CN102939106B

CN102939106B - 蛋白质制剂

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Publication number: CN102939106B
Application number: CN201180017219.7A
Authority: CN
Inventors: J·杰泽克; B·K·德勒姆
Original assignee: Arecor Ltd
Current assignee: Arecor Ltd
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2031-02-24
Also published as: ES2672902T3; US10925965B2; JP2013520481A; CA2790895C; JP5859987B2; CA2790895A1; US20130149335A1; CN102939106A; EP2538974B1; EP2538974A1; WO2011104557A1; US20210283259A1

Abstract

本发明涉及到下述的发现：通过芳香性羧酸根离子的添加能够抑制由芳香性防腐剂所引发的蛋白质的不稳定性。因此，本发明涉及到组合物，优选的是含水的组合物，包括蛋白质、芳香性防腐剂以及芳香性羧酸根离子。所述的蛋白质仍然是稳定并且适合在环境温度下或者更低的温度下进行储存，即使是以含水的形式。优选的，所述的含水组合物包括蛋白质，酚类防腐剂以及苯甲酸根离子，其中所述的组合物所具有的pH为至少是1个pH单位直至超过苯甲酸所具有的pK_a。本发明同样提供了用以减少蛋白质分解的方法，该分解是通过存在于一种易于发生这样的分解作用的含水蛋白质制剂中的芳香性防腐剂来引发的，所述的方法包括下述的步骤：向所述的制剂中添加芳香性的羧酸根离子，其中将所述的制剂维持在一定的pH下，所述的pH为至少是1个pH单位直至超过所述相应的芳香性羧酸根离子所具有的pK_a。

Description

蛋白质制剂

发明的背景

与传统的有机药物以及无机药物相比而言，蛋白质更大并且更为复杂，除了复杂的三维结构之外，还具有多官能团，因此它们的制剂面临特殊的问题。为了使蛋白质能够保持其生物学活性，制剂必须要使所述的蛋白质氨基酸中的至少一个核心序列的构象完整性保持完全，而同时需要保护所述蛋白质的多官能团避免分解。蛋白质的分解途径可能涉及到化学的不稳定性(即，包含了所述蛋白质的修饰的任何过程，其中所述的修饰是通过键的形成或者切断来实现的，从而生成一种新的化学实体)或者物理的不稳定性(即，在所述蛋白质的高阶结构方面所产生的变化)。化学的不稳定性可能源自下述的作用：脱酰胺作用、外消旋作用、水解作用、氧化作用、β消去作用或者二硫键的交换作用。物理的不稳定性可能源自下述的作用：例如，变性作用、聚合作用、沉淀作用或者吸收作用。在存储的过程中，特别是当以含水溶液的形式存在时，许多蛋白质，例如酶，以重组蛋白质为基础的疫苗或者治疗性蛋白质是不稳定的并且易于发生结构上的分解并且因此造成活性上的损失。所述的分解过程所具有的速率通常情况下与温度呈现一定的比例关系。因此在大体上蛋白质并且特别是蛋白质的含水制剂在较低的温度下一般而言是更加稳定的。

出于对蛋白质的含水制剂的存储考虑，可能同样也需要在所述的制剂中存在防腐剂，用以防止细菌生长，特别是当含有所述制剂的最终产物意在被用来进行多重剂量的治疗性应用时。在含有蛋白质的药物制剂中被用来抑制细菌生长的大部分的防腐剂都不能够与蛋白质制剂具有相容性。科学家将能够适用于所述的蛋白质制剂的防腐剂的列表缩减到只有仅仅一些化合物。硫柳汞(Thimerosal)，一种芳香性的有机汞化合物，自1930年开始已经被用来作为各种不同的生物产品以及药物产品中的防腐剂，特别是用在疫苗中。现如今，所述的硫柳汞的使用已经被限制在几种疫苗之中，并且，由于安全的顾虑，其未来的用途可能是非常局限的。

已经被权威机构批准用于其他的多重剂量的治疗性应用中的防腐剂包括这样的化合物，例如苯甲烷铵盐类以及芳香醇类，例如苯酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲基酸甲酯或者对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚以及间甲酚。在目前市场上售卖的多重剂量的基于蛋白质的生物制品中，通常而言优选的是苯酚、间甲酚以及苯甲醇。

苯甲酸能够抑制霉菌、酵母以及某些细菌的生长，并且已经被用来在各种不同的食品中作为防腐剂。其同样被用来在局部用品中作为一种抗真菌试剂。已经知晓，在pH＞4.5的情况下所述的苯甲酸所具有的抗微生物的功效会发生显著的降低(http://www.nysaes.cornell.edu/necfe/pubs/pdf/Venture/venture2_chemical.html)，这归因于所述的羧酸根基团的解离作用。

在对用于制剂中的防腐剂进行筛选时，对下述的问题进行确认是必要的：何种水平的防腐剂能够有效的抑制在所述的特定制剂中的细菌生长，同时能够保持所述蛋白质的完整性以及所述的防腐剂与存在于所述的蛋白质制剂之中的其他辅料的组合的完整性。所述的防腐剂所具有的功效取决于存在于所述的制剂之中的其他辅料，因此所述的制剂学家必须在一项防腐剂挑战测试中对所述的最终制剂条件进行评估，其中所述的评估是遵照所述的药典抗微生物功效测试(PharmacopoeiaAntimicrobialEffectivenessTest)(USP<51>，Vol.32)来进行的。

当存在防腐剂时，通常情况下蛋白质并不是十分稳定的。在一般情况下，所述的优选的防腐剂中包括一个疏水性的区域，例如一个苯环，其能够与所述的蛋白质上的疏水性区域进行相互作用从而导致对蛋白质结构的破坏。

因此，需要这样的蛋白质制剂，在存在防腐剂的情况下，所述的含水蛋白质制剂在环境温度或者更低的温度下具有提高的蛋白质稳定性，其中所述的防腐剂特别是一种芳香性的防腐剂，例如苯酚或者是间甲酚。

发明概述

本发明涉及到下述的发现：通过芳香性的羧酸根离子的添加，能够抑制由苯酚类防腐剂所引发的蛋白质的不稳定性，其中所述的羧酸根离子例如是苯甲酸根离子。这样的不稳定性可能是其自身所显现出来的，例如，通过分解产物的产生或者作为聚合作用的迹象的高分子量种类的产生。因此，本发明涉及到一种含水组合物，其中包括蛋白质，芳香性防腐剂以及芳香性的羧酸根离子，例如苯甲酸根离子。所述的蛋白质仍然是稳定的并且适合在环境温度下或者更低的温度下进行储存，即使是以含水的形式。优选的，所述的含水组合物包括蛋白质，酚类防腐剂以及苯甲酸根离子，其中所述的组合物所具有的pH为至少是1个pH单位直至超过苯甲酸所具有的pK_a。本发明同样提供了用以减少蛋白质的分解的方法，所述的分解是通过存在于一种易于发生这样的酚类分解作用的含水蛋白质制剂中的酚类来引发的，所述的方法包括下述的步骤：向所述的制剂中添加芳香性的羧酸根离子，其中将所述的制剂维持在一定的pH下，所述的pH为至少是1个pH单位直至超过所述的苯甲酸所具有的pK_a，其中所述的羧酸根离子例如是苯甲酸根离子。

发明的详细描述

因此，本发明中所述的含水的蛋白质制剂包括苯甲酸根离子或者其他的芳香性的羧酸根离子，并且在存在芳香性防腐剂的条件下具有提升的稳定性。

本发明所使用的“防腐剂”是一种化合物，所述的化合物可以被添加到一种含水的蛋白质制剂之中用以在本质上减少微生物(例如，细菌)反应。“防腐剂”同样可以意味着这样的组合物的组合，例如，一对这样的组合物。可能的芳香性防腐剂的例子包括芳香醇(即，同时含有芳香环以及醇官能团的物质，所述的芳香环以及醇官能团不非必要是直接连接的)例如苯酚，苯甲醇，对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲基酸甲酯或者对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚，间甲酚以及氯化甲酚，优选的是苯酚、间甲酚以及苯甲醇。“对羟基苯甲酸酯”是4-羟基苯甲酸的羧酸酯。例如所述的芳香醇中可以含有一个羟基官能团，所述的羟基官能团直接连接在芳香环之上。芳香环包括碳环芳香环例如苯环和萘环，以及杂环芳香环例如五元至十元的异芳香环，其中所述的异芳香环中含有一个或者多个(例如，1个至3个)杂原子，选自氮原子，氧原子以及硫原子，特别是氮原子以及氧原子，特别是氧原子。芳香性的防腐剂中不应当含有羧酸官能团。

芳香醇防腐剂的一种子类别是分类防腐剂，例如苯酚或者是苯酚的衍生物(即，它们包括至少一个与羟基相连接的苯环)。芳香醇防腐剂的另外一种子类别是苯甲基类醇，例如苯甲醇或者是苯甲醇的衍生物。本发明在一定程度上是以下述的发现为基础的：芳香性防腐剂能够引发蛋白质的分解作用，特别是具有暴露在外的疏水性表面的蛋白质的分解作用。本发明进一步的以下述的发现为基础：通过进行芳香性的羧酸根离子的添加，例如苯甲酸根离子，能够减少这种分解作用。当所述制剂的pH在至少大约5.2，优选的至少大约5.5、6、6.5或者7的情况下，由于所述的芳香性羧酸根离子并且特别是苯甲酸根离子的存在，蛋白质的稳定性得到了进一步的增强或者优化。适宜的，所述的pH为大约8.5或者更低，例如8.0或者更低。因此最为适合的pH范围包括，例如，6至8.5，例如6.5至8.0。值得记录的是，苯甲酸所具有的pK_a是4.2左右。在将所述的pH维持在至少大约为1个pH单位直至超过所述的芳香性羧酸根离子例如苯甲酸所具有的pK_a的过程中，由所述的酚类防腐剂所引发的蛋白质的分解作用在本质上被减轻了。适宜的，所述的pH为低于5左右，例如，低于4个pH单位左右直至超过所述的芳香性的羧酸根离子所具有的pK_a。

所述的芳香性的羧酸根离子是以能够有效的减少酚类的分解作用的剂量来进行添加的，其中所述的羧酸根离子例如是所述的苯甲酸根离子。

当在本发明中被进行使用时，对于一种具体的“芳香性的羧酸根”例如“苯甲酸根”的表述包括了对相应的芳香性的羧酸例如苯甲酸的表述，并且反之亦然，存在于所述的组合物之中的种类(即，酸或者阴离子)是由所述的pH来决定的。

一系列的低分子量的化合物可以被用来替代苯甲酸盐。这样的化合物的例子包括被取代的苯甲酸盐以及苯甲酸盐的同系物，其中所述的苯甲酸盐同系物在所述的芳香环以及所述的羧酸基团之间存在小的桥接基团。被取代的苯甲酸盐可以选自这样的化合物，所述的化合物在所述苯环的其他位置上承载有一个或者多个取代基。苯甲酸盐的同系物包括这样的化合物，在所述的化合物中所述的羧酸基团与一个稠合的芳香环系统进行了连接(即，直接的连接或者间接的连接)，其中所述的稠合的芳香环例如是萘，正如在所述的1-萘甲酸以及2-萘甲酸中的情形。一个进一步的例子是昔萘酸(1-羟基-2-萘甲酸)。

芳香性的羧酸包括这样的化合物，在所述的化合物中，一个羧酸官能团与一个芳香环进行了连接(即，直接的连接或者经由一个小的桥接基团进行了间接的连接)。芳香环包括碳环芳香环例如苯环和萘环，以及杂环芳香环，例如五元至十元的异芳香环，其中所述的异芳香环中含有一个或者多个(例如，1个至3个)杂原子，选自氮原子，氧原子以及硫原子，特别的为氮原子以及氧原子并且特别是氧原子。

所述的最为适合的芳香环是苯基。

因此苯甲酸盐的同系物同样可以选自这样的化合物，在所述的化合物中存在一个桥接基团，所述的桥接基团位于所述的芳香环以及所述的羧酸根基团之间，其包括一个或者两个碳原子，任选的被含有氧原子的官能团(例如，羟基)进行取代，并且当是一种两个碳原子的连接物的情形时，它可以是饱和的或者是不饱和的。这样的苯甲酸盐同系物可以，例如，选自苯基乙酸，扁桃酸，2-苯基丙酸，苯基乳酸以及苯乙烯酸。优选的，这些低分子量的化合物是在一定的pH条件下被进行使用的，在所述的pH条件下所述的可离子化的羧酸基团被进行了至少90％的离子化，即，在pH条件为至少1个pH单位直至超过所述的芳香性羧酸所具有的羧酸盐基团的pK_a的范围内。

适宜的，所述的芳香性羧酸并不是一种芳香性的氨基酸。

在某些实施方式中所述的芳香性的羧酸包括两个或者更多(例如，两个)羧酸基团，例如在苯二甲酸中的情形。

当所述的芳香性的羧酸承载了不止一个羧酸基团时，当在本发明中被进行使用时，对所述的芳香性的羧酸所具有的pK_a所进行的表述应当被解读为对所述的芳香性羧酸所具有的任意的羧酸基团的最低pK_a所进行的表述。

适宜的，所述的芳香性羧酸承载了单个的羧酸基团。

在某些实施方式中可以使用由两个或者更多个芳香性羧酸所形成的混合物，例如由苯甲酸以及苯基乙酸所形成的混合物。

在下文的表格A中给出了范例性的芳香性羧酸的列表：

表格A

化合物(以酸的形式)	羧酸基团的pK_a数值
		苯甲酸	4.17
2-羟基苯甲酸(水杨酸)	2.98
		3-羟基苯甲酸	4.08
4-羟基苯甲酸	4.58
		3，4，5-三羟基苯甲酸(五倍子酸)	4.41
4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(香草酸)	4.5
		苯二甲酸(1，2)	2.98，5.28
异苯二甲酸(1，3)	3.46，4.46
		对苯二甲酸(1，4)	3.46，4.46
1-萘甲酸	3.70

2-萘甲酸	4.17
		吲哚-3-乙酸	4.75
苯基乙酸	4.28
		3-苯基丙酸	4.66
反式-苯乙烯酸	4.44
		顺式-苯乙烯酸	3.89
扁桃酸	3.85

存在于所述的含水蛋白质制剂之中的所述的芳香性羧酸的剂量是可以变化的，并且能够以低于、高于或者约等于所述的芳香性防腐剂的摩尔浓度存在。在一种个体化合物的情形中，所存在的所述剂量可以由其在所述的含水介质之中所具有的最大溶解性来决定，其中所述的溶解性指的是在所期望的储存温度以及pH的条件下所具有的溶解性。

所述的芳香性的羧酸根离子所具有的摩尔浓度，例如苯甲酸根离子所具有的摩尔浓度，可以是至少大约1毫摩，例如，存在于1-500毫摩的范围之内，优选的存在于1-200毫摩的范围之内，更为优选的存在于5-100毫摩或者5-50毫摩的范围之内，例如具有5毫摩、10毫摩或者20毫摩的摩尔浓度。

与之相类似的，存在于所述的含水蛋白质制剂之中的所述的芳香性防腐剂的剂量可以是变化的。所述的芳香性防腐剂所具有的摩尔浓度，例如苯酚所具有的摩尔浓度，可以存在于5-100毫摩的范围之内，优选的存在于10-60毫摩的范围之内，更为优选的存在于20-40毫摩的范围之内例如具有20毫摩或者30毫摩的摩尔浓度。本领域技术人员能够以防腐剂挑战测试所得出的结果为根据来确定在一种特定的制剂之中所需要的所述防腐剂的剂量，其中所述的挑战测试是遵照所述的药典抗微生物功效测试(PharmacopoeiaAntimicrobialEffectivenessTest)(USP<51>，Vol.32)来进行的。

本发明可以被应用在任何的蛋白质(如下文中所描述到的)中，其中所述的蛋白质被用在需要进行多重剂量的给药以及存在芳香性防腐剂的人类治疗或者动物治疗之中。在用于治疗用途或者预防用途的组合物之中的所述蛋白质的浓度可以在一个很宽的浓度范围内进行变化，从大约1微克/毫升至大约100毫克/毫升，这取决于所述的治疗剂产品的指示以及性质。除此之外，治疗性蛋白质的多重剂量皮下给药可能需要高于100毫克/毫升的浓度，例如150毫克/毫升，200毫克/毫升或者300毫克/毫升。本发明可以适用于从大约1微克/毫升至大约300毫克/毫升的蛋白质浓度的全部范围。

术语“蛋白质”当在本发明中被进行使用时包括这样的分子或者分子复合物，其中所述的分子或者分子复合物具有一个氨基酸序列，所述的氨基酸序列具有足够的链长度能够生成二级结构并且包括单个的多肽链或者蛋白质复合物，其中所述的蛋白质复合物包括两个或者多个多肽。术语“蛋白质”意在涵盖这样的分子，所述的分子任选的包括共价连接的非氨基酸半族例如糖基化的肽，脂蛋白，聚乙二醇化的蛋白质，或者共轭蛋白质。被包含在所述的术语“蛋白质”之内的有金属蛋白质，所述的金属蛋白质具有特定的三维结构以及令人感兴趣的生物学活性，其中所述的活性和/或结构取决于一个特定的金属离子在所述的蛋白质之中的结合位点上的停留。所述的金属可能与所述蛋白质上的氨基酸侧链进行了直接的结合，或者其可以是一个更为复杂的化学组成部分中的一部分，其中所述的化学组成部分被结合在所述的蛋白质结构之中。同样被包含在术语“蛋白质”之内的基于蛋白质的超分子系统，所述的超分子系统被定义为由离散数量的聚集的分子亚单元或者组成部分所构成的系统。这样的超分子系统的例子包括蛋白质多聚体，病毒样颗粒以及灭活病毒或者减毒型病毒。

在要求保护的本发明中所使用到的所述蛋白质优选的是那些意在进行多重剂量的应用的蛋白质，例如在多重剂量药瓶、注射器、泵及其他装置中应用的蛋白质。在这样的应用中防腐剂是一种必要的组成成分。

在要求保护的本发明中所使用到的所述蛋白质优选的具有一个苯酚吸引区域。可以通过一个疏水性的表面或者可接触性结构域或区域对这样的蛋白质进行识别或者鉴定。

在要求保护的本发明中所使用到的所述的蛋白质的例子包括：蛋白质或者肽激素和生长因子，例如：胰岛素、胰高血糖素、人类生长激素、促性腺激素、人类甲状腺刺激激素、粒细胞集落刺激因子、甲状旁腺激素、降血钙素以及促红细胞生成素以及重组人生长激素(Somatropin)；治疗性的酶类例如，链激酶，天冬酰胺酶，以及尿酸氧化酶；疫苗，包括重组蛋白质疫苗。

本发明同样可以被用来提高疫苗中的蛋白质含量所具有的稳定性，其中所述的疫苗通常情况下例如是灭活的病毒或者是减毒型病毒或者是全细胞疫苗，例如乙型肝炎疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、白喉疫苗、疟疾疫苗、人乳头瘤疫苗、A型脑膜炎疫苗、C型脑膜炎疫苗、百日咳疫苗、脊髓灰质炎疫苗。进一步的范例性的疫苗包括那些甲型肝炎疫苗、霍乱疫苗、肺炎疫苗和伤寒症疫苗。

在要求保护的本发明中所使用到的其他蛋白质的例子包括治疗性抗体、免疫球蛋白、融合蛋白、干扰素包括α干扰素、β干扰素以及γ干扰素、血液凝集因子，例如血液凝集因子VIII以及血液凝集因子IX以及血液凝集因子VIIa，以及抗微生物肽例如卡泊芬净(Caspofungin)。

本发明同样可以适用于酶类，其中所述的酶类存在于适合进行治疗性应用或者诊断性应用的组合物之中，例如是尿酸酶以及辣根过氧化物酶。

应当理解的是，尽管上述的例子代表的是可以用在要求保护的本发明之中的优选的蛋白质类型，本发明可以适用于任何的蛋白质或者含有蛋白质的系统，其中所述的蛋白质或者系统被配制成为含有防腐剂，特别是任何的这样的蛋白质，所述的蛋白质在含有防腐剂的情况下倾向于不稳定作用或者表现出不稳定作用的迹象。这样的不稳定作用的迹象例如可能是在经历过所述的含有防腐剂的制剂的培育之后蛋白质活性上发生的损失的证据，这种损失是相对于不含有所述的防腐剂的对照制剂而言的。

所述的蛋白质是以一定的浓度存在的，所述的浓度意在能够达到其治疗功效或者其他的本质功能。优选的，根据本发明中的所有方面的所述组合物中包括一种药理学可接受性的表面活性剂例如聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60，聚山梨醇酯80，泊洛沙姆188或者泊洛沙姆407。

优选的，根据本发明中的所有方面的所述组合物所具有的渗透压在150-500摩斯摩尔/升(mOsm/L)的范围内，更为优选的在220-380摩斯摩尔/升的范围内，最为优选的在大约300摩斯摩尔/升的范围内。

优选的，根据本发明中的所有方面的所述组合物是无菌的，所述的无菌是通过在最终向适宜的容器内进行灌装之前对所述的组合物进行过滤的方式来实现的，其中所述的过滤是在无菌的条件下，使用一种适宜的过滤器或者膜来实现的，例如是一种0.22微米的过滤器，其中所述的容器例如是药瓶或者是预先灌注的注射器。

根据本发明中所述的组合物中可以含有其他的组成成分，例如用以对金属或者蛋白酶抑制剂进行复合的螯合试剂，用来确保所述的蛋白质不会由于存在于所述的样本之中的蛋白酶活性而被缓慢的消化。可以使用的另外的添加剂是多元醇，例如，在至少0.5％的浓度下，并且在通常情况下直至5％(重量/重量)。这样的化合物的例子是糖类例如是蔗糖或者海藻糖或者糖醇例如是肌醇、乳糖醇、甘露醇或者木糖醇。多元醇的进一步的例子包括1，2-丙二醇、丙三醇、山梨醇以及棉子糖。1，2-丙二醇和甘露醇是优选的多元醇。

本发明可以适用于这样的蛋白质，该蛋白质能够自由的溶解在含水溶液或者含水凝胶形式之中，或者所述的蛋白质能够以一种分散液或悬浮液的形式存在于一种含水系统之中，以及所述的蛋白质能够通过疏水性的相互作用、离子间的相互作用或者配体交换的相互作用被连接在固体物质之上，其中所述的固体物质例如是疫苗佐剂或者细胞膜。本发明同样可以适用于固体状态下的蛋白质，在所述的蛋白质中水分已经通过干燥或者通过冷冻干燥或者通过喷雾干燥的方式部分的或者完全的从含水溶液中被去除，其中游离的水或者结合的水是仍然存在的。

因此本发明提供了一种方法，所述的方法包括根据本发明中所述的从一种含水溶液中部分的或者完全的去除水；同样提供了这样的方法所获得的产物。

一种“稳定的”制剂应当是这样的制剂，在存储的过程中存在于其中的蛋白质在本质上而言能够保持其物理稳定性以及化学稳定性以及完整性。当在本发明中被进行使用时“提高的稳定性”意味着：在相同的测试条件下，与只存在防腐剂的相同的蛋白质制剂相比，在存在防腐剂以及芳香性的苯甲酸根离子的情况下，蛋白质制剂是更为稳定的。

本领域中可以利用各种不同的分析技术，用以测量蛋白质的稳定性(参见，例如，HerronJ.N.，JiskootW.以及CrommelinJ.A.(编著)的PhysicalMethodsto CharacterizePharmaceuticalProteins《用以鉴定药物学蛋白质的物理方法》，Plenum出版社，纽约/伦敦，1995年)。可以在选定的温度下在选定的时间段内对稳定性进行测量。尽管通常情况下在2-8℃以及25℃下的存储稳定性具有重要的实际意义，在加速胁迫的条件下所进行的存储，例如在40℃下或者在60℃下，可以被用来对所述蛋白质所具有的稳定性进行评价。本发明中所述的制剂在存储的过程中具有提高的稳定性，其中所述的存储是在温度范围为冷却温度至室温的范围之内，存储的时间为至少1个月，优选的为至少13周。在本发明所具有的一种优选的实施方式中，这样的制剂在2℃至8℃的范围内进行几个月的存储的过程中具有提高的稳定性，例如存储3个月，优选的存储至少12个月，最为优选的存储至少18个月。在本发明所具有的一种优选的实施方式中，这样的制剂在15℃至25℃的温度范围内储存至少13周具有提高的稳定性。在另外一种优选的实施方式中，所述的组合物能够在25℃下进行至少18周的稳定的存储。在另外一种实施方式中，所述的组合物能够在5℃下进行至少26周的稳定的存储并且优选的进行至少52周的稳定的存储。

正如上文中所讨论的苯甲酸根离子，根据本发明中所述的优选的稳定剂，优选的在高于大约5.2的pH下被进行使用。缓冲剂，特别是置换缓冲剂，可以被用来控制并且维持所述的pH。置换缓冲剂，例如，是在WO2008084327A2中所描述到的，上述文献在本发明中被引入作为参考。在一种特别优选的实施方式中，所选定的一种置换缓冲剂系统包括苯甲酸盐以及另外一种缓冲剂。所述的另外一种缓冲剂优选的选自由下述的缓冲剂所组成的组中：TRIS、甘氨酸、精氨酸以及甲硫氨酸。

在一种置换缓冲剂系统中，通常情况下优选的是避免使用一种可离子化的种类，其中所述的可离子化的种类所具有的pK_a存在于所选定的pH的1个pH单位之内。这样的置换缓冲剂适宜的以一定的剂量存在，这样一来每一种缓冲剂所具有的摩尔浓度为至少1毫摩和/或少于1摩，优选的为2毫摩至200毫摩，最为优选的为5毫摩至100毫摩。在一种实施方式中，一种或者多种置换缓冲剂优选的是以1毫摩至大约1摩的浓度存在的；更为优选的是以大约2毫摩至大约200毫摩的浓度存在的，并且甚至更为优选的是以大约5毫摩至大约100毫摩的浓度存在的。

因此在一种实施方式中，本发明中所述的蛋白质组合物中包括两种置换缓冲剂，其中包括至少一种这样的置换缓冲剂，其所具有的pK_a比在所期望的温度下所述的组合物所具有的pH高至少1个单位，以及至少一种这样的置换缓冲剂(优选的，苯甲酸盐)，其所具有的pK_a比在所期望的温度下所述的组合物所具有的pH低至少1个单位。在一种实施方式中，本发明中所述的蛋白质组合物中包括两种置换缓冲剂，其中包括至少一种这样的置换缓冲剂，其所具有的pK_a比在所期望的温度下所述的组合物所具有的pH高至少1.5个单位，以及至少一种这样的置换缓冲剂，其所具有的pK_a比在所期望的温度下所述的组合物所具有的pH低至少1.5个单位。在一种实施方式中，本发明中所述的蛋白质组合物中包括两种置换缓冲剂，其中包括至少一种这样的置换缓冲剂，其所具有的pK_a比在所期望的温度下所述的组合物所具有的pH高至少2个单位，以及至少一种这样的置换缓冲剂，其所具有的pK_a比在所期望的温度下所述的组合物所具有的pH低至少2个单位。为了达到清楚的目的，当一种置换缓冲剂具有多个pK_a时，对于每一个pK_a而言，所述溶液所具有的pH并不存在于1、1.5或者2之内，这需要视情况而定。

除了对所述的pH进行缓冲之外，在许多情形中所述的置换缓冲剂的存在已经表现出对于所述的蛋白质稳定性而言具有有益的功效。例如，在一种实施方式中，在根据本发明中所述的一种组合物之中，一种蛋白质所具有的蛋白质活性在至少一周的时间内能够保持其活性的至少40％，并且优选的在至少四周的时间内能够保持其活性的至少40％，这是在期望的温度下(例如，环境温度或者更高的温度)得到的。在另外一种实施方式中，在根据本发明中所述的一种组合物之中，在期望的温度下，一种蛋白质所具有的蛋白质活性在至少一周的时间内能够保持其活性的至少50％，并且优选的在期望的温度下(例如，环境温度或者更高的温度)在至少四周的时间内能够保持其活性的至少50％。在另外一种实施方式中，在根据本发明中所述的一种组合物之中，一种蛋白质所具有的蛋白质结构活性在至少一周的时间内能够保持至少40％并且优选的保持至少50％，并且更为优选的在期望的温度下在至少四周的时间内能够保持至少40％并且优选的保持至少50％。

根据本发明，所述的蛋白质组合物中优选的不包括有意义的剂量的常规缓冲剂。换句话说，所述的蛋白质组合物中含有低于有意义的剂量的所述的常规缓冲剂。在通常情况下，常规的缓冲剂是以2-200毫摩的浓度被应用到蛋白质组合物之中的，更为典型的情况下是以5-50毫摩的浓度被应用到蛋白质组合物之中的并且最为典型的情况下是以大约20毫摩的浓度被应用到蛋白质组合物之中的。所述的术语“常规缓冲剂”因此在本发明中被定义为任何的化学种类，其所具有的pKa与所述的组合物所具有的pH相比具有少于1个单位的差值但是优选的具有少于0.5个单位的差值，这是在指定的用于存储所述组合物的温度范围内测量得到的，其中所述的组合物具有对所述的蛋白质进行缓冲的能力。所述的术语“低于有意义的剂量”意味着所述的常规缓冲剂是以低于5毫摩的浓度存在于所述的组合物之中的，但是优选的是以低于2毫摩的浓度存在于所述的组合物之中的。

本发明可以适用于在蛋白质的产品周期内对其进行稳定，其中所述的产品周期包括分离或者表达，纯化，运输以及存储。

本发明中的进一步的方面包括：

-芳香性的羧酸根离子的用途，用以增强一种含水组合物的稳定性，其中所述的含水组合物包括蛋白质以及芳香性防腐剂；以及

-用以增强一种含水组合物的稳定性的方法，其中所述的含水组合物包括蛋白质以及芳香性防腐剂，所述的方法包括向所述的组合物中添加芳香性的羧酸根离子。

在本发明中所提及的专利文献以及科学文献构建了那些本领域技术人员能够获得的知识。在本发明中被引用的所有的美国专利以及公开的或者未被公开的美国专利申请都被引入作为参考。在本发明中被引用的所有的公开的外国专利以及专利申请都被引入作为参考。在本发明中被引用的所有其他的公开参考文献、文档、手稿以及科学文献都被引入作为参考。

实施例

实施例1：在40℃下，在存在苯酚作为防腐剂的情况下，苯甲酸根离子对人类生长激素(hGH)的含水组合物的聚集速率所产生的影响

在人类生长激素(hGH)的含水溶液中进行高分子量种类(HMWS)的形成，其中所述的形成是通过使用下述的尺寸排阻高效液相色谱(HPLC)方法来实现的：通过将97份(体积/体积)63毫摩的磷酸钠(pH为7.0)与3份(体积/体积)丙-2-醇进行混合的方式来制备所述的流动相。在进行使用之前对所述的流动相进行过滤。为所述的液相色谱仪(Agilent1100系列)配备一个214纳米的探测器，保护柱以及一个7.8x300毫米的BioSepSEC-S2000柱。将所述的流动速率保持在0.6毫升/分钟。向其中注入15微升的人类生长激素(hGH)的含水样本。将所述的高分子量种类(HMWS)所占的百分比表示为具有较短的洗脱时间的全部峰值所占有的总面积与所述的总峰值面积的比率，忽略掉对应于所述的辅料的峰值，其中所述的较短的洗脱时间是相对于所述的人类生长激素(hGH)所具有的单体形式而言的。在40℃下对所述的人类生长激素(hGH)溶液进行培养并且在特殊的时间点上对所述的高分子量种类(HMWS)所占的百分含量进行评价。除此之外，利用目测是否出现可以观察到的沉淀的现象来对所述的样本进行评价。在两种不同的背景溶液中，对苯甲酸根阴离子(以苯甲酸钾的形式)对所述的聚集反应的速率所产生的影响进行研究：

背景溶液1：组氨酸(10毫摩)，甘露醇(264毫摩)，泊洛沙姆188(3毫克/毫升)，苯酚(30毫摩)，pH6.1。

背景溶液2：乳酸盐(100毫摩)，TRIS(20毫摩)，泊洛沙姆188(3毫克/毫升)，苯酚(30毫摩)，pH6.1。

在40℃下所述的高分子量种类(HMWS)的形成速率在表格1中被示出。已经表示出，在背景溶液1以及在背景溶液2中，所述的10毫摩的苯甲酸根阴离子的存在导致了高分子量种类(HMWS)的形成速率降低。

表格1.在经过40℃下的培养之后，在人类生长激素(hGH)的含水组合物中，制剂的组成成分对所述的高分子量种类(HMWS)所具有的形成速率所产生的影响

实施例2：在60℃下，在存在苯酚以及间甲酚防腐剂的条件下，芳香性的羧酸盐以及其他的化合物对尿酸酶的稳定性所产生的影响

尿酸酶是从Sigma(U0880)处获得的。将所述的酶配制成100微克/毫升。通过使用一种光学检测在96孔培养板上来实现对酶活性的测量：将10微升所述的制剂与100微升的酶稀释溶液(硼酸盐缓冲液25毫摩，pH为8.5)以及50微升的底物(尿酸钠2毫摩)进行混合。在室温下对所述的混合液进行大约5分钟的平衡。经过5分钟之后，以下述特定的顺序向每一个样本中加入下述的试剂(所述的第一种试剂必须要在精确的5分钟时加入，其他试剂的加入试剂是次要的)：50微升的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(0.5M，pH为4.0)；15微升的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(3毫克/毫升，溶解于二甲基亚砜(DMSO)之中)在此之后15微升的乳过氧化物酶(1毫克/毫升，溶解于水中)。对上述得到的溶液进行充分的搅拌并且通过使用一种培养板阅读器在630纳米处阅读吸收率。使用一定的浓度范围内的参考酶溶液对光学密度进行校验。所有的测量都是以一式三份的形式来完成的并且对平均值进行记录。在所述的预备试验中已经发现酶所具有的稳定性在pH为8.0左右时达到最佳状态，并且离子强度对所述的稳定性所产生的影响最小。在一种背景制剂中对所述的酶活性的保持进行了研究，其中在所述的背景制剂中含有10毫摩的组氨酸以及300毫摩的1，2-丙二醇，并且将其pH调节至8。除了所述的对照样本之外，所述的酶溶液中含有苯酚(30毫摩)或者苯甲醇(30毫摩)作为防腐剂。对所述的稳定性辅料所具有的作用进行了研究，所述的研究是通过下述的方式来进行的：对存在于溶液中的尿酸酶所具有的稳定性进行比较，其中在一种溶液中仅仅含有所述的防腐剂并且在另外一种溶液中同时含有所述的防腐剂以及所述的稳定性组成成分。根据它们在含水溶液中的溶解性，对受试的所述添加剂所具有的浓度进行选择。

已经显示出(表格2)，在60℃下，所述的防腐剂(苯酚或者苯甲醇)的存在导致了对尿酸酶所具有的稳定性的削弱。虽然在不存在所述的防腐剂的条件下，在60℃下经过了6小时的培养之后，可以观察到所述的酶所具有的78.9％的初始活性，在存在苯酚的条件下所述的活性恢复率为55.6％并且在存在苯甲醇的条件下所述的活性恢复率为57.7％。在所述的含有防腐剂的组合物中，芳香性的羧酸盐作为另外一种辅料的存在导致了对所述的防腐剂所具有的去稳定化作用的减轻。与此相反，一种非芳香性的碳环羧酸盐(环己烷羧酸的离子)的存在引发了所述的去稳定化作用的增强。

表格2.在一种背景组合物之中，在60℃下制剂的组成成分对所述的尿酸酶所具有的稳定性所产生的影响，其中所述的背景组合物是由组氨酸(10毫摩)，以及1，2-丙二醇(300毫摩)组成的，pH为8.0。稳定性被表示为活性的百分含量，其中所述的稳定性是在60℃下经过6小时的培养之后测量得到的，所述的活性是在一种新鲜制备的样本中测量得到的。

实施例3：在60℃下，在存在一种防腐剂的条件下，芳香性的羧酸盐对辣根过氧化物酶(HRP)所具有的稳定性所产生的影响

辣根过氧化物酶(HRP)是从Sigma(P8250)处获得的。将所述的酶配制成0.5毫克/毫升。通过使用一种光学检测在96孔培养板上来实现对酶活性的测量：将20微升所述的制剂与180微升的酶稀释溶液(2，2-二氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)1.82毫摩，存在于pH为7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液之中的28毫摩的过氧化氢)进行混合。对上述得到的溶液进行充分的搅拌并且在5分钟之后通过使用一种培养板阅读器在630纳米处阅读吸收率。使用一定的浓度范围内的参考酶溶液对光学密度进行校验。所有的测量都是以一式三份的形式来完成的并且对平均值进行记录。在所述的预备试验中已经发现酶所具有的稳定性在pH为8.0左右时达到最佳状态，并且相对而言不依赖于离子强度。在一种背景制剂中对所述的酶活性的保持进行了研究，其中在所述的背景制剂中含有10毫摩的TRIS以及1，2-丙二醇(300毫摩)，并且其所具有的pH为7.0。除了所述的对照溶液之外，所述的溶液中含有间甲酚(30毫摩)。对所述的稳定性辅料所具有的作用进行了研究，所述的研究是通过下述的方式来进行的：对存在于溶液中的辣根过氧化物酶(HRP)所具有的稳定性进行比较，其中在一种溶液中仅仅含有所述的防腐剂并且在另外一种溶液中同时含有所述的防腐剂以及所述的稳定性组成成分。根据它们在含水溶液中的溶解性，对受试的所述添加剂所具有的浓度进行选择。

已经显示出(表格3)，在60℃下，所述的一种选定的防腐剂(间甲酚)的存在导致了对辣根过氧化物酶(HRP)所具有的稳定性的些许的削弱。虽然在不存在所述的防腐剂的条件下，在60℃下经过了6小时的培养之后，可以观察到所述的酶所具有的90.2％的初始活性，在存在间甲酚的条件下所述的活性恢复率为79.5％。在所述的含有防腐剂的组合物中，芳香性的羧酸盐作为另外一种辅料的存在导致了对所述的防腐剂所具有的去稳定化作用的减轻。

表格3.在一种背景组合物之中，在60℃下制剂的组成成分对所述的辣根过氧化物酶(HRP)所具有的稳定性所产生的影响，其中所述的背景组合物是由TRIS(10毫摩)，以及1，2-丙二醇(300毫摩)组成的，pH为7.0。稳定性被表示为活性的百分含量，其中所述的稳定性是在60℃下经过6小时的培养之后测量得到的，所述的活性是在一种新鲜制备的样本中测量得到的。

尽管参照本发明所具有的优选的实施方式对本发明进行了具体的展现以及描述，本领域技术人员应当理解的是，在不背离本发明所具有的范围的前提下，可以对本发明做出各种不同的形式上的以及细节上的改变，其中本发明所具有的范围是由后附的权利要求所涵盖的。同样应当被理解的是，在本发明中所描述的实施方式并不是彼此互斥的，并且根据本发明，可以将来自于所述的各种不同的实施方式之中的特征进行整体上的或者部分上的组合。

除非上下文需要另外指出，在通篇的说明书以及随后的权利要求书中，所述的词语“包括”，以及变形形式例如“包含”和“含有”，将被理解为涵盖了所指定的整数、步骤、整数组或者步骤组，但是并没有排除其他任何的整数、步骤、整数组或者步骤组。

本发明涵盖了在上文中所提及的优选的和更为优选的组以及适宜的和更为适宜的组以及实施方式组中的全部组合。

Claims

1.一种含水组合物，该组合物包括蛋白质、芳香性防腐剂以及芳香性羧酸根离子，其中所述芳香性防腐剂是苯酚、间甲酚或者苯甲醇。

2.根据权利要求1中所述的组合物，其中所述的芳香性羧酸根离子选自苯甲酸根离子、被取代的苯甲酸盐和苯甲酸盐同系物，其中所述的苯甲酸盐同系物在所述的芳香环与所述的羧酸基团之间具有小的桥接基团。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物所具有的pH比所述的芳香性的羧酸根中的羧酸基团所具有的pK_a高至少一个单位。

4.根据权利要求1中所述的组合物，其中所述的芳香性的羧酸根离子是苯甲酸根离子。

5.根据权利要求4中所述的组合物，其中所述的苯甲酸根离子来自于至少90％的离子化的苯甲酸。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述的组合物所具有的pH为至少5.2。

7.根据权利要求6中所述的组合物，其中所述的组合物所具有的pH为至少5.5。

8.根据权利要求7中所述的组合物，其中所述的组合物所具有的pH为至少6.0。

9.根据权利要求4所述的组合物，其中所述的苯甲酸根离子是以至少1毫摩的剂量进行添加。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的苯甲酸根离子以5至50毫摩的剂量进行添加。

11.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括一种缓冲剂，所述的缓冲剂选自由下述的缓冲剂所组成的组中：TRIS，甘氨酸，精氨酸以及甲硫氨酸。

12.根据前述任意一项权利要求所述的组合物，其中芳香性羧酸根离子的浓度是至少1mM。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中芳香性羧酸根离子的浓度是5至50mM。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的蛋白质是一种用于多重剂量的应用中的治疗性蛋白质。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的蛋白质选自由下述的蛋白质所组成的组中：肽激素以及生长因子、治疗性的酶类、疫苗干扰素以及血液因子。

16.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括一种或者多种蛋白质稳定试剂，

17.根据权利要求16所述的组合物，其中一种或者多种蛋白质稳定试剂为蛋白酶抑制剂、螯合试剂、糖类或者清洁剂。

18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的蛋白质指的是在一种疫苗之中的蛋白质含量，其中在所述的疫苗中含有一种灭活病毒或者减毒型病毒或者是一种全细胞疫苗。

19.一种密闭的容器，其中含有根据在前任意一项权利要求中所述的组合物。

20.一种用以减少存在于含水制剂中的蛋白质的分解作用的方法，其中所述的分解作用是由酚类防腐剂所产生的，所述的含水制剂中包括酚类防腐剂以及易于发生酚类分解作用的蛋白质，所述的方法包括下述的步骤：向所述的制剂中添加芳香性的羧酸根离子，其中所述的制剂的pH被保持在比所对应的芳香性的羧酸所具有的pK_a高至少一个单位，并且其中所述的酚类防腐剂是苯酚或者间甲酚。

21.根据权利要求20中所述的方法，其中所述的芳香性的羧酸根离子是苯甲酸根离子并且所述的pH为至少5.2。

22.根据权利要求20或者权利要求21中所述的方法，其中在期望的温度下经过至少一周的时间所述的蛋白质活性的至少50％得以保持。

23.根据权利要求22中所述的方法，其中在期望的温度下经过至少四周的时间所述的蛋白质活性的至少50％得以保持。

24.根据权利要求20或者权利要求21中所述的方法，其中在期望的温度下经过至少一周的时间所述的蛋白质的结构完整性的至少40％得以保持。

25.根据权利要求20或者权利要求21中所述的方法，其中在期望的温度下经过至少四周的时间所述的蛋白质的结构完整性的至少40％得以保持。

26.根据权利要求20或者权利要求21中所述的方法，其中在期望的温度下经过至少一周的时间所述的蛋白质的结构完整性的至少50％得以保持。

27.根据权利要求20或者权利要求21中所述的方法，其中在期望的温度下经过至少四周的时间所述的蛋白质的结构完整性的至少50％得以保持。

28.芳香性的羧酸根离子的用途，用以增强一种含水组合物的稳定性，其中所述的含水组合物中包括蛋白质以及芳香性防腐剂，其中所述芳香性防腐剂是苯酚、间甲酚或者苯甲醇。

29.一种用以增强含水组合物所具有的稳定性的方法，其中所述的含水组合物中包括蛋白质以及芳香性防腐剂，所述的方法包括向所述的组合物中添加芳香性的羧酸根离子，其中所述芳香性防腐剂是苯酚、间甲酚或者苯甲醇。

30.根据权利要求29中所述的方法，其中所述的芳香性的羧酸根离子是苯甲酸根离子。

31.根据权利要求30中所述的方法，其中所述的含水组合物所具有的pH为至少5.2。

32.根据权利要求31中所述的方法，其中所述的含水组合物所具有的pH为8.5或者更低。