CN105012339A - 氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤的药物中的应用，实验结果表明，氢气能显著降低肢体缺血-再灌注丙二醛（MDA）及8-异前列腺素F2 α（8-iso-PGF2 α）的升高，保护超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，减少脂质过氧化，保护组织细胞结构和功能的完整性，有效地保护肢体缺血-再灌注所造成的组织损伤，对临床预防和治疗肢体缺血-再灌注损伤具有重要意义。

Description

氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
肢体缺血-再灌注损伤是指缺血的肢体在血流恢复时，造成比因缺血引起的还要严重的组织损伤。肢体缺血-再灌注损伤常见于骨外科、创伤外科、血管外科等，是一临床常见而严重的问题，其后果是通过一系列病理生理反应最终导致组织细胞的损伤乃至坏死，甚至出现危及生命的严重并发症。尽管对缺血-再灌注损伤进行了大量研究，但其机制至今仍不甚明了，也无十分有效的预防和治疗方法。
近年来，氢气的生物学效应得到了广泛的研究。氢是自然界最简单的元素，氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。以往大多学者一直认为氢气属于生理性惰性气体。2007年日本学者Ohsawa等发现吸入2% 氢气可成功减少脑卒中大鼠模型脑梗死面积并改善预后，氢气被认为具有选择性抗氧化应激作用。此后众多学者用不同的动物模型验证了氢气对各组织器官缺血-再灌注损伤的保护作用，但这些研究多集中于心、脑、肾、肝、肠等器官，对肢体的研究相对较少。给氢的途径主要为吸入氢气、静脉或腹腔注射富氢盐水、饮用氢水等，腹腔注射氢气的给氢途径少有研究。迄今，关于腹腔注射氢气能否预防肢体缺血-再灌注损伤的研究尚未见报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用。为实现上述发明目的，提供如下技术方案 ：
氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用。其中氢气纯度≥99.999%，用氢气发生器电解水产生。氢气给予途径为腹腔注射，根据不同的动物及实验模型，用量为5 ～ 10mL/kg。
进一步，氢气在制备预防肢体缺血-再灌注引起脂质过氧化的药物中的应用。
更进一步，所述脂质过氧化程度的判定是通过检测相关指标进行。
再进一步，所述的相关指标是丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。
本发明的有益效果在于 ：本发明公开了氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用，通过建立家兔肢体缺血-再灌注损伤模型，①检测血清MDA含量和SOD活性。MDA和SOD是反映脂质过氧化程度的一对指标。②检测8-iso-PGF2α水平和GSH-Px活性。8-iso-PGF2α为一种体内反应氧化损伤的可靠指标，被认为是测量体内氧化应激的金标准。GSH-Px是机体内抗氧化系统中重要的抗氧化剂。
通过上述指标的检测，证实腹腔注射氢气能减少脂质过氧化，保持氧化还原平衡，保护组织细胞结构和功能的完整性，有效地保护肢体缺血-再灌注所造成的组织损伤。
本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：采用腹腔注射氢气预防肢体缺血-再灌注损伤，方法简便、安全、副作用小、费用低，效果明显，可作为一种防治肢体缺血-再灌注损伤的有效的新方案。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案做进一步的说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤血清MDA和SOD活性的影响。
实验方法：制备家兔肢体缺血-再灌注损伤动物模型，检测血清MDA含量和SOD活性，证实腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤的预防作用。
具体通过以下步骤完成：
1. 氢气制备：使用M177021氢气发生器（北京中西远大科技有限公司生产）电解水方式产生氢气，纯度为99.999%。
2. 实验动物：健康成年雄性新西兰大耳白兔30只，体质量(2.21±0.13) kg。动物购进后在SPF级动物房分笼饲养1周，饲养环境为室温25°C，湿度40%~60%。实验前12h禁食，但正常饮水。
3. 动物分组及模型建立：30只动物随机分为三组：假手术组（Sham组），缺血-再灌注组（I/R组）和缺血-再灌注+腹腔注射氢气组（IRH组），每组10只。建立兔肢体缺血-再灌注动物模型：30只动物皆自耳缘静脉注射0.20%的乌拉坦5ml/kg进行麻醉，右腹股沟区小心剪毛，勿伤及皮肤，消毒，铺盖无菌洞巾，沿股血管神经走行方向切开皮肤，在解剖显微镜下分离暴露股动、静脉及股神经。I/R组与IRH组动物用微血管夹夹闭股动脉，在后肢近侧端用橡皮止血带进行环扎阻断侧枝循环，以保证右后肢血液完全断流。2h后除去血管夹及橡皮止血带，恢复血供。Sham组动物只切开腹股沟处皮肤暴露股血管，不进行夹闭股动脉及环扎后肢。在松开血管夹恢复血供前10min时，IRH组每只动物腹腔注射氢气10 mL/kg，60 s内注射完毕。其他两组每只动物分别注射等体积的空气。
4. 血样采集：在再灌注后6h，三组动物分别自股静脉抽取血液2ml，2500 r/min离心10 min，抽取上部血清至试管，置于-20°C冰箱保存，以备检测。
5. 指标检测：MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体检测步骤按试剂盒说明书进行。
6. 统计分析：所得数据以均数±标准差（                                                ± s）表示，应用SPSS 16.0 for Windows统计软件包进行统计分析。多组样本均数比较行单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较用Newman–Keuls检验 (q 检验)，P < 0.05为有统计学意义。
7. 结果与分析：结果见表1。
表1  各组动物血清MDA、SOD测定值及比较（± s）
组别 动物数(只) MDA(nmol/mL) SOD(NU/mL)
Sham组 10 3.81±0.44 420.28±44.63
I/R组 10 5.35±0.43* 330.07±32.27*
IRH组 10 4.06±0.54＃ 399.23±30.22＃
注：表中*表示与Sham组比较P<0.01；#表示与I/R组比较P<0.01。
虽然缺血-再灌注损伤发病机制尚未完全阐明，但目前普遍认为其发生与氧自由基介导的脂质过氧化密切相关。MDA和SOD是反映脂质过氧化程度的一对指标，MDA为脂质过氧化产物的一种，测试其含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧化物阴离子，保护细胞免受损伤，SOD的测定可反映组织内自由基水平及脂质过氧化程度。
从表1可见， I/R组MDA含量明显高于Sham组（P < 0.01）；IRH组MDA含量明显低于I/R组（P < 0.01），接近Sham组（P >0.05）。I/R组与Sham组比较，SOD活性明显降低（P <0.01）；IRH组与Sham组比较无显著降低（P >0.05），其活性接近Shame组。此结果表明，肢体缺血-再灌注损伤可使MDA含量显著升高、SOD活性显著降低。腹腔注射氢气能使MDA含量显著降低、SOD活性显著提高。腹腔注射氢气可显著改善肢体缺血-再灌注造成的组织损伤。
实施例2
腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤血清8-iso-PGF2α水平和GSH-Px活性的影响。
实验方法：制备家兔肢体缺血-再灌注损伤动物模型，检测血清8-iso-PGF2α水平和GSH-Px 活性，证实腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤的预防作用。
1. 除指标检测外，其他同实施例1。
2. 指标检测： 酶联免疫吸附测定8-iso-PGF2α水平，检测试剂盒购自Cayman Chemical 公司（Ann Arbor，MI）。二硫代硝基苯甲酸法测定GSH-Px活性，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。具体检测步骤按试剂盒说明书进行。
3. 结果及分析：结果见表2。
表2  各组动物血清8-iso-PGF2α、GSH-Px测定值及比较（± s）
组别 动物数(只) 8-iso-PGF2α(pg/mL) GSH-Px(U)
Sham组 10 80.67±20.13 121.50±12.63
I/R组 10 165.65±32.79* 100.27±9.85*
IRH组 10 113.34±22.21＃ 119.20±10.91＃
 注：表中*表示与Sham组比较P<0.01；#表示与I/R组比较P<0.01。
近年研究发现，传统建立起来的检测反映脂质过氧化程度的指标如MDA和SOD，虽然可以反映自由基水平，但这些指标易受体内外诸多因素的影响，有时不能准确反映体内产生自由基的真实水平。最近，一种主要脂质过氧化产物－异前列腺素，可作为一种体内反应氧化损伤的可靠指标，已为人们越来越重视。8-iso-PGF2α为一种主要的异前列腺素，主要是细胞膜上的花生四烯酸在自由基的攻击下发生脂质过氧化，经非酶途径产生的，可作为病理生理和改变细胞膜的流动性和完整性的媒介。8-iso-PGF2α已被证明存在运行于血浆，从尿液排出体外，是组织中稳定的化合物，能灵敏、特异地反映再灌注后自由基增加所引发的脂质过氧化。因此，8-iso-PGF2α被认为是测量体内氧化应激的金标准。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢起还原反应，从而清除细胞内有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，是抗氧化系统中重要的抗氧化剂。因此，GSH-Px活性可反映机体抗氧化能力。
从表2可见， I/R组8-iso-PGF2α水平明显高于Sham组（P <0.01），表明肢体缺血-再灌注损伤可致8-iso-PGF2α明显上升。IRH组8-iso-PGF2α明显低于I/R组（P <0.01），与Sham组比较无明显上升（P <0.01），表明腹腔注射氢气可有效阻止由肢体缺血-再灌注造成的8-iso-PGF2α的升高。I/R组GSH-Px活性较Sham组明显降低（P < 0.01）；IRH组GSH-Px活性较I/R组明显升高（P < 0.01），接近Sham组（P >0.05）。此结果表明，肢体缺血-再灌注可损伤GSH-Px的活性，而腹腔注射氢气可明显提高GSH-Px活性，从而保护组织细胞。
实施例2进一步证实了腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤的预防作用。
以上实验结果表明，腹腔注射氢气能明显保护肢体缺血-再灌注损伤 SOD、GSH-Px活性，降低MDA、8-iso-PGF2α的产生，减少脂质过氧化，保持氧化还原平衡，保护细胞膜的结构和功能，有效地保护肢体缺血-再灌注所造成的组织损伤，可用于预防肢体缺血-再灌注损伤。

Claims (3)

1.氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用，其特征在于：所述的氢气，其纯度不低于99.999%。
3.根据权利要求1所述的氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用，其特征在于：氢气给予途径为腹腔注射。
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