DE60111917T2

DE60111917T2 - Lyophilisierbares Kontrastmittel, gasgefüllte Mikrobläschen enthaltend

Info

Publication number: DE60111917T2
Application number: DE60111917T
Authority: DE
Inventors: Michel Schneider; Yan Feng; Jean Brochot; David Lazarus
Original assignee: Bracco International BV
Current assignee: Bracco Suisse SA
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: EP1228770A1; ES2243350T3; ATE299378T1; DK1228770T3; DE60111917D1; EP1228770B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten (oder dehydratisierten) Kontrastmittels, das ein Gas oder eine Gasmischung enthält, das bzw. die in der Ultraschallechographie, in der Nuklearmedizin oder in der Magnetresonanzbildgebung (MRI) brauchbar ist. Die Erfindung umfasst auch ein lyophilisiertes Kontrastmittel, das nach diesem Verfahren erhalten wird, sowie einen Zweikomponentenkit zur Wiederherstellung einer injizierbaren Suspension von mit Luft oder Gas gefüllten Mikrobläschen und ihre Verwendung als Kontrastmittel in der diagnostischen Bildgebung des menschlichen und tierischen Körpers.
Hintergrund der Erfindung
Die rasche Entwicklung der Ultraschallkontrastmittel in den vergangenen Jahren hat zu einer Reihe verschiedener Formulierungen geführt, die bei der Ultraschallbildgebung von Organen und Geweben des menschlichen oder tierischen Körpers brauchbar sind. Diese Mittel sind so aufgebaut, dass sie hauptsächlich als intravenöse oder intraarterielle, injizierbare Materialien zusammen mit der Verwendung von medizinischen Echographiegeräten verwendet werden sollen, die beispielsweise die Bildgebung im B-Modus (basierend auf der räumlichen Verteilung von Rückstreuungseigenschaften des Gewebes) oder Doppler-Signalverarbeitung (basierend auf Dauerschall oder gepulster Doppler-Verarbeitung von Ultraschallechos, um Blut- oder Flüssigkeitsströmungsparameter zu bestimmen) verwenden. Injizierbare Formulierungen, die als Ultraschallkontrastmittel brauchbar sind und Suspensionen von Gasmikrobläschen in wässrigen flüssigen Trägern enthalten, können im wesentlichen in zwei Kategorien unterteilt werden. Freie Gasbläschen gehören nicht in diese Kategorien, da sie nicht ausreichend stabil sind. Daher bestand ein Interesse an Verfahren zur Stabilisierung von Gasbläschen für die Echographie, oder anderen Ultraschallstudien, beispielsweise unter Verwendung von Emulgatoren, Ölen, Verdickern oder Zuckern, oder durch Mitreißen oder Verkapseln des Gases oder eines Vorläufers davon in einer Vielfalt von Systemen. Die erste Kategorie bilden wässrige Suspensionen, in denen die Gasmikrobläschen durch eine sehr dünne Hülle, die das Tensid beinhaltet, das an die Gas-an-Flüssigkeit-Grenzfläche gebunden ist, an der Gas/Flüssigkeits-Grenzfläche begrenzt sind. Die zweite Kategorie bilden Suspensionen, in denen die Mikrobläschen eine Hülle aus festem Material aufweisen, das aus natürlichen oder synthetischen Polymeren gebildet ist. Im letzteren Fall werden die gasgefüllten Partikel als Mikroballons bezeichnet. Es gibt noch eine weitere Sorte von Ultraschallkontrastmitteln: Suspensionen von porösen Polymerpartikeln oder anderen Feststoffen, die Gasmikrobläschen tragen, die in die Poren der Mikropartikel eingeschlossen sind. Diese Kontrastmittel werden hier als Variante der Mikroballonsorte angesehen. Mehr über diese unterschiedlichen Formulierungen findet sich in US-A-4,466,442 (EP-A-0 077 752/Schering), EP-A-0 123 235 (Schering), EP-A-0 324 938 (Widder et al.), US-A-5,271,928 (EP-A-0 474 833/Schneider et al.), US-A-5,711,933 (EP-A-0 458 745/Bichon et al.), US-A-4,900,540 (Ryan), US-A-5,230,882 (Unger), usw.
Die Verwendung von Suspensionen von Gasmikrobläschen in Trägerflüssigkeit als effiziente Ultraschallreflektoren ist in der Technik wohl bekannt. Die Entwicklung von Mikrobläschensuspensionen als Echopharmazeutika zur Verbesserung der Ultraschallbildgebung entsprach frühen Beobachtungen, dass rasche intravenöse Injektionen von wässrigen Lösungen dazu führen können, dass gelöste Gase sich unter Bildung von Bläschen aus der Lösung abscheiden. Wegen ihrer von Blut wesentlich verschiedenen akustischen Impedanz haben sich diese intravaskulären Gasbläschen als hervorragende Ultraschallreflektoren erwiesen. Das Injizieren von Suspensionen von Gasmikrobläschen in einer Trägerflüssigkeit in den Blutstrom eines lebenden Organismus verstärkt die Ultraschallechographiebildgebung in hohem Maße, wodurch die Visualisierung innerer Organe verbessert wird. Da die bildliche Darstellung von Organen und in der Tiefe befindlichen Geweben bei der medizinischen Diagnosestellung entscheidend sein kann, wurden viele Bemühungen auf die Entwicklung stabiler Suspensionen von hochkonzentrierten Gasmikrobläschen gerichtet, die gleichzeitig einfach herzustellen und zu verabreichen sind, eine minimale Menge an aktiven Spezies enthalten und sich lange lagern und einfach vertreiben lassen. Es wurden viele Versuche zur Herstellung von Lösungen unternommen, die diese Kriterien erfüllen, keine lieferte jedoch ein völlig befriedigendes Ergebnis.
Obwohl die Zusammensetzungen des Standes der Technik Vorzüge haben, leiden sie noch an mehreren Nachteilen, die ihre praktische Anwendung erschweren. Erstens haben einige Zusammensetzungen des Standes der Technik relativ kurze Lebenszeiten und zweitens haben sie eine relativ niedrige Anfangsbläschenzahl, z. B. zwischen 10⁴ und 10⁵ Bläschen/ml Dadurch werden die Reproduzierbarkeit und Analysen von Echographietests recht schwierig, die mit solchen Zusammensetzungen durchgeführt werden. Außerdem erzeugen einige Techniken Bläschen in einem weiten Bereich von Durchmessern (bis zu 50 μm), was ihre Verwendung als Echographiemittel in bestimmten Anwendungen verhindert, da die Echographie des linken Herzens und der allgemeinen Zirkulation Bläschengrößen kleiner als 8–10 μm erfordert.
Der Bedarf an stabilen Formulierungen von Mikrobläschen, die Druckvariationen im Blutstrom widerstehen und eine gute Lagerbarkeit haben, wird ferner durch die schlechte Stabilität einiger Zusammensetzungen des Standes der Technik erhöht. Mikrobläschenformulierungen, deren Verteilung und Lagerung unproblematisch ist, sind besonders wichtig.
Leicht herstellbare wässrige Suspensionen, die als Bildgebungsmittel in der Ultraschallechographie verwendbar sind, sind in US-A-5,271,928 (Schneider et al.) offenbart. Die Suspensionen enthalten filmbildende Tenside in laminarer und/oder lamellarer Form und gegebenenfalls hydrophile Stabilisatoren. Diese Mikrobläschen werden durch eine oder mehrere monomolekulare Schicht(en) amphipathischer Verbindungen stabilisiert, d. h. Verbindungen mit hydrophilen und hydrophoben Anteilen. Die Suspensionen werden erhalten, indem die laminarisierten Tenside Luft oder einem Gas ausgesetzt werden, bevor oder nachdem sie mit einer wässrigen Phase gemischt werden. Die Umwandlung filmbildender Tenside in Lamellenform wird gemäß verschiedenen Liposombildungstechniken durchgeführt, zu denen die Hochdruckhomogenisierung oder die Schallbehandlung mit akustischen oder Ultraschallfrequenzen gehören. Die beanspruchte Konzentration von Phospholipiden liegt zwischen 0,01% und 20%, und die Konzentration der Mikrobläschen liegt zwischen 10⁸ und 10⁹ Bläschen/ml. Das oben genannte Patent US-A-5,271,928 beinhaltet auch eine trockene Zusammensetzung, die nach Mischen mit einer wässrigen Trägerflüssigkeit eine sterile Suspension von Mikrobläschen bildet, die danach als Kontrastmittel für die Ultraschallechographie brauchbar ist. Diese trokkene feinpulverige Zusammensetzung enthält ein oder mehrere Tenside in laminarer Form und hydrolösliche Stabilisatoren.
US-A-5,445,813 (EP-B-0 619 743/Schneider et al.) basiert auf dem unerwarteten Fund, dass sehr stabile Suspensionen von gasgefüllten Mikrobläschen, die mindestens 10⁷ Mikrobläschen pro Milliliter enthalten, unter Verwendung von Phospholipiden als Stabilisatoren erhalten werden können, selbst wenn sehr niedrige Konzentrationen davon verwendet werden. Die als Kontrastmittel in der Ultraschallechographie verwendbaren Suspensionen werden erhalten, indem mindestens ein Phospholipid als Stabilisator der Mikrobläschen gegen das Kollabieren mit der Zeit und unter Druck in einem wässrigen Träger suspendiert wird, wobei die Konzentration der Phospholipide unter 0,01 Gew.-% liegt, jedoch gleich oder höher als diejenige ist, die vorliegt, wenn die Phospholipidmoleküle nur an der Gasmikrobläschen-Flüssigkeit-Grenzfläche vorhanden sind.
US-A-5,413,774 (EP-B-0 554 213, Schneider et al.) schlägt vor, dass man gasgefüllten Mikrovesikeln Beständigkeit gegen das Kollabieren unter Druck verleihen kann, indem man mindestens ein Gas in dieselben einbringt, dessen Löslichkeit in Wasser, ausgedrückt in Litern Gas/Liter Wasser unter Standardbedingungen, geteilt durch die Quadratwurzel seines Molekulargewichts 0,003 nicht überschreitet. Es wird angegeben, dass bevorzugte physiologisch verträgliche Gase Schwefelhexafluorid, verschiedene Freon^®s wie CF₄, CBrF₃, C₄F₈, CClF₃, CCl₂F₂, C₂F₆, C₂ClF₅, CBrClF₂, C₂Cl₂F₄, CCl₂F₂ und C₄Fl₁₀ einschließen. Solche Gase können unter anderem in Phospholipid enthaltenden Zusammensetzungen des Typs verwendet werden, der in der oben genannten US-A-5,271,928 beschrieben ist.
US-A-5,556,610 (WO-A-95/16467 (Yan et al.) offenbart die Verwendung von Ultraschallkontrastmedien, die eine Mischung der Gase A und B enthalten, wobei Gas B in einer Menge von 0,5 bis 41% Vol./Vol. vorhanden ist, ein Molekulargewicht größer als 80 Dalton hat und eine Wasserlöslichkeit unter 0,0283 ml/ml Wasser unter Standardbedingungen hat, wobei der Rest der Mischung Gas A ist.
Repräsentative Gase A sind Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid und Mischungen davon. Zu repräsentativen Gasen B gehören fluorhaltige Gase, wie Schwefelhexafluorid und verschiedene perfluorierte Kohlenwasserstoffe. Bevorzugte Stabilisatoren in solchen Kontrastmedien schließen Phospholipide ein.
Lagerung und Transport solcher Kontrastmittel werden erheblich effizienter gemacht, wenn die Mikrobläschen in getrockneter Form gelagert werden können. Die trockene Form benötigt keine Temperaturkontrolle und speziellen Lagerungseinrichtungen zur Lagerung und zum Transport. Das ist der Grund, warum die Lagerung lyophilisierter Kontrastmittel besonderes Interesse auf sich gezogen hat und sich viele Bemühungen darauf gerichtet haben.
Es ist beispielsweise durch WO-A-97/29782 (Nycomed) vorgeschlagen worden, dass ein gefriergetrocknetes Vesikel erhalten werden könnte, das ein Ultraschallkontrastmittel enthält, das einen Gefriertrocknungsstabilisator enthält und das bei Temperaturen über 20°C thermisch stabil ist. Der erfindungsgemäß verwendete Stabilisator kann ein physiologisch tolerierbarer Gefriertrocknungsstabilisator (oder eine Mischung) mit einer Glasübergangstemperatur (T_g) über 20°C und einem T_g ^–1-Wert von – 37°C oder darüber sein. Beispiele für geeignete Stabilisatoren schließen Sucrose, Maltose-H₂O, Trehalose, Raffinose und Stachyose ein.
Ein Zweck der Verpackung von Pharmazeutika liegt darin, einen adäquaten Produktschutz zu gewährleisten. Der Behälter bildet die Hauptbarriere, die zur Gewährleistung der Qualität während der Lagerungszeit des Produkts erforderlich ist. Bestimmte Produkte, speziell jene, die lyophilisiert sind, müssen auch vor Feuchtigkeit geschützt werden und müssen möglicherweise vor Sauerstoff geschützt werden. Kontrastmittel, die gasgefüllte Mikrobläschen enthalten, sind besonders lagerungsempfindlich. Die Lagerungsprobleme sind wässrigen Gassuspensionen immanent, die aufgrund ihrer Natur Phasentrennung oder -abscheidung, Koaleszenz der Gasbläschen, Gasdiffusion und nach langen Zeiträumen sogar Ausfällung verschiedener Additive zeigen.
Mikrobläschen enthaltende Kontrastmittel des Standes der Technik werden typischerweise hergestellt, indem gepulvertes Tensid, z. B. gefriergetrocknete oder sprühgetrocknete Phospholipidlösungen, mit Luft oder anderem Gas und danach mit wässrigem Träger in Kontakt gebracht und bewegt werden, um eine Mikrobläschensuspension zu erzeugen, die dann kurz nach ihrer Herstellung verabreicht werden muss. Solche Verfahren leiden jedoch unter den Nachteilen, dass erhebliche Bewegungsenergie aufgebracht werden muss, um die erforderliche Dispersion zu erzeugen, und dass die Größe und Größenverteilung der Mikrobläschen von der Menge der zugeführten Energie abhängt und in der Praxis nicht kontrolliert werden kann.
Es müssen außerdem zweckmäßige Behälter ausgewählt werden. Das Lagern lyophilisierter Kontrastmittel bei atmosphärischem Druck erfordert auch speziell angepasste Verbindungssysteme sowie Behälter. Die Verdünnung von lyophilisiertem Produkt mit einem gegebenen Volumen an wässrigem flüssigen Träger erzeugt einen Überdruck im Inneren des Behälters. Zweckmäßige Verbindungssysteme oder Adapter sind möglicherweise in WO-A-98/13006 (Biodome) sowie in US-A-4,787,898 (Raines) offenbart. Bei den obigen Adaptern muss eine Entlüftung in ihrer Struktur vorhanden sein, um den Druck des Behälters einzustellen, nachdem das Kontrastmittel verdünnt worden ist. Die genannten Vorrichtungen zum Versiegeln verschlossener Behälter und Adapter sind teuer und nicht sehr leicht handhabbar.
Es ist unlängst offenbart worden, dass Pharmazeutika auch in Behältern unter vermindertem Druck versiegelt werden können. Daukas et al. beschreiben im PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, Band 53(1), Seiten 31–39 (1999) Vergleichsverfahren zum Testen der Ingegrität von Ampullen für Lyophile, die unter verminderten Drücken versiegelt worden sind. Ein Vorteil des Versiegelns bei vermindertem Druck kann in der leichteren Wiederherstellung liegen, da das Vakuum Verdünnungsmittel in die Ampulle zieht. Buckley präsentiert im PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology. Band 48(4), Seiten 189–196 (1994) die Zeitabhängigkeit des Drucks in Lyophilisierungsampullen. Ampullen, die lyophilisierte Produkte enthalten, werden oft bei einem nominellen Kammerdruck Pc < 50 mtorr (1 torr = 1 mm Hg = 1,333 mbar) versiegelt, es können jedoch Ampullendrücke im Bereich von 2 bis 100 Torr auftreten. Eine Kontrolle der Lagerungsatmosphäre und eine Erleichterung des Auflösens von festen Produkten vor Gebrauch können auch andere Vorteile von unter vermindertem Druck versiegelten Behältern sein.
Weitere Probleme mit der Lagerung von Trockensuspensionen treten bei Ultraschallkontrastmitteln auf, die Phospholipide als Stabilisatoren der Gasmikrobläschen enthalten. Derartige getrocknete Produkte sind keine konventionellen Lyophile und haben daher ein spezifisches und inhärentes Verhalten. Aufgrund der Lagerung unter vermindertem Druck kann die Verdünnung gasgefüllter Mikrobläschen zu unwirksamen Kontrastmitteln führen. Ein weiteres wichtiges, zu lösendes Problem ist die Verhinderung der Veränderung der akustischen Eigenschaften (des echogenen Ansprechvermögens) nach der Verdünnung eines über lange Zeit unter vermindertem Druck gelagerten trockenen Pulvers zu einer wässrigen Suspension. Außerdem liegt eines der Hauptprobleme bei den verdünnten lyophilisierten Mikro bläschen in der Anwesenheit sehr großer Bläschen (> 10 μm). Um die Anwesenheit großer Bläschen zu vermeiden, liegt ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Kontrolle der Größe der Bläschen nach der Verdünnung. Bislang bleibt das Problem der Lagerung von Ultraschallkontrastmitteln, die Mikrobläschensuspensionen enthalten, daher ungelöst.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Kontrastmittels, das ein Gas oder eine Gasmischung enthält, die in der diagnostischen Bildgebung wie Ultraschallechographie, Magnetresonanzbildgebung oder Nuklearmedizin brauchbar ist. Die Erfindung umfasst auch ein lyophilisiertes Kontrastmittel, das nach diesem Verfahren erhalten worden ist, sowie einen Zweikomponentenkit zur Wiederherstellung einer injizierbaren Suspension von mit Luft oder Gas gefüllten Mikrobläschen und ihre Verwendung als Kontrastmittel in der diagnostischen Bildgebung des menschlichen und tierischen Körpers. Das Ziel der Erfindung liegt darin, eine längere Lagerung von getrocknetem Kontrastmittel unter vermindertem Druck zu ermöglichen und dennoch die Wiederherstellung stabiler Mikrobläschensuspensionen mit einem herabgesetzten Prozentsatz an großen Bläschen zu ermöglichen.
Ein Aspekt der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines in der diagnostischen Bildgebung brauchbaren Kontrastmittels, das Mikrobläschen eines Gases oder einer Gasmischung enthält, das durch Verdünnen eines lyophilisierbaren Materials in einem physiologisch verträglichen, flüssigen, wässrigen Träger erhalten wurde, welches durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem man ein lyophilisierbares Material, das in einem Behälter enthalten ist, lyophilisiert, wobei das lyophilisierbare Material mindestens ein filmbildendes Phospholipidtensid enthält, man den Behälter dicht verschließt. Bevor man den Behälter dicht verschließt, setzt man den Behälter unter Vakuum und bringt anschließend das Gas oder die Gasmischung unter einem verminderten Druck in den Behälter ein. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung liegt zwischen 900 und 100 mbar. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung liegt bevorzugt zwischen 700 und 300 mbar. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung beträgt besonders bevorzugt 500 mbar. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann der verminderte Druck unmittelbar vor dem Verdünnen mit einem verträglichen flüssigen Träger in den versiegelten Behälter eingebracht werden.
In der Erfindung kann das verdünnte Kontrastmittel ein Gas oder einen Gasvorläufer enthalten (z. B. eine Verbindung oder Mischung von Verbindungen, die bei normalen Körpertemperaturen (37°C) des Menschen im Wesentlichen gasförmig ist (einschließlich Dampf), d. h. C₅F₁₂, C₆F₁₄, usw.). Es kann jedes bioverträgliche Gas, jeder biologisch verträgliche Gasvorläufer oder jede biologisch verträgliche Mischung verwendet werden. Interessanterweise sei darauf hingewiesen, dass Gase oder Gasvorläufer wie Perfluorkohlenstoffe mit einem Siedepunkt nahe Raumtemperatur (d. h. C₅F₁₂ oder C₆F₁₄) erfindungsgemäß verwendet werden können. Einer der Vorteile des verminderten Drucks liegt darin, das Gas oder den Gasvorläufer in seinem Dampfzustand zu halten und somit jegliche Kondensation dieses Gases oder Gasvorläufers zu vermeiden. Das Gas kann somit beispielsweise Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff, Stickstoffoxid, ein Inertgas wie Helium, Argon, Xenon oder Krypton; radioaktive Gase wie ¹³³Xe oder ⁸¹Kr; ein hyperpolari siertes Gas wie hyperpolarisiertes Helium oder hyperpolarisierte Edelgase wie hyperpolarisiertes Xenon oder hyperpolarisiertes Neon; ein Schwefelfluorid wie Schwefelhexafluorid oder Trifluormethylschwefelpentafluorid; ein gegebenenfalls halogeniertes Silan wie Tetramethylsilan; einen Kohlenwasserstoff mit niedrigem Molekulargewicht (der z. B. bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält), beispielsweise ein Alkan wie Methan, Ethan, ein Propan, ein Butan oder ein Pentan, ein Cycloalkan wie Cyclobutan oder Cyclopentan, ein Alken wie Propen oder ein Buten, oder ein Alken wie Acetylen; einen Ether; ein Keton; einen Ester; einen halogenierten Kohlenwasserstoff mit niedrigem Molekulargewicht (der z. B. bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält) oder eine beliebige Mischung der Vorhergehenden umfassen. Mindestens einige der Halogenatome in halogenierten Gasen sind vorteilhaft Fluoratome.
Bioverträgliche halogenierte Kohlenwasserstoffgase können daher beispielsweise ausgewählt sein aus Bromchlordifluormethan, Chlordifluormethan, Dichlordifluormethan, Bromtrifluormethan, Chlortrifluormethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortetrafluorethan und Perfluorkohlenstoffen, z. B. Perfluoralkanen wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropanen, Perfluorbutanen (z. B. Perfluor-n-butan, gegebenenfalls gemischt mit anderen Isomeren wie Perfluorisobutan), Perfluorpentanen, Perfluorhexanen und Perfluorheptanen; Perfluoralkenen wie Perfluorpropen, Perfluorbutenen (z. B. Perfluorbut-2-en) und Perfluorbutadien; Perfluoralkinen wie Perfluorbut-2-in; und Perfluorcycloalkanen wie Perfluorcyclobutan, Perfluormethylcyclobutan, Perfluordimethylcyclobutanen, Perfluortrimethylcyclobutanen, Perfluorcyclopentan, Perfluormethylcyclopentan, Perfluordimethylcyclopentanen, Perfluorcyclohexan, Perfluormethylcyclohexan und Perfluorcycloheptan. Zu anderen halogenierten Gasen gehören fluorierte, z. B. perfluorierte Ke tone wie Perfluoraceton und fluorierte, z. B. perfluorierte Ether, wie Perfluordiethylether.
Das bioverträgliche Gas oder die bioverträgliche Gasmischung kann für die Ultraschallechographie vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Helium, Krypton, Xenon, Argon, Methan, hyperpolarisierten Gasen, halogenierten Kohlenwasserstoffen (einschließlich fluorierten Gasen wie Perfluorkohlenstoffen) und Schwefelhexafluorid und Mischungen davon ausgewählt werden. Die hyperpolarisierten Gase können vorzugsweise ausgewählt sein aus hyperpolarisiertem Helium oder hyperpolarisiertem Xenon oder hyperpolarisiertem Neon und Mischungen davon. Die halogenierten Kohlenwasserstoffe können vorzugsweise aus Perfluorkohlenstoffen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluorpentan, Perfluorhexan und Mischungen davon bestehen. Das verwendete physiologisch annehmbare Gas kann beispielsweise ausgewählt sein aus SF₆, Freon^® wie CF₄, CBrF₃, C₄F₈, CClF₃, CCl₂F₂, C₂F₆, C₂ClF₅, CBrClF₂, CBr₂F₂, C₃F₈ und C₄F₁₀ oder Mischungen davon.
Besonders bevorzugte Kontrastmittel, die bei der MRI verwendbar sind, enthalten hyperpolarisiertes Neon, hyperpolarisiertes Helium, hyperpolarisiertes Xenon oder Mischungen davon mit Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Helium, Schwefelhexafluorid, Perfluorpropan, Perfluorbutan oder CO₂.
Erfindungsgemäße Kontrastmittel für die Nuklearmedizin enthalten vorzugsweise radioaktive Gase, wie ¹³³Xe oder ⁸¹Kr oder Mischungen davon mit Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Helium, Perfluorkohlenstoffen oder CO₂.
Es hat sich herausgestellt, dass die erfindungsgemäß zweckmäßigen Tenside aus amphipathischen Verbindungen ausgewählt werden können, die in Gegenwart von Wasser und Gasen stabile Filme bilden können. Der Film oder die Membran kann aus jedem beliebigen filmbildenden Phospholipidmaterial gebildet werden, insbesondere nicht-vernetzten Phospholipiden. Das filmbildende Phospholipidmaterial kann vorzugsweise ausgewählt sein aus gesättigten Phospholipiden oder synthetischen ungesättigten Phospholipiden oder einer Mischung davon. Zu den bevorzugten Tensiden gehören die Lecithine (Phosphatidylcholin) und andere Phospholipide, unter anderem Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin (CL), Sphingomyeline und Mischungen davon. Beispiele für geeignete Phospholipide sind natürliche oder synthetische Lecithine, wie Ei- oder Sojalecithin, oder gesättigte synthetische Lecithine, wie Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Diarachidoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Distearoylphosphatidylserin, Diarachidoylphosphatidylserin, Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Distearoylphosphatidylgycerin, Diarachidoylphosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Distearoylphosphatidylethanolamin, Diarachidoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatididsäure, Distearoylphosphatididsäure, Diarachidoylphosphatididsäure, Dimyristoylphosphatidylinositol, Dipalmitoylphosphatidylinositol, Distearoylphosphatidylinositol oder Diarachidoylphosphatidylinositol oder ungesättigte synthetische Lecithine, wie Dioleylphosphatidylcholin oder Dilinoleylphosphatidylcholin oder gemischtkettige Phosphatidylcholine wie beispielsweise Monooleylmonopalmitoylphosphatidylcholin, wobei gesättigte Lecithine bevorzugt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das filmbildende Phospholipidtensid ein natürliches oder synthetisches, gesättigtes oder ungesättigtes Phospholipid oder eine Mischung davon sein. Das filmbildende Phospholipidtensid kann vorzugsweise ein gesättigtes Phospholipid oder ein synthetisches ungesättigtes Phospholipid sein. Das gesättigte Phospholipid kann besonders bevorzugt ausgewählt sein aus gesättigter Phosphatidsäure, gesättigtem Phosphatidylcholin, gesättigtem Phosphatidylethanolamin, gesättigtem Phosphatidylserin, gesättigtem Phosphatidylglycerin, gesättigtem Phosphatidylinositol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen davon.
Additive wie Cholesterin und andere Substanzen können gegebenenfalls einem oder mehreren der vorhergehenden Lipide in Anteilen im Bereich von Null bis 50 Gew.-% zugesetzt werden. Solche Additive können andere Nicht-Phospholipid-Tenside einschließen, die gemischt mit den filmbildenden Tensiden verwendet werden können und die im Wesentlichen bekannt sind. Eine Erklärung für solche Additive oder die Verweilzeit im Blut verlängernde Mittel kann in der Tatsache liegen, dass sie als Opsonisationsinhibitoren wirken, die die Aufnahme der Mikrobläschen aus dem Gefäßsystem in das Retikuloendothelialsystem verzögern. Verbindungen wie Polyoxypropylenglykol und Polyoxyethylenglykol sowie Copolymere davon, Ergosterol, Phytosterol, Sitosterol, Lanosterol, Tocopherol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat und butyliertes Hydroxytoluol sind Beispiele. Die Menge dieser nicht-filmbildenden Tenside beträgt üblicherweise bis zu 50 Gew.-% der Gesamtmenge der Tenside, liegt vorzugsweise jedoch zwischen 0 und 30%. Dies bedeutet, dass die Konzentration der verschiedenen Additive in den erfindungsgemäßen Phospholipidgehaltsuspensionen im Bereich von 0 bis 0,05% liegen kann.
Bevorzugte Additive sind ausgewählt aus Dicetylphosphat, Cholesterin, Ergosterol, Phytosterol, Sitosterol, Lanosterol, Tocopherol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat und butyliertem Hydroxytoluol. Das Kontrastmittel kann ferner Viskositätsverbesserer oder Stabilisatoren ausgewählt aus linearen und vernetzten Poly- und Oligosacchariden, Zuckern, hydrophilen Polymeren wie Polyoxypropylenglykol und Polyoxyethylenglykol enthalten. Die obigen Kontrastmittel können ferner bis zu 50 Gew.-% der Nicht-Phospholipidtenside ausgewählt aus Fettsäuren, Estern und Ethern von Fettsäuren und Alkoholen mit Polyolen enthalten.
Gewünschtenfalls können andere Hilfsstoffe in der Zusammensetzung vorhanden sein, die getrocknet wird, oder können der Formulierung für die Verabreichung zugesetzt werden. Solche Hilfsstoffe können beispielsweise pH-Regulierungsmittel, Osmolalitätseinstellungsmittel, Viskositätsverbesserer, Emulgatoren, Volumenerhöhungsmittel, usw. einschließen und können in konventionellen Mengen verwendet werden. Da die Herstellung der Kontrastmittel wie erörtert typischerweise eine Gefriertrocknungs- oder Sprühtrocknungsstufe beinhalten, kann es jedoch vorteilhaft sein, ein oder mehrere Mittel mit kryoschützender und/oder lyoschützender Wirkung und/oder ein oder mehrere Volumenerhöhungsmittel zuzugeben, beispielsweise eine Aminosäure wie Glycin; ein Kohlehydrat, z. B. einen Zucker wie Sucrose, Mannitol, Trehalose, Glucose, Lactose oder ein Cyclodextrin, oder ein Polysaccharid wie Dextran; oder ein Polyglykol wie Polyethylenglykol. Eine umfangreiche Liste der Mittel mit kryoschützenden und/oder lyoschützenden Wirkungen findet sich in Acta Pharm. Technol. 34(3), Seiten 129–139 (1988), auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die Druckbeständigkeit der nach der Verdünnung des lyophili sierten Materials in einer wässrigen Suspension erhaltenen Bläschen selbst dann erhalten bleibt, nachdem das lyophilisierte Material in einem Behälter unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 25°C oder 30°C oder sogar 40°C während eines Zeitraums von einem Monat, 2 Monaten, 3 Monaten oder sogar 6 Monaten oder mehr gelagert worden ist. Dieses Charakteristikum ist in den 3 und 5 illustriert. Die Druckbeständigkeit (Definition wird z. B. in EP-B-0 554 213 gegeben) bleibt unabhängig von den Lagerungsbedingungen erhalten. Es ist überraschenderweise auch gezeigt worden, dass die Eigenschaften der Mikrobläschen (Bläschenkonzentration, mittlere Größe und verkapseltes Gasvolumen) nach dem Verdünnen von lyophilisierten Produkten, die unter vermindertem Druck gelagert wurden, im Wesentlichen gleich bleiben. Tabelle 1 zeigt beispielsweise, dass die Eigenschaften der Gasmikrobläschen bei einem verringerten Druck von 500 mbar noch recht gut sind, verglichen mit der unter atmosphärischem Druck hergestellten Probe. In Abhängigkeit von der Technik, die für die Herstellung der Mikrobläschen verwendet worden ist, können wir jedoch einige Variationen der Eigenschaften der Mikrobläschen haben. Ein Prozentsatz, der höher oder gleich 10% der Anfangsbläschenkonzentration ist, reicht dennoch aber aus, um eine gute Echogenizität zu erreichen.
Es sollte auch erwähnt werden, dass ein anderes Merkmal der injizierbaren verdünnten erfindungsgemäßen Suspensionen eine relativ "hohe" Gaseinschlusskapazität der Mikrobläschen ist, d. h. ein hohes Verhältnis zwischen der Gesamtmenge des eingeschlossenen Gases und der Menge an Tensid.
Unter einem anderen Aspekt gesehen liefert die Erfindung ein lyophilisiertes Kontrastmittel, das in der diagnostischen Bildgebung verwendbar ist, das ein Gas oder eine Gasmischung enthält, welches nach dem Verfahren erhältlich ist, bei dem man ein lyophilisierbares Material, das in einem Behälter enthalten ist, lyophilisiert, wobei das lyophilisierbare Material mindestens ein filmbildendes Phospholipidtensid enthält, man den Behälter dicht verschließt. Bevor man den Behälter dicht verschließt, setzt man den Behälter unter Vakuum und bringt anschließend das Gas oder die Gasmischung unter einem verminderten Druck in den Behälter ein. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung liegt zwischen 900 und 100 mbar. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung liegt vorzugsweise zwischen 700 und 300 mbar. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung beträgt besonders bevorzugt 500 mbar. Das Gas oder die Gasmischungen, die filmbildenden Phospholipidtenside, die Additive, die Viskositätsverbesserer oder Stabilisatoren und die Nicht-Phospholipid-Tenside, die zur Herstellung dieser lyophilisierten Kontrastmittel brauchbar sind, wurden zuvor bereits erörtert.
Es ist überraschenderweise gefunden worden, dass das nach dem obigen Verfahren erhaltene lyophilisierte oder getrocknete Kontrastmittel nach Lagerung für sehr lange Zeit (mehr als ein Jahr) verbesserte Stabilität zeigte.
Das lyophilisierte erfindungsgemäße Kontrastmittel kann zweckmäßig mit nicht-laminarisierten Phospholipiden hergestellt werden, oder mit Phospholipiden, die entweder lamellarisiert oder laminarisiert werden, bevor sie dann in Kontakt mit Luft oder anderem Gas gebracht werden. Der Begriff lamellar oder Lamelle oder Laminarform bedeutet hier, dass die Tenside in Form von dünnen Filmen oder Lagen mit einer oder mehreren monomolekularen Schicht(en) vorliegen. Wie in WO-A-91/15244 beschrieben ist, kann die Umwandlung filmbildender Tenside in lamellare Form leicht nach jedem beliebigen Liposombildungsverfahren erfolgen, wie beispielsweise durch mechanische Homogenisierung mit hoher Geschwindigkeit oder durch Schallbehandlung mit akustischen oder Ultraschallfrequenzen.
Es ist überraschenderweise außerdem gefunden worden, dass es durch geeignete Auswahl des verringerten Drucks möglich ist, lyophilisierte Ultraschall- oder MRI- oder Nuklearmedizin-Kontrastmittel zu produzieren, die im Zeitverlauf bei Umgebungstemperaturen und darüber und in der Tat bei allen Temperaturen stabil sind, die normalerweise während Transport und Lagerung vorkommen.
Die stabilen lyophilisierten erfindungsgemäßen Kontrastmittel können danach ohne Notwendigkeit der Temperatursteuerung ihrer Umgebung gelagert und transportiert werden, und können insbesondere Krankenhäusern und Ärzten zur Formulierung an Ort und Stelle zu einer gebrauchsfertigen, verabreichbaren Suspension geliefert werden, ohne dass diese Anwender spezielle Lagerungseinrichtungen benötigen. Erfindungsgemäße lyophilisierte Produkte haben sich als lagerstabil für mehrere Monate unter Umgebungsbedingungen erwiesen. Die durch Verdünnung in Wasser (oder anderen Verdünnungsflüssigkeiten) erzeugten Mikrobläschendispersionen oder -suspensionen können für erhebliche Zeitspannen, z. B. bis zu mindestens 12 Stunden, stabil sein, was erhebliche Flexibilität zulässt, wann das getrocknete Produkt vor der Injektion verdünnt wird.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung basiert auf der Tatsache, dass das getrocknete Kontrastmittel, weil es unter vermindertem Druck versiegelt ist, leichter wiederhergestellt wird, weil das Vakuum das Verdünnungsmittel in die Ampulle zieht. Das Versiegeln unter vermindertem Druck ermöglicht auch die Kontrolle der Lagerungsatmosphäre und erleichtert die Auflösung der lyophilisierten festen Produkte vor Ge brauch. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann der verminderte Druck unmittelbar vor dem Verdünnen mit einem flüssigen Träger in den versiegelten Behälter eingebracht werden. In der letzteren Ausführungsform kann das lyophilisierte Kontrastmittel unter atmosphärischem Druck in einem Behälter gelagert werden.
Unter einem anderen Aspekt gesehen liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Kontrastmittels, das ein Gas oder eine Gasmischung enthält, welches in der diagnostischen Bildgebung verwendbar ist, bei dem man ein lyophilisierbares Material, das in einem Behälter enthalten ist, lyophilisiert, wobei das lyophilisierbare Material mindestens ein filmbildendes Phospholipidtensid enthält, man den Behälter dicht verschließt. Bevor man den Behälter dicht verschließt, setzt man den Behälter unter Vakuum und bringt anschließend das Gas oder die Gasmischung unter einem verminderten Druck in den Behälter ein. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung liegt zwischen 900 und 100 mbar. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung liegt vorzugsweise zwischen 700 und 300 mbar. Der verminderte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der in den Behälter eingebrachten Gasmischung beträgt besonders bevorzugt 500 mbar.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann der verminderte Druck angelegt werden, unmittelbar bevor das Kontrastmittel mit einem physiologisch annehmbaren flüssigen Träger verdünnt wird. Der verminderte Druck kann unmittelbar nach Anlegen des Vakuums an den Behälter in den versiegelten Behälter eingebracht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren wiederhergestellten Suspension von mit Luft oder Gas gefüllten Mikrobläschen, die als Bildgebungskontrastmittel in der diagnostischen Bildgebung verwendbar sind. Das wie oben definierte lyophilisierte Kontrastmittel wird mit Wasser oder einer physiologisch verträglichen, wässrigen Trägerflüssigkeit gemischt.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung die Verwendung des lyophilisierten Kontrastmittels wie oben definiert in einem physiologisch oder pharmazeutisch verträglichen, wässrigen, flüssigen Träger zur Herstellung einer injizierbaren wässrigen Suspension von gasgefüllten Mikrobläschen zur Verwendung in der Diagnose, welche die diagnostische Ultraschallbildgebung oder die Magnetresonanz (MRI) oder die Nuklearmedizin umfaßt.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Kontrastmittel zur Verwendung in diagnostischen Untersuchungen, welche die Ultraschallechographie, die Nuklearmedizin oder die MRI umfassen.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur diagnostischen Bildgebung, bei dem man einem Subjekt eine kontrastverstärkende Menge eines Kontrastmittels gemäß der obigen Beschreibung verabreicht und mindestens einen Teil des Subjekts durch Ultraschall oder Magnetresonanz oder Szintigraphie untersucht. Gemäß diesem Verfahren ist das Subjekt ein Wirbeltier, und das Kontrastmittel wird in das Gefäßsystem oder in eine Körperhöhle des Wirbeltiers eingebracht.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Zweikomponentenkit, der als erste Komponente ein lyophilisiertes Kontrastmittel enthält, das in der diagnostischen Bildgebung verwendbar ist und ein Gas oder eine Gasmischung wie oben definiert enthält, und als zweite Komponente eine physiologisch verträgliche Trägerflüssigkeit enthält, die beim Mischen mit der ersten Komponente ein injizierbares Kontrastmittel ergibt.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein lyophilisiertes Kontrastmittel, das ein oder mehrere filmbildende Phospholipidtenside enthält, die bei Auflösung in Wasser oder in einer wässrigen Trägerflüssigkeit eine injizierbare wässrige Suspension von gasgefüllten Mikrobläschen bilden, welche als Bildgebungskontrastmittel in der diagnostischen Bildgebung verwendbar ist. Es ist ein Merkmal der Erfindung, die Veränderung der akustischen Eigenschaften (der echogenen Reaktion) während der Lagerung vollständig oder signifikant zu verhindern. Bei der sorgfältigen Einstellung des Bereichs der reduzierten Drücke, die an den Behälter angelegt werden, werden die akustischen Eigenschaften durch Lagerung des lyophilisierten Pulvers für verlängerte Zeitspannen nicht beeinflusst. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist somit die Verhinderung der Veränderung der akustischen Eigenschaften nach der Wiederherstellung in einer wässrigen Suspension mit einem lyophilisierten Material, das in einem Behälter unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 20°C oder 30°C oder sogar 40°C während eines Zeitraums von einem Monat oder sogar zwei Monaten oder mehr gelagert worden ist.
Bei Ultraschallanwendungen, wie der Echokardiographie, sind Mikrobläschen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,1 bis 10 μm erforderlich, um einen freien Durchgang durch das Pulmonarsystem zu ermöglichen und Resonanz mit den bevorzugten Bildgebungsfrequenzen von etwa 0,1 bis 15 MHz zu erreichen. Erfindungsgemäße Kontrastmittel können mit einer sehr engen Größenverteilung innerhalb des für die Echokardiographie bevorzugten Bereichs produziert werden, wodurch ihre effektive Echogenizität sowie ihre Sicherheit in vivo wesentlich erhöht werden und was die Kontrastmittel besonders vorteilhaft für Anwendungen wie Blutdruckmessungen, Blutstromverfolgung und Ultraschalltomographie macht.
In der vorliegenden Erfindung ist die Größe der erzeugten Mikrobläschen konsistent reproduzierbar und in der Praxis unabhängig von der Menge der zugeführten Bewegungsenergie, dieser Größenparameter bleibt überraschenderweise im Wesentlichen in dem lyophilisierten und verdünnten Produkt erhalten. Da die Größe der Mikrobläschen in der Anfangsdispersion somit durch Verfahrensparameter leicht kontrolliert werden kann, wie die Methode, die Lagerung unter einem definierten Bereich des reduzierten Drucks, Geschwindigkeit und Dauer der Bewegung, kann die am Ende vorhandene Größe der Mikrobläschen leicht kontrolliert werden. Dieses Vermeiden unbegrenzter Größenanstiege, die zu einer unerwünschten und potentiell hochgefährlichen Blockierung der Blutgefäßkapillaren führen können, ist ein Hauptvorteil dieser Kontrastmittel. Es ist eine ausgeprägte Abnahme des Volumens der Bläschen größer als 10 μm gezeigt worden, während Bläschen im Bereich von 2 bis 8 μm durch Partialdruck weniger modifiziert werden. In Beispiel 10 zeigen die Ergebnisse, dass mehr als 50% der großen Bläschen (> 8 μm) durch Verwendung eines reduzierten Drucks von 500 mbar eliminiert wurden, verglichen mit der Probe, die bei atmosphärischem Gasdruck (1000 mbar) hergestellt wurde.
Um die erfindungsgemäßen getrockneten Kontrastmittel zu erhalten, können Gefriertrockungs- und Sprühtrockungstechniken verwendet werden. Das getrocknete oder lyophilisierte Produkt liegt allgemein in Pulver- oder Kuchenform vor und ist leicht in einem geeigneten wässrigen flüssigen Träger wiederverdünnbar, der physiologisch (oder pharmazeutisch) verträglich, steril und injizierbar ist. Geeignete flüssige Träger sind Wasser, wässrige Lösungen wie Salzlösung (die vorteilhaft so abgestimmt sein kann, dass das Endprodukt für die Injektion nicht hypoton ist), oder Lösungen von einer oder mehreren Tonizitätseinstellungssubstanzen, wie Salzen oder Zuckern, Zukkeralkoholen, Glykolen und anderen nichtionischen Polyolmaterialien (z. B. Glucose, Sucrose, Sorbitol, Mannitol, Glycerin, Polyethylenglykole, Propylenglykole und dergleichen). In der Praxis sollten alle injizierbaren Zusammensetzungen nach Verdünnung des lyophilisierten Kontrastmittels auch so weit wie möglich mit Blut isoton sein. Vor der Injektion können den erfindungsgemäßen Suspensionen jedoch auch geringe Mengen isotoner Mittel zugefügt werden. Die isotonen Mittel sind physiologische Lösungen, die üblicherweise in der Medizin verwendet werden, und sie umfassen wässrige Salzlösung (0,9% NaCl), 2,6% Glycerinlösung, 5% Dextroselösung, usw. Die Wiederherstellung erfordert allgemein nur minimale Bewegung, wie sie beispielsweise durch gelindes Schütteln von Hand erzielt werden kann. Die Größe der so erzeugten Mikrobläschen ist konsistent reproduzierbar und in der Praxis unabhängig von der Menge der zugeführten. Bewegungsenergie. Die Wiederherstellung der wässrigen Mikrobläschensuspensionen wird somit durch einfache Auflösung der gasgelagerten, getrockneten, filmbildenden Phospholipide ohne jegliche heftige Bewegung erzielt.
Das Volumen und die Konzentrationen der Verdünnungsflüssigkeit können erwünschterweise so ausbalanciert werden, dass die resultierenden gebrauchsfertigen Formulierungen im Wesentlichen isoton sind. Das Volumen und die Konzentration der gewählten Verdünnungsflüssigkeit hängen somit von dem Typ und der Menge an Stabilisator (und anderen Volumenerhöhungsmitteln) ab, die in dem gefriergetrockneten Produkt enthalten sind.
Die erfindungsgemäßen Bläschensuspensionen sind auch in anderen medizinischen/diagnostischen Anwendungen brauchbar, wo die stabilisierten Mikrobläschen nach ihrer Injektion zielge richtet zu speziellen Stellen in dem Körper geführt werden sollen, beispielsweise zu in den Blutgefäßen vorliegenden Thromben, zu Atheroskleroseläsionen (Plaques) in Arterien, zu Tumorzellen, sowie zur Diagnose veränderter Oberflächen von Körperhöhlen, z. B. Ulzerierungsstellen im Magen oder Tumoren der Blase. Hierfür kann man monoklonale Antikörper, die gentechnisch maßgeschneidert worden sind, Antikörperfragmente, Peptide, Oligopeptide oder Polypeptide, die Antikörper nachahmen sollen, bioadhäsive Polymere, Lectine und andere Ortserkennungsmoleküle (Liganden) an das filmbildende Phospholipidtensid binden, das die Mikrobläschen stabilisiert. Phospholipidderivate können so erhalten werden, d. h. DPPE gekoppelt mit N-Biotinyl in Beispiel 2.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass weniger Gas verwendet werden muss, weil das Gas oder die Gasmischung unter vermindertem Druck in die Ampulle eingebracht wird, die das lyophilisierte Produkt enthält. Dies ist ein bedeutsamer Vorteil, weil Gase wie Perfluorkohlenstoffe sehr teuer sind. Das Setzen der Lyophilisierungskammer unter reduzierten Druck kann in der Tat die Gasmenge um 50 bis 80% reduzieren. Die Verwendung eines Drucks von 200 mbar ermöglicht beispielsweise eine Einsparung von 80% der Gasmenge, verglichen mit einem Kontrastmittel, das bei atmosphärischem Druck hergestellt ist. Dies führt auch zu einer ökologischen Verbesserung, da weniger Perfluorkohlenstoffgase in die Atmosphäre abgegeben werden. Im Fall sehr teurer Gase, wie dem hyperpolarisiertem Helium, Xenon oder Neon, die zur Magnetresonanzbildgebung (MRI) verwendet werden, kann die Einsparung signifikant sein.
Geeignete erfindungsgemäße Behälter, Ampullen oder Flaschen sind beispielsweise in 1 gezeigt. Es sind keine spezielle Ampulle oder speziellen Verbindungssysteme erforder lich, die vorliegende Erfindung kann konventionelle Ampullen und Adapter verwenden. Die einzige Anforderung ist eine gute Abdichtung (Versiegelung) zwischen dem Stopfen und dem Behälter. Die Qualität der Versiegelung ist daher ein Hauptthema, jede Verschlechterung der Siegelungsintegrität kann es unerwünschten Substanzen ermöglichen, in die Ampulle zu gelangen. Um Sterilität zu gewährleisten, ist der Beibehalt des Vakuums für unter verringerten Drücken verschlossene Produkte wesentlich, um eine sichere und richtige Verdünnung zu gewährleisten. Der Stopfen kann eine Kompound- oder Mehrkomponentenformulierung auf Basis von Elastomer sein, wie Poly(isobutylen) oder "Butylkautschuk".
Es ist zu erkennen, dass Kits wie in Beispiel 13 illustriert zur Verwendung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrobläschenzubereitungen gefertigt werden können. Diese Kits können einen Behälter enthalten, der das gesamte erfindungsgemäße sterile lyophilisierte Material enthält und das oben beschriebene Gas oder die oben beschriebenen Gasmischungen in einer Kammer unter vermindertem Druck einschließt. Die sterile wässrige Flüssigkeit kann in einer zweiten Kammer desselben Behälters enthalten sein. In einer Ausführungsform ist der Behälter eine konventionelle septumversiegelte Ampulle. In einer anderen Ausführungsform umfaßt er ein Mittel, um die Zufuhr einer ausreichenden Menge an Energie zur Bläschenbildung in den Inhalt des Behälters zu leiten oder zu ermöglichen. Wenn das getrocknete Produkt in einer Ampulle enthalten ist, wird diese zweckmäßig mit einem Septum versiegelt, durch das die Trägerflüssigkeit mit einer gegebenenfalls vorbefüllten Spritze injiziert werden kann. Das getrocknete Produkt und die Trägerflüssigkeit können alternativ in einem Zweikomponentenkit, wie einer Doppelkammerspritze, zusammen angeboten werden. Es kann vorteilhaft sein, das Produkt nach dem Wiederherstellen zu mischen oder leicht zu schütteln. Wie bereits gesagt, kann in den erfindungsgemäßen stabilisierten Kontrastmitteln die Größe der Gasmikrobläschen jedoch im Wesentlichen unabhängig von der Menge an Bewegungsenergie sein, die dem verdünnten getrockneten Produkt zugeführt wird. Daher ist möglicherweise nicht mehr als leichtes Schütteln von Hand erforderlich, um reproduzierbare Produkte mit konsistenter Mikrobläschengröße zu ergeben.
Die Erfindung ist zuvor in Bezug auf Mikrobläschen-Ultraschallkontrastmittel beschrieben worden. Sie ist jedoch auch auf Kontrastmittel für andere diagnostische Bildgebungsmodalitäten anwendbar (z. B. MRI, Röntgen, SPELT, PET, Szintigraphiebildgebung, Magnetbildgebung, usw.), oder sogar für therapeutische Anwendungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Beispiel für einen geeigneten Behälter zur Lagerung von erfindungsgemäßem lyophilisiertem Kontrastmedium.
2 zeigt die Variation der Zahl der Bläschenkonzentration bei 1, 0,75 und 0,5 bar zum Zeitpunkt Null sowie nach einem Monat, zwei Monaten, drei Monaten und sechs Monaten bei 25°C.
3 zeigt die Variation der Druckbeständigkeit in mm Hg bei 1, 0,75 und 0,5 bar zum Zeitpunkt Null sowie nach einem Monat, zwei Monaten, drei Monaten und sechs Monaten bei 25°C.
4 illustriert die Variation der Zahl der Bläschenkonzentration bei 1, 0,75 und 0,5 bar zum Zeitpunkt Null sowie nach einem Monat, zwei Monaten, drei Monaten und sechs Monaten bei 40°C.
5 zeigt die Variation der Druckbeständigkeit in mm Hg bei 1, 0,75 und 0,5 bar zum Zeitpunkt Null sowie nach einem Monat, zwei Monaten, drei Monaten und sechs Monaten bei 40°C.
Es wird hierin die Offenbarung aller oben beschriebenen Patente durch Bezug aufgenommen.
Die vorhergehende Beschreibung wird in Bezug auf die folgenden Beispiele besser verständlich. Diese Beispiele sind jedoch beispielhaft für Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken.
Beispiele
Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung der Beispiele für Lipidkomponenten verwendet.

DAPC: Diarachidoylphosphatidylcholin
DCP: Dicetylphosphat
DPPC: Dipalmitoylphosphatidylcholin
DPPG: Dipalmitoylphosphatidylglycerin
DPPA: Dipalmitoylphosphatidsäure
DPPS: Dipalmitoylphosphatidylserin
DSPC: Distearoylphosphatidylcholin
DSPS: Distearoylphosphatidylserin
DSPE-PEG2000: Distearoylphosphoethanolamin-N-poly(ethylenglykol) 2000
DPPE-PEG5000: Dipalmitoylphosphoethanolamin-N-poly(ethylenglykol) 5000
N-Biotinyl-Cap-PE: n-Biotinylcaproylphosphatidylethanolamin
TAP: Distearoyltrimethylammoniumpropan

Alle diese Phospholipide wurden von Lipoid (Schweiz) und/oder von Avanti Polar Lipids (USA) erworben.
Beispiel 1
Eine Lösung, die 0,9 g DPPC und 100 mg DPPG enthielt, wurde mit 50 ml Hexan(Isopropanol 8/2 Vol/Vol (Fluka, Schweiz) hergestellt. Die Lösungsmittel wurden zur Trockne eingedampft. Es wurden 20 ml destilliertes Wasser zugefügt, und die Mischung wurde eine Stunde an einer Rotationsverdampfervorrichtung auf 65°C erwärmt. Die resultierende Suspension wurde dann nacheinander durch 3 und 1 μm Polycarbonatmembranen extrudiert (Nuclepore^®). Die extrudierte Suspension wurde nach dem Abkühlen mit Macrogol 4000-Lösung (100 mg/ml; Macrogol 4000 ist Poly(ethylenglykol) mit einem Molekulargewicht von 4000 und wurde von Clarian, Deutschland, erworben) mit einem Volumenverhältnis von 1:9 (Lipidsuspension/Macrogol-Lösung) gemischt und in einem Rundkolben bei –45°C rasch eingefroren. Die gefrorene Probe wurde dann unter Vakuum (0,2 bar) und über Nacht gefriergetrocknet. Aliquote des erhaltenen Lyophilisats wurden in 10 ml Glasampullen (450 mg/Ampulle) gegeben und mit einem gasdichten Stopfen versiegelt. Die Ampullen wurden mittels Hochvakuumpumpe vollständig evakuiert und danach unter unterschiedlichen absoluten Gasdrücken (100, 200, 300, 500 und 1000 mbar) mit C₄F₁₀-Gas gefüllt. Die Lyophilisatproben wurden danach mit 5 ml Salzlösung (durch den Stopfen injiziert) mit kräftigem Schütteln auf einem Vortex-Mischer verdünnt, um Gasmikrobläschen zu erzeugen. Mit den Bläschensuspensionen wurden Coulter-Zählermessungen (Multisizer II) durchgeführt, um die Bläschencharakteristika (Größe und Zahl) unter verschiedenen reduzierten Gasdrücken zu bewerten. Die Ergebnisse der Coulter-Messungen sind nachfolgend zusammengefasst. Dn entspricht dem Durchmesser (Zahlenmittel). Das Bläschenvolumens ist das Gesamtvolumen des in die Bläschen eingeschlossenen Gases pro ml verdünnter Lösung.
Tabelle 1
Diese Ergebnisse zeigen überraschenderweise, dass die Eigenschaften der Gasbläschen mit einem reduzierten Druck von 500 mbar noch recht gut sind, verglichen mit der unter normalem atmosphärischem Druck (1000 mbar) hergestellten Probe. Es werden selbst mit einem so niedrigen Druck wie 100 mbar mehr als 2 × 10⁸ Bläschen/ml erhalten.
Beispiel 2
Eine Reihe wässriger Phospholipidsuspensionen wurde mit den folgenden Lipidzusammensetzungen hergestellt:

A. 25 mg DAPC, 70 mg DSPS und 5 mg DSPE-PEG2000
B. 45 mg DSPC, 45 mg DPPG, 10 mg Palmitinsäure
C. 54 mg DPPG, 6 mg DPPA, 40 mg PE-PEG 5000
D. 100 mg DPPS
E. 90 mg DPPS, 10 mg DSPE-PEG2000
F. 50 mg DPPC, 45 mg DPPS, 5 mg Pluronic^® F108
G. 50 mg DPPG, 150 mg Pluronic^® F68, 2,5 mg N-Biotinyl-Cap-PE
H. 90 mg DSPC, 10 mg TAP

Die Komponenten jeder Zusammensetzung wurden in 50 ml wässriger Lösung dispergiert, die 1,5 g Glycerin und 5 g Propylenglykol enthielt. Alle Dispersionen wurden eine Stunde zur Lipidhydratisierung an einer Rotationsverdampfervorrichtung auf 75°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden die Suspensionen dann unter mechanischer Bewegung mit hoher Geschwindigkeit unter Verwendung eines Polytron^® (Kinematica AG, 15.000 UpM und 2 Minuten) bei 5°C und unter C₄F₁₀-Gas in Luft homogenisiert. Die erzeugten Bläschensuspensionen wurden in 50 ml Spritzen eingebracht und eine Nacht dekantiert. Die Spritzen wurden horizontal gehalten. Nach dem Dekantieren (eine weiße opake dünne Bläschenschicht bildete sich oben auf der Lösung) wurde die untere Phase (~45 ml) verworfen, die bläschenhaltige Phase (~5 ml) wurde gewonnen und in demselben Volumen einer wässrigen 5% Dextran-15-Lösung (Mw 15.000) erneut suspendiert. Dieses Bläschendekantierverfahren ermöglicht die Beseitigung überschüssiger Lipide, die nicht mit Bläschen assoziiert sind, und erzeugt so Bläschensuspensionen, die sehr niedrige Phospholipidkonzentrationen enthalten (siehe US-A-5,445,813, auf die hier vollständig Bezug genommen wird). Die resultierenden Bläschensuspensionen wurden in 10 ml Glasampullen (1 ml pro Ampulle) eingebracht, danach rasch bei –45°C gefroren (siehe US-A-5,961,956, auf die hier Bezug genommen wurde), und gefriergetrocknet. Nach der Lyophilisierung wurden die Ampullen mittels Hochvakuumpumpe evakuiert und danach entweder unter normalem (1000 mbar) oder reduziertem Gasdruck (500 mbar) mit C₄F₁₀-Gas gefüllt und mit gasdichten Stopfen versiegelt. Mikrobläschensuspensionen wurden erhalten, indem durch den Stopfen 0,9% NaCl (5 ml) in jede Ampulle injiziert und anschließend kräftig bewegt wurde. Mit allen Bläschensuspensionen wurden Coulter-Zählermessungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachfolgend zusammengefasst:
Tabelle 2
Diese Ergebnisse zeigen, dass die getesteten Formulierungen selbst unter dem halben normalen Gasdruck (500 mbar gegenüber 1000 mbar) die Eigenschaften der Mikrobläschen (Bläschenkonzentrationen, mittlere Größen und Gasverkapselungsvolumina) beibehielten.
Beispiel 3
Eine Phospholipidmischung, die 27 mg DPPC, 3 mg DPPA und DPPE-PEG5000 enthielt, wurde in 18 g tert.-Butanol unter Rückfluss (82°C) gelöst. Nach dem Auflösen wurden 3 g Macrogol 4000 zugegeben. Nach vollständiger Auflösung wurden Aliquote der Lösung in 10 ml Glasampullen gefüllt (310 μl/Ampulle), bei 45°C gefroren und lyophilisiert. Die Lyophilisat enthaltenden Ampullen wurden mittels Hochvakuumpumpe evakuiert, mit verschiedenen Gasen (siehe unten) unter unterschiedlichen absoluten Gasdrücken (100, 300, 500, 700 und 1000 mbar) gefüllt und mit gasdichten Stopfen versiegelt. Die Lyophilisatproben wurden danach mit 5 ml Salzlösung (durch den Stopfen injiziert) mit kräftigem Schütteln verdünnt, um Gasmikrobläschen zu erzeugen. Es wurden Coulter-Zähleranalysen durchgeführt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Die Konzentration der Gasmikrobläschen, die mit 300, 500 und 700 mbar hergestellt wurden, werden als relative Bläschenkonzentrationen ausgedrückt, normalisiert mit den Werten, die aus mit 1000 mbar (atmosphärischem Druck) hergestellten Proben erhalten wurden.
Tabelle 3 Bläschenkonzentration (%)
Die Natur des Gases oder der Gasmischung scheint einen wichtigen Einfluss auf die Mikrobläschenkonzentration unter verringertem Gasdruck zu haben, insbesondere bei niedrigen Druckwerten (100–500 mbar). Es sei darauf hingewiesen, dass man sich nicht verpflichtet fühlen muss, dieselbe Bläschenkonzentration bei reduziertem Druck zu erhalten, verglichen mit atmosphärischem Druck. Ein Produkt, das 10⁷ Bläschen/ml enthält, kann als Echographiekontrastmittel brauchbar sein.
Beispiel 4
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 3 hergestellt, außer bei der Phospholipidzusammensetzung: Hier wurden 47,5 mg DSPC, 2,5 mg DCP verwendet (statt DPPC/DPPA/DPPE-PEG5000). Die Coulter-Zählerergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4 Bläschenkonzentration (%)
Beispiel 5
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung von 25 mg DPPC, 25 mg DPPG (anstelle von DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000) hergestellt. Aliquote der tert.-Butanollösung (500 μl/Ampulle) wurde gefroren und lyophilisiert. Die Lyophilisat enthaltenden Ampullen wurden evakuiert und mit verschiedenen Gasen (siehe unten) unter unterschiedlichen reduzierten Gasdrücken (100, 300, 500, 700 und 1000 mbar) gefüllt und mit gasdichten Stopfen versiegelt. Die lyophilisierten Proben wurden mit 5 ml Salzlösung verdünnt, und es wurde eine Coulter-Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben.
Tabelle 5 Bläschenkonzentration (%)
Beispiel 6
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung von 47,5 mg DAPC, 2,5 mg DPPG (anstelle von DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000) hergestellt. Aliquote der tert.-Butanollösung (250 μl/Ampulle) wurden gefroren und lyophilisiert (anstelle von 310 μl/Ampulle in Beispiel 3). Die Ergebnisse der Coulter-Analyse sind für jedes getestete Gas oder jede getestete Gasmischung in Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6 Bläschenkonzentration (%)
Beispiel 7
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 6 beschrieben mit 22,5 mg DSPC, 22,5 mg DPPG und 5 mg Palmitinsäure (anstelle von DAPC, DPPG) hergestellt. Die Coulter-Zählerergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.
Tabelle 7 Bläschenkonzentration (%)
Beispiel 8
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 6 beschrieben mit 25 mg DSPC, 22,5 mg DPPG und 2,5 mg Pluronic^® F108 (anstelle von DAPC, DPPG) hergestellt. Die Coulter-Zählerergebnisse sind in Tabelle 8 wiedergegeben.
Tabelle 8 Bläschenkonzentration (%)
Beispiele 3 bis 8 zeigen, dass die Bläschenbildung unter reduzierten Gasdrücken (< 1000 mbar) durch Auswahl der Zusammensetzung der Lipide und des Gases oder der Gasmischungen (Löslichkeit, Molekulargewicht) weiter verbessert oder kontrolliert werden kann.
Die folgenden Beispiele (Beispiele 9–11) zeigen, dass die Verwendung eines reduzierten Gasdrucks dazu beitragen kann, die Größenverteilung der Mikrobläschen zu kontrollieren, insbesondere um große Mikrobläschen zu eliminieren (> 8 μm). Dies ist wichtig, um das Risiko von Gasemboliebildung in Blutgefäßen herabzusetzen und den transpulmonaren Durchgang der Mikrobläschen zu verbessern, wodurch reproduzierbare und quantitative in vivo-Ultraschallbildgebungseigenschaften ermöglicht werden.
Beispiel 9
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt und unter verschiedenen reduzierten Gasdrücken (siehe Tabelle 9) mit dem Gas C₄F₁₀ gefüllt. Die Coulter-Zähleranalysen wurden durchgeführt, um Bläschencharakteristika zu bestimmen, wie Bläschenkonzentration (Nb/ml), Durchmesser (Zahlenmittel) (Dn) und Durchmesser (Volumenmittel) (Dv) und das Bläschenvolumen, das in Bläschen größer als 8 μm (Vol > 8 μm) vorliegt, ausgedrückt als Prozentsatz des Bläschenvolumens in Bläschen größer als 8 μm, das bei einem Druck von 1000 mbar vorhanden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 wiedergegeben. Tabelle 9 Bläschencharakteristika als Funktion des Gasdrucks

* Polydispersitätsindex = Dv/Dn

Dieses Beispiel zeigt eindeutig, dass die Verwendung eines reduzierten Drucks ohne erhebliche Veränderung der allgemeinen Bläschencharakteristika (Nb/ml, Dn) die Kontrolle der Bläschengrößenverteilung vor dem Verdünnen und insbesondere die erhebliche Reduktion der Zahl der großen Mikrobläschen (> 8 μm) ermöglicht, die die Lungen in vivo wegen pulmonarer Filtration nicht passieren würden. Die Zahl der unter einem Druck von 100 mbar produzierten Bläschen ist somit 55% des Werts, der bei 1000 mbar erhalten wurde (2,6 × 10⁸ gegenüber 4,7 × 10⁸), sie enthalten jedoch ein 25-fach kleineres Volumen (Tabelle 9 zeigt, dass das Gesamtvolumen der Mikrobläschen größer als 8 μm von 100% auf 4% herabgesetzt wird).
Beispiel 10
Lyophilisate wurden wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt und mit einer Gasmischung aus C₃F₈ und Luft (66:35, Vol.%) unter verschiedenen reduzierten Gasdrücken gefüllt. Es wurden auch Coulter-Analysen durchgeführt, um die Bläschencharakteristika zu bestimmen, wie die Bläschenkonzentration (Nb/ml), den Durchmesser (Zahlenmittel) (Dn), den Durchmesser (Volumenmittel (Dv) sowie das Bläschenvolumen, das in Bläschen größer als 8 μm vorlag, wie in Beispiel 9 definiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben.
Tabelle 10 Bläschencharakteristika als Funktion des Gasdrucks
Mehr als 50% des in den großen Mikrobläschen (> 8 μm) vorliegenden Volumens wurden durch Verwendung eines reduzierten Drucks von 500 mbar eliminiert, verglichen mit der Herstellung der Probe unter atmosphärischem Gasdruck (1000 mbar). Die anderen Bläscheneigenschaften blieben im Wesentlichen unverändert. Die Reduktion war bei 200 mbar sogar noch eindrucksvoller, wobei das Volumen in den großen (> 8 μm) Bläschen auf 10% des Werts bei atmosphärischem Druck sank, während die Gesamtbläschenkonzentration nur um 39% sank (von 5,1 auf 3,1 × 10⁸/ml).
Beispiel 11
Eine phospholipidhaltige sprühgetrocknete Formulierung wurde wie folgt erhalten:
0,45 g hydriertes Ei-Phosphophatidylcholin (Lipoid EPC-3) und 0,15 g Poloxamer 188 wurden in 100 ml destilliertem Wasser dispergiert. Die Dispersion wurde eine Stunde auf 50°C erwärmt, danach auf 4°C abgekühlt. 3 ml 1,1,2-Trichlortrifluorethan (Freon^® 113) wurden mit der Dispersion unter Verwendung von Homogenisierung mit hoher Geschwindigkeit gemischt (Polytron^®, 2 Minuten mit 10.000 UpM und 4°C). Die resultierende Emulsion wurde eine Nacht in einen Kühlschrank gestellt, danach durch einen Mikrofluidisierer (Microfluidics Corp.) extrudiert, um die Emulsionsgröße zu reduzieren (10.000 psi, 5°C und 5 Durchgänge). Eine wässrige Lösung, die 3,6 g Maltodextrin, 3 g NaCl und 2,6 g Na₂HPO₄ und 0,9 g NaH₂PO₄ enthielt, wurde in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Diese Lösung wurde mit der Emulsion gemischt und danach sprühgetrocknet (Minisprühtrockner Büchi 190: Einlasslufttemperatur 235°C; Auslasstemperatur 105°C). Die resultierenden getrockneten Pulver wurden in 10 ml Glasampullen aufgeteilt, unter verschiedenen Gasdrücken mit C₄F₁₀ gefüllt und danach mit destilliertem Wasser verdünnt (30 mg/ml). Coulter-Zähleranalysen wurden wie zuvor durchgeführt. In Tabelle 11 sind die erhaltenen Bläschencharakteristika (Nb/ml, Dn, Dv, Polydispersitätsindex und der Prozentsatz des Bläschenvolumens (> 8 μm)) zusammengefasst. Tabelle 11 Bläschencharakteristika als Funktion des Gasdrucks

* Polydispersitätsindex = Dv/Dn

Die Bläschengrößenverteilung wird hier wieder durch die Verwendung eines reduzierten Gasdrucks erheblich verengt. Dies trifft insbesondere auf die Reduktion der großen Mikrobläschen (> 8 μm) zu. Es gibt bei 200 mbar beispielsweise fast so viele Bläschen wie bei atmosphärischem Druck (8,3 gegenüber 9,1 × 10⁸/ml), das Volumen der großen Bläschen (> 8 μm) wird jedoch um 74% verringert. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit die Verbesserung des Sicherheitsprofils dieser Formulierung.
Beispiel 12
(in vivo-Bildgebung)
Dieses Beispiel zeigt die in vivo-Wirksamkeit der Formulierung von Beispiel 11 (sprühgetrocknete Phospholipidsuspension), die unter verschiedenen reduzierten Drücken hergestellt wurde. Kurz gesagt wurden Minischweine, die über Nacht fasten gelassen worden waren, mit Stressnil (Azaperone, Janssen: 2 mg/kg), gefolgt von Forene (Isofurane, Abbot), anästhesiert. Die Opazifizierung des linken Herzventrikels wurde mit einem ATL HDI-550 Bildgebungssystem bewertet, das mit Pulsinversionsmodus ausgestattet war. Die P4-2-Sonde (2,8/3,2 MHz) wurde verwendet. Am Anfang des Experiments wurden die Bildgebungsdosis (0,1 ml/kg) und alle Einstellungsparameter optimiert (Schallleistung, Stärkeregelung, Tiefe, Fokus, Bildraten und -verarbeitung) und für alle getesteten Proben konstant gehalten. Die Ergebnisse (Peakintensität, Dauer und Fläche unter der Intensität-gegen-Zeit-Kurve) sind in Tabelle 12 wiedergegeben.
Tabelle 12
Die in vivo-Ergebnisse zeigen, dass selbst bei einem reduzierten Gasdruck von 100 mbar die Formulierung noch hochwirksam war. Ähnliche Ergebnisse wurden zu Kontrasterhöhungsstudien des Myokards erhalten.
Beispiel 13
(Kontrastmittelherstellung aus einem Kit)
Die Stabilität von Gasmikrobläschen, die unter verschiedenen reduzierten Gasdrücken hergestellt worden waren, wurde bewertet. Phospholipide enthaltende Lyophilisate, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurden in Glasampullen (DIN8R) hergestellt und mit 55% C₄F₁₀ in Luft unter 500 und 1000 mbar gefüllt. Eine mit Salzlösung vorgefüllte Spritze (die 5 ml NaCl 0,9% Lösung enthielt) wurde zur Wiederherstellung mit der Ampulle verbunden. Bei der 1000 mbar Probe (bei 1 Atmosphäre) wurde ein Bio-Set^®-System verwendet, das mit einem Entlüftungsfilter ausgestattet war, um den aus der Zugabe des Volumens der Salzlösung in die Ampulle resultierenden Überdruck zu kompensieren, während bei der 500 mbar Probe keine Entlüftung erforderlich war. Da der Gasdruck in der Ampulle nur die Hälf te des atmosphärischen Drucks betrug, wenn die Spritze mit der Ampulle verbunden wurde, saugte das Vakuum (500 mbar) die Salzlösung automatisch ein, bis die Flüssigkeit (5 ml) vollständig aspiriert war. An diesem Punkt war der Gasdruck in der Ampulle durch einfaches Verdünnen wieder auf atmosphärischem Druck (1000 mbar). Zum Vergleich der Stabilität der anfangs unter dem normalen (1000 mbar) und reduzierten (500 mbar) Druck hergestellten Mikrobläschensuspensionen wurden bei t = 0 und 6 Stunden nach dem Verdünnen Coulter-Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse (Vergleich der Bläschenkonzentration und des Volumens zwischen t = 0 und 6 Stunden nach dem Verdünnen) sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Tabelle 13

* getestete Proben (n = 5)

Die Ergebnisse zeigen, dass die Stabilität der bei 500 mbar und 1000 mbar hergestellten Gasmikrobläschen vergleichbar ist.
Beispiel 14
(Stabilität des Lyophilisats unter reduziertem Gasdruck während der Lagerung)
Phospholipide enthaltende Lyophilisate, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurden in Glasampullen (DIN8R) hergestellt und mit 55% C₄F₁₀ in Luft unter Gasdrücken von 500, 750 beziehungsweise 1000 mbar gefüllt. Die Stabilität der lyophilisierten Proben unter den reduzierten Gasdrücken wurde nach 0, 1, 3 und 6 Monaten Lagerung bei 25°C und 40°C bewertet. Die Coul ter-Analysen (Bläschenkonzentration) sind nachfolgend wiedergegeben (Tabelle 14 und 2 und 4). Tabelle 14 Stabilitätsstudien bei 25°C und 40°C (Nb/ml)

* getestete Proben (n = 5)

Die Ergebnisse des Coulter-Zählers zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei lyophilisierten Proben, die mit unterschiedlichen Gasdrücken befüllt worden waren, nach 1 und 3 Monaten der Lagerung.
Die Druckbeständigkeit wurde in vitro mit einem spektrophotometrischen Verfahren bewertet. Die Bläschensuspensionen wurden 1/50 in einer Lösung von 0,9% Natriumchlorid verdünnt und in die Probenzelle eines Spektrophotometers (Jenway Modell 6100) eingebracht. Die Zelle wurde mit einem pneumatischen Ventil verbunden, das einen linearen Druckanstieg von 0 auf 700 mm Hg ermöglichte. Die simultane Aufzeichnung des Drucks (durch einen Drucksensor) und der Extinktion liefert typische Kurven, die die Bestimmung eines "kritischen Drucks" (Pc50) ermöglichen, der dem Druck entspricht, bei dem die Extinktion um 50% abgenommen hat.
Die in den 3 und 5 gezeigten Druckbeständigkeiten sind unabhängig von den Lagerungsbedingungen in hohem Maße konstant. Temperatur und Druck im Inneren der Ampulle haben keinen Einfluss auf diesen Parameter. Daraus folgt, dass es keinen signifikanten Einfluss der Dauer und der Temperatur der Lagerung auf die Bläschencharakteristika gibt (Druckbeständigkeit, Bläschenkonzentration).
Beispiel 15
Ampullen, die Zusammensetzung C enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten. Nach dem Gefriertrocknen wurden die Ampullen polarisiertem Heliumgas (erhalten von dem Laue-Langevin Institute, Grenoble, Frankreich) sowohl unter normalem (1000 mbar) als auch unter reduziertem Gasdruck (500 und 100 mbar) ausgesetzt. Nach Injektion von Salzlösung (1 ml) durch die Stopfen, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Bläschensuspensionen erhalten. Die Bläschensuspensionen (1 ml) wurden in die Halsvene von Ratten injiziert und Bildgebung in einem 2 Tesla MR-Bildgebungsgerät mit einem Magnet mit 17 cm Bohrung und einer Volumenspule mit 6 cm Durchmesser unterzogen, das auf sowohl ¹H- als auch ³He-Resonanzfrequenz einstellbar war. Die abdominelle Aorta war deutlich sichtbar. Es wurden keine erheblichen Unterschiede zwischen den Ampullen mit unterschiedlichen Gasdrücken nachgewiesen.

Claims

Kontrastmittel, das bei bildgebenden, diagnostischen Verfahren brauchbar ist, das Mikrobläschen eines Gases oder einer Gasmischung enthält, das durch Verdünnen eines lyophilisierbaren Materials in einem physiologisch verträglichen, flüssigen, wäßrigen Träger erhalten wurde, welches durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem man ein lyophilisierbares Material, das in einem Behälter enthalten ist, lyophilisiert, wobei das lyophilisierbare Material mindestens ein filmbildendes Phospholipidtensid enthält, man den Behälter dicht verschließt, dadurch gekennzeichnet, daß man den Behälter vor dem Verschließen unter Vakuum setzt und man anschließend das Gas oder die Gasmischung unter einem verminderten Druck zwischen 900 und 100 mbar in den Behälter einbringt.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, bei dem der reduzierte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der Gasmischung zwischen 700 und 300 mbar liegt.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, bei dem der reduzierte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der Gasmischung 500 mbar beträgt.
Kontrastmittel wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, bei dem das Gas aus der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus halogenierten Kohlenwasserstoffgasen, Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Helium, Krypton, Xenon, Argon, Methan, hyperpolarisierten Gasen, hyperpolarisierten Edelgasen, radioaktiven Gasen, Schwefelhexafluorid und Mischungen davon besteht.
Kontrastmittel nach Anspruch 4, bei dem das Gas aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus fluorierten Gasen besteht, einschließlich Schwefelhexafluorid, Perfluorkohlenstoffen oder Mischungen davon.
Kontrastmittel nach Anspruch 5, bei dem die Perfluorkohlenstoffe aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Perfluoralkanen, wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropanen, Perfluorbutanen, Perfluorpentanen, Perfluorhexanen, Perfluorheptanen; Perfluoralkenen, wie Perfluorpropen, Perfluorbutenen, Perfluorbutadien, Perfluoralkinen, wie Perfluorbut-2-in; Perfluorcycloalkanen, wie Perfluorcyclobutan, Perfluormethylcyclobutan, Perfluordimethylcyclobutanen, Perfluortrimethylcyclobutanen, Perfluorcyclopentan, Perfluormethylcyclopentan, Perfluordimethylcyclopentanen, Perfluorcyclohexan, Perfluormethylcyclohexan, Perfluorcycloheptan und Mischungen davon besteht.
Kontrastmittel nach Anspruch 6, bei dem die Perfluorkohlenstoffe aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluorpentan, Perfluorhexan und Mischungen davon besteht.
Kontrastmittel nach Anspruch 4, bei dem das hyperpolarisierte Gas aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus hyperpo larisiertem Helium, hyperpolarisiertem Xenon, hyperpolarisiertem Neon und Mischungen davon besteht.
Kontrastmittel nach Anspruch 4, bei dem die radioaktiven Gase aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Xe¹³³ oder Kr⁸¹ und Mischungen davon besteht.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das filmbildende Phospholipidtensid ein gesättigtes Phospholipid oder ein synthetisches, ungesättigtes Phospholipid oder eine Mischung davon ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 10, bei dem das gesättigte Phospholipid aus gesättigter Phosphatidsäure, gesättigtem Phosphatidylcholin, gesättigtem Phosphatidylethanolamin, gesättigtem Phosphatidylserin, gesättigtem Phosphatidylglycerin, gesättigtem Phosphatidylinositol, Cardiolipin und Sphingomyelin und Mischungen davon ausgewählt ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 11, bei dem das gesättigte Phospholipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Diarachidoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Distearoylphosphatidylserin, Diarachidoylphosphatidylserin, Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Distearoylphosphatidylglycerin, Diarachidoylphosphatidylglycerin, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Distearoylphosphatidylethanolamin, Diarachidoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphospha tidsäure, Distearoylphosphatidsäure, Diarachidoylphosphatidsäure, Dimyristoylphosphatidylinositol, Dipalmitoylphosphatidylinositol, Distearoylphosphatidylinositol oder Diarachidoylphosphatidylinositol und Mischungen davon besteht.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, bei dem das lyophilisierte Material weiter Viskositätsverstärker oder Stabilisatoren enthält, die aus linearem und vernetztem Poly- und Oligosacchariden, Zuckern, hydrophilen Polymeren, wie Polyoxypropylenglycol und Polyoxyethylenglycol, ausgewählt sind.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, bei dem das lyophilisierte Material weiter bis zu 50 Gew.-% an nicht-phospholipid-Tensiden enthält, die aus Fettsäuren, Estern und Ethern von Fettsäuren und Alkoholen mit Polyolen ausgewählt sind.
Abgedichteter Behälter, der ein lyophilisiertes Material und ein Gas oder eine Gasmischung zur Verwendung als Kontrastmittel bei der bildgebenden, diagnostischen Untersuchung enthält, wobei das lyophilisierte Material mindestens ein filmbildendes Phospholipidtensid enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas oder die Gasmischung, die in dem abgedichteten Behälter enthalten ist, einen reduzierten Druck zwischen 900 und 100 mbar hat.
Abgedichteter Behälter nach Anspruch 15, in dem der reduzierte Druck des Gases oder der Gasmischung zwischen 700 und 300 mbar liegt.
Abgedichteter Behälter nach Anspruch 15 oder 16, in dem der reduzierte Druck des Gases oder der Gasmischung vorzugsweise 500 mbar ist.
Abgedichteter Behälter wie in einem der Ansprüche 15 bis 17 beansprucht, bei dem das Gas aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus halogenierten Kohlenwasserstoffgasen, Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Helium, Krypton, Xenon, Argon, Methan, radioaktiven Gasen, hyperpolarisierten Gasen, Schwefelhexafluorid und Mischungen davon besteht.
Abgedichteter Behälter nach einem der Ansprüche 15 bis 18, bei dem das filmbildende Phospholipidtensid ein gesättigtes Phospholipid oder ein synthetisches, ungesättigtes Phospholipid oder eine Mischung davon ist.
Abgedichteter Behälter nach Anspruch 19, bei dem das gesättigte Phospholipid aus Phosphatidsäure, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinositol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen davon ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Kontrastmittels, das ein Gas oder eine Gasmischung enthält und bei der diagnostischen, bildgebenden Untersuchung brauchbar ist, bei dem man lyophilisierbares Material, das in einem Behälter enthalten ist, lyophilisiert, wobei das lyophilisierbare Material mindestens ein filmbildendes Phospholipidtensid enthält, man den Behälter dicht verschließt, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Verschließen des Behälters den Behälter unter Vakuum setzt und man das Gas oder die Gasmischung mit einem reduzierten Druck zwischen 900 und 100 mbar in den Behälter einbringt.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der reduzierte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der Gasmischung vorzugsweise zwischen 700 und 300 mbar liegt.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, bei dem der reduzierte Druck des in den Behälter eingebrachten Gases oder der Gasmischung besonders bevorzugt 500 mbar beträgt.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 21 bis 23 beansprucht, bei dem das Gas oder die Gasmischung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus halogenierten Kohlenwasserstoffgasen, Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Helium, Krypton, Xenon, Argon, Methan, radioaktiven Gasen, hyperpolarisierten Gasen, Schwefelhexafluorid und Mischungen davon besteht.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 21 bis 24 beansprucht, bei dem das filmbildende Phospholipidtensid ein gesättigtes Phospholipid oder ein synthetisches, ungesättigtes Phospholipid oder eine Mischung davon ist.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das gesättigte Phospholipid aus Phosphatidsäure, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinositol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das gefriergetrocknete Material weiter Substanzen enthält, die aus Dicethylphosphat, Cholesterin, Ergosterin, Phytosterin, Sitosterin, Lanosterin, Tocopherol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat und butyliertem Hydroxytoluol ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das gefriergetrocknete Material weiter einen Viskositätsverstärker oder Stabilisatoren enthält, die aus linearen oder vernetzten Poly- und Oligosacchariden, Zuckern, hydrophilen Polymeren, wie Polyoxypropylenglycol und Polyoxiethylenglycol, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das gefriergetrocknete Material weiter bis zu 50 Gew.-% an nicht-phospholipid-Tensiden enthält, die aus Fettsäuren, Estern und Ethern von Fettsäuren und Alkoholen mit Polyolen ausgewählt sind.
Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren, wiederhergestellten Suspension von luft- oder gasgefüllten Mikrobläschen, die als bildgebendes Kontrastmittel bei der bildgebenden, diagnostischen Untersuchung geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhalt des in einem der Ansprüche 15 bis 20 beanspruchten Behälters mit Wasser oder einer physiologisch verträglichen, wäßrigen Trägerflüssigkeit gemischt wird.
Verwendung eines abgedichteten Behälters, wie in einem der Ansprüche 15 bis 20 beansprucht, zur Herstellung einer injizierbaren, wäßrigen Suspension von gasgefüllten Mikrobläschen durch Verdünnen des Inhalts davon mit einem phy siologisch verträglichen, wäßrigen Träger, zur Verwendung bei der Diagnose, die eine bildgebende, diagnostische Ultraschalluntersuchung umfaßt, in der Nuklearmedizin oder Magnetresonanzbildgebung.
Zweikomponentenkit, der als erste Komponente ein gefriergetrocknetes Material und ein Gas oder eine Gasmischung, die in einem Behälter enthalten sind, wie in einem der Ansprüche 15 bis 20 beansprucht, und als zweite Komponente eine physiologisch verträgliche Trägerflüssigkeit enthält, die beim Mischen mit der ersten Komponente ein injizierbares Ultraschallkontrastmittel oder Kontrastmittel für die Magnetresonanzbildgebung ergibt.
Verwendung eines Kontrastmittels gemäß Anspruch 1 bis 14 in der Ultraschallechographie.
Verwendung eines Kontrastmittels gemäß Anspruch 8 bei der Magnetresonanzbildgebung.
Verwendung eines Kontrastmittels gemäß Anspruch 9 in der Nuklearmedizin.