JP5039075B2 - Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 - Google Patents
Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5039075B2 JP5039075B2 JP2009049512A JP2009049512A JP5039075B2 JP 5039075 B2 JP5039075 B2 JP 5039075B2 JP 2009049512 A JP2009049512 A JP 2009049512A JP 2009049512 A JP2009049512 A JP 2009049512A JP 5039075 B2 JP5039075 B2 JP 5039075B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kdr
- binding
- vegf
- peptide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 508
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 393
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 title claims description 221
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 title claims description 220
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 377
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 title description 9
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 title description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 319
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 91
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 39
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 claims description 36
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 33
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 28
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 22
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 16
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 15
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 claims description 11
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 11
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims description 8
- 150000008574 D-amino acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 7
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001924 cycloalkanes Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 claims description 2
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000006852 aliphatic spacer Chemical group 0.000 claims 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 220
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 142
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 132
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 131
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 114
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 101
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 description 97
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 94
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 94
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 94
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 93
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 89
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 89
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 87
- -1 His Chemical compound 0.000 description 86
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 86
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 85
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 53
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 51
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 48
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 46
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 46
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 41
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 41
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 41
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 39
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 35
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 27
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 27
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 26
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 24
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 23
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 22
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 18
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 15
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 14
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 14
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 14
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 11
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 11
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 10
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 10
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 10
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 10
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 9
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 9
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 9
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 9
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine group Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 9
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical group [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 8
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 8
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 8
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 8
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 8
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 7
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 7
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 7
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 7
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 7
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N L-lanthionine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CSC[C@H](N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 6
- DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N meso-lanthionine Natural products OC(=O)C(N)CSCC(N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 229910052702 rhenium Inorganic materials 0.000 description 6
- WUAPFZMCVAUBPE-UHFFFAOYSA-N rhenium atom Chemical compound [Re] WUAPFZMCVAUBPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical group NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Chemical group NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Chemical group OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000003402 intramolecular cyclocondensation reaction Methods 0.000 description 5
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 5
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 4
- HHLZCENAOIROSL-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid Chemical class OC(=O)CN1CCNCCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 HHLZCENAOIROSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002616 MRI contrast agent Substances 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 4
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 4
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 4
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 4
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 3
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 3
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 3
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 description 3
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005865 alkene metathesis reaction Methods 0.000 description 3
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 3
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 3
- 150000001987 diarylethers Chemical class 0.000 description 3
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 3
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 3
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005393 sonoluminescence Methods 0.000 description 3
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 3
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 2
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical compound C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYIHHARGXZADR-UHFFFAOYSA-N 1-(methylamino)cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound CNC1(C(O)=O)CCCCC1 HVYIHHARGXZADR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFVFQQWKPSOBED-PSXMRANNSA-N 1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCC RFVFQQWKPSOBED-PSXMRANNSA-N 0.000 description 2
- PIFFQYJYNWXNGE-UHFFFAOYSA-N 2,4-diacetylphloroglucinol Chemical compound CC(=O)C1=C(O)C=C(O)C(C(C)=O)=C1O PIFFQYJYNWXNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical group NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YFMDCHTYRWCFRZ-UHFFFAOYSA-N 2-[n-[2-[n-(carboxymethyl)-2-hydroxyanilino]ethyl]-2-hydroxyanilino]acetic acid Chemical compound C=1C=CC=C(O)C=1N(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)C1=CC=CC=C1O YFMDCHTYRWCFRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPCTZQVDEJYUGT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone Chemical compound CC=1OC=CC(=O)C=1O XPCTZQVDEJYUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-carboxyphenyl)phenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(O)=O)C=C1 FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZJPLYNZGCXSJM-UHFFFAOYSA-N 5-valerolactone Chemical compound O=C1CCCCO1 OZJPLYNZGCXSJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101800000884 C-terminal-flanking peptide Proteins 0.000 description 2
- 102400000095 C-terminal-flanking peptide Human genes 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N Cyclopentane Chemical compound C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N Dipalmitoylphosphatidylserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KLFKZIQAIPDJCW-HTIIIDOHSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- WVMBPWMAQDVZCM-UHFFFAOYSA-N N-methylanthranilic acid Chemical compound CNC1=CC=CC=C1C(O)=O WVMBPWMAQDVZCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N Propene Chemical compound CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241001516645 Simian hemorrhagic fever virus Species 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical group 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000006427 angiogenic response Effects 0.000 description 2
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001543 aryl boronic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical class N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 2
- BFGKITSFLPAWGI-UHFFFAOYSA-N chromium(3+) Chemical compound [Cr+3] BFGKITSFLPAWGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 150000001923 cyclic compounds Chemical group 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 150000002668 lysine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005649 metathesis reaction Methods 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002923 oximes Chemical group 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N pimelic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(O)=O WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 2
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 150000003585 thioureas Chemical class 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- DUXYWXYOBMKGIN-UHFFFAOYSA-N trimyristin Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCC DUXYWXYOBMKGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIQBQSYATKKL-UHFFFAOYSA-N tripalmitin Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PVNIQBQSYATKKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N (-)-beta-Sitosterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@@H](C(C)C)CC)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N 0.000 description 1
- TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N (1,10,13-trimethyl-3-oxo-4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl) heptanoate Chemical group C1CC2CC(=O)C=C(C)C2(C)C2C1C1CCC(OC(=O)CCCCCC)C1(C)CC2 TXUICONDJPYNPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N (10S)-3c-Acetoxy-4.4.10r.13c.14t-pentamethyl-17c-((R)-1.5-dimethyl-hexen-(4)-yl)-(5tH)-Delta8-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren Natural products CC12CCC(OC(C)=O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-ethyl-5alpha-cholest-22-en-3beta-ol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N (2r)-2-hydroxy-n-[(2s,3r,4e,8e)-3-hydroxy-9-methyl-1-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadeca-4,8-dien-2-yl]heptadecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)C(=O)N[C@H]([C@H](O)\C=C\CC\C=C(/C)CCCCCCCCC)CO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JSPNNZKWADNWHI-PNANGNLXSA-N 0.000 description 1
- LNDPCYHWPSQBCA-LURJTMIESA-N (2s)-2,5-diamino-2-methylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@](N)(C)CCCN LNDPCYHWPSQBCA-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ZENNTZUZBRESKJ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(1-benzothiophen-2-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2SC(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC2=C1 ZENNTZUZBRESKJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YPJJGMCMOHDOFZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(1-benzothiophen-3-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CSC2=C1 YPJJGMCMOHDOFZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- RWLSBXBFZHDHHX-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-2-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=C21 RWLSBXBFZHDHHX-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- CNMAQBJBWQQZFZ-LURJTMIESA-N (2s)-2-(pyridin-2-ylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=CC=N1 CNMAQBJBWQQZFZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTKYBFQVZPCGAO-LURJTMIESA-N (2s)-2-(pyridin-3-ylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=CN=C1 WTKYBFQVZPCGAO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- SUODTESVGYBURC-MLWJPKLSSA-N (2s)-2-amino-3-(1,2,3,4-tetrahydropyridin-4-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1CCNC=C1 SUODTESVGYBURC-MLWJPKLSSA-N 0.000 description 1
- NHBKDLSKDKUGSB-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(2-methylphenyl)propanoic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1C[C@H](N)C(O)=O NHBKDLSKDKUGSB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- DDLYNVBJVVOUGB-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(3-aminophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(N)=C1 DDLYNVBJVVOUGB-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DQLHSFUMICQIMB-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-(4-methylphenyl)propanoic acid Chemical compound CC1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 DQLHSFUMICQIMB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N (2s)-2-amino-3-({[(2r)-2,3-bis(tetradecanoyloxy)propoxy](hydroxy)phosphoryl}oxy)propanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC WKJDWDLHIOUPPL-JSOSNVBQSA-N 0.000 description 1
- LKRMSSDDHQZQHJ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)-2-methylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@](N)(C)CCCN=C(N)N LKRMSSDDHQZQHJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- SEUPQWHWULSGJC-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-(2-methoxyphenyl)propanoate Chemical compound COC1=CC=CC=C1C[C@H](N)C(O)=O SEUPQWHWULSGJC-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XTXGLOBWOMUGQB-VIFPVBQESA-N (2s)-2-azaniumyl-3-(3-methoxyphenyl)propanoate Chemical compound COC1=CC=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 XTXGLOBWOMUGQB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- YNJSNEKCXVFDKW-VIFPVBQESA-N (2s)-3-(5-amino-1h-indol-3-yl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound C1=C(N)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 YNJSNEKCXVFDKW-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JAJFOZGCMXHKET-LURJTMIESA-N (2s)-6-amino-2-[(2-bromoacetyl)amino]hexanoic acid Chemical class NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CBr JAJFOZGCMXHKET-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N (3beta,5alpha)-4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21 CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 1
- SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC SLKDGVPOSSLUAI-PGUFJCEWSA-N 0.000 description 1
- KLFKZIQAIPDJCW-GPOMZPHUSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KLFKZIQAIPDJCW-GPOMZPHUSA-N 0.000 description 1
- CFGDUGSIBUXRMR-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrrol-2-ide Chemical class C=1C=[C-]NC=1 CFGDUGSIBUXRMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 0.000 description 1
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 description 1
- LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical compound CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 1
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 14alpha-methylzymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(dodecanoyloxy)propyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCC IJFVSSZAOYLHEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFJNVIPVOCESGZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dipyridin-2-ylpyridine Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CN=C1C1=CC=CC=N1 JFJNVIPVOCESGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azaniumylethoxy)ethoxy]acetate Chemical compound NCCOCCOCC(O)=O RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RAEOEMDZDMCHJA-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-[2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]ethyl]amino]acetic acid Chemical class OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CCN(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O RAEOEMDZDMCHJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRUVVLWKPGIYEG-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[carboxymethyl-[(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]ethyl-[(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]acetic acid Chemical compound C=1C=CC=C(O)C=1CN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC1=CC=CC=C1O GRUVVLWKPGIYEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DMQQXDPCRUGSQB-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DMQQXDPCRUGSQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKSJWFNPRUOUQU-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetrazacyclotetradec-1-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCCCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 SKSJWFNPRUOUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYJJBQHFWIIZBB-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[acetyl-(2-sulfanylacetyl)amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical class SCC(=O)N(C(=O)C)CC(=O)NCC(O)=O OYJJBQHFWIIZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical compound SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEZDNQCXEZDCBI-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumylethyl 2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC NEZDNQCXEZDCBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 2-bromoacetamide Chemical class NC(=O)CBr JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 24xi-n-propylcholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CCC)C(C)C)C1(C)CC2 KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATAFDSCDEDHMOK-UHFFFAOYSA-N 3,3-diaminopropanoic acid Chemical compound NC(N)CC(O)=O ATAFDSCDEDHMOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHFDRBXTEDBWCZ-ZROIWOOFSA-N 3-[2,4-dimethyl-5-[(z)-(2-oxo-1h-indol-3-ylidene)methyl]-1h-pyrrol-3-yl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC=CC=C3NC\2=O)=C1C NHFDRBXTEDBWCZ-ZROIWOOFSA-N 0.000 description 1
- JZRBSTONIYRNRI-VIFPVBQESA-N 3-methylphenylalanine Chemical compound CC1=CC=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 JZRBSTONIYRNRI-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 3beta-Hydroxy-lanostan Natural products C1CC2C(C)(C)C(O)CCC2(C)C2C1C1(C)CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 4,6-dichlorotriazine Chemical compound ClC1=CC(Cl)=NN=N1 IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 4-amino-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- PJJGZPJJTHBVMX-UHFFFAOYSA-N 5,7-Dihydroxyisoflavone Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C2=O)C=1OC=C2C1=CC=CC=C1 PJJGZPJJTHBVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUKKZLIDCNWKIN-VIFPVBQESA-N 5-chloro-L-tryptophan zwitterion Chemical compound C1=C(Cl)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 TUKKZLIDCNWKIN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KVNPSKDDJARYKK-JTQLQIEISA-N 5-methoxytryptophan Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C2=C1 KVNPSKDDJARYKK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- HUNCSWANZMJLPM-UHFFFAOYSA-N 5-methyltryptophan Chemical group CC1=CC=C2NC=C(CC(N)C(O)=O)C2=C1 HUNCSWANZMJLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000050 Abdominal adhesions Diseases 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102100034278 Annexin A6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000656 Annexin A6 Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100204479 Arabidopsis thaliana SWEET12 gene Proteins 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- JWBOIMRXGHLCPP-UHFFFAOYSA-N Chloditan Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C(C(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 JWBOIMRXGHLCPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N Citrostadienol Natural products CC=C(CC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC[C@H]4[C@H](C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)C(C)C LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N Cyclobutane Chemical compound C1CCC1 PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVZWSLJZHVFIQJ-UHFFFAOYSA-N Cyclopropane Chemical compound C1CC1 LVZWSLJZHVFIQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 125000000030 D-alanine group Chemical group [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N Dehydro-beta-sitosterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004937 Dexon® Polymers 0.000 description 1
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N Doxorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150009958 FLT4 gene Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWDQPCIQCXRBQP-UHFFFAOYSA-M Fenaminosulf Chemical compound [Na+].CN(C)C1=CC=C(N=NS([O-])(=O)=O)C=C1 IWDQPCIQCXRBQP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N Fenclonine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N Gluanol Natural products CC(C)CC=CC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(O)C(C)(C)C4CC3 BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N Glycerol-phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(O)CO XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101100008681 Glycine max DHPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 238000007101 Grubbs Olefin metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007015 Grubbs metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052689 Holmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N Lanosterol Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000817 Leuprolide Proteins 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- HYMLWHLQFGRFIY-UHFFFAOYSA-N Maltol Natural products CC1OC=CC(=O)C1=O HYMLWHLQFGRFIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001608711 Melo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007126 N-alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N Nerifoliol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004404 Neurofibroma Diseases 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYBMYRBIABFTA-UHFFFAOYSA-N O-methyltyrosine Chemical compound COC1=CC=C(CC(N)C(O)=O)C=C1 GEYBMYRBIABFTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVJZSBGHRPJMMA-IOLBBIBUSA-N PG(18:0/18:0) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC FVJZSBGHRPJMMA-IOLBBIBUSA-N 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920002367 Polyisobutene Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229910052777 Praseodymium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101001000212 Rattus norvegicus Decorin Proteins 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- KDGARKCAKHBEDB-NKWVEPMBSA-N Ser-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O KDGARKCAKHBEDB-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- JVHROZDXPAUZFK-UHFFFAOYSA-N TETA Chemical class OC(=O)CN1CCCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCCN(CC(O)=O)CC1 JVHROZDXPAUZFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043189 Telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021626 Tin(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 229910052769 Ytterbium Inorganic materials 0.000 description 1
- PVNFMCBFDPTNQI-UIBOPQHZSA-N [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] acetate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] 3-methylbutanoate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] 2-methylpropanoate [(1S,2R,5S,6S,16E,18E,20R,21S)-11-chloro-21-hydroxy-12,20-dimethoxy-2,5,9,16-tetramethyl-8,23-dioxo-4,24-dioxa-9,22-diazatetracyclo[19.3.1.110,14.03,5]hexacosa-10,12,14(26),16,18-pentaen-6-yl] propanoate Chemical compound CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(C)=O)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2.CCC(=O)O[C@H]1CC(=O)N(C)c2cc(C\C(C)=C\C=C\[C@@H](OC)[C@@]3(O)C[C@H](OC(=O)N3)[C@@H](C)C3O[C@@]13C)cc(OC)c2Cl.CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2.CO[C@@H]1\C=C\C=C(C)\Cc2cc(OC)c(Cl)c(c2)N(C)C(=O)C[C@H](OC(=O)CC(C)C)[C@]2(C)OC2[C@H](C)[C@@H]2C[C@@]1(O)NC(=O)O2 PVNFMCBFDPTNQI-UIBOPQHZSA-N 0.000 description 1
- KMLCRELJHYKIIL-UHFFFAOYSA-N [1-(azanidylmethyl)cyclohexyl]methylazanide;platinum(2+);sulfuric acid Chemical compound [Pt+2].OS(O)(=O)=O.[NH-]CC1(C[NH-])CCCCC1 KMLCRELJHYKIIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYWWUFGJFMXXRE-UHFFFAOYSA-N [2-(aminomethyl)phenyl]-(2,3-dihydroxyphenyl)methanone Chemical compound NCC1=CC=CC=C1C(=O)C1=CC=CC(O)=C1O HYWWUFGJFMXXRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N [azido(phenoxy)phosphoryl]oxybenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(N=[N+]=[N-])OC1=CC=CC=C1 SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUSUZAGBORAKPY-UHFFFAOYSA-N acetic acid;n'-[2-(2-aminoethylamino)ethyl]ethane-1,2-diamine Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.NCCNCCNCCN RUSUZAGBORAKPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000004064 acoustic neuroma Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000012387 aerosolization Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005262 alkoxyamine group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000033 alkoxyamino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical class 0.000 description 1
- 125000005210 alkyl ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N allene Chemical compound C=C=C IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- HRRYYCWYCMJNGA-ZETCQYMHSA-N alpha-methyl-L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@](N)(C)CC1=CN=CN1 HRRYYCWYCMJNGA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 description 1
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N aminoglutethimide Chemical compound C=1C=C(N)C=CC=1C1(CC)CCC(=O)NC1=O ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003437 aminoglutethimide Drugs 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N amsacrine Chemical compound COC1=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=C1NC1=C(C=CC=C2)C2=NC2=CC=CC=C12 XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001220 amsacrine Drugs 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 229940033495 antimalarials Drugs 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940045985 antineoplastic platinum compound Drugs 0.000 description 1
- 239000003904 antiprotozoal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 150000008209 arabinosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000001769 aryl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 1
- MMIMIFULGMZVPO-UHFFFAOYSA-N benzyl 3-bromo-2,6-dinitro-5-phenylmethoxybenzoate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=C(C(=O)OCC=2C=CC=CC=2)C([N+](=O)[O-])=C(Br)C=C1OCC1=CC=CC=C1 MMIMIFULGMZVPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N beta-Sistosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2C3CC=C4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- JCZLABDVDPYLRZ-AWEZNQCLSA-N biphenylalanine Chemical compound C1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C1C1=CC=CC=C1 JCZLABDVDPYLRZ-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N butene Natural products CC=CC IAQRGUVFOMOMEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 1
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 1
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- YAYRGNWWLMLWJE-UHFFFAOYSA-L carboplatin Chemical compound O=C1O[Pt](N)(N)OC(=O)C11CCC1 YAYRGNWWLMLWJE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 201000007455 central nervous system cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000001549 ceramide group Chemical group 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N cerebroside D Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O RIZIAUKTHDLMQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical class NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000009734 composite fabrication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L copper(ii) acetate Chemical compound [Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 208000033921 delayed sleep phase type circadian rhythm sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000005266 diarylamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- HUPFGZXOMWLGNK-UHFFFAOYSA-N diflunisal Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(C=2C(=CC(F)=CC=2)F)=C1 HUPFGZXOMWLGNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000616 diflunisal Drugs 0.000 description 1
- QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N dihydrolanosterol Natural products CC(C)CCCC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N dimyristoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 1
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BIABMEZBCHDPBV-UHFFFAOYSA-N dipalmitoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BIABMEZBCHDPBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001585 disappearance potential spectroscopy Methods 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- FVJZSBGHRPJMMA-UHFFFAOYSA-N distearoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC FVJZSBGHRPJMMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 description 1
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 229960002918 doxorubicin hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 201000011523 endocrine gland cancer Diseases 0.000 description 1
- JHFPQYFEJICGKC-UHFFFAOYSA-N erbium(3+) Chemical compound [Er+3] JHFPQYFEJICGKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- IIUMCNJTGSMNRO-VVSKJQCTSA-L estramustine sodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].ClCCN(CCCl)C(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)OP([O-])([O-])=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 IIUMCNJTGSMNRO-VVSKJQCTSA-L 0.000 description 1
- 125000005677 ethinylene group Chemical group [*:2]C#C[*:1] 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- LNBHUCHAFZUEGJ-UHFFFAOYSA-N europium(3+) Chemical compound [Eu+3] LNBHUCHAFZUEGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 125000000457 gamma-lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical class NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- KJZYNXUDTRRSPN-UHFFFAOYSA-N holmium atom Chemical compound [Ho] KJZYNXUDTRRSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006017 homo-polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical class [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006289 hydroxybenzyl group Chemical group 0.000 description 1
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002075 inversion recovery Methods 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229940058690 lanosterol Drugs 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N lanosterol Chemical compound C([C@]12C)C[C@@H](O)C(C)(C)[C@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@]21C CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N 0.000 description 1
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 description 1
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N leuprolide Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N 0.000 description 1
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940043353 maltol Drugs 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- MMIPFLVOWGHZQD-UHFFFAOYSA-N manganese(3+) Chemical compound [Mn+3] MMIPFLVOWGHZQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940013798 meclofenamate Drugs 0.000 description 1
- SBDNJUWAMKYJOX-UHFFFAOYSA-M meclofenamic acid(1-) Chemical compound CC1=CC=C(Cl)C(NC=2C(=CC=CC=2)C([O-])=O)=C1Cl SBDNJUWAMKYJOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 1
- 229960003464 mefenamic acid Drugs 0.000 description 1
- RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N megestrol acetate Chemical compound C1=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N 0.000 description 1
- 229960004296 megestrol acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960003194 meglumine Drugs 0.000 description 1
- 229940053382 meglumine antimonate Drugs 0.000 description 1
- XOGYVDXPYVPAAQ-SESJOKTNSA-M meglumine antimoniate Chemical compound O[Sb](=O)=O.CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO XOGYVDXPYVPAAQ-SESJOKTNSA-M 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- YQCIWBXEVYWRCW-UHFFFAOYSA-N methane;sulfane Chemical compound C.S YQCIWBXEVYWRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000350 mitotane Drugs 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- GCTFIRZGPIUOAK-UHFFFAOYSA-N n-[[3,5-bis[[(2,3-dihydroxybenzoyl)amino]methyl]phenyl]methyl]-2,3-dihydroxybenzamide Chemical compound OC1=CC=CC(C(=O)NCC=2C=C(CNC(=O)C=3C(=C(O)C=CC=3)O)C=C(CNC(=O)C=3C(=C(O)C=CC=3)O)C=2)=C1O GCTFIRZGPIUOAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-M naproxen(1-) Chemical compound C1=C([C@H](C)C([O-])=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-M 0.000 description 1
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical compound [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000008481 normal tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000012633 nuclear imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229960002969 oleic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229940127234 oral contraceptive Drugs 0.000 description 1
- 239000003539 oral contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 229960000649 oxyphenbutazone Drugs 0.000 description 1
- HFHZKZSRXITVMK-UHFFFAOYSA-N oxyphenbutazone Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=C(O)C=C1 HFHZKZSRXITVMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002940 palladium Chemical class 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000037368 penetrate the skin Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 229960004692 perflenapent Drugs 0.000 description 1
- NJCBUSHGCBERSK-UHFFFAOYSA-N perfluoropentane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F NJCBUSHGCBERSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- HTYIXCKSEQQCJO-UHFFFAOYSA-N phenaglycodol Chemical compound CC(C)(O)C(C)(O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTYIXCKSEQQCJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002895 phenylbutazone Drugs 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N phosphonic acid group Chemical group P(O)(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- QYSPLQLAKJAUJT-UHFFFAOYSA-N piroxicam Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 QYSPLQLAKJAUJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002702 piroxicam Drugs 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 150000003058 platinum compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000771 poly (alkylcyanoacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002946 poly[2-(methacryloxy)ethyl phosphorylcholine] polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002717 polyvinylpyridine Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N praseodymium atom Chemical compound [Pr] PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001586 procarbazine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- MWWATHDPGQKSAR-UHFFFAOYSA-N propyne Chemical compound CC#C MWWATHDPGQKSAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000948 quinine Drugs 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000020874 response to hypoxia Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- DOSGOCSVHPUUIA-UHFFFAOYSA-N samarium(3+) Chemical compound [Sm+3] DOSGOCSVHPUUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000007659 semicarbazones Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 235000015500 sitosterol Nutrition 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N sitosterol Natural products CC=C(/CCC(C)C1CC2C3=CCC4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1)C(C)C NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- FGGPAWQCCGEWTJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2,3-bis(sulfanyl)propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(S)CS FGGPAWQCCGEWTJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RMLUKZWYIKEASN-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-9-(2-hydroxyethoxymethyl)purin-6-olate Chemical compound [Na+].O=C1[N-]C(N)=NC2=C1N=CN2COCCO RMLUKZWYIKEASN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)([O-])=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M 0.000 description 1
- XGRLSUFHELJJAB-JGSYTFBMSA-M sodium;[(2r)-2-hydroxy-3-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)([O-])=O XGRLSUFHELJJAB-JGSYTFBMSA-M 0.000 description 1
- ZTEPAMQURYRDPM-UHFFFAOYSA-M sodium;n,n-diethylcarbamothioate Chemical compound [Na+].CCN(CC)C([O-])=S ZTEPAMQURYRDPM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229950004330 spiroplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000001119 stannous chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011150 stannous chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 125000004354 sulfur functional group Chemical group 0.000 description 1
- MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N sulindac Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2\C1=C/C1=CC=C(S(C)=O)C=C1 MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N 0.000 description 1
- 229960000894 sulindac Drugs 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- FQZYTYWMLGAPFJ-OQKDUQJOSA-N tamoxifen citrate Chemical compound [H+].[H+].[H+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 FQZYTYWMLGAPFJ-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 1
- 229960003454 tamoxifen citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001367 tartaric acid Drugs 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001984 thiazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N thiohydroxylamine Chemical group SN RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001670 trilostane Drugs 0.000 description 1
- KVJXBPDAXMEYOA-CXANFOAXSA-N trilostane Chemical compound OC1=C(C#N)C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@@]32O[C@@H]31 KVJXBPDAXMEYOA-CXANFOAXSA-N 0.000 description 1
- 229940113164 trimyristin Drugs 0.000 description 1
- 229960001947 tripalmitin Drugs 0.000 description 1
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Substances C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003667 tyrosine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229960003636 vidarabine Drugs 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N vinblastine sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 KDQAABAKXDWYSZ-PNYVAJAMSA-N 0.000 description 1
- 229960004982 vinblastine sulfate Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AQTQHPDCURKLKT-JKDPCDLQSA-N vincristine sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C=O)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 AQTQHPDCURKLKT-JKDPCDLQSA-N 0.000 description 1
- 229960002110 vincristine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N ytterbium Chemical compound [Yb] NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical compound O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
- A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Dermatology (AREA)
Description
本出願は2002年3月1日に出願された米国仮出願第60/360,851号および
2003年1月15日に出願された米国仮出願第60/440,411号に基づく利益を
主張する。
成長中の胚では、主要な血管ネットワークは脈管形成と呼ばれる過程において中胚葉細
胞のin situでの分化により確立される。しかし胚の脈管形成後、胚または成体に
おけるその後のすべての新しい血管の生成は血管新生と呼ばれる過程における現存の血管
からの新しい毛細血管の成長または分離により支配される(Pepper,M,et a
l.,1996.Enzyme Protein,49:138−162;Risau,
W.,1997.Nature,386:671−674)。血管新生は胚の成長ならび
に正常組織の成長および修復に関与するだけでなく、女性の生殖周期、妊娠の確立および
維持、ならびに創傷および骨折の修復にも関与する。正常な個体において起こる血管新生
に加えて、血管形成事象は多数の病的過程、とりわけ腫瘍増殖および転移、ならびに糖尿
病性網膜症、乾癬、および関節疾患のような、血管増殖が増大する他の状態にも関与する
。過形成性から腫瘍形成性増殖への腫瘍の転換に血管新生は非常に重要であるため、血管
新生の阻害が有効な癌治療となっている(Kim,K.et al.,1993.Nat
ure,362;841−844)。
る血管を静止および安定に保つ傾向がある他の影響力を圧倒する(Hanahan,D.
andFolkman,J.,1996.Cell,86:353−364)。これらの
前血管新生因子の中で最も性状が解析されているものは血管内皮増殖因子(VEGF)で
ある(Neufeld、G.et al.,1999.FASEB J.,13:9−2
2)。
れる。また、多くの腫瘍も多量のVEGFを産生し、および/または近くの間質細胞を誘
導してVEGFを産生させる(Fukumura,D.et al.,1998.Cel
l,94:715−725)。VEGFはVEGF−Aとも表し、5種の異なるスプライ
スアイソフォームの121、145、165、189、および206アミノ酸として合成
される。VEGF121およびVEGF165はとりわけ腫瘍において産生される主要な
型である(Neufeld,G et al.,1999,上記を参照されたい)。VE
GF121はVEGF遺伝子のエキソン6および7によりコードされる塩基性ドメインを
欠失し、VEGF165とは異なり、ヘパリンまたは細胞外マトリックスに結合しない。
する。一般に、受容体チロシンキナーゼは1以上の具体的な成長因子に結合できる細胞外
ドメイン、膜貫通ドメイン(通常αヘリックス)、膜近接ドメイン(ここで受容体は、た
とえばリン酸化により調節されてよい)、チロシンキナーゼドメイン(受容体の触媒成分
)、および多くの受容体においてチロシンキナーゼの基質の認識および結合に関与するカ
ルボキシ末端尾部を有する糖タンパク質である。これらはVEGFに結合することが既知
の3種の内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ:VEGFR−1(Flt−1)、VE
GFR−2(KDRまたはFlk−1)、およびVEGFR−3(Flt4)である。F
lt−1およびKDRは主要な高親和性VEGF受容体として同定されている。Flt−
1はVEGFに対してより高い親和性を有するが、KDRは内皮細胞でより豊富に発現す
る(Bikfalvi,A.et al.,1991.J.Cell.Physiol.
,149:50−59)。さらに、KDRは血管新生反応を支配すると考えられ、そのた
めより高い治療的および診断的関心事である(Neufeld,G et al.,19
99,上記を参照されたい)。KDRの発現は、新生血管、とりわけ強い血管新生反応を
誘発する腫瘍において非常にアップレギュレーションされている(Veikkola,T
.et al.,2000.Cancer Res.,60:203−212)。
PAGEゲル上で約205kDaの見かけの分子量として移動する。KDRはその細胞外
ドメイン中に7つのイムノグロブリン様ドメインを含み、そのうちはじめの3つがVEG
F結合において最も重要である(Neufeld,G et al.,1999,上記を
参照されたい)。VEGF自体は同時に2つのKDR分子に結合することができるホモ二
量体である。その結果として、2つのKDR分子が結合時に二量体になり、自己リン酸化
され、はるかに活性になる。次に上昇したキナーゼ活性はVEGFのKDR特異的生物学
的作用が介在するシグナル伝達経路を開始する。
でなく、内皮細胞においてKDRアップレギュレーションを検出し、またはVEGF/K
DR結合複合体を検出する能力が、悪性腫瘍増殖検出のような具体的な診断的適用を含む
、血管新生の検出またはモニタリングにおいてきわめて好都合であろうということを理解
することができる。また、腫瘍部位に殺腫瘍剤もしくは血管新生阻害剤を導くか、または
KDR、VEGF/KDR、または血管新生アゴニストを所望の部位に標的化するような
治療的適用において好都合であろう。
本発明は、血管内皮増殖因子(VEGF)に対する内皮細胞上の主要受容体、すなわち
血管内皮増殖因子受容体−2(VEGFR−2、キナーゼドメイン領域(KDR)および
胎児肝キナーゼ−1(Flk−1)としても公知)を検出し標的にすること、およびVE
GFおよびKDRにより形成される複合体を画像化し標的にすることに有用なポリペプチ
ドおよび組成物に関する。血管新生にVEGFおよびKDRが関与することは、たとえば
新生物性腫瘍のような血管新生の重要な部位の画像化、たとえば放射線治療薬を含む治療
薬のような物質のそのような部位への標的化、および不適切な血管新生に関連したある種
の疾患状態を含む、そのような状態の治療に、本発明のVEGFおよびKDR結合ポリペ
プチドをとりわけ有用にする。
KDR結合ポリペプチド」または「KDR結合部分」およびその相同体として表す)が見
出されている。そのようなKDRおよびVEGF/KDR結合ポリペプチドは、血管新生
部位において濃縮され、新生物性腫瘍増殖部位を含む活発な血管新生部位を検出し、そし
て画像化するための手段を提供するであろう。そのようなKDRおよびVEGF/KDR
結合ポリペプチドは、たとえば血管新生を阻害するかまたは促進するための新規治療薬を
提供する。たとえば造影剤としてまたはKDRもしくはVEGF/KDR−指向性治療薬
の融合パートナーとしてのそのようなポリペプチドの調製、使用およびスクリーニングが
本明細書に詳細に記載される。
た物質および方法に関する必要性に答えるために、本発明者らは驚くべくことにKDRま
たはVEGF/KDR複合体に特異的に結合する、非天然の7種のポリペプチドファミリ
ーを現在発見している。そのようなポリペプチドの適切な標識は、たとえばKDR発現内
皮細胞またはVEGF/KDR複合体を提示する細胞に高濃度で結合することができる検
出可能な造影剤を提供し、血管新生特異的造影剤を提供する。したがって、本発明のKD
RおよびVEGF/KDR結合ポリペプチドは、そのような血管新生関連疾患の検出およ
び診断に使用することができる。また、VEGF阻害剤または殺腫瘍剤のような効果的な
物質とそのようなポリペプチドとの結合または融合は、たとえば活発な血管新生部位に結
合物または融合物を「指向」させ、それにより血管新生に関連した病的状態を治療するた
めの効果的な手段を提供することによって病的腫瘍を治療するために使用することができ
る。
たは多量体もしくはポリマー構築物での単一結合ポリペプチドの使用、および多量体もし
くはポリマー構築物での1以上の本発明の結合ポリペプチドの使用を含む。本発明に記載
の結合ポリペプチドは、ポリペプチド結合部位を保持するKDRまたはVEGF/KDR
複合体、またはそのフラグメントを結合し、検出し、または単離することが好都合である
任意の適用において有用である。本明細書に開示された結合ポリペプチドのとりわけ好都
合な用途はin vivoでの血管新生を画像化する方法にある。該方法は、血管新生部
位の検出に本発明に記載の特異的結合ポリペプチドの使用を必要とし、ここで結合ポリペ
プチドは核磁気共鳴画像用(MRI)造影剤、X線造影剤、放射線医薬品造影剤、超音波
造影剤、および光造影剤を含む、造影剤として使用するために検出可能に標識されている
。
都合な使用は、血管新生部位またはKDRを発現する他の組織に、治療薬(治療、放射線
治療、または細胞毒性効果を提供可能な化合物を含む)、または治療薬(薬物、遺伝物質
などを含む)の送達ビヒクルを標的化することである。
量体結合ポリペプチドに比較して、標的分子への改善された結合能力を示す。たとえば、
実施例5に示すように、本明細書に提供されたKDR結合ポリペプチドの四量体構築物は
、KDRを形質移入した293H細胞に結合するための改善された能力を示した。単一分
子構築物中に2以上の結合ポリペプチドを組合わせると、KDの減少により示されるよう
に、単量体結合ポリペプチド以上に構築物の結合活性を改善すると考えられる。
トープに特異的な2以上の結合ポリペプチドを含む構築物(たとえば、「ヘテロマー」ま
たは「ヘテロ多量体」構築物、米国特許出願第60/440,201号、およびそれと共
に出願された代理人整理番号50203/01004号を有する出願を参照されたい。そ
れぞれの内容は本明細書に援用される)を作製した。本明細書に提供される2以上の結合
ポリペプチドを含む構築物は、KDRまたはVEGF/KDR上の複数の部位をブロック
することが予想される。ヘテロマー構築物は、対応する単量体、および同一結合ポリペプ
チドの複数のコピーを含む多量体構築物によりも優れた結合能力を示す。さらに、異なる
エピトープに特異的な2以上の結合ペプチドと対照ペプチドを一緒に含むヘテロマー構築
物もKDRを形質移入した293H細胞に効率的に結合することが可能であった。したが
って、異なるエピトープを認識する2以上の結合ポリペプチドの含有は、KDの減少によ
り示されるように、標的分子への構築物の結合活性をさらに改善する。
機能を阻害するための改善された能力を示す。本明細書に記載された実施例に基づき、K
DRおよび/またはKDR/VEGFの異なるエピトープに特異的な少なくとも2種の結
合ポリペプチドを含む本発明の二量体および他の多量体構築物は、受容体チロシンキナー
ゼの機能を阻害すると予想される。とりわけ、そのような構築物はVEGF−2/KDR
、VEGF−1/Flt−1およびVEGF−3/Flt−4の機能を阻害すると予想さ
れる。
体リン酸化、受容体のキナーゼ活性、下流シグナル伝達分子の動員、遺伝子の誘導、細胞
増殖の誘導、細胞遊走の誘導、またはその組み合わせのいずれか1つを含むことができる
。たとえば、本明細書に提供される結合ポリペプチドのヘテロマー構築物は、KDR受容
体のVEGF誘導リン酸化の阻害により示されるように、ヒト内皮細胞においてVEGF
誘導KDR受容体活性化を阻害する。さらに、本明細書に提供される結合ペプチドのヘテ
ロマー構築物はVEGFで刺激される内皮細胞遊走を阻害する。本明細書に示すように、
単一結合構築物によるKDR上の2以上の異なるエピトープへの標的化は受容体機能を阻
害する構築物の能力を著しく改善する。受容体活性をブロックする能力が弱い結合ペプチ
ドでさえ、VEGF誘導受容体機能をブロックする能力が改善されたヘテロマー構築物を
作製するために使用することができる。
の態様では、多量体構築物は単一結合ポリペプチドの2以上のコピーを含む。他の態様で
は、本発明の多量体構築物は、2以上の結合ポリペプチドを含み、構築物中の少なくとも
2つの結合ポリペプチドはKDRまたはKDR/VEGF上の異なるエピトープに特異的
である。これらの構築物は本明細書で「ヘテロマー構築物」「ヘテロ多量体」などとも呼
ばれる。また、本発明の構築物は関連のないまたは対照のペプチドを包含してもよい。該
構築物は2以上、3以上、または4以上の結合ポリペプチドを包含してもよい。本明細書
に提供される教示に基づき、当業者は本明細書に提供される結合ポリペプチドを多量体構
築物に組み立て、改善された特性、たとえば標的分子を結合するための改善された能力、
または受容体チロシンキナーゼ機能を阻害するための改善された能力を有する多量体構築
物を選択することができる。そのような改善された特性を有する多量体構築物は本発明に
包含される。
R結合ポリペプチドに基づいて決定されている。具体的態様において、本発明のKDRお
よびVEGF/KDR結合ポリペプチドは1以上のこれらの配列を含む。そのような好ま
しいKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドは、以下のコンセンサス配列
1〜5から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成る、不変システイン残
基間に環状構造またはループ構造を形成する可能性を有するポリペプチドを包含する:
コンセンサス配列1:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−X9−X
10−Cys−X12−X13−X14(TN8)、ここで、
X1はAla、Arg、Asp、Gly、His、Leu、Lys、Pro、Ser、T
hr、Trp、TyrもしくはValであり;
X2はAsn、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Phe、Ser、T
hr、Trp、TyrもしくはValであり;
X3はAsn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Met、Thr、Trpもし
くはValであり;
X5はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Lys、P
he、Pro、Ser、TrpもしくはTyrであり;
X6はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、L
ys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはValであり
;
X7はAla、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、P
he、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはValであり;
X8はAla、Asp、Glu、Gly、Leu、Phe、Pro、Ser、Thr、T
rpもしくはTyrであり;
X9はArg、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Thr、T
rp、TyrもしくはValであり;
X10はAla、Arg、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、
Met、Phe、TrpもしくはTyrであり;
X12はArg、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、
Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはValであり;
X13はArg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、
Lys、Met、Phe、Ser、Thr、TrpもしくはTyrであり;そして
X14はGln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、
Pro、Ser、Thr、TrpもしくはTyrである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列2:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−X9−X
10−X11−X12−X13−X14−Cys−X16−X17−X18(TN12)
、ここで、
X1はAla、Asn、Asp、Gly、Leu、Pro、Ser、TrpもしくはTy
r(好ましくはAsn、Asp、Pro、またはTyr)であり;
X2はAla、Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Pro、Ser、T
rpもしくはTyr(好ましくはAsp、Gly、Pro、Ser、またはTrp)であ
り;
X3はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、M
et、Phe、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはTrp)で
あり;
X5はArg、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、T
hr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlu、IleまたはTyr)であり
;
X6はAla、Arg、Asn、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Phe、S
er、TrpもしくはTyr(好ましくはGlu、PheまたはTyr)であり;
X7はArg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Pro、S
er、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlu)であり;
X8はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Met、Phe、P
ro、Ser、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlnまたはSer)であり
;
X9はAsp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、P
ro、Ser、Thr、TrpもしくはTyr(好ましくはAsp)であり;
X10はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、Leu、Lys、
Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくは
LysまたはSer)であり;
X11はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、
Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlyまたはTyr)であり;
X12はAla、Arg、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、
Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはTrpまたはThr)であ
り;
X13はArg、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、
Thr、TrpもしくはVal(好ましくはGluまたはTrp)であり;
X14はArg、Asn、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Phe、
Pro、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはPhe)であり;
X16はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、Lys、Met、Phe、
Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはAsp)であり;
X17はArg、Asn、Asp、Cys、Gly、His、Phe、Pro、Ser、
TrpもしくはTyr(好ましくはProまたはTyr)であり;そして
X18はAla、Asn、Asp、Gly、His、Leu、Phe、Pro、Ser、
TrpもしくはTyr(好ましくはAsn、ProまたはTrp)である、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列3:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−Gly−X9−
Cys−X11−X12−X13(TN7)、ここで、
X1はGlyもしくはTrpであり;
X2はIle、TyrもしくはValであり;
X3はGln、Glu、ThrもしくはTrpであり;
X5はAsn、AspもしくはGluであり;
X6はGlu、His、LysもしくはPheであり;
X7はAsp、Gln、Leu、Lys、MetもしくはTyrであり;
X9はArg、Gln、Leu、LysもしくはValであり;
X11はArg、Phe、Ser、TrpもしくはValであり;
X12はGlu、HisもしくはSerであり;そして
X13はGlu、Gly、TrpもしくはTyrである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列4:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−X9−X
10−X11−Cys−X13−X14−X15(TN9)、
ここで、
X1はArg、Asp、Gly、Ile、Met、ProもしくはTyr(好ましくはT
yr)であり;
X2はAsp、Gly、His、ProもしくはTrp(好ましくはGlyまたはTrp
)であり;
X3はGly、Pro、Phe、ThrもしくはTrp(好ましくはPro)であり;
X5はAla、Asp、Lys、Ser、TrpもしくはVal(好ましくはLys)で
あり;
X6はAsn、Glu、Gly、HisもしくはLeuであり;
X7はGln、Glu、Gly、Met、Lys、Phe、TyrもしくはVal(好ま
しくは好ましくはMet)であり;
X8はAla、Asn、Asp、Gly、Leu、Met、Pro、SerもしくはTh
rであり;
X9はHis、ProもしくはTrp(好ましくはPro)であり;
X10はAla、Gly、His、Leu、TrpもしくはTyr(好ましくはHisま
はtrp)であり;
X11はAla、Asp、Gln、Leu、Met、ThrもしくはTrpであり;
X13はAla、Lys、Ser、Trp、もしくはTyr(好ましくはTrp)であり
;
X14はAsp、Gly、Leu、His、Met、Thr、TrpもしくはTyr(好
ましくはHis、Trp、またはTyr)であり;そして
X15はAsn、Gln、Glu、Leu、Met、ProもしくはTrp(好ましくは
Glu、Met、またはTrp)である、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列5:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−Ser−
Gly−Pro−X12−X13−X14−X15−Cys−X17−X18−X19(
MTN13;配列番号1)、ここで、
X1はArg、Glu、His、SerもしくはTrpであり;
X2はAsn、Asp、Leu、Phe、ThrもしくはValであり;
X3はArg、Asp、Glu、His、LysもしくはThrであり;
X5はAsp、Glu、HisもしくはThrであり;
X6はArg、His、LysもしくはPheであり;
X7はGln、Ile、Lys、TyrもしくはValであり;
X8はGln、Ile、Leu、MetもしくはPheであり;
X12はAsn、Asp、Gly、HisもしくはTyrであり;
X13はGln、Gly、SerもしくはThrであり;
X14はGlu、Lys、PheもしくはSerであり;
X15はGlu、Ile、SerもしくはValであり;
X17はGlu、Gly、Lys、Phe、Ser、もしくはValであり;
X18はArg、Asn、SerもしくはTyrであり;そして
X19はAsp、Gln、Glu、Gly、MetもしくはTyrである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する。
ドのさらなる解析は、好ましい結合ポリペプチドのサブファミリーを明らかにし、それら
は以下のコンセンサス配列6、7および8に記載される:
コンセンサス配列6:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−X9−T
yr−Cys−X12−X13−X14、ここで、
X1はAla、Arg、Asp、Leu、Lys、Pro、SerもしくはValであり
;
X2はAsn、Asp、Glu、Lys、ThrもしくはSer(好ましくはAsn、A
sp、Glu、またはLys)であり;
X3はIle、LeuもしくはTrpであり;
X5はAla、Arg、Glu、LysもしくはSer(好ましくはGlu)であり;
X6はAla、Asp、Gln、Glu、ThrもしくはVal(好ましくはAspまた
はGlu)であり;
X7はAspもしくはGluであり;
X8はTrpもしくはTyrであり;
X9はThrもしくはTyr(好ましくはTyr)であり;
X12はGlu、Met、PheもしくはTyr(好ましくはTrp、Phe、Met、
またはTyr)であり;;
X13はIle、LeuもしくはMetであり;そして
X14はIle、Leu、Met、PheもしくはThr(好ましくはThrまたはLe
u)である、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列7:Trp−Tyr−Trp−Cys−X5−X6−X7−Gly−
X9−X10−Cys−X12−X13−X14(配列番号2)、ここで、
X5はAsp、GlnもしくはHisであり;
X6はHisもしくはTyr(好ましくはTyr)であり;
X7はIle、HisもしくはTyrであり;
X9はIle、MetもしくはValであり;
X10はGlyもしくはTyrであり;
X12はAsp、LysもしくはProであり;
X13はGln、GlyもしくはTrpであり;そして
X14はPhe、SerもしくはThrである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列8:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−Gly−
X10−Cys−X12−X13−X14、ここで、
X1はGly、Leu、His、Thr、TrpもしくはTyr、(好ましくはTrp、
Tyr、LeuまたはHis)であり;
X2はIle、Leu、Thr、TrpもしくはVal(好ましくはVal、Ile、ま
たはLeu)であり;
X3はAsp、Glu、Gln、TrpもしくはThr(好ましくはGlu、Aspまた
はGln)であり;
X5はAla、Arg、Asn、Asp、His、Phe、TrpもしくはTyr(好ま
しくはTyr、TrpまたはPhe)であり;
X6はAla、Asp、Gln、His、Lys、Met、Ser、Thr、Trp、T
yrもしくはValであり;
X7はAla、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、P
he、Pro、Ser、ThrもしくはValであり;
X8はAsp、Phe、Ser、Thr、TrpもしくはTyr(好ましくはThr、S
erまたはAsp)であり;
X10はAla、Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、
TrpもしくはTyr(好ましくはArgまたはLys)であり;
X12はArg、Gln、His、Ile、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、
TyrもしくはVal(好ましくはTyr、Trp、Phe、Ile、またはVal)で
あり;
X13はArg、Asn、Asp、Glu、His、Met、Pro、SerもしくはT
hrであり;そして
X14はArg、Gln、Glu、Gly、Phe、Ser、TrpもしくはTyrであ
る、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する。
チドのさらなる解析は、好ましい結合ポリペプチドのサブファミリーを明らかにし、それ
らは以下のコンセンサス配列9〜12に記載される:
コンセンサス配列9:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−Trp−
Gly−Gly−X12−X13−Cys−X15−X16−X17(TN11、すなわ
ちTN12ライブラリーから単離された11量体結合体;配列番号3)、ここで、
X1はSer、Phe、Trp、TyrもしくはGly(好ましくはSer)であり;
X2はArg、Gly、SerもしくはTrp(好ましくはArg)であり;
X3はAla、Glu、IleもしくはVal(好ましくはValまたはIle)であり
;
X5はAla、PheもしくはTrp(好ましくはTrpまたはPhe)であり;
X6はGluもしくはLys(好ましくはGlu)であり;
X7はAsp、Ser、TrpもしくはTyr(好ましくはAsp、TrpまたはTyr
)であり;
X8はPhe、ProもしくはSer(好ましくはSer)であり;
X12はGlnもしくはGlu(好ましくはGlu)であり;
X13はIle、PheもしくはValであり;
X15はGln、Ile、Leu、PheもしくはTyr(好ましくはPhe、Tyr、
またはLeu)であり;
X16はArg、GlyもしくはPro(好ましくはArg)であり;そして
X17はGln、His、Phe、Ser、TyrもしくはVal(好ましくはTyr、
Phe、HisまたはVal)である、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列10:Tyr−Pro−X3−Cys−X5−Glu−X7−Ser
−X9−Ser−X11−X12−X13−Phe−Cys−X16−X17−X18(
TN12;配列番号4;)、ここで、
X3はGlyもしくはTrp(好ましくはTrp)であり;
X5はHisもしくはTyr(好ましくはHis、またはTyr)であり;
X7はHis、LeuもしくはThrであり;
X9はAspもしくはLeu(好ましくはAsp)であり;
X11はGlyもしくはVal(好ましくはVal)であり;
X12はThrもしくはVal(好ましくはThr)であり;
X13はArgもしくはTrp(好ましくはArg)であり;
X16はAlaもしくはVal(好ましくはVal)であり;
X17はAspもしくはPro(好ましくはPro)であり;そして
X18はGlyもしくはTrp(好ましくはTrp)である、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列11:X1−X2−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−X9−
X10−Gly−X12−Trp−X14−Cys−X16−X17−X18(TN12
;配列番号5)、ここで、
X1はAsp、Gly、Pro、もしくはSer(好ましくはAsp)であり;
X2はArg、Asn、Asp、Gly、もしくはSer(好ましくはAsp、Asn、
またはSer)であり;
X3はGly、Thr、TrpもしくはTyr(好ましくはTrpまたはTyr)であり
;
X5はGlu、MetもしくはThr(好ましくはGlu)であり;
X6はIle、Leu、MetもしくはPhe(好ましくはMet、Leu、またはPh
e)であり;
X7はArg、Asp、Glu、Met、TrpもしくはValであり;
X8はAsn、Gln、Gly、SerもしくはValであり;
X9はAspもしくはGluであり;
X10はLys、Ser、ThrもしくはVal(好ましくはLys)であり;
X12はArg、Gln、LysもしくはTrp(好ましくはTrp、Arg、またはL
ys)であり;
X14はAsn、Leu、PheもしくはTyr(好ましくはTyr、Phe、またはA
sn)であり;
X16はGly、Phe、SerもしくはTyr(好ましくはTyr、またはPhe)で
あり;
X17はGly、Leu、ProもしくはSer(好ましくはProまたはSer)であ
り;そして
X18はAla、Asp、Pro、Ser、Trp、もしくはTyrである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列12:Asn−Trp−X3−Cys−X5−X6−X7−X8−X
9−X10−X11−X12−X13−X14−Cys−X16−X17−X18(TN
12;配列番号6)、ここで、
X3はGluもしくはLysであり;
X5はGluもしくはGlyであり;
X6はTrpもしくはTyrであり;
X7はSerもしくはThrであり;
X8はAsnもしくはGlnであり;
X9はGlyもしくはMetであり;
X10はPheもしくはTyrであり;
X11はAspもしくはGlnであり;
X12はLysもしくはTyrであり;
X13はGluもしくはThrであり;
X14はGluもしくはPheであり;
X16はAlaもしくはValであり;
X17はArgもしくはTyrであり;そして
X18はLeuもしくはProである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する。
は、以下のコンセンサス配列13および14のアミノ酸配列を含む好ましい態様の2種の
ファミリーを明らかにした:
コンセンサス配列13:Z1−X1−X2−X3−X4−X5−Z2(Lin20)、
ここで、
Z1は少なくとも1つのアミノ酸のポリペプチドであるか、または存在せず;
X1はAla、Asp、GlnもしくはGlu(好ましくはGlnまたはGlu)であり
;
X2はAla、Asp、Gln、Glu、Pro(好ましくはAsp、GlnまたはGl
u)であり;
X3はAla、Leu、Lys、Phe、Pro、Trp、もしくはTyr(好ましくは
Trp、Tyr、PheまたはLeu)であり;
X4はAsp、Leu、Ser、Trp、Tyr、もしくはVal(好ましくはTyr、
Trp、LeuまたはVal)であり;
X5はAla、Arg、Asp、Glu、Gly、Leu、Trp、もしくはTyr(好
ましくはTrp、TyrまたはLeu)であり;そして
Z2は少なくとも1つのアミノ酸のポリペプチドであるか、または存在しない、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
コンセンサス配列14:X1−X2−X3−Tyr−Trp−Glu−X7−X8−X
9−Leu(Lin20;配列番号7);ここで、配列は場合によりN末端ポリペプチド
、C末端ポリペプチド、または両末端において少なくとも1つのアミノ酸のポリペプチド
を有することができ、ここで、
X1はAsp、GlyもしくはSer(好ましくはGly)であり;
X2はIle、PheもしくはTyrであり;
X3はAla、SerもしくはValであり;
X7はGln、Glu、IleもしくはValであり;
X8はAla、IleもしくはVal(好ましくはIleまたはVal)であり;
X9はAla、Glu、ValもしくはThrである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する。
X10のアミノ酸配列がAsp−Trp−Tyr−Tyr(配列番号8)であるポリペプ
チドが挙げられる。より好ましい構造には、コンセンサス配列1を含むポリペプチドが挙
げられ、ここでX3はTrpであり、そしてX5〜X10のアミノ酸配列はGlu−Gl
u−Asp−Trp−Tyr−Tyr(配列番号9)である。コンセンサス配列1を含む
別の好ましい配列には、X3がTrpであり、X5〜X10のアミノ酸配列がGlu−G
lu−Asp−Trp−Tyr−Tyr(配列番号9)であり、そしてペプチドX13〜
X14がIle−Thrであるポリペプチドが挙げられる。これらの好ましいポリペプチ
ドの中で、X1がProであり、そしてX12がPhe、TrpまたはTyrの1つであ
るものがさらに好ましい。
開示される。
KDRまたはVEGF/KDR標的を結合させることが見出されたさらなる環状ポリペ
プチドは、2つのシステイン残基間のジスルフィド結合により形成され、たとえば以下の
ような10アミノ酸から成る環状部分(またはループ)を有する:
Asn−Asn−Ser−Cys−Trp−Leu−Ser−Thr−Thr−Leu−
Gly−Ser−Cys−Phe−Phe−Asp(配列番号10)、
Asp−His−His−Cys−Tyr−Leu−His−Asn−Gly−Gln−
Trp−Ile−Cys−Tyr−Pro−Phe(配列番号11)、
Asn−Ser−His−Cys−Tyr−Ile−Trp−Asp−Gly−Met−
Trp−Leu−Cys−Phe−Pro−Asp(配列番号12)。
配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはそれから成るKDRまたはVEGF/KD
R標的を結合可能な線状ポリペプチドを包含する。
した付加的なアミノ酸を有していてもよい。好ましい態様において、1以上、好ましくは
2アミノ酸のN末端および/またはC末端フランキングペプチドを有する本発明に記載の
結合ポリペプチドを作製することができ、該アミノ酸は結合ポリペプチドが単離されたフ
ァージ選択物のディスプレイ構築物のフランキングペプチドに対応する。好ましいN末端
フランキングペプチドには、Ala−Gly−(TN7、TN8、TN9配列に最も好ま
しい)、Gly−Ser−(TN10配列に最も好ましい)、Gly−Asp−(TN1
2配列に最も好ましい)、Ala−Gln−(線状配列に最も好ましい)、およびSer
−Gly−(MTN13配列に最も好ましい)が挙げられる。好ましいC末端フランキン
グペプチドには、−Gly−Thr(TN7、TN8、TN9配列に最も好ましい)、−
Ala−Pro(TN10配列に最も好ましい)、−Asp−Pro(TN12配列に最
も好ましい)、−Gly−Gly(線状配列に最も好ましい)、および−Gly−Ser
(MTN13配列に最も好ましい)が挙げられる。また、単一の末端アミノ酸を本発明の
結合ポリペプチドに付加してもよく、そして好ましい末端アミノ酸は親ファージディスプ
レイ構築物に対応することになり、たとえば最も好ましくは、N末端アミノ酸はGly−
(TN7、TN8、TN9、MTN13配列に最も好ましい)、Ser−(TN10配列
に最も好ましい)、Asp−(TN12配列に最も好ましい)、およびGln−(線状配
列に最も好ましい)から選択され、そして最も好ましいC末端アミノ酸は−Gly(TN
7、TN8、TN9、MTN13および線状配列に最も好ましい)、−Ala(TN10
配列に最も好ましい)、および−Asp(TN12配列に最も好ましい)から選択される
ことになる。そのようなフランキングアミノ酸に対する保存的置換(すなわち、以下の群
から選択されるアミノ酸置換:{Arg、His、Lys}、{Glu、Asp}、{A
sp、Cys、Glu、Gly、Ser、Thr、Tyr}、{Ala、Ile、Leu
、Met、Phe、Pr、Trp、Val})も企図される。
、TN7、TN8、TN9、TN10、TN12およびMTN13と呼ばれるライブラリ
ー)の単離物由来の配列情報および結合データの検索により、ループ構造を形成すること
ができる一連のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドを同定する。具体
的な態様において、本発明の環状KDRまたはVEGF/KDR結合ポリペプチドは、以
下のループコンセンサス配列15〜20から選択されるアミノ酸配列を包含するか、ある
いはそれから成る:
ループコンセンサス配列15:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−X7−Cys
(TN8)、ここで、
X2はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Lys、P
he、Pro、Ser、TrpもしくはTyr(好ましくはAsp、Glu、またはTy
r)であり;
X3はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、L
ys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ま
しくはGlu、MetまたはTyr)であり;
X4はAla、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、P
he、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはAsp)で
あり;
X5はAla、Asp、Glu、Gly、Leu、Phe、Pro、Ser、Thr、T
rp、もしくはTyr(好ましくはTrpまたはThr)であり;
X6はArg、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Thr、T
rp、TyrもしくはVal(好ましくはGlyまたはTyr)であり;そして
X7はAla、Arg、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、M
et、Phe、Trp、もしくはTyr(好ましくはLysまたはTyr)である;
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
ループコンセンサス配列16:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−
X9−X10−X11−Cys(TN12)、ここで、
X2はArg、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、T
hr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlu、IleまたはTyr)であり
;
X3はAla、Arg、Asn、Cys、Glu、Ile、Leu、Met、Phe、S
er、TrpもしくはTyr(好ましくはGlu、PheまたはTyr)であり;
X4はArg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Pro、S
er、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlu)であり;
X5はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Met、Phe、P
ro、Ser、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはGlnまたはSer)であり
;
X6はAsp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、P
ro、Ser、Thr、TrpもしくはTyr(好ましくはAsp)であり;
X7はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、Leu、Lys、M
et、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはL
ysまたはSer)であり;
X8はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、T
rp、Tyr、もしくはVal(好ましくはGlyまたはTyr)であり;
X9はAla、Arg、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、S
er、Thr、Trp、TyrもしくはVal(好ましくはTrpまたはThr)であり
;
X10はArg、Gln、Glu、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、
Thr、TrpもしくはVal(好ましくはGluまたはTrp)であり;そして
X11はArg、Asn、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Phe、
Pro、Thr、Trp、Tyr、もしくはVal(好ましくはPhe)である;
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
ループコンセンサス配列17:Cys−X2−X3−X4−Gly−X6−Cys(T
N7)、ここで、
X2はAsn、AspもしくはGluであり;
X3はGlu、His、LysもしくはPheであり;
X4はAsp、Gln、Leu、Lys、MetもしくはTyrであり;そして
X6はArg、Gln、Leu、LysもしくはValである;
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
ループコンセンサス配列18:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−
Cys(TN9)、ここで、
X2はAla、Asp、Lys、Ser、TrpもしくはVal(好ましくはLys)で
あり;
X3はAsn、Glu、Gly、HisもしくはLeuであり;
X4はGln、Glu、Gly、Met、Lys、Phe、TyrもしくはVal(好ま
しくはMet)であり;
X5はAla、Asn、Asp、Gly、Leu、Met、Pro、SerもしくはTh
rであり;
X6はHis、ProもしくはTrp(好ましくはProまたはTrp)であり;
X7はAla、Gly、His、Leu、TrpもしくはTyr(好ましくはTrp)で
あり;そして
X8はAla、Asp、Gln、Leu、Met、ThrもしくはTrpである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する;または
ループコンセンサス配列19:Cys−X2−X3−X4−X5−Ser−Gly−P
ro−X9−X10−X11−X12−Cys(MTN13;配列番号13)、ここで、
X2はAsp、Glu、HisもしくはThrであり;
X3はArg、His、LysもしくはPheであり;
X4はGln、Ile、Lys、TyrもしくはValであり;
X5はGln、Ile、Leu、MetもしくはPheであり;
X9はAsn、Asp、Gly、HisもしくはTyrであり;
X10はGln、Gly、SerもしくはThrであり;
X11はGlu、Lys、PheもしくはSerであり;そして
X12はGlu、Ile、SerもしくはValである、
ここで、ポリペプチドはKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する。
ンサス配列20〜22を含む、KDRおよび/またはVEGF/KDR複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる:
ループコンセンサス配列20:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−Tyr−Cy
s(TN8)、ここで、
X2はAla、Arg、Glu、LysもしくはSer(好ましくはGlu)であり;
X3はAla、Asp、Gln、Glu、ThrもしくはVal(好ましくはAspまた
はGlu)であり;
X4はAspもしくはGluであり;
X5はTrpもしくはTyrであり;そして
X6はThrもしくはTyr(好ましくはTyr)である;または
ループコンセンサス配列21:Cys−X2−X3−X4−Gly−X6−X7−Cy
s(TN8)、ここで、
X2はAsp、GlnもしくはHisであり;
X3はHisもしくはTyr(好ましくはTyr)であり;
X4はHis、IleもしくはTyrであり;
X6はIle、MetもしくはValであり;そして
X7はGlyもしくはTyrである;または
ループコンセンサス配列22:Cys−X2−X3−X4−X5−Gly−X7−Cy
s(TN8)、ここで、
X2はAla、Arg、Asn、Asp、His、Phe、TrpもしくはTyr(好ま
しくはTyr、Trp、またはPhe)であり;
X3はAla、Asp、Gln、His、Lys、Met、Ser、Thr、Trp、T
yrもしくはValであり;
X4はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、L
ys、Pro、Ser、ThrもしくはValであり;
X5はAsp、Phe、Ser、Thr、TrpもしくはTyr(好ましくはThr、S
er、またはAsp)であり;そして
X7はAla、Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、T
rpもしくはTyr(好ましくはArgまたはLys)である。
ンサス配列23〜26の配列を含む、KDRおよび/またはVEGF/KDR複合体結合
ポリペプチドが挙げられる:
ループコンセンサス配列23:Cys−X2−X3−X4−X5−Trp−Gly−G
ly−X9−X10−Cys(TN11、すなわちTN12ライブラリーの単離物に基づ
いた11量体;配列番号14)、ここで、
X2はAla、PheもしくはTrp(好ましくはTrpまたはPhe)であり;
X3はGluもしくはLys(好ましくはGlu)であり;
X4はAsp、Ser、TrpもしくはTyr(好ましくはAsp、TrpまたはTyr
)であり;
X5はPhe、ProもしくはSer(好ましくはSer)であり;
X9はGlnもしくはGlu(好ましくはGlu)であり;そして
X10はIle、PheもしくはValである;または
ループコンセンサス配列24:Cys−X2−Glu−X4−Ser−X6−Ser−
X8−X9−X10−Phe−Cys(TN12;配列番号15)、ここで、
X2はHisもしくはTyrであり;
X4はLeu、HisもしくはThrであり;
X6はAspもしくはLeu(好ましくはAsp)であり;
X8はGlyもしくはVal(好ましくはVal)であり;
X9はThrもしくはVal(好ましくはThr)であり;そして
X10はArgもしくはTrp(好ましくはArg)である;または
ループコンセンサス配列25:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−X7−Gly
−X9−Trp−X11−Cys(TN12;配列番号16)、ここで、
X2はGlu、MetもしくはThr(好ましくはGlu)であり;
X3はIle、Leu、MetもしくはPhe(好ましくはMet、LeuまたはPhe
)であり;
X4はArg、Asp、Glu、Met、TrpもしくはValであり;
X5はAsn、Gln、Gly、SerもしくはValであり;
X6はGluもしくはAspであり;
X7はLys、Ser、ThrもしくはVal(好ましくはLys)であり;
X9はArg、Gln、LysもしくはTrp(好ましくはTrp、ArgまたはLys
)であり;そして
X11はAsn、Leu、PheもしくはTyr(好ましくはTyr、PheまたはAs
n)である;または
ループコンセンサス配列26:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−
X9−X10−X11−Cys(TN12)、ここで、
X2はGluもしくはGlyであり;
X3はTrpもしくはTyrであり;
X4はSerもしくはThrであり;
X5はAspもしくはGlnであり;
X6はGlyもしくはMetであり;
X7はPheもしくはTyrであり;
X8はAspもしくはGlnであり;
X9はLysもしくはTyrであり;
X10はGluもしくはThrであり;そして
X11はGluもしくはPheである。
ンサス配列27の配列を含む、KDRおよび/またはVEGF/KDR複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる:
ループコンセンサス配列27:Cys−X2−X3−X4−Gly−X6−Cys(TN
7)、ここで、
X2はAsn、AspまたはGluであり;
X3はGlu、His、LysまたはPheであり;
X4はAsp、Gln、Leu、Lys、MetまたはTyrであり;そして
X6はArg、Gln、Leu、LysまたはValである。
ンサス配列28の配列を含む、KDRおよび/またはVEGF/KDR複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる:
ループコンセンサス配列28:Cys−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−
Cys(TN9)、ここで、
X2はAla、Lys、Ser、TrpまたはVal(好ましくはLys)であり;
X3はAsn、Glu、Gly、HisまたはLeuであり;
X4はGlu、Gly、Lys、MetまたはTyr(好ましくはMet)であり;
X5はAla、Asn、Asp、Leu、Met、ProまたはSerであり;
X6はHis、ProまたはTrp(好ましくはPro)であり;
X7はHis、Leu、TrpまたはTyr(好ましくはTrpまたはHis)であり;
そして
X8はAla、Asp、Gln、Leu、Met、ThrまたはTrpである。
ンサス配列29の配列を含む、KDRおよび/またはVEGF/KDR複合体結合ポリペ
プチドが挙げられる:
ループコンセンサス配列29:Cys−X2−X3−X4−X5−Ser−Gly−P
ro−X9−X10−X11−X12−Cys(MTN13;配列番号17)、ここで、
X2はAsp、Glu、HisまたはThrであり;
X3はArg、His、LysまたはPheであり;
X4はGln、Ile、Lys、TyrまたはValであり;
X5はGln、Ile、Leu、MetまたはPheであり;
X9はAsn、Asp、Gly、HisまたはTyrであり;
X10はGlu、Gly、SerもしくはThrであり;
X11はGlu、Lys、PheまたはSerであり;そして
X12はGlu、Ile、SerまたはValである。
ンサス配列に適合する任意の具体的配列に使用される、化学的または物理的改変、および
本明細書に記載の任意の配列改変が包含される。
末端のいずれかまたは両方に結合する付加的なアミノ酸を有していてもよく、多量体構築
物に改変するか、最適化するか、または使用してよい。さらに、本発明は本明細書に記載
のKDRおよびVEGF/KDR複合体結合ペプチドの相同体を包含する。
定の血管新生造影剤を提供するための上記ポリペプチドの改変に関する。そのような検出
可能な標識には、放射性標識、酵素標識もしくはMR常磁性キレート剤もしくは微小粒子
による標識;超音波バブル、微小粒子、ミクロスフェア、エマルジョンもしくはリポソー
ムへの取込;または光学色素との結合を挙げることができる。
現細胞を単離するための方法が提供される。
さらに、本発明のKDRおよびVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドは、薬剤的に
受容できる組成物中の単独生理活性物質として、または血管新生もしくはたとえばマラリ
ア、HIV、SIV、サル出血熱等を含む多数の病原体に関連する疾患に関与する状態ま
たは疾患を治療するための他の治療薬と結合して(または組み合わせて)治療薬として使
用することができる。
もしれない。これは、a)血清アルブミンのような血清タンパク質上の遊離スルフヒドリ
ル基と反応する、マレイミドのような部分をペプチドに結合させること、b)血清アルブ
ミンのような血清タンパク質に非共有結合的に結合する、脂肪酸のような部分をペプチド
に結合させること、c)血清滞留時間を延長させることが公知のPEGのようなポリマー
をペプチドに結合させること、およびd)ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質ま
たは抗体をコードするDNAに、KDR結合ペプチドをコードするDNAを融合させ、コ
ードされた融合タンパク質を発現させることにより達成することができる。
であろう。
本発明の他の側面では、標的発現細胞に結合する能力についてファージディスプレイに
より同定されたポリペプチドをスクリーニングする方法が提供される。これらの方法は、
標準の細胞結合アッセイで評価するには単量体親和性が低すぎるポリペプチドを含むポリ
ペプチドの結合能力の迅速なスクリーニングを可能にする。
以下のセクションにおいて、「組換え体」という用語は、非天然に変換または操作され
た核酸、異種核酸を形質移入された宿主細胞、または単離されたDNAの操作および宿主
細胞の形質転換により非天然に発現されたポリペプチドを説明するために使用される。組
換え体は、遺伝子工学的技術を使用して、in vitroで構築されているDNA分子
を特に包含し、そして分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドを説明するための形容詞としての「組換え体」という用語の使用は、天然に存在する
そのような分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを特に
除外する。
子の凝集により構築された保護殻を含む細菌ウイルスとして定義される。「バクテリオフ
ァージ」および「ファージ」という用語は、本明細書では互換性がある。
鎖(側鎖に対して)を介して結合した2以上のアミノ酸の化合物を表すために使用される
。本明細書では、「ペプチド」という用語は「ポリペプチド」と互換性があるが、通常4
0以下、好ましくは25以下のアミノ酸を有するポリペプチドを表すために使用される。
成可能ないずれかのポリペプチドを表す。本明細書で時々使用される同じ意味の用語は「
結合部分」である。「KDR結合ポリペプチド」は、血管内皮増殖因子受容体−2(また
はKDR、Flk−1)とin vitroまたはin vivoで複合体を形成するポ
リペプチドであり;「VEGF/KDR複合体結合ポリペプチド」は、血管内皮増殖因子
(VEGF)とKDRとのあいだで形成される結合複合体、とりわけ血管新生中に内皮細
胞の表面において形成されると考えられる、ホモ二量体VEGFと1つまたは2つのKD
R分子との複合体とin vitroまたはin vivoで複合体を形成するポリペプ
チドである。KDRおよびVEGF/KDR結合ポリペプチドの具体的な例としては、以
下の表1〜7に提示されるペプチドが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
そしてそのようなペプチドを取り込むハイブリッドおよびキメラポリペプチドを包含する
。また、本明細書に記載のように改変または最適化されたポリペプチドは、KDRおよび
VEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの定義内に包含される。
裂部位を削除するなどのために親ポリペプチド配列をアミノ酸置換すること;たとえば結
合ポリペプチドを検出可能な画像化標識または他の基質に連結させるためのC末端または
N末端のアミノ酸置換または伸長、その例としては、たとえば精製を補助するためにポリ
ヒスチジン「尾部」を付加することが挙げられる;切断;アミド結合変化;転位;レトロ
インベルソペプチド;ペプトイド;レトロインベルソペプトイド;N末端もしくはC末端
の改変またはリンカー、たとえばポリグリシンまたはポリリジンセグメントの使用;固体
支持体上に本発明の結合ポリペプチドを固定化させるのを補助するか、または蛍光色素を
結合するために、官能基、とりわけヒドラジド(−NH−NH2)官能基もしくはC末端
リンカー−Gly−Gly−Gly−Lys(配列番号18)を含むように変換すること
;薬物動態学的改変、構造特性を保持するための構造改変、水溶性を増加させるためもし
くは製剤化し易くするための塩形成などが挙げられる。
切な基質には、殺腫瘍剤もしくは酵素、リポソーム(たとえば治療薬、超音波適合ガスま
たは両方を負荷したもの)、または固体支持体、ウェル、プレート、ビーズ、チューブ、
スライド、フィルター、もしくはディッシュが挙げられる。さらに、1以上のKDRまた
はVEGF/KDR結合ポリペプチドの二量体または多量体が形成されてもよい。そのよ
うな構築物は、たとえば促進されたKDRへの結合能を示すことができる。また、そのよ
うに改変された結合ポリペプチドのすべては、それらがKDRまたはVEGF/KDR標
的に結合する能力を保持する限り、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチ
ドであると見なされる。
公知の改変または最適化技術のいずれかを使用して作製することができる。そのような相
同体ポリペプチドは、アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失または他のそのような改変が
KDRまたはVEGF/KDR複合体のいずれかに結合するその能力を除去しない限り、
本発明の範囲およびKDRおよびVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの定義内に包
含される。本明細書で使用する「相同性」という用語は、2種のポリマー(すなわち、ポ
リペプチド分子または核酸分子)間の配列相同性の程度を表す。同じ核酸もしくはアミノ
酸残基または実質的に類似した特性を有するもの(すなわち保存的置換)が比較される2
種のポリマーにおいてある配列位置を占める場合、ポリマーはその位置において相同であ
る。たとえば、2種のポリペプチド配列において100のアミノ酸位置のうち60アミノ
酸残基が一致するか相同である場合、2種の配列は60%相同性である。本明細書で表さ
れた相同性%の数字は、2種のポリマー間で可能な最大相同性、すなわち、一致した(相
同性の)位置が最も多くなるように2種のポリマーを並べた場合の%相同性を意味する。
本発明の範囲内のポリペプチド相同体は、本明細書に開示された少なくとも1つのKDR
またはVEGF/KDR結合配列に少なくとも70%、好ましくは80%以上相同性であ
ろう。
するという、本明細書に記載のアッセイを含む標準アッセイによる確定を表す。そのよう
な標準アッセイには、平衡透析、ゲルろ過、および結合によるスペクトル変化のモニタリ
ングを含むが、それらに限定されない。
ポリペプチドを表す。「KDR特異性」という用語は、KDRに対して他の無関係な標的
より高い親和性を有するKDR結合部分を表す。「VEGF/KDR特異性」という用語
は、VEGF/KDR複合体に対して所定の標的より高い親和性を有するVEGF/KD
R複合体結合部分を表す。結合特異性は、2種の試験される標的物質に対する解離平衡定
数(KD)または会合平衡定数(Ka)により特徴付けられるか、または相対的結合強度
の任意の尺度であってもよい。本発明に記載の結合ポリペプチドは、KDRまたはVEG
F/KDR複合体に特異的で、好ましくはKDRまたはVEGF/KDR複合体に対する
KDが10μM未満、より好ましくは1.0μM未満、最も好ましくは0.5μM未満ま
たはずっと低い。
「薬剤的に受容できる」担体または賦形剤という用語は、本発明の化合物と一緒に患者
に投与でき、その生物活性または薬理活性を破壊しない、非毒性の担体または賦形剤を表
す。
ルボニル(fmocまたはFmoc)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)
、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、無水酢酸(Ac2O)、(4,
4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシ−1−イリデン)−3−メチルブチル(i
vDde)、トリフルオロ酢酸(TFA)、試薬B(TFA:H2O:フェノール:トリ
イソプロピルシラン、88:5:5:2)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DI
EA)、O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメ
チルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、O−(7−アザベンゾトリ
アゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホス
フェート(HATU)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、固相ペプチド合成(
SPPS)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジクロロメタン(DCM)、ジメチル
ホルムアミド(DMF)、およびN−メチルピロリジノン(NMP)。
本発明は、KDRまたはVEGFとKDRとの複合体に結合する新規結合部分を提供す
る。そのような結合部分は、アップレギュレーションされたKDR発現を示しVEGFに
結合する、活性化内皮細胞の効率的な検出、画像化および局在化を可能にする。そのよう
な内皮細胞は活発な血管新生に特徴的であり、したがって本明細書に記載のポリペプチド
は血管新生部位の検出、モニタリングおよび局在化の手段を提供する。とりわけ、本発明
の結合ポリペプチドは、適切に標識された場合、腫瘍誘発血管新生の検出、画像化および
局在化に有用である。したがって、結合ポリペプチドは、新生物性腫瘍増殖または他の病
原性血管新生事象の診断および治療のための多様な診断薬および治療薬の作製に使用する
ことができる。さらに、結合ポリペプチド自体を治療薬として使用することができる。
にファージディスプレイライブラリーのスクリーニング、すなわち表面に外来ペプチドを
発現するように形質転換された組換えバクテリオファージ集団のスクリーニングにより単
離された。KDRまたはVEGF/KDRのような特定の標的に対する新規ポリペプチド
結合部分を単離するために、たとえばファージディスプレイライブラリーを使用して、大
きなペプチドライブラリーをスクリーニングすることは、非常に大量(たとえば、5×1
09)の潜在的結合体を試験することができ、好結果の結合体を短期間で単離できる点で
とりわけ好都合である。
クリーニングするためのポリペプチドを提示するファージライブラリーを作製するために
、ライブラリーに提示されるペプチドに対する構造テンプレートとして作用するように結
合ドメイン候補が選択される。ファージライブラリーは多数の親ドメインまたはテンプレ
ートの類似体から構成される。結合ドメインテンプレートは天然でも合成タンパク質でも
よく、またはタンパク質の領域もしくはドメインであってもよい。結合ドメインテンプレ
ートは、結合ドメインテンプレートと結合標的とのあいだの公知の相互作用に関する知識
に基づき選択することができるが、このことは重要ではない。実際、ライブラリーのテン
プレートとして作用するように選択されたドメインが標的に対して任意の親和性を有する
ことは少しも重要ではない。その目的は、類似構造をしたポリペプチド(類似体)の多様
性(ライブラリー)を作製できる構造を提供することであり、その類似体の多様性は好ま
しくは所望の結合特性(およびスクリーニングされるいずれか他の特性)を示す1以上の
類似体を包含するであろう。
選択において考慮すべき最も重要なことは、多様なペプチドドメインがどのように標的に
提示されるかということ、すなわちどのようなコンホメーションにおいてペプチド類似体
が標的と接触することになるかということである。ファージディスプレイ法において、た
とえば類似体は、類似体をコードする合成DNAをファージに挿入することにより作製さ
れ、ファージの表面に類似体を提示することになる。多様な異なるポリペプチドを提示す
るM13ファージのようなファージのライブラリーは、たとえば、本明細書に援用される
Kay et al.,Phage Display of Peptides and
Proteins:A Laboratory Manual(Academic P
ress,Inc.,San Diego,1996)および米国特許第5,223,4
09号(Ladner et al.)に記載の技術を使用して作製することができる。
TN8/IX、TN9/IV、TN10/IX、TN12/I、およびMTN3/1と呼
ばれる7種の環状ペプチド(またはループ)ライブラリー、ならびにLin20と呼ばれ
る線状ライブラリーが使用された。それぞれのライブラリーはM13ファージ上に多様な
ポリペプチドを発現するために構築された。「TN」表示を有する7種のライブラリーは
、それぞれタンパク質IIIのアミノ末端の6、7、8、9、10、12または13アミ
ノ酸の、短い多様な外来ペプチドループをM13ファージの表面に提示するように設計さ
れた。該ライブラリーは、TN6/VI(潜在的に3.3×1012アミノ酸配列多様性
を有する)、TN7/IV(潜在的に1.2×1014アミノ酸配列多様性を有する)、
TN8/IX(潜在的に2.2×1015アミノ酸配列多様性を有する)、TN9/IV
(潜在的に4.2×1016アミノ酸配列多様性を有する)、TN10/IX(潜在的に
3.0×1016アミノ酸配列多様性を有する)、TN12/I(潜在的に4.6×10
19アミノ酸配列多様性を有する)、MTN13/I(潜在的に8.0×1017アミノ
酸配列多様性を有する)、およびLin20(潜在的に3.8×1025アミノ酸配列多
様性を有する)と呼ばれる。
ンパク質結合ループを提示するように構築された。TN6/VIライブラリーはXaa1
−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Cys−X
aa10−Xaa11−Xaa12のテンプレート配列を使用した。テンプレートの2、
3、5、6、7、8、10、および11番目のアミノ酸はシステイン(Cys)以外の任
意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの1および12番目のアミノ酸はシステ
イン(Cys)、グルタミン酸(Glu)、イソロイシン(Ile)、リジン(Lys)
、メチオニン(Met)、およびスレオニン(Thr)以外の任意のアミノ酸に変化可能
であった。
ンパク質結合ループを提示するように構築された。TN7/IVライブラリーはXaa1
−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−
Cys−Xaa11−Xaa12−Xaa13のテンプレート配列を使用した。テンプレ
ートの1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、および13番目のアミノ酸は、シ
ステイン(Cys)以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。
ンパク質結合ループを提示するように構築された。TN8/IXライブラリーはXaa1
−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−
Xaa10−Cys−Xaa12−Xaa13−Xaa14のテンプレート配列を使用し
た。テンプレートの1、2、3、5、6、7、8、9、10、12、13および14番目
のアミノ酸はシステイン(Cys)以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。
ンパク質結合ループを提示するように構築された。TN9/IVライブラリーはXaa1
−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−
Xaa10−Xaa11−Cys−Xaa13−Xaa14−Xaa15のテンプレート
配列を使用した。テンプレートの1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、13、
14および15番目のアミノ酸はシステイン(Cys)以外の任意のアミノ酸に変化可能
であった。
タンパク質結合ループを提示するように構築された。TN10/IXライブラリーはXa
a1−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa
9−Xaa10−Xaa11−Xaa12−Cys−Xaa14−Xaa15−Xaa1
6のテンプレート配列を使用した。テンプレートの1、2、15および16番目のアミノ
酸は、10アミノ酸:D、F、H、L、N、P、R、S、W、またはYの群から選択され
る任意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの3および14番目のアミノ酸は、
14アミノ酸:A、D、F、G、H、L、N、P、Q、R、S、V、W、またはYの群か
ら選択される任意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの5、6、7、8、9、
10、11、および12番目のアミノ酸はシステイン(Cys)以外の任意のアミノ酸に
変化可能であった。
ンパク質結合ループを提示するように構築された。TN12/IライブラリーはXaa1
−Xaa2−Xaa3−Cys−Xaa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−
Xaa10−Xaa11−Xaa12−Xaa13−Xaa14−Cys−Xaa16−
Xaa17−Xaa18のテンプレート配列を使用した。テンプレートの1、2、17お
よび18番目のアミノ酸は、12アミノ酸:A、D、F、G、H、L、N、P、R、S、
W、またはYの群から選択される任意のアミノ酸に変化可能であった。テンプレートの3
、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および16番目のアミノ酸はシ
ステイン(Cys)以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。
より分離された等しいサイズ(すなわち8アミノ酸)の2つの可変領域を特徴とする19
アミノ酸のテンプレートに含有される単一の微小タンパク質結合ループを提示するように
構築された。MTN13/IライブラリーはXaa1−Xaa2−Xaa3−Cys−X
aa5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Ser−Gly−Pro−Xaa12−Xaa
13−Xaa14−Xaa15−Cys−Xaa16−Xaa17−Xaa18−Xaa
18(配列番号19)のテンプレート配列を使用した。テンプレートの1、2、3、5、
6、7、8、12、13、14、15、17、18、および19番目のアミノ酸はシステ
イン(Cys)以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。
するように構築された。テンプレートのそれぞれの位置におけるアミノ酸はシステイン(
Cys)以外の任意のアミノ酸に変化可能であった。
切断を包含することができる。そのような改変された結合ポリペプチドはKDRまたはV
EGF/KDR複合体に結合することが予想される。たとえば、本明細書に提供される結
合ポリペプチドのいくつかのN末端に存在する−GGGKリンカーは任意のリンカーであ
る。したがって、末端の−GGGK配列がない以外は同じ配列を有するポリペプチドも本
発明に包含される。さらに、本明細書に提供されるテンプレートおよび配列のループ部分
を含む結合ポリペプチドはKDRおよび/またはVEGF/KDR複合体に結合すること
が予想され、やはり本発明に包含される。テンプレートおよび配列のループ部分は、ジス
ルフィド結合を形成すると考えられる2つのシステイン残基の間であって、それらを含む
配列を包含し、それによってペプチドループ構造を生成する。さらに、本発明の結合ポリ
ペプチドは付加的なアミノ酸残基をN末端および/またはC末端に含むことができる。
内に、設計された一連の変異または変化を作製することにより作られ、それぞれの変異配
列は、テンプレート配列中に1以上のアミノ酸変化を有すること以外は、全体的な構造に
おいてテンプレートに対応するペプチド類似体をコードする。新規に変化した(変異した
)DNAは配列多様性を提供し、そしてそれぞれの形質転換ファージは、DNAによりコ
ードされる初期のテンプレートアミノ酸配列の1変異体を提示し、極めて多数の異なるが
構造的に関連したアミノ酸配列をファージ集団(ライブラリー)に提示させる。アミノ酸
変化は、少なくとも大部分の置換物において著しい構造変化なしに、結合ペプチドまたは
ドメインの結合特性を変化させると考えられる。変化のために選択されるアミノ酸位置(
可変アミノ酸位置)は、表面のアミノ酸位置、すなわち、ドメインが最も安定なコンホメ
ーションであるとき外部表面(すなわち溶液に曝される表面)に現れるドメインのアミノ
酸配列における位置であることが好ましい。最も好ましくは、変化させるアミノ酸位置は
、置換による効果を最大にするために、隣接するかまたは接近しているであろう。
ptides and Proteins:A Laboratory Manual(
Academic Press,Inc.,San Diego,1996)および米国
特許第5,223,409号に記載の技術は、選択された親テンプレートに対応する潜在
的な結合体ライブラリーの作製にとりわけ有用である。先に説明した7種のライブラリー
はそのような技術に従って作製され、それらは以下の実施例で説明するように、固定した
標的に対するKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドに関してスクリーニ
ングされた。
コンポーネントに接触させて結合させる。結合体と非結合体の分離を容易にするには、固
体支持体上に標的を固定することが好都合である。標的結合部分を有するファージは固体
支持体上で標的と複合体を形成するが、非結合ファージは溶液に残り、過剰なバッファー
で洗浄することができる。次に結合ファージは、バッファーを極端なpH(pH2または
pH10)に変え、バッファーのイオン強度を変え、変性剤を添加し、または他の公知の
手段により、標的から遊離される。本発明のポリペプチドを示す結合ファージを単離する
ためにタンパク質溶出が行われる。すなわち、あるファージは溶液中でVEGFを使用し
て標的から溶出され(競合的溶出);また、VEGFと一晩インキュベートしても競合阻
害されない非常に高親和性の結合ファージは、大腸菌細胞に感染させるための依然として
基質に結合したファージを使用することにより、捕捉される。
んだ新規プールを用いて繰り返されたスクリーニング工程により増幅することができる。
少しの結合ファージの回収でさえ、工程を完了させるのに十分である。数ラウンドの選択
後、結合プール中の選択されたファージクローンに由来する結合部分をコードする遺伝子
配列を以下に記載の慣用の方法により決定し、ファージの結合親和性を標的に付与するペ
プチド配列を明らかにする。選択工程を行う場合、集団の配列多様性は所望の結合体が残
るまでそれぞれの選択ラウンドごとに低下する。配列は、少数の関連する結合体、通常そ
れぞれのライブラリーに由来する1千万以上のオリジナル候補から10〜50に収束する
。それぞれの選択ラウンドで回収されるファージ数が増加し、そしてもちろん、密接に関
連する配列が回収されることは、スクリーニング中にライブラリーの収束が起こったこと
を示す良い指標である。1組の結合ポリペプチドが同定された後、配列情報を使用して、
付加的な所望の特性を有するメンバーに関してバイアスをかけた他の二次的なファージラ
イブラリーを設計することができる。
すため、その形成は好都合である。しかし、血清中では、遊離システインまたは他のチオ
ール含有分子により、ジスルフィド結合は開裂されるかもしれない。したがって、システ
イン残基を改変して、ジスルフィド架橋を別の反応性の低い結合に置換することが有用で
あるかもしれない。−CH2−S−S−CH2−架橋は、硫黄間の二面結合が90度に近
い、好ましい幾何配置を有するが、正確な幾何配置は他の側鎖の構造および分子の結合状
態により決定される。結合ループの閉鎖架橋の好ましい改変は、全体の結合の長さおよび
角度を可能な限り保持するであろう。そのような代わりとなる適切な架橋には、−CH2
−S−CH2−CH2−、−CH2−CH2−S−CH2−、−CH2−CH2−S−C
H2−CH2−のようなチオエーテル結合;−CH2−NH−CO−CH2−および−C
H2−CO−NH−CH2−のようなラクタム結合;−CH2−CH2−O−CH2−C
H2−のようなエーテル結合;−(CH2)n−(n=4、5、または6)のようなアル
キレンブリッジ;−CH2−NH−CO−NH−CH2−結合、および当該技術分野で公
知の類似した基が挙げられる。
列に由来する線状ポリペプチドは、たとえば一方または両方のシステイン残基の置換によ
り容易に作製することができ、それらはジスルフィド結合を含有するオリジナルポリペプ
チドのKDRまたはVEGF/KDR結合活性の少なくとも一部を保持できる。Cysを
置換するには、アミノ酸Gly、Ser、およびAlaが好ましく、また、ポリペプチド
が溶液中の他の遊離チオール基と二量体化または反応することができる単一Cysを残さ
ないように、両方のCys残基を置換することが好ましい。KDRまたはVEGF/KD
R結合特性を保持するそのような線状誘導体はすべて本発明の範囲内である。
技術を使用して行うことができる。固相合成が好ましい。本明細書に援用される、Ste
wart et al.,Solid−Phase Peptide Synthesi
s(W.H.Freeman Co.San Francisco,1989);Mer
rifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963
);Bodanszky and Bodanszky,The Practice o
f Peptide Synthesis(Springer−Verlag,New
York,1984)を参照されたい。
BACHEM Bioscience,Inc.,King of Prussia,P
.A.;Quality Controlled Biochemicals,Inc.
,Hopkinton,MA)により商業的に作製することもできる。Perkin−E
lmer Applied Biosystems製のような自動ペプチド合成機も利用
できる。
ましくは精製される。精製のためには、アルキル化シリカカラム、たとえばC4−、C8
−、またはC18−シリカを使用する逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC
)を含む、多くの標準法が使用できる。一般に有機物含有量が増加するグラジエント移動
相、たとえば、通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する、水性バッファー中のアセトニト
リルを使用して精製する。イオン交換クロマトグラフィーを使用し、電荷に基づいてペプ
チドを分離することもできる。ポリペプチドの純度は、HPLC上の主要な大ピークの同
定を含む種々の方法により測定することができる。HPLCカラムに投入した物質の少な
くとも95%である単一ピークを生じるポリペプチドが好ましい。HPLCカラムに投入
した物質の少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または99.5%以
上もの単一ピークを生じるポリペプチドがさらにより好ましい。
ペプチドであることを確かめるために、ペプチド組成の解析を行うことができる。そのよ
うな組成解析は高分解能質量分析法を使用して行い、ペプチドの分子量を決定することが
できる。あるいは、水性酸中でペプチドを加水分解し、HPLCまたはアミノ酸分析機を
使用して混合物の成分を分離、同定、および定量することにより、ペプチドのアミノ酸含
量を確かめることができる。順次ペプチドを分解し、アミノ酸を順番に同定するペプチド
配列決定装置もペプチドの配列を決定するために使用することができる。
A技術を用いて、本発明に記載のポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)を
利用し、それらを組換え技術により発現させる、すなわち公知の方法で外来核酸分子を導
入し、所望のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドを産生するよう宿主
細胞を操作することにより作製することもできる。そのような手順は当業者の能力の範囲
内である(援用されるDavis et al.,Basic Methods in
Molecular Biology(1986)を参照されたい)。本明細書に記載さ
れるような短いペプチドの組換えによる作製は、直接合成に比べて実用的ではないかもし
れないが、本発明のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分がハイブリッドポリペ
プチドまたは融合タンパク質中に取り込まれている場合、組換えによる作製手段は非常に
好都合である。
EGF/KDR複合体結合部分の親和性を、他のタンパク質または標的と比較して測定す
ることは有用な尺度となり、KDRまたはVEGF/KDR複合体に対する特異性として
表される。結合を定量し親和性を測定するための標準アッセイには、平衡透析、平衡結合
、ゲルろ過、または結合部分とその標的との相互作用の結果生じる多くのスペクトル変化
(たとえば蛍光偏光の変化)のモニタリングが挙げられる。これらの技術は、リガンド(
またはタンパク質)濃度の関数として、結合および遊離リガンドの濃度を測定する。結合
ポリペプチドの濃度([結合])は、以下の等式に記載されるように、遊離ポリペプチド
の濃度([遊離])およびポリペプチドの結合部位、すなわちKDRまたはVEGF/K
DR複合体上の結合部位の濃度(N)に関連する。
この等式に対するデータの解は、結合親和性の定量的尺度である結合定数Kaを生じる
。結合定数Kaは解離定数KDの逆数である。KDは親和性の測定においてより頻繁に報
告される。好ましいKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドは、KDRま
たはVEGF/KDR複合体に対するKDが1nM〜100μMの範囲であり、10nM
未満、20nM未満、40nM未満、60nM未満、80nM未満、1μM未満、5μM
未満、10μM未満、20μM未満、40μM未満、60μM未満、および80μM未満
のKDを含む。
異性の他の側面がより重要になるかもしれない:造影剤は動的な系において機能し、そこ
では標的(たとえば活性化内皮上の、KDRまたはVEGF/KDR複合体、)への造影
剤の結合は、画像化手順のあいだ安定な平衡状態であってはならない。たとえば、造影剤
を初めに注入するとき、造影剤の濃度および造影剤−標的複合体の濃度は速やかに増大す
る。しかし、注入後すぐに、循環する(遊離)造影剤は腎臓または肝臓により排除されは
じめ、造影剤の血漿濃度は低下し始める。血漿中の遊離造影剤濃度のこの低下は、最終的
に造影剤−標的複合体の解離を引き起こす。造影剤の有用性は、造影剤の排除速度と造影
剤−標的の解離速度が異なることに依存する。解離速度は排除速度に比べて遅いことが理
想であり、血漿中に造影剤−標的複合体が高濃度でおよび遊離造影剤(バックグラウンド
シグナル)が低濃度であるあいだ、長く画像化を行うことになる。
に行うことができる:光ファイバー蛍光分光法(たとえば、Anderson&Mill
er,Clin.Chem.,34(7):1417−21(1988)を参照されたい
)、表面プラズモン共鳴(Malmborg et al.,J.Immunol.Me
thods,198(1):51−7(1996)and Schuck,Curren
t Opinion in Biotechnology,8:498−502(199
7)、共鳴ミラー、および回折格子結合平面光導波路(たとえばHutchinson,
Molec.Biotechnology,3:47−54(1995)を参照されたい
)。結合速度を測定するための自動バイオセンサーが市販されている:BIAcore表
面プラズモン共鳴センサー(Biacore AB,Uppsala SE)、LAsy
s共鳴ミラーセンサー(Fisons Applied Sensor Technol
ogy,Cambridge GB)、BIOS−1回折格子結合平面光導波センサー(
Artificial Sensor Instruments,Zurich CH)
。
てスクリーニングする方法:
本発明の他の側面において、ファージディスプレイで同定された結合ポリペプチドを、
標的発現細胞に対する結合能(標的を発現しない細胞には結合しない)に関してスクリー
ニングする方法が提供される。これらの方法は、ファージディスプレイにより同定される
ペプチドのスクリーニングに関連した重大な問題に取り組んでいる:そのように同定され
るペプチドは、慣用のアッセイにおいて、標的発現細胞に対してスクリーニングされるこ
とになる標的に対し十分な親和性をもたないことが多い。しかし、ファージで同定された
特定のペプチドが標的発現細胞に結合する(発現しない細胞には結合しない)のを確かめ
ることは、in vivoでの潜在的な標的部分である結合ペプチドを同定する上で情報
の重要な部分となる。該方法は、多価性結合に伴う親和性および結合活性の増大を利用し
、標的発現細胞に低親和性のポリペプチドのスクリーニングを可能にする。
ニングから成る。たとえば、ファージディスプレイにより標的に結合するとして同定され
るポリペプチドは、ビオチン化され、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラア
ビジンと複合体を形成して、四量体構築物を形成する。次にこれらの四量体構築物を、所
望の標的を発現する細胞および発現しない細胞とインキュベートし、四量体構築物の結合
を検出する。結合は当該技術分野で公知のいずれかの検出方法を使用して検出することが
できる。たとえば、結合を検出するためにアビジン、ストレプトアビジンまたはニュート
ラアビジンは検出可能なマーカーに結合させることができる(たとえば、放射性標識、蛍
光標識、または色調が変化する酵素標識、たとえばHRP(ホースラディッシュペルオキ
シダーゼ)、TMB(テトラメチルベンジジン)またはアルカリ性ホスファーターゼ)。
ニュートラアビジンにはレクチン結合炭水化物部分および細胞接着受容体結合RYDドメ
インがないため、ニュートラアビジンは他の代替物より分子への非特異的結合が低い。H
iller et al.,Biochem.J.,248:167−171(1987
);Alon et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun
.,170:1236−41(1990)を参照されたい。
技術により操作されている細胞(たとえば形質移入体、形質転換体など)に対してスクリ
ーニングすることができる。標的を発現するように形質移入されている細胞を使用する場
合、mock形質移入細胞(すなわち、標的をコードする遺伝物質なしに形質移入された
細胞)を対照として使用することができる。
て、アッセイを用いて、ペプチドの標的への結合に対する血清の作用を速やかに評価する
ことができる。
体の標的化構築物に使用するために異なる結合ポリペプチドの組み合わせを作製し、評価
する上で特に有用である。ビオチン/アビジン複合体を使用することで、1〜4種の異な
る結合ペプチドを含有する四量体構築物を比較的容易に作製することができる。さらに、
同じ標的上の異なるエピトープに結合する2以上の標的化部分を含むことにより、標的化
構築物の親和性および結合活性の増大が可能であることが見出されている。本明細書に記
載のスクリーニング法は、そのような多量体構築物に含まれるとき増大する親和性を有す
ることができる結合ポリペプチドの組み合わせの同定に有用である。
ような、ファージディスプレイにより同定されるKDRおよびVEGF/KDR複合体結
合ポリペプチドのスクリーニングに使用することができる。以下の実施例5に詳細に記載
されるように、これらの方法は、KDR発現細胞またはKDRを発現するように操作され
ている細胞へのKDR結合ポリペプチドの特異的結合を評価するために使用することがで
きる。本発明のビオチン化KDR結合ポリペプチドとニュートラアビジン−HRPとの四
量体複合体を作製して、KDRを発現するように形質移入された細胞およびmock形質
移入細胞(いかなるKDRも含まない)に対してスクリーニングすることができる。
の位数である場合であっても、KDR発現細胞に特異的に結合する(KDRを発現しない
細胞には結合しない)KDR結合ポリペプチドを同定するために、アッセイを使用するこ
とができる。アッセイは、本発明の単一KDR結合ポリペプチドを4コピー含有するホモ
四量体構築物、および2以上の異なるKDR結合ポリペプチドを含有するヘテロ四量体構
築物をスクリーニングするために使用することができる。本発明に記載の方法は、多量体
構築物、とりわけKDRの異なるエピトープに結合する2以上のKDR結合ポリペプチド
を含有する構築物に使用するためのKDR結合ポリペプチドの組み合わせを評価するのに
とりわけ有用である。
ともできる。実際、本明細書に開示されるスクリーニング方法を使用して、結合が血清に
より著しく影響を受けない配列番号264、294、および356のようなKDR結合ポ
リペプチドが同定された。
説明したように、KDRおよびVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの改変または
最適化は本発明の範囲内であり、改変または最適化されたポリペプチドは「KDRおよび
VEGF/KDR複合体結合ポリペプチド」の定義の範囲内に包含される。とりわけ、フ
ァージディスプレイにより同定されるポリペプチド配列を改変してその潜在力、薬物動態
学的挙動、安定性および/または他の生物学的、物理的および化学的特性を最適化するこ
とができる。
たとえば、得られるポリペプチドが上記の特性と類似するかまたは改善された特性を有
すると予想して、親ポリペプチド配列に以下の等配電子的および/または保存的アミノ酸
変化を行うことができる:
アルキル置換された疎水性アミノ酸の置換:分枝、環状および直鎖アルキル、アルケニ
ルまたはアルキニル置換を含むC1〜C10炭素由来の脂肪族側鎖によって置換されたア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、S−2−アミノ酪酸、S−シ
クロヘキシルアラニンまたは他の単純なα−アミノ酸を含む。
シン、ビフェニルアラニン、1−ナフチルアラニン、2−ナフチルアラニン、2−ベンゾ
チエニルアラニン、3−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、先に記載の芳香族アミノ
酸のアミノ化、アルキルアミノ化、ジアルキルアミノ化、アザ化、ハロゲン化(フルオロ
、クロロ、ブロモ、またはヨード)またはアルコキシ化(C1〜C4)置換体を含み、そ
れらの具体例としては:2−、3−または4−アミノフェニルアラニン、2−、3−、4
−クロロフェニルアラニン、2−、3−または4−メチルフェニルアラニン、2−、3−
または4−メトキシフェニルアラニン、5−アミノ−、5−クロロ−、5−メチル−また
は5−メトキシトリプトファン、2’−、3’−または4’−アミノ−、2’−、3’−
または4’−クロロ−、2、3−または4−ビフェニルアラニン、2’−、3’−または
4’−メチル−2、3または4−ビフェニルアラニン、および2−または3−ピリジルア
ラニンが挙げられる。
ン、2,3−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、先のアミノ酸のアルキル置換、ア
ルケニル置換またはアリール置換(C1〜C10までの分枝、線状または環状)誘導体で
あって、置換基はたとえばヘテロ原子(たとえばα窒素または遠位窒素)、またはプロ−
R位のα炭素上のいずれであってもよい。実例となる化合物には以下のものが挙げられる
:N−ε−イソプロピル−リジン、3−(4−テトラヒドロピリジル)−グリシン、3−
(4−テトラヒドロピリジル)−アラニン、N,N−γ、γ’−ジエチル−ホモアルギニ
ン。アルキル基がα炭素のプロ−R位を占める、α−メチルアルギニン、α−メチル2,
3−ジアミノプロピオン酸、α−メチルヒスチジン、α−メチルオルニチンのような化合
物も包含される。また、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族(ここでヘテロ芳香族基は1以
上の窒素、酸素または硫黄原子を単独または組み合わせて有する)カルボン酸、または酸
塩化物、活性エステル、活性アゾリドおよび関連する誘導体のような多くの周知の活性化
誘導体のいずれか、ならびにリジン、オルニチン、または2,3−ジアミノプロピオン酸
から形成されるアミドも包含される。
アミノプロピオン酸のチロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロ
アリール スルホンアミド、オルニチンまたはリジンおよびテトラゾール−置換アルキル
アミノ酸を含む。
ミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む。
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換:セリン、スレオニン、ホモセリン、2,3−ジアミ
ノプロピオン酸、およびセリンまたはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含
む。また、上記のそれぞれのカテゴリー内のアミノ酸は同じ群の別のものに置換してもよ
いことが理解される。
特許の範囲内での他の型の改変は、ポリペプチドの骨格内のアミド結合を置換すること
である。たとえば、望ましくないタンパク質分解、または血清安定性を減少させて生物活
性を低下もしくは消失させる他の分解経路を減らすかもしくは除去するため、またはコン
ホメーションの柔軟性を制限するかもしくは増大させるため、所望の方法で、存在するコ
ンホメーションを模倣するかまたはコンホメーションを変化させる官能基でペプチド骨格
内のアミド結合を置換することはよくあることである。そのような改変は、増大した結合
親和性または改善された薬物動態学的挙動を生み出すことができる。ペプチド合成技術の
分野に精通している者は、得られるペプチドが同じかまたは改善された活性を有すること
ができると予想して、2つのアミノ酸を結合するいずれかのアミド結合に対し、以下のよ
うにアミド結合を変化させることができると理解される:α−N−メチルアミドまたはペ
プチドアミド骨格チオアミドの挿入、同系の第2アミンを生み出すためのカルボニルの除
去、セミカルバゾン誘導体を生み出すためのアザ−アミノ酸による1アミノ酸の置換、な
らびにアミド結合代替物としてのE−オレフィンおよび置換したE−オレフィンの使用。
特許の範囲内での他のアプローチは、不安定なペプチド結合に遠位または近位のD−ア
ラニンまたは他のD−アミノ酸の導入である。この場合、置換されるL−アミノ酸に対し
、D−アミノ酸の側鎖が保存的置換ではないようなD−アミノ酸で、そのようなD−アミ
ノ酸置換をすることが可能であり、そして時に置換する必要があることが当業者には理解
される。これはキラリティーの違い、したがって側鎖配向性の違いのためであり、置換さ
れたL−アミノ酸の側鎖により提供されるものとは荷電、疎水性、立体的必要条件などが
異なる部分を有する標的が、未検討の結合部位領域に接近することを可能にする。
具体的な適用におけるKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの使用は
、薬物動態学的および薬力学的挙動を改善するためにペプチドの改変またはペプチドの製
剤化を必要としてよいことも理解される。ペプチドの特性は、所望の物理的または化学的
特性を付与すると考えられる部分の結合により変えられると予想される。そのような部分
は、酸またはアミンを使用してそれぞれアミド結合もしくは尿素結合を介してペプチドに
付加させてよく、ペプチドのN末端もしくはC末端、またはペプチド中に適切に位置する
リジンもしくはリジン誘導体、2,3−ジアミノプロピオン酸、オルニチン、またはペン
ダントアミン基またはペンダントアルコキシアミンもしくはヒドラジン基を有するペプチ
ド中の他のアミノ酸のペンダントアミノ基に付加させてよい。導入される部分は、目的の
ペプチドおよびその特性を改変するための現存している要件に依存して、親水性、塩基性
、または無極性アルキルもしくは芳香族基である基であってよい。
本発明の範囲内でのさらに他の改変は、グリコシル化アミノ酸残基(たとえば、セリン
、スレオニンまたはアスパラギン残基)を、単独で、または結合部分(または複数の部分
)もしくはリンカー部分または両方のいずれかにおいて組み合わせて使用することである
。標準状態を使用して行うことができるグリコシル化は溶解度を高めるため、薬物動態学
および薬力学的を変化させるため、またはグリコシド部分を含む特異的または非特異的相
互作用を介して結合を促進するために使用することができる。別の方法では、O−(2−
アセトアミド−2−デオキシ−3,4,6−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノ
シル)セリンまたは類似のスレオニン誘導体(D−またはL−アミノ酸)のようなグリコ
シル化アミノ酸を、手動もしくは自動固相ペプチド合成中に、または手動もしくは自動溶
液相ペプチド合成においてペプチドに取り込むことができる。同様に、D−またはL−N
γ−(2−アセトアミド−2−デオキシ−3,4,6−トリ−O−アセチル−β−D−グ
ルコピラノシル)−アスパラギンを使用することができる。グリコシル化に使用すること
ができる適切に官能化および活性化された炭水化物部分の作用により、ペンダント酸素、
窒素または硫黄官能基上でグリコシル化されたアミノ酸の使用が期待される。そのような
炭水化物官能基は単糖、二糖、またはオリゴ糖のより大きな集合体であってよい(Kih
lberg,Jan.(2000)Glycopeptide synthesis.I
n;Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis−A P
ractical Approach(Chan,W.C.and White,P.D
.編)Oxford University Press,New York,NY 8
章、pp195−213)。
ノ酸の炭水化物官能基の付加が期待される。グリコシドへのアミノ酸の結合は炭水化物官
能基のアノマー炭素への結合の形成に限定されない。そのかわり、アミノ酸への炭水化物
部分の結合は、C−ヘテロ原子、C−Cまたはヘテロ原子−ヘテロ原子(例としてはS−
S、O−N、N−N、P−O、P−Nが挙げられる)結合のために使用される、当該技術
分野で公知の方法によるいずれかの適切で十分に反応性の酸素原子、窒素原子、炭素原子
、または他の炭水化物官能基のペンダント原子を使用するものであってよい。
これらのペプチドの水溶性または形成し易さを増すことができる、異なる塩を形成する
ことも本発明の範囲内である。これらには、N−メチルグルカミン(メグルミン)、酢酸
塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の範囲内でのさらに他の改変は、環状ポリペプチドの切断である。本発明の多く
のポリペプチドの環の性質は、とりわけ環の内部で、ペプチド配列が利用できる立体構造
の空間を限定する。したがって、N末端またはC末端領域のいずれかにおいて、環から遠
位のまたは近位であっても1以上の残基によりペプチドを切断すると、類似または改善さ
れた生物活性を有する短鎖ペプチドを提供することができる。結合活性にかかわるアミノ
酸の特有の配列は、3アミノ酸程度であっても同定され、RGDペプチドとして表される
(たとえばPlow et al.,Blood,70(1):110−5(1987)
;Oldberg et al.,Journal of Biological Ch
emistry,263(36):19433−19436(1988);Taub e
t al.,Journal of Biological Chemistry,26
4(1):259−65(1989);Andrieux et al.,Journa
l of Biological Chemistry,264(16):9258−6
5(1989);および米国特許第5,773,412号および米国特許第5,759,
996号を参照されたい。これらはそれぞれ本明細書中に援用される。
プチド環を実質的に短縮できることが文献に示されている。本明細書中に援用される米国
特許第5,556,939号を参照されたい。
ミノ基とのアミド結合を使用して形成することができる。
さらに、D−アミノ酸をペプチド配列に添加して、回転特性を安定化することができる
(とりわけグリシンの場合)。別の方法では、α、β、γまたはδジペプチドまたは回転
模倣物(たとえばα、β、γまたはδ模倣物)(そのいくつかは図26の1、2および3
に図式化されている)を使用して、ペプチド中の構造モチーフおよび回転特性を模倣し、
同時にタンパク質分解に対する安定性を提供し、たとえば立体構造の安定性および溶解度
のような他の特性を促進することができる(構造1:Hart et al.,J.Or
g.Chem.,64:2998−2999(1999);構造2:Hanessian
et al.,“Synthesis of a Versatile Peptid
omimetic Scaffold”in Methods in Molecula
r Medicine,Vol.23:Peptidomimetics Protoc
ols,W.M.Kazmierski,編(Humana Press Inc.,T
otowa,N.J.,1999),10章,pp.161−174;構造3:WO01
/1635)。
本発明のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプチド内のジスルフィド結合に対
するジスルフィド模倣物の置換も本発明の範囲内である。
重大な問題はジスルフィド結合の存在である。過テクネチウム酸イオンの還元、およびそ
の後のTc特異的キレート基を生じる物質への還元Tc種の取込に依存する経路を介して
99mTcを取り込むように設計された手順中に、ジスルフィド結合の完全性を維持する
ことは困難である。これは、放射性医薬品をワンステップで作製するように考案されたキ
ット製品において一般的に使用される還元剤により、ジスルフィド結合がかなり容易に還
元されるためである。したがって、Tcキレート化中にジスルフィド結合が還元されやす
いことが、ジスルフィド結合の模倣物による置換を必要とするかもしれない。したがって
、本発明の範囲内での他の改変は、本発明のKDR結合ポリペプチドの活性および他の所
望の特性を維持しながら、本明細書に開示されるかまたは当業者に公知の方法を使用して
ジスルフィド部分を模倣物で置換することである:
1)オキシムリンカー
オキシム部分は多くの状況において研究者らによりリンカーとして使用されている。M
utter et al.,の研究(Wahl and Mutter,Tetrahe
dron Lett.,37:6861−6864(1996))は最も興味深いもので
ある。アミノアルコール官能基を含有するアミノ酸4、およびアルコキシアミノ官能基を
含有する5はペプチド鎖に取り込まれるが、必ずしもペプチド鎖の末端ではない(図27
)。ペプチド形成後、側鎖保護基は除去される。アルデヒド基は暴露され、オキシム結合
が形成される。
ランチオニンは環状スルフィドであり、ジスルフィド結合(S−S)は炭素−硫黄(C
−S)結合により置換される。したがって、還元に対する不安定性はかなり低い。ランチ
オニンは1971年以来、多数の方法により作製されている。
ランチオニンは公知の方法により容易に作製することができる。たとえば、Robey
et al.,Anal.Biochem.,177:373−377(1989);
Inman et al.,Bioconjugate Chem.,2:458−46
3(1991);Ploinsky et al.,Med.Chem.,35:418
5−4194(1992);Mayer et al.,“Peptides,Fron
tiers of Peptide Science”in Proceedings
of the 15th American Peptide Symposium,T
am&Kaumaya(編),June 14〜19,1995,Nashville,
Tenn.(Klumer Academic Pub.,Boston),pp.29
1−292;Wakao et al.,Jpn.Kokai Tokyo Koho,
JP 07300452 A2(1995)を参照されたい。Boc自動ペプチド合成機
を使用したペプチドの作製、その後のペプチド末端とブロモ酢酸とのカップリングにより
十分な収率でブロモアセチル化ペプチドが得られる。ペプチドの開裂および脱保護はHF
/アニソールを使用して行われる。ペプチドがシステイン基を有する場合、その反応性は
低いpHにより制御できる。培地のpHを6〜7に上げると、ポリマー化または環化のい
ずれかが起こる。ポリマー化は高濃度(100mg/mL)が好都合であるが、一方環化
は低濃度(1mg/mL)が好都合であり、たとえば6は7に環化する(スキーム1:図
28)。
アセチルを生じる部分を配置することが可能であるブロモアセチル基の担体としてのNα
−(Boc)−Nε−[N−(ブロモアセチル)−β−アラニル]−L−リジンの使用を
示した。予備的な実験において、かれらはシステインからブロモアセチル−リジン誘導体
を分離する4〜6アミノ酸を持つペプチドが環化する傾向があることを見出し、この方法
の潜在的な有用性を示した。
この方法のいくつかの変法を使用することができる。樹脂結合セリンは、ブロム化−デ
ヒドロブロム化−チオール付加の順序を使用するか、またはジスクシニミジルカーボネー
トによる脱水、その後のチオール付加のいずれかにより作製することができる。Ploi
nsky et al.,M.J.Med.Chem.,35:4185−4194(1
992);Mayer et al.,“Peptides,Frontiers of
Peptide Science”in Proceedings of the 1
5th American Peptide Symposium,Tam&Kauma
ya(編),June 14〜19,1995,Nashville,Tenn.(Kl
umer Academic Pub.,Boston)、pp.291−292。アク
リルアミドへのチオール共役物付加も詳細に記載され、アクリルアミドへの2−メルカプ
トエタノールの付加について言及されている。Wakao et al.,Jpn.Ko
kai Tokyo Koho,JP 07300452 A2(1995)。
ンの分子内環化に由来するジアリールエーテル結合
最近、空気中、周囲温度で、ジクロロメタン中において塩基としてピリジンまたはトリ
エチルアミンを使用した、酢酸銅存在下におけるフェノール、アミンおよびヘテロ環式ア
ミンとアリールボロン酸の反応が十分な収率(98%の高率)で非対称ジアリールエーテ
ルおよび関連するアミンを提供することが報告されている。Evans et al.,
Tetrahedron Lett.,39:2937−2940(1998);Cha
m et al.,Tetrahedron Lett.,39:2933−2936(
1998);Lam et al.,Tetrahedron Lett.,39:29
41−2944(1998)を参照されたい。N−保護チロシン誘導体がフェノール成分
の場合、収率は同様に98%の高さであった。このことは、アミノ酸アミド(ペプチド)
が形質転換に安定で、収率が高いことを示す。ペプチドからラクタムへの容易な分子内環
化、SNAr反応に基づいた分子内ビアリールエーテル形成および高度の希釈条件下また
は樹脂上での分子内環化反応の一般性の点から見て、分子内反応に関する先例が存在する
。ここで擬希釈効果は高度な希釈条件を模倣する。
る環状ペプチドの形成
使用可能な別の方法としては、近接アミノメルカプタン官能基(たとえば、通常線状配
列の末端におけるシステインの配置に由来するか、またはリジンの側鎖窒素を介して配列
に結合する)およびアルデヒド官能基の分子内環化が挙げられ、それはチアゾリジンを提
供して二環式ペプチドを形成し、その環の一方は主鎖の残基により形成され、2番目の環
はチアゾリジン環である。スキーム2(図29)は1つの例を提供する。必要なアルデヒ
ド官能基は、適切に配置された近接アミノアルコール官能基のメタ過ヨウ素酸ナトリウム
開裂により作製可能であり、そしてそれはリジン部分への側鎖アミノ基への付加により鎖
に結合した非保護セリンとして存在することができる。ある場合には、必要なアルデヒド
官能基は、鎖のC末端またはN末端での保護されたアルデヒド誘導体の暴露により作製さ
れる。この方法の実例はBotti et al.,J.Am.Chem.Soc.,1
18:10018−10034(1996)に見出される。
大環状ペプチドは頭部から尾部への環化またはペンダント基の環化によるラクタム形成
により作製されている。基本的方法は、アミン保護基およびカルボキシル保護基を選択的
に除去することができる、十分に保護されたペプチドを作製することである。直交保護法
が開発されている。開発されているものの中で、アリル、トリチル、およびDde法が最
も使用されている。Mellor et al.,“Synthesis of Mod
ified Peputides”、in Fmoc Solid Phase Syn
thesis:A Practical Approach,White and Ch
an(編)(Oxford University Press,New York,2
000),6章,pp.169−178を参照されたい。Dde法は、カルボン酸官能基
(Dmabエステル)およびアミノ基(Dde基)の両方に対して類似した保護基を使用
するため興味が持たれる。両基は周囲温度でDMF中2〜10%ヒドラジンにより除去さ
れる。あるいは、Ddeはアミノ基に対して使用され、そしてアリル基がカルボキシルに
対して使用されてもよい。
内カップリングにより得られるラクタム官能基は、ジスルフィド結合の代替物として作用
することができる。Dde/Dmab法は、スキーム3a(図30)に示す。
負荷(約0.1〜0.2mmol/g)において、Tentagelを基礎にしたRin
kアミド樹脂上で作製することができる。ヒドラジンによる両官能基の脱保護、続く樹脂
上の環化により所望の生成物が得られる。
ントカルボキシル基はアリルエステルとして保護され、そしてペンダントアミノ基はアロ
ック(alloc)基として保護される。樹脂上で、両基はDMF中、N−メチルモルホ
リンおよび酢酸の存在下、パラジウムトリス−トリフェニルホスフィンによる処理により
選択的に暴露される。残りのパラジウム塩はDMF中DIEAの存在下でジエチルチオカ
ルバメートナトリウムを使用して取り除き、その後DMFで洗浄する。ラクタム環は、N
−メチルモルホリンの存在下でHATU/HOAtを使用して形成される。上記のように
、他のカップリング試薬も使用することができる。上記のようにペプチドプロセシングが
行われ、所望のペプチドラクタムを提供する。
に関しては、アミノ酸、たとえばトランス−4−(iV−Dde)メチルアミノシクロヘ
キサンカルボン酸、トランス−4−(iV−Dde)メチルアミノ安息香酸、またはそれ
らのアロック同族体を使用することができると理解すべきである。さらに別の方法は、樹
脂からの開裂中の分子内ラクタム形成にセーフティーキャッチ法を使用することである。
負荷(約0.1〜0.2mmol/g)において、Tentagelを基礎にしたRin
kアミド樹脂上で作製することができる。ヒドラジンによる両官能基の脱保護、続く樹脂
上の環化により所望の生成物が得られる。その後、樹脂からの開裂および精製も行うこと
ができる。ペプチドのN末端の官能化に関しては、ジアミノ酸、たとえばトランス−4−
(iV−Dde)メチルアミノシクロヘキサンカルボン酸またはトランス−4−(iV−
Dde)メチルアミノ安息香酸が必要であると理解すべきである。別の方法は、樹脂から
の開裂中の分子内ラクタム形成にセーフティーキャッチ法を使用することである。
Grubbs反応(スキーム4、図32)はオレフィン結合の複分解/環化を含み、そ
して以下に示すように説明される。Schuster et al.,Angewand
te.Chem.Int.Edn.Engl.,36:2036−2056(1997)
;Miller et al.,J.Am.Chem.Soc.,118:9606−9
614(1996)を参照されたい。
ることは容易に理解される(図32)。反応は、実際オレフィン官能化ペプチドからの環
状化合物の作製に適用されている。たとえば、Pernerstorfer et al
.,Chem.Commun.,20:1949−50(1997)を参照されたい;ま
たCovalent Capture and stabilization of c
ylindricalβ−sheet peptide assemblies,Cla
rk et al.,Chem.Eur.J.,5(2):782−792(1999)
;Highly efficient synthesis of covalentl
y cross−linked peptide helices by ring−c
losing metathesis,Blackwell et al.,Angew
.Chem.Int.Ed.,37(23):3281−3284(1998);Syn
thesis of novel cyclic protease inhibito
rs using Grubbs olefin metathesis,Ripka
et al.,Med.Chem.Lett.,8(4):357−3760(1998
);Application of Ring−closing Metathesis
to the Synthesis of Rigidified Amino Ac
ids and Peptides,Miller et al.,J.Am.Chem
.Soc.,118(40):9606−9614(1996);Supramolec
ular Design by Covalent Capture,Design o
f a Peptide Cylinder via Hydrogen−Bond−P
romoted Intermolecular Olefin Metathesis
,Clark et al.,J.Am.Chem.Soc.,117(49):123
64−12365(1995);Synthesis of Conformation
ally Restricted Amino Acids and Peptides
Employing Olefin Metathesis,Miller et a
l.,J.Am.Chem.Soc.,117(21):5855−5856(1995
)を参照されたい。ジスルフィド結合含有ペプチドの代替物としてのカルバブリッジ環状
ペプチドを作製するために、C−アリル化アミノ酸またはおそらくN−アリル化アミノ酸
のいずれかを作製し、この反応においてそれらを使用することができる。
を持つチロシンヒドロキシルの官能化は一選択肢である。リジンε−アミノ基はたとえば
アシル化部分の一部としてのオレフィン含有ユニットの付加物を持つ別の選択肢である。
かわりにリジン側鎖アミノ基がオレフィン含有テザーによりアルキル化される場合、それ
はさらにレポーターの結合点として依然として機能することができる。リジン、オルニチ
ン、またはジアミノプロピオン側鎖アミノ基のアシル化剤としての5−ペンタン酸の使用
は、別の可能性である。オレフィン含有テザーの長さも構造活性関連を調べるために変化
させることができる。
本発明の範囲内での他の改変にはペプチド配列の一般的な操作が挙げられ、それは類似
または改善した生物学的特性を有するペプチドを生じると考えることができる。これらに
は、アミノ酸転位(配列中のアミノ酸を交換する)、元の配列または改変した元の配列の
かわりのレトロインベルソペプチドの使用、ペプトイドおよびレトロ−インベルソペプト
イド配列が挙げられる。具体的な残基がペプチドのかわりにペプトイドであり、それらが
完全にペプチドでもなく、完全にペプトイドでもないハイブリッド分子を生じる構造も同
様に考えられる。
本発明の範囲内でのさらなる改変には、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプ
チドの標的化配列と検出可能な標識または治療薬間へのリンカーまたはスペーサーの導入
が挙げられる。そのようなリンカー/スペーサーの使用は、結合ペプチドの適切な特性を
改善する(たとえば、血清安定性を増大させる、など)ことができる。これらのリンカー
には、当該技術分野で一般的な、置換、または非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコー
ル誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、または脂肪族もしくは芳香族スペーサーが挙げられ
るが、それらに限定されない。さらにまた、上記の部分の組み合わせであるリンカーを使
用して、ペプチドの特性に特定の利点を与えることができる。リンカーを持つ脂質分子は
結合して超音波バブル、リポソームまたは他の凝集に基づいた構築物を形成することがで
きる。そのような構築物は診断レポーター、治療薬(たとえば、治療のための化学的「弾
頭」)またはこれらの組み合わせの標的化および送達のための物質として使用することが
できる。
また、本発明の1種以上のVEGFまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの
二量体、多量体、またはポリマーを使用する構築物が企図される。実際、二量体および多
量体の形成によって効力の低いペプチドまたは低分子の結合を実質的に増加できるいう十
分な文献報告がある。したがって、二量体および多量体構築物(同種または異種の両方)
は本発明の範囲内である。実際、実施例でより詳細に説明するように、二量体または多量
体構築物中に複数のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチド配列を含むこ
とは本発明の範囲内である。さらに、以下の実施例4で示すように、これらの構築物は単
量体構築物に比べ改善された結合を示すことができる。二量体構築物のポリペプチド配列
は、それらのN末端、もしくはC末端、または適切に配置されたリジン部分(またはペン
ダントオキシアミノまたは他の求核基のような選択的に誘導体化可能な基を生じる別の官
能基)のN−ε窒素に結合可能であるか、または適切な結合化学を使用して1以上のリン
カーを介して一緒になることができる。このカップリング化学には、アミド、尿素、チオ
ウレア、オキシム、またはアミノアセチルアミド(クロロ−またはブロモアセトアミド誘
導体由来)が挙げられるが、それらに限定されない。たとえば、以下の方法のいずれかを
使用して、本発明のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの二量体また
は多量体構築物を作製することができる。
十分に保護されたKDR結合ペプチドは、自動または手動Fmocペプチド合成プロト
コールを使用してEllman型セーフティーキャッチ樹脂上で構築することができる。
Backs et al.,J.Am.Chem.Soc.,118(12):3055
−56(1996)。それとは別に、当該技術分野で公知のペプチド合成の標準法を使用
して、ジ−リジン誘導体を2−クロロトリチル樹脂上で合成することができる。たとえば
、Fields et al.,“Principles and Practice
of Solid Phase Synthesis”in Synthetic Pe
ptides,A Users Guide,Grand,編.(W.H.Freema
n Co.New York,1992),3章,pp.77−183;Barlos
et al.,“Convergent Peptide Synthesis”in
Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Chan,
W.C.and White、P.D.,編(Oxford University P
ress,New York,2000),9章,pp.215−228を参照されたい
。側鎖保護基を除去せずに、2−クロロトリチル樹脂からのこれの遊離、カルボキシル基
の活性化、およびいずれかのアミン官能化標識基とのカップリングはジ−リジン誘導体を
提供し、そのペンダント窒素原子は暴露されて2種の遊離アミノ基を得ることができる。
先に記載のセーフティーキャッチ樹脂は活性化され、所望するN−脱保護標識基−官能化
ジ−リジン誘導体が活性化セーフティーキャッチ樹脂に付加される。ペンダントアミノ基
は、今度は樹脂から離れ、ジ−リジン構造の構成部分であるセーフティーキャッチ樹脂結
合ペプチドのカルボキシ末端によりアシル化される。過剰なセーフティーキャッチ樹脂結
合ペプチドを使用してジ−リジン構築物のアミノ基の完全な反応を保証することができる
。このスキームにおける反応パートナーの比の最適化は収率を最適化する。KDR結合ペ
プチド上の保護基はトリフルオロ酢酸を基礎にした開裂プロトコールを使用して取り除く
。
合成は容易に行うことができる。直交保護スキーム(たとえば、1窒素上にアリルオキシ
カルボニル基および他の窒素上にFmoc基、または他の窒素上にiV−Dde保護基と
結合したFmoc基を使用する)を使用して、上記のジ−リジン誘導体のペンダント窒素
原子を区別することができる。
KDR結合ペプチドと反応させると、結合した単一のKDR結合ペプチドを有するジ−リ
ジン構築物が提供される。第2の保護基の除去は残っている窒素を暴露する。Mello
r et al.,“Synthesis of Modified Peptides
”in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、C
han,W.C.and White、P.D.,編(Oxford Universi
ty Press,New York,2000),6章,pp.169−176も参照
されたい。得られた産物と別のKDR結合ペプチドを提示する第2のセーフティーキャッ
チ樹脂を反応させて十分に保護されたホモ二量体構築物を提供し、トリフルオロ酢酸によ
り保護基を除去した後、所望する物質を提供する。
通常Fmocペプチド合成プロトコールを使用して、KDR結合ペプチドは自動または
手動ペプチドカップリング法によりRinkアミド樹脂上に集められる。ペプチドは、た
とえばリジン部分のε−アミノ基のような付加的な求核基を有してよいリンカーまたはリ
ンカー標識基構築物により官能化されたC末端またはN末端を有してよい。保護基の開裂
は、トリフルオロ酢酸を使用して、ペプチドの性質に依存した適切な調節物質により行う
ことができる。十分に脱保護されたペプチドはその後、市販のグルタル酸ビス−N−ヒド
ロキシスクシニミドエステル(Tyger Scientific,Inc.)のような
過剰な二官能求電子試薬と反応する。得られたグルタル酸のモノアミド化、モノ−N−ヒ
ドロキシスクシニミジルエステルは次に同じペプチドの付加的な当量、または異なるKD
R−結合ペプチドの当量で処理する。得られた物質のHPLCによる精製により適切な標
識基を生じる所望のホモ二量体構築物が得られる。
モジュール式スキームを使用して、上記の適切な標識基を生じる二量体またはより重合
した多量体構築物を作製することができる。簡単に説明すると、fmoc−リジン(iV
−Dde)Rinkアミド樹脂をピペリジンで処理し、fmoc部分を除去する。次に標
識官能基、たとえばビオチン、5−カルボキシフルオレセインまたは、N,N−ジメチル
−Gly−Ser(O−t−Bu)−(Acm)−Gly−OHを窒素原子に結合させる
。樹脂は次にヒドラジンで処理してiV−Dde基を除去する。完全な洗浄後、樹脂をD
MF、NMPまたはジクロロメタンのような適切な溶媒中で、塩化シアヌル、およびジイ
ソプロピルエチルアミンのようなヒンダード塩基で処理し、樹脂に結合した単官能化ジク
ロロトリアジンを提供する。その後、残余塩素原子のKDR結合ペプチドの2当量による
順次置換は、樹脂結合ホモ二量体標識基官能化構築物を提供する。Falorni et
al.,Tetrahedron Lett.,39(41):7607−7610(
1998);Johnson et al.,Tetrahedron Lett.,5
4(16):4097−4106(1998);Stankova et al.,Mo
l.Diversity,2(1/2):75−80(1996)。生じるペプチドは、
状態が保証するので保護されても保護されなくてもよい。保護基の開裂は上記のようなト
リフルオロ酢酸を基礎にした脱保護試薬を使用して行われ、そして所望の物質は高速液体
クロマトグラフィーにより精製される。
すことができる。KDR結合ペプチド間の距離を変化させる足場として作用するために必
要数のマスクされまたは直交保護された窒素原子を有する関連したより堅い分子を使用し
て(互いにおよびレポーターに対してKDR結合ペプチドの運動および相対的位置を束縛
することにより)構築物の堅さを増すことは、完全にA〜Cの方法および本明細書に記載
されるすべての他の方法の範囲内である。先に引用された参考文献はそのまま本明細書に
援用される。
本発明に記載のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分はin vitroおよ
びin vivoでKDRまたはVEGF/KDR複合体の検出および/または画像化、
とりわけ先に説明したように、VEGFおよびKDRが密接に関与する血管新生部位の検
出および/または画像化に非常に有用である。KDRまたはVEGF/KDR複合体のア
ッセイまたは画像化のいずれか適切な方法を使用することができる。本発明のKDRおよ
びVEGF/KDR複合体結合部分はまた、血管新生に関連した疾患状態または多数の病
因に関連した状態を含む、多様なそのような疾患状態の治療に役立つ。本発明のKDRお
よびVEGF/KDR複合体結合部分は、それら自体治療薬として使用してよく、または
血管新生部位を含むKDR発現細胞に1以上の治療薬(たとえば、化学療法剤、放射線治
療剤、遺伝物質など)を局在化させるために使用できる。
溶液でのKDRまたはVEGF/KDR複合体の検出には、本発明に記載の結合ポリペ
プチドを検出可能に標識して、たとえば蛍光的に標識、酵素的に標識、または放射性もし
くは常磁性金属で標識して溶液と接触させてよく、その後結合ポリペプチドとKDRまた
はVEGF/KDR複合体標的間の複合体の形成を検出することができる。例としては、
蛍光標識KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプチドはin vitroでのKD
RまたはVEGF/KDR複合体検出アッセイに使用してよく、ここでペプチドは溶液に
添加され、結合が起きる条件下でKDRまたはVEGF/KDR複合体が試験される。蛍
光標識KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプチドとKDRまたはVEGF/KD
R複合体標的間の複合体は、遊離ペプチドに比較した、KDRまたはVEGF/KDR複
合体結合ペプチドから生じる増大した蛍光偏光を測定することにより、検出し、定量する
ことができる。
GF/KDR複合体結合ポリペプチドは、プラスチックチューブまたはウェルのような固
体支持体上に固定化され、そしてKDRまたはVEGF/KDR複合体標的を含むと推定
される溶液と固定化結合部分を接触させ、非結合体を洗浄し、複合体形成したポリペプチ
ドをKDRまたはVEGF/KDR複合体を認識するモノクローナル抗体のような適切な
検出試薬を使用して検出する。モノクローナル抗体は、たとえば放射標識、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼなどのような酵素との結合、蛍光標識などで検出可能に標識され
ていることを含む、当該技術分野で公知の慣用の手段により検出可能である。
のために、本発明の結合ポリペプチドをクロマトグラフィー支持体または他のマトリクス
材料のような固体基質上に固定化し、固定化された結合体を結合ポリペプチド:KDR複
合体、または結合ポリペプチド:VEGF/KDR複合体の形成に適切な条件下で、溶液
に負荷するか、または溶液と接触させることができる。溶液の非結合部分はたとえば、抗
KDRもしくは抗VEGF/KDR複合体抗体または抗結合ポリペプチド抗体を使用して
検出してよく、またはKDRまたはVEGF/KDR複合体標識は適切な溶出条件で結合
部分から遊離させてもよい。
役割は多くの研究者によって検討されていて、研究および開発の活発な分野であり続けて
いる。そのような研究および開発の促進において、大量のKDRまたはVEGF/KDR
複合体を純粋な形状で精製する方法が好ましく、そして上記の通常の精製法を使用した本
発明に記載の結合ポリペプチドはその目的にとりわけ有用である。
in vivo
診断画像法
本発明に記載のポリペプチドのとりわけ好ましい用途は、たとえば生存および転移に血
管新生を必要とする新生物性腫瘍、または他の血管新生活性部位のような、KDR発現組
織の肉眼的に判読し易い画像の作製である。本明細書に開示されたKDRおよびVEGF
/KDR複合体結合ポリペプチドは、所望によりリンカーを介して、診断用検出に適切な
標識とポリペプチドを結合することにより造影剤に変換させることができる。好ましくは
、他の血清タンパク質よりKDRまたはVEGF/KDR複合体に対してより高い特異性
を示すペプチドを、使用することになる検出方法に適切な標識に結合または連結する。た
とえば、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドは、核磁気共鳴画像法(
MRI)に適切な常磁性キレート剤に対するリンカー(またはリンカーなしに)、X線、
PET、もしくはシンチグラフィーイメージングに適切な放射性標識(放射性金属に対す
るキレート剤を含む)、超音波検出に適切な超音波造影剤(たとえば安定化マイクロバブ
ル、超音波造影剤、ミクロスフェアまたはガス封入「リポソーム」と呼ばれているもの)
、または光学画像化色素と結合することができる。
たとえばポリグリシン)、ポリエチレングリコール、ポリアミド、および他の簡単な高分
子リンカーであってよい。
術は、患者の身体外部で検出可能なシグナルを標識が発生するという前提に基づく。たと
えば、検出可能に標識されたKDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分が、たとえば
血管新生の検出が望ましい患者に投与される場合、KDRまたはVEGF/KDR複合体
に対するKDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分の高親和性が、結合部分を血管新
生部位に結合させ、そして血管新生部位に標識を蓄積させる。血管新生部位に標識した結
合部分が局在するには十分な時間が予想される。標識ペプチドにより発生したシグナルは
使用する標識の型に従って変化するスキャンニング装置により検出され、そしてシグナル
は血管新生部位の画像に変換される。
GF/KDR複合体結合ポリペプチドを直接標識するかわりに、本発明のペプチドをたと
えば、アビジン、ビオチン、または検出可能な標識もしくは放射線治療剤に結合する抗体
もしくは抗体フラグメントと結合させることができる。たとえば、1以上のKDR結合ペ
プチドはKDR発現細胞にin vivoで結合するために、ストレプトアビジン(潜在
的に多価結合する)に結合させてよい。非結合標的化構築物が体内から排出された後、標
的化構築物が結合する部位に速やかに濃縮される、ビオチン化された検出可能な標識もし
くは放射線治療用造影剤(たとえば放射性金属と複合体形成したキレート分子)を注入す
ることができる。いくつかの状況におけるこの方法は、検出可能な標識投与後の画像化が
可能になるまでに要する時間を少なくすることができる。それはまた、標的部位でのシグ
ナル対ノイズ比を高め、必要な放射性標識または放射線治療用造影剤の量を減らすことが
できる。これは、たとえば骨髄、腎臓、および肝臓のような正常であるが照射に感受性が
高い身体部位に送達される放射線の線量として放射性標識または放射線治療剤が使用され
る場合、とりわけ有用である。ときどきプレターゲッティング法、または2ステップもし
くは3ステップ法と呼ばれるこの方法は、S.F.RosebroughのQ.J.Nu
cl.Med.,40:234−251(1996)に総説され、これを本明細書に援用
する。
本発明のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分は好都合には、MRIで使用す
る造影剤を形成するために1以上の常磁性金属キレート剤と結合することができる。好ま
しい常磁性金属イオンは原子番号21〜29、42、44、または57〜83を有する。
これには、1,およびより好ましくは5以上の不対電子および少なくとも1.7Bohr
磁子の磁気モーメントを有する遷移金属またはランタン系が挙げられる。好ましい常磁性
金属にはクロム(III),マンガン(II)、マンガン(III)、鉄(II)、鉄(
III)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、プラセオジウム(III
)、ネオジウム(III)、サマリウム(III)、ガドリニウム(III)、テルビウ
ム(III)、ジスポジウム(III)、ホルミウム(III)、エルビウム(III)
、ユーロピウム(III)およびイッテルビウム(III)、クロム(III)、鉄(I
II)、およびガドリニウム(III)が挙げられる。3価カチオン、Gd3+は高い緩
和性および低い毒性、さらに患者による金属の望ましくない代謝を最小にするただ1つの
生物学的に好都合な酸化状態で存在するという利点のために、MRI造影剤にはとりわけ
好ましい。別の有用な金属は比較的安価なCr3+である。Gd(III)キレート剤は
1988年以来臨床および放射線MR適用に使用され、現在およそ30%のMR試験がガ
ドリニウムを基礎にした造影剤を使用する。あるいは、本発明のヘテロ多量体も1以上の
超常磁性粒子と結合することができる。
のような他の因子を考慮して金属を選択するであろう(Tweedle et al.,
Magnetic Resonance Imaging(2版)、1巻、Partai
n et al.,編(W.B.Saunders Co.1988),pp.796−
797)。一般に、個々の金属の望ましい量はその緩和性に比例し、金属の生体内分布、
薬物動態学および代謝により改変されることになる。
それと複合体を形成する1以上の極性基を有する分子である。適切なキレート剤は当該技
術分野で公知であり、メチレンホスホン酸基、メチレンカルボヒドロキサミン酸基、カル
ボキシエチリデン基、またはカルボキシメチレン基を持つ酸が挙げられる。キレート剤の
例としては以下のものが挙げられるが、それらに限定されない:ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸(DTPA)、1,4,7,10−テトラアザシクロ−テトラデカン−1,4,
7,10−テトラ酢酸(DOTA)、1−置換1,4,7−トリカルボキシメチル−1,
4,7,10−テトラアザシクロドデカン(DO3A)、エチレンジアミンテトラ酢酸(
EDTA)、および1,4,8,11−テトラ−アザシクロテトラデカン−1,4,8,
11−テトラ酢酸(TETA)。付加的なキレートリガンドには以下のものが挙げられる
:エチレンビス−(2−ヒドロキシ−フェニルグリシン)(EHPG)、およびその誘導
体、たとえば5−Cl−EHPG、5Br−EHPG、5−Me−EHPG、5t−Bu
−EHPG、および5sec−Bu−EHPG;ベンゾジエチレントリアミンペンタ酢酸
(ベンゾ−DTPA)およびその誘導体、たとえばジベンゾ−DTPA、フェニル−DT
PA、ジフェニル−DTPA、ベンジル−DTPA、およびジベンジルDTPA;ビス−
2(ヒドロキシベンジル)−エチレン−ジアミン二酢酸(HBED)およびその誘導体;
少なくとも3炭素原子、より好ましくは少なくとも6、および少なくとも2つのヘテロ原
子(Oおよび/またはN)を含む大環状化合物のクラス(その大環状化合物はヘテロ環成
分において一緒になった1環、または2もしくは3環から構成されてよい)、たとえばベ
ンゾ−DOTA、ジベンゾ−DOTA、およびベンゾ−NOTA(ここでNOTAは1,
4,7−トリアザシクロノナンN,N’,N″−三酢酸である)、ベンゾ−TETA、ベ
ンゾ−DOTMA(ここでDOTMAは1,4,7,10−テトラアザシクロテトラデカ
ン−1,4,7,10−テトラ(メチルテトラ酢酸)である)、およびベンゾ−TETM
A(ここでTETMAは1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン−1,4,8
,11−(メチルテトラ酢酸)である);1,3−プロピレン−ジアミンテトラ酢酸(P
DTA)およびトリエチレンテトラアミンヘキサ酢酸(TTHA)の誘導体;1,5,1
0−N,N’,N″−トリス(2,3−ジヒドロキシベンゾイル)−トリカテコレート(
LICAM)の誘導体;および1,3,5−N,N’,N″−トリス(2,3−ジヒドロ
キシベンゾイル)アミノメチルベンゼン(MECAM)。本発明で使用するための好まし
いキレート剤は、DTPAであり、そしてDO3Aの使用がとりわけ好ましい。本発明に
より企図する代表的なキレート剤およびキレート基はWO98/18496、WO86/
06605、WO91/03200、WO95/28179、WO96/23526、W
O97/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/28179、
および米国特許第4,899,755号、米国特許第5,474,756号、米国特許第
5,846,519号、および米国特許第6,143,274号に記載され、それらのす
べてを本明細書に援用する。
する。キレート剤(複数のキレート剤)の位置決定は、KDRまたはVEGF/KDR複
合体結合ポリペプチドの結合親和性または特異性を妨害しないように選択されるべきであ
る。好ましくは、キレート剤(複数のキレート剤)はN末端またはC末端のいずれかに付
加されるが、キレート剤(複数のキレート剤)は配列のどこに結合してもよい。好ましい
態様において、遊離中心カルボン酸基(たとえば、DTPA−Asp(β−COOH)−
)OtBu)を有するキレート剤(複数のキレート剤)は、アミド結合の形成により、ペ
プチドのN末端に容易に結合する。キレート剤(複数のキレート剤)はまた、リンカーの
補助によりC末端に結合することができる。あるいは、ペプチド配列のどこかの遊離アミ
ノ基に、DTPAを生じる適切なイソチオシアネート基を結合する方法として、イソチオ
シアネート結合化学を使用することができる。
検出可能な標識)に直接または共有結合的に結合してもよく、またはリンカーを使用して
金属キレート剤にカップリング、または結合してもよく、そのようなリンカーは以下のも
のであってよいが、それらに限定されない:アミド、尿素、アセタール、ケタール、二重
エステル、カルボニル、カルバメート、チオウレア、スルホン、チオエステル、エステル
、エーテル、ジスルフィド、ラクトン、イミン、ホスホリル、またはホスホジエステル結
合;置換または非置換飽和または非飽和アルキル鎖;線状、分枝、もしくは環状アミノ酸
鎖、または単一アミノ酸もしくは異なる複数のアミノ酸(たとえば、KDRまたはVEG
F/KDR複合体結合部分のN末端またはC末端の伸長);誘導体化もしくは非誘導体化
ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、またはポリビニルピリジン鎖;置換また
は非置換ポリアミド鎖;誘導体化もしくは非誘導体化ポリアミン、ポリエステル、ポリエ
チレンイミン、ポリアクリレート、ポリ(ビニルアルコール)、ポリグリセロール、また
はオリゴサッカライド(たとえばデキストラン)鎖;交互ブロック共重合体;マロン酸、
コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸;カプロン酸;簡単なジアミンおよ
びジアルコール;本明細書に開示された他のリンカーのいずれか;または当該技術分野で
公知のいずれか他の簡単な高分子リンカー(たとえば、WO98/18497、WO98
/8496を参照されたい)。好ましくはリンカーの分子量は厳密に制御されてよい。分
子量は、100未満から1000以上までのサイズの範囲であってよい。好ましくはリン
カーの分子量は100未満である。さらに、in vivoで生体内分解性であるリンカ
ーを使用して、本発明のイメージング試薬の効率的な排出経路を提供することが好都合で
あってよい。リンカー内の位置に依存して、そのような生体内分解性官能基には、エステ
ル、二重エステル、アミド、ホスホエステル、エーテル、アセタール、およびケタール官
能基を挙げることができる。
とKDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分をカップリングさせることができる。た
とえば、WO95/28967、WO98/18496、WO98/18497、および
それらの説明を参照されたい。KDRまたはVEGF/KDR複合体結合部分は、N末端
またはC末端を通じて、アミド結合を介し、たとえば金属キレート剤の金属配位結合骨格
窒素、または金属キレート剤自体の酢酸アームに結合することができる。金属キレート剤
が毒性を最少化するために金属に強固に結合する能力を保持するならば、本発明はどのよ
うな位置へのキレート剤の結合も企図する。同様に、KDRまたはVEGF/KDR複合
体結合部分の改変または伸長が、KDRまたはVEGF/KDR複合体への金属キレート
剤の結合能力を損なわないならば、そのような金属キレート剤への結合のための部位を生
み出すために改変または伸長してもよい。
使用することができる。血管新生部位を画像化する場合、バックグラウンドの血液および
組織に対する該部位のコントラストを高めるためにある種のMR技術およびパルス配列が
好ましくてよい。これらの技術には、たとえば、急速スピンエコー配列(たとえば、Al
exander et al.,Magnetic Resonance in Med
icine,40(2):298−310(1998)を参照されたい)のような血液を
暗くするblack blood血管造影法配列およびフロー−スポイルドグラジエント
エコー配列(たとえばEdelman et al.,Radiology,177(1
):45−50(1990)を参照されたい)が挙げられるがそれらに限定されない。ま
た、これらの方法としては血管新生性腫瘍およびバックグラウンド組織間のコントラスト
を増す、反転−回復法により調製されるか、または飽和−回復法により調製される配列の
ような、コントラストの差を大きくする、流量に依存しない技術が挙げられる。結局、磁
化移動調製法もこれらの物質によりコントラストを改善することができる(たとえばGo
odrich et al.,Investigayive Radiology,31
(6):323−32(1996))。
は、好ましくは静脈内、動脈内、硬膜内、間質内、または体腔内を意味する、非経口的投
与が好ましい。活発な血管新生を画像化するためには、静脈内、または動脈内投与が好ま
しい。MRIでは、血管新生部位で少なくとも10%MRシグナルを増大させるために十
分な造影剤の量を対象に投与することが企図される。KDRまたはVEGF/KDR複合
体結合部分−含有MRI試薬の注射後、患者は、MRI装置でスキャンニングされ、血管
新生部位のいずれかの位置が確認される。治療においては、血管新生(たとえば腫瘍)位
置確認時に、必要な場合、殺腫瘍剤または抗血管新生剤(たとえばVEGFの阻害剤)が
速やかに投与され、その後腫瘍退縮または血管新生阻止を視覚化するために患者をスキャ
ンニングすることができる。
超音波が物質を通って伝達される場合、物質の音響特性は伝達速度および物質の密度に
依存することになる。音響特性の変化は異なる物質(固体、液体、気体)の界面において
最も著しい。超音波造影剤は物質と周囲の組織間の音響の差のために、きわめて強い音波
反射体である。液体(たとえば血液)と気体含有または気体発生超音波造影剤間の音響の
差のために、気体含有または気体発生超音波造影剤がとりわけ有用である。マイクロバブ
ル、超音波造影剤などを含む超音波造影剤は、そのサイズのために注射後、他の検出可能
な部分よりも血流に長く留まることが可能である;標的のKDRまたはVEGF/KDR
複合体に特異的な超音波剤はしたがって、血管新生部位の優れた画像化を行うことができ
る。
像法に有用な物質に結合することができる。たとえば、KDRまたはVEGF/KDR複
合体結合ポリペプチドは、小胞(たとえばマイクロバブル、超音波造影剤ミクロスフェア
など)、または検出可能な標識として機能する液体または気体を含むエマルジョン(たと
えば、エコー発生気体またはエコー発生気体を生成することができる物質)を形成するた
めに使用される物質に結合することができる。そのような小胞作製物質には、界面活性剤
、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物
、および合成または天然の高分子物質が挙げられる。たとえば、WO98/53857、
WO98/18498,WO98/18495、WO98/18497、WO98/18
496、およびWO98/18501を参照されたい。それらはそのまま本明細書に援用
される。
よびとりわけ飽和リン脂質が好ましい。本発明の好ましい気体封入マイクロバブルは、た
とえば以下の特許:EP554213、米国特許第5,413,774号、米国特許第5
,578,292号、EP744962、EP682530、米国特許第5,556,6
10号、米国特許第5,846,518号、米国特許第6,183,725号、EP47
4833、米国特許第5,271,928号、米国特許第5,380,519号、米国特
許第5,531,980号、米国特許第5,567,414号、米国特許第5,658,
551号、米国特許第5,643,553号、米国特許第5,911,972号、米国特
許第6,110,443号、米国特許第6,136,293号、EP619743、米国
特許第5,445,813号、米国特許第5,597,549号、米国特許第5,686
,060号、米国特許第6,187,288号および米国特許第5,908,610号の
いずれか1つに記載の方法により、当該技術分野で公知の手段により作製可能であり、そ
れらはそのまま本明細書に援用される。好ましい態様において、リン脂質部分の少なくと
も1つは構造18または19(図33)を有し、米国特許第5,686,030号に記載
され、これは本明細書に援用される。
びリン酸グリセロールのエステルが挙げられ、ここでリン酸残基は次にコリン、セリン、
イノシトール、グリセロール、エタノールアミンなどの基に結合する。リン脂質に存在す
る脂肪酸は一般に長鎖脂肪族酸であり、典型的には12〜24、好ましくは14〜22の
炭素原子を含み、それらは飽和されているか、または1以上の不飽和を含んでいてよい。
適切な脂肪酸の例としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノレン酸、およびリノール酸が挙げられる。リ
ン脂質のモノエステルもリン脂質の「リソ」型として当該技術分野で公知である。
リン酸のジエステル、スフィンゴミエリン、すなわち脂肪酸を持つグリセロールジエステ
ル残基がセラミド鎖により置換される、ホスファチジルコリン類似体、カルジオリピン、
すなわち脂肪酸を持つ1,3−ジホスファチジルグリセロールのエステル、セレブロシド
などが挙げられる。本明細書で使用するように、リン脂質という用語は単独、または混合
物としてのいずれかで使用することができる、天然に存在するか、半合成または合成産物
のいずれかを含む。
レシチン(ホスファチジルコリン(PC)誘導体)が挙げられる。
半合成リン脂質の例としては、天然に存在するレシチンの部分的または完全な水素化誘
導体が挙げられる。
LPC」)、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)、ジパルミトイル−
ホスファチジルコリン(「DPPC」)、ジアラキドリルホスファチジルコリン(「DA
PC」)、ジステアロイル−ホスファチジルコリン(「DSPC」)、1−ミリストイル
−2−パルミトイルホスファチジルコリン(「MPPC」)、1−パルミトイル−2−ミ
リストイルホスファチジルコリン(「PMPC」)、1−パルミトイル−2−ステアロイ
ルホスファチジルコリン(「PSPC」)、1−ステアロイル−2−パルミトイル−ホス
ファチジルコリン(「SPPC」)、ジオレオイルホスファチジルコリン(「DOPC」
)、1,2ジステアロイル−sn−グリセロ−3−エチルホスホコリン(エチル−DSP
C)、ジラウリロイル−ホスファチジルグリセロール(「DLPG」)およびそのアルカ
リ金属塩、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール(「DAPG」)およびそのアル
カリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)およびそのア
ルカリ金属塩、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール(「DPPG」)およびそ
のアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(「DSPG」)および
そのアルカリ金属塩、ジオレイルホスファチジルグリセロール(「DOPG」)およびそ
のアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸(「DMPA」)およびそのアルカ
リ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸(「DPPA」)およびそのアルカリ金属塩
、ジステアロイルホスファチジン酸(「DSPA」)、ジアラキドイルホスファチジン酸
(「DAPA」)およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジル−エタノー
ルアミン(「DMPE」)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(「DPP
E」)、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン(「DSPE」)、ジミリス
トイルホスファジルセリン(「DMPS」)、ジアラキドイルホスファチジルセリン(「
DAPS」)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(「DPPS」)、ジステアロイル
ホスファジルセリン(「DSPS」)、ジオレイルホスファチジルセリン(「DOPS」
)、ジパルミトイルスフィンゴミエリン(「DPSP」)、およびジステアロイルスフィ
ンゴミエリン(「DSSP」)が挙げられる。
スファチジン酸、およびジパルミトイルホスファチジルセリンが挙げられる。また、組成
物はPEG−4000および/またはパルミチン酸を含んでいてよい。本明細書に開示さ
れるか、または当業者に公知の任意の気体を使用することができる;しかし、不活性ガス
、たとえばSF6またはCF4、C3F8およびC4F10のようなフルオロカーボンが
好ましい。
ズドライもしくはスプレードライするような公知の工程を使用するか、またはEP554
213;米国特許第5,413,774号;米国特許第5,578,292号;EP74
4962;EP682530;米国特許第5,556,610号;米国特許第5,846
,518号;米国特許第6,183,725号;EP474833;米国特許第5,27
1,928号;米国特許第5,380,519号;米国特許第5,531,980号;米
国特許第5,567,414号;米国特許第5,658,551号;米国特許第5,64
3,553号;米国特許第5,911,972号;米国特許第6,110,443号;米
国特許第6,136,293号;EP619743;米国特許第5,445,813号;
米国特許第5,597,549号;米国特許第5,686,060号;米国特許第6,1
87,288号;および米国特許第5,908,610号(これらはそのまま本明細書に
援用される)に示された工程を使用して、リン脂質から調製することができる。最も好ま
しくは、リン脂質を有機溶媒に溶かし、その溶液をリポソーム形成段階を経ずに乾燥させ
る。これは、適切な有機溶媒中で、親水性安定化物質または、有機溶媒および水の両方に
可溶性の化合物と一緒に適切な溶媒中にリン脂質を溶かし、そして溶液をフリーズドライ
もしくはスプレードライすることにより行うことができる。この態様において、親水性安
定化物質の選択のために使用される基準は、好みの有機溶媒におけるその溶解度である。
水および有機溶媒に可溶性の親水性安定化物質の例としては、たとえばポリビニルピロリ
ドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレングリコール(PEG)
などのようなポリマー、リンゴ酸、グリコール酸、マルトールなどが挙げられる。また、
そのような親水性化合物はマイクロバブルホモゲナイズにおけるサイズ分布を助け、貯蔵
中の安定性を高める。任意の適切な有機溶媒の沸点が十分に高く、そしてその融点が十分
に低く、その後の乾燥を促進する限り、その有機溶媒は使用可能である。代表的な有機溶
媒には、たとえば、ジオキサン、シクロヘキサノール、3級ブタノール、テトラクロロジ
フルオロエチレン(C2Cl4F2)または2−メチル−2−ブタノールが挙げられる。
2−メチル−2−ブタノールおよびC2Cl4F2が好ましい。
しくはスプレードライリン脂質粉末は空気または別の気体と接触する。水性担体に接触す
る場合、構造が粉砕されている粉末化リン脂質はラメラ化またはラミナ化部分を形成し、
それらはその中に分散した気体のマイクロバブルを安定化するであろう。この方法は長期
間貯蔵する場合でさえ安定であり、振とうまたはどのような激しい撹拌もせずに、乾燥し
たラミナ化リン脂質(それらは所望する気体下で貯蔵されている)の簡単な溶解により得
られるマイクロバブル懸濁液の産生を可能にする。
水性溶液に懸濁することにより、マイクロバブルを作製することができる。マイクロバブ
ル作製のための別の工程は、本明細書に援用される同時係属中の欧州特許出願第0300
2373号に開示され、そしてそれは任意の洗浄および/またはろ過工程後、リン脂質存
在下で水性培地中において有機溶媒のエマルジョンを作製し、その後上記エマルジョンを
凍結乾燥することを含む。
たとえば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールならび
に類似した化合物、それに加え、その各種コポリマー;ミリスチン酸、パルミチン酸、ス
テアリン酸、アラキジン酸またはそれらの誘導体のような脂肪酸、エルゴステロール、フ
ィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、プロピルガレート
、アスコルビルパルミテートおよびブチル化ヒドロキシトルエンを含む、非フィルム形成
界面活性剤を添加することができる。これらの非フィルム形成界面活性剤の量は通常界面
活性剤の総重量の50%までであるが、好ましくは0〜30%の間である。
873、さらにEP881915に開示され、そられはそのまま本明細書に援用する。こ
れらの物質は米国特許第5,798,091号またはWO97/29783に記載のよう
に作製することができる。
う用語は境界または外被を持つ気体封入体を表す。マイクロバルーン製剤および作製の方
法に関する詳細は、EP324938(米国特許第4,844,882号);米国特許第
5,711,933号;米国特許第5,840,275号;米国特許第5,863,52
0号;米国特許第6,123,922号;米国特許第6,200,548号;米国特許第
4,900,540号;米国特許第5,123,414号;米国特許第5,230,88
2号;米国特許第5,469,854号;米国特許第5,585,112号;米国特許第
4,718,433号;米国特許第4,774,958号;WO95/01187;米国
特許第5,529,766号;米国特許第5,536,490号;および米国特許第5,
990,263号に見出すことができ、それらの内容は本明細書に援用される。
分解性固体脂質を含む外被を有する。本発明のマイクロバルーンの作製に有用なポリマー
は、たとえば以下の特許:EP458745、米国特許第5,711,933号、米国特
許第5,840,275号、EP554213、米国特許第5,413,774号および
米国特許第5,578,292号のいずれかに記載の生体内分解性で生理的に適合するポ
リマーのいずれかから選択することができる。とりわけ、ポリマーは以下のような生体内
分解性で生理的に適合したポリマーから選択することができる:たとえば水溶性の低い多
糖類、ポリラクチドおよびポリグリコリドならびにそれらのコポリマー、ラクチドおよび
ε−カプロラクトン、γ−バレロラクトンのようなラクトンおよびポリペプチド。他の適
切なポリマーには以下のものが挙げられる:ポリ(オルト)エステル(たとえば米国特許
第4,093,709号;米国特許第4,131,648号;米国特許第4,138,3
44号;米国特許第4,180,646号を参照されたい);ポリ乳酸およびポリグリコ
ール酸ならびにそれらのコポリマー、たとえばDEXON(J.Heller,Biom
aterials 1(1980),51を参照されたい);ポリ(DL−ラクチド−c
o−ε−カプロラクトン)、ポリ(DL−ラクチド−co−γ−バレロラクトン)、ポリ
(DL−ラクチド−co−γ−ブチロラクトン)ポリアルキルシアノアクリレート;ポリ
アミド、ポリヒドロキシブチレート;ポリジオキサン;ポリ−β−アミノケトン(A.S
.Angelloni,P.Ferruti,M.Tramontini and M.
Casolaro,The Mannich basises in polymer
synthesis:3.Reduction of poly(beta−amino
ketone)s to poly(gamma−aminoalcohol)s an
d their N−alkylation to poly(gamma−hydro
xyquaternary ammonium salt)s,Polymer23,p
p1693−1697,1982.);ポリホスファゼン(Allcock,Harry
R.Polyphosphazenes:new polymers with in
organic backbone atoms(Science 193(4259)
,1214−19(1976))およびポリ無水物。また、本発明のマイクロバルーンは
WO−A−96/15815(本明細書に援用する)の方法に従って作製可能であり、こ
こでマイクロバルーンは、好ましくはモノ−、ジ−もしくはトリ−グリセリド、脂肪酸、
ステロール、ワックスおよびそれらの混合物から選択される生体内分解性脂質を含む、生
体内分解性膜から作られる。好ましい脂質は、ジ−もしくはトリ−グリセリド、たとえば
ジ−、もしくはトリ−ミリスチン、−パルミチンもしくは−ステアリン、とりわけトリパ
ルミチンまたはトリステアリンである。マイクロバルーンは当業者に公知の、本明細書に
開示された気体のいずれを使用してもよい;しかし不活性気体、たとえばフッ素化ガスが
好ましい。マイクロバルーンは、当業者に公知の任意の添加剤および安定化剤と共に薬剤
的に受容できる液体担体中に懸濁することができる。
会合(たとえばその表面に吸着する、および/またはその中の空隙、空洞または小孔に含
まれる)した気体を有する該微小粒子(とりわけ微小粒子の凝集物)を含む。これらの物
質の作製方法は、EP0122624;EP0123235;EP0365467;米国
特許第5,558,857号;米国特許第5,607,661号;米国特許第5,637
,289号;米国特許第5,558,856号;米国特許第5,137,928号;WO
95/21631またはWO93/13809に記載され、それらをそのまま本明細書に
援用する。
たがって、注射の前に少量の等張性物質を上記の超音波造影剤懸濁液のいずれかに添加す
ることができる。等張性物質は薬物に一般的に使用される生理的溶液であり、そしてそれ
らは水性生理食塩水(0.9% NaCl)、2.6% グルセロール溶液、5% デキ
ストロース溶液などを含む。さらに、超音波組成物は、たとえば、乳化剤、粘性調節剤、
凍結保護物質、溶解保護物質、増量剤などを含む、標準的な薬剤的に受容できる添加剤を
挙げることができる。
書で使用する「気体」という用語には、通常のヒトの体温で実質的に気体の形状のいずれ
かの物質(混合物を含む)が挙げられる。したがって、気体にはたとえば、空気、窒素、
酸素、CO2、アルゴン、キセノンまたはクリプトン、フッ素化ガス(たとえば、過フッ
化炭素、SF6、SeF6が挙げられる)、低分子量炭化水素(たとえば1〜7炭素原子
を含む)、たとえばメタン、エタン、プロパン、ブタンもしくはペンタンのようなアルカ
ン、シクロプロパン、シクロブタンもしくはシクロペンタンのようなシクロアルカン、エ
チレン、プロペン、プロパジエンもしくはブテンのようなアルケン、またはアセチレンも
しくはプロピンおよび/またはその混合物のようなアルキンを挙げることができる。しか
し、フッ素化ガスが好ましい。フッ素化ガスには、SF6のような少なくとも1フッ素原
子を含む物質、フレオン(1以上の炭素およびフッ素を含む有機化合物、すなわちCF4
、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、CBrF3、CCl2F2、C2ClF
5、およびCBrClF2)およびペルフルオロカーボンが挙げられる。ペルフルオロカ
ーボンという用語は、ただ1つの炭素および複数のフッ素原子を含む化合物を表し、とり
わけ、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンが挙げられる。通常好ましい飽和
ペルフルオロカーボンは式CnFn+2を有し、ここでnは1〜12であり、好ましくは
2〜10であり、最も好ましくは3〜8であり、そしてさらにより好ましくは3〜6であ
る。適切なペルフルオロカーボンには、たとえばCF4、C2F6、C3F8、C4F8
、C4F10、C5F12、C6F12、C7F14、C8F18およびC9F20が挙
げられる。最も好ましくは気体または気体混合物は、SF6を含むか、またはC3F8、
C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C7F14、C8F18から成る群よ
り選択されるペルフルオロカーボンを含むが、C4F10が最も好ましい。たとえばWO
97/29783、WO98/53857、WO98/18498、WO98/1849
5、WO98/18496、WO98/18497、WO98/18501、WO98/
05364、WO98/17324も参照されたい。
れる、invivoで気体に変換できる物質)を含有することが好ましい。好ましくは気
体前駆体およびそれが生み出す気体は生理的に受容可能である。気体前駆体はpHにより
活性化、光により活性化、温度により活性化をうけるなどされてよい。たとえば、ある種
のペルフルオロカーボンは温度活性化気体前駆体として使用することができる。過フルオ
ロペンタンのようなこれらのペルフルオロカーボンは、室温(または物質が産生される、
および/または貯蔵される温度)以上であるが、体温以下の液体/気体相転移温度を有す
る;したがってそれらは相転移を受けてヒトの体内で気体に変換する。
好ましい気体混合物である:気体(A)および(B)の混合物、ここで気体(B)の少な
くとも1種は容量で0.5〜41%の間で存在し、80ダルトンより大きい分子量を有し
、そしてフッ素化ガスであり、そして(A)は酸素、窒素、二酸化炭素およびその混合物
から成る群より選択され、混合物の優位は気体Aである。
物質の標的化効率を高めるために、複数のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリ
ペプチドに連結または結合してよい。上記(または当業者に公知)の超音波造影剤への結
合は、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドと小胞を作製するために使
用される物質間の直接共有結合を介するか、上記のリンカーを介してよい。たとえば、二
官能PEGリンカー(その後リポソーム組成物と反応する)へのペプチドの結合の説明に
は一般にWO98/53857を参照されたい。Lanza et al.,Ultra
sound in Med.&Bio.,23(6):863−870(1997)も参
照されたい。
るマイクロバブルの懸濁液を作製することができる。たとえば、リン脂質形成において5
%(w/w)N−MPB−PE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホ
エタノールアミン−4−(p−マレイミド−フェニルブチラミド)、(Avanti P
olar−Lipids,Inc)の取込により、マレイミド−由来マイクロバブルを作
製することができる。次に、脱アセチル溶液(50mM リン酸ナトリウム、25mM
EDTA、0.5M ヒドロキシルアミン.HCl、pH7.5)中でインキュベートさ
れているメルカプトアセチル化KDR結合ペプチド溶液(DMF中、10mg/ml)が
マレイミド−活性化マイクロバブル懸濁液に添加される。穏やかに撹拌しながら暗所でイ
ンキュベーション後、マイクロバブルに結合したペプチドは、遠心分離により精製するこ
とができる。
外被において化合物を効率的に取り込ませるためのマイクロバブル、またはマイクロバル
ーンの外被を形成する物質と適合する疎水性部分;上記の部分は一般に脂質部分(ジパル
ミチン、ジステアロイル)により示される;および(b)スペーサー(一般に異なる分子
量のPEG)、それはある種の場合(たとえば、スペーサーがあまりに長い場合、マイク
ロバブルの凍結乾燥がたとえば困難を呈するかもしれない)は任意であってよく、または
他の場合(たとえば短いスペーサーを持つマイクロバルーンに結合する場合、ペプチドは
活性が低い可能性がある)には好ましくてよい;および(c)結合することになるペプチ
ド上の対応する反応部分と反応が可能な反応基。
を使用して作製することができる。たとえば、アビジン−結合マイクロバブルは、メルカ
プトアセチル化−アビジン(脱アセチル溶液と共にインキュベートされている)に添加さ
れる上記のように作製されたマレイミド−活性化リン脂質マイクロバブル懸濁液を使用し
て作製することができる。次に、ビオチン化KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポ
リペプチド(本明細書に記載のように作製される)をアビジン−結合マイクロバブルの懸
濁液に添加し、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプチドに結合したマイクロバ
ブル懸濁液を得る。
は周囲の温度管理を必要とせずに貯蔵および輸送可能であり、そしてとりわけそれは特殊
な貯蔵設備を有することを使用者に要求せずに、調製済みの投与可能な懸濁液に現場で製
剤されて、病院や医師に供給することができる。好ましくは、そのような場合、それは2
−成分キット製品の形状で供給可能であり、それには2つの別々の容器または2−チャン
バー容器を含むことができる。前述の場合では、好ましくは容器は慣用の隔壁−密封バイ
アルであり、ここで工程b)の凍結乾燥残留物を含むバイアルは、隔壁で密封され、担体
液は任意に前もって充填したシリンジを使用して、それを通して注射する。そのような場
合、2番目の成分の容器として使用されるシリンジは次に造影剤を注射するためにも使用
される。後者の場合、好ましくは2−チャンバー容器は2−チャンバーシリンジであり、
いったん凍結乾燥品を溶解し、適切に混合するか、または穏やかに振とうしていれば、そ
の容器は直接造影剤を注射するために使用することができる。両方の場合、容器の内容物
への十分なバブル形成エネルギーの適用に関するか、またはそれを可能にする手段が提供
される。しかし、先に示したように、本発明に記載の安定化された造影剤では、気体マイ
クロバブルのサイズは溶かした乾燥産物に適用された撹拌エネルギーの量に実質的に依存
しない。したがって、一定のマイクロバブルサイズを有する、再現可能な産物を得るため
には、一般に穏やかな手動の撹拌だけを必要とする。
の範囲内であることを当業者は、理解するであろう。そのような系では、非水溶性気体と
環境の間に水相が介在する場合、産物の貯蔵期間を延長させることがとりわけ好都合であ
る。造影剤を形成するために必要な物質(たとえば、溶解中にリン脂質に結合することに
なるターゲッテイングリガンド)が予め容器に存在していない場合、好ましくはキット製
品の別の成分との容易な組み合わせを促進するために適用される形状または容器中で、キ
ット製品の別の成分と一緒にそれを包装することができる。
びアダプターを使用することができる。唯一の要件は、ストッパーと容器間の十分な密封
である。したがって、密封の質が主要な関心事であり;密封の完全性のどのような劣化も
、所望しない物質のバイアルへの侵入を可能にする。周囲圧または減圧で栓をした産物の
安全で適切な溶解を保証するためには、無菌性であることに加え、真空の保持が必須であ
る。栓としては、ポリ(イソブチレン)またはブチルゴムのような、エラストマーに基づ
いた化合物または多成分製剤であってよい。
パワードップラー、ドップラー振幅、刺激された音響画像法、および2次元または3次元
画像化のような公知の技術が挙げられる。画像化は調和(共鳴頻度)または基礎モードで
行ってよく、第2調和が好ましい。
えば、注射されるリン脂質の量が0.1〜200μg/kg体重の範囲、好ましくは約0
.1〜30μg/kgまでであるような量で投与することができる。マイクロバルーン含
有造影剤は一般に壁形成ポリマーまたは脂質の量が約10μg/kg〜約20mg/kg
体重であるような量で投与される。
本発明にしたがい、多数の光学的パラメータを使用して、光学標識KDRまたはVEG
F/KDR複合体結合ポリペプチド注射後の対象のin vivo光学画像法によりKD
RまたはVEGF/KDR複合体の位置を決定することができる。画像作製中に検出され
る光学的パラメータとしては、伝搬放射、吸収、蛍光またはリン光放出、光反射、吸光度
振幅または最大値の変化、および弾性的に散乱した放射を挙げることができる。たとえば
、生物組織は650〜1000nmの近赤外(NIR)波長範囲の光を比較的に通す。N
IR放射は数センチメートルまで組織に浸透し、in vivoでのKDRまたはVEG
F/KDR複合体の光学画像法のための本発明のKDRまたはVEGF/KDR複合体結
合ポリペプチドの使用を可能にする。
そして400〜1500nmの範囲の吸収または放射最大値を有する有機発色団または蛍
光団を含む、光学色素のような光標識と結合してもよい。KDRまたはVEGF/KDR
複合体結合ポリペプチドはかわりに生物ルミネセンス分子で誘導体化されてもよい。光標
識の吸収最大値の好ましい範囲は、ヘモグロビンからのシグナルによる妨害を最小にする
ために、600〜1000nmの間である。好ましくは、光吸収標識はたとえば>105
cm−1M−1の大きなモル吸光係数を有し、一方蛍光光学色素は高い量子収率を有する
。光学色素の例としては、WO98/18497、WO98/18496、WO98/1
8495、WO98/18498、WO98/53857、WO96/17628、WO
97/18841、WO96/23534、WO98/47538、およびここに引用さ
れた参考文献に記載のものが挙げられるが、それらに限定されない。光標識は先に記載の
ように直接KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプチドに共有結合するか、または
リンカーを介して、KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ペプチドに結合する。
扱者が使用する光標識に適切な波長で、1以上の光源(たとえばレーザー)によりスキャ
ンニングされる。使用する光は単色または多色、および連続またはパルスであってよい。
透過、散乱、または反射光は光検出器により1種または複数の波長に変換されて検出され
、対象におけるKDRまたはVEGF/KDR複合体の位置を決定する。光学パラメータ
の変化は一定の期間モニターし、血管新生部位における光標識試薬の蓄積を検出すること
ができる。標準画像処理および検出装置は本発明の光学画像化試薬と一緒に使用すること
ができる。
ネセンス画像法のために使用することができる(米国特許第5,171,298号、WO
98/57666、およびそこに引用された参考文献を参照されたい)。光音響画像法で
は、超音波照射が対象に適用され、透過、散乱、または反射光の光学パラメータに影響を
与える。音ルミネセンス画像法では、適用された超音波は実際に検出される光を発生する
。そのような技術を使用する適切な画像法はWO98/57666に記載される。
KDRまたはVEGF/KDR複合体部分はシンチグラフィー、SPECT、またはP
ET画像法に適合した放射性核種レポーター、および/または放射線療法に適合した放射
性核種と結合することができる。KDRまたはVEGF/KDR複合体部分が診断画像法
に有用な放射性核種に対するキレート剤および放射線療法に有用なキレート剤の両方に結
合する構築物は本発明の範囲内である。
ば51Mn、52Fe、60Cu、68Ga、72As、94mTc、または110In
の1種と錯体を形成する。本発明の結合部分はまた、放射性核種、たとえば18F、12
4I、125I、131I、123I、77Brおよび76Brを使用したハロゲン化に
より標識することができる。シンチグラフィーまたは放射線療法のための好ましい金属放
射性核種には、99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、16
7Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88
Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu
、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212B
i、213Bi、214Bi、105Rh、109Pb、117mSn、149Pm、1
61Tb、177Lu、198Auおよび199Auが挙げられる。金属の選択は、所望
する治療または診断適用に基づいて決定されるであろう。たとえば、診断のために好まし
い放射性核種には、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、および111Inが挙
げられる。治療のために好ましい放射性核種には、64Cu、90Y、105Rh、11
1In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho
、175Yb、177Lu、186/188Re、および199Auが挙げられる。99
mTcは低価格、有用性、画像化特性、および高比放射能のために診断適用にはとりわけ
好ましい。Tc−99mの核および放射能特性はこの同位体を理想的なシンチグラフィー
イメージング剤にする。この同位体は、140keVの単一光子エネルギーおよび約6時
間の放射能半減期を有し、99Mo−99mTc発生器から容易に得ることができる。
またはN4キレート剤(米国特許第5,367,080号、米国特許第5,364,61
3号、米国特許第5,021,556号、米国特許第5,075,099号、米国特許第
5,886,142号も参照されたい)、ならびにたとえばHYNIC、DTPA、ED
TA、DOTA、DO3A、TETA、およびビスアミノビスチオール(BAT)キレー
ト剤を含むが、それらに限定されない、当該技術分野で公知の他のキレート剤によりキレ
ート化されてよい(米国特許第5,720,934号も参照されたい)。たとえば、N4
キレート剤は米国特許第6,143,274号;米国特許第6,093,382号;米国
特許第5,608,110号;米国特許第5,665,329号;米国特許第5,656
,254号;および米国特許第5,688,487号に記載される。ある種のN3Sキレ
ート剤はPCT/CA94/00395、PCT/CA94/00479、PCT/CA
95/00249ならびに米国特許第5,662,885号;米国特許第5,976,4
95号;および米国特許第5,780,006号に記載される。キレート剤はまたN3S
およびMAMA(モノアミドモノアミンジチオール)、DADS(N2Sジアミンジチオ
ール)、CODADSなどのようなN2S2系を含むキレート化リガンド、メルカプトー
アセチル−アセチル−グリシル−グリシン(MAG3)の誘導体を含んでいてよい。これ
らのリガンド系および多様な他のリガンド系はLiu and Edwards,Che
m Rev.,99:2235−2268(1999)およびその中の参考文献に記載さ
れる。
含んでいてもよい。これらには、米国特許第5,183,653号;米国特許第5,38
7,409号;および第5,118,797号に記載のような、テクニチウムおよびレニ
ウムジオキシムのボロン酸付加物が挙げられ、それらの開示はそのまま本明細書に援用さ
れる。
ィド結合は、99mTcのような放射性核種のキレート形成のための2種のリガンドとし
て使用される。このようにして、ペプチドループはTcの導入により拡張される(ペプチ
ド−S−S−ペプチドがペプチド−S−Tc−S−ペプチドに変化する)。これは生理活
性を維持しながら、文献(Chen et al.,J.Nucl.Med.,42:1
847−1855(2001))において他のジスルフィド含有ペプチドに使用されてい
る。Tcに対する他のキレート基は、骨格のアミド窒素、別のシスチンアミノ酸またはア
ミノ酸の別の改変により供給することができる。
、24b、および25のそれらが挙げられる(図34A〜F)。式20〜22(図34A
〜C)は、常磁性Ga3+のようなランタニドおよび177Lu、90Y、153Sm、
111In、または166Hoのような放射性ランタニドにとりわけ有用である。式23
a〜24b(図34DおよびF)は放射性核種99mTc、186Reまたは188Re
にとりわけ有用である。式25(図34F)は99mTcにとりわけ有用である。これら
および他の金属キレート基は米国特許第6,093,382号および米国特許第5,60
8,110号に記載され、それらはそのまま本明細書に援用される。さらに、式22(図
34C)のキレート基は、たとえば米国特許第6,143,274号に記載され;式24
のキレート基は、たとえば米国特許第5,627,286号および米国特許第6,093
,382号に記載され;そして式25のキレート基は、たとえば米国特許第5,662,
885号;米国特許第5,780,006号;および米国特許第5,976,495号に
記載される。
り、;YはC1〜C10分枝または非分枝アルキル、アリール、アリールオキシ、アリー
ルアミノ、アリールアミノアシル、またはC1〜C10分枝もしくは非分枝アルキル基、
ヒドロキシまたはC1〜C10分枝もしくは非分枝ポリヒドロキシアルキル基、C1〜C
10分枝もしくは非分枝ヒドロキシまたはポリアルコキシアルキルもしくはポリヒドロキ
シ−ポリアルコキシアルキル基を含むアリールアルキルであり;JはC(=O)−、OC
(=O)−、SO2−、NC(=O)−、NC(=S)−、N(Y)、NC(=NCH3
)−、NC(=NH)−、N=N−、ホモポリアミドまたは合成もしくは本来存在するア
ミノ酸に由来するヘテロアミンであり;そしてnは1〜100である。これらの構造の別
の変種はたとえば米国特許第6,093,382号に記載される。上記の特許、特許出願
および参考文献のそれぞれの開示はそのまま本明細書に援用される。
結合により直接結合するか、またはリンカーを介してKDRまたはVEGF/KDR複合
体結合ポリペプチドに結合してよく、その後選択した放射性金属により直接標識される(
WO98/52618、米国特許第5,879,658号、および第5,849,261
号を参照されたい)。
合体は放射線療法にとりわけ有用である。本発明の試薬と放射性テクネチウムの複合体形
成において、テクネチウム複合体、好ましくはTc−99m過テクネテートの塩は、還元
剤の存在下で試薬と反応する。好ましい還元剤は、ジチオナイト、スズおよび鉄イオンで
あり;最も好ましい還元剤は塩化第一スズである。そのような複合体を作製する手段は好
都合にはキットの形状で提供され、標識されることになる本発明の前もって計量された量
の試薬およびTc−99mで試薬を標識するための十分な量の還元剤を含む密封バイアル
を含む。あるいは、複合体は、テクネチウムおよび転移リガンドとして公知の別の化合物
の前もって形成された不安定な複合体と適切なキレート剤に結合した本発明のペプチドを
反応させることにより形成することができる。この工程はリガンド交換として公知であり
、当業者によく知られている。不安定な複合体はたとえばタートレート、シトレート、グ
ルコネートまたはマンニトールのような転移リガンドを使用して形成することができる。
本発明に有用なTc−99m過テクネテート塩の中には、ナトリウム塩、またはアンモニ
ウム塩もしくは低級アルキルアンモニウム塩のようなアルカリ金属塩が包含される。
ム出発物質を使用して行うことができる。レニウムがRe(VII)状態にある化合物の
例としては、NH4ReO4またはKReO4が挙げられる。Re(V)は、たとえば[
ReOCl4](NBu4)、[ReOCl4](AsPh4)、ReOCl3(PPh
3)2として、およびReO2(ピリジン)4 +として利用可能であり、ここでPhはフ
ェニルであり、そしてBuはn−ブチルである。レニウム複合体を形成することができる
他のレニウム試薬も使用することができる。
ング剤が提供される。Tc−99m放射性複合体の形成には、一般に約0.01mCi〜
100mCi/mLの濃度で放射能を含む溶液中で放射性複合体を形成することが好まし
い。
i〜20mCiの放射能を有する。単位用量において注射されることになる溶液は、約0
.01ml〜約10mLである。
20mCiを提供する。患者にKDRまたはVEGF/KDR複合体−特異的放射性核種
造影剤を注射後、造影剤に取り込まれた核種のγ線エネルギーに対して較正したγカメラ
を使用してイメージング剤が取り込まれた領域を映し、その部位に存在する放射能の量を
定量するin vivoでの該部位の画像化は、およそ数分のうちに行われてよい。しか
し、画像化は、所望する場合、放射標識ペプチドが患者に注射された後、数時間またはさ
らに長い間行われてよい。多くの場合、十分な量の投与量が約0.1時間以内に画像化さ
れる部位に蓄積し、シンチフォトを撮ることを可能にする。
物は、単回もしくは複数回のIVまたはIP注射を含むが、それらに限定されない多くの
方法を使用し、標的とするKDR発現組織の損傷または消耗を引き起こすために十分であ
るが、非標的(正常組織)に実質的な損傷を引き起こさない量の放射能を使用して投与す
ることができる。異なる構築物に対して必要な投与してよい線量は、使用する同位体のエ
ネルギーおよび半減期、物質の身体および腫瘍塊からの取込およびクリアランスの程度に
依存して異なる。一般に、線量は約30〜50mCiの単回量から約3キュリーまでの蓄
積量までの範囲であってよい。
前に化合物の放射線分解性損傷を予防するための放射安定化剤を必要としてよい。放射安
定化剤は当業者には公知であり、そしてたとえばパラ−アミノ安息香酸、アスコルビン酸
、ゲンチスチン酸(gentistic acid)などを含んでいてよい。
イアルのキット製品は本発明の不可欠な部分である。
単一バイアルキット製品は、好ましくはキレート化リガンド、第一スズ塩源、または薬
剤的に受容できる還元剤を含み、薬剤的に受容できる酸または塩基で適切に処理してpH
を約3〜約9に調節する。還元剤の量および型は形成されることになる交換複合体の性質
に高度に依存するであろう。適切な条件は、当業者には公知である。キット内容物は凍結
乾燥型であることが好ましい。そのような単一バイアルキット製品は、所望により不安定
、または交換リガンド、たとえばグルコペプトネート、グルコネート、マンニトール、マ
レート、クエン酸もしくは酒石酸を含んでいてよく、そして最終産物の放射化学的純度お
よび安定性の改善に役立つ反応調節剤、たとえばジエチレントリアミン五酢酸(DPTA
)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、またはα、β、もしくはγシクロデキストリ
ンを含んでいてもよい。キット製品はさらに、安定化剤、凍結乾燥工程の補助を意図した
マンニトールのような増量剤、および当業者に公知の他の添加剤を含んでいてよい。
おいて1以上のバイアルを使用する。たとえば、過テクネテートの添加時に不安定なTc
(V)複合体を形成するために必要とするすべての成分(たとえば第一スズ源または他の
還元剤)を1バイアルが含んでいてよい。過テクネテートはこのバイアルに添加され、適
当な期間放置後、バイアル内容物はリガンドおよび最適値にpHを調節するために適切な
バッファーを含む第2バイアルに添加される。約5〜60分反応後、本発明の複合体が形
成される。この複数バイアルキット製品の両バイアル内容物は凍結乾燥されることが好都
合である。上記のように、反応調節剤、交換リガンド、安定化剤、増量剤などはいずれか
、または両方のバイアルに存在してよい。
本発明のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドを使用して、血管新生
が行われる内皮上でKDRまたはVEGF/KDR複合体に対する親和性およびKDRま
たはVEGF/KDR複合体におけるそれらの滞留時間を提供するかまたは改善すること
により、新生物性腫瘍において起こるような望ましくない血管新生に対する血管新生阻害
剤または殺腫瘍剤のような治療薬の活性を改善することができる。本発明のこの側面にお
いて、治療薬と本発明に記載のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドを
結合することによりハイブリッド剤が提供される。治療薬は上記の放射線治療薬、薬物、
化学療法もしくは殺腫瘍剤、遺伝物質または遺伝子送達ビヒクルなどであってよい。結合
物のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチド部分は治療薬をKDRまたは
VEGF/KDR複合体(すなわち活性化内皮)部位へ「接近」させ、内皮に対する結合
物の親和性を改善し、その結果結合物の活性はより血管新生部位に局在化され、濃縮され
る。そのような結合物は、ヒトを含む哺乳動物において血管新生に関連した疾患、とりわ
け新生物性腫瘍の増殖および転移の治療に有用であり、そしてその方法は治療薬に結合し
た本発明に記載のKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドの効果的な量を
それが必要な哺乳動物に投与することを含む。本発明はまた、ヒトを含む哺乳動物におい
て血管新生に関連した疾患の治療のための薬物製造におけるそのような結合物の使用を提
供する。
限定されない:抗新生物薬、たとえばプラチナ化合物(たとえば、スピロプラチン、シス
プラチン、およびカルボプラチン)、メトトレキセート、アドリアマイシン、マイトマイ
シン、アンサミトシン、ブレオマイシン、サイトシン、アラビノシド、アラビノシルアデ
ニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルフ
ァラン(たとえば、PAM、L−PAM、またはフェニルアラニンマスタード)、メルカ
プトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)
、塩酸ダウロルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、マイトマイシン、プリカマイ
シン(ミスラマイシン)、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸ナトリウム、フ
ルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストイ
アクトン、トリロスタン、アムサクリン(m−AMSA)、アパラギナーゼ(L−アパラ
ギナーゼ)、Erwinaアパラギナーゼ、エトポシド(VP−16)、インターフェロ
ンcx−2a、インターフェロンcx−2b、テニポシド(VM−26、硫酸ビンブラス
チン(VLB)、硫酸ビンクリスチン、硫酸ブレオマイシン、アドリアマイシン、および
アラビノシル;血管新生阻害剤、たとえばSU5416およびSU6668(Sugen
/Pharmacia&Upjohn)のような血管新生および/または腫瘍増殖に重要
なシグナリング分子に対する活性を有するチロシンキナーゼ阻害剤、エンドスタチン(E
ntreMed)、アンギオスタチン(EntreMed)、コンブレスタチン(Oxi
gene)、シクロスポリン、5−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ドキソルビシン
、パクリタキセル、ダウロルビシン、イムノトキシン;凝固因子;抗ウイルス剤、たとえ
ばアシクロビル、アマンタジンアジドチミジン(AZTまたはジドブジン(Zidovu
dine))、リバビリンおよびビダラビン一水和物(アデニンアラヒノシド、ara−
A);抗生物質、抗マラリア剤、クロロキンのような抗原虫剤、ヒドロキシクロロキン、
メトロイダゾール、キニーネおよびアンチモン酸メグルミン;抗炎症剤、たとえばジフル
ニサール、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナプ
ロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダック、ト
ルメチン、アスピリンおよびサリシレート。
伝物質をKDR発現細胞に導くことができる。したがって、それらは遺伝子治療、とりわ
け血管新生に関連した疾患の治療に有用であってよい。この態様において、遺伝物質また
は血管新生に関連した疾患の治療に有用な遺伝物質を含む1以上の送達ビヒクルを1以上
の本発明のKDR結合部分に結合させ、患者に投与することができる。遺伝物質には核酸
、たとえば、組換えRNAおよびDNAならびにアンチセンスRNAおよびDNAを含む
、天然または合成起源のいずれかのRNAまたはDNAを挙げることができる。使用して
よい遺伝物質の型としては、たとえば、プラスミド、ファージミド、コスミド、イースト
人工クロモソーム(YAC’s)および欠陥または「ヘルパー」ウイルスのような発現ベ
クター上で運ばれる遺伝子、抗遺伝子核酸、1本鎖および2本鎖RNAおよびDNAの両
方、ならびにホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドのよう
なその類似体が挙げられる。さらに、遺伝物質はたとえば、脂質、タンパク質または他の
ポリマーと結合することができる。遺伝物質の送達ビヒクルとしては、たとえばウイルス
粒子、レトロウイルスまたは他の遺伝子療法ベクター、リポソーム、脂質(とりわけカチ
オン性脂質)と遺伝物質の複合体、デキストラン誘導体と遺伝物質の複合体などを挙げる
ことができる。
子治療に使用される。この態様において、たとえば血管新生に関連した疾患の治療に有用
な遺伝物質または遺伝物質を含む1以上の送達ビヒクルを本発明の1以上のKDRまたは
VEGF/KDR複合体結合ポリペプチドまたはヘテロ多量体に結合し、患者に投与する
ことができる。
皮細胞に遺伝子を選択的に導入するために使用してよく、そしてそれらは癌を治療するだ
けでなく、血管新生の阻害が再狭窄を阻害できる、血管形成術後にも有用であってよい。
部分で説明した同じ型のリンカーを使用し、公知の方法で結合または融合することができ
る。好ましいリンカーは置換または非置換アルキル鎖、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコ
ール鎖、および当該技術分野で公知の他の簡単な高分子リンカーであろう。より好ましく
は、治療薬がそれ自体タンパク質であり、そしてそのコーディングDNA配列が公知の場
合、治療薬およびKDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドは、先に記載の
組換えDNA技術を使用して作製された、同じ合成遺伝子から共発現されてよい。KDR
またはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドのコーディング配列は治療薬のそれと骨
格で融合してよく、治療タンパク質またはKDRもしくはVEGF/KDR複合体結合ポ
リペプチドのいずれかの要求される生物学的機能をそのような配置が破壊しないことが確
認される場合、ペプチドは治療タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または
末端間のある部分で発現される。この一般的方法の具体的な利点は、複数の直列に並んだ
KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドのコンカテマー化が可能で、それ
によってそれぞれの治療タンパク質に関連したKDRまたはVEGF/KDR複合体の結
合部位数および濃度を増やすことである。この方法において、組換え治療融合タンパク質
の効力を改善すると予想されるKDRまたはVEGF/KDR複合体結合活性が増大する
。
含む類似した組換えタンパク質は画像化または治療的適用に有用であってよい。たとえば
、以下に説明した多様なプレターゲッティング適用において、KDRまたはVEGF/K
DR複合体結合ポリペプチドのコーディング配列は抗体(または抗体フラグメントもしく
は抗体を含む組換えDNA構築物など)をコードする配列に骨格で融合してもよく、そし
てそれはたとえば、放射性核種(または別の検出可能な標識)に対するキレート剤に結合
する。KDRまたはVEGF/KDR複合体結合ポリペプチドを発現する抗体は次に患者
に投与され、KDR発現組織に局在し、そして結合する。非結合抗体が除去された後、抗
体が認識するキレート剤−放射性核種複合体(または他の検出可能な標識)が投与され、
KDR発現組織の画像化またはそれへの放射線療法を可能にする。さらに、KDRまたは
VEGF/KDR複合体結合ペプチドのコーディング配列は、たとえば、生物学的作用(
たとえばアポトーシス、凝固、内在化、分化、細胞静止、免疫系刺激もしくは抑制、また
はそれらの組み合わせ)を生じる血清タンパク質または他のタンパク質をコードする配列
に骨格で融合してよい。得られた組換えタンパク質は、癌、および血管新生または本明細
書で説明した病原体に関連する疾患を含む他の疾患に関する画像化、放射線療法、ならび
に複数の療法に有用である。
はそれ自体治療薬として使用され、多数の疾患を治療することができる。たとえば、タン
パク質または他の分子(たとえば成長因子、ホルモンなど)の結合が疾患過程に必要であ
るか、またはその一因となり、そして結合部分がそのような結合を阻害する場合、そのよ
うな結合部分を含む構築物は治療薬として有用であってよい。同様に、結合部分自体の結
合が疾患過程を阻害する場合、そのような結合部分を含む構築物も治療薬として有用であ
ってよい。
KDRへのVEGFの結合を阻害する(またはさもなければ、KDRの活性化を阻害する
)KDR複合体結合ポリペプチドを含む構築物は血管新生阻害剤として使用することがで
きる。KDRの活性化を阻害する本発明のいくつかのペプチドは以下の実施例9において
説明する。KDRの活性化を阻害する多量体およびヘテロ多量体を含む、本発明のある種
の構築物も実施例で説明する。とりわけ好ましいヘテロ多量体はヘテロ二量体含有構築物
D1(実施例により提供される構造)である。他の好ましいヘテロ二量体構築物には、D
4、D5、およびD6(以下の実施例12および18に提供される構造)が挙げられる。
本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は内皮細胞を含む状態を治療するための治療
薬として有用である。内皮細胞の重要な機能が血管新生、または血管形成であるため、ポ
リペプチドおよびその構築物は血管新生を含む状態の治療にとりわけ有用である。血管新
生を含む状態としては、たとえば、固形腫瘍、腫瘍転移および良性腫瘍が挙げられる。そ
のような腫瘍および関連する疾患は当該技術分野で十分に公知であり、たとえばメラノー
マ、中枢神経系腫瘍、内分泌腫瘍、肉腫、多発性骨髄腫、ならびに乳腺、肺、前立腺、結
腸、頭部&頸部、および卵巣の癌が挙げられる。付加的な腫瘍および関連する疾患は、M
oses,et al.の2000年2月15日に発行された米国特許第6,025,3
31号の表1に記載され、その教示は本明細書に援用される。良性腫瘍には、たとえば、
血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫が挙げられる。血管新
生を含む他の関連する疾患には、たとえば慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜
症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植後拒絶反応、新生血管緑内障、水晶体線維増殖症
のような眼球疾患、レベオーシス(rebeosis)、Osler−Webber症候
群、心筋血管新生、プラーク血管新生、毛細血管拡張症、血友病患者関節、血管線維症お
よび創傷肉芽形成が挙げられる。血管増殖を含む、他の関連する疾患または状態には、腸
管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕、および潰瘍が挙げられ
る。さらに、本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は、卵子着床に必要な子宮血管
新生を減少させるか、または阻害するために、たとえば経口避妊薬として使用することが
できる。本発明のヘテロ多量体はまた、VEGFがKDRに結合する場合、結果として生
じてよい血管透過性事象の治療に有用であってよい。腎不全では、たとえば抗VEGF抗
体が障害を抑制できることが示されている。同様に、本発明の化合物は、たとえば糖尿病
における腎透過性発症を抑えることができる。
マラリア、HIV、SIV、サル出血熱ウイルスなどを含むある種の病原体に関連した疾
患の治療に有用であってよい。NCBIのBLASTプログラムを使用したファージディ
スプレイにより同定されたKDR結合ペプチドの配列相同性検索は、病原性生物の表面に
存在することが公知であるか、または推測される多数の相同性タンパク質を同定している
。本発明のポリペプチドと各種マラリア系統、HIV、SIV、サル出血熱ウイルス、お
よび腸管出血性大腸菌株由来のタンパク質間に相同性が認められた。PfEMP1および
EBL−1のような相同性タンパク質のいくつかは、病原性において役割を果たすことが
公知の過可変接着タンパク質である。これらのタンパク質は、宿主表面上の1以上の標的
分子に結合可能な複数の結合部位を有する。それらの高い変異および組換え速度が、それ
らに新規結合部位を速やかに発生させ、生存および/または侵入を促進する。同様に、H
IVのgp120(それも本明細書に開示されたKDR結合ペプチドのいくつかに相同性
を有する)のようなタンパク質はそれらの宿主への病原体の結合に重要な役割を果たす。
今まで報告されていないが、本明細書に開示されたKDR結合ペプチドに相同性を有する
多くの病原体タンパク質もKDRに結合することが可能である。病原体タンパク質配列と
対応するペプチド配列の比較は、ペプチドの結合特性を促進することになるその配列の変
化または他の改変を暗示できる。さらに、本明細書に開示されたKDR結合ペプチド配列
は、相同性を有する病原体種による感染の阻害に有用性であってよい。実際、CD4のよ
うなそれらの公知の細胞表面標的へのウイルスエンベロープタンパク質の結合を妨げるの
を試みることによる類似した方法がHIV感染阻害に使用されている。Howie et
al.,“Synthetic peptides representing di
scontinuous CD4 binding epitops of HIV−1
gp120 that induce T cell apoptosis and
block cell death induced by gp120”,FASEB
J,12(11):991−998(1998)を参照されたい。したがって、KDR
は多数の病原体に対し事前に未知の標的を提示し、そして本発明のKDR結合ペプチドは
それらの病原体に関連する疾患の治療に有用であってよい。
時間経過で個体に投与することができる。結合ポリペプチドおよびその構築物は予防的に
、たとえば状態が診断される前か、またはある状態にかかりやすい個体に投与することが
できる。結合ポリペプチドおよびその構築物は、個体が状態の症状を示す間、または症状
が治まるか、さもなければ緩和された後(たとえば腫瘍の除去後)に投与してもよい。さ
らに、本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は維持処方の一部として、たとえば再
発、または症状もしくは状態を妨げるか、または緩和させるために投与することができる
。以下に記載のように、本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は全身的、または局
所的に投与することができる。
治療に対して、たとえば新生物性腫瘍増殖の場合、腫瘍の位置およびサイズは投与される
物質の量に影響を及ぼすであろう。使用される正確な量および投与様式は病気の性質の観
点から必然的に処置を指図する医師によって状況にあわせて決定されなければならない。
一般に、本発明の薬物結合体の投与量は治療薬単独に対して慣例である投与量に従うこと
になるが、本発明の結合ポリペプチドまたはヘテロ多量体の標的に対する改善された親和
性は標準投与量を減らすことができる。
は静脈内、または動脈内投与のために製剤される。一般に、そしてとりわけ投与が静脈内
または動脈内である場合、医薬組成物はボーラスとして、時間の離れた2回以上の投与量
として、または一定もしくは非線形流量注入物として投与してよい。
緩和を含む。本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は、有用であるために完全に症
状を緩和させる必要はない。たとえば、個体の治療が腫瘍もしくは疾患部位のサイズの縮
小、または腫瘍もしくは疾患部位のサイズ増大の予防になってよい。治療は関心のある部
位において血管数を減らしてよいか、または関心のある部位において血管数の増加を妨げ
てよい。また、治療は主要な腫瘍(複数の腫瘍)の転移性増殖物の数またはサイズの増大
を妨げるか、または減らすことができる。
な生理的特性が挙げられる。本発明の結合ポリペプチドおよびその構築物は、VEGF−
2/KDR、VEGF−1/Flt−1およびVEGF−3/Flt−4を含むVEGF
受容体活性を阻害することができる。そのような阻害は、たとえば結合ポリペプチドおよ
びその構築物の存在下、またはそれらによる処置後の受容体のリン酸化状態を測定するこ
とにより検出できる。また、そのような阻害は、結合ポリペプチドおよびその構築物の存
在下、またはそれらによる処置後の内皮細胞の遊走能を測定することにより検出すること
ができる。本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は本明細書に提供される結合ポ
リペプチドおよびその構築物の適切な量の投与法を知り、関心のあるパラメータに対する
処置の効果を測定することができる。たとえば、関心のある部位(たとえば腫瘍または病
巣)のサイズは、処置前および後で測定することができる。別の態様では、個体から採取
した試料において、相当する受容体のリン酸化状態、または関心のある部位における内皮
細胞の遊走能を測定することができる。VEGF受容体または内皮細胞は試料から単離し
、本明細書に記載のアッセイに使用することができる。
らびに状態の性質および全体的な治療計画に依存してよい。ポリペプチドおよびその構築
物の生物学的効果は本明細書に記載される。したがって、本明細書に提供される結合ポリ
ペプチドおよび構築物の生物学的効果および処置の所望する予後に基づき、慣例の最適化
法により、当業者は好ましい投与量を決定することができる。一般に、1日投与量は約0
.1μg/kg〜約1mg/kgの範囲である。
と一緒に単独の活性成分として投与するか、または他の結合ポリペプチドおよびその構築
物、他の治療薬、もしくはそれらの組み合わせと一緒に投与してよい。さらに、結合ポリ
ペプチドおよびその構築物は、たとえば特性、体内の滞留時間、または治療効果を改善す
るために治療薬に結合してもよい。そのような他の治療薬としては、たとえば他の血管新
生阻害化合物、および殺腫瘍化合物が挙げられる。治療薬はまた、抗体を含んでいてよい
。
ることができる。したがって、結合ポリペプチドまたはその構築物は、核酸が内皮細胞を
標的にするように、たとえば治療ポリペプチドをコードする核酸に結合してよい。いった
ん核酸に結合した結合ポリペプチドに曝されると、内皮細胞は結合した核酸を内在化し、
発現して、標的細胞に治療ペプチドを送達することができる。
波造影剤は、先に記載のように、造影剤に含まれる小胞(とりわけマイクロバブルまたは
マイクロバルーン)を形成するために使用される物質に結合した、本発明のKDRまたは
VEGF複合体結合ペプチドを含む。たとえば、上記造影剤/治療薬結合は、米国特許第
6,258,378号に記載のように行うことが可能であり、これを本明細書に援用する
。したがって、たとえば先に引用した米国特許第6,258,378号に開示されたよう
に、超音波造影剤の投与、およびKDRまたはVEGF/KDR複合体を発現する病原性
部位に結合した造影剤の所望する画像化後に、病原性部位はエネルギー光線(好ましくは
たとえば0.3〜3MHzの周波数の超音波)によって照射され、微小小胞の破裂を引き
起こすことができる。治療薬の治療効果はこうして好都合には微小小胞の破裂によって放
出されたエネルギーによって促進され、とりわけ標的とされる病原性部位への治療薬の効
果的な送達を行うことができる。
。適切な投与経路には、局所適用、経皮、非経口、消化管、膣内、および経歯槽が挙げら
れるがそれらに限定されない。所望する投与経路のための組成物は、たとえばRemin
gton:The Science and Practice of Pharmac
y,20版,Lippincott,Williams and Wilkins,20
00に記載のように、薬剤的技術分野で公知のいずれかの方法により作成することができ
る。
濁し、全身送達のためにポリペプチドおよびその構築物が皮膚に浸透して血流に入るか、
または局所送達のために関心のある部位と接触することを可能にする。局所適用に適した
組成物は、少なくともポリペプチドが最小限に可溶性の、薬剤的に受容できる基剤を含む
。
できる懸濁液で適用することができる。本発明のポリペプチドを投与するための適切な経
皮手段の例は、たとえばFoldvari,et al.の2000年12月26日に発
行された米国特許第6,165,458号およびSintov,et al.の2001
年8月4日に発行された米国特許第6,274,166号B1に記載され、それらの教示
は本明細書に援用する。
ができる。一般に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液で
ある。他の薬剤的に受容できる担体には滅菌水、生理食塩水、および緩衝食塩水(リン酸
または酢酸のようなバッファーを含む)、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール
、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パ
ラフィンなどを含むが、それらに限定されない。必要な場合、組成物は可溶化剤、および
注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインのような局所麻酔剤、保存剤、安定化剤、湿
潤剤、乳化剤、塩類、潤滑剤などを、それらが活性化合物と反応して悪影響を及ぼさない
限り、含むことができる。同様に、組成物は慣用の添加剤、すなわち、非経口的、経腸ま
たは鼻腔内適用に適した薬剤的に受容できる有機または無機担体物質を、それらが活性化
合物と反応して悪影響を及ぼさない限り含むことができる。一般に、成分は、たとえばア
ンプルまたはプラスチック製小容器のような気密シール容器中の乾燥した凍結乾燥粉末ま
たは無水濃縮物として、活性剤の量を活性単位で示す単位剤形中に、別々、または一緒に
混合して供給されることになる。組成物が注入により投与されることになっている場合、
滅菌薬剤等級「注射用水」または生理食塩水を含む注入容器により投薬することができる
。組成物が注射により投与されることになっている場合、滅菌注射用水または生理食塩水
のアンプルが提供され、成分は投与前に混合することができる。
丸剤または液剤に、そして直腸または膣内投与には坐剤に取り込まれてよい。
経歯槽、舌下または肺投与には、ポリペプチドはエアゾール化および吸入のために、ま
たはマウスウォッシュとして適切な薬剤的に受容できる添加剤に懸濁することができる。
噴霧器および吸入器のような経歯槽投与に適切な装置も本発明の範囲内である。舌下また
は肺経路を使用したポリペプチドのエアゾール送達に適した製剤は、たとえば2001年
11月6日に発行されたPankaj Modiの米国特許第6,312,665号B1
に見出すことができる。
に懸濁される場合、経鼻または眼球投与することができる。
本発明のポリペプチドは個体において持続的に放出されるように(徐放または制御放出
)投与することができる。たとえば、ポリペプチドは、1回の投与が少なくとも1週間、
または1年間以上にわたりポリペプチドを送達するような組成物に製剤することができる
。徐放系には、一体型または容器型マイクロカプセル、デポ製剤埋め込み物、浸透圧ポン
プ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチおよびイオン泳動装置が挙げられる。一態様
において、本発明のポリペプチドは分解の遅い、非毒性ポリマー中に封入されるか、また
は混合される。本明細書に提供されるポリペプチドの徐放に適した付加的な製剤は、19
83年7月5日に発行されたFolkman,et al.の米国特許第4,391,7
97号に記載され、その教示は本明細書に援用される。
vivo産生を介する。ポリペプチドをコードする遺伝子は、コードされるポリペプチ
ドが発現されるように個体に投与することができる。遺伝子は一過性に発現することがで
きる。具体的な態様において、ポリペプチドをコードする遺伝子は患者から得ている細胞
に形質移入され、その方法はex vivo遺伝子治療と呼ばれる。ポリペプチドを発現
する細胞はその後患者の体内に戻される。ex vivo遺伝子治療法は当該技術分野で
公知であり、1998年3月21日に発行されたAnderson,et al.の米国
特許第4,391,797号に記載され、その教示は本明細書に援用される。
さらに説明されるであろう。以下の実施例に含まれる具体的なパラメータは本発明の実施
を説明することを意図し、そしてそれらはどのような方法によっても本発明の範囲を限定
するように提示されない。
ヒトKDR(#357−KD−050)、マウスKDR(#443−KD−050)、
ヒトVEGFR−1(#321−FL−050)、ヒトVEGFR−3(#349−F4
−050)、およびヒトTrail R4(#633−TR−100)とIg Fc領域
のキメラ融合体は担体なしの形(BSAなし)でR&D Systems(ミネアポリス
、MN)から購入した。Trail R4 Fcは、標的Fc融合体(KDR Fc)と
同じFc融合体領域を有する不適切なFc融合タンパク質であり、Fc結合剤のライブラ
リーを枯渇させるために使用する。VEGF165(#100−20)は担体なしの形で
Peprotech(ロッキーヒル、NJ)から購入した。プロテインA磁気ビーズ(#
100.02)はDynal(オスロ、ノルウェー)から購入した。ヘパリン(#H−3
393)はSigma Chemical Company(セントルイス、MO)から
購入した。A2−成分テトラメチルベンチジン(TMB)システムはKPL(ゲイサーブ
ルグ,MD)から購入した。
浄機(ウィヌースキー,VT)で洗浄した。ELISA信号はBio−Tekプレートリ
ーダー(ウィヌースキー,VT)で読み取った。96ウェルプレートの撹拌はLabQu
ake振とう機(Labindustries,ベーカリー,CA)上で行った。
DR標的に対するスクリーニングのために調製した:環状ペプチドディスプレイライブラ
リーTN6/VI、TN7/IV、TN8/IX、TN9/IV、TN10/IX、TN
12/IおよびMTN13/I、および直鎖状ディスプレイライブラリーLIN20。こ
れらのライブラリーの設計は前に説明されている。
in−Elmer,ウェレスレイ,MA)を使用してPCR増幅できるように、両方の末
端に一定のDNAを有するように合成し、NcoIおよびPstIで切断し、そして同様
に切断されたファージディスプレイベクターへ連結した。XLL−BLue MFR’大
腸菌細胞を連結したDNAで形質転換した。ライブラリーのすべてを同一の様式で構築し
た。
プロテインA磁気ビーズを1回、1×PBS(pH7.5)、0.01%Tween−
20、0.1%HSA(ブロッキング緩衝液)を用いて室温で30分ブロックし、1×P
BS(pH7.5)、0.01%Tween−20、5μg/mlヘパリン(PBSTH
緩衝液)で5回洗浄した。
ーは、最初のスクリーニングのために2つのプールに分けてプールした。TN6/VI、
TN7/IVおよびTN8/IXが1つのプールであり;TN9/IV、TN10/IX
およびTN12/Iが第2のプールであった。2つのプールしたライブラリーおよび直鎖
状ライブラリー(Lin20)は、Trail R4 Fc融合体(不適切なFc融合体
)に対して枯渇させ、そして次にKDR Fc融合体に対して選択した。100μl P
BSTH当たり、各々のライブラリーから1011プラーク形成単位(pfu)を一緒に
プールした、例えば、3つのプールされたライブラリーは、総容量で〜350μlPBS
THを生じるであろう。
体(0.1μl/μlPBST保存液(ヘパリンなし))を、1000μlの洗浄し、ブ
ロックしたプロテインA磁気ビーズへ加えた。融合体は、4℃で撹拌しながら、一夜ビー
ズへ結合させた。次の日、磁気ビーズを5回、PBSTHで洗浄した。各々のファージプ
ールは50μlのTrail R4 Fc融合体ビーズと、LabQuake振とう機上
、室温(RT)で1時間インキュベートした。インキュベーション後、ファージ上清を除
去し、そして別の50μlのTrail R4ビーズとインキュベートした。非特異的F
c融合およびライブラリーからビーズ結合ファージを除去するため、総計で5ラウンドの
枯渇を繰り返した。
lPBST保存液(ヘパリンなし))を、500μlの洗浄し、ブロックしたビーズへ加
えた。KDR−Fc融合体は、4℃で撹拌しながら、一夜ビーズへ結合させた。次の日、
ビーズを5回、PBSTHで洗浄した。各々の枯渇ライブラリープールを100μlのK
DR−Fc融合体ビーズへ加え、LabQuake振とう機上、室温で1時間インキュベ
ートした。ビーズは次に、磁気スタンド(Promega)を使用してできるだけ迅速に
5×1ml PBSTHで洗浄して、ビーズを洗浄緩衝液から分離した。洗浄後にビーズ
にまだ結合しているファージは、250μlのVEGF(50μg/ml、〜1μM)の
PBSTH溶液で、LabQuake振とう機上、室温で1時間、1度溶出させた。1時
間溶出液を除去し、保存した。最初の溶出後、ビーズを再び250μlのVEGF(50
μg/ml、〜1μM)で、LabQuake振とう機上、室温で一夜インキュベートし
た。2つのVEGF溶出液は別々に保ち、力価決定のために各々から一部を少量採取した
。各々の溶出液を、中間対数期まで増殖させた後、氷で冷やしておいたXL1−Blue
MRF’(または他のF’細胞株)大腸菌細胞の一部と混合した。VEGF溶出後の残
りのビーズもまた、ビーズにまだ結合されているファージ、即ち、2回のVEGFインキ
ュベーション(1時間および一夜溶出)によっても競合により取り除かれなかったKDR
結合ファージ、を増幅させるために細胞と混合した。室温で約15分後、ファージ/細胞
混合物を、50μg/mlアンピシリン含有NZCYM寒天を含んでいるBio−Ass
ay Dishes(243×243×18mm,Nalge Nunc)上に広げた。
プレートは37℃で一夜インキュベートした。次の日、各々の増幅されたファージ培養物
を、そのそれぞれのプレートから採取した。次の日の終わりまでに、インプット、アウト
プットおよび増幅ファージ培養物のFOI(即ち、インプット率=ファージアウトプット
÷ファージインプット)を滴定した。
、上記と同一のプロトコールに従い、〜1010インプットファージ/ラウンドを使用す
る選択のさらなる2〜3の追加ラウンドで選り分けた。各々の追加ラウンドのため、KD
R−Fcビーズは、ラウンドが開始される前夜に調製した。続いてのラウンドにおける溶
出工程に対し、KDR−Fcビーズ上の増幅された溶出液再スクリーンは、いつも同一の
様式で溶出し、すべての他の溶出は洗液として処理した。例えば、大腸菌を感染させるた
め、まだ結合されているビーズを使用して回収された増幅溶出液に対しては、1時間およ
び一夜VEGF溶出を実施し、そして洗液として廃棄した。次に、ビーズを再び大腸菌を
感染させるために使用し、次のラウンドの増幅溶出液を産生した。この手順を使用すると
、各々のライブラリープールから、選択の終わりには3つの最終溶出液のみしか得られな
い。それ故、2つのプールおよび1つの直鎖状ライブラリーから、選択の終わりには9つ
の最終溶出液が得られた。
に対して繰り返した、即ち、すべての工程において、PBSTHをPBST(PBS(p
H7.5)、0.01%Tween−20)に置き換えた。
プロテインA磁気ビーズを、ブロッキング緩衝液で30分、室温で1回ブロックした後
、5回PBSTHで洗浄した。
)は前のように調製し、結合VEGFなしでのレセプターへの結合剤を除去するためTr
ail−R4 Fc融合体の代わりに、KDR Fc融合体のみに対して枯渇させた。枯
渇させたら、ライブラリーをKDR:VEGF165複合体に対して選択した。
μg/μlPBST保存液(ヘパリンなし))を、1mlの洗浄しブロックしたビーズに
加えた。融合体は4℃で撹拌しながら、一夜結合させた。次の日、ビーズをPBSTHで
5回洗浄した。各々のファージプールは、LabQuake振とう機上、室温で1時間、
50μlのKDR−FC融合体ビーズとインキュベートした。インキュベーション後、フ
ァージ上清を除去し、別の50μlのKDR−FC融合体ビーズとインキュベートした。
これを総計で5ラウンドの枯渇のために繰り返した。
融合体ビーズを15μlのVEGF(1mg/ml)とインキュベートした。VEGFは
室温で1時間結合させた。ビーズを5回、PBSTHで洗浄した。各々の枯渇ライブラリ
ープールを100μlのKDR:VEGF複合体ビーズへ加え、LabQuake振とう
機上、室温で1時間インキュベートした。ビーズは次に、磁気スタンド(Promega
)を使用してできるだけ迅速に5×1ml PBSTHで洗浄して、ビーズを洗浄緩衝液
から分離した。洗浄後にビーズにまだ結合しているファージを溶出するため、ビーズを細
胞と混合し、ビーズにまだ結合されているファージを増幅した。室温で約15分後、ファ
ージ/細胞混合物を、50μg/mlアンピシリン含有NZCYM寒天を含んでいるBi
o−Assay Dishes(243×243×18mm,Nalge Nunc)上
に広げた。プレートは37℃で一夜インキュベートした。次の日、各々の増幅されたファ
ージ培養物を、そのそれぞれのプレートから採取した。次の日の終わりまでに、インプッ
ト、アウトプットおよび増幅ファージ培養物のFOIを滴定した。この選択プロトコール
を、各々の増幅溶出液からの1010のインプットファージを使用して、さらに2ラウン
ド繰り返した。
100μlのKDR−FC融合体またはTrail R4−Fc癒合体(1μg/ml
)を二重のImmulon IIプレートのあらゆるウェルへ加え、4℃で一夜インキュ
ベートした。各々のプレートを2回、PBST(PBS、0.05%Tween−20)
で洗浄した。ウェルを1×PBS、1%BSAで上まで満たし、室温で2時間インキュベ
ートした。各々のプレートを1回、PBST(PBS、0.05%Tween−20)で
洗浄した。
、各々のKDRウェルへ100μlのVEGF(1μg/ml)のPBST溶液を加え、
室温で30分インキュベートした。各々のプレートは次に、PBST(PBS、0.05
%Tween−20)で洗浄した。
20、1%BSAで1:1に希釈した(または、精製ファージ保存液を使用して1010
pfuへ)。100μlの各々の希釈培養液を加え、室温で2〜3時間インキュベートし
た。各々のプレートを5回、PBSTで洗浄した。結合ファージは、PBSTに1:10
,000希釈で希釈した、HRP−抗M13抗体コンジュゲート(Pharmacia)
を各々のプレートへ加えることにより可視化し、室温で1時間インキュベートした。各々
のプレートを7回、PBST(PBS、0.05%Tween−20)で洗浄し、次にプ
レートをHPR基質で発色させ(〜10分)、そして吸光度信号(630nm)をプレー
トリーダーで検出した。
与しているディスプレイペプチドの配列を、標準DNA配列決定法により決定した。単離
されたファージの結合ペプチドは、下記の表1〜7に示されている。
の単離物を二次ライブラリー構築のためのテンプレートとして働くように選択し、それか
らさらに高親和性結合ポリペプチドを単離した。二次TN8ライブラリーにおいて、ファ
ージ単離物配列PKWCEEDWYYCMIT(配列番号21)を、各々の可変コドンで
親配列に対して1−、2−および3−塩基突然変異を許容するライブラリーの構築するた
めのテンプレートとして使用した。二次TN12ライブラリーにおいて、ファージ単離物
配列SRVCWEDSWGGEVCFRY(配列番号88)を、各々の可変コドンで親配
列に対して1−、2−および3−塩基突然変異を許容するライブラリーの構築するための
テンプレートとして使用した。別の二次TN12ライブラリーにおいては、最初のTN8
配列からの反復性モチーフは一定に保ち(WVEC−−−TG−C−−−;配列番号26
0)、そして他のコドン位置のすべて(即ち、「−」での)はNNKコドン置換を使用し
て変更することを許容した、ここでNは任意のヌクレオチドを表し、およびKは任意のケ
トヌクレオチド(GまたはT)を表している。
17764(1998)、により記載されているようなソフト無作為化によるペプチド最
適化法を使用し、2つのライブラリーを配列番号21および配列番号88の配列に基づい
て調製した。各々の残基位置において、特定コドン内の各々のヌクレオチドは、親コドン
のヌクレオチドには対応しない、別の3つのヌクレオチドの固定量を加えることにより発
展させることを許容した。このヌクレオチド混合は、ライブラリーを作製するために使用
したテンプレートDNAの合成において達成した。これらのライブラリーについて、各々
のコドン内の親ヌクレオチドは、配列番号21で64%、および配列番号88で67%維
持されており、ところが他のヌクレオチドは3で割った残りの頻度で付加されていた。親
ヌクレオチドが多数であるので、全ライブラリーの総合的な共通配列は、まだ親配列を含
んでいるのは当然である。しかしながら、個々の配列を点検すると、多数の突然変異が可
能であることを示しており、それ故、親配列と比較して改良された結合能力を有するペプ
チドの選択を可能にしている。
すべてが、テンプレートオリゴヌクレオチド中のNNK置換で変化するのを許容されてい
た。置換を広げるため、NNK多様性がまた2つのフランキングアミノ酸位置で許容され
、従って、ディスプレイペプチドのN末端およびC末端に多様なアミノ酸位を加えている
。それ故、二次ライブラリーテンプレートは以下の配列のディスプレイペプチドをコード
していた:Xaa−Xaa−Trp−Val−Glu−Cys−Xaa−Xaa−Xaa
−Thr−Gly−Xaa−Cys−Xaa−Xaa−Xaa−Xaa−Xaa(配列番
号261)、式中、Xaaは任意のアミノ酸でありうる。共通配列には親配列が残ってい
る、前の2つのライブラリーと異なり、このライブラリーはすべての許容された位置で全
く異なっており、一定に保たれた残基中の親モチーフのみが似ていた。
出戦略は変更された。結合されたファージの競合溶出は、特定の二次ライブラリーを作製
するために使用された親ペプチド(50μM)を使用して実施した(即ち、各々の配列番
号21、88および40のペプチド)。結合ファージは3工程で溶出した:(1)室温で
1時間の溶出、溶出されたファージは、増幅のため、細胞に感染させるのに使用されてい
る、(2)一夜溶出、ここで、新鮮な競合溶出ペプチドを結合されたファージへ加え、そ
して撹拌しながら4℃で一夜インキュベートした、溶出されたファージは次に、増幅のた
め、細胞に感染させるのに使用されている、および(3)残存するビーズ(溶出されなか
った結合ファージを有している)は、直接的に細胞に感染させるのに使用された。3ラウ
ンドの選択を実施した。ラウンド2および3からプラークを拾い、ELISAで分析し、
そして配列決定した。KDR陽性単離物は、50μM遊離親ペプチドとの競合でさらにア
ッセイした。親ペプチドと最小競合を示したペプチドがより高い親和性結合剤と考え、合
成した。これらの配列は、TN8二次ライブラリーに対しては配列番号22〜23、TN
12二次ライブラリーに対しては配列番号89〜95として、以下の表に掲げられている
。
も存在する。これらの実験に使用されたライブラリーは、ヌクレオチドの代わりに、トリ
ヌクレオチド(コドン)をカップリングするTRIM技術を使用して構築されたので、ラ
イブラリーテンプレートDNAはしばしば低いパーセンテージの欠失されたコドンを有し
ている。例えば、TN12ライブラリーの場合、全ライブラリーの約5.3%は、12量
体どころか環状11量体であり、そして本当にいくつかのファージ発現11量体が、上記
選択過程で単離された(表12参照)。
、たぶんKDRのヘパリン結合ドメインを標的としている;クラスIIペプチドはヘパリ
ンまたはVEGFの存在下または不在下で結合し、それ故、たぶんKDR上の関係しない
部位で結合する;クラスIIIペプチドは、ヘパリンには影響されないが、VEGFの存
在下では乱される結合特性を示し、それ故、たぶんこれらはVEGFまたはKDRのVE
GF結合ドメインを結合する。溶出欄において、1HR、O/N、およびCellは各々
、1時間VEGF、一夜VEGF、およびビーズ感染溶出液を表している。ある場合には
、特定の単離物配列が2つの異なった溶出液で観察された。二次世代ライブラリーにより
同定された単離物では、VEGF溶出がペプチド溶出に置換されている(下記参照)。
陽性ファージ単離物に相当する、選択されたKDRまたはVEGF/KDR複合体結合
ペプチドを、9−フルオレニルメトキシカルボニルプロトコールを使用する固相上で合成
し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。ペプチド質量はエレクトロスプレー質量分
光法により確認し、そしてペプチドは289nmでの吸光度により定量した。合成のため
、ペプチドが切り出されたファージベクター配列からの2つのN末端および2つのC末端
アミノ酸、は保持され、そして各々のペプチドのC末端へ−Gly−Gly−Gly−L
ys−NH2リンカー(配列番号262)を付加した。各々のペプチドは、N末端をアセ
チル化した。選択されたリジン残基を有するペプチドに対しては、C末端リジンへの選択
的カップリングを可能にする、1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキサ
−1−イリデン)−3−メチルブチル(ivDde)で保護し、ペプチド切断の間は除去
せず、カップリング後、2%ヒドラジンのDMF溶液または0.5Mヒドロキシルアミン
の水溶液(pH8)で除去できる。
またはフルオレセイン イソチオシアネート(FITC)の2%ジイソプロピルエチルア
ミン(DIPEA)含有DMF溶液を使用して、C末端リジンをフルオレセインで標識し
た。もし、ペプチドがivDde保護リジンを含んでいたら、すべての遊離NHS−フル
オレセインと反応し、そして内部保護基を除去する、2%ヒドラジンの添加により反応を
停止させた。すべての他のペプチドに対しては、等容量の0.5Mヒドロキシルアミン、
pH8、の添加により反応を停止させた。停止された反応液は、次にDMFが10%より
少なくなるまで水で希釈し、そしてC18逆相クロマトグラフィーを使用して精製した。
ペプチドは、LC−MSシステム(ライン内にSCIEX AP150単四重極質量分析
計を備えたHP1100 HPLC)で純度および正しい質量を確認した。
蛍光異方性測定は、384ウェルマイクロプレート中、10μlの結合緩衝液(PBS
、0.01%Tween−20、pH7.5)で、Tecan Polarion蛍光偏
光プレートリーダーを使用して実施した。ある場合には、ヘパリン(0.5μg/ml)
または10%ヒト血清を結合緩衝液へ加えた(データは示されていない)。蛍光標識ペプ
チドの濃度は一定に保ち(20nM)、そしてKDR−Fc(または類似の標的)の濃度
を変化させた。結合混合液は、測定前に30℃で10分間、マイクロプレート中で平衡化
した。観察された偏光の変化を、見掛けのKDを得るため、非線形回帰を経て下記の式に
当てはめた。この式(1)は、合成ペプチドおよびKDRが1:1の化学量論で、溶液中
で可逆的複合体を形成することを仮定している。
rboundは結合されたペプチドの異方性であり、KDは見掛けの解離定数であり、K
DRは全KDR濃度であり、およびPは全蛍光標識ペプチド濃度である。KDは直接結合
アッセイで計算し(KD,B)(表8参照)、それ故、これらの値は蛍光標識ペプチドへ
のKDR結合を表している。
ミンカップリング法により、CM5センサーチップのデキストラン表面へ架橋した(0.
5mg/ml溶液を50mM酢酸塩、pH6.0、で1:20に希釈、RLKDR−Fc
=12859)。実験はHBS−P緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.
15M NaCl、0.005%ポリソルベート20(v/v))中で実行した。吸光係
数により定量したペプチド溶液を、HBS−Pで400nMに希釈した。200、100
、50および25nM溶液を生じるように一連の希釈を行った。会合のためには、kin
jectプログラムを使用して、ペプチドを20μl/分で1分間注入した。1分間の解
離に続いて、1m NaClを50μl/分で25秒間急速に注入して、残存するペプチ
ドを標的表面から除去した。すべての試料は2重に注入した。各々のペプチド系列の間で
の、緩衝液および非標的結合ペプチド注入が追加の対照として働いた。センサーグラムは
、BIAevaluationソフトウェア3.1の同時ka/kdフィッティングプロ
グラムを使用して分析した。この方法による見掛けのKDは、表8にBiaKDとして示
されている。上記蛍光異方性実験と異なり、非標識ペプチドがすべての試験で使用されて
おり、それ故、このアッセイを使用すると、これらの値は非標識ペプチドへのKDR結合
を表している。合成されたポリペプチドについて決定された結合親和性は、下記表8に示
されている。ポリペプチドの推定されるジスルフィド強要環状ペプチド部分は、下線が引
かれている。
上記のような両方のアッセイ(蛍光異方性/BiaCore)で、複合体への結合を試験
した。異方性アッセイにおいて、KDR−VEGF複合体は、2倍モル過剰のVEGFと
KDR−Fcを一緒に混合することにより形成させた。この混合物は次に、前に行ったよ
うに蛍光標識ペプチドを使用する直接結合滴定で使用した。対照として、各々のペプチド
はまたKDRおよびVEGF単独との結合を試験することにより、それらの複合体に対す
る特異性を試験した。どのペプチドも少しもVEGFと結合しなかったので、アッセイに
おける過剰のVEGFの存在は、KD決定に影響を与えるはずがない。下記表9に示した
ように、ペプチドすべてが劇的な結合優先性を示した(VEGFよりもKDR/VEGF
に対する結合)。しかしながら、それらのいくつかは、いくらかの遊離KDRへの残存性
結合を示した。異方性結果を確認するため、非標識ペプチドを前のようにBiacore
で試験した、ただし、ペプチドの注入に先立って、KDR/VEGF複合体を形成させる
ためにチップをVEGFで飽和した。試験されたペプチドにおいて、BiaKDは、異方
性測定の少なくとも2倍以内であった。
以下の方法を実施例4〜10で用いた。以下の共通の略語を使用する:9−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt
)、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、N−メチルピロリジノン(N
MP)、無水酢酸(Ac2O)、(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキサ−
1−イリデン)−3−メチルブチル(ivDde)、トリフルオロ酢酸(TFA)、試薬
B(TFA:H2O:フェノール:トリイソプロピルシラン 88:5:5:2)、ジイ
ソプロピルエチルアミン(DIEA)、O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−
N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU
)、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウ
ロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)、N−ヒドロキシスクシンイミド(
NHS)、固相ペプチド合成(SPPS)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジクロ
ロメタン(DCM)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ヒト血清アルブミン(HSA)
および放射化学的純度(RCP)。
ペプチドは、Fmocペプチド合成プロトコール、特にカップリング剤としてHOBt
/DICおよび溶媒としてNMPを用い、Advanced ChemTech ACT
357またはACT 496合成機を使用し、NovaSyn TGR(Rinkアミ
ド)樹脂(0.2ミリモル/g)上で合成した。Fmocは、Nova−Syn TGR
(Rinkアミド−NovaBiochem,サンディエゴ CA、から入手可能)樹脂
結合ペプチドを25%ピペリジンのDMF溶液で2回(4分および10分)処理すること
により除去した。すべてのアミノ酸をNMPに溶解した(アミノ酸が純粋なNMPに溶解
しない場合にはDMFを添加した)。アミノ酸の濃度は0.25Mであり、HOBtおよ
びDICの濃度は各々0.5Mであった。
0.04ミリモル規模の合成のためには:
典型的アミノ酸カップリングサイクル(洗浄工程を含まないで)では、ピペリジン溶液
(2.4mL)を各々のウェルに分配し、そして4分間混合し、次にすべてのウェルを空
にした。NMP(320μL)、HOBt溶液(320μL、4当量)、アミノ酸(64
0μL、4当量)およびDIC(320μL、4当量)溶液を各々のウェルに分配した。
カップリング時間は3時間であり;次に樹脂を洗浄した。各々のアミノ酸に対してサイク
ルを繰り返した。最後のアミノ酸カップリング後、樹脂結合ペプチドを、25%ピペリジ
ンで処理してFmoc保護基を除去した。洗浄後、樹脂結合ペプチドを、1.0M Ac
2O(ウェル当たり1.2ml)およびジイソプロピルエチルアミンのDMF溶液(任意
にさまざまな量のHOBtを混合物に含んで)で30分キャップ(cap)した。樹脂を
メタノールそして次にジクロロメタンで洗浄して乾燥させた。樹脂からのペプチドの切断
および側鎖の脱保護は、試薬Bを4.5時間使用して達成した。切断溶液を集め、そして
樹脂を追加の試薬Bで洗浄した。合併した溶液は濃縮して乾固した。回旋させながら、ま
たは撹拌しながらエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。エーテルをデカントし、固形
物を集めた。不純物を除去するため、この操作を2〜3回繰り返した。粗直鎖状ペプチド
をDMSOおよび水の混合物に溶解し、HPLCで精製した(カラム:Waters A
ssociates Xterra C18,19×50mm;溶媒:0.1%TFA含
有H2Oおよび0.1%TFA含有CH3CN;UV 220μm;流速:50〜60m
l/分)。ペプチドを含んでいる溶液を凍結乾燥すると、所望のペプチドを白色でふわふ
わした凍結乾燥物として得た(純度>90%)。精製された直鎖状ジ−システイン含有ペ
プチドを水、水−アセトニトリル混合物、または水−DMSO混合物に、0.1mg/m
lから2.0mg/mlの濃度で溶解した。溶媒の選択は、粗ペプチドの溶媒への溶解度
に依存した。溶液のpHを、アンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液または炭酸水素アン
モニウム水溶液でpH7.5〜8.5に調節した。混合物は空気中で24〜48時間激し
く撹拌した。非DMSO含有溶媒系の場合、溶液のpHをトリフルオロ酢酸水溶液でpH
2へ調節した。混合物を凍結乾燥すると、粗環状ジスルフィド含有ペプチドを与えた。環
状ジスルフィドは次に、最少量のアセトニトリル(0.1%TFA)を含んでいる1〜2
ml容量の水溶液(0.1%TFA)に溶解した。C18またはC8逆相セミ分取または
分取HPLCカラムを使用し、得られた溶液を逆相カラムに加え、そして所望の化合物は
アセトニトリル−水の濃度勾配溶離により得られた。DMSO含有溶液の場合、ペプチド
が沈殿しない最少のDMSO濃度まで希釈した。得られた混合物は、希トリフルオロ酢酸
で迅速にpH2の酸性とし、そして逆相HPLCシステムへ加え、説明したように精製し
た。所望の物質を含んでいる分画をプールし、そしてペプチドを凍結乾燥により単離した
。
以下の変更を加え、方法1のようにペプチドを合成した。HBTU/HOBT/DIE
Aをカップリング試薬として使用し、およびNMPを溶媒として使用した。上記Nova
−Syn TGR樹脂から調製された、低負荷(〜0.2ミリモル/g)Fmoc−GG
GK(Boc)−NovaSyn−TGR−樹脂が0.01ミリモル規模のペプチド合成
に用いられた。
0.01ミリモル規模合成に対して:
Fmoc基を除去した後、標準カップリング法は、HOBt(720μl、6当量)、
アミノ酸(804μl、6.6当量)、HBTU(720μl、6当量)およびDIEA
(798μl、13.3当量)の溶液を使用した。混合物を15分撹拌し、空にし、そし
て樹脂を洗浄した。すべてのカップリング後、そして上記のようなすべての切断および精
製後、所望の直鎖状ペプチドを含んでいる溶液を凍結乾燥すると、ペプチド(純度>90
%)を白色でふわふわした固形物として得た。粗エーテル沈殿直鎖状ジ−システイン含有
ペプチドは、水、水性アセトニトリル混合液(0.1%TFA)、または水性DMSOに
溶解し、アンモニア水、炭酸アンモニウム水溶液または炭酸水素アンモニウム水溶液の添
加による溶液pHのpH7.5〜8.5への調整により環化した。ペプチド濃度は0.1
から2.0mg/mlであった。混合物を空気中で24〜48時間撹拌し、トリフルオロ
酢酸水溶液でpH2の酸性とし、そして次にアセトニトリル−水の濃度勾配を用いる分取
逆相HPLCにより精製した。所望の物質を含んでいる分画をプールし、そしてペプチド
を凍結乾燥により単離した。
ペプチドは、方法1に記載したように、Advanced ChemTech ACT
496 MOS合成機を使用して合成した。ペプチド合成のために、低負荷(〜0.2
ミリモル/g)Fmoc−GGGK(Boc)−NovaSyn−TGR−樹脂を用いた
。カップリング溶媒はNMP/DMSO 8:2であった。合成は0.02ミリモル規模
で実行し、3時間のカップリング時間を使用した。粗直鎖状ペプチドは方法1で記載した
ようにさらに処理した。
ペプチドは、カップリング試薬としてHBTU/DIEA、および溶媒としてNMPを
用いるACT 496により、方法3を使用して合成した。1M溶液としての2,4,6
−コリジンを塩基として使用した。ペプチド合成のために、低負荷Fmoc−GGGK(
Boc)−NovaSyn−TGR−樹脂(〜0.2ミリモル/g)を用いた。カップリ
ング時間は30分であった。粗直鎖状ペプチドは方法1で記載したようにさらに処理した
。
ペプチドの合成を、0.25ミリモル規模で、FastMocプロトコール(Appl
ied Biosystems Inc)を使用して実施した。このプロトコールの各々
のサイクルにおいて、カートリッジ中の1ミリモルの乾燥保護アミノ酸は0.9ミリモル
のHBTU、2ミリモルのDIEA、および0.9ミリモルのHOBtのDMF溶液に溶
解し、追加のNMPを加えた。ペプチドは0.1ミリモルのNovaSyn TGR(R
inkアミド)樹脂(樹脂置換0.2ミリモル/g)を使用して作製した。このプロトコ
ールにおけるカップリング時間は21分であった。Fmoc脱保護は、20%ピペリジン
NMP溶液で実施した。最後のサイクルの終わりに、合成されたペプチドを、無水酢酸/
DIEA/HOBt/NMPを使用してアセチル化した。ペプチド樹脂を洗浄し、さらな
る操作または樹脂からの切断(試薬Bを使用する)のために乾燥した。一般に、切断され
たペプチドは、精製前に方法1のように環化した。
ペプチドは方法5を使用して調製した。C末端リジン上のivDde保護基は、10%
ヒドラジンのDMF溶液による処理により選択的に除去した。樹脂は次に、DIEA存在
下、ビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルのDMF溶液で処理した。洗浄
後、樹脂を乾燥し、そして試薬Bを使用して切断を実施した。樹脂を濾過して除き、濾液
を濃縮乾固した。ビオチニル化ペプチドをニートDMSOに溶解し、DIEAで処理し、
そしてジスルフィド環化を達成するために4〜6時間撹拌した。粗混合物は分取HPLC
により精製した。
溶液で処理し(2×20mL)、そしてDMF(2×20mL)、次にジクロロメタン(
1×20mL)で洗浄した。樹脂をDMF(10mL)に再懸濁し、そしてビオチン−N
HSエステル溶液(0.2ミリモル、5当量)およびDIEA(0.2ミリモル)で処理
し、次に、樹脂を試薬と4時間混合した。反応の完了はニンヒドリン試験により検査した
。ペプチドは次に、試薬B(10mL)による4時間の処理により樹脂から放出させた。
樹脂を濾過して除き、試薬Bを真空下で除去し、そして無水エーテルの添加によりペプチ
ドを沈殿させた。形成された固形物を集め、エーテルで洗浄して乾燥した。固形物は無水
DMSOに溶解し、混合物をDIEAでpH7.5に調整し、ジスルフィド環化を達成す
るために4〜6時間撹拌した。ジスルフィド環化反応は、分析用HPLCでモニターした
。環化完了後、混合物溶液を25%アセトニトリル含有水溶液で希釈し、そして、アセト
ニトリル−水(両方とも0.1%TFAを含んでいる)の濃度勾配を使用し、逆相C18
カラムでのHPLCにより直接精製した。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物
を含んでいる分画を集め、凍結乾燥すると必要なビオチニル化ペプチドを得た。
遊離アミノ基を含んでいる精製ペプチド(10mg、方法1〜5により製造)を無水D
MFまたはDMSO(1ml)に溶解し、ビオチン−NHSエステル(5当量)およびD
IEA(5当量)を加えた。反応をHPLCでモニターし、反応完了後(1〜2時間)、
粗反応混合物を分取用HPLCで直接精製した。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な
生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥すると必要なビオチニル化ペプチドを得た。
典型的な実験において、400mgの樹脂含有ペプチド(ABI 433A合成機を使
用して作製、ivDde−保護リジンを有する)を10%ヒドラジンDMF溶液(2×2
0ml)で処理した。樹脂をDMF(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗
浄した。樹脂をDMF(10ml)に再懸濁し、Fmoc−アミノジオキサオクタン酸(
0.4ミリモル)、HOBt(0.4ミリモル)、DIC(0.4ミリモル)、DIEA
(0.8ミリモル)で、4時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をDMF(2×10
ml)およびDCM(1×10ml)で洗浄した。樹脂は次に、20%ピペリジン含有D
MF(2×15ml)で各々、10分間処理した。樹脂を洗浄し、Fmoc−ジアミノジ
オキサオクタン酸とカップリングさせ、Fmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。遊
離アミノ基を含んでいる、得られた樹脂は、ビオチン−NHSエステル(0.4ミリモル
、5当量)およびDIEA(0.4ミリモル、5当量)のDMF溶液中、2時間処理した
。ペプチド−樹脂は、前に記載したように洗浄し、そして乾燥した後、試薬B(20ml
)で4時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと撹拌する
と固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。固形物を無水DMS
Oに溶解し、DIEAでpHを7.5に調整した。混合物を4〜6時間撹拌してジスルフ
ィド環化を達成し、それは分析用HPLCでモニターした。環化完了後、DMSO溶液を
25%アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相C18カラムへ直接応用した。精製はア
セトニトリル−水(両方とも0.1%TFAを含んでいる)の濃度勾配を使用して達成し
た。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥す
ると必要なビオチニル化ペプチドを得た。
リジンのイプシロン窒素上にivDde保護基を含んでいる、方法5により得られたペ
プチド−樹脂を、ivDde基を除去するために、ヒドラジンのDMF溶液と混合した(
10%ヒドラジン/DMF、2×10ml、10分)。リジンのイプシロン窒素は、フル
オレセイン−5−イソチオシアネート(0.12ミリモル)およびジイソプロピルエチル
アミン(0.12ミリモル)のDMF溶液で標識した。混合物は12時間、激しく撹拌し
た(フルオレセイン含有化合物は光から保護した)。樹脂は次にDMF((3×1mL)
および2回、CH2Cl2(10mL)で洗浄し、窒素下で1時間乾燥した。試薬Bを4
時間使用して、ペプチドを樹脂から切断し、溶液を濾過して集めた。揮発分を減圧下で除
去し、残渣を真空下で乾燥した。ペプチドをエーテルで沈殿させ、集め、そして沈殿を窒
素気流下で乾燥した。沈殿を水に加え(1mg/ml)、混合物のpHを、10%メグル
ミン水溶液で8に調整した。ペプチドの環化を48時間実施し、溶液を凍結乾燥した。粗
環状ペプチドを水に溶解し、水からアセトリトリル(両方の相とも0.1%TFAを含む
)への直線濃度勾配を用いた、C18カラムでのRP−HPLCにより精製した。純粋な
生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥した。ペプチドはES−MSで確認し、および
純度はRP−HPLC(水からアセトリトリルへの直線濃度勾配/0.1%TFA)によ
り決定した。
ートの製造
ペプチドは0.1ミリモルのNovaSyn−TGR樹脂(0.2ミリモル/g 置換
)から出発して合成した。脱保護(ivDde)樹脂は次にFmoc−Gly−OH、F
moc−Cys(Acm)−OHおよびFmoc−Ser(tBu)−OHの取り込みの
ためのプロトコールAに従って処理した。
単一アミノ酸のマニュアルカップリングのためのプロトコールA:
1. 4当量の相当するFmocアミノ酸および4.1当量のHOBtおよび4.1当量
のDICで5時間処理
2. DMFで洗浄(3×10ml)
3. 20%ピペリジンのDMF溶液で処理(2×10mL、10分)
4. DMFで洗浄(3×10mL)
Fmoc保護ペプチド添加樹脂は次に、20%ピペリジンのDMF溶液(2×10mL、
10分)で処理し、DMFで洗浄した(3×10mL)。N,N−ジメチルグリシン(0
.11ミリモル)、HATU(1ミリモル)およびDIEA(0.11ミリモル)のDM
F溶液(10mL)をFmoc保護ペプチド添加樹脂に加え、マニュアルカップリングを
5時間続けた。反応後、樹脂をDMF(3×10mL)およびCH2Cl2(3×10m
L)で洗浄し、真空下で乾燥した。
使用するメルカプトアセチル化ペプチドの形成
S−アセチルチオグリコール酸 N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SATA)
(0.0055ミリモル)をペプチド(0.005ミリモル、遊離アミンを有し、方法1
〜5で得られた)のDMF溶液(0.25mL)へ加え、反応混合物は室温で6時間撹拌
した。真空下で揮発分を除去し、残渣は0.1%TFA含有アセトニトリル−水を使用す
る分取HPLCにより精製した。純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥すると
メルカプトアセチル化ペプチドを得た。メルカプトアセチル化ペプチドはESI−MSで
確認し、および純度は水からアセトリトリル(両方とも0.1%TFAを含んでいる)へ
の直線濃度勾配を用いる逆相HPLC分析により決定した。
形成
ジスルフィド環化後、方法5からの精製ペプチドを、NMP中で、S−アセチルチオグ
リコール酸(1.5〜10当量)/HOBt(1.5〜10当量)/DIC(1.5〜1
0当量)と、室温で2〜16時間結合させた。混合物は次に、分取HPLCにより精製し
た;純粋なペプチドを含んでいる分画を合併し、凍結乾燥した。ivDde基により保護
された別のリジンを有する化合物の場合、脱保護反応は、2%ヒドラジンDMSO溶液と
の、室温で3時間の反応を用いた。反応混合物の精製により純粋なペプチドを得た。
結合した化合物を製造する場合、方法5からの精製ペプチド(遊離アミノ基を有する)は
、NMP中で、AcSCH2CO−(NH−CH2−CH2−O−CH2−CH2−O−
CH2−CO)2−OH(30当量)/HOBt(30当量)/DIC(30当量)と、
室温で40時間結合させた。混合物を精製し、そしてivDde基を除去した。第二の精
製後、最終生成物を白色凍結乾燥物として得た。
製造)へ結合させ、続いてFmoc除去およびS−アセチルチオグリコール酸へのカップ
リングを行った。
必要とされる精製ペプチドは、方法5を使用してSPPSにより製造した。ホモ二量体
を製造するには、二量体の製造に必要とされるペプチドの半分をDMFに溶解し、10当
量のグルタール酸ビスN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで処理した。反応の進行
はHPLC分析および質量分析法によりモニターした。反応完了時、揮発分を真空下で除
去し、未反応のビス−NHSエステルを除去するため、残渣を酢酸エチルで洗浄した。残
渣を乾燥し、無水DMFに再溶解して、2当量のDIEA存在下、ペプチドの残りの半分
で処理した。反応を24時間進行させた。この混合物は直接、Waters Assoc
iates C−18 XTerra逆相HPLCカラムへ応用し、水からアセトリトリ
ル(両方とも0.1%TFAを含んでいる)への直線濃度勾配での溶出により精製した。
過剰のビスNHSエステルを洗い流した後、DIEA存在下、第二のペプチドを加えた。
反応後、混合物は分取HPLCにより精製した。
上に示した方法を利用し、表10に示したKDRおよびVEGF/KDR複合体結合ポ
リペプチドのビオチニル化体を製造した。ペプチド配列中の文字「J」はスペーサーまた
はリンカー基、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタノイル、を指示している。
施例5に示したアッセイを使用して評価した。数個のビオチニル化ペプチドは、KDR発
現細胞へよく結合した:配列番号356(KD 1.81nM±0.27)、配列番号2
64(KD 14.87±5.0nM、4回の実験の平均)、配列番号294+スペーサ
ー(KD 10.00±2.36nM、4回の実験の平均)、配列番号301(KD 4
.03±0.86nM、3回の実験の平均)、配列番号337(KD 6.94±1.9
4nM、1回の実験)、および配列番号338(KD 3.02±0.75nM、1回の
実験)。
の結合
ファージディスプレイにより同定されたペプチドの、一過性にトランスフェクトされた
293H細胞で発現されたKDRへの結合を決定するため、トランスフェクトされた細胞
表面上のKDRへの、ニュートラアビジンHRPと複合体形成したビオチニル化ペプチド
の結合を測定する、新規アッセイを開発した。このアッセイは、実施例4で示したビオチ
ニル化ペプチドをスクリーニングするために使用した。ニュートラアビジンHRPは、レ
クチン結合炭化水素部分が存在しないため、およびまた、ニュートラアビジン中に細胞接
着レセプター−結合RYDドメインが存在しないため、ビオチン以外の分子への非特異的
結合がより低いので、ストレプトアビジンまたはアビジンの代わりに使用した。
4、配列番号277および配列番号356、およびKDRへ結合しない対照ペプチドの四
量複合体を合成し、KDRで一過性にトランスフェクトされた293H細胞へ結合するそ
れらの能力を試験した。KDR結合ペプチドの四量複合体4つすべてがビオチニル化され
ており、JJスペーサーを含んでおり、KDR発現細胞へ結合した;しかしながら、配列
番号356が最もよいKD(1.81nM)を示した。KDR結合ペプチド配列番号29
4、配列番号264の四量複合体は、同じペプチドの単量体よりも改良された結合を示し
た。さらに、KDR結合ペプチドとビオチン間のスペーサーの包含は、実験Bにおいて改
良された結合が示された。
ペプチドの結合における血清の影響を評価するために、使用することができることが示さ
れた。配列番号264、配列番号294および配列番号356の結合は、血清存在下でも
有意に影響されなかったが、一方、配列番号277の結合は、血清存在下で50%より多
く減少した。
む多量体標的指向化構築物における使用のため、異なった組合わせのKDRおよびVEG
F/KDR複合体結合ペプチドを評価する際に、このアッセイが有用であることが示され
ている。さらに、実験DおよびEは、異なったエピトープへ結合する、2つまたはそれよ
り多くのKDR結合ペプチドを含んでいる四量体構築物は、標的指向化ペプチド単独の「
純粋な」四量体構築物より優れた結合を示したことを確認した。
m−RNA&5’RACEの準備ができたcDNAライブラリーの調製
HUVEC細胞を、175cm2組織培養フラスコ(Becton Dickinso
n, Biocoat,カタログ番号6478)中でほとんど80%コンフルエントまで
増殖し、KDRの発現を誘導するため、10ng/mlのbFGF(Oncogene,
カタログ番号PF003)を24時間加えた。mRNAはInvitrogenからのマ
イクロ−ファーストトラック2.0キット(カタログ番号K1520−02)を使用して
単離した。キット使用説明書に従って、2つのフラスコ(約3000万細胞)から12μ
gのmRNA(260nmの吸光度で測定)を得た。cDNAを発生させるための逆転写
を、モロニーマウス白血病ウイルス(NMLV)逆転写酵素を使用し、2μgのmRNA
、オリゴdTプライマー(5’(T)25GC−3’)および/またはスマートIIオリ
ゴ(5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG−3’)で実
施した。反応は、20μlの総容量で実施し、反応混合物は2μlのRNA、1μlのオ
リゴdTプライマー、4μlの5×第一鎖緩衝液(250mMトリスHCl pH8.3
、375mM KCl、30mM MgCl2)、1μlのDTT(20mM、逆転写酵
素とともにも供給される)、1μlのdNTP混合物(10mM、dATP、dCTP、
dGTP、およびdTTPの各々をddH2Oに、Stratagene,カタログ番号
200415)、9μlのddH2Oおよび1μlのMMLV逆転写酵素(Clonet
ech,カタログ番号8460−1)を含んでいた。逆転写反応は、42℃で90分実施
し、250μlのトリシン−EDTA緩衝液(10mMトリシン、1.0mM EDTA
)の添加により反応を停止させた。逆転写生成物、5’RACEの準備ができたcDNA
ライブラリー、は−20℃で3ヶ月保存することができる。DNAおよびRNA処理に使
用したすべての水は、USB(カタログ番号70783)からのDNAaseおよびRN
Aaseを含まない水であったことに注意されたい。
s−KDRをクローン化するため、5’オリゴ(G ATG GAG AGC AAG
GTG CTG CTG G)(配列番号358)および3’オリゴ(C CAA G
TT CGT CTT TTC CTG GGC A)(配列番号359)を使用した。
これらは、pfuポリメラーゼ(Stratagene,カタログ番号600135)に
よるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する、5’RACEの準備ができたcDNA
ライブラリー(上記)からKDR完全細胞外ドメイン(〜2.2kbp)を増幅するため
に設計した。PCR反応は50μlの総容量であり、反応混合物は、2μlの5’RAC
Eの準備ができたcDNAライブラリー、1μlの5’オリゴ(10μM)、1μlの3
’オリゴ(10μM)、pfu酵素に加えて1%DMSOおよび8%グリセロールを補給
した5μlの10×PCR緩衝液(200mM トリス−HCl pH8.8、20mM
MgSO4、100mM KCl、100mM (NH4)2SO4)、1μlのdN
TP混合物(10mM)および40μlのddH2Oを含んでいた。PCR反応は94℃
で1分、68℃で1分および72℃で4分の40サイクルにセットされたプログラムを使
用することにより実行した。PCR生成物は、1容量のフェノールでの抽出、続いての1
容量のクロロホルムでの抽出、そして3容量のエタノールおよび1/10容量の3M酢酸
ナトリウムでの沈殿により精製した。PCR生成物は17μlのddH2Oに再懸濁し、
生成物の各々の末端にAオーバーハングを発生させるため、2μlの10×Taqポリメ
ラーゼ緩衝液(100mMトリス−HCl pH8.8、500mM KCl、15mM
MgCl2、0.01%ゼラチン)および1μlのTaqポリメラーゼ(Strata
gene,カタログ番号600131)を加えた。72℃で1時間インキュベート後、修
飾された生成物を、製造業者のプロトコールに従って、TOPOIIベクター(InVi
trogen,カールスバット,CA)内へ直接クローン化すると、TOPO−sKDR
を得た。Taq(PCR酵素)処理PCR生成物のA−オーバーハングのため、TOPO
ベクターはPCR生成物の容易なクローニングを可能にしている。
KDRの膜貫通および細胞質ドメインをクローン化するため、5’オリゴ(TCC C
CC GGG ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG G
TG)(配列番号360)および3’オリゴ(C AGG AGG AGA GCT C
AG TGT GGT C)(配列番号361)を使用した。これらは、pfuポリメラ
ーゼによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する、5’RACEの準備ができたc
DNAライブラリー(上記)からKDRの完全膜貫通および細胞質ドメイン(〜1.8k
bp)を増幅するために設計した。PCR反応条件およびプログラムは上記s−KDRで
記載したものと全く同一であった。s−KDR配列と全く同じように、PCR生成物はフ
ェノールクロロホルム抽出を使用して精製し、Taqポリメラーゼで処理し、そしてIn
vitrogenからのTOPOIIベクター内へクローン化すると、TOPO−CYT
Oを得た。
完全長レセプターを作製するため、細胞外および細胞質ドメイン(膜貫通ドメインを含
んで)を別々に、各々のTOPO−sKDRおよびTOPO−CYTOから、PCRによ
り増幅し、後でライゲートして完全長レセプターを作製した。細胞外ドメインの5’末端
にNotI部位を有するオリゴ(A TAA GAA TGC GGC CGC AGG
ATG GAG AGC AAG GTG CTG CTG G)(配列番号362)
および細胞外ドメインの3’末端に相補的なオリゴ(TTC CAA GTT CGT
CTT TTC CTG GGC ACC)(配列番号363)を、TOPO−sKDR
からの細胞外ドメインのPCRによる増幅に使用した。同様に、5’オリゴ(ATC A
TT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG)(配列番号364)
および、NotI部位を有する3’オリゴ(A TAA GAA TGC GGC CG
C AAC AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C)(配列番
号365)を、TOPO−CYTOからの細胞質ドメイン(膜貫通ドメインを有する)の
PCRによる増幅に使用した。両方のPCR生成物をNotIで消化し、一緒にライゲー
トして完全長レセプターを作製した。完全長レセプターをコードするcDNAをアガロー
スゲルで精製し、pcDNA6/V5−HisCベクターのNotI部位へライゲートし
た。DNAの精製およびライゲーションは、前にpsKDRのために記載したように行っ
た。ライゲーション反応液はDH5α細菌培養物を形質転換するために使用し、そして多
数の個々のクローンは、各々のクローンから精製されたプラスミドのEcoRI酵素によ
る制限分析により、挿入物の存在および配向を分析した。
293H細胞はInvitrogen(カタログ番号11631)から得られ、推薦さ
れている培地に1ml/Lのペニシリン/ストレプトマイシン(InVitrogen,
カタログ番号15140−148)を加えて、単層培養として増殖させた。すべての細胞
は、毎日の培養では抗生物質存在下で増殖させたが、トランスフェクション前の16〜2
0時間は、抗生物質を含まない培地に分割した。
グリセリン保存物からの、pf−KDRを含んでいる大腸菌DH5αを、50μg/m
lアンピシリンを含むLB(LB寒天はUS biologicalsから、カタログ番
号75851およびアンピシリンはSigmaから、カタログ番号A2804)プレート
に画線し、一夜増殖させるためプレートを37℃のインキュベーター中に放置した。次の
朝、単一コロニーをプレートから突き取り、3mlのLB/アンピシリン培地(US b
iologicalsからのLB、カタログ番号US75852)中、37℃で増殖させ
た。8時間後、3mlチューブから100μlの細菌培地を、250mlのLB/アンピ
シリン培地へ移し、37℃で一夜インキュベートした。細菌を、500mlボトル(Be
ckman,カタログ番号355605)中、220rpmの円を描く撹拌により、La
b−Lineインキュベーター振盪機で増殖させた。次の日、細菌培養物をmaxi−p
repキット(QIAGEN,カタログ番号12163)を使用して処理した。一般に、
250mlの細菌培養物から、約1mgのプラスミドDNA(260nmでの吸光度によ
り定量した)が得られた。
トランスフェクションは、ポリ−D−リジン被覆96ウェルプレートを使用して、リポ
フェクタミン2000プロトコール(Invitrogen,カタログ番号11668−
019)で推薦されているように行った。320ngのKDR DNA(pc−DNA6
−fKDR)/ウェル、0.1ml中、を96ウェルトランスフェクションに使用した。
トランスフェクションは血清含有培地中で行い、トランスフェクション試薬混合物を6〜
8時間後に細胞から除去し、通常の血清含有培地に取り替えた。トランスフェクションは
、黒/透明96ウェルプレート(Becton Dickinson,カタログ番号35
4640)で行った。プレートの左半分をMockトランスフェクトし(DNAなしで)
、プレートの右半分をKDR cDNAでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェ
クション時には80〜90%コンフルエントであり、アッセイする時間である次の日には
完全にコンフルエントであり、さもなければ、アッセイを中止した。
アッセイのためのM199培地を調製するため、1つのM199培地小包(GIBCO
,カタログ番号31100−035)、20mlの1mMHEPES(GIBCO,カタ
ログ番号15630−080)および2mgのDIFCOゼラチン(DIFCO,カタロ
グ番号0143−15−1)を950mlのddH2Oに加え、約4mlの1N NaO
Hを加えることにより溶液のpHを7.4に調整した。pH調整後、ゼラチンを溶解させ
るため、M199培地を水浴中、37℃で2時間暖め、次に0.2μmフィルター(Co
rning,カタログ番号43109)を使用して濾過滅菌し、後でアッセイに使用する
ように4℃で保存した。
スの調製
SoftLinkソフトリリースアビジン−セファロースは、Promega(カタロ
グ番号V2011)から得られたセファロースを、12,000rpmで2分間遠心分離
し、氷冷水で2回洗浄し(洗浄の中間には遠心分離を行う)、ペレットを冷水に再懸濁し
てddH2O中での50%スラリーを作製することにより調製した。新鮮なアビジンの5
0%スラリーを、各々の実験のたびに調製した。
ビオチニル化ペプチド配列番号294、264、277、356および非結合ビオチニ
ル化対照ペプチドを、250μMの50%DMSO保存溶液を調製するために使用し、お
よびニュートラアビジン−HRPの33μM保存溶液は、2mgのニュートラアビジン−
HRP(Pierce,カタログ番号31001)を1mLのddH2Oに溶解すること
により調製した(すべてのポリペプチドはJJスペーサーを含んでいた)。ペプチド保存
溶液は−20℃で保存し、一方、ニュートラアビジン−HRP保存溶液は−80℃で保存
した。ペプチド/ニュートラアビジン−HRP複合体を調製するため、10μlの250
μMビオチニル化ペプチド保存溶液および10μlの33μMニュートラアビジン−HR
Pを1mlのM199培地に加えた。この混合物は4℃にて60分、回転板上でインキュ
ベートし、続いて、過剰のペプチドを除去するために50μlのソフトリリースアビジン
−セファロース(ddH2O中での50%スラリー)を加え、さらに4℃にて30分、回
転板上でインキュベートした。最後に、12,000rpmで5分間、室温で遠心分離す
ることにより、ソフトリリースアビジン−セファロースをペレット化し、得られた上清を
アッセイに使用した。新鮮なペプチド/ニュートラアビジン−HRP複合体を、各々の実
験のたびに調製した。
飽和結合実験のため、120μl、60μl、20μl、10μl、8μl、6μl、
4μl、および1μlのペプチド/ニュートラアビジン−HRP複合体を1.2mlのM
199培地に加えて、各々33.33nM、16.65nM、5.55nM、2.78n
M、1.67nM、1.11nMおよび0.28nM複合体の最終濃度を有する希釈液を
作製した。
ブロッキング溶液は、20mlのM199培地を10mgの凍結乾燥非標識ニュートラ
アビジン(Pierce,カタログ番号31000)に加えることにより調製した。新鮮
なブロッキング溶液を、各々の実験のたびに調製した。
トランスフェクション24時間後、293H細胞の各々のウェルを1回100μlのM
199培地で洗浄し、80μlのブロッキング溶液と37℃でインキュベートした。1時
間後、細胞を100μlのM199培地で2回洗浄し、70μlの対照ペプチド、配列番
号294、配列番号264、配列番号277および配列番号356のペプチド/ニュート
ラアビジン−HRP希釈液と、室温で2.5時間インキュベートした。各々の希釈液は、
偽ならびにKDRトランスフェクト293H細胞(各々の飽和結合実験に2つのプレート
を使用した)を含む3つの別々のウェルへ加えた。室温でインキュベーション後、さらに
半時間のインキュベーションのため、プレートを4℃へ移した。続いて、細胞を氷冷M1
99培地で5回、氷冷PBSで1回洗浄した(この順序で)。最終洗浄後、100μlの
氷冷TMB溶液(KPL,カタログ番号50−76−00)を各々のウェルへ加え、各々
のプレートを、空気インキュベーター中、37℃でインキュベートした。最後に、HRP
酵素反応を、50μlの1Nリン酸を各々のウェルへ加えることにより停止させ、マイク
ロプレートリーダー(BioRad モデル3550)を使用して450nmでの吸光度
を測定することにより、結合を定量した。
このアッセイにおいて、対照ペプチド、配列番号294、配列番号264、配列番号2
77および配列番号356ペプチド(各々がビオチニル化され、JJスペーサーを有し、
およびニュートラアビジン−HRPとコンジュゲートされている)は上記のように調製し
、KDRで一過性にトランスフェクトされた293H細胞へ結合するそれらの能力を試験
した。ペプチド/ニュートラアビジン複合体調製の間、ニュートラアビジンの4つのビオ
チン結合部位すべてが占有されることを確実にするため、ニュートラアビジン−HRPに
対して7.5倍過剰のビオチニル化ペプチドを使用した。複合体形成後、遊離ビオチニル
化ペプチドとニュートラアビジン−HRP−複合体形成ビオチニル化ペプチド間のどんな
競合も避けるため、過剰の遊離ビオチニル化ペプチドはソフトリリースアビジン−セファ
ロースを使用して除去した。配列番号264および配列番号294の飽和結合曲線(図1
A)を作成するため0.28nMから33.33nM、配列番号277および配列番号3
56の飽和結合曲線(図1B)を作成するため0.28nMから5.55nM、のいくつ
かの異なったペプチド/ニュートラアビジン−HRP濃度で実験を実施した。飽和結合曲
線を描くため、試験された各々の濃度での、各々の異なったペプチド/ニュートラアビジ
ン−HRP複合体のKDRトランスフェクト細胞への結合から、Mockトランスフェク
ト細胞へのバックグラウンド結合を差し引いた。それ故、図1(下記)Y軸の吸光度は、
差吸光度(KDRから偽を差し引いた)であり、絶対吸光度ではない。Graph Pa
d Prismソフトウェア(バージョン3.0)を使用する、図1の飽和結合データの
分析から、四量体配列番号294ペプチド複合体に対して10.00nM(±2.36)
、四量体配列番号264に対して14.87nM(±5.066)、四量体配列番号27
7に対して4.031nM(±0.86)、および四量体配列番号356に対して1.8
14nM(±0.27)のKDを得た。予想されるように、これらの結合定数は、関連す
る単座ペプチド配列番号294(69nM)、配列番号264(280nM)、配列番号
310(51nM)のKDRFcに対して、FPにより測定されたものよりも低かったが
、単座ペプチド配列番号277(3nM)に類似していた。予想されるように、対照(結
合剤なし)ペプチド/ニュートラアビジン−HRP複合体に対しては、結合の飽和は観察
されなかった。単一濃度実験が、非結合ペプチドからKDR結合ペプチド(配列番号26
4、295および277)を区別するために使用できることを示すため、単一濃度(5.
55nM)でのペプチド/ニュートラアビジン−HRP複合体の結合(図2)をプロット
した。
実験Bは、KDR結合配列(配列番号294および264)およびビオチン間のスペー
サー(JJ、表10)の必要性を調べるために計画された。この実験においては、スペー
サーJJを有するまたは有しないビオチニル化ペプチドを試験し(例えば、JJスペーサ
ーを有するビオチニル化配列番号264、JJスペーサーを有しないビオチニル化配列番
号264、スペーサーを有するビオチニル化配列番号294、およびスペーサーを有しな
いビオチニル化配列番号294)、非KDR結合、ビオチニル化対照ペプチド(スペーサ
ーを有するまたは有しない、前に示したように調製)を対照として使用した。この実験で
試験されたすべてのKDR結合配列のペプチド構造は、図3に示されている。
でのみ行われた。
結果:図4に示された結果から、スペーサーが配列番号294および配列番号264の結
合を促進したことは明らかである。結合配列およびビオチン間のスペーサーは、複数の機
構により、標的分子への結合の促進を助けることができる。第一に、それは、単一アビジ
ン分子への結合後、4つのビオチニル化ペプチド間の立体障害軽減を助けることができる
。第二に、それは、単一細胞上の利用可能な複数の結合部位へ到達するために必要とされ
る、特別な長さを提供できる。
実験Cは、配列番号294、264、277および356の結合に対する血清効果を調
べるために計画した。この方法において、配列番号294、264、277および356
のビオチニル化ペプチド/アビジンHRP複合体を、40%ラット血清存在下または不在
下、M199培地中で試験した(実験Aで前に記載したように)。この実験は実験Aで記
載したように実施したが、ただ、配列番号294および264に対しては6.66nm、
および配列番号277に対しては3.33nM、および配列番号356に対しては2.2
2nMの単一濃度でのみ行った。ポリペプチドの各々はビオチニル化されており、および
JJスペーサーを有していた。
ラット血清により有意に影響されなかったのに対して、配列番号277の結合は、40%
ラット血清存在下で50%以上低下したことを示している。Tc−キレートを有する、T
c−標識配列番号277の結合においては、40%ラット血清存在下、80%以上の低下
が観察された(図27)。Tc−標識配列番号277の結合に対する血清効果は、本明細
書に開示されたアビジンHRPアッセイによく似ているので、このアッセイは、KDRへ
のペプチド(類)の結合に対する血清効果を、迅速に評価するために使用することができ
る。
実験Dは、KDRおよびVEGF/KDR複合体−結合ポリペプチド配列番号294お
よび配列番号264の四量複合体、特に少なくとも2つのKDR結合ポリペプチドを含む
構築物の結合を評価するために計画した。KDR結合ペプチドおよび対照結合ペプチドは
上記のように調製した。この実験は、実験Aで示したプロトコールを使用して実施したが
、以下に示した手順はこの実験に独特のものであった。
94および対照ペプチドの250μM保存溶液は50%DMSOで調製し、およびニュー
トラアビジン HRPの33μM保存溶液は、2mgのニュートラアビジン HRP(P
ierce,カタログ番号31001)を1mLのddH2Oに溶解することにより調製
した。ペプチド保存溶液は−20℃で保存し、一方、ニュートラアビジン−HRP保存溶
液は−80℃で保存した。ビオチニル化ペプチドの配列は前に示されている。ペプチド/
ニュートラアビジン−HRP複合体を調製するため、5.36μLの250μMビオチニ
ル化ペプチド保存溶液(またはペプチド混合物の溶液、アビジン HRP分子数の4倍の
ペプチド分子を与えるため)および10μLの33μMニュートラアビジン−HRPを1
mlのM199培地に加えた。この混合物は4℃にて60分、回転板上でインキュベート
し、続いて、過剰のペプチドを除去するために50μlのソフトリリースアビジン−セフ
ァロース(ddH2O中での50%スラリー)を加え、さらに4℃にて30分、回転板上
でインキュベートした。最後に、12,000rpmで5分間、室温で遠心分離すること
により、ソフトリリースアビジン−セファロースをペレット化し、得られた上清をアッセ
イに使用した。新鮮なペプチド/ニュートラアビジン−HRP複合体を、各々の実験のた
びに調製した。
ェクション24時間後、293H細胞の各々のウェルを1回100μlのM199培地で
洗浄し、80μlのブロッキング溶液と37℃でインキュベートした。1時間後、細胞を
100μlのM199培地で2回洗浄し、70μlの3.33nMペプチド(またはペプ
チド混合物)・ニュートラアビジン HRP溶液(前に調製した保存溶液の10μLを1
mLのM199培地に加えることにより調製)と、室温で2.5時間インキュベートした
。各々の希釈液は、偽ならびにKDRトランスフェクト293H細胞を含む3つの別々の
ウェルへ加えた。室温でインキュベーション後、さらに半時間のインキュベーションのた
め、プレートを4℃へ移した。続いて、細胞を氷冷M199培地で5回、氷冷PBSで1
回洗浄した(この順序で)。最終洗浄後、100μlの氷冷TMB溶液(KPL,ゲイサ
ーブルグ,MD)を各々のウェルへ加え、各々のプレートを、空気インキュベーター中、
37℃でインキュベートした。最後に、HRP酵素反応を、50μlの1Nリン酸を各々
のウェルへ加えることにより停止させ、マイクロプレートリーダー(BioRad モデ
ル3550)を使用して450nmでの吸光度を測定することにより、結合を定量した。
し、および293Hトランスフェクト細胞におけるKDRへの結合のためお互いが協力し
ていることを確認した。KDRに結合しないビオチニル化対照ペプチドを使用した。予想
されるように、アビジン−HRPと対照ペプチドの四量複合体はKDR−トランスフェク
ト細胞への促進された結合を示さなかった。配列番号294および配列番号264の四量
複合体は、Mockトランスフェクト細胞よりも、KDR−トランスフェクト細胞へ著し
くより良好に結合した(図6参照)。しかしながら、配列番号294四量体は、配列番号
264四量体よりもより良好に結合した。もし、四量複合体を形成させるため、使用され
たペプチド混合物に対照ペプチドを加えたら、KDR−トランスフェクト細胞への結合は
減少した。単量体、二量体および三量体に対する、四量体の特異的結合の比は、四量体、
三量体および二量体の特異的結合(KDR−トランスフェクト細胞からMockトランス
フェクト細胞への結合を差し引くことにより得られた)を単量体の特異的結合で割ること
により計算した。結果は、KDR−トランスフェクト細胞への結合に対して、配列番号2
64、294および356の多量体化の協力効果が存在することを示している。
クト細胞に対して、バックグラウンドと比較して有意には結合せず、アッセイを通してK
DRに結合されたままであるには、配列番号264/アビジン−HRP複合体にとって多
価結合が決定的であることを示している。この現象はまた、配列番号294に対しても当
てはまり、四量複合体において、50%のペプチドを対照ペプチドで置換すると、トラン
スフェクト細胞上のKDRへのほとんどすべての結合が消滅した。
64から構成されたペプチド混合物は、Mockトランスフェクト細胞と比較して、KD
R−トランスフェクト細胞へきわめてうまく結合し、同一標的分子上の2つの部位または
エピトープを標的化することは大きな利点があることを示している。さらに、配列番号2
94および配列番号264を異なった比(3:1、2:2および1:3)で含んでいる四
量複合体はすべて、両方のペプチドの純粋な四量体よりも、KDR−トランスフェクト細
胞へより良好に結合し、単一標的分子上の2つの異なった部位の標的化は、単一部位への
多量体結合よりも優れているという考えと一致している。これは、多量体が同時に結合す
るには、十分にお互いが近接している2つまたはそれより多くの別々の標的分子に、多量
体結合実体が広がっていることを必要とするが、一方、単一標的分子上の2つまたはそれ
より多い異なった部位に結合できる多価結合剤は、多価結合を達成するため、その手の届
くところに別の標的分子を発見することには依存しないためであろう。
実験Eは、配列番号294および配列番号264がKDR上の異なった部位(エピトー
プ)へ結合することを確認するために計画した。もし、これらのペプチドがKDR上の同
一の部位へ結合するとしたら、これらはお互いに競合することが可能でなければならない
;しかしながら、もし、これらが異なった部位へ結合するとしたら、これらは競合すべき
ではない。この実験は、各々のウェルに単一濃度の配列番号264/アビジン HRP溶
液(3.33nM)を加え、スペーサーを有するビオチニル化対照ペプチド、配列番号2
64、および配列番号294(これらはいずれもアビジンと複合体形成されていない)の
濃度を変化させて(0〜2.5μM)加えることにより実施した。
配列番号264/アビジン HRP溶液と競合したのに対し、対照および配列番号294
はKDR−トランスフェクト細胞への結合について、配列番号264/アビジン HRP
溶液と競合しなかった。それ故、配列番号264および配列番号294は、KDR上の異
なったおよび相補的な部位へ結合する。
KDR結合ポリペプチドのN末端およびC末端切り詰め物を作製し、切り詰めポリペプ
チドのKDR発現細胞への結合について試験した。合成されたポリペプチドは図8に示さ
れている。KDR発現細胞へのポリペプチドの結合は、実施例3の手順に従って決定した
。
アセチル化およびフルオレセイン化した(実施例3)。結果は、配列番号294ポリペプ
チドにおいて、ジスルフィド強要ループ外側のC末端残基がKDR結合に寄与しているこ
とを示している(図8)。
確認するためのビーズ結合アッセイ
以下の手順を、KDR発現細胞へ結合する、KDR結合ペプチドの能力を評価するため
に実施した。この手順においては、配列番号264、337、36および373を含んで
いるKDR結合ペプチドを、蛍光ビーズへコンジュゲートし、KDR発現293H細胞へ
結合する能力を評価した。実験は、KDR発現部位へ、ビーズのごとき粒子を結合させる
ため、これらのペプチドが使用できることを示している。結果は、両方のKDR結合配列
の結合が、スペーサーの付加により改良されたことを示している。
抗KDR抗体のビオチニル化:腹水液としての、Sigma(V−9134)からの抗
KDRを、Molecular Probes(F−6347)からのキットを使用し、
製造業者の説明書に従ってビオチニル化した。
たように調製した、50%DMSO)の0.2mM保存溶液からの0.1mLを、0.1
mLのニュートラアビジン被覆赤色蛍光微小球(直径2ミクロン、Molecular
Probesから注文生産品として)および0.2mLの50mm MES(Sigma
M−8250)緩衝液、pH6.0、と、回転板上、室温で1時間インキュベートした
。陽性対照として、ビオチニル化抗KDR抗体を、ニュートラアビジン被覆ビーズと上記
のようにインキュベートしたが、ペプチド溶液に代わりに0.03mgのビオチニル化抗
体調製物のPBS溶液(Gibco、カタログ番号14190−136)を使用した。ビ
ーズは必要になるまで、1週間までは4℃で保存できる。
mで10分、室温で遠心分離した。上清を除去し、0.06mlのMES、pH6.0、
を加えた。各々のビーズ溶液は次にボルテックスし、水浴中で15分、超音波処理した。
1.47mlのDMEM、1×MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)(GIBCO 1
1140−050)および40%FBS(Hyclone SH30070.02)を含
む高グルコース(GIBCO #11965−084)、へ0.03mlの超音波処理ビ
ーズ調製液を加えた。Mockトランスフェクトされている293H細胞を列1から6に
、そしてKDRトランスフェクト細胞を列7から12に蒔いた96ウェルプレート(実施
例5のように)の水気を切り、そして1回DMEM、1×NEAAおよび40%FBSを
含む高グルコース、で洗浄した。ビーズ調製液当たり6つのウェルで、各々のウェルに0
.1mlのビーズ溶液を加えた。室温で30分インキュベートした後、プレートを逆にす
ることによりウェルの水気を切り、0.1mlのCa++Mg++含有PBS(GIBC
O カタログ番号14040−117)で、室温にて5分振盪しながら4回洗浄した。水
気を切った後、ウェル当たり0.1mlのPBSを加えた。プレートは次に、Packa
rd FluoroCount蛍光計を使用し、励起550nm/発光620nmで読み
取った。コンジュゲートされていないニュートラアビジンを陰性対照として使用すると同
時に、ビオチニル化抗KDR抗体でコンジュゲートしたビーズをアッセイの陽性対照とし
て使用した。
た標準曲線が各々のアッセイプレートに含まれている。標準曲線は、各々のウェルの蛍光
強度に基づき、ウェル当たりに結合されたビーズ数を計算するために使用した。
されたが、一方、何も付着していないアビジンビーズは両方の細胞型へ結合されなかった
(図9)。ビオチニル化配列番号264ビーズは、Mockトランスフェクト細胞よりも
有意にはKDRトランスフェクト細胞へ結合されなかったが、ペプチド部分およびビオチ
ン基の間に親水性スペーサーを加えることにより(JJスペーサーを有するビオチニル化
配列番号264ビーズ)、Mockトランスフェクト細胞への結合を増加させることなく
、KDR細胞への結合が促進された。ビオチニル化配列番号294ビーズは、KDRトラ
ンスフェクト細胞へのより強い結合を示し、そして、ペプチド部分およびビオチン分子の
間に親水性スペーサーを加えることにより(JJスペーサーを有するビオチニル化配列番
号264)、トランスフェクト細胞中のKDRへの特異的結合が著しく改良された。それ
故、配列番号264および配列番号294両方のペプチド配列は、ビーズのような粒子を
KDR発現部位へ結合するために使用できる。ペプチドおよび粒子への付着に使用された
基の間への親水性スペーサーの付加は、ここに評価したペプチド両方の結合を改良するの
で、新規標的指向化分子でルーチン的に試験されるべきである。
5I−標識VEGFの競合
KDR−結合ポリペプチドは次に、トランスフェクトされた293H細胞により発現さ
れたKDRへの結合において、125I−標識VEGFと競合する能力を評価した。結果
は、KDR結合ポリペプチド配列番号263(Ac−AGDSWCSTEYTYCEMI
GTGGGK−NH2)は125I−標識VEGFと有意に競合しなかったが、配列番号
294、264および配列番号277は125I−標識VEGFと非常によく競合する、
125I−標識VEGF結合の96.29±2.97%および104.48±2.074
%を阻害する、ことを示した。
ールを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションは、黒/透明96ウェルプ
レート(Becton Dickinson,カタログ番号354640)で行った。プ
レートの左半分をMockトランスフェクトし(DNAなしで)、プレートの右半分をK
DR cDNAでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション時には80〜9
0%コンフルエントであり、アッセイする時間である次の日には完全にコンフルエントで
あり、さもなければ、アッセイを中止した。
ペプチド溶液の調製:ペプチド配列番号294、配列番号263、配列番号264およ
び配列番号277の3mM保存溶液は、上に記載したように、50%DMSOで調製した
。
Fの25μCi(Amersham,カタログ番号IM274)を250μlのddH2
Oで再構築して保存溶液を作製し、それは後に使用するまで−80℃で保存した。各々の
アッセイに対して、上記保存溶液をM199培地に希釈することにより、125I−標識
VEGFの300pM溶液を新しく作製した。125I−標識VEGFの濃度は、その日
の材料の比活性に基づいて毎日計算した。
調製:各々の96ウェルプレートのため、300pM125I−標識VEGFを含む10
mlのM199培地を4℃で調製した。各々のペプチド溶液(3mM、上に記載したよう
に調製した)を、300pM125I−標識VEGFを含む300μlのM199培地に
1:100および1:10000で希釈して、300pM125I−標識VEGFを含ん
でいる、30μMおよび0.3μMペプチド溶液を調製した。調製したら、この溶液はす
ぐ使用できるように氷上に保った。300pM125I−標識VEGFを含んでいるM1
99培地でのペプチドの希釈は、各々の実験で新たに行った。
胞は、トランスフェクション24時間後に使用し、アッセイのための細胞を調製するため
、それらを3回、室温のM199培地で洗浄し、冷蔵庫に入れた。15分後、M199培
地をプレートから除き、ポリペプチドを含む75μlの300pM125I−標識VEG
FのM199培地(上のように調製された)で置き換えた。各々の希釈液は偽およびKD
Rトランスフェクト細胞を含む3つの別々のウェルへ加えた。4℃で2時間インキュベー
トした後、プレートを冷結合緩衝液で5回洗浄し、優しく吸い取って乾燥し、細胞損失を
顕微鏡下で検査した。100μlの可溶化溶液(2%トリトンX−100、10%グリセ
ロール、0.1%BSA)を各々のウェルへ加え、プレートを室温で30分インキュベー
トした。各々のウェル中の可溶化溶液をピペットで吸い上げたり吐き出したりすることに
より混合し、そして1.2mlチューブへ移した。各々のウェルを100μlの可溶化溶
液で2回洗浄し、洗液を対応する1.2mlチューブへ加えた。各々の1.2mlチュー
ブは、プログラム54(125Iウィンドウで1分)を使用するLKBガンマカウンター
で計数されるべき15.7×100cmチューブへ移した。
−標識VEGFを特異的に阻止する、KDR結合ペプチド配列番号294、配列番号26
3、配列番号264および配列番号277の能力を、MockトランスフェクトおよびK
DR−トランスフェクト細胞で評価した。配列番号263は、本明細書で説明したFPア
ッセイにおいてKDRへの乏しい結合を示し、および、それ故にVEGFと置き換わるま
たは競合するとは予想されないので、このアッセイにおいて陰性対照として使用した。K
DRへの特異的結合を計算するため、Mockトランスフェクト細胞への125I−標識
VEGFの結合を、KDR−トランスフェクト細胞から差し引いた。それ故、KDR結合
ペプチドによる293H細胞への125I−標識VEGF結合の阻害を計算する場合、K
DR以外の部位への125I−標識VEGFの結合(293H細胞に存在してもよいし、
または存在しなくてもよい)は含まれていない。阻害率は、式[(Y1−Y2)×100
/Y1]、式中、Y1はペプチド不在下でのKDR−トランスフェクト293細胞への特
異的結合であり、およびY2はペプチドまたはDMSO存在下でのKDR−トランスフェ
クト293細胞への特異的結合である、を使用して計算した。KDR−トランスフェクト
293細胞への特異的結合は、KDR−トランスフェクト293細胞への結合からMoc
kトランスフェクト細胞への結合を差し引くことにより計算した。
陰性対照として使用された配列番号263は、125I−標識VEGFと有意には競合し
なかった、30μMで12.69±2.97%および0.3μMで−5.45±9.37
%(図10)。同時に、配列番号294および277は125I−標識VEGFと非常に
よく競合し、各々、30μMで125I−標識VEGF結合を96.29±2.97%お
よび104.4±2.074%、0.3μMで52.27±3.78%および80.96
±3.8%阻害した(図10)。配列番号264の阻害率は、30μMで125I−標識
VEGF結合の47.95±5.09%、および0.3μMで24.41±8.43%で
あった(図10)。従って、3つの強力KDR結合ポリペプチドはVEGFと競合せず、
それらの有効性はそれらの結合親和性とともに増加した。このアッセイは、KDRへ強固
に結合するが、VEGFとは競合しないペプチドを同定するために有用であろうし、それ
はさもなければKDR−標的化分子の結合を阻止するであろう、VEGFの高い局所濃度
がしばしば存在する、腫瘍におけるKDR画像化に有用であることが特色である。
ーの阻害
KDRのVEGF誘導活性化(リン酸化)を阻害する、ファージディスプレイにより同
定されたKDR結合ペプチドの能力を、以下のアッセイを使用して評価した。本発明のペ
プチドの多数が、単量体および/または四量体構築物でKDRの活性化を阻害することが
示された。上に議論したように、KDRの活性化を阻害するペプチドは、抗血管新生剤と
して有用である。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(Biowhittaker カタログ番号CC
−2519)はドライアイスで凍結されて得られ、融解するまで液体窒素中で保存した。
これらの細胞は、製造業者により説明されているように、融解し、継代し、そしてEGM
−MV培地(Biowhittaker カタログ番号CC−3125)中で維持した。
細胞を100mmディッシュに蒔きコンフルエントになるまで放置し、次に血清を欠く基
本EBM培地(Biowhittaker カタログ番号CC−3121)で一夜培養し
た。次の朝、ディッシュ中の培地を、37℃で、添加物を含まない(陰性対照)、5ng
/ml VEGF(Calbiochem カタログ番号676472またはPepro
tech カタログ番号100−20)(陽性対照)、または5ng/ml VEGFに
指定された濃度のKDR結合ペプチド(上に説明したように調製した)を加えたもの、を
含んでいる10mlの新鮮なEBM培地で置き換えた。いくつかの場合、中和抗KDR抗
体(カタログ番号AF357,R&D Systems)を、活性化の陽性対照阻害剤と
して使用した。そのような場合、VEGFおよび抗体の両方を含んでいる新鮮培地の添加
に先立ち、37℃で30分、抗体を試験細胞と前もってインキュベートした。ディッシュ
を、37℃の組織培養インキュベーター中で5分インキュベートした後、カルシウムおよ
びマグネシウムを含んでいる氷冷D−PBSで3回洗浄し、最後の10mlのダルベッコ
リン酸緩衝化塩溶液(D−PBS)を除去することなく、氷の上に置いた。第一のディッ
シュの組を排水し、0.5mlのトリトン溶解緩衝液(20mMトリス塩基 pH8.0
、137mM NACl、10%グリセロール、1%トリトンX−100、2mM ED
TA(エチレンジアミン四酢酸)、1mM PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオ
リド)、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、100mM NaF、50mMピロリン酸
ナトリウム、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン)を加えた。細
胞スクレーパー(Falcon,カタログ番号353087)を使用して細胞を溶解緩衝
液内へ迅速にかきとり、簡単にピペットで吸い上げたり吐き出したりすることにより分散
し、得られた溶解物を対となる第二の排水したディッシュに移した。別の0.5mlの溶
解緩衝液を第一のディッシュを洗い流すために使用して第二のディッシュへ移し、それは
次にまたかきとりおよび分散させた。2つのディッシュからプールした溶解物を1.5m
lのエッペンドルフチューブへ移した。上記の手順を各々の対照および試験試料(KDR
結合ペプチド)に対し同じ時に繰り返した。溶解物は、すべての試料か処理されるまで氷
上に保存した。この時点で、試料を−70℃で保存するか、または中断することなくアッ
セイの最後まで処理した。
セファロースビーズ(Sigma 3391、D−PBSで前膨潤させ、大過剰のD−P
BSで3回洗浄し、そして50%スラリーにするために6mlのD−PBSで再構築され
ている)を加え、4℃で30分揺り動かすことにより、前もってきれいにした。ビーズは
、Picofuge(Stratgene,カタログ番号400550)中、2000×
gで2分遠心分離することによりペレット化し、上清を新しい1.5mlチューブへ移し
た。20μgの抗Flk−1抗体(Santa Cruz Biotechnology
,カタログ番号sc−504)を各々のチューブへ加え、KDRを免疫沈降させるため、
回転板上、4℃で一夜(16〜18時間)チューブをインキュベートした。次の日、40
μlのプロテインA−セファロースビーズをチューブへ加え、それは回転板上、4℃で1
時間インキュベートした。各々のチューブ内のビーズは続いてPicofuge中、2分
遠心分離することにより3回洗浄し、上清を捨て、ビーズを新しく加えた1mlのTBS
T緩衝液(20mMトリス塩基 pH7.5、137mM NACl、および0.1%T
ween20)に分散させた。遠心分離後、最後の洗浄での液体を除去し、40μlのL
aemmli SDS−PAGE試料緩衝液(Bio−Rad,カタログ番号161−0
737)を各々のチューブへ加え、チューブにキャップをかぶせ、5分間煮沸した。冷却
後、各々のチューブ中のビーズは遠心分離することによりペレット化し、免疫沈降したK
DRを含んでいる上清を新しいチューブへ移し、直ちに使用するか、または後での分析の
ため凍結させて−70℃で保存した。
施した。各々の免疫沈降物の半分(20μL)を、7.5%プレキャストReady G
el(Bio−Rad,カタログ番号161−1154)上、Laemmli(Natu
re,227:680−685(1970))の方法に従って、SDS−PAGEにより
分離した。
)を使用し、各々のゲル中の分離されたタンパク質は、Matsudairaの方法(J
.Biol.Chem.,262:10035−10038(1987))に従って、1
40mAで2時間、CAPS緩衝液(10mM CAPS,Sigma カタログ番号C
−6070,1%ACSグレードメタノール,pH11.0)中、Bio−Rad mi
ni Trans−Blot cell(カタログ番号170−3930)中のPVDF
膜(Bio−Rad,カタログ番号162−0174)へエレクトロブロットした。ブロ
ットを、前もって37℃に暖めた5% Blotto−TBS(Pierce カタログ
番号37530)中、室温で2時間ブロックした。ブロットは最初に、0.1%Twee
n20を加えた5%Blotto−TBSで1:200に希釈した、抗ホスホチロシン抗
体(Transduction Labs,カタログ番号P11120)を用い、室温で
2時間探索した。非結合抗体を、0.1%Tween20を含んでいるD−PBS(D−
PBST)で、1洗浄当たり5分で4回、ブロットを洗浄することにより除去した。続い
て、ブロットを、0.1%Tween20を加えた5%Blotto−TBSで1:25
,000に希釈した、HRP−コンジュゲートヒツジ抗マウス抗体(Amersham
Biosciences カタログ番号NA931)を用い、室温で1時間探索し、D−
PBSTで4回洗浄した。最後に、ブロットを2mlの化学発光基質(ECL Plus
,Amersham カタログ番号RPN2132)を上に広げて2分間インキュベート
し、ウェルを水切り排水し、プラスチックシ−トプロテクター(C−Line Prod
ucts,カタログ番号62038)に置き、最適なコントラストを達成するために時間
を変えて、X線フィルム(Kodak BioMax ML,カタログ番号113943
5)へ暴露した。
4に調整したTBST中、37℃で30分インキュベートすることによりブロットを剥が
し、0.1%Tween20を加えた5%Blotto−TBS(Blotto−TBS
T)を用いて室温で1時間ブロックし、1%正常ヤギ血清(Life Tech カタロ
グ番号16210064)を含む5%Blotto−TBSTで1:200に希釈した抗
Flk−1ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotech、カタログ番号
SC−315)を用い、室温で2時間、再探索した。非結合抗体を、D−PBSTで、1
洗浄当たり5分で4回、ブロットを洗浄することにより除去した。続いて、ブロットを、
5%Blotto−TBSTで1:10,000に希釈した、HRP−コンジュゲートロ
バ抗ウサギ二次抗体(Amersham Biosciences カタログ番号NA9
34)を用い、室温で1時間探索し、D−PBSTで4回洗浄した。最後に、ブロットを
2mlの化学発光基質とインキュベートし、上記のようにX線フィルムへ暴露した。
の免疫ブロットは、HUVECがVEGFで刺激された場合に、活性化(リン酸化)KD
Rを検出できたことを示した。抗ホスホチロシン抗体(PY−20)は、非刺激HUVE
Cから、KDRの移動位置に近接するリン酸化タンパク質をブロット上に検出しなかった
が、5分のVEGF刺激後、予想される位置に強いバンドが矛盾なく観察された(図11
、上のパネル)。酸性溶液中でのインキュベーションにより、ブロットから結合抗体を剥
がし、次に抗KDR抗体(sc−315)で再探索した場合、リン酸化バンドの同一性は
、KDRであることで確認された。さらに、非刺激HUVECからの免疫沈降物は、VE
GF−刺激HUVECからの免疫沈降物とほぼ同じの総KDRを含んでいることが確認さ
れた(図11、下のパネル)。
の自己リン酸化を経て既存のKDRから形成され、KDRのような大きなグリコシル化細
胞表面レセプターを合成および加工するには、5分は十分な時間ではないことを示してい
る。
EGFと組み合わせて一連の化合物をHUVECへ加え、上記免疫ブロットアッセイでK
DRリン酸化を測定することにより評価した。陰性および陽性対照として、試験化合物不
在下で、非刺激HUVECおよびVEGF刺激HUVECからの免疫沈降物もまたアッセ
イごとに試験した。中和抗KDR抗体(R&D Systems、カタログ番号AF−3
57)をVEGFと併用した場合、KDRリン酸化の程度は非常に減少し(図12、上の
パネル)、抗体は、KDRへ結合しおよび活性化するVEGFの能力を妨害できることを
示している。VEGF−誘導DNA合成を阻止するこの抗体の能力が、抗体の製造業者に
よる品質管理試験の一部であることから、この結果は予想された。抗KDR抗体でのブロ
ットの再探索は(図12、下のパネル)、VEGFのみで処理したレーンと比較し、VE
GF+抗体−処理レーン(+V+α−KDR)中にはわずかに少ない総KDRが存在する
ことを示しているが、この相違は、抗体−処理レーン中のリン酸化KDRのより少ない発
生量を説明するには十分に大きくない。
DYWIQQYLRYTD,配列番号140)の有効性を評価するため、VEGF存在下
、KDR結合配列Ac−AQAFPRFGGDDYWIQQYLRYTDGGK−NH2
(配列番号306)を含んでいる合成ペプチドでアッセイを繰り返した。配列番号306
はKDRのVEGF−誘導リン酸化を阻害できた。総KDRのためのブロットの再探索は
、VEGF+配列番号306−処理細胞(+V+配列番号306)中には、VEGFのみ
で処理した細胞(+V)中よりも多くの総KDRが存在することを示した(図13、下の
パネル)。それ故、配列番号306存在下でのKDRリン酸化の減少は、試料添加の差に
よるものではなく、むしろ、KDRのVEGF−活性化を阻害する、ポリペプチドの能力
によるものであることは明らかである。
リン酸化の少なくとも50%の阻害を示した:
Ac−AGWIECYHPDGICYHFGTGGGK−NH2(配列番号269)
Ac−AGWLECYAEFGHCYNFGTGGGK−NH2(配列番号267)
Ac−GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK−NH2(配列番号29
4)
Ac−GDWWECK(ivDde)REEYRNTTWCAWADPGGGK−NH
2(ブロックされたKを有する配列番号366)
Ac−GDPDTCTMWGDSGRWYCFPADPGGGK−NH2(配列番号3
01)
Ac−AQEPEGYAYWEVITLYHEEDGDGGK−NH2(配列番号30
5)
Ac−AQAFPRFGGDDYWIQQYLRYTDGGK−NH2(配列番号30
6)
Ac−AQGDYVYWEIIELTGATDHTPPGGK−NH2(配列番号30
7)
配列番号269および294はこのアッセイにおいて最も強力な化合物であり、1μM
でVEGF−誘導KDRリン酸化の少なくとも50%の阻害を生じた。
を生じなかった:
Ac−AGPK(ivDde)WCEEDWYYCMITGTGGGK−NH2(配列
番号264)
Ac−GSDHHCYLHNGQWICYPFAPGGGK−NH2(配列番号314
)
Ac−GDYPWCHELSDSVTRFCVPWDPGGGK−NH2(配列番号2
93)
Ac−GDDHMCRSPDYQDHVFCMYWDPGGGK−NH2(配列番号2
95)
Ac−GDPPLCYFVGTOEWHHCNPFDPGGGK−NH2(配列番号2
96)
Ac−GDGSWCEMRQDVGK(ivDde)WNCFSDDPGGGK−NH
2(配列番号299)
Ac−AQRGDYQEQYWHQQLVEQLK(ivDde)LLGGGK−NH
2(配列番号331)
Ac−GDNWECGWSNMFOK(ivDde)EFCARPDPGGGK−NH
2(配列番号303)
Ac−AGPGPCK(ivDde)GYMPHQCWYMGTGGGK−NH2(配
列番号367)
Ac−AGYGPCAEMSPWLCWYPGTGGGK−NH2(配列番号322)
加えて、配列番号294および277のビオチニル化誘導体の四量体複合体(前に記載
したように調製)は、10μMでVEGF−誘導KDRリン酸化の少なくとも50%の阻
害を生じた。
KDRへ結合するTc−標識配列番号339の能力を、KDR−トランスフェクト29
3H細胞を使用して評価した。Tc−標識配列番号277(即ち、Ac−AGPTWCE
DDWYYCWLFGT−GGGK(N,N−ジメチル−Gly−Ser−Cys−Gl
y−ジ(アミノジオキサオクタ−))−NH2)は、Mockトランスフェクト293H
に対するよりもKDRトランスフェクト細胞へ有意によく結合し、およびTc−標識配列
番号339の濃度とともに直線的様式で結合が増加した。
250mLのSPPS反応容器へ、6.64ミリモルのH−Gly−2−Cl−トリチ
ル樹脂(0.84ミリモル/g、Novabiochem)を加えた。60mLのDMF
で1時間膨潤させた。各々のカップリングサイクルに対し、26.6ミリモルのDIEA
、26.6ミリモルのFmoc−アミノ酸DMF溶液(EM Science)、26.
6ミリモルのHOBT(Novabiochem)のDMF溶液、および26.6ミリモ
ルのDICを樹脂に加えた。反応混合物を4時間振盪した。次に樹脂を濾過し、DMFで
洗浄した(3×80ml)。20%ピペリジンDMF溶液(80mL)を樹脂へ加え、1
0分振盪した。樹脂を濾過し、このピペリジン処理を繰り返した。樹脂を最終的にDMF
で洗浄(3×80ml)すると、次のカップリングサイクルの準備が完了する。最後のカ
ップリングサイクルで、HATU/DIEA活性化を使用してN,N−ジメチルグリシン
(Aldrich)を結合させた。それ故、N,N−ジメチルグリシン(26.6ミリモ
ル)のDMF懸濁液を、26.6ミリモルのHATU(Perseptive Bios
ystems)DMF溶液および53.1ミリモルのDIEAへ加えた。透明な溶液を樹
脂へ加え、16時間振盪した。合成後、樹脂を濾過し、DMF(3×80ml)、CH2
Cl2(3×80ml)で洗浄して乾燥した。樹脂を80mLのAcOH/CF3CH2
OH/DCM(1/1/8、v/v/v)と混合し、45分振盪した。樹脂を濾過し、濾
液を蒸発させてペーストにした。25%MeOH/DCMを使用するシリカゲルクロマト
グラフィーにより粗物質の精製で2.0gの最終生成物を得た。
ジイソプロピルカルボジイミド(0.0055ミリモル)を、精製Me2N−Gly−
Cys−(Trt)−Ser(tBu)−Gly−OHおよびヒドロキシベンゾトリアゾ
ール(0.0055ミリモル)をDMF(0.25L)に溶解した混合物へ加え、混合物
を室温で6時間撹拌した。ペプチド(0.005ミリモル)のDMF(0.25mL)溶
液を次に反応混合物へ加え、さらに6時間撹拌を続けた。真空下でDMFを除去し、樹脂
を試薬Bで処理して3時間撹拌した。減圧下でTFAを除去し、0.1%TFAを含んで
いるアセトニトリル−水を使用する分取HPLCにより残渣を精製した。純粋な生成物を
含んでいる分画を集め、凍結乾燥するとペプチドを得た。ペプチドはES−MSで確認し
、その純度はRP−HPLC(アセトニトリル−水/0.1%TFA、濃度勾配)により
決定した。
グルコン酸第一スズ溶液は、2mlの20μg/ml SnCl2・2H2Oの窒素置
換1N HCl溶液を、13mgのグルコヘプト酸ナトリウムを含む1.0mlの窒素置
換水へ加えることにより調製した。4mlのオートサンプラーバイアルに、50/50エ
タノール/H2Oに溶解した20〜40μl(20〜40μg)の配列番号339リガン
ド、6〜12mCiの99mTcO4 −の食塩水および100μlのグルコヘプト酸第一
スズ溶液を加えた。混合物を100℃に22分加熱した。得られた放射化学的純度(RC
P)は、Vydac C18ペプチドおよびタンパク質カラムを使用し、66%H2O(
0.1%TFA)/34%ACN(0.085%TFA)で1ml/分の流速で溶出して
分析した場合、10〜47%であった。反応混合物は、0.1%TFA含有水溶液を水相
として、および0.085%TFA含有アセトニトリル溶液を有機相として使用し、1m
l/分の流速でのVydac C18カラム(4.6mm×250mm)を用いるHPL
Cにより精製した。以下の濃度勾配を使用した:29.5%有機相で35分、5分以上か
けて85%への勾配をつけ、10分保つ。99mTc配列番号339は、5mg/mlア
スコルビン酸および16mg/mlのヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリンを5
0mMリン酸緩衝液に含んでいる500μlの安定化緩衝液に集めた。アセトニトリルを
除去するため、混合物はスピードバキューム装置を使用して濃縮し、そして200μlの
0.1%HSA含有50mM pH5のクエン酸緩衝液を加えた。得られた生成物は10
0%のRCPを有していた。動物への注射に先立ち、化合物は通常の生理食塩水で所望の
放射濃度に希釈した。
293H細胞は前記のプロトコールを使用してトランスフェクトした。トランスフェク
ションは、黒/透明96ウェルプレート(Becton Dickinson,カタログ
番号354640)で行った。プレートの左半分をMockトランスフェクトし(DNA
なしで)、プレートの右半分をKDR cDNAでトランスフェクトした。細胞は、トラ
ンスフェクション時には80〜90%コンフルエントであり、アッセイする時間である次
の日には完全にコンフルエントであり、さもなければ、アッセイを中止した。
opti−MEMIはInvitrogen(カタログ番号11058−021)から
得られ、およびヒト血清アルブミン(HSA)はSigma(カタログ番号A−3782
)から得られた。0.1%HSAを含むopti−MEMI培地を調製するため、0.1
%w/vHSAをopti−MEMIに加え、室温で20分撹拌し、次に0.2μmフィ
ルターを使用して濾過滅菌した。
Tc−標識配列番号339の保存溶液(117μCi/ml)を0.1%HSA含有o
pti−MEMIで1:100、1:50、1:25および1:10で希釈すると、1.
17、2.34、4.68および11.7μCi/mlの最終濃度を有するTc−標識配
列番号339の溶液が得られた。
細胞は、トランスフェクション24時間後に使用し、アッセイのための細胞を調製する
ため、それらを100μlの室温の0.1%HSA含有opti−MEMIで1回洗浄し
た。洗浄後、0.1%HSA含有opti−MEMIをプレートから除き、70μlの1
.17、2.34、4.68および11.7μCi/mlのTc−標識配列番号339(
上のように調製された)で置き換えた。各々の希釈液は偽およびKDRトランスフェクト
細胞を含む3つの別々のウェルへ加えた。室温で1時間インキュベートした後、プレート
を4℃に15分間冷却し、100μlの冷結合緩衝液(0.1%HSA含有opti−M
EMI)で5回洗浄し、優しく吸い取って乾燥し、細胞損失を顕微鏡下で検査した。10
0μlの可溶化溶液(2%トリトンX−100、10%グリセロール、0.1%BSA)
を各々のウェルへ加え、プレートを37℃で10分インキュベートした。各々のウェル中
の可溶化溶液をピペットで吸い上げたり吐き出したりすることにより混合し、そして1.
2mlチューブへ移した。各々のウェルを100μlの可溶化溶液で1回洗浄し、洗液を
対応する1.2mlチューブへ加えた。各々の1.2mlチューブは、プログラム12(
Tcウィンドウで20秒)を使用するLKBガンマカウンターで計数されるべき15.7
×100cmチューブへ移した。
KDRへ特異的に結合するTc−標識配列番号339の能力を、一過性トランスフェク
ト293H細胞を使用して評価した。
H細胞に比較してKDRトランスフェクト細胞へ著しくよく結合した。KDRへの特異的
結合を計算するため、Tc−標識配列番号339ポリペプチドのKDRトランスフェクト
細胞への結合から、Mockトランスフェクト細胞への結合を差し引いた。Tc−標識配
列番号339の濃度を増加させるにつれて、KDRに対するTc−標識配列番号339の
特異的結合における直線的増加が観察された(図26)。Tc−標識配列番号339の濃
度は〜100pMのみであったので(アッセイにおいて試験された最も高い濃度でさえ、
11.7μCi/ml)、直線的結合は驚くことではなく、それは配列番号277のKD
値である〜3−4nM(アビジンHRPアッセイを使用して計算されたように)のはるか
下であり、そのため結合の飽和は予想されないであろう。
以下の方法を、下記実施例(11〜15)に記載されている個々のペプチドおよび二量
体ペプチド製造のために使用した。
ペプチド合成を、FastMocプロトコールを使用し、0.25ミリモル規模でAB
I−433A合成機(Applied Biosystems Inc.,フォスターシ
ティー,CA)で実施した。このプロトコール前活性化の各々のサイクルは、カートリッ
ジ中の1ミリモルの必要な乾燥Nα−Fmoc側鎖保護アミノ酸を、0.9ミリモルのH
BTU、2ミリモルのDIEA、および0.9ミリモルのHOBtのDMF−NMP溶液
に溶解することにより達成した。ペプチドはNovaSyn TGR(Rinkアミド)
樹脂(樹脂置換0.2ミリモル/g)上で組み立てた。カップリングは21分実施した。
Fmoc脱保護は、20%ピペリジンNMP溶液で実施した。最後のサイクルの終わりに
、N末端Fmoc基を除去し、完全保護樹脂結合ペプチドを無水酢酸/DIEA/HOB
t/NMPを使用してアセチル化した。
樹脂からのペプチドの切断および側鎖の脱保護は、試薬Bを4.5時間使用して達成し
た。切断溶液を集め、そして樹脂を追加の試薬Bで洗浄した。合併した溶液は濃縮して乾
固した。回旋させながら、または撹拌しながらエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。
エーテルをデカントし、固形物を集めた。不純物および残った切断カクテル成分を除去す
るため、この操作を2〜3回繰り返した。
粗エーテル沈殿直鎖状ジ−システイン含有ペプチドは、水、水性アセトニトリル混合液
(0.1%TFA)、水性DMSOまたは100%DMSOに溶解し、アンモニア水、炭
酸アンモニウム水溶液、炭酸水素アンモニウム水溶液またはDIEAの添加による溶液p
HのpH7.5〜8.5への調整により環化した。混合物を空気中で16〜48時間撹拌
し、トリフルオロ酢酸水溶液でpH2の酸性とし、そして次に水へのアセトニトリルの濃
度勾配を用いる分取逆相HPLCにより精製した。所望の物質を含んでいる分画をプール
し、精製ペプチドを凍結乾燥により単離した。
典型的な実験において、400mgのivDde−保護リジンを有する樹脂含有ペプチ
ドを10%ヒドラジンDMF溶液(2×20ml)で処理した。樹脂をDMF(2×20
ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。樹脂をDMF(10ml)に再懸濁し
、Fmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(0.4ミリモル)、HOBt(
0.4ミリモル)、DIC(0.4ミリモル)およびDIEA(0.8ミリモル)で、4
時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をDMF(2×10ml)およびDCM(1×
10ml)で洗浄した。樹脂は次に、20%ピペリジン含有DMF(2×15ml)で各
々、10分間処理した。樹脂を洗浄し、Fmoc−−8−アミノ−3,6−ジオキサオク
タン酸とカップリングさせ、Fmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。
20ml)で4時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと
撹拌すると固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。固形物を無
水DMSOに溶解し、DIEAでpHを7.5に調整した。混合物を16時間撹拌してジ
スルフィド環化を達成し、反応は分析用HPLCでモニターした。環化完了後、反応混合
物を25%アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相C18カラムへ直接応用した。精製
は水へのアセトニトリルの(両方とも0.1%TFAを含んでいる)濃度勾配を使用して
達成した。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結
乾燥すると必要なペプチドを得た。
典型的な実験において、400mgのivDde−保護リジンを有する樹脂含有ペプチ
ドを10%ヒドラジンDMF溶液(2×20ml)で処理した。樹脂をDMF(2×20
ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。樹脂をDMF(10ml)に再懸濁し
、Fmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(0.4ミリモル)、HOBt(
0.4ミリモル)、DIC(0.4ミリモル)およびDIEA(0.8ミリモル)で、4
時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をDMF(2×10ml)およびDCM(1×
10ml)で洗浄した。樹脂は次に、20%ピペリジン含有DMF(2×15ml)で各
々、10分間処理した。樹脂を洗浄し、Fmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタ
ン酸とカップリングさせ、Fmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。
(0.4ミリモル、5当量)およびDIEA(0.4ミリモル、5当量)のDMF溶液中
、2時間処理した。樹脂は、前に記載したように洗浄し、そして乾燥した後、試薬B(2
0ml)で4時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をエーテルと撹
拌すると固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。固形物を無水
DMSOに溶解し、DIEAでpHを7.5に調整した。混合物を4〜6時間撹拌してジ
スルフィド環化を達成し、それはHPLCでモニターした。環化完了後、反応混合物を2
5%アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相C18カラムへ直接応用した。精製は水へ
のアセトニトリルの(両方とも0.1%TFAを含んでいる)濃度勾配を使用して達成し
た。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め、凍結乾燥す
ると必要なビオチニル化ペプチドを得た。
ュゲートペプチドの製造
典型的な実験において、400mgのNε−ivDde−保護リジン部分を有する樹脂
含有ペプチドを10%ヒドラジンDMF溶液(2×20ml)で処理した。樹脂をDMF
(2×20ml)およびDCM(1×20ml)で洗浄した。樹脂をDMF(10ml)
に再懸濁し、Fmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(0.4ミリモル)、
HOBt(0.4ミリモル)、DIC(0.4ミリモル)およびDIEA(0.8ミリモ
ル)で、4時間混合しながら処理した。反応後、樹脂をDMF(2×10ml)およびD
CM(1×10ml)で洗浄した。樹脂は次に、20%ピペリジン含有DMF(2×15
ml)で各々、10分間処理した。樹脂を洗浄し、Fmoc−−8−アミノ−3,6−ジ
オキサオクタン酸とカップリングさせ、Fmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。遊
離アミノ基を含んでいる、得られた樹脂結合ペプチドをDMF(10mL)に再懸濁し、
1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−テトラ酢酸 1,4
,7−トリス−t−ブチルエステル(DOTA−トリス−t−ブチルエステル、0.4ミ
リモル、5当量)、HOBt(0.4ミリモル)、DIC(0.4ミリモル)およびDI
EA(0.8ミリモル)のDMF(10mL)溶液で、混合しながら4時間処理した。反
応が完了したら、樹脂をDMF(2×10ml)およびDCM(1×10ml)で洗浄し
、試薬B(20ml)で4時間処理した。混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣を
エーテルと撹拌すると固形物を生じ、それを集め、エーテルで洗浄し、そして乾燥した。
固形物を無水DMSOに溶解し、DIEAでpHを7.5に調整した。混合物を16時間
撹拌してジスルフィド環化を達成し、それはHPLCでモニターした。環化完了後、反応
混合物を25%アセトニトリル含有水溶液で希釈し、逆相C−18カラムへ直接応用した
。精製は水へのアセトニトリルの(両方とも0.1%TFAを含んでいる)濃度勾配を使
用して達成した。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を集め
、凍結乾燥すると必要なビオチニル化ペプチドを得た。
「PnAO6」とは、3−(2−アミノ−3−(2−ヒドロキシイミノ−1,1−ジメチ
ル−プロピルアミノ)−プロピルアミノ)−3−メチル−ブタン−2−オン オキシムを
表している。
上記実施例8で述べた精製ペプチド単量体を種々のホモ二量体およびへテロ構築物の製
造に使用した。
ホモ二量体化合物を製造するため、二量体の製造に必要とされるペプチドの半分をDM
Fに溶解し、10当量のグルタール酸ビスN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで処
理した。反応の進行はHPLC分析および質量分析法によりモニターした。反応完了時、
揮発分を真空下で除去し、未反応のビス−NHSエステルを除去するため、残渣を酢酸エ
チルで洗浄した。残渣を乾燥し、無水DMFに再溶解して、2当量のDIEA存在下、ペ
プチドの残りの半分で処理した。反応を24時間進行させた。この混合物は直接YMC逆
相HPLCカラムへ応用し、水からアセトリトリル(両方とも0.1%TFAを含んでい
る)への直線濃度勾配での溶出により精製した。
ヘテロ二量体の場合、単量体の一つ(「A」)をグルタール酸のビスNHSエステル(
ホモ二量体化合物で説明したような)と反応させ、過剰のビスNHSエステルを洗い流し
た後、DIEA存在下、第二の単量体(「B」)を加えた。反応後、混合物は分取HPL
Cにより精製した。典型的には、グルタール酸ビスN−ヒドロキシスクシンイミジルエス
テル(0.02ミリモル、10当量)のDMF(0.5mL)溶液に、ペプチド「A」お
よびDIEA(2当量)のDMF(0.5mL)溶液を加え、混合物を2時間撹拌した。
反応の進行はHPLC分析および質量分析法によりモニターした。反応完了時、揮発分を
真空下で除去し、未反応のビス−NHSエステルを除去するため、残渣を酢酸エチル(3
×1.0mL)で洗浄した。残渣を乾燥し、無水DMF(0.5mL)に再溶解し、ペプ
チド「B」およびDIEA(2当量)のDMF(0.5mL)溶液で24時間処理した。
この混合物を水で希釈し(1:1、v/v)、直接YMC逆相HPLCカラムへ応用し、
水からアセトリトリル(両方とも0.1%TFAを含んでいる)への直線濃度勾配での溶
出により精製した。分画を分析用HPLCで分析し、純粋な生成物を含んでいる分画を合
わせ、凍結乾燥すると必要な二量体を得た。図36〜63に示されている二量体がこの方
法で製造された(構造、名前、化合物参照番号は「図の簡単な説明」に記載されている)
。
ラジンを反応混合物に加え(リジンNε−アミノ基を露出するため)、溶液を2分撹拌し
た。反応混合物を水(1mL)で希釈し、TFAでpHを2に調整した。次にこれを上記
の方法により精製した。
えられている。
システムA:カラム:YMC C−4(4.6×250mm);溶出液:A:水(0.
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、25%B、直線濃度勾
配25〜60%B 10分で;流速:2.0ml/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、25%B、直線濃度勾
配25〜60%B 20分で;流速:2.0ml/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、30%B、直線濃度勾
配30〜60%B 10分で;流速:2.0mL/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、20%B、直線濃度勾
配20〜60%B 10分で;流速:2.0mL/分;検出:UV@220nm。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、10%B、直
線濃度勾配10〜60%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、30%B、直
線濃度勾配30〜70%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、30%B、直
線濃度勾配30〜75%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、20%B、直
線濃度勾配20〜52%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、10%B、直
線濃度勾配10〜65%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、20%B、直
線濃度勾配20〜60%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、5%B、直線
濃度勾配5〜60%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、5%B、直線
濃度勾配5〜65%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、15%B、直
線濃度勾配15〜50%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
水(0.1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、20%B、直
線濃度勾配20〜80%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm
。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、30%B、直線濃度勾
配30〜60%B 10分で;流速:2.0mL/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、20%B、直線濃度勾
配20〜80%B 20分で;流速:2.0mL/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、20%B、直線濃度勾
配20〜60%B 6分で;流速:2.0mL/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、25%B、直線濃度勾
配25〜60%B 10分で;流速:2.0mL/分;検出:UV@220nm。
1%TFA)、B:ACN(0.1%TFA);溶出:初期条件、10%B、直線濃度勾
配10〜60%B 10分で;流速:3.0mL/分;検出:UV@220nm。
−VEGFとの競合
以下の実験で、トランスフェクトされた293H細胞により発現されるKDRへの結合
に対する、125I−標識VEGFと競合するKDR結合ペプチドの能力を評価した。
293H細胞を、標準技術によりKDR cDNAでトランスフェクトするか、または
Mockトランスフェクトした。細胞は、競合化合物存在下(10μM、0.3μMおよ
び0.03μM)または不在下で、125I−VEGFとインキュベートした。細胞を洗
浄後、結合された放射活性をガンマカウンターで定量した。VEGF結合の阻害率は、式
[(Y1−Y2)×100/Y1]、式中、Y1はペプチド不在下でのKDR−トランス
フェクト293細胞への特異的結合であり、およびY2はペプチド競合剤存在下でのKD
R−トランスフェクト293細胞への特異的結合である、を使用して計算した。KDR−
トランスフェクト293細胞への特異的結合は、KDR−トランスフェクト293細胞へ
の結合からMockトランスフェクト細胞への結合を差し引くことにより計算した。
図15に示したように、アッセイしたすべてのKDR結合ペプチドが、KDR−トラン
スフェクト細胞に対する結合において、125I−VEGFと競合した。ヘテロ二量体(
D1)が、2つのホモ二量体を超えて、125I−VEGFとの競合で明らかに最も有効
であり、D1の優れた結合性が確認された。
KDRのVEGF誘導活性化(リン酸化)を阻害するKDR結合ペプチドの能力を、以
下のアッセイを使用して評価した。
ほとんどコンフルエントなHUVECのディッシュを、血清または増殖因子を欠いた基
本培地に一夜おいた。下記群(c)のディッシュは、KDR結合ペプチドを含む基本培地
中で15分前処理し、次に、群(a)、(b)および(c)のディッシュの細胞を:
(a)添加物なし(陰性対照)、
(b)5ng/mL VEGF(陽性対照)、または
(c)5ng/mL VEGFに推定競合/阻害ペプチド
含んでいる新鮮な基本培地においた。5分の処理後、各々のディッシュの組から溶解物を
調製した。溶解物から免疫沈降されたKDRは、抗ホスホチロシン抗体でリン酸化を、お
よび抗KDR抗体で総KDRを(試料添加を調節するため)、免疫ブロッティングにより
連続的に分析した。
図16に示したように、D1は10nMで、HUVECにおけるKDRのVEGF−誘
導リン酸化を完全に阻止できた。1nMでは、リン酸化の半分以上がこの化合物により阻
害された。D1に含まれている2つの個々の結合部分から作製されている、ホモ二量体D
2およびD3は、100nMまでではリン酸化に何の影響も与えず、レセプター−リガン
ド相互作用の阻止におけるヘテロ二量体構築物の利点を示している。複数の実験において
、このアッセイにおけるD1のIC50は、0.5から1nMの間で変化した。非関連結
合配列を含んでいる、異なったヘテロ二量体、配列番号305および配列番号306のポ
リペプチドから成っている尾部−尾部ヘテロ二量体(図64)は、その高い親和性(SP
RによりKDRに対して11nM)にもかかわらず、100nMでもリン酸化に効果がな
く、KDRへの結合に対してVEGFと競合するための多量体を構築する場合には、KD
R結合部分の選択が重要であることを示唆している。当業者は、本明細書に提供された結
合ポリペプチドおよびルーチンのスクリーニングアッセイを使用して、適したヘテロ多量
体を構築することができるであろう。
より)、活性化アッセイにおけるD1のIC50は大きくても100分の1以下である。
理論に縛られるのを望むわけではないが、このことは、1つの結合分子でKDR上の2つ
の独特なエピトープを標的化することは、KDR上の1つのエピトープへのみ結合する、
類似の親和性を有する分子よりも大きな立体障害を発生できることを示唆しており、それ
故、VEGF誘導KDR活性を阻害する能力を改良する。同様に、レセプター活性化アッ
セイにおいて単量体遊離ペプチド(配列番号277および配列番号337)として試験さ
れた場合、D1内の2つのKDR結合部分は、各々0.1および1マイクロモルのIC5
0を有していたことを指摘するべきである。単量体遊離ペプチドのIC50は本アッセイ
においてD1に対するIC50よりも100から1000倍高く、および単量体ペプチド
のフルオレセイン化誘導体に対するKDよりも14から30倍高かった。従って、弱いV
EGF−阻止活性を有する2つのペプチドを含んでいる二量体を作製することにより、D
1の増加した結合親和性をはるかに超えた、非常に強力なVEGF−阻止活性を有する分
子が生じた。
以下の実験は、培養におけるHUVECのVEGF誘導遊走を阻止するD1の能力を評
価した。
血清−飢餓HUVECを、ウェル当たり100,000細胞で、BD マトリゲル−被
覆 FluoroBlok 24ウェル挿入プレート(カタログ番号354141)の上
部チャンバー内に置いた。VEGF−阻止/阻害の可能性を有する化合物の存在下または
不在下、VEGF(10ng/mL)または血清(5%FBS)のような異なった誘因物
質を含む、または何も含まない基本培地をウェルの下部チャンバーへ加えた。22時間後
、蛍光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤/遊走細胞の蛍光を蛍光プレートリ
ーダーで測定することにより細胞遊走/浸潤の定量を達成した。VEGF−誘導遊走は、
ウェルの下部チャンバーに基本培地のみを置いた場合に起こった遊走を差し引くことによ
り計算した。
VEGFは、本アッセイにおいて内皮細胞遊走を大きく増加させ、それはD1により強
く阻止された。5nM D1で、VEGF−刺激内皮細胞遊走は84%阻止された(図1
7参照)。25nM D1では、この遊走はほとんど完全に阻止された。別の実験で、既
知のKDR阻害剤、SU−1498(Strawn,L.ら、1996,Cancer
Res.,56:3540−3545)を本アッセイで試験した。3ミリモルのSU−1
498は、D1のようにはVEGF−誘導遊走を阻止しなかった(3ミリモルで47%阻
止された)。D6(構造は下記実施例18に示されている)ではまた、50nMで、VE
GFにより刺激された遊走の本質的に完全な阻害を生じた。血清は、VEGFの代わりに
使用した場合、本アッセイで非常に強力な誘因物質であったが、その効果は有意にD1に
より減らされず、D1はVEGFにより誘導された内皮細胞遊走を特異的に阻害すること
を示している。
以下の実験は、Tc、InおよびI−標識化合物を製造するために使用した方法を説明
している。
nAO6−NH−(O=)C(CH2)3C(=O)−JJ)−NH2;配列番号378
)の製造
SnCl2・2H2O(20mg)を1mLのHClに溶解し、この溶液の10μLを
、10mgのCaNa2DTPA・2.5H2O(Fluka)を1mLの水に溶解する
ことにより調製したDTPA溶液1mLへ加えた。スズDTPA溶液のpHを、1N N
aOHを使用してpH6〜8に調整した。配列番号378(50μgを50μLのDMF
に溶解)を20μLの99mTcO4 −(2.4から4mCi,Syncor)、続いて
、100μLのSn−DTPA溶液と混合した。室温で30分後、放射化学純度(RCP
)は93%であった。生成物は、1g/L酢酸アンモニウム含有水(A)およびアセトニ
トリル(B)の水性/有機濃度勾配を使用し、0.5mL/分の流速で溶出した、Sup
elco Discovery C16アミドカラム(4×250mm,5μm孔径)で
精製した。以下の濃度勾配を使用した:30.5%Bから35%B、30分で、傾斜をつ
けて10分で70%Bへ。21.2分の保持時間で溶出された化合物を、1%アスコルビ
ン酸および0.1%HSAを含んでいる50mMクエン酸緩衝液(pH5.2)500μ
Lに集め、Speed Vacuum(Savant)を使用してアセトニトリルを除去
した。精製後、化合物は>98%のRCPを有していた。
NH2(配列番号338)の製造
配列番号338(50μgを50μLの10%DMFに溶解)を111InCl3(5
0μL、400μCi、Mallinckrodt)および100μLの0.2M酢酸ア
ンモニウムまたはpH5.3のクエン酸緩衝液と混合した。85℃で45分加熱した後、
HPLCを使用して決定した放射化学純度(RCP)は44%から52.2%の範囲であ
った。以下の条件下:水相、1g/L酢酸アンモニウム(pH6.8);有機相、アセト
ニトリル、濃度勾配:30分で23%有機から25%有機、2分で30%有機に上昇させ
、10分保持、Vydac C18カラム(4.6×25cm、5ミクロン孔径)を使用
して非標識リガンドから111In−標識化合物を分離した。20.8分の保持時間で溶
出された化合物を、1%アスコルビン酸および0.1%HSAを含んでいる50mMクエ
ン酸緩衝液(pH5.2)200μLに集め、Speed Vacuum(Savant
)を使用してアセトニトリルを除去した。精製後、化合物は>93%のRCPを有してい
た。
ヒスチジン緩衝液は、0.1Mヒスチジン(Sigma)溶液を濃水酸化アンモニウム
でpH6.25に調整することにより準備した。酢酸アンモニウム緩衝液は、0.2M酢
酸アンモニウム(99.99%,Aldrich)溶液に濃HCl(J.T.Baker
,Ultra Pure)を加えてpH5.5に調整することにより準備した。高純度1
11InCl3(100μL、1.2mCi、Mallinckrodt、ヘーゼルウッ
ド、MO)をD4(200μgを200μLの50%DMF、10%DMSO、20%ア
セトニトリルおよび20%水に溶解)、続いて300μLのヒスチジン緩衝液を加えた。
最終pHは5.5であった。85℃で45分の反応混合物のインキュベーション後、RC
Pは20%であった。
Ci,Mallinckrodt)として提供された111InCl3を162μLの0
.2M酢酸アンモニウム緩衝液に溶解したD4(135μg)へ加えた。最終pHは5.
5であった。85℃で45分の反応混合物のインキュベーション後、RCPは20%であ
った。
前もってジイソプロピルアミンを使用してpH8.5〜9.0へ調整されているDMF
溶液30μLへ溶解させたD5(200μg)を、蒸発乾固させた1mCiの一ヨウ化1
25I Bolton−Hunter試薬(NEX−120,Perkin−Elmer
)へ加えた。バイアルを振盪し、次に時々振盪しながら、氷上で30分インキュベートし
た。この時間後、RCPは23%であった。125I−D5は、下記の条件下でVyda
c C18カラム(4.6×25cm、5ミクロン孔径)を使用し、1mL/分の流速で
のHPLCにより精製した。水相:0.1%TFA含有水;有機相:0.085%TFA
含有アセトニトリル。濃度勾配:30分で30%有機から36%有機へ、5分で60%有
機まで上昇、5分間保持。化合物を、1%アスコルビン酸および0.1%HSAを含んで
いる50mMクエン酸緩衝液(pH5.2)200μLに集めた。アセトニトリルはSp
eed Vacuum(Savant)を使用して除去した。得られた化合物は>97%
のRCPを有していた(図65)。
KDR−トランスフェクト293H細胞へ結合する125I−標識D5の能力を試験す
る実験を実施した。この実験においては、異なった量の125I−標識D5(1〜4μC
l/ml、125I Bolton−Hunter試薬で標識し、HPLCで精製)を、
偽およびKDR−トランスフェクト293H細胞と、96ウェルプレート中、室温で1時
間インキュベートした。KDR−トランスフェクト細胞への結合に対する血清効果を評価
するため、結合は40%マウス血清と、または無しで実施した。非結合化合物を洗い流し
た後、各々のウェル中の細胞を0.5N NaOHで溶解し、溶解物をガンマカウンター
で計数した。
−トランスフェクト細胞へ特異的に結合でき、その結合は40%マウス血清存在下でも影
響されない。KDR−トランスフェクト細胞への幾分より強い結合が、40%マウス血清
存在下での結合に比較して、血清不在下で観察された。しかしながら、Mockトランス
フェクト細胞への125I−標識D5の結合も、アッセイ間に血清を削除した場合に同じ
程度増加しており、血清不在下での結合の増加は非特異的であることを示している(図1
8)。KDR−トランスフェクト細胞への特異的結合(Mockトランスフェクト細胞へ
の結合を差し引いた後)は、マウス血清の有無に関係なくほとんど同一に見える(図19
に示したように)。この実験において、総CPMの10〜14%がKDR−トランスフェ
クト細胞へ特異的に結合された(データは示されていない)。
配列番号277および配列番号294から構成されたヘテロ二量体(図66)は、グル
タル酸ビスN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用して、実施例12に記載した
ように製造した。以下のように、このヘテロ二量体について、Biacoreを使用して
KDR−Fcへの結合を試験し、および親和定数を決定した。
プのデキストラン表面に架橋した(0.5mg/mL溶液を、50mM酢酸塩、pH6.
0、で1:100または1:50に希釈)。対照減算として働かせるため、フローセル1
を活性化し、次にブロックした。達成された最終固定化レベル:
RLFc2KDR−Fc=1607
RLFc3KDR−Fc=3001
RLFc4KDR−Fc=6319。
5%P−20(v/v))中で実施した。D6はPBSで250nMに希釈し、125、
62.5、31.3、15.6、7.8および3.9nM溶液を生じるように一連の希釈
を行った。すべての試料を2重に注射した。会合のため、ペプチドを、kinjectプ
ログラムを使用して、20μL/分で12.5分注射した。10分の解離に続いて、残存
するペプチドを、75μL/分で12秒の50mM NaOH+1M NaClの急速注
射により、KDR表面から剥がした。センサーグラムは、BIAevaluationソ
フトウェア3.1およびSigmaPlot6.0の双曲線二重矩形回帰方程式を使用し
て分析した。ヘテロ二量体定常状態結合親和性(KDAV)を、3つすべてのKDR固定
化密度で決定した(表14)。
〜0.6nM)でKDRを結合する。
このペプチドヘテロ二量体のインビボクリアランスを評価するため、少量の物質を、標
準プロトコール(Pierce)に従って、ヨードゲン(iodogen)およびNa1
25Iを使用してヨード化した。ヨードゲン試薬で被覆した一つのチューブを、1mLの
25mMトリス、0.4M NaCl、pH7.5で前もって湿らせた。この液を廃棄し
、100μLの同一の緩衝液を加えた。ハミルトンシリンジを使用し、11μLの125
I−NaIを反応チューブへ移した。143.555mCi/mlであるNa125I濃
度の原見積もりに基づくと、11μLは約1.5mCiを含んでいなければならない。添
加後、試料を回旋させ、6分インキュベートするためにリードピッグにセットし、30秒
ごとに回旋させた。6分後、全試料を、エッペンドルフチューブに加えてあるタンパク質
へ移した。試料を回旋させ、8分インキュベートするためにセットし、30秒ごとに回旋
させた。8分後、チロシン(10mg/mL、飽和溶液)で反応をクエンチ(停止)させ
、5分間そのままにし、次に2μLを標準物質のために取り除いた。
ロシンから標識ペプチドを分離した。カラムは、非特異的部位をブロックするため、最初
に10mLの食塩水、次に2.5%HSAを含む5mLの25mMトリス、0.4M N
aCl、pH7.5、で洗浄した。HSA緩衝液での洗浄後、カラムを60mLの25m
Mトリス、0.4M NaCl緩衝液で溶出し、そしてカラムを一夜4℃で保存した。標
識試料は、線量標準物質により決定したところ、1.355mCiを含んでいた。標準物
質として取り除かれた2μLの試料は、8.8μCiを含んでいた。ペプチド試料をD−
塩1800カラムへ応用し、トリス/NaCl緩衝液、pH7.5、で溶出した。分画番
号1〜14の各々には0.5mL、そして分画25〜43には1.0mLになるように流
量を調節した。図20は活性に対する分画番号の溶出プロフィールを示している。分画9
、10および11での活性のピークは、ペプチドであると推定された。24から〜40の
放射活性は、標識されたチロシンであるようである。この精製から、分画番号9〜12を
一緒にプールし、続いてのクリアランス研究に使用した(プール中の125I−D6濃度
は7.023μg/mlであり、100μL=0.702μgで8.6μCiを有する)
。
以下の時点で殺した:0、7、15、30、90分。注射後、2μCi以上がシリンジ中
に残っていることが観察され、従って、注射された実際の活性は約6μCiであった。6
μCiの注射で、投与された対応するタンパク質は動物当たり〜0.5μgであった。殺
したら、各々の動物からの血漿試料50μL中の計数値を決定した。各々の時点での、3
匹の動物の各々の組について、計数値を平均し、%注射された線量/ml血漿(ID%/
mL)へ変換し、次に、クリアランス速度を評価するためにプロットした(図20)。こ
のデータは、この分子の二相性半減期を決定するため、4かまたは5パラメーター方程式
にフィットさせた。4パラメーターフィットは、2.55分のT1/2αおよび64.6
6分のT1/2βの結果を生じた。5パラメーターフィットは、2.13分のT1/2α
および23.26分のT1/2βの結果を生じた。
試料は、ペプチドと血清タンパク質との会合を評価するため、放射活性検出器と組み合わ
せたSuperdexペプチドカラム(Pharmacia)へ注入した(図21)。示
されているように、標識ペプチドは実際により高分子量のタンパク質と会合しており、ペ
プチドの二相性半減期クリアランス挙動を説明できる。
使用する内皮細胞増殖アッセイおよびBrdU検出で試験した。簡単には、新しく単離さ
れたHUVEC(p3〜6の間)をRPMI+10%FCS+1%抗生物質+1%L−グ
ルタミン+0.4%BBE(ウシ脳抽出物)で培養し、ウェル当たり、5000〜100
00/ウェルで100μL蒔いた。細胞は、使用に先立って24時間回復させた。これら
の細胞をPBSで2回洗浄し、RPMI+0.1%BSA+1%L−グルタミンに溶解し
た抗VEGF抗体(陽性対照)またはペプチドA、BおよびC(0.1および10μg/
ml)で、48時間処理した。以下の6つの変化させた条件下、2シリーズ(n=4)で
試験した:
シリーズI: w/oVEGF
シリーズII: w/VEGF(30ng/mL)
1. 標準培地:RPMI+10%FCS+1%抗生物質+1%L−グルタミン+0
.4%BBE
2. 陰性対照1:RPMI(真の飢餓)
3. 陰性対照2:RPMI+0.1%BSA+1%L−グルタミン
4. 陽性対照:抗VEGF10μg/ml含有RPMI+0.1%BSA+1%L
−グルタミン
5. 0.1μg/mlKDRペプチド含有RPMI+0.1%BSA+1%L−グ
ルタミン
6. 10μg/mlKDRペプチド含有RPMI+0.1%BSA+1%L−グル
タミン。
1) 種々の条件下で48時間細胞をインキュベート
2) 24時間目に10μLのBrdU希釈液(EBMで1:100に)を加える
3) さらに24時間インキュベート
4) 培養培地を吸引
5) 各々のウェルに100μLのFixDenat(Roche Applied S
cience,インディアナポリス,IN)を加え、室温で30分インキュベート
6) FixDenat溶液を廃棄
7) 各々のウェルに100μLの抗体溶液(PBS 1%BSAおよび抗BrdU P
O)を加え
8) 室温で90分インキュベート
9) PBSで3回洗浄、200μL/ウェル、5分
10) 基質溶液(TMB)を加え、10〜30分インキュベート
11) すべてを可動性プレートへ移す
12) 2M H2SO4を加えることにより反応を停止、25μL/ウェル
13) 反応を停止して5分以内に450nmでの吸光度を読み取る。
バックグラウンド結合は、対照細胞(完全培地で培養;EBM+BulletKit(C
lonetics,BioWhittaker,Inc.,MD)を含む4つのウェルで
抗BrdUを削除することにより、およびBrdUへ暴露されなかった細胞の完全標識化
により、決定した。
番号277)の内、D6は抗VEGF抗体(陽性対照)と同様に、VEGF存在下、10
μg/mlでHUVEC増殖を完全に阻害した。一方、配列番号277(ヘテロ二量体を
作り上げているペプチドの1つ)は、試験された最も高い濃度(10μg/ml)におい
ても、このアッセイにおいて増殖を阻害しなかった。結果として、ヘテロ二量体は、配列
番号277単独と比較して、VEGFと競合する、増強された能力を示している。
Biacoreを使用し、ペプチド二量体D1(配列番号277および配列番号294
のヘテロ二量体)およびD7(配列番号264および配列番号294のヘテロ二量体;図
67参照)のマウスKDR−Fcに対する結合定数を決定した。
3つの密度の組換えマウスKDR−Fcを、標準アミンカップリング法により、CM5
センサーチップのデキストラン表面に架橋した(0.5mg/mL溶液を、50mM酢酸
塩、pH6.0、で1:100または1:50に希釈)。対照減算として働かせるため、
フローセル1を活性化し、次にブロックした。達成された最終固定化レベル:
RLFc2KDR−Fc=2770
RLFc3KDR−Fc=5085
RLFc4KDR−Fc=9265。
5%P−20(v/v))中で実施した。対照として行った配列番号277はPBSで1
25nMに希釈し、62.5、31.3、15.6、7.8および3.9nM溶液を生じ
るように一連の希釈を行った。D1およびD6はPBSで50nMに希釈し、25、12
.5、6.25、3.13、1.56、0.78および0.39nM溶液を生じるように
一連の希釈を行った。すべての試料を2重に注射した。会合のため、ペプチドを、kin
jectプログラムを使用して、30μL/分で3分注射した。10分の解離に続いて、
残存するペプチドを、75μL/分で12秒の50mM NaOH+1M NaClの急
速注射により、KDR表面から剥がした。
フィッティングプログラムを使用して分析した。結果は表15および図23〜25に示さ
れている。センサーチップ上のレセプター密度が半分に減少していた場合においてさえも
、両方のヘテロ二量体でほとんど同じKD2定数が達成されたという事実は、レセプター
との架橋型結合よりもむしろ、個々のレセプターへのヘテロ二量体の多量体型結合と一致
している。
インビボ異種移植片腫瘍モデルを使用して、SW−480ヒト結腸癌に対して抗血管新
生活性を有していると疑われた試験物(Test Article)(結合ペプチド、D
6)の3つの濃度の有効性を決定するための方法を提供する条件が説明されている。
Points to Consider in the Characterizati
on of Cell Lines used to Produce Biologi
cals(Points to Consider in the Character
ization of Cell Lines used to Produce Bi
ologicals,FDA 1993)、で必要とされている。
ペプチドは、高い親和性でヒトVEGFレセプター2(KDR)へ結合し、VEGF結合
と競合する。
結腸癌、SW−480細胞(ATCC)は、4mM L−グルタミン、0.1mM非必
須アミノ酸、50mg/mLゲンタマイシン、250mg/mLフンギゾンおよび10%
熱不活性化ウシ胎児血清を補給した、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中、95
%空気および5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。
食塩水(PBS)で2回洗浄した。注射のために、細胞をハンクス平衡塩類溶液(HBS
S)に懸濁した。
、適合性を確認するため細胞培養試験を行った;7.3〜7.7のpHおよび271〜2
87mOsm/kgの浸透圧モル濃度を有している。PBSは試験物を再構成するための
、および媒体調節注射のための媒体であった。
,Inc.;ロサンジェルス,CA)は、製造業者の仕様書に従って製造した。シスプラ
チンは、BL2 BioChem保護フードを使用して無菌様式で製造した。
A. 種/株:ハツカネズミ、Crl:NU/NU−nuBRマウス(ヌードマウス)
B. 性:メス
C. 齢:処理の開始で6〜8週
D. 体重範囲:体重要求性なし
E. 供給源:動物はCharles River LaboratoriesのGno
ttobiotic部門、ウィルミントン,MA、から受け取った
F. 数:総計で115匹の動物を受け取り、そしてこの研究のために注射し、研究では
90匹のマウスが使用された。
G. 同定の方法:
マウスは耳タグシステムを使用してただ一つのみの番号付けを行った。さらに、ケージ
はケージカードを記して、群番号、動物番号、研究番号およびIACUCプロトコール番
号を最小限に同定した。
H. 無作為化:
マイクロソフトExcel97 SR−1プログラムを使用して、動物を処理群に無作
為に帰属させた。
I. 動物の人道的世話:
動物の処理および世話は、USDA Animal Welfare Act(9CF
R,1,2および3巻)およびGuide for the Care and Use
of Laboratory Animals、を遵守している、Charles R
iver Laboratoriesの標準作業法に従った。
Institutional Animal Care and Use Commit
tee(IACUCプロトコール番号:P07182001I)で保証されている。
A. 食餌および飲料水:
マウスにはガンマ線照射齧歯動物用固形飼料をアドリブで給餌した。水道水を滅菌し、
ボトルおよびシッパーチューブ経由で、アドリブで供給した。
B. 動物環境:
動物は、群分けし、半剛体隔離装置に収容した。マウスは5から10匹の動物を含んで
いる平底ケージに収容した。ケージはガンマ線照射した接触床敷きを含んでいた。各々の
ケージ中のマウス数は、マウスの挙動により変化させてもよく、変更は隔離調査記録に記
録した。ハウジングはGuide for the Care and Use of
Laboratory Animals,National Academy Pres
s,ワシントン,D.C.,1996、およびすべての続いての改訂に示されている勧告
に従っている。
るように調節した。12:12時間の明:暗サイクルを維持した。
C. 順化:
動物を受け取ったら、研究開始に先だって24時間、実験室環境に順化させた。疾患の
徴候、異常な食物および/または水の消費、またはその他の不十分な条件の一般的徴候に
ついてマウスを観察した。動物受け取りの時点で、動物を臨床的に観察し、健康であると
思われた。
A. 一般的説明:
6〜8週齢のメス無胸腺ヌードマウス(Crl:NU/NU−nuBR)をこの研究で
使用した。総計で115匹のマウスに、5×106 SW−480ヒト結腸癌細胞を皮下
で、右胸側面へ注射した。腫瘍が、約150±75mgの標的ウインドサイズに達した時
、90匹の腫瘍−所有マウスを無作為に選択し、9つの群の1つへ分配した。試験物およ
び媒体は腹腔内(IP)に投与し、シスプラチンは静脈内(IV)へ投与した。手に持っ
たカリパスを使用する腫瘍測定を、週に2回記録した。マウスは毒性および病的状態の徴
候について毎日モニターした。研究終了時、動物を過剰量の二酸化炭素で安楽死させ、組
織収集のために剖検した。
B. 群帰属:
総計で9群をこの研究で使用した。各々の群は10匹の腫瘍−所有マウスを含んでいた
。群1および2は各々、非処置および媒体処置の陰性対照マウスを含んでいた。群3、4
および5は、D6抗血管新生ペプチドの3つの異なった濃度の1つを受けたマウスを含ん
でいた。群9は、陽性対照として、標準化学療法化合物であるシスプラチンを受けたマウ
スを含んでいた。
C. 投与量レベルおよび投与計画:
各々の群に対する投与量レベルが表16に提供されている。投与は、動物を無作為に群
に選別した日と同じ日に始めた(研究日7)。各々の動物のため、各々の投与量を、無菌
技術を使用して投与量バイアルから取り、注射部位を、投与量の投与に先だってアルコー
ル綿棒で拭いた。投与量は、各々のマウスのための1mL注射器および27ゲージ×1/
2”ニードルで投与した。
。シスプラチンは1仕事日おきに、総計で5回、静脈内経路で投与した。
各々の動物の臨床観察は、毒性、病的状態および死亡率について、少なくとも1日1度
実施し、記録した。病的状態には、痩せ、脱水、嗜眠、背を曲げた姿勢、ぼさぼさの外観
、呼吸困難、および尿または糞着色のごとき病気の徴候を含むが、これらに限定されるわ
けではない。
E. 腫瘍測定:
プロトコールに従い、較正されたカリパスで腫瘍の長さおよび幅を測定することにより
、研究を通して週に2回腫瘍測定を行った。測定は最低限3〜4日離して行ったが、ただ
し、動物を安楽死させた場合は測定を行った;このことで、時には3日未満の間隔を生じ
ることがあった。腫瘍重量は、以下の式:mg=(L×W2)/2、を使用して計算した
。平均腫瘍重量が、2回連続の測定で群当たり≧1000mgであるか、または腫瘍が潰
瘍化し、歩き回るまたは食物および水を摂取する動物の能力を害するような場合、動物を
安楽死させた。
F. 臨時の安楽死および予定外の死:
1. 臨時の安楽死:
研究の間、臨時の安楽死を必要とする動物はいなかった。
2. 予定外の死:
研究の間、動物は死亡しなかった。
G. 剖検:
1. 安楽死および剖検注文:
群1、2、3、4および5のすべてのマウス(総計50)は、群内で、2回連続して腫
瘍が≧1000mg以上の群平均標的サイズに達した場合に剖検を寄託した。動物は剖検
のためCharles River Laboratories Health Mon
itoring Laboratory(HM),ウィルミントン,MA、へ寄託した。
試験物処置群で平均腫瘍サイズが≧1000mgであったので、試験物の容認された全2
8日処置計画より短いが、すべての動物は研究日22に安楽死させた。すべての動物は、
二酸化炭素(CO2)吸入により、人道にかなって安楽死させた。
2. 組織採集:
腫瘍は、取り巻く組織およびかぶっている皮膚を含まないように切り裂いた。さらに腎
臓を採集した。腎表面に何ら異常は認められなかった。
腎臓)をとった。腎臓切片は皮質および髄質を含んでいた。組織切片はラベルを付けたプ
ラスチック−凍結用成型物の底に置いた。組織はOCT培地で包理した。ブロックは、ド
ライアイスで冷却したイソペンタン内に凍結するまで浸けた。ブロックの質を簡単に検査
し、ドライアイス上に保存した。
=腫瘤)を記したラベルを付けた。1匹の動物からのブロックを、ラベルを付けた袋に入
れた。
A. 生存中の測定および観察:
1. 臨床観察、病的状態および死亡率の要約:
すべての動物は健康に思われ、研究を通して正常限界内であった。D6はこの研究で使
用された投与量では毒性の徴候を示さなかった。
ったので、群9のマウスを除いたすべてのマウスを、試験物投与を完了する前に安楽死さ
せた。シスプラチン処置動物は研究日22に安楽死させたが、その時、平均腫瘍重量は9
96mgであった。研究期間中に死亡した動物はいなかった。
2. 腫瘤触診要約:
研究を通して、触診できる腫瘤がすべてのマウスで検出され、腫瘍は研究の継続期間の
間、段々に成長した。予期されるように、非処置および媒体処置陰性対照マウス(群1お
よび2)中の腫瘍は最も速く成長し、研究日20に、またはその前に1000mgの平均
腫瘍サイズに到達した。加えて、シスプラチンで処置した動物(群9)も腫瘍を発育させ
たが、その成長は最も遅く、研究終了時(日22)で996mgの平均腫瘍サイズに達し
た。
った(図68)。低用量(0.05mg/kg)のD6で処置した、群3の動物は、群1
および2の非処置および媒体処置動物とほとんど同じ速度で成長した腫瘍を有していた。
より高い用量(群4および5)のD6で処置した動物は、より遅く成長した腫瘍を有して
いた;研究日21に1000mgの平均腫瘍サイズに達する。対照群1および2のマウス
と比較した場合、試験物処理は、約1日の腫瘍成長の遅延を生じた。
B. 結論:
対照群1および2および陽性対照群9の、腫瘍所有マウスが予期されるように応答した
ので、この研究のデータから使用したモデルが妥当であることを確認できる。
究を通して健康でありおよび正常限界内であった。さらに、D6は動物に悪い影響を与え
なかった。それ故、これらのデータは、D6試験物で処置した動物がゆっくりと成長する
(22日の試験期間の終わりまでで対照より約1日遅い)腫瘍を有していたことを示唆す
るであろう。また、試験物は有意の毒性効果を示さなかったので、試験物のより高い濃度
も、より良好な腫瘍緩解の可能性を持って使用できる。
微小血管内皮細胞(MVEC,Cascade Biologics,ポートランド,
OR)をD6および関連類似体のVEGF−刺激増殖阻害能力を評価するために使用した
。MVEC(継代2)を90%コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理し、4.8
×103細胞/ウェルの密度で、ゼラチン被覆96ウェルマイクロタイタープレートに蒔
いた。蒔いて16から20時間後、ウシ胎児血清は全くないが、0.1%ウシ血清アルブ
ミン(BSA)を含んでいる培地で1回洗浄した(200μL/ウェル)。各々のウェル
へ新鮮なBSA含有培地を加え、さらに24時間インキュベートした。この24時間の飢
餓期間後、D6を含む、または含まない新鮮なBSA含有培地(25ng/mLのVEG
Fを含んでいる)を加え、細胞をさらに37℃で48時間インキュベートした。このアッ
セイにおける用量応答を評価するため、複数のD6濃度を2重のウェルで試験した。培地
を除去し、BrdUを含む、または含まない新鮮なBSA含有培地を加え、製造業者によ
り説明されているように取り込みのレベルを正確に決定するのに先立って、さらに24時
間インキュベートした。結果は図84に示されている。
D27の能力を評価し、加えられたグリコシル化および/またはD27で使用された特有
のスペーサー構造がその有効性を促進することを示している。
フィブロネクチン−被覆 FluoroBlok 24ウェル挿入プレートの上部チャン
バー内に置いた。D25またはD27の存在下または不在下、VEGF(10ng/mL
)を含む、または含まない基本培地をウェルの下部チャンバーへ加えた。22時間後、蛍
光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤/遊走細胞の蛍光を蛍光プレートリーダ
ーで測定することにより細胞遊走/浸潤の定量を達成した。ウェルの下部チャンバーに基
本培地のみを置いた場合に起こった遊走量を差し引くことにより、各々の実験条件のVE
GF−誘導遊走を計算した。
およびD27の両方で強く阻止された(図69)。D27はD25より10倍強力であり
(各々、IC50 0.5nMおよび5nM)、D27のグリコシル化および/またはそ
の特有のスペーサー特性が、KDRへ結合するおよびVEGFの効果を阻止する、その能
力を促進したことを示している。
促進する、TKPPRペプチドの「添加物(Adjunct)A」多量体構築物(配列番
号503;KDRにより媒介されるVEGFの効果を促進するVEGFレセプター、NP
−1に結合)の能力を評価した。添加物A=5CF−GLY−N{[CH2CH2C(=
O)−Gly−N(CH2CH2C(=O)−Adoa−Thr−Lys−Pro−Pr
o−Arg−OH)2]2 式中、Adoa=3,6−ジオキサ−8−アミノオクタノイ
ル,5CF=5−カルボキシフルオレセイニル。
フィブロネクチン−被覆 FluoroBlok 24ウェル挿入プレートの上部チャン
バー内に置いた。濃度を変化させたD6、または一定の100nM 添加物A(WO 0
1/91805 A2に記載されているように合成)と組み合わせた、濃度を変化させた
D6、の存在下または不在下、VEGF(10ng/mL)を含む、または含まない基本
培地をウェルの下部チャンバーへ加えた。22時間後、蛍光色素で挿入プレート内の細胞
を後標識し、浸潤/遊走細胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することにより細胞遊
走/浸潤の定量を達成した。VEGF不在下で観察された遊走量を差し引くことにより、
各々の実験条件のVEGF−誘導遊走を計算した。
より強く阻止されたが(IC50 約12.5nM)、100nM 添加物A単独では阻
止されなかった(図70)。しかしながら驚くことに、添加物AをD6と同時にアッセイ
で使用した場合、D6の有効性を約10倍促進することができた(IC50 約2.5n
M)。このことは、添加物Aに見られるTKPPR配列(または類似物)を含んでいる化
合物は、KDRへの結合に対してVEGFと競合するD6のごとき特定の化合物の有効性
を促進するために使用できることを示している。加えて、1つまたはそれより多い繰り返
しで、添加物Aに見られるペプチド配列(または類似物)、並びにTKPPR配列(また
は類似物)を含んでいるヘテロ二量体は、このアッセイにおいて促進された活性を所有す
るであろう。
1および3の合成(図71および72参照)
単量体の合成は、出発樹脂としてFmoc−GGGK(iV−Dde)NH−PAL−
PEG−PS樹脂を用いる0.25ミリモル規模において方法5に記載したように実施し
た。ペプチド樹脂を、切断または自動化または人力での方法によるさらなる誘導体化の前
に洗浄および乾燥した。
1および3への、ビオチン−JJ、リシル、グルシルおよびセリニル(GalNAc(
Ac)3−α−D)部分の付加体は、方法6および方法8に記載したごとき手操作SPP
Sにより実施した。アミノ酸のカップリングは、HOBt/DIC活性化(Ser(Ga
lNAc(Ac)3−α−D)を除いて)を使用し、DMF中で実施した。Fmoc除去
は、20%ピペリジンDMF溶液で実施した。すべてのカップリングは5〜16時間の持
続時間であった。各々のカップリング後、完了をカイザー(Kaiser)試験により確
認した。Ser(GalNAc(Ac)3−α−Dの場合、カップリング剤としてHAT
U/DIEAを用いて、DMF中で実施した。カイザー試験が未反応アミノ基を示した場
合、カップリングを繰り返した。N末端Fmoc基の除去、および樹脂からの切断を実行
した。粗ペプチドをエーテル中で沈殿し、エーテルで2回洗浄し、真空下で乾燥した。直
鎖状粗ペプチドは、ペプチドをDMSOに溶解することにより(40mg/mL)直接環
化した。N−メチルグルカミン水溶液の添加により、溶液のpHを8に調整し、溶液を空
気雰囲気下、室温で48時間撹拌した。ペプチドは次に、Waters−YMC C−1
8 ODS分取カラム(250mm×4.6mm内径)を用いる、方法1に記載したよう
な濃度勾配HPLCを用いて精製した。純粋な生成物を含んでいる分画を合わせ、凍結乾
燥すると、必要とされるペプチドを得た。
グルタール酸ビス−NHSエステル(0.122ミリモル、Pierce Scien
tific Co.)の無水DMF溶液へ、4のDMF溶液(40mg、0.0122ミ
リモル、ペプチドに結合しているトリフルオロ酢酸および反応の間に形成されるN−ヒド
ロキシスクシンイミドを中和するためにDIEAが加えられている)を滴加した。この0
.7mL溶液を4時間撹拌した。反応は、HPLCおよび質量分析法によりモニターした
。真空下でDMFを除去した。過剰のジエステルは酢酸エチルの添加により除去し、それ
は、ペプチド−モノエステル5を沈殿させると同時に、グルタール酸ビス−NHSエステ
ルを溶解する。混合物を遠心分離し、液体部分をデカンドした。これを2回繰り返した。
残渣は真空下に10分維持した。残渣をDMFに溶解し、2(37mg、0.009ミリ
モル)のDMF溶液(pH7)と混合した。それは室温で16時間撹拌した。高真空下で
揮発物を除去し、残渣を1mLのヒドラジン/MeOH(15/85、v/v)と室温で
2.5時間撹拌して処理することにより、アセテート機能を取り除いた。過剰のヒドラジ
ンをクエンチするためにアセトンを加え、真空下で揮発物を除去した。生じた残渣をDM
SOに溶解し、前記のように分取HPLCにより精製すると、9mgの純粋な物質を得た
。
以下の実験は、ヘテロ多量体ペプチドが、同一の標的に対して類似の結合親和性を有す
る単量体ペプチドよりも大きな生物学的有効性を示すことができることを明らかにしてい
る。
DNAまたはMockトランスフェクトした。細胞を配列番号504またはD1(300
、30、3および0.3nMで)の存在下または不在下で、125I−VEGFとインキ
ュベートした。VEGF結合の阻害率は、式[(Y1−Y2)×100/Y1]、式中、
Y1はペプチド不在下でのKDR−トランスフェクト293細胞への特異的結合であり、
およびY2はペプチド競合剤存在下でのKDR−トランスフェクト293細胞への特異的
結合である、を使用して計算した。KDR−トランスフェクト293細胞への特異的結合
は、KDR−トランスフェクト293細胞への結合からMockトランスフェクト細胞へ
の結合を差し引くことにより計算した。
BD フィブロネクチン−被覆 FluoroBlok 24ウェル挿入プレートの上部
チャンバー内に置いた。濃度を増加させた配列番号504またはD1の存在下または不在
下、VEGF(10ng/mL)を含む、または含まない基本培地をウェルの下部チャン
バーへ加えた。22時間後、蛍光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤/遊走細
胞の蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することにより細胞遊走/浸潤の定量を達成した
。VEGF−刺激遊走は、VEGF不在下で測定された基本遊走量を差し引くことにより
誘導した。
スフェクト細胞への結合に対して、125I−VEGFとほとんど等しく競合し、それら
は同等の結合親和性、ならびにKDRへの結合からVEGFを阻害する同等の能力を有し
ていることを示している。
25I−VEGF結合を強く阻止する(図75)という事実にもかかわらず、ヘテロ二量
体D1は、内皮細胞遊走アッセイで示されたように、VEGFの生物学的効果の阻止にお
いて、単量体配列番号504より強力であった(図75)。62.5nMまで、配列番号
504はVEGF−刺激遊走に対して効果を有しなかったのに対し、D1は、50nMで
VEGF−刺激遊走を完全に阻止した。
以下の実験は、配列番号356の断片が著しいKDR結合活性を維持できることを示し
ている。
またはMockトランスフェクトした。細胞へのストレプトアビジン−HRPの結合は、
0から250nMまたは0から1000nMの以下の競合ペプチド:配列番号356、4
62、463および465、の存在下、5.5nMの複合体濃度で、実施例6のように実
施した。各々の実験条件下で特異的結合を決定した後、各々のペプチドのIC50を決定
した(可能な場合)。
合モチーフのみから構成され、それはまた、ファージディスプレイデータに基づいて合成
されたほとんどの単量体ペプチドに付加されている非標的化Gly−Gly−Gly−L
ys(配列番号286)配列とともに配列番号286と共有されている、配列番号462
が、1マイクロモル以下のID50でペプチド/ストレプトアビジン−HRP複合体結合
を阻止できる最も小さい断片であった。驚くことに、配列番号356から誘導されたより
大きな断片は、1マイクロモルで複合体結合を有意に阻止できなかった。しかしながら、
可溶化モチーフ、(Gly−Arg−Gly)3を後者のペプチドに加えて配列番号46
5を作製した場合、それは175nMのID50で、結合に対して複合体と競合でき、A
sp−Trp−Tyr−Tyr(配列番号490)モチーフを含んでいる配列番号356
の特定の断片がKDR結合活性を保持していることが確認された。
KDR/VEGF複合体へ選択的に結合する、KDR/VEGF複合体結合ペプチドの
能力が示された。
このアッセイのための試薬は、以下に示す点を除いて、実施例5に記載されたように調
製した。
ビオチニル化ペプチド配列番号321、320および323、およびビオチニル化非結
合対照ペプチドを、1.25μM保存50%DMSO溶液を調製するために使用した。1
25I−ストレプトアビジンの33.33nM保存溶液は、Amersham(バッキン
ガムシア、英国)から購入した。13.33nM 125I−ストレプトアビジン/10
0nM VEGF保存溶液は、850mLの125I−ストレプトアビジンと22μLの
10μM VEGFおよび1275μLのM199培地を混合することにより調製した。
他の保存溶液も同様の様式で調製したが、しかしVEGFを欠いていた。13.33nM
ペプチド−125I−ストレプトアビジン複合体溶液±VEGFを調製するため、500
μLの125I−ストレプトアビジン(VEGFを含む、または含まない)保存溶液(最
後の工程で調製された)を、24μLの配列番号321、320および323、または対
照ペプチドの1.25μMペプチド溶液と混合した。混合物は4℃にて60分、回転板上
でインキュベートし、続いて、過剰のペプチドを除去するために50μlのソフトリリー
スアビジン−セファロース(ddH2O中での50%スラリー)を加え、さらに4℃にて
30分、回転板上でインキュベートした。最後に、12,000rpmで5分間、室温で
遠心分離することにより、ソフトリリースアビジン−セファロースをペレット化し、得ら
れた上清をアッセイに使用した。
VEGF存在下または不在下、対照ペプチドおよび試験ペプチド(配列番号321、3
20および323)と125I−ストレプトアビジンの複合体(上記のように調製)を、
KDRで一過性にトランスフェクトした293H細胞に結合する能力について試験した。
配列番号321と125I−ストレプトアビジンの複合体は、VEGF存在下、Mock
トランスフェクト細胞と比較して、KDR−トランスフェクト293H細胞へ特異的に結
合したが(図76)、VEGFが除かれている場合は結合しなかった(図77)。配列番
号321はまた、蛍光偏光およびSPR(BIAcore)アッセイを使用して試験する
ペプチドの中で最良のKDR/VEGF複合体結合剤でもあった(表9)。この実施例は
、ペプチド(配列番号321)が細胞表面上に存在するKDR/VEGF複合体へ特異的
に結合できることを示している。このことは、診断または治療目的のため、インビトロお
よびインビボでの、KDR/VEGF複合体標的化のために有用であるアッセイの有用性
を確立している。KDR/VEGF結合ペプチドは、機能的および活性なKDRレセプタ
ーのみを検出し、細胞表面上に存在するすべてのKDRを検出するわけではないので、腫
瘍、転移、糖尿病性網膜症、乾癬および関節症における、活性な血管新生の検出、および
/または処置に有用であろう。
の、2つのエピトープの1つを結合するホモ二量体より優れているであろう、より多くの
証拠。
的効果を阻止する能力で、ホモ二量体ペプチドより優れている、さらなる証拠を提供する
。
フィブロネクチン−被覆 FluoroBlok 24ウェル挿入プレートの上部チャン
バー内に置いた。濃度を増加させたホモ二量体D8またはヘテロ二量体D17の存在下ま
たは不在下、VEGFを含む、または含まない基本培地をウェルの下部チャンバーへ加え
た。22時間後、蛍光色素で挿入プレート内の細胞を後標識し、浸潤/遊走細胞の蛍光を
蛍光プレートリーダーで測定することにより細胞遊走/浸潤の定量を達成した。
により強く阻止されたが、D8では阻止されなかった。D17はVEGF−誘導遊走を約
250nMのIC50で阻止したが、一方、D8は800nMでさえも遊走には何の有意
な影響を与えなかった。これは、D8が配列番号356で観察される完全標的化配列を使
用し、一方、D17は、KDRに対する低親和性を有する(実施例26で示されたように
)配列番号356配列の切り詰め体を含んでいるという事実にもかかわらなかった。
運ぶ側鎖(GluかまたはAsp)および他がアミノを運ぶ側鎖[LysまたはDpr(
2,3−ジアミノプロパン酸)]、アミノ基配列番号301のジスルフィド結合置換類似
体を製造した。配列番号301(ジスルフィド結合の形成により作製された)に含まれて
いるものと同一の配列位置を含んでいる環を、側鎖アミノおよび側鎖酸部分の縮合により
作製し、配列番号301のジスルフィド結合により行われているような、残基6〜13を
架橋するラクタム環を得た。
に行われた、置換のいくつかの例を示している。
1の合成は0.25ミリモル規模での方法5を使用して実施した。ペプチド樹脂1を洗
浄して乾燥し、人力でさらに誘導体化した〔図78参照〕。
1(240mg、0.06ミリモル)へNMM(N−メチルモルホリン)/HOAc/
DMF 1/2/10(v/v/v)(65mL)を加えた。トリス−トリフェニルホス
フィンパラジウム[Pd(PPh3)4,554.4mg,0.48ミリモル]を加え、
樹脂を遮光して20時間振とうした。樹脂を濾過し、ジエチルジチオカルバメートナトリ
ウム(0.5g)/DIEA(0.5mL)/DMF(100mL)溶液で、最後にDM
F(3×70mL)で洗浄した。この処理は、ラクタム形成反応に必要とされるGlu6
およびLys13のカルボキシおよびアミノ基のみを露出するために働いた。2の樹脂上
の環化は、HATU(114mg,0.3ミリモル)、NMM(66μL,0.6ミリモ
ル)およびDMF(10mL)を使用して3時間実施した。環化の完了はカイザー試験に
よりモニターした。試薬Bを4時間使用して、ペプチド樹脂3からペプチドを切断した。
樹脂を濾過し、濾液を蒸発させてペーストとした。粗ペプチドをエーテル中で沈殿させ、
エーテルで2回洗浄した。環状ペプチドは、溶出液としてH2OへのCH3CN(両方と
も0.1%TFAを含んでいる)を用い、Waters−YMC C−18カラム(25
0mm×30mm内径)を使用する分取逆相直線濃度勾配HPLCにより精製した。生成
物含有分画の凍結乾燥は、8mgの配列番号453を与えた。配列番号454、455、
456および457を同様に製造した。
以下の実験は、ラクタム配列番号454が有意なKDR活性を維持するように、化学的
に反応性のジスルフィド架橋を置き換えたことを示した。
またはMockトランスフェクトした。ストレプトアビジン−HRP複合体は実施例6の
ように調製した。細胞へのストレプトアビジン−HRPの結合は、0から250nMの配
列番号454存在下、5.5nMの複合体濃度で、実施例6のように実施した。各々の実
験条件下で特異的結合を決定した後、各々のペプチドのIC50を決定した(可能な場合
)。
454は、今まで通りKDRへの結合に対してペプチド−ストレプトアビジン−HRP複
合体と競合できたが、幾分の親和性は失われていた(IC50 108nM対13nM)
。
この実施例は、最適化されたリンカーおよび/またはスペーサーを有するホモ二量体を
作製する利点を示している。
化誘導体、配列番号482の、結合のためのスペーサー長を決定した。ペプチドおよびビ
オチン間に置かれるべきスペーサー長を決定するため、スペーサーがない、1つのJスペ
ーサーまたはJJスペーサーを有する配列番号482を合成した。ニュートラアビジンH
RPと、cMet結合ペプチド配列番号482のこれら3つの異なった誘導体およびc−
Metへ結合しない対照ペプチドは四量体複合体として、c−Met発現MDA−MB−
231細胞へ結合するそれらの能力について試験した。cMet結合ペプチドの3つの四
量体複合体すべてが、対照と比較するとMB−231細胞へ結合した;しかしながら、2
つのスペーサーを有する誘導体が最もよいKD(12.62nM)を示した。このことは
、cMet結合ペプチドおよびビオチン間の2つのJJ−スペーサーの包含は、1つのス
ペーサーまたはスペーサー無しよりもよいことを示唆している。
地に1mL/Lペニシリン/ストレプトマイシン(InVitrogen,カールスバッ
ト,CA)を加えて、単層培養で増殖させた。細胞はアッセイの前日に分割し、96ウェ
ルプレートの各々のウェルへ35000細胞を加えた。実験の残りは、以下に注意したこ
とを除いて実施例6のように実施した。
対照ペプチド、および0、1または2のJスペーサーを有する配列番号482とニュー
トラアビジン−HRPの複合体は、上記のように製造し、MDA−MB−231細胞を結
合するそれらの能力を試験した。ペプチド/ニュートラアビジンHRP複合体製造の間、
ニュートラアビジン上の4つすべてのビオチン結合部位が占拠されることを確実にするた
め、ニュートラアビジン−HRPよりも7.5倍過剰のビオチニル化ペプチドを使用した
。複合体形成後、遊離ビオチニル化ペプチドおよびニュートラアビジンHRP−複合体化
ビオチニル化ペプチド間の競合を避けるため、過剰の遊離ビオチニル化ペプチドはソフト
リリースアビジン−セファロースを使用して除去した。スペーサー無し、または1つのス
ペーサーを有する誘導体の飽和結合曲線を発生させるため、0.28nMから33.33
nMの(図80)、および2つのスペーサーを有する誘導体の飽和結合曲線を発生させる
ため、0.28nMから16.65nMの(図80)、いくつかの異なった濃度のペプチ
ド/ニュートラアビジンHRPで実験を実行した。飽和結合曲線を描くため、試験された
各々の濃度に対する結合誘導体ペプチド/ニュートラアビジンHRP複合体の結合から、
対照ペプチド/ニュートラアビジンHRP複合体のバックグラウンド結合を差し引いた。
それ故、図80のY軸の吸光度は、差吸光度であり(c−Met結合ペプチドから対照ペ
プチドを差し引いた)、絶対吸光度ではない。Graph Pad Prismソフトウ
ェア(バージョン3.0)を使用した飽和結合データの分析により、2つのスペーサーを
有する四量体誘導体に対しては12.62nM(±3.16)のKD、1つのスペーサー
を有する四量体誘導体に対しては155.4nM(±86.56)のKD、およびスペー
サーを有しない四量体誘導体に対しては123.8nM(±37.71)のKDが得られ
た。予期されるように、これらの結合定数は、関連する単量体ペプチド配列番号482に
ついてFPにより測定された値(880nM)より低い。
ド結合として対照ペプチドの結合(n=1)を差し引いた後、12.62nMのKDで、
Jスペーサーを有するまたはスペーサーがない誘導体よりも、MDA−MB−231細胞
上のc−Metへのより良好な結合を示した。このことは、特定の最小スペーサー長が、
細胞上の複数の異なった結合部位へ到達し、そして多重の結合を達成することを可能にす
るために必要とされることを示唆している。この特定の最小スペーサー長は、細胞上の異
なった標的分子間の間隔に依存している。結合標的がKDRであった場合のように、ファ
ージディスプレイで同定されたビオチニル化ペプチドでのニュートラアビジン−HRPア
ッセイは、ELISA型アッセイ(結合後の洗浄工程を伴う)がうまく働くには、単量体
結合配列の親和性があまりにも低い場合でさえも、固定化された標的へ結合できるペプチ
ドを同定するために有用であった。
合
KDRへ結合するTc−標識D10の能力を、KDR−トランスフェクト293H細胞
を使用して評価した。結果は、Tc−標識D10は、Mockトランスフェクト293H
細胞よりもKDR−トランスフェクト293H細胞へ有意に良好に結合し、良好な結合は
40%マウス血清存在下でも維持されたことを示している。加えて、そのアミノ酸配列が
スクランブルされた、Tc−標識D10の誘導体D18は、KDR発現細胞に対する親和
性を有していないことが示され、これらの細胞へのD10の結合特異性を確認している。
99mTc−D10および99mTc−D18の製造
実施例37を参照されたい。
293H細胞は実施例5に記載したプロトコールを使用してトランスフェクトした。ト
ランスフェクションは、黒/透明96ウェルプレート(Becton Dickinso
n,カタログ番号354640)で行った。プレートの左半分(48ウェル)をMock
トランスフェクトし(DNAなしで)、プレートの他の半分にある細胞はKDR cDN
Aでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション時には80〜90%コンフル
エントであり、アッセイする時間である次の日には完全にコンフルエントであった(もし
これらの条件が満たされなければ、アッセイを中止した)。
opti−MEMIはInvitrogen(カタログ番号11058−021)から
得られ、およびヒト血清アルブミン(HSA)はSigma(セントルイス、MO)から
得られた。0.1%HSA、0.1%HSAw/vをopti−MEMIに加え、続いて
室温で20分撹拌することにより、opti−MEMI培地を調製した。培地は0.2μ
mフィルターを使用して濾過滅菌した。
Tc−標識D10およびD18を0.1%HSA含有opti−MEMIで希釈すると
、各々のTc−標識ヘテロ二量体の1.25、2.5、5.0および10μCi/mlの
最終濃度を有する溶液が提供される。第二の組の希釈液もまた、40%マウス血清/60
% 0.1%HSA含有opti−MEMIの混合物を希釈液として使用して調製した。
細胞は、トランスフェクション24時間後に使用し、アッセイのための細胞を調製する
ため、それらを100μlの室温の0.1%HSA含有opti−MEMIで1回洗浄し
た。洗浄後、0.1%HSA含有opti−MEMIをプレートから除き、70μlの1
.25、2.5、5.0および10μCi/mlのTc−標識D10またはD18(両方
の希釈液で上のように調製された)で置き換えた。各々の希釈液は偽およびKDRトラン
スフェクト細胞を含む3つの別々のウェルへ加えた。室温で1時間インキュベートした後
、プレートを100μlの冷結合緩衝液(0.1%HSA含有opti−MEMI)で5
回洗浄した。100μlの可溶化溶液(0.5N NaOH)を各々のウェルへ加え、プ
レートを37℃で10分インキュベートした。各々のウェル中の可溶化溶液をピペットで
吸い上げたり吐き出したりすることにより混合し、そして1.2mlチューブへ移した。
各々のウェルを100μlの可溶化溶液で1回洗浄し、洗液を対応する1.2mlチュー
ブへ加えた。各々の1.2mlチューブは、LKBガンマカウンターで計数されるべき1
5.7×100cmチューブへ移した。
KDRへ特異的に結合するTc−標識10およびD18の能力を、一過性トランスフェ
クト293H細胞を使用して示した。図81に示したように、Tc−標識D10は、血清
存在下で幾分の阻害が存在したけれども、40%マウス血清存在下および不在下の両方で
、Mockトランスフェクト293H細胞に比較してKDR−トランスフェクト細胞へよ
く結合した。KDR発現細胞への、このTc−標識ヘテロ二量体の総特異的結合は、前に
Tc−標識単量体ペプチド(実施例19)で観察されたよりも多かった。一方、D18は
MockトランスフェクトまたはKDR−トランスフェクト細胞の両方に親和性を示さず
、D10結合の特異性を確認している。
合
KDRへ結合するLu−標識D13の能力を、KDR−トランスフェクト293H細胞
を使用して評価した。結果は、Lu−標識D13は、Mockトランスフェクト293H
細胞よりもKDR−トランスフェクト293H細胞へ良好に結合し、有意な結合は40%
マウス血清存在下でも維持されたことを示している。
実施例37を参照されたい。
293H細胞のトランスフェクション
293H細胞は実施例5に記載したプロトコールを使用してトランスフェクトした。ト
ランスフェクションは、黒/透明96ウェルプレート(Becton Dickinso
n,サンノゼ、CA)で実施した。プレートの左半分(48ウェル)をMockトランス
フェクトし(DNAなしで)、プレートの他の半分にある細胞はKDR cDNAでトラ
ンスフェクトした。細胞は、トランスフェクション時には80〜90%コンフルエントで
あり、アッセイする時間である次の日には完全にコンフルエントであった(もしこれらの
条件が満たされなければ、アッセイを中止した)。
opti−MEMIは実施例32のように調製した。
アッセイのためのLu−標識ペプチド希釈液の調製
Lu−標識D13の保存溶液を0.1%HSA含有opti−MEMIで希釈すると、
標識ヘテロ二量体の1.25、2.5、5.0および10μCi/mlの最終濃度を有す
る溶液が得られた。第二の組の希釈液もまた、40%マウス血清/60% 0.1%HS
A含有opti−MEMIの混合物を希釈液として使用して調製した。
結合の検出は、実施例32に詳細に記載したように測定したが、ただし、Tc−標識ヘ
テロ二量体の代わりにLu−標識D13を使用した。
KDRへ特異的に結合するLu−標識13の能力を、一過性トランスフェクト293H
細胞を使用して示した。Lu−標識13は血清存在下で幾分の阻害が存在したけれども、
40%マウス血清存在下および不在下の両方で、Mockトランスフェクト293H細胞
に比較してKDR−トランスフェクト細胞へ有意によく結合した。
この実施例において、ヌードマウスに移植されたPC3細胞腫瘍の増殖を阻害するLu
−標識D13の能力を示した。
実施例37を参照されたい。
動物モデル
供給者が推薦するように増殖させた、ACTTからのPC3細胞を、ヌードマウスの肩
胛骨の間に皮下で注射した。それらの腫瘍が100〜140mm3に達した時、12匹の
マウスに500マイクロキューリーのLu−標識D13をi.v.で注射し、それらの増
殖をさらに18日モニターした。マウスがその体重を20%またはそれ以上失うか、また
はそれらの腫瘍が2000mm3を超えたら、マウスを殺した。処理マウスにおける腫瘍
増殖を、PC3を移植した37匹の非処置マウスにおける平均腫瘍増殖と比較した。
この研究において、12匹の処置マウスの内6匹において、非処置腫瘍マウスと比較し
て腫瘍の著しいまたは完全な増殖遅延が起こり(図83)、用いられた条件下、D13は
PC3腫瘍増殖を遅くすることに効果的であった。
細胞株:13762 Mat BIIIと称されるラット乳腺癌は、ATCC(CRL
−1666)から得られ、マッコイ5a培地+10%FCS、1%グルタミンおよび1%
ペニシリン/ストレプトマイシン(InVitrogen、カールスバット、CA)中で
増殖させた。懸濁液中の細胞を集め、ただしわずかに付着している細胞はEDTAで引き
剥がした。細胞を増殖培地で洗浄し、遠心分離し、mL当たり1×107細胞でPBSま
たは増殖培地に再懸濁した。
したメスFisher344ラットの乳房脂肪体内へ注射した。腫瘍は通常、8日以内に
5〜8mmの直径まで成長する。
材料:Texwipe(サドルリバー,NJ)から、長い取っ手を持つ、編まれたal
phaLiteポリエステルスワブを得た。
皮下に移植した。動物(ラットおよびマウス)は日15(ラットおよびマウス)または日
18(マウス)に麻酔薬の過剰投与により殺した。
スワブを免疫組織化学的試験のために取り除いた。
材料:ウサギ抗マウスflk−1抗体(Santa Cruz Biotechnolo
gy,Inc.,サンタクルス,CA)。 ラット抗マウスflk−1モノクローナル抗
体(Chemicon,テメキュラ,CA)。HRP−コンジュゲートヤギ抗ウサギIg
G(H+L)抗体(KPL,ガイセルブルグ,MD)。HRP−コンジュゲートウサギ抗
ラットIgG(H+L)抗体および試薬用ウサギIgG(Sigma,セントルイス,M
O)。ラットIgG(Ssrotic,ローリー,NC)。AEC:アミノエチルカルバ
ゾール基質キット:基質緩衝液、色素源溶液、過酸化水素溶液のボトル(Zymed,サ
ンフランシスコ,CA)。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質、ヘマトキシリン対比染色
試薬(Zymed)。グリセロールビニルアルコール水性マウンティング溶液(Zyme
d)。 Superfrost Plusガラススライド(メンツェル−グレーシャー,
ドイツ)。
オスタットを使用して10μm切片へ切断した。切片をSuperfrost Plus
ガラススライドにマウントし、冷アセトンで20分固定した。PBS中で5分、2回洗浄
後、0.5%H2O2での30分間のインキュベーションにより、内在性ペルオキシダー
ゼ活性をクエンチし、次に再びPBS中で洗浄した。切片は最初に0.2%BSA含有P
BS溶液で1時間処理した後、抗VEGF−R2抗体(1/50)またはビオチニル化ペ
プチド(2μM)または非特異的IgGPBS溶液(1/50)またはPBSのみと一夜
インキュベートした。切片を3回、PBS中で5分洗浄し、次に1/200希釈したヤギ
抗ウサギHRP抗体、または1/250希釈のストレプトアビジン−HRP(ビオチニル
化ペプチドに対して)と室温で1時間インキュベートした。切片を再び3回、PBS中で
5分洗浄し、AECで染色し、H2Oですすぎ、ヘマトキシリンで3分対比染色した。組
織切片を光学顕微鏡法のためにマウントした。
材料:超音波イメージングシステム:直線アレープローブ(L7−4)を備えたATL
HDI 5000。
ブを有するマウスの静脈内に注射した。断続パルス反転B−モード画像化を、スワブの新
生血管中の標的化マイクロバブルをモニターするために使用した。対照実験は非コンジュ
ゲートマイクロバブルまたはマイクロバブルと結合された非特異的ペプチドで実施した。
VEGFレセプター2を発現している領域に対応するエコー発生区域が、KDR−特異的
マイクロバブルを使用した場合に観察された。
懸濁液を調製した。これらの懸濁液は、超音波対比剤として有用である。前により詳細に
説明したように、本発明のKDR結合ペプチドへコンジュゲートされたマイクロバブルは
動物(ヒトを含む)に投与でき、そしてKDRを発現している動物領域(腫瘍のような血
管新生区域を含んで)の超音波イメージを発生させるために使用できる。
脂質懸濁液から調製された気体バブル
一連のリン脂質水性懸濁液を以下の組成で調製した:
A) 40mgのDSPC、10mgのDPPA、2.5mgのN−MPB−PE(1,
2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−4−(P−マレイ
ミド−フェニルブチルアミド(Avanti Polar−Lipids,Inc,アラ
ブスター,AL)および3gのラクトース
B) 50mgのDPPS、2.5mgのN−MPB−PEおよび1.5gのグリセロー
ルおよび5gのプロピレングリコール。
%NaCl)に分散し、0.2μmポリカーボネート膜(NucleporeR)を通し
て押し出した。得られた懸濁液は次に、気体マイクロバブルを発生させるための方法に従
って処理した:懸濁液Aは−45℃で凍結し、20ミリバールの減圧下で凍結乾燥し;得
られた乾燥飼料をバイアル中でC4F10へ暴露し(100mgの凍結乾燥物/バイアル
)、次に10mLの水で再構築した;懸濁液BはPolytronRを使用し、C4F1
0ガス雰囲気下、高速機械撹拌でホモジナイズした(12,000rpmおよび2分)。
バブルは次に、Coulter Multisizerを使用して計数した。気体マイク
ロバブルは、懸濁液の型および活性化の方法に依存して、1から15μmに変化したサイ
ズ、および108から109に変化した数で観察された。
等量のDSPCおよびDPPGをN−MPB−PE5%(w/w)および1gのMac
rogol−4000(Clarian,ドイツ)へ混合し、次に、tert−ブタノー
ルへ60℃で溶解すると透明な液が得られた。溶液をガラスバイアルへ分け、−45℃で
急速凍結し、そして凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を、空気を置換することによりC
4F10に暴露し、凍結乾燥器(ChristR)内で栓を用いて封をした。凍結乾燥試
料は、バイアル当たり10mLの食塩水(0.9%)で再構築した。再構築後、バブル形
成(乳白色懸濁液)、エコー輝度(7MHzでの後方散乱係数;Schneider,M
.,1999.Echocardiography,16(7pt2):743−746
、を参照されたい)、圧力への抵抗性および濃度(Schneiderら、EP 0 5
54 213 B1、を参照されたい)を決定した。
10mg/mLでメルカプトアセチル化ペプチド(配列番号294、264および28
6,上に示したように製造された)のDMF溶液を調製した。9mLのPBS−EDTA
溶液(10mM pH7.5)へ、20μLのペプチド溶液および1mLの脱アセチル化
溶液(50mMリン酸ナトリウム、25mM EDTA、0.5Mヒドロキシルアミン.
HCl、pH7.5)を加えた。混合物を室温で30分インキュベートした後、マレイミ
ド活性化マイクロバブル懸濁液を加えた。穏やかに撹拌しながら、暗所で2時間のインキ
ュベーション後、コンジュゲートマイクロバブルを遠心分離により精製した。
するため、架橋剤SATA(Pierce)を製造業者の指示に従って使用し、タンパク
質を透析により精製した。
、容量で1/10の脱アセチル化溶液(50mMリン酸ナトリウム、25mM EDTA
、0.5Mヒドロキシルアミン.HCl、pH7.5)を加えた。混合物を室温で30分
インキュベートした後、マレイミド活性化マイクロバブル懸濁液を加えた。穏やかに撹拌
しながら、暗所で2時間のインキュベーション後、コンジュゲートマイクロバブルを遠心
分離により非コンジュゲートタンパク質から分離した。コンジュゲートアビジンの量は、
色素HABAを使用することにより分光学的に決定した。
ビオチニル化ペプチド(配列番号294および264,上に示したように製造)をアビ
ジン−コンジュゲートマイクロバブルのPBS懸濁液に、上で決定されたように、アビジ
ン1モル当たり10モルのペプチドの比で加え、穏やかに撹拌しながら、室温で30分イ
ンキュベートした。過剰のペプチドは遠心分離により除去した。
SnCl2 2H2O(20mg)を1mLの1N HClに溶解し、10gのCaN
a2DTPA 2.5H2O(Fluka)を1mLの水に溶解することにより調製され
た1mLのDTPA溶液へ加えた。D10(100μgを100μLの50%DMFに)
を、75μLの0.1M、pH9リン酸緩衝液および50μLの99mTcO4 −(2.
4から5mCi,Syncor)、続いて100μLの第一スズSn−DTPA溶液と混
合した。室温で30分後、放射化学純度(RCP)は72%であった。生成物は、0.1
%TFA水溶液(A)および0.085%TFAアセトニトリル溶液(B;「ACN」)
の水性/有機濃度勾配を使用し、0.7mL/分の流速で溶出する、Supelco D
iscovery C16アミドカラム(4×250mm、5μm孔径)で精製した。以
下の濃度勾配を使用した:36分で30%Bから42%Bへ、傾斜をつけて10分で70
%Bへ。32分の保持時間で溶出された化合物を、0.2%HSAを含んでいる50mM
クエン酸緩衝液(pH5.2)500μLに集め、Speed Vacuum(Sava
nt)を使用してアセトニトリルを除去した。精製後、化合物は>90%のRCPを有し
ていた。
D11(〜1μg/μL 0.05N NH4OH/10%EtOH溶液の5μL)を
、80μLの0.2M NaOAc緩衝液、pH5.6、を含んでいるガラス差し込みマ
イクロバイアルへ加えた。177Luをリガンド:Luの比が2:1になるように加えた
(1〜5mCi)。バイアルをクリンプシールし、100℃で15〜20分加熱し、5分
間冷却し、3μLの1%Na2EDTA 2H2OのH2O溶解液で処理した。全反応混
合物を、Supelco Discovery RPアミドC16カラム(4×250m
m×5μm)に注入した。以下のHPLC条件を使用した:カラム温度=50℃、溶媒A
=0.1%TFA含有H2O、溶媒B=0.085%TFA含有ACN、勾配 t=0分
で0.6/0.25mL/分 A/Bからt=60分で0.5/0.4mL/分 A/B
。D11の保持時間は〜40分であり、177Lu−D11は〜42分であった。放射活
性のあるピークを、0.1%ヒト血清アルブミン分画Vおよび1%アスコルビン酸を含ん
でいる0.7mLの0.05Mクエン酸緩衝液、pH5.2、に集め、有機溶媒を除くた
め、混合物をSavant Speed Vac中で回転沈降させた。80%より高い放
射化学純度が得られた。
SnCl2 2H2O(20mg)を1mLの1N HClに溶解し、10gのCaN
a2DTPA 2.5H2O(Fluka)を1mLの水に溶解することにより調製され
た1mLのDTPA溶液へ加えた。D12(100μgを100μLの50%DMFに)
を、75μLの0.1M、pH9リン酸緩衝液および60μLの99mTcO4 −(2.
4から4mCi,Syncor)、続いて100μLの第一スズSn−DTPA溶液と混
合した。40℃で10分後、放射化学純度(RCP)は16%であった。生成物は、0.
1%TFA水溶液(A)および0.085%TFA ACN溶液(B)の水性/有機濃度
勾配を使用し、0.7mL/分の流速で溶出する、Supelco Discovery
C16アミドカラム(4×250mm、5μm孔径)で精製した。以下の濃度勾配を使
用した:36分で30%Bから42%Bへ、傾斜をつけて10分で70%Bへ。37.1
分の保持時間で溶出された化合物を、0.2%HSAを含んでいる50mMクエン酸緩衝
液(pH5.2)500μLに集め、Speed Vacuum(Savant)を使用
してACNを除去した。精製後、化合物は>90%のRCPを有していた。
D13(306μg)を、〜450μLの円錐形差し込みを持つ2mLオートサンプラ
ーバイアルに加え、0.01N NH4OH(50μL)で溶解した。このバイアルに、
アスコルビン酸ナトリウム、ゲンチジン酸ナトリウム、L−メチオニンおよびL−トリプ
トファン、各々の10mg/mL、に加えて2mg/mLのヒト血清アルブミン分画Vを
含み、NaOHで最終pH=7.6に調整した、0.5Mの酢酸アンモニウム(300μ
L)を加えた。177LuCl3の0.05N HCl溶液の一部6.8μL(39.3
mCl)を加え、バイアルをクリンプシールし、37℃で15分温め、5分間冷却し、1
0μLの1%Na2EDTA 2H2OのH2O溶解液を加えた。反応混合物の350μ
Lを、Supelco Discovery RPアミドC16カラム(4×250mm
×5μm)に注入した。以下のHPLC条件を使用した:カラム温度=37℃、溶媒A=
2g/L NH4OAc緩衝液含有H2O、溶媒B=80%ACN/20%H2O、勾配
t=0分で0.56/0.24mL/分 A/Bからt=30分で0.47/0.33
mL/分 A/B。D13の保持時間は〜28分であり、177Lu−D13の保持時間
は〜29分であった。放射活性のあるピークを、アスコルビン酸ナトリウム、ゲンチジン
酸ナトリウム、L−メチオニンおよびL−トリプトファン、各々の10mg/mL、に加
えて2mg/mLのヒト血清アルブミン分画Vを含み、NaOHで最終pH=7.6に調
整した緩衝液1mLに集めた。ACNを除くため、Speed Vacuum(Sava
nt)を使用して回転沈降させた。単離された生成物のRCPは86%であった。
SnCl2 2H2O(20mg)を1mLの1N HClに溶解し、10gのCaN
a2DTPA 2.5H2O(Fluka)を1mLの水に溶解することにより調製され
た1mLのDTPA溶液へ加えた。D14(100μgを100μLの50%DMFに)
を、50μLの99mTcO4 −(6mCi,Syncor)および125μLの0.1
Mリン酸緩衝液(pH9)、続いて100μLの第一スズSn−DTPA溶液と混合した
。40℃で15分後、放射化学純度(RCP)は21%であった。生成物は、0.1%T
FA水溶液(A)および0.085%TFAアセトニトリル溶液(B)の水性/有機濃度
勾配を使用し、1mL/分の流速で溶出する、VydacペプチドC18カラム(4.6
×250mm)で精製した。以下の濃度勾配を使用した:40分で30%Bから45%B
へ。34.9分の保持時間で溶出された化合物を、0.2%HSAを含んでいる50mM
クエン酸緩衝液(pH5.3)500μLに集め、Speed Vacuum(Sava
nt)を使用してACNを除去した。精製後、化合物は92.5%のRCPを有していた
。
SnCl2 2H2O(20mg)を1mLの1N HClに溶解し、10gのCaN
a2DTPA 2.5H2O(Fluka)を1mLの水に溶解することにより調製され
た1mLのDTPA溶液へ加えた。D18(100μgを100μLの50%DMFに)
を、50μLの0.1M、pH9リン酸緩衝液および90μLの99mTcO4 −(14
mCi,Syncor)、続いて100μLの第一スズSn−DTPA溶液と混合した。
反応液を37℃で20分温めた。全生成物を、Vydac218TP54 C18カラム
(4.6×250mm、5μmシリカ)に注入し、0.1%TFA水溶液(A)および0
.085%TFA ACN(B)の水性/有機濃度勾配を使用し、1.5mL/分の流速
で溶出した。以下の濃度勾配を使用した:30分で32%Bから39%Bへ、傾斜をつけ
て2分で80%Bへ。遊離リガンドは19分の保持時間で溶出された。24分の保持時間
で溶出された化合物を、0.1%HSAおよび1%アスコルビン酸を含んでいる50mM
クエン酸緩衝液(pH5.2)500μLに集め、ACNおよび過剰のTFAをSpee
d Vacuum(Savant)を40分使用して除去した。精製後、化合物は93%
のRCPを有していた。
200mgのDSPC(ジステアロイルホスファチジルコリン)、275mgのDPP
G・Na(ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ナトリウム塩)、25mgのN
−MPB−PEを、50mLのヘキサン/イソプロパノール(42/8)に60℃で可溶
化した。真空下で溶媒を蒸発させ、次にPEG−4000(35.046g)を脂質に加
え、混合物は水浴中、106.92gのt−ブチルアルコールに60℃で可溶化した。溶
液は1.5mL溶液でバイアルに充填した。試料を−45℃で急速冷凍し、凍結乾燥した
。ヘッドスペースの空気を、C4F10/空気(50/50)の混合物に置き換え、バイ
アルにキャップをかぶせて、そして圧着した。凍結乾燥試料は、バイアル当たり10mL
の食塩水(0.9%NaCl)で再構築した。
例えば、配列番号374および配列番号277のペプチドを、以下の方法論に従って、
上に記載したようなマイクロバブル調製試料へコンジュゲートした。
リン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈した。この溶液を、18mLのPBS−EDTA 1
0mM、pH7.5、に分散したN−MPB−機能化マイクロバブルへ加え、そして2m
Lの脱アセチル化溶液(50mMリン酸ナトリウム、25mM EDTA、0.5Mヒド
ロキシルアミン.HCl、pH7.5)を加えた。ヘッドスペースをC4F10/空気(
35/65)で満たし、混合物を穏やかに撹拌しながら(回転盤)、暗所で2.5時間イ
ンキュベートした。コンジュゲートバブルを遠心分離により洗浄した。
6mgのジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS,Genzyme)、24m
gのジステアロイルホスファツジルコリン(DSPC,Genzyme)および3gのマ
ンニトールを含んでいる蒸留水(30mL)を65℃で15分加熱した後、室温まで冷却
した。N−MPB−PE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノ
ールアミン−N−[4−(P−マレイミド−フェニルブチルアミド)]Na塩−Avan
ti Polar−Lipids)を加えた(5%モル−1.9mg)。この誘導体化リ
ン脂質を、超音波浴を使用して水性相に分散した(Branson1210−3分)。
して、この水性相に乳化した(PolytronR、10000rpm、1分)。
この乳濁液は、遠心分離により(200g/10分)1回洗浄し、次に30mLの10
%マンニトール蒸留水液に再懸濁した。洗浄乳濁液を凍結し(−45℃、5分)、次に凍
結乾燥した(0.2ミリバール下、24時間)。
を蒸留水(30mL)に溶解した。マイクロバブルを遠心分離により1回洗浄し、10m
Lのリン酸緩衝食塩水に再分散した。
チオアセチル化ペプチド(200μg)を20μLのDMSOに溶解し、次に1mLの
リン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈した。この溶液を、5mLのN−MPB−機能化マイ
クロバブルと混合した。0.6mLの脱アセチル化溶液(50mMリン酸ナトリウム、2
5mM EDTA、0.5Mヒドロキシルアミン.HCl、pH7.5)を加え、懸濁液
を反転により2.5時間撹拌した。
む蒸留水を用い、遠心分離により(200g/10分)2回洗浄した。最終容量は5mL
に固定した。
40mgのジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC,Genzyme)を含ん
でいる蒸留水(30mL)を65℃で15分加熱した後、40℃まで冷却した。
pids)およびトリパルミチン(60mg−Fluka)を、超音波浴中で2分、40
℃でシクロヘキサン(0.6mL)に溶解した。
R、10000rpm、1分)。
蒸留水(5mL)に溶解したポリビニルアルコール(200mg)を乳濁液に加えた。
混合物は5℃に冷却し、次に凍結し(−45℃、5分)、そして最後に凍結乾燥した(0
.2ミリバール下、24時間)。
ーンの均質な懸濁液を得た。
ペプチドコンジュゲーション
チオアセチル化ペプチド(200μg)を20μLのDMSOに溶解し、次にPBSで
希釈した(1mL)。
0rpmで5分)。水溶性の分画(infranatant)を捨て、そしてマイクロバ
ルーンをリン酸緩衝食塩水(2mL)に再分散した。
0ミリリットルのヒドロキシルアミン溶液(10.4mgを含むPBS 50mM、pH
:7.5)を懸濁液に加えた。懸濁液を反転により2.5時間撹拌した。
含む蒸留水を用い、遠心分離により(500g/5分)2回洗浄し、最終的に3mLのこ
の溶液に再分散した。
本発明のペプチドへコンジュゲートされたマイクロバブルの、KDR発現細胞への結合
についての能力を、KDRを発現するようにトランスフェクトされた293H細胞を使用
して評価した。
293H細胞をKDR DNAでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、ペ
プチド−コンジュゲートマイクロバブルの懸濁液と、または対照ペプチド(KDRへの親
和性を有しない、コンジュゲートペプチドのスクランブル化体)とインキュベートした。
1から3×108のペプチド−コンジュゲートマイクロバブルを含んでいる懸濁液で満た
し、そして、トランスフェクト細胞がコンジュゲートマイクロバブルと接触するように、
キャップを反転させたThermanoxRカバーガラスで覆った。室温で約20分後、
カバーガラスをピンセットで持ち上げ、PBSで3回洗浄し、コンジュゲートマイクロバ
ブルの結合を評価するため顕微鏡下で試験した。
胞へ特異的に結合することを示している。実際、KDR結合ペプチドへコンジュゲートさ
れたマイクロバルーンはKDR発現細胞へ結合したのに対し、それらはMockトランス
フェクト細胞へは認めうるほどには結合せず、そしてスクランブル化対照ペプチドを有す
るマイクロバルーンは、認知できる結合を示さなかった。
イメージはデジタルカメラDC300F(Leica)で取得し、イメージ化された領
域中の結合マイクロバブルまたはマイクロバルーンにより覆われている表面のパーセント
は、ソフトウェアQWin(Leica Microsystem AG,ベーゼル、ス
イス)を使用して決定した。
和性の結果(イメージ化された表面の被覆度%として表現されている)を示しており、M
ockトランスフェクト細胞に対する、同一標的化微小胞の結合、または(ペプチドの場
合のみ)同一のKDRトランスフェクト細胞に対するスクランブル化ペプチドで標的化さ
れた微小胞の結合と比較されている。
を示している。
血管新生の既知のモデル(ラットマトリゲルモデルおよびラットMat B IIIモ
デル)を、超音波コンジュゲート体へコンジュゲートされたペプチドの血管新生組織へ局
在する、および血管新生組織のイメージを提供する能力を試験するために使用した。
r 344ラット(Charles River Laboratories,フランス
)を使用した。マトリゲル注射のためには、120から160gの体重のオスOFAラッ
ト(Charles River Laboratories,フランス)を使用した。
キシラジン(Veterinaria AG/Sigma)(50/10mg/mL)混
合物の筋肉内注射(1mL/kg)で麻酔した。画像化実験のためには、動物を同一の混
合物に50%ウレタン(1g/kg)の皮下注射を加えて麻酔した。
乳腺癌は、ATCC(CRL−1666)から得られ、マッコイ5a培地+10%FCS
、1%グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン(InVitrogen、
カタログ番号15290−018)中で増殖させた。懸濁液中の細胞を集め、細胞を増殖
培地で洗浄し、遠心分離し、mL当たり1×107細胞でPBSまたは増殖培地に再懸濁
した。腫瘍の誘導のためには:0.1mL当たり1×106の細胞を、麻酔したメスFi
sher344ラットの乳房脂肪体内へ注射した。腫瘍は通常、8日以内に5〜8mmの
直径まで成長する。
ef:GF003)を含んでいるマトリゲル(400μL)(ECM,Sigma,セン
トルイス,MO)を各々のラットの背部側面へ皮下で注射した。
出を避けるため、注射部位を手で数秒閉じたままに保った。体温では、マトリゲルはゼラ
チン状になる。注射10日後、ラットのマトリゲルプラグで新しい血管新生が観察され、
画像化実験を実行した。
直線状プローブを備えた、超音波イメージングシステムATL HDI 5000装置を
使用して実施した。新しい血管の内皮上に発現されたKDRレセプター上の、ペプチドコ
ンジュゲート−マイクロバブルの蓄積を追跡するために、低音響出力のB−モードパルス
反転(み=0.05)を使用した。対照実験として、非コンジュゲートマイクロバブルま
たは非特異的ペプチドとコンジュゲートされたマイクロバブルの静脈内ボーラスを注射し
た。直線状プローブは、移植した腫瘍またはマトリゲルプラグの線上に、直接皮膚に固定
し、標的化バブルの蓄積を30分間追跡した。
行った。このことは、血管新生状態の評価を可能にする;SonoVueR注射後に得ら
れたビデオ強度を内部標準として採用した。
色々の時点で(1、2、5、10、15、20、25、30分)超音波照射を再活性化し
、1秒の2フレームをビデオテープに記録した。
−キャプチャーおよびImage−Pro Plus 2.0ソフトウェアで、各々キャ
プチャーおよび分析した。腫瘍またはマトリゲルの全区画を含んでいる、同一方形の問題
とする領域(AOI)を、異なった時点での(1、2、5、10、15、20、25、3
0分)イメージ上で選択した。各々の時点で、AOI内部のビデオピクセルの合計を、A
OIベースラインの差し引き後に計算した。結果は、100%として採用された、Son
oVueで得られた信号のパーセンテージとして表現されている。同様に、自由に循環し
ている対比剤を代表している、マトリゲルまたは腫瘍の外側の位置を占めている第二のA
OIもまた分析した。
の血管新生(および、それゆえKDRを発現している)組織へ局在化していることを示し
ている。特に、図84は、実施例38に従って調製された、本発明のKDRペプチドへコ
ンジュゲートされた、リン脂質安定化マイクロバブルの懸濁剤の注射30分後までの、腫
瘍中のバブルコントラスト剤の取り込みおよび保持を示している。対照的に、同一のバブ
ルは、腫瘍部位の外側に位置しているAOIでの、一過性の(10分を超えない)可視化
/バブルコントラストのみを示した。同様に、図85および図86は、実施例38に従っ
て調製された、本発明のKDRペプチド(配列番号374)へコンジュゲートされた、リ
ン脂質安定化マイクロバブルの懸濁剤の注射30分後までの、マトリゲル中のバブルコン
トラスト剤の取り込みおよび保持を示している。対照的に、同一のバブルは、マトリゲル
部位の外側に位置しているAOIでの、一過性の(10分を超えない)可視化/バブルコ
ントラストのみを示した。
マレイミドおよびチオールと反応できるその他の基を含む化合物は、化合物を注射した
場合、血清タンパク質、特に血清アルブミン上のチオール基と反応することが当該技術分
野で知られている。付加物は、血清アルブミンと同様の、例えば、ヒトにおいて14日を
超える血清寿命を持っている。
マレイミド−標識直鎖ペプチドの直接合成を可能にする、利用可能な方法は本発明に包
含されている(Holmes,D.ら、2000.Bioconjug.Chem.,1
1:439−444)。
三のシステインを、カルボキシ末端に付加できる。付加されたシステインは、ジスルフィ
ドを形成するシステインのために使用された型の基に直交している保護基で保護される。
ジスルフィドは、意図されるシステインを選択的に脱保護し、ペプチドを酸化することに
より形成される。最後のシステインを次に脱保護し、ペプチドを大過剰モルのビスマレイ
ミドと反応させる。生じる化合物は、血清アルブミンまたは他のチオール−含有血清タン
パク質と反応するために解放されたマレイミドの1つを有している。
含有C末端伸長で合成される。KDR結合モチーフのリジンをivDdeで保護し、C末
端リジンを脱保護する。このリジンを、N−[ε−マレイミドカプロイルオキシ]スクシ
ンイミドエステル(Pierce Biotechnology,ロックフォード,IL
)またはN−[α−マレイミドアセチキシ]スクシンイミドエステル(Pierce B
iotechnology)のようなマレイミド含有化合物と反応させる。
50〜60kDa未満の分子量を有しているポリペプチドは、急速に排出される。脂肪
酸のような、多くの小分子は血清アルブミンへ結合する。10から20の炭素原子を有し
ている脂肪酸は、血清アルブミンに対する実質的な親和性を有する。血清におけるこの結
合は、排出速度を減少させることができる。当該技術分野で既知の技術を使用し、血清ア
ルブミン結合部分を、本明細書で開示したペプチドの1つへコンジュゲートできる。血清
アルブミン結合部分は、リンカーを通してKDR結合ペプチドへ連結できる。リンカーは
ペプチド性または、PEGのような他のものであってもよい。ゼロから約30原子のリン
カーが好ましい。リンカーは親水性であることが好適である。血清アルブミン結合部分は
、末端でまたは付随するアミノ酸の側鎖を通してKDR結合ペプチドへコンジュゲート可
能である。適した側鎖には、リジンおよびシステインが含まれる。そのような化合物はま
た、本明細書で記載したような、放射性核種のためのキレーターも含むことが可能である
。血清アルブミン結合部分へ連結されたKDR結合ペプチドはKDRへ結合するであろう
。
当該技術分野でよく知られているように、タンパク質およびペプチドへのポリ(エチレ
ングリコール)(PEG)の添加は、これらの分子の血清抵抗性を増強する。KDR結合
ペプチドへのPEG(直鎖または分岐鎖)の添加は、血清抵抗時間の実質的な増強を与え
ることが期待される。PEGの分子量は少なくとも10kDa、より好適には少なくとも
20kDa、最も好適には30kDaまたはそれ以上であるべきである。PEGは、N末
端またはC末端に添加できる。ペプチドへPEGを結合する方法は、当該技術分野でよく
知られている(Roberts M.ら、2002.Adv.Drug.Deliv.
Rev.,54:459−476)。PEGは、リジンまたはシステインのような反応性
側鎖へ結合できる。
血清アルブミン(SA)および他のタンパク質を含むタンパク質は増強された血清抵抗
時間を有することは当該技術分野でよく知られている。ヒトSA(hSA)のアミノ酸配
列は表22に示されている。表23は
AGDWWVECRVGTGLCYRYDTGTGGGK(配列番号286)::
PGGSGGEGGSGGEGGRPGGSEGGTGG::成熟hSA::
GGSGGEGGSGGEGGSGPGEGGEGSGGRP::
GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号294)を含んでいる
融合タンパク質を示している。KDR結合ペプチドは、グリシンに富むリンカーにより成
熟hSAから分離されており、柔軟なスペーシングを可能にしている。増強された血清抵
抗時間を有するであろう、注射可能なタンパク質を得るために、hSAのすべてを必要と
しないことが、当該技術分野で知られている。また、マレイミドおよびアルファブロモカ
ルボキシレートのような化学基は、対をなしていないシステイン(残基34)と反応して
、安定な付加物を形成することも当該技術分野で知られている。それ故、付加物が放射性
核種を結合するであろうように、hSA融合タンパク質へ1つのキレーターを結合するこ
とができる。マレイミドを有するキレーターを製造し、それをhSAまたはhSA誘導体
へ結合することができる。もしくは、hSAまたはhSA誘導体をビスマレイミドと反応
させることができ、および反応性チオールを有するキレーターをビスマレイミド−誘導体
化hSAと反応させることができる。
サッカロミセス セレビジエにおけるhSA融合体の発現は、当該技術分野で知られてい
る(Sleep,Dら、1991.Biotechnology(NY),9:183−
187)。
通常の放射免疫癌療法は2つの問題に悩まされている。一般的に、到達可能な標的化比
(腫瘍に局在化する投与量対血液を循環している投与量の比、または腫瘍に局在化する投
与量対骨髄へ移動している投与量の比)が低い。また、腫瘍へ送達される放射線または治
療薬剤の絶対的量が、多くの場合で有意な腫瘍応答を惹起するには不十分である。標的化
比または腫瘍への絶対量の改良が、癌治療のために非常に重要であろう。
供する。本方法は、例えば、a)受容個体へ、標的化部分およびリガンド−抗リガンド結
合剤対の1つのメンバーを含んでいる融合タンパク質を投与し;b)その後、受容個体へ
、受容個体の肝細胞レセプターを経て循環融合タンパク質のクリアランスを方向付けでき
るクリアリング剤を投与し、ここでクリアリング剤はリガンド−抗リガンド結合剤対の1
つのメンバーを取り込んでいる;およびc)続いて、リガンド/抗リガンド結合剤対メン
バーを含んでいる活性薬剤を受容個体へ投与する。
−ホスフェート、N−アセチルグルコサミン、ペンタマンノシルホスフェート、N−アセ
チルガラクトサミン、ガラクトースのチオグリコシド、およびそれらの混合物が肝臓クリ
アランスを起こすことに効果的であることが、当該技術分野で知られている。しかしなが
ら、肝臓レセプターへの糖の結合は、分子を肝臓へ方向付ける唯一の手段ではない。
への結合によるものである。クッパー細胞へのCEAの結合は、CEA配列のアミノ酸1
07〜112を示すペプチド配列YPELPKを経て起こることを我々は示した。このペ
プチド配列はN末端と第一の免疫グロブリン様ループドメイン間の領域に位置している。
天然のCEAおよびヘテロ二機能性架橋剤と複合体形成したこの配列を含んでいるペプチ
ド、およびビオチニル化CEAおよびNCAでのリガンドブロッティングを使用し、クッ
パー細胞表面上の80kDaタンパク質への結合を、我々は示した。この結合タンパク質
は肝臓転移の発生に重要であろう。」(Thomas,P.ら、1992.Bioche
m.Biophys.Res.Commun.,188:671−677)
クリアランス剤としてYPELPK(配列番号498)を使用するには、この配列を、
リンカーを経て、融合タンパク質(Ab)を結合する部分に融合する。例えば、もし、A
bがDOTA/Reに対する親和性を有するとすれば、DOTA/Reに結合されたYP
ELPKを有する誘導体を作製するであろう;例えば、rvYPELPKpsGGG−D
OTA。「rvYPELPKps」は、Thomasらにより同定されたYPELPKを
含む、CEAの断片である。DOTA上の、任意の都合のよい点が、結合のために使用で
きる。RVYPELPKPSGGG−DOTA/coldRe(配列番号499)を次に
クリアリング剤として使用してもよい。融合Abに対応するFabは、Kd<100nM
、好適にはKd<10nM、および最も好適にはKd<1nMの、クリアリング剤のため
の親和性を有するであろう。
されたAbが高親和性でビス−DOTA化合物を結合するために、治療薬は2つまたはそ
れより多いDOTA部分を含んでいるであろう。2つのDOTA部分は、望ましくは、1
0から30単位のPEGの親水性リンカーと連結されるであろう。PEGは分解せず、溶
解度を促進するので、PEGは望ましいリンカーである。10から30単位のPEGは、
ビスDOTA化合物に非常に長い血清抵抗時間を与えるには不十分である。30分から1
0時間の半減期が許容できる。放射線のほとんどが腫瘍または外部環境へ送達されるため
には、血清半減期は、使用される放射性核種の放射活性半減期より長くなければならない
。
は重鎖(HC)のアミノ末端またはカルボキシ末端へ融合された、少なくとも1つのKD
R結合ペプチドを含んでいる。任意におよび好適には、2つまたはそれより多いKDR結
合ペプチドが抗体へ融合される。抗体は、放射活性にできるまたは結合された毒素を持つ
ことができる小分子に対して高い親和性を持つように選ばれる。好適には、Abに対応し
ているFabの親和性は、100nM未満の、より好適には10nM未満の、最も好適に
は1nM未満のKdで、小分子に対する親和性を有する。小分子は、有用な放射活性原子
(その多くが本明細書に掲げられている)を結合できるキレーターであることができる。
小分子は、ペプチドの結合特性に大きく影響することなく、放射性ヨウ素が結合できる、
1つまたはそれ以上のチロシンを有するペプチドであってもよい。
可能な、抗体の末端かまたは鎖へ融合できる。有用な具体例には以下のものが含まれる:
1) KDR−BP#1::link::LC/HC、
2) LC::link::KDR−BP#1/HC、
3) LC/KDR−BP#1::link::HC、
4) LC/HC::link::KDR−BP#1、
5) KDR−BP#1::link1::LC::link2::KDR−BP2/H
C、
6) LC/KDR−BP#1::link1::HC::link2::KDR−BP
#2、
7) KDR−BP#1::link1::LC/KDR−BP#2::link2::
HC、
8) KDR−BP#1::link1::LC/HC::link2::KDR−BP
#2、
9) LC::link1::KDR−BP#1/KDR−BP#2::link2::
HC、
10) LC::link1::KDR−BP#1/HC:link2::KDR−BP
#2、
11) KDR−BP#1::link1::LC::link2::KDR−BP#2
/KDR−BP#3::link3::HC、
12) KDR−BP#1::link1::LC::link2::KDR−BP#2
/HC::link3::KDR−BP#3、
13) KDR−BP#3::link3::LC/KDR−BP#1::link1:
:HC::link2::KDR−BP#2、
14) LC::link3::KDR−BP#3/KDR−BP#1::link1:
:HC::link2::KDR−BP#2、および
15) KDR−BP#1::link1::LC::link2::KDR−BP#2
/KDR−BP#3::link3::HC::link4::KDR−BP#4。
ink3」および「link4」として示されている)は同じでもまたは異なっていても
または存在しなくてもよい。これらのリンカーは、もし存在するなら、好適には親水性、
プロテアーゼ耐性、無毒、非免疫源性、および可動性である。好適には、リンカーはグリ
コシル化部位または肝臓クリアランスを起こすことが知られている配列を含んでいない。
0から15のアミノ酸長が望ましい。KDR結合ペプチド(KDR−BP#1、#2、#
3および#4)は同じでもまたは異なっていてもよい。もし、コードされているアミノ酸
配列が同じであるなら、これらの配列をコードしているDNAが異なっているのが望まし
い。
ーを示すであろう。(15)の場合、8つのKDR−BPが存在し、そしてKDR提示細
胞への結合は、高度に貪欲であるべきである。腫瘍侵入は、最大の親和性よりも、各々の
KDR−BPにおける中程度のKDR親和性により援助されることが可能である。
て配列番号286を有している。例えば、(7)の場合において(KDR−BP#1::
link1::LC/KDR−BP#2::link2::HC)、KDR−BP#1は
配列番号294であり、KDR−BP#2は配列番号284であり、およびlink1は
10から20の間のアミノ酸であり、およびlink2もまた10から20の間のアミノ
酸である。link1に適した配列はGGSGGEGRPGEGGSG(配列番号491
)であり、およびlink2に適した配列はGSESGGRPEGGSGEGG(配列番
号492)である。Gly、Ser、Glu、Asp、Thr、Gln、ArgおよびL
ysに富んだ他の配列が適している。タンパク質分解の危険性を避けるため、Argまた
はLysにProが続くのが望ましい。製造の困難さおよび乏しい溶解性を避けるために
は、非荷電残基の長い伸長(12を超えた)を避けるのが望ましい。ペプチドはLCおよ
びHCのアミノ末端に示されるので、結合されたリンカー長は、それらをKDRへ同時に
結合させることを可能にする。さらに、(15)の場合(KDR−BP#1::link
1::LC::link2::KDR−BP#2/KDR−BP#3::link3::
HC::link4::KDR−BP#4)、KDR−BP#1およびKDR−BP#2
は配列番号294であり、およびKDR−BP#3およびKDR−BP#4はDX−91
2である。link1およびlink3は10から20のアミノ酸であり、およびlin
k2およびlink4は各々、15から30のアミノ酸である。link2およびlin
k4は、LCのカルボキシ末端上のペプチドをHCのC末端のペプチドへ届かせる必要が
あるので、それらはより長い。
れる。好適には、細胞は、CHOのような哺乳動物細胞である。
融合タンパク質は患者に注射し、腫瘍に融合タンパク質が蓄積するように時間が与えら
れる。腫瘍に固定化されていない融合タンパク質が排除されるように、クリアリング剤が
注射される。従来の前標的化法においては、抗体結合部位は腫瘍を標的にするよう使用さ
れ、およびビオチン/アビジンまたはビオチン/ストレプトアビジンは放射活性または毒
性薬剤を固定化抗体へ付着するように使用されてきた。ビオチン/アビジンまたはストレ
プトアビジン結合は本質的に不可逆である。ここで、我々は標的結合ペプチドを抗体へ融
合し、それは放射活性または毒性薬剤を結合するように選んだ。融合タンパク質は2、4
、6または8のKDR−BPを含み、腫瘍への融合タンパク質の結合は非常に貪欲である
。腫瘍に固定化されていない融合タンパク質を排除する、クリアリング剤は。融合タンパ
ク質の注射の2から48時間の間に投与できる。クリアリング剤は、抗体と結合する部分
は単量体であるので、クリアリング剤および固定化融合タンパク質の複合体は、非常に長
い半減期は持たないであろう。クリアリング剤を注射して4から48時間以内に、固定化
された抗体は、そこに結合しているクリアリング剤を失っているであろう。好適には、活
性薬剤は、融合タンパク質と結合する部分において二量体である。活性薬剤は、クリアリ
ン剤の注射の2から約48時間の間に注射される。
付随する特許請求の範囲に包含されている本発明の範囲を離れることなく、形態および詳
細の多様な変更がなされることを理解されたい。本明細書に引用された刊行物、特許およ
び他の参照文献は、その全体が本明細書において援用される。
Claims (18)
- AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK(配列番号264);
AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(配列番号277);
AGDWWVECRVGTGLCYRYDTGTGGGK(配列番号286);
GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号294);
AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGK(配列番号310);および
VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号337)
より選択されるアミノ酸配列を含むKDRまたはVEGF/KDR複合体に結合する能力を有する少なくとも1つのポリペプチドに結合された微小胞を含む、超音波造影剤。 - 超音波造影剤が2以上のポリペプチドを含み、そして該ポリペプチドがKDR上の異なるエピトープに対して特異性を有する、請求項1に記載の超音波造影剤。
- 少なくとも1つのポリペプチドが、アミノ酸置換、およびアミド結合置換、D−アミノ酸置換、グリコシル化アミノ酸、ジスルフィド様置換、アミノ酸転位、レトロインベルソペプチド、ペプトイド、レトロインベルソペプトイド、または合成ペプチドを含み、そして受容体に結合する能力を維持する、請求項1または2に記載の超音波造影剤。
- 1以上のポリペプチドが、それらのアミノ酸配列中にC末端GGGK伸長を含まない、請求項1または2に記載の超音波造影剤。
- ポリペプチドが、以下の組み合わせ:
AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(配列番号277)および
VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号337);
AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(配列番号277)および
GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号294);
AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK(配列番号264)および
GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号294);または
AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGK(配列番号310)および
VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(配列番号337)、
のいずれかを含む、請求項2に記載の超音波造影剤。 - ポリペプチドが、リンカーまたはスペーサーを介して微小胞に連結された、請求項1〜5のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
- 前記リンカーまたはスペーサーが、置換アルキル鎖、非置換アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子、またはこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項6の超音波造影剤。
- 微小胞が、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、および合成または天然の高分子物質から成る群より選択される、微小胞形成物質を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
- ポリペプチドが前記微小胞形成物質に連結された、請求項8に記載の超音波造影剤。
- 前記微小胞形成物質がリン脂質を含み、そしてポリペプチドがリンカーまたはスペーサーを介して該リン脂質に連結された、請求項9に記載の超音波造影剤。
- 微小胞が、マイクロバブル、マイクロバルーン、微小粒子、およびミクロスフェアから成る群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
- マイクロバブルがリン脂質を含む、請求項11に記載の超音波造影剤。
- 微小胞が、生体適合性気体、生体適合性気体の混合物、または気体前駆体を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
- 気体または気体混合物がフッ素化ガスを含む、請求項13に記載の超音波造影剤。
- 気体または気体混合物が、空気;窒素;酸素;二酸化炭素;アルゴン;キセノン;クリプトン;低分子量アルカン、低分子量シクロアルカン、低分子量アルケン、または低分子量アルキン;過分極気体、SF6、フレオン、およびペルフルオロカーボンから成る群より選択される、少なくとも1つの気体を含む、請求項13に記載の超音波造影剤。
- 気体または気体混合物が、SF6、C3F8、C4F8、C4F10、およびC5F12から成る群より選択される気体を含む、請求項13に記載の超音波造影剤。
- さらに治療薬を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の超音波造影剤。
- リン脂質および請求項1に記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む、請求項1に記載の超音波造影剤を作製するための凍結乾燥残留物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36085102P | 2002-03-01 | 2002-03-01 | |
US60/360,851 | 2002-03-01 | ||
US44041103P | 2003-01-15 | 2003-01-15 | |
US60/440,411 | 2003-01-15 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003572527A Division JP2006514915A (ja) | 2002-03-01 | 2003-03-03 | Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009161549A JP2009161549A (ja) | 2009-07-23 |
JP5039075B2 true JP5039075B2 (ja) | 2012-10-03 |
Family
ID=27791656
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003572527A Pending JP2006514915A (ja) | 2002-03-01 | 2003-03-03 | Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 |
JP2009049512A Expired - Lifetime JP5039075B2 (ja) | 2002-03-01 | 2009-03-03 | Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003572527A Pending JP2006514915A (ja) | 2002-03-01 | 2003-03-03 | Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP2014310B8 (ja) |
JP (2) | JP2006514915A (ja) |
AU (2) | AU2003213730A1 (ja) |
CA (2) | CA2477836A1 (ja) |
ES (2) | ES2398393T3 (ja) |
SI (1) | SI2301587T1 (ja) |
WO (1) | WO2003074005A2 (ja) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7211395B2 (en) | 2001-03-09 | 2007-05-01 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
US7261876B2 (en) | 2002-03-01 | 2007-08-28 | Bracco International Bv | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
ES2523654T3 (es) * | 2002-03-01 | 2014-11-28 | Bracco Suisse Sa | Constructos multivalentes para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico |
US7794693B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-09-14 | Bracco International B.V. | Targeting vector-phospholipid conjugates |
US8623822B2 (en) | 2002-03-01 | 2014-01-07 | Bracco Suisse Sa | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
CA2513044A1 (en) | 2002-03-01 | 2004-08-05 | Dyax Corp. | Kdr and vegf/kdr binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
US20050250700A1 (en) * | 2002-03-01 | 2005-11-10 | Sato Aaron K | KDR and VEGF/KDR binding peptides |
US7666979B2 (en) * | 2002-03-01 | 2010-02-23 | Bracco International B.V. | Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same |
US7211240B2 (en) | 2002-03-01 | 2007-05-01 | Bracco International B.V. | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
NO20026286D0 (no) * | 2002-12-30 | 2002-12-30 | Amersham Health As | Nye peptider |
MXPA05007730A (es) | 2003-02-04 | 2006-01-31 | Bracco Int Bv | Agentes de contraste para ultrasonido y proceso para la preparacion de los mismos. |
NZ576739A (en) * | 2003-04-22 | 2011-01-28 | Sod Conseils Rech Applic | Peptide vectors for delivering paclitaxel |
US9750821B2 (en) | 2003-12-22 | 2017-09-05 | Bracco Suisse S.A. | Gas-filled microvesicle assembly for contrast imaging |
CN1960707B (zh) | 2004-06-03 | 2012-11-14 | 博莱科瑞士股份有限公司 | 用于治疗和/或诊断用途的脂质集合体 |
CN101005858A (zh) | 2004-08-18 | 2007-07-25 | 伯拉考开发股份有限公司 | 用于反差成像的充气微泡组合物 |
US20060160157A1 (en) * | 2005-01-19 | 2006-07-20 | Zuckerman Mathew M | Method, compositions and classification for tumor diagnostics and treatment |
EP1714642A1 (en) | 2005-04-18 | 2006-10-25 | Bracco Research S.A. | Pharmaceutical composition comprising gas-filled microcapsules for ultrasound mediated delivery |
DK2359864T3 (da) * | 2005-12-09 | 2019-07-08 | Bracco Suisse Sa | Målrettende vektor-phospholipid-konjugater |
ATE469660T1 (de) | 2006-09-05 | 2010-06-15 | Bracco Research Sa | Gasgefüllte mikrovesikel mit polymer- modifizierten lipiden |
WO2008075192A2 (en) * | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Bracco International Bv | Targeting and therapeutic compounds and gas-filled microvesicles comprising said com ounds |
EP2346532B1 (en) | 2008-10-07 | 2020-10-07 | Bracco Suisse SA | Targeting construct comprising anti-polymer antibody and microvesicles binding to the same |
WO2011046991A2 (en) * | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Gilead Connecticut, Inc. | Certain substituted ureas as modulators of kinase activity |
US10010630B2 (en) | 2012-12-21 | 2018-07-03 | Bracco Suisse S.A. | Gas-filled microvesicles |
BE1021191B1 (fr) * | 2014-08-29 | 2015-10-27 | Anmi S.A. | Kit pour radiomarquage. |
US11027030B2 (en) | 2014-08-29 | 2021-06-08 | Anmi S.A. | Kit for radiolabelling |
DK3233136T3 (da) | 2014-12-18 | 2019-05-20 | Bracco Suisse Sa | Formulering med målrettede gasfyldte mikrovesikler |
WO2016199430A1 (ja) * | 2015-06-10 | 2016-12-15 | 学校法人帝京大学 | セラノスティクス用のバブル製剤(tb)及びその使用方法 |
TR201723077A2 (tr) * | 2017-12-29 | 2019-07-22 | Ege Ueniversitesi | Ultrases duyarli manyeti̇k hedefli̇ nano i̇laç taşiyici si̇stem |
US20200360289A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Bracco Suisse Sa | Freeze-dried product and gas-filled microvesicles suspension |
US11717570B2 (en) | 2019-05-15 | 2023-08-08 | Bracco Suisse Sa | Gas-filled microvesicles |
WO2022023496A2 (en) | 2020-07-29 | 2022-02-03 | Universidade De Santiago De Compostela | Functionalized isonitriles and products, preparation and uses thereof |
CN113740539B (zh) * | 2021-08-11 | 2023-07-25 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 一种测定特异性生长因子的试剂盒 |
Family Cites Families (94)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4180646A (en) | 1975-01-28 | 1979-12-25 | Alza Corporation | Novel orthoester polymers and orthocarbonate polymers |
US4093709A (en) | 1975-01-28 | 1978-06-06 | Alza Corporation | Drug delivery devices manufactured from poly(orthoesters) and poly(orthocarbonates) |
US4131648A (en) | 1975-01-28 | 1978-12-26 | Alza Corporation | Structured orthoester and orthocarbonate drug delivery devices |
US4391797A (en) | 1977-01-05 | 1983-07-05 | The Children's Hospital Medical Center | Systems for the controlled release of macromolecules |
US4718433A (en) | 1983-01-27 | 1988-01-12 | Feinstein Steven B | Contrast agents for ultrasonic imaging |
DE3313946A1 (de) | 1983-04-15 | 1984-10-18 | Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen | Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel |
DE3313947A1 (de) | 1983-04-15 | 1984-10-18 | Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen | Mikropartikel und gasblaeschen enthaltende ultraschall-kontrastmittel |
DE3834705A1 (de) | 1988-10-07 | 1990-04-12 | Schering Ag | Ultraschallkontrastmittel aus gasblaeschen und fettsaeure enthaltenden mikropartikeln |
US4900540A (en) | 1983-06-20 | 1990-02-13 | Trustees Of The University Of Massachusetts | Lipisomes containing gas for ultrasound detection |
US4899755A (en) | 1985-05-08 | 1990-02-13 | The General Hospital Corporation | Hepatobiliary NMR contrast agents |
MX174467B (es) | 1986-01-23 | 1994-05-17 | Squibb & Sons Inc | 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos |
US5021556A (en) | 1987-07-22 | 1991-06-04 | Neorx Corporation | Method of radiolabeling chelating compounds comprising sulfur atoms with metal radionuclides |
DE3726264A1 (de) | 1987-08-07 | 1989-02-16 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von feuchtigkeitshaertenden bindemittelkompositionen und ihre verwendung |
IE61591B1 (en) | 1987-12-29 | 1994-11-16 | Molecular Biosystems Inc | Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production |
US4844882A (en) | 1987-12-29 | 1989-07-04 | Molecular Biosystems, Inc. | Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent |
US5075099A (en) | 1988-05-31 | 1991-12-24 | Neorx Corporation | Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5364613A (en) | 1989-04-07 | 1994-11-15 | Sieving Paul F | Polychelants containing macrocyclic chelant moieties |
DE69032761T2 (de) | 1989-08-28 | 1999-04-22 | The General Hospital Corp., Charlestown, Mass. | Hydroxy-aryl metallchelate für bildformung zur nmr diagnose |
US5118797A (en) | 1989-08-28 | 1992-06-02 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Rhenium tris dioxime complexes |
US5230882A (en) | 1989-12-22 | 1993-07-27 | Unger Evan C | Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same |
US5123414A (en) | 1989-12-22 | 1992-06-23 | Unger Evan C | Liposomes as contrast agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same |
US5585112A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-17 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres |
US5469854A (en) | 1989-12-22 | 1995-11-28 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of preparing gas-filled liposomes |
CA2034042C (en) | 1990-01-18 | 1999-08-17 | Adrian D. Nunn | Boronic acid adducts of rhenium dioxime and technetium-99m dioxime complexes containing a biochemically active group |
US5556610A (en) | 1992-01-24 | 1996-09-17 | Bracco Research S.A. | Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method |
US5578292A (en) | 1991-11-20 | 1996-11-26 | Bracco International B.V. | Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof |
US5445813A (en) | 1992-11-02 | 1995-08-29 | Bracco International B.V. | Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography |
IN172208B (ja) | 1990-04-02 | 1993-05-01 | Sint Sa | |
US5183653A (en) | 1990-04-13 | 1993-02-02 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds |
US5137928A (en) | 1990-04-26 | 1992-08-11 | Hoechst Aktiengesellschaft | Ultrasonic contrast agents, processes for their preparation and the use thereof as diagnostic and therapeutic agents |
AU636481B2 (en) | 1990-05-18 | 1993-04-29 | Bracco International B.V. | Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography |
US5367080A (en) | 1990-11-08 | 1994-11-22 | Sterling Winthrop Inc. | Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods |
US5849261A (en) | 1991-02-08 | 1998-12-15 | Diatide, Inc. | Radiolabeled vasoactive intestinal peptides for diagnosis and therapy |
US5965107A (en) | 1992-03-13 | 1999-10-12 | Diatide, Inc. | Technetium-99m labeled peptides for imaging |
DK0570493T3 (da) | 1991-02-08 | 2000-06-26 | Diatide Inc | Technetium-99m-mærkede polypeptider til billeddannelse. |
GB9106673D0 (en) | 1991-03-28 | 1991-05-15 | Hafslund Nycomed As | Improvements in or relating to contrast agents |
GB9106686D0 (en) | 1991-03-28 | 1991-05-15 | Hafslund Nycomed As | Improvements in or relating to contrast agents |
EP0586524B2 (en) | 1991-06-03 | 2000-11-02 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to contrast agents |
JPH06510758A (ja) | 1991-07-05 | 1994-12-01 | ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト | 造影剤におけるまたは造影剤に関する改良 |
US5808091A (en) | 1991-10-29 | 1998-09-15 | Bracco International B.V. | Rhenium and technetium complexes containing a hypoxia localizing moiety |
GB9200387D0 (en) | 1992-01-09 | 1992-02-26 | Nycomed As | Improvements in or relating to contrast agents |
GB9200391D0 (en) | 1992-01-09 | 1992-02-26 | Nycomed As | Improvements in or relating to contrast agents |
GB9200388D0 (en) | 1992-01-09 | 1992-02-26 | Nycomed As | Improvements in or relating to contrast agents |
IL104084A (en) | 1992-01-24 | 1996-09-12 | Bracco Int Bv | Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them |
US5608110A (en) | 1993-06-15 | 1997-03-04 | Bracco International B.V. | Heteroatom-bearing ligands and metal complexes thereof |
PL312387A1 (en) | 1993-07-02 | 1996-04-15 | Molecular Biosystems Inc | Proteinous microbeads of encapsulated non-dissolving gas and method of making them and their application as ultrasonic visualisation medium |
AU7261994A (en) | 1993-07-19 | 1995-02-20 | Resolution Pharmaceuticals Inc. | Hydrazino-type radionuclide chelators having an n3s configuration |
US5798091A (en) | 1993-07-30 | 1998-08-25 | Alliance Pharmaceutical Corp. | Stabilized gas emulsion containing phospholipid for ultrasound contrast enhancement |
US5574140A (en) | 1993-09-03 | 1996-11-12 | Resolution Pharmaceutical Inc. | Hydrazino-type N2 S2 chelators |
AU679295B2 (en) | 1993-12-15 | 1997-06-26 | Bracco Suisse S.A. | Gas mixtures useful as ultrasound contrast media |
GB9402867D0 (en) | 1994-02-15 | 1994-04-06 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to contrast agents |
JP2891647B2 (ja) | 1994-03-11 | 1999-05-17 | 株式会社日本触媒 | 有機スルフィド化合物及びその製造方法 |
US5770565A (en) | 1994-04-13 | 1998-06-23 | La Jolla Cancer Research Center | Peptides for reducing or inhibiting bone resorption |
US5582814A (en) | 1994-04-15 | 1996-12-10 | Metasyn, Inc. | 1-(p-n-butylbenzyl) DTPA for magnetic resonance imaging |
EP0755269B1 (en) | 1994-04-20 | 2005-12-07 | Amersham Health Salutar Inc. | Contrast agents |
US5650135A (en) | 1994-07-01 | 1997-07-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal |
US5662885A (en) | 1994-07-22 | 1997-09-02 | Resolution Pharmaceuticals Inc. | Peptide derived radionuclide chelators |
GB9417941D0 (en) | 1994-09-06 | 1994-10-26 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to contrast agents |
US5556939A (en) | 1994-10-13 | 1996-09-17 | Merck Frosst Canada, Inc. | TC or RE radionuclide labelled chelate, hexapeptide complexes useful for diagnostic or therapeutic applications |
US6333021B1 (en) | 1994-11-22 | 2001-12-25 | Bracco Research S.A. | Microcapsules, method of making and their use |
DE4445065A1 (de) | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Diagnostikforschung Inst | Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung |
IL116328A (en) | 1994-12-16 | 1999-09-22 | Bracco Research Sa | Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging |
TW319763B (ja) | 1995-02-01 | 1997-11-11 | Epix Medical Inc | |
GB9502065D0 (en) | 1995-02-02 | 1995-03-22 | Nycomed Imaging As | Contrast media |
US5837680A (en) | 1996-02-16 | 1998-11-17 | Children's Medical Center Corporation | Pharmaceutical compositions comprising troponin subunits, fragments and analogs thereof and methods of their use to inhibit angiogenesis |
NZ331509A (en) | 1996-02-19 | 2000-04-28 | Nycomed Imaging As | Aqueous dispersions of stabilised gas microbubbles and their use as contrast agents |
ATE268187T1 (de) | 1996-04-01 | 2004-06-15 | Epix Medical Inc | Bioaktivierte diagnostische bilderzeugungskontrastmittel |
CA2262908A1 (en) | 1996-08-02 | 1998-02-12 | David Johnson | Contrast agents for ultrasound imaging of the liver |
PL332820A1 (en) | 1996-10-21 | 1999-10-11 | Nycomed Imaging As | Improved contrast media |
WO1998018496A2 (en) | 1996-10-28 | 1998-05-07 | Nycomed Imaging As | Contrast agents |
ES2264159T3 (es) | 1996-10-28 | 2006-12-16 | Amersham Health As | Mejoras en/o relacionadas con agentes de diagnostico/terapeuticos. |
EP0991427A2 (en) | 1996-10-28 | 2000-04-12 | Marsden, John Christopher | Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents |
EP0963209A2 (en) | 1996-10-28 | 1999-12-15 | Marsden, John Christopher | Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents |
EP0946202B1 (en) | 1996-10-28 | 2003-09-10 | Amersham Health AS | Contrast agents |
US5919967A (en) | 1997-04-11 | 1999-07-06 | Epix Medical, Inc. | Process for synthesizing phosphodiesters |
DE19717904A1 (de) | 1997-04-23 | 1998-10-29 | Diagnostikforschung Inst | Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie |
US5886142A (en) | 1997-05-20 | 1999-03-23 | Thomas Jefferson University | Radiolabeled thrombus imaging agents |
US6245318B1 (en) | 1997-05-27 | 2001-06-12 | Mallinckrodt Inc. | Selectively binding ultrasound contrast agents |
IL120943A (en) | 1997-05-29 | 2004-03-28 | Univ Ben Gurion | A system for administering drugs through the skin |
GB9712525D0 (en) | 1997-06-16 | 1997-08-20 | Nycomed Imaging As | Method |
HUP0101245A3 (en) | 1997-10-02 | 2003-10-28 | Epix Pharmaceuticals Inc Cambr | Contrast-enhanced diagnostic imaging method for monitoring interventional therapies |
US6165458A (en) | 1997-12-26 | 2000-12-26 | Pharmaderm Laboratories Ltd. | Composition and method for dermal and transdermal administration of a cytokine |
ATE296113T1 (de) | 1998-02-09 | 2005-06-15 | Bracco Research Sa | Zielgerichtete abgabe von biologische-aktive medien |
EA200001007A1 (ru) * | 1998-03-31 | 2001-04-23 | Дюпон Фармасьютикалз Компани | Фармацевтические препараты для визуализации ангиогенных расстройств |
US6093382A (en) | 1998-05-16 | 2000-07-25 | Bracco Research Usa Inc. | Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications |
US6312665B1 (en) | 1998-12-21 | 2001-11-06 | Generex Pharmaceuticals Incorporated | Aerosol formulations for buccal and pulmonary application |
JP2002536968A (ja) * | 1999-01-29 | 2002-11-05 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | Kdrに特異的な抗体およびその使用 |
ES2320367T3 (es) * | 1999-04-16 | 2009-05-21 | Genentech, Inc. | Variantes del factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares y sus usos. |
US6294525B1 (en) | 1999-09-01 | 2001-09-25 | Molecumetics Ltd. | Reverse-turn mimetics and methods relating thereto |
EP1248642A4 (en) * | 2000-01-18 | 2005-05-18 | Ludwig Inst Cancer Res | PEPTIDOMIMETIC INHIBITOR OF VEGF AND VEGF-C AND -D |
EP2286843A3 (en) | 2000-06-02 | 2011-08-03 | Bracco Suisse SA | Compounds for targeting endothelial cells |
EP1311302A2 (en) * | 2000-06-21 | 2003-05-21 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders |
EP2267018A3 (en) * | 2000-08-18 | 2011-04-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS) |
-
2003
- 2003-03-03 EP EP08008365A patent/EP2014310B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-03 ES ES08008365T patent/ES2398393T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-03 EP EP10185498.2A patent/EP2301587B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-03 EP EP03711418A patent/EP1572724A4/en not_active Withdrawn
- 2003-03-03 WO PCT/US2003/006731 patent/WO2003074005A2/en active Search and Examination
- 2003-03-03 JP JP2003572527A patent/JP2006514915A/ja active Pending
- 2003-03-03 CA CA002477836A patent/CA2477836A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-03 CA CA2666005A patent/CA2666005C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-03-03 SI SI200332390T patent/SI2301587T1/sl unknown
- 2003-03-03 AU AU2003213730A patent/AU2003213730A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-03 ES ES10185498.2T patent/ES2506142T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-03-03 JP JP2009049512A patent/JP5039075B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2009-03-19 AU AU2009201114A patent/AU2009201114B2/en not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2666005C (en) | 2016-01-19 |
EP2014310B1 (en) | 2012-10-24 |
AU2009201114B2 (en) | 2012-01-19 |
EP2014310A3 (en) | 2009-09-09 |
WO2003074005A8 (en) | 2005-07-21 |
CA2477836A1 (en) | 2003-09-12 |
ES2506142T3 (es) | 2014-10-13 |
JP2006514915A (ja) | 2006-05-18 |
EP2301587A2 (en) | 2011-03-30 |
ES2398393T3 (es) | 2013-03-15 |
AU2003213730A1 (en) | 2003-09-16 |
EP2301587B1 (en) | 2014-06-25 |
AU2009201114A1 (en) | 2009-04-09 |
EP2301587A3 (en) | 2011-04-06 |
EP1572724A4 (en) | 2007-03-14 |
WO2003074005A2 (en) | 2003-09-12 |
EP1572724A2 (en) | 2005-09-14 |
EP2014310A2 (en) | 2009-01-14 |
JP2009161549A (ja) | 2009-07-23 |
EP2014310B8 (en) | 2012-12-26 |
CA2666005A1 (en) | 2003-09-12 |
SI2301587T1 (sl) | 2014-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5039075B2 (ja) | Kdrおよびvegf/kdr結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用 | |
US9629934B2 (en) | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy | |
US9056138B2 (en) | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications | |
US8663603B2 (en) | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications | |
US7666979B2 (en) | Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same | |
WO2006031885A2 (en) | Kdr and vegf/kdr binding peptides | |
US9408926B2 (en) | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy | |
CA2477935C (en) | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100607 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100607 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20110519 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111122 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120214 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120217 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120522 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120611 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120706 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150713 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5039075 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |