CN103099780A

CN103099780A - 制备含氢气微泡水溶液的方法,其产品及应用

Info

Publication number: CN103099780A
Application number: CN2012105331139A
Authority: CN
Inventors: 郑海荣; 严飞; 靳巧锋; 杨伟; 邓志婷
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd., Guangzhou
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2032-12-11
Also published as: CN103099780B

Abstract

本发明涉及一种含氢气药物新剂型。通过使用磷脂包裹，将氢气制成含氢气微泡水溶液，大大提高了溶液中氢气的含量、浓度可控，且更加稳定。此外，由于采用微泡技术，使得到的含氢气微泡水溶液还可以用作超声造影剂，具有多重功能效果。

Description

制备含氢气微泡水溶液的方法,其产品及应用

【技术领域】

本发明涉及一种生物医疗领域，具体涉及含氢气微泡水溶液的制备，其产品及应用。

【背景技术】

近年来，氢气在生物医疗方面的应用越来越引起人们的兴趣。

Dole等(Science，1975，4210：152-154)在《科学》杂志发表了连续呼吸8个大气压97.5％氢气(2.5％氧)14天，高压氢气可有效治疗动物皮肤恶性肿瘤的论文，一方面可降低氧气的浓度，另一方面提高了氢气在机体内的浓度。

法国潜水医学家Gharib等(Life Sciences，2001，324：719-724)也报道证明，呼吸8个大气压高压氢气可治疗肝寄生虫感染引起的炎症反应，首次证明氢气具有抗炎作用，并提出氢气与羟自由基直接反应是治疗炎症损伤的基础。

日本医科大学Ohsawa教授(Nature Medicine，2007，13：688-694)报道，呼吸2％的氢气就可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤。他们采用化学反应、细胞学等手段证明，氢气溶解在液体中可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子，而后两者是氧化损伤的最重要介质。

因此认为，氢气治疗脑缺血再灌注损伤的基础是选择性抗氧化作用，提出氢气可选择性中和毒性自由基，是一种选择性抗氧化物质。该发现让世界生物学界再次把眼光投向这个小小的气体分子，迅速引起广泛关注并引起了研究氢气治疗疾病的热潮。

随后，该研究组又在肝和心肌缺血动物模型，证明呼吸2％的氢气可治疗肝和心肌缺血再灌注损伤(BBRC，2007，361：670-674)。美国匹斯堡大学移植中心发表了呼吸2％的氢气可治疗小肠移植引起的炎症损伤的文章(Am JTransplant.2008，8(10)：2015-24)。第二军医大学孙学军教授的实验室发表了呼吸2％的氢气可治疗新生儿脑缺血缺氧损伤的文章(Neuroscience Letters，2008，441：167-172)。

从疾病发生机制上考虑，氧化损伤几乎是所有疾病的最基本病理生理过程，氢气既然是选择性抗氧化物质，就有可能对人类大部分疾病具有治疗作用。大量动物试验也证明，氢气可通过减少氧化损伤、炎症性损伤、细胞凋亡等病理过程，对40多种人类常见疾病具有显著的治疗效果。例如脑、心脏、其他各类重要器官如肝、肾和小肠缺血再灌注损伤；再如各类与衰老有关的神经退行性疾病老年性痴呆、巴金森病、糖尿病和肥胖等；还如各类炎症性疾病，如关节炎、全身炎症反应等等。

虽然氢气对许多疾病具有潜在的治疗价值，但到目前为止，由于没有大规模临床证据，尚没有任何一项研究可以明确肯定这种临床治疗价值。但关于氢气治疗疾病的临床研究正逐渐增加，如在糖尿病、肾衰、中风、皮肤病、肝癌后放射治疗造成的损伤等方面都有氢气治疗有效的文献报道。

目前用于治疗的氢气应用方式主要有呼入氢气、口服含氢气水和注射饱和氢气生理盐水三种类型。然而，这三种方式在实际应用中各自都存在一些问题。

直接呼入氢气：由于氢气的易燃易爆的特性，呼入高压高氢气存在巨大的安全隐患，虽然将氢气体积浓度降低到4％可以避免爆炸，但大量氢氧混合物的制备、存储、运输都有巨大的风险，并且为了安全起见，需要一系列复杂的设备及严格的操作来保证呼吸氢气的安全性。

口服富含氢气水：虽然每天口服富含氢气水似乎更具有可行性，但由于氢气在水中的溶解度极低，加上氢气容易渗透和扩散，富含氢气水的制备和存储都有一定的难度。另外，通过口服的方式递送氢气具有很大的不确定性，供给氢气的浓度和位置都不可控，更适合持续的饮用来起保健作用，不适应于临床疾病应用。

注射饱和氢气生理盐水：采用注射的方式供给氢气，比口服在剂量控制，给药时间和反复给药上更有优势，更容易控制浓度和位置，更具有临床前景。但由于氢气在水中低溶解和易扩散等性质，需要注射的量相对较大，每千克需要注射5-10ml的量，而且氢气浓度不稳定，存储时间短。

由于氢气的高度可燃性及在水中极低的溶解性，20℃的常压条件下，1体积水中的只能溶解0.0182体积的氢气，目前除了通过加压的办法来提高氢气在水中的溶解度，尚没有看到有更有效的报道。因此，有必要开发更有效的氢气递送介质和途径，提高氢气在水中的溶解度用于医疗应用。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术中用于医疗用途的氢气溶液中氢气溶解度低、浓度不稳定且难以控制、储存时间短的问题。

为此，本发明一方面提供一种用于制备含氢气微泡水溶液的方法，包括步骤：

S1形成磷脂薄膜：于容器中使用低沸点有机溶剂溶解磷脂，之后以惰性气流除去低沸点有机溶剂，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜，其中

所述磷脂为20个C原子的硬脂酸链，12-24个C原子的脂肪酸对应的双链磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，它们的混合物或经抗体、多肽靶向修饰的衍生物；

S2薄膜水化：添加pH为7-7.4的水性缓冲液到所述容器中，加热并保持在所述磷脂薄膜的相转变温度以上，超声分散所述磷脂薄膜到水性缓冲液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液；

S3气体置换：将所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置换容器内空气为氢气混合气体，其中氢气的体积百分数为0-90％；以及

S4震荡形成含氢气微泡水溶液。

所述磷脂可以为1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000修饰的硬脂酸单酯、硬质酸聚乙二醇2000酯、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸，或它们的混合物，并且尤其可以为1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱与聚乙二醇酯的混合物，其中1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱的摩尔比百分数为85-90％，并且其中聚乙二醇酯选自聚乙二醇2000修饰的硬脂酸单酯、硬质酸聚乙二醇2000酯，或它们与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸的混合物。

步骤S1还可以包括真空干燥所述磷脂薄膜的操作。

所述水性缓冲液可以为磷酸缓冲溶液、甘油-丙二醇-Tris三羟基氨甲烷混合溶液、生理盐水，或它们的混合物。

所述磷脂水混合溶液中，磷脂的浓度可以为0.5-15mg/ml。

所述氢气混合气体可以为氢气与六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮气，或它们的混合物的混合气体，并且尤其可以为氢气与三氟丙烷的混合气体，并且氢气与三氟丙烷的体积比为1∶1-3。

所述步骤S4可以通过机械震荡、探头式细胞破碎机超声、声振法、微流控芯片、冻干再水化法进行。

本发明另一方面提供一种根据本发明的方法制备得到的含氢气微泡水溶液，其特征在于，所述含氢气微泡水溶液中的氢气含量大于50ul/ml。

本发明再一方面提供该含氢气微泡水溶液在制备抗炎症、肿瘤、缺血再灌注损伤的药物中的应用，其特征在于，所述抗炎症、肿瘤、缺血再灌注损伤的药物用于治疗肿瘤、缺血再灌注损伤、肾炎、肝炎、动脉粥样硬化，并且所述药物同时具有超声造影的功能。

所述药物可以通过静脉注射，或静脉输注给药。所述药物中的含氢气微泡可通过超声探头控制释放。

本发明具有以下优点：通过用磷脂膜包裹氢气形成微泡，大大提高了氢气在水中的溶解度、溶液中氢气的浓度可控，且更稳定。由此得到的含氢气微泡水溶液在应用中不仅可以降低使用剂量，还兼具超声造影功能。

【附图说明】

图1为氢气氟碳混合气体微泡溶液(左)和纯氢气微泡溶液(右)。

图2为根据本发明用于制备含氢气微泡水溶液的方法流程图

图3为氢气微泡的氢气含量测量装置示意图。

图4为根据本发明制备得到的含氢气微泡水溶液中氢气微泡的粒径分布及浓度。

图5为根据本发明制备得到的含氢气微泡水溶液中氢气微泡的形貌图。

图6A和6B分别为使用本发明的含氢气微泡水溶液处理大鼠心肌缺血前后的心电图。

图7A-C为使用本发明的含氢气微泡水溶液治疗心肌缺血，使用氯化硝基四氮唑蓝液(NBT)的染色对照图。

【具体实施方式】

本发明提出一种以氢气作为药物的新剂型，来改善目前氢气药物溶液中，氢气溶解度低，浓度不易控制，且稳定性差的问题。

本发明人注意到，超声造影技术中，通过使用磷脂包裹气泡形成气体微泡可以获得具有较高气体含量的微泡溶液。然而，由于氢气分子体积小，具有极强的扩散性，单纯的氢气几乎不能被制备造影剂微泡的磷脂包裹形成气泡，更不能用于造影和治疗。

为此，本发明人通过两种方案对这个问题进行了优化：

一方面使用氢气混合气体，即氢气与六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮气等气体的混合气体。由于氟碳、氮气等气体具有较大的分子量和分子体积，不容易穿过磷脂膜，从而可以起到骨架支撑的作用，使氢气能够分布在气泡内。

第二方面在于：要制作氢气微泡，需要对常用作微泡造影剂的材料进行改进，通过改进磷脂材料的种类，以增加外壳的厚度及紧密性，来提高磷脂膜对氢气的包裹能力。本申请中，发明人将磷脂改成疏水性链的长度为20个碳原子的磷脂，例如1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱(20∶0，PC)，或是22个甚至24个碳链长度的磷脂，等等，来提高氢气微泡的稳定性。

图1为氢气氟碳混合气体微泡溶液(左图)和纯氢气微泡溶液(右图)。从图中可见，单纯的氢气几乎不能形成微泡，或者形成极少部分的泡沫(右图)，而氟碳和氢气的混合，可以得到具有丰富泡沫的溶液(左图)。

总体上，本发明制作含氢气微泡水溶液的方法包括四个步骤，参见图2所示的流程图。

首先，是步骤S1形成磷脂薄膜：于容器中使用低沸点有机溶剂溶解磷脂，之后以惰性气流除去低沸点有机溶剂，以在所述容器壁上形成磷脂薄膜。

为了能够更完全地去除溶剂，还可以将得到的磷脂薄膜在真空烘箱中干燥处理。例如在45℃干燥2小时，或更久。

低沸点溶剂为能够溶解磷脂的有机溶剂，其沸点通常低于65℃，从而能够容易地使用惰性气流(如氮气流)除去。例如，低沸点溶剂可以是三氯甲烷、甲醇、乙醚或他们的混合溶剂等。

磷脂如上文所示，可以是20个C原子的硬脂酸链，或是12-24个C原子的脂肪酸对应的双链磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油，或是它们的混合物。此外，磷脂还可以进行修饰，例如使用抗体、多肽等对磷脂进行修饰，已得到具有靶向功能的磷脂衍生物。

具体地，磷脂可以使用1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000修饰的硬脂酸单酯、硬质酸聚乙二醇2000酯、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸，或它们的混合物，例如当磷脂为1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱与聚乙二醇酯的混合物时，前者的摩尔比百分数可以为85-90％。聚乙二醇酯可以是聚乙二醇2000修饰的硬脂酸单酯、硬质酸聚乙二醇2000酯，或它们与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸的混合物。

接下来是步骤S2薄膜水化：添加pH为7-7.4的水性缓冲液到所述容器中，加热并保持在所述磷脂薄膜的相转变温度以上，超声分散所述磷脂薄膜到水性缓中液中，至溶液透明，形成磷脂水混合溶液。

使用中性或弱碱性缓冲液是为了与生理环境保持等渗透性。该缓冲液可以是磷酸缓冲溶液、甘油-丙二醇-Tris三羟基氨甲烷混合溶液、生理盐水，或它们的混合物。缓冲液的量对最终得到的含氢气微泡水溶液中氢气微泡的包膜厚度有影响，通常情况下，磷脂水混合溶液中，磷脂的浓度可以为0.5-15mg/ml。

随后是步骤S3气体置换：将所述磷脂水混合溶液置于密封容器中，置换容器内空气为氢气混合气体，其中氢气的体积百分数为0-90％。

密封容器可以是例如西林瓶这样的容器。氢气混合气体如上文所示，可以为氢气与六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮气，或它们的混合物的混合气体。优选的情况中，氢气混合气体为氢气与三氟丙烷的混合气体，并且氢气与三氟丙烷的体积比为1∶1-3。

最后是步骤S4：震荡形成含氢气微泡水溶液。

该步骤可以通过机械震荡、探头式细胞破碎机超声、声振法、微流控芯片、冻干再水化法，等方法进行。

使用本发明的方法得到的含氢气微泡水溶液中，氢气含量通常大于50ul/ml。这远远大于现有技术中氢气在水中的溶解度(约10ppm)。

本发明得到的含氢气微泡水溶液具有氢气的治疗作用，可以用来制备抗炎药物，例如用于治疗肿瘤、缺血再灌注损伤、肾炎、肝炎、动脉粥样硬化。另外，由于制成了含氢气微泡水溶液的剂型，其还具有超声造影的功能，可以同时用作超声造影剂。其给药方式包括静脉注射，或静脉输注等等。

当所用的磷脂为经靶向修饰的磷脂时，本发明的含氢气微泡水溶液还具有靶向标记作用。这进一步扩大了氢气在治疗上的应用范围，和治疗效果。

而且，由于微泡具有超声敏感性，本发明制备的含氢气微泡水溶液在用于治疗时，可以通过使用超声探头控制氢气的释放。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

实施例1

含氢气微泡水溶液的制备

S1按90∶10摩尔比将一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱(20∶0，PC)，聚乙二醇2000修饰的1、2-二硬脂酰甘油基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)在三氯甲烷中用涡旋混合器混匀。用干燥的氮气流除去三氯甲烷使溶解的材料在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中45℃干燥2小时以上。

S2根据上述磷脂的总质量，加入一定体积pH为7.4的缓冲溶液(含10％(体积比)甘油、10％(体积比)丙二醇和80％(体积比)0.1M的Tris三羟基氨甲烷)，将磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最终浓度为3mg/ml。加热到70℃以上，使其从试管壁上脱落。保持水温在70℃以上用水浴式超声震荡器使磷脂水混合物彻底分散直至完全透明。

S3以1毫升/瓶将磷脂水混合溶液装入2毫升的西林瓶中，用橡胶塞和铝塑盖封口后，将西林瓶内部的空气置换成氢气和全氟丙烷体积比为1∶1的混合气体。

S4用频率为4500次/分钟的机械震荡器震荡45秒到90秒，得到均匀丰富的微泡。

氢气含量检测

使用如图3所示的测量装置，用注射器抽取上述微泡1ml，注入1L总容量的上嘴抽滤瓶中，将出口用配套的有孔带导气管橡胶塞塞紧，导气管的出口及抽滤瓶的上嘴口分别与氢气检测仪GT901的进气和出气口形成密闭循环。按下检测仪开关进行检测，待读数稳定后得到气体体积分数为Nppm，经换算，Nppm相当于每升瓶中气体含氢气N ul，即1ml微泡即含有N ul的氢气。

针对该实施例，取1ml该微泡用氢气检测装置分析，1ml氢气微泡含有87.2ul氢气。与1ml的饱和氢气水中的氢气含量10ppm相比，有了8倍左右的提高。

氢气微泡的浓度及粒径分布测试

用移液器取2.5微升上述微泡，注入到PSS780A颗粒计数分析仪的样品腔中，测量得到氢气微泡的粒径分布及浓度，取一滴稀释后夹在载玻片上，用显微镜观察并拍照。

图4所示为该实施例制备得到的含氢气微泡水溶液中氢气微泡的粒径分布及浓度。从图中可见，99％以上的微泡小于8um，小于1微米的微泡占据了微泡数量的绝大部分，平均粒径为1.03um，能够安全的通过肺循环，微泡的浓度达到了每毫升1.33×10¹⁰个。

图5为该实施例制备得到的含氢气微泡水溶液中氢气微泡显微镜下的形貌图。从图中可见，微泡分布相对均匀，具有良好的分散性质，明场显微镜下呈现出暗色的磷脂外壳包围着亮的气体核心，为典型的微泡结构。

心肌缺血再灌注试验

腹腔麻醉后，全程心电图监测，如图6所示，图6A和6B分别为使用该实施例含氢气微泡水溶液处理大鼠心肌缺血前后的心电图。

从图中可见，缺血前后的心电图ST段抬高，为心肌缺血的典型心电图。后期通过依注射文思蓝染色，确定缺血模型建立成功。

对照组：

进行左冠状动脉结扎手术形成心肌缺血再灌注模型，再灌注前3分钟通过静脉注射0.5ml的生理盐水。3分钟后打开结扎部位，再灌注3小时后，注射伊文斯兰染色，确定缺血区和非缺血区。然后通过氯化硝基四氮唑蓝液(NBT)染色确定梗死区和非梗死区，通过重量法测量心肌平均梗死范围为42.73％左右(图7A)。

氢气治疗组：

左冠状动脉结扎手术形成心肌缺血再灌注模型后，再灌注前3分钟通过静脉注射0.1ml的上述氢气微泡，3分钟后打开结扎部位，再灌注3小时后，注射伊文斯兰染色，确定缺血区和非缺血区，然后通过氯化硝基四氮唑蓝液(NBT)染色确定梗死区和非梗死区，通过重量法测量心肌平均梗死范围为27.43％左右(图7B)。

氢气+超声治疗组：

左冠状动脉结扎手术形成心肌缺血再灌注模型后，再灌注前3分钟通过静脉注射0.1ml的上述氢气微泡，用频率2.25M聚焦深度5cm的单振元超声探头，4.5％占空比辐照心脏区域30秒，进行氢气释放，3分钟后打开结扎部位，再灌注3小时后，注射伊文斯兰染色，确定缺血区和非缺血区，然后通过氯化硝基四氮唑蓝液(NBT)染色确定梗死区和非梗死区，通过重量法测量心肌平均梗死范围为22.56％左右(图7C)。

实施例2

含氢气微泡水溶液的制备

S1按90∶10摩尔比将一定量的1，2-二二十二烷基脂肪酰甘油基磷脂酰胆碱(22∶0PC)，聚乙二醇2000修饰的1、2-二硬脂酰甘油基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)在三氯甲烷中用涡旋混合器混匀。用干燥的氮气流除去三氯甲烷使溶解的材料在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中45℃干燥2小时以上。

S2根据上述磷脂的总质量，加入一定体积pH为7.4的缓冲溶液(含10％(体积比)甘油、10％(体积比)丙二醇和80％(体积比)0.1M的Tris三羟基氨甲烷)，将磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最终浓度为3mg/ml。加热到70℃以上，使其从试管壁上脱落。保持水温在80℃以上用水浴式超声震荡器使磷脂水混合物彻底分散直至完全透明。

S3以1毫升/瓶将磷脂水混合溶液装入2毫升的西林瓶中，用橡胶塞和铝塑盖封口后，将西林瓶内部的空气置换成氢气和全氟丙烷体积比为1∶3的混合气体。

氢气含量检测

取1ml该微泡用上述氢气检测装置分析，测得1ml氢气微泡含有50.7ul氢气。和1ml的饱和氢气水中的氢气含量10ppm相比，有了5倍左右的提高。

实施例3

含氢气微泡水溶液的制备

S1按85∶15摩尔比将一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱(20∶0，PC)，硬质酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)在三氯甲烷中用涡旋混合器混匀。用干燥的氮气流除去三氯甲烷使溶解的材料在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中45℃干燥2小时以上。

S3然后1毫升/瓶装入2毫升的西林瓶中，用橡胶塞和铝塑盖封口后，将西林瓶内部的空气置换成氢气和全氟丙烷体积比为1∶1的混合气体。

氢气含量检测

取1ml该微泡用上述氢气检测装置分析，测得1ml氢气微泡含有80.5ul氢气。和1ml的饱和氢气水中的氢气含量10ppm相比，有了7倍左右的提高。

实施例4

含氢气微泡水溶液的制备

S1按90∶10摩尔比将一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱(20∶0，PC)，硬质酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)在三氯甲烷中用涡旋混合器混匀。用干燥的氮气流除去三氯甲烷使溶解的材料在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中45℃干燥2小时以上。

根据上述磷脂的总质量，加入一定体积pH为7.4的缓冲溶液(含10％(体积比)甘油、10％(体积比)丙二醇和80％(体积比)0.1M的Tris三羟基氨甲烷)，将磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最终浓度为3mg/ml。加热到70℃以上，使其从试管壁上脱落。保持水温在70℃以上用水浴式超声震荡器使磷脂水混合物彻底分散直至完全透明。

S4在通入氢气和全氟丙烷1∶1混合气体的情况下，用探头式细胞破碎机超声30s即可得到丰富的白色泡沫。

氢气含量检测

取1ml该微泡用上述氢气检测装置分析，测得1ml氢气微泡含有60.3ul氢气。和1ml的饱和氢气水中的氢气含量10ppm相比，有了6倍左右的提高。

实施例5

含氢气微泡水溶液的制备

S1按90∶5∶5的摩尔比将一定量的1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱(24∶0，PC)，硬质酸聚乙二醇2000酯(PEG40S)，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸(DSPC-PEG-folate)在三氯甲烷中用涡旋混合器混匀。用干燥的氮气流除去三氯甲烷使溶解的材料在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中45℃干燥2小时以上。

根据上述磷脂的总质量，加入一定体积pH为7.4的缓冲溶液(含10％(体积比)甘油、10％(体积比)丙二醇和80％(体积比)0.1M的Tris三羟基氨甲烷)，将磷脂混合物薄膜水化，使得磷脂的最终浓度为3mg/ml。加热到70℃以上，使其从试管壁上脱落。保持水温在85℃以上用水浴式超声震荡器使磷脂水混合物彻底分散直至完全透明。

S4用频率为4500次/分钟的机械震荡器震荡45秒到90秒，得到具有叶酸配体的氢气微泡。

氢气含量检测

取1ml该微泡用上述氢气检测装置分析，1ml氢气微泡含有74.5ul氢气。和1ml的饱和氢气水中的氢气含量10ppm相比，有了7.5倍左右的提高。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种用于制备含氢气微泡水溶液的方法，包括步骤：

S4震荡形成含氢气微泡水溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂为1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000修饰的硬脂酸单酯、硬质酸聚乙二醇2000酯、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸，或它们的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷脂为1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱与聚乙二醇酯的混合物，其中1，2-花生酰甘油基磷脂酰胆碱的摩尔比百分数为85-90％，并且其中聚乙二醇酯选自聚乙二醇2000修饰的硬脂酸单酯、硬质酸聚乙二醇2000酯，或它们与1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-叶酸的混合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1还包括真空干燥所述磷脂薄膜的操作。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水性缓冲液为磷酸缓冲溶液、甘油-丙二醇-Tris三羟基氨甲烷混合溶液、生理盐水，或它们的混合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂水混合溶液中，磷脂的浓度为0.5-15mg/ml。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氢气混合气体为氢气与六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、全氟戊烷、氮气，或它们的混合物的混合气体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氢气混合气体为氢气与三氟丙烷的混合气体，并且氢气与三氟丙烷的体积比为1∶1-3。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4通过机械震荡、探头式细胞破碎机超声、声振法、微流控芯片、冻干再水化法进行。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法制备得到的含氢气微泡水溶液，其特征在于，所述含氢气微泡水溶液中的氢气含量大于50ul/ml。

11.权利要求10所述的含氢气微泡水溶液在制备抗炎症、肿瘤、缺血再灌注损伤的药物中的应用，其特征在于，所述抗炎症、肿瘤、缺血再灌注损伤的药物用于治疗肿瘤、缺血再灌注损伤、肾炎、肝炎、动脉粥样硬化，并且所述药物同时具有超声造影的功能。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗炎症、肿瘤、缺血再灌注损伤的药物通过静脉注射，或静脉输注给药。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗炎症、肿瘤、缺血再灌注损伤的药物的含氢气微泡可通过超声探头控制释放。