤＯＴＡ、およびベンゾ−ＮＯＴＡ（ここでＮＯＴＡは１，
４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ″−三酢酸である）、ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベ
ンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここでＤＯＴＭＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカ
ン−１，４，７，１０−テトラ（メチルテトラ酢酸）である）、およびベンゾ−ＴＥＴＭ
Ａ（ここでＴＥＴＭＡは１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８
，１１−（メチルテトラ酢酸）である）；１，３−プロピレン−ジアミンテトラ酢酸（Ｐ
ＤＴＡ）およびトリエチレンテトラアミンヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１，５，１
０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ″−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコレート（
ＬＩＣＡＭ）の誘導体；および１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ″−トリス（２，３−ジヒドロ
キシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）。本発明で使用するための好まし
いキレート剤は、ＤＴＰＡであり、そしてＤＯ３Ａの使用がとりわけ好ましい。本発明に
より企図する代表的なキレート剤およびキレート基はＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ８６／
０６６０５、ＷＯ９１／０３２００、ＷＯ９５／２８１７９、ＷＯ９６／２３５２６、Ｗ
Ｏ９７／３６６１９、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１４７３、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２８１７９、
および米国特許第４，８９９，７５５号、米国特許第５，４７４，７５６号、米国特許第
５，８４６，５１９号、および米国特許第６，１４３，２７４号に記載され、それらのす
べてを本明細書に援用する。

本発明に従って、ＭＲＩ造影剤のキレート剤は、ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドに結合
する。キレート剤（複数のキレート剤）の位置決定は、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複
合体結合ポリペプチドの結合親和性または特異性を妨害しないように選択されるべきであ
る。好ましくは、キレート剤（複数のキレート剤）はＮ末端またはＣ末端のいずれかに付
加されるが、キレート剤（複数のキレート剤）は配列のどこに結合してもよい。好ましい
態様において、遊離中心カルボン酸基（たとえば、ＤＴＰＡ−Ａｓｐ（β−ＣＯＯＨ）−
）ＯｔＢｕ）を有するキレート剤（複数のキレート剤）は、アミド結合の形成により、ペ
プチドのＮ末端に容易に結合する。キレート剤（複数のキレート剤）はまた、リンカーの
補助によりＣ末端に結合することができる。あるいは、ペプチド配列のどこかの遊離アミ
ノ基に、ＤＴＰＡを生じる適切なイソチオシアネート基を結合する方法として、イソチオ
シアネート結合化学を使用することができる。

一般に、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は金属キレート剤（または他の
検出可能な標識）に直接または共有結合的に結合してもよく、またはリンカーを使用して
金属キレート剤にカップリング、または結合してもよく、そのようなリンカーは以下のも
のであってよいが、それらに限定されない：アミド、尿素、アセタール、ケタール、二重
エステル、カルボニル、カルバメート、チオウレア、スルホン、チオエステル、エステル
、エーテル、ジスルフィド、ラクトン、イミン、ホスホリル、またはホスホジエステル結
合；置換または非置換飽和または非飽和アルキル鎖；線状、分枝、もしくは環状アミノ酸
鎖、または単一アミノ酸もしくは異なる複数のアミノ酸（たとえば、ＫＤＲまたはＶＥＧ
Ｆ／ＫＤＲ複合体結合部分のＮ末端またはＣ末端の伸長）；誘導体化もしくは非誘導体化
ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、またはポリビニルピリジン鎖；置換また
は非置換ポリアミド鎖；誘導体化もしくは非誘導体化ポリアミン、ポリエステル、ポリエ
チレンイミン、ポリアクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロール、また
はオリゴサッカライド（たとえばデキストラン）鎖；交互ブロック共重合体；マロン酸、
コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸；カプロン酸；簡単なジアミンおよ
びジアルコール；本明細書に開示された他のリンカーのいずれか；または当該技術分野で
公知のいずれか他の簡単な高分子リンカー（たとえば、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８
／８４９６を参照されたい）。好ましくはリンカーの分子量は厳密に制御されてよい。分
子量は、１００未満から１０００以上までのサイズの範囲であってよい。好ましくはリン
カーの分子量は１００未満である。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで生体内分解性であるリンカ
ーを使用して、本発明のイメージング試薬の効率的な排出経路を提供することが好都合で
あってよい。リンカー内の位置に依存して、そのような生体内分解性官能基には、エステ
ル、二重エステル、アミド、ホスホエステル、エーテル、アセタール、およびケタール官
能基を挙げることができる。

一般に、公知の方法でそのようなリンカーを使用してキレート剤（複数のキレート剤）
とＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分をカップリングさせることができる。た
とえば、ＷＯ９５／２８９６７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９７、および
それらの説明を参照されたい。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は、Ｎ末端
またはＣ末端を通じて、アミド結合を介し、たとえば金属キレート剤の金属配位結合骨格
窒素、または金属キレート剤自体の酢酸アームに結合することができる。金属キレート剤
が毒性を最少化するために金属に強固に結合する能力を保持するならば、本発明はどのよ
うな位置へのキレート剤の結合も企図する。同様に、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合
体結合部分の改変または伸長が、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体への金属キレート
剤の結合能力を損なわないならば、そのような金属キレート剤への結合のための部位を生
み出すために改変または伸長してもよい。

本明細書の開示に従って作製されたＭＲＩ造影剤は、慣用のＭＲＩ造影剤と同じ様式で
使用することができる。血管新生部位を画像化する場合、バックグラウンドの血液および
組織に対する該部位のコントラストを高めるためにある種のＭＲ技術およびパルス配列が
好ましくてよい。これらの技術には、たとえば、急速スピンエコー配列（たとえば、Ａｌ
ｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ，４０（２）：２９８−３１０（１９９８）を参照されたい）のような血液を
暗くするｂｌａｃｋ ｂｌｏｏｄ血管造影法配列およびフロー−スポイルドグラジエント
エコー配列（たとえばＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１７７（１
）：４５−５０（１９９０）を参照されたい）が挙げられるがそれらに限定されない。ま
た、これらの方法としては血管新生性腫瘍およびバックグラウンド組織間のコントラスト
を増す、反転−回復法により調製されるか、または飽和−回復法により調製される配列の
ような、コントラストの差を大きくする、流量に依存しない技術が挙げられる。結局、磁
化移動調製法もこれらの物質によりコントラストを改善することができる（たとえばＧｏ
ｏｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｙｉｖｅ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，３１
（６）：３２３−３２（１９９６））。

標識試薬は注射可能な組成物の形状で患者に投与される。ＭＲＩ造影剤を投与する方法
は、好ましくは静脈内、動脈内、硬膜内、間質内、または体腔内を意味する、非経口的投
与が好ましい。活発な血管新生を画像化するためには、静脈内、または動脈内投与が好ま
しい。ＭＲＩでは、血管新生部位で少なくとも１０％ＭＲシグナルを増大させるために十
分な造影剤の量を対象に投与することが企図される。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合
体結合部分−含有ＭＲＩ試薬の注射後、患者は、ＭＲＩ装置でスキャンニングされ、血管
新生部位のいずれかの位置が確認される。治療においては、血管新生（たとえば腫瘍）位
置確認時に、必要な場合、殺腫瘍剤または抗血管新生剤（たとえばＶＥＧＦの阻害剤）が
速やかに投与され、その後腫瘍退縮または血管新生阻止を視覚化するために患者をスキャ
ンニングすることができる。

Ｂ．超音波画像法
超音波が物質を通って伝達される場合、物質の音響特性は伝達速度および物質の密度に
依存することになる。音響特性の変化は異なる物質（固体、液体、気体）の界面において
最も著しい。超音波造影剤は物質と周囲の組織間の音響の差のために、きわめて強い音波
反射体である。液体（たとえば血液）と気体含有または気体発生超音波造影剤間の音響の
差のために、気体含有または気体発生超音波造影剤がとりわけ有用である。マイクロバブ
ル、超音波造影剤などを含む超音波造影剤は、そのサイズのために注射後、他の検出可能
な部分よりも血流に長く留まることが可能である；標的のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ
複合体に特異的な超音波剤はしたがって、血管新生部位の優れた画像化を行うことができ
る。

本発明のこの側面において、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は超音波画
像法に有用な物質に結合することができる。たとえば、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複
合体結合ポリペプチドは、小胞（たとえばマイクロバブル、超音波造影剤ミクロスフェア
など）、または検出可能な標識として機能する液体または気体を含むエマルジョン（たと
えば、エコー発生気体またはエコー発生気体を生成することができる物質）を形成するた
めに使用される物質に結合することができる。そのような小胞作製物質には、界面活性剤
、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物
、および合成または天然の高分子物質が挙げられる。たとえば、ＷＯ９８／５３８５７、
ＷＯ９８／１８４９８，ＷＯ９８／１８４９５、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８
４９６、およびＷＯ９８／１８５０１を参照されたい。それらはそのまま本明細書に援用
される。

安定化マイクロバブルの懸濁液を含む造影剤（好ましい態様）としては、リン脂質、お
よびとりわけ飽和リン脂質が好ましい。本発明の好ましい気体封入マイクロバブルは、た
とえば以下の特許：ＥＰ５５４２１３、米国特許第５，４１３，７７４号、米国特許第５
，５７８，２９２号、ＥＰ７４４９６２、ＥＰ６８２５３０、米国特許第５，５５６，６
１０号、米国特許第５，８４６，５１８号、米国特許第６，１８３，７２５号、ＥＰ４７
４８３３、米国特許第５，２７１，９２８号、米国特許第５，３８０，５１９号、米国特
許第５，５３１，９８０号、米国特許第５，５６７，４１４号、米国特許第５，６５８，
５５１号、米国特許第５，６４３，５５３号、米国特許第５，９１１，９７２号、米国特
許第６，１１０，４４３号、米国特許第６，１３６，２９３号、ＥＰ６１９７４３、米国
特許第５，４４５，８１３号、米国特許第５，５９７，５４９号、米国特許第５，６８６
，０６０号、米国特許第６，１８７，２８８号および米国特許第５，９０８，６１０号の
いずれか１つに記載の方法により、当該技術分野で公知の手段により作製可能であり、そ
れらはそのまま本明細書に援用される。好ましい態様において、リン脂質部分の少なくと
も１つは構造１８または１９（図３３）を有し、米国特許第５，６８６，０３０号に記載
され、これは本明細書に援用される。

適切なリン脂質の例としては、１または２分子の脂肪酸（同じか、または異なる）およ
びリン酸グリセロールのエステルが挙げられ、ここでリン酸残基は次にコリン、セリン、
イノシトール、グリセロール、エタノールアミンなどの基に結合する。リン脂質に存在す
る脂肪酸は一般に長鎖脂肪族酸であり、典型的には１２〜２４、好ましくは１４〜２２の
炭素原子を含み、それらは飽和されているか、または１以上の不飽和を含んでいてよい。
適切な脂肪酸の例としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノレン酸、およびリノール酸が挙げられる。リ
ン脂質のモノエステルもリン脂質の「リソ」型として当該技術分野で公知である。

リン脂質の別の例としては、ホスファチジン酸、すなわち脂肪酸を持つグリセロール−
リン酸のジエステル、スフィンゴミエリン、すなわち脂肪酸を持つグリセロールジエステ
ル残基がセラミド鎖により置換される、ホスファチジルコリン類似体、カルジオリピン、
すなわち脂肪酸を持つ１，３−ジホスファチジルグリセロールのエステル、セレブロシド
などが挙げられる。本明細書で使用するように、リン脂質という用語は単独、または混合
物としてのいずれかで使用することができる、天然に存在するか、半合成または合成産物
のいずれかを含む。

天然に存在するリン脂質の例としては、代表的には、ダイズまたは卵黄のような天然の
レシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）が挙げられる。
半合成リン脂質の例としては、天然に存在するレシチンの部分的または完全な水素化誘
導体が挙げられる。

合成リン脂質の例としては、たとえば、ジラウリロイル−ホスファチジルコリン（「Ｄ
ＬＰＣ」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジパルミトイル−
ホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジアラキドリルホスファチジルコリン（「ＤＡ
ＰＣ」）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−ミリストイル
−２−パルミトイルホスファチジルコリン（「ＭＰＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ミ
リストイルホスファチジルコリン（「ＰＭＰＣ」）、１−パルミトイル−２−ステアロイ
ルホスファチジルコリン（「ＰＳＰＣ」）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホス
ファチジルコリン（「ＳＰＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」
）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰ
Ｃ）、ジラウリロイル−ホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）およびそのアルカ
リ金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＡＰＧ」）およびそのアル
カリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）およびそのア
ルカリ金属塩、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）およびそ
のアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）および
そのアルカリ金属塩、ジオレイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）およびそ
のアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（「ＤＭＰＡ」）およびそのアルカ
リ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（「ＤＰＰＡ」）およびそのアルカリ金属塩
、ジステアロイルホスファチジン酸（「ＤＳＰＡ」）、ジアラキドイルホスファチジン酸
（「ＤＡＰＡ」）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジル−エタノー
ルアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰ
Ｅ」）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、ジミリス
トイルホスファジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（「
ＤＡＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、ジステアロイル
ホスファジルセリン（「ＤＳＰＳ」）、ジオレイルホスファチジルセリン（「ＤＯＰＳ」
）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「ＤＰＳＰ」）、およびジステアロイルスフィ
ンゴミエリン（「ＤＳＳＰ」）が挙げられる。

他の好ましいリン脂質には、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホ
スファチジン酸、およびジパルミトイルホスファチジルセリンが挙げられる。また、組成
物はＰＥＧ−４０００および／またはパルミチン酸を含んでいてよい。本明細書に開示さ
れるか、または当業者に公知の任意の気体を使用することができる；しかし、不活性ガス
、たとえばＳＦ_６またはＣＦ_４、Ｃ_３Ｆ_８およびＣ_４Ｆ_１０のようなフルオロカーボンが
好ましい。

本発明の好ましいマイクロバブル懸濁液は、適切な溶媒中で粗リン脂質の溶液をフリー
ズドライもしくはスプレードライするような公知の工程を使用するか、またはＥＰ５５４
２１３；米国特許第５，４１３，７７４号；米国特許第５，５７８，２９２号；ＥＰ７４
４９６２；ＥＰ６８２５３０；米国特許第５，５５６，６１０号；米国特許第５，８４６
，５１８号；米国特許第６，１８３，７２５号；ＥＰ４７４８３３；米国特許第５，２７
１，９２８号；米国特許第５，３８０，５１９号；米国特許第５，５３１，９８０号；米
国特許第５，５６７，４１４号；米国特許第５，６５８，５５１号；米国特許第５，６４
３，５５３号；米国特許第５，９１１，９７２号；米国特許第６，１１０，４４３号；米
国特許第６，１３６，２９３号；ＥＰ６１９７４３；米国特許第５，４４５，８１３号；
米国特許第５，５９７，５４９号；米国特許第５，６８６，０６０号；米国特許第６，１
８７，２８８号；および米国特許第５，９０８，６１０号（これらはそのまま本明細書に
援用される）に示された工程を使用して、リン脂質から調製することができる。最も好ま
しくは、リン脂質を有機溶媒に溶かし、その溶液をリポソーム形成段階を経ずに乾燥させ
る。これは、適切な有機溶媒中で、親水性安定化物質または、有機溶媒および水の両方に
可溶性の化合物と一緒に適切な溶媒中にリン脂質を溶かし、そして溶液をフリーズドライ
もしくはスプレードライすることにより行うことができる。この態様において、親水性安
定化物質の選択のために使用される基準は、好みの有機溶媒におけるその溶解度である。
水および有機溶媒に可溶性の親水性安定化物質の例としては、たとえばポリビニルピロリ
ドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
などのようなポリマー、リンゴ酸、グリコール酸、マルトールなどが挙げられる。また、
そのような親水性化合物はマイクロバブルホモゲナイズにおけるサイズ分布を助け、貯蔵
中の安定性を高める。任意の適切な有機溶媒の沸点が十分に高く、そしてその融点が十分
に低く、その後の乾燥を促進する限り、その有機溶媒は使用可能である。代表的な有機溶
媒には、たとえば、ジオキサン、シクロヘキサノール、３級ブタノール、テトラクロロジ
フルオロエチレン（Ｃ_２Ｃｌ_４Ｆ_２）または２−メチル−２−ブタノールが挙げられる。
２−メチル−２−ブタノールおよびＣ_２Ｃｌ_４Ｆ_２が好ましい。

水性担体中での分散によるマイクロバブル懸濁液の形成に先だって、フリーズドライも
しくはスプレードライリン脂質粉末は空気または別の気体と接触する。水性担体に接触す
る場合、構造が粉砕されている粉末化リン脂質はラメラ化またはラミナ化部分を形成し、
それらはその中に分散した気体のマイクロバブルを安定化するであろう。この方法は長期
間貯蔵する場合でさえ安定であり、振とうまたはどのような激しい撹拌もせずに、乾燥し
たラミナ化リン脂質（それらは所望する気体下で貯蔵されている）の簡単な溶解により得
られるマイクロバブル懸濁液の産生を可能にする。

あるいは、ＷＯ９７／２９７８３に開示されたように、高い振とう速度において気体を
水性溶液に懸濁することにより、マイクロバブルを作製することができる。マイクロバブ
ル作製のための別の工程は、本明細書に援用される同時係属中の欧州特許出願第０３００
２３７３号に開示され、そしてそれは任意の洗浄および／またはろ過工程後、リン脂質存
在下で水性培地中において有機溶媒のエマルジョンを作製し、その後上記エマルジョンを
凍結乾燥することを含む。

当業者に公知の添加剤は、安定化されたマイクロバブルの懸濁液中に包含されてよい。
たとえば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールならび
に類似した化合物、それに加え、その各種コポリマー；ミリスチン酸、パルミチン酸、ス
テアリン酸、アラキジン酸またはそれらの誘導体のような脂肪酸、エルゴステロール、フ
ィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、プロピルガレート
、アスコルビルパルミテートおよびブチル化ヒドロキシトルエンを含む、非フィルム形成
界面活性剤を添加することができる。これらの非フィルム形成界面活性剤の量は通常界面
活性剤の総重量の５０％までであるが、好ましくは０〜３０％の間である。

他の気体含有懸濁液は、たとえば、米国特許第５，７９８，０９１号、ＷＯ９７／２９
８７３、さらにＥＰ８８１９１５に開示され、そられはそのまま本明細書に援用する。こ
れらの物質は米国特許第５，７９８，０９１号またはＷＯ９７／２９７８３に記載のよう
に作製することができる。

別の好ましい超音波造影剤は、複数の超音波造影剤を含む。「マイクロバルーン」とい
う用語は境界または外被を持つ気体封入体を表す。マイクロバルーン製剤および作製の方
法に関する詳細は、ＥＰ３２４９３８（米国特許第４，８４４，８８２号）；米国特許第
５，７１１，９３３号；米国特許第５，８４０，２７５号；米国特許第５，８６３，５２
０号；米国特許第６，１２３，９２２号；米国特許第６，２００，５４８号；米国特許第
４，９００，５４０号；米国特許第５，１２３，４１４号；米国特許第５，２３０，８８
２号；米国特許第５，４６９，８５４号；米国特許第５，５８５，１１２号；米国特許第
４，７１８，４３３号；米国特許第４，７７４，９５８号；ＷＯ９５／０１１８７；米国
特許第５，５２９，７６６号；米国特許第５，５３６，４９０号；および米国特許第５，
９９０，２６３号に見出すことができ、それらの内容は本明細書に援用される。

好ましいマイクロバルーンは生体内分解性で生理的に適合するポリマーまたは、生体内
分解性固体脂質を含む外被を有する。本発明のマイクロバルーンの作製に有用なポリマー
は、たとえば以下の特許：ＥＰ４５８７４５、米国特許第５，７１１，９３３号、米国特
許第５，８４０，２７５号、ＥＰ５５４２１３、米国特許第５，４１３，７７４号および
米国特許第５，５７８，２９２号のいずれかに記載の生体内分解性で生理的に適合するポ
リマーのいずれかから選択することができる。とりわけ、ポリマーは以下のような生体内
分解性で生理的に適合したポリマーから選択することができる：たとえば水溶性の低い多
糖類、ポリラクチドおよびポリグリコリドならびにそれらのコポリマー、ラクチドおよび
ε−カプロラクトン、γ−バレロラクトンのようなラクトンおよびポリペプチド。他の適
切なポリマーには以下のものが挙げられる：ポリ（オルト）エステル（たとえば米国特許
第４，０９３，７０９号；米国特許第４，１３１，６４８号；米国特許第４，１３８，３
４４号；米国特許第４，１８０，６４６号を参照されたい）；ポリ乳酸およびポリグリコ
ール酸ならびにそれらのコポリマー、たとえばＤＥＸＯＮ（Ｊ．Ｈｅｌｌｅｒ，Ｂｉｏｍ
ａｔｅｒｉａｌｓ １（１９８０），５１を参照されたい）；ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃ
ｏ−ε−カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−γ−バレロラクトン）、ポリ
（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−γ−ブチロラクトン）ポリアルキルシアノアクリレート；ポリ
アミド、ポリヒドロキシブチレート；ポリジオキサン；ポリ−β−アミノケトン（Ａ．Ｓ
．Ａｎｇｅｌｌｏｎｉ，Ｐ．Ｆｅｒｒｕｔｉ，Ｍ．Ｔｒａｍｏｎｔｉｎｉ ａｎｄ Ｍ．
Ｃａｓｏｌａｒｏ，Ｔｈｅ Ｍａｎｎｉｃｈ ｂａｓｉｓｅｓ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：３．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ−ａｍｉｎｏ
ｋｅｔｏｎｅ）ｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ）ｓ ａｎ
ｄ ｔｈｅｉｒ Ｎ−ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｏｌｙ（ｇａｍｍａ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）ｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒ２３，ｐ
ｐ１６９３−１６９７，１９８２．）；ポリホスファゼン（Ａｌｌｃｏｃｋ，Ｈａｒｒｙ
Ｒ．Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ：ｎｅｗ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｉｎ
ｏｒｇａｎｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｔｏｍｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９３（４２５９）
，１２１４−１９（１９７６））およびポリ無水物。また、本発明のマイクロバルーンは
ＷＯ−Ａ−９６／１５８１５（本明細書に援用する）の方法に従って作製可能であり、こ
こでマイクロバルーンは、好ましくはモノ−、ジ−もしくはトリ−グリセリド、脂肪酸、
ステロール、ワックスおよびそれらの混合物から選択される生体内分解性脂質を含む、生
体内分解性膜から作られる。好ましい脂質は、ジ−もしくはトリ−グリセリド、たとえば
ジ−、もしくはトリ−ミリスチン、−パルミチンもしくは−ステアリン、とりわけトリパ
ルミチンまたはトリステアリンである。マイクロバルーンは当業者に公知の、本明細書に
開示された気体のいずれを使用してもよい；しかし不活性気体、たとえばフッ素化ガスが
好ましい。マイクロバルーンは、当業者に公知の任意の添加剤および安定化剤と共に薬剤
的に受容できる液体担体中に懸濁することができる。

他の気体含有造影剤の製剤は、微小粒子中に含有するか、またはそうでなければそれに
会合（たとえばその表面に吸着する、および／またはその中の空隙、空洞または小孔に含
まれる）した気体を有する該微小粒子（とりわけ微小粒子の凝集物）を含む。これらの物
質の作製方法は、ＥＰ０１２２６２４；ＥＰ０１２３２３５；ＥＰ０３６５４６７；米国
特許第５，５５８，８５７号；米国特許第５，６０７，６６１号；米国特許第５，６３７
，２８９号；米国特許第５，５５８，８５６号；米国特許第５，１３７，９２８号；ＷＯ
９５／２１６３１またはＷＯ９３／１３８０９に記載され、それらをそのまま本明細書に
援用する。

また、これらの超音波組成物はいずれもできる限り血液と等張性であるべきである。し
たがって、注射の前に少量の等張性物質を上記の超音波造影剤懸濁液のいずれかに添加す
ることができる。等張性物質は薬物に一般的に使用される生理的溶液であり、そしてそれ
らは水性生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）、２．６％ グルセロール溶液、５％ デキ
ストロース溶液などを含む。さらに、超音波組成物は、たとえば、乳化剤、粘性調節剤、
凍結保護物質、溶解保護物質、増量剤などを含む、標準的な薬剤的に受容できる添加剤を
挙げることができる。

任意の生体適合性気体を本発明に有用な超音波造影剤に使用することができる。本明細
書で使用する「気体」という用語には、通常のヒトの体温で実質的に気体の形状のいずれ
かの物質（混合物を含む）が挙げられる。したがって、気体にはたとえば、空気、窒素、
酸素、ＣＯ_２、アルゴン、キセノンまたはクリプトン、フッ素化ガス（たとえば、過フッ
化炭素、ＳＦ_６、ＳｅＦ_６が挙げられる）、低分子量炭化水素（たとえば１〜７炭素原子
を含む）、たとえばメタン、エタン、プロパン、ブタンもしくはペンタンのようなアルカ
ン、シクロプロパン、シクロブタンもしくはシクロペンタンのようなシクロアルカン、エ
チレン、プロペン、プロパジエンもしくはブテンのようなアルケン、またはアセチレンも
しくはプロピンおよび／またはその混合物のようなアルキンを挙げることができる。しか
し、フッ素化ガスが好ましい。フッ素化ガスには、ＳＦ_６のような少なくとも１フッ素原
子を含む物質、フレオン（１以上の炭素およびフッ素を含む有機化合物、すなわちＣＦ_４
、Ｃ_２Ｆ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０、ＣＢｒＦ_３、ＣＣｌ_２Ｆ_２、Ｃ_２ＣｌＦ
_５、およびＣＢｒＣｌＦ_２）およびペルフルオロカーボンが挙げられる。ペルフルオロカ
ーボンという用語は、ただ１つの炭素および複数のフッ素原子を含む化合物を表し、とり
わけ、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンが挙げられる。通常好ましい飽和
ペルフルオロカーボンは式Ｃ_ｎＦ_ｎ＋２を有し、ここでｎは１〜１２であり、好ましくは
２〜１０であり、最も好ましくは３〜８であり、そしてさらにより好ましくは３〜６であ
る。適切なペルフルオロカーボンには、たとえばＣＦ_４、Ｃ_２Ｆ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８
、Ｃ_４Ｆ_１０、Ｃ_５Ｆ_１２、Ｃ_６Ｆ_１２、Ｃ_７Ｆ_１４、Ｃ_８Ｆ_１８およびＣ_９Ｆ_２０が挙
げられる。最も好ましくは気体または気体混合物は、ＳＦ_６を含むか、またはＣ_３Ｆ_８、
Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０、Ｃ_５Ｆ_１２、Ｃ_６Ｆ_１２、Ｃ_７Ｆ_１４、Ｃ_８Ｆ_１８から成る群よ
り選択されるペルフルオロカーボンを含むが、Ｃ_４Ｆ_１０が最も好ましい。たとえばＷＯ
９７／２９７８３、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／１８４９
５、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８５０１、ＷＯ９８／
０５３６４、ＷＯ９８／１７３２４も参照されたい。

ある種の状況では、気体状物質への前駆体（たとえば、しばしば「気体前駆体」と呼ば
れる、ｉｎｖｉｖｏで気体に変換できる物質）を含有することが好ましい。好ましくは気
体前駆体およびそれが生み出す気体は生理的に受容可能である。気体前駆体はｐＨにより
活性化、光により活性化、温度により活性化をうけるなどされてよい。たとえば、ある種
のペルフルオロカーボンは温度活性化気体前駆体として使用することができる。過フルオ
ロペンタンのようなこれらのペルフルオロカーボンは、室温（または物質が産生される、
および／または貯蔵される温度）以上であるが、体温以下の液体／気体相転移温度を有す
る；したがってそれらは相転移を受けてヒトの体内で気体に変換する。

説明したように、気体は気体混合物を含んでいてもよい。以下の組み合わせはとりわけ
好ましい気体混合物である：気体（Ａ）および（Ｂ）の混合物、ここで気体（Ｂ）の少な
くとも１種は容量で０．５〜４１％の間で存在し、８０ダルトンより大きい分子量を有し
、そしてフッ素化ガスであり、そして（Ａ）は酸素、窒素、二酸化炭素およびその混合物
から成る群より選択され、混合物の優位は気体Ａである。

超音波小胞は、本明細書に記載の他の検出可能な標識より大きくてよいため、それらは
物質の標的化効率を高めるために、複数のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリ
ペプチドに連結または結合してよい。上記（または当業者に公知）の超音波造影剤への結
合は、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドと小胞を作製するために使
用される物質間の直接共有結合を介するか、上記のリンカーを介してよい。たとえば、二
官能ＰＥＧリンカー（その後リポソーム組成物と反応する）へのペプチドの結合の説明に
は一般にＷＯ９８／５３８５７を参照されたい。Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａ
ｓｏｕｎｄ ｉｎ Ｍｅｄ．＆Ｂｉｏ．，２３（６）：８６３−８７０（１９９７）も参
照されたい。

多数の方法を使用してＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドに結合す
るマイクロバブルの懸濁液を作製することができる。たとえば、リン脂質形成において５
％（ｗ／ｗ）Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
エタノールアミン−４−（ｐ−マレイミド−フェニルブチラミド）、（Ａｖａｎｔｉ Ｐ
ｏｌａｒ−Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）の取込により、マレイミド−由来マイクロバブルを作
製することができる。次に、脱アセチル溶液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、２５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ヒドロキシルアミン．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中でインキュベートさ
れているメルカプトアセチル化ＫＤＲ結合ペプチド溶液（ＤＭＦ中、１０ｍｇ／ｍｌ）が
マレイミド−活性化マイクロバブル懸濁液に添加される。穏やかに撹拌しながら暗所でイ
ンキュベーション後、マイクロバブルに結合したペプチドは、遠心分離により精製するこ
とができる。

マイクロバブルの誘導体化に使用される化合物は一般に以下の成分を含む（ａ）小胞の
外被において化合物を効率的に取り込ませるためのマイクロバブル、またはマイクロバル
ーンの外被を形成する物質と適合する疎水性部分；上記の部分は一般に脂質部分（ジパル
ミチン、ジステアロイル）により示される；および（ｂ）スペーサー（一般に異なる分子
量のＰＥＧ）、それはある種の場合（たとえば、スペーサーがあまりに長い場合、マイク
ロバブルの凍結乾燥がたとえば困難を呈するかもしれない）は任意であってよく、または
他の場合（たとえば短いスペーサーを持つマイクロバルーンに結合する場合、ペプチドは
活性が低い可能性がある）には好ましくてよい；および（ｃ）結合することになるペプチ
ド上の対応する反応部分と反応が可能な反応基。

あるいは、マイクロバブルに結合したＫＤＲ結合ポリペプチドは、ビオチン／アビジン
を使用して作製することができる。たとえば、アビジン−結合マイクロバブルは、メルカ
プトアセチル化−アビジン（脱アセチル溶液と共にインキュベートされている）に添加さ
れる上記のように作製されたマレイミド−活性化リン脂質マイクロバブル懸濁液を使用し
て作製することができる。次に、ビオチン化ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポ
リペプチド（本明細書に記載のように作製される）をアビジン−結合マイクロバブルの懸
濁液に添加し、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドに結合したマイクロバ
ブル懸濁液を得る。

特殊な貯蔵条件を必要とすることが公知の過分極気体を含まない限り、凍結乾燥残留物
は周囲の温度管理を必要とせずに貯蔵および輸送可能であり、そしてとりわけそれは特殊
な貯蔵設備を有することを使用者に要求せずに、調製済みの投与可能な懸濁液に現場で製
剤されて、病院や医師に供給することができる。好ましくは、そのような場合、それは２
−成分キット製品の形状で供給可能であり、それには２つの別々の容器または２−チャン
バー容器を含むことができる。前述の場合では、好ましくは容器は慣用の隔壁−密封バイ
アルであり、ここで工程ｂ）の凍結乾燥残留物を含むバイアルは、隔壁で密封され、担体
液は任意に前もって充填したシリンジを使用して、それを通して注射する。そのような場
合、２番目の成分の容器として使用されるシリンジは次に造影剤を注射するためにも使用
される。後者の場合、好ましくは２−チャンバー容器は２−チャンバーシリンジであり、
いったん凍結乾燥品を溶解し、適切に混合するか、または穏やかに振とうしていれば、そ
の容器は直接造影剤を注射するために使用することができる。両方の場合、容器の内容物
への十分なバブル形成エネルギーの適用に関するか、またはそれを可能にする手段が提供
される。しかし、先に示したように、本発明に記載の安定化された造影剤では、気体マイ
クロバブルのサイズは溶かした乾燥産物に適用された撹拌エネルギーの量に実質的に依存
しない。したがって、一定のマイクロバブルサイズを有する、再現可能な産物を得るため
には、一般に穏やかな手動の撹拌だけを必要とする。

無菌的に水溶液と乾燥粉末を合わせることができる別の２−チャンバー溶解系も本発明
の範囲内であることを当業者は、理解するであろう。そのような系では、非水溶性気体と
環境の間に水相が介在する場合、産物の貯蔵期間を延長させることがとりわけ好都合であ
る。造影剤を形成するために必要な物質（たとえば、溶解中にリン脂質に結合することに
なるターゲッテイングリガンド）が予め容器に存在していない場合、好ましくはキット製
品の別の成分との容易な組み合わせを促進するために適用される形状または容器中で、キ
ット製品の別の成分と一緒にそれを包装することができる。

特定の容器、バイアルまたは連結系は必要とせず；本発明は慣用の容器、バイアルおよ
びアダプターを使用することができる。唯一の要件は、ストッパーと容器間の十分な密封
である。したがって、密封の質が主要な関心事であり；密封の完全性のどのような劣化も
、所望しない物質のバイアルへの侵入を可能にする。周囲圧または減圧で栓をした産物の
安全で適切な溶解を保証するためには、無菌性であることに加え、真空の保持が必須であ
る。栓としては、ポリ（イソブチレン）またはブチルゴムのような、エラストマーに基づ
いた化合物または多成分製剤であってよい。

本発明に従って使用することができる超音波画像法技術としては、カラードップラー、
パワードップラー、ドップラー振幅、刺激された音響画像法、および２次元または３次元
画像化のような公知の技術が挙げられる。画像化は調和（共鳴頻度）または基礎モードで
行ってよく、第２調和が好ましい。

超音波適用において、リン脂質安定化マイクロバブルにより形成された造影剤は、たと
えば、注射されるリン脂質の量が０．１〜２００μｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは約０
．１〜３０μｇ／ｋｇまでであるような量で投与することができる。マイクロバルーン含
有造影剤は一般に壁形成ポリマーまたは脂質の量が約１０μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ
体重であるような量で投与される。

Ｃ．光学画像法、音ルミネセンスまたは光音響画像法
本発明にしたがい、多数の光学的パラメータを使用して、光学標識ＫＤＲまたはＶＥＧ
Ｆ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチド注射後の対象のｉｎ ｖｉｖｏ光学画像法によりＫＤ
ＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の位置を決定することができる。画像作製中に検出され
る光学的パラメータとしては、伝搬放射、吸収、蛍光またはリン光放出、光反射、吸光度
振幅または最大値の変化、および弾性的に散乱した放射を挙げることができる。たとえば
、生物組織は６５０〜１０００ｎｍの近赤外（ＮＩＲ）波長範囲の光を比較的に通す。Ｎ
ＩＲ放射は数センチメートルまで組織に浸透し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＫＤＲまたはＶＥＧ
Ｆ／ＫＤＲ複合体の光学画像法のための本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結
合ポリペプチドの使用を可能にする。

ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、広範な脱局在環系を有し、
そして４００〜１５００ｎｍの範囲の吸収または放射最大値を有する有機発色団または蛍
光団を含む、光学色素のような光標識と結合してもよい。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ
複合体結合ポリペプチドはかわりに生物ルミネセンス分子で誘導体化されてもよい。光標
識の吸収最大値の好ましい範囲は、ヘモグロビンからのシグナルによる妨害を最小にする
ために、６００〜１０００ｎｍの間である。好ましくは、光吸収標識はたとえば＞１０^５
ｃｍ^−１Ｍ^−１の大きなモル吸光係数を有し、一方蛍光光学色素は高い量子収率を有する
。光学色素の例としては、ＷＯ９８／１８４９７、ＷＯ９８／１８４９６、ＷＯ９８／１
８４９５、ＷＯ９８／１８４９８、ＷＯ９８／５３８５７、ＷＯ９６／１７６２８、ＷＯ
９７／１８８４１、ＷＯ９６／２３５３４、ＷＯ９８／４７５３８、およびここに引用さ
れた参考文献に記載のものが挙げられるが、それらに限定されない。光標識は先に記載の
ように直接ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドに共有結合するか、または
リンカーを介して、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドに結合する。

光学的に標識したＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分の注射後、患者は、取
扱者が使用する光標識に適切な波長で、１以上の光源（たとえばレーザー）によりスキャ
ンニングされる。使用する光は単色または多色、および連続またはパルスであってよい。
透過、散乱、または反射光は光検出器により１種または複数の波長に変換されて検出され
、対象におけるＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の位置を決定する。光学パラメータ
の変化は一定の期間モニターし、血管新生部位における光標識試薬の蓄積を検出すること
ができる。標準画像処理および検出装置は本発明の光学画像化試薬と一緒に使用すること
ができる。

上記の光学画像化試薬はまた、光標識造影剤により行われる光音響画像法または音ルミ
ネセンス画像法のために使用することができる（米国特許第５，１７１，２９８号、ＷＯ
９８／５７６６６、およびそこに引用された参考文献を参照されたい）。光音響画像法で
は、超音波照射が対象に適用され、透過、散乱、または反射光の光学パラメータに影響を
与える。音ルミネセンス画像法では、適用された超音波は実際に検出される光を発生する
。そのような技術を使用する適切な画像法はＷＯ９８／５７６６６に記載される。

Ｄ．核画像法（放射性核種画像法）および放射線療法
ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体部分はシンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、またはＰ
ＥＴ画像法に適合した放射性核種レポーター、および／または放射線療法に適合した放射
性核種と結合することができる。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体部分が診断画像法
に有用な放射性核種に対するキレート剤および放射線療法に有用なキレート剤の両方に結
合する構築物は本発明の範囲内である。

ＰＥＴ物質として使用するために、ペプチドは各種ポジトロン放射金属イオン、たとえ
ば^５１Ｍｎ、^５２Ｆｅ、^６０Ｃｕ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^９４ｍＴｃ、または^１１０Ｉｎ
の１種と錯体を形成する。本発明の結合部分はまた、放射性核種、たとえば^１８Ｆ、^１２
４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^７７Ｂｒおよび^７６Ｂｒを使用したハロゲン化に
より標識することができる。シンチグラフィーまたは放射線療法のための好ましい金属放
射性核種には、^９９ｍＴｃ、^５１Ｃｒ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^１６
７Ｔｍ、^１４１Ｃｅ、^１１１Ｉｎ、^１６８Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１４０Ｌａ、^９０Ｙ、^８８
Ｙ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ
、^９７Ｒｕ、^１０３Ｒｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２０３Ｐｂ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂ
ｉ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｂ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１
６１Ｔｂ、^１７７Ｌｕ、^１９８Ａｕおよび^１９９Ａｕが挙げられる。金属の選択は、所望
する治療または診断適用に基づいて決定されるであろう。たとえば、診断のために好まし
い放射性核種には、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^９９ｍＴｃ、および^１１１Ｉｎが挙
げられる。治療のために好ましい放射性核種には、^６４Ｃｕ、^９０Ｙ、^１０５Ｒｈ、^１１
１Ｉｎ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ
、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^{１８６／１８８}Ｒｅ、および^１９９Ａｕが挙げられる。^９９
ｍＴｃは低価格、有用性、画像化特性、および高比放射能のために診断適用にはとりわけ
好ましい。Ｔｃ−９９ｍの核および放射能特性はこの同位体を理想的なシンチグラフィー
イメージング剤にする。この同位体は、１４０ｋｅＶの単一光子エネルギーおよび約６時
間の放射能半減期を有し、^９９Ｍｏ−^９９ｍＴｃ発生器から容易に得ることができる。

金属放射性核種はたとえば、線状、大環状、テルピリジン、およびＮ_３Ｓ、Ｎ_２Ｓ_２、
またはＮ_４キレート剤（米国特許第５，３６７，０８０号、米国特許第５，３６４，６１
３号、米国特許第５，０２１，５５６号、米国特許第５，０７５，０９９号、米国特許第
５，８８６，１４２号も参照されたい）、ならびにたとえばＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、ＥＤ
ＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＴＥＴＡ、およびビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレー
ト剤を含むが、それらに限定されない、当該技術分野で公知の他のキレート剤によりキレ
ート化されてよい（米国特許第５，７２０，９３４号も参照されたい）。たとえば、Ｎ_４
キレート剤は米国特許第６，１４３，２７４号；米国特許第６，０９３，３８２号；米国
特許第５，６０８，１１０号；米国特許第５，６６５，３２９号；米国特許第５，６５６
，２５４号；および米国特許第５，６８８，４８７号に記載される。ある種のＮ_３Ｓキレ
ート剤はＰＣＴ／ＣＡ９４／００３９５、ＰＣＴ／ＣＡ９４／００４７９、ＰＣＴ／ＣＡ
９５／００２４９ならびに米国特許第５，６６２，８８５号；米国特許第５，９７６，４
９５号；および米国特許第５，７８０，００６号に記載される。キレート剤はまたＮ_３Ｓ
およびＭＡＭＡ（モノアミドモノアミンジチオール）、ＤＡＤＳ（Ｎ_２Ｓジアミンジチオ
ール）、ＣＯＤＡＤＳなどのようなＮ_２Ｓ_２系を含むキレート化リガンド、メルカプトー
アセチル−アセチル−グリシル−グリシン（ＭＡＧ３）の誘導体を含んでいてよい。これ
らのリガンド系および多様な他のリガンド系はＬｉｕ ａｎｄ Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃｈｅ
ｍ Ｒｅｖ．，９９：２２３５−２２６８（１９９９）およびその中の参考文献に記載さ
れる。

キレート剤はまた、四配座アレイにおいて金属に付加しないリガンド原子を含む錯体を
含んでいてもよい。これらには、米国特許第５，１８３，６５３号；米国特許第５，３８
７，４０９号；および第５，１１８，７９７号に記載のような、テクニチウムおよびレニ
ウムジオキシムのボロン酸付加物が挙げられ、それらの開示はそのまま本明細書に援用さ
れる。

別の態様において、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドのジスルフ
ィド結合は、^９９ｍＴｃのような放射性核種のキレート形成のための２種のリガンドとし
て使用される。このようにして、ペプチドループはＴｃの導入により拡張される（ペプチ
ド−Ｓ−Ｓ−ペプチドがペプチド−Ｓ−Ｔｃ−Ｓ−ペプチドに変化する）。これは生理活
性を維持しながら、文献（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：１
８４７−１８５５（２００１））において他のジスルフィド含有ペプチドに使用されてい
る。Ｔｃに対する他のキレート基は、骨格のアミド窒素、別のシスチンアミノ酸またはア
ミノ酸の別の改変により供給することができる。

とりわけ好ましい金属キレート剤には、式２０、２１、２２，２３ａ、２３ｂ，２４ａ
、２４ｂ、および２５のそれらが挙げられる（図３４Ａ〜Ｆ）。式２０〜２２（図３４Ａ
〜Ｃ）は、常磁性Ｇａ^３＋のようなランタニドおよび^１７７Ｌｕ、^９０Ｙ、^１５３Ｓｍ、
^１１１Ｉｎ、または^１６６Ｈｏのような放射性ランタニドにとりわけ有用である。式２３
ａ〜２４ｂ（図３４ＤおよびＦ）は放射性核種^９９ｍＴｃ、^１８６Ｒｅまたは^１８８Ｒｅ
にとりわけ有用である。式２５（図３４Ｆ）は^９９ｍＴｃにとりわけ有用である。これら
および他の金属キレート基は米国特許第６，０９３，３８２号および米国特許第５，６０
８，１１０号に記載され、それらはそのまま本明細書に援用される。さらに、式２２（図
３４Ｃ）のキレート基は、たとえば米国特許第６，１４３，２７４号に記載され；式２４
のキレート基は、たとえば米国特許第５，６２７，２８６号および米国特許第６，０９３
，３８２号に記載され；そして式２５のキレート基は、たとえば米国特許第５，６６２，
８８５号；米国特許第５，７８０，００６号；および米国特許第５，９７６，４９５号に
記載される。

先の式２４ａおよび２４ｂ（図３４Ｅ）において、ＸはＣＨ_２またはＯのいずれかであ
り、；ＹはＣ_１〜Ｃ_１０分枝または非分枝アルキル、アリール、アリールオキシ、アリー
ルアミノ、アリールアミノアシル、またはＣ_１〜Ｃ_１０分枝もしくは非分枝アルキル基、
ヒドロキシまたはＣ_１〜Ｃ_１０分枝もしくは非分枝ポリヒドロキシアルキル基、Ｃ_１〜Ｃ
_１０分枝もしくは非分枝ヒドロキシまたはポリアルコキシアルキルもしくはポリヒドロキ
シ−ポリアルコキシアルキル基を含むアリールアルキルであり；ＪはＣ（＝Ｏ）−、ＯＣ
（＝Ｏ）−、ＳＯ_２−、ＮＣ（＝Ｏ）−、ＮＣ（＝Ｓ）−、Ｎ（Ｙ）、ＮＣ（＝ＮＣＨ_３
）−、ＮＣ（＝ＮＨ）−、Ｎ＝Ｎ−、ホモポリアミドまたは合成もしくは本来存在するア
ミノ酸に由来するヘテロアミンであり；そしてｎは１〜１００である。これらの構造の別
の変種はたとえば米国特許第６，０９３，３８２号に記載される。上記の特許、特許出願
および参考文献のそれぞれの開示はそのまま本明細書に援用される。

キレート剤は先に記載のように、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分に共有
結合により直接結合するか、またはリンカーを介してＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合
体結合ポリペプチドに結合してよく、その後選択した放射性金属により直接標識される（
ＷＯ９８／５２６１８、米国特許第５，８７９，６５８号、および第５，８４９，２６１
号を参照されたい）。

放射性テクネチウムの複合体は診断画像法にとりわけ有用であり、放射性レニウムの複
合体は放射線療法にとりわけ有用である。本発明の試薬と放射性テクネチウムの複合体形
成において、テクネチウム複合体、好ましくはＴｃ−９９ｍ過テクネテートの塩は、還元
剤の存在下で試薬と反応する。好ましい還元剤は、ジチオナイト、スズおよび鉄イオンで
あり；最も好ましい還元剤は塩化第一スズである。そのような複合体を作製する手段は好
都合にはキットの形状で提供され、標識されることになる本発明の前もって計量された量
の試薬およびＴｃ−９９ｍで試薬を標識するための十分な量の還元剤を含む密封バイアル
を含む。あるいは、複合体は、テクネチウムおよび転移リガンドとして公知の別の化合物
の前もって形成された不安定な複合体と適切なキレート剤に結合した本発明のペプチドを
反応させることにより形成することができる。この工程はリガンド交換として公知であり
、当業者によく知られている。不安定な複合体はたとえばタートレート、シトレート、グ
ルコネートまたはマンニトールのような転移リガンドを使用して形成することができる。
本発明に有用なＴｃ−９９ｍ過テクネテート塩の中には、ナトリウム塩、またはアンモニ
ウム塩もしくは低級アルキルアンモニウム塩のようなアルカリ金属塩が包含される。

金属が放射性レニウムである本発明の複合体作製は、＋５または＋７酸化状態のレニウ
ム出発物質を使用して行うことができる。レニウムがＲｅ（ＶＩＩ）状態にある化合物の
例としては、ＮＨ_４ＲｅＯ_４またはＫＲｅＯ_４が挙げられる。Ｒｅ（Ｖ）は、たとえば［
ＲｅＯＣｌ_４］（ＮＢｕ_４）、［ＲｅＯＣｌ_４］（ＡｓＰｈ_４）、ＲｅＯＣｌ_３（ＰＰｈ
_３）２として、およびＲｅＯ_２（ピリジン）_４ ^＋として利用可能であり、ここでＰｈはフ
ェニルであり、そしてＢｕはｎ−ブチルである。レニウム複合体を形成することができる
他のレニウム試薬も使用することができる。

適切な量の放射能を有する、本発明に提供される放射性標識シンチグラフィーイメージ
ング剤が提供される。Ｔｃ−９９ｍ放射性複合体の形成には、一般に約０．０１ｍＣｉ〜
１００ｍＣｉ／ｍＬの濃度で放射能を含む溶液中で放射性複合体を形成することが好まし
い。

一般に、投与される単位量は、約０．０１ｍＣｉ〜１００ｍＣｉ、好ましくは、１ｍＣ
ｉ〜２０ｍＣｉの放射能を有する。単位用量において注射されることになる溶液は、約０
．０１ｍｌ〜約１０ｍＬである。

本発明に記載のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合造影剤の代表的な量は１０〜
２０ｍＣｉを提供する。患者にＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−特異的放射性核種
造影剤を注射後、造影剤に取り込まれた核種のγ線エネルギーに対して較正したγカメラ
を使用してイメージング剤が取り込まれた領域を映し、その部位に存在する放射能の量を
定量するｉｎ ｖｉｖｏでの該部位の画像化は、およそ数分のうちに行われてよい。しか
し、画像化は、所望する場合、放射標識ペプチドが患者に注射された後、数時間またはさ
らに長い間行われてよい。多くの場合、十分な量の投与量が約０．１時間以内に画像化さ
れる部位に蓄積し、シンチフォトを撮ることを可能にする。

本発明の放射線療法用の化合物の適切な投与スケジュールは当業者に公知である。化合
物は、単回もしくは複数回のＩＶまたはＩＰ注射を含むが、それらに限定されない多くの
方法を使用し、標的とするＫＤＲ発現組織の損傷または消耗を引き起こすために十分であ
るが、非標的（正常組織）に実質的な損傷を引き起こさない量の放射能を使用して投与す
ることができる。異なる構築物に対して必要な投与してよい線量は、使用する同位体のエ
ネルギーおよび半減期、物質の身体および腫瘍塊からの取込およびクリアランスの程度に
依存して異なる。一般に、線量は約３０〜５０ｍＣｉの単回量から約３キュリーまでの蓄
積量までの範囲であってよい。

本発明の放射線療法用組成物は生理的に受容できるバッファーを含んでいてよく、注射
前に化合物の放射線分解性損傷を予防するための放射安定化剤を必要としてよい。放射安
定化剤は当業者には公知であり、そしてたとえばパラ−アミノ安息香酸、アスコルビン酸
、ゲンチスチン酸（ｇｅｎｔｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）などを含んでいてよい。

放射性核種以外の本発明の複合体の作製に必要な成分をすべて含む単一、または複数バ
イアルのキット製品は本発明の不可欠な部分である。
単一バイアルキット製品は、好ましくはキレート化リガンド、第一スズ塩源、または薬
剤的に受容できる還元剤を含み、薬剤的に受容できる酸または塩基で適切に処理してｐＨ
を約３〜約９に調節する。還元剤の量および型は形成されることになる交換複合体の性質
に高度に依存するであろう。適切な条件は、当業者には公知である。キット内容物は凍結
乾燥型であることが好ましい。そのような単一バイアルキット製品は、所望により不安定
、または交換リガンド、たとえばグルコペプトネート、グルコネート、マンニトール、マ
レート、クエン酸もしくは酒石酸を含んでいてよく、そして最終産物の放射化学的純度お
よび安定性の改善に役立つ反応調節剤、たとえばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ
）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはα、β、もしくはγシクロデキストリ
ンを含んでいてもよい。キット製品はさらに、安定化剤、凍結乾燥工程の補助を意図した
マンニトールのような増量剤、および当業者に公知の他の添加剤を含んでいてよい。

複数バイアルキット製品は好ましくは同じ一般的成分を含むが、放射線医薬品の溶解に
おいて１以上のバイアルを使用する。たとえば、過テクネテートの添加時に不安定なＴｃ
（Ｖ）複合体を形成するために必要とするすべての成分（たとえば第一スズ源または他の
還元剤）を１バイアルが含んでいてよい。過テクネテートはこのバイアルに添加され、適
当な期間放置後、バイアル内容物はリガンドおよび最適値にｐＨを調節するために適切な
バッファーを含む第２バイアルに添加される。約５〜６０分反応後、本発明の複合体が形
成される。この複数バイアルキット製品の両バイアル内容物は凍結乾燥されることが好都
合である。上記のように、反応調節剤、交換リガンド、安定化剤、増量剤などはいずれか
、または両方のバイアルに存在してよい。

他の治療的適用
本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを使用して、血管新生
が行われる内皮上でＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に対する親和性およびＫＤＲま
たはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体におけるそれらの滞留時間を提供するかまたは改善すること
により、新生物性腫瘍において起こるような望ましくない血管新生に対する血管新生阻害
剤または殺腫瘍剤のような治療薬の活性を改善することができる。本発明のこの側面にお
いて、治療薬と本発明に記載のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを
結合することによりハイブリッド剤が提供される。治療薬は上記の放射線治療薬、薬物、
化学療法もしくは殺腫瘍剤、遺伝物質または遺伝子送達ビヒクルなどであってよい。結合
物のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチド部分は治療薬をＫＤＲまたは
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体（すなわち活性化内皮）部位へ「接近」させ、内皮に対する結合
物の親和性を改善し、その結果結合物の活性はより血管新生部位に局在化され、濃縮され
る。そのような結合物は、ヒトを含む哺乳動物において血管新生に関連した疾患、とりわ
け新生物性腫瘍の増殖および転移の治療に有用であり、そしてその方法は治療薬に結合し
た本発明に記載のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの効果的な量を
それが必要な哺乳動物に投与することを含む。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物におい
て血管新生に関連した疾患の治療のための薬物製造におけるそのような結合物の使用を提
供する。

本発明のこの側面における用途に適切な治療薬には以下のものが含まれるが、それらに
限定されない：抗新生物薬、たとえばプラチナ化合物（たとえば、スピロプラチン、シス
プラチン、およびカルボプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイ
シン、アンサミトシン、ブレオマイシン、サイトシン、アラビノシド、アラビノシルアデ
ニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルフ
ァラン（たとえば、ＰＡＭ、Ｌ−ＰＡＭ、またはフェニルアラニンマスタード）、メルカ
プトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）
、塩酸ダウロルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、マイトマイシン、プリカマイ
シン（ミスラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸ナトリウム、フ
ルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストイ
アクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アパラギナーゼ（Ｌ−アパラ
ギナーゼ）、Ｅｒｗｉｎａアパラギナーゼ、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロ
ンｃｘ−２ａ、インターフェロンｃｘ−２ｂ、テニポシド（ＶＭ−２６、硫酸ビンブラス
チン（ＶＬＢ）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ブレオマイシン、アドリアマイシン、および
アラビノシル；血管新生阻害剤、たとえばＳＵ５４１６およびＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ
／Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）のような血管新生および／または腫瘍増殖に重要
なシグナリング分子に対する活性を有するチロシンキナーゼ阻害剤、エンドスタチン（Ｅ
ｎｔｒｅＭｅｄ）、アンギオスタチン（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、コンブレスタチン（Ｏｘｉ
ｇｅｎｅ）、シクロスポリン、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ドキソルビシン
、パクリタキセル、ダウロルビシン、イムノトキシン；凝固因子；抗ウイルス剤、たとえ
ばアシクロビル、アマンタジンアジドチミジン（ＡＺＴまたはジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕ
ｄｉｎｅ））、リバビリンおよびビダラビン一水和物（アデニンアラヒノシド、ａｒａ−
Ａ）；抗生物質、抗マラリア剤、クロロキンのような抗原虫剤、ヒドロキシクロロキン、
メトロイダゾール、キニーネおよびアンチモン酸メグルミン；抗炎症剤、たとえばジフル
ニサール、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナプ
ロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダック、ト
ルメチン、アスピリンおよびサリシレート。

また、本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを使用して、遺
伝物質をＫＤＲ発現細胞に導くことができる。したがって、それらは遺伝子治療、とりわ
け血管新生に関連した疾患の治療に有用であってよい。この態様において、遺伝物質また
は血管新生に関連した疾患の治療に有用な遺伝物質を含む１以上の送達ビヒクルを１以上
の本発明のＫＤＲ結合部分に結合させ、患者に投与することができる。遺伝物質には核酸
、たとえば、組換えＲＮＡおよびＤＮＡならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを含む
、天然または合成起源のいずれかのＲＮＡまたはＤＮＡを挙げることができる。使用して
よい遺伝物質の型としては、たとえば、プラスミド、ファージミド、コスミド、イースト
人工クロモソーム（ＹＡＣ’ｓ）および欠陥または「ヘルパー」ウイルスのような発現ベ
クター上で運ばれる遺伝子、抗遺伝子核酸、１本鎖および２本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡの両
方、ならびにホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドのよう
なその類似体が挙げられる。さらに、遺伝物質はたとえば、脂質、タンパク質または他の
ポリマーと結合することができる。遺伝物質の送達ビヒクルとしては、たとえばウイルス
粒子、レトロウイルスまたは他の遺伝子療法ベクター、リポソーム、脂質（とりわけカチ
オン性脂質）と遺伝物質の複合体、デキストラン誘導体と遺伝物質の複合体などを挙げる
ことができる。

好ましい態様において、本発明の構築物は血管新生に関連した疾患の治療のための遺伝
子治療に使用される。この態様において、たとえば血管新生に関連した疾患の治療に有用
な遺伝物質または遺伝物質を含む１以上の送達ビヒクルを本発明の１以上のＫＤＲまたは
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドまたはヘテロ多量体に結合し、患者に投与する
ことができる。

遺伝物質および本発明のＫＤＲ結合ポリペプチドを含む構築物は、とりわけ血管新生内
皮細胞に遺伝子を選択的に導入するために使用してよく、そしてそれらは癌を治療するだ
けでなく、血管新生の阻害が再狭窄を阻害できる、血管形成術後にも有用であってよい。

治療薬および本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は、本出願の他の
部分で説明した同じ型のリンカーを使用し、公知の方法で結合または融合することができ
る。好ましいリンカーは置換または非置換アルキル鎖、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコ
ール鎖、および当該技術分野で公知の他の簡単な高分子リンカーであろう。より好ましく
は、治療薬がそれ自体タンパク質であり、そしてそのコーディングＤＮＡ配列が公知の場
合、治療薬およびＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、先に記載の
組換えＤＮＡ技術を使用して作製された、同じ合成遺伝子から共発現されてよい。ＫＤＲ
またはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドのコーディング配列は治療薬のそれと骨
格で融合してよく、治療タンパク質またはＫＤＲもしくはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポ
リペプチドのいずれかの要求される生物学的機能をそのような配置が破壊しないことが確
認される場合、ペプチドは治療タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または
末端間のある部分で発現される。この一般的方法の具体的な利点は、複数の直列に並んだ
ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドのコンカテマー化が可能で、それ
によってそれぞれの治療タンパク質に関連したＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体の結
合部位数および濃度を増やすことである。この方法において、組換え治療融合タンパク質
の効力を改善すると予想されるＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合活性が増大する
。

ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの１以上のコーディング配列を
含む類似した組換えタンパク質は画像化または治療的適用に有用であってよい。たとえば
、以下に説明した多様なプレターゲッティング適用において、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／Ｋ
ＤＲ複合体結合ポリペプチドのコーディング配列は抗体（または抗体フラグメントもしく
は抗体を含む組換えＤＮＡ構築物など）をコードする配列に骨格で融合してもよく、そし
てそれはたとえば、放射性核種（または別の検出可能な標識）に対するキレート剤に結合
する。ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを発現する抗体は次に患者
に投与され、ＫＤＲ発現組織に局在し、そして結合する。非結合抗体が除去された後、抗
体が認識するキレート剤−放射性核種複合体（または他の検出可能な標識）が投与され、
ＫＤＲ発現組織の画像化またはそれへの放射線療法を可能にする。さらに、ＫＤＲまたは
ＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドのコーディング配列は、たとえば、生物学的作用（
たとえばアポトーシス、凝固、内在化、分化、細胞静止、免疫系刺激もしくは抑制、また
はそれらの組み合わせ）を生じる血清タンパク質または他のタンパク質をコードする配列
に骨格で融合してよい。得られた組換えタンパク質は、癌、および血管新生または本明細
書で説明した病原体に関連する疾患を含む他の疾患に関する画像化、放射線療法、ならび
に複数の療法に有用である。

さらに、本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを含む構築物
はそれ自体治療薬として使用され、多数の疾患を治療することができる。たとえば、タン
パク質または他の分子（たとえば成長因子、ホルモンなど）の結合が疾患過程に必要であ
るか、またはその一因となり、そして結合部分がそのような結合を阻害する場合、そのよ
うな結合部分を含む構築物は治療薬として有用であってよい。同様に、結合部分自体の結
合が疾患過程を阻害する場合、そのような結合部分を含む構築物も治療薬として有用であ
ってよい。

ＶＥＧＦの結合およびＫＤＲの活性化は血管新生活性に必須であるため、一態様では、
ＫＤＲへのＶＥＧＦの結合を阻害する（またはさもなければ、ＫＤＲの活性化を阻害する
）ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドを含む構築物は血管新生阻害剤として使用することがで
きる。ＫＤＲの活性化を阻害する本発明のいくつかのペプチドは以下の実施例９において
説明する。ＫＤＲの活性化を阻害する多量体およびヘテロ多量体を含む、本発明のある種
の構築物も実施例で説明する。とりわけ好ましいヘテロ多量体はヘテロ二量体含有構築物
Ｄ１（実施例により提供される構造）である。他の好ましいヘテロ二量体構築物には、Ｄ
４、Ｄ５、およびＤ６（以下の実施例１２および１８に提供される構造）が挙げられる。
本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は内皮細胞を含む状態を治療するための治療
薬として有用である。内皮細胞の重要な機能が血管新生、または血管形成であるため、ポ
リペプチドおよびその構築物は血管新生を含む状態の治療にとりわけ有用である。血管新
生を含む状態としては、たとえば、固形腫瘍、腫瘍転移および良性腫瘍が挙げられる。そ
のような腫瘍および関連する疾患は当該技術分野で十分に公知であり、たとえばメラノー
マ、中枢神経系腫瘍、内分泌腫瘍、肉腫、多発性骨髄腫、ならびに乳腺、肺、前立腺、結
腸、頭部＆頸部、および卵巣の癌が挙げられる。付加的な腫瘍および関連する疾患は、Ｍ
ｏｓｅｓ，ｅｔ ａｌ．の２０００年２月１５日に発行された米国特許第６，０２５，３
３１号の表１に記載され、その教示は本明細書に援用される。良性腫瘍には、たとえば、
血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫が挙げられる。血管新
生を含む他の関連する疾患には、たとえば慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜
症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植後拒絶反応、新生血管緑内障、水晶体線維増殖症
のような眼球疾患、レベオーシス（ｒｅｂｅｏｓｉｓ）、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候
群、心筋血管新生、プラーク血管新生、毛細血管拡張症、血友病患者関節、血管線維症お
よび創傷肉芽形成が挙げられる。血管増殖を含む、他の関連する疾患または状態には、腸
管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕、および潰瘍が挙げられ
る。さらに、本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は、卵子着床に必要な子宮血管
新生を減少させるか、または阻害するために、たとえば経口避妊薬として使用することが
できる。本発明のヘテロ多量体はまた、ＶＥＧＦがＫＤＲに結合する場合、結果として生
じてよい血管透過性事象の治療に有用であってよい。腎不全では、たとえば抗ＶＥＧＦ抗
体が障害を抑制できることが示されている。同様に、本発明の化合物は、たとえば糖尿病
における腎透過性発症を抑えることができる。

さらに、本発明のＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドは、たとえば
マラリア、ＨＩＶ、ＳＩＶ、サル出血熱ウイルスなどを含むある種の病原体に関連した疾
患の治療に有用であってよい。ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを使用したファージディ
スプレイにより同定されたＫＤＲ結合ペプチドの配列相同性検索は、病原性生物の表面に
存在することが公知であるか、または推測される多数の相同性タンパク質を同定している
。本発明のポリペプチドと各種マラリア系統、ＨＩＶ、ＳＩＶ、サル出血熱ウイルス、お
よび腸管出血性大腸菌株由来のタンパク質間に相同性が認められた。ＰｆＥＭＰ１および
ＥＢＬ−１のような相同性タンパク質のいくつかは、病原性において役割を果たすことが
公知の過可変接着タンパク質である。これらのタンパク質は、宿主表面上の１以上の標的
分子に結合可能な複数の結合部位を有する。それらの高い変異および組換え速度が、それ
らに新規結合部位を速やかに発生させ、生存および／または侵入を促進する。同様に、Ｈ
ＩＶのｇｐ１２０（それも本明細書に開示されたＫＤＲ結合ペプチドのいくつかに相同性
を有する）のようなタンパク質はそれらの宿主への病原体の結合に重要な役割を果たす。
今まで報告されていないが、本明細書に開示されたＫＤＲ結合ペプチドに相同性を有する
多くの病原体タンパク質もＫＤＲに結合することが可能である。病原体タンパク質配列と
対応するペプチド配列の比較は、ペプチドの結合特性を促進することになるその配列の変
化または他の改変を暗示できる。さらに、本明細書に開示されたＫＤＲ結合ペプチド配列
は、相同性を有する病原体種による感染の阻害に有用性であってよい。実際、ＣＤ４のよ
うなそれらの公知の細胞表面標的へのウイルスエンベロープタンパク質の結合を妨げるの
を試みることによる類似した方法がＨＩＶ感染阻害に使用されている。Ｈｏｗｉｅ ｅｔ
ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｄｉ
ｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ＣＤ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｓ ｏｆ ＨＩＶ−１
ｇｐ１２０ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ Ｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ
ｂｌｏｃｋ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｐ１２０”，ＦＡＳＥＢ
Ｊ，１２（１１）：９９１−９９８（１９９８）を参照されたい。したがって、ＫＤＲ
は多数の病原体に対し事前に未知の標的を提示し、そして本発明のＫＤＲ結合ペプチドは
それらの病原体に関連する疾患の治療に有用であってよい。

結合ポリペプチドおよびその構築物は状態の性質および所望する予後に依存して適切な
時間経過で個体に投与することができる。結合ポリペプチドおよびその構築物は予防的に
、たとえば状態が診断される前か、またはある状態にかかりやすい個体に投与することが
できる。結合ポリペプチドおよびその構築物は、個体が状態の症状を示す間、または症状
が治まるか、さもなければ緩和された後（たとえば腫瘍の除去後）に投与してもよい。さ
らに、本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は維持処方の一部として、たとえば再
発、または症状もしくは状態を妨げるか、または緩和させるために投与することができる
。以下に記載のように、本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は全身的、または局
所的に投与することができる。

投与される物質の量は状態の重症度に依存することになる。たとえば、血管新生状態の
治療に対して、たとえば新生物性腫瘍増殖の場合、腫瘍の位置およびサイズは投与される
物質の量に影響を及ぼすであろう。使用される正確な量および投与様式は病気の性質の観
点から必然的に処置を指図する医師によって状況にあわせて決定されなければならない。
一般に、本発明の薬物結合体の投与量は治療薬単独に対して慣例である投与量に従うこと
になるが、本発明の結合ポリペプチドまたはヘテロ多量体の標的に対する改善された親和
性は標準投与量を減らすことができる。

そのような結合した医薬組成物は好ましくは非経口投与のために、そして最も好ましく
は静脈内、または動脈内投与のために製剤される。一般に、そしてとりわけ投与が静脈内
または動脈内である場合、医薬組成物はボーラスとして、時間の離れた２回以上の投与量
として、または一定もしくは非線形流量注入物として投与してよい。

本明細書で使用する「治療的」という用語は、一定の状態の少なくとも部分的な症状の
緩和を含む。本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は、有用であるために完全に症
状を緩和させる必要はない。たとえば、個体の治療が腫瘍もしくは疾患部位のサイズの縮
小、または腫瘍もしくは疾患部位のサイズ増大の予防になってよい。治療は関心のある部
位において血管数を減らしてよいか、または関心のある部位において血管数の増加を妨げ
てよい。また、治療は主要な腫瘍（複数の腫瘍）の転移性増殖物の数またはサイズの増大
を妨げるか、または減らすことができる。

緩和することができる症状としては、ＶＥＧＦ受容体活性および内皮細胞遊走能のよう
な生理的特性が挙げられる。本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は、ＶＥＧＦ−
２／ＫＤＲ、ＶＥＧＦ−１／Ｆｌｔ−１およびＶＥＧＦ−３／Ｆｌｔ−４を含むＶＥＧＦ
受容体活性を阻害することができる。そのような阻害は、たとえば結合ポリペプチドおよ
びその構築物の存在下、またはそれらによる処置後の受容体のリン酸化状態を測定するこ
とにより検出できる。また、そのような阻害は、結合ポリペプチドおよびその構築物の存
在下、またはそれらによる処置後の内皮細胞の遊走能を測定することにより検出すること
ができる。本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は本明細書に提供される結合ポ
リペプチドおよびその構築物の適切な量の投与法を知り、関心のあるパラメータに対する
処置の効果を測定することができる。たとえば、関心のある部位（たとえば腫瘍または病
巣）のサイズは、処置前および後で測定することができる。別の態様では、個体から採取
した試料において、相当する受容体のリン酸化状態、または関心のある部位における内皮
細胞の遊走能を測定することができる。ＶＥＧＦ受容体または内皮細胞は試料から単離し
、本明細書に記載のアッセイに使用することができる。

ポリペプチドおよびその構築物の投与量は個体の年齢、性、健康状態、および体重、な
らびに状態の性質および全体的な治療計画に依存してよい。ポリペプチドおよびその構築
物の生物学的効果は本明細書に記載される。したがって、本明細書に提供される結合ポリ
ペプチドおよび構築物の生物学的効果および処置の所望する予後に基づき、慣例の最適化
法により、当業者は好ましい投与量を決定することができる。一般に、１日投与量は約０
．１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲である。

本明細書に提供される結合ポリペプチドおよびその構築物は薬剤的に受容できる添加剤
と一緒に単独の活性成分として投与するか、または他の結合ポリペプチドおよびその構築
物、他の治療薬、もしくはそれらの組み合わせと一緒に投与してよい。さらに、結合ポリ
ペプチドおよびその構築物は、たとえば特性、体内の滞留時間、または治療効果を改善す
るために治療薬に結合してもよい。そのような他の治療薬としては、たとえば他の血管新
生阻害化合物、および殺腫瘍化合物が挙げられる。治療薬はまた、抗体を含んでいてよい
。

さらに、本発明の結合ポリペプチドまたはその構築物は内皮細胞誘導手段として使用す
ることができる。したがって、結合ポリペプチドまたはその構築物は、核酸が内皮細胞を
標的にするように、たとえば治療ポリペプチドをコードする核酸に結合してよい。いった
ん核酸に結合した結合ポリペプチドに曝されると、内皮細胞は結合した核酸を内在化し、
発現して、標的細胞に治療ペプチドを送達することができる。

本発明の別の態様において、治療薬は超音波造影剤組成物と結合してよく、上記の超音
波造影剤は、先に記載のように、造影剤に含まれる小胞（とりわけマイクロバブルまたは
マイクロバルーン）を形成するために使用される物質に結合した、本発明のＫＤＲまたは
ＶＥＧＦ複合体結合ペプチドを含む。たとえば、上記造影剤／治療薬結合は、米国特許第
６，２５８，３７８号に記載のように行うことが可能であり、これを本明細書に援用する
。したがって、たとえば先に引用した米国特許第６，２５８，３７８号に開示されたよう
に、超音波造影剤の投与、およびＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体を発現する病原性
部位に結合した造影剤の所望する画像化後に、病原性部位はエネルギー光線（好ましくは
たとえば０．３〜３ＭＨｚの周波数の超音波）によって照射され、微小小胞の破裂を引き
起こすことができる。治療薬の治療効果はこうして好都合には微小小胞の破裂によって放
出されたエネルギーによって促進され、とりわけ標的とされる病原性部位への治療薬の効
果的な送達を行うことができる。

結合ポリペプチドおよびその構築物は任意の適切な経路によって投与することができる
。適切な投与経路には、局所適用、経皮、非経口、消化管、膣内、および経歯槽が挙げら
れるがそれらに限定されない。所望する投与経路のための組成物は、たとえばＲｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃ
ｙ，２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０
００に記載のように、薬剤的技術分野で公知のいずれかの方法により作成することができ
る。

局所適用には、結合ポリペプチドはたとえば、クリーム剤、ゲル剤またはリンス剤に懸
濁し、全身送達のためにポリペプチドおよびその構築物が皮膚に浸透して血流に入るか、
または局所送達のために関心のある部位と接触することを可能にする。局所適用に適した
組成物は、少なくともポリペプチドが最小限に可溶性の、薬剤的に受容できる基剤を含む
。

経皮適用には、ポリペプチドは適切な経皮手段または「パッチ」と一緒に薬剤的に受容
できる懸濁液で適用することができる。本発明のポリペプチドを投与するための適切な経
皮手段の例は、たとえばＦｏｌｄｖａｒｉ，ｅｔ ａｌ．の２０００年１２月２６日に発
行された米国特許第６，１６５，４５８号およびＳｉｎｔｏｖ，ｅｔ ａｌ．の２００１
年８月４日に発行された米国特許第６，２７４，１６６号Ｂ１に記載され、それらの教示
は本明細書に援用する。

非経口適用には、ポリペプチドは静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下に注入すること
ができる。一般に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液で
ある。他の薬剤的に受容できる担体には滅菌水、生理食塩水、および緩衝食塩水（リン酸
または酢酸のようなバッファーを含む）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール
、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パ
ラフィンなどを含むが、それらに限定されない。必要な場合、組成物は可溶化剤、および
注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインのような局所麻酔剤、保存剤、安定化剤、湿
潤剤、乳化剤、塩類、潤滑剤などを、それらが活性化合物と反応して悪影響を及ぼさない
限り、含むことができる。同様に、組成物は慣用の添加剤、すなわち、非経口的、経腸ま
たは鼻腔内適用に適した薬剤的に受容できる有機または無機担体物質を、それらが活性化
合物と反応して悪影響を及ぼさない限り含むことができる。一般に、成分は、たとえばア
ンプルまたはプラスチック製小容器のような気密シール容器中の乾燥した凍結乾燥粉末ま
たは無水濃縮物として、活性剤の量を活性単位で示す単位剤形中に、別々、または一緒に
混合して供給されることになる。組成物が注入により投与されることになっている場合、
滅菌薬剤等級「注射用水」または生理食塩水を含む注入容器により投薬することができる
。組成物が注射により投与されることになっている場合、滅菌注射用水または生理食塩水
のアンプルが提供され、成分は投与前に混合することができる。

消化管および膣内投与には、ポリペプチドは経口摂取には薬剤的に受容できる粉末剤、
丸剤または液剤に、そして直腸または膣内投与には坐剤に取り込まれてよい。
経歯槽、舌下または肺投与には、ポリペプチドはエアゾール化および吸入のために、ま
たはマウスウォッシュとして適切な薬剤的に受容できる添加剤に懸濁することができる。
噴霧器および吸入器のような経歯槽投与に適切な装置も本発明の範囲内である。舌下また
は肺経路を使用したポリペプチドのエアゾール送達に適した製剤は、たとえば２００１年
１１月６日に発行されたＰａｎｋａｊ Ｍｏｄｉの米国特許第６，３１２，６６５号Ｂ１
に見出すことができる。

さらに、本発明のポリペプチドは点滴状投与に適切な、液状の薬剤的に受容できる物質
に懸濁される場合、経鼻または眼球投与することができる。
本発明のポリペプチドは個体において持続的に放出されるように（徐放または制御放出
）投与することができる。たとえば、ポリペプチドは、１回の投与が少なくとも１週間、
または１年間以上にわたりポリペプチドを送達するような組成物に製剤することができる
。徐放系には、一体型または容器型マイクロカプセル、デポ製剤埋め込み物、浸透圧ポン
プ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチおよびイオン泳動装置が挙げられる。一態様
において、本発明のポリペプチドは分解の遅い、非毒性ポリマー中に封入されるか、また
は混合される。本明細書に提供されるポリペプチドの徐放に適した付加的な製剤は、１９
８３年７月５日に発行されたＦｏｌｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，３９１，７
９７号に記載され、その教示は本明細書に援用される。

本発明のポリペプチドを個体に送達するための別の適切な方法は、ポリペプチドのｉｎ
ｖｉｖｏ産生を介する。ポリペプチドをコードする遺伝子は、コードされるポリペプチ
ドが発現されるように個体に投与することができる。遺伝子は一過性に発現することがで
きる。具体的な態様において、ポリペプチドをコードする遺伝子は患者から得ている細胞
に形質移入され、その方法はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療と呼ばれる。ポリペプチドを発現
する細胞はその後患者の体内に戻される。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法は当該技術分野で
公知であり、１９９８年３月２１日に発行されたＡｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．の米国
特許第４，３９１，７９７号に記載され、その教示は本明細書に援用される。

（パネルＡおよびＢ）は結合ペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体の飽和結合曲線を示すグラフである。図１Ａは配列番号２６４および配列番号２９４の飽和結合曲線を示す。図１Ｂは配列番号２７７および配列番号３５６の飽和結合曲線を示す。すべてのペプチドはＣ末端ビオチンおよびＪＪスペーサーを有している。 （パネルＡおよびＢ）は結合ペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体の飽和結合曲線を示すグラフである。図１Ａは配列番号２６４および配列番号２９４の飽和結合曲線を示す。図１Ｂは配列番号２７７および配列番号３５６の飽和結合曲線を示す。すべてのペプチドはＣ末端ビオチンおよびＪＪスペーサーを有している。 ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞およびＭｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ細胞への、単一濃度（５．５５ｎＭ）のペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体：対照（スペーサーによりビオチン化、ならびに配列番号２６４、２９４、２７７および３５６）の結合を示すグラフである。すべてのペプチドはＣ末端ビオチンおよびＪＪスペーサーを有している。 実施例５で試験したスペーサー（ジ（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）「ＪＪ」）およびビオチンの両方を持つペプチド構造および持たない構造：（（ａ）ＪＪスペーサーを持つビオチン化配列番号２６４；（ｂ）Ｎ末端ビオチンを持つ配列番号２６４；（ｃ）ＪＪスペーサーを持つビオチン化配列番号２９４；（ｄ）ビオチン化配列番号２９４）を示す。 ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞およびＭｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ細胞への、単一濃度（２．７８ｎＭ）のペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体の結合を示す棒グラフである；ペプチドは（ａ）対照（スペーサーを持つ）；（ｂ）対照；（ｃ）ＪＪスペーサーを持つビオチン化配列番号２６４；（ｄ）Ｎ末端ビオチンを持つ配列番号２６４；および（ｅ）ＪＪスペーサーを持つビオチン化配列番号２９４；およびビオチン化配列番号２９４を含む。 ４０％ラット血清存在下および非存在下でのペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体の特異的結合（ＫＤＲトランスフェクト細胞への結合からＭｏｃｋトランスフェクト細胞への結合を引く）を示す棒グラフである。（ａ）配列番号２９４；（ｂ）配列番号２６４；（ｃ）配列番号２７７；（ｄ）配列番号３５６。ペプチド／アビジンＨＲＰ溶液の濃度は（ａ）および（ｂ）は６．６６ｎＭ、（ｃ）３．３３ｎＭ、および（ｄ）２．２２ｎＭであった。すべてのペプチドはＣ末端ビオチンおよびＪＪスペーサーを有している。 ４５０ｎｍの吸光度としてプロットしたｍｏｃｋトランスフェクト細胞およびＫＤＲトランスフェクト細胞へのポリペプチド／アビジン−ＨＲＰ溶液（配列番号２９４および／または配列番号２６４）の結合を示す棒グラフである。それぞれの四量体複合体を形成するために使用される対照およびＫＤＲ結合ペプチドの割合はそれぞれの試験多量体の下の説明に示す。 ４５０ｎｍでの吸光度としてプロットした、ＫＤＲトランスフェクト細胞へのＪＪスペーサー／アビジン−ＨＲＰ複合体を持つビオチン化配列番号２６４の特異的結合（ｍｏｃｋトランスフェクト細胞へのバックグラウンド結合を引く）を示す棒グラフである。下の説明に示すように、アッセイ系に複合体を形成していないペプチドの濃度（Ｘ軸に示す）を増やしながら添加した。遊離配列番号２６４だけがＫＤＲトランスフェクト細胞への配列番号２６４複合体の結合を減少させることが可能であった。 実施例６で試験した結合ポリペプチド配列：配列番号２９４および３６８〜３７２の構造を示す。 ＫＤＲトランスフェクト細胞およびＭｏｃｋトランスフェクト細胞への蛍光ビーズの結合を示す棒グラフである。表示されたビオチン化リガンドが結合したニュートラアビジン被覆ビーズによるＫＤＲ発現２９３Ｈ細胞および非発現２９３Ｈ細胞への結合を試験した。 ＫＤＲ発現２９３Ｈ形質移入体への、２種の濃度（３０μＭおよび０．３μＭ）の結合ポリペプチド（ａ）アセチル化配列番号２９４（改変したＣ末端「Ｐ６」、ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰ；配列番号３７４を持たない）；（ｂ）配列番号２６３（改変したＣ末端「Ｐ４」、ＡＧＤＳＷＣＳＴＥＹＴＹＣＥＭＩＧＴ；配列番号３７５を持たない）；（ｃ）ＪＪスペーサーを持つビオチン化配列番号２６４；および（ｄ）配列番号２７７（ＪＪスペーサーでビオチン化）による^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合の阻害割合（％）を示す棒グラフである。 活性化（リン酸化）ＫＤＲは非刺激（−Ｖ）ＨＵＶＥＣ由来の免疫沈降物には検出されず、ＶＥＧＦ−刺激（＋Ｖ）ＨＵＶＥＣ由来の免疫沈降物には豊富にあることを示すフィルム上の化学ルミネセンス検出を示す（上部パネル）。抗ＫＤＲによるブロットの再検索は、全ＫＤＲに相当する量が両免疫沈降物に存在することを示した（下部パネル）。 ＶＥＧＦ−介在リン酸化を部分的に阻害する抗ＫＤＲ抗体（１μｇ／ｍＬ）の能力を示す、フィルム上における化学ルミネセンス検出を示す。 ＶＥＧＦ−介在ＫＤＲリン酸化を阻害するＫＤＲ結合ポリペプチド配列番号３０６（１０μＭ）の能力を示す、フィルム上における化学ルミネセンス検出を示す。 ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＴｃ−標識ポリペプチド（配列番号３３９）の結合を示す棒グラフである。 ３種の異なる濃度（１０μＭ、０．３μＭ、および０．０３μＭ）のペプチドＰ１２−ＸＢ（配列番号２７７）Ｄ２、Ｄ１、Ｄ３、およびＰ１３−Ｄ（ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧ；配列番号３７６）による、ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合の阻害割合（％）を示す棒グラフである。結果は、トリプリケートで行われた１回の実験±Ｓ．Ｄ．に由来する。 ＨＵＶＥＣ中のＫＤＲのＶＥＧＦ誘発リン酸化を１０ｎＭで完全に阻害し、そして１ｎＭで大部分のリン酸化を阻害するＤ１の能力を示す写真である。全ＫＤＲ（下部パネル）に対するブロットの再検索は、試験化合物の効果が少ない試料負荷によるものではないことを示した。Ｄ１に含まれる２種の結合配列からなるホモ二量体は１００ｎＭまでリン酸化を阻害しなかった。 ＶＥＧＦにより誘発される内皮細胞の遊走／浸潤をＤ１が強力に阻害することを示すグラフである。蛍光色素で遊走細胞を染色後、該遊走細胞を蛍光測定により定量した。 ４０％マウス血清の非存在下および存在下におけるｍｏｃｋ形質移入２９３Ｈ細胞およびＫＤＲ形質移入２９３Ｈ細胞への^１２５Ｉ−標識Ｄ５の結合を示すグラフである。 ４０％マウス血清の非存在下および存在下におけるＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への^１２５Ｉ−標識Ｄ５の特異的結合（ＫＤＲ−ＭＯＣＫ）を示すグラフである。 パーセントで表した注射量／ｍＬ対時間としての血漿クリアランスのグラフである。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム由来の血漿のＳＥ−ＨＰＬＣ特性を示す。パネルは上から、注入された試料、０分、３０分、および９０分。それぞれのパネルの挿入物はＨＰＬＣ解析の測定時間、動物数、および注射容積を示す。 ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおけるＫＤＲペプチドの試験の結果を示すグラフである。Ａ：Ｄ６；Ｂ：配列番号２７７；Ｃ：配列番号３７７（ＡＥＧＴＧＤＬＨＣＹＦＰＷＶＣＳＬＤＰＧＰＥＧＧＧＫ陰性対照）；Ｆ：配列番号３７７；陰性対照。 マウスＫＤＲ−Ｆｃに結合するＤ１（図３６を参照されたい）の速度論解析を示す。すべてのセンソグラムは２価分析物モデルに適合する。 マウスＫＤＲ−Ｆｃに結合するＤ１（図３６を参照されたい）の速度論解析を示す。すべてのセンソグラムは２価分析物モデルに適合する。 配列番号２６４および配列番号２９４のヘテロ二量体、Ｄ７の速度論解析を示す。すべてのセンソグラムは、２価分析物モデルに適合する。 配列番号２６４および配列番号２９４のヘテロ二量体、Ｄ７の速度論解析を示す。すべてのセンソグラムは、２価分析物モデルに適合する。 マウスＫＤＲ−Ｆｃに結合した蛍光標識配列番号２７７の速度論解析を示す。すべてのセンソグラムは、１：１ラングミュアモデルに適合する。 マウスＫＤＲ−Ｆｃに結合した蛍光標識配列番号２７７の速度論解析を示す。すべてのセンソグラムは、１：１ラングミュアモデルに適合する。 パネル１、２および３に示す、α、β、γもしくはδジペプチド、または回転模倣物（たとえばα、β、γ、またはδ模倣物）の例を示す。 オキシムリンカーを示す。アミノアルコール官能基を含む（４）、およびアルコキシアミノ官能基を含む（５）アミノ酸はペプチド鎖に取り込まれるが、必ずしもペプチド鎖の末端ではない。 ペンダントブロモアセトアミド官能基を有するシステインの環化の例を示す。 システイン部分とペプチドアルデヒドの分子内反応を介したチアゾリジン結合による環状ペプチドの形成を示す図式である。 ＬｙｓおよびＡｓｐの準直交（ｑｕａｓｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）脱保護、その後の樹脂上環化および樹脂からの開裂によるジスルフィド結合のラクタム代替物を示す図式である。 アリルを基礎にした保護基を使用したＬｙｓおよびＡｓｐの準直交脱保護、その後の樹脂上環化および樹脂からの開裂によるジスルフィド結合のラクタム代替物を示す図式である。 Ｇｒｕｂｂｓオレフィンメタセシス環化を示す図式である。 リン脂質構造を示す。 図３４Ａ〜Ｆは、キレート剤の好ましい構造を示す。 図３４Ａ〜Ｆは、キレート剤の好ましい構造を示す。 図３４Ａ〜Ｆは、キレート剤の好ましい構造を示す。 図３４Ａ〜Ｆは、キレート剤の好ましい構造を示す。 図３４Ａ〜Ｆは、キレート剤の好ましい構造を示す。 図３４Ａ〜Ｆは、キレート剤の好ましい構造を示す。 キレート剤の構造を示す。 二量体１（Ｄ１；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）［（ビオチン−ＪＪＫ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ_２）_３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（（Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧ（配列番号３７０））−ＮＨ）ＣＯＮＨ_２）−ＮＨ_２］を示す。 二量体２（Ｄ２；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）［（ビオチン−ＪＪＫ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ_２）_３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＪ（配列番号３３８））−ＮＨ）ＣＯＮＨ_２）−ＮＨ_２］を示す。 二量体３（Ｄ３；Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）［（ビオチン−ＪＪＫ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ_２）_３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ−ＮＨ（ＣＨ２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（（Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧ（配列番号３７０））−ＮＨ）ＣＯＮＨ_２）−ＮＨ_２］を示す。 二量体４（Ｄ４；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＪＫ（配列番号３３８）［ＤＯＴＡ−ＪＪＫ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ_２）_３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（（Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧ（配列番号３７０））−ＮＨ）ＣＯＮＨ_２］−ＮＨ_２）を示す。 二量体５（Ｄ５；Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）（ＪＪ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_３Ｃ（＝Ｏ）−Ｋ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧ（配列番号３７８））−ＮＨ）ＣＯＮＨ_２）−ＮＨ_２）を示す。 二量体８（Ｄ８；Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（配列番号３５６）｛Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（配列番号３５６）（Ｊ−Ｇｌｕｔ−）−ＮＨ_２｝Ｋ（ビオチン−ＪＪ）−ＮＨ_２）を示す。 二量体９（Ｄ９；Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（配列番号３５６）｛［Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）（ＪＪ−Ｇｌｕｔ−）］−ＮＨ_２｝Ｋ−ＮＨ_２）を示す。 二量体１０（Ｄ１０；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛［Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）（ＪＪ−Ｇｌｕｔ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ−ＮＨ）（Ｃ＝Ｏ−））−ＮＨ_２］−ＮＨ_２｝を示す。 二量体１１（Ｄ１１；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号４７５）［ＪＪ−Ｇｌｕｔ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（ＤＯＴＡ−ＪＪ−ＮＨ−）（Ｃ＝Ｏ）−］−ＮＨ_２｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１２（Ｄ１２；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号４７６）｛［ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ−Ｋ（Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）（−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−）−ＮＨ_２）］−ＮＨ_２｝を示す。 二量体１３（Ｄ１３；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）［ＪＪ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＢＯＡ）］−ＮＨ_２｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１４（Ｄ１４；Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＧＧＫ（配列番号３５６）｛ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ−Ｋ［Ａｃ−ＧＳＤＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号４７７） （ＪＪ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ_２］｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１５（Ｄ１５；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛［［Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫＪＪ（配列番号２９４）−Ｇｌｕｔ］−ＮＨ_２］−Ｋ（ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ）｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１６（Ｄ１６；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ−Ｋ［Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）［−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−］−ＮＨ_２］｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１７（Ｄ１７；Ａｃ−ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＪＧＲＧＧＲＧＧＲＧＧＫ（配列番号４７８）｛Ｋ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）（ＪＪ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ_２］｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１８（Ｄ１８；Ａｃ−ＡＰＧＴＷＣＤＹＤＷＥＹＣＷＬＧＴＦＧＧＧ（配列番号４７９）｛ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ−Ｋ［Ａｃ−ＧＶＤＦＲＣＥＷＳＤＷＧＥＶＧＣＲＳＰＤＹＧＧＧＫ（配列番号４８９）（ＪＪ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ_２］｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体１９（Ｄ１９；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２９４）｛ビオチン−Ｋ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（ＪＪ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ_２］｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体２０（Ｄ２０；（−ＪＪＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＧＫ（配列番号４８０）−ＮＨ_２）−Ｇｌｕｔ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧ（配列番号３７０）−ＮＨ_２）を示す。 二量体２１（Ｄ２１；［−ＪＪＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＧＫ（配列番号４８０）（ＰｎＡＯ６−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ_２］−Ｇｌｕｔ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧ（配列番号３７０）−ＮＨ_２）を示す。 二量体２２（Ｄ２２；Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）｛ＪＪ−Ｇｌｕｔ−ＪＪ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＴＧＧＧＫ（配列番号４８１）−ＮＨ_２｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体２３（Ｄ２３；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）［ＪＪ−Ｇｌｕｔ−Ｋ（ＳＡＴＡ）］−ＮＨ_２｝−ＮＨ_２を示す。また、Ｄ２３はＳＡＴＡ（Ｓ−アセチルチオアセチル）基で官能化されている。 二量体２４（Ｄ２４；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛ＳＡＴＡ−ＪＪＫ［Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）（ＪＪ−Ｇｌｕｔ）−ＮＨ_２］｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体２５（Ｄ２５；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）［ＪＪ−Ｇｌｕｔ−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）−］−ＮＨ_２｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体２６（Ｄ２６；ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛（−Ｇｌｕｔ−ＪＪ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧ（配列番号３７０）−ＮＨ_２）−Ｋ｝−ＮＨ_２）を示す。 二量体２７（Ｄ２７；Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＧＫ（配列番号２７７）｛Ａｃ−ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）［Ｓ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）_３−α−Ｄ）−Ｇ−Ｓ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）_３−α−Ｄ）−Ｇｌｕｔ−Ｓ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）_３−α−Ｄ）−Ｇ−Ｓ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）_３−α−Ｄ）−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−（Ｓ）−ＣＨ（ビオチン−ＪＪＮＨ−）Ｃ（＝Ｏ）−］−ＮＨ_２｝−ＮＨ_２）を示す。 本発明の二量体結合ペプチドを示す。 本発明の二量体結合ペプチドを示す。 本発明の二量体結合ペプチドを示す。 本発明の二量体結合ペプチドを示す。 Ｄ６濃度の関数としての腫瘍増殖阻害を示す。 グリコシル化し、改変したスペーサーを持つＤ２６（■）が細胞遊走アッセイにおいてＶＥＧＦの作用を阻害し、それらの化学的改変を欠如するＤ２４（◆）より強力にＶＥＧＦ−刺激細胞遊走を阻害できることを示す。 培養したＨＵＶＥＣによる細胞遊走アッセイにおいて、ＶＥＧＦの生物学的作用を阻害するＤ６の効力を付加物Ａが促進することを示す。◆：示した濃度でのＤ６単独。■：示した濃度でのＤ６＋１００ｎＭ 付加物Ａ（一定）。 スキーム１（ペプチド２の合成）を示す図式である。 スキーム２（ペプチド４の合成）を示す図式である。 スキーム３（Ｄ２６の合成）を示す図式である。 配列番号５０４（■）およびＤ１（◆）によるＫＤＲトランスフェクト細胞への特異的^１２５Ｉ−ＶＥＧＦ結合の％阻害±ｓ．ｄ．を示す。 配列番号５０４（◆）およびＤ１（■）の示した濃度の存在下でのＨＵＶＥＣ細胞の％最大ＶＥＧＦ−刺激細胞遊走±ｓ．ｄ．を示す。 ^１２５Ｉ−ストレプトアビジンと対照ペプチドおよび試験ペプチド（配列番号３２１、３２０および３２３）の複合体のｍｏｃｋトランスフェクト細胞およびＫＤＲトランスフェクト細胞への全結合（ＶＥＧＦ存在下）をグラフで示す。配列番号３２１を含む複合体だけが特異的結合（ＫＤＲ−ｍｏｃｋ）を示した。 ペプチド（配列番号３２１）−^１２５Ｉ−ストレプトアビジン複合体の各種濃度（０〜１３．３３ｎＭ）での、ＫＤＲトランスフェクト細胞へのペプチド−^１２５Ｉ−ストレプトアビジン複合体の特異的結合（ＶＥＧＦ非存在下および存在下）を示すグラフである。 ホモ二量体Ｄ８（■）はヘテロ二量体Ｄ１７（◆）とは異なり、実施例２８で行われた細胞遊走アッセイにおいてＶＥＧＦの作用を阻害しないことを示す。 環状ラクタムペプチドの合成を示す図式である（見本手順）。 異なるスペーサー長とビオチンを持つ配列番号４８２誘導体の結合を示すグラフである。誘導体は配列番号４８２標的配列とビオチン間において、それぞれＪスペーサーを０、１および２有する。 実施例３２に記載のＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＴｃ−標識Ｄ１０の結合を示す。パネルＢは実施例３２に記載のＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＴｃ−標識Ｄ１８の結合の欠如を表す。Ｍｏｃｋ＝ｍｏｃｋトランスフェクト。Ｔｒａｎｓ＝ＫＤＲトランスフェクト。ＭＳ＝マウス血清 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 図７９Ａ〜Ｇは、本発明の結合ペプチドの誘導体を示す。 ＰＣ３腫瘍を移植されたヌードマウスで行われたＤ１３による放射線治療研究の結果を要約する。実施例３４に記載のように、描かれたそれぞれの線は、１組の非処置マウスにおける平均の腫瘍増殖を表す太い点線以外は、処置されたマウスにおける個々の腫瘍増殖の時間経過を示す。 本発明のＫＤＲペプチドに結合したマイクロバブルの懸濁液注射後３０分までのマトリゲルまたは腫瘍におけるバブル造影剤の取込および滞留を示す。対照的に、同じバブルは、マトリゲルまたは腫瘍部位の外側に位置するＡＯＩでは一過性（わずか１０分）の可視化／バブル造影剤だけを示した。 本発明のＫＤＲペプチドに結合したマイクロバブルの懸濁液注射後３０分までのマトリゲルまたは腫瘍におけるバブル造影剤の取込および滞留を示す。対照的に、同じバブルは、マトリゲルまたは腫瘍部位の外側に位置するＡＯＩでは一過性（わずか１０分）の可視化／バブル造影剤だけを示した。 １０％ヒト血清アルブミン存在下でのＫＤＲトランスフェクト細胞またはｍｏｃｋトランスフェクト細胞に結合したペプチド結合超音波造影剤の代表例を示す。（拡大：１００×）

本発明に従ったＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合部分は以下の実施例において
さらに説明されるであろう。以下の実施例に含まれる具体的なパラメータは本発明の実施
を説明することを意図し、そしてそれらはどのような方法によっても本発明の範囲を限定
するように提示されない。

ＫＤＲおよびＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体標的に対するライブラリースクリーニング
ヒトＫＤＲ（＃３５７−ＫＤ−０５０）、マウスＫＤＲ（＃４４３−ＫＤ−０５０）、
ヒトＶＥＧＦＲ−１（＃３２１−ＦＬ−０５０）、ヒトＶＥＧＦＲ−３（＃３４９−Ｆ４
−０５０）、およびヒトＴｒａｉｌ Ｒ４（＃６３３−ＴＲ−１００）とＩｇ Ｆｃ領域
のキメラ融合体は担体なしの形（ＢＳＡなし）でＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス
、ＭＮ）から購入した。Ｔｒａｉｌ Ｒ４ Ｆｃは、標的Ｆｃ融合体（ＫＤＲ Ｆｃ）と
同じＦｃ融合体領域を有する不適切なＦｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ結合剤のライブラ
リーを枯渇させるために使用する。ＶＥＧＦ_１６５（＃１００−２０）は担体なしの形で
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ロッキーヒル、ＮＪ）から購入した。プロテインＡ磁気ビーズ（＃
１００．０２）はＤｙｎａｌ（オスロ、ノルウェー）から購入した。ヘパリン（＃Ｈ−３
３９３）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（セントルイス、ＭＯ）から
購入した。Ａ２−成分テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）システムはＫＰＬ（ゲイサーブ
ルグ，ＭＤ）から購入した。

以下の方法において、マイクロタイタープレートはＢｉｏ−Ｔｅｋ ４０４プレート洗
浄機（ウィヌースキー，ＶＴ）で洗浄した。ＥＬＩＳＡ信号はＢｉｏ−Ｔｅｋプレートリ
ーダー（ウィヌースキー，ＶＴ）で読み取った。９６ウェルプレートの撹拌はＬａｂＱｕ
ａｋｅ振とう機（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ベーカリー，ＣＡ）上で行った。

８つのＭ１３ファージディスプレイライブラリーを、固定化ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／Ｋ
ＤＲ標的に対するスクリーニングのために調製した：環状ペプチドディスプレイライブラ
リーＴＮ６／ＶＩ、ＴＮ７／ＩＶ、ＴＮ８／ＩＸ、ＴＮ９／ＩＶ、ＴＮ１０／ＩＸ、ＴＮ
１２／ＩおよびＭＴＮ１３／Ｉ、および直鎖状ディスプレイライブラリーＬＩＮ２０。こ
れらのライブラリーの設計は前に説明されている。

ライブラリーをコードするＤＮＡは、ＤＮＡがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ウェレスレイ，ＭＡ）を使用してＰＣＲ増幅できるように、両方の末
端に一定のＤＮＡを有するように合成し、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで切断し、そして同様
に切断されたファージディスプレイベクターへ連結した。ＸＬＬ−ＢＬｕｅ ＭＦＲ’大
腸菌細胞を連結したＤＮＡで形質転換した。ライブラリーのすべてを同一の様式で構築し
た。

ヘパリン存在下でのＫＤＲ選択プロトコール
プロテインＡ磁気ビーズを１回、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−
２０、０．１％ＨＳＡ（ブロッキング緩衝液）を用いて室温で３０分ブロックし、１×Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５μｇ／ｍｌヘパリン（ＰＢＳＴＨ
緩衝液）で５回洗浄した。

環状ペプチド、または「強要された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ループ」、ライブラリ
ーは、最初のスクリーニングのために２つのプールに分けてプールした。ＴＮ６／ＶＩ、
ＴＮ７／ＩＶおよびＴＮ８／ＩＸが１つのプールであり；ＴＮ９／ＩＶ、ＴＮ１０／ＩＸ
およびＴＮ１２／Ｉが第２のプールであった。２つのプールしたライブラリーおよび直鎖
状ライブラリー（Ｌｉｎ２０）は、Ｔｒａｉｌ Ｒ４ Ｆｃ融合体（不適切なＦｃ融合体
）に対して枯渇させ、そして次にＫＤＲ Ｆｃ融合体に対して選択した。１００μｌ Ｐ
ＢＳＴＨ当たり、各々のライブラリーから１０^１１プラーク形成単位（ｐｆｕ）を一緒に
プールした、例えば、３つのプールされたライブラリーは、総容量で〜３５０μｌＰＢＳ
ＴＨを生じるであろう。

不適切なＦｃ融合体ビーズを調製するため、５００μｌのＴｒａｉｌ Ｒ４−Ｆｃ融合
体（０．１μｌ／μｌＰＢＳＴ保存液（ヘパリンなし））を、１０００μｌの洗浄し、ブ
ロックしたプロテインＡ磁気ビーズへ加えた。融合体は、４℃で撹拌しながら、一夜ビー
ズへ結合させた。次の日、磁気ビーズを５回、ＰＢＳＴＨで洗浄した。各々のファージプ
ールは５０μｌのＴｒａｉｌ Ｒ４ Ｆｃ融合体ビーズと、ＬａｂＱｕａｋｅ振とう機上
、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ファージ上清を除
去し、そして別の５０μｌのＴｒａｉｌ Ｒ４ビーズとインキュベートした。非特異的Ｆ
ｃ融合およびライブラリーからビーズ結合ファージを除去するため、総計で５ラウンドの
枯渇を繰り返した。

ＫＤＲ標的ビーズを調製するため、５００μｌのＫＤＲ−Ｆｃ融合体（０．１μｌ／μ
ｌＰＢＳＴ保存液（ヘパリンなし））を、５００μｌの洗浄し、ブロックしたビーズへ加
えた。ＫＤＲ−Ｆｃ融合体は、４℃で撹拌しながら、一夜ビーズへ結合させた。次の日、
ビーズを５回、ＰＢＳＴＨで洗浄した。各々の枯渇ライブラリープールを１００μｌのＫ
ＤＲ−Ｆｃ融合体ビーズへ加え、ＬａｂＱｕａｋｅ振とう機上、室温で１時間インキュベ
ートした。ビーズは次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してできるだけ迅速に
５×１ｍｌ ＰＢＳＴＨで洗浄して、ビーズを洗浄緩衝液から分離した。洗浄後にビーズ
にまだ結合しているファージは、２５０μｌのＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍｌ、〜１μＭ）の
ＰＢＳＴＨ溶液で、ＬａｂＱｕａｋｅ振とう機上、室温で１時間、１度溶出させた。１時
間溶出液を除去し、保存した。最初の溶出後、ビーズを再び２５０μｌのＶＥＧＦ（５０
μｇ／ｍｌ、〜１μＭ）で、ＬａｂＱｕａｋｅ振とう機上、室温で一夜インキュベートし
た。２つのＶＥＧＦ溶出液は別々に保ち、力価決定のために各々から一部を少量採取した
。各々の溶出液を、中間対数期まで増殖させた後、氷で冷やしておいたＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’（または他のＦ’細胞株）大腸菌細胞の一部と混合した。ＶＥＧＦ溶出後の残
りのビーズもまた、ビーズにまだ結合されているファージ、即ち、２回のＶＥＧＦインキ
ュベーション（１時間および一夜溶出）によっても競合により取り除かれなかったＫＤＲ
結合ファージ、を増幅させるために細胞と混合した。室温で約１５分後、ファージ／細胞
混合物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＮＺＣＹＭ寒天を含んでいるＢｉｏ−Ａｓｓ
ａｙ Ｄｉｓｈｅｓ（２４３×２４３×１８ｍｍ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）上に広げた。
プレートは３７℃で一夜インキュベートした。次の日、各々の増幅されたファージ培養物
を、そのそれぞれのプレートから採取した。次の日の終わりまでに、インプット、アウト
プットおよび増幅ファージ培養物のＦＯＩ（即ち、インプット率＝ファージアウトプット
÷ファージインプット）を滴定した。

第一のラウンドにおいて、各々のプールで３つの増幅溶出液を得た。これらの溶出液は
、上記と同一のプロトコールに従い、〜１０^１０インプットファージ／ラウンドを使用す
る選択のさらなる２〜３の追加ラウンドで選り分けた。各々の追加ラウンドのため、ＫＤ
Ｒ−Ｆｃビーズは、ラウンドが開始される前夜に調製した。続いてのラウンドにおける溶
出工程に対し、ＫＤＲ−Ｆｃビーズ上の増幅された溶出液再スクリーンは、いつも同一の
様式で溶出し、すべての他の溶出は洗液として処理した。例えば、大腸菌を感染させるた
め、まだ結合されているビーズを使用して回収された増幅溶出液に対しては、１時間およ
び一夜ＶＥＧＦ溶出を実施し、そして洗液として廃棄した。次に、ビーズを再び大腸菌を
感染させるために使用し、次のラウンドの増幅溶出液を産生した。この手順を使用すると
、各々のライブラリープールから、選択の終わりには３つの最終溶出液のみしか得られな
い。それ故、２つのプールおよび１つの直鎖状ライブラリーから、選択の終わりには９つ
の最終溶出液が得られた。

この選択手順を、ヘパリン非存在下のすべての結合緩衝液中で、すべてのライブラリー
に対して繰り返した、即ち、すべての工程において、ＰＢＳＴＨをＰＢＳＴ（ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に置き換えた。

ヘパリン存在下でのＫＤＲ：ＶＥＧＦ複合体選択プロトコール
プロテインＡ磁気ビーズを、ブロッキング緩衝液で３０分、室温で１回ブロックした後
、５回ＰＢＳＴＨで洗浄した。

強要されたループライブラリーの２つのプールおよび直鎖状ライブラリー（Ｌｉｎ２０
）は前のように調製し、結合ＶＥＧＦなしでのレセプターへの結合剤を除去するためＴｒ
ａｉｌ−Ｒ４ Ｆｃ融合体の代わりに、ＫＤＲ Ｆｃ融合体のみに対して枯渇させた。枯
渇させたら、ライブラリーをＫＤＲ：ＶＥＧＦ_１６５複合体に対して選択した。

ＫＤＲ−ＦＣ融合体枯渇ビーズを調製するため、１ｍＬのＫＤＲ−ＦＣ融合体（０．１
μｇ／μｌＰＢＳＴ保存液（ヘパリンなし））を、１ｍｌの洗浄しブロックしたビーズに
加えた。融合体は４℃で撹拌しながら、一夜結合させた。次の日、ビーズをＰＢＳＴＨで
５回洗浄した。各々のファージプールは、ＬａｂＱｕａｋｅ振とう機上、室温で１時間、
５０μｌのＫＤＲ−ＦＣ融合体ビーズとインキュベートした。インキュベーション後、フ
ァージ上清を除去し、別の５０μｌのＫＤＲ−ＦＣ融合体ビーズとインキュベートした。
これを総計で５ラウンドの枯渇のために繰り返した。

ＫＤＲ：ＶＥＧＦ複合体ビーズを調製するため、３００μｌの上記からのＫＤＲ−ＦＣ
融合体ビーズを１５μｌのＶＥＧＦ（１ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ＶＥＧＦは
室温で１時間結合させた。ビーズを５回、ＰＢＳＴＨで洗浄した。各々の枯渇ライブラリ
ープールを１００μｌのＫＤＲ：ＶＥＧＦ複合体ビーズへ加え、ＬａｂＱｕａｋｅ振とう
機上、室温で１時間インキュベートした。ビーズは次に、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ
）を使用してできるだけ迅速に５×１ｍｌ ＰＢＳＴＨで洗浄して、ビーズを洗浄緩衝液
から分離した。洗浄後にビーズにまだ結合しているファージを溶出するため、ビーズを細
胞と混合し、ビーズにまだ結合されているファージを増幅した。室温で約１５分後、ファ
ージ／細胞混合物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＮＺＣＹＭ寒天を含んでいるＢｉ
ｏ−Ａｓｓａｙ Ｄｉｓｈｅｓ（２４３×２４３×１８ｍｍ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ）上
に広げた。プレートは３７℃で一夜インキュベートした。次の日、各々の増幅されたファ
ージ培養物を、そのそれぞれのプレートから採取した。次の日の終わりまでに、インプッ
ト、アウトプットおよび増幅ファージ培養物のＦＯＩを滴定した。この選択プロトコール
を、各々の増幅溶出液からの１０^１０のインプットファージを使用して、さらに２ラウン
ド繰り返した。

ＫＤＲおよびＫＤＲ／ＶＥＧＦスクリーニングアッセイ
１００μｌのＫＤＲ−ＦＣ融合体またはＴｒａｉｌ Ｒ４−Ｆｃ癒合体（１μｇ／ｍｌ
）を二重のＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩプレートのあらゆるウェルへ加え、４℃で一夜インキュ
ベートした。各々のプレートを２回、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）
で洗浄した。ウェルを１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡで上まで満たし、室温で２時間インキュベ
ートした。各々のプレートを１回、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で
洗浄した。

ＫＤＲ：ＶＥＧＦ複合体への結合を評価するため、別の組のＫＤＲを上記の様に準備し
、各々のＫＤＲウェルへ１００μｌのＶＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）のＰＢＳＴ溶液を加え、
室温で３０分インキュベートした。各々のプレートは次に、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。

プレートを準備したら、各々の一夜ファージ培養物をＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０、１％ＢＳＡで１：１に希釈した（または、精製ファージ保存液を使用して１０^１０
ｐｆｕへ）。１００μｌの各々の希釈培養液を加え、室温で２〜３時間インキュベートし
た。各々のプレートを５回、ＰＢＳＴで洗浄した。結合ファージは、ＰＢＳＴに１：１０
，０００希釈で希釈した、ＨＲＰ−抗Ｍ１３抗体コンジュゲート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を各々のプレートへ加えることにより可視化し、室温で１時間インキュベートした。各々
のプレートを７回、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、次にプ
レートをＨＰＲ基質で発色させ（〜１０分）、そして吸光度信号（６３０ｎｍ）をプレー
トリーダーで検出した。

ＫＤＲおよびＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合ファージを回収し、増幅し、そして結合に関
与しているディスプレイペプチドの配列を、標準ＤＮＡ配列決定法により決定した。単離
されたファージの結合ペプチドは、下記の表１〜７に示されている。

最初の選択ラウンドでのＫＤＲおよびＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体単離物の単離後、ある種
の単離物を二次ライブラリー構築のためのテンプレートとして働くように選択し、それか
らさらに高親和性結合ポリペプチドを単離した。二次ＴＮ８ライブラリーにおいて、ファ
ージ単離物配列ＰＫＷＣＥＥＤＷＹＹＣＭＩＴ（配列番号２１）を、各々の可変コドンで
親配列に対して１−、２−および３−塩基突然変異を許容するライブラリーの構築するた
めのテンプレートとして使用した。二次ＴＮ１２ライブラリーにおいて、ファージ単離物
配列ＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹ（配列番号８８）を、各々の可変コドンで親配
列に対して１−、２−および３−塩基突然変異を許容するライブラリーの構築するための
テンプレートとして使用した。別の二次ＴＮ１２ライブラリーにおいては、最初のＴＮ８
配列からの反復性モチーフは一定に保ち（ＷＶＥＣ−−−ＴＧ−Ｃ−−−；配列番号２６
０）、そして他のコドン位置のすべて（即ち、「−」での）はＮＮＫコドン置換を使用し
て変更することを許容した、ここでＮは任意のヌクレオチドを表し、およびＫは任意のケ
トヌクレオチド（ＧまたはＴ）を表している。

Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７（５１）：１７７５４−
１７７６４（１９９８）、により記載されているようなソフト無作為化によるペプチド最
適化法を使用し、２つのライブラリーを配列番号２１および配列番号８８の配列に基づい
て調製した。各々の残基位置において、特定コドン内の各々のヌクレオチドは、親コドン
のヌクレオチドには対応しない、別の３つのヌクレオチドの固定量を加えることにより発
展させることを許容した。このヌクレオチド混合は、ライブラリーを作製するために使用
したテンプレートＤＮＡの合成において達成した。これらのライブラリーについて、各々
のコドン内の親ヌクレオチドは、配列番号２１で６４％、および配列番号８８で６７％維
持されており、ところが他のヌクレオチドは３で割った残りの頻度で付加されていた。親
ヌクレオチドが多数であるので、全ライブラリーの総合的な共通配列は、まだ親配列を含
んでいるのは当然である。しかしながら、個々の配列を点検すると、多数の突然変異が可
能であることを示しており、それ故、親配列と比較して改良された結合能力を有するペプ
チドの選択を可能にしている。

第三のライブラリーのためには、上記ＴＮ８モチーフは一定に保ち、そして他の位置の
すべてが、テンプレートオリゴヌクレオチド中のＮＮＫ置換で変化するのを許容されてい
た。置換を広げるため、ＮＮＫ多様性がまた２つのフランキングアミノ酸位置で許容され
、従って、ディスプレイペプチドのＮ末端およびＣ末端に多様なアミノ酸位を加えている
。それ故、二次ライブラリーテンプレートは以下の配列のディスプレイペプチドをコード
していた：Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番
号２６１）、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸でありうる。共通配列には親配列が残ってい
る、前の２つのライブラリーと異なり、このライブラリーはすべての許容された位置で全
く異なっており、一定に保たれた残基中の親モチーフのみが似ていた。

各々のライブラリーから、総計で２×１０^１１ｐｆｕが前のように使用され、ただし溶
出戦略は変更された。結合されたファージの競合溶出は、特定の二次ライブラリーを作製
するために使用された親ペプチド（５０μＭ）を使用して実施した（即ち、各々の配列番
号２１、８８および４０のペプチド）。結合ファージは３工程で溶出した：（１）室温で
１時間の溶出、溶出されたファージは、増幅のため、細胞に感染させるのに使用されてい
る、（２）一夜溶出、ここで、新鮮な競合溶出ペプチドを結合されたファージへ加え、そ
して撹拌しながら４℃で一夜インキュベートした、溶出されたファージは次に、増幅のた
め、細胞に感染させるのに使用されている、および（３）残存するビーズ（溶出されなか
った結合ファージを有している）は、直接的に細胞に感染させるのに使用された。３ラウ
ンドの選択を実施した。ラウンド２および３からプラークを拾い、ＥＬＩＳＡで分析し、
そして配列決定した。ＫＤＲ陽性単離物は、５０μＭ遊離親ペプチドとの競合でさらにア
ッセイした。親ペプチドと最小競合を示したペプチドがより高い親和性結合剤と考え、合
成した。これらの配列は、ＴＮ８二次ライブラリーに対しては配列番号２２〜２３、ＴＮ
１２二次ライブラリーに対しては配列番号８９〜９５として、以下の表に掲げられている
。

^＊ＤＮＡ合成の間、低いパーセンテージの不完全カップリングが各々のサイクルでいつ
も存在する。これらの実験に使用されたライブラリーは、ヌクレオチドの代わりに、トリ
ヌクレオチド（コドン）をカップリングするＴＲＩＭ技術を使用して構築されたので、ラ
イブラリーテンプレートＤＮＡはしばしば低いパーセンテージの欠失されたコドンを有し
ている。例えば、ＴＮ１２ライブラリーの場合、全ライブラリーの約５．３％は、１２量
体どころか環状１１量体であり、そして本当にいくつかのファージ発現１１量体が、上記
選択過程で単離された（表１２参照）。

前記の表において、クラスＩペプチドはヘパリン不在下でのみＫＤＲを結合し、それ故
、たぶんＫＤＲのヘパリン結合ドメインを標的としている；クラスＩＩペプチドはヘパリ
ンまたはＶＥＧＦの存在下または不在下で結合し、それ故、たぶんＫＤＲ上の関係しない
部位で結合する；クラスＩＩＩペプチドは、ヘパリンには影響されないが、ＶＥＧＦの存
在下では乱される結合特性を示し、それ故、たぶんこれらはＶＥＧＦまたはＫＤＲのＶＥ
ＧＦ結合ドメインを結合する。溶出欄において、１ＨＲ、Ｏ／Ｎ、およびＣｅｌｌは各々
、１時間ＶＥＧＦ、一夜ＶＥＧＦ、およびビーズ感染溶出液を表している。ある場合には
、特定の単離物配列が２つの異なった溶出液で観察された。二次世代ライブラリーにより
同定された単離物では、ＶＥＧＦ溶出がペプチド溶出に置換されている（下記参照）。

ペプチド合成およびフルオレセイン標識
陽性ファージ単離物に相当する、選択されたＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合
ペプチドを、９−フルオレニルメトキシカルボニルプロトコールを使用する固相上で合成
し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。ペプチド質量はエレクトロスプレー質量分
光法により確認し、そしてペプチドは２８９ｎｍでの吸光度により定量した。合成のため
、ペプチドが切り出されたファージベクター配列からの２つのＮ末端および２つのＣ末端
アミノ酸、は保持され、そして各々のペプチドのＣ末端へ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ−ＮＨ_２リンカー（配列番号２６２）を付加した。各々のペプチドは、Ｎ末端をアセ
チル化した。選択されたリジン残基を有するペプチドに対しては、Ｃ末端リジンへの選択
的カップリングを可能にする、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ
−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）で保護し、ペプチド切断の間は除去
せず、カップリング後、２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液または０．５Ｍヒドロキシルアミン
の水溶液（ｐＨ８）で除去できる。

各々のペプチドは、フルオレセイン（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体）
またはフルオレセイン イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の２％ジイソプロピルエチルア
ミン（ＤＩＰＥＡ）含有ＤＭＦ溶液を使用して、Ｃ末端リジンをフルオレセインで標識し
た。もし、ペプチドがｉｖＤｄｅ保護リジンを含んでいたら、すべての遊離ＮＨＳ−フル
オレセインと反応し、そして内部保護基を除去する、２％ヒドラジンの添加により反応を
停止させた。すべての他のペプチドに対しては、等容量の０．５Ｍヒドロキシルアミン、
ｐＨ８、の添加により反応を停止させた。停止された反応液は、次にＤＭＦが１０％より
少なくなるまで水で希釈し、そしてＣ１８逆相クロマトグラフィーを使用して精製した。
ペプチドは、ＬＣ−ＭＳシステム（ライン内にＳＣＩＥＸ ＡＰ１５０単四重極質量分析
計を備えたＨＰ１１００ ＨＰＬＣ）で純度および正しい質量を確認した。

蛍光異方性測定およびＢｉａＣｏｒｅアッセイ
蛍光異方性測定は、３８４ウェルマイクロプレート中、１０μｌの結合緩衝液（ＰＢＳ
、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で、Ｔｅｃａｎ Ｐｏｌａｒｉｏｎ蛍光偏
光プレートリーダーを使用して実施した。ある場合には、ヘパリン（０．５μｇ／ｍｌ）
または１０％ヒト血清を結合緩衝液へ加えた（データは示されていない）。蛍光標識ペプ
チドの濃度は一定に保ち（２０ｎＭ）、そしてＫＤＲ−Ｆｃ（または類似の標的）の濃度
を変化させた。結合混合液は、測定前に３０℃で１０分間、マイクロプレート中で平衡化
した。観察された偏光の変化を、見掛けのＫ_Ｄを得るため、非線形回帰を経て下記の式に
当てはめた。この式（１）は、合成ペプチドおよびＫＤＲが１：１の化学量論で、溶液中
で可逆的複合体を形成することを仮定している。

式中、ｒ_ｏｂｓは観察された異方性であり、ｄ_ｆｒｅｅは遊離ペプチドの異方性であり、
ｒ_{ｂｏｕｎｄ}は結合されたペプチドの異方性であり、Ｋ_Ｄは見掛けの解離定数であり、Ｋ
ＤＲは全ＫＤＲ濃度であり、およびＰは全蛍光標識ペプチド濃度である。Ｋ_Ｄは直接結合
アッセイで計算し（Ｋ_Ｄ，Ｂ）（表８参照）、それ故、これらの値は蛍光標識ペプチドへ
のＫＤＲ結合を表している。

ＫＤのＢｉａＣｏｒｅ決定には、ＫＤＲ−Ｆｃ（または他のタンパク質標的）を標準ア
ミンカップリング法により、ＣＭ５センサーチップのデキストラン表面へ架橋した（０．
５ｍｇ／ｍｌ溶液を５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．０、で１：２０に希釈、ＲＬＫＤＲ−Ｆｃ
＝１２８５９）。実験はＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））中で実行した。吸光係
数により定量したペプチド溶液を、ＨＢＳ−Ｐで４００ｎＭに希釈した。２００、１００
、５０および２５ｎＭ溶液を生じるように一連の希釈を行った。会合のためには、ｋｉｎ
ｊｅｃｔプログラムを使用して、ペプチドを２０μｌ／分で１分間注入した。１分間の解
離に続いて、１ｍ ＮａＣｌを５０μｌ／分で２５秒間急速に注入して、残存するペプチ
ドを標的表面から除去した。すべての試料は２重に注入した。各々のペプチド系列の間で
の、緩衝液および非標的結合ペプチド注入が追加の対照として働いた。センサーグラムは
、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１の同時ｋ_ａ／ｋ_ｄフィッティングプロ
グラムを使用して分析した。この方法による見掛けのＫ_Ｄは、表８にＢｉａＫ_Ｄとして示
されている。上記蛍光異方性実験と異なり、非標識ペプチドがすべての試験で使用されて
おり、それ故、このアッセイを使用すると、これらの値は非標識ペプチドへのＫＤＲ結合
を表している。合成されたポリペプチドについて決定された結合親和性は、下記表８に示
されている。ポリペプチドの推定されるジスルフィド強要環状ペプチド部分は、下線が引
かれている。

ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体へ特異的に結合するペプチドの分析のため、各々のペプチドを
上記のような両方のアッセイ（蛍光異方性／ＢｉａＣｏｒｅ）で、複合体への結合を試験
した。異方性アッセイにおいて、ＫＤＲ−ＶＥＧＦ複合体は、２倍モル過剰のＶＥＧＦと
ＫＤＲ−Ｆｃを一緒に混合することにより形成させた。この混合物は次に、前に行ったよ
うに蛍光標識ペプチドを使用する直接結合滴定で使用した。対照として、各々のペプチド
はまたＫＤＲおよびＶＥＧＦ単独との結合を試験することにより、それらの複合体に対す
る特異性を試験した。どのペプチドも少しもＶＥＧＦと結合しなかったので、アッセイに
おける過剰のＶＥＧＦの存在は、Ｋ_Ｄ決定に影響を与えるはずがない。下記表９に示した
ように、ペプチドすべてが劇的な結合優先性を示した（ＶＥＧＦよりもＫＤＲ／ＶＥＧＦ
に対する結合）。しかしながら、それらのいくつかは、いくらかの遊離ＫＤＲへの残存性
結合を示した。異方性結果を確認するため、非標識ペプチドを前のようにＢｉａｃｏｒｅ
で試験した、ただし、ペプチドの注入に先立って、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体を形成させる
ためにチップをＶＥＧＦで飽和した。試験されたペプチドにおいて、ＢｉａＫ_Ｄは、異方
性測定の少なくとも２倍以内であった。

（実施例４〜１０のための方法）
以下の方法を実施例４〜１０で用いた。以下の共通の略語を使用する：９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ
）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−メチルピロリジノン（Ｎ
ＭＰ）、無水酢酸（Ａｃ_２Ｏ）、（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−
１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、試薬
Ｂ（ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：フェノール：トリイソプロピルシラン ８８：５：５：２）、ジイ
ソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ
）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウ
ロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨＳ）、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロ
ロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
および放射化学的純度（ＲＣＰ）。

ＡＣＴ ３５７ ＭＰＳおよびＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ合成機のための方法１
ペプチドは、Ｆｍｏｃペプチド合成プロトコール、特にカップリング剤としてＨＯＢｔ
／ＤＩＣおよび溶媒としてＮＭＰを用い、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ＡＣＴ
３５７またはＡＣＴ ４９６合成機を使用し、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ（Ｒｉｎｋアミ
ド）樹脂（０．２ミリモル／ｇ）上で合成した。Ｆｍｏｃは、Ｎｏｖａ−Ｓｙｎ ＴＧＲ
（Ｒｉｎｋアミド−ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ，サンディエゴ ＣＡ、から入手可能）樹脂
結合ペプチドを２５％ピペリジンのＤＭＦ溶液で２回（４分および１０分）処理すること
により除去した。すべてのアミノ酸をＮＭＰに溶解した（アミノ酸が純粋なＮＭＰに溶解
しない場合にはＤＭＦを添加した）。アミノ酸の濃度は０．２５Ｍであり、ＨＯＢｔおよ
びＤＩＣの濃度は各々０．５Ｍであった。
０．０４ミリモル規模の合成のためには：
典型的アミノ酸カップリングサイクル（洗浄工程を含まないで）では、ピペリジン溶液
（２．４ｍＬ）を各々のウェルに分配し、そして４分間混合し、次にすべてのウェルを空
にした。ＮＭＰ（３２０μＬ）、ＨＯＢｔ溶液（３２０μＬ、４当量）、アミノ酸（６４
０μＬ、４当量）およびＤＩＣ（３２０μＬ、４当量）溶液を各々のウェルに分配した。
カップリング時間は３時間であり；次に樹脂を洗浄した。各々のアミノ酸に対してサイク
ルを繰り返した。最後のアミノ酸カップリング後、樹脂結合ペプチドを、２５％ピペリジ
ンで処理してＦｍｏｃ保護基を除去した。洗浄後、樹脂結合ペプチドを、１．０Ｍ Ａｃ
_２Ｏ（ウェル当たり１．２ｍｌ）およびジイソプロピルエチルアミンのＤＭＦ溶液（任意
にさまざまな量のＨＯＢｔを混合物に含んで）で３０分キャップ（ｃａｐ）した。樹脂を
メタノールそして次にジクロロメタンで洗浄して乾燥させた。樹脂からのペプチドの切断
および側鎖の脱保護は、試薬Ｂを４．５時間使用して達成した。切断溶液を集め、そして
樹脂を追加の試薬Ｂで洗浄した。合併した溶液は濃縮して乾固した。回旋させながら、ま
たは撹拌しながらエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。エーテルをデカントし、固形
物を集めた。不純物を除去するため、この操作を２〜３回繰り返した。粗直鎖状ペプチド
をＤＭＳＯおよび水の混合物に溶解し、ＨＰＬＣで精製した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｘｔｅｒｒａ Ｃ１８，１９×５０ｍｍ；溶媒：０．１％ＴＦＡ含
有Ｈ_２Ｏおよび０．１％ＴＦＡ含有ＣＨ_３ＣＮ；ＵＶ ２２０μｍ；流速：５０〜６０ｍ
ｌ／分）。ペプチドを含んでいる溶液を凍結乾燥すると、所望のペプチドを白色でふわふ
わした凍結乾燥物として得た（純度＞９０％）。精製された直鎖状ジ−システイン含有ペ
プチドを水、水−アセトニトリル混合物、または水−ＤＭＳＯ混合物に、０．１ｍｇ／ｍ
ｌから２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。溶媒の選択は、粗ペプチドの溶媒への溶解度
に依存した。溶液のｐＨを、アンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液または炭酸水素アン
モニウム水溶液でｐＨ７．５〜８．５に調節した。混合物は空気中で２４〜４８時間激し
く撹拌した。非ＤＭＳＯ含有溶媒系の場合、溶液のｐＨをトリフルオロ酢酸水溶液でｐＨ
２へ調節した。混合物を凍結乾燥すると、粗環状ジスルフィド含有ペプチドを与えた。環
状ジスルフィドは次に、最少量のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を含んでいる１〜２
ｍｌ容量の水溶液（０．１％ＴＦＡ）に溶解した。Ｃ１８またはＣ８逆相セミ分取または
分取ＨＰＬＣカラムを使用し、得られた溶液を逆相カラムに加え、そして所望の化合物は
アセトニトリル−水の濃度勾配溶離により得られた。ＤＭＳＯ含有溶液の場合、ペプチド
が沈殿しない最少のＤＭＳＯ濃度まで希釈した。得られた混合物は、希トリフルオロ酢酸
で迅速にｐＨ２の酸性とし、そして逆相ＨＰＬＣシステムへ加え、説明したように精製し
た。所望の物質を含んでいる分画をプールし、そしてペプチドを凍結乾燥により単離した
。

ＡＣＴ ３５７ ＭＰＳおよびＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ合成機のための方法２
以下の変更を加え、方法１のようにペプチドを合成した。ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／ＤＩＥ
Ａをカップリング試薬として使用し、およびＮＭＰを溶媒として使用した。上記Ｎｏｖａ
−Ｓｙｎ ＴＧＲ樹脂から調製された、低負荷（〜０．２ミリモル／ｇ）Ｆｍｏｃ−ＧＧ
ＧＫ（Ｂｏｃ）−ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＲ−樹脂が０．０１ミリモル規模のペプチド合成
に用いられた。
０．０１ミリモル規模合成に対して：
Ｆｍｏｃ基を除去した後、標準カップリング法は、ＨＯＢｔ（７２０μｌ、６当量）、
アミノ酸（８０４μｌ、６．６当量）、ＨＢＴＵ（７２０μｌ、６当量）およびＤＩＥＡ
（７９８μｌ、１３．３当量）の溶液を使用した。混合物を１５分撹拌し、空にし、そし
て樹脂を洗浄した。すべてのカップリング後、そして上記のようなすべての切断および精
製後、所望の直鎖状ペプチドを含んでいる溶液を凍結乾燥すると、ペプチド（純度＞９０
％）を白色でふわふわした固形物として得た。粗エーテル沈殿直鎖状ジ−システイン含有
ペプチドは、水、水性アセトニトリル混合液（０．１％ＴＦＡ）、または水性ＤＭＳＯに
溶解し、アンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液または炭酸水素アンモニウム水溶液の添
加による溶液ｐＨのｐＨ７．５〜８．５への調整により環化した。ペプチド濃度は０．１
から２．０ｍｇ／ｍｌであった。混合物を空気中で２４〜４８時間撹拌し、トリフルオロ
酢酸水溶液でｐＨ２の酸性とし、そして次にアセトニトリル−水の濃度勾配を用いる分取
逆相ＨＰＬＣにより精製した。所望の物質を含んでいる分画をプールし、そしてペプチド
を凍結乾燥により単離した。

ＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ合成機のための方法３
ペプチドは、方法１に記載したように、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ＡＣＴ
４９６ ＭＯＳ合成機を使用して合成した。ペプチド合成のために、低負荷（〜０．２
ミリモル／ｇ）Ｆｍｏｃ−ＧＧＧＫ（Ｂｏｃ）−ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＲ−樹脂を用いた
。カップリング溶媒はＮＭＰ／ＤＭＳＯ ８：２であった。合成は０．０２ミリモル規模
で実行し、３時間のカップリング時間を使用した。粗直鎖状ペプチドは方法１で記載した
ようにさらに処理した。

ＡＣＴ ４９６ ＭＯＳ合成機のための方法４
ペプチドは、カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、および溶媒としてＮＭＰを
用いるＡＣＴ ４９６により、方法３を使用して合成した。１Ｍ溶液としての２，４，６
−コリジンを塩基として使用した。ペプチド合成のために、低負荷Ｆｍｏｃ−ＧＧＧＫ（
Ｂｏｃ）−ＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＲ−樹脂（〜０．２ミリモル／ｇ）を用いた。カップリ
ング時間は３０分であった。粗直鎖状ペプチドは方法１で記載したようにさらに処理した
。

ＡＢＩ ４３３Ａ合成機のための方法５
ペプチドの合成を、０．２５ミリモル規模で、ＦａｓｔＭｏｃプロトコール（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ）を使用して実施した。このプロトコールの各々
のサイクルにおいて、カートリッジ中の１ミリモルの乾燥保護アミノ酸は０．９ミリモル
のＨＢＴＵ、２ミリモルのＤＩＥＡ、および０．９ミリモルのＨＯＢｔのＤＭＦ溶液に溶
解し、追加のＮＭＰを加えた。ペプチドは０．１ミリモルのＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ（Ｒ
ｉｎｋアミド）樹脂（樹脂置換０．２ミリモル／ｇ）を使用して作製した。このプロトコ
ールにおけるカップリング時間は２１分であった。Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％ピペリジン
ＮＭＰ溶液で実施した。最後のサイクルの終わりに、合成されたペプチドを、無水酢酸／
ＤＩＥＡ／ＨＯＢｔ／ＮＭＰを使用してアセチル化した。ペプチド樹脂を洗浄し、さらな
る操作または樹脂からの切断（試薬Ｂを使用する）のために乾燥した。一般に、切断され
たペプチドは、精製前に方法１のように環化した。

方法６：樹脂結合ペプチドのビオチニル化
ペプチドは方法５を使用して調製した。Ｃ末端リジン上のｉｖＤｄｅ保護基は、１０％
ヒドラジンのＤＭＦ溶液による処理により選択的に除去した。樹脂は次に、ＤＩＥＡ存在
下、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルのＤＭＦ溶液で処理した。洗浄
後、樹脂を乾燥し、そして試薬Ｂを使用して切断を実施した。樹脂を濾過して除き、濾液
を濃縮乾固した。ビオチニル化ペプチドをニートＤＭＳＯに溶解し、ＤＩＥＡで処理し、
そしてジスルフィド環化を達成するために４〜６時間撹拌した。粗混合物は分取ＨＰＬＣ
により精製した。

典型的な実験においては、２００ｍｇの樹脂結合ペプチドを１０％ヒドラジンのＤＭＦ
溶液で処理し（２×２０ｍＬ）、そしてＤＭＦ（２×２０ｍＬ）、次にジクロロメタン（
１×２０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍＬ）に再懸濁し、そしてビオチン−Ｎ
ＨＳエステル溶液（０．２ミリモル、５当量）およびＤＩＥＡ（０．２ミリモル）で処理
し、次に、樹脂を試薬と４時間混合した。反応の完了はニンヒドリン試験により検査した
。ペプチドは次に、試薬Ｂ（１０ｍＬ）による４時間の処理により樹脂から放出させた。
樹脂を濾過して除き、試薬Ｂを真空下で除去し、そして無水エーテルの添加によりペプチ
ドを沈殿させた。形成された固形物を集め、エーテルで洗浄して乾燥した。固形物は無水
ＤＭＳＯに溶解し、混合物をＤＩＥＡでｐＨ７．５に調整し、ジスルフィド環化を達成す
るために４〜６時間撹拌した。ジスルフィド環化反応は、分析用ＨＰＬＣでモニターした
。環化完了後、混合物溶液を２５％アセトニトリル含有水溶液で希釈し、そして、アセト
ニトリル−水（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）の濃度勾配を使用し、逆相Ｃ１８
カラムでのＨＰＬＣにより直接精製した。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な生成物
を含んでいる分画を集め、凍結乾燥すると必要なビオチニル化ペプチドを得た。

方法７：精製ペプチドのビオチニル化
遊離アミノ基を含んでいる精製ペプチド（１０ｍｇ、方法１〜５により製造）を無水Ｄ
ＭＦまたはＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解し、ビオチン−ＮＨＳエステル（５当量）およびＤ
ＩＥＡ（５当量）を加えた。反応をＨＰＬＣでモニターし、反応完了後（１〜２時間）、
粗反応混合物を分取用ＨＰＬＣで直接精製した。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な
生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥すると必要なビオチニル化ペプチドを得た。

方法８：リンカーを含んでいる樹脂結合ペプチドのビオチニル化
典型的な実験において、４００ｍｇの樹脂含有ペプチド（ＡＢＩ ４３３Ａ合成機を使
用して作製、ｉｖＤｄｅ−保護リジンを有する）を１０％ヒドラジンＤＭＦ溶液（２×２
０ｍｌ）で処理した。樹脂をＤＭＦ（２×２０ｍｌ）およびＤＣＭ（１×２０ｍｌ）で洗
浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ）に再懸濁し、Ｆｍｏｃ−アミノジオキサオクタン酸（
０．４ミリモル）、ＨＯＢｔ（０．４ミリモル）、ＤＩＣ（０．４ミリモル）、ＤＩＥＡ
（０．８ミリモル）で、４時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０
ｍｌ）およびＤＣＭ（１×１０ｍｌ）で洗浄した。樹脂は次に、２０％ピペリジン含有Ｄ
ＭＦ（２×１５ｍｌ）で各々、１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−ジアミノジ
オキサオクタン酸とカップリングさせ、Ｆｍｏｃ保護基の除去をもう一度繰り返した。遊
離アミノ基を含んでいる、得られた樹脂は、ビオチン−ＮＨＳエステル（０．４ミリモル
、５当量）およびＤＩＥＡ（０．４ミリモル、５当量）のＤＭＦ溶液中、２時間処理した
。ペプチド−樹脂は、前に記載したように洗浄し、そして乾燥した後、試薬Ｂ（２０ｍｌ
）で４時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと撹拌する
と固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。固形物を無水ＤＭＳ
Ｏに溶解し、ＤＩＥＡでｐＨを７．５に調整した。混合物を４〜６時間撹拌してジスルフ
ィド環化を達成し、それは分析用ＨＰＬＣでモニターした。環化完了後、ＤＭＳＯ溶液を
２５％アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相Ｃ１８カラムへ直接応用した。精製はア
セトニトリル−水（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）の濃度勾配を使用して達成し
た。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥す
ると必要なビオチニル化ペプチドを得た。

方法９：５−カルボキシフルオレセイン標識ペプチドの形成
リジンのイプシロン窒素上にｉｖＤｄｅ保護基を含んでいる、方法５により得られたペ
プチド−樹脂を、ｉｖＤｄｅ基を除去するために、ヒドラジンのＤＭＦ溶液と混合した（
１０％ヒドラジン／ＤＭＦ、２×１０ｍｌ、１０分）。リジンのイプシロン窒素は、フル
オレセイン−５−イソチオシアネート（０．１２ミリモル）およびジイソプロピルエチル
アミン（０．１２ミリモル）のＤＭＦ溶液で標識した。混合物は１２時間、激しく撹拌し
た（フルオレセイン含有化合物は光から保護した）。樹脂は次にＤＭＦ（（３×１ｍＬ）
および２回、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）で洗浄し、窒素下で１時間乾燥した。試薬Ｂを４
時間使用して、ペプチドを樹脂から切断し、溶液を濾過して集めた。揮発分を減圧下で除
去し、残渣を真空下で乾燥した。ペプチドをエーテルで沈殿させ、集め、そして沈殿を窒
素気流下で乾燥した。沈殿を水に加え（１ｍｇ／ｍｌ）、混合物のｐＨを、１０％メグル
ミン水溶液で８に調整した。ペプチドの環化を４８時間実施し、溶液を凍結乾燥した。粗
環状ペプチドを水に溶解し、水からアセトリトリル（両方の相とも０．１％ＴＦＡを含む
）への直線濃度勾配を用いた、Ｃ１８カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。純粋な
生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥した。ペプチドはＥＳ−ＭＳで確認し、および
純度はＲＰ−ＨＰＬＣ（水からアセトリトリルへの直線濃度勾配／０．１％ＴＦＡ）によ
り決定した。

方法１０：単一アミノ酸のカップリングによる、Ｔｃへの結合のためのペプチド性キレ
ートの製造
ペプチドは０．１ミリモルのＮｏｖａＳｙｎ−ＴＧＲ樹脂（０．２ミリモル／ｇ 置換
）から出発して合成した。脱保護（ｉｖＤｄｅ）樹脂は次にＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆ
ｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨの取り込みの
ためのプロトコールＡに従って処理した。
単一アミノ酸のマニュアルカップリングのためのプロトコールＡ：
１． ４当量の相当するＦｍｏｃアミノ酸および４．１当量のＨＯＢｔおよび４．１当量
のＤＩＣで５時間処理
２． ＤＭＦで洗浄（３×１０ｍｌ）
３． ２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理（２×１０ｍＬ、１０分）
４． ＤＭＦで洗浄（３×１０ｍＬ）
Ｆｍｏｃ保護ペプチド添加樹脂は次に、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（２×１０ｍＬ、
１０分）で処理し、ＤＭＦで洗浄した（３×１０ｍＬ）。Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（０
．１１ミリモル）、ＨＡＴＵ（１ミリモル）およびＤＩＥＡ（０．１１ミリモル）のＤＭ
Ｆ溶液（１０ｍＬ）をＦｍｏｃ保護ペプチド添加樹脂に加え、マニュアルカップリングを
５時間続けた。反応後、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１０ｍ
Ｌ）で洗浄し、真空下で乾燥した。

方法１１：Ｓ−アセチルチオグリコール酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
使用するメルカプトアセチル化ペプチドの形成
Ｓ−アセチルチオグリコール酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）
（０．００５５ミリモル）をペプチド（０．００５ミリモル、遊離アミンを有し、方法１
〜５で得られた）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）へ加え、反応混合物は室温で６時間撹拌
した。真空下で揮発分を除去し、残渣は０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル−水を使用す
る分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥すると
メルカプトアセチル化ペプチドを得た。メルカプトアセチル化ペプチドはＥＳＩ−ＭＳで
確認し、および純度は水からアセトリトリル（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）へ
の直線濃度勾配を用いる逆相ＨＰＬＣ分析により決定した。

方法１２：Ｓ−アセチルチオグリコール酸を使用するメルカプトアセチル化ペプチドの
形成
ジスルフィド環化後、方法５からの精製ペプチドを、ＮＭＰ中で、Ｓ−アセチルチオグ
リコール酸（１．５〜１０当量）／ＨＯＢｔ（１．５〜１０当量）／ＤＩＣ（１．５〜１
０当量）と、室温で２〜１６時間結合させた。混合物は次に、分取ＨＰＬＣにより精製し
た；純粋なペプチドを含んでいる分画を合併し、凍結乾燥した。ｉｖＤｄｅ基により保護
された別のリジンを有する化合物の場合、脱保護反応は、２％ヒドラジンＤＭＳＯ溶液と
の、室温で３時間の反応を用いた。反応混合物の精製により純粋なペプチドを得た。

Ｓ−アセチルチオグリコール酸が２つのアミノジオキサオクタン酸基およびペプチドへ
結合した化合物を製造する場合、方法５からの精製ペプチド（遊離アミノ基を有する）は
、ＮＭＰ中で、ＡｃＳＣＨ_２ＣＯ−（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−
ＣＨ_２−ＣＯ）_２−ＯＨ（３０当量）／ＨＯＢｔ（３０当量）／ＤＩＣ（３０当量）と、
室温で４０時間結合させた。混合物を精製し、そしてｉｖＤｄｅ基を除去した。第二の精
製後、最終生成物を白色凍結乾燥物として得た。

もしくは、Ｆｍｏｃアミノジオキサオクタン酸を２度連続してペプチド（方法５により
製造）へ結合させ、続いてＦｍｏｃ除去およびＳ−アセチルチオグリコール酸へのカップ
リングを行った。

方法１３：ホモおよびヘテロ二量体の製造
必要とされる精製ペプチドは、方法５を使用してＳＰＰＳにより製造した。ホモ二量体
を製造するには、二量体の製造に必要とされるペプチドの半分をＤＭＦに溶解し、１０当
量のグルタール酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで処理した。反応の進行
はＨＰＬＣ分析および質量分析法によりモニターした。反応完了時、揮発分を真空下で除
去し、未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去するため、残渣を酢酸エチルで洗浄した。残
渣を乾燥し、無水ＤＭＦに再溶解して、２当量のＤＩＥＡ存在下、ペプチドの残りの半分
で処理した。反応を２４時間進行させた。この混合物は直接、Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｓ Ｃ−１８ ＸＴｅｒｒａ逆相ＨＰＬＣカラムへ応用し、水からアセトリトリ
ル（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）への直線濃度勾配での溶出により精製した。

ヘテロ二量体の場合、単量体の一つをグルタール酸のビスＮＨＳエステルと反応させ、
過剰のビスＮＨＳエステルを洗い流した後、ＤＩＥＡ存在下、第二のペプチドを加えた。
反応後、混合物は分取ＨＰＬＣにより精製した。

ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポリペプチドの製造
上に示した方法を利用し、表１０に示したＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ポ
リペプチドのビオチニル化体を製造した。ペプチド配列中の文字「Ｊ」はスペーサーまた
はリンカー基、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル、を指示している。

ＫＤＲへ結合するビオチニル化ポリペプチド（ＪＪスペーサーを有する）の能力は、実
施例５に示したアッセイを使用して評価した。数個のビオチニル化ペプチドは、ＫＤＲ発
現細胞へよく結合した：配列番号３５６（Ｋ_Ｄ １．８１ｎＭ±０．２７）、配列番号２
６４（Ｋ_Ｄ １４．８７±５．０ｎＭ、４回の実験の平均）、配列番号２９４＋スペーサ
ー（Ｋ_Ｄ １０．００±２．３６ｎＭ、４回の実験の平均）、配列番号３０１（Ｋ_Ｄ ４
．０３±０．８６ｎＭ、３回の実験の平均）、配列番号３３７（Ｋ_Ｄ ６．９４±１．９
４ｎＭ、１回の実験）、および配列番号３３８（Ｋ_Ｄ ３．０２±０．７５ｎＭ、１回の
実験）。

ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＫＤＲ結合ペプチド／アビジンＨＲＰ複合体
の結合
ファージディスプレイにより同定されたペプチドの、一過性にトランスフェクトされた
２９３Ｈ細胞で発現されたＫＤＲへの結合を決定するため、トランスフェクトされた細胞
表面上のＫＤＲへの、ニュートラアビジンＨＲＰと複合体形成したビオチニル化ペプチド
の結合を測定する、新規アッセイを開発した。このアッセイは、実施例４で示したビオチ
ニル化ペプチドをスクリーニングするために使用した。ニュートラアビジンＨＲＰは、レ
クチン結合炭化水素部分が存在しないため、およびまた、ニュートラアビジン中に細胞接
着レセプター−結合ＲＹＤドメインが存在しないため、ビオチン以外の分子への非特異的
結合がより低いので、ストレプトアビジンまたはアビジンの代わりに使用した。

本明細書に記載した実験において、ＫＤＲ結合ペプチド配列番号２９４、配列番号２６
４、配列番号２７７および配列番号３５６、およびＫＤＲへ結合しない対照ペプチドの四
量複合体を合成し、ＫＤＲで一過性にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞へ結合するそ
れらの能力を試験した。ＫＤＲ結合ペプチドの四量複合体４つすべてがビオチニル化され
ており、ＪＪスペーサーを含んでおり、ＫＤＲ発現細胞へ結合した；しかしながら、配列
番号３５６が最もよいＫ_Ｄ（１．８１ｎＭ）を示した。ＫＤＲ結合ペプチド配列番号２９
４、配列番号２６４の四量複合体は、同じペプチドの単量体よりも改良された結合を示し
た。さらに、ＫＤＲ結合ペプチドとビオチン間のスペーサーの包含は、実験Ｂにおいて改
良された結合が示された。

実験Ｃにおいて、このアッセイは、ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体への本発明の
ペプチドの結合における血清の影響を評価するために、使用することができることが示さ
れた。配列番号２６４、配列番号２９４および配列番号３５６の結合は、血清存在下でも
有意に影響されなかったが、一方、配列番号２７７の結合は、血清存在下で５０％より多
く減少した。

実験Ｄにおいて、１つより多いＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドを含
む多量体標的指向化構築物における使用のため、異なった組合わせのＫＤＲおよびＶＥＧ
Ｆ／ＫＤＲ複合体結合ペプチドを評価する際に、このアッセイが有用であることが示され
ている。さらに、実験ＤおよびＥは、異なったエピトープへ結合する、２つまたはそれよ
り多くのＫＤＲ結合ペプチドを含んでいる四量体構築物は、標的指向化ペプチド単独の「
純粋な」四量体構築物より優れた結合を示したことを確認した。

実験Ａ
ｍ−ＲＮＡ＆５’ＲＡＣＥの準備ができたｃＤＮＡライブラリーの調製
ＨＵＶＥＣ細胞を、１７５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ， Ｂｉｏｃｏａｔ，カタログ番号６４７８）中でほとんど８０％コンフルエントまで
増殖し、ＫＤＲの発現を誘導するため、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
カタログ番号ＰＦ００３）を２４時間加えた。ｍＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのマ
イクロ−ファーストトラック２．０キット（カタログ番号Ｋ１５２０−０２）を使用して
単離した。キット使用説明書に従って、２つのフラスコ（約３０００万細胞）から１２μ
ｇのｍＲＮＡ（２６０ｎｍの吸光度で測定）を得た。ｃＤＮＡを発生させるための逆転写
を、モロニーマウス白血病ウイルス（ＮＭＬＶ）逆転写酵素を使用し、２μｇのｍＲＮＡ
、オリゴｄＴプライマー（５’（Ｔ）_２５ＧＣ−３’）および／またはスマートＩＩオリ
ゴ（５’ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧ−３’）で実
施した。反応は、２０μｌの総容量で実施し、反応混合物は２μｌのＲＮＡ、１μｌのオ
リゴｄＴプライマー、４μｌの５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．３
、３７５ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、１μｌのＤＴＴ（２０ｍＭ、逆転写酵
素とともにも供給される）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの各々をｄｄＨ_２Ｏに、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号
２００４１５）、９μｌのｄｄＨ_２Ｏおよび１μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｅｔ
ｅｃｈ，カタログ番号８４６０−１）を含んでいた。逆転写反応は、４２℃で９０分実施
し、２５０μｌのトリシン−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリシン、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ
）の添加により反応を停止させた。逆転写生成物、５’ＲＡＣＥの準備ができたｃＤＮＡ
ライブラリー、は−２０℃で３ヶ月保存することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡ処理に使
用したすべての水は、ＵＳＢ（カタログ番号７０７８３）からのＤＮＡａｓｅおよびＲＮ
Ａａｓｅを含まない水であったことに注意されたい。

ＴＯＰＯＩＩベクター内へのｓ−ＫＤＲのクローニング
ｓ−ＫＤＲをクローン化するため、５’オリゴ（Ｇ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ Ｇ）（配列番号３５８）および３’オリゴ（Ｃ ＣＡＡ Ｇ
ＴＴ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＣ Ａ）（配列番号３５９）を使用した。
これらは、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号６００１３５）に
よるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する、５’ＲＡＣＥの準備ができたｃＤＮＡ
ライブラリー（上記）からＫＤＲ完全細胞外ドメイン（〜２．２ｋｂｐ）を増幅するため
に設計した。ＰＣＲ反応は５０μｌの総容量であり、反応混合物は、２μｌの５’ＲＡＣ
Ｅの準備ができたｃＤＮＡライブラリー、１μｌの５’オリゴ（１０μＭ）、１μｌの３
’オリゴ（１０μＭ）、ｐｆｕ酵素に加えて１％ＤＭＳＯおよび８％グリセロールを補給
した５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、１μｌのｄＮ
ＴＰ混合物（１０ｍＭ）および４０μｌのｄｄＨ_２Ｏを含んでいた。ＰＣＲ反応は９４℃
で１分、６８℃で１分および７２℃で４分の４０サイクルにセットされたプログラムを使
用することにより実行した。ＰＣＲ生成物は、１容量のフェノールでの抽出、続いての１
容量のクロロホルムでの抽出、そして３容量のエタノールおよび１／１０容量の３Ｍ酢酸
ナトリウムでの沈殿により精製した。ＰＣＲ生成物は１７μｌのｄｄＨ_２Ｏに再懸濁し、
生成物の各々の末端にＡオーバーハングを発生させるため、２μｌの１０×Ｔａｑポリメ
ラーゼ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、０．０１％ゼラチン）および１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，カタログ番号６００１３１）を加えた。７２℃で１時間インキュベート後、修
飾された生成物を、製造業者のプロトコールに従って、ＴＯＰＯＩＩベクター（ＩｎＶｉ
ｔｒｏｇｅｎ，カールスバット，ＣＡ）内へ直接クローン化すると、ＴＯＰＯ−ｓＫＤＲ
を得た。Ｔａｑ（ＰＣＲ酵素）処理ＰＣＲ生成物のＡ−オーバーハングのため、ＴＯＰＯ
ベクターはＰＣＲ生成物の容易なクローニングを可能にしている。

ＴＯＰＯＩＩベクター内へのＫＤＲの膜貫通および細胞質ドメインのクローニング
ＫＤＲの膜貫通および細胞質ドメインをクローン化するため、５’オリゴ（ＴＣＣ Ｃ
ＣＣ ＧＧＧ ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＣＧ ＧＣＧ Ｇ
ＴＧ）（配列番号３６０）および３’オリゴ（Ｃ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＣＴ Ｃ
ＡＧ ＴＧＴ ＧＧＴ Ｃ）（配列番号３６１）を使用した。これらは、ｐｆｕポリメラ
ーゼによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する、５’ＲＡＣＥの準備ができたｃ
ＤＮＡライブラリー（上記）からＫＤＲの完全膜貫通および細胞質ドメイン（〜１．８ｋ
ｂｐ）を増幅するために設計した。ＰＣＲ反応条件およびプログラムは上記ｓ−ＫＤＲで
記載したものと全く同一であった。ｓ−ＫＤＲ配列と全く同じように、ＰＣＲ生成物はフ
ェノールクロロホルム抽出を使用して精製し、Ｔａｑポリメラーゼで処理し、そしてＩｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＯＰＯＩＩベクター内へクローン化すると、ＴＯＰＯ−ＣＹＴ
Ｏを得た。

ｐｃＤＮＡ６ベクター内への完全長ＫＤＲのクローニング
完全長レセプターを作製するため、細胞外および細胞質ドメイン（膜貫通ドメインを含
んで）を別々に、各々のＴＯＰＯ−ｓＫＤＲおよびＴＯＰＯ−ＣＹＴＯから、ＰＣＲによ
り増幅し、後でライゲートして完全長レセプターを作製した。細胞外ドメインの５’末端
にＮｏｔＩ部位を有するオリゴ（Ａ ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＧ
ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ Ｇ）（配列番号３６２）
および細胞外ドメインの３’末端に相補的なオリゴ（ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＧＴ
ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＣＣ）（配列番号３６３）を、ＴＯＰＯ−ｓＫＤＲ
からの細胞外ドメインのＰＣＲによる増幅に使用した。同様に、５’オリゴ（ＡＴＣ Ａ
ＴＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＣＧ ＧＣＧ ＧＴＧ）（配列番号３６４）
および、ＮｏｔＩ部位を有する３’オリゴ（Ａ ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧ
Ｃ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＧＴ ＧＧＴ Ｃ）（配列番
号３６５）を、ＴＯＰＯ−ＣＹＴＯからの細胞質ドメイン（膜貫通ドメインを有する）の
ＰＣＲによる増幅に使用した。両方のＰＣＲ生成物をＮｏｔＩで消化し、一緒にライゲー
トして完全長レセプターを作製した。完全長レセプターをコードするｃＤＮＡをアガロー
スゲルで精製し、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−ＨｉｓＣベクターのＮｏｔＩ部位へライゲートし
た。ＤＮＡの精製およびライゲーションは、前にｐｓＫＤＲのために記載したように行っ
た。ライゲーション反応液はＤＨ５α細菌培養物を形質転換するために使用し、そして多
数の個々のクローンは、各々のクローンから精製されたプラスミドのＥｃｏＲＩ酵素によ
る制限分析により、挿入物の存在および配向を分析した。

細胞培養
２９３Ｈ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１６３１）から得られ、推薦さ
れている培地に１ｍｌ／Ｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，
カタログ番号１５１４０−１４８）を加えて、単層培養として増殖させた。すべての細胞
は、毎日の培養では抗生物質存在下で増殖させたが、トランスフェクション前の１６〜２
０時間は、抗生物質を含まない培地に分割した。

トランスフェクションのためのＤＮＡ調製
グリセリン保存物からの、ｐｆ−ＫＤＲを含んでいる大腸菌ＤＨ５αを、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＬＢ（ＬＢ寒天はＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから、カタログ番
号７５８５１およびアンピシリンはＳｉｇｍａから、カタログ番号Ａ２８０４）プレート
に画線し、一夜増殖させるためプレートを３７℃のインキュベーター中に放置した。次の
朝、単一コロニーをプレートから突き取り、３ｍｌのＬＢ／アンピシリン培地（ＵＳ ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからのＬＢ、カタログ番号ＵＳ７５８５２）中、３７℃で増殖させ
た。８時間後、３ｍｌチューブから１００μｌの細菌培地を、２５０ｍｌのＬＢ／アンピ
シリン培地へ移し、３７℃で一夜インキュベートした。細菌を、５００ｍｌボトル（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ，カタログ番号３５５６０５）中、２２０ｒｐｍの円を描く撹拌により、Ｌａ
ｂ−Ｌｉｎｅインキュベーター振盪機で増殖させた。次の日、細菌培養物をｍａｘｉ−ｐ
ｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，カタログ番号１２１６３）を使用して処理した。一般に、
２５０ｍｌの細菌培養物から、約１ｍｇのプラスミドＤＮＡ（２６０ｎｍでの吸光度によ
り定量した）が得られた。

９６ウェル中での２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
トランスフェクションは、ポリ−Ｄ−リジン被覆９６ウェルプレートを使用して、リポ
フェクタミン２０００プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１１６６８−
０１９）で推薦されているように行った。３２０ｎｇのＫＤＲ ＤＮＡ（ｐｃ−ＤＮＡ６
−ｆＫＤＲ）／ウェル、０．１ｍｌ中、を９６ウェルトランスフェクションに使用した。
トランスフェクションは血清含有培地中で行い、トランスフェクション試薬混合物を６〜
８時間後に細胞から除去し、通常の血清含有培地に取り替えた。トランスフェクションは
、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号３５
４６４０）で行った。プレートの左半分をＭｏｃｋトランスフェクトし（ＤＮＡなしで）
、プレートの右半分をＫＤＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェ
クション時には８０〜９０％コンフルエントであり、アッセイする時間である次の日には
完全にコンフルエントであり、さもなければ、アッセイを中止した。

Ｍ１９９培地の調製
アッセイのためのＭ１９９培地を調製するため、１つのＭ１９９培地小包（ＧＩＢＣＯ
，カタログ番号３１１００−０３５）、２０ｍｌの１ｍＭＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ，カタ
ログ番号１５６３０−０８０）および２ｍｇのＤＩＦＣＯゼラチン（ＤＩＦＣＯ，カタロ
グ番号０１４３−１５−１）を９５０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに加え、約４ｍｌの１Ｎ ＮａＯ
Ｈを加えることにより溶液のｐＨを７．４に調整した。ｐＨ調整後、ゼラチンを溶解させ
るため、Ｍ１９９培地を水浴中、３７℃で２時間暖め、次に０．２μｍフィルター（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ，カタログ番号４３１０９）を使用して濾過滅菌し、後でアッセイに使用する
ように４℃で保存した。

ＳｏｆｔＬｉｎｋソフトリリース（ｓｏｆｔ ｒｅｌｅａｓｅ）アビジン−セファロー
スの調製
ＳｏｆｔＬｉｎｋソフトリリースアビジン−セファロースは、Ｐｒｏｍｅｇａ（カタロ
グ番号Ｖ２０１１）から得られたセファロースを、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離
し、氷冷水で２回洗浄し（洗浄の中間には遠心分離を行う）、ペレットを冷水に再懸濁し
てｄｄＨ_２Ｏ中での５０％スラリーを作製することにより調製した。新鮮なアビジンの５
０％スラリーを、各々の実験のたびに調製した。

ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ溶液の調製
ビオチニル化ペプチド配列番号２９４、２６４、２７７、３５６および非結合ビオチニ
ル化対照ペプチドを、２５０μＭの５０％ＤＭＳＯ保存溶液を調製するために使用し、お
よびニュートラアビジン−ＨＲＰの３３μＭ保存溶液は、２ｍｇのニュートラアビジン−
ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号３１００１）を１ｍＬのｄｄＨ_２Ｏに溶解すること
により調製した（すべてのポリペプチドはＪＪスペーサーを含んでいた）。ペプチド保存
溶液は−２０℃で保存し、一方、ニュートラアビジン−ＨＲＰ保存溶液は−８０℃で保存
した。ペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体を調製するため、１０μｌの２５０
μＭビオチニル化ペプチド保存溶液および１０μｌの３３μＭニュートラアビジン−ＨＲ
Ｐを１ｍｌのＭ１９９培地に加えた。この混合物は４℃にて６０分、回転板上でインキュ
ベートし、続いて、過剰のペプチドを除去するために５０μｌのソフトリリースアビジン
−セファロース（ｄｄＨ_２Ｏ中での５０％スラリー）を加え、さらに４℃にて３０分、回
転板上でインキュベートした。最後に、１２，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離す
ることにより、ソフトリリースアビジン−セファロースをペレット化し、得られた上清を
アッセイに使用した。新鮮なペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体を、各々の実
験のたびに調製した。

アッセイのためのペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ希釈液の調製
飽和結合実験のため、１２０μｌ、６０μｌ、２０μｌ、１０μｌ、８μｌ、６μｌ、
４μｌ、および１μｌのペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体を１．２ｍｌのＭ
１９９培地に加えて、各々３３．３３ｎＭ、１６．６５ｎＭ、５．５５ｎＭ、２．７８ｎ
Ｍ、１．６７ｎＭ、１．１１ｎＭおよび０．２８ｎＭ複合体の最終濃度を有する希釈液を
作製した。

トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞のためのブロッキング溶液の調製
ブロッキング溶液は、２０ｍｌのＭ１９９培地を１０ｍｇの凍結乾燥非標識ニュートラ
アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号３１０００）に加えることにより調製した。新鮮
なブロッキング溶液を、各々の実験のたびに調製した。

ペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰの結合を検出するためのアッセイ
トランスフェクション２４時間後、２９３Ｈ細胞の各々のウェルを１回１００μｌのＭ
１９９培地で洗浄し、８０μｌのブロッキング溶液と３７℃でインキュベートした。１時
間後、細胞を１００μｌのＭ１９９培地で２回洗浄し、７０μｌの対照ペプチド、配列番
号２９４、配列番号２６４、配列番号２７７および配列番号３５６のペプチド／ニュート
ラアビジン−ＨＲＰ希釈液と、室温で２．５時間インキュベートした。各々の希釈液は、
偽ならびにＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞（各々の飽和結合実験に２つのプレート
を使用した）を含む３つの別々のウェルへ加えた。室温でインキュベーション後、さらに
半時間のインキュベーションのため、プレートを４℃へ移した。続いて、細胞を氷冷Ｍ１
９９培地で５回、氷冷ＰＢＳで１回洗浄した（この順序で）。最終洗浄後、１００μｌの
氷冷ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ，カタログ番号５０−７６−００）を各々のウェルへ加え、各々
のプレートを、空気インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。最後に、ＨＲＰ
酵素反応を、５０μｌの１Ｎリン酸を各々のウェルへ加えることにより停止させ、マイク
ロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ モデル３５５０）を使用して４５０ｎｍでの吸光度
を測定することにより、結合を定量した。

ＫＤＲ−トランスフェクト細胞へのペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰの結合
このアッセイにおいて、対照ペプチド、配列番号２９４、配列番号２６４、配列番号２
７７および配列番号３５６ペプチド（各々がビオチニル化され、ＪＪスペーサーを有し、
およびニュートラアビジン−ＨＲＰとコンジュゲートされている）は上記のように調製し
、ＫＤＲで一過性にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞へ結合するそれらの能力を試験
した。ペプチド／ニュートラアビジン複合体調製の間、ニュートラアビジンの４つのビオ
チン結合部位すべてが占有されることを確実にするため、ニュートラアビジン−ＨＲＰに
対して７．５倍過剰のビオチニル化ペプチドを使用した。複合体形成後、遊離ビオチニル
化ペプチドとニュートラアビジン−ＨＲＰ−複合体形成ビオチニル化ペプチド間のどんな
競合も避けるため、過剰の遊離ビオチニル化ペプチドはソフトリリースアビジン−セファ
ロースを使用して除去した。配列番号２６４および配列番号２９４の飽和結合曲線（図１
Ａ）を作成するため０．２８ｎＭから３３．３３ｎＭ、配列番号２７７および配列番号３
５６の飽和結合曲線（図１Ｂ）を作成するため０．２８ｎＭから５．５５ｎＭ、のいくつ
かの異なったペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ濃度で実験を実施した。飽和結合曲
線を描くため、試験された各々の濃度での、各々の異なったペプチド／ニュートラアビジ
ン−ＨＲＰ複合体のＫＤＲトランスフェクト細胞への結合から、Ｍｏｃｋトランスフェク
ト細胞へのバックグラウンド結合を差し引いた。それ故、図１（下記）Ｙ軸の吸光度は、
差吸光度（ＫＤＲから偽を差し引いた）であり、絶対吸光度ではない。Ｇｒａｐｈ Ｐａ
ｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン３．０）を使用する、図１の飽和結合データの
分析から、四量体配列番号２９４ペプチド複合体に対して１０．００ｎＭ（±２．３６）
、四量体配列番号２６４に対して１４．８７ｎＭ（±５．０６６）、四量体配列番号２７
７に対して４．０３１ｎＭ（±０．８６）、および四量体配列番号３５６に対して１．８
１４ｎＭ（±０．２７）のＫ_Ｄを得た。予想されるように、これらの結合定数は、関連す
る単座ペプチド配列番号２９４（６９ｎＭ）、配列番号２６４（２８０ｎＭ）、配列番号
３１０（５１ｎＭ）のＫＤＲＦｃに対して、ＦＰにより測定されたものよりも低かったが
、単座ペプチド配列番号２７７（３ｎＭ）に類似していた。予想されるように、対照（結
合剤なし）ペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体に対しては、結合の飽和は観察
されなかった。単一濃度実験が、非結合ペプチドからＫＤＲ結合ペプチド（配列番号２６
４、２９５および２７７）を区別するために使用できることを示すため、単一濃度（５．
５５ｎＭ）でのペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体の結合（図２）をプロット
した。

実験Ｂ
実験Ｂは、ＫＤＲ結合配列（配列番号２９４および２６４）およびビオチン間のスペー
サー（ＪＪ、表１０）の必要性を調べるために計画された。この実験においては、スペー
サーＪＪを有するまたは有しないビオチニル化ペプチドを試験し（例えば、ＪＪスペーサ
ーを有するビオチニル化配列番号２６４、ＪＪスペーサーを有しないビオチニル化配列番
号２６４、スペーサーを有するビオチニル化配列番号２９４、およびスペーサーを有しな
いビオチニル化配列番号２９４）、非ＫＤＲ結合、ビオチニル化対照ペプチド（スペーサ
ーを有するまたは有しない、前に示したように調製）を対照として使用した。この実験で
試験されたすべてのＫＤＲ結合配列のペプチド構造は、図３に示されている。

この実験は、上記実験Ａで示されたように実施したが、ただ、２．７８ｎＭの単一濃度
でのみ行われた。
結果：図４に示された結果から、スペーサーが配列番号２９４および配列番号２６４の結
合を促進したことは明らかである。結合配列およびビオチン間のスペーサーは、複数の機
構により、標的分子への結合の促進を助けることができる。第一に、それは、単一アビジ
ン分子への結合後、４つのビオチニル化ペプチド間の立体障害軽減を助けることができる
。第二に、それは、単一細胞上の利用可能な複数の結合部位へ到達するために必要とされ
る、特別な長さを提供できる。

実験Ｃ
実験Ｃは、配列番号２９４、２６４、２７７および３５６の結合に対する血清効果を調
べるために計画した。この方法において、配列番号２９４、２６４、２７７および３５６
のビオチニル化ペプチド／アビジンＨＲＰ複合体を、４０％ラット血清存在下または不在
下、Ｍ１９９培地中で試験した（実験Ａで前に記載したように）。この実験は実験Ａで記
載したように実施したが、ただ、配列番号２９４および２６４に対しては６．６６ｎｍ、
および配列番号２７７に対しては３．３３ｎＭ、および配列番号３５６に対しては２．２
２ｎＭの単一濃度でのみ行った。ポリペプチドの各々はビオチニル化されており、および
ＪＪスペーサーを有していた。

結果：図５は、配列番号２６４、配列番号２９４および配列番号３５６の結合は４０％
ラット血清により有意に影響されなかったのに対して、配列番号２７７の結合は、４０％
ラット血清存在下で５０％以上低下したことを示している。Ｔｃ−キレートを有する、Ｔ
ｃ−標識配列番号２７７の結合においては、４０％ラット血清存在下、８０％以上の低下
が観察された（図２７）。Ｔｃ−標識配列番号２７７の結合に対する血清効果は、本明細
書に開示されたアビジンＨＲＰアッセイによく似ているので、このアッセイは、ＫＤＲへ
のペプチド（類）の結合に対する血清効果を、迅速に評価するために使用することができ
る。

実験Ｄ
実験Ｄは、ＫＤＲおよびＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体−結合ポリペプチド配列番号２９４お
よび配列番号２６４の四量複合体、特に少なくとも２つのＫＤＲ結合ポリペプチドを含む
構築物の結合を評価するために計画した。ＫＤＲ結合ペプチドおよび対照結合ペプチドは
上記のように調製した。この実験は、実験Ａで示したプロトコールを使用して実施したが
、以下に示した手順はこの実験に独特のものであった。

ペプチド／ニュートラアビジン溶液の調製：ビオチニル化ペプチド配列番号２６４，２
９４および対照ペプチドの２５０μＭ保存溶液は５０％ＤＭＳＯで調製し、およびニュー
トラアビジン ＨＲＰの３３μＭ保存溶液は、２ｍｇのニュートラアビジン ＨＲＰ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ，カタログ番号３１００１）を１ｍＬのｄｄＨ_２Ｏに溶解することにより調製
した。ペプチド保存溶液は−２０℃で保存し、一方、ニュートラアビジン−ＨＲＰ保存溶
液は−８０℃で保存した。ビオチニル化ペプチドの配列は前に示されている。ペプチド／
ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体を調製するため、５．３６μＬの２５０μＭビオチニ
ル化ペプチド保存溶液（またはペプチド混合物の溶液、アビジン ＨＲＰ分子数の４倍の
ペプチド分子を与えるため）および１０μＬの３３μＭニュートラアビジン−ＨＲＰを１
ｍｌのＭ１９９培地に加えた。この混合物は４℃にて６０分、回転板上でインキュベート
し、続いて、過剰のペプチドを除去するために５０μｌのソフトリリースアビジン−セフ
ァロース（ｄｄＨ_２Ｏ中での５０％スラリー）を加え、さらに４℃にて３０分、回転板上
でインキュベートした。最後に、１２，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離すること
により、ソフトリリースアビジン−セファロースをペレット化し、得られた上清をアッセ
イに使用した。新鮮なペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰ複合体を、各々の実験のた
びに調製した。

ペプチド／ニュートラアビジン−ＨＲＰの結合を検出するためのアッセイ：トランスフ
ェクション２４時間後、２９３Ｈ細胞の各々のウェルを１回１００μｌのＭ１９９培地で
洗浄し、８０μｌのブロッキング溶液と３７℃でインキュベートした。１時間後、細胞を
１００μｌのＭ１９９培地で２回洗浄し、７０μｌの３．３３ｎＭペプチド（またはペプ
チド混合物）・ニュートラアビジン ＨＲＰ溶液（前に調製した保存溶液の１０μＬを１
ｍＬのＭ１９９培地に加えることにより調製）と、室温で２．５時間インキュベートした
。各々の希釈液は、偽ならびにＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞を含む３つの別々の
ウェルへ加えた。室温でインキュベーション後、さらに半時間のインキュベーションのた
め、プレートを４℃へ移した。続いて、細胞を氷冷Ｍ１９９培地で５回、氷冷ＰＢＳで１
回洗浄した（この順序で）。最終洗浄後、１００μｌの氷冷ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ，ゲイサ
ーブルグ，ＭＤ）を各々のウェルへ加え、各々のプレートを、空気インキュベーター中、
３７℃でインキュベートした。最後に、ＨＲＰ酵素反応を、５０μｌの１Ｎリン酸を各々
のウェルへ加えることにより停止させ、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ モデ
ル３５５０）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、結合を定量した。

結果：この実験は、配列番号２９４および配列番号２６４はＫＤＲに多量体様式で結合
し、および２９３Ｈトランスフェクト細胞におけるＫＤＲへの結合のためお互いが協力し
ていることを確認した。ＫＤＲに結合しないビオチニル化対照ペプチドを使用した。予想
されるように、アビジン−ＨＲＰと対照ペプチドの四量複合体はＫＤＲ−トランスフェク
ト細胞への促進された結合を示さなかった。配列番号２９４および配列番号２６４の四量
複合体は、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞よりも、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞へ著し
くより良好に結合した（図６参照）。しかしながら、配列番号２９４四量体は、配列番号
２６４四量体よりもより良好に結合した。もし、四量複合体を形成させるため、使用され
たペプチド混合物に対照ペプチドを加えたら、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合は
減少した。単量体、二量体および三量体に対する、四量体の特異的結合の比は、四量体、
三量体および二量体の特異的結合（ＫＤＲ−トランスフェクト細胞からＭｏｃｋトランス
フェクト細胞への結合を差し引くことにより得られた）を単量体の特異的結合で割ること
により計算した。結果は、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に対して、配列番号２
６４、２９４および３５６の多量体化の協力効果が存在することを示している。

２５％非結合対照ペプチドと７５％配列番号２６４の混合物は、ＫＤＲ−トランスフェ
クト細胞に対して、バックグラウンドと比較して有意には結合せず、アッセイを通してＫ
ＤＲに結合されたままであるには、配列番号２６４／アビジン−ＨＲＰ複合体にとって多
価結合が決定的であることを示している。この現象はまた、配列番号２９４に対しても当
てはまり、四量複合体において、５０％のペプチドを対照ペプチドで置換すると、トラン
スフェクト細胞上のＫＤＲへのほとんどすべての結合が消滅した。

驚くべきことに、５０％対照ペプチドと２５％配列番号２９４および２５％配列番号２
６４から構成されたペプチド混合物は、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞と比較して、ＫＤ
Ｒ−トランスフェクト細胞へきわめてうまく結合し、同一標的分子上の２つの部位または
エピトープを標的化することは大きな利点があることを示している。さらに、配列番号２
９４および配列番号２６４を異なった比（３：１、２：２および１：３）で含んでいる四
量複合体はすべて、両方のペプチドの純粋な四量体よりも、ＫＤＲ−トランスフェクト細
胞へより良好に結合し、単一標的分子上の２つの異なった部位の標的化は、単一部位への
多量体結合よりも優れているという考えと一致している。これは、多量体が同時に結合す
るには、十分にお互いが近接している２つまたはそれより多くの別々の標的分子に、多量
体結合実体が広がっていることを必要とするが、一方、単一標的分子上の２つまたはそれ
より多い異なった部位に結合できる多価結合剤は、多価結合を達成するため、その手の届
くところに別の標的分子を発見することには依存しないためであろう。

実験Ｅ
実験Ｅは、配列番号２９４および配列番号２６４がＫＤＲ上の異なった部位（エピトー
プ）へ結合することを確認するために計画した。もし、これらのペプチドがＫＤＲ上の同
一の部位へ結合するとしたら、これらはお互いに競合することが可能でなければならない
；しかしながら、もし、これらが異なった部位へ結合するとしたら、これらは競合すべき
ではない。この実験は、各々のウェルに単一濃度の配列番号２６４／アビジン ＨＲＰ溶
液（３．３３ｎＭ）を加え、スペーサーを有するビオチニル化対照ペプチド、配列番号２
６４、および配列番号２９４（これらはいずれもアビジンと複合体形成されていない）の
濃度を変化させて（０〜２．５μＭ）加えることにより実施した。

結果：図７から、配列番号２６４はＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合について、
配列番号２６４／アビジン ＨＲＰ溶液と競合したのに対し、対照および配列番号２９４
はＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合について、配列番号２６４／アビジン ＨＲＰ
溶液と競合しなかった。それ故、配列番号２６４および配列番号２９４は、ＫＤＲ上の異
なったおよび相補的な部位へ結合する。

ＫＤＲ発現細胞へのＫＤＲ結合ペプチド類似物の結合
ＫＤＲ結合ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端切り詰め物を作製し、切り詰めポリペプ
チドのＫＤＲ発現細胞への結合について試験した。合成されたポリペプチドは図８に示さ
れている。ＫＤＲ発現細胞へのポリペプチドの結合は、実施例３の手順に従って決定した
。

すべてのペプチドは前に記載した方法に従って見掛けのＫＤを決定するため、Ｎ末端を
アセチル化およびフルオレセイン化した（実施例３）。結果は、配列番号２９４ポリペプ
チドにおいて、ジスルフィド強要ループ外側のＣ末端残基がＫＤＲ結合に寄与しているこ
とを示している（図８）。

ＫＤＲ発現細胞へ結合する、ファージディスプレイにより同定されたペプチドの能力を
確認するためのビーズ結合アッセイ
以下の手順を、ＫＤＲ発現細胞へ結合する、ＫＤＲ結合ペプチドの能力を評価するため
に実施した。この手順においては、配列番号２６４、３３７、３６および３７３を含んで
いるＫＤＲ結合ペプチドを、蛍光ビーズへコンジュゲートし、ＫＤＲ発現２９３Ｈ細胞へ
結合する能力を評価した。実験は、ＫＤＲ発現部位へ、ビーズのごとき粒子を結合させる
ため、これらのペプチドが使用できることを示している。結果は、両方のＫＤＲ結合配列
の結合が、スペーサーの付加により改良されたことを示している。

プロトコール
抗ＫＤＲ抗体のビオチニル化：腹水液としての、Ｓｉｇｍａ（Ｖ−９１３４）からの抗
ＫＤＲを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｆ−６３４７）からのキットを使用し、
製造業者の説明書に従ってビオチニル化した。

ペプチド−コンジュゲート蛍光ビーズの調製：各々のビオチニル化ペプチド（上に示し
たように調製した、５０％ＤＭＳＯ）の０．２ｍＭ保存溶液からの０．１ｍＬを、０．１
ｍＬのニュートラアビジン被覆赤色蛍光微小球（直径２ミクロン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓから注文生産品として）および０．２ｍＬの５０ｍｍ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ
Ｍ−８２５０）緩衝液、ｐＨ６．０、と、回転板上、室温で１時間インキュベートした
。陽性対照として、ビオチニル化抗ＫＤＲ抗体を、ニュートラアビジン被覆ビーズと上記
のようにインキュベートしたが、ペプチド溶液に代わりに０．０３ｍｇのビオチニル化抗
体調製物のＰＢＳ溶液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０−１３６）を使用した。ビ
ーズは必要になるまで、１週間までは４℃で保存できる。

結合アッセイ：上記ビーズ調製物から、０．１２ｍＬを、微量遠心管中、２０００ｒｐ
ｍで１０分、室温で遠心分離した。上清を除去し、０．０６ｍｌのＭＥＳ、ｐＨ６．０、
を加えた。各々のビーズ溶液は次にボルテックスし、水浴中で１５分、超音波処理した。
１．４７ｍｌのＤＭＥＭ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ＧＩＢＣＯ １
１１４０−０５０）および４０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０２）を含
む高グルコース（ＧＩＢＣＯ ＃１１９６５−０８４）、へ０．０３ｍｌの超音波処理ビ
ーズ調製液を加えた。Ｍｏｃｋトランスフェクトされている２９３Ｈ細胞を列１から６に
、そしてＫＤＲトランスフェクト細胞を列７から１２に蒔いた９６ウェルプレート（実施
例５のように）の水気を切り、そして１回ＤＭＥＭ、１×ＮＥＡＡおよび４０％ＦＢＳを
含む高グルコース、で洗浄した。ビーズ調製液当たり６つのウェルで、各々のウェルに０
．１ｍｌのビーズ溶液を加えた。室温で３０分インキュベートした後、プレートを逆にす
ることによりウェルの水気を切り、０．１ｍｌのＣａ^＋＋Ｍｇ^＋＋含有ＰＢＳ（ＧＩＢＣ
Ｏ カタログ番号１４０４０−１１７）で、室温にて５分振盪しながら４回洗浄した。水
気を切った後、ウェル当たり０．１ｍｌのＰＢＳを加えた。プレートは次に、Ｐａｃｋａ
ｒｄ ＦｌｕｏｒｏＣｏｕｎｔ蛍光計を使用し、励起５５０ｎｍ／発光６２０ｎｍで読み
取った。コンジュゲートされていないニュートラアビジンを陰性対照として使用すると同
時に、ビオチニル化抗ＫＤＲ抗体でコンジュゲートしたビーズをアッセイの陽性対照とし
て使用した。

ウェル当たりに結合されたビーズの数を計算するため、同一の蛍光ビーズ数を増加させ
た標準曲線が各々のアッセイプレートに含まれている。標準曲線は、各々のウェルの蛍光
強度に基づき、ウェル当たりに結合されたビーズ数を計算するために使用した。

結果：抗ＴＤＰが付着した陽性対照ビーズは、明らかにＫＤＲ発現細胞へ優先的に結合
されたが、一方、何も付着していないアビジンビーズは両方の細胞型へ結合されなかった
（図９）。ビオチニル化配列番号２６４ビーズは、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞よりも
有意にはＫＤＲトランスフェクト細胞へ結合されなかったが、ペプチド部分およびビオチ
ン基の間に親水性スペーサーを加えることにより（ＪＪスペーサーを有するビオチニル化
配列番号２６４ビーズ）、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞への結合を増加させることなく
、ＫＤＲ細胞への結合が促進された。ビオチニル化配列番号２９４ビーズは、ＫＤＲトラ
ンスフェクト細胞へのより強い結合を示し、そして、ペプチド部分およびビオチン分子の
間に親水性スペーサーを加えることにより（ＪＪスペーサーを有するビオチニル化配列番
号２６４）、トランスフェクト細胞中のＫＤＲへの特異的結合が著しく改良された。それ
故、配列番号２６４および配列番号２９４両方のペプチド配列は、ビーズのような粒子を
ＫＤＲ発現部位へ結合するために使用できる。ペプチドおよび粒子への付着に使用された
基の間への親水性スペーサーの付加は、ここに評価したペプチド両方の結合を改良するの
で、新規標的指向化分子でルーチン的に試験されるべきである。

ＫＤＲトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合におけるＫＤＲ結合ペプチドおよび^１２
５Ｉ−標識ＶＥＧＦの競合
ＫＤＲ−結合ポリペプチドは次に、トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞により発現さ
れたＫＤＲへの結合において、^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと競合する能力を評価した。結果
は、ＫＤＲ結合ポリペプチド配列番号２６３（Ａｃ−ＡＧＤＳＷＣＳＴＥＹＴＹＣＥＭＩ
ＧＴＧＧＧＫ−ＮＨ_２）は^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと有意に競合しなかったが、配列番号
２９４、２６４および配列番号２７７は^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと非常によく競合する、
^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合の９６．２９±２．９７％および１０４．４８±２．０７４
％を阻害する、ことを示した。

２９３Ｈ細胞のトランスフェクション：２９３Ｈ細胞を、実施例５に記載したプロトコ
ールを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプ
レート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号３５４６４０）で行った。プ
レートの左半分をＭｏｃｋトランスフェクトし（ＤＮＡなしで）、プレートの右半分をＫ
ＤＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション時には８０〜９
０％コンフルエントであり、アッセイする時間である次の日には完全にコンフルエントで
あり、さもなければ、アッセイを中止した。

Ｍ１９９培地の調製：Ｍ１９９培地は、実施例５に記載したごとく調製した。
ペプチド溶液の調製：ペプチド配列番号２９４、配列番号２６３、配列番号２６４およ
び配列番号２７７の３ｍＭ保存溶液は、上に記載したように、５０％ＤＭＳＯで調製した
。

アッセイのための^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ溶液の調製：凍結乾燥^１２５Ｉ−標識ＶＥＧ
Ｆの２５μＣｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，カタログ番号ＩＭ２７４）を２５０μｌのｄｄＨ_２
Ｏで再構築して保存溶液を作製し、それは後に使用するまで−８０℃で保存した。各々の
アッセイに対して、上記保存溶液をＭ１９９培地に希釈することにより、^１２５Ｉ−標識
ＶＥＧＦの３００ｐＭ溶液を新しく作製した。^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの濃度は、その日
の材料の比活性に基づいて毎日計算した。

３００ｐＭ^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦにおける３０μＭおよび０．３μＭペプチド溶液の
調製：各々の９６ウェルプレートのため、３００ｐＭ^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦを含む１０
ｍｌのＭ１９９培地を４℃で調製した。各々のペプチド溶液（３ｍＭ、上に記載したよう
に調製した）を、３００ｐＭ^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦを含む３００μｌのＭ１９９培地に
１：１００および１：１００００で希釈して、３００ｐＭ^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦを含ん
でいる、３０μＭおよび０．３μＭペプチド溶液を調製した。調製したら、この溶液はす
ぐ使用できるように氷上に保った。３００ｐＭ^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦを含んでいるＭ１
９９培地でのペプチドの希釈は、各々の実験で新たに行った。

２９３Ｈ細胞における^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦとの競合を検出するためのアッセイ：細
胞は、トランスフェクション２４時間後に使用し、アッセイのための細胞を調製するため
、それらを３回、室温のＭ１９９培地で洗浄し、冷蔵庫に入れた。１５分後、Ｍ１９９培
地をプレートから除き、ポリペプチドを含む７５μｌの３００ｐＭ^１２５Ｉ−標識ＶＥＧ
ＦのＭ１９９培地（上のように調製された）で置き換えた。各々の希釈液は偽およびＫＤ
Ｒトランスフェクト細胞を含む３つの別々のウェルへ加えた。４℃で２時間インキュベー
トした後、プレートを冷結合緩衝液で５回洗浄し、優しく吸い取って乾燥し、細胞損失を
顕微鏡下で検査した。１００μｌの可溶化溶液（２％トリトンＸ−１００、１０％グリセ
ロール、０．１％ＢＳＡ）を各々のウェルへ加え、プレートを室温で３０分インキュベー
トした。各々のウェル中の可溶化溶液をピペットで吸い上げたり吐き出したりすることに
より混合し、そして１．２ｍｌチューブへ移した。各々のウェルを１００μｌの可溶化溶
液で２回洗浄し、洗液を対応する１．２ｍｌチューブへ加えた。各々の１．２ｍｌチュー
ブは、プログラム５４（^１２５Ｉウィンドウで１分）を使用するＬＫＢガンマカウンター
で計数されるべき１５．７×１００ｃｍチューブへ移した。

２９３Ｈ細胞におけるペプチドと^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの競合：ＫＤＲへの^１２５Ｉ
−標識ＶＥＧＦを特異的に阻止する、ＫＤＲ結合ペプチド配列番号２９４、配列番号２６
３、配列番号２６４および配列番号２７７の能力を、ＭｏｃｋトランスフェクトおよびＫ
ＤＲ−トランスフェクト細胞で評価した。配列番号２６３は、本明細書で説明したＦＰア
ッセイにおいてＫＤＲへの乏しい結合を示し、および、それ故にＶＥＧＦと置き換わるま
たは競合するとは予想されないので、このアッセイにおいて陰性対照として使用した。Ｋ
ＤＲへの特異的結合を計算するため、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞への^１２５Ｉ−標識
ＶＥＧＦの結合を、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞から差し引いた。それ故、ＫＤＲ結合
ペプチドによる２９３Ｈ細胞への^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合の阻害を計算する場合、Ｋ
ＤＲ以外の部位への^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦの結合（２９３Ｈ細胞に存在してもよいし、
または存在しなくてもよい）は含まれていない。阻害率は、式［（Ｙ１−Ｙ２）×１００
／Ｙ１］、式中、Ｙ１はペプチド不在下でのＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞への特
異的結合であり、およびＹ２はペプチドまたはＤＭＳＯ存在下でのＫＤＲ−トランスフェ
クト２９３細胞への特異的結合である、を使用して計算した。ＫＤＲ−トランスフェクト
２９３細胞への特異的結合は、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞への結合からＭｏｃ
ｋトランスフェクト細胞への結合を差し引くことにより計算した。

図１０に示した様に、２９３細胞において、その比較的高いＫ_ｄ（＞２μＭ）のために
陰性対照として使用された配列番号２６３は、^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと有意には競合し
なかった、３０μＭで１２．６９±２．９７％および０．３μＭで−５．４５±９．３７
％（図１０）。同時に、配列番号２９４および２７７は^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと非常に
よく競合し、各々、３０μＭで^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ結合を９６．２９±２．９７％お
よび１０４．４±２．０７４％、０．３μＭで５２．２７±３．７８％および８０．９６
±３．８％阻害した（図１０）。配列番号２６４の阻害率は、３０μＭで^１２５Ｉ−標識
ＶＥＧＦ結合の４７．９５±５．０９％、および０．３μＭで２４．４１±８．４３％で
あった（図１０）。従って、３つの強力ＫＤＲ結合ポリペプチドはＶＥＧＦと競合せず、
それらの有効性はそれらの結合親和性とともに増加した。このアッセイは、ＫＤＲへ強固
に結合するが、ＶＥＧＦとは競合しないペプチドを同定するために有用であろうし、それ
はさもなければＫＤＲ−標的化分子の結合を阻止するであろう、ＶＥＧＦの高い局所濃度
がしばしば存在する、腫瘍におけるＫＤＲ画像化に有用であることが特色である。

ファージディスプレイにより同定されたペプチドによるＶＥＧＦ−誘導ＫＤＲレセプタ
ーの阻害
ＫＤＲのＶＥＧＦ誘導活性化（リン酸化）を阻害する、ファージディスプレイにより同
定されたＫＤＲ結合ペプチドの能力を、以下のアッセイを使用して評価した。本発明のペ
プチドの多数が、単量体および／または四量体構築物でＫＤＲの活性化を阻害することが
示された。上に議論したように、ＫＤＲの活性化を阻害するペプチドは、抗血管新生剤と
して有用である。

プロトコール
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ カタログ番号ＣＣ
−２５１９）はドライアイスで凍結されて得られ、融解するまで液体窒素中で保存した。
これらの細胞は、製造業者により説明されているように、融解し、継代し、そしてＥＧＭ
−ＭＶ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ カタログ番号ＣＣ−３１２５）中で維持した。
細胞を１００ｍｍディッシュに蒔きコンフルエントになるまで放置し、次に血清を欠く基
本ＥＢＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ カタログ番号ＣＣ−３１２１）で一夜培養し
た。次の朝、ディッシュ中の培地を、３７℃で、添加物を含まない（陰性対照）、５ｎｇ
／ｍｌ ＶＥＧＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ番号６７６４７２またはＰｅｐｒｏ
ｔｅｃｈ カタログ番号１００−２０）（陽性対照）、または５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦに
指定された濃度のＫＤＲ結合ペプチド（上に説明したように調製した）を加えたもの、を
含んでいる１０ｍｌの新鮮なＥＢＭ培地で置き換えた。いくつかの場合、中和抗ＫＤＲ抗
体（カタログ番号ＡＦ３５７，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、活性化の陽性対照阻害剤と
して使用した。そのような場合、ＶＥＧＦおよび抗体の両方を含んでいる新鮮培地の添加
に先立ち、３７℃で３０分、抗体を試験細胞と前もってインキュベートした。ディッシュ
を、３７℃の組織培養インキュベーター中で５分インキュベートした後、カルシウムおよ
びマグネシウムを含んでいる氷冷Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄し、最後の１０ｍｌのダルベッコ
リン酸緩衝化塩溶液（Ｄ−ＰＢＳ）を除去することなく、氷の上に置いた。第一のディッ
シュの組を排水し、０．５ｍｌのトリトン溶解緩衝液（２０ｍＭトリス塩基 ｐＨ８．０
、１３７ｍＭ ＮＡＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオ
リド）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＦ、５０ｍＭピロリン酸
ナトリウム、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン）を加えた。細
胞スクレーパー（Ｆａｌｃｏｎ，カタログ番号３５３０８７）を使用して細胞を溶解緩衝
液内へ迅速にかきとり、簡単にピペットで吸い上げたり吐き出したりすることにより分散
し、得られた溶解物を対となる第二の排水したディッシュに移した。別の０．５ｍｌの溶
解緩衝液を第一のディッシュを洗い流すために使用して第二のディッシュへ移し、それは
次にまたかきとりおよび分散させた。２つのディッシュからプールした溶解物を１．５ｍ
ｌのエッペンドルフチューブへ移した。上記の手順を各々の対照および試験試料（ＫＤＲ
結合ペプチド）に対し同じ時に繰り返した。溶解物は、すべての試料か処理されるまで氷
上に保存した。この時点で、試料を−７０℃で保存するか、または中断することなくアッ
セイの最後まで処理した。

新しく調製された、または凍結した後に融解した溶解物は、２０μｌのプロテインＡ−
セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ ３３９１、Ｄ−ＰＢＳで前膨潤させ、大過剰のＤ−Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、そして５０％スラリーにするために６ｍｌのＤ−ＰＢＳで再構築され
ている）を加え、４℃で３０分揺り動かすことにより、前もってきれいにした。ビーズは
、Ｐｉｃｏｆｕｇｅ（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，カタログ番号４００５５０）中、２０００×
ｇで２分遠心分離することによりペレット化し、上清を新しい１．５ｍｌチューブへ移し
た。２０μｇの抗Ｆｌｋ−１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，カタログ番号ｓｃ−５０４）を各々のチューブへ加え、ＫＤＲを免疫沈降させるため、
回転板上、４℃で一夜（１６〜１８時間）チューブをインキュベートした。次の日、４０
μｌのプロテインＡ−セファロースビーズをチューブへ加え、それは回転板上、４℃で１
時間インキュベートした。各々のチューブ内のビーズは続いてＰｉｃｏｆｕｇｅ中、２分
遠心分離することにより３回洗浄し、上清を捨て、ビーズを新しく加えた１ｍｌのＴＢＳ
Ｔ緩衝液（２０ｍＭトリス塩基 ｐＨ７．５、１３７ｍＭ ＮＡＣｌ、および０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ２０）に分散させた。遠心分離後、最後の洗浄での液体を除去し、４０μｌのＬ
ａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号１６１−０
７３７）を各々のチューブへ加え、チューブにキャップをかぶせ、５分間煮沸した。冷却
後、各々のチューブ中のビーズは遠心分離することによりペレット化し、免疫沈降したＫ
ＤＲを含んでいる上清を新しいチューブへ移し、直ちに使用するか、または後での分析の
ため凍結させて−７０℃で保存した。

免疫沈降物中のリン酸化ＫＤＲならびに総ＫＤＲの検出は、免疫ブロット分析により実
施した。各々の免疫沈降物の半分（２０μＬ）を、７．５％プレキャストＲｅａｄｙ Ｇ
ｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号１６１−１１５４）上、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕ
ｒｅ，２２７：６８０−６８５（１９７０））の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分離した。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ３装置（カタログ番号１６５−３３０２
）を使用し、各々のゲル中の分離されたタンパク質は、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａの方法（Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１００３５−１００３８（１９８７））に従って、１
４０ｍＡで２時間、ＣＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭ ＣＡＰＳ，Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ
−６０７０，１％ＡＣＳグレードメタノール，ｐＨ１１．０）中、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｍｉ
ｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ｃｅｌｌ（カタログ番号１７０−３９３０）中のＰＶＤＦ
膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号１６２−０１７４）へエレクトロブロットした。ブロ
ットを、前もって３７℃に暖めた５％ Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ カタログ
番号３７５３０）中、室温で２時間ブロックした。ブロットは最初に、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を加えた５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳで１：２００に希釈した、抗ホスホチロシン抗
体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ，カタログ番号Ｐ１１１２０）を用い、室温で
２時間探索した。非結合抗体を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいるＤ−ＰＢＳ（Ｄ−
ＰＢＳＴ）で、１洗浄当たり５分で４回、ブロットを洗浄することにより除去した。続い
て、ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳで１：２５
，０００に希釈した、ＨＲＰ−コンジュゲートヒツジ抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号ＮＡ９３１）を用い、室温で１時間探索し、Ｄ−
ＰＢＳＴで４回洗浄した。最後に、ブロットを２ｍｌの化学発光基質（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ
，Ａｍｅｒｓｈａｍ カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を上に広げて２分間インキュベート
し、ウェルを水切り排水し、プラスチックシ−トプロテクター（Ｃ−Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ，カタログ番号６２０３８）に置き、最適なコントラストを達成するために時間
を変えて、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＬ，カタログ番号１１３９４３
５）へ暴露した。

同じ量のＫＤＲがアッセイで比較されたことを確認するため、ＨＣｌでそのｐＨを２．
４に調整したＴＢＳＴ中、３７℃で３０分インキュベートすることによりブロットを剥が
し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ（Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳ
Ｔ）を用いて室温で１時間ブロックし、１％正常ヤギ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ カタロ
グ番号１６２１００６４）を含む５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳＴで１：２００に希釈した抗
Ｆｌｋ−１ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号
ＳＣ−３１５）を用い、室温で２時間、再探索した。非結合抗体を、Ｄ−ＰＢＳＴで、１
洗浄当たり５分で４回、ブロットを洗浄することにより除去した。続いて、ブロットを、
５％Ｂｌｏｔｔｏ−ＴＢＳＴで１：１０，０００に希釈した、ＨＲＰ−コンジュゲートロ
バ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号ＮＡ９
３４）を用い、室温で１時間探索し、Ｄ−ＰＢＳＴで４回洗浄した。最後に、ブロットを
２ｍｌの化学発光基質とインキュベートし、上記のようにＸ線フィルムへ暴露した。

結果：前ＶＥＧＦ刺激あり、またはなしのＨＵＶＥＣから調製されたＫＤＲ免疫沈降物
の免疫ブロットは、ＨＵＶＥＣがＶＥＧＦで刺激された場合に、活性化（リン酸化）ＫＤ
Ｒを検出できたことを示した。抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ−２０）は、非刺激ＨＵＶＥ
Ｃから、ＫＤＲの移動位置に近接するリン酸化タンパク質をブロット上に検出しなかった
が、５分のＶＥＧＦ刺激後、予想される位置に強いバンドが矛盾なく観察された（図１１
、上のパネル）。酸性溶液中でのインキュベーションにより、ブロットから結合抗体を剥
がし、次に抗ＫＤＲ抗体（ｓｃ−３１５）で再探索した場合、リン酸化バンドの同一性は
、ＫＤＲであることで確認された。さらに、非刺激ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物は、ＶＥ
ＧＦ−刺激ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物とほぼ同じの総ＫＤＲを含んでいることが確認さ
れた（図１１、下のパネル）。

以上の結果は、検出されたリン酸化ＫＤＲは、ＶＥＧＦ結合により生じたＫＤＲ二量体
の自己リン酸化を経て既存のＫＤＲから形成され、ＫＤＲのような大きなグリコシル化細
胞表面レセプターを合成および加工するには、５分は十分な時間ではないことを示してい
る。

ＫＤＲのＶＥＧＦ活性化を阻止できる試薬を検出するためのこのアッセイの能力は、Ｖ
ＥＧＦと組み合わせて一連の化合物をＨＵＶＥＣへ加え、上記免疫ブロットアッセイでＫ
ＤＲリン酸化を測定することにより評価した。陰性および陽性対照として、試験化合物不
在下で、非刺激ＨＵＶＥＣおよびＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物もまたアッセ
イごとに試験した。中和抗ＫＤＲ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ−３
５７）をＶＥＧＦと併用した場合、ＫＤＲリン酸化の程度は非常に減少し（図１２、上の
パネル）、抗体は、ＫＤＲへ結合しおよび活性化するＶＥＧＦの能力を妨害できることを
示している。ＶＥＧＦ−誘導ＤＮＡ合成を阻止するこの抗体の能力が、抗体の製造業者に
よる品質管理試験の一部であることから、この結果は予想された。抗ＫＤＲ抗体でのブロ
ットの再探索は（図１２、下のパネル）、ＶＥＧＦのみで処理したレーンと比較し、ＶＥ
ＧＦ＋抗体−処理レーン（＋Ｖ＋α−ＫＤＲ）中にはわずかに少ない総ＫＤＲが存在する
ことを示しているが、この相違は、抗体−処理レーン中のリン酸化ＫＤＲのより少ない発
生量を説明するには十分に大きくない。

ファージディスプレイにより同定された直鎖状ＫＤＲ結合ペプチド（ＡＦＰＲＦＧＧＤ
ＤＹＷＩＱＱＹＬＲＹＴＤ，配列番号１４０）の有効性を評価するため、ＶＥＧＦ存在下
、ＫＤＲ結合配列Ａｃ−ＡＱＡＦＰＲＦＧＧＤＤＹＷＩＱＱＹＬＲＹＴＤＧＧＫ−ＮＨ_２
（配列番号３０６）を含んでいる合成ペプチドでアッセイを繰り返した。配列番号３０６
はＫＤＲのＶＥＧＦ−誘導リン酸化を阻害できた。総ＫＤＲのためのブロットの再探索は
、ＶＥＧＦ＋配列番号３０６−処理細胞（＋Ｖ＋配列番号３０６）中には、ＶＥＧＦのみ
で処理した細胞（＋Ｖ）中よりも多くの総ＫＤＲが存在することを示した（図１３、下の
パネル）。それ故、配列番号３０６存在下でのＫＤＲリン酸化の減少は、試料添加の差に
よるものではなく、むしろ、ＫＤＲのＶＥＧＦ−活性化を阻害する、ポリペプチドの能力
によるものであることは明らかである。

上記アッセイを繰り返すと、下記のポリペプチドは、１０μＭでＶＥＧＦ−誘導ＫＤＲ
リン酸化の少なくとも５０％の阻害を示した：
Ａｃ−ＡＧＷＩＥＣＹＨＰＤＧＩＣＹＨＦＧＴＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号２６９）
Ａｃ−ＡＧＷＬＥＣＹＡＥＦＧＨＣＹＮＦＧＴＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号２６７）
Ａｃ−ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号２９
４）
Ａｃ−ＧＤＷＷＥＣＫ（ｉｖＤｄｅ）ＲＥＥＹＲＮＴＴＷＣＡＷＡＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ
_２（ブロックされたＫを有する配列番号３６６）
Ａｃ−ＧＤＰＤＴＣＴＭＷＧＤＳＧＲＷＹＣＦＰＡＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号３
０１）
Ａｃ−ＡＱＥＰＥＧＹＡＹＷＥＶＩＴＬＹＨＥＥＤＧＤＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号３０
５）
Ａｃ−ＡＱＡＦＰＲＦＧＧＤＤＹＷＩＱＱＹＬＲＹＴＤＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号３０
６）
Ａｃ−ＡＱＧＤＹＶＹＷＥＩＩＥＬＴＧＡＴＤＨＴＰＰＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号３０
７）
配列番号２６９および２９４はこのアッセイにおいて最も強力な化合物であり、１μＭ
でＶＥＧＦ−誘導ＫＤＲリン酸化の少なくとも５０％の阻害を生じた。

以下のペプチドが本アッセイで試験されたが、１０μＭでもＫＤＲ活性化の有意な阻害
を生じなかった：
Ａｃ−ＡＧＰＫ（ｉｖＤｄｅ）ＷＣＥＥＤＷＹＹＣＭＩＴＧＴＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列
番号２６４）
Ａｃ−ＧＳＤＨＨＣＹＬＨＮＧＱＷＩＣＹＰＦＡＰＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号３１４
）
Ａｃ−ＧＤＹＰＷＣＨＥＬＳＤＳＶＴＲＦＣＶＰＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号２
９３）
Ａｃ−ＧＤＤＨＭＣＲＳＰＤＹＱＤＨＶＦＣＭＹＷＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号２
９５）
Ａｃ−ＧＤＰＰＬＣＹＦＶＧＴＯＥＷＨＨＣＮＰＦＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号２
９６）
Ａｃ−ＧＤＧＳＷＣＥＭＲＱＤＶＧＫ（ｉｖＤｄｅ）ＷＮＣＦＳＤＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ
_２（配列番号２９９）
Ａｃ−ＡＱＲＧＤＹＱＥＱＹＷＨＱＱＬＶＥＱＬＫ（ｉｖＤｄｅ）ＬＬＧＧＧＫ−ＮＨ
_２（配列番号３３１）
Ａｃ−ＧＤＮＷＥＣＧＷＳＮＭＦＯＫ（ｉｖＤｄｅ）ＥＦＣＡＲＰＤＰＧＧＧＫ−ＮＨ
_２（配列番号３０３）
Ａｃ−ＡＧＰＧＰＣＫ（ｉｖＤｄｅ）ＧＹＭＰＨＱＣＷＹＭＧＴＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配
列番号３６７）
Ａｃ−ＡＧＹＧＰＣＡＥＭＳＰＷＬＣＷＹＰＧＴＧＧＧＫ−ＮＨ_２（配列番号３２２）
加えて、配列番号２９４および２７７のビオチニル化誘導体の四量体複合体（前に記載
したように調製）は、１０μＭでＶＥＧＦ−誘導ＫＤＲリン酸化の少なくとも５０％の阻
害を生じた。

ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＴｃ−標識配列番号３３９の結合
ＫＤＲへ結合するＴｃ−標識配列番号３３９の能力を、ＫＤＲ−トランスフェクト２９
３Ｈ細胞を使用して評価した。Ｔｃ−標識配列番号２７７（即ち、Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥ
ＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴ−ＧＧＧＫ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｙ−ジ（アミノジオキサオクタ−））−ＮＨ_２）は、Ｍｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ
に対するよりもＫＤＲトランスフェクト細胞へ有意によく結合し、およびＴｃ−標識配列
番号３３９の濃度とともに直線的様式で結合が増加した。

ＳＰＰＳ（図３５）によるＴｃへの結合のためのペプチドキレートの製造
２５０ｍＬのＳＰＰＳ反応容器へ、６．６４ミリモルのＨ−Ｇｌｙ−２−Ｃｌ−トリチ
ル樹脂（０．８４ミリモル／ｇ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を加えた。６０ｍＬのＤＭＦ
で１時間膨潤させた。各々のカップリングサイクルに対し、２６．６ミリモルのＤＩＥＡ
、２６．６ミリモルのＦｍｏｃ−アミノ酸ＤＭＦ溶液（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６．
６ミリモルのＨＯＢＴ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）のＤＭＦ溶液、および２６．６ミリモ
ルのＤＩＣを樹脂に加えた。反応混合物を４時間振盪した。次に樹脂を濾過し、ＤＭＦで
洗浄した（３×８０ｍｌ）。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液（８０ｍＬ）を樹脂へ加え、１
０分振盪した。樹脂を濾過し、このピペリジン処理を繰り返した。樹脂を最終的にＤＭＦ
で洗浄（３×８０ｍｌ）すると、次のカップリングサイクルの準備が完了する。最後のカ
ップリングサイクルで、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ活性化を使用してＮ，Ｎ−ジメチルグリシン
（Ａｌｄｒｉｃｈ）を結合させた。それ故、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（２６．６ミリモ
ル）のＤＭＦ懸濁液を、２６．６ミリモルのＨＡＴＵ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）ＤＭＦ溶液および５３．１ミリモルのＤＩＥＡへ加えた。透明な溶液を樹
脂へ加え、１６時間振盪した。合成後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（３×８０ｍｌ）、ＣＨ_２
Ｃｌ_２（３×８０ｍｌ）で洗浄して乾燥した。樹脂を８０ｍＬのＡｃＯＨ／ＣＦ_３ＣＨ_２
ＯＨ／ＤＣＭ（１／１／８、ｖ／ｖ／ｖ）と混合し、４５分振盪した。樹脂を濾過し、濾
液を蒸発させてペーストにした。２５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用するシリカゲルクロマト
グラフィーにより粗物質の精製で２．０ｇの最終生成物を得た。

ペプチドへのペプチドキレートのカップリング（断片カップリング）
ジイソプロピルカルボジイミド（０．００５５ミリモル）を、精製Ｍｅ_２Ｎ−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ−（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨおよびヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（０．００５５ミリモル）をＤＭＦ（０．２５Ｌ）に溶解した混合物へ加え、混合物
を室温で６時間撹拌した。ペプチド（０．００５ミリモル）のＤＭＦ（０．２５ｍＬ）溶
液を次に反応混合物へ加え、さらに６時間撹拌を続けた。真空下でＤＭＦを除去し、樹脂
を試薬Ｂで処理して３時間撹拌した。減圧下でＴＦＡを除去し、０．１％ＴＦＡを含んで
いるアセトニトリル−水を使用する分取ＨＰＬＣにより残渣を精製した。純粋な生成物を
含んでいる分画を集め、凍結乾燥するとペプチドを得た。ペプチドはＥＳ−ＭＳで確認し
、その純度はＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル−水／０．１％ＴＦＡ、濃度勾配）により
決定した。

^９９ｍＴｃ標識配列番号３３９の合成
グルコン酸第一スズ溶液は、２ｍｌの２０μｇ／ｍｌ ＳｎＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏの窒素置
換１Ｎ ＨＣｌ溶液を、１３ｍｇのグルコヘプト酸ナトリウムを含む１．０ｍｌの窒素置
換水へ加えることにより調製した。４ｍｌのオートサンプラーバイアルに、５０／５０エ
タノール／Ｈ_２Ｏに溶解した２０〜４０μｌ（２０〜４０μｇ）の配列番号３３９リガン
ド、６〜１２ｍＣｉの^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻の食塩水および１００μｌのグルコヘプト酸第一
スズ溶液を加えた。混合物を１００℃に２２分加熱した。得られた放射化学的純度（ＲＣ
Ｐ）は、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ペプチドおよびタンパク質カラムを使用し、６６％Ｈ_２Ｏ（
０．１％ＴＦＡ）／３４％ＡＣＮ（０．０８５％ＴＦＡ）で１ｍｌ／分の流速で溶出して
分析した場合、１０〜４７％であった。反応混合物は、０．１％ＴＦＡ含有水溶液を水相
として、および０．０８５％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を有機相として使用し、１ｍ
ｌ／分の流速でのＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いるＨＰＬ
Ｃにより精製した。以下の濃度勾配を使用した：２９．５％有機相で３５分、５分以上か
けて８５％への勾配をつけ、１０分保つ。^９９ｍＴｃ配列番号３３９は、５ｍｇ／ｍｌア
スコルビン酸および１６ｍｇ／ｍｌのヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリンを５
０ｍＭリン酸緩衝液に含んでいる５００μｌの安定化緩衝液に集めた。アセトニトリルを
除去するため、混合物はスピードバキューム装置を使用して濃縮し、そして２００μｌの
０．１％ＨＳＡ含有５０ｍＭ ｐＨ５のクエン酸緩衝液を加えた。得られた生成物は１０
０％のＲＣＰを有していた。動物への注射に先立ち、化合物は通常の生理食塩水で所望の
放射濃度に希釈した。

２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
２９３Ｈ細胞は前記のプロトコールを使用してトランスフェクトした。トランスフェク
ションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ
番号３５４６４０）で行った。プレートの左半分をＭｏｃｋトランスフェクトし（ＤＮＡ
なしで）、プレートの右半分をＫＤＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトした。細胞は、トラ
ンスフェクション時には８０〜９０％コンフルエントであり、アッセイする時間である次
の日には完全にコンフルエントであり、さもなければ、アッセイを中止した。

０．１％ＨＳＡを含むｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地の調製
ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１０５８−０２１）から
得られ、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はＳｉｇｍａ（カタログ番号Ａ−３７８２
）から得られた。０．１％ＨＳＡを含むｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地を調製するため、０．１
％ｗ／ｖＨＳＡをｏｐｔｉ−ＭＥＭＩに加え、室温で２０分撹拌し、次に０．２μｍフィ
ルターを使用して濾過滅菌した。

アッセイのためのＴｃ−標識配列番号３３９希釈液の調製
Ｔｃ−標識配列番号３３９の保存溶液（１１７μＣｉ／ｍｌ）を０．１％ＨＳＡ含有ｏ
ｐｔｉ−ＭＥＭＩで１：１００、１：５０、１：２５および１：１０で希釈すると、１．
１７、２．３４、４．６８および１１．７μＣｉ／ｍｌの最終濃度を有するＴｃ−標識配
列番号３３９の溶液が得られた。

Ｔｃ−標識配列番号３３９の結合を検出するためのアッセイ
細胞は、トランスフェクション２４時間後に使用し、アッセイのための細胞を調製する
ため、それらを１００μｌの室温の０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩで１回洗浄し
た。洗浄後、０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩをプレートから除き、７０μｌの１
．１７、２．３４、４．６８および１１．７μＣｉ／ｍｌのＴｃ−標識配列番号３３９（
上のように調製された）で置き換えた。各々の希釈液は偽およびＫＤＲトランスフェクト
細胞を含む３つの別々のウェルへ加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレート
を４℃に１５分間冷却し、１００μｌの冷結合緩衝液（０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−Ｍ
ＥＭＩ）で５回洗浄し、優しく吸い取って乾燥し、細胞損失を顕微鏡下で検査した。１０
０μｌの可溶化溶液（２％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、０．１％ＢＳＡ）
を各々のウェルへ加え、プレートを３７℃で１０分インキュベートした。各々のウェル中
の可溶化溶液をピペットで吸い上げたり吐き出したりすることにより混合し、そして１．
２ｍｌチューブへ移した。各々のウェルを１００μｌの可溶化溶液で１回洗浄し、洗液を
対応する１．２ｍｌチューブへ加えた。各々の１．２ｍｌチューブは、プログラム１２（
Ｔｃウィンドウで２０秒）を使用するＬＫＢガンマカウンターで計数されるべき１５．７
×１００ｃｍチューブへ移した。

ＫＤＲトランスフェクト細胞へのＴｃ−標識配列番号３３９の結合
ＫＤＲへ特異的に結合するＴｃ−標識配列番号３３９の能力を、一過性トランスフェク
ト２９３Ｈ細胞を使用して評価した。

図１４に示したように、Ｔｃ−標識配列番号３３９はＭｏｃｋトランスフェクト２９３
Ｈ細胞に比較してＫＤＲトランスフェクト細胞へ著しくよく結合した。ＫＤＲへの特異的
結合を計算するため、Ｔｃ−標識配列番号３３９ポリペプチドのＫＤＲトランスフェクト
細胞への結合から、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞への結合を差し引いた。Ｔｃ−標識配
列番号３３９の濃度を増加させるにつれて、ＫＤＲに対するＴｃ−標識配列番号３３９の
特異的結合における直線的増加が観察された（図２６）。Ｔｃ−標識配列番号３３９の濃
度は〜１００ｐＭのみであったので（アッセイにおいて試験された最も高い濃度でさえ、
１１．７μＣｉ／ｍｌ）、直線的結合は驚くことではなく、それは配列番号２７７のＫ_Ｄ
値である〜３−４ｎＭ（アビジンＨＲＰアッセイを使用して計算されたように）のはるか
下であり、そのため結合の飽和は予想されないであろう。

ペプチドおよび二量体ペプチド構築物の製造
以下の方法を、下記実施例（１１〜１５）に記載されている個々のペプチドおよび二量
体ペプチド製造のために使用した。

自動化ペプチド合成
ペプチド合成を、ＦａｓｔＭｏｃプロトコールを使用し、０．２５ミリモル規模でＡＢ
Ｉ−４３３Ａ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，フォスターシ
ティー，ＣＡ）で実施した。このプロトコール前活性化の各々のサイクルは、カートリッ
ジ中の１ミリモルの必要な乾燥Ｎ^α−Ｆｍｏｃ側鎖保護アミノ酸を、０．９ミリモルのＨ
ＢＴＵ、２ミリモルのＤＩＥＡ、および０．９ミリモルのＨＯＢｔのＤＭＦ−ＮＭＰ溶液
に溶解することにより達成した。ペプチドはＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ（Ｒｉｎｋアミド）
樹脂（樹脂置換０．２ミリモル／ｇ）上で組み立てた。カップリングは２１分実施した。
Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％ピペリジンＮＭＰ溶液で実施した。最後のサイクルの終わりに
、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、完全保護樹脂結合ペプチドを無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＨＯＢ
ｔ／ＮＭＰを使用してアセチル化した。

粗ペプチドの切断、側鎖保護および単離
樹脂からのペプチドの切断および側鎖の脱保護は、試薬Ｂを４．５時間使用して達成し
た。切断溶液を集め、そして樹脂を追加の試薬Ｂで洗浄した。合併した溶液は濃縮して乾
固した。回旋させながら、または撹拌しながらエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。
エーテルをデカントし、固形物を集めた。不純物および残った切断カクテル成分を除去す
るため、この操作を２〜３回繰り返した。

ジ−システインペプチドの環化
粗エーテル沈殿直鎖状ジ−システイン含有ペプチドは、水、水性アセトニトリル混合液
（０．１％ＴＦＡ）、水性ＤＭＳＯまたは１００％ＤＭＳＯに溶解し、アンモニア水、炭
酸アンモニウム水溶液、炭酸水素アンモニウム水溶液またはＤＩＥＡの添加による溶液ｐ
ＨのｐＨ７．５〜８．５への調整により環化した。混合物を空気中で１６〜４８時間撹拌
し、トリフルオロ酢酸水溶液でｐＨ２の酸性とし、そして次に水へのアセトニトリルの濃
度勾配を用いる分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。所望の物質を含んでいる分画をプール
し、精製ペプチドを凍結乾燥により単離した。

リンカーを含んでいるペプチドの製造
典型的な実験において、４００ｍｇのｉｖＤｄｅ−保護リジンを有する樹脂含有ペプチ
ドを１０％ヒドラジンＤＭＦ溶液（２×２０ｍｌ）で処理した。樹脂をＤＭＦ（２×２０
ｍｌ）およびＤＣＭ（１×２０ｍｌ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ）に再懸濁し
、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（０．４ミリモル）、ＨＯＢｔ（
０．４ミリモル）、ＤＩＣ（０．４ミリモル）およびＤＩＥＡ（０．８ミリモル）で、４
時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍｌ）およびＤＣＭ（１×
１０ｍｌ）で洗浄した。樹脂は次に、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ（２×１５ｍｌ）で各
々、１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−−８−アミノ−３，６−ジオキサオク
タン酸とカップリングさせ、Ｆｍｏｃ保護基の除去をもう一度繰り返した。

遊離アミノ基を含んでいる、得られた樹脂結合ペプチドは洗浄および乾燥し、試薬Ｂ（
２０ｍｌ）で４時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと
撹拌すると固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。固形物を無
水ＤＭＳＯに溶解し、ＤＩＥＡでｐＨを７．５に調整した。混合物を１６時間撹拌してジ
スルフィド環化を達成し、反応は分析用ＨＰＬＣでモニターした。環化完了後、反応混合
物を２５％アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相Ｃ１８カラムへ直接応用した。精製
は水へのアセトニトリルの（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）濃度勾配を使用して
達成した。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結
乾燥すると必要なペプチドを得た。

リンカーを含んでいるビオチニル化ペプチドの製造
典型的な実験において、４００ｍｇのｉｖＤｄｅ−保護リジンを有する樹脂含有ペプチ
ドを１０％ヒドラジンＤＭＦ溶液（２×２０ｍｌ）で処理した。樹脂をＤＭＦ（２×２０
ｍｌ）およびＤＣＭ（１×２０ｍｌ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ）に再懸濁し
、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（０．４ミリモル）、ＨＯＢｔ（
０．４ミリモル）、ＤＩＣ（０．４ミリモル）およびＤＩＥＡ（０．８ミリモル）で、４
時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍｌ）およびＤＣＭ（１×
１０ｍｌ）で洗浄した。樹脂は次に、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ（２×１５ｍｌ）で各
々、１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタ
ン酸とカップリングさせ、Ｆｍｏｃ保護基の除去をもう一度繰り返した。

遊離アミノ基を含んでいる、得られた樹脂結合ペプチドは、ビオチン−ＮＨＳエステル
（０．４ミリモル、５当量）およびＤＩＥＡ（０．４ミリモル、５当量）のＤＭＦ溶液中
、２時間処理した。樹脂は、前に記載したように洗浄し、そして乾燥した後、試薬Ｂ（２
０ｍｌ）で４時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと撹
拌すると固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。固形物を無水
ＤＭＳＯに溶解し、ＤＩＥＡでｐＨを７．５に調整した。混合物を４〜６時間撹拌してジ
スルフィド環化を達成し、それはＨＰＬＣでモニターした。環化完了後、反応混合物を２
５％アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相Ｃ１８カラムへ直接応用した。精製は水へ
のアセトニトリルの（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）濃度勾配を使用して達成し
た。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥す
ると必要なビオチニル化ペプチドを得た。

選択されたガドリニウムまたはインジウム同位元素で標識するためのＤＯＴＡ−コンジ
ュゲートペプチドの製造
典型的な実験において、４００ｍｇのＮ^ε−ｉｖＤｄｅ−保護リジン部分を有する樹脂
含有ペプチドを１０％ヒドラジンＤＭＦ溶液（２×２０ｍｌ）で処理した。樹脂をＤＭＦ
（２×２０ｍｌ）およびＤＣＭ（１×２０ｍｌ）で洗浄した。樹脂をＤＭＦ（１０ｍｌ）
に再懸濁し、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（０．４ミリモル）、
ＨＯＢｔ（０．４ミリモル）、ＤＩＣ（０．４ミリモル）およびＤＩＥＡ（０．８ミリモ
ル）で、４時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍｌ）およびＤ
ＣＭ（１×１０ｍｌ）で洗浄した。樹脂は次に、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ（２×１５
ｍｌ）で各々、１０分間処理した。樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ−−８−アミノ−３，６−ジ
オキサオクタン酸とカップリングさせ、Ｆｍｏｃ保護基の除去をもう一度繰り返した。遊
離アミノ基を含んでいる、得られた樹脂結合ペプチドをＤＭＦ（１０ｍＬ）に再懸濁し、
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸 １，４
，７−トリス−ｔ−ブチルエステル（ＤＯＴＡ−トリス−ｔ−ブチルエステル、０．４ミ
リモル、５当量）、ＨＯＢｔ（０．４ミリモル）、ＤＩＣ（０．４ミリモル）およびＤＩ
ＥＡ（０．８ミリモル）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液で、混合しながら４時間処理した。反
応が完了したら、樹脂をＤＭＦ（２×１０ｍｌ）およびＤＣＭ（１×１０ｍｌ）で洗浄し
、試薬Ｂ（２０ｍｌ）で４時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣を
エーテルと撹拌すると固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。
固形物を無水ＤＭＳＯに溶解し、ＤＩＥＡでｐＨを７．５に調整した。混合物を１６時間
撹拌してジスルフィド環化を達成し、それはＨＰＬＣでモニターした。環化完了後、反応
混合物を２５％アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相Ｃ−１８カラムへ直接応用した
。精製は水へのアセトニトリルの（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）濃度勾配を使
用して達成した。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め
、凍結乾燥すると必要なビオチニル化ペプチドを得た。

下記の表１１の単量体ペプチドは上の方法により製造され、本明細書で使用する場合、
「ＰｎＡＯ６」とは、３−（２−アミノ−３−（２−ヒドロキシイミノ−１，１−ジメチ
ル−プロピルアミノ）−プロピルアミノ）−３−メチル−ブタン−２−オン オキシムを
表している。

ホモ二量体およびへテロ構築物の製造
上記実施例８で述べた精製ペプチド単量体を種々のホモ二量体およびへテロ構築物の製
造に使用した。

ホモ二量体−含有構築物の製造
ホモ二量体化合物を製造するため、二量体の製造に必要とされるペプチドの半分をＤＭ
Ｆに溶解し、１０当量のグルタール酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで処
理した。反応の進行はＨＰＬＣ分析および質量分析法によりモニターした。反応完了時、
揮発分を真空下で除去し、未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去するため、残渣を酢酸エ
チルで洗浄した。残渣を乾燥し、無水ＤＭＦに再溶解して、２当量のＤＩＥＡ存在下、ペ
プチドの残りの半分で処理した。反応を２４時間進行させた。この混合物は直接ＹＭＣ逆
相ＨＰＬＣカラムへ応用し、水からアセトリトリル（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでい
る）への直線濃度勾配での溶出により精製した。

ヘテロ二量体−含有構築物の製造
ヘテロ二量体の場合、単量体の一つ（「Ａ」）をグルタール酸のビスＮＨＳエステル（
ホモ二量体化合物で説明したような）と反応させ、過剰のビスＮＨＳエステルを洗い流し
た後、ＤＩＥＡ存在下、第二の単量体（「Ｂ」）を加えた。反応後、混合物は分取ＨＰＬ
Ｃにより精製した。典型的には、グルタール酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエス
テル（０．０２ミリモル、１０当量）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ペプチド「Ａ」お
よびＤＩＥＡ（２当量）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液を加え、混合物を２時間撹拌した。
反応の進行はＨＰＬＣ分析および質量分析法によりモニターした。反応完了時、揮発分を
真空下で除去し、未反応のビス−ＮＨＳエステルを除去するため、残渣を酢酸エチル（３
×１．０ｍＬ）で洗浄した。残渣を乾燥し、無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に再溶解し、ペプ
チド「Ｂ」およびＤＩＥＡ（２当量）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液で２４時間処理した。
この混合物を水で希釈し（１：１、ｖ／ｖ）、直接ＹＭＣ逆相ＨＰＬＣカラムへ応用し、
水からアセトリトリル（両方とも０．１％ＴＦＡを含んでいる）への直線濃度勾配での溶
出により精製した。分画を分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を合
わせ、凍結乾燥すると必要な二量体を得た。図３６〜６３に示されている二量体がこの方
法で製造された（構造、名前、化合物参照番号は「図の簡単な説明」に記載されている）
。

二量体Ｄ５の製造のためには、個々のペプチドのカップリング反応後、５０μＬのヒド
ラジンを反応混合物に加え（リジンＮ^ε−アミノ基を露出するため）、溶液を２分撹拌し
た。反応混合物を水（１ｍＬ）で希釈し、ＴＦＡでｐＨを２に調整した。次にこれを上記
の方法により精製した。

二量体ペプチドのＨＰＬＣ分析データおよび質量スペクトルデータは、下記表１２に与
えられている。

ＨＰＬＣ分析システム
システムＡ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２５％Ｂ、直線濃度勾
配２５〜６０％Ｂ １０分で；流速：２．０ｍｌ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＢ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２５％Ｂ、直線濃度勾
配２５〜６０％Ｂ ２０分で；流速：２．０ｍｌ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＣ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、３０％Ｂ、直線濃度勾
配３０〜６０％Ｂ １０分で；流速：２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＤ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２０％Ｂ、直線濃度勾
配２０〜６０％Ｂ １０分で；流速：２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＥ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、１０％Ｂ、直
線濃度勾配１０〜６０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＦ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、３０％Ｂ、直
線濃度勾配３０〜７０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＧ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、３０％Ｂ、直
線濃度勾配３０〜７５％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＨ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２０％Ｂ、直
線濃度勾配２０〜５２％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＩ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、１０％Ｂ、直
線濃度勾配１０〜６５％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＪ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２０％Ｂ、直
線濃度勾配２０〜６０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＫ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、５％Ｂ、直線
濃度勾配５〜６０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＬ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、５％Ｂ、直線
濃度勾配５〜６５％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＭ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、１５％Ｂ、直
線濃度勾配１５〜５０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＮ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ、４．６×５０ｍｍ；溶出液：Ａ：
水（０．１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２０％Ｂ、直
線濃度勾配２０〜８０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ
。

システムＯ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−１８、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、３０％Ｂ、直線濃度勾
配３０〜６０％Ｂ １０分で；流速：２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＰ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−１８、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２０％Ｂ、直線濃度勾
配２０〜８０％Ｂ ２０分で；流速：２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＱ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−１８、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２０％Ｂ、直線濃度勾
配２０〜６０％Ｂ ６分で；流速：２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＲ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−１８、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、２５％Ｂ、直線濃度勾
配２５〜６０％Ｂ １０分で；流速：２．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

システムＳ：カラム：ＹＭＣ Ｃ−１８、４．６×２５０ｍｍ；溶出液：Ａ：水（０．
１％ＴＦＡ）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期条件、１０％Ｂ、直線濃度勾
配１０〜６０％Ｂ １０分で；流速：３．０ｍＬ／分；検出：ＵＶ＠２２０ｎｍ。

ＨＵＶＥＣおよびＫＤＲ−トランスフェクト細胞上のＫＤＲへの結合に対する^１２５Ｉ
−ＶＥＧＦとの競合
以下の実験で、トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞により発現されるＫＤＲへの結合
に対する、^１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦと競合するＫＤＲ結合ペプチドの能力を評価した。

プロトコール
２９３Ｈ細胞を、標準技術によりＫＤＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトするか、または
Ｍｏｃｋトランスフェクトした。細胞は、競合化合物存在下（１０μＭ、０．３μＭおよ
び０．０３μＭ）または不在下で、^１２５Ｉ−ＶＥＧＦとインキュベートした。細胞を洗
浄後、結合された放射活性をガンマカウンターで定量した。ＶＥＧＦ結合の阻害率は、式
［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ１］、式中、Ｙ１はペプチド不在下でのＫＤＲ−トランス
フェクト２９３細胞への特異的結合であり、およびＹ２はペプチド競合剤存在下でのＫＤ
Ｒ−トランスフェクト２９３細胞への特異的結合である、を使用して計算した。ＫＤＲ−
トランスフェクト２９３細胞への特異的結合は、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞へ
の結合からＭｏｃｋトランスフェクト細胞への結合を差し引くことにより計算した。

結果
図１５に示したように、アッセイしたすべてのＫＤＲ結合ペプチドが、ＫＤＲ−トラン
スフェクト細胞に対する結合において、^１２５Ｉ−ＶＥＧＦと競合した。ヘテロ二量体（
Ｄ１）が、２つのホモ二量体を超えて、^１２５Ｉ−ＶＥＧＦとの競合で明らかに最も有効
であり、Ｄ１の優れた結合性が確認された。

レセプター活性化アッセイ
ＫＤＲのＶＥＧＦ誘導活性化（リン酸化）を阻害するＫＤＲ結合ペプチドの能力を、以
下のアッセイを使用して評価した。

プロトコール
ほとんどコンフルエントなＨＵＶＥＣのディッシュを、血清または増殖因子を欠いた基
本培地に一夜おいた。下記群（ｃ）のディッシュは、ＫＤＲ結合ペプチドを含む基本培地
中で１５分前処理し、次に、群（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のディッシュの細胞を：
（ａ）添加物なし（陰性対照）、
（ｂ）５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ（陽性対照）、または
（ｃ）５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦに推定競合／阻害ペプチド
含んでいる新鮮な基本培地においた。５分の処理後、各々のディッシュの組から溶解物を
調製した。溶解物から免疫沈降されたＫＤＲは、抗ホスホチロシン抗体でリン酸化を、お
よび抗ＫＤＲ抗体で総ＫＤＲを（試料添加を調節するため）、免疫ブロッティングにより
連続的に分析した。

結果
図１６に示したように、Ｄ１は１０ｎＭで、ＨＵＶＥＣにおけるＫＤＲのＶＥＧＦ−誘
導リン酸化を完全に阻止できた。１ｎＭでは、リン酸化の半分以上がこの化合物により阻
害された。Ｄ１に含まれている２つの個々の結合部分から作製されている、ホモ二量体Ｄ
２およびＤ３は、１００ｎＭまでではリン酸化に何の影響も与えず、レセプター−リガン
ド相互作用の阻止におけるヘテロ二量体構築物の利点を示している。複数の実験において
、このアッセイにおけるＤ１のＩＣ_５０は、０．５から１ｎＭの間で変化した。非関連結
合配列を含んでいる、異なったヘテロ二量体、配列番号３０５および配列番号３０６のポ
リペプチドから成っている尾部−尾部ヘテロ二量体（図６４）は、その高い親和性（ＳＰ
ＲによりＫＤＲに対して１１ｎＭ）にもかかわらず、１００ｎＭでもリン酸化に効果がな
く、ＫＤＲへの結合に対してＶＥＧＦと競合するための多量体を構築する場合には、ＫＤ
Ｒ結合部分の選択が重要であることを示唆している。当業者は、本明細書に提供された結
合ポリペプチドおよびルーチンのスクリーニングアッセイを使用して、適したヘテロ多量
体を構築することができるであろう。

ＫＤＲに対するＤ１の親和性はＤ２の親和性よりも１０倍高いけれども（ＳＰＲ分析に
より）、活性化アッセイにおけるＤ１のＩＣ_５０は大きくても１００分の１以下である。
理論に縛られるのを望むわけではないが、このことは、１つの結合分子でＫＤＲ上の２つ
の独特なエピトープを標的化することは、ＫＤＲ上の１つのエピトープへのみ結合する、
類似の親和性を有する分子よりも大きな立体障害を発生できることを示唆しており、それ
故、ＶＥＧＦ誘導ＫＤＲ活性を阻害する能力を改良する。同様に、レセプター活性化アッ
セイにおいて単量体遊離ペプチド（配列番号２７７および配列番号３３７）として試験さ
れた場合、Ｄ１内の２つのＫＤＲ結合部分は、各々０．１および１マイクロモルのＩＣ_５
０を有していたことを指摘するべきである。単量体遊離ペプチドのＩＣ_５０は本アッセイ
においてＤ１に対するＩＣ_５０よりも１００から１０００倍高く、および単量体ペプチド
のフルオレセイン化誘導体に対するＫ_Ｄよりも１４から３０倍高かった。従って、弱いＶ
ＥＧＦ−阻止活性を有する２つのペプチドを含んでいる二量体を作製することにより、Ｄ
１の増加した結合親和性をはるかに超えた、非常に強力なＶＥＧＦ−阻止活性を有する分
子が生じた。

遊走アッセイ
以下の実験は、培養におけるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導遊走を阻止するＤ１の能力を評
価した。

プロトコール
血清−飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェル当たり１００，０００細胞で、ＢＤ マトリゲル−被
覆 ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェル挿入プレート（カタログ番号３５４１４１）の上
部チャンバー内に置いた。ＶＥＧＦ−阻止／阻害の可能性を有する化合物の存在下または
不在下、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）または血清（５％ＦＢＳ）のような異なった誘因物
質を含む、または何も含まない基本培地をウェルの下部チャンバーへ加えた。２２時間後
、蛍光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤／遊走細胞の蛍光を蛍光プレートリ
ーダーで測定することにより細胞遊走／浸潤の定量を達成した。ＶＥＧＦ−誘導遊走は、
ウェルの下部チャンバーに基本培地のみを置いた場合に起こった遊走を差し引くことによ
り計算した。

結果：
ＶＥＧＦは、本アッセイにおいて内皮細胞遊走を大きく増加させ、それはＤ１により強
く阻止された。５ｎＭ Ｄ１で、ＶＥＧＦ−刺激内皮細胞遊走は８４％阻止された（図１
７参照）。２５ｎＭ Ｄ１では、この遊走はほとんど完全に阻止された。別の実験で、既
知のＫＤＲ阻害剤、ＳＵ−１４９８（Ｓｔｒａｗｎ，Ｌ．ら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，５６：３５４０−３５４５）を本アッセイで試験した。３ミリモルのＳＵ−１
４９８は、Ｄ１のようにはＶＥＧＦ−誘導遊走を阻止しなかった（３ミリモルで４７％阻
止された）。Ｄ６（構造は下記実施例１８に示されている）ではまた、５０ｎＭで、ＶＥ
ＧＦにより刺激された遊走の本質的に完全な阻害を生じた。血清は、ＶＥＧＦの代わりに
使用した場合、本アッセイで非常に強力な誘因物質であったが、その効果は有意にＤ１に
より減らされず、Ｄ１はＶＥＧＦにより誘導された内皮細胞遊走を特異的に阻害すること
を示している。

標識化合物の製造
以下の実験は、Ｔｃ、ＩｎおよびＩ−標識化合物を製造するために使用した方法を説明
している。

^９９ｍＴＣ−３７８（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ^＊ＥＤＤＷＹＹＣ^＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（Ｐ
ｎＡＯ_６−ＮＨ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ_２）３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ）−ＮＨ_２；配列番号３７８
）の製造
ＳｎＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬのＨＣｌに溶解し、この溶液の１０μＬを
、１０ｍｇのＣａＮａ_２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ_２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解する
ことにより調製したＤＴＰＡ溶液１ｍＬへ加えた。スズＤＴＰＡ溶液のｐＨを、１Ｎ Ｎ
ａＯＨを使用してｐＨ６〜８に調整した。配列番号３７８（５０μｇを５０μＬのＤＭＦ
に溶解）を２０μＬの^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻（２．４から４ｍＣｉ，Ｓｙｎｃｏｒ）、続いて
、１００μＬのＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。室温で３０分後、放射化学純度（ＲＣＰ
）は９３％であった。生成物は、１ｇ／Ｌ酢酸アンモニウム含有水（Ａ）およびアセトニ
トリル（Ｂ）の水性／有機濃度勾配を使用し、０．５ｍＬ／分の流速で溶出した、Ｓｕｐ
ｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ，５μｍ孔径）で
精製した。以下の濃度勾配を使用した：３０．５％Ｂから３５％Ｂ、３０分で、傾斜をつ
けて１０分で７０％Ｂへ。２１．２分の保持時間で溶出された化合物を、１％アスコルビ
ン酸および０．１％ＨＳＡを含んでいる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）５００μ
Ｌに集め、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用してアセトニトリルを除去
した。精製後、化合物は＞９８％のＲＣＰを有していた。

^１１１Ｉｎ−Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＪＫ（ＪＪ−ＤＯＴＡ）−
ＮＨ_２（配列番号３３８）の製造
配列番号３３８（５０μｇを５０μＬの１０％ＤＭＦに溶解）を^１１１ＩｎＣｌ_３（５
０μＬ、４００μＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）および１００μＬの０．２Ｍ酢酸ア
ンモニウムまたはｐＨ５．３のクエン酸緩衝液と混合した。８５℃で４５分加熱した後、
ＨＰＬＣを使用して決定した放射化学純度（ＲＣＰ）は４４％から５２．２％の範囲であ
った。以下の条件下：水相、１ｇ／Ｌ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）；有機相、アセト
ニトリル、濃度勾配：３０分で２３％有機から２５％有機、２分で３０％有機に上昇させ
、１０分保持、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム（４．６×２５ｃｍ、５ミクロン孔径）を使用
して非標識リガンドから^１１１Ｉｎ−標識化合物を分離した。２０．８分の保持時間で溶
出された化合物を、１％アスコルビン酸および０．１％ＨＳＡを含んでいる５０ｍＭクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．２）２００μＬに集め、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ
）を使用してアセトニトリルを除去した。精製後、化合物は＞９３％のＲＣＰを有してい
た。

^１１１Ｉｎ−Ｄ４の製造
ヒスチジン緩衝液は、０．１Ｍヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）溶液を濃水酸化アンモニウム
でｐＨ６．２５に調整することにより準備した。酢酸アンモニウム緩衝液は、０．２Ｍ酢
酸アンモニウム（９９．９９％，Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に濃ＨＣｌ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ
，Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ）を加えてｐＨ５．５に調整することにより準備した。高純度^１
１１ＩｎＣｌ_３（１００μＬ、１．２ｍＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、ヘーゼルウッ
ド、ＭＯ）をＤ４（２００μｇを２００μＬの５０％ＤＭＦ、１０％ＤＭＳＯ、２０％ア
セトニトリルおよび２０％水に溶解）、続いて３００μＬのヒスチジン緩衝液を加えた。
最終ｐＨは５．５であった。８５℃で４５分の反応混合物のインキュベーション後、ＲＣ
Ｐは２０％であった。

もしくは、商業的に入手可能なＯｃｔｅｏＳｃａｎ^ＴＭキット（１３４μＬ、０．６ｍ
Ｃｉ，Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）として提供された^１１１ＩｎＣｌ_３を１６２μＬの０
．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解したＤ４（１３５μｇ）へ加えた。最終ｐＨは５．
５であった。８５℃で４５分の反応混合物のインキュベーション後、ＲＣＰは２０％であ
った。

^１２５Ｉ−Ｄ５の製造
前もってジイソプロピルアミンを使用してｐＨ８．５〜９．０へ調整されているＤＭＦ
溶液３０μＬへ溶解させたＤ５（２００μｇ）を、蒸発乾固させた１ｍＣｉの一ヨウ化^１
２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（ＮＥＸ−１２０，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
）へ加えた。バイアルを振盪し、次に時々振盪しながら、氷上で３０分インキュベートし
た。この時間後、ＲＣＰは２３％であった。^１２５Ｉ−Ｄ５は、下記の条件下でＶｙｄａ
ｃ Ｃ１８カラム（４．６×２５ｃｍ、５ミクロン孔径）を使用し、１ｍＬ／分の流速で
のＨＰＬＣにより精製した。水相：０．１％ＴＦＡ含有水；有機相：０．０８５％ＴＦＡ
含有アセトニトリル。濃度勾配：３０分で３０％有機から３６％有機へ、５分で６０％有
機まで上昇、５分間保持。化合物を、１％アスコルビン酸および０．１％ＨＳＡを含んで
いる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）２００μＬに集めた。アセトニトリルはＳｐ
ｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去した。得られた化合物は＞９７％
のＲＣＰを有していた（図６５）。

ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合
ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へ結合する^１２５Ｉ−標識Ｄ５の能力を試験す
る実験を実施した。この実験においては、異なった量の^１２５Ｉ−標識Ｄ５（１〜４μＣ
ｌ／ｍｌ、^１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識し、ＨＰＬＣで精製）を、
偽およびＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と、９６ウェルプレート中、室温で１時
間インキュベートした。ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に対する血清効果を評価
するため、結合は４０％マウス血清と、または無しで実施した。非結合化合物を洗い流し
た後、各々のウェル中の細胞を０．５Ｎ ＮａＯＨで溶解し、溶解物をガンマカウンター
で計数した。

この実験の結果が図１８および図１９に要約されている。^１２５Ｉ−標識Ｄ５はＫＤＲ
−トランスフェクト細胞へ特異的に結合でき、その結合は４０％マウス血清存在下でも影
響されない。ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への幾分より強い結合が、４０％マウス血清
存在下での結合に比較して、血清不在下で観察された。しかしながら、Ｍｏｃｋトランス
フェクト細胞への^１２５Ｉ−標識Ｄ５の結合も、アッセイ間に血清を削除した場合に同じ
程度増加しており、血清不在下での結合の増加は非特異的であることを示している（図１
８）。ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への特異的結合（Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞へ
の結合を差し引いた後）は、マウス血清の有無に関係なくほとんど同一に見える（図１９
に示したように）。この実験において、総ＣＰＭの１０〜１４％がＫＤＲ−トランスフェ
クト細胞へ特異的に結合された（データは示されていない）。

ＫＤＲ−Ｆｃへのヘテロ二量体結合のＢｉａｃｏｒｅ分析および親和定数
配列番号２７７および配列番号２９４から構成されたヘテロ二量体（図６６）は、グル
タル酸ビスＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用して、実施例１２に記載した
ように製造した。以下のように、このヘテロ二量体について、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して
ＫＤＲ−Ｆｃへの結合を試験し、および親和定数を決定した。

３つの密度のＫＤＲ−Ｆｃを、標準アミンカップリング法により、ＣＭ５センサーチッ
プのデキストラン表面に架橋した（０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．
０、で１：１００または１：５０に希釈）。対照減算として働かせるため、フローセル１
を活性化し、次にブロックした。達成された最終固定化レベル：
Ｒ_ＬＦｃ２ＫＤＲ−Ｆｃ＝１６０７
Ｒ_ＬＦｃ３ＫＤＲ−Ｆｃ＝３００１
Ｒ_ＬＦｃ４ＫＤＲ−Ｆｃ＝６３１９。

実験はＰＢＳ（５．５ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．６５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．００
５％Ｐ−２０（ｖ／ｖ））中で実施した。Ｄ６はＰＢＳで２５０ｎＭに希釈し、１２５、
６２．５、３１．３、１５．６、７．８および３．９ｎＭ溶液を生じるように一連の希釈
を行った。すべての試料を２重に注射した。会合のため、ペプチドを、ｋｉｎｊｅｃｔプ
ログラムを使用して、２０μＬ／分で１２．５分注射した。１０分の解離に続いて、残存
するペプチドを、７５μＬ／分で１２秒の５０ｍＭ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌの急速注
射により、ＫＤＲ表面から剥がした。センサーグラムは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソ
フトウェア３．１およびＳｉｇｍａＰｌｏｔ６．０の双曲線二重矩形回帰方程式を使用し
て分析した。ヘテロ二量体定常状態結合親和性（ＫＤＡＶ）を、３つすべてのＫＤＲ固定
化密度で決定した（表１４）。

このデータから、より高い固定化濃度において、ヘテロ二量体はナノモル以下の親和性（
〜０．６ｎＭ）でＫＤＲを結合する。
このペプチドヘテロ二量体のインビボクリアランスを評価するため、少量の物質を、標
準プロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って、ヨードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）およびＮａ^１
２５Ｉを使用してヨード化した。ヨードゲン試薬で被覆した一つのチューブを、１ｍＬの
２５ｍＭトリス、０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で前もって湿らせた。この液を廃棄し
、１００μＬの同一の緩衝液を加えた。ハミルトンシリンジを使用し、１１μＬの^１２５
Ｉ−ＮａＩを反応チューブへ移した。１４３．５５５ｍＣｉ／ｍｌであるＮａ^１２５Ｉ濃
度の原見積もりに基づくと、１１μＬは約１．５ｍＣｉを含んでいなければならない。添
加後、試料を回旋させ、６分インキュベートするためにリードピッグにセットし、３０秒
ごとに回旋させた。６分後、全試料を、エッペンドルフチューブに加えてあるタンパク質
へ移した。試料を回旋させ、８分インキュベートするためにセットし、３０秒ごとに回旋
させた。８分後、チロシン（１０ｍｇ／ｍＬ、飽和溶液）で反応をクエンチ（停止）させ
、５分間そのままにし、次に２μＬを標準物質のために取り除いた。

精製のため、Ｄ−塩ポリアクリルアミド１８００の１０ｍＬカラムを使用して、標識チ
ロシンから標識ペプチドを分離した。カラムは、非特異的部位をブロックするため、最初
に１０ｍＬの食塩水、次に２．５％ＨＳＡを含む５ｍＬの２５ｍＭトリス、０．４Ｍ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７．５、で洗浄した。ＨＳＡ緩衝液での洗浄後、カラムを６０ｍＬの２５ｍ
Ｍトリス、０．４Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で溶出し、そしてカラムを一夜４℃で保存した。標
識試料は、線量標準物質により決定したところ、１．３５５ｍＣｉを含んでいた。標準物
質として取り除かれた２μＬの試料は、８．８μＣｉを含んでいた。ペプチド試料をＤ−
塩１８００カラムへ応用し、トリス／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、で溶出した。分画番
号１〜１４の各々には０．５ｍＬ、そして分画２５〜４３には１．０ｍＬになるように流
量を調節した。図２０は活性に対する分画番号の溶出プロフィールを示している。分画９
、１０および１１での活性のピークは、ペプチドであると推定された。２４から〜４０の
放射活性は、標識されたチロシンであるようである。この精製から、分画番号９〜１２を
一緒にプールし、続いてのクリアランス研究に使用した（プール中の^１２５Ｉ−Ｄ６濃度
は７．０２３μｇ／ｍｌであり、１００μＬ＝０．７０２μｇで８．６μＣｉを有する）
。

総計で１５匹のマウスに１００μＬの^１２５Ｉ−Ｄ６を注射し、マウス（３匹の組）を
以下の時点で殺した：０、７、１５、３０、９０分。注射後、２μＣｉ以上がシリンジ中
に残っていることが観察され、従って、注射された実際の活性は約６μＣｉであった。６
μＣｉの注射で、投与された対応するタンパク質は動物当たり〜０．５μｇであった。殺
したら、各々の動物からの血漿試料５０μＬ中の計数値を決定した。各々の時点での、３
匹の動物の各々の組について、計数値を平均し、％注射された線量／ｍｌ血漿（ＩＤ％／
ｍＬ）へ変換し、次に、クリアランス速度を評価するためにプロットした（図２０）。こ
のデータは、この分子の二相性半減期を決定するため、４かまたは５パラメーター方程式
にフィットさせた。４パラメーターフィットは、２．５５分のＴ_１／２αおよび６４．６
６分のＴ_１／２βの結果を生じた。５パラメーターフィットは、２．１３分のＴ_１／２α
および２３．２６分のＴ_１／２βの結果を生じた。

より多量の血漿も、０、３０および９０分時点で殺したマウスから採取した。これらの
試料は、ペプチドと血清タンパク質との会合を評価するため、放射活性検出器と組み合わ
せたＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ注入した（図２１）。示
されているように、標識ペプチドは実際により高分子量のタンパク質と会合しており、ペ
プチドの二相性半減期クリアランス挙動を説明できる。

抗血管新生阻害剤としてのペプチドの有効性評価を助けるため、Ｄ６を、ＨＵＶＥＣを
使用する内皮細胞増殖アッセイおよびＢｒｄＵ検出で試験した。簡単には、新しく単離さ
れたＨＵＶＥＣ（ｐ３〜６の間）をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％抗生物質＋１％Ｌ−グ
ルタミン＋０．４％ＢＢＥ（ウシ脳抽出物）で培養し、ウェル当たり、５０００〜１００
００／ウェルで１００μＬ蒔いた。細胞は、使用に先立って２４時間回復させた。これら
の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｌ−グルタミンに溶解し
た抗ＶＥＧＦ抗体（陽性対照）またはペプチドＡ、ＢおよびＣ（０．１および１０μｇ／
ｍｌ）で、４８時間処理した。以下の６つの変化させた条件下、２シリーズ（ｎ＝４）で
試験した：
シリーズＩ： ｗ／ｏＶＥＧＦ
シリーズＩＩ： ｗ／ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）
１． 標準培地：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％抗生物質＋１％Ｌ−グルタミン＋０
．４％ＢＢＥ
２． 陰性対照１：ＲＰＭＩ（真の飢餓）
３． 陰性対照２：ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｌ−グルタミン
４． 陽性対照：抗ＶＥＧＦ１０μｇ／ｍｌ含有ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｌ
−グルタミン
５． ０．１μｇ／ｍｌＫＤＲペプチド含有ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｌ−グ
ルタミン
６． １０μｇ／ｍｌＫＤＲペプチド含有ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｌ−グル
タミン。

プロトコール：
１） 種々の条件下で４８時間細胞をインキュベート
２） ２４時間目に１０μＬのＢｒｄＵ希釈液（ＥＢＭで１：１００に）を加える
３） さらに２４時間インキュベート
４） 培養培地を吸引
５） 各々のウェルに１００μＬのＦｉｘＤｅｎａｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，インディアナポリス，ＩＮ）を加え、室温で３０分インキュベート
６） ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を廃棄
７） 各々のウェルに１００μＬの抗体溶液（ＰＢＳ １％ＢＳＡおよび抗ＢｒｄＵ Ｐ
Ｏ）を加え
８） 室温で９０分インキュベート
９） ＰＢＳで３回洗浄、２００μＬ／ウェル、５分
１０） 基質溶液（ＴＭＢ）を加え、１０〜３０分インキュベート
１１） すべてを可動性プレートへ移す
１２） ２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えることにより反応を停止、２５μＬ／ウェル
１３） 反応を停止して５分以内に４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。
バックグラウンド結合は、対照細胞（完全培地で培養；ＥＢＭ＋ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｃ
ｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）を含む４つのウェルで
抗ＢｒｄＵを削除することにより、およびＢｒｄＵへ暴露されなかった細胞の完全標識化
により、決定した。

図２２に示されているように、試験された２つのＫＤＲ結合ペプチド（Ｄ６および配列
番号２７７）の内、Ｄ６は抗ＶＥＧＦ抗体（陽性対照）と同様に、ＶＥＧＦ存在下、１０
μｇ／ｍｌでＨＵＶＥＣ増殖を完全に阻害した。一方、配列番号２７７（ヘテロ二量体を
作り上げているペプチドの１つ）は、試験された最も高い濃度（１０μｇ／ｍｌ）におい
ても、このアッセイにおいて増殖を阻害しなかった。結果として、ヘテロ二量体は、配列
番号２７７単独と比較して、ＶＥＧＦと競合する、増強された能力を示している。

Ｂｉａｃｏｒｅ分析−ペプチド二量体Ｄ１およびＤ７のマウスＫＤＲ−Ｆｃ結合
Ｂｉａｃｏｒｅを使用し、ペプチド二量体Ｄ１（配列番号２７７および配列番号２９４
のヘテロ二量体）およびＤ７（配列番号２６４および配列番号２９４のヘテロ二量体；図
６７参照）のマウスＫＤＲ−Ｆｃに対する結合定数を決定した。

方法
３つの密度の組換えマウスＫＤＲ−Ｆｃを、標準アミンカップリング法により、ＣＭ５
センサーチップのデキストラン表面に架橋した（０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を、５０ｍＭ酢酸
塩、ｐＨ６．０、で１：１００または１：５０に希釈）。対照減算として働かせるため、
フローセル１を活性化し、次にブロックした。達成された最終固定化レベル：
Ｒ_ＬＦｃ２ＫＤＲ−Ｆｃ＝２７７０
Ｒ_ＬＦｃ３ＫＤＲ−Ｆｃ＝５０８５
Ｒ_ＬＦｃ４ＫＤＲ−Ｆｃ＝９２６５。

実験はＰＢＳ（５．５ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．６５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．００
５％Ｐ−２０（ｖ／ｖ））中で実施した。対照として行った配列番号２７７はＰＢＳで１
２５ｎＭに希釈し、６２．５、３１．３、１５．６、７．８および３．９ｎＭ溶液を生じ
るように一連の希釈を行った。Ｄ１およびＤ６はＰＢＳで５０ｎＭに希釈し、２５、１２
．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８および０．３９ｎＭ溶液を生じるように
一連の希釈を行った。すべての試料を２重に注射した。会合のため、ペプチドを、ｋｉｎ
ｊｅｃｔプログラムを使用して、３０μＬ／分で３分注射した。１０分の解離に続いて、
残存するペプチドを、７５μＬ／分で１２秒の５０ｍＭ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌの急
速注射により、ＫＤＲ表面から剥がした。

センサーグラムは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１の同時ｋ_ａ／ｋ_ｄ
フィッティングプログラムを使用して分析した。結果は表１５および図２３〜２５に示さ
れている。センサーチップ上のレセプター密度が半分に減少していた場合においてさえも
、両方のヘテロ二量体でほとんど同じＫ_Ｄ２定数が達成されたという事実は、レセプター
との架橋型結合よりもむしろ、個々のレセプターへのヘテロ二量体の多量体型結合と一致
している。

腫瘍増殖のインビボ阻害
インビボ異種移植片腫瘍モデルを使用して、ＳＷ−４８０ヒト結腸癌に対して抗血管新
生活性を有していると疑われた試験物（Ｔｅｓｔ Ａｒｔｉｃｌｅ）（結合ペプチド、Ｄ
６）の３つの濃度の有効性を決定するための方法を提供する条件が説明されている。

無胸腺マウスは、同種および異種細胞の増殖を受容可能な宿主である。ヌードマウスは
Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｓ（Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＦＤＡ １９９３）、で必要とされている。

Ｄ６は抗血管新生活性を有していると疑われる合成ヘテロ二量体ペプチドである。この
ペプチドは、高い親和性でヒトＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）へ結合し、ＶＥＧＦ結合
と競合する。

ＳＷ−４８０ヒト結腸癌細胞
結腸癌、ＳＷ−４８０細胞（ＡＴＣＣ）は、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必
須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、２５０ｍｇ／ｍＬフンギゾンおよび１０％
熱不活性化ウシ胎児血清を補給した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９５
％空気および５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養した。

指数増殖期の細胞を採取し、トリプシンまたは血清の痕跡を除去するため、リン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。注射のために、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ
Ｓ）に懸濁した。

滅菌リン酸緩衝食塩水（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を、ｃＧＭＰ規制に従って製造し
、適合性を確認するため細胞培養試験を行った；７．３〜７．７のｐＨおよび２７１〜２
８７ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有している。ＰＢＳは試験物を再構成するための
、および媒体調節注射のための媒体であった。

シスプラチン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ
，Ｉｎｃ．；ロサンジェルス，ＣＡ）は、製造業者の仕様書に従って製造した。シスプラ
チンは、ＢＬ２ ＢｉｏＣｈｅｍ保護フードを使用して無菌様式で製造した。

試験システム
Ａ． 種／株：ハツカネズミ、Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲマウス（ヌードマウス）
Ｂ． 性：メス
Ｃ． 齢：処理の開始で６〜８週
Ｄ． 体重範囲：体重要求性なし
Ｅ． 供給源：動物はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＧｎｏ
ｔｔｏｂｉｏｔｉｃ部門、ウィルミントン，ＭＡ、から受け取った
Ｆ． 数：総計で１１５匹の動物を受け取り、そしてこの研究のために注射し、研究では
９０匹のマウスが使用された。
Ｇ． 同定の方法：
マウスは耳タグシステムを使用してただ一つのみの番号付けを行った。さらに、ケージ
はケージカードを記して、群番号、動物番号、研究番号およびＩＡＣＵＣプロトコール番
号を最小限に同定した。
Ｈ． 無作為化：
マイクロソフトＥｘｃｅｌ９７ ＳＲ−１プログラムを使用して、動物を処理群に無作
為に帰属させた。
Ｉ． 動物の人道的世話：
動物の処理および世話は、ＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ（９ＣＦ
Ｒ，１，２および３巻）およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ
ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、を遵守している、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ
ｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの標準作業法に従った。

この研究プロトコールは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔ
ｔｅｅ（ＩＡＣＵＣプロトコール番号：Ｐ０７１８２００１Ｉ）で保証されている。

動物の世話
Ａ． 食餌および飲料水：
マウスにはガンマ線照射齧歯動物用固形飼料をアドリブで給餌した。水道水を滅菌し、
ボトルおよびシッパーチューブ経由で、アドリブで供給した。
Ｂ． 動物環境：
動物は、群分けし、半剛体隔離装置に収容した。マウスは５から１０匹の動物を含んで
いる平底ケージに収容した。ケージはガンマ線照射した接触床敷きを含んでいた。各々の
ケージ中のマウス数は、マウスの挙動により変化させてもよく、変更は隔離調査記録に記
録した。ハウジングはＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，ワシントン，Ｄ．Ｃ．，１９９６、およびすべての続いての改訂に示されている勧告
に従っている。

環境調節は、３０〜７０の相対湿度で、温度を１６〜２６℃（７０±８°Ｆ）を維持す
るように調節した。１２：１２時間の明：暗サイクルを維持した。
Ｃ． 順化：
動物を受け取ったら、研究開始に先だって２４時間、実験室環境に順化させた。疾患の
徴候、異常な食物および／または水の消費、またはその他の不十分な条件の一般的徴候に
ついてマウスを観察した。動物受け取りの時点で、動物を臨床的に観察し、健康であると
思われた。

実験設計
Ａ． 一般的説明：
６〜８週齢のメス無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲ）をこの研究で
使用した。総計で１１５匹のマウスに、５×１０^６ ＳＷ−４８０ヒト結腸癌細胞を皮下
で、右胸側面へ注射した。腫瘍が、約１５０±７５ｍｇの標的ウインドサイズに達した時
、９０匹の腫瘍−所有マウスを無作為に選択し、９つの群の１つへ分配した。試験物およ
び媒体は腹腔内（ＩＰ）に投与し、シスプラチンは静脈内（ＩＶ）へ投与した。手に持っ
たカリパスを使用する腫瘍測定を、週に２回記録した。マウスは毒性および病的状態の徴
候について毎日モニターした。研究終了時、動物を過剰量の二酸化炭素で安楽死させ、組
織収集のために剖検した。
Ｂ． 群帰属：
総計で９群をこの研究で使用した。各々の群は１０匹の腫瘍−所有マウスを含んでいた
。群１および２は各々、非処置および媒体処置の陰性対照マウスを含んでいた。群３、４
および５は、Ｄ６抗血管新生ペプチドの３つの異なった濃度の１つを受けたマウスを含ん
でいた。群９は、陽性対照として、標準化学療法化合物であるシスプラチンを受けたマウ
スを含んでいた。
Ｃ． 投与量レベルおよび投与計画：
各々の群に対する投与量レベルが表１６に提供されている。投与は、動物を無作為に群
に選別した日と同じ日に始めた（研究日７）。各々の動物のため、各々の投与量を、無菌
技術を使用して投与量バイアルから取り、注射部位を、投与量の投与に先だってアルコー
ル綿棒で拭いた。投与量は、各々のマウスのための１ｍＬ注射器および２７ゲージ×１／
２”ニードルで投与した。

試験物処置および媒体処置マウスには、１５日の間、毎日腹腔内（ＩＰ）注射を行った
。シスプラチンは１仕事日おきに、総計で５回、静脈内経路で投与した。

Ｄ． 動物の臨床観察：
各々の動物の臨床観察は、毒性、病的状態および死亡率について、少なくとも１日１度
実施し、記録した。病的状態には、痩せ、脱水、嗜眠、背を曲げた姿勢、ぼさぼさの外観
、呼吸困難、および尿または糞着色のごとき病気の徴候を含むが、これらに限定されるわ
けではない。
Ｅ． 腫瘍測定：
プロトコールに従い、較正されたカリパスで腫瘍の長さおよび幅を測定することにより
、研究を通して週に２回腫瘍測定を行った。測定は最低限３〜４日離して行ったが、ただ
し、動物を安楽死させた場合は測定を行った；このことで、時には３日未満の間隔を生じ
ることがあった。腫瘍重量は、以下の式：ｍｇ＝（Ｌ×Ｗ^２）／２、を使用して計算した
。平均腫瘍重量が、２回連続の測定で群当たり≧１０００ｍｇであるか、または腫瘍が潰
瘍化し、歩き回るまたは食物および水を摂取する動物の能力を害するような場合、動物を
安楽死させた。
Ｆ． 臨時の安楽死および予定外の死：
１． 臨時の安楽死：
研究の間、臨時の安楽死を必要とする動物はいなかった。
２． 予定外の死：
研究の間、動物は死亡しなかった。
Ｇ． 剖検：
１． 安楽死および剖検注文：
群１、２、３、４および５のすべてのマウス（総計５０）は、群内で、２回連続して腫
瘍が≧１０００ｍｇ以上の群平均標的サイズに達した場合に剖検を寄託した。動物は剖検
のためＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｏｎ
ｉｔｏｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＨＭ），ウィルミントン，ＭＡ、へ寄託した。
試験物処置群で平均腫瘍サイズが≧１０００ｍｇであったので、試験物の容認された全２
８日処置計画より短いが、すべての動物は研究日２２に安楽死させた。すべての動物は、
二酸化炭素（ＣＯ_２）吸入により、人道にかなって安楽死させた。
２． 組織採集：
腫瘍は、取り巻く組織およびかぶっている皮膚を含まないように切り裂いた。さらに腎
臓を採集した。腎表面に何ら異常は認められなかった。

各動物について腫瘍および腎臓の凍結ブロックを作製した。組織の代表的切片（腫瘍、
腎臓）をとった。腎臓切片は皮質および髄質を含んでいた。組織切片はラベルを付けたプ
ラスチック−凍結用成型物の底に置いた。組織はＯＣＴ培地で包理した。ブロックは、ド
ライアイスで冷却したイソペンタン内に凍結するまで浸けた。ブロックの質を簡単に検査
し、ドライアイス上に保存した。

ブロックに、動物番号および組織に対応する文字コード（Ａ＝左腎臓；Ｂ＝右腎臓；Ｃ
＝腫瘤）を記したラベルを付けた。１匹の動物からのブロックを、ラベルを付けた袋に入
れた。

結果
Ａ． 生存中の測定および観察：
１． 臨床観察、病的状態および死亡率の要約：
すべての動物は健康に思われ、研究を通して正常限界内であった。Ｄ６はこの研究で使
用された投与量では毒性の徴候を示さなかった。

動物は研究日２２に安楽死させた。群１〜８では平均腫瘍サイズが≧１０００ｍｇであ
ったので、群９のマウスを除いたすべてのマウスを、試験物投与を完了する前に安楽死さ
せた。シスプラチン処置動物は研究日２２に安楽死させたが、その時、平均腫瘍重量は９
９６ｍｇであった。研究期間中に死亡した動物はいなかった。
２． 腫瘤触診要約：
研究を通して、触診できる腫瘤がすべてのマウスで検出され、腫瘍は研究の継続期間の
間、段々に成長した。予期されるように、非処置および媒体処置陰性対照マウス（群１お
よび２）中の腫瘍は最も速く成長し、研究日２０に、またはその前に１０００ｍｇの平均
腫瘍サイズに到達した。加えて、シスプラチンで処置した動物（群９）も腫瘍を発育させ
たが、その成長は最も遅く、研究終了時（日２２）で９９６ｍｇの平均腫瘍サイズに達し
た。

一般に、群３のマウスを除き、試験物で処置したすべての動物で、腫瘍成長がより遅か
った（図６８）。低用量（０．０５ｍｇ／ｋｇ）のＤ６で処置した、群３の動物は、群１
および２の非処置および媒体処置動物とほとんど同じ速度で成長した腫瘍を有していた。
より高い用量（群４および５）のＤ６で処置した動物は、より遅く成長した腫瘍を有して
いた；研究日２１に１０００ｍｇの平均腫瘍サイズに達する。対照群１および２のマウス
と比較した場合、試験物処理は、約１日の腫瘍成長の遅延を生じた。
Ｂ． 結論：
対照群１および２および陽性対照群９の、腫瘍所有マウスが予期されるように応答した
ので、この研究のデータから使用したモデルが妥当であることを確認できる。

研究を通して、触診できる腫瘤がすべての群で観察された。加えて、すべての動物は研
究を通して健康でありおよび正常限界内であった。さらに、Ｄ６は動物に悪い影響を与え
なかった。それ故、これらのデータは、Ｄ６試験物で処置した動物がゆっくりと成長する
（２２日の試験期間の終わりまでで対照より約１日遅い）腫瘍を有していたことを示唆す
るであろう。また、試験物は有意の毒性効果を示さなかったので、試験物のより高い濃度
も、より良好な腫瘍緩解の可能性を持って使用できる。

インビトロ細胞増殖アッセイ
微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ，Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ポートランド，
ＯＲ）をＤ６および関連類似体のＶＥＧＦ−刺激増殖阻害能力を評価するために使用した
。ＭＶＥＣ（継代２）を９０％コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理し、４．８
×１０^３細胞／ウェルの密度で、ゼラチン被覆９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔
いた。蒔いて１６から２０時間後、ウシ胎児血清は全くないが、０．１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含んでいる培地で１回洗浄した（２００μＬ／ウェル）。各々のウェル
へ新鮮なＢＳＡ含有培地を加え、さらに２４時間インキュベートした。この２４時間の飢
餓期間後、Ｄ６を含む、または含まない新鮮なＢＳＡ含有培地（２５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧ
Ｆを含んでいる）を加え、細胞をさらに３７℃で４８時間インキュベートした。このアッ
セイにおける用量応答を評価するため、複数のＤ６濃度を２重のウェルで試験した。培地
を除去し、ＢｒｄＵを含む、または含まない新鮮なＢＳＡ含有培地を加え、製造業者によ
り説明されているように取り込みのレベルを正確に決定するのに先立って、さらに２４時
間インキュベートした。結果は図８４に示されている。

以下の実験は、培養におけるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ−誘導遊走を阻止するＤ２５および
Ｄ２７の能力を評価し、加えられたグリコシル化および／またはＤ２７で使用された特有
のスペーサー構造がその有効性を促進することを示している。

プロトコール：血清−飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェル当たり１００，０００細胞で、ＢＤ
フィブロネクチン−被覆 ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェル挿入プレートの上部チャン
バー内に置いた。Ｄ２５またはＤ２７の存在下または不在下、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ
）を含む、または含まない基本培地をウェルの下部チャンバーへ加えた。２２時間後、蛍
光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤／遊走細胞の蛍光を蛍光プレートリーダ
ーで測定することにより細胞遊走／浸潤の定量を達成した。ウェルの下部チャンバーに基
本培地のみを置いた場合に起こった遊走量を差し引くことにより、各々の実験条件のＶＥ
ＧＦ−誘導遊走を計算した。

結果：ＶＥＧＦは、本アッセイにおいて内皮細胞遊走を大きく増加させ、それはＤ２５
およびＤ２７の両方で強く阻止された（図６９）。Ｄ２７はＤ２５より１０倍強力であり
（各々、ＩＣ_５０ ０．５ｎＭおよび５ｎＭ）、Ｄ２７のグリコシル化および／またはそ
の特有のスペーサー特性が、ＫＤＲへ結合するおよびＶＥＧＦの効果を阻止する、その能
力を促進したことを示している。

以下の実験は、Ｄ６により生じる培養におけるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ−誘導遊走阻止を
促進する、ＴＫＰＰＲペプチドの「添加物（Ａｄｊｕｎｃｔ）Ａ」多量体構築物（配列番
号５０３；ＫＤＲにより媒介されるＶＥＧＦの効果を促進するＶＥＧＦレセプター、ＮＰ
−１に結合）の能力を評価した。添加物Ａ＝５ＣＦ−ＧＬＹ−Ｎ｛［ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（＝
Ｏ）−Ｇｌｙ−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−Ａｄｏａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ＯＨ）_２］_２ 式中、Ａｄｏａ＝３，６−ジオキサ−８−アミノオクタノイ
ル，５ＣＦ＝５−カルボキシフルオレセイニル。

プロトコール：血清−飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェル当たり１００，０００細胞で、ＢＤ
フィブロネクチン−被覆 ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェル挿入プレートの上部チャン
バー内に置いた。濃度を変化させたＤ６、または一定の１００ｎＭ 添加物Ａ（ＷＯ ０
１／９１８０５ Ａ２に記載されているように合成）と組み合わせた、濃度を変化させた
Ｄ６、の存在下または不在下、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む、または含まない基本
培地をウェルの下部チャンバーへ加えた。２２時間後、蛍光色素で挿入プレート内の細胞
を後標識し、浸潤／遊走細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することにより細胞遊
走／浸潤の定量を達成した。ＶＥＧＦ不在下で観察された遊走量を差し引くことにより、
各々の実験条件のＶＥＧＦ−誘導遊走を計算した。

結果：ＶＥＧＦは、本アッセイにおいて内皮細胞遊走を大きく増加させ、それはＤ６に
より強く阻止されたが（ＩＣ_５０ 約１２．５ｎＭ）、１００ｎＭ 添加物Ａ単独では阻
止されなかった（図７０）。しかしながら驚くことに、添加物ＡをＤ６と同時にアッセイ
で使用した場合、Ｄ６の有効性を約１０倍促進することができた（ＩＣ_５０ 約２．５ｎ
Ｍ）。このことは、添加物Ａに見られるＴＫＰＰＲ配列（または類似物）を含んでいる化
合物は、ＫＤＲへの結合に対してＶＥＧＦと競合するＤ６のごとき特定の化合物の有効性
を促進するために使用できることを示している。加えて、１つまたはそれより多い繰り返
しで、添加物Ａに見られるペプチド配列（または類似物）、並びにＴＫＰＰＲ配列（また
は類似物）を含んでいるヘテロ二量体は、このアッセイにおいて促進された活性を所有す
るであろう。

Ｄ２７の合成
１および３の合成（図７１および７２参照）
単量体の合成は、出発樹脂としてＦｍｏｃ−ＧＧＧＫ（ｉＶ−Ｄｄｅ）ＮＨ−ＰＡＬ−
ＰＥＧ−ＰＳ樹脂を用いる０．２５ミリモル規模において方法５に記載したように実施し
た。ペプチド樹脂を、切断または自動化または人力での方法によるさらなる誘導体化の前
に洗浄および乾燥した。

方法：ペプチド２およびペプチド４の合成（図７１および７２参照）
１および３への、ビオチン−ＪＪ、リシル、グルシルおよびセリニル（ＧａｌＮＡｃ（
Ａｃ）_３−α−Ｄ）部分の付加体は、方法６および方法８に記載したごとき手操作ＳＰＰ
Ｓにより実施した。アミノ酸のカップリングは、ＨＯＢｔ／ＤＩＣ活性化（Ｓｅｒ（Ｇａ
ｌＮＡｃ（Ａｃ）_３−α−Ｄ）を除いて）を使用し、ＤＭＦ中で実施した。Ｆｍｏｃ除去
は、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で実施した。すべてのカップリングは５〜１６時間の持
続時間であった。各々のカップリング後、完了をカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験により確
認した。Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）_３−α−Ｄの場合、カップリング剤としてＨＡＴ
Ｕ／ＤＩＥＡを用いて、ＤＭＦ中で実施した。カイザー試験が未反応アミノ基を示した場
合、カップリングを繰り返した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の除去、および樹脂からの切断を実行
した。粗ペプチドをエーテル中で沈殿し、エーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥した。直
鎖状粗ペプチドは、ペプチドをＤＭＳＯに溶解することにより（４０ｍｇ／ｍＬ）直接環
化した。Ｎ−メチルグルカミン水溶液の添加により、溶液のｐＨを８に調整し、溶液を空
気雰囲気下、室温で４８時間撹拌した。ペプチドは次に、Ｗａｔｅｒｓ−ＹＭＣ Ｃ−１
８ ＯＤＳ分取カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ内径）を用いる、方法１に記載したよう
な濃度勾配ＨＰＬＣを用いて精製した。純粋な生成物を含んでいる分画を合わせ、凍結乾
燥すると、必要とされるペプチドを得た。

方法：Ｄ２７−化合物６の合成（図７３参照）
グルタール酸ビス−ＮＨＳエステル（０．１２２ミリモル、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）の無水ＤＭＦ溶液へ、４のＤＭＦ溶液（４０ｍｇ、０．０１２２ミ
リモル、ペプチドに結合しているトリフルオロ酢酸および反応の間に形成されるＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドを中和するためにＤＩＥＡが加えられている）を滴加した。この０
．７ｍＬ溶液を４時間撹拌した。反応は、ＨＰＬＣおよび質量分析法によりモニターした
。真空下でＤＭＦを除去した。過剰のジエステルは酢酸エチルの添加により除去し、それ
は、ペプチド−モノエステル５を沈殿させると同時に、グルタール酸ビス−ＮＨＳエステ
ルを溶解する。混合物を遠心分離し、液体部分をデカンドした。これを２回繰り返した。
残渣は真空下に１０分維持した。残渣をＤＭＦに溶解し、２（３７ｍｇ、０．００９ミリ
モル）のＤＭＦ溶液（ｐＨ７）と混合した。それは室温で１６時間撹拌した。高真空下で
揮発物を除去し、残渣を１ｍＬのヒドラジン／ＭｅＯＨ（１５／８５、ｖ／ｖ）と室温で
２．５時間撹拌して処理することにより、アセテート機能を取り除いた。過剰のヒドラジ
ンをクエンチするためにアセトンを加え、真空下で揮発物を除去した。生じた残渣をＤＭ
ＳＯに溶解し、前記のように分取ＨＰＬＣにより精製すると、９ｍｇの純粋な物質を得た
。

インビトロアッセイによる結合親和性および生物学的有効性の相違の証明
以下の実験は、ヘテロ多量体ペプチドが、同一の標的に対して類似の結合親和性を有す
る単量体ペプチドよりも大きな生物学的有効性を示すことができることを明らかにしてい
る。

プロトコール実験１：２９３Ｈ細胞を実施例５に記載した標準技術により、ＫＤＲ ｃ
ＤＮＡまたはＭｏｃｋトランスフェクトした。細胞を配列番号５０４またはＤ１（３００
、３０、３および０．３ｎＭで）の存在下または不在下で、^１２５Ｉ−ＶＥＧＦとインキ
ュベートした。ＶＥＧＦ結合の阻害率は、式［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ１］、式中、
Ｙ１はペプチド不在下でのＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞への特異的結合であり、
およびＹ２はペプチド競合剤存在下でのＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞への特異的
結合である、を使用して計算した。ＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞への特異的結合
は、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞への結合からＭｏｃｋトランスフェクト細胞へ
の結合を差し引くことにより計算した。

プロトコール実験２：血清−飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェル当たり１００，０００細胞で、
ＢＤ フィブロネクチン−被覆 ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェル挿入プレートの上部
チャンバー内に置いた。濃度を増加させた配列番号５０４またはＤ１の存在下または不在
下、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む、または含まない基本培地をウェルの下部チャン
バーへ加えた。２２時間後、蛍光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤／遊走細
胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することにより細胞遊走／浸潤の定量を達成した
。ＶＥＧＦ−刺激遊走は、ＶＥＧＦ不在下で測定された基本遊走量を差し引くことにより
誘導した。

結果 実験１：図７４に示したように、配列番号５０４およびＤ１は、ＫＤＲ−トラン
スフェクト細胞への結合に対して、^１２５Ｉ−ＶＥＧＦとほとんど等しく競合し、それら
は同等の結合親和性、ならびにＫＤＲへの結合からＶＥＧＦを阻害する同等の能力を有し
ていることを示している。

結果 実験２：配列番号５０４およびＤ１の両方が、同じ程度にＫＤＲ発現細胞への^１
２５Ｉ−ＶＥＧＦ結合を強く阻止する（図７５）という事実にもかかわらず、ヘテロ二量
体Ｄ１は、内皮細胞遊走アッセイで示されたように、ＶＥＧＦの生物学的効果の阻止にお
いて、単量体配列番号５０４より強力であった（図７５）。６２．５ｎＭまで、配列番号
５０４はＶＥＧＦ−刺激遊走に対して効果を有しなかったのに対し、Ｄ１は、５０ｎＭで
ＶＥＧＦ−刺激遊走を完全に阻止した。

ＫＤＲ結合活性を有する配列番号３５６の断片の同定
以下の実験は、配列番号３５６の断片が著しいＫＤＲ結合活性を維持できることを示し
ている。

プロトコール：２９３Ｈ細胞を実施例６に記載した標準技術により、ＫＤＲ ｃＤＮＡ
またはＭｏｃｋトランスフェクトした。細胞へのストレプトアビジン−ＨＲＰの結合は、
０から２５０ｎＭまたは０から１０００ｎＭの以下の競合ペプチド：配列番号３５６、４
６２、４６３および４６５、の存在下、５．５ｎＭの複合体濃度で、実施例６のように実
施した。各々の実験条件下で特異的結合を決定した後、各々のペプチドのＩＣ_５０を決定
した（可能な場合）。

結果：表１８に示したように、Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号４９０）結
合モチーフのみから構成され、それはまた、ファージディスプレイデータに基づいて合成
されたほとんどの単量体ペプチドに付加されている非標的化Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｓ（配列番号２８６）配列とともに配列番号２８６と共有されている、配列番号４６２
が、１マイクロモル以下のＩＤ_５０でペプチド／ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体結合
を阻止できる最も小さい断片であった。驚くことに、配列番号３５６から誘導されたより
大きな断片は、１マイクロモルで複合体結合を有意に阻止できなかった。しかしながら、
可溶化モチーフ、（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）_３を後者のペプチドに加えて配列番号４６
５を作製した場合、それは１７５ｎＭのＩＤ_５０で、結合に対して複合体と競合でき、Ａ
ｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号４９０）モチーフを含んでいる配列番号３５６
の特定の断片がＫＤＲ結合活性を保持していることが確認された。

ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合剤結合のための、細胞に基づいたアッセイ
ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体へ選択的に結合する、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合ペプチドの
能力が示された。

試薬調製
このアッセイのための試薬は、以下に示す点を除いて、実施例５に記載されたように調
製した。

ペプチド−^１２５Ｉ−ニュートラアビジン溶液の調製
ビオチニル化ペプチド配列番号３２１、３２０および３２３、およびビオチニル化非結
合対照ペプチドを、１．２５μＭ保存５０％ＤＭＳＯ溶液を調製するために使用した。^１
２５Ｉ−ストレプトアビジンの３３．３３ｎＭ保存溶液は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（バッキン
ガムシア、英国）から購入した。１３．３３ｎＭ ^１２５Ｉ−ストレプトアビジン／１０
０ｎＭ ＶＥＧＦ保存溶液は、８５０ｍＬの^１２５Ｉ−ストレプトアビジンと２２μＬの
１０μＭ ＶＥＧＦおよび１２７５μＬのＭ１９９培地を混合することにより調製した。
他の保存溶液も同様の様式で調製したが、しかしＶＥＧＦを欠いていた。１３．３３ｎＭ
ペプチド−^１２５Ｉ−ストレプトアビジン複合体溶液±ＶＥＧＦを調製するため、５００
μＬの^１２５Ｉ−ストレプトアビジン（ＶＥＧＦを含む、または含まない）保存溶液（最
後の工程で調製された）を、２４μＬの配列番号３２１、３２０および３２３、または対
照ペプチドの１．２５μＭペプチド溶液と混合した。混合物は４℃にて６０分、回転板上
でインキュベートし、続いて、過剰のペプチドを除去するために５０μｌのソフトリリー
スアビジン−セファロース（ｄｄＨ_２Ｏ中での５０％スラリー）を加え、さらに４℃にて
３０分、回転板上でインキュベートした。最後に、１２，０００ｒｐｍで５分間、室温で
遠心分離することにより、ソフトリリースアビジン−セファロースをペレット化し、得ら
れた上清をアッセイに使用した。

ＫＤＲ−トランスフェクト細胞へのペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰの結合
ＶＥＧＦ存在下または不在下、対照ペプチドおよび試験ペプチド（配列番号３２１、３
２０および３２３）と^１２５Ｉ−ストレプトアビジンの複合体（上記のように調製）を、
ＫＤＲで一過性にトランスフェクトした２９３Ｈ細胞に結合する能力について試験した。
配列番号３２１と^１２５Ｉ−ストレプトアビジンの複合体は、ＶＥＧＦ存在下、Ｍｏｃｋ
トランスフェクト細胞と比較して、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へ特異的に結
合したが（図７６）、ＶＥＧＦが除かれている場合は結合しなかった（図７７）。配列番
号３２１はまた、蛍光偏光およびＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイを使用して試験する
ペプチドの中で最良のＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体結合剤でもあった（表９）。この実施例は
、ペプチド（配列番号３２１）が細胞表面上に存在するＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体へ特異的
に結合できることを示している。このことは、診断または治療目的のため、インビトロお
よびインビボでの、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体標的化のために有用であるアッセイの有用性
を確立している。ＫＤＲ／ＶＥＧＦ結合ペプチドは、機能的および活性なＫＤＲレセプタ
ーのみを検出し、細胞表面上に存在するすべてのＫＤＲを検出するわけではないので、腫
瘍、転移、糖尿病性網膜症、乾癬および関節症における、活性な血管新生の検出、および
／または処置に有用であろう。

単一標的分子上の２つのエピトープを標的とするヘテロ二量体ペプチドが、標的分子上
の、２つのエピトープの１つを結合するホモ二量体より優れているであろう、より多くの
証拠。

以下の実験は、ヘテロ二量体構築物が、ペプチド増殖因子またはサイトカインの生物学
的効果を阻止する能力で、ホモ二量体ペプチドより優れている、さらなる証拠を提供する
。

プロトコール：血清−飢餓ＨＵＶＥＣを、ウェル当たり１００，０００細胞で、ＢＤ
フィブロネクチン−被覆 ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ ２４ウェル挿入プレートの上部チャン
バー内に置いた。濃度を増加させたホモ二量体Ｄ８またはヘテロ二量体Ｄ１７の存在下ま
たは不在下、ＶＥＧＦを含む、または含まない基本培地をウェルの下部チャンバーへ加え
た。２２時間後、蛍光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤／遊走細胞の蛍光を
蛍光プレートリーダーで測定することにより細胞遊走／浸潤の定量を達成した。

結果：ＶＥＧＦは、本アッセイにおいて内皮細胞遊走を大きく増加させ、それはＤ１７
により強く阻止されたが、Ｄ８では阻止されなかった。Ｄ１７はＶＥＧＦ−誘導遊走を約
２５０ｎＭのＩＣ_５０で阻止したが、一方、Ｄ８は８００ｎＭでさえも遊走には何の有意
な影響を与えなかった。これは、Ｄ８が配列番号３５６で観察される完全標的化配列を使
用し、一方、Ｄ１７は、ＫＤＲに対する低親和性を有する（実施例２６で示されたように
）配列番号３５６配列の切り詰め体を含んでいるという事実にもかかわらなかった。

６および１３位のＣｙｓ残基が、対のアミノ酸に置き換えられた、１つがカルボキシを
運ぶ側鎖（ＧｌｕかまたはＡｓｐ）および他がアミノを運ぶ側鎖［ＬｙｓまたはＤｐｒ（
２，３−ジアミノプロパン酸）］、アミノ基配列番号３０１のジスルフィド結合置換類似
体を製造した。配列番号３０１（ジスルフィド結合の形成により作製された）に含まれて
いるものと同一の配列位置を含んでいる環を、側鎖アミノおよび側鎖酸部分の縮合により
作製し、配列番号３０１のジスルフィド結合により行われているような、残基６〜１３を
架橋するラクタム環を得た。

下記表１９は、ラクタム類似体において、配列番号３０１のＣｙｓ^６およびＣｙｓ^１３
に行われた、置換のいくつかの例を示している。

樹脂結合ペプチド１の合成
１の合成は０．２５ミリモル規模での方法５を使用して実施した。ペプチド樹脂１を洗
浄して乾燥し、人力でさらに誘導体化した〔図７８参照〕。

４〔配列番号４５３〕の合成
１（２４０ｍｇ、０．０６ミリモル）へＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）／ＨＯＡｃ／
ＤＭＦ １／２／１０（ｖ／ｖ／ｖ）（６５ｍＬ）を加えた。トリス−トリフェニルホス
フィンパラジウム［Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４，５５４．４ｍｇ，０．４８ミリモル］を加え、
樹脂を遮光して２０時間振とうした。樹脂を濾過し、ジエチルジチオカルバメートナトリ
ウム（０．５ｇ）／ＤＩＥＡ（０．５ｍＬ）／ＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液で、最後にＤＭ
Ｆ（３×７０ｍＬ）で洗浄した。この処理は、ラクタム形成反応に必要とされるＧｌｕ６
およびＬｙｓ１３のカルボキシおよびアミノ基のみを露出するために働いた。２の樹脂上
の環化は、ＨＡＴＵ（１１４ｍｇ，０．３ミリモル）、ＮＭＭ（６６μＬ，０．６ミリモ
ル）およびＤＭＦ（１０ｍＬ）を使用して３時間実施した。環化の完了はカイザー試験に
よりモニターした。試薬Ｂを４時間使用して、ペプチド樹脂３からペプチドを切断した。
樹脂を濾過し、濾液を蒸発させてペーストとした。粗ペプチドをエーテル中で沈殿させ、
エーテルで２回洗浄した。環状ペプチドは、溶出液としてＨ_２ＯへのＣＨ_３ＣＮ（両方と
も０．１％ＴＦＡを含んでいる）を用い、Ｗａｔｅｒｓ−ＹＭＣ Ｃ−１８カラム（２５
０ｍｍ×３０ｍｍ内径）を使用する分取逆相直線濃度勾配ＨＰＬＣにより精製した。生成
物含有分画の凍結乾燥は、８ｍｇの配列番号４５３を与えた。配列番号４５４、４５５、
４５６および４５７を同様に製造した。

ＫＤＲ結合活性を保持しながらのジスルフィド架橋の置換
以下の実験は、ラクタム配列番号４５４が有意なＫＤＲ活性を維持するように、化学的
に反応性のジスルフィド架橋を置き換えたことを示した。

プロトコール：２９３Ｈ細胞を実施例６に記載した標準技術により、ＫＤＲ ｃＤＮＡ
またはＭｏｃｋトランスフェクトした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体は実施例６の
ように調製した。細胞へのストレプトアビジン−ＨＲＰの結合は、０から２５０ｎＭの配
列番号４５４存在下、５．５ｎＭの複合体濃度で、実施例６のように実施した。各々の実
験条件下で特異的結合を決定した後、各々のペプチドのＩＣ_５０を決定した（可能な場合
）。

結果：表２０に示したように、ラクタムジスルフィド架橋置換を含んでいる、配列番号
４５４は、今まで通りＫＤＲへの結合に対してペプチド−ストレプトアビジン−ＨＲＰ複
合体と競合できたが、幾分の親和性は失われていた（ＩＣ_５０ １０８ｎＭ対１３ｎＭ）
。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するｃＭｅｔ結合ペプチド／アビジンＨＲＰの結合
この実施例は、最適化されたリンカーおよび／またはスペーサーを有するホモ二量体を
作製する利点を示している。

ｃ−Ｍｅｔ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するｃＭｅｔ結合ペプチドのビオチニル
化誘導体、配列番号４８２の、結合のためのスペーサー長を決定した。ペプチドおよびビ
オチン間に置かれるべきスペーサー長を決定するため、スペーサーがない、１つのＪスペ
ーサーまたはＪＪスペーサーを有する配列番号４８２を合成した。ニュートラアビジンＨ
ＲＰと、ｃＭｅｔ結合ペプチド配列番号４８２のこれら３つの異なった誘導体およびｃ−
Ｍｅｔへ結合しない対照ペプチドは四量体複合体として、ｃ−Ｍｅｔ発現ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１細胞へ結合するそれらの能力について試験した。ｃＭｅｔ結合ペプチドの３つの四
量体複合体すべてが、対照と比較するとＭＢ−２３１細胞へ結合した；しかしながら、２
つのスペーサーを有する誘導体が最もよいＫ_Ｄ（１２．６２ｎＭ）を示した。このことは
、ｃＭｅｔ結合ペプチドおよびビオチン間の２つのＪＪ−スペーサーの包含は、１つのス
ペーサーまたはスペーサー無しよりもよいことを示唆している。

細胞培養：ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞はＡＴＣＣから得られ、それらに推薦されている培
地に１ｍＬ／Ｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッ
ト，ＣＡ）を加えて、単層培養で増殖させた。細胞はアッセイの前日に分割し、９６ウェ
ルプレートの各々のウェルへ３５０００細胞を加えた。実験の残りは、以下に注意したこ
とを除いて実施例６のように実施した。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞へのペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰの結合
対照ペプチド、および０、１または２のＪスペーサーを有する配列番号４８２とニュー
トラアビジン−ＨＲＰの複合体は、上記のように製造し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を結
合するそれらの能力を試験した。ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体製造の間、
ニュートラアビジン上の４つすべてのビオチン結合部位が占拠されることを確実にするた
め、ニュートラアビジン−ＨＲＰよりも７．５倍過剰のビオチニル化ペプチドを使用した
。複合体形成後、遊離ビオチニル化ペプチドおよびニュートラアビジンＨＲＰ−複合体化
ビオチニル化ペプチド間の競合を避けるため、過剰の遊離ビオチニル化ペプチドはソフト
リリースアビジン−セファロースを使用して除去した。スペーサー無し、または１つのス
ペーサーを有する誘導体の飽和結合曲線を発生させるため、０．２８ｎＭから３３．３３
ｎＭの（図８０）、および２つのスペーサーを有する誘導体の飽和結合曲線を発生させる
ため、０．２８ｎＭから１６．６５ｎＭの（図８０）、いくつかの異なった濃度のペプチ
ド／ニュートラアビジンＨＲＰで実験を実行した。飽和結合曲線を描くため、試験された
各々の濃度に対する結合誘導体ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体の結合から、
対照ペプチド／ニュートラアビジンＨＲＰ複合体のバックグラウンド結合を差し引いた。
それ故、図８０のＹ軸の吸光度は、差吸光度であり（ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドから対照ペ
プチドを差し引いた）、絶対吸光度ではない。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウ
ェア（バージョン３．０）を使用した飽和結合データの分析により、２つのスペーサーを
有する四量体誘導体に対しては１２．６２ｎＭ（±３．１６）のＫ_Ｄ、１つのスペーサー
を有する四量体誘導体に対しては１５５．４ｎＭ（±８６．５６）のＫ_Ｄ、およびスペー
サーを有しない四量体誘導体に対しては１２３．８ｎＭ（±３７．７１）のＫ_Ｄが得られ
た。予期されるように、これらの結合定数は、関連する単量体ペプチド配列番号４８２に
ついてＦＰにより測定された値（８８０ｎＭ）より低い。

結果：図８０から、ＪＪスペーサーを有する配列番号４８２誘導体は、バックグラウン
ド結合として対照ペプチドの結合（ｎ＝１）を差し引いた後、１２．６２ｎＭのＫ_Ｄで、
Ｊスペーサーを有するまたはスペーサーがない誘導体よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
上のｃ−Ｍｅｔへのより良好な結合を示した。このことは、特定の最小スペーサー長が、
細胞上の複数の異なった結合部位へ到達し、そして多重の結合を達成することを可能にす
るために必要とされることを示唆している。この特定の最小スペーサー長は、細胞上の異
なった標的分子間の間隔に依存している。結合標的がＫＤＲであった場合のように、ファ
ージディスプレイで同定されたビオチニル化ペプチドでのニュートラアビジン−ＨＲＰア
ッセイは、ＥＬＩＳＡ型アッセイ（結合後の洗浄工程を伴う）がうまく働くには、単量体
結合配列の親和性があまりにも低い場合でさえも、固定化された標的へ結合できるペプチ
ドを同定するために有用であった。

ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＴｃ−標識ヘテロ二量体ポリペプチドの結
合
ＫＤＲへ結合するＴｃ−標識Ｄ１０の能力を、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞
を使用して評価した。結果は、Ｔｃ−標識Ｄ１０は、Ｍｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ
細胞よりもＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へ有意に良好に結合し、良好な結合は
４０％マウス血清存在下でも維持されたことを示している。加えて、そのアミノ酸配列が
スクランブルされた、Ｔｃ−標識Ｄ１０の誘導体Ｄ１８は、ＫＤＲ発現細胞に対する親和
性を有していないことが示され、これらの細胞へのＤ１０の結合特異性を確認している。

^９９ｍＴｃ−標識ペプチドの合成
^９９ｍＴｃ−Ｄ１０および^９９ｍＴｃ−Ｄ１８の製造
実施例３７を参照されたい。

２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
２９３Ｈ細胞は実施例５に記載したプロトコールを使用してトランスフェクトした。ト
ランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ，カタログ番号３５４６４０）で行った。プレートの左半分（４８ウェル）をＭｏｃｋ
トランスフェクトし（ＤＮＡなしで）、プレートの他の半分にある細胞はＫＤＲ ｃＤＮ
Ａでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション時には８０〜９０％コンフル
エントであり、アッセイする時間である次の日には完全にコンフルエントであった（もし
これらの条件が満たされなければ、アッセイを中止した）。

０．１％ＨＳＡを含むｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地の調製
ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１１０５８−０２１）から
得られ、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はＳｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）から
得られた。０．１％ＨＳＡ、０．１％ＨＳＡｗ／ｖをｏｐｔｉ−ＭＥＭＩに加え、続いて
室温で２０分撹拌することにより、ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地を調製した。培地は０．２μ
ｍフィルターを使用して濾過滅菌した。

アッセイのためのＴｃ−標識ペプチド希釈液の調製
Ｔｃ−標識Ｄ１０およびＤ１８を０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩで希釈すると
、各々のＴｃ−標識ヘテロ二量体の１．２５、２．５、５．０および１０μＣｉ／ｍｌの
最終濃度を有する溶液が提供される。第二の組の希釈液もまた、４０％マウス血清／６０
％ ０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの混合物を希釈液として使用して調製した。

Ｔｃ−標識ヘテロ二量体の結合を検出するためのアッセイ
細胞は、トランスフェクション２４時間後に使用し、アッセイのための細胞を調製する
ため、それらを１００μｌの室温の０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩで１回洗浄し
た。洗浄後、０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩをプレートから除き、７０μｌの１
．２５、２．５、５．０および１０μＣｉ／ｍｌのＴｃ−標識Ｄ１０またはＤ１８（両方
の希釈液で上のように調製された）で置き換えた。各々の希釈液は偽およびＫＤＲトラン
スフェクト細胞を含む３つの別々のウェルへ加えた。室温で１時間インキュベートした後
、プレートを１００μｌの冷結合緩衝液（０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ）で５
回洗浄した。１００μｌの可溶化溶液（０．５Ｎ ＮａＯＨ）を各々のウェルへ加え、プ
レートを３７℃で１０分インキュベートした。各々のウェル中の可溶化溶液をピペットで
吸い上げたり吐き出したりすることにより混合し、そして１．２ｍｌチューブへ移した。
各々のウェルを１００μｌの可溶化溶液で１回洗浄し、洗液を対応する１．２ｍｌチュー
ブへ加えた。各々の１．２ｍｌチューブは、ＬＫＢガンマカウンターで計数されるべき１
５．７×１００ｃｍチューブへ移した。

ＫＤＲ−トランスフェクト細胞へのＴｃ−標識ペプチドの結合
ＫＤＲへ特異的に結合するＴｃ−標識１０およびＤ１８の能力を、一過性トランスフェ
クト２９３Ｈ細胞を使用して示した。図８１に示したように、Ｔｃ−標識Ｄ１０は、血清
存在下で幾分の阻害が存在したけれども、４０％マウス血清存在下および不在下の両方で
、Ｍｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ細胞に比較してＫＤＲ−トランスフェクト細胞へよ
く結合した。ＫＤＲ発現細胞への、このＴｃ−標識ヘテロ二量体の総特異的結合は、前に
Ｔｃ−標識単量体ペプチド（実施例１９）で観察されたよりも多かった。一方、Ｄ１８は
ＭｏｃｋトランスフェクトまたはＫＤＲ−トランスフェクト細胞の両方に親和性を示さず
、Ｄ１０結合の特異性を確認している。

ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へのＬｕ−標識ヘテロ二量体ポリペプチドの結
合
ＫＤＲへ結合するＬｕ−標識Ｄ１３の能力を、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞
を使用して評価した。結果は、Ｌｕ−標識Ｄ１３は、Ｍｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ
細胞よりもＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞へ良好に結合し、有意な結合は４０％
マウス血清存在下でも維持されたことを示している。

^１７７Ｌｕ−Ｄ１３の製造
実施例３７を参照されたい。
２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
２９３Ｈ細胞は実施例５に記載したプロトコールを使用してトランスフェクトした。ト
ランスフェクションは、黒／透明９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ，サンノゼ、ＣＡ）で実施した。プレートの左半分（４８ウェル）をＭｏｃｋトランス
フェクトし（ＤＮＡなしで）、プレートの他の半分にある細胞はＫＤＲ ｃＤＮＡでトラ
ンスフェクトした。細胞は、トランスフェクション時には８０〜９０％コンフルエントで
あり、アッセイする時間である次の日には完全にコンフルエントであった（もしこれらの
条件が満たされなければ、アッセイを中止した）。

０．１％ＨＳＡを含むｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地の調製
ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩは実施例３２のように調製した。
アッセイのためのＬｕ−標識ペプチド希釈液の調製
Ｌｕ−標識Ｄ１３の保存溶液を０．１％ＨＳＡ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩで希釈すると、
標識ヘテロ二量体の１．２５、２．５、５．０および１０μＣｉ／ｍｌの最終濃度を有す
る溶液が得られた。第二の組の希釈液もまた、４０％マウス血清／６０％ ０．１％ＨＳ
Ａ含有ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの混合物を希釈液として使用して調製した。

Ｌｕ−標識ヘテロ二量体の結合を検出するためのアッセイ
結合の検出は、実施例３２に詳細に記載したように測定したが、ただし、Ｔｃ−標識ヘ
テロ二量体の代わりにＬｕ−標識Ｄ１３を使用した。

ＫＤＲ−トランスフェクト細胞へのＬｕ−標識ペプチドの結合
ＫＤＲへ特異的に結合するＬｕ−標識１３の能力を、一過性トランスフェクト２９３Ｈ
細胞を使用して示した。Ｌｕ−標識１３は血清存在下で幾分の阻害が存在したけれども、
４０％マウス血清存在下および不在下の両方で、Ｍｏｃｋトランスフェクト２９３Ｈ細胞
に比較してＫＤＲ−トランスフェクト細胞へ有意によく結合した。

腫瘍を運んでいるマウスにおけるＬｕ−標識ヘテロ二量体ペプチドによる放射線療法
この実施例において、ヌードマウスに移植されたＰＣ３細胞腫瘍の増殖を阻害するＬｕ
−標識Ｄ１３の能力を示した。

^１７７Ｌｕ−Ｄ１３の製造
実施例３７を参照されたい。
動物モデル
供給者が推薦するように増殖させた、ＡＣＴＴからのＰＣ３細胞を、ヌードマウスの肩
胛骨の間に皮下で注射した。それらの腫瘍が１００〜１４０ｍｍ^３に達した時、１２匹の
マウスに５００マイクロキューリーのＬｕ−標識Ｄ１３をｉ．ｖ．で注射し、それらの増
殖をさらに１８日モニターした。マウスがその体重を２０％またはそれ以上失うか、また
はそれらの腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えたら、マウスを殺した。処理マウスにおける腫瘍
増殖を、ＰＣ３を移植した３７匹の非処置マウスにおける平均腫瘍増殖と比較した。

結果：
この研究において、１２匹の処置マウスの内６匹において、非処置腫瘍マウスと比較し
て腫瘍の著しいまたは完全な増殖遅延が起こり（図８３）、用いられた条件下、Ｄ１３は
ＰＣ３腫瘍増殖を遅くすることに効果的であった。

ラット腫瘍モデル
細胞株：１３７６２ Ｍａｔ ＢＩＩＩと称されるラット乳腺癌は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ
−１６６６）から得られ、マッコイ５ａ培地＋１０％ＦＣＳ、１％グルタミンおよび１％
ペニシリン／ストレプトマイシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバット、ＣＡ）中で
増殖させた。懸濁液中の細胞を集め、ただしわずかに付着している細胞はＥＤＴＡで引き
剥がした。細胞を増殖培地で洗浄し、遠心分離し、ｍＬ当たり１×１０^７細胞でＰＢＳま
たは増殖培地に再懸濁した。

腫瘍の誘導：０．１ｍＬ当たり１×１０^６の細胞を、１２０から１６０ｇの体重の麻酔
したメスＦｉｓｈｅｒ３４４ラットの乳房脂肪体内へ注射した。腫瘍は通常、８日以内に
５〜８ｍｍの直径まで成長する。

ラットおよびマウススポンジモデル
材料：Ｔｅｘｗｉｐｅ（サドルリバー，ＮＪ）から、長い取っ手を持つ、編まれたａｌ
ｐｈａＬｉｔｅポリエステルスワブを得た。

スワブ挿入：滅菌小型スポンジ様ポリエステルファイバースラブを、動物の背面脇腹の
皮下に移植した。動物（ラットおよびマウス）は日１５（ラットおよびマウス）または日
１８（マウス）に麻酔薬の過剰投与により殺した。
スワブを免疫組織化学的試験のために取り除いた。

凍結切片の免疫組織化学
材料：ウサギ抗マウスｆｌｋ−１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｉｎｃ．，サンタクルス，ＣＡ）。 ラット抗マウスｆｌｋ−１モノクローナル抗
体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，テメキュラ，ＣＡ）。ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ，ガイセルブルグ，ＭＤ）。ＨＲＰ−コンジュゲートウサギ抗
ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体および試薬用ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，Ｍ
Ｏ）。ラットＩｇＧ（Ｓｓｒｏｔｉｃ，ローリー，ＮＣ）。ＡＥＣ：アミノエチルカルバ
ゾール基質キット：基質緩衝液、色素源溶液、過酸化水素溶液のボトル（Ｚｙｍｅｄ，サ
ンフランシスコ，ＣＡ）。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質、ヘマトキシリン対比染色
試薬（Ｚｙｍｅｄ）。グリセロールビニルアルコール水性マウンティング溶液（Ｚｙｍｅ
ｄ）。 Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓガラススライド（メンツェル−グレーシャー，
ドイツ）。

免疫組織化学：スワブおよび腫瘍を切り出し、イソペンタン中で凍結し、そしてクライ
オスタットを使用して１０μｍ切片へ切断した。切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ
ガラススライドにマウントし、冷アセトンで２０分固定した。ＰＢＳ中で５分、２回洗浄
後、０．５％Ｈ_２Ｏ_２での３０分間のインキュベーションにより、内在性ペルオキシダー
ゼ活性をクエンチし、次に再びＰＢＳ中で洗浄した。切片は最初に０．２％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ溶液で１時間処理した後、抗ＶＥＧＦ−Ｒ_２抗体（１／５０）またはビオチニル化ペ
プチド（２μＭ）または非特異的ＩｇＧＰＢＳ溶液（１／５０）またはＰＢＳのみと一夜
インキュベートした。切片を３回、ＰＢＳ中で５分洗浄し、次に１／２００希釈したヤギ
抗ウサギＨＲＰ抗体、または１／２５０希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰ（ビオチニル
化ペプチドに対して）と室温で１時間インキュベートした。切片を再び３回、ＰＢＳ中で
５分洗浄し、ＡＥＣで染色し、Ｈ_２Ｏですすぎ、ヘマトキシリンで３分対比染色した。組
織切片を光学顕微鏡法のためにマウントした。

インビトロ超音波画像法
材料：超音波イメージングシステム：直線アレープローブ（Ｌ７−４）を備えたＡＴＬ
ＨＤＩ ５０００。

画像化：実施例３６に記載したペプチド−コンジュゲートマイクロバブルを、移植スワ
ブを有するマウスの静脈内に注射した。断続パルス反転Ｂ−モード画像化を、スワブの新
生血管中の標的化マイクロバブルをモニターするために使用した。対照実験は非コンジュ
ゲートマイクロバブルまたはマイクロバブルと結合された非特異的ペプチドで実施した。
ＶＥＧＦレセプター２を発現している領域に対応するエコー発生区域が、ＫＤＲ−特異的
マイクロバブルを使用した場合に観察された。

本発明のＫＤＲ結合ペプチドへコンジュゲートされたリン脂質安定化マイクロバブルの
懸濁液を調製した。これらの懸濁液は、超音波対比剤として有用である。前により詳細に
説明したように、本発明のＫＤＲ結合ペプチドへコンジュゲートされたマイクロバブルは
動物（ヒトを含む）に投与でき、そしてＫＤＲを発現している動物領域（腫瘍のような血
管新生区域を含んで）の超音波イメージを発生させるために使用できる。

ＫＤＲペプチド結合剤へコンジュゲートされた、超音波診断法のための組成物の調製
脂質懸濁液から調製された気体バブル
一連のリン脂質水性懸濁液を以下の組成で調製した：
Ａ） ４０ｍｇのＤＳＰＣ、１０ｍｇのＤＰＰＡ、２．５ｍｇのＮ−ＭＰＢ−ＰＥ（１，
２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−４−（Ｐ−マレイ
ミド−フェニルブチルアミド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ−Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ，アラ
ブスター，ＡＬ）および３ｇのラクトース
Ｂ） ５０ｍｇのＤＰＰＳ、２．５ｍｇのＮ−ＭＰＢ−ＰＥおよび１．５ｇのグリセロー
ルおよび５ｇのプロピレングリコール。

７０℃で加熱することにより、各々の組成物の化合物を３０ｍＬの食塩水溶液（０．９
％ＮａＣｌ）に分散し、０．２μｍポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ^Ｒ）を通し
て押し出した。得られた懸濁液は次に、気体マイクロバブルを発生させるための方法に従
って処理した：懸濁液Ａは−４５℃で凍結し、２０ミリバールの減圧下で凍結乾燥し；得
られた乾燥飼料をバイアル中でＣ_４Ｆ_１０へ暴露し（１００ｍｇの凍結乾燥物／バイアル
）、次に１０ｍＬの水で再構築した；懸濁液ＢはＰｏｌｙｔｒｏｎ^Ｒを使用し、Ｃ_４Ｆ_１
０ガス雰囲気下、高速機械撹拌でホモジナイズした（１２，０００ｒｐｍおよび２分）。

再構築または撹拌後に、懸濁液は乳白色および不透明になった。得られた気体マイクロ
バブルは次に、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒを使用して計数した。気体マイク
ロバブルは、懸濁液の型および活性化の方法に依存して、１から１５μｍに変化したサイ
ズ、および１０^８から１０^９に変化した数で観察された。

リン脂質を含んでいる乾燥処方から調製された気体バブル
等量のＤＳＰＣおよびＤＰＰＧをＮ−ＭＰＢ−ＰＥ５％（ｗ／ｗ）および１ｇのＭａｃ
ｒｏｇｏｌ−４０００（Ｃｌａｒｉａｎ，ドイツ）へ混合し、次に、ｔｅｒｔ−ブタノー
ルへ６０℃で溶解すると透明な液が得られた。溶液をガラスバイアルへ分け、−４５℃で
急速凍結し、そして凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を、空気を置換することによりＣ
_４Ｆ_１０に暴露し、凍結乾燥器（Ｃｈｒｉｓｔ^Ｒ）内で栓を用いて封をした。凍結乾燥試
料は、バイアル当たり１０ｍＬの食塩水（０．９％）で再構築した。再構築後、バブル形
成（乳白色懸濁液）、エコー輝度（７ＭＨｚでの後方散乱係数；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ
．，１９９９．Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ，１６（７ｐｔ２）：７４３−７４６
、を参照されたい）、圧力への抵抗性および濃度（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、ＥＰ ０ ５
５４ ２１３ Ｂ１、を参照されたい）を決定した。

マレイミドを使用したコンジュゲートマイクロバブルの調製
１０ｍｇ／ｍＬでメルカプトアセチル化ペプチド（配列番号２９４、２６４および２８
６，上に示したように製造された）のＤＭＦ溶液を調製した。９ｍＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ
溶液（１０ｍＭ ｐＨ７．５）へ、２０μＬのペプチド溶液および１ｍＬの脱アセチル化
溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍヒドロキシルアミン．
ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えた。混合物を室温で３０分インキュベートした後、マレイミ
ド活性化マイクロバブル懸濁液を加えた。穏やかに撹拌しながら、暗所で２時間のインキ
ュベーション後、コンジュゲートマイクロバブルを遠心分離により精製した。

アビジンのチオアセチル化：アビジン（Ｆｌｕｋａ）内に保護スルフヒドリル基を導入
するため、架橋剤ＳＡＴＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業者の指示に従って使用し、タンパク
質を透析により精製した。

アビジン−コンジュゲートマイクロバブル：メルカプトアセチル化−アビジンの溶液に
、容量で１／１０の脱アセチル化溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＥＤＴＡ
、０．５Ｍヒドロキシルアミン．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えた。混合物を室温で３０分
インキュベートした後、マレイミド活性化マイクロバブル懸濁液を加えた。穏やかに撹拌
しながら、暗所で２時間のインキュベーション後、コンジュゲートマイクロバブルを遠心
分離により非コンジュゲートタンパク質から分離した。コンジュゲートアビジンの量は、
色素ＨＡＢＡを使用することにより分光学的に決定した。

ペプチドコンジュゲートマイクロバブル懸濁液の形成
ビオチニル化ペプチド（配列番号２９４および２６４，上に示したように製造）をアビ
ジン−コンジュゲートマイクロバブルのＰＢＳ懸濁液に、上で決定されたように、アビジ
ン１モル当たり１０モルのペプチドの比で加え、穏やかに撹拌しながら、室温で３０分イ
ンキュベートした。過剰のペプチドは遠心分離により除去した。

^９９ｍＴｃ−Ｄ１０の製造
ＳｎＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、１０ｇのＣａＮ
ａ_２ＤＴＰＡ ２．５Ｈ_２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解することにより調製され
た１ｍＬのＤＴＰＡ溶液へ加えた。Ｄ１０（１００μｇを１００μＬの５０％ＤＭＦに）
を、７５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９リン酸緩衝液および５０μＬの^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻（２．
４から５ｍＣｉ，Ｓｙｎｃｏｒ）、続いて１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混
合した。室温で３０分後、放射化学純度（ＲＣＰ）は７２％であった。生成物は、０．１
％ＴＦＡ水溶液（Ａ）および０．０８５％ＴＦＡアセトニトリル溶液（Ｂ；「ＡＣＮ」）
の水性／有機濃度勾配を使用し、０．７ｍＬ／分の流速で溶出する、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄ
ｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、５μｍ孔径）で精製した。以
下の濃度勾配を使用した：３６分で３０％Ｂから４２％Ｂへ、傾斜をつけて１０分で７０
％Ｂへ。３２分の保持時間で溶出された化合物を、０．２％ＨＳＡを含んでいる５０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）５００μＬに集め、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａ
ｎｔ）を使用してアセトニトリルを除去した。精製後、化合物は＞９０％のＲＣＰを有し
ていた。

^１７７Ｌｕ−Ｄ１１の製造
Ｄ１１（〜１μｇ／μＬ ０．０５Ｎ ＮＨ_４ＯＨ／１０％ＥｔＯＨ溶液の５μＬ）を
、８０μＬの０．２Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液、ｐＨ５．６、を含んでいるガラス差し込みマ
イクロバイアルへ加えた。^１７７Ｌｕをリガンド：Ｌｕの比が２：１になるように加えた
（１〜５ｍＣｉ）。バイアルをクリンプシールし、１００℃で１５〜２０分加熱し、５分
間冷却し、３μＬの１％Ｎａ_２ＥＤＴＡ ２Ｈ_２ＯのＨ_２Ｏ溶解液で処理した。全反応混
合物を、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＲＰアミドＣ１６カラム（４×２５０ｍ
ｍ×５μｍ）に注入した。以下のＨＰＬＣ条件を使用した：カラム温度＝５０℃、溶媒Ａ
＝０．１％ＴＦＡ含有Ｈ_２Ｏ、溶媒Ｂ＝０．０８５％ＴＦＡ含有ＡＣＮ、勾配 ｔ＝０分
で０．６／０．２５ｍＬ／分 Ａ／Ｂからｔ＝６０分で０．５／０．４ｍＬ／分 Ａ／Ｂ
。Ｄ１１の保持時間は〜４０分であり、^１７７Ｌｕ−Ｄ１１は〜４２分であった。放射活
性のあるピークを、０．１％ヒト血清アルブミン分画Ｖおよび１％アスコルビン酸を含ん
でいる０．７ｍＬの０．０５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５．２、に集め、有機溶媒を除くた
め、混合物をＳａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ中で回転沈降させた。８０％より高い放
射化学純度が得られた。

^９９ｍＴｃ−Ｄ１２の製造
ＳｎＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、１０ｇのＣａＮ
ａ_２ＤＴＰＡ ２．５Ｈ_２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解することにより調製され
た１ｍＬのＤＴＰＡ溶液へ加えた。Ｄ１２（１００μｇを１００μＬの５０％ＤＭＦに）
を、７５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９リン酸緩衝液および６０μＬの^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻（２．
４から４ｍＣｉ，Ｓｙｎｃｏｒ）、続いて１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混
合した。４０℃で１０分後、放射化学純度（ＲＣＰ）は１６％であった。生成物は、０．
１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）および０．０８５％ＴＦＡ ＡＣＮ溶液（Ｂ）の水性／有機濃度
勾配を使用し、０．７ｍＬ／分の流速で溶出する、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
Ｃ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、５μｍ孔径）で精製した。以下の濃度勾配を使
用した：３６分で３０％Ｂから４２％Ｂへ、傾斜をつけて１０分で７０％Ｂへ。３７．１
分の保持時間で溶出された化合物を、０．２％ＨＳＡを含んでいる５０ｍＭクエン酸緩衝
液（ｐＨ５．２）５００μＬに集め、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用
してＡＣＮを除去した。精製後、化合物は＞９０％のＲＣＰを有していた。

^１７７Ｌｕ−Ｄ１３の製造
Ｄ１３（３０６μｇ）を、〜４５０μＬの円錐形差し込みを持つ２ｍＬオートサンプラ
ーバイアルに加え、０．０１Ｎ ＮＨ_４ＯＨ（５０μＬ）で溶解した。このバイアルに、
アスコルビン酸ナトリウム、ゲンチジン酸ナトリウム、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トリプ
トファン、各々の１０ｍｇ／ｍＬ、に加えて２ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン分画Ｖを
含み、ＮａＯＨで最終ｐＨ＝７．６に調整した、０．５Ｍの酢酸アンモニウム（３００μ
Ｌ）を加えた。^１７７ＬｕＣｌ_３の０．０５Ｎ ＨＣｌ溶液の一部６．８μＬ（３９．３
ｍＣｌ）を加え、バイアルをクリンプシールし、３７℃で１５分温め、５分間冷却し、１
０μＬの１％Ｎａ_２ＥＤＴＡ ２Ｈ_２ＯのＨ_２Ｏ溶解液を加えた。反応混合物の３５０μ
Ｌを、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＲＰアミドＣ１６カラム（４×２５０ｍｍ
×５μｍ）に注入した。以下のＨＰＬＣ条件を使用した：カラム温度＝３７℃、溶媒Ａ＝
２ｇ／Ｌ ＮＨ_４ＯＡｃ緩衝液含有Ｈ_２Ｏ、溶媒Ｂ＝８０％ＡＣＮ／２０％Ｈ_２Ｏ、勾配
ｔ＝０分で０．５６／０．２４ｍＬ／分 Ａ／Ｂからｔ＝３０分で０．４７／０．３３
ｍＬ／分 Ａ／Ｂ。Ｄ１３の保持時間は〜２８分であり、^１７７Ｌｕ−Ｄ１３の保持時間
は〜２９分であった。放射活性のあるピークを、アスコルビン酸ナトリウム、ゲンチジン
酸ナトリウム、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トリプトファン、各々の１０ｍｇ／ｍＬ、に加
えて２ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン分画Ｖを含み、ＮａＯＨで最終ｐＨ＝７．６に調
整した緩衝液１ｍＬに集めた。ＡＣＮを除くため、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａ
ｎｔ）を使用して回転沈降させた。単離された生成物のＲＣＰは８６％であった。

^９９ｍＴｃ−Ｄ１４の製造
ＳｎＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、１０ｇのＣａＮ
ａ_２ＤＴＰＡ ２．５Ｈ_２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解することにより調製され
た１ｍＬのＤＴＰＡ溶液へ加えた。Ｄ１４（１００μｇを１００μＬの５０％ＤＭＦに）
を、５０μＬの^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻（６ｍＣｉ，Ｓｙｎｃｏｒ）および１２５μＬの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９）、続いて１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した
。４０℃で１５分後、放射化学純度（ＲＣＰ）は２１％であった。生成物は、０．１％Ｔ
ＦＡ水溶液（Ａ）および０．０８５％ＴＦＡアセトニトリル溶液（Ｂ）の水性／有機濃度
勾配を使用し、１ｍＬ／分の流速で溶出する、ＶｙｄａｃペプチドＣ１８カラム（４．６
×２５０ｍｍ）で精製した。以下の濃度勾配を使用した：４０分で３０％Ｂから４５％Ｂ
へ。３４．９分の保持時間で溶出された化合物を、０．２％ＨＳＡを含んでいる５０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）５００μＬに集め、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａ
ｎｔ）を使用してＡＣＮを除去した。精製後、化合物は９２．５％のＲＣＰを有していた
。

^９９ｍＴｃ−Ｄ１８の製造
ＳｎＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ（２０ｍｇ）を１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌに溶解し、１０ｇのＣａＮ
ａ_２ＤＴＰＡ ２．５Ｈ_２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）を１ｍＬの水に溶解することにより調製され
た１ｍＬのＤＴＰＡ溶液へ加えた。Ｄ１８（１００μｇを１００μＬの５０％ＤＭＦに）
を、５０μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９リン酸緩衝液および９０μＬの^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻（１４
ｍＣｉ，Ｓｙｎｃｏｒ）、続いて１００μＬの第一スズＳｎ−ＤＴＰＡ溶液と混合した。
反応液を３７℃で２０分温めた。全生成物を、Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４ Ｃ１８カラム
（４．６×２５０ｍｍ、５μｍシリカ）に注入し、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）および０
．０８５％ＴＦＡ ＡＣＮ（Ｂ）の水性／有機濃度勾配を使用し、１．５ｍＬ／分の流速
で溶出した。以下の濃度勾配を使用した：３０分で３２％Ｂから３９％Ｂへ、傾斜をつけ
て２分で８０％Ｂへ。遊離リガンドは１９分の保持時間で溶出された。２４分の保持時間
で溶出された化合物を、０．１％ＨＳＡおよび１％アスコルビン酸を含んでいる５０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）５００μＬに集め、ＡＣＮおよび過剰のＴＦＡをＳｐｅｅ
ｄ Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を４０分使用して除去した。精製後、化合物は９３％
のＲＣＰを有していた。

ペプチドコンジュゲーションのための誘導体化マイクロバブルの調製
２００ｍｇのＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、２７５ｍｇのＤＰＰ
Ｇ・Ｎａ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ナトリウム塩）、２５ｍｇのＮ
−ＭＰＢ−ＰＥを、５０ｍＬのヘキサン／イソプロパノール（４２／８）に６０℃で可溶
化した。真空下で溶媒を蒸発させ、次にＰＥＧ−４０００（３５．０４６ｇ）を脂質に加
え、混合物は水浴中、１０６．９２ｇのｔ−ブチルアルコールに６０℃で可溶化した。溶
液は１．５ｍＬ溶液でバイアルに充填した。試料を−４５℃で急速冷凍し、凍結乾燥した
。ヘッドスペースの空気を、Ｃ_４Ｆ_１０／空気（５０／５０）の混合物に置き換え、バイ
アルにキャップをかぶせて、そして圧着した。凍結乾燥試料は、バイアル当たり１０ｍＬ
の食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で再構築した。

ペプチドコンジュゲーション
例えば、配列番号３７４および配列番号２７７のペプチドを、以下の方法論に従って、
上に記載したようなマイクロバブル調製試料へコンジュゲートした。

チオアセチル化ペプチド（２００μｇ）を２０μＬのＤＭＳＯに溶解し、次に１ｍＬの
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。この溶液を、１８ｍＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ １
０ｍＭ、ｐＨ７．５、に分散したＮ−ＭＰＢ−機能化マイクロバブルへ加え、そして２ｍ
Ｌの脱アセチル化溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍヒド
ロキシルアミン．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えた。ヘッドスペースをＣ_４Ｆ_１０／空気（
３５／６５）で満たし、混合物を穏やかに撹拌しながら（回転盤）、暗所で２．５時間イ
ンキュベートした。コンジュゲートバブルを遠心分離により洗浄した。

ペプチドコンジュゲーションのための誘導体化マイクロバブルの調製
６ｍｇのジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ，Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２４ｍ
ｇのジステアロイルホスファツジルコリン（ＤＳＰＣ，Ｇｅｎｚｙｍｅ）および３ｇのマ
ンニトールを含んでいる蒸留水（３０ｍＬ）を６５℃で１５分加熱した後、室温まで冷却
した。Ｎ−ＭＰＢ−ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ
ールアミン−Ｎ−［４−（Ｐ−マレイミド−フェニルブチルアミド）］Ｎａ塩−Ａｖａｎ
ｔｉ Ｐｏｌａｒ−Ｌｉｐｉｄｓ）を加えた（５％モル−１．９ｍｇ）。この誘導体化リ
ン脂質を、超音波浴を使用して水性相に分散した（Ｂｒａｎｓｏｎ１２１０−３分）。

パーフルオロヘプタン（２．４ｍＬ、Ｆｌｕｋａから）を、高速ホモジナイザーを使用
して、この水性相に乳化した（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^Ｒ、１００００ｒｐｍ、１分）。
この乳濁液は、遠心分離により（２００ｇ／１０分）１回洗浄し、次に３０ｍＬの１０
％マンニトール蒸留水液に再懸濁した。洗浄乳濁液を凍結し（−４５℃、５分）、次に凍
結乾燥した（０．２ミリバール下、２４時間）。

Ｃ_４Ｆ_１０および空気の混合物を導入することにより大気圧を回復させた。凍結乾燥物
を蒸留水（３０ｍＬ）に溶解した。マイクロバブルを遠心分離により１回洗浄し、１０ｍ
Ｌのリン酸緩衝食塩水に再分散した。

ペプチドコンジュゲーション
チオアセチル化ペプチド（２００μｇ）を２０μＬのＤＭＳＯに溶解し、次に１ｍＬの
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。この溶液を、５ｍＬのＮ−ＭＰＢ−機能化マイ
クロバブルと混合した。０．６ｍＬの脱アセチル化溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍヒドロキシルアミン．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、懸濁液
を反転により２．５時間撹拌した。

マイクロバブルを、マルトース５％およびＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ ０．０５％を含
む蒸留水を用い、遠心分離により（２００ｇ／１０分）２回洗浄した。最終容量は５ｍＬ
に固定した。

ペプチドコンジュゲーションのための誘導体化マイクロバルーンの調製
４０ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ，Ｇｅｎｚｙｍｅ）を含ん
でいる蒸留水（３０ｍＬ）を６５℃で１５分加熱した後、４０℃まで冷却した。

ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（３．５ｍｇ−Ａｖａｎｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉ
ｐｉｄｓ）およびトリパルミチン（６０ｍｇ−Ｆｌｕｋａ）を、超音波浴中で２分、４０
℃でシクロヘキサン（０．６ｍＬ）に溶解した。

この有機相を、高速ホモジナイザーを使用して、水性相に乳化した（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ
^Ｒ、１００００ｒｐｍ、１分）。
蒸留水（５ｍＬ）に溶解したポリビニルアルコール（２００ｍｇ）を乳濁液に加えた。
混合物は５℃に冷却し、次に凍結し（−４５℃、５分）、そして最後に凍結乾燥した（０
．２ミリバール下、２４時間）。

凍結乾燥物を蒸留水（１５ｍＬ）に分散した。混合物を３０分撹拌するとマイクロバル
ーンの均質な懸濁液を得た。
ペプチドコンジュゲーション
チオアセチル化ペプチド（２００μｇ）を２０μＬのＤＭＳＯに溶解し、次にＰＢＳで
希釈した（１ｍＬ）。

上記のようにして得られたマイクロバルーンの懸濁液７．５ｍＬを遠心分離した（５０
０ｒｐｍで５分）。水溶性の分画（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）を捨て、そしてマイクロバ
ルーンをリン酸緩衝食塩水（２ｍＬ）に再分散した。

マイクロカプセル懸濁液をペプチド溶液と混合した。チオールを脱保護するため、３０
０ミリリットルのヒドロキシルアミン溶液（１０．４ｍｇを含むＰＢＳ ５０ｍＭ、ｐＨ
：７．５）を懸濁液に加えた。懸濁液を反転により２．５時間撹拌した。

マイクロバルーンを、マルトース５％およびＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ ０．０５％を
含む蒸留水を用い、遠心分離により（５００ｇ／５分）２回洗浄し、最終的に３ｍＬのこ
の溶液に再分散した。

トランスフェクト細胞でのインビトロアッセイ
本発明のペプチドへコンジュゲートされたマイクロバブルの、ＫＤＲ発現細胞への結合
についての能力を、ＫＤＲを発現するようにトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞を使用
して評価した。

Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ^Ｒカバーガラス上での２９３Ｈ細胞のトランスフェクション
２９３Ｈ細胞をＫＤＲ ＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、ペ
プチド−コンジュゲートマイクロバブルの懸濁液と、または対照ペプチド（ＫＤＲへの親
和性を有しない、コンジュゲートペプチドのスクランブル化体）とインキュベートした。

トランスフェクト細胞とのインキュベーションのため、小さなプラスチックキャップを
１から３×１０^８のペプチド−コンジュゲートマイクロバブルを含んでいる懸濁液で満た
し、そして、トランスフェクト細胞がコンジュゲートマイクロバブルと接触するように、
キャップを反転させたＴｈｅｒｍａｎｏｘ^Ｒカバーガラスで覆った。室温で約２０分後、
カバーガラスをピンセットで持ち上げ、ＰＢＳで３回洗浄し、コンジュゲートマイクロバ
ブルの結合を評価するため顕微鏡下で試験した。

図８５は、本発明のペプチドへコンジュゲートされたマイクロバルーンがＫＤＲ発現細
胞へ特異的に結合することを示している。実際、ＫＤＲ結合ペプチドへコンジュゲートさ
れたマイクロバルーンはＫＤＲ発現細胞へ結合したのに対し、それらはＭｏｃｋトランス
フェクト細胞へは認めうるほどには結合せず、そしてスクランブル化対照ペプチドを有す
るマイクロバルーンは、認知できる結合を示さなかった。

微小胞により覆われている表面の％の決定
イメージはデジタルカメラＤＣ３００Ｆ（Ｌｅｉｃａ）で取得し、イメージ化された領
域中の結合マイクロバブルまたはマイクロバルーンにより覆われている表面のパーセント
は、ソフトウェアＱＷｉｎ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ ＡＧ，ベーゼル、ス
イス）を使用して決定した。

下記の表は、ＫＤＲトランスフェクト細胞に対する、本発明の標的化微小胞の、結合親
和性の結果（イメージ化された表面の被覆度％として表現されている）を示しており、Ｍ
ｏｃｋトランスフェクト細胞に対する、同一標的化微小胞の結合、または（ペプチドの場
合のみ）同一のＫＤＲトランスフェクト細胞に対するスクランブル化ペプチドで標的化さ
れた微小胞の結合と比較されている。

図２１に示されているように、標的化微小胞は、促進されたＫＤＲに対する結合親和性
を示している。

インビボ動物モデル
血管新生の既知のモデル（ラットマトリゲルモデルおよびラットＭａｔ Ｂ ＩＩＩモ
デル）を、超音波コンジュゲート体へコンジュゲートされたペプチドの血管新生組織へ局
在する、および血管新生組織のイメージを提供する能力を試験するために使用した。

動物：ＭａｔＢ ＩＩＩ腫瘍移植のため、１２０から１６０ｇの体重のメスＦｉｓｈｅ
ｒ ３４４ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランス
）を使用した。マトリゲル注射のためには、１２０から１６０ｇの体重のオスＯＦＡラッ
ト（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランス）を使用した。

麻酔：ラットは、マトリゲルまたはＭａｔＢ ＩＩＩ細胞の移植前に、ケタミノール／
キシラジン（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ＡＧ／Ｓｉｇｍａ）（５０／１０ｍｇ／ｍＬ）混
合物の筋肉内注射（１ｍＬ／ｋｇ）で麻酔した。画像化実験のためには、動物を同一の混
合物に５０％ウレタン（１ｇ／ｋｇ）の皮下注射を加えて麻酔した。

ラットＭａｔＢ ＩＩＩ腫瘍モデル：１３７６２ Ｍａｔ ＢＩＩＩと称されるラット
乳腺癌は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６６６）から得られ、マッコイ５ａ培地＋１０％ＦＣＳ
、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、
カタログ番号１５２９０−０１８）中で増殖させた。懸濁液中の細胞を集め、細胞を増殖
培地で洗浄し、遠心分離し、ｍＬ当たり１×１０^７細胞でＰＢＳまたは増殖培地に再懸濁
した。腫瘍の誘導のためには：０．１ｍＬ当たり１×１０^６の細胞を、麻酔したメスＦｉ
ｓｈｅｒ３４４ラットの乳房脂肪体内へ注射した。腫瘍は通常、８日以内に５〜８ｍｍの
直径まで成長する。

ラットマトリゲルモデル：ヒトｂＦＧＦ（６００ｎｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ：ｒ
ｅｆ：ＧＦ００３）を含んでいるマトリゲル（４００μＬ）（ＥＣＭ，Ｓｉｇｍａ，セン
トルイス，ＭＯ）を各々のラットの背部側面へ皮下で注射した。

マトリゲル溶液は注射まで４℃で液体に保った。マトリゲル注射直後、マトリゲルの漏
出を避けるため、注射部位を手で数秒閉じたままに保った。体温では、マトリゲルはゼラ
チン状になる。注射１０日後、ラットのマトリゲルプラグで新しい血管新生が観察され、
画像化実験を実行した。

インビボ超音波画像法：Ｍａｔ Ｂ ＩＩＩ腫瘍またはマトリゲル画像化は、Ｌ７−４
直線状プローブを備えた、超音波イメージングシステムＡＴＬ ＨＤＩ ５０００装置を
使用して実施した。新しい血管の内皮上に発現されたＫＤＲレセプター上の、ペプチドコ
ンジュゲート−マイクロバブルの蓄積を追跡するために、低音響出力のＢ−モードパルス
反転（み＝０．０５）を使用した。対照実験として、非コンジュゲートマイクロバブルま
たは非特異的ペプチドとコンジュゲートされたマイクロバブルの静脈内ボーラスを注射し
た。直線状プローブは、移植した腫瘍またはマトリゲルプラグの線上に、直接皮膚に固定
し、標的化バブルの蓄積を３０分間追跡した。

両方のモデルにおいて、試験バブル懸濁液を注射する前に、ＳｏｎｏＶｕｅ^Ｒの潅流を
行った。このことは、血管新生状態の評価を可能にする；ＳｏｎｏＶｕｅ^Ｒ注射後に得ら
れたビデオ強度を内部標準として採用した。

ベースラインフレームを記録し、次に超音波照射をバブル注射の間停止した。注射後の
色々の時点で（１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０分）超音波照射を再活性化し
、１秒の２フレームをビデオテープに記録した。

マトリゲルまたはＭａｔ Ｂ ＩＩＩ腫瘍画像化実験からのビデオフレームを、ビデオ
−キャプチャーおよびＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ２．０ソフトウェアで、各々キャ
プチャーおよび分析した。腫瘍またはマトリゲルの全区画を含んでいる、同一方形の問題
とする領域（ＡＯＩ）を、異なった時点での（１、２、５、１０、１５、２０、２５、３
０分）イメージ上で選択した。各々の時点で、ＡＯＩ内部のビデオピクセルの合計を、Ａ
ＯＩベースラインの差し引き後に計算した。結果は、１００％として採用された、Ｓｏｎ
ｏＶｕｅで得られた信号のパーセンテージとして表現されている。同様に、自由に循環し
ている対比剤を代表している、マトリゲルまたは腫瘍の外側の位置を占めている第二のＡ
ＯＩもまた分析した。

結果は、本発明のＫＤＲ結合部分を有している超音波コントラスト剤が、動物モデル中
の血管新生（および、それゆえＫＤＲを発現している）組織へ局在化していることを示し
ている。特に、図８４は、実施例３８に従って調製された、本発明のＫＤＲペプチドへコ
ンジュゲートされた、リン脂質安定化マイクロバブルの懸濁剤の注射３０分後までの、腫
瘍中のバブルコントラスト剤の取り込みおよび保持を示している。対照的に、同一のバブ
ルは、腫瘍部位の外側に位置しているＡＯＩでの、一過性の（１０分を超えない）可視化
／バブルコントラストのみを示した。同様に、図８５および図８６は、実施例３８に従っ
て調製された、本発明のＫＤＲペプチド（配列番号３７４）へコンジュゲートされた、リ
ン脂質安定化マイクロバブルの懸濁剤の注射３０分後までの、マトリゲル中のバブルコン
トラスト剤の取り込みおよび保持を示している。対照的に、同一のバブルは、マトリゲル
部位の外側に位置しているＡＯＩでの、一過性の（１０分を超えない）可視化／バブルコ
ントラストのみを示した。

ＫＤＲ結合ペプチドの血清抵抗性の促進
マレイミドおよびチオールと反応できるその他の基を含む化合物は、化合物を注射した
場合、血清タンパク質、特に血清アルブミン上のチオール基と反応することが当該技術分
野で知られている。付加物は、血清アルブミンと同様の、例えば、ヒトにおいて１４日を
超える血清寿命を持っている。

マレイミドへのコンジュゲーション
マレイミド−標識直鎖ペプチドの直接合成を可能にする、利用可能な方法は本発明に包
含されている（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．ら、２０００．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１
１：４３９−４４４）。

ジスルフィドを含むペプチドは、いくつかの方法の１つで誘導体化できる。例えば、第
三のシステインを、カルボキシ末端に付加できる。付加されたシステインは、ジスルフィ
ドを形成するシステインのために使用された型の基に直交している保護基で保護される。
ジスルフィドは、意図されるシステインを選択的に脱保護し、ペプチドを酸化することに
より形成される。最後のシステインを次に脱保護し、ペプチドを大過剰モルのビスマレイ
ミドと反応させる。生じる化合物は、血清アルブミンまたは他のチオール−含有血清タン
パク質と反応するために解放されたマレイミドの１つを有している。

もしくは、本発明の環状ペプチドは、−ＧＧＧＫ（配列番号２６２）のような、リジン
含有Ｃ末端伸長で合成される。ＫＤＲ結合モチーフのリジンをｉｖＤｄｅで保護し、Ｃ末
端リジンを脱保護する。このリジンを、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシ
ンイミドエステル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ロックフォード，ＩＬ
）またはＮ−［α−マレイミドアセチキシ］スクシンイミドエステル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなマレイミド含有化合物と反応させる。

非共有結合で血清アルブミンと結合する部分へのコンジュゲーション
５０〜６０ｋＤａ未満の分子量を有しているポリペプチドは、急速に排出される。脂肪
酸のような、多くの小分子は血清アルブミンへ結合する。１０から２０の炭素原子を有し
ている脂肪酸は、血清アルブミンに対する実質的な親和性を有する。血清におけるこの結
合は、排出速度を減少させることができる。当該技術分野で既知の技術を使用し、血清ア
ルブミン結合部分を、本明細書で開示したペプチドの１つへコンジュゲートできる。血清
アルブミン結合部分は、リンカーを通してＫＤＲ結合ペプチドへ連結できる。リンカーは
ペプチド性または、ＰＥＧのような他のものであってもよい。ゼロから約３０原子のリン
カーが好ましい。リンカーは親水性であることが好適である。血清アルブミン結合部分は
、末端でまたは付随するアミノ酸の側鎖を通してＫＤＲ結合ペプチドへコンジュゲート可
能である。適した側鎖には、リジンおよびシステインが含まれる。そのような化合物はま
た、本明細書で記載したような、放射性核種のためのキレーターも含むことが可能である
。血清アルブミン結合部分へ連結されたＫＤＲ結合ペプチドはＫＤＲへ結合するであろう
。

ＰＥＧへのコンジュゲーション
当該技術分野でよく知られているように、タンパク質およびペプチドへのポリ（エチレ
ングリコール）（ＰＥＧ）の添加は、これらの分子の血清抵抗性を増強する。ＫＤＲ結合
ペプチドへのＰＥＧ（直鎖または分岐鎖）の添加は、血清抵抗時間の実質的な増強を与え
ることが期待される。ＰＥＧの分子量は少なくとも１０ｋＤａ、より好適には少なくとも
２０ｋＤａ、最も好適には３０ｋＤａまたはそれ以上であるべきである。ＰＥＧは、Ｎ末
端またはＣ末端に添加できる。ペプチドへＰＥＧを結合する方法は、当該技術分野でよく
知られている（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ．ら、２００２．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．
Ｒｅｖ．，５４：４５９−４７６）。ＰＥＧは、リジンまたはシステインのような反応性
側鎖へ結合できる。

血清タンパク質への融合
血清アルブミン（ＳＡ）および他のタンパク質を含むタンパク質は増強された血清抵抗
時間を有することは当該技術分野でよく知られている。ヒトＳＡ（ｈＳＡ）のアミノ酸配
列は表２２に示されている。表２３は
ＡＧＤＷＷＶＥＣＲＶＧＴＧＬＣＹＲＹＤＴＧＴＧＧＧＫ（配列番号２８６）：：
ＰＧＧＳＧＧＥＧＧＳＧＧＥＧＧＲＰＧＧＳＥＧＧＴＧＧ：：成熟ｈＳＡ：：
ＧＧＳＧＧＥＧＧＳＧＧＥＧＧＳＧＰＧＥＧＧＥＧＳＧＧＲＰ：：
ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）を含んでいる
融合タンパク質を示している。ＫＤＲ結合ペプチドは、グリシンに富むリンカーにより成
熟ｈＳＡから分離されており、柔軟なスペーシングを可能にしている。増強された血清抵
抗時間を有するであろう、注射可能なタンパク質を得るために、ｈＳＡのすべてを必要と
しないことが、当該技術分野で知られている。また、マレイミドおよびアルファブロモカ
ルボキシレートのような化学基は、対をなしていないシステイン（残基３４）と反応して
、安定な付加物を形成することも当該技術分野で知られている。それ故、付加物が放射性
核種を結合するであろうように、ｈＳＡ融合タンパク質へ１つのキレーターを結合するこ
とができる。マレイミドを有するキレーターを製造し、それをｈＳＡまたはｈＳＡ誘導体
へ結合することができる。もしくは、ｈＳＡまたはｈＳＡ誘導体をビスマレイミドと反応
させることができ、および反応性チオールを有するキレーターをビスマレイミド−誘導体
化ｈＳＡと反応させることができる。

与えられたアミノ酸配列をコードする遺伝子の構築は、当該技術分野で知られている。
サッカロミセス セレビジエにおけるｈＳＡ融合体の発現は、当該技術分野で知られてい
る（Ｓｌｅｅｐ，Ｄら、１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），９：１８３−
１８７）。

ＫＤＲ発現腫瘍への放射活性または毒素の前標的化
通常の放射免疫癌療法は２つの問題に悩まされている。一般的に、到達可能な標的化比
（腫瘍に局在化する投与量対血液を循環している投与量の比、または腫瘍に局在化する投
与量対骨髄へ移動している投与量の比）が低い。また、腫瘍へ送達される放射線または治
療薬剤の絶対的量が、多くの場合で有意な腫瘍応答を惹起するには不十分である。標的化
比または腫瘍への絶対量の改良が、癌治療のために非常に重要であろう。

本発明は、哺乳動物受容個体の標的細胞部位での活性薬剤局在化を増加させる方法を提
供する。本方法は、例えば、ａ）受容個体へ、標的化部分およびリガンド−抗リガンド結
合剤対の１つのメンバーを含んでいる融合タンパク質を投与し；ｂ）その後、受容個体へ
、受容個体の肝細胞レセプターを経て循環融合タンパク質のクリアランスを方向付けでき
るクリアリング剤を投与し、ここでクリアリング剤はリガンド−抗リガンド結合剤対の１
つのメンバーを取り込んでいる；およびｃ）続いて、リガンド／抗リガンド結合剤対メン
バーを含んでいる活性薬剤を受容個体へ投与する。

ヘキソース、特にヘキソースガラクトース、グルコース、マンノース、マンノース−６
−ホスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、ペンタマンノシルホスフェート、Ｎ−アセ
チルガラクトサミン、ガラクトースのチオグリコシド、およびそれらの混合物が肝臓クリ
アランスを起こすことに効果的であることが、当該技術分野で知られている。しかしなが
ら、肝臓レセプターへの糖の結合は、分子を肝臓へ方向付ける唯一の手段ではない。

「循環系からの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のクリアランスは、肝臓におけるクッパー細胞
への結合によるものである。クッパー細胞へのＣＥＡの結合は、ＣＥＡ配列のアミノ酸１
０７〜１１２を示すペプチド配列ＹＰＥＬＰＫを経て起こることを我々は示した。このペ
プチド配列はＮ末端と第一の免疫グロブリン様ループドメイン間の領域に位置している。
天然のＣＥＡおよびヘテロ二機能性架橋剤と複合体形成したこの配列を含んでいるペプチ
ド、およびビオチニル化ＣＥＡおよびＮＣＡでのリガンドブロッティングを使用し、クッ
パー細胞表面上の８０ｋＤａタンパク質への結合を、我々は示した。この結合タンパク質
は肝臓転移の発生に重要であろう。」（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．ら、１９９２．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８８：６７１−６７７）
クリアランス剤としてＹＰＥＬＰＫ（配列番号４９８）を使用するには、この配列を、
リンカーを経て、融合タンパク質（Ａｂ）を結合する部分に融合する。例えば、もし、Ａ
ｂがＤＯＴＡ／Ｒｅに対する親和性を有するとすれば、ＤＯＴＡ／Ｒｅに結合されたＹＰ
ＥＬＰＫを有する誘導体を作製するであろう；例えば、ｒｖＹＰＥＬＰＫｐｓＧＧＧ−Ｄ
ＯＴＡ。「ｒｖＹＰＥＬＰＫｐｓ」は、Ｔｈｏｍａｓらにより同定されたＹＰＥＬＰＫを
含む、ＣＥＡの断片である。ＤＯＴＡ上の、任意の都合のよい点が、結合のために使用で
きる。ＲＶＹＰＥＬＰＫＰＳＧＧＧ−ＤＯＴＡ／ｃｏｌｄＲｅ（配列番号４９９）を次に
クリアリング剤として使用してもよい。融合Ａｂに対応するＦａｂは、Ｋｄ＜１００ｎＭ
、好適にはＫｄ＜１０ｎＭ、および最も好適にはＫｄ＜１ｎＭの、クリアリング剤のため
の親和性を有するであろう。

治療薬はＤＯＴＡ／^１８５Ｒｅを含むであろう。好適な態様において、腫瘍上に固定化
されたＡｂが高親和性でビス−ＤＯＴＡ化合物を結合するために、治療薬は２つまたはそ
れより多いＤＯＴＡ部分を含んでいるであろう。２つのＤＯＴＡ部分は、望ましくは、１
０から３０単位のＰＥＧの親水性リンカーと連結されるであろう。ＰＥＧは分解せず、溶
解度を促進するので、ＰＥＧは望ましいリンカーである。１０から３０単位のＰＥＧは、
ビスＤＯＴＡ化合物に非常に長い血清抵抗時間を与えるには不十分である。３０分から１
０時間の半減期が許容できる。放射線のほとんどが腫瘍または外部環境へ送達されるため
には、血清半減期は、使用される放射性核種の放射活性半減期より長くなければならない
。

１つの態様において、本発明の「融合タンパク質」は、ヒト抗体の軽鎖（ＬＣ）かまた
は重鎖（ＨＣ）のアミノ末端またはカルボキシ末端へ融合された、少なくとも１つのＫＤ
Ｒ結合ペプチドを含んでいる。任意におよび好適には、２つまたはそれより多いＫＤＲ結
合ペプチドが抗体へ融合される。抗体は、放射活性にできるまたは結合された毒素を持つ
ことができる小分子に対して高い親和性を持つように選ばれる。好適には、Ａｂに対応し
ているＦａｂの親和性は、１００ｎＭ未満の、より好適には１０ｎＭ未満の、最も好適に
は１ｎＭ未満のＫｄで、小分子に対する親和性を有する。小分子は、有用な放射活性原子
（その多くが本明細書に掲げられている）を結合できるキレーターであることができる。
小分子は、ペプチドの結合特性に大きく影響することなく、放射性ヨウ素が結合できる、
１つまたはそれ以上のチロシンを有するペプチドであってもよい。

本発明の任意のＫＤＲ結合ペプチド（ＫＤＲ−ＢＰ）は、小さな放射活性化合物を結合
可能な、抗体の末端かまたは鎖へ融合できる。有用な具体例には以下のものが含まれる：
１） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ：：ＬＣ／ＨＣ、
２） ＬＣ：：ｌｉｎｋ：：ＫＤＲ−ＢＰ＃１／ＨＣ、
３） ＬＣ／ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ：：ＨＣ、
４） ＬＣ／ＨＣ：：ｌｉｎｋ：：ＫＤＲ−ＢＰ＃１、
５） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＬＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ２／Ｈ
Ｃ、
６） ＬＣ／ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＨＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ
＃２、
７） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＬＣ／ＫＤＲ−ＢＰ＃２：：ｌｉｎｋ２：：
ＨＣ、
８） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＬＣ／ＨＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ
＃２、
９） ＬＣ：：ｌｉｎｋ１：：ＫＤＲ−ＢＰ＃１／ＫＤＲ−ＢＰ＃２：：ｌｉｎｋ２：：
ＨＣ、
１０） ＬＣ：：ｌｉｎｋ１：：ＫＤＲ−ＢＰ＃１／ＨＣ：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ
＃２、
１１） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＬＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ＃２
／ＫＤＲ−ＢＰ＃３：：ｌｉｎｋ３：：ＨＣ、
１２） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＬＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ＃２
／ＨＣ：：ｌｉｎｋ３：：ＫＤＲ−ＢＰ＃３、
１３） ＫＤＲ−ＢＰ＃３：：ｌｉｎｋ３：：ＬＣ／ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：
：ＨＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ＃２、
１４） ＬＣ：：ｌｉｎｋ３：：ＫＤＲ−ＢＰ＃３／ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：
：ＨＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ＃２、および
１５） ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ１：：ＬＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ＃２
／ＫＤＲ−ＢＰ＃３：：ｌｉｎｋ３：：ＨＣ：：ｌｉｎｋ４：：ＫＤＲ−ＢＰ＃４。

（５）〜（１５）の場合において、リンカー（「ｌｉｎｋ１」、「ｌｉｎｋ２」、「ｌ
ｉｎｋ３」および「ｌｉｎｋ４」として示されている）は同じでもまたは異なっていても
または存在しなくてもよい。これらのリンカーは、もし存在するなら、好適には親水性、
プロテアーゼ耐性、無毒、非免疫源性、および可動性である。好適には、リンカーはグリ
コシル化部位または肝臓クリアランスを起こすことが知られている配列を含んでいない。
０から１５のアミノ酸長が望ましい。ＫＤＲ結合ペプチド（ＫＤＲ−ＢＰ＃１、＃２、＃
３および＃４）は同じでもまたは異なっていてもよい。もし、コードされているアミノ酸
配列が同じであるなら、これらの配列をコードしているＤＮＡが異なっているのが望まし
い。

抗体は二量体であるので、各々の融合タンパク質は、各々の融合ペプチドの２つのコピ
ーを示すであろう。（１５）の場合、８つのＫＤＲ−ＢＰが存在し、そしてＫＤＲ提示細
胞への結合は、高度に貪欲であるべきである。腫瘍侵入は、最大の親和性よりも、各々の
ＫＤＲ−ＢＰにおける中程度のＫＤＲ親和性により援助されることが可能である。

好適な態様の１つの群は、ＫＤＲ−ＢＰの１つとして配列番号２９４、および他方とし
て配列番号２８６を有している。例えば、（７）の場合において（ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：
ｌｉｎｋ１：：ＬＣ／ＫＤＲ−ＢＰ＃２：：ｌｉｎｋ２：：ＨＣ）、ＫＤＲ−ＢＰ＃１は
配列番号２９４であり、ＫＤＲ−ＢＰ＃２は配列番号２８４であり、およびｌｉｎｋ１は
１０から２０の間のアミノ酸であり、およびｌｉｎｋ２もまた１０から２０の間のアミノ
酸である。ｌｉｎｋ１に適した配列はＧＧＳＧＧＥＧＲＰＧＥＧＧＳＧ（配列番号４９１
）であり、およびｌｉｎｋ２に適した配列はＧＳＥＳＧＧＲＰＥＧＧＳＧＥＧＧ（配列番
号４９２）である。Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＡｒｇおよびＬ
ｙｓに富んだ他の配列が適している。タンパク質分解の危険性を避けるため、Ａｒｇまた
はＬｙｓにＰｒｏが続くのが望ましい。製造の困難さおよび乏しい溶解性を避けるために
は、非荷電残基の長い伸長（１２を超えた）を避けるのが望ましい。ペプチドはＬＣおよ
びＨＣのアミノ末端に示されるので、結合されたリンカー長は、それらをＫＤＲへ同時に
結合させることを可能にする。さらに、（１５）の場合（ＫＤＲ−ＢＰ＃１：：ｌｉｎｋ
１：：ＬＣ：：ｌｉｎｋ２：：ＫＤＲ−ＢＰ＃２／ＫＤＲ−ＢＰ＃３：：ｌｉｎｋ３：：
ＨＣ：：ｌｉｎｋ４：：ＫＤＲ−ＢＰ＃４）、ＫＤＲ−ＢＰ＃１およびＫＤＲ−ＢＰ＃２
は配列番号２９４であり、およびＫＤＲ−ＢＰ＃３およびＫＤＲ−ＢＰ＃４はＤＸ−９１
２である。ｌｉｎｋ１およびｌｉｎｋ３は１０から２０のアミノ酸であり、およびｌｉｎ
ｋ２およびｌｉｎｋ４は各々、１５から３０のアミノ酸である。ｌｉｎｋ２およびｌｉｎ
ｋ４は、ＬＣのカルボキシ末端上のペプチドをＨＣのＣ末端のペプチドへ届かせる必要が
あるので、それらはより長い。

融合タンパク質は、ＨＣの定常部分がグリコシル化されるように真核生物細胞で産生さ
れる。好適には、細胞は、ＣＨＯのような哺乳動物細胞である。
融合タンパク質は患者に注射し、腫瘍に融合タンパク質が蓄積するように時間が与えら
れる。腫瘍に固定化されていない融合タンパク質が排除されるように、クリアリング剤が
注射される。従来の前標的化法においては、抗体結合部位は腫瘍を標的にするよう使用さ
れ、およびビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンは放射活性または毒
性薬剤を固定化抗体へ付着するように使用されてきた。ビオチン／アビジンまたはストレ
プトアビジン結合は本質的に不可逆である。ここで、我々は標的結合ペプチドを抗体へ融
合し、それは放射活性または毒性薬剤を結合するように選んだ。融合タンパク質は２、４
、６または８のＫＤＲ−ＢＰを含み、腫瘍への融合タンパク質の結合は非常に貪欲である
。腫瘍に固定化されていない融合タンパク質を排除する、クリアリング剤は。融合タンパ
ク質の注射の２から４８時間の間に投与できる。クリアリング剤は、抗体と結合する部分
は単量体であるので、クリアリング剤および固定化融合タンパク質の複合体は、非常に長
い半減期は持たないであろう。クリアリング剤を注射して４から４８時間以内に、固定化
された抗体は、そこに結合しているクリアリング剤を失っているであろう。好適には、活
性薬剤は、融合タンパク質と結合する部分において二量体である。活性薬剤は、クリアリ
ン剤の注射の２から約４８時間の間に注射される。

本発明は、その好適な態様に関して、特に示されおよび説明されてきたが、当業者は、
付随する特許請求の範囲に包含されている本発明の範囲を離れることなく、形態および詳
細の多様な変更がなされることを理解されたい。本明細書に引用された刊行物、特許およ
び他の参照文献は、その全体が本明細書において援用される。

Claims (18)

1. ＡＧＰＫＷＣＥＥＤＷＹＹＣＭＩＴＧＴＧＧＧＫ（配列番号２６４）；
   ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）；
   ＡＧＤＷＷＶＥＣＲＶＧＴＧＬＣＹＲＹＤＴＧＴＧＧＧＫ（配列番号２８６）；
   ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）；
   ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＫ（配列番号３１０）；および
   ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）
   より選択されるアミノ酸配列を含むＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体に結合する能力を有する少なくとも１つのポリペプチドに結合された微小胞を含む、超音波造影剤。
2. 超音波造影剤が２以上のポリペプチドを含み、そして該ポリペプチドがＫＤＲ上の異なるエピトープに対して特異性を有する、請求項１に記載の超音波造影剤。
3. 少なくとも１つのポリペプチドが、アミノ酸置換、およびアミド結合置換、Ｄ−アミノ酸置換、グリコシル化アミノ酸、ジスルフィド様置換、アミノ酸転位、レトロインベルソペプチド、ペプトイド、レトロインベルソペプトイド、または合成ペプチドを含み、そして受容体に結合する能力を維持する、請求項１または２に記載の超音波造影剤。
4. １以上のポリペプチドが、それらのアミノ酸配列中にＣ末端ＧＧＧＫ伸長を含まない、請求項１または２に記載の超音波造影剤。
5. ポリペプチドが、以下の組み合わせ：
   ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）および
   ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）；
   ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（配列番号２７７）および
   ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）；
   ＡＧＰＫＷＣＥＥＤＷＹＹＣＭＩＴＧＴＧＧＧＫ（配列番号２６４）および
   ＧＤＳＲＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号２９４）；または
   ＡＱＤＷＹＹＤＥＩＬＳＭＡＤＱＬＲＨＡＦＬＳＧＧＧＫ（配列番号３１０）および
   ＶＣＷＥＤＳＷＧＧＥＶＣＦＲＹＤＰＧＧＧＫ（配列番号３３７）、
   のいずれかを含む、請求項２に記載の超音波造影剤。
6. ポリペプチドが、リンカーまたはスペーサーを介して微小胞に連結された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
7. 前記リンカーまたはスペーサーが、置換アルキル鎖、非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子、またはこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項６の超音波造影剤。
8. 微小胞が、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、および合成または天然の高分子物質から成る群より選択される、微小胞形成物質を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
9. ポリペプチドが前記微小胞形成物質に連結された、請求項８に記載の超音波造影剤。
10. 前記微小胞形成物質がリン脂質を含み、そしてポリペプチドがリンカーまたはスペーサーを介して該リン脂質に連結された、請求項９に記載の超音波造影剤。
11. 微小胞が、マイクロバブル、マイクロバルーン、微小粒子、およびミクロスフェアから成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
12. マイクロバブルがリン脂質を含む、請求項１１に記載の超音波造影剤。
13. 微小胞が、生体適合性気体、生体適合性気体の混合物、または気体前駆体を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
14. 気体または気体混合物がフッ素化ガスを含む、請求項１３に記載の超音波造影剤。
15. 気体または気体混合物が、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；アルゴン；キセノン；クリプトン；低分子量アルカン、低分子量シクロアルカン、低分子量アルケン、または低分子量アルキン；過分極気体、ＳＦ_６、フレオン、およびペルフルオロカーボンから成る群より選択される、少なくとも1つの気体を含む、請求項１３に記載の超音波造影剤。
16. 気体または気体混合物が、ＳＦ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０、およびＣ_５Ｆ_１２から成る群より選択される気体を含む、請求項１３に記載の超音波造影剤。
17. さらに治療薬を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
18. リン脂質および請求項１に記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む、請求項１に記載の超音波造影剤を作製するための凍結乾燥残留物。