JP2010260828A - リポソーム、リポソームの製造方法、及び医薬組成物 - Google Patents
リポソーム、リポソームの製造方法、及び医薬組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明に係るリポソームは、パーフルオロ炭化水素を内包する生体親和性のミセルを内包する。ミセル内部のパーフルオロ炭化水素は、例えばパーフルオロノルマルペンタンである。リポソーム表面にはトランスフェリンが修飾されている。リポソーム内部には、音響化学活性物質としてドキソルビシンが含有されている。
【選択図】図1
Description
ポリエチレングリコール(数平均分子量750)−ポリ乳酸(数平均分子量1000)ブロックポリマーを1.3mg/mlと、120mM硫酸アンモニウムを50mlと、パーフルオロノルマルペンタンを200μlとを混合させ、その混合液をナノマイザー(吉田機械興業(株))にて超高圧分散して乳化処理をした。圧力は35MPa、温度は20℃、加圧処理時間は10分であった。このようにして形成されたパーフルオロ炭化水素内包ミセルの直径は、図3に示すように69.5±16.9nmであった。なお、パーフルオロ炭化水素内包ミセルの直径は大塚電子株式会社のゼータ電位・粒径測定システムを使用して測定した。
マウス結腸癌Colon26細胞に対して、実施例1にて製造したリポソームの結合性と、トランスフェリンによる修飾がなされていないリポソーム(Bare-Liposome)の結合性とを比較した。Bare-Liposomeは、トランスフェリン修飾をしない以外は上述の実施例1と同様の製造方法にして製造した。蛍光標識は、ニトロベンゾキサゾールジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(NBD-PE)を使用した。この比較結果を図7(a)に示す。トランスフェリン修飾がなされているリポソームのマウス結腸癌Colon26細胞に対する結合性が確認された。
実施例1にて製造したリポソームに、照射強度1W/cm2、周波数1MHzの超音波を15秒間照射した。図8(a)は超音波照射の前を示す写真であり、図8(b)は超音波照射の後を示す写真である。図8(b)に示すように、超音波照射により、パーフルオロ炭化水素内包ミセルに内包されていたパーフルオロノルマルペンタンの気泡の発生が確認された。気泡の直径は50μm前後であった。直径は、顕微鏡観察写真内で無作為に抽出した150個の気泡の直径の平均から計算した。
次に、実施例1にて製造したリポソームについて、超音波診断装置による超音波造影を行った。図9(a)は、実施例1にて製造したリポソームの超音波照射の前を示す写真であり、図9(b)は、実施例1にて製造したリポソームの超音波照射の後を示す写真であり、図9(c)は、PBSコントロールの超音波照射の前を示す写真であり、図9(d)は、PBSコントロールの超音波照射の後を示す写真である。超音波照射は、照射強度1W/cm2、周波数1MHzの超音波を15秒間行った。図9(b)に示すように、実施例1にて製造したリポソームの超音波造影能が確認された。
次に、実施例1で製造したリポソームに対して超音波照射を行い、発生するキャビテーションによる発熱を熱電対で測定した。超音波照射は、照射強度1000W/cm2、周波数3.35MHz、照射時間30秒であった。実施例1のリポソームの発熱と、PBSの場合の発熱と、無処置の場合(超音波照射無し)の発熱とにおける測定結果を図10に示す。本実施例のリポソームは無処置の場合と比較して、約20℃程度の温度上昇が確認された。これにより、本実施例のリポソームは、腫瘍組織の加熱凝固治療に有益であることが示された。
次に、実施例1で製造したリポソームに超音波照射し、ドキソルビシンによる一重項酸素の発生を通常の手法に従いルミノール反応にて確認した。一重項酸素は反応性に富み、強い酸化作用により腫瘍細胞に傷害を与える。また、生体内における一重項酸素の寿命は非常に短く、影響を及ぼす範囲はそれが生成した局所に限定されるので、腫瘍細胞のみに傷害を与え、それ以外の健康部位には傷害を与えない。超音波の照射条件は、照射強度1W/cm2、周波数1MHz、照射時間15秒間であった。一重項酸素の生成結果を図12に示す。コントロールはPBSである。本実施例に係るリポソームは、ローズベンガルやメチレンブルー溶液と比較しても高い一重項酸素の生成が確認された。
次に、実施例1で製造したリポソームを担癌マウスに投与し、超音波照射による抗腫瘍効果を調べた。担癌マウスは、健康な実験用マウスの後背部にColon26細胞を1×106cells/100μl注入して作成した。リポソームの投与は、Colon26細胞を実験用マウスに投与してから4日後に注入した。超音波の照射条件は、照射強度600W/cm2、周波数3.35MHz、照射時間120秒間であった。超音波照射後に、腫瘍径を計測した。一方で、超音波照射のみの場合と無処理の場合(リポソーム注入も、超音波照射もしていない場合)とについても、同様に作成した担癌マウスに同じ超音波条件で超音波照射して腫瘍径を計測した。この結果を図13に示す。図13に示すように、本実施例のリポソームを注入して超音波照射した場合は、腫瘍体積が著しく減少していることが判明した。
200:膜
300:リガンド
400:薬物
500:ガラスフィルター装置
520:薄膜
530:ナノフィルター
540:排出口
900:リポソーム
Claims (12)
- 生体親和性且つ両親媒性のミセル外殻形成物質と、分散液と、パーフルオロ炭化水素とを含有する混合物を超高圧乳化分散機にて乳化分散させて、前記パーフルオロ炭化水素を内包する生体親和性のミセルであるパーフルオロ炭化水素内包ミセルを形成するミセル化工程と、前記パーフルオロ炭化水素内包ミセルを内包するリポソームを形成するリポソーム形成工程とを有することを特徴とするリポソームの製造方法。
- 前記リポソーム形成工程は、脂質の薄膜をナノフィルターの一方の面に貼り付け、分散液に分散させた前記パーフルオロ炭化水素内包ミセルを前記脂質の薄膜及び前記ナノフィルターを通過させることで、前記脂質をリポソーム膜とするリポソームを形成することを特徴とする請求項1記載のリポソームの製造方法。
- 前記リポソームの外表面に、標的細胞、標的組織又は標的病巣に対するリガンドを結合させてリガンド修飾リポソームを得るリガンド結合工程を有することを特徴とする請求項1又は2記載のリポソームの製造方法。
- 前記リガンドは、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のFab'フラグメント、又はペプチドであることを特徴とする請求項3記載のリポソームの製造方法。
- 前記リガンド修飾リポソームに薬物及び遺伝子の少なくとも何れか一つを封入する封入工程を有することを特徴とする請求項3又は4記載のリポソームの製造方法。
- 前記パーフルオロ炭化水素は、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフロオロプロパン、パーフロオロブタン、パーフロオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロヘプタン、及びパーフルオロオクタンの少なくとも何れか一つを含有することを特徴とする請求項1乃至5の何れか1項に記載のリポソームの製造方法。
- 前記リポソーム形成工程は、前記脂質の薄膜及び前記ナノフィルターを通過することにより形成されたリポソームを、超高圧乳化分散機にて粒子径を減少させることを特徴とする請求項2記載のリポソームの製造方法。
- パーフルオロ炭化水素を内包する生体親和性のミセルを内包するリポソーム。
- リポソーム表面に、標的細胞、標的組織又は標的病巣に対するリガンドを有することを特徴とする請求項8記載のリポソーム。
- 前記リガンドは、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のFab'フラグメント、又はペプチドであることを特徴とする請求項9記載のリポソーム。
- 更に薬物及び遺伝子の少なくとも何れか一つを内包することを特徴とする請求項8乃至10の何れか1項に記載のリポソーム。
- 請求項8乃至11の何れか1項に記載のリポソーム及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍を治療するための医薬組成物。
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