WO2016199430A1 - セラノスティクス用のバブル製剤（ｔｂ）及びその使用方法 - Google Patents

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丸山　一雄
鈴木　亮
ヨハン ミカエル ウンガ
大樹 小俣
雄介 小田
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学校法人帝京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a bubble preparation (TB) for theranostics that enables diagnosis and treatment of a target tissue, and a method of using the bubble preparation for theranostics.
  • TB bubble preparation
  • Ultrasound contrast agent is a suspension of microbubbles
  • ultrasound contrast agents used in Japan mainly include Levovist (registered trademark) and Sonazoid (registered trademark).
  • Levovist is used as a diagnosis of cardiovascular angiography
  • sonazoid is used for diagnosis of liver cancer and mammary tumor by Kupffer cell imaging.
  • the film of Levovist is composed of galactose, which is a carbohydrate, and air is enclosed inside.
  • the sonazoid coating is composed of phosphatidylserine sodium, which is a phospholipid, and perflubutane is enclosed inside.
  • ultrasound has the advantage that non-invasive, simple, relatively low cost, and real-time diagnostic imaging can be obtained. Therefore, the ultrasonic diagnostic apparatus has become an indispensable diagnostic method in a wide range of clinical fields.
  • the physical energy of ultrasound has already been applied not only to diagnosis but also to treatment in clinical settings.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a method of delivering a drug or gene into cells by using a combination of microbubbles, which are ultrasonic contrast agents clinically applied for the purpose of angiography, and ultrasonic irradiation has been reported (Non-Patent Documents 1 and 2). ).
  • This method can be introduced efficiently only to the site irradiated with ultrasonic waves by temporally and spatially controlling the collapse (cavitation) of microbubbles caused by ultrasonic irradiation from outside the body.
  • in-vitro and in-vivo gene introduction in various tissues has been reported.
  • HIGH INTENSITY FOCUSED ULTRASOUND (HIFU) treatment which is becoming popular for destroying cancer cells without putting a scalpel into the body, is a high-intensity ultrasound (eg, 3000-5000 W / cm 2 energy intensity) ) Is collected from outside the body to one point of cancer tissue in the body, and the cancer tissue is cauterized and necrotized by thermal energy (thermal action) and cavitation (non-thermal action) (Patent Document 1). This effect is due to the destruction of cancer cells by cauterization of the cancer cells by heat energy that reaches about 80-90 ° C. at the focal point.
  • HIFU HIGH INTENSITY FOCUSED ULTRASOUND
  • the range that can be irradiated and cauterized at one time is, for example, 3 mm ⁇ 3 mm ⁇ 10 mm, so it is necessary to repeatedly irradiate while shifting the focus.
  • the focus shift is extremely dangerous, so it is performed under the guidance of MRI and ultrasound images.
  • the skin and surrounding parts become hot, it is necessary to ensure precise control and cooling time constantly. Therefore, usually 2 to 4 hours of treatment time is required.
  • HIFU is ideal for non-invasive treatment, but if a bubble preparation having a therapeutic function can be present in cancer tissue, for example, 1/100 to higher than the high-intensity ultrasound used in HIFU. Cancer treatment by cavitation may be possible only at a site where bubbles exist with low-intensity ultrasound as weak as about 1/500.
  • the present invention has been made in view of such a problem, and is capable of diagnosing and treating a target tissue by low-intensity ultrasonic irradiation, and a bubble formulation for theranostics and a bubble formulation for the theranostics.
  • the purpose is to provide a method of use.
  • the bubble formulation (TB) for thelanostics comprises a lipid coating and a gas enclosed in the lumen of the coating, and diagnoses the target tissue by applying ultrasonic waves for low intensity treatment.
  • a bubble formulation for theranostics that enables (Diagnostics) and Therapeutics, wherein the coating comprises distearoylphosphatidylcholine (DSPC), distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), and 1,2-distearoyl- Sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol)] (DSPE-PEG) is an anionic lipid formed by coating at a molar ratio of 22-60: 30-68: 4-12 And the gas contains at least one of perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoropentane, and perfluorohexane, or a mixed gas. It is characterized by doing.
  • the method of using the bubble formulation for thelanostics (TB) according to the present invention comprises introducing a suspension in which the bubble formulation for theranostics according to the present invention is suspended in water for injection into the target tissue, Diagnosis by contrast imaging of the target tissue by applying diagnostic ultrasound consisting of frequency to the target tissue, and cavitation phenomenon by applying low-intensity therapeutic ultrasound consisting of the second frequency to the target tissue The target tissue is treated (Therapeutics).
  • the bubble preparation for theranostics according to the present invention can resonate and resonate for a long time without being broken by irradiation of diagnostic ultrasonic waves. It is. Further, according to the present invention, diagnosis and treatment of a target tissue by low-intensity therapeutic ultrasonic irradiation can be performed. Using low-intensity focused ultrasound (Low-Intensity-Focused-Ultrasound, LOFU), the temperature at the focal point does not rise and the safety is high. As a result, it is expected to construct an ultrasonic theranostics system for early diagnosis and treatment of highly safe thrombus and minimally invasive treatment of brain function disease and kidney disease.
  • LOFU low-intensity focused ultrasound
  • FIG. 3 is a diagram showing ultrasonic imaging images in the case of time lapse in a sonazoid (comparative example), a perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation, and a perfluorobutane gas-enclosed bubble preparation.
  • FIG. 3 is a diagram showing an ultrasound imaging image when a tumor site is enlarged in a sonazoid (comparative example) and a perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation.
  • the bubble formulation for theranostics comprises a film made of lipid and a gas enclosed in the lumen of the film.
  • the coatings were distearoylphosphatidylcholine (DSPC), distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol)] (DSPE-PEG ) Is an anionic lipid formed in a molar ratio of 22-60: 30-68: 4-12.
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DSPG distearoylphosphatidylglycerol
  • DSPE-PEG 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol)] Is an anionic lipid formed in a molar ratio of 22-60: 30-68: 4-12.
  • the gas is a perfluoro hydrocarbon gas, and specifically contains at least one of perfluoropropane, perfluoroisobutane and perfluoronormal butane, or a mixed gas thereof.
  • a particularly preferred perfluorohydrocarbon gas is perfluoropropane because it can be purchased for medical use in Japan.
  • perfluoro hydrocarbons other than these can also be included, and specifically, for example, perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoroisooctane, perfluoronormal octane, and sulfur hexafluoride.
  • the pressure of the gas to be filled is, for example, about 0.1 to 1.0 MPa.
  • the bubble preparation for thelanostics according to the present invention is a microbubble in which a hydrophobic fluorocarbon gas is encapsulated with phospholipid and PEG-lipid, and is present in the liquid as a foam having a diameter of 500 nm to 5 ⁇ m.
  • the diameter of the bubble preparation for theranostics is measured, for example, by a dynamic light scattering method.
  • the coating is formed of DSPC, DSPG and DSPE-PEG at a molar ratio of 22-60: 30-68: 4-12, which increases the retention of perfluorohydrocarbons and allows for the irradiation of diagnostic ultrasound. It shows continuous resonance and resonance without collapsing, which enables continuous ultrasound imaging for a long time.
  • phospholipids can be used in addition to DSPE.
  • DSPC DSPG and DSPE-PEG constituting the film
  • stearyl PEG, palmitoyl PEG, PEG oleate, myristyl PEG, lauroyl PEG and the like can be mentioned in addition to DSPE-PEG.
  • the molecular weight of PEG is 500-12000.
  • DSPE-PEG is preferably DSPE-PEG 2000 , DSPE-PEG 3000 or DSPE-PEG 5000 , particularly preferably DSPE-PEG 2000 .
  • phosphatidylcholines such as dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dilauroyl phosphatidylcholine (DLPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dilinoleoylphosphatidylcholine; Phosphatidylglycerols such as glycerol (DMPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dilinoleoylphosphatidylglycerol; dilauroylphosphatidylethanolamine (DLPE), dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), Dipalmitoy
  • glyceroglycolipids and sphingoglycolipids can be included in the coating.
  • the glyceroglycolipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like.
  • the glycosphingolipid include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside and the like.
  • the lipid surface of the coating is modified with ligands for target cells, target tissues, and target lesions.
  • the ligand include Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) sequence peptide, Sigma Protein, etc. as a ligand for thrombus, and transferrin, folic acid, hyaluronic acid, galactose or mannose as a ligand for cancer cells.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can also be used as ligands.
  • the RGD peptide is preferably used, and the RGD peptide has a function of specifically binding to a cell adhesion factor present on a specific cell or thrombus. Therefore, it is possible to further facilitate visualization of the thrombus by modifying the RGD peptide on the lipid surface of the coating.
  • the coating is preferably DSPC, DSPG and DSPE-PEG derivatives.
  • DSPE-PEG-Maleimide (MAL), DSPE-PEG-Carboxylic Acid (COOH), DSPE-PEG-N-Hydroxysuccinimide (NHS) or DSPE-PEG-NH 2 is preferable.
  • a film stabilizer sitosterol, cholesterol, dihydrocholesterol, cholesterol ester, phytosterol, stigmasterol, campesterol, cholestanol, lanosterol, 1-O— Sterol glucoside, 1-O-sterol maltoside, and mixtures thereof can be included.
  • the drug is preferably a drug whose blood concentration is desired to be maintained for a long period of time or a drug that needs to be administered for targeting to a specific disease site or cell.
  • the drug is not particularly limited, and examples thereof include anticancer drugs, antibiotics, antiasthma drugs, antithrombotic drugs, antiprotozoal drugs, immunostimulants, peptide drugs, and antiviral drugs.
  • the anticancer agent is not particularly limited, and examples thereof include doxorubicin, cisplatin, mitomycin, bleomycin, 5-fluorouracil, methotrexate, nitrogen mustard, busulfan, oxaliplatin, taxol, camptothecin and the like.
  • Antibiotics are, for example, sulfazen, gentamicin, streptomycin and the like.
  • Anti-asthma drugs are, for example, theophylline.
  • Examples of the antithrombotic agent include tPA, heparin, low molecular weight heparin, urokinase, thrombomodulin, streptokinase and the like.
  • Antiprotozoal agents are, for example, meglumine antimonate.
  • the immunostimulant include muramyl peptides.
  • Peptide drugs are, for example, natural or genetically modified ⁇ , ⁇ , ⁇ -interferon, interleukin, superoxide desmutase and the like.
  • examples of drugs include arteriosclerosis therapeutic agents such as prostaglandins, NF kappa B for arterial occlusion and Virtua disease, decoy and the like.
  • genes are, for example, DNA, RNA, antisense DNA, siRNA, decoy, therapeutic oligonucleotide and the like.
  • a bubble formulation for thelanostics according to the present invention is made by contacting a lipid solution with perfluorohydrocarbon gas while stirring so as to form a suspension, and then homogenizer (15000 rpm). , 5 minutes), and emulsifying the organic phase into the aqueous phase.
  • the bubble preparation for theranostics according to the present invention can be prepared not only by a homogenizer but also by, for example, shaking.
  • a homogenizer for example, a homogenizer
  • shaking for example, it is also possible to prepare a nanobubble suspension by putting a liposome solution in a predetermined ratio into a vial and shaking with a vial shaker.
  • the freeze-dried powder according to this embodiment is a freeze-dried powder obtained by freeze-drying a suspension in which the bubble formulation for thelanostics according to the present invention is suspended in a sugar solution that is trehalose or sucrose. Is the body.
  • freeze-dried additives can be contained for freeze protection and / or dispersion protection.
  • Lyophilized additives include, for example, amino acids such as glycine; saccharides such as mannitol, maltose, glucose, lactose, inulin, sucrose, trehalose or cyclodextrin; polysaccharides such as dextran and chitosan; or polyethylene glycol Examples include polyoxyalkylene glycol.
  • This freeze-dried powder can be stored for a long period of 3 months or longer, and can be restored and used with water for injection and perfluorohydrocarbon gas such as perfluoropropane described above.
  • the bubble formulation for thelanostics according to the present invention is used as follows. That is, a suspension in which the bubble formulation for thelanostics according to the present invention is suspended in water for injection is introduced into the target tissue.
  • the target tissue is not particularly limited, but is, for example, a cancer tissue.
  • diagnosis by contrast imaging of the target tissue is performed by applying diagnostic ultrasonic waves having the first frequency to the target tissue.
  • the first frequency is, for example, 3 MHz to 20 MHz.
  • a microstreaming phenomenon occurs by applying the first frequency.
  • the nanobubbles repeatedly expand and contract by the sound pressure intensity of the ultrasonic waves and vibrate locally.
  • the target tissue is treated by the cavitation phenomenon by applying low-intensity ultrasonic waves having the second frequency to the target tissue.
  • the second frequency is, for example, 0.5 MHz to 3.0 MHz.
  • Cavitation is a phenomenon in which jet pressure is generated by releasing a large pressure when nanobubbles collapse.
  • Example 1 ⁇ Preparation of bubble preparation for theranostics> DSPC, DSPG and DSPE-PEG 2000 -OMe in contact with a perfluoropropane gas (gas flow rate 12 ml / min) with stirring in an anionic lipid solution of 22:68:10 molar ratio to form a suspension I let you. Then, the bubble suspension was produced by emulsifying the gas using a homogenizer (15000 rpm, 5 minutes).
  • a bubble suspension was prepared in the same manner as above except that the molar ratio of DSPC, DSPG and DSPE-PEG 2000 -OMe in the anionic lipid solution was changed as follows.
  • a bubble suspension was prepared in the same manner as above except that the molar ratio of DSPC, DSPG and DSPE-PEG 2000 -OMe in the anionic lipid solution was changed as follows.
  • FIG. 2 is a diagram showing the persistence of nanobubbles when the coating component ratio is variously changed.
  • the bubble needs to be retained and stable in the blood vessel and in the tumor.
  • the bubble preparation according to the present invention is more time consuming than the bubble preparation according to the comparative example.
  • the retention was very good.
  • Example 2 ⁇ Continuous imaging in cancer-bearing mice> Next, the possibility of continuous oscillation was observed with diagnostic ultrasound in cancer-bearing mice, and blood flow imaging was taken.
  • Nanobubbles are brought into contact with perfluoropropane gas while stirring an anionic lipid solution formed of DSPC, DSPG and DSPE-PEG 2000 -OMe in a molar ratio of 22:68:10 to form a suspension. Thereafter, the organic phase was emulsified into an aqueous phase using a homogenizer (15000 rpm, 5 minutes). Next, a bubble preparation was prepared in the same manner as described above except that perfluorobutane gas was used.
  • Ultrasonic imaging was performed using a diagnostic ultrasonic device to determine whether the nanobubbles reached the tumor site.
  • LOGIQ E9 from GE Healthcare was used as the diagnostic ultrasonic device.
  • FIG. 3 is a diagram showing ultrasonic imaging images in the case of time lapse in the sonazoid (comparative example), the perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation, and the perfluorobutane gas-enclosed bubble preparation.
  • a stronger echo signal was observed from the tumor site than in the comparative example, and stable reachability of the present bubble preparation could be confirmed.
  • a strong echo signal could be observed over time.
  • FIG. 4 is a view showing an ultrasound imaging image when a tumor site is enlarged in a sonazoid (comparative example) and a perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation. As shown in FIG. 4, in this example, a stronger echo signal was observed from the tumor site than in the comparative example.
  • Example 3 ⁇ Ultrasound gene introduction> Next, we evaluated the function of the gene transfer system using perfluoropropane gas-filled bubble preparation (TB) and low-intensity ultrasonic irradiation.
  • TB perfluoropropane gas-filled bubble preparation
  • a perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation (50 nmol) according to the present example and a pDNA encoding a reporter gene (Luciferase) were administered to a mouse via the tail vein (100 ⁇ g), and immediately a part of the liver was transcutaneously.
  • US therapeutic ultrasonic irradiation
  • FIG. 5 is a graph showing an increase in luciferase activity.
  • luciferin substrate 15 mg / mL, 200 ⁇ L
  • FIG. 6 shows the results of in vivo luminescence imaging. As shown in FIGS. 5 and 6, the expression of luciferase was observed only from the liver irradiated with therapeutic ultrasonic waves.
  • the perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation (5 nmol / sample) according to this example and pDNA (5 ⁇ g / sample) encoding the reporter gene (Luciferase) were added to the Colon26 cultured cell solution for treatment.
  • pDNA 5 ⁇ g / sample
  • reporter gene Lucinerase
  • the perfluoropropane gas-encapsulated bubble preparation (TB) and the delivery system using ultrasonic irradiation for low-intensity treatment according to this example proved to be useful in cancer gene / nucleic acid therapy. did.
  • Example 4 ⁇ Creation of bubble preparation by shaking>
  • a bubble suspension was prepared by emulsifying gas using a homogenizer.
  • Example 4 shows the production of a bubble suspension by shaking.
  • Example 5 ⁇ Evaluation of binding ability of peptide-modified bubble prepared by homogenizer to target cells> DSPE-PEG 3400 modified with cyclic RGD (cRGD) was prepared as a peptide-modified lipid.
  • cRGD cyclic RGD
  • CRGD is a peptide sequence that specifically binds to ⁇ V ⁇ 3 integrin that is overexpressed on the surface of neovascular endothelial cells of cancer tissue. Targeting bubbles that bind to can be prepared.
  • HUVEC Human umbilical vein endothelial cells
  • cyclic RAD (cRAD) was used as a control peptide that does not bind to HUVEC.
  • the cRAD-modified bubble was prepared in the same manner as the cRGD-modified bubble and was modified to 5 mol%.
  • CRGD or cRAD modified bubble (DiI label) was added to HUVEC cells and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the cells were washed, and the binding of bubbles to cells was evaluated with a flow cytometer. As shown in FIG. 9, the cRGDRG5 mol% modified bubble prepared by the homogenizer showed excellent binding to HUVEC cells compared to the cRAD 5 mol% modified bubble.
  • Example 6 ⁇ Evaluation of binding ability of peptide-modified bubble prepared by shaking to target cells>
  • Example 5 the binding property of peptide modified bubbles prepared using a homogenizer to HUVEC cells was shown.
  • Example 6 shows the binding property of peptide-modified bubbles prepared by shaking to HUVEC cells.
  • DSPE-PEG 3400 modified with cyclic RGD was prepared as a peptide-modified lipid.
  • DSPC: DSPG: DSPE-PEG 2000 -OMe: cRGD modified DSPE-PEG 3400 1 mL of 30: 60: 5: 5 or 30: 60: 0: 10 (molar ratio) liposome (lipid concentration: 0.5 mM) in a vial
  • the head space in the vial was replaced with perfluoropropane gas and cooled on ice. Thereafter, the mixture was shaken for 45 seconds with a vial shaker and cooled on ice again.
  • cRGD-modified bubbles In order to remove large bubbles, the vial was allowed to stand upside down for about 15 minutes, and the lower part of the bubble suspension was recovered to prepare cRGD-modified bubbles.
  • cRGD modification a modified bubble of 5 mol% modification and a modified bubble of 10 mol% modification were prepared.
  • cyclic RAD (cRAD) was used as a control peptide.
  • the cRAD-modified bubble was prepared by shaking in the same manner as the cRGD-modified bubble, and a 5 mol% modified bubble and a 10 mol% modified bubble were prepared.
  • cRGD or cRAD modified bubble (DiO label) was added to HUVEC cells and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the cells were washed, and the binding of bubbles to cells was evaluated with a flow cytometer.
  • the cRGD 5 mol% modified bubble prepared by shaking showed superior binding to HUVEC cells compared to the cRAD 5 mol% modified bubble.
  • the cRGD 10 mol% modified bubble prepared by shaking also showed excellent binding to HUVEC cells compared to the cRAD 10 mol% modified bubble.
  • mouse melanoma cells (B16BL6 cells) 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L / mouse were transplanted subcutaneously in the back of the C57BL / 6j mouse, 7 days after tumor bearing, 25 ⁇ L of bubble through a 5 ⁇ m filter was administered intratumorally, Immediately thereafter, ultrasonic waves were irradiated percutaneously toward the tumor.
  • the ultrasonic irradiation conditions were as follows. Device: sonitron2000 (Neppagene Corporation) Freqency: 1MHz Intensity: 4W / cm 2 Duty: 50% Time: 120sec Burst Rate: 2Hz
  • the tumor volume was calculated by the following formula: (tumor major axis ⁇ tumor minor axis ⁇ tumor minor axis) ⁇ 0.5 (mm 3 ), and the antitumor effect was evaluated using the tumor diameter as an index. As shown in FIG. 12, the excellent antitumor effect of the bubble according to this example was found.

Abstract

診断用超音波及び低強度治療超音波での超音波照射による対象組織の診断及び治療を可能とする、セラノスティクス用のバブル製剤を提供する。脂質からなる被膜と、被膜の内腔に封入されたガスと、からなる。被膜は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、及び、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-PEG2000）により形成されたアニオニック脂質である。ガス及び混合ガスは、パーフルオロプロパン又はパーフルオロブタンである。

Description

セラノスティクス用のバブル製剤（ＴＢ）及びその使用方法
　本発明は、対象組織の診断(Diagnostics)及び治療(Therapeutics)を可能とするセラノスティクス用のバブル製剤（TB）、及び、そのセラノスティクス用のバブル製剤の使用方法に関する。
　超音波造影剤は微小気泡の懸濁液であり、国内で使用されている超音波造影剤には主としてレボビスト(登録商標)とソナゾイド(登録商標)とがある。レボビストは心血管造影の診断として使用されており、ソナゾイドはクッパー細胞造影による肝癌の診断及び乳腺腫瘍の診断に使用されている。レボビストの被膜は糖質であるガラクトースで構成され、内部には空気が封入されている。ソナゾイドの被膜はリン脂質であるホスファチジルセリンナトリウムで構成され、内部にはペルフルブタンが封入されている。
　しかしながら、これらの超音波造影剤には治療を行う機能を有しておらず、臨床現場等からは更なる機能の充実性が要求されている。また、近年、診断（Diagnosis）と治療（Therapeutics）を融合したセラノスティクス(Theranostics)が注目を集めている。これは診断と治療を同時に行うシステムを示しており、DDSの分野においてもTheranostics製剤として高機能なナノキャリアー開発に注目が注がれている。
　臨床応用されている診断法のなかで、超音波は、非侵襲的、簡便、比較的低コスト、かつリアルタイムでの診断イメージングが取得可能という利点を有する。それゆえ超音波診断装置は、幅広い臨床領域で必要不可欠な診断手法となっている。超音波の物理的エネルギーは、すでに臨床現場において、診断のみならず治療にも適用されている。
　例えば、血管造影等の目的で臨床応用されている超音波造影剤であるマイクロバブルと超音波照射の併用により細胞内へ薬物や遺伝子を送達する方法が報告されている（非特許文献１，２）。この方法は、体外からの超音波照射によるマイクロバブルの圧壊（キャビテーション）を時間的・空間的に制御することで、超音波照射した部位にのみ効率良く導入可能であり、臓器・組織特異的に遺伝子・核酸を導入する方法として期待され、種々の組織でのin vitro、in vivoにおける遺伝子導入が報告されている。
　体にメスを入れること無く癌細胞を破壊するとして普及しつつある高強度焦点式超音波(HIGH INTENSITY FOCUSED ULTRASOUND：HIFU)治療は、高強度の超音波(例えば3000～5000W/cm2のエネルギー強度)を体外から体内の癌組織の一点に集めることにより、熱エネルギー（熱的作用）及びキャビテーション（非熱的作用）で癌組織を焼灼壊死させるというものである（特許文献１）。この作用は、焦点部位の約80～90℃になる熱エネルギーによる癌細胞の焼灼による癌細胞の破壊によるものである。
　しかしながら、HIFUでは１回に照射して焼灼できる範囲が例えば３mm×３mm×10mmであるため、焦点をずらしながら繰返し照射する必要がある。HIFUでは、焦点のズレは非常に危険を伴うため、MRIや超音波画像のガイド下で行われる。また皮膚や周辺部位が高温になるため、絶えず精密なコントロールと冷却時間を確保する必要がある。そのため通常２時間から４時間の治療時間が必要である。
　このようにHIFUは非侵襲的な治療法で理想的であるが、治療機能を有するバブル製剤を癌組織に存在させることができれば、HIFUで使用される高強度超音波よりも例えば1/100～1/500程度弱い低強度超音波で、バブルの存在する部位でのみキャビテーションによる癌治療が可能となりうる。
特表２００９－５３３１８８号公報
Mitragotri S, Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature Rev. Drug Discov. 2005; 4: 255-259. Lawrie A, Brisken AF, Francis SE, Cumberland DC, Crossman DC, Newman CM, Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery. Gene Ther., 2000; 7: 2023-2027.
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、低強度超音波照射による対象組織の診断及び治療を可能とする、セラノスティクス用のバブル製剤、及び、そのセラノスティクス用のバブル製剤の使用方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤（TB）は、脂質からなる被膜と前記被膜の内腔に封入されたガスとからなり、低強度治療用超音波を作用させることにより、対象組織の診断(Diagnostics)及び治療(Therapeutics)を可能とするセラノスティクス用のバブル製剤であって、前記被膜は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、及び、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）]（DSPE-PEG）を、22～60：30～68：4～12のモル比にて被覆され形成されたアニオニック脂質であり、前記ガスは、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、及び、パーフルオロヘキサンの少なくとも何れか又は混合ガスを含有することを特徴とする。
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤（TB）の使用方法は、本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤が注射用水に懸濁されている懸濁液を対象組織に導入し、第１の周波数からなる診断用超音波を対象組織に作用させることにより対象組織の造影による診断(Diagnostics)を行い、第２の周波数からなる低強度治療用超音波を対象組織に作用させることによりキャビテーション現象による対象組織の治療(Therapeutics)を行うことを特徴とする。
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤は、従来のマイクロバブルに比べて、診断用超音波照射により壊れること無く長時間の共振・共鳴が可能であるため、長時間の連続超音波造影が可能である。また、本発明によれば、低強度治療超音波照射による対象組織の診断及び治療が可能となる。低強度の集束治療超音波（Low Intensity Focused Ultrasound, LOFU）を用いれば、焦点部位の温度は上がらず安全性が高い。これにより安全性の高い血栓の早期診断・治療、脳機能疾患や腎臓疾患の低侵襲的な治療に向けた超音波セラノスティクスシステムの構築が期待できる。
本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤の製造工程を示す図である。 被膜成分割合を種々変更した場合におけるバブル製剤の持続性を示す図である。 ソナゾイド(比較例)、パーフルオロプロパンガス封入バブル製剤、及び、パーフルオロブタンガス封入バブル製剤において、時間経過の場合の超音波イメージング画像を示す図である。 ソナゾイド(比較例)、及び、パーフルオロプロパンガス封入バブル製剤において、腫瘍部位を拡大した場合における超音波イメージング画像を示す図である。 in vivo　肝臓へのルシフェラーゼ遺伝子導入におけるルシフェラーゼ活性の上昇を示す図である。 in vivo　肝臓へのルシフェラーゼ遺伝子導入における発光イメージングの結果を示す図である。 in vitro　colon26 培養細胞に対するルシフェラーゼ遺伝子導入におけるルシフェラーゼ活性の上昇を示す図である。 シェイキングにより作成したバブル製剤の写真図である。 ホモジナイザーにより調製したcRGD 5モル％修飾バブルのHUVEC細胞への結合性を示す図である。 シェイキングにより調製したcRGD 5モル％修飾バブルのHUVEC細胞への結合性を示す図である。 シェイキングにより調製したcRGD 10モル％修飾バブルのHUVEC細胞への結合性を示す図である。 本実施例にかかるバブル製剤の抗腫瘍効果を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　１.<セラノスティクス用のバブル製剤>
　本実施形態にかかるセラノスティクス用のバブル製剤は、脂質からなる被膜と、この被膜の内腔に封入されたガスとからなる。
　被膜は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、及び、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）]（DSPE-PEG）を、22～60：30～68：4～12のモル比にて形成されたアニオニック脂質である。
　ガスはパーフルオロ炭化水素ガスであり、具体的にはパーフロオロプロパン、パーフロオロイソブタン、及び、パーフロオロノルマルブタンの少なくとも何れか又はこれらの混合ガスを含有する。特に好ましいパーフルオロ炭化水素ガスは、日本では医療用として購入できるため、パーフルオロプロパンである。なお、これら以外のパーフルオロ炭化水素を包含することも可能で有り、具体的には例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロイソオクタン、パーフルオロノルマルオクタン、及び六フッ化イオウである。充填されるガスの圧力としては、例えば0.1～1.0ＭＰａ程度である。
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤は、リン脂質とPEG-脂質によって疎水性のフルオロカーボンガスを包み込んだ微少気泡であり、液体中に直径500nm～5μmの泡状体で存在する。セラノスティクス用のバブル製剤の直径は、例えば動的光散乱法により測定される。
　被膜は、DSPC、DSPG及びDSPE-PEGを22～60：30～68：4～12のモル比にて形成されることにより、パーフルオロ炭化水素の保持性が高まり、診断用超音波の照射で崩壊すること無く持続的な共振・共鳴を示し、これにより長時間の連続超音波造影が可能となる。
　なお、被膜を構成するDSPC、DSPG及びDSPE-PEGにおいて、DSPE以外に下記に示すリン脂質とすることも可能である。即ち、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン(DAPE)又はジリノレイルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)等のホスファチジルエタノールアミン；ジラウロイル－ホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイル－ホスファチジルコリン(DMPC)、ジパルミトイル－ホスファチジルコリン(DPPC)、ジアラキドイル－ホスファチジルコリン(DAPC)、又はジオレイル－ホスファチジルコリン(DOPC)等のホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルセリン(DMPS)、ジアラキドイルホスファチジルセリン(DAPS)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)、ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)、ジオレイルホスファチジルセリン(DOPS)等のホスファチジルセリン；ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)、ジミリストイルホスファチジン酸(DMPA)、ジステアロイルホスファチジン酸(DSPA)、ジアラキドイルホスファチジン酸(DAPA)及びそのアルカリ金属塩等のホファチジン酸誘導体；ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)及びそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)及びそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)及びそのアルカリ金属塩、ジオレイル－ホスファチジルグリセロール(DOPG)等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルイノシトール(DLPI)、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール(DAPI)、ジミリストイルホスファチジルイノシトール(DMPI)、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール(DPPI)、ジステアロイルホスファチジルイノシトール(DSPI)、ジオレイルホスファチジルイノシトール(DOPI)等のホスファチジルイノシトールが挙げられる。
　また、被膜を構成するDSPC、DSPG及びDSPE-PEGにおいて、DSPE-PEG以外にステアリルPEG、パルミトイルPEG、オレイン酸PEG、ミリスチルPEG、ラウロイルPEG等も挙げられる。
　PEGの分子量は500～12000が挙げられる。DSPE-PEGは好ましくはDSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000又はDSPE-PEG5000であり、特に好ましくはDSPE-PEG2000である。
　なお、被膜には、DSPC、DSPG及びDSPE-PEG以外に更に付加して下記に示すリン脂質を包含させることも可能である。即ち、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジラウロイルホスファチジルコリン（DLPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール（DLPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（DLPE）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジラウロイルホスファチジルセリン（DLPS）、ジミリストイルホスファチジルセリン（DMPS）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）、ジリノレオイルホスファチジルセリン等のホスファチジルコリン等が挙げられる。
　また、被膜には、前述のリン脂質以外に、例えばグリセロ糖脂質やスフィンゴ糖脂質を包含させることも可能である。グリセロ糖脂質は、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質は、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。
　被膜の脂質表面に、標的細胞、標的組織、標的病巣に対するリガンドが修飾されていることも可能である。リガンドは、例えば、血栓に対するリガンドとしてArginine-Glycine-Aspartic acid(RGD)配列ペプチド、Sigma Protein等が挙げられ、癌細胞に対するリガンドとしてトランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース又はマンノースが挙げられる。またモノクローナル抗体やポリクローナル抗体もリガンドとして使用できる。好ましくはRGDペプチドであり、RGDペプチドは、特定の細胞や血栓上に存在する細胞接着因子に特異的に結合する機能を持つ。そのため被膜の脂質表面にRGDペプチドを修飾させることにより、血栓の可視化を更に容易とすることが可能となる。
　被膜の脂質表面にリガンドを修飾させるために、被膜は、DSPC、DSPG及びDSPE-PEG誘導体とすることが好ましい。例えば、DSPE-PEG-Maleimide(MAL)、DSPE-PEG-Carboxylic Acid(COOH)、DSPE-PEG-N-Hydroxysuccinimide(NHS)又はDSPE-PEG-NH2とすることが好ましい。
　被膜には、必要に応じ他の物質を加えることもでき、例えば膜安定化剤としてシトステロール、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、ラノステロール、１－Ｏ－ステロールグルコシド、１－Ｏ－ステロールマルトシド、及びこれらの混合物を含有させることができる。
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤の被膜の内部には薬物を内包又は表面吸着させることも可能である。薬物は、長期間血中濃度が維持されることが望まれる薬物又は特定の疾患部位や細胞への標的指向性を意図した投与が必要な薬物等が好ましい。薬物は、特に限定されるものではないが、例えば抗癌剤、抗生物質、抗喘息薬、抗血栓剤、抗原虫薬、免疫賦活剤、ペプチド系薬物、抗ウイルス薬である。
　抗癌剤は、特に限定されるものではないが、例えばドキソルビシン、シスプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、５－フルオロウラシル、メソトレキサート、ナイトロジェンマスタード、ブスルファン、オギザリプラチン、タキソール、カンプトテシン等である。抗生物質は例えばスルファゼン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン等である。抗喘息薬は例えばテオフィリン等である。抗血栓剤は、例えば、ｔPA、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、ストレプトキナーゼ等である。抗原虫薬は例えばアンチモン酸メグルミン等である。免疫賦活剤は例えばムラミルペプチド類等である。ペプチド系薬物は例えば、天然型又は遺伝子組み換え型のα、β、γ－インターフェロン、インターロイキン、スーパーオキシドデスムターゼ等である。その他にも薬物として、例えばプロスタグランジン等の動脈硬化症治療薬、動脈閉塞症、バーチャ病に対するＮＦカッパーＢ、デコイ等が挙げられる。
　また、セラノスティクス用のバブル製剤の内部には薬物のみならず遺伝子類を内包又は表面吸着させることも可能である。遺伝子類は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ、治療用オリゴヌクレオチド等である。
　２.<セラノスティクス用のバブル製剤の製造方法>
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤は、図１に示されるように、脂質溶液を、懸濁液を生成するように撹拌しながらパーフルオロ炭化水素ガスに接触させ、その後、ホモジナイザー(15000 rpm, 5分)を用いて有機相を水性相に乳化することにより、ナノバブル懸濁液として製造可能である。
　また、本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤は、ホモジナイザーにより調製するのみならず、例えばシェイキングにより調製することも可能である。例えば、所定比率のリポソーム溶液をバイアルに入れ、バイアルシェーカーで振とうしてナノバブル懸濁液を製造することも可能である。
　３.<凍結乾燥粉末体>
　本実施形態にかかる凍結乾燥粉末体は、本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤が、トレハロース又はスクロースである糖質の溶液に懸濁している懸濁液を凍結乾燥させて得られる凍結乾燥粉末体である。
　凍結乾燥の際に、凍結保護及び／又は分散保護のために凍結乾燥添加剤を含有させておくことも可能である。凍結乾燥添加剤としては、例えば、グリシンのようなアミノ酸；マンニトール、マルトース、グルコース、ラクトース、イヌリン、スクロース、トレハロース又はシクロデキストリンのような糖類；デキストラン、キトサンのような多糖；又はポリエチレングリコールのようなポリオキシアルキレングリコール等が挙げられる。
　この凍結乾燥粉末体により３ヶ月以上の長期の保存が可能となり、注射用水と、上述したパーフルオロプロパン等のパーフルオロ炭化水素ガスにより復元して使用することが可能である。
　４.<セラノスティクス用のバブル製剤（TB）の使用方法>
　本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤は、下記のように使用する。即ち、本発明にかかるセラノスティクス用のバブル製剤が注射用水に懸濁されている懸濁液を対象組織に導入する。対象組織は特に限定されるものではないが、例えば癌組織である。
　次に第１の周波数からなる診断用超音波を対象組織に作用させることにより対象組織の造影による診断を行う。第１の周波数は例えば3MHz～20MHzである。第１の周波数を作用させることによりMicrostreaming現象が生じる。即ち、超音波の音圧強度によりナノバブルが拡大・縮小を繰り返して局所的に振動する。
　次に第２の周波数からなる低強度超音波を対象組織に作用させることによりキャビテーション現象による対象組織の治療を行う。第２の周波数は例えば0.5MHz～3.0MHzである。キャビテーション現象は、ナノバブルが圧壊する時点で大きな圧力を放出し、ジェット流が生じるものである．
　第１の周波数による診断用超音波を対象組織に作用させることにより対象組織の造影が可能となり、造影できるということはその部位に向かって第２の周波数による低強度超音波又はLOFUを照射すればキャビテーションによる治療が可能となる。更に、低強度超音波又はLOFUのみの照射では焦点部位の温度は上がらないので、安全性の高い低侵襲的な治療が可能となる。
　実施例１.<セラノスティクス用のバブル製剤の作成>
　DSPC、DSPG及びDSPE-PEG2000-OMeを22：68：10のモル比のアニオニック脂質溶液を、懸濁液を生成するように撹拌しながらパーフルオロプロパンガス(ガス流量は12ml/分)に接触させた。その後、ホモジナイザー(15000 rpm, 5分)を用いてガスを乳化することにより、バブル懸濁液を作製した。
　続いてアニオニック脂質溶液におけるDSPC、DSPG及びDSPE-PEG2000-OMeのモル比を下記のように変更した以外は、上記と同じようにバブル懸濁液を作製した。
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝30：60：10
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝36：54：10
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝45：45：10
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝54：36：10
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝60：30：10
　また比較例としてアニオニック脂質溶液におけるDSPC、DSPG及びDSPE-PEG2000-OMeのモル比を下記のように変更した以外は、上記と同じようにバブル懸濁液を作製した。
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝0：90：10
　DSPC：DSPG：DSPE-PEG2000-OMe＝90：0：10
　このようにして被膜成分割合を種々変更させて複数のバブル製剤を作製した。図２は、被膜成分割合を種々変更した場合におけるナノバブルの持続性を示す図である。バブルには血管内及び腫瘍内での滞留性及び安定性が必要であるが、図２に示されるように、比較例にかかるバブル製剤と比べて、本発明にかかるバブル製剤は時間が経過しても滞留性が極めて良好であった。
　実施例２.<担がんマウスでの持続的造影>
　次に、担がんマウスでの診断用超音波で持続的なオシレーションの可能性を観察し、血流イメージングを撮影した。
　ナノバブルは、DSPC、DSPG及びDSPE-PEG2000-OMeを22：68：10のモル比にて形成されたアニオニック脂質溶液を、懸濁液を生成するように撹拌しながらパーフルオロプロパンガスに接触させ、その後、ホモジナイザー(15000 rpm, 5分)を用いて有機相を水性相に乳化することにより作製した。次に、パーフルオロブタンガスを使用する以外は上記と同様にしてバブル製剤を作製した。
　ナノバブルが腫瘍部位に到達されているかを、診断用超音波装置を用いて超音波イメージングを行った。診断用超音波装置はGE Healthcare社のLOGIQ E9を使用した。
　図３は、ソナゾイド(比較例)、パーフルオロプロパンガス封入バブル製剤、及び、パーフルオロブタンガス封入バブル製剤において、時間経過の場合の超音波イメージング画像を示す図である。図３に示されるように、本実施例においては比較例と比べて腫瘍部位から強いエコーシグナルが観察され、本バブル製剤の安定な到達性が確認できた。また本実施例においては時間経過しても強いエコーシグナルが観察できた。
　図４は、ソナゾイド(比較例)、及び、パーフルオロプロパンガス封入バブル製剤において、腫瘍部位を拡大した場合における超音波イメージング画像を示す図である。図４に示されるように、本実施例においては比較例と比べて腫瘍部位から強いエコーシグナルが観察された。
　実施例３.<超音波遺伝子導入>
　次にパーフルオロプロパンガス封入バブル製剤（TB）と低強度超音波照射併用による遺伝子導入システムの機能評価を行った。In vivo 実験では、本実施例にかかるパーフルオロプロパンガス封入バブル製剤(50nmol)と、レポーター遺伝子(Luciferase)をコードしたpDNAとともにマウスに尾静脈投与し(100μg)、ただちに経皮的に肝臓の部分をソニトロン プローブ(12nm)を使用して治療用超音波照射(US)（１MHz, 50% duty, １W/cm2, 60sec.）した。図５はルシフェラーゼ活性の上昇を示す図である。in vivo発光イメージングでは、イソフルラン麻酔下のマウスに対してルシフェリン基質(15 mg/mL, 200μL)を投与後、IVISイメージングシステムを用いて、発光を検出、定量化した。図６はin vivo発光イメージングの結果を示す図である。図５及び図６に示されるように、治療用超音波を照射した肝臓からのみルシフェラーゼの発現が観察された。
　In vitro実験では、Colon26培養細胞液中に本実施例にかかるパーフルオロプロパンガス封入バブル製剤(５nmol/sample)と、レポーター遺伝子(Luciferase)をコードしたpDNA(５μg/sample)をともに添加し、治療用超音波照射（２MHz, 50% duty, ２W/cm2, 60sec.）した。図７が示すように、パーフルオロプロパンガス封入バブル製剤と治療用超音波照射でのみ、顕著な遺伝子発現が観察された。
　これにより、本実施例にかかるパーフルオロプロパンガス封入バブル製剤（TB）と低強度治療用超音波照射によるデリバリーシステムは、癌の遺伝子・核酸治療においての有用性を期待できるものであることが判明した。
　実施例４.<シェイキングによるバブル製剤の作成>
　実施例１ではホモジナイザーを用いてガスを乳化することにより、バブル懸濁液を作製した。実施例４ではシェイキングによるバブル懸濁液の作製を示す。
　DSPC:DSPG:DSPE-PEG2000-OMe＝30：60：10（モル比）のリポソーム（脂質濃度：0.5mM)１ｍLをバイアルに入れ、バイアル内のヘッドスペースをパーフルオロプロパンガスで置換し、氷冷した。その後、バイアルシェーカーで45秒間振とうし、再度氷冷した。大きな気泡を除去する目的で、バイアルを逆さに15分間ほど静置し、図８に示されるように、気泡懸濁液の下部を回収した。
　実施例５.<ホモジナイザーにより調製したペプチド修飾バブルの標的細胞への結合性評価>
　ペプチド修飾脂質としてcyclic RGD(cRGD)で修飾したDSPE-PEG3400を用意した。なお、cRGDはがん組織の新生血管内皮細胞の表面上に過剰発現しているαVβ3インテグリンに特異的に結合するペプチド配列であり、バブル表面に修飾することで、標的細胞に選択的に結合するターゲティング型バブルを調製できる。そしてDSPC:DSPG:DSPE-PEG2000-OMe: cRGD修飾DSPE-PEG3400＝30:60:5:5（モル比）のアニオニック脂質溶液を、懸濁液を生成するように撹拌しながらパーフルオロプロパンガス(ガス流量は12ml/分)に接触させた。その後、ホモジナイザー(15000 rpm, 5分)を用いてガスを乳化することによりバブル懸濁液を作製してcRGD修飾バブルを用意した。cRGD修飾は5モル％修飾とした。
　標的細胞としてヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いた。このHUVECはcRGDが結合する細胞である。
　一方、HUVECに結合しないコントロールペプチドとしてcyclic RAD(cRAD)を用いた。cRAD修飾バブルは、cRGD修飾バブルと同様にして作成し、5モル％修飾とした。
　HUVEC細胞に、cRGD又はcRAD修飾バブル（DiIラベル）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメーターにてバブルの細胞への結合を評価した。図９に示されるように、ホモジナイザーにより調製したcRGD 5モル％修飾バブルは、cRAD 5モル％修飾バブルと比較してHUVEC細胞への優れた結合性を示した。
　実施例６.<シェイキングにより調製したペプチド修飾バブルの標的細胞への結合性評価>
　実施例５ではホモジナイザーを用いて作製したペプチド修飾バブルのHUVEC細胞への結合性を示した。実施例６ではシェイキングで作製したペプチド修飾バブルのHUVEC細胞への結合性を示す。
　実施例５と同様に、ペプチド修飾脂質としてcyclic RGD(cRGD)で修飾したDSPE-PEG3400を用意した。そしてDSPC:DSPG:DSPE-PEG2000-OMe: cRGD修飾DSPE-PEG3400＝30:60:5:5又は30:60:0:10（モル比）のリポソーム（脂質濃度：0.5mM)１ｍLをバイアルに入れ、バイアル内のヘッドスペースをパーフルオロプロパンガスで置換し、氷冷した。その後、バイアルシェーカーで45秒間振とうし、再度氷冷した。大きな気泡を除去する目的で、バイアルを逆さに15分間ほど静置し、気泡懸濁液の下部を回収してcRGD修飾バブルを用意した。cRGD修飾は5モル％修飾の修飾バブルと、10モル％修飾の修飾バブルとを用意した。
　実施例５と同様に、コントロールペプチドとしてcyclic RAD(cRAD)を用いた。cRAD修飾バブルは、cRGD修飾バブルと同様にシェイキングにより作成し、5モル％修飾の修飾バブルと、10モル％修飾の修飾バブルとを用意した。
　次に、HUVEC細胞に、cRGD又はcRAD修飾バブル（DiOラベル）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメーターにてバブルの細胞への結合を評価した。図１０に示されるように、シェイキングにより調製したcRGD 5モル％修飾バブルは、cRAD 5モル％修飾バブルと比較してHUVEC細胞への優れた結合性を示した。また、図１１に示されるように、シェイキングにより調製したcRGD 10モル％修飾バブルも、cRAD 10モル％修飾バブルと比較してHUVEC細胞への優れた結合性を示した。
　実施例７.<抗腫瘍効果の評価>
　DSPC:DSPG:DSPE-PEG2000-OMe＝30:60:10（モル比）のアニオニック脂質溶液を、懸濁液を生成するように撹拌しながらパーフルオロプロパンガス(ガス流量は12ml/分)に接触させた。その後、ホモジナイザー(15000 rpm, 5分)を用いてガスを乳化することによりバブル懸濁液を作製した。そしてこのバブル懸濁液を凍結乾燥させて凍結乾燥粉末体を得た。この凍結乾燥粉末体に2mLの超純水(2mL MilliQ)を添加して懸濁させた。
　次に、マウスメラノーマ細胞(B16BL6細胞)1×106 cells/50μL/匹をC57BL/6jマウス後背部皮下に移植し、担がん7日後、5μmフィルターを通したバブル25μLを腫瘍内投与し、その直後に腫瘍に向けて経皮的に超音波を照射した。
　超音波照射条件は、下記であった。
装置：sonitron2000(ネッパジーン株式会社)
Freqency：1MHz
Intensity：4W/cm2
Duty：50%
Time：120sec
Burst Rate：2Hz
　腫瘍体積は、（腫瘍の長径×腫瘍の短径×腫瘍の短径)×0.5(mm3)なる計算式により算出し、腫瘍径を指標に抗腫瘍効果を評価した。図１２に示されるように本実施例にかかるバブルの優れた抗腫瘍効果が判明した。
　血栓治療又は癌治療に利用できる。

Claims (10)

  1. 　脂質からなる被膜と、前記被膜の内腔に封入されたガスとからなり、診断用超音波と低強度治療用超音波を作用させることにより、対象組織の診断(Diagnostics)及び治療(Therapeutics)を可能とするセラノスティクス用のバブル製剤であって、
    　前記被膜は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、及び、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）]（DSPE-PEG）を、22～60：30～68：4～12のモル比にて形成されたアニオニック脂質であり、
    　前記ガスは、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、及び、パーフルオロヘキサンの少なくとも何れか又は混合ガスを含有することを特徴とするセラノスティクス用のバブル製剤。
  2. 　前記被膜は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)とジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、及び、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトオキシ（ポリエチレングリコール）]（DSPE-PEG）を、30：60：10の重量比にて形成されたアニオニック脂質であり、
    　前記ガスはパーフルオロプロパンであることを特徴とする請求項１に記載のセラノスティクス用のバブル製剤。
  3. 　前記低強度治療用超音波は0.03～50W/cm2のエネルギー強度であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラノスティクス用のバブル製剤。
  4. 　直径が500nm～5μmである請求項１乃至３の何れか１項に記載のセラノスティクス用のバブル製剤。
  5. 　前記被膜は、DSPC、DSPG及びDSPE-PEG誘導体であり、
    　前記DSPE-PEG誘導体は、DSPE-PEG-MAL、DSPE-PEG-COOH、DSPE-PEG-NHS又はDSPE-PEG-NH2であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のセラノスティクス用のバブル製剤。
  6. 　前記被膜の脂質表面にリガンドが修飾されており、
    　前記リガンドは、Arginine-Glycine-Aspartic acid(RGD)配列ペプチド、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース又はマンノースであることを特徴とする請求項５に記載のセラノスティクス用のバブル製剤。
  7. 　請求項１乃至６の何れか１項に記載のセラノスティクス用のバブル製剤が、トレハロース、イヌリン又はスクロースである糖質の溶液に懸濁している懸濁液を凍結乾燥させて得られる凍結乾燥粉末体。
  8. 　請求項１乃至６の何れか１項に記載のセラノスティクス用のバブル製剤が注射用水に懸濁されている懸濁液を対象組織に導入し、
    　第１の周波数からなる造影用超音波を対象組織に作用させることにより対象組織の造影による診断(Diagnostics)を行い、
    　第２の周波数からなる低強度超音波又は低強度収束超音波を対象組織に作用させることによりキャビテーション現象による対象組織の治療(Therapeutics)を行うことを特徴とするセラノスティクス用のバブル製剤の使用方法。
  9. 　前記第１の周波数は3.0MHz～20MHzであり、前記第２の周波数は0.5MHz～3.0MHzであることを特徴とする請求項８に記載のセラノスティクス用のバブル製剤の使用方法。
  10. 　前記対象組織は癌組織であることを特徴とする請求項８又は９に記載のセラノスティクス用のバブル製剤の使用方法。
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