ES2609010T3 - Formulaciones de anticuerpos y de proteínas a concentración elevada - Google Patents

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Novartis AG
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Abstract

Formulación líquida estable de turbidez baja que comprende: (a) un anticuerpo dirigido contra IgE en una cantidad de aproximadamente 150 mg/ml, (b) arginina-HCl en una cantidad de 200 mM, (c) histidina en una cantidad de 20 mM, (d) polisorbato en una cantidad de 0,01 a 0,1 %, en la que la formulación tiene además un pH de 6,0, en la que el anticuerpo dirigido contra IgE se produce mediante un procedimiento que comprende (1) cultivar células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos identificada como E25 en la figura 10A y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos identificada como E25 en la figura 10B, y (2) purificar el anticuerpo dirigido contra IgE producido por las células.

Description

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DESCRIPCION
Formulaciones de anticuerpos y de protelnas a concentracion elevada Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere a formulaciones de anticuerpos a concentracion elevada, que son particularmente adecuadas para administracion subcutanea. La presente invencion proporciona ademas formulaciones llquidas estables muy concentradas (por ejemplo, >100 mg/ml de protelnas).
Descripcion de la tecnica relacionada
[0002] Existe una demanda significativa de formulaciones llquidas de anticuerpos muy concentradas. Sin embargo, las formulaciones de protelnas muy concentradas presentan diversos problemas. Un problema es la inestabilidad debida a la formation de material particulado. En las preparaciones liofilizadas reconstituidas para generar formulaciones llquidas, este problema se ha resuelto mediante el uso de tensioactivos (por ejemplo, un polisorbato), pero los tensioactivos son inadecuados para las formulaciones llquidas, debido a que dificultan el procesado adicional. Ademas, los tensioactivos no reducen el incremento de la viscosidad producido como resultado de las numerosas interacciones moleculares debidas a la naturaleza macromolecular de los anticuerpos.
[0003] Aunque se ha demostrado que los tensioactivos reducen significativamente el grado de formacion de partlculas de las protelnas, no resuelven el problema del incremento de la viscosidad que dificulta la manipulation y la administracion de formulaciones concentradas de anticuerpos. Los anticuerpos tienden a formar disoluciones viscosas con elevada concentracion debido a su naturaleza macromolecular y al potencial de interacciones intermoleculares. Ademas, a menudo se usan como estabilizantes azucares farmaceuticamente aceptables en grandes cantidades. Dichos azucares pueden potenciar las interacciones intermoleculares, incrementando por tanto la viscosidad de la formulation. Formulaciones muy viscosas son diflciles de fabricar, arrastrar en una jeringuilla e inyectar subcutaneamente. El uso de fuerza en la manipulacion de formulaciones viscosas conduce a una excesiva formacion de espuma, que puede acarrear la desnaturalizacion y la inactivation de los compuestos biologicos activos. Se carece de solution satisfactoria para este problema.
[0004] Aunque la tecnica anterior indica numerosos ejemplos de excipientes que se pueden emplear adecuadamente para crear formulaciones farmaceuticas, se han formulado satisfactoriamente muy pocas protelnas por encima de 100 mg/ml, o se han descrito tecnicas para realizar lo anterior.
[0005] Los solicitantes han descubierto que la Arginina, especlficamente Arginina-HCl es particularmente adecuada para formulaciones llquidas muy concentradas de protelnas o anticuerpos.
[0006] Se dan a conocer formulaciones estables de protelnas liofilizadas isotonicas en la publication PCT WO 97/04801, publicada el 13 de febrero de 1997, el contenido completo de la misma se incorpora en el presente documento por referencia. Las formulaciones liofilizadas dadas a conocer se pueden reconstituir para generar formulaciones llquidas con elevada concentracion de protelnas sin perdida aparente de estabilidad. Sin embargo, no se hace referencia alas cuestiones potenciales asociadas con la elevada viscosidad de las formulaciones reconstituidas. La agregacion de protelnas se ha reducido previamente mediante la adicion de azucares, pero al hacer eso, se puede incrementar drasticamente la viscosidad y la osmolaridad, haciendo por tanto poco practico el procesado y el uso.
[0007] La solicitud PCT de los solicitantes, publicacion WO02/30463, publicada el 18 de abril de 2002 da a conocer formulaciones con concentraciones elevadas de protelnas, pero de baja viscosidad, conseguidas: 1) mediante pH bajo (aproximadamente 4,0 a 5,3); 2) pH alto (aproximadamente 6,5 a 12,0), o 3) incrementando la fuerza ionica total de la formulacion mediante la adicion de sales o tampones. Sin embargo, aunque el aumento de la fuerza ionica disminuye la viscosidad de la formulacion (tal como con NaCl) esto puede dar tambien como resultado un incremento de la turbidez, que esta asociado a menudo con la formacion de partlculas de protelnas (por ejemplo, agregacion). De esta manera, una formulacion optima con una elevada concentracion de protelnas debe superar los desaflos de la estabilidad, viscosidad, osmolaridad y turbidez.
Descripcion resumida de la invencion
[0008] La presente invencion se refiere a formulaciones muy concentradas de anticuerpos E25 dirigidos contra IgE que son estables, y de baja viscosidad y turbidez, segun se define en las reivindicaciones.
[0009] El presente documento se refiere a formulaciones de anticuerpos muy concentradas de baja turbidez que comprenden anticuerpos (100 - 260 mg/ml), histidina (10 - 100 mM), arginina-HCl (50 - 200 mM) y polisorbato (0,01% - 0,1%), que tienen un pH de 5,5 - 7,0, una viscosidad de 50 cs o menos y una osmolaridad entre 200
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mOsm/kg y 450 mOsm/kg. Alternativamente, el anticuerpo en las formulaciones puede variar entre 120 y 260 mg/ml, alternativamente 150 - 260 mg/ml, alternativamente 180 - 260 mg/ml, alternativamente 200 - 260 mg/ml de anticuerpo. Alternativamente, la osmolaridad varla entre 250 mOsm/kg y 350 mOsm/kg. Alternativamente, la concentracion de arginina-HCl varla entre 100 y 200 mM, alternativamente 150 - 200 mM, alternativamente 180 - 200 mM. Formulaciones de baja turbidez que comprenden anticuerpo (40 - 150 mg/ml), histidina (10-100 mM), azucar (por ejemplo, trehalosa o sacarosa, 20 - 350 mM) y polisorbato (0,01% - 0,1%).
[0010] En el presente documento se describe una formulacion que contiene elevadas concentraciones de protelnas de gran peso molecular, tales como anticuerpos o inmunoglobulinas. Los anticuerpos se dirigen contra un antlgeno predeterminado concreto, cuyo antlgeno es IgE (rhuMABE-25 descrito en los documentos U.S.P. 6.329.509 y WO 99/01556).
[0011] Las formulaciones de la presente invencion pueden ser formulaciones farmaceuticas. En un aspecto especlfico, la formulacion se administra subcutaneamente.
[0012] En una realizacion, la presente invencion proporciona el uso medico de las formulaciones dadas a conocer en el presente documento que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo en un procedimiento para el tratamiento, profilactico o terapeutico, de un trastorno tratable mediante el anticuerpo formulado.
[0013] Dichas formulaciones son particularmente utiles para la administracion subcutanea. En un aspecto especlfico, el trastorno es un trastorno mediado por IgE. En otro aspecto especlfico adicional, el trastorno mediado por IgE es rinitis alergica, asma (por ejemplo, asma alergica y asma no alergica), dermatitis atopica, gastroenteropatla alergica, hipersensibilidad (por ejemplo, anafilaxis, urticaria, alergias alimentarias, etc.), aspergilosis broncopulmonar alergica, enfermedades parasitarias, cistitis intersticial, slndrome de hiper IgE, ataxia- telangiectasia, slndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tlmica, mieloma de IgE y reaccion de injerto contra hospedador.
[0014] En una realizacion, la presente invencion proporciona un artlculo de fabricacion que comprende un envase que contiene una formulacion de la presente invencion. En un aspecto, el artlculo de fabricacion es una jeringuilla precargada. En otro aspecto especlfico adicional, la jeringuilla precargada esta contenida adicionalmente dentro de un dispositivo de inyeccion. En otro aspecto especlfico adicional, el dispositivo de inyeccion es un autoinyector.
Breve descripcion de las figuras
[0015]
Figura 1. Cromatografla de interaccion hidrofoba de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE digerido con pepsina. Se formularon las muestras a diferentes pH y tampones: (•) Acetato 20 mM, (D) Succinato 20 mM, (▲) Na2HPO4 20 mM, (V) K2PO4 20 mM y (*) tampon Tris 20 mM. Se almacenaron las muestras a 30° C durante 6 meses.
Figura 2. Cromatografla de exclusion por tamano de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE almacenado a 40° C durante 6 meses. Se formularon las muestras a diferentes pH y tampones: (■) Glutamato 20 mM, (•) Acetato 20 mM, (D) Succinato 20 mM, ( ) Histidina 20 mM, (▲) Na2HPO4 20 mM, (▼) K2PO4 20 mM y (*) tampon Tris 20 mM.
Figura 3. Actividad de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE almacenado a 30° C durante 6 meses. Se formularon las muestras a diferentes pH y tampones: (•) Acetato 20 mM, (D) Succinato 20 mM, ( ) Histidina 20 mM, (▲) Na2HPO4 20 mM, (▼) K2PO4 20 mM y (*) tampon Tris 20 mM.
Figura 4. Efectos de Polisorbato 20 en la turbidez del anticuerpo monoclonal estresado dirigido contra IgE. Las muestras contienen 100 mg/ml de anticuerpo, Succinato 20 mM, Trehalosa 192 mM y diversas cantidades de Polisorbato 20 a pH 6,0. Las concentraciones de Polisorbato son (■) 0, (▲) 0,01 %, (•) 0,02 % y (D) 0,05 %.
Figura 5. Turbidez de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE a ~150 mg/ml con diferentes excipientes (▲) CaCl2, (V) MgCl2 y (D) Arginina-HCl.
Figura 6. Turbidez de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE a ~150 mg/ml con diversos excipientes. Se almacenaron las muestras a (▲) -70° C, (■) 2-8° C, (D) 15° C, ( ) 30° C y (V) 40° C.
Figura 7. Analisis mediante cromatografla de interaccion hidrofoba de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE digerido con papalna. Se formularon las muestras a -150 mg/ml con diversos excipientes y se almacenaron a (▼) - 70° C, (■) 2-8° C, (▲) 15° C, (D) 30° C y ( ) 40° C.
Figura 8. Cromatografla de exclusion por tamano de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE a -150 mg/ml en (■) arginina-HCl 200 mM, histidina 23 mM, pH 6,0 (▲) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, pH 6,0 (•) arginina-
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HCl 182 mM, histidina 20 mM, sacarosa 91 mM, pH 6,0 ( ) MgCl2 50 mM, 27 mg/ml de trehalosa, acetato al 0,01 %, (D) MgCl2 50 mM, MgAc2 30 mM, acetato al 0,01 %, y (O) MgCh 50 mM, MgAc2 45 mM, acetato al 0,01 %. Se almacenaron las muestras a 30° C durante 6 meses.
Figura 9. Analisis mediante cromatografla de interaccion hidrofoba de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE diferido con papalna. Se formularon las muestras mostradas en (■) arginina-HCl 200 mM, histidina 23 mM, (▲) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, (•) arginina-HCl 182 mM, histidina 20 mM, sacarosa 91 mM, ( ) MgCh 50 mM, 27 mg/ml de trehalosa, acetato al 0,01 %, (D), MgCh 50 mM, MgAc2 30 mM, acetato al 0,01 % y (O) MgCl2 50 mM, MgAc2 45 mM, acetato al 0,01 %. Se almacenaron las muestras a 30° C durante 6 meses.
Figura 10. Muestra una comparacion de las secuencias de longitud completa de las cadenas variable y constante de los anticuerpos E25, E26 y Hu-901 dirigidos contra IgE. Se muestran subrayadas las regiones CDR de Hu-901. Para E25 y E26, se muestran en negrita las regiones CDR segun se define por Chothia, mientras que las regiones CDR segun se define por Kabat se delinean con parentesis. La Figura 10A muestra las secuencias de la cadena ligera de E25, E26 y Hu-901 (SEC de ID Nos: 1-3), mientras que la Figura 10B muestra las secuencias de la cadena pesada de E25, E26 y Hu-901 (SEC de ID Nos: 4-6).
Description detallada de la realization preferida
I. Definiciones
[0016] Por “protelna” se entiende una secuencia de aminoacidos por la cual la longitud de la cadena es suficiente para producir los niveles superiores de la estructura terciaria y/o cuaternaria. De esta manera, las protelnas se distinguen de los “peptidos”, que son tambien moleculas basadas en aminoacidos que no tienen dicha estructura. Normalmente, una protelna para uso en el presente documento tendra un peso molecular de al menos aproximadamente 15-20 kD, preferiblemente al menos aproximadamente 20 kD.
[0017] Los ejemplos de protelnas abarcadas dentro de la definition en el presente documento incluyen protelnas de mamlferos, tales como, por ejemplo, hormona del crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberation de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora del tiroides; lipoprotelnas; a-1-antitripsina; cadena A de la insulina; proinsulina; hormona estimuladora del follculo; calcitonina; hormona luteneizante; glucagon; factores de coagulation tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular, y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes tales como Protelna C; factor natriuretico atrial; tensioactivo pulmonar, un activador del plasminogeno, tal como uroquinasa o activador del plasminogeno de tipo tisular (t-PA, por ejemplo, Activase®, TNKase®, Retevase®); bombazina; trombina, factor-a y p de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (celula T expresada y segregada normalmente regulada en la activation); protelna inflamatoria de macrofagos humanos (MIP-1-a); albumina de suero tal como albumina de suero humano; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; peptido asociado a la gonadotropina de raton; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormonas o factores de crecimiento; una integrina; protelna A o D; factores reumatoides; un factor neurotrofico tal como el factor neurotrofico derivado de hueso (BDNf), neurotrofina 3, 4, 5, o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de los fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidermico (eGf); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-a y TGF-p, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4, o TGF-p5; factor I y II de crecimiento tipo insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-1(IGF-I de cerebro); protelnas de union al factor de crecimiento tipo insulina, protelnas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina (EPO); trombopoyetina (TPO); factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una protelna morfogenetica osea (BMP); un interferon tal como interferon a, p, y g, factores estimuladores de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G- CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superoxido dismutasa; receptores de celulas T; protelnas superficiales de membrana; factor acelerador de la descomposicion (DAF); un antlgeno vlrico tal como, por ejemplo, una portion de la envoltura del virus del SIDA; protelnas de transporte; receptores localizadores; adresinas, protelnas reguladoras; inmunoadhesinas; anticuerpos; y fragmentos o variantes biologicamente activas de cualquiera de los polipeptidos anteriormente relacionados.
[0018] La protelna que se formula es, preferiblemente, esencialmente pura y, deseablemente, esencialmente homogenea (es decir, exenta de protelnas contaminantes). Protelna “esencialmente pura” significa una composition que comprende al menos aproximadamente un 90 % en peso de la protelna, basandose en el peso total de la composicion, preferiblemente, al menos un 95 % en peso. Protelna “esencialmente homogenea” significa una composicion que comprende al menos aproximadamente un 99 % en peso de protelna, basandose en el peso total de la composicion.
[0019] Tal como se describe en el presente documento, la protelna es un anticuerpo. El anticuerpo puede unirse por ejemplo a cualquiera de las moleculas anteriormente mencionadas. Las dianas moleculares de los anticuerpos a modo de ejemplo abarcadas por la presente invention incluyen IgE, las protelnas CD CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 y cD40; los miembros de la familia de receptores hEr tales como el receptor EGF, receptor HER2, HER3 o
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HER4; 2c4, 4D5, PSCA, LDP-2, moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y la integrina av/p3 que incluye las subunidades a y p de la misma (por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra CD11, dirigidos contra CD18 o dirigidos contra CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF; antlgenos de grupos sangulneos; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4, y protelna C.
[0020] El termino “anticuerpo”, segun se usa en el presente documento incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud completa que tienen una region Fc de la inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitopica, anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo., anticuerpos biespeclficos, diacuerpos, y moleculas monocatenarias, as! como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2, y Fv). En el presente documento, se usa el termino “inmunoglobulina” (Ig) de manera intercambiable con “anticuerpo”.
[0021] La unidad basica de anticuerpo de 4 cadenas es una glicoprotelna heterotetramera compuesta de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Un anticuerpo IgM esta constituido por 5 unidades basicas heterotetrameras junto con un polipeptido adicional denominado cadena J, y contiene 10 sitios de union al antlgeno, mientras que los anticuerpo IgA comprenden entre 2-5 de las unidades basicas de 4 cadenas que pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes en combinacion con la cadena J. En el caso de las IgG la unidad de 4 cadenas es generalmente aproximadamente de 150.000 dalton. Cada cadena L se une a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen entre si mediante uno o mas enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L tiene tambien puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el termino N, una region variable (Vh) seguida por tres regiones constantes (Ch) por cada una de las cadenas a y g y cuatro regiones Ch para los isotipos p y e. Cada cadena L tiene en el termino N, una region variable (Vl) seguida por una region constante en su otro extremo. La Vl se alinea con la Vh y la Cl se alinea con la primera region constante de la cadena pesada (Ch1). Se cree que los restos de aminoacidos particulares forman una interfase entre las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El emparejamiento de una Vh y una Vl conjuntamente forma un unico sitio de union al antlgeno. Para la estructura y las propiedades de los anticuerpos, vease, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a Edicion, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, pagina 71 y Capltulo 6.
[0022] Se puede asignar la cadena L de cualquier especie de vertebrado a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basandose en las secuencias de aminoacidos de sus regiones constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoacidos de la region constante de sus cadenas pesadas (CH), se pueden asignar las inmunoglobulinas a diferentes tipos o isotipos. Existen cinco tipos de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tiene cadenas pesadas designadas a, 8, e, g y p, respectivamente. Los tipos g y p se dividen adicionalmente en subtipos sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y funcion de las CH, por ejemplo, los seres humanos expresan los siguientes subtipos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2.
[0023] El termino “variable” se refiere al hecho de que algunos segmentos de las regiones variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. La region V media la union al antlgeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antlgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye por igual a lo largo del espacio completo de las regiones variables. En vez de esto, las regiones V estan constituidas por tramos relativamente invariantes denominados regiones marco (FR) de aproximadamente 15-30 restos de aminoacidos separados por regiones mas cortas de extrema variabilidad denominadas “regiones hipervariables” o algunas veces “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR) que son cada una de aproximadamente 9-12 restos de aminoacidos de longitud. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada naturales, comprenden cada una cuatro FR, adoptando en gran medida una configuracion de p lamina, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la p lamina. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las fR y, con las regiones hipervariables de la otras cadenas, contribuyen a la formacion del sitio de union al antlgeno de los anticuerpos (vease Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Las regiones constantes no estan implicadas directamente en la union de un anticuerpo a un antlgeno, pero presentan algunas funciones efectoras, tales como la participacion del anticuerpo dependiente de la citotoxicidad celular (ADCC).
[0024] El termino “region hipervariable” (conocido tambien como “regiones determinantes de la complementariedad” o CDR) cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que estan (usualmente tres o cuatro regiones cortas de la secuencia de variabilidad extrema) dentro del dominio de la region V de una inmunoglobulina que forma el sitio de union al antlgeno y son los determinantes principales de la especificidad del antlgeno. Existen al menos dos procedimientos para identificar los restos CDR: (1) Un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia de las especies cruzadas (es decir, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MS 1991); y (2) Un enfoque basado en estudios cristalograficos de complejos antlgeno-anticuerpo (Chothia, C. y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Sin embargo, en la extension en la que las tecnicas de identificacion de los dos restos definen regiones de solapamiento, pero no regiones identicas, se pueden combinar para definir una CDR hlbrida.
[0025] El termino “anticuerpo monoclonal”, segun se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo
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obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos excepto por las posibles mutaciones que se producen naturalmente y/o las modificaciones posteriores a la traduccion (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy especlficos, dirigiendose contra un unico sitio antigenico. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epltopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antlgeno. Adicionalmente a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan mediante cultivo del hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo que se ha obtenido a partir de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se construye requiriendo la produccion del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar segun la presente invencion se pueden preparar mediante el procedimiento del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567). Se pueden aislar tambien “anticuerpos monoclonales” a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando por ejemplo las tecnicas descritas en Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).
[0026] Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen especlficamente anticuerpos “quimericos” (inmunoglobulinas) en que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica con un homologa a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivadas de una especie particular o que pertenecen a un tipo o subtipo de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es(son) identica con una homologa a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivadas de otras especies o que pertenecen a otro tipo o subtipo de anticuerpo, as! como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes en el presente documento incluyen anticuerpos “primatizados” que comprendes secuencias de union a antlgeno de la region variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.), y secuencias de la region constante humana.
[0027] Un anticuerpo “intacto” es el que comprende un sitio de union a antlgeno as! como una CL y al menos las regiones de la cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Las regiones constantes pueden ser regiones constantes de la secuencia natural (por ejemplo, regiones constantes de la secuencia natural humana) o variantes de la secuencia de aminoacidos de la misma. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o mas funciones efectoras.
[0028] Un “fragmento de anticuerpo” comprende una porcion de un anticuerpo intacto, preferiblemente la union al antlgeno y/o la region variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (vease la Patente de los Estados Unidos 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata y col., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moleculas de anticuerpos monocatenarias y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
[0029] La digestion de los anticuerpos con papalna produjo dos fragmentos de union a antlgeno identicos, denominados fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual, una designacion que refleja la capacidad para cristalizar facilmente. El fragmento Fab esta constituido por una cadena L completa junto con el dominio de la region variable de la cadena H (Vh) y la primera region constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la union al antlgeno, es decir, tiene un unico sitio de union al antlgeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo da como resultado un unico fragmento grande F(ab')2 que corresponde de manera grosera a dos fragmentos Fab unidos mediante un enlace disulfuro que tienen diferente actividad de union al antlgeno es aun capaz de reticular el antlgeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener unos pocos restos adicionales en el termino carboxi de la region Ch1 que incluyen una o mas cistelnas procedentes de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion en el presente documento de Fab' en la que el resto(s) de cistelna de las regiones constantes soporta un grupo tiol libre. Los fragmento de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como parejas de los fragmentos Fab' que tenlan cistelnas bisagra entre ellos. Se conocen tambien otros acoplamientos qulmicos de los fragmentos de anticuerpos.
[0030] El fragmento Fc comprende las porciones carboxi terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas mediante enlaces disulfuros. Se determinaron las funciones efectoras de los anticuerpos mediante las secuencias en la region Fc, la region que se reconoce tambien mediante los receptores Fc (FcR) que se encuentran en algunos tipos de celulas.
[0031] “Fv” es el mlnimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antlgeno y de union a antlgeno. Este fragmento esta constituido por un dlmero de un dominio de la region variable de una cadena pesada y una ligera en asociacion estrecha no covalente. Del plegado de estas dos regiones emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada una procedentes de la cadena H y la L) que contribuyen a los restos de aminoacidos para la union al antlgeno y confieren especificidad de union al antlgeno con el anticuerpo. Sin embargo, incluso una unica region variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR especlficas de un antlgeno) tiene la capacidad de reconocer un antlgeno de union, aunque a una afinidad inferior que la del sitio de union completo.
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[0032] “Fv monocatenario” abreviado tambien como “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpos que comprenden las regiones VH y VL de los anticuerpos conectadas en una unica cadena polipeptldica. Preferiblemente, el polipeptido sFv comprende ademas un enlazante polipeptldico entre las regiones Vh y Vl que permite al sFv formar la estructura deseada para la union al antlgeno. Para una revision del sFv, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
[0033] El termino “diacuerpos” se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos preparados construyendo fragmentos sFv (vease parrafo anterior) con enlazantes cortos (aproximadamente 5-10) restos) entre las regiones Vh y Vl de tal manera que se consigue el emparejamiento de la intercadena pero no el de la intracadena de las regiones V, dando como resultado por tanto un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de union a antlgeno. Los diacuerpos biespeclficos son heterodlmeros de dos fragmentos sFv “entrecruzados” en los que las regiones Vh y Vl de los dos anticuerpos estan presentes en diferentes cadenas polipeptldicas. Se describen los diacuerpos con mayor detalle en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
[0034] Un anticuerpo que “se une especlficamente a” o es “especlfico de” un polipeptido o un epltopo particular en un polipeptido particular es el que se une al polipeptido o epltopo particular en un polipeptido particular sin unirse sustancialmente a cualquier otro polipeptido o epltopo de polipeptido.
[0035] El termino “fase solida” describe una matriz no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente invencion. Los ejemplos de fases solidas abarcadas en el presente documento incluyen las formadas parcial o completamente por vidrio (por ejemplo, vidrio de porosidad controlada), polisacaridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinllico y siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase solida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificacion (por ejemplo, una columna de cromatografla por afinidad). Este termino incluye tambien una fase solida discontinua de partlculas discretas, tal como la descrita en la Patente de los Estados Unidos N° 4.275.149.
[0036] “Formas humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de union a antlgeno) de secuencias principalmente humanas, que contienen la secuencia minima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los restos de una region hipervariable (tambien CDR) del receptor se sustituyen por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los restos de la region marco de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por lo correspondientes restos no humanos. Ademas, “anticuerpos humanizados” segun se usa en el presente documento puede comprender tambien restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Se hacen estas modificaciones para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado comprendera tambien optimamente al menos una porcion de una region constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, veanse Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann y col., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593596 (1992).
[0037] Un “anticuerpo dependiente de la especie”, por ejemplo, un anticuerpo de mamifero dirigido contra IgE humana, es un anticuerpo que tiene una afinidad de union mas fuerte por un antlgeno procedente de una primera especie de mamifero que la que tiene por un homologo de esta antlgeno procedente de una segunda especie de mamifero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie se “une especlficamente” a un antigeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de union (Kd) de no mas de aproximadamente 1 x 10‘7 M, alternativamente no mas de aproximadamente 1 x 10‘8 M, alternativamente no mas de aproximadamente 1 x 10‘9 M) pero tiene una afinidad de union por un homologo del antigeno procedente de una segunda especie de mamifero no humana que es al menos de aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, mas debil que esta afinidad de union por el antlgeno no humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser de cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos segun se ha definido anteriormente, pero preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano.
[0038] “Funciones efectoras” del anticuerpo se refiere a las actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una secuencia natural de la secuencia FC o la secuencia de aminoacidos de la region Fc variante) de un anticuerpo, y varla con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: union a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; union al receptor Fc; citotoxicidad mediada por celula dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulacion por defecto de los receptores superficiales celulares (por ejemplo, receptores de las celulas B; y activacion de las celulas B.
[0039] “Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos” o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig segregada se une a los receptores Fc (FcR) presentes en algunas celulas citotoxicas
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(por ejemplo, celulas asesinas naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) permite a estas celulas efectoras citotoxicas unirse especificamente a una celula diana que soporta un antigeno y eliminar posteriormente la celula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” las celulas citotoxicas y se requieren para eliminar la celula diana mediante este mecanismo. Las celulas primarias para mediar ADCC, las celulas NK, expresan unicamente FcgRI 11, mientras que los monocitos expresan FcgRI, FcgRII y FcgRIII. En la Tabla 3 se resume la expresion de Fc en las celulas hematopoyeticas en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes, se puede llevar a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como el que se describe en la Patente de los Estados Unidos N° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC) y celulas asesinas naturales (NK). Alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molecula de interes, por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes y col., PNAS USA 95: 652-656 (1998).
[0040] “Receptor Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia natural de FcR humano. Ademas, un FcR preferido es el que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de los subtipos FcgRI, FCgRII, y FcgRIII, incluyendo las variantes alelicas y las formas alternativamente de corte y empalme de estos receptores. Los receptores FcgRII incluyen FcgRIIA (un “receptor de activacion”) y FcRIIB (un “receptor de inhibicion”) que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en sus regiones citoplasmicas. El receptor de activacion FcgRIIA contiene un motivo de activacion basado en el inmunoreceptor de la tirosina (ITAM) en su region citoplasmica. El receptor de inhibicion FcgRIIB contiene un motivo de inhibicion basado en el inmunoreceptor de la tirosina (ITIM) en su region citoplasmica. (veanse M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997). Se revisaron los FcR en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel y col., Immunometlzods 4: 25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan abarcados por el termino “FcR” en el presente documento. El termino incluye tambien el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de las IgG en el feto. Guyer y col., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim y col., J. Immunol. 24: 249 (1994).
[0041] “Celulas efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las celulas expresan al menos FcgRIII y llevan a cabo funciones efectoras de ADCC Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC), celulas asesinas naturales (NK), monocitos, celulas T citotoxicas y neutrofilos, siendo preferidas las celulas PBMC y MNK. Se pueden aislar las celulas efectoras a partir de una fuente natural, por ejemplo, sangre.
[0042] “Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una celula diana en presencia del complemento. La activacion de la ruta clasica del complemento se inicia mediante la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) con los anticuerpos (del subtipo apropiado) que se unen a su antigeno analogo. Para evaluar la activacion del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo CDC, por ejemplo, segun se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
[0043] “Aislado”, cuando se usa para describir los diversos polipeptidos y anticuerpos dados a conocer en el presente documento, significa un polipeptido o anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recubierto a partir de un componente de su entorno de produccion. Preferiblemente, el polipeptido aislado esta libre de asociacion con otros componentes de su entorno de produccion. Los componentes contaminantes de su entorno de produccion, tal como los resultantes de las celulas transfectadas recombinantes, son materiales que interferinan con los usos diagnosticos o terapeuticos del polipeptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos. En las realizaciones preferidas, el polipeptido se purificara (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoacidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de capsula giratoria, o (2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomasie o, preferiblemente, tincion de plata. Ordinariamente, sin embargo, se preparara un polipeptido o anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificacion.
[0044] Una molecula de acido nucleico “aislada” que codifica los polipeptidos y anticuerpos en el presente documento es una molecula de acido nucleico que se identifica y separa a partir de al menos una molecula de acido nucleico contaminante con la que se asocia ordinariamente en el entorno en que se produjo. Preferiblemente, el acido nucleico aislado esta libre de asociacion con todos los componentes asociados con el entorno de produccion, Las moleculas de acido nucleico aisladas que codifican los polipeptidos y anticuerpos en el presente documento estan en una forma diferente que en la forma o configuracion en la que se encuentran en la naturaleza. Las moleculas de acido nucleico aisladas se distinguen por tanto del acido nucleico que codifica los polipeptidos y los anticuerpos en el presente documento, que existen naturalmente en las celulas.
[0045] El termino “secuencias control” se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia de codificacion unida de manera operable en un organismo hospedador particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de union al ribosoma. Se conocen celulas eucariotas que utilizan promotores, senales de poliadenilacion, y potenciadores.
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[0046] El acido nucleico se “une de manera operable” cuando se situa en relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o llder secretora se une de manera operable al ADN de un polipeptido si este se expresa como una preprotelna que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador se une de manera operable a una secuencia de codificacion si afecta a la transcription de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma se une de manera operable a una secuencia de codificacion si se situa de tal manera que facilita la traduction. Generalmente, “unido de manera operable” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de una llder secretora, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, lo potenciadores no tienen porque ser contiguos. La union se lleva a cabo mediante ligadura en los sitios de restriction convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazantes de oligonucleotidos sinteticos segun la practica convencional.
[0047] El termino “epltopo etiquetado”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido quimerico que comprende un polipeptido o anticuerpo descrito en el presente documento condensado a un “polipeptido etiquetado”. El polipeptido etiquetado tiene suficientes restos para proporcionar un epltopo contra el cual se puede preparar un anticuerpo, adicionalmente, es suficientemente corto, de tal manera que no interfiere con la actividad del polipeptido al cual se condensa. El polipeptido etiquetado es tambien preferiblemente unico de tal manera que el anticuerpo no reacciona sustancialmente en cruzado con otros epltopos. Los polipeptidos etiquetados adecuados tienen generalmente al menos seis restos de aminoacidos y usualmente entre aproximadamente y 50 restos de aminoacidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 restos de aminoacidos).
[0048] Segun se usa en el presente documento, el termino “inmunoadhesina” designa moleculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de union de una protelna heterologa (una “adhesina”) con las funciones efectoras de las regiones constantes de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una condensacion de una secuencia de aminoacidos con la especificidad de union deseada que es diferente de la del sitio de reconocimiento y union del antlgeno de un anticuerpo (es decir, es “heterologa”), y una secuencia de la region constante de la inmunoglobulina. La parte de la adhesina de una molecula de inmunoadhesina es normalmente una secuencia de aminoacidos contigua que comprende al menos el sitio de union de un receptor o un ligando. Se puede obtener la secuencia de la region constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la sustitucion de una region de un polipeptido o anticuerpo descrito en el presente documento en lugar de al menos una region variable en el interior de una molecula de Ig. En una realization particularmente preferida, la condensation de la inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una molecula de IgG1. Para la production de las condensaciones de la inmunoglobulina vease tambien la Patente de los Estados Unidos N° 5.428.130 otorgada el 27 de junio de 1995.
[0049] Una formulation “estable” es aquella en la que la protelna de la anterior retiene esencialmente su estabilidad e integridad flsica y qulmica tras almacenamiento. Estan disponibles en la tecnica algunas tecnicas anallticas para medir la estabilidad de la protelna y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Se puede medir la estabilidad a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. Para un cribado rapido, se puede mantener la formulacion a 40° C durante 2 semanas a 1 mes, en cuyo momento se mide la estabilidad. Cuando la formulacion es para almacenarse a 2-8° C, generalmente, la formulacion deberla ser estable a 30° C o 40° C durante al menos 1 mes y/o estable a 2-8° C durante al menos 2 anos. Cuando la formulacion es para almacenarse a 30° C, generalmente la formulacion deberla ser estable durante al menos 2 anos a 30° C y/o estable a 40° C durante al menos 6 meses. Por ejemplo, se puede usar la extension de la agregacion durante el almacenamiento como un indicador de la estabilidad de la protelna. De esta manera, una formulacion “estable” puede ser la que en menos de aproximadamente un 10 % y preferiblemente menos de un 5 % de la protelna estan presentes como un agregado en la formulacion. En otras realizaciones, se puede determinar cualquier incremento en la formation de un agregado durante el almacenamiento de la formulacion.
[0050] Una formulacion “reconstituida” es la que se ha preparado disolviendo una formulacion de protelna o anticuerpo liofilizado en un diluyente de tal manera que la protelna se disuelva completamente. La formulacion reconstituida es adecuada para la administration (por ejemplo, administration parenteral) a un paciente que se va a tratar con la protelna de interes y, en algunas realizaciones de la invention, puede ser una que sea adecuada para la administracion subcutanea.
[0051] Una formulacion “isotonica” es la que tiene esencialmente la misma presion osmotica que la sangre humana. Las formulaciones isotonicas tendran generalmente una presion osmotica entre aproximadamente 250 a 350 mOsm. El termino “hipotonica” describe una formulacion con una presion osmotica por debajo de la de la sangre humana. En correspondencia, el termino “hipertonica” describe se usa para describir una formulacion con una presion osmotica por encima de la de la sangre humana. Se puede medir la isotonicidad usando, por ejemplo, una presion de vapor o un osmometro de tipo criocongelacion. Las formulaciones de la presente invencion son hipertonicas como resultado de la adicion de sal y/o tampon.
[0052] Una formulacion “reconstituida” es la que se ha preparado disolviendo una formulacion de protelna
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liofilizada en un diluyente de tal manera que la protelna se dispersa en la formulacion reconstituida. La formulacion reconstituida es adecuada para la administracion (por ejemplo, administracion parenteral) a un paciente que se va a tratar con la protelna de interes, en algunas realizaciones de la invencion, puede ser una que sea adecuada para la administracion subcutanea.
[0053] Un “acido farmaceuticamente aceptable” incluye acidos inorganicos y organicos que no son toxicos a la
concentracion y manera en la que se formulan. Por ejemplo, los acidos inorganicos adecuados incluyen clorhldrico, perclorico, bromhldrico, yodhldrico, nltrico, sulfurico, sulfonico, sulflnico, sulfanllico, fosforico, carbonico, etc. Los acidos organicos adecuados incluyen alquilo de cadena lineal y ramificada, aromaticos, clclicos, cicloalifaticos, arilalifaticos, heteroclclicos, saturados, insaturados, mono, di y tricarboxllicos, incluyendo por ejemplo, formico, acetico, 2-hidroxiacetico, trifluoroacetico, fenilacetico, trimetilacetico, t-butil acetico, antranllico, propanoico, 2- hidroxipropanoico, 2-oxopropanoico, propandioico, ciclopentanopropionico, ciclopentano propionico, 3- fenilpropionico, butanoico, butandioico, benzoico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, 2-acetoxi-benzoico, ascorbico, cinamico, lauril sulfurico, estearico, muconico, mandelico, succlnico, embonico, fumarico, malico, maleico, hidroximaleico, malonico, lactico, cltrico, tartarico, glicolico, gliconico, gluconico, piruvico, glioxalico, oxalico, mesllico, succlnico, salicllico, ftalico, palmoico, palmeico, tiocianico, metanosulfonico, etanosulfonico, 1,2-etanodisulfonico, 2- hidroxietanosulfonico, bencenosulfonico, 4-clorobencenosulfonico, naftaleno-2-sulfonico, p-toluensulfonico,
alcanforsulfonico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxllico, glucoheptonico, acido 4,4’-metilenobis-3-(hidroxi-2- eno-1-carboxllico), hidroxinaftoico.
[0054] Las “bases farmaceuticamente aceptables” incluyen las bases inorganicas y organicas cuando son no toxicas a la concentracion y manera en la que se formulan. Por ejemplo, las bases adecuadas incluyen las formadas a partir de metales que forman bases inorganicas tales como litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina y las bases no toxicas organicas que incluyen aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, aminas clclicas, y resinas basicas de intercambio ionico,[por ejemplo, N(R’)4+ ( en la que R' es independientemente H o alquilo C1-4, amonio, Tris)], por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafelna, procalna, hidrabamina, colina, betalna, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Las bases organicas no toxicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina, y cafelna.
[0055] Los acidos y las bases adicionales farmaceuticamente aceptables utilizables con la presente invencion incluyen las que se derivan de los aminoacidos, por ejemplo, histidina, glicina, fenilalanina, acido aspartico, acido glutamico, lisina y asparagina.
[0056] Los tampones y sales “farmaceuticamente aceptables” incluyen los derivados de las sales de adicion de acido y base de los acidos y bases anteriormente indicados. Los tampones y/o las sales especlficas incluyen histidina, succinato y acetato.
[0057] Un “lioprotector” es una molecula que, cuando se combina con una protelna de interes, evita o reduce significativamente la inestabilidad qulmica y/o flsica de la protelna tras la liofilizacon y el posterior almacenamiento. Los lioprotectores a modo de ejemplo incluyen azucares y sus correspondientes alcoholes azucarados; un aminoacido tal como glutamato monosodico o histidina; una metilamina tal como betalna; una sal liotropica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes azucarados trihldricos o de mayor peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; Pluronics®; y sus combinaciones. Los lioprotectores adicionales a modo de ejemplo incluyen glicerina y gelatina, y los azucares melibiosa, melezitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Los ejemplos de azucares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, iso-maltulosa y lactulosa. Los ejemplos de azucares no reductores incluyen glicosidos no reductores de compuestos polihidroxi seleccionados entre alcoholes azucarados y otros polialcoholes de cadena ramificada. Los alcoholes azucarados preferidos son monoglicosidos, especialmente los compuestos obtenidos mediante la reduccion de disacaridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo glicosldico lateral puede ser tanto glucosldico como galactosldico. Los ejemplos adicionales de alcoholes azucarados son glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulosa. Los lioprotectores preferidos son los azucares no reductores trehalosa o sacarosa.
[0058] Se anade el lioprotector a la formulacion preliofilizada en una “cantidad lioprotectora” lo que significa que, tras la liofilizacion de la protelna en presencia de la cantidad lioprotectora de lioprotector, la protelna retiene esencialmente su estabilidad en integridad flsica y qulmica tras la liofilizacion y el almacenamiento.
[0059] En la preparacion de las formulaciones de viscosidad reducida de la invencion, deberla tenerse cuidado al usar los excipientes enumerados anteriormente as! como otros aditivos, especialmente cuando se anaden a elevada concentracion, de tal manera que no aumenten la viscosidad de la formulacion.
[0060] Un “azucar farmaceuticamente aceptable” es una molecula que, cuando se combina con una protelna de interes, evita o reduce significativamente la inestabilidad qulmica y/o flsica de la protelna tras el almacenamiento. Cuando se pretende liofilizar y a continuacion reconstituir la formulacion, se pueden conocer tambien los “azucares
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farmaceuticamente aceptables” como “lioprotectores”. Los azucares a modo de ejemplo y sus correspondientes alcoholes azucarados incluyen: un aminoacido tal como glutamato monosodico o histidina; una metilamina tal como betalna; una sal liotropica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes azucarados trihldricos o de mayor peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; Pluronics®; y sus combinaciones. Los lioprotectores adicionales a modo de ejemplo incluyen glicerina y gelatina, y los azucares melibiosa, melezitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Los ejemplos de azucares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, iso-maltulosa y lactulosa. Los ejemplos de azucares no reductores incluyen glicosidos no reductores de compuestos polihidroxi seleccionados entre alcoholes azucarados y otros polialcoholes de cadena ramificada. Los alcoholes azucarados preferidos son monoglicosidos, especialmente los compuestos obtenidos mediante la reduccion de disacaridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo glicosldico lateral puede ser tanto glucosldico como galactosldico. Los ejemplos adicionales de alcoholes azucarados son glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulosa. Los azucares farmaceuticamente aceptables preferidos son los azucares no reductores trehalosa o sacarosa.
[0061] Se anaden los azucares farmaceuticamente aceptables a la formulacion en una “cantidad protectora” (por ejemplo, preliofilizacion), lo que significa que la protelna retiene esencialmente su estabilidad e integridad flsica y qulmica durante el almacenamiento (por ejemplo, tras la reconstitucion y el almacenamiento).
[0062] El diluyente de interes en el presente documento es el que es farmaceuticamente aceptable (seguro y no toxico par la administracion a un ser humano) y es util para la preparacion de una formulacion llquida, tal como un formulacion reconstituida tras la liofilizacion. Los diluyentes a modo de ejemplo incluyen agua esteril, agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), una disolucion de pH tamponado (por ejemplo, disolucion salina tamponada con fosfatos), disolucion salina esteril, disolucion de Ringer o disolucion de dextrosa. En una realizacion alternativa, los diluyentes pueden incluir, disoluciones acuosas de sales y/o tampones.
[0063] Un “conservante” es un compuesto que se puede anadir a las formulaciones en el presente documento para reducir la actividad bacteriana. La adicion de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la produccion de una formulacion multiuso (dosis multiple). Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetildibencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromaticos tales como fenol, alcohol butllico y bencllico, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol. El conservante mas preferido en el presente documento es el alcohol bencllico.
[0064] “Tratamiento” se refiere a tratamiento terapeutico y profilactico o medidas preventivas. Los individuos animales en necesidad de tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno as! como aquellos en los que se puede evitar el trastorno.
[0065] “Mamlfero” para los objetivos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamlfero, incluyendo los seres humanos, animales domesticos y de granja, y de zoo, deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, conejos, ganado, cerdos, hamsters, gerbos, ratones, hurones, ratas, gatos, etc.
[0066] Un “trastorno” es cualquier dolencia que podrla beneficiarse del tratamiento con la protelna. Este incluye los trastornos o enfermedades cronicas y agudas que incluyen las dolencias patologicas que predispones al mamlfero al trastorno en cuestion. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a tratar en el presente documento incluyen carcinomas y alergias.
[0067] Una “cantidad terapeuticamente eficaz” es al menos la concentracion minima requerida para efectuar una mejor o prevention mensurable de un trastorno particular. Se conocen bien en la tecnica las cantidades terapeuticamente eficaces de proteina conocidas, mientras que se pueden determinar las cantidades eficaces de proteinas descubiertas a partir de ahora en el presente documento mediante las tecnicas normalizadas que estan comprendidas dentro de los conocimientos del tecnico o persona tecnica experta, tal como un medico ordinario.
[0068] “Viscosidad”, segun se usa en el presente documento puede ser “viscosidad cinematica” o “viscosidad absoluta”. “Viscosidad cinematica” es una medida del flujo resistivo de un fluido bajo la influencia de la gravedad. Cuando se colocan dos fluidos de igual volumen en viscosimetros capilares identicos y se dejan fluir por gravedad, un fluido viscoso tarda mas que un fluido menos viscoso en fluir a traves del capilar. Si un fluido tarda 200 segundos hasta completar su flujo y otro fluido tarda 400 segundos, el segundo fluido es el doble de viscoso que el primero en una escala de viscosidad cinematica. “Viscosidad absoluta”, algunas veces denominada viscosidad dinamica o simple, es el producto de la viscosidad cinematica y la densidad del fluido:
Viscosidad Absoluta = Viscosidad Cinematica X Densidad
La dimension de la viscosidad cinematica es L2/T en la que L es una longitud y T es un tiempo. Habitualmente, la viscosidad cinematica se expresa en centistokes (cSt) La unidad de la viscosidad cinematica en el SI es mm2(s, que es 1 cSt. La viscosidad absoluta se expresa en unidades de centipoise (cP). La unidad SI de la viscosidad absoluta
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es el miliPascal-segundo (mPa-s), en el que 1 CP = 1 mPa-s.
[0069] Un “antihistamlnico” segun se usa en el presente documento es un agente que antagoniza el efecto fisiologico de la histamina. La union de la histamina a sus receptores, H1 y H2 da como resultado los caracterlsticos slntomas y efectos alergicos o picor, enrojecimiento, hinchazon, etc. Muchos antihistamlnicos actuan bloqueando la union de la histamina a sus receptores, h1, H2; sin embargo, se cree que otros operan inhibiendo la liberacion de la histamina. Ejemplos de antihistamlnicos son clorfeniramina, difenildramina, prometazina, cromolina de sodio, astemizol, maleato deazatadina, maleato de bronfeniramina, maleato de carbinoxamina, clorhidrato de cetirizina, fumarato de clemastina, clorhidrato de ciproheptadina maleato de dexbronfeniramina, maleato de desclorfeniramina, clorhidrato de terfenadina, clorhidrato de hidroxizina, loratidina, clorhidrato de meclizina, citrato de tripelenamina, clorhidrato de tripelenamina, clorhidrato de tripolidina.
[0070] Un “broncodilatador”, segun se usa en el presente documento, describe agentes que antagonizan o invierten la broncoconstriccion, un episodio fisiologico que se produce normalmente en la fase temprana en las reacciones asmaticas que dan como resultado una disminucion de la capacidad pulmonar y un acortamiento de la respiracion. Los broncodilatadores a modo de ejemplo incluyen epinefrina, un alfa y beta adrenergico de amplia actuacion, y los beta adrenergicos albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol, e isoetarina. Se puede conseguir tambien la broncodilatacion mediante la administration de xantinas, incluyendo aminofilina y teofilina.
[0071] Un “glucocorticoide”, segun se usa en el presente documento describe agentes basados en esteroides que tienen actividad antiinflamatoria. Se usan comunmente los glucocorticoides para atenuar la fase tardla de la reaction asmatica. Los glucocorticoides a modo de ejemplo incluyen, prednisona, dipropionato de beclometasona, triamcinolona acetonida, flunisolide, betametasona, budesonide, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolide, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona.
[0072] Un “farmaco antiinflamatorio no esteroideo” o “AINE”, segun se usa en el presente documento, describe agentes que tienen actividad antiinflamatoria que no estan basados en esteroides. Los AINE a modo de ejemplo incluyen acetaminofeno, aspirina, bromfenaco de sodio, diclofenaco de sodio, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno de calcio, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, meclofenamato de sodio, acido mefenamico, nabumetona, naproxen, naproxen de sodio, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicamo, sulindaco, tolmetina de sodio.
II Modos de llevar a cabo la invencion
A. Preparation de polipeptuidos y anticuerpos
[0073] La siguiente description se refiere principalmente a la production de los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento mediante el cultivo de celulas transformadas o transfectadas con un vector que contiene acido nucleico que codifica el mismo y la purification de la protelna o anticuerpo resultante. Se contempla, por supuesto, que se pueden emplear procedimientos alternativos, que se conocen bien en la tecnica, para preparar dichos polipeptidos o anticuerpos. Por ejemplo, se pueden producir dichas secuencias, o porciones de las mismas, mediante slntesis directa de peptidos usando tecnicas en fase solida [veanse, por ejemplo, Stewart y col., Solid- Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 21492154 (1963)]. Se puede llevar a cabo la slntesis de protelnas in vitro usando tecnicas manuales o automatica. Se puede llevar a cabo la slntesis automatizada, por ejemplo, usando un Sintetizador de Peptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar qulmicamente de manera separada diversas porciones de las protelnas o anticuerpos descritos en el presente documento y combinarse usando procedimientos qulmicos o enzimaticos.
1. Aislamiento del ADN que codifica las protelnas descritas en el presente documento
[0074] Se puede obtener el ADN que codifica las protelnas descritas en el presente documento a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm correspondiente y que expresa este a un nivel detectable. Segun esto, se puede obtener convenientemente dicho ADN que codifica la protelna humana a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, segun se describe en los Ejemplos. Se puede obtener tambien el gen que codifica la protelna a partir de una genoteca o mediante procedimientos sinteticos conocidos (por ejemplo, slntesis automatizada de acidos nucleicos).
[0075] Se pueden cribar las genotecas con sondas (tales como oligonucleotidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) disenadas para identificar el gen de interes. Se puede llevar a cabo la criba del ADNc o de la genoteca con la sonda seleccionada usando procedimientos normalizados, segun se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el gen deseado es usar la metodologla de la PCR [Sambrook y col., mas arriba; Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
[0076] Los Ejemplos siguientes describen las tecnicas de cribado de una biblioteca de ADNc. Las secuencias de
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oligonucleotidos seleccionados como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente sin ambiguedad para que se minimicen los falsos positivos. Se marca preferiblemente el oligonucleotido de tal manera que se pueda detectar tras la hibridacion con el ADN en la biblioteca que se esta cribando. Se conocen bien en la tecnica los procedimientos de marcado, e incluyen el uso de radiomarcas del tipo de ATP marcado con 32P, biotinilacion o marcado enzimatico. Se proporcionan en Sambrook y col., mas arriba, las condiciones de hibridacion, que incluyen restriction moderada y restriction elevada.
[0077] Se pueden comparar las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de las bibliotecas y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos publicas tales como Genbank u otras bases de datos de secuencias privadas. Se puede determinar la identidad de la secuencia (tanto a nivel de aminoacido como de nucleotido) dentro de regiones definidas de la molecula o a traves de la secuencia de longitud completa usando procedimientos conocidos en la tecnica segun se describe en el presente documento.
[0078] Se puede obtener el acido nucleico que tiene la secuencia que codifica la protelna cribando el ADNc o las genotecas seleccionadas usando la secuencia de aminoacidos deducida dada a conocer en el presente documento por vez primera, y, si es necesario, los procedimientos convencionales de extension del cebador, segun se describe en Sambrook y col, mas arriba, para detectar los precursores y lo intermedios de proceso del ARNm que no se han transcrito de manera inversa en el ADNc.
2. Selection y transformation de celulas hospedadoras
[0079] Las celulas hospedadoras se transfectan o transforman con vectores de expresion o de donation que contienen las protelnas o anticuerpos descritos en el presente documento para la production y se cultivan en medios nutrientes convencionales segun sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. El tecnico experto puede las condiciones de cultivo, tales como los medios, temperatura, pH y similares sin experimentation innecesaria. En general, se pueden encontrar los principios, protocolos, y tecnicas practicas para maximizar la productividad de los cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., mas arriba.
[0080] La persona normalmente experta en la tecnica conoce los procedimientos de transfection de celulas eucariotas y de transformacion de celulas procariotas, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediada por liposomas y electroporation. Dependiendo de la celula hospedadora usada, la transformacion se lleva a cabo usando las tecnicas normalizadas apropiadas para dichas celulas. Para procariotas, se usan el tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, segun se describe en Sambrook y col, mas arriba, o la electroporacion. Se usa la infection con Agrobacterium tumefaciens para la transformacion de algunas celulas de plantas, segun se describe por Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y en el documento WO 89/05859, publicado el 29 de junio de 1989. Para celulas de mamlferos in dichas paredes celulares, se puede emplear el procedimiento de precipitation con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos generales de las transfecciones en el sistema de celulas hospedadoras de mamlferos en la Patente de los Estados Unidos N° 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo normalmente segun el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, se pueden usar tambien otros procedimientos para introducir ADN en las celulas, tales como mediante microinyeccion nuclear, electroporacion, fusion de protoplastos bacterianos con celulas intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para las diversas tecnicas para transformar celulas de mamlferos, veanse Keown y col., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336: 348-352 (1988).
[0081] Las celulas hospedadoras adecuadas para la clonacion o la expresion del ADN en los vectores en el presente documento incluyen celulas procariotas, levaduras, o celulas eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Estan publicamente disponibles algunas cepas de E. coli, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446, E. coli X1776 (ATCC 31.537); las cepas W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635) de E. coli. Otras celulas hospedadoras procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigella, as! como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P dado a conocer en el documento DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos mas bien que limitantes. La cepa W3110 es un hospedador u hospedador parental particularmente preferido debido a que es una cepa hospedadora comun para el producto de ADN recombinante de las fermentaciones. Preferiblemente, la celula hospedadora segrega mlnimas cantidades de enzimas proteollticas. Se puede modificar, por ejemplo, la cepa W3110 para efectuar una mutation genetica en los genes que codifican las protelnas endogenas en el hospedador, incluyendo los ejemplos de dichos hospedadores la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo de tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo de tonA ptr3, la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244) que tiene el genotipo completo de ton A ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutacion con deleccion de degP no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa mutante periplasmica dada a conocer en la Patente de los Estados
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Unidos N° 4.946.786 otorgada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados los procedimientos de clonacion in vitro, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de acidos nucleicos con la polimerasa.
[0082] Adicionalmente a los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos o levaduras filamentosas son hospedadores de clonacion o expresion adecuados para los vectores que codifican las protelnas o los anticuerpos descritos en el presente documento. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; documento EP 139.383 publicado el 2 mayo de 1985); hospedadores de Kluyveromyces (Patente de los Estados Unidos N° 4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (cepas MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 154(2): 737-42 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y col., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28: 265278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394.538 publicado el 31 de Octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de junio de 1991), y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn y col., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Las levaduras metilotropicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas entre los generos constituidos por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies especlficas que son a modo de ejemplo de estos tipos de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
[0083] Las celulas hospedadoras adecuadas para la expresion de la forma glicosilada de los polipeptidos y anticuerpos descritos en el presente documento se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de celulas de invertebrados incluyen celulas de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, as! como celulas de plantas. Los ejemplos de llneas celulares hospedadoras de mamlferos incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO) y COS. Los ejemplos mas especlficos incluyen la llnea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS- 7, ATCC CRL 1651); llnea de rinon embrionico humano (celulas 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspension Graham y col., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de hlgado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51). Se considera que la seleccion de la celula hospedadora apropiada esta comprendida dentro del conocimiento de la persona experta en la tecnica.
3. Seleccion y uso de un vector replicable
[0084] Se puede insertar el acido nucleico (por ejemplo, el ADNc o el ADN genomico) que codifica los polipeptidos y anticuerpos descritos en el presente documento en un vector replicable par clonacion (amplification del ADN) o para expresion. Estan publicamente disponibles diversos vectores. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plasmido, cosmido, partlcula vlrica, o fago. Se puede insertar la secuencia de acido nucleico apropiada en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general se inserta el ADN en un sitio(s) de la endonucleasa de restriction apropiada usando las tecnicas conocidas en la tecnica. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o mas de una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de termination de la transcription. la construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de esto componentes emplea tecnicas de ligadura normalizadas que conocen los tecnicos expertos.
[0085] Se puede llevar a cabo la production recombinante de los polipeptidos o anticuerpos no solo directamente, sino tambien como un polipeptido de condensation con un polipeptido heterologo. La portion heterologa puede ser una secuencia senal u otro polipeptido que tiene un sitio de escision especlfico en el termino N de la protelna o polipeptido maduro. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el polipeptido o anticuerpo que se inserta en el vector. La secuencia senal puede ser una secuencia senal procariotica seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o llderes de la enterotoxina II termicamente estables. Para la secretion de las levaduras la secuencia senal puede ser, por ejemplo, la llder de la invertasa de levadura, la llder del factor alfa (que incluye Saccharomyces y Kluyveromyces, las llderes del factor a, la ultima descrita en la Patente de los Estados Unidos N° 5.010.182), o la llder de la fosfatasa acida, la llder de la glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la senal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresion de una celula de mamlfero, se pueden usar secuencias senal de mamlfero para dirigir la secrecion de la protelna, tal como las secuencias senal de los polipeptidos segregados de la misma o de especies relacionadas, as! como las llderes secretoras vlricas.
[0086] Los vectores de expresion y de clonacion contienen una secuencia de acido nucleico que permite al vector replicarse en una o mas celulas hospedadoras seleccionadas. Se conocen bien dichas secuencias para una
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variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicacion procedente del plasmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de bacterias Gram negativas. El origen del plasmido 2p es adecuado para la levadura, y diversos orlgenes vlricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son utiles para los vectores de clonacion en celulas de mamlferos.
[0087] Los vectores de expresion y de clonacion contendran normalmente un gen de seleccion, denominado tambien marcador seleccionable. Los genes de seleccion tlpicos codifican protelnas que (a) confieren resistencia a los antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes crlticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa par los Bacilli.
[0088] Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las celulas de mamlferos son los que permiten la identificacion de celulas competentes para capturar la secuencia de ADN que codifica los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento, tales como DHFR o timidina quinasa. Una celula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR natural es la llnea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada segun se describe por Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Un gen de seleccion adecuado para uso en levaduras es el gen trpl presente en el plasmido YRp7 de levadura [Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].
[0089] Los vectores de expresion y de clonacion contienen usualmente un promotor unido de manera operable a las mencionadas secuencias de ADN para dirigir la slntesis de ARNm. Se conocen bien los promotores reconocidos por una variedad de celulas hospedadoras potenciales. Los promotores adecuados para el uso con hospedadores procariotas incluyen los sistemas promotores de la p-lactamasa y la lactosa [Chang y col., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); documento EP 36.776], y promotores hlbridos tales como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacterianos contendran tambien una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida de manera operable a dichas secuencias de ADN.
[0090] Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con hospedadores de levaduras incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glicollticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa- 6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
[0091] Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripcion controlada en condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrogeno, metalotioneina, gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilizacion de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresion de levaduras se describen adicionalmente en el documento EP 73.657.
[0092] Se puede controlar la transcripcion de vectores en celulas hospedadoras de mamlferos, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de los virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989) adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, y Virus 40 de Simio (SV40), a partir de promotores heterologos de mamlferos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de la inmunoglobulina, y a partir de promotores del choque termico, con la condicion de que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las celulas hospedadoras.
[0093] Se puede incrementar la transcripcion de acido nucleico que codifica los polipeptidos o anticuerpos en el presente documento por eucariotas superiores insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actuan en cis, usualmente aproximadamente entre 10 y 300 pb, que actuan sobre un promotor para incrementar su transcripcion. Se conocen ahora muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamlferos (globina, elastasa, albumina, a-fetoprotelna, e insulina). Normalmente, sin embargo, se usara un potenciador procedente de un virus de celula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado posterior del origen de replicacion (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado posterior del origen de replicacion, y los potenciadores de adenovirus. Se puede cortar y empalmar el potenciador en el vector en una posicion 5' o 3' de la secuencia de codificacion, pero se localiza preferiblemente en el sitio 5' del promotor.
[0094] Los vectores de expresion usados en celulas hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o celulas nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendran tambien las secuencias necesarias para la finalizacion de la transcripcion y para la estabilizacion del ARNm. Dichas
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secuencias estan comunmente disponibles a partir de las regiones 5', y ocasionalmente 3' no traducidas de los ADN o ADNc eucariotas o vlricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porcion no traducida del ARNm que codifica los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento.
[0095] Otros procedimientos adicionales, vectores, y celulas hospedadoras adecuadas para la adaptacion a la slntesis de los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento en cultivos celulares recombinantes de vertebrados se describen en Gething y col., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281: 40-46 (1979); en el documento EP 117.060; y en el documento EP 117.058.
4. Detection de la amplificacion/expresion del gen
[0096] Se puede medir la amplification y/o la expresion del gen en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcription del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], inmunotransferencia (analisis del ADN), o hibridacion in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basandose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden duplex especlficos, incluyendo duplex de ADN, duplex de ARN, y duplex hlbridos de ADN-ARN o duplex de ADN-protelna. Se pueden marcar a la vez los anticuerpos y se puede llevar a cabo el ensayo cuando el duplex se une a una superficie, de tal manera que tras la formation del duplex en la superficie, se pueda detectar la presencia de anticuerpo unido al duplex.
[0097] Se puede medir, alternativamente, la expresion genica, mediante procedimientos inmunologicos, tales como tincion inmunohistoqulmica de celulas o secciones de tejido y ensayo de cultivos celulares o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresion del producto genico. Los anticuerpos utiles para tincion inmunohistoqulmica y/o ensayo de muestras de fluidos pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamlfero. Convenientemente, se pueden preparar los anticuerpos contra los polipeptidos descritos en el presente documento o contra un peptido sintetico basandose en las secuencias de AdN proporcionadas en el presente documento o contra secuencias exogenas condensadas con el ADN que codifica dichos polipeptidos y anticuerpos y que codifica un epltopo especlfico de anticuerpo.
5. Purification del polipeptido
[0098] As! pueden recuperar formas procedentes de un medio de cultivo o de lisados de celulas hospedadoras. Si estan unidas a la membrana, se pueden liberar de la membrana usando una disolucion detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escision enzimatica. Se pueden perturbar las celulas empleadas en la expresion de los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento mediante diversos medios flsicos o qulmicos, tales como ciclacion mediante congelacion-descongelacion, sonicacion, perturbation mecanica, o agentes lisantes celulares.
[0099] Se puede desear purificar los polipeptidos o los anticuerpos descritos en el presente documento a partir de protelnas celulares recombinantes u otros polipeptidos. Los siguientes procedimientos son a modo de ejemplo de los procedimientos de purificacion adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio ionico; precipitation con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografla sobre gel de sllice o sobre resina de intercambio cationico tal como DEAE; cromatofocalizacion; SDS-PAGE; precipitacion con sulfato de amonio; filtration en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de protelna A Sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas de quelacion de metales para unirse a formas de epltopos etiquetados del polipeptido o el anticuerpo Se pueden emplear diversos procedimientos de purificacion de protelnas y se conocen dichos procedimientos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa(s) de purificacion seleccionada dependera, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de production usado y del polipeptido o anticuerpo particular producido.
B. Preparation de anticuerpos
[00100] En algunas realizaciones de la presente invention, la protelna de election es un anticuerpo. A continuation se describen las tecnicas para la produccion de anticuerpos, incluyendo anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespeclficos y heteroconjugados.
1) Anticuerpos policlonales
[00101] Se incrementan generalmente los anticuerpos policlonales en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antlgeno relevante y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antlgeno relevante con una protelna que sea inmunogena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana /KLH), albumina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de la tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, maleimidobenzoilo, ester de sulfosuccinimida (conjugation a traves de restos de cistelna), N-hidroxisuccinimida (a traves de restos de lisina), glutaraldehldo, anhldrido succlnico, SOCl2, o
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R1N=C=NR, en el que R y R1 son independientemente grupos de alquilo inferior. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil Llpido A, dicorinomicolato de trehalosa sintetica. Una persona experta en la tecnica puede seleccionar el protocolo de inmunizacion sin experimentacion innecesaria.
[00102] Se inmunizaron los animales contra el antlgeno, los conjugados inmunogenicos, o los derivados, combinando, por ejemplo, 100 pg o 5 pg o la protelna o el conjugado (de conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolucion intradermicamente en multiples sitios. Un mes despues, se estimularon los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de peptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyeccion subcutanea en multiples sitios. Siete a catorce dlas despues, se sangraron los animales y se ensayo el suero par los tltulos de anticuerpos. Se estimularon los animales hasta que los tltulos alcanzaron una meseta. Se pueden preparar tambien conjugados en cultivos celulares recombinantes como protelnas de condensacion. Tambien, agentes de agregacion tales como alum, se usan para potenciar la respuesta inmune.
2) Anticuerpo monoclonales
[00103] Se obtuvieron anticuerpos monoclonales a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente y/o modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo como de que no es una mezcla de anticuerpos discretos.
[00104] Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales usando el procedimiento del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567)
[00105] En el procedimiento del hibridoma, un raton u otro animal hospedador apropiado, tal como un hamster, se inmuniza como se ha descrito anteriormente en el presente documento para estimular linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se uniran especlficamente con la protelna usada para la inmunizacion. Alternativamente, se pueden inmunizar linfocitos in vitro. A continuation se fusionan los linfocitos con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986).
[00106] El agente inmunizante incluira normalmente la protelna antigenica o una variante de condensacion de la misma. Generalmente, o se usan linfocitos de sangre periferica (“PBL”) si se desean celulas de origen humano, o se usan celulas de bazo o celulas de nodulos linfoides si se desean fuentes de mamlferos no humanos. A continuacion se fusionan los linfocitos con una llnea celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103.
[00107] Las llneas celulares inmortalizadas son normalmente celulas de mamlferos transformadas, particularmente celulas de mieloma de roedor, bovino y de origen humano. Usualmente, se emplean llneas celulares de mieloma de rata o raton. Las celulas de mieloma preparadas de esta manera se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parental carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluira normalmente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
[00108] Las celulas de mieloma inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan un nivel de production estable elevado del anticuerpo por las celulas que producen el anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, se prefieren las llneas de mieloma de murino, tales como las derivadas de tumores MOPC-21 y MPC-11 de raton disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA., y las celulas sP-2 (y sus derivados, por ejemplo X63-Ag8-653) disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia USA. Se han descrito tambien llneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
[00109] Se ensayo medio de cultivo en el que se hicieron crecer celulas de hibridoma para la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antlgeno. Preferiblemente, se determino la especificidad de la union de los anticuerpos monoclonales por las celulas de hibridoma mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).
[00110] Se puede evaluar el medio de cultivo en el que se cultivan las celulas de hibridoma para la presencia de
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anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antlgeno deseado. Preferiblemente se puede determinar la afinidad y la especificidad de la union del anticuerpo monoclonal mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo unido a enzima (ELISA). Se conocen en la tecnica dichas tecnicas y ensayos. Por ejemplo, se puede determinar la afinidad de la union mediante el analisis Scatchard de Munson y col., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
[00111] Despues que se identifican las celulas del hibridoma que producen anticuerpos de especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, se pueden subclonar los clones limitando los procedimientos de dilucion y crecimiento mediante procedimientos normalizados (Goding, mas arriba). Los medios de cultivo adecuados para este objetivo incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Adicionalmente, se pueden hacer crecer las celulas de hibridoma in vivo como tumores de ascites en un mamlfero.
[00112] Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascites, o suero, mediante procedimientos de purificacion de la inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, protelna A-Sefarosa, cromatografla de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, o cromatografla de afinidad.
[00113] Se pueden preparar tambien anticuerpos monoclonales mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567, y segun se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se alsla facilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que sean capaces de unirse especlficamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de murino). Las celulas de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, se puede colocar el ADN en vectores de expresion, que a continuacion se transfecta en celulas hospedadoras tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que no producen de otra manera las protelna de la inmunoglobulina, con el fin de sintetizar anticuerpos monoclonales en dichas celulas hospedadoras recombinantes. Los artlculos para revision sobre la expresion recombinante en bacterias del ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992).
[00114] En una realizacion adicional, se pueden aislar anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos generadas usando las tecnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) que describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la produccion de afinidad elevada (intervalo nM) de anticuerpos humanos mediante reorganizacion de la cadena (Marks y col., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), as! como la infeccion combinatoria y la recombinacion in vivo como estrategia para construir bibliotecas muy grandes de fagos (Waterhouse y col., Nucl. Acids Res., 21: 22652266 (1993)). De esta manera, estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas tradicionales del hibridoma de los anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
[00115] Se puede modificar tambien el ADN, sustituyendo, por ejemplo, la secuencia de codificacion de las regiones constantes de la cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias homologas de murino (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison, y coll., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia de codificacion de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificacion de un polipeptido no de inmunoglobulina. Normalmente, dichos polipeptidos no de inmunoglobulina estan sustituidos por las regiones constantes de un anticuerpo, o estan sustituidos por las regiones variables de un sitio de combinacion con un antlgeno de un anticuerpo para crear una anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combination con un antlgeno que tiene especificidad por un antlgeno y otro sitio de combinacion con un antlgeno que tiene especificidad por un antlgeno diferente.
[00116] Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento pueden ser monovalente, la preparation de los cuales es bien conocida en la tecnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresion recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la region Fc de tal manera que se evita la reticulation de la cadena pesada. Alternativamente, se pueden sustituir los restos de cistelna relevantes con otros restos de aminoacidos o se eliminan de tal manera que se evita la reticulacion. Son tambien adecuados los procedimientos in vitro para preparar anticuerpos monovalentes. La digestion de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmento Fab, se puede llevar a cabo usando tecnicas rutinarias conocidas en la tecnica.
[00117] Se pueden preparar tambien anticuerpos quimericos o hlbridos in vitro usando procedimientos conocidos en la qulmica de las protelnas sinteticas, que incluyen los que implican agentes de reticulacion. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reaction de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioeter Los ejemplos de reactivos adecuados a este objeto incluyen iminotiolato y metil-4.mercaptobutirimidato.
3) Anticuerpos humanizados
[00118] Los anticuerpos pueden comprender ademas anticuerpos humanizados o humanos. La formas
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humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de union a antlgeno de los anticuerpos) que contienen la secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se sustituyen los restos de una region determinante de la complementariedad (CDR) del receptor por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, se sustituyen los restos del marco Fv de la inmunoglobulina humana por los correspondientes restos no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender tambien restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o en las secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente toda de al menos una, y normalmente dos, regiones variables, en las que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado optimamente comprendera tambien al menos una porcion de una region constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Jones y col., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332: 323-329 (1988) y Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
[00119] Se conocen bien en la tecnica los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacidos introducidos en este procedentes de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoacidos no humanos se denominan a menudo restos de “importacion”, que se obtiene normalmente de una region variable de “importacion”. Se puede llevar a cabo esencialmente la humanizacion siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores, Jones y col., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239: 1534-1536 (1988), o a traves de secuencias que sustituyen la CDR o secuencias de la CDR por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Segun esto, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quimericos (Patente de los Estados Unidos N° 4.816.567), en los que sustancialmente se ha sustituido menos de una region variable humana intacta por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedores.
[00120] La eleccion de las regiones variables humanas, la ligera y la pesada, que se van a usar en la preparacion de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Segun esto, en el as! denominado procedimiento de “mejor ajuste”, se criba la secuencia de la region variable de un anticuerpo de roedor contra la biblioteca completa de secuencias de la region variable humana conocidas. A continuacion se acepta la secuencia que esta mas cercana a la del roedor como el marco humano (FR) del anticuerpo humanizado. Sims y col., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987). Otro procedimiento usa un marco particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. Se puede usar el mismo marco para diversos anticuerpos diferentes humanizados. Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993).
[00121] Adicionalmente, es importante que los anticuerpos se humanicen con retention de la elevada afinidad por el antlgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para conseguir esta meta, segun un procedimiento preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizada. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales estan comunmente disponibles y son familiares para las personas expertas en la tecnica. Estan disponibles programas informaticos que ilustran y muestran las estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspection de estas pantallas permite el analisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de los restos que influencia la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antlgeno. De esta manera, se pueden seleccionar los restos del FR y combinarse a partir de las secuencias del receptor e importacion, de tal manera que se consigue la caracteristica desead del anticuerpo, tal como un aumento de la afinidad por el antigeno(s) diana. En general, los restos de la CDR estan directa y mas sustancialmente implicados en influenciar la union al antlgeno.
[00122] Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o mas agente(s) citotoxico con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
4) Anticuerpos humanos
[00123] Como una alternativa a la humanizacion, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de production de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleccion homocigotica de la region de union a la cadena pesada del anticuerpo (Jh) del gen en ratones mutantes de lineas quimerica y germinal da como resultado la completa inhibition de la produccion de anticuerpo endogeno. La transferencia de la matriz del gen de la inmunoglobulina de linea germinal humana en
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dicha ilnea germinal de ratones mutantes dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras el estlmulo con el antlgeno. Veanse, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patente de los Estados Unidos No 5.591.669 y documento WO 97/17852.
[00124] Alternativamente, se puede usar la tecnologla de presentacion de fagos par producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de la region variable de la inmunoglobulina (V) de repertorios de genes de donantes no inmunizados. McCafferty y col., Nature 348: 552-553 (1990); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991). Segun esta tecnica, se clonan en marco los genes de la region V del anticuerpo en cualquier gen de una protelna mayor o menor recubierta de un bacteriofago filamentoso tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partlcula del fago. Debido a que la partlcula filamentosa contiene una copia del ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo dan como resultado de esta manera la seleccion del gen que codifica el anticuerpo que presenta aquellas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de las celulas B. Se puede llevar a cabo la presentacion del fago en una variedad de formatos, revisada en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3: 564-571 (1993). Se pueden usar diversas fuentes de segmentos de genes V para la presentacion del fago Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991) aislaron una matriz diversa de anticuerpos dirigidos contra oxazolona a partir de una pequena biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar los anticuerpos para una matriz diversa de antlgenos) incluyendo autoantlgenos) siguiendo esencialmente las tecnicas descritas por Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Veanse tambien las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.565.332 y 5.573.905.
[00125] Estan tambien disponibles las tecnicas de Cole y col., y Boerner y col., para la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991). Similarmente, se pueden preparar anticuerpos humanos introduciendo loci de la inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los se han inactivado parcial o completamente los genes de la inmunoglobulina endogena. Tras el estlmulo, se observa produccion de anticuerpos humanos, que se asemeja estrechamente a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la redisposicion del gen, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Se describe esta solucion, por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.545.807; 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 y en las siguientes publicaciones cientlficas: Marks y col., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
[00126] Finalmente, se pueden generar tambien anticuerpos humanos in vitro mediante celulas B activadas (veanse las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.567.610 y 5.229.275).
5) Fragmentos de anticuerpos
[00127] En algunas circunstancias existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, mas bien que en el de anticuerpos completos.
[00128] Se han desarrollado algunas tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, se derivaron estos fragmentos mediante digestion proteolltica de anticuerpos intactos (veanse, por ejemplo, Morimoto y col., J Biochem Biophys. Method. 24: 107-117 (1992); y Brennan y col., Science 229: 81 (1985)). Sin embargo, se pueden producir ahora estos fragmentos directamente mediante celulas hospedadoras recombinantes. Se pueden expresar todos los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv en y segregarse de E. coli, permitiendo de esta manera la produccion facil de grandes cantidades de estos fragmentos. Se pueden aislar fragmentos de anticuerpos a partir de las bibliotecas de anticuerpos de fagos discutidas anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarse qulmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Segun otra solucion, se pueden aislar fragmentos F(ab')2 directamente de cultivos celulares de hospedadores recombinantes. Se describen Fab y F(ab')2 con incremento in vivo de la semivida en la Patente de los Estados Unidos 5.869.046. en otras realizaciones, el anticuerpo de eleccion es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Veanse el documento WO 93/16185; la Patente de los Estados Unidos N° 5.571.894 y la Patente de los Estados Unidos N° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo puede ser tambien un “anticuerpo lineal”, por ejemplo, segun se describe en la Patente de los Estados Unidos N° 5.641.870. dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespeclficos y biespeclficos.
6) Terapia de profarmacos mediada por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT)
[00129] Se pueden usar tambien los anticuerpos en ADEPT conjugando el anticuerpo con una enzima activadora de un profarmaco que convierte un profarmaco (por ejemplo, un agente quimioterapeutico de peptidilo, vease el documento WO 81/01145) en un farmaco anticanceroso activo. Veanse, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y
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la Patente de los Estados Unidos N° 4.975.278.
[00130] El componente del enzima del inmunoconjugado util para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profarmaco de tal manera que los convierta en su forma citotoxica mas activa.
[00131] Las enzimas que son utiles en el procedimiento de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, Glicosidasa, glucosa oxidasa, lisozima humana, glucuronidasa humana, fosfatasa alcalina util para convertir los profarmacos que contienen fosfato en farmacos libres; arilsulfatasa util para convertir los profarmacos que contienen sulfato en profarmacos libres; citosina desaminasa util para convertir la 5-fluorocitosina no toxica en el farmaco anticanceroso 5-fluoroacilo; proteasas, tales como proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y carboxipeptidasa A) y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son utiles para convertir profarmacos que contienen peptidos en farmacos libres; Dalanilcarboxipeptidasas, utiles para convertir profarmacos que contienen sustituyentes de aminoacidos D en farmacos libres; p lactamasa, util para convertir farmacos derivatizados con p lactamas en farmacos libres; y penicilin amidasa, tales como penicilin V amidasa o penicilin G amidasa, utiles para convertir farmacos derivatizados en sus nitrogenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en farmacos libres. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos con actividad enzimatica, conocidos tambien en la tecnica como “abzimas” para convertir o profarmcos de la invencion en farmacos libres activos (vease, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Se pueden preparar conjugados de anticuerpo-abzima segun se describe en el presente documento par la administracion de la abzima a una poblacion de celulas tumorales.
[00132] Las enzimas anteriores se pueden unir covalentemente al polipeptido o a los anticuerpos descritos en el presente documento mediante tecnicas bien conocidas en el sector, tales como el uso de los agentes de reticulacion heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, se pueden construir protelnas de fusion que comprenden al menos la region de union al antlgeno del anticuerpo de la presente invencion unida a al menos una porcion funcionalmente activa de una enzima de la invencion, usando las tecnicas de ADN recombinante bien conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Neuberger y col., Nature 312: 604-608 (1984)).
7) Anticuerpos biespecfficos y poliespecfficos
[00133] Los anticuerpos biespeclficos (BsAb) son anticuerpos que tienen especificidades de union por al menos dos epltopos diferentes, incluyendo aquellos en la misma u otra protelna. Se puede instalar un brazo para unirse al antlgeno diana, y se puede combinar otro brazo con un brazo que se une a una molecula estimuladora sobre un leucocito tal como una molecula receptora de celulas T (por ejemplo, CD3), o receptores Fc para IgG (FcgR) tales como FcgR1 (CD64), FcgRII (CD32) y FcgRIII (CD16), de tal manera que focalicen y localicen los mecanismos de defensa celular de la celula que expresa el antlgeno diana. Se pueden derivar dichos anticuerpos de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespeclfico F(ab')2).
[00134] Se pueden usar tambien anticuerpos biespeclficos para localizar agentes citotoxicos en las celulas que expresan el antlgeno diana. Dichos anticuerpos poseen un brazo que se une al antlgeno deseado y otro brazo que se une al agente citotoxico (por ejemplo, saporina, anti-interferon-a, vinca alcaloide, cadena A de la ricina, metotrexato o hapteno con isotopo radioactivo), los ejemplos de anticuerpos biespeclficos conocidos incluyen los anticuerpos dirigidos contra ErbB2/anticuerpos dirigidos contra FcgRIII (documento WO 96/16673), los anticuerpos dirigidos contra ErbB2/anticuerpos dirigidos contra FcgRI (documento U.S.P. 5.837.234), los anticuerpos dirigidos contra ErbB2/anticuerpos dirigidos contra CD3 (documento U.S.P. 5.821.337).
[00135] Se conocen en la tecnica los procedimientos para preparar anticuerpos biespeclficos. La produccion tradicional de anticuerpos biespeclficos de longitud completa se basa en la expresion simultanea de dos parejas de la cadena pesada/cadena ligera de la inmunoglobulina, en las que las dos cadenas tienen especificidades diferentes. Millstein y col., Nature, 305: 537-539 (1983). Debido a la clasificacion aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moleculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespeclfica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que se lleva a cabo usualmente mediante cromatografla de afinidad por etapas, es mas bien engorrosa, y los resultados del producto son bajos. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker y col., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
[00136] Segun un enfoque diferente, las regiones variables de los anticuerpos con las especificidades de union deseadas sitios de combinacion de anticuerpo-antlgeno) se fusionan con las secuencias de la region constante de la inmunoglobulina. La fusion es preferiblemente con una region constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera region constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la union de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados, y se transfectan simultaneamente en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipeptidos en las realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas de polipeptidos usados en la construccion proporcionan optimos rendimientos. Es, sin embargo,
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posible insertar las secuencias de codificacion de dos de las tres cadenas de polipeptidos en un vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas de polipeptidos en relaciones iguales da como resultado elevados rendimientos o cuando las relaciones no son de particular significancia.
[00137] En una realizacion preferida de esta solucion, los anticuerpos biespeclficos estan compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina hlbrida con una primera especificidad de union en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina hlbrida (que proporciona una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Se encontro que esta estructura asimetrica facilita la separation del compuesto biespeclfico deseado de las combinaciones no deseadas de la cadena de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de la inmunoglobulina en unicamente una mitad de las moleculas biespeclficas proporciona un medio facil de separacion. Se da a conocer esta solucion en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales de generation de anticuerpos biespeclficos, vease, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
[00138] Segun otra solucion descrita en el documento WO 96/27011 o en el documento U.S.P. 5.731.168, se puede disenar mediante ingenierla genetica la interfase entre una pareja de moleculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodlmeros que se recuperan a partir de un cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte de la region CH3 de la region constante de un anticuerpo. En este procedimiento, se sustituyen una o mas de las pequenas cadenas laterales de aminoacidos procedentes de la interfase de la primera molecula de anticuerpo con cadenas laterales mas grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamano identico o similar al de la cadena(s) lateral grande sobre la interfase de la segunda molecula de anticuerpo sustituyendo las grandes cadenas laterales de aminoacidos con unas mas pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodlmero sobre otros productos terminales no deseados tales como homodlmeros.
[00139] Se han descrito en la bibliografla las tecnicas para generar anticuerpos biespeclficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespeclficos usando el enlace qulmico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que se escinden proteollticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditioles del vicinal y evitar la formation del disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuation en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuacion en el derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespeclfico. Se pueden usar los anticuerpos biespeclficos como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
[00140] Se pueden recuperar directamente los fragmentos Fab' a partir de E. coli y acoplarse qulmicamente para formar anticuerpos biespeclficos. Shalaby y col., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describe la production de moleculas F(ab')2 de anticuerpo biespeclfico completamente humanizado. Se segrego cada fragmento Fab' separadamente a partir de E. coli y se sometio a acoplamiento qulmico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespeclfico. El anticuerpo biespeclfico formado de esta manera fue capaz de unirse a celulas que expresaban por exceso el receptor ErbB2 y a celulas T humanas normales, as! como estimular la actividad lltica de los linfocitos citotoxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
[00141] Se han descrito tambien diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos bivalentes directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodlmeros bivalentes usando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Se enlazaron los peptidos de la cremallera de leucina de las protelnas Fos y Jun a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusion genica. Se redujeron los homodlmeros de los anticuerpos en la region bisagra para formar monomeros y a continuacion se volvieron a oxidar para formar los heterodlmeros de los anticuerpos. La tecnologla del “diacuerpo” descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos Biespeclficos/bivalentes. Los fragmentos comprenden una region variable de la cadena pesada (Vh) conectada a un region variable de la cadena ligera (Vl) por un enlazante que es demasiado corto para permitirle emparejarse entre las dos regiones de la misma cadena. Segun esto, las regiones Vh y Vl de un fragmento se fuerzan a emparejarse con las regiones Vl y Vh complementarias de otro fragmento, formando por tanto dos sitios de union a antlgeno. Se ha informado tambien de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespeclficos/bivalentes mediante el uso de dlmeros Fv monocatenarios (sFv). Vease Gruber y col., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
[00142] Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespeclficos. Tutt y col., J. Immunol, 147: 60 (1991).
[00143] Los anticuerpos biespeclficos a modo de ejemplo pueden unirse a dos epltopos diferentes en una molecula dada. Alternativamente, se puede combinar un brazo dirigido contra la protelna con un brazo que se une a una molecula estimuladora en un leucocito, tal como una molecula del receptor de la celula T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o de los receptores Fc de IgG (FcgR), tales como FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) y FcgRIII (CD 16) de tal manera que focalicen los mecanismos de defensa celular de la celula que expresa la protelna particular. Se pueden usar tambien anticuerpos biespeclficos para localizar agentes citotoxicos en las celulas que expresan una protelna particular. Dichos anticuerpos poseen un brazo de union a la protelna y un brazo que se une a un agente citotoxico o
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a un quelador de radionucleido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecifico de interes se une a la protelna de interes y se une ademas al factor tisular (TF).
6) Anticuerpos heteroconjugados
[00144] Los anticuerpos heteroconjugados estan compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar con avidina, el otro con biotina. Se han propuesto dichos anticuerpos, por ejemplo, para dirigir las celulas del sistema inmune hacia celulas no deseadas., documento U.S.P. 4.676.980, y para el tratamiento de la infeccion por VIH. Documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 0308936. Se contempla que se puedan preparar los anticuerpos in vitro usando procedimientos conocidos en la qulmica de las protelnas sinteticas, incluyendo los que implican agentes de reticulacion. Se pueden construir, por ejemplo, inmunotoxinas usando una reaccion de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioeter. Los ejemplos de reactivos adecuados a este objeto incluyen iminotiolato y metil-4.mercaptobutirimidato y los dados a conocer, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N° 4.676.980. Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulacion conveniente. Se conocen bien en la tecnica los agentes de reticulacion adecuados, y se dan a conocer, en la Patente de los Estados Unidos N° 4.676.980, junto con numerosas tecnicas de reticulacion.
7) Diseno mediante ingenierfa genetica de la funcion efectora
[00145] Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invencion con respecto a la funcion efectora, con el fin de potenciar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cancer. Por ejemplo se puede introducir un resto(s) de cistelna en la region Fc, permitiendo por tanto la formacion de enlaces disulfuro intercadena en esta region. En anticuerpo homodimerico generado de esta manera puede tener capacidad de internalizacion mejorada y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y muerte celular mediada por el complemento aumentadas. Veanse Caron y col., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Se pueden preparar anticuerpos homodimericos con actividad antitumoral potenciada usando reticuladores heterobifuncionales segun se describe Wolff y col., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede disenar mediante ingenierla genetica un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles y puede tener por tanto potenciada la lisis del complemento y las capacidades ADCC. Vease Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
8) Inmunoconjugados
[00146] El documento tambien se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico, tal como un agente quimioterapeutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isotopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
[00147] Los agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de dichos inmunoconjugados incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina, vinblastina, adriamicina y 5-fluorouracilo.
[00148] Las toxinas y sus fragmentos enzimaticamente activos que se pueden usar incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de la difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, protelnas de Aleurites fordii, protelnas de la diantina, protelnas de la Phytolaca americana (PAPI-PAPII y PAP-S) inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos.
[00149] Se preparan los conjugados del anticuerpo y el agente citotoxico usando una variedad de protelnas bifuncionales-agentes de acoplamiento tales como N-succinimidil-3-(2-piridiltiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados funcionales de imidoesteres (tales como HCl de dimetil adipimidato), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehldos (tales como glutaraldehldo), bis-azido compuestos (tales como bis (pazidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-disocianato de tolueno), y compuestos de fluor bis-activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno), Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina segun se describe en Vitetta y col, Science, 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugacion de radionucleotidos con el anticuerpo. Vease documento WO 94/11026. El enlazante puede ser un “enlazante escindible” que facilite la liberacion del farmaco citotoxico en la celula. Se puede usar, por ejemplo, un enlazante labil a acido, enlazante sensible a peptidasa, enlazante de dimetilo o enlazante que contiene disulfuro (Chari y col., Cancer Res. 52: 127-131 (1992)).
[00150] Adicionalmente, se contemplan tambien pequenas moleculas de toxinas tales como caliqueamicina, maitansina (documento U.S.P. 5.208.020), tricoteno y CC1065 y toxinas conjugables para uso con la formulacion inventiva. En una realizacion, el anticuerpo de longitud completa o sus fragmentos de union a antlgeno se pueden conjugar con una o mas moleculas maitansinoides (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moleculas maitansinoides por molecula de anticuerpo). Los maitansinoides son inhibidores mitoticos que actuan
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inhibiendo la polimerizacion de la tubulina. Se han descrito maitansinoides, aislados de fuentes naturales o preparados sinteticamente, incluyen maitansina, maitansinal y sus derivados y analogos, veanse, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N° 5.208.020 y las referencias citadas en la anterior (vease col. 2, llnea 53 a col. 3, llnea 10) y las Patentes de los Estados Unidos 3.896.111 y 4.151.042. Se describe tambien el procedimiento para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide en la Patente de los Estados Unidos N° 5.208.020. en una realizacion preferida, se une un maitansinoide con el anticuerpo mediante un enlace disulfuro u otro grupo enlazante que contenga azufre. Se puede convertir, por ejemplo, la maitansina en May-SS-Me, que se puede reducir a May- SH3 y reaccionar con el anticuerpo modificado para generar un inmunoconjugado de maitansinoide-anticuerpo. Chari y col., Cancer Res. 52: 127-131 (1992). Se puede modificar el anticuerpo mediante procedimientos conocidos y el anticuerpo que contiene grupos tioles libres o protegidos se hace reaccionar a continuacion con un maitansinoide que contiene disulfuro. Se puede medir la citotoxicidad del conjugado anticuerpo-maitansinoide in vitro o in vivo mediante procedimientos conocidos y determinarse la CI50.
[00151] La caliqueamicina es otro inmunoconjugado de interes. La familia de antibioticos de la caliqueamicina son capaces de producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones sub-picomolares. Los analogos estructurales de la caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, gi1, a21, as1, N-acetil-gi1, PSAG y 011 (Hinman y col., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993) y Lode y col., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)). Otros farmacos antitumorales que se pueden conjugar con el anticuerpo incluyen QFA, que es un antifolato. La caliqueamicina y QFA tienen sitios intracelulares de acciones y no cruzan facilmente la membrana plasmatica. Por tanto, la captacion celular de estos agentes a traves de la internalizacion mediada por el anticuerpo potencia mucho sus efectos citotoxicos.
[00152] Se contemplan tambien los inmunoconjugados formados entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolltica (por ejemplo, una ribonucleasa o endonucleasa de ADN tal como desoxiribonucleasa, DNasa).
[00153] Se puede conjugar tambien el anticuerpo con un atomo muy radioactivo. Estan disponibles una variedad de radionucleidos para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, Bi212, I131, In131, Y90, Re186, Re188, Sm153, P32, Pb212, y los isotopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el conjugado para diagnostico, puede comprender un atomo radioactivo para estudios de centelleo, por ejemplo Tc99 o I123, o una marca de spin para diagnostico por imagenes mediante resonancia magnetica nuclear (rmn) (conocido tambien como formacion de imagenes mediante resonancia magnetica, mri)tal como yodo-123, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, oxlgeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
[00154] Se pueden incorporar radio u otras marcas en el conjugado por medios conocidos. Por ejemplo, se puede biosintetizar el peptido o se puede sintetizar mediante slntesis qulmica de aminoacidos usando aminoacidos precursores adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrogeno. Se pueden unir marcas tales como Tc99 o I123, Re186 e In111 mediante un resto cistelna en el peptido. Se puede unir Itrio-90 mediante un resto lisina. Se puede usar el procedimiento IODOGEN® para incorporar yodo-123, Fraker y col., Biohem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978). Se describen otros procedimientos de conjugar radionucleidos en "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy," (Chatal, CRC Press 1989).
[00155] Alternativamente, se puede preparar una protelna de condensation que comprenda el anticuerpo y el agente citotoxico mediante tecnicas recombinantes o slntesis de peptidos. La longitud del ADN puede comprender las regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, tanto adyacentes entre si como separadas por una region que codifica un peptido enlazante que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
[00156] En otra realization, se puede conjugar el anticuerpo con un “receptor” (tal como estreptavidina) para la utilization en el predireccionamiento de tumores en el que se administra el conjugado de anticuerpo-receptor al paciente, seguido por la elimination del conjugado no unido de la circulation usando un agente de aclaramiento y a continuacion la administration de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleotido).
9) Inmunoliposomas
[00157] Se pueden formular tambien los anticuerpos dados a conocer en el presente documento como inmunoliposomas. Un “liposoma” es una pequena veslcula compuesta por diversos tipos de llpidos, fosfollpidos y/0 tensioactivos, que es util para la administracion de un farmaco a un mamlfero. Los componentes del liposoma se disponen comunmente en una formacion bicapa, similar a la disposition de llpidos de las membranas biologicas.
[00158] Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la tecnica, tales como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545. se dan a conocer liposomas con tiempo de circulacion potenciados en la Patente de los Estados Unidos N° 5.013. 556.
[00159] Se pueden generar liposomas particularmente utiles mediante el procedimiento de evaporation en fase
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inversa con una composition llpida que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Se extruden los liposomas a traves de filtros de tamano de poro definido para dar como resultado liposomas con el diametro deseado. Se pueden conjugar fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invention con los liposomas segun se describe en Martin y col., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reaction de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapeutico (tal como Doxorubicina) esta opcionalmente contenido en el interior del liposoma. Vease Gabizon y col., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989).
10) Otras modificaciones del anticuerpo
[00160] Se contemplan en el presente documento otras modificaciones. Por ejemplo, se puede unir el anticuerpo a uno de una variedad de pollmeros no proteinaceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copollmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Se puede atrapar el anticuerpo en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial (por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente), en sistemas coloidales de administration de farmacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartlculas y nanocapsulas), o en microemulsiones. Se dan a conocer dichas tecnicas y otras formulaciones adecuadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).
C. Formulaciones liofilizadas
[00161] Se pueden preparar tambien las formulaciones descritas en el presente documento como formulaciones liofilizadas reconstituidas. Las protelnas o anticuerpos descritos en el presente documento se liofilizan y a continuation se reconstituyen para producir las formulaciones llquidas estables de viscosidad reducida de la invention. En esta realization particular, tras la preparation de la protelna de interes segun se ha descrito anteriormente, se produce “una formulation preliofilizada”. La cantidad de protelna presente en la formulation preliofilizada se determina teniendo en cuenta los volumenes de dosis deseados, el modo(s) de administration, etc. Por ejemplo, la concentration de partida de un anticuerpo intacto puede estar entre aproximadamente 2 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente entre aproximadamente 5 mg/ml y aproximadamente 40 mg/ml y mas preferiblemente entre aproximadamente 20-30 mg/ml.
1) Preparation de formulaciones liofilizadas
[00162] La protelna que se va a formular esta generalmente presente en disolucion. Por ejemplo, en las formulaciones de viscosidad reducida con elevada fuerza ionica de la invention, puede estar presente la protelna en una disolucion de pH tamponado a un pH entre aproximadamente 4-8, y preferiblemente entre aproximadamente 57. La concentration del tampon puede ser entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM, alternativamente entre aproximadamente 3 mM y aproximadamente 15 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampon y de la tonicidad deseada de la formulation (por ejemplo, de la formulation reconstituida) Los tampones y/o las sales a modo de ejemplo son aquellos que son farmaceuticamente aceptables y se pueden crear a partir de acidos, bases y sales de los mismos adecuadas, tales como los que se defines como acidos, bases o tampones “farmaceuticamente aceptables”.
[00163] En una realization, se anade un lioprotector a la formulation preliofilizada. La cantidad de lioprotector en la formulation preliofilizada es generalmente tal que, tras reconstitution, la formulation resultante sera isotonica. Sin embargo, pueden ser tambien adecuadas formulaciones reconstituidas hipertonicas. Adicionalmente, la cantidad de lioprotector no debe ser tan baja que se produzca una cantidad inaceptable de degradacion/agregacion de la protelna tras la liofilizacion. Sin embargo, las concentraciones lioprotectoras a modo de ejemplo en la formulation preliofilizada estan entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 400 mM, alternativamente entre aproximadamente 30 mM y aproximadamente 200 mM, alternativamente entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 100 mM. Los lioprotectores a modo de ejemplo incluyen azucares y alcoholes azucarados tales como sacarosa, manosa, trehalosa, glucosa, sorbitol, manitol. Sin embargo, en circunstancias concretas, algunos lioprotectores pueden contribuir tambien a un incremento en la viscosidad de la formulation. Como tal, debe tenerse cuidado en la selection de lioprotectores particulares que minimicen o neutralicen este efecto. Se han descrito anteriormente lioprotectores adicionales con la definition de “lioprotectores, denominados tambien en el presente documento “azucares farmaceuticamente aceptables”.
[00164] La relation de protelna a lioprotector puede variar para cada protelna o anticuerpo particular y la combination lioprotectora. En el caso de un anticuerpo como la protelna de election y un azucar (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) como el lioprotector, para generar una formulation reconstituida isotonica con una elevada concentration de protelna, la relation molar de lioprotector a anticuerpo puede ser de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo, y preferiblemente de entre 200 a aproximadamente 1000 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo, por ejemplo, de entre aproximadamente 200 a aproximadamente 600 moles de lioprotector a 1 mol de anticuerpo.
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[00165] En una realizacion preferida, puede ser deseable anadir un tensioactivo a la formulacion preliofilizada. Alternativa, o adicionalmente, se puede anadir el tensioactivo a la formulacion liofilizada y/o a la formulacion reconstituida. Los tensioactivos a modo de ejemplo incluyen tensioactivos no ionicos tales como polisorbatos (por ejemplo polisorbatos 20 u 80); poloxameros (poloxamero 188); Triton; octil glicosido de sodio; lauril, miristil, linoleil, o estearil-sulfobetalna, lauril, miristil, linoleil o estearil Sarcosina; linoleil, miristil, o cetil-betalna; lauroamidopropil, cocoamidopropil, linoleamidopropil, miristamidopropil, palmidopropil, o isostearamidopropil-betalna (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil, palmidopropil, o isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil de sodio, o metil oleil-taurato de sodio; y la serie MONAQUA™ (Mona Industries, Inc., Paterson, Nueva Jersey), polietilglicol, polipropilglicol, y los copollmeros de etilen y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.). La cantidad de tensioactivo anadido es tal que reduce la formacion de partlculas de la protelna reconstituida y minimiza la formation de partlculas tras la reconstitution. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulacion preliofilizada en la cantidad de entre aproximadamente 0,001-0,5 %, alternativamente entre aproximadamente 0,005-0,05 %.
[00166] Se puede usar una mezcla de lioprotector (tal como sacarosa o trehalosa) y un agente de volumen (por ejemplo manitol o glicina) en la preparation de la formulacion de preliofilizacion. El agente de volumen puede facilitar la production de una torta liofilizada uniforme sin excesivas bolsas en la misma, etc. Se pueden incluir otros vehlculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edition, Osol, A. Ed. (1980) en la formulacion preliofilizada (y/o la formulacion liofilizada y/o la formulacion reconstituida) con la condition de que no afecten adversamente las caracterlsticas deseadas de la formulacion. Los vehlculos, excipientes o estabilizantes aceptables no sean toxicos para los receptores a las dosificaciones y las concentraciones empleadas e incluyen; agentes tamponantes adicionales; conservantes; cosolventes; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metalicos (por ejemplo, complejos Zn-protelna); pollmeros biodegradables tales como poliesteres; y/o contraiones formadores de sales tales como sodio.
[00167] La formulacion en el presente documento puede contener tambien mas de una protelna segun sea necesario para la indication particular que se esta tratando, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afecten adversamente a la otra protelna. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar dos o mas anticuerpos que se unan a la diana deseada (por ejemplo, receptor o antlgeno) en una unica formulacion. Dichas protelnas estan presentes en combination de manera adecuada en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.
[00168] Las formulaciones que se van a usar para la administration in vivo deben ser esteriles. Esto se lleva a cabo facilmente mediante filtration a traves de membranas de filtration esteriles, antes de, o despues, de la liofilizacion y la reconstitucion. Alternativamente, se puede llevar a cabo la esterilidad de la mezcla completa autoclavando los ingredientes, excepto la protelna, a aproximadamente 120° C durante aproximadamente 30 minutos, por ejemplo.
[00169] Despues que se mezclan conjuntamente la protelna, el lioprotector opcional y los otros componentes opcionales, se liofiliza la formulacion. Estan disponibles muchos criodesecadores diferentes a este objeto tales como los criodesecadores Hull50™ (Hull, EE.UU.) o GT20™ (Leybold-Heraeus, Alemania). Se lleva a cabo la criodesecacion congelando la formulacion y posteriormente sublimando el hielo del contenido congelado a una temperatura adecuada para un secado primario. En estas condiciones, la temperatura del producto esta por debajo del punto eutectico o la temperatura de colapso de la formulacion. Normalmente, la temperatura de almacenamiento para el secado primario oscilara entre aproximadamente -30 a 25° C (con la condicion de que el producto permanezca congelado durante el secado primario) a una presion adecuada, que varla normalmente entre aproximadamente 50 y 250 mTorr. La formulacion, el tamano y el tipo del envase en el que se mantiene la muestra (por ejemplo, un vial de vidrio) y el volumen del llquido dictaran principalmente el tiempo requerido para el secado, que puede variar entre unas pocas horas a algunos dlas (por ejemplo, 40-60 horas). Opcionalmente, se puede llevar tambien a cabo una etapa de secado secundario dependiendo del nivel de humedad residual deseado en el producto. La temperatura a la cual se lleva a cabo el secado secundario varla entre aproximadamente 0-40° C, dependiendo principalmente del tipo y tamano del envase y del tipo de protelna empleada. Por ejemplo, la temperatura de almacenamiento a traves de la fase completa de elimination del agua de la liofilizacion puede ser de aproximadamente 15-30° C (por ejemplo, aproximadamente 20° C). El tiempo y la presion requerida para el secado secundario sera el que produzca una torta liofilizada adecuada, dependiente, por ejemplo, de la temperatura y de otros parametros. El tiempo de secado secundario viene dictado por el nivel de humedad residual deseado en el producto y normalmente tarda al menos aproximadamente 5 horas (por ejemplo, 10-15 horas). La presion puede ser la misma que la empleada durante la etapa de secado primario. Se pueden variar las condiciones de criocongelacion dependiendo de la formulacion y del tamano del vial.
2. Reconstitucion de una formulacion liofilizada
[00170] Antes de la administracion al paciente, la formulacion liofilizada se reconstituye con un diluyente farmaceuticamente aceptable de tal manera que la concentration de protelna en la formulacion reconstituida sea al menos de aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo entre aproximadamente 50 mg/ml y aproximadamente 400 mg/ml, alternativamente entre aproximadamente 80 mg/ml y aproximadamente 300 mg/ml, alternativamente entre aproximadamente 90 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml, Dichas elevadas concentraciones de protelna en la
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formulacion se considera que son particularmente utiles cuando se pretende la administracion subcutanea de la formulacion reconstituida. Sin embargo, para otras rutas de administracion, tales como la administracion intravenosa, se pueden desear concentraciones mas bajas de la protelna en la formulacion reconstituida (por ejemplo, entre aproximadamente 5-50 mg/ml, o entre aproximadamente 10-40 mg/ml de protelna en la formulacion reconstituida). En algunas realizaciones, la concentracion de protelna en la formulacion reconstituida es significativamente mayor que la de la formulacion preliofilizada. Por ejemplo, la concentracion de protelna en la formulacion reconstituida puede ser aproximadamente 2-40 veces, alternativamente 3-10 veces, alternativamente 3-6 veces (por ejemplo, al menos tres veces o al menos cuatro veces) la de la formulacion preliofilizada.
[00171] La reconstitucion tiene lugar generalmente a un temperatura de aproximadamente 25° C para asegurar la completa hidratacion, aunque se pueden emplear otras temperaturas segun se desee. El tiempo requerido para la reconstitucion dependera, por ejemplo, del tipo de diluyente, la cantidad de excipiente(s) y la protelna. Los diluyentes a modo de ejemplo incluyen agua esteril, agua bacteriostatica para inyeccion (BWEI), una disolucion a pH tamponado (por ejemplo, disolucion salina tamponada con fosfato), disolucion salina esteril, disolucion de Ringer o disolucion de dextrosa. El diluyente contiene opcionalmente un conservante. Se han descrito anteriormente los conservantes a modo de ejemplo, siendo preferidos como conservantes los alcoholes aromaticos tales como alcohol bencllico o fenolico. La cantidad de conservante empleado se determina evaluando las concentraciones de los diferentes conservantes para la compatibilidad con la protelna y el ensayo de la eficacia del conservante. Por ejemplo, si el conservante es un alcohol aromatico (tal como alcohol bencllico), puede estar presente en una cantidad entre aproximadamente un 0,1-2,0 % y preferiblemente entre aproximadamente un 0,5-1,5 %, pero lo mas preferible aproximadamente un 1,0-1,2 %.
[00172] Preferiblemente, la formulacion reconstituida tiene al menos 6000 partlculas por vial que son > 10 pm de tamano.
D. Formulaciones liauidas
[00173] Las formulaciones terapeuticas se preparan para el almacenamiento mezclando el ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con vehlculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 18a edicion, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990]). Los vehlculos, excipientes, o estabilizantes aceptables no son toxicos para los receptores a las dosificaciones y la concentraciones empleadas, e incluyen, tampones, antioxidantes que incluyen acido ascorbico, metionina Vitamina E, metabisulfito de sodio; conservantes, isotonificantes, estabilizantes, complejos metalicos (por ejemplo, complejos Zn-protelna); agentes quelantes tales como EDTA y/o tensioactivos no ionicos.
[00174] Cuando el agente terapeutico es un fragmento de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor mas pequeno que se une especlficamente con la region de union de la protelna diana. Por ejemplo, basandose en las secuencias de la region variable de un anticuerpo, se pueden disenar fragmentos de anticuerpos o incluso moleculas de peptidos que retengan la capacidad de unirse a la secuencia de la protelna diana. Se pueden sintetizar dichos peptidos qulmicamente y/o producirse mediante tecnologla de ADN recombinante (vease, por ejemplo, Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 [1993]).
[00175] Se usan tampones para controlar el pH en un intervalo que optimice la efectividad terapeutica, especialmente si la estabilidad es dependiente del pH. Los tampones estan preferiblemente presentes a concentraciones que varlan entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 250 mM. Los agentes tamponantes adecuados para uso con la presente invencion incluyen acidos organicos e inorganicos y sus sales. Por ejemplo, citrato, fosfato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Adicionalmente. Los tampones pueden estar comprendidos por histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.
[00176] Se anaden conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y estan tlpicamente presentes en un intervalo entre 0,2 %-1,0 % (p/v). Los conservantes adecuados para uso con la presente invencion incluyen (los mencionados como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de bencetonio; timerosal, fenol, alcohol butllico o bencllico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol.
[00177] Los agentes de tonicidad, conocidos algunas veces como “estabilizantes” estan presentes para ajustar o mantener la tonicidad del llquido de una composicion. Cuando se usan con grandes biomoleculas cargadas tales como protelnas y anticuerpos, se denominan a menudo “estabilizantes” debido a que pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de aminoacidos, disminuyendo el potencial de las interacciones inter e intramoleculares. Pueden estar presentes los agentes de tonicidad en cualquier cantidad entre 0,1 % y 25 % en peso, preferiblemente 1 a 5 %, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes. Los agentes de tonicidad incluyen alcoholes azucarados polihfdricos, preferiblemente trihldricos o alcoholes azucarados superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.
[00178] Los excipientes adicionales incluyen agentes que pueden servir como uno o mas de los siguientes:
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(1) Agentes de volumen, (2) potenciadores de la solubilidad, (3) estabilizantes y (4) agentes que evitan la desnaturalizacion o la adherencia a la pared del contendor. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo entre 0,1 y 10.000 partes por peso de protelna activa o anticuerpo. Los estabilizantes tlpicos incluyen: alcoholes azucarados polihldricos (enumerados anteriormente); aminoacidos tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalnina, acido glutamico, treonina, etc.; azucares organicos o alcoholes azucarados tales como sacarosa, lactosa, lactitol, trehalosa, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mionisitosa, mionisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutation, acido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; protelnas de bajo peso molecular tale como albumina de suero humano, albumina de suero bovino, gelatina u otras inmunoglobulinas; pollmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; monosacaridos (por ejemplo, xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacaridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa); trisacaridos tales como rafinosa; y polisacaridos tale como dextrina o dextrano.
[00179] Los tensioactivos no ionicos o detergentes (conocidos tambien como “agentes humectantes” estan presentes para ayudar a solubilizar el agente terapeutico as! como para proteger la protelna terapeutica contra la agregacion inducida por la agitacion, lo que permite tambien que la formulacion se exponga al estres superficial por cizalladura sin que se produzca la desnaturalizacion de la protelna terapeutica o anticuerpo activo. Los tensioactivos no ionicos estan presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
[00180] Los tensioactivos no ionicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), poloxameros (184, 188, etc.), polioles Pluronic®, Triton, monoeteres de polioxietilen sorbitan (Tween®-20, Tween®-80, etc.), lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, ester de sacarosa acido graso, metil celulosa y carboximetil celulosa. Los detergentes anionicos que se pueden usar incluyen lauril sulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilo sodio y sulfonato de dioctil sodio. Los detergentes cationicos incluyen cloruro de benzalconio o cloruro de benzetonio.
[00181] Con el fin de usar las formulaciones para la administracion in vivo, deben ser esteriles. Se puede volver esteril la formulacion mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles. Las composiciones terapeuticas en el presente documento se colocan en un envase que tiene puerto de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolucion intravenosa que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica.
[00182] La ruta de administracion esta de acuerdo con los procedimientos conocidos y aceptados, tales como mediante bolo o infusion unica o multiple durante un largo periodo de tiempo de una manera adecuada, por ejemplo, inyeccion o infusion mediante rutas subcutanea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional o intraarticular, administracion topica, inhalacion o mediante liberacion mantenida o medios de liberacion extendida.
[00183] La formulacion en el presente documento puede contener tambien mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion particular que se esta tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre si. Alternativa, o adicionalmente, la composicion puede comprender un agente citotoxico, citocina o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moleculas estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son efectivas para el objetivo pretendido.
[00184] Se pueden atrapar tambien los ingredientes activos en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administracion de farmacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartlculas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Se dan a conocer dichas tecnicas en Remington's Pharmaceutical Sciences 18a edicion, mas arriba.
[00185] Se pueden preparar preparaciones de liberacion mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion mantenida incluyen matrices semipermeables de pollmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de artlculos conformados, por ejemplo, pellculas, o microcapsulas: Los ejemplos de matrices de liberacion mantenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil- metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidos (Patente de los Estados Unidos N° 3.773.919) copollmeros de acido L- glutamico y g-etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copollmeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copollmero de acido lactico- acido glicolico y acetato de leuprolido, y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutfrico. Se ha llevado a cabo satisfactoriamente la microencapsulacion de protelnas recombinantes para liberacion mantenida con la hormona de crecimiento humana (rhGH), interferon-(rhlFN), interleucina-2, y MN rpg 120. Johnson y col., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda y col., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora y col., Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439462; documentos WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; y Patente de los Estados Unidos N° 5.654.010.
[00186] Se pueden desarrollar las formulaciones de liberacion mantenida de estas protelnas usando un pollmero de
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acido polilactico-coglicolico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y a la amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradacion de PLGA, los acidos lactico y glicolico, se pueden aclarar bastante en el interior del cuerpo humano. Ademas, se puede ajustar la degradabilidad de este pollmero de meses a anos dependiendo de su peso molecular y composicion. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; Nueva York, 1990), M. Chasin y R. Langer (Eds.) pp. 1-41.
[00187] Mientras que pollmeros tales como acetato de etilen-vinilo y acido lactico-acido glicolico liberan las moleculas durante 100 dlas, algunos hidrogeles liberan las protelnas en periodos mas cortos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposicion a la humedad a 37° C, dando como resultado una perdida de actividad biologica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden concebir estrategias racionales de estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es la formacion de un enlace S-S intermolecular mediante un intercambio tio-disulfuro, se puede conseguir la estabilizacion modificando los restos sulfidrilo, liofilizandolos a partir de disoluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando los aditivos apropiados y desarrollando composiciones especlficas de matriz polimerica.
[00188] Se pueden usar tambien composiciones liposomales o proteoinoides para formular las protelnas o los anticuerpos dados a conocer en el presente documento. Veanse las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.925.673 y 5.013.556.
[00189] Se puede potenciar la estabilidad de las protelnas y anticuerpos descritos en el presente documento mediante el uso de “sales metalicas polivalentes solubles en agua” no toxicas. Los ejemplos incluyen Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Sn4+, Al2+ y Al3+. Los aniones modo de ejemplo que pueden formar sales solubles en agua con los cationes metalicos polivalentes anteriores incluyen los formados a partir de acidos inorganicos y/o acidos organicos. Dichas sales solubles en agua tienen una solubilidad en agua (a 20° C) de al menos aproximadamente 20 mg/ml, alternativamente al menos aproximadamente 100 mg/ml, alternativamente al menos aproximadamente 200 mg/ml.
[00190] Los acidos inorganicos adecuados que se pueden usar para formar las “sales metalicas polivalentes solubles en agua” incluyen el acido clorhldrico, acetico, sulfurico, nltrico, tiocianico y fosforico. Los acidos organicos adecuados que se pueden usar incluyen acidos carboxllicos alifaticos y acidos aromaticos. Los acidos alifati cos comprendidos dentro de esta definicion se pueden definir como acidos carboxllicos C2-9 saturados o insaturados (por ejemplo, acidos mono, di y tricarboxllicos). Por ejemplo, los acidos monocarboxllicos a modo de ejemplo comprendidos dentro de esta definicion incluyen los acidos monocarboxllicos C2-9 saturados acetico, propionico, butlrico, valerico, caproico, enantico, caprllico, pelargonico y caprionico, y los acidos monocarboxllicos C2-9 insaturados acrllico, propiolico, metacrllico, crotonico e isocrotonico. Los acidos dicarboxllicos a modo de ejemplo incluyen los acidos dicarboxllicos C2-9 saturados malonico, succlnico, glutarico, adlpico y pimelico, mientras que los acidos dicarboxllicos C2-9 insaturados incluyen los acidos maleico, fumarico, citacronico y mesaconico. Los acidos tricarboxllicos a modo de ejemplo incluyen los acidos tricarboxllicos C2-9 saturados tricarballlico, y 1,23- butanotricarboxllico. Adicionalmente, los acidos carboxllicos de esta definicion pueden contener tambien uno o dos grupos hidroxilo para formar acidos hidroxi carboxllicos. Los acidos hidroxi carboxllicos a modo de ejemplo incluye el acido glicolico, lactico, glicerico, tartronico, malico, tartarico y cltrico. Los acidos aromaticos comprendidos dentro de esta definicion incluyen acido benzoico y salicllico.
[00191] Las sales metalicas polivalentes solubles en agua comunmente empleadas que se pueden usar para ayudar a estabilizar los polipeptidos encapsulados de esta invencion incluyen, por ejemplo: (1) las sales metalicas de acidos inorganicos de haluros (por ejemplo, cloruro de cinc, cloruro de calcio), sulfatos, nitratos, fosfatos y tiocianatos; (2) las sales metalicas de acidos carboxllicos alifaticos (por ejemplo, acetato de calcio, acetato de cinc, propionato de calcio, glicolato de cinc, lactato de calcio, lactato de cinc y tartrato de cinc); y (3) las sales metalicas de acidos carboxllicos aromaticos de benzoatos (por ejemplo, benzoato de cinc) y los salicilatos.
E. Procedimientos de tratamiento:
[00192] Para la prevention o el tratamiento de la enfermedad, la dosificacion apropiada de un agente activo dependera del tipo de enfermedad que se va a tratar, segun se ha definido anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el agente se administra con objetivos preventivos o terapeuticos, de la terapia previa, el historial cllnico del paciente y la respuesta al agente, y de la discretion del medico especialista que atiende la enfermedad. El agente se administra adecuadamente al paciente en una vez o en una serie de tratamientos.
[00193] Un procedimiento preferido de tratamiento es el tratamiento de los trastornos mediados por IgE. Los trastornos mediados por IgE incluyen trastornos atopicos, que se caracterizan por una propension heredada a responder inmunologicamente a cualquier antlgeno que se produzca naturalmente, inhalado o ingerido y a la continua production de anticuerpos IgE. Los trastornos atopicos especlficos incluyen asma alergica, rinitis alergica, dermatitis atopica y gastroenteropatla alergica. Los pacientes atopicos tienen a menudo multiples alergias, los que significa que tienen anticuerpos IgE de, y slntomas de, muchos alergenos ambientales, que incluyen polenes,
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hongos (por ejemplo, mohos), residuos animales y de insectos y algunos alimentos.
[00194] Sin embargo, los trastornos asociados con elevados niveles de IgE no se limitan a aquellos con una etiologla heredada (atopica). Otros trastornos asociados con elevados niveles de IgE, que parecen estar mediados por IgE y son tratables con la formulaciones de esta presente invencion incluyen hipersensibilidad (por ejemplo, hipersensibilidad anafilactica), eczema, urticaria, aspergilosis broncopulmonar alergica, enfermedades parasitarias, slndrome de hiper-IgE, ataxia-telangiectasia, slndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tlmica, mieloma de IgE, y reaccion del hospedador frente a injerto.
[00195] La rinitis alergica, conocida tambien como rinoconjuntivitis alergica o fiebre del heno, es la manifestacion mas comun de una reaccion atopica a alergenos inhalados, la gravedad y duracion de la cual esta a menudo correlacionada con la intensidad y la longitud de la exposicion al alergeno. Es una enfermedad cronica, que puede aparecer en primer lugar a cualquier edad, pero el comienzo es usualmente durante la infancia o la adolescencia. Un ataque tlpico consiste en una rinorrea acuosa profusa, estornudos paroxlsmicos, obstruccion nasal y picor de la nariz y del paladar, El drenado del moco postnasal produce tambien dolor de garganta, aclarado de la garganta y tos. Pueden ser tambien slntomas de blefaroconjuntivitis alergica, con picor intenso de la conjuntiva y los parpados, enrojecimiento, carraspera, y fotofobia. Los ataques graves se ven a menudo acompanados por malestar sistemico, debilidad, fatiga, y algunas veces, dolor muscular tras intensos periodos de estornudos.
[00196] Asma, conocida tambien como enfermedad obstructiva reversible de las vlas aereas, se caracteriza por hipersensibilidad del arbol traqueobronquial a los irritantes respiratorios y a los agentes qulmicos broncoconstrictores, produciendo ataques de estornudos, disnea, opresion en el pecho, y tos, que son reversibles espontaneamente o con tratamiento. Es una enfermedad cronica que implica la via aerea completa, pero que varla en la gravedad desde ligeros episodios transitorios ocasionales a obstruccion bronquial cronica, grave, con riesgo para la vida. El asma y la atopla pueden coexistir, pero unicamente aproximadamente la mitad de los asmaticos son tambien atopicos, e incluso un porcentaje mas pequeno de pacientes atopicos tienen tambien asma. Sin embargo, la atopla y el asma no son completamente independientes ya que el asma se produce mas frecuentemente entre individuos atopicos que entre no atopicos, especialmente durante la infancia. De manera adicional, se ha clasificado el asma historicamente en dos subgrupos, asma extrlnseca y asma intrlnseca.
[00197] El asma extrlnseca, conocida tambien como asma alergica, atopica o inmunologica, es descriptiva de pacientes que desarrollan generalmente asma de una manera temprana durante la vida, usualmente durante la primera o segunda infancia. Coexisten a menudo otras manifestaciones de atopla, que incluyen ezcemas o rinitis alergica. Se pueden producir los ataques asmaticos durante las estaciones con polen, en presencia de animales, o en exposicion al polvo en las casas, almohadas de plumas, u otros alergenos. Las pruebas en piel muestran reacciones de habon y eritema positivas a los alergenos causantes. De manera interesante, las concentraciones de IgE en suero con frecuentemente elevadas, pero algunas veces normales.
[00198] El asma intrlnseca, conocida tambien como asma no alergica o idiopatica, se produce normalmente en primer lugar durante la vida adulta, tras una infeccion respiratoria aparente. Los slntomas incluyen obstruccion bronquial cronica o recurrente no relacionada con las estaciones con polen o exposicion a otros alergenos. Las pruebas en piel son negativas a los alergenos atopicos usuales, la concentration de IgE en suero es normal. Los slntomas adicionales incluyen esputos de sangre y eosinofilia. Otros esquemas para clasificar el asma en subgrupos, del tipo sensible a la aspirina, inducida por ejercicio, factores estimuladores externos que definen solamente caracterlsticas infecciosas y psicologicas que afectan a algunos pacientes mas que a otros.
[00199] Finalmente, es importante senalar que se han asociado historicamente algunas clasificaciones unicamente al asma alergica con dependencia de IgE, existen ahora importantes datos estadlsticamente significativos que muestran una correlation entre IgE y asma (alergica y no alergica). Capltulo 27, "The Atopic Diseases", A.I. Terr en Medical Immunology, 9a Ed., Simon and Schuster, Stites y col, Ed. (1997). Como resultado, el termino “trastornos mediados por IgE”, para los objetivos de esta solicitud de patente, incluye el asma alergica y no alergica.
[00200] Los signos flsicos de un ataque de asma incluyen taquipnea, estertor audible, y uso de los musculos accesorios de la respiration. Estan tambien presentes un pulso rapido y una elevada presion sangulnea, tal como as! mismo elevados niveles de eosinofilos en la sangre periferica y secreciones nasales. Las funciones pulmonares muestran una disminucion en los caudales y un volumen expiratorio forzado de 1 segundo (FEVi). La capacidad pulmonar total y la capacidad residual funcional son tlpicamente normales o ligeramente incrementadas, pero pueden disminuir con broncoespasmos extremos.
[00201] Se puede distinguir la patologla del asma mediante las reacciones de la fase temprana y la fase tardla. La fase temprana se caracteriza por la contraction del musculo liso, edema e hipersecrecion, mientras que las reacciones de la fase tardla por la inflamacion celular. Se puede inducire el asma por diversos estimuladores no especlficos que incluyen las infecciones (por ejemplo, infecciones respiratorias vlricas), factores fisiologicos (por ejemplo, ejercicio, hiperventilacion, respiracion profunda, factores psicologicos), factores atmosfericos (por ejemplo, dioxido de azufre, amonlaco, aire frlo, ozono, vapor de agua destilada), ingestivos (por ejemplo, propanolol, aspirina, farmacos antiinflamatorios no esteroideos), inhalantes experimentales (por ejemplo, isocianatos). Los diversos
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alergenos laborales o ambientales que producen asma alergica pueden incluir, productos animales, insectos del polvo, criaturas marinas, productos para el cuidado de las plantas, frutos, semillas hojas y polenes, colorantes y tintas organicas, agentes microbianos, enzimas, agentes terapeuticos, agentes esterilizantes, compuestos qulmicos inorganicos y organicos.
[00202] La dermatitis atopica, conocida tambien como eczema, neurodermatitis, eczema topico o prurigo de Besnier, es el trastorno cronico comun de la piel especlfico de un subconjunto de pacientes con caracterlsticas familiares e inmunologicas de atopla. La caracterlstica esencial es una respuesta inflamatoria dermica prurltica que induce una erupcion en la piel distribuida simetricamente de forma caracterlstica con predileccion por algunos sitios. Existe tambien una frecuente produccion en exceso de IgE por los linfocitos B. Aunque la dermatitis atopica se clasifica como una forma cutanea de atopla debido a que esta asociada con la rinitis alergica t el asma y elevados niveles de IgE, la gravedad de la dermatitis, sin embargo, no se correlaciona siempre con la prueba de alergenos en piel, y la desensibilizacion (a diferencia de otras enfermedades alergicas) no es un tratamiento eficaz. Aunque un elevado nivel de IgE en suero es confirmativo de un diagnostico de asma alergica, niveles normales no excluyen esta. El comienzo de la enfermedad puede producirse a cualquier edad, y las lesiones comienza de manera aguda con papulas o placas edematosas eritematosas con escarificaciones. El picor conduce al llanto y la formacion de costras y a continuacion a la liquenificacion. A nivel celular, la lesion aguda es edematosa y la dermis esta infiltrada con celulas mononucleares, linfocitos CD4. Son raros los neutrofilos, eosinofilos, las celulas plasmaticas y los basofilos, pero estan presentes mastocitos desgranulados. hiperplasia epidermica caracterlstica de las lesiones cronicas, hiperqueratosis y parqueratosis, y la dermis esta infiltrada con celulas mononucleares, celulas de Langerhans y mastocitos. Pueden existir zonas focales de fibrosis que incluyen la implication del perineuro de pequeno nervios.
[00203] La gastroenteropatfa alergica, conocida tambien como gastroenteropatla eosinofllica, es una manifestation atopica inusual en la que se asocian multiples sensibilidades alimentarias a IgE con una reaction mucosal local en el tracto gastrointestinal. Es rara en adultos, pero mas comun, aunque transitoria, en ninos. Se produce la dolencia cuando los alergenos alimentarios ingeridos reaccionan con los anticuerpos IgE locales en la mucosa yeyunal y liberan mediadores mastoclticos, dando como resultado slntomas gastrointestinales poco despues de la comida. La exposition continuada produce inflamacion cronica, dando como resultado la perdida de protelnas gastrointestinales y edema hipoproteinemico. La perdida de sangra a traves de la mucosa intestinal inflamada puede ser suficientemente significativa para producir anemia por deficiencia en hierro. La reaccion alergica se produce localmente en la mucosa gastrointestinal superior tras la exposicion al alergeno, pero se resuelve evitando el alergeno.
[00204] Anafilaxis y urticaria estan claramente mediadas por IgE, aunque carecen de determinantes geneticos, y no tienen predileccion por individuos atopicos. La anafilaxis es una reaccion alergica aguda generalizad con implicacion simultanea de diversos sistema organicos, usualmente cardiovascular, respiratorio, cutaneo y gastrointestinal. La reaccion esta inmunologicamente mediada, y se produce por la exposicion a un alergeno al cual el sujeto se ha sensibilizado anteriormente. La urticaria y el angiodema estan referidos a hinchazon flsica, eritema y picor, resultantes de receptores estimulados por histaminas en los vasos sangulneos cutaneos superficiales, y es la caracterlstica cutanea de contraste de la anafilaxis sistemica. La anafilaxis sistemica es la incidencia de una reaccion mediada por IgE simultaneamente en multiples organos resultante de farmacos, venenos de insectos o alimentos. Se produce repentinamente por los mastocitos inducidos por alergeno saturados de IgE, dando como resultado una profunda alteration con riesgo para la vida en el funcionamiento de diversos organos vitales. El colapso vascular, obstruction aguda de las vlas aereas, vasodilatation cutanea y edema, y espasmos musculares gastrointestinales y genitourinarios se producen siempre simultaneamente, aunque no siempre en el mismo grado.
[00205] La patologla de la anafilaxis incluye el angiodema y los pulmones hiperinflamados, con taponamiento mucosos de las vlas aereas y atelectasis focal. A nivel celular, los pulmones aparecen similarmente como durante un ataque agudo de asma con hipersecrecion de las glandulas submucosales bronquiales, edema mucosal y submucosal, congestion vascular peribronquial, y eosinofilia en las paredes bronquiales. Pueden estar presentes el edema pulmonar y hemorragias. Pueden estar tambien presentes espasmos musculares bronquiales, hiperinflamacion, e incluso rotura de los alveolos. Las caracterlsticas importantes de la anafilaxis humana incluyen edema, congestion vascular y eosinofilia en la lamina propia de la laringe, traquea, epiglotis e hipofaringe.
[00206] La exposicion al alergeno puede ser mediante ingestion, inyeccion, inhalation o contacto con la piel o la membrana mucosa. La reaccion comienza en segundos o minutos tras la exposicion al alergeno. Puede ser un miedo o sensation inicial de muerte inminente, seguido rapidamente por slntomas en uno o mas sistemas organicos diana: cardiovascular, respiratorio, cutaneo y gastrointestinal.
[00207] Los alergenos responsables de la aanafilaxis difieren de los comunmente asociados con la atopla Alimentos, farmacos, venenos de insectos o latex son fuentes comunes. Los alergenos alimentarios incluyen los que se encuentran en crustaceos, moluscos (por ejemplo, langosta, camaron, cangrejo), pescado, legumbres (por ejemplo, cacahuetes, guisantes, alubias, regaliz), semillas (por ejemplo, sesamo, semillas de algodon, alcaravea, mostaza semillas de lino, girasol), nueces, bayas, huevos blancos, trigo sarraceno y leche. Los alergenos de farmacos incluyen los que se encuentran en protelnas y polipeptidos heterologos, polisacaridos y farmacos
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haptenicos. Los alergenos de insectos incluyen insectos himenopteros, que incluyen, la abeja, avispa germanica, avispon, avispa, hormiga colorada.
[00208] Aunque el tratamiento tlpico para la epinefrina es la anafilaxis, se prescriben normalmente antihistamlnicos u otros bloqueantes de las histaminas para la urticaria menos intensa o la reaccion angioedemica.
F. Terapias de combinacion
[00209] El procedimiento de tratamiento se puede combinar con procedimientos conocidos de tratamiento para el trastorno mediado por IgE, como etapas de tratamiento combinadas o adicionales, o como componentes adicionales de una formulacion terapeutica.
[00210] Por ejemplo, se pueden administrar histaminas, especialmente antihistamlnicos no sedantes, antes, antes de, o en proporcion con los anticuerpos dirigidos contra IgE de la invencion. Los antihistamlnicos adecuados incluyen los de la alquilamina (por ejemplo, clorfeniramina), etanolamina (por ejemplo, difenhidramina) y fenotiazina (por ejemplo, prometazina) Aunque muchos antihistamlnicos antagonizan los efectos farmacologicos de la histamina bloqueando sus sitios receptores en las celulas efectoras, otros farmacos antihistamlnicos comunes operan bloqueando la liberation de la histamina desde los mastocitos que se han sensibilizado y provisto con IgE especlfica de alergeno (por ejemplo, cromolina de sodio). Los antihistamlnicos a modo de ejemplo incluyen astemizol, maleato de azatadina, maleato de brofeniramina, maleato de carbinoxamina, clorhidrato de cetirizina, fumarato de clemastina, clorhidrato de ciproheptadina, maleato de dexbronferniramina, maleato de dexclorfeniramina, dimenhidrinato, clorhidrato de difenhidramina, succinato de doxilamina, clorhidrato de fexofendadina, clorhidrato de terfenadina, clorhidrato de hidroxizina, loratidina, clorhidrato de meclizina, citrato de tripelenamina, clorhidrato de tripelenamina, clorhidrato de tripolidina.
[00211] Se pueden mejorar los slntomas particulares de los trastornos mediados por IgE (por ejemplo reacciones en la fase temprana) con simpaticomimeticos o farmacos que tienen efecto broncodilatador. La epinefrina es un alfa y beta-adrenergico de amplio espectro que se administra a menudo por via subcutanea en una dosis de 0,1 - 0,5 ml de una disolucion acuosa 1:100. Una forma de actuation a largo plazo (es decir, terbutalina) incluye albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol, isoetarina y formoterol para administration nasal (por ejemplo, nebulizador de manipulation manual), dispositivo de respiration intermitente a presion positiva, o inhaladores presurizados de dosis medida) o por via oral.
[00212] Se puede conseguir tambien la broncodilatacion mediante la administracion de xantinas, especialmente cuando se administran en combinacion con los anteriores farmacos simpaticomimeticos. Las xantinas a modo de ejemplo incluyen aminofilina (iv. 250-500 mg) y teofilina (oral, 10-20 pg/ml ce concentration en suero).
[00213] Se pueden atenuar otros slntomas de diversos trastornos mediados por IgE (por ejemplo, trastornos en la fase tardla) mediante el tratamiento con glucocorticoides u otros farmacos que tienen efectos antiinflamatorios. Se administra prednisona (30-60 mg diariamente) sistemicamente para ataques graves, mientras que se administran dipropionato de beclometasona, triamcinolona acetonida y flunisolide en forma de aerosol como terapia de mantenimiento a largo plazo. Adicionalmente, los corticoesteroides que tienen efectos antiinflamatorios incluyen: betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolide, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona.
[00214] Los farmacos antiinflamatorios no esteroideos que se pueden usar tambien en combinacion con los procedimientos terapeuticos incluyen, acetaminofeno, aspirina, bromfenaco de sodio, diclofenaco de sodio, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno de calcio, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, meclofenamato de sodio, acido mefenamico, nabumetona, naproxeno, naproxeno de sodio, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicamo, sulindaco, tolmetina de sodio.
[00215] Adicionalmente se puede conseguir tambien el maximo beneficio terapeutico con la administracion de descongestivos (por ejemplo, fenilefrina, fenilpropalamina, pseudoefedrina), supresores de la tos (por ejemplo, dextrometorfan, codelna, o hidrocodona) o analgesicos (por ejemplo, acetaminofeno, aspirina).
[00216] La desensibilizacion al alergeno es una forma de tratamiento en la que se inyectan alergenos en el paciente a objeto de reducir o eliminar la respuesta alergica. Se conoce tambien como inmunoterapia alergena, hiposensibilizacion o terapia de inyeccion para la alergia. Se usa a menudo con otros tratamientos de la alergia, pero no a menudo como tratamiento principal. Se ha empleado satisfactoriamente cuando es imposible evitar el alergeno. Un tratamiento de desensibilizacion a alergeno tlpico incorpora la inyeccion subcutanea de alergeno esteril en dosis crecientes una o dos veces a la semana hasta que se consiga una dosis que produzca una pequena zona local transitoria de inflamacion en el sitio de la inyeccion. A continuation se proporciona la dosis en un programa de mantenimiento una vez cada 2-4 semanas. Se usa mas a menudo la desensibilizacion de la alergia en el tratamiento del asma alergica y la rinitis alergica, aunque ha tenido exito en el tratamiento de la anafilaxis. Se ha usado eficazmente la desensibilizacion mediante el uso de adyuvantes, tales como el adyuvante incompleto de Freund, que es una emulsion de un antlgeno acuoso en aceite mineral. El efecto fisiologico crea un deposito de llquido insoluble
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en el que se liberan gradualmente gotlcuias de alergeno. Otra forma de desensibilizacion a alergeno es polimerizar alergenos monomericos con glutaraldehldo para crear una molecula con alergenicidad relativamente baja (es decir, produce la respuesta alergica), reteniendo a la vez un eficaz grado de inmunogenicidad.
G. Dosificaciones farmaceuticas:
[00217] Las dosificaciones y la concentracion de farmaco deseada de las composiciones del presente documento pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determination de la dosificacion o de las rutas de administration apropiadas esta bien comprendida dentro del conocimiento de la persona normalmente experta en la tecnica. Los experimentos con animales proporcionan directrices fiables para la determinacion de las dosis eficaces para la terapia humana. Se puede llevar a cabo el escalado interespecies de las dosis eficaces siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi y col., Eds, Pergamon Press, Nueva York 1989, pag.42-46.
[00218] Cuando se usa la administracion in vivo de los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento, las cantidades de dosificacion normales pueden variar entre aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de mamlfero o mas por dla, preferiblemente, aproximadamente 1 mg/kg/dla a 10 mg(kg/dla, dependiendo de la ruta de administracion. Se proporcionan en la bibliografla las directrices como dosificaciones o procedimientos de administracion particulares; veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. esta dentro del alcance de la invention que diferentes formulaciones sean efectivas para diferentes tratamientos y diferentes trastornos, y la administracion pretendida para tratar un organo o tejido especlfico puede necesitar la administracion de una manera diferente de la de otro organo o tejido. Ademas, se pueden administrar las dosificaciones mediante una o mas administraciones separadas, o mediante infusion continua. Para administraciones repetidas durante algunos dlas o mas, dependiendo de la dolencia, se mantiene el tratamiento hasta que se produzca una supresion deseada de los slntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser utiles otros reglmenes de dosificacion. Se puede vigilar facilmente el progreso de esta terapia mediante las tecnicas y ensayos convencionales.
H. Administracion de la formulation
[00219] Las formulaciones de la presente invencion, incluyendo, pero sin limitarse a las formulaciones reconstituidas, se administran a un mamlfero en necesidad de tratamiento con la protelna, preferiblemente un ser humano, segun los procedimientos conocidos, tales como la administracion intravenosa como un bolo o mediante infusion continua durante un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica, o mediante inhalation.
[00220] En las realizaciones preferidas, se administran las formulaciones al mamlfero mediante administracion subcutanea (es decir, debajo de la piel). A dicho objeto, se puede inyectar la formulacion usando una jeringuilla. Sin embargo, estan disponibles otros dispositivos para la administracion de la formulacion tales como dispositivos de inyeccion (por ejemplo, los dispositivos Inject-easeTM y GenjectTM; plumas inyectoras (tales como GenPen™); dispositivos autoinyectores, dispositivos sin aguja (por ejemplo, MediJector™ y BioJectorTM); y sistemas de administracion mediante parches subcutaneos.
[00221] En una realization especlfica, se describen kits para una unidad de administracion de dosis unica. Dichos kits comprenden un envase de una formulacion acuosa de protelna o anticuerpo terapeutico que incluye jeringuillas precargadas individuales o multicamara. Estan disponibles jeringuillas precargadas a modo de ejemplo de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.
[00222] La dosificacion apropiada (“cantidad terapeuticamente eficaz”) de la protelna dependera, por ejemplo, de la dolencia que se va tratar, la gravedad y el curso de la dolencia, de si se administra la protelna con objetivos preventivos o terapeuticos, de la terapia previa, el historial cllnico del paciente y la respuesta a la protelna, el tipo de protelna usada, y de la discretion del especialista medico que atiende la enfermedad. La protelna se administra adecuadamente al paciente de una vez o en una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento del diagnostico progresivo. Se puede administrar la protelna como un unico tratamiento o en conjuncion con otros farmacos o terapias utiles en el tratamiento de la dolencia en cuestion.
[00223] Cuando la protelna de election es un anticuerpo, entre aproximadamente 0,1-20 mg/kg es una dosificacion candidata inicial para la administracion al paciente, ya sea como, por ejemplo, en una o mas administraciones separadas. Sin embargo, pueden ser utiles otros reglmenes de dosificacion: El progreso de esta terapia se vigila facilmente mediante las tecnicas convencionales.
[00224] Los usos para la formulacion dirigida contra IgE (por ejemplo, rhuMAbE-25, rhMAbE-26, Hu-901) incluyen, por ejemplo, el tratamiento o la profilaxis de las enfermedades alergicas mediadas por IgE, infecciones parasitarias, cistitis intersticial y asma. Dependiendo de la enfermedad o trastornos que se va tratar, se administra al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz (por ejemplo, entre aproximadamente 1-15 mg/kg) del anticuerpo dirigido contra IgE.
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I. Articulos de fabricacion
[00225] En otra realizacion de la invencion, se proporciona un artlculo de fabricacion que contiene la formulacion y se proporcionan preferiblemente instrucciones para su uso. El artlculo de fabricacion comprende un envase, Los envases adecuados contienen, por ejemplo, botellas, viales (por ejemplo, viales de doble camara), jeringuillas (tales como jeringuillas individuales o de doble camara) y tubos de ensayo. El contendor puede estar formado por una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. El envase mantiene la formulacion y la marca en, o asociada con, el envase puede indicar directrices para la reconstitucion y/o el uso. La marca puede indicar adicionalmente que la formulacion es util o pretendida para la administracion subcutanea. El envase que mantiene la formulacion puede ser un vial multiusos, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, entre 2-6 administraciones) de la formulacion reconstituida. El artlculo de fabricacion puede comprender ademas un segundo envase que comprende un diluyente adecuados (por ejemplo, BWFI). Tras mezclar el diluyente y la formulacion liofilizada, la concentration final de protelna en la formulacion reconstituida sera generalmente al menos de 50 mg/ml. El artlculo de fabricacion puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, e inserciones empaquetadas con instrucciones para el uso.
[00226] Se entendera mas completamente la invencion con referencia a los siguientes ejemplos. No deberlan, sin embargo, construirse como limitantes del alcance de la invencion.
[00227] En otra realizacion, la invencion proporciona un artlculo de fabricacion que comprende las formulaciones descritas en el presente documento para la administracion en un dispositivo autoinyector. Se puede describir un autoinyector como un dispositivo de inyeccion que tras la activation, administrara sus contenidos sin action necesaria adicional del paciente o el administrador, Son particularmente adecuados para la automedicacion de las formulaciones terapeuticas cuando la velocidad de administracion debe ser constante y el tiempo de administracion es mayor que unos pocos momentos.
EJEMPLO 1
Preparation de una formulacion rhuMAbE25 ("E25") dirigida contra IgE
[00228] Se prepararon formulaciones del anticuerpo rhuMAbE25 dirigido contra IgE a partir del lote K9094A residual a granel de E25 (50 mg/ml de rhuMAb E25, trehalosa 85 mM, histidina 5 mM, pH 6, Tween 20 al 0,01 %) o rhuMAbE25 Q-Pool (5 mg/ml de rhuMAb E25, Tris 25 mM, NaCl 200 mM.
[00229] Se prepararon disoluciones acuosas de rhuMAbE25 mediante dialisis en diferentes tampones (His-HCl 20 mM y Arg-HCl 200 mM, pH 6,0) a 2-8° C usando un Casete de Dialisis Slide-A-Lyzer (Pierce). A continuation se transfirieron las muestras en el deposito de muestras de unos microconcentradores centrlfugos Centricon-30 (Amicon). Se concentraron las protelnas mediante centrifugation del concentrador Centricon-3 a 4000-5000 g hasta que se alcanzo la concentracion deseada de protelna.
[00230] A continuacion se concentraron las muestras a ~150 mg/ml de rhuMAb E25 usando la ultrafiltracion. Se anadio Tween 20 a cada preparacion hasta una concentracion final de 0,02 %. Se filtraron todas las formulaciones, se rellenaron asepticamente en viales FormaVitrum de 3 cc y se taponaron los viales con tapones Diakyo de 13 mm en una sala de Tipo 100.
EJEMPLO 2
Procedimientos y materiales:
[00231]
Estudios de estabilidad: Se rellenaron todas las formulaciones a 1 ml en viales FormaVitrum de 3 cc y se taponaron con tapones Diakyo de 13 mm en una sala de rellenado esteril de Tipo 100. Se colocaron los viales a -70, 2-8, 15, 30 y 40° C en recipientes impermeables a la luz.
Estudio de agitacion: se colocaron allcuotas de cada formulacion en viales de vidrio. Se agitaron los viales horizontalmente en un Agitador de Sobremesa Glas-Col a temperatura ambiente. Se ajusto el agitador a 70 con una longitud del brazo de 30 cm (maximo). Tras la agitacion se inspeccionaron las muestras y se analizaron segun el siguiente protocolo.
Estudio de Congelacion-Descongelacion: las muestras de E25 experimentaron tres ciclos de congelacion- descongelacion. Cada ciclo consistio en una congelation a -70° C durante la noche y posteriormente a una descongelacion a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Despues de cada ciclo, se inspeccionaron las muestras visualmente usando una caja de luz para evaluar el color y la claridad del llquido. Se midieron la turbidez y los agregados solubles siguiendo el protocolo descrito a continuacion.
Procedimientos analfticos: se analizo la estabilidad de las muestras mediante los procedimientos resenados en la Tabla 1
Tabla 1: Procedimientos analfticos
Ensayo
Color, Trasparencia, Apariencia8
Cromatografla de Exclusion por tamano (SEC)b
Cromatografla de Interaccion Hidrofoba (HIC)C
Barrido de Espectro UV (Gravimetrico)f
Turbidez (DO promedio 340-360 nm)
Actividade
Objetivo
Inspeccion visual de formulaciones liquidas
Mide el % de monomero, los agregados solubles y lo componentes de bajo peso molecular_________
Mide el nivel de isomerizacion de Asp-32 y de tiol libre
Mide la concentracion de proteina
Mide los agregados solubles e insolubles
Determina la actividad de union de anti-IgE
a Paso por Color, Apariencia y Transparencia: Se evaluaron visualmente el color, la apariencia y la trasparencia de la muestra frente al fondo blanco y negro de la inspeccion y se compararon con un volumen igual de control negativo. Se deben hacer girar las muestras cuidadosamente para asegurar una mezcla homogenea, pero no demasiado vigorosamente para que no aparezcan burbujas. b Cromatografla de Exclusion por Tamano: Se uso una columna TSK SUPER SW3000 (4,6 x 300 mm) en un sistema de cromatografla HP100. La columna se cargo con 20 mg de proteina y se eluyo en fosfato de potasio 0,1 M, pH 6,8. Se midio la muestra a 280 nm mediante un detector UV. c Cromatografla de Interaccion Hidrofoba (HIC): Se llevaron a cabo experimentos HIC usando una columna TSK Phenyl-5PW (7,5 x 75 mm) (TosoHaas) en un sistema de cromatografla liquida HP 1100. Se introdujo la columna con 28 pg de fragmentos Fab digeridos con papaina y se eluyo a un gradiente de concentracion de sulfato de amonio en tampon Tris 20 mM de 2 M a 0 M. Se vigilaron los picos a 210 nm mediante un detector UV.
d Turbidez: Se determino la turbidez de las muestras en una cubeta de 1 cm de camino optico usando un espectrometro HP. Se calculo la turbidez como la absorbancia promedio entre 340-360 nm. e Se determino la actividad del anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE mediante un ensayo de inhibicion de union al receptor. Se diluyeron las muestras hasta que estuvieron comprendidas dentro del intervalo de la curva estandar entre 100 y 1,56 pg/ml en un diluyente de ensayo que contenia tampon fosfato, BSA al 0,5 %, polisorbato 20 al 0,05 %, timerosol al 0,01 %. Se recubrio una placa de microvaloracion con receptor de IgE, a continuacion se incubo con IgE-biotina y una muestra anti-IgE diluida. Se midio la cantidad de IgE-biotina unida al receptor que se correlaciono con la actividad del anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE usando Estreptavidina-HRP. Se analizaron los datos usando un programa logistico de ajuste de curvas de 4 parametros
f Se obtuvo la concentracion del anticuerpo en un espectrofotometro de matriz de diodos Hewlett Packard 8453 con una cubeta de cuarzo de 1 cm. Se calculo la concentracion usando una absortividad de 1,5 cm-1 (mg/ml)-1.__________________________________________________________________
5 _____________________________ Resumen de Formulaciones Liquidas
Formulaciones
Intervalos de proteina Tampon/ intervalos Excipientes/ intervalos
80mg/ml de E25 50 mM Histidi na-HCl 150 mM Trehalosa al 0,05 % Polisorbato 20 pH 6,0
40-150 mg/ml His-HCl o His- Acetato Intervalos: 10 mM-100 mM Azucar trehalosa o sacarosa Intervalos: 20 mM-350 mM Polisorbato: 0,01 %-0,1 %
150 mg/ml de E25 20 mM Histidi na-HCl 200 nM ArgHCl al 0,02 % Polisorbato 20 pH 6,0
40-260 mg/ml His-HCl o His- Acetato Intervalos: 10 mM-100mM° ArgHCl Intervalos: 50 mM- 200 mM Polisorbato: 0,01 %-0,1 %
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Datos de estabilidad para 150 mg/ml de E25 en formulacion de Histidina y ArgHCl
Temp (°C)
Tiempo (meses) Visual pH SEC a % de monomero HIC b % de principal Potencia c Turbidez d
5
0 Pasa 6,2 99,0 64 106 0,25
1 Pasa 6,0 99,2 63 100 0,27
3 Pasa 6,0 99,3 63 111 0,25
16 Pasa 6,0 98,9 62 83 0,27
30
1 Pasa 5,9 98,43 54 91 0,25
3 Pasa 6,1 97,53 42 65 0,30
16 Pasa 6,0 90,63 19 28 0,54
Datos de estabilidad para ^ 80 mg/ml de E25 en formulacion de Histidina y Trehalosa
Temp (°C)
Tiempo (meses) Visual pH SEC a % de monomero HIC b % de principal Potencia c Turbidez d
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0 Pasa 5,7 99,1 64 100 0,20
1 Pasa 5,8 98,7 63 92 0,20
3 Pasa 5,7 98,8 63 124 0,20
6 Pasa 5,7 99,1 63 97 0,21
14 Pasa 5,7 99,0 62 83 0,21
24 Pasa 5,7 98,8 62 84 0,20
30
1 Pasa 5,8 98,7 55 77 0,20
3 Pasa 5,7 97,4 41 76 0,29
6 Pasa 5,8 95,5 31 48 0,38
14 Pasa 5,7 93,1 22 30 0,48
a. Cromatografia de exclusion por tamano para medir los agregados y fragmento solubles
b. Cromatografia de interaccion hidrofoba de E25 digerido con papaina
c. Ensayo de inhibicion de la union del receptor de IgE
d. DO promedio (340-360 nm)__________'____________________________________
Estudio de agitacion:
PARA Agitacion despues de 3 dias
Formulacion
Visual SEC (% de monomero) Turbidez Visual SEC (% de monomero) Turbidez
1
Pasa 99,5 0,18 Pasa 99,3 0,18
2
Pasa 99,0 0,19 99,4 0,19
Estudio de congelacion-descongelacion:
Para Despues del 1er Ciclo Despues del 3er Ciclo
Formulacion
Visual SEC % de Turbidez Monomero Visual SEC % de Turbidez Monomero Visual SEC % de Turbidez Monomero
1 2
Pasa 99,5 0,18 Pasa 99,0 0,19 Pasa 99,3 0,17 Pasa 99,2 0,19 Pasa 99,4 0,17 Pasa 99,2 0,18
Formulacion 1: 156 mg/ml de E25, ArgCl 200 mM, His 23 mM, T20 al 0,02 % Formulacion 2: 150 mg/ml de E25, ArgCl 182 mM, His 20 mM, T20 al 0,02 %
EJEMPLO 3
[00232] Se prepararon muestras de formulaciones liquidas de anticuerpo monoclonal dirigido contra IgE (E26) en tampones 20 mM y se almacenaron a continuacion a 30° C y 40° C. Se determino la estabilidad de E26 mediante cromatografia y medidas de actividad, Se uso la cromatografia de exclusion por tamano para determinar los agregados solubles, y se uso la cromatografia de interaccion hidrofoba de la muestra digerida con pepsina para medir la isomerizacion. Se vigilo la actividad de la muestra usando un ensayo de union al receptor de IgE. Segun se muestra en la figura 1, 2 y 3 la degradation de E26 es muy dependiente del pH de los tampones. El E26 parece ser el mas estable alrededor de pH 6,0.
EJEMPLO 4
[00233] La formation de particulas es un desafio principal para preparar la formulacion liquida a elevada concentration debido a que esta aumenta normalmente con el incremento de la concentration de proteina en condiciones de estres. La Figura 4 muestra el resultado del estudio de agitacion de una formulacion liquida concentrada de E26. Se preparo la formulacion en succinato 20 mM, trehalosa 192 mM a pH 6,0 con diferente concentracion de polisorbato 20. Se vigilo la formacion de particulas mediante medida de la turbidez. El resultado muestra que la turbidez de la disolucion de E26 aumenta con el tiempo de agitacion. La adicion de al menos 0,01 %
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de polisorbato es esencial para reducir la formacion de partlcuias en condiciones de estres. Se observaron tambien resultados similares para la formulacion llquida concentrada de E25.
EJEMPLO 5
[00234] La Figura 5 muestra la formulacion llquida de 150 mg/ml de E25 preparada mediante reconstitucion de E25 liofilizado. El incremento de la concentracion salina inhibe la formacion reversible de partlculas y da como resultado la reduccion de la lectura de la turbidez. Entre todas las sales ensayadas, la formulacion con Arg-HCl parece tener la menor turbidez. Se ha observado tambien el efecto de la concentracion salina sobre la disminucion de la lectura de la turbidez para E25 preparado usando un procedimiento TFF.
EJEMPLO 6
[00235] La formulacion llquida de E25 en presencia de ArgHCl tambien parece tener mejor estabilidad que las otras formulaciones llquidas. La Figura 6 y 7 muestra el estudio de estabilidad de E25 a 150 mg/ml en las formulaciones llquidas que contienen ArgHCl, CaCl2 y MgCh. Para la formulacion llquida que contiene ArgHCl con o sin sacarosa, existe una pequena diferencia en su estabilidad en terminos de turbidez, isomerizacion y fragmentacion. Las formulaciones llquidas que contienen ArgHCl son mas estables que la formulacion que contiene MgCl2 y CaCl2.
EJEMPLO 7
[00236] La Figura 8 muestra los resultados de un estudio de estabilidad de la formulacion llquida de E25 con formulaciones de acetato e histidina. La formulacion con histidina tiene mayor pH que la formulacion con acetato. Los resultados mostraron claramente que E25 en una formulacion llquida de histidina, ArgHCl son mas estables que en otras condiciones.
EJEMPLO 8
[00237] La elevada concentracion de E25 puede formar un gel solido en presencia de algunos iones, tales como citrato, succinato y sulfato (Tabla I), particularmente a la temperatura de almacenamiento de 2-8° C. Usar arginina- HCl como excipiente permite formular E25 hasta mas de 200 mg/ml si formacion de gel o precipitado.
Tabla 1: Efecto de diversos excipientes sobre la gelacion de E25 a 125 mg/ml, pH ~6,0
Excipiente
Concentracion de excipiente MM Preparacion Turbidez a T0 (340-360 nm) Concentracion de anticuerpo mg/mi Apariencia visual
SWFI
Lio Recons 0,21 125 Transp.
NaCl
188 Lio Recons 0,25 125 Transp.
Succinato
94 Lio Recons 0,31 125 Gel
Succinato
19 Lio Recons 0,28 125 Gel
Citrato
188 Lio Recons Pendiente 125 Gel
Citrato
19 Lio Recons Pendiente 125 Gel
Na2SO4
Pendiente Lio Recons Pendiente 125 Gel
Na2SO4
Pendiente Lio Recons Pendiente 125 Opalesc.
Fosfato
Pendiente Lio Recons Pendiente 125 Opalesc.
Acetato
188 Lio Recons Pendiente 125 Transp.
Acetato
94 Lio Recons Pendiente 125 Transp.
Acetato
19 Lio Recons Pendiente 125 Transp.
Histidina
94 Lio Recons 0,19 125 Transp.
Histidina
47 Lio Recons 0,24 125 Transp.
Arg-HCl
150 Lio Recons 0,25 137 Transp.
Arg-HCl
200 TFF 0,19 162 Transp.
Arg-SO4
150 Lio Recons 0,27 137 Gel
CaCl2
125 TFF 0,32 147 Transp.
MgCl2
125 TFF 0,48 147 Opalesc.
EJEMPLO 9
Expresion de la proteina o del anticuerpo en E. coli
[00238] Este ejemplo ilustra la preparacion de una forma no glicosilada de una proteina o anticuerpo deseados mediante la expresion recombinante en E. coli.
[00239] Se amplifica inicialmente la secuencia de ADN que codifica la proteina o el anticuerpo deseado usando cebadores de la PCR seleccionados. Los cebadores deberian contener los sitios para el enzima de restriccion que corresponden a los sitios para el enzima de restriccion en el vector de expresion seleccionado. Se puede emplear
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una variedad de vectores de expresion. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; vease Bolivar y col., Gene, 2: 95 (1977)) que contiene los genes de la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. Se digiere el vector con el enzima de restriccion y se desfosforila: A continuacion se ligan las secuencias amplificadas mediante la PCR en el vector. El vector incluira preferiblemente las secuencias que codifican el gen de resistencia a un antibiotico, un promotor trp, una llder polihis (que incluye los seis primeros codones STII, la secuencia polihis, y el sitio de escision de la enteroquinasa), la region de codificacion de la protelna o el anticuerpo deseado, el finalizador transcripcional lambda, y un gen argU. Adicionalmente, el vector puede incluir al menos porciones no insignificantes de las secciones 5' y 3' no traducidas de la secuencia natural del acido nucleico que codifica la protelna o el anticuerpo deseado.
[00240] A continuacion se usa la mezcla de ligadura para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los procedimientos descritos en Sambrook y col., mas arriba. Se identifican los transformantes por su capacidad para crecer en placas LB y a continuacion se seleccionan las colonias resistentes. Se puede aislar el ADN plasmido y confirmarse mediante el analisis de restriccion y la secuenciacion del ADN.
[00241] Se pueden hacer crecer los clones seleccionados durante la noche en medio de cultivo llquido tal como caldo LB suplementado con antibioticos. Se puede usar posteriormente el cultivo desarrollado durante la noche para inocular un cultivo a mayor escala. A continuacion se hacen crecer las celulas a una densidad optica deseada, durante la cual se activa el promotor de la expresion.
[00242] Tras cultivar las celulas durante algunas horas mas, se pueden cosechar las celulas mediante centrifugacion. Se puede solubilizar el aglomerado celular obtenido mediante la centrifugacion usando diversos agentes conocidos en la tecnica, y a continuacion puede purificarse la protelna o el anticuerpo solubilizado deseado usando una columna quelante de metales en condiciones que permitan una estrecha union de la protelna o anticuerpo solubilizado.
[00243] Se puede expresar la protelna o el anticuerpo deseado en E, coli en una forma etiquetada con poli-His, usando el siguiente procedimiento. Se amplifica inicialmente el ADN que codifica la protelna o el anticuerpo deseado usando cebadores de la PCR seleccionados. Los cebadores contendran los sitios para el enzima de restriccion que corresponden a los sitios para el enzima de restriccion en el vector de expresion seleccionado, y otras secuencias utiles que proporcionan un inicio de la traduccion eficaz y fiable, purificacion rapida en una columna de quelacion de metales, y eliminacion proteolltica con enteroquinasa. A continuacion se ligan las secuencias etiquetadas con polihis, amplificadas mediante la PCR en un vector de expresion, que se usa para transformar un hospedador de E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Se hacen crecer en primer lugar los transformantes en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30° C con agitacion hasta que se alcanza una D.O. 600 de 3.5. A continuacion se diluyen los cultivos 50-100 veces en medios CRAP (preparados mezclando 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de sodio^2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, as! como MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55 % (p/v) glucosa y MgSo4 7 mM) y se hacen crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30° C con agitacion. Se retiran las muestras para verificar la expresion mediante analisis SDS-PAGE, y se centrifuga el volumen del cultivo para aglomerar las celulas. Las celulas aglomeradas se congelan hasta purificacion y replegado.
[00244] Se volvio a suspender pasta de E. coli de fermentaciones de entre 0,5 a 1 l (aglomerados de 6-10 g) en 10 volumenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, tampon a pH 8. Se anadieron bisulfito de sodio solido y tetrationato de sodio para preparar concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y se agito la disolucion durante la noche a 4° C. Esta etapa dio como resultado una protelna desnaturalizada con todos los restos de cistelna bloqueados mediante sulfitolizacion. Se centrifugo la disolucion a 40.000 rpm en una Ultracentrlfuga Beckman durante 30 min. Se diluyo el sobrenadante con 3-5 volumenes de tampon de columna quelante de metales (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) a se filtro a traves de filtros de 0,22 micrometros para clarificar. Se introdujo el extracto clarificado en una columna quelante de metales Ni-NTA de Quiagen de 5 ml equilibrada en el tampon de columna quelante de metales. Se lavo la columna con mas tampon que contenla imidazol 50 mM (Calbiochem, calidad Utrol), pH 7,4. Se eluyo la protelna con tampon que contenla imidazol 250 mM. Se combinaron las fracciones que contenlan la protelna deseada y se almacenaron a 4° C. Se estimo la concentracion de la protelna por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extincion calculado basandose en su secuencia de aminoacidos.
[00245] Se replegaron las protelnas diluyendo la muestra lentamente en tampon de replegado preparado recientemente constituido por: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cistelna 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Se escogieron los volumenes de replegado de tal manera que la concentracion final de protelna esta entre 50 y 100 microgramos/ml. Se agito la disolucion de replegado suavemente a 4° C durante 12-36 horas. Se detuvo rapidamente la reaccion de replegado mediante la adicion de TFA hasta una concentracion final de 0,4 % (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificacion adicional de la protelna, se filtro la disolucion a traves de un filtro de 0,22 micrometros y se anadio acetonitrilo hasta una concentracion final de 2-10 %. Se cromatografio la protelna replegada en una columna en fase inversa Poros R1/H usando un tampon movil de TFA al 0,1 % con elucion con un gradiente de acetonitrilo entre 10 y 80 %. Se analizaron allcuotas de las fracciones con absorbancia A280 en geles de SDS poliacrilamida y se combinaron las fracciones que contenlan protelna replegada homogenea. Generalmente, las especies replegadas apropiadamente de la mayor parte de las protelnas se eluyeron a las concentraciones mas
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bajas de acetonitrilo ya que aquellas especies son las mas compactas con sus interiores hidrofobos protegidos de la interaccion con la resina en fase inversa. Las especies agregadas se eluyeron usualmente a concentraciones mayores de acetonitrilo. Adicionalmente a la resolucion de las formas incorrectamente plegadas de las protelnas de la forma desead, la etapa en fase inversa elimina tambien la endotoxina de las muestras.
[00246] Se combinaron las fracciones que contenlan la protelna o el anticuerpo plegado deseado y se elimino el acetonitrilo usando una corriente suave de nitrogeno dirigida a la disolucion. Se formularon las protelnas en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro de sodio 0,14 M y manitol al 4 % mediante dialisis o mediante filtracion en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampon de la formulacion y se filtraron esteriles.
EJEMPLO 10
Expresion de la protelna o del anticuerpo en celulas de mamiferos
[00247] Este ejemplo ilustra la preparacion de formas potencialmente glicosiladas de la protelna o el anticuerpo deseado mediante expresion recombinante en celulas de mamiferos.
[00248] Se empleo el vector, pRK5 (vease documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo de 1989) como vector de expresion. Opcionalmente, se ligo el ADN que codificaba la proteina o el anticuerpo deseado en pRK5 con enzimas de restriccion seleccionados para permitir la insercion de dicho ADN usando procedimientos de ligadura tales como los descritos en Sambrook y col., mas arriba.
[00249] En una realization, las celulas hospedadoras seleccionadas pueden ser celulas 293. Se hicieron crecer celulas 293 (ATCC CCL 1573) hasta confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibioticos. Se mezclaron aproximadamente 10 pg si el ADN codificaba la proteina o el anticuerpo deseado ligado en pRK5 con aproximadamente 1 pg de ADN que codificaba el ARN del gen VA [Thimmappaya y col., Cell, 31: 543 (1982)] y se disolvieron en 500 pl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 M. Se anadieron a esta mezcla, gota a gota, 500 pl de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO4 1,5 mM, y se dejo formar un precipitado durante 10 minutos a 25° C. Se suspendio el precipitado y se anadio a las celulas 293 y se permitio sedimentar durante aproximadamente cuatro horas a 37° C. se elimino mediante aspiration el medio de cultivo y se anadieron 2 ml de glicerol al 20 % en PBS durante 30 segundos. A continuation se lavaron las celulas 293 con medio exento de suero, se anadio medio reciente y se incubaron las celulas durante aproximadamente 5 dias.
[00250] Aproximadamente 24 horas despues de las transfecciones, se retiro el medio de cultivo y se sustituyo con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo conteniendo 200 pCi/ml de 35S-cisteina y 200 pCi/ml de 35S-metionina. Tras una incubation de 12 horas, se recogio el medio acondicionado, se concentro en un filtro roscado, y se introdujo en un gel SDS al 15 %. Se puede secar el gel procesado y exponerse a una pelicula durante un periodo de tiempo seleccionado para desvelar la presencia de la proteina o el anticuerpo deseado. Los cultivos que contienen celulas transfectadas pueden experimentar una incubacion adicional (en medio exento de suero) y se ensayo el medio en bioensayos seleccionados.
[00251] En una tecnica alternativa, se puede introducir de manera transitoria la proteina o el anticuerpo deseado en celulas 293 usando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Se hicieron crecer celulas 293 hasta densidad maxima en un matraz de agitation giratoria y se anadieron 700 pg de ADN que codificaba la protelna o el anticuerpo deseado ligado en pRK5. Se concentraron las celulas en primer lugar procedentes del matraz de agitacion giratoria mediante centrifugation y se lavaron con PBS. Se incubo el precipitado de ADN-dextrano en el aglomerado celular durante cuatro horas. Se trataron las celulas con glicerol al 20 % durante 90 segundos, se lavaron con medio de cultivo de tejido, y de reintrodujeron en el matraz de agitacion giratoria que contenla el medio de cultivo de tejido, 5 pg/ml de insulina bovina y 0,1 pg/ml de transferrina bovina. Tras aproximadamente cuatro dias, se centrifugo el medio acondicionado y se filtro para eliminar las celulas y los desechos. A continuacion se puede concentrar la muestra que contiene la protelna o el anticuerpo expresado y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como dialisis y/o cromatografia en columna.
[00252] En otra realizacion, se puede expresar la proteina o el anticuerpo deseado en celulas CHO. Se puede transfectar el ADN que codifica la proteina o el anticuerpo deseado ligado en pRK5 en celulas CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO4 o DEAE-dextrano. Segun se ha descrito anteriormente, se pueden incubar los cultivos celulares, y sustituirse el medio con medio de cultivo (solo) o medio que contenga una radiomarca tal como 35S-metionina. Tras determinar la presencia de la protelna o el anticuerpo deseado, se puede sustituir el medio de cultivo con medio exento de suero. Preferiblemente, se incuban los cultivos durante aproximadamente 6 dias, y se cosecha el medio acondicionado. A continuacion se puede concentrar el medio que contiene la protelna o el anticuerpo expresado y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
[00253] Se pueden expresar tambien en celulas CHO hospedadoras las variantes etiquetadas con epitopos de la proteina o el anticuerpo deseado. Se puede subclonar el ADN que codifica la proteina o el anticuerpo deseado ligado en pRK5 en el vector pRK55. El subclon inserto puede experimentar la pCr para fusionarse en marco con
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una etiqueta de epltopo seleccionada tal como una etiqueta poli-his en un vector de expresion de Baculovirus. A continuacion se puede subclonar el ADN etiquetado con poli-his que codifica la protelna o el anticuerpo deseado inserto en un vector de impulsion de SV40 que contiene un marcador de seleccion tal como DHFR para la seleccion de clones estables. Finalmente, se pueden transfectar las celulas CHO (segun se ha descrito anteriormente) con el vector de impulsion de SV40. Se puede llevar a cabo el marcado, segun se ha descrito anteriormente, para verificar la expresion. A continuacion se puede concentrar el medio de cultivo que contiene la protelna o el anticuerpo deseado expresado etiquetado con poli-His y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografla de afinidad quelada con Ni2+.
[00254] Se puede expresar tambien la protelna o el anticuerpo deseado en celulas CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresion transitoria o en celulas CHO mediante otro procedimiento de expresion estable.
[00255] Se llevo a cabo la expresion estable en celulas CHO usando el siguiente procedimiento. Se expresaron las protelnas como una construction de IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias de codification de las formas solubles (por ejemplo, las regiones extracelulares) de las protelnas respectivas se fusionaron a una secuencia de la region constante de IgG1 que contenla la bisagra, las regiones CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con poli-His.
[00256] Tras la amplification mediante la PCR, se subclonaron lo ADN respectivos en un vector de expresion de CHO usando las tecnicas normalizadas segun se describe en Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Se construyeron los vectores de expresion de CHO para tener sitios 5' y 3' de restriction compatibles con el ADN de interes para permitir el trasporte conveniente de los ADNc. La expresion del vector usado en celulas CHO se segun se describe en Lucas y col., Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor/potenciador temprano del SV40 para impulsar la expresion del ADNc de interes y de la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresion de DHFR permite la seleccion para el mantenimiento estable del plasmido tras la transfection.
[00257] Se introdujeron doce microgramos del ADN plasmido deseado en aproximadamente 10 millones de celulas CHO usando reactivos de transfeccion Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) comercialmente disponibles. Se hicieron crecer las celulas segun se describe en Lucas y col., mas arriba. Se congelaron aproximadamente 3 x 10-7 celulas en una ampolla para crecimiento y production adicional segun se describe a continuacion.
[00258] Se descongelaron las ampollas que contenlan el ADN plasmido mediante colocation en bano de agua y se mezclaron mediante vortizacion. Se pipetearon los contenidos en un tubo de centrlfuga que contenla 10 ml de medios y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Se aspiro el sobrenadante y se volvieron a suspender las celulas en 10 ml de medios selectivos (0,2 pm de PS20 filtrado con 0,2 pm de suero bovino fetal diafiltrado al 5 %). A continuacion se distribuyeron en allcuotas en un agitador giratorio de 100 ml que contenla 90 ml de medios selectivos. Despues de 1-2 dlas, se transfirieron las celulas en un agitador giratorio de 250 ml relleno con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37° C. Despues de otros 2-3 dlas, se sembraron agitadores giratorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml con 3 x 105 celulas/ml. Se intercambiaron los medios celulares con medios recientes mediante centrifugation y resuspension en un medio de produccion. Aunque se puede emplear cualquier medio de CHO adecuado, se puede usar actualmente un medio de produccion descrito en la Patente de los Estados unidos N° 5.122,469, otorgada el 16 de junio de 1992. Se sembro un agitador giratorio de 3l de produccion a 1,2 x 106 celulas/ml. En el dla 0 se determino el numero de celulas y el pH. En el dla 1, se muestreo el agitador giratorio y se comenzo el burbujeo con aire filtrado. En el dla 2, se muestreo el agitador giratorio, la temperatura se desplazo a 33° C, y se tomaron 30 ml de 500 g/l de glucosa y 0,6 ml de antiespumante al 10 % (por ejemplo, emulsion de polidimetilsiloxano al 35 %, Dow Corning 365 Emulsion de Calidad Medica). Durante la produccion, se ajusto el pH segun fue necesario para mantener este alrededor de 7,2. Despues de 10 dlas, o hasta que la viabilidad disminuyo por debajo del 70 %, se cosecho el cultivo celular mediante centrifugacion y se filtro a traves de un filtro de 0,22 pm. Se almaceno el filtrado a 4° C o se introdujo inmediatamente en columnas para la purification.
[00259] Para las construcciones etiquetadas con poli-His, se purificaron las protelnas usando una columna Ni-NTA (Quiagen). Antes de la purificacion, se anadio imidazol a los medios acondicionados hasta una concentration de 5 mM. Se bombearon los medios condicionado en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada a 4° C, en Hepes 20 mM, pH 7,4, conteniendo el tampon NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a un caudal de 4-5 ml/min. Tras la introduction, se lavo la columna con un tampon de equilibrio adicional y se eluyo la protelna con tampon de equilibrio que contenla imidazol 0,25 M. La protelna muy purificada se desalo posteriormente en un tampon de almacenamiento que contenla Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4 %, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almaceno a -80° C.
[00260] Se purificaron las construcciones de inmunoadhesina (que contenlan Fc) a partir de los medios acondicionados como sigue. Se bombeo el medio acondicionado en una columna de Protelna A de 5 ml (Pharmacia) que se habla equilibrado en tampon de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Tras la introduccion, se lavo la columna extensivamente con tampon de equilibrio antes de la elucion con acido cltrico 100 mM, pH 3,5, Se neutralizo inmediatamente la protelna eluida recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenlan 275 pl de tampon Tris 1 M, pH 9. Se desalo posteriormente la protelna muy purificada en tampon de almacenamiento segun se ha descrito
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anteriormente par las protelnas etiquetadas con poli-His. Se evaluo la homogeneidad con geles de SDS poliacrilamida y con la secuenciacion de aminoacidos N terminales mediante la degradacion de Edman.
EJEMPLO 11
Expresion de protelnas o anticuerpos en levaduras
[00261] El siguiente procedimiento describe la expresion recombinante de la protelna o el anticuerpo deseado en levaduras.
[00262] En primer lugar, se construyeron vectores de expresion para la produccion o secrecion intracelular de la protelna o el anticuerpo deseado a partir del promotor ADH2/GAPDH. Se inserto el ADN que codificaba la protelna o el anticuerpo deseado y el promotor en los sitios adecuados del enzima de restriccion en el plasmido seleccionado con el fin de dirigir la expresion intracelular. Para la secrecion, se puede clonar el ADN que codifica la protelna o el anticuerpo deseado en el plasmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un peptido senal natural u otro peptido senal de mamlfero, o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia senal secretora /llder de la invertasa, y las secuencias enlazantes (si es necesario) para la expresion de la protelna o del anticuerpo deseado.
[00263] A continuacion se pueden transformar las celulas de levaduras, tales como las de la cepa AB 110 de levadura, con los plasmidos de expresion descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentacion seleccionados. Se pueden analizar los sobrenadantes de las levaduras transformadas mediante precipitacion con acido tricloroacetico al 10 % y separacion mediante SDS-PAGE, seguida por tincion de los geles con tincion de Azul de Coomasie.
[00264] Se puede aislar posteriormente la protelna o el anticuerpo recombinante y purificarse eliminando las celulas de levadura procedentes del medio de fermentacion mediante centrifugacion y a continuacion concentrando el medio usando filtros de cartucho seleccionados. Se puede purificar adicionalmente el concentrado que contiene la protelna o el anticuerpo recombinante usando resinas de cromatografla en columna seleccionadas.
EJEMPLO 12
Expresion de la protelna o el anticuerpo en celulas de insecto infectadas con baculovirus
[00265] El siguiente procedimiento describe la expresion recombinante de la protelna o el anticuerpo deseado en celulas de insecto infectadas con Baculovirus.
[00266] Se fusiono en la direccion 5' la secuencia de codificacion de la protelna o el anticuerpo deseado de una etiqueta de epltopo contenida en el interior de un vector de expresion de baculovirus, Dichas etiquetas de epltopo incluyen etiquetas poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (regiones de tipo Fc de IgG). Se puede emplear una variedad de plasmidos, incluyendo los plasmidos derivados de plasmidos comercialmente disponibles tales como PVL1393 (Novagen). De manera breve, se amplifico mediante la PCR la secuencia que codificaba la porcion de la protelna o el anticuerpo deseado , tal como la secuencia que codificaba la region extracelular de una protelna transmembrana o la secuencia que codifica la protelna madura si la protelna es extracelular con los cebadores complementarios con las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios que flanquean el enzima de restriccion (seleccionado). A continuacion se digirio el producto con los enzimas de restriccion seleccionado y se subclono en el vector de expresion.
[00267] Se genero baculovirus recombinante transfectando simultaneamente el plasmido anterior y ADN vlrico de BaculoGold™ (Pharmigen) en celulas de Spodoptera frugiperda (“Sf9”) (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL). Despues de 4-5 dlas de incubacion a 28° C, se cosecharon los virus liberados y se usaron para las amplificaciones adicionales. Se llevaron a cabo la infeccion vlrica y la expresion de la protelna segun se describe por O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
[00268] A continuacion se purifico la protelna o el anticuerpo expresado etiquetado con poli-his, por ejemplo, mediante cromatografla de afinidad quelada con Ni2+. Se prepararon los extractos a partir de celulas Sf9 infectadas con virus recombinante segun se describe por Rupert y col., Nature, 362: 175-179 (1993). Se lavaron celulas Sf9, se volvieron a suspender en tampon de sonicacion (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCh 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10 %; NP-40 al 0,1 %; KCl 0,4 M), y se sonicaron dos veces durante 20 segundos en hielo. Se aclararon los sonicados mediante centrifugacion, y se diluyo el sobrenadante 50 veces en tampon de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10 %, pH 7,8) y se filtraron a traves de un filtro de 0,45 pm. Se preparo una columna de Ni2+-NTA agarosa (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen del lecho de 5 ml, se lavo con 265 ml de agua y se equilibro con 25 ml de tampon de carga. Se introdujo el extracto celular filtrado en la columna a 0,5 ml por minuto. Se lavo la columna hasta un valor inicial A280 con tampon de carga, en el que en ese momento se inicio la recogida de la fraccion puntual. A continuacion, se lavo la columna con tampon secundario de lavado (fosfato 50 mM; NaCl
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300 mM, glicerol al 10 %, pH 6,0, que eluye la protelna no especlficamente unida. Tas alcanzar de nuevo el valor inicial A280, se desarrollo la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampon secundario de lavado. Se recogieron fracciones de un ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y tincion de plata o transferencia Western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Se combinaron las fracciones que contenlan la protelna o el anticuerpo eluido etiquetado con Hisi0 y se dializaron frente al tampon de carga.
[00269] Alternativamente, se puede llevar a cabo la purificacion de la protelna o el anticuerpo etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) usando tecnicas de cromatografla conocidas, que incluyen, por ejemplo, cromatografla en columna de Protelna A o protelna G.
EJEMPLO 13
Preparacion de anticuerpos
[00270] Este ejemplo ilustra la preparacion de anticuerpos monoclonales que se pueden unir especlficamente a la protelna de interes del antlgeno deseado.
[00271] Se conocen en la tecnica las tecnicas para producir anticuerpos monoclonales y se describen, por ejemplo, en Goding, mas arriba. Los inmunogenos que se pueden emplear incluyen la protelna o el anticuerpo diana purificado deseado, las protelnas de condensation que contienen la protelna desead o el antlgeno diana, y las celulas que expresan dicha protelna o antlgeno recombinante en la superficie de la celula. El tecnico experto puede llevar a cabo la selection del inmunogeno sin experimentation innecesaria.
[00272] Se inmunizaron ratones, tal como Balb/c, con la protelna o el antlgeno diana inmunogeno deseado emulsificado en adyuvante completo de Freund y se inyecto subcutanea o intraperitonealmente en una cantidad entre 1-100 microgramos. Alternativamente, se emulsifico el inmunogeno en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecto en las almohadillas de las patas traseras. A continuation se estimularon los ratones inmunizados 10 a 12 dlas despues con mas inmunogeno emulsificado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante algunas semanas, se pueden estimular tambien los ratones con inyecciones de inmunizacion adicionales. Se pueden obtener periodicamente muestras de suero obtenidas de los ratones mediante sangrado retroorbital para ensayar en pruebas ELISA a objeto de detectar los anticuerpos dirigidos a la protelna o antlgeno deseado.
[00273] Despues que se ha detectado el tltulo del anticuerpo, se pueden inyectar los animales “positivos” par los anticuerpos con una inyeccion intravenosa final de la protelna o antlgeno diana deseado. Tres a cuatro dlas despues, se sacrificaron los ratones y se cosecharon la celulas de bazo. A continuacion se fusionaron las celulas de bazo (usando polietilenglicol al 35 %) con una llnea celular seleccionada de mieloma de murino tal como P3X63AgU.1, disponible de la ATCC, N° CRL 1597. Las fusiones generan celulas de hibridoma que se pueden plaquear a continuacion en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina).
[00274] Las celulas de hibridoma se cribaran en un ELISA para la reactividad contra la protelna o el antlgeno diana deseado. Esta comprendida dentro del conocimiento del tecnico experto la determination de las celulas de hibridoma “positivas” que segregan dichos anticuerpos monoclonales.
[00275] Se pueden inyectar intraperitonealmente las celulas de hibridoma positivas enratones Balb/c singenicos para producir ascites que contienen dichos anticuerpos monoclonales. Alternativamente, se pueden hacer crecer celulas de hibridoma en matraces de cultivo de tejido o botellas de cultivo rotatorias. Se puede llevar a cabo la purificacion de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites usando la precipitacion son sulfato de amonio, seguida por la cromatografla de exclusion en gel. Alternativamente, se puede emplear la cromatografla de afinidad basandose en la union del anticuerpo a la protelna A o a la protelna G.
EJEMPLO 14
Purificacion de la protelna deseada usando anticuerpos especificos
[00276] Se puede purificar la protelna deseada tanto en forma natural como recombinante, mediante una variedad de tecnicas normalizadas en la tecnica de la purificacion de protelnas. Por ejemplo, se pueden purificar formas de propolipeptidos, polipeptidos maduros, o prepolipeptidos de la protelna deseada mediante cromatografla de inmunoafinidad usando anticuerpos especificos de la proteina deseada. En general, se construye la columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo que se une especlficamente a la proteina deseada con una resina cromatografica activada.
[00277] Se prepararon inmunoglobulinas policlonales a partir de inmunosueros tanto mediante precipitation con sulfato de amonio como mediante purificacion en Proteina A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Igualmente, se prepararon anticuerpos monoclonales procedentes de fluido de ascites de raton
mediante precipitacion con sulfato de amonio o cromatografla en Protelna A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se unio covalentemente a una resina cromatografica tal como SEPHAROSE™ activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). Se acoplo el anticuerpo a la resina, se bloqueo la resina, y la resina derivada se lavo segun las instrucciones del fabricante.
5
[00278] Se utilizo dicha columna de inmunoafinidad en la purificacion de la protelna desead preparando una fraccion de celulas que expresaban esta en forma soluble. Se derivo esta preparacion mediante solubilizacion de las celulas completas de una fraccion subcelular obtenida a traves de centrifugacion diferencial mediante la adicion de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la tecnica. Alternativamente, se puede segregar protelna
10 soluble conteniendo una secuencia senal en una cantidad util en el medio en el que se hacen crecer las celulas.
[00279] Se paso la preparacion solubilizada que contenla la protelna desead sobre la columna de inmunoafinidad, y se lavo la columna en condiciones que permitlan la absorbancia preferente de la protelna deseada (por ejemplo, tampones con elevada fuerza ionica en presencia de detergente. A continuacion, se eluyo la columna en condiciones
15 que perturbaban la union del anticuerpo con la protelna (por ejemplo, un tampon a pH bajo tal como aproximadamente pH 2-3, o una elevada concentracion de un caotropo tal como urea o un ion tiocianato) y a continuacion se recogio la protelna deseada.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Formulacion llquida estable de turbidez baja que comprende:
    (a) un anticuerpo dirigido contra IgE en una cantidad de aproximadamente 150 mg/ml, (b) arginina-HCl en una cantidad de 200 mM, (c) histidina en una cantidad de 20 mM, (d) polisorbato en una cantidad de 0,01 a 0,1 %, en la que la formulacion tiene ademas un pH de 6,0,
    en la que el anticuerpo dirigido contra IgE se produce mediante un procedimiento que comprende (1) cultivar celulas transformadas o transfectadas con un vector que contiene acido nucleico que codifica un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos identificada como E25 en la figura 10A y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos identificada como E25 en la figura 10B, y (2) purificar el anticuerpo dirigido contra IgE producido por las celulas.
  2. 2. Formulacion, segun la reivindicacion 1, en la que las celulas son:
    (i) celulas eucariotas o celulas procariotas;
    (ii) celulas eucariotas que con celulas de mamlfero o celulas de levadura; o
    (iii) celulas eucariotas que son celulas de ovario de hamster chino (CHO).
  3. 3. Formulacion, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha formulacion se prepara mediante la reconstitucion de anticuerpo liofilizado.
  4. 4. Artlculo de fabricacion que comprende un envase que contiene la formulacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  5. 5. Artlculo de fabricacion, segun la reivindicacion 4, en el que el envase es una jeringuilla, y en el que, opcionalmente, la jeringuilla esta contenida ademas en el interior de un dispositivo de inyeccion, en el que, opcionalmente, el dispositivo de inyeccion es un autoinyector.
  6. 6. Formulacion, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para usar en un procedimiento para el tratamiento de un trastorno mediado por IgE, comprendiendo el procedimiento administrar a un paciente con necesidad del mismo una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha formulacion.
  7. 7. Formulacion para usar, segun la reivindicacion 6, en la que el trastorno mediado por IgE se selecciona del grupo que consiste en:
    (i) rinitis alergica, asma, asma alergica, asma no alergica, dermatitis atopica y gastroenteropatla; o
    (ii) hipersensibilidad, aspergilosis broncopulmonar alergica, enfermedades parasitarias, cistitis intersticial, slndrome de hiper-IgE, ataxia telangiectasia, slndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia tlmica, mieloma de IgE y reaccion de injerto contra hospedador.
  8. 8. Formulacion para usar, segun la reivindicacion 7(ii), en la que el trastorno de hipersensibilidad se selecciona del grupo que consiste en anafilaxis, urticaria y alergia alimentaria.
  9. 9. Formulacion para usar, segun la reivindicacion 8, en la que la alergia alimentaria es el resultado de la exposicion a una legumbre, y en la que, opcionalmente, la legumbre es un cacahuete.
  10. 10. Formulacion para usar, segun la reivindicacion 6, comprendiendo el procedimiento administrar la formulacion en combinacion con un antihistamlnico, un broncodilatador, un glucocorticoide o un AINE.
  11. 11. Formulacion para usar, segun la reivindicacion 6, comprendiendo el procedimiento administrar la formulacion en combinacion con la administracion de un antihistamlnico, un broncodilatador, un glucocorticoide o un AINE, o una desensibilizacion a alergeno.
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