CN104800238A - 至少包含氢分子的液体/气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及至少包含氢分子的液体/气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用，从而提高药物的抗神经胶质瘤效果。通过本发明所制备的抗神经胶质瘤的药含有至少包含氢分子的液体或气体。在该介质中既可以包含气体分子，如氧分子、二氧化碳分子等，还可以包含液体，如纯水、去离子水、蒸馏水、生理盐水、有机酸的酸性水溶液等。所制备的抗神经胶质瘤的药具有抑制神经胶质瘤细胞生长、浸润和迁移的作用。

Description

至少包含氢分子的液体/气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及用于抗神经胶质瘤的药，其包含氢分子作为活性成分。

背景技术

神经胶质瘤(glioma)主要来源于神经上皮，是最常见的原发性颅内肿瘤，其占中枢神经系统肿瘤的30％和所有恶性颅内肿瘤的80％，其年发病率为十万分之六。常见分类有：星形细胞瘤、星形母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤等。好发生于男性，不同年龄均可发病。多数为浸润性生长，预后较差。临床表现为颅内压升高症状，如头痛、呕吐、视乳头水肿及局限性神经损害等症状。

目前神经胶质瘤的治疗手段多为外科手术集合化疗和放疗的联合疗法。外科手术最为有效，但其对正常脑组织的损伤也最为严重。同时，多数神经胶质瘤呈浸润性生长，外科手术无法将其完全切除，因而手术后复发率极高。放疗对神经胶质瘤的作用有限，并且放疗还可能引起正常组织的癌变，因而放疗在神经胶质瘤的治疗过程中通常都作为辅助手段。由于血脑屏障的存在，限制了很多化疗药物的应用。替莫唑胺是目前最好的化疗药物之一，其能高效穿过血脑屏障并且对肿瘤细胞进行有效杀伤。遗憾的是MGMT阳性表达的肿瘤细胞对替莫唑胺有极强的抵抗能力，所以其应用也相当有限。尽管近30年来在胶质瘤手术、化疗与放疗方面取得很大的进步，但神经胶质瘤患者的中位生存期仅有14.6个月。因此，神经胶质瘤的临床治疗仍是一个需要研究和探索的难题，目前当务之急是找到疗效更佳、特异性更好的药物。

氢分子是自然界中最小的分子，长期以来，生物学家误认为它是生理学上的惰性气体。2007年日本学者Ohsawa等(Ohsawa et al.,2007)在Nature Medicine的报道发现，呼吸2％的氢气即可有效治疗脑缺血再灌注损伤，并提出了氢可以通过选择性清除羟自由基和亚硝酸阴离子来发挥其抗氧化作用。该研究迅速引起广泛关注，并掀起了氢分子医学研究的热潮。研究表明，氢不仅具有抗氧化作用，还具有抗炎症和抗凋亡作用，对于缺血再灌注损伤、电离辐射损伤、炎症性疾病、代谢性疾病等方面均有很好的防治作用。同时，作为一种新型抗氧化剂，氢还具有无毒、无残留、制备简单、给药方便等诸多优点，具有很好的临床应用前景。然而，目前尚未报道氢分子在神经胶质瘤防治方面的应用。

发明内容

本发明的目的是将至少包含氢分子的液体/气体用在抗神经胶质瘤的药物的制备中，从而提高药物的抗神经胶质瘤效果。其特点在于所制备的抗神经胶质瘤的药中包含氢分子作为活性成分。

本发明的发明人首次发现，将含有氢分子的液态或气态的组合物用在抗神经胶质瘤的药的制备中，可以抑制神经胶质瘤细胞的生长、浸润和迁移。在下文中详细描述了本发明。

(1)一种至少包含氢分子的液体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。

(2) (1)所述的应用，其特征在于，其特征在于所述至少包含氢分子的液体的溶剂可以是纯水、去离子水、蒸馏水、生理盐水或有机酸的酸性水溶液等。

(3) (2)所述的应用，其特征在于，至少包含氢分子的液体包含0.1ppm以上即0.05mM以上的氢分子。

(4) (2)或(3)所述的应用，其特征在于，至少包含氢分子的液体还包含氧分子。

(5) (2)-(4)所述的应用，其特征在于，至少包含氢分子的液体可以通过口服、注射或洗浴的方式施用。

(6)一种至少包含氢分子的气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。

(7) (6)所述的应用，其特征在于，其中至少含有氢分子的气体是氢气和氧气的混合物。

(8) (6)所述的应用，其特征在于，其中至少含有氢分子的气体是氢气、氧气和惰性气体的混合物。

(9) (6)所述的应用，其特征在于，其中至少含有氢分子的气体是氢和空气的混合物。

(10) (6)-(9)中任何一项所述的应用，其特征在于，至少包含氢分子的液体包含浓度为1.0％-4.5％(v/v)的氢气。

(11) (1)-(10)中任何一项所述的应用，其特征在于，所制备抗神经胶质瘤的药物用于抑制神经胶质瘤细胞的生长、或者抑制神经胶质瘤细胞的浸润、或者抑制神经胶质瘤细胞的迁移。

附图说明

图1显示给予富氢生理盐水和氢气对大鼠神经胶质瘤肿瘤体积的影响。

图2显示氢处理对大鼠神经胶质瘤细胞C6生长速率的影响。

图3显示氢处理对大鼠神经胶质瘤细胞C6浸润能力的影响。

图4显示氢处理对大鼠神经胶质瘤细胞C6迁移能力的影响。

具体实施方式

虽然下文将参考以下实施例更详细地描述本发明，但本发明的技术范围不仅限于此，可在不脱离本发明主题和范围的情况下以同等方式对本发明进行各种改变和修饰。

氢浓度的测定

用氢电极(Unisense A/S,Aarhus,Denmark)测定溶液中的氢浓度，通过气体层析测定氢气浓度(Teramecs Co.,Kyoto)。

富氢生理盐水(或富氢细胞培养液)的制备

制备饱和氢水时，将1升生理盐水(或细胞培养液)注入5升体积的耐压瓶中，然后将氢气引入其中以便产生0.4兆帕的压力。2小时后，减压除去瓶内的氢化生理盐水(或细胞培养液)。通过以上过程获得约0.8mM的含饱和氢的生理盐水(或细胞培养液)，溶液中的氢浓度可以用“氢浓度的测定”的方法测定。

将氢气给予大鼠

为了让每只大鼠都连续吸入氢气，使纯氢气与浓度为2％(1.5％-2.5％体积/体积)的用泵递送的空气混合，将所得气体送入气密塑料容器内。将含氢气的气体混合体以每分钟2-5升的速率供应其中。用上文中“氢浓度的测定”方法测定氢气浓度。将大鼠的笼子置于所述容器内，以便将氢气稳定地给予大鼠。

实施例1：给予富氢生理盐水或氢气对大鼠神经胶质瘤具有很好的抑制作用

将雄性Wistar大鼠(200-250g)分为3组，每组8只大鼠，其中第一组为富氢生理盐水组，即通过腹腔注射(5ml/kg)的方法给予富氢生理盐水；第二组为氢气组，即按照上文中的方法将氢气给予大鼠；第三组为对照组，即不采取任何治疗措施。

首先，建立大鼠神经胶质瘤模型，方法如下：

大鼠神经胶质瘤细胞C6的准备：新复苏C6细胞，接种前再传代1次，24小时后更换1次培养基，在细胞对数生长期时，以0.25％胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液，Hanks液洗涤2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为1×10⁶/10μl，置于37℃水浴中待接种。苔盘蓝排斥实验检测细胞活力>95％。

C6细胞脑内原位接种：接种当天，3.5％水合氯醛于大鼠腹腔内注射(1ml/100g)麻醉后，将大鼠头部用立体定向架固定。在头顶双侧眼裂连线后大约1.5cm处纵向切开头皮，暴露前囱颅骨标志，前囱中点后1mm，矢状缝右侧旁开3mm处用牙科钻钻孔，孔径1.0mm，50μl微量注射器抽取1×10⁶/10μl细胞悬液，经骨孔处缓慢进针至硬脑膜下6mm，后退1mm，于10min内将细胞悬液注完(1μl/min)，注射完毕后留针5min，缓慢退针，骨蜡封闭骨孔，1号丝线缝合头皮切口，对接种的大鼠进行单笼饲养。

大鼠接种后的给药处理：富氢生理盐水组大鼠每天早上9点和晚上5点分两次给药处理，氢气组按照上述方法给药处理，对照组常规饲养。给药两周后将大鼠处死，打开头颅将神经胶质瘤小心取出并测量肿瘤体积(应用公式(a²×b)/2计算，其中a为肿瘤短径，b为肿瘤长径)。

结果如图1所示，与对照组相比，富氢生理盐水组和氢气组的神经胶质瘤体积明显缩小，说明这两种治疗方法对神经胶质瘤均有很好的抑制作用。

实施例2：富氢细胞培养液可以抑制大鼠神经胶质瘤细胞C6的生长、浸润和迁 移

C6细胞分为两组，第一组为氢处理组，即用富氢细胞培养液进行细胞培养；第二组为对照组，即用普通培养液进行细胞培养。细胞培养24h后进行体外实验检测细胞功能的改变。

MTT法检测细胞生长：将上述两组细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，以2×10³cells/100μl/well的细胞密度接种C6细胞于96孔板中，每组接种6孔。以接种后第1、2、3、4、5天为5个观察时间点，共铺5块板，于37℃，5％CO₂孵箱中培养。细胞培养24h后取出其中一块板，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，于37℃，5％CO₂孵箱中培养4小时。小心吸弃培养上清液，每孔加入100μlDMSO，并震荡10min使MTT充分溶解。用酶标仪测定波长570nm处各孔的吸光值(OD值)。以后每24小时取出一块板按照上述步骤进行。最后以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图2所示，与对照组相比，氢处理组C6细胞的生长速率明显降低。

Transwell法检测细胞浸润：将Matrigel溶于无血清细胞培养液中，终浓度为0.5mg/ml，将其加到24孔板的insert中，55℃干燥3小时后用100μl去离子水水化40min备用。将上述两组细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，按照2×10⁴cells/200μl/well的密度将细胞接种于24孔板的insert中，每组接种3孔。经细胞培养72小时，并用结晶紫染色后计数穿过膜的细胞数。结果如图3所示，与对照组相比，氢处理组的穿膜细胞数明显减少，说明氢处理对C6细胞的浸润能力具有明显的抑制作用。

划痕实验检测细胞迁移：将上述两组细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，按照2×10⁵cells/500μl/well的密度将细胞接种于24孔板中，每组接种3孔。于37℃，5％CO₂孵箱中培养24小时。待细胞融合后，用无菌的10μl枪头在well底中央划垂直的“一”字线,宽度约200μm。用细胞培养液冲洗若干次,以洗去划痕处的细胞，再换上新鲜培养液于37℃，5％CO₂孵箱中培养。倒置显微镜下观察，分别记录0、6、24小时的划痕创面愈合情况。细胞迁移能力以迁移率表示，细胞迁移率(％)＝(原划痕宽度-现划痕宽度)/原划痕宽度×100％。结果如图4和表1所示，与对照组相比，氢处理组的细胞迁移率明显降低，说明氢处理对C6细胞的迁移能力具有明显的抑制作用。

表1 氢处理对C6细胞迁移能力的影响

Claims (10)

1.一种至少包含氢分子的液体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述至少包含氢分子的液体的溶剂纯水、去离子水、蒸馏水、生理盐水或有机酸的酸性水溶液。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的液体包含0.1ppm以上即0.05mM以上的氢分子。

4.如权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在至少包含氢分子的液体还包含氧分子。

5.如权利要求1-4任意一项中所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的液体通过口服、注射或洗浴的方式施用。

6.一种含有至少包含氢分子的气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。

7.如权利要求6中所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的气体是氢气和氧气的气体混合物或者是氢气、氧气和惰性气体的气体混合物。

8.如权利要求6中所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的气体是氢气和空气的气体混合物。

9.如权利要求6-8中任何一项所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的气体包含体积浓度为1.0％-4.5％的氢气。

10.如权利要求1-9中任何一项所述的应用，其特征在于所制备抗神经胶质瘤的药物用于抑制神经胶质瘤细胞的生长、或者抑制神经胶质瘤细胞的浸润、或者抑制神经胶质瘤细胞的迁移。