KR101195295B1 - 고농도 항체 및 단백질 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안정하고 비교적 등장성이며 저탁도인, 감소된 점도를 갖는 고농도의 항체 및 단백질 제형에 관한 것이다. 상기 제형은 피하 투여에 특히 적합하다. 본 발명은 추가로 제형화된 항체 또는 단백질로 치료가능한 장애를 치료하기 위한 상기 제형을 함유하는 제품 및 그의 사용 방법을 기술한다. 상기 제형은 아르기닌-HCl, 히스티딘 및 폴리소르베이트를 포함한다.
폴리소르베이트, 액체 제형, IgE-매개 장애, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 천식, 비-알레르기성 천식, 아토피성 피부염 및 위장관병증

Description

고농도 항체 및 단백질 제형{HIGH CONCENTRATION ANTIBODY AND PROTEIN FORMULATIONS}
본 발명은 특히 피하 투여에 적합한 고도로 농축된 항체 제형에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 안정하고 고도로 농축된 (예를 들어, ≥ 100 mg/ml 단백질) 액체 제형을 제공한다.
고도로 농축된 액체 항체 제형이 상당히 요구되고 있다. 그러나, 고도로 농축된 단백질 제형은 여러 가지 문제점이 있다. 하나의 문제점은 입자의 형성으로 인한 불안정성이다. 액체 제형을 만들기 위해 재구성된 동결건조 제제에 있어서는 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트)를 사용함으로써 이러한 문제점을 해결했지만, 계면활성제는 추가의 공정들을 어렵게 만들기 때문에 액체 제형에는 부적합하다. 나아가, 계면활성제는 또한 항체의 거대분자적 성질로부터 기인하는 수많은 분자간 상호작용으로 인한 점도 증가를 감소시키지 않는다.
계면활성제는 단백질의 입자 형성 정도를 현저히 감소시키는 것으로 나타났지만, 농축 항체 제형의 조작 및 투여를 어렵게 만드는 점도 증가의 문제점을 해결하지는 못한다. 항체는 거대분자적 성질 및 분자간 상호작용에 대한 가능성 때문에 고농도에서는 점성 용액을 형성하는 경향이 있다. 또한, 흔히 제약학상 허용되 는 당이 안정화제로서 다량 사용된다. 이러한 당은 분자간 상호작용을 증강시켜 제형의 점도를 증가시킬 수 있다. 고점도의 제형은 제조하고, 주사기로 주입하며 피하로 주사하기에 어려움이 있다. 점성 제형을 다루는데 힘을 주면 거품이 과도하게 생기는데, 이는 활성 생물질의 변성 및 불활성화를 야기할 수 있다. 이러한 문제점에 대한 만족스러운 해결책은 현재 없다.
선행 기술들은 제약 제형을 생산하는데 적절하게 사용될 수 있는 부형제를 다수 예시하고 있지만, 100 mg/ml를 초과하여 성공적으로 제형화된 단백질, 또는 그렇게 하기 위한 기술로서 개시된 것은 극히 소수였다.
본 출원자들은 아르기닌, 구체적으로 아르기닌-HCl이 고도로 농축된 액체 단백질 또는 항체 제형에 특히 적합하다는 사실을 발견했다.
안정한 등장성 동결건조 단백질 제형은 1997년 2월 13일에 공개된 PCT 공개 WO 97/04801에 개시되어 있고, 그 전체 개시내용은 명백히 본원에서 참조한다. 개시된 동결건조 제형은 안정성의 명백한 소실없이 재구성하여 고농도의 단백질 액체 제형을 생성할 수 있다. 그러나, 재구성된 제형의 높은 점도와 관련된 잠재적인 문제점들은 해결되지 않았다. 단백질 응집은 당을 첨가함으로써 미리 감소시켰지만, 그렇게 함으로써 점도 및 몰삼투압농도가 현저하게 증가되어 처리하고 사용하기에 비실용적이 될 수 있다.
본 출원자들은 2002년 4월 18일에 공개된 PCT 출원, 공개 W002/30463에서 1) 낮은 pH (약 4.0 내지 5.3)로써, 2) 높은 pH (약 6.5 내지 12.0)로써, 또는 3) 염 또는 완충액을 첨가하여 제형의 총 이온 세기를 증가시킴으로써 단백질 농도는 높 지만 점도는 낮은 제형을 달성하여 이를 개시했다. 그러나, 이온 세기가 증가하면 (NaCl에 의해서와 같이) 제형의 점도는 감소하는 반면, 용액의 탁도가 증가할 수도 있는데, 이는 흔히 단백질 입자의 형성 (예를 들어, 응집)과 관련된다. 따라서, 최적의 고농도 단백질 제형은 안정성, 점도, 몰삼투압농도 및 탁도의 난제를 극복해야만 한다.
발명의 요약
본 발명은 안정하고 점도 및 탁도는 낮은 고도로 농축된 단백질 또는 항체 제형에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 단백질 또는 항체 (100-260 mg/ml), 히스티딘 (10-100 mM), 아르기닌-HCl (50-200 mM) 및 폴리소르베이트 (0.01%-0.1%)을 포함하고, 5.5-7.0의 pH, 50 cs 이하의 점도, 및 200 mOsm/kg-450 mOsm/kg의 몰삼투압농도를 갖는, 저탁도의 고도로 농축된 항체 제형에 관한 것이다. 다르게는, 제형 내의 단백질 또는 항체는 120-260mg/ml, 다르게는 150-260 mg/ml, 다르게는 180-260mg/ml, 다르게는 200-260mg/ml의 단백질 또는 항체의 범위일 수 있다. 대안으로서, 몰삼투압농도는 250 mOsm/kg-350 mOsm/kg의 범위이다. 대안으로서, 아르기닌-HCl의 농도는 100-200 mM, 다르게는 150-200 mM, 다르게는 180-200 mM의 범위이다.
다르게는, 본 발명은 항체 (40-150 mg/ml), 히스티딘 (10-100 mM), 당 (예를 들어, 트레할로스 또는 수크로스, 20-350 mM) 및 폴리소르베이트 (0.01%-0.1%)을 포함하는 고도로 농축된 저탁도 항체 제형에 관한 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 분자량이 큰 단백질, 예를 들어 항체 또는 면역글로불린을 고농도로 함유하는 제형을 제공한다. 항체는 예를 들어, 특정 소정의 항원에 대한 항체일 수 있다. 특정 면에서, 항원은 IgE이다 (예를 들어, 미국 특허 6,329,509 및 WO 99/01556에 기술된 rhuMAbE-25 및 rhuMAbE-26). 다르게는, 항-IgE 항체는 콘 (Corne) 등의 문헌 [J. Clin. Invest. 99(5):879-887(1997)], W092/17207에 기술된 CGP-5101 (Hu-901), 및 ATTC 기탁 번호 BRL-10706 및 11130, 11131, 11132, 11133일 수 있다. 다르게는, 항원은 CD 단백질 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40; HER 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 2C4, 4D5, PSCA, LDP-2, 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 및 α- 및 β-서브유닛을 포함하는 αv/β3 인테그린 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어 VEGF; 혈액 군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체, CTLA-4, 및 단백질 C를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형은 제약 제형일 수 있다. 특정 면에서, 제형은 피하로 전달된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 치료적 유효량의 단백질 또는 항체를 포함하는 본원에 개시된 제형을 투여하는 것을 포함하는, 제형화된 단백질 또는 항체로 치료할 수 있는 장애의 처치, 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 제형은 특히 피하 투여에 유용하다. 특정 면에서, 장애는 IgE-매개 장애이다. 또한 추가의 면에서, IgE-매개 장애는 알레르기성 비염, 천식 (예를 들어, 알레르기성 천식 및 비-알레르기성 천식), 아토피성 피부염, 알레르기성 위장관병증, 과민증 (예를 들어, 아나필락시스, 담마진, 음식 알레르기 등), 알레르기성 기관지-폐 아스페길루스증, 기생충성 질환, 간질성 방광염, 과-IgE 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 위스코트-알드리치 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 흉선성 림프형성 부전증, IgE 골수종 및 이식편-대-숙주 반응이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 제형이 들어있는 용기를 포함하는 제품을 제공한다. 한 면에서, 제품은 미리 채워진 (pre-filled) 주사기이다. 또 다른 특정 면에서, 미리 채워진 주사제는 또한 주입 장치 내에 포함되어 있다. 또 다른 특정 면에서, 주입 장치는 자동 주입기이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 펩신 분해된 항-IgE 모노클로날 항체의 소수성 상호작용 크로마토그래피. 샘플을 상이한 pH 및 완충액에서 제형화했다: (●) 20 mM 아세테이트, (△) 20 mM 숙시네이트, (▲) 20 mM Na2HPO4, (▽) 20 mM K2PO4 및 (*) 20 mM 트리스 완충액. 샘플을 30℃에서 6개월 동안 보관했다.
도 2. 40℃에서 6개월 동안 보관한 항-IgE 모노클로날 항체의 크기 배제 크로마토그래피. 샘플을 상이한 pH 및 완충액에서 제형화했다: (■) 20 mM 글루타메이트, (●) 20 mM 아세테이트, (△) 20 mM 숙시네이트, (□) 20 mM 히스티딘, (▲) 20 mM Na2HP04, (▼) 20 mM K2P04 및 (*) 20 mM 트리스 완충액.
도 3. 30℃에서 6개월 동안 보관한 항-IgE 모노클로날 항체의 활성. 샘플을 상이한 pH 및 완충액에서 제형화했다: (●) 20 mM 아세테이트, (△) 20 mM 숙시네이트, (□) 20 mM 히스티딘, (▲) 20 mM Na2HP04, (▼) 20 mM K2P04 및 (*) 20 mM 트리스 완충액.
도 4. 스트레스 조건하의 항-IgE 모노클로날 항체의 탁도에 대한 폴리소르베이트 20의 효과. 샘플은 pH 6.0에서 100 mg/ml의 항체, 20 mM의 숙시네이트, 192 mM의 트레할로스, 및 다양한 양의 폴리소르베이트 20을 함유한다. 폴리소르베이트 농도는 (■) 0, (▲) 0.01%, (●) 0.02% 및 (△) 0.05%이다.
도 5. ~150 mg/ml에서 상이한 부형제 (▲) CaCl2, (▽) MgCl2 및 (△) 아르기닌-HCl을 갖는 항-IgE 모노클로날 항체의 탁도.
도 6. ~150 mg/ml에서 여러 가지의 부형제를 갖는 항-IgE 모노클로날 항체의 탁도. 샘플을 (▲) -70℃, (■) 2-8℃, (△) 15℃, (□) 30℃ 및 (▽) 40℃에서 보관했다.
도 7. 파파인 분해된 항-IgE 모노클로날 항체의 소수성 상호작용 크로마토그래피 분석. 샘플을 ~150 mg/ml에서 다양한 부형제와 제형화하고 (▼) -70℃, (■) 2-8℃, (▲) 15℃, (△) 30℃ 및 (□) 40℃에서 보관했다.
도 8. (■) 200 mM의 아르기닌-HCl, 23 mM의 히스티딘, pH 6.0, (▲) 182 mM의 아르기닌-HCl, 20 mM의 히스티딘, pH 6.0, (●) 182 mM의 아르기닌-HCl, 20 mM의 히스티딘, 91 mM의 수크로스, pH 6.0, (□) 50 mM의 MgCl2, 27 mg/ml의 트레할로스, 0.01% 아세테이트, (△) 50 mM의 MgCl2, 30 mM의 MgAc2, 0.01% 아세테이트, 및 (○) 50 mM의 MgCl2, 45 mM의 MgAc2, 0.01% 아세테이트 중의 ~150 mg/ml 항-IgE 모노클로날 항체의 크기 배제 크로마토그래피. 샘플을 30℃에서 6개월 동안 보관했다.
도 9. 파파인 분해된 항-IgE 모노클로날 항체의 소수성 상호작용 크로마토그래피 분석. 나타낸 샘플은 (■) 200 mM의 아르기닌-HCl, 23 mM 히스티딘, (▲) 182 mM의 아르기닌-HCl, 20 mM의 히스티딘, (●) 182 mM의 아르기닌-HCl, 20 mM의 히스티딘, 91 mM의 수크로스, (□) 50 mM의 MgCl2, 27 mg/ml의 트레할로스, 0.01% 아세테이트, (△) 50 mM의 MgCl2, 30 mM의 MgAc2, 0.01% 아세테이트, 및 (○) 50 mM의 MgCl2, 45 mM의 MgAc2, 0.01% 아세테이트에서 제형화했다. 샘플을 30℃에서 6개월 동안 보관했다.
도 10. 항-IgE 항체 E25, E26 및 Hu-901의 가변 및 불변쇄 모두의 전장 서열을 비교해 보여준다. Hu-901의 CDR 영역은 밑줄로 나타냈다. E25 및 E26에 대해, 초티아 (Chothia)에 의해 정의된 CDR 영역은 굵게 나타냈지만, 카밧 (Kabat)에 의해 정의된 CDR 영역은 괄호로 나타냈다. 도 10A는 E25, E26 및 Hu-901의 경쇄 서열을 나타내는 반면 (서열 1-3), 도 10B는 E25, E26 및 Hu-901의 중쇄 서열을 나타낸다 (서열 4-6).
바람직한 실시태양의 상세한 설명
I. 정의
"단백질"은 사슬 길이가 보다 높은 수준의 3차 및(또는) 4차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 단백질은 상기 구조를 갖지 않는 역시 아미노산계 분자인 "펩티드"와 구별된다. 전형적으로, 본원에 사용하기 위한 단백질은 약 15-20 kD 이상, 바람직하게는 약 20 kD 이상의 분자량을 가질 것이다.
본원의 정의에 포함되는 예시적인 단백질은 포유동물 단백질, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 (von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방성 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들어 유로키나제 또는 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA, 예를 들어 Activase
Figure 112005055918210-pct00001
, TNKase
Figure 112005055918210-pct00002
, Retevase
Figure 112005055918210-pct00003
); 봄바진; 트롬빈; 종양 괴사인자-α 및 -β; 엔케팔리나제; RANTES (Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 뮐러-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 향신경성 인자, 예를 들어 뼈-유래 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-1); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴 (EPO); 트롬보포이에틴 (TPO); 골유도성 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 촉진 인자 (CSFs), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막단백질; 붕괴 가속 인자 (DAF); 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 외막의 부분; 운반 단백질; 귀환 (homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 면역어드헤신 (immunoadhesin); 항체; 및 상기 열거한 임의의 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
제형화된 단백질은 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (즉, 오염성 단백질이 없음). "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기초로 약 90 중량% 이상, 바람직하게는 약 95 중량% 이상의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 단백질은 조성물의 총 중량을 기초로 약 99 중량% 이상의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다.
특정 실시태양에서, 단백질은 항체이다. 항체는 예를 들어, 상기 언급한 임의의 분자에 결합할 수 있다. 본 발명에 포함되는 항체에 대한 예시적인 분자 표적은 IgE, CD 단백질 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40; HER 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 2c4, 4D5, PSCA, LDP-2, 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, pl50, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 및 α- 및 β-서브유닛을 포함하는 αv/β3 인테그린 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예를 들어 VEGF; 혈액 군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체, CTLA-4, 및 단백질 C를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체 (면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체를 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 특이성 항체 (예를 들어, 이중 특이성 항체, 디아바디 및 단쇄 분자, 및 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다.
기본적인 4-쇄 항체 유닛은 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 헤테로테트라머의 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄라 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 헤테로테트라머 유닛으로 구성되고 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, IgA 항체는 중합화하여 J 쇄와 함께 다가의 집합을 형성할 수 있는 2-5개의 기본적인 4-쇄 유닛을 포함한다. IgG의 경우, 4-쇄 유닛은 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄의 이소타입에 따라 하나 이상의 디술피드 결합으로 서로 연결된다. 또한, 각각의 H 및 L 쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (VH), 및 α 및 γ 쇄 각각에 대해서는 이에 후속하는 3개의 불변 도메인 (CH)을, 그리고 μ 및 ε 이소타입에 대해서는 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (VL)을, 그리고 다른 말단에서는 이에 후속하는 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH와 VL이 함께 쌍을 이루어 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 성질에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 L 쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 및 람다로 불리는 2개의 명백히 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다. 면역글로불린은 그의 중쇄 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스 또는 이소타입으로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 클래스가 있고, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭되는 중쇄를 갖는다. γ 및 μ 클래스는 CH 서열 및 기능에 있어서의 상대적으로 미미한 차이점을 기초로 하여 인간이 발현하는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류된다.
용어 "가변"이란 가변 도메인의 특정 분절이 서열에 있어서 항체들 간에 크게 상이하다는 사실을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지는 않는다. 대신, V 영역은 "초가변 영역", 또는 때로는 "상보성 결정 영역" (CDRs)이라 불리는 각각 약 9-12 아미노산 잔기 길이의 극가변성의 짧은 영역에 의해 분리된, 약 15-30 아미노산 잔기의 프레임워크 영역 (FRs)이라 불리는 상대적으로 불변인 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결을 형성하며 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트의 입체형태인 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참가와 같은 다양한 이펙터 기능을 보인다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" ("상보성 결정 영역" 또는 CDR로도 알려져 있음)이란, 항원-결합 부위를 형성하고 항원 특이성의 주요 결정요소인 면역글로불린의 V-영역 도메인 내에 존재하는 (통상적으로 극도의 서열 가변성을 갖는 3 또는 4개의 짧은 영역) 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR 잔기를 동정하는 데에는 2가지 이상의 방법이 있다: (1) 종간 (cross-species) 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MS 1991)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 그러나, 2가지의 잔기 동정 기술은 동일한 영역이 아닌 중첩되는 영역을 규정하므로, 이들을 조합하여 하이브리드 CDR을 규정할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이 및(또는) 번역후 변형 (예를 들어, 이성체화, 아미드화)을 제외하고 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 관한 것이므로 매우 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정군 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정군에 대한 것이다. 모노클로날 항체는 그 특이성 이외에도 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물로 합성할 수 있다는 장점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특별한 방법으로 항체를 제조하는데 요구되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495(1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 생물학적 활성을 발휘하는 한 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특별한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성있는 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)). 본원에서 관심대상인 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 올드 월드 멍키(Old World Monkey), 에이프(Ape) 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "1차화된 (primitized)" 항체를 포함한다.
"온전한 (intact)" 항체는 항원-결합 부위, 뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 및(또는) 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995) 참조); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등을 포함한다.
항체를 파파인 (Papain) 절단하면 2개의 동일한 항원-결합 단편, 소위 "Fab" 단편, 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, "Fc"라는 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (VH)과 함께 전체 L 쇄, 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)으로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가인데, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 상이한 항원-결합 활성을 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는, 2개의 디술피드 결합으로 연결된 Fab 단편에 거의 상응하는 하나의 큰 F(ab')2 단편이 생성된다. Fab' 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 Fab' 단편의 쌍으로 제조되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.
Fc 단편은 두 H 쇄가 디술피드로 함께 연결된 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 특정 형태의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해서도 인식되는 영역인 Fc 영역의 서열에 의해 결정된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인으로 이루어진 다이머로 구성된다. 이 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변성 루프 (H 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 친화도는 낮지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄 내에서 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조.
용어 "디아바디"는 V 도메인이 쇄 간에는 쌍을 이루지만 쇄 내에서는 쌍을 이루지 않아서 2가의 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 형성하도록 VH와 VL 도메인 간에 짧은 링커 (약 5-10 잔기)를 갖는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 제작함으로써 제조된, 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중 특이성 디아바디는 두 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "크로스오버" sFv 단편의 헤테로다이머이다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호, 국제 공개 제93/11161호 및 Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"특이적으로 결합하는", 또는 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 대해 "특이적인" 항체는, 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체이다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 본원에서 유리 (예를 들어, 세공 조절된 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 부분적으로 또는 전체적으로 형성된 것들을 포함한다. 특정 실시태양에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시태양에서 고상은 정제 칼럼 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피 칼럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 마우스) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는, 대부분이 인간 서열인 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 (또한 CDR)의 잔기를 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)의 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 소정 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 본 발명에서 사용된 "인간화 항체"는 수용자 항체에서도 또는 공여자 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변경은 항체의 성능을 보다 정밀화시키거나 최대화하기 위해 이루어진다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 사항은 문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조.
"종-의존성 항체", 예를 들어 포유동물 항-인간 IgE 항체는 제1 포유동물 종의 항원에 대하여, 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대해서보다 강한 결합 친화도를 갖는 항체이다. 일반적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합"하지만 (즉, 약 1 x 10-7 M 이하, 다르게는 약 1 x 10-8 M 이하, 다르게는 약 1 x 10-9 M 이하의 결합 친화도 (Kd) 값을 가짐), 제2 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 비-인간 항원에 대한 결합 친화도보다 약 50배 이상, 약 500배 이상, 또는 약 1000배 이상 약하다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 형태의 항체일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 의한 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소타입에 따라 다를 수 있다. 항체 이펙터 기능은 예를 들어, C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용 (phagocytosis); 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 ADCC는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs)에 결합된 분비 Ig가 상기 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하도록 하여, 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 죽일 수 있는 형태의 세포독성을 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장 (arm)"시키고 상기 메커니즘으로 표적 세포를 죽이는데 필요하다. ADCC를 1차적으로 매개하는 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 Fc 발현은 라베취 및 키넷의 문헌의 464 페이지, 표 3에 요약되어 있다 (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991)). 관심대상인 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기술된 것과 같은 시험관내 ACDD 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석법에 대해 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 관심대상인 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., PNAS USA 95:652-656(1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타낸다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (상기 수용체의 대립유전자 (allelic) 변이체 및 얼터너티브 스플라이싱된 (alternatively spliced) 형태를 포함)를 포함하고, FcγRII 수용체는 주로 세포질 도메인이 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다. (M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조). FcRs는 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991); Capel et al., ImmunoMethods 4:25-34(1994); de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)]에서 검토하고 있다. 앞으로 동정될 것들을 비롯한 기타 FcRs는 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 또한, 모체의 IgG를 태아에게 전달하는 신생 수용체, FcRn을 포함한다. Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994).
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구는 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 MNK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"CDC"의 "보체 의존성 세포독성"은 보체 존재하에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템 제1 보체 (C1q)가 인지 (cognate) 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 검정법을 수행할 수 있다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드 및 항체를 기술함에 있어 사용된 "단리된"이란, 확인되었고 그 생산 환경의 성분들로부터 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드 또는 항체를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 그 생산 환경으로부터 유래한 모든 다른 성분과 결합되어 있지 않다. 재조합 트랜스펙션된 세포로부터 야기된 것과 같은 생산 환경의 오염원 성분은, 통상적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 방해할 수 있는 물질이며 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열 중 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 비환원 또는 또는 환원 조건하에서 쿠마씨 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 SDS-PAGE로 균질하게 정제될 수 있다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 하나 이상의 정제 단계로 제조될 것이다.
본원의 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는, 통상적으로 그 핵산이 생산된 환경에서 일반적으로 관련되는 하나 이상의 오염원 핵산 분자로부터 분리되고 확인된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산에는 생산 환경과 관련된 모든 성분들이 없다. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 자연 상태에서 발견되는 형태 또는 세팅이 아니다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 세포에서 천연으로 존재하는 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 핵산과는 구별된다.
용어 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 (operably linked) 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 대하여 적합한 조절 서열은, 예를 들면 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓일때 "작동적으로 연결"된 것이다. 예를 들면, 전구서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA가, 만일 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현된다면 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결된 것이며; 프로모터 또는 인핸서는 만일 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 위치하면 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되어 있는 DNA 서열이 인접하고, 분비성 리더의 경우에는 인접하고 리딩 페이즈 내에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 만일 그러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 종래의 방식에 따라 사용한다.
본원에 사용된 "에피토프 태그된 (tagged)"이란 "태그 폴리펩티드"에 융합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 또한, 매우 독특해서 그 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차-반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (약 10 내지 20개의 아미노산 잔기가 바람직함).
본원에 사용된 용어 "면역어드헤신"이란, 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종"인) 목적 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로, 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 얻을 수 있다. Ig 융합물은 바람직하게는, Ig 분자 내의 하나 이상의 가변 영역 대신 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체 도메인의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합물은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합물의 생산에 대해서는 1995년 6월 27에 발행된 미국 특허 제5,428,130호도 참조한다.
"안정한" 제형이란 보관시 그 안의 단백질이 그의 물리적 및 화학적 안정성, 및 일체성을 본질적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술들이 당 분야에서 사용될 수 있고, 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs.(1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)]에 검토되어 있다. 안정성은 선택된 시간 주기 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 신속한 스크리닝을 위해 제형을 40℃에서 2주 내지 1개월 동안 보관할 수 있고, 그 때 안정성을 측정한다. 제형을 2-8℃에서 보관할 경우에는, 통상적으로 제형은 30℃ 또는 40℃에서 1개월 이상 보관시 안정해야 하고(하거나), 2-8℃에서 2년 이상 보관시 안정해야 한다. 제형을 30℃에서 보관할 경우에는, 통상적으로 제형은 30℃에서 2년 이상 안정해야 하고(하거나) 40℃에서 6개월 이상 안정해야 한다. 예를 들어, 보관 동안의 응집 정도는 단백질 안정성의 표지로서 사용될 수 있다. 따라서, "안정한" 제형은 제형에서 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만의 단백질이 제형 내에 응집체로서 존재하는 것일 수 있다. 기타 실시태양에서, 제형을 보관하는 동안 응집체 형성이 증가하는지를 측정할 수 있다.
"재구성된" 제형은 동결건조된 단백질 또는 항체 제형을 단백질이 희석되도록 희석액에 용해하여 제조된 것이다. 재구성된 제형은 관심대상인 단백질로 치료될 대상체에게 투여 (예를 들어, 비경구 투여)하기에 적합하고, 본 발명의 특정 실시태양에서는 피하 투여에 적합한 것일 수 있다.
"등장성" 제형은 본질적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성 제형은 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 용어 "저장성 (hypotonic)"이란 인간 혈액 미만의 삼투압을 갖는 제형을 나타낸다. 따라서, 용어 "고장성 (hypertonic)"은 인간 혈액의 삼투압을 초과하는 삼투압을 갖는 제형을 기술하는데 사용된다. 등장성은 예를 들어, 증기압 또는 제빙형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 제형은 염 및(또는) 완충액을 첨가한 결과로써 고장성이다.
"재구성된" 제형은 단백질이 재구성된 제형 내에 분산되도록 동결건조된 단백질 제형을 희석액에 용해하여 제조한 것이다. 재구성된 제형은 관심대상인 단백질로 치료될 대상체에게 투여 (예를 들어, 비경구 투여)하기에 적합하고, 본 발명의 특정 실시태양에서는 피하 투여에 적합한 것일 수 있다.
"제약학상 허용되는 산"은 제형화된 농도 및 방식에서 무독성인 무기산 및 유기산을 포함한다. 예를 들어, 적합한 무기 산은 염산, 과염소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 술폰산, 술핀산, 술파닐산, 인산, 카르본산 등을 포함한다. 적합한 유기산은 직쇄 및 분지쇄 알킬산, 방향족산, 시클릭산, 시클로지방족산, 아릴지방족산, 헤테로시클릭산, 포화, 불포화, 모노, 디- 및 트리-카르복실산을 포함하고, 예를 들어 포름산, 아세트산, 2-히드록시아세트산, 트리플루오로아세트산, 페닐아세트산, 트리메틸아세트산, t-부틸 아세트산, 안트라닐산, 프로파논산, 2-히드록시프로파논산, 2-옥소프로파논산, 프로판디온산 (propandioic acid), 시클로펜탄프로피온산, 시클로펜탄 프로피온산, 3-페닐프로피온산, 부타논산, 부탄디온산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 아스코르브산, 신남산, 라우릴 황산, 스테아르산, 뮤콘산, 만델산, 숙신산, 엠본산, 푸마르산, 말산, 말레산, 히드록시말레산, 말론산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 글리콜산, 글리콘산, 글루콘산, 피루브산, 글리옥살산, 옥살산, 메실산, 숙신산, 살리실산, 프탈산, 팔모산, 팔메산, 티오시안산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, p-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-3-(히드록시-2-엔-1-카르복실산), 히드록시나프토산이 포함된다.
"제약학상 허용되는 염기"는 제형화된 농도 및 방식에서 무독성인 무기 염기 및 유기 염기를 포함한다. 예를 들어, 적합한 염기는 무기 염기 형성 금속, 예를 들어 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, N-메틸글루카민, 모르폴린, 피페리딘, 및 1차, 2차 및 3차 아민, 치환된 아민, 시클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지[예를 들어, N(R')4 + (여기서, R'은 독립적으로 H 또는 C1-4알킬, 예를 들어 암모늄, 트리스임)]를 비롯한 유기 무독성 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등으로부터 형성된 것을 포함한다. 특히 바람직한 유기 무독성 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 추가의 제약학상 허용되는 산 및 염기는 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 글리신, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신 및 아스파라긴으로부터 유래된 것을 포함한다.
"제약학상 허용되는" 완충액 및 염은 상기 기재한 산 및 염기의 산 및 염기 부가염으로부터 유래된 것을 포함한다. 구체적인 완충액 및(또는) 염은 히스티딘, 숙시네이트 및 아세테이트를 포함한다.
"동결보호제 (lyoprotectant)"는 관심대상인 단백질과 함께 조합했을 때 동결건조 및 후속적인 보관시 단백질의 화학적 및(또는) 물리적 불안정성을 현저하게 예방하거나 감소시키는 분자이다. 예시적인 동결보호제는 당 및 그의 상응하는 당 알코올; 아미노산, 예를 들어 모노소듐 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민, 예를 들어 베타인; 이액성 (lyotropic) 염, 예를 들어 황산마그네슘; 폴리올, 예를 들어 3가 또는 그보다 분자량이 높은 당 알코올, 예를 들어 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스 (Pluronics
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); 및 그의 조합을 포함한다. 추가의 예시적인 동결보호제는 글리세린 및 젤라틴, 및 당 멜리비오스 (sugar mellibiose), 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스 및 스타키오스를 포함한다. 환원 당은 예를 들어, 글루코스, 말토스, 락토스, 말투로스, 이소-말투로스 및 락투로스를 포함한다. 비-환원 당은 예를 들어, 당 알코올 및 기타 직쇄 폴리알코올로부터 선택된 폴리히드록시 화합물의 비-환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알코올은 모노글리코시드, 특히 락토스, 말토스, 락투로스 및 말투로스와 같은 이당류의 환원에 의해 수득되는 화합물이다. 글리코시드 측쇄기는 글루코시드 또는 갈락토시드일 수 있다. 당 알코올의 추가적인 예는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말투로스이다. 바람직한 동결보호제는 비-환원 당 트레할로스 또는 수크로스이다.
동결보호제는 동결보호량의 동결보호제 존재하에 단백질의 동결건조후, 단백질이 동결건조 및 보관시 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 일체성을 본질적으로 유지하는 것을 의미하는 "동결보호량"으로 동결건조 전의 제형에 첨가된다.
본 발명의 점도가 감소된 제형을 제조함에 있어서 상기 언급한 부형제 및 기타 첨가제를 사용할 때에는, 특히 고농도로 첨가되는 경우 제형의 점도를 증가시키기 않도록 주의를 기울여야 한다.
"제약학상 허용되는 당"은 관심대상인 단백질과 조합된 경우, 보관시 단백질의 화학적 및(또는) 물리적 불안정성을 현저하게 예방하거나 감소시키는 분자이다. 제형이 동결건조된 다음 재구성되는 경우에는, "제약학상 허용되는 당"을 "동결보호제"로 이해할 수도 있다. 예시적인 당 및 그의 상응하는 당 알코올은 아미노산, 예를 들어 모노소듐 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민, 예를 들어 베타인; 이액성 염, 예를 들어 황산마그네슘; 폴리올, 예를 들어 3가 또는 그보다 분자량이 높은 당 알코올, 예를 들어 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스
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; 및 그의 조합을 포함한다. 추가의 예시적인 동결보호제는 글리세린 및 젤라틴, 및 당 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스 및 스타키오스를 포함한다. 환원 당은 예를 들어, 글루코스, 말토스, 락토스, 말투로스, 이소-말투로스 및 락투로스를 포함한다. 비-환원 당은 예를 들어, 당 알코올 및 기타 직쇄 폴리알코올로부터 선택된 폴리히드록시 화합물의 비-환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알코올은 모노글리코시드, 특히 락토스, 말토스, 락투로스 및 말투로스와 같은 이당류의 환원으로 수득되는 화합물이다. 글리코시드 측쇄기는 글루코시드 또는 갈락토시드일 수 있다. 당 알코올의 추가적인 예는 글루시톨, 말티톨, 락티톨 및 이소-말투로스이다. 바람직한 제약학상 허용되는 당은 비-환원 당 트레할로스 또는 수크로스이다.
제약학상 허용되는 당은 단백질이 보관 동안 (예를 들어, 재구성 및 보관 후) 본질적으로 그 물리적 및 화학적 안정성 및 일체성을 유지하는 양을 의미하는 "보호량"으로 (예를 들어, 동결건조 전에) 제형에 첨가된다.
본원에서 관심대상인 "희석액"은 제약학상 허용되고 (인간 투여에 안전하고 무독성임) 액체 제형, 예를 들어 동결건조 후 재구성된 제형의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 희석액은 무균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 인산염-완충 식염수), 무균 식염 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 별도의 실시태양에서, 희석액은 염 및(또는) 완충액의 수용액을 포함할 수 있다.
"보존제"는 박테리아 활성을 감소시키기 위해 본원의 제형에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는 예를 들어, 다용도 (다용량) 제형의 생산을 촉진할 수 있다. 잠재적인 보존제는 예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다. 기타 형태의 보존제는 방향족 알코올, 예를 들어 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레솔시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 억제 조치를 모두 지칭한다. 치료가 필요한 대상은 이미 질병에 걸린 경우 뿐만 아니라 질병을 예방하려는 경우도 포함된다.
치료하기 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육동물, 동물원용, 경기용 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌쥐, 마우스, 페릿, 래트, 고양이 등을 비롯하여 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
"장애"는 단백질로의 치료가 도움이 되는 임의의 증상이다. 이는 포유동물이 문제의 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건을 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본 발명에서 치료되는 장애의 비제한적인 예는 암 및 알레르기를 포함한다.
"치료적 유효량"은 적어도 특정 장애를 측정가능한 정도로 개선 또는 예방하는데 필요한 최소 농도이다. 공지된 단백질의 치료적 유효량은 당 분야에 잘 알려져 있지만, 이하 발견된 단백질의 유효량은 당업자, 예를 들어 일반 내과의사에게 잘 알려진 표준 기술로 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "점도"는 "동적 점도" 또는 "절대 점도"일 수 있다. "동적 점도"는 중력 영향하에 유체의 저항성 유동을 측정한 것이다. 동일한 부피의 두 유체가 동일한 모세관 점도계 내에 위치하여 중력에 의해 흐를 경우, 점성 유체는 모세관을 통해 흐르는데 점성이 보다 낮은 유체보다 시간이 더 많이 걸린다. 만일 한 유체가 완전히 흐르는데 200초가 걸리고 다른 유체는 400초 걸린다면, 동적 점도 스케일에서 두번째 유체는 첫번째보다 점성이 2배인 것이 된다. 가끔 동적 또는 단순 점도라고도 불리는 "절대 점도"는 동적 점도와 유체 밀도의 곱이다:
절대 점도 = 동적 점도 x 밀도
동적 점도의 치수는 L2/T (여기서, L은 길이이고 T는 시간임)이다. 일반적으로, 동적 점도는 센티스토크 (cSt)로 표현된다. 동적 점도의 SI 유닛은 mm2/s이고, 이는 1 cSt이다. 절대 점도는 센티포이즈 (cP) 단위로 표현된다. 절대 점도의 SI 유닛은 밀리파스칼-초 (mPa-s)이고, 여기서 1 cP = 1mPa-s이다.
본원에 사용된 "항히스타민"은 히스타민의 생리학적 효과를 길항하는 약제이다. 히스타민이 그의 수용체, H1 및 H2에 결합하면 특징적인 알레르기성 증상과 효과 또는 가려움, 발적, 부종 등을 일으킨다. 다수의 항히스타민은 히스타민이 수용체, H1, H2에 결합하는 것을 차단함으로써 작용하지만, 다른 것은 히스타민 분비를 억제함으로써 작용하는 것으로 생각된다. 예시적인 항히스타민은 클로르페니라민, 디펜히드라민, 프로메타진, 크로몰린 소듐, 아스테미졸, 아자타딘 말레에이트, 브로페니라민 말레에이트, 카르비녹사민 말레에이트, 세티리진 히드로클로라이드, 클레마스틴 푸마레이트, 사이프로헵타딘 히드로클로라이드, 덱스브롬페니라민 말레에이트, 덱스클로르페니라민 말레에이트, 디멘히드리네이트, 디펜히드라민 히드로클로라이드, 독실아민 숙시네이트, 펙소펜다딘 히드로클로라이드, 테르페나딘 히드로클로라이드, 히드록시진 히드로클로라이드, 로라티딘, 메클리진 히드로클로라이드, 트리펠란나민 시트레이트, 트리펠렌나민 히드로클로라이드, 트리프롤리딘 히드로클로라이드이다.
본원에 사용된 "기관지확장제"는 통상적으로 폐 용량의 감소 및 숨이 차는 증상을 야기하는 조기 (early phase) 천식 반응에서 발생하는 생리학적 현상인 기관지수축을 길항 또는 역전시키는 약제이다. 예시적인 기관지확장제는 에피네프린, 광범위하게 작용하는 알파 및 베타-아드레날린성, 및 베타-아드레날린성 알부테롤, 피르부테롤, 메타프로테레놀, 살메테롤, 및 이소에타린을 포함한다. 기관지확장은 또한, 아미노필린 및 테오필린을 비롯한 크산틴의 투여를 통해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 "당질코르티코이드"는 항-염증 활성을 갖는 스테로이드계 약제를 나타낸다. 당질코르티코이드는 일반적으로 후기 (late phase) 천식 반응을 감쇠시키는데 사용된다. 예시적인 당질코르티코이드는 프레드니손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 플루니솔리드, 베타메타손, 부데소나이드, 덱사메타손, 플루드로코티손 아세테이트, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트, 히드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 및 트리암시놀론을 포함한다.
본원에 사용된 "비-스테로이드성 항-염증성 약물" 또는 "NSAID"는 항-염증성 활성을 갖는 스테로이드계가 아닌 약제를 나타낸다. 예시적인 NSAID는 아세트아미노펜, 아스피린, 브롬페낙 소듐, 디클로페낙 소듐, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜 칼슘, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트 소듐, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 나프록센 소듐, 옥시펜부타존, 페닐부트존, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴 소듐을 포함한다.
II. 본 발명을 수행하는 방식
A. 폴리펩티드 및 항체 제조
이하 기재는 주로 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포의 배양에 의한 상기 폴리펩티드 또는 항체의 생산, 및 결과 단백질 또는 항체의 정제에 관한 것이다. 물론, 상기 폴리펩티드 또는 항체를 제조하는데 당 분야에 공지된 별법이 사용될 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 상기 서열 또는 그의 부분은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 본원에 기술된 단백질 또는 항체의 다양한 부분을 화학적으로 별도로 합성하고, 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합할 수 있다.
1. 본원에 기술된 단백질을 코딩하는 DNA의 단리
본원에 기술된 단백질을 코딩하는 DNA는 상응하는 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 상기 인간 단백질-코딩 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이, 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 단백질-코딩 유전자는 또한, 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 공지된 합성법 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)으로 수득할 수 있다.
라이브러리는 관심대상인 유전자를 동정하기 위해 설계된 프로브 (예를 들어, 약 20-80 염기 이상의 올리고뉴클레오티드)로 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 목적 유전자를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 바이오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 고도 엄격성을 비롯한 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 동정된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이터베이스 또는 다른 독점 서열 데이터베이스에 기탁되고 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하고 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은, 당 분야에 공지된 방법 및 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요하다면 cDNA로 역전사되지 않았을 수 있는 mRNA의 전구체 및 프로세싱 중간체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다.
2. 숙주 세포의 선별 및 형질전환
숙주 세포는 생산을 위해 본 발명에 기술된 단백질 또는 항체를 함유하는 발현 또는 클로닝 벡터로 트랜스펙션 또는 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하게끔 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵 세포의 트랜스펙션 방법 및 원핵세포의 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로의 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457(1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 트랜스펙션의 일반적인 측면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 온전한 세포와의 박테리아 원형질 융합, 또는 다원양이온 (polycation), 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하기 위한 여러 기술에 대해서는 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537(1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352(1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 엔테로박테리아시에 (Enterobacteriaceae)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 기타 적합한 원핵 숙주세포는 엔테로박테리아시에, 예컨대 에스케리키아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 어위니아 (Erwinia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬젤라 (Shigella), 뿐만 아니라 바실리 (Bacilli), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 에어루지노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예들은 한정적인 것이라기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물의 발효에 대한 일반적인 숙주 균주이므로 특히 바람직한 숙주 또는 모숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백분해 효소를 분비한다. 예컨대, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전적 돌연변이가 일어나도록 변형될 수 있는데, 이는 예를 들어 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전자형 tonA ptr3를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 37D6 균주인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일에 발행된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 돌연변이 주변세포질 (periplasmic) 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함하는 상기 숙주이다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법에서는 예를 들어, PCR 또는 기타 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
원핵세포 이외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 본원에 기술된 단백질 또는 항체를 코딩하는 벡터에 대해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 기타 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse, Nature, 290:140[1981]; 1985년 5월 2일에 공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol, 154(2):737-42[1983]), 케이. 프라질리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 윅케라미 (K. Wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia, EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris, EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol, 28:265-278 [1988]); 칸디다; 트리코더마 리이시아 (Trichoderma reesia, EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸 (Neurospora crassa, Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 슈반니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일에 공개된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움 (Tolypocladium, 1991년 1월 10에 공개된 WO 91/00357), 및 아스퍼질루스 숙주 (예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans)(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289[1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221[1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984)) 및 에이. 나이저 (A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479[1985])를 포함한다. 향메틸성 효모가 본원에 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스, 및 로도토룰라로 구성된 속으로부터 선택된 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 호모군의 예인 구체적인 종 목록은 문헌[C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269(1982)]에서 찾을 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드 및 항체의 글리코실화 형태의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포, 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포 (293 세포 또는 현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1977)); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL51)가 포함된다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선별 및 사용
본원에 기술된 폴리펩티드 및 항체를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입될 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 결찰 기술을 사용한다.
폴리펩티드 또는 항체의 재조합 생산은 직접적으로 달성될 수 있을 뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서도 제조될 수 있다. 이종 부분은 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 기타 폴리펩티드일 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입된 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 장독소 (enterotoxin) II 리더 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질이 분비되도록 할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 선택된 1종 이상의 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스의 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 것이다. 통상적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 본 발명에 기술된 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열을 수용할 수 있는 (competent) 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이며, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장능이 결여된 효모의 돌연변이주, 예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 지시하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615(1978); Goeddel et al., Nature, 281:544(1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터계 [Goeddel, Nucleic acids Res., 8:4057(1980); EP 36,776] 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25(1983)]를 포함한다. 또한, 박테리아계에서 사용하기 위한 프로모터는 상기 DNA 서열에 작동적으로 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073(1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900(1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적인 이점을 갖는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포내 벡터로부터의 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포계에 상용성인 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
고등 진핵세포에 의한 본원의 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 핵산의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 시스-액팅 DNA 요소이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터 유래한 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5', 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 분절을 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체의 합성에 적용하는 데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625(1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46(1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용하여 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205(1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 제자리 혼성화 (in situ hybridization)에 의해 샘플에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 하이브리드 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 비롯한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시켜, 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 검정법을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위해 세포 또는 조직 단편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 검정과 같은 면역학적 방법에 의해 측정할 수 있다. 샘플 유체의 면역조직화학적 염색 및(또는) 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 본원에 기술된 폴리펩티드에 대해, 본원에서 제공되는 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대해, 또는 상기 폴리펩티드 및 항체를 코딩하고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
형태들은 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막에 결합된 경우, 이는 적합한 세제 용액 (예를 들어, 트리톤 (Triton)-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 막으로부터 방출될 수 있다. 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 주기, 초음파 처리, 기계적 붕괴 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 붕괴시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 기타 폴리펩티드로부터 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼, 및 에피토프-태그된 형태의 폴리펩티드 또는 항체를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 칼럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)]에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어, 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 폴리펩티드 또는 항체의 특성에 따라 좌우될 것이다.
B. 항체 제조
본 발명의 특정 실시태양에서, 선택된 단백질은 항체이다. 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중 특이성 및 헤테로컨쥬게이트 항체를 비롯한 항체를 생산하기 위한 기술을 이하 개시한다.
1) 폴리클로날 항체.
폴리클로날 항체는 통상적으로 동물에게 관련되는 항원 및 애주번트를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 다중 주사하여 생성된다. 관련 항원은 이작용기성 또는 유도화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기에 의한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기에 의한 컨쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 독립적으로 저급 알킬기임)을 사용하여, 면역 처리되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 컨쥬게이션시키는 것이 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 애주번트의 예로는 프로인트 완전 애주번트 및 MPL-TDM 애주번트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 당업자라면 과도한 시행착오 없이 면역화 프로토콜을 선택할 수 있다.
동물은 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3부피의 프로인트 완전 애주번트와 합하고, 이 용액을 여러 부위에 진피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후, 동물에게 프로인트 완전 애주번트 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사하여 부스팅했다. 7 내지 14일 후, 동물의 피를 뽑아 항체 역가에 대해 혈청을 검정했다. 역가가 정체기에 도달할 때까지 동물을 부스팅했다. 컨쥬게이트는 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양물 내에서 제조될 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집 약제는 면역 반응을 증강시키기 위해 적합하게 사용된다.
2) 모노클로날 항체.
모노클로날 항체는 실질적으로 동종 항체들, 즉 한 집단을 이루는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이 및(또는) 번역후 변형 (예를 들어, 이성체화, 아미드화)을 제외하고는 동일한 항체의 집단으로부터 얻어진다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개 항체의 혼합물이 아니라 항체의 성질을 나타낸다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 먼저 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495[1975])에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 상기 기술한 바와 같이 면역화하여, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발한다. 별법으로, 림프구는 시험관내로 면역화될 수 있다. 그 다음, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜로 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986)
면역화제는 통상적으로 항원성 단백질 또는 그의 융합 변이체를 포함할 것이다. 통상적으로, 인간 기원의 세포를 원할 경우 말초 혈액 림프구 ("PBL")를 사용하고, 또는 비인간 포유동물 공급원을 원할 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103).
불멸화된 세포주는 보통 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 접종되어 배양될 수 있다. 예를 들면, 모골수종 세포에 히포크잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 통상적으로 히포크잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.
바람직한 불멸화 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정적인 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이 중에서, 바람직한 것은 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것과 같은 마우스 골수종 세포주, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나싸스)으로부터 입수가능한 SP-2 세포 (및 그의 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653)이다. 또한, 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 기술되어 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63 (마르셀 덱커, 미국 뉴욕 1987).
하이브리도마 세포가 자라고 있는 배양 배지를 목적 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 바람직하게는, 모노클로날 항체의 결합 친화도를 면역침전 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 측정한다.
하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 항원에 대한 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 바람직하게는, 모노클로날 항체의 결합 친화도 및 특이성을 면역침전 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들어 방사선면역검정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)으로 측정할 수 있다. 이러한 기술 및 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 결합 친화도는 예를 들어, 스캐차드 (Scatchard) 분석법 (Munson et al., Anal. Biochem ., 107:220 (1980))으로 결정될 수 있다.
하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생산하는지 확인한 후, 클론을 한계 희석법으로 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기문헌)으로 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 포유동물의 생체내에서 복수 (ascite) 종양으로 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제법에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해, 그리고 상기 기술한 바와 같이 제조할 수도 있다. 상기 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 이용 (예를 들면, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용)하여 쉽게 단리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리하면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 다음에 이를 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션시켜, 상기 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188(1992)을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항체는 문헌[McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클락손 등[Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991)]과 마크스 등[Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 마우스 및 인간 항체의 단리에 대해 각각 기술하고 있다. 후속적인 문헌들은 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 방법으로서 쇄 셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783(1992)), 뿐만 아니라 재조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266(1993))에 의한 고친화도 (nM 범위)의 인간 항체 생산을 기술하고 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
또한, DNA는 예를 들어 상동성인 마우스 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시켜 변형시킬 수 있다. 통상적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드로 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 다른 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.
본원에 기술된 모노클로날 항체는 1가일 수 있고, 이를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 Fc 영역 중 임의의 지점에서 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실될 수 있다. 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체를 절단하여 그의 단편, 특히 Fab 단편을 제조하는 것은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 비롯한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서도 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드-교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트가 포함된다.
3) 인간화 항체.
본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비인간 (예를 들어, 마우스) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열 중 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로는 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 영역에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 기원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트 (import)" 잔기라고 불리며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 본질적으로 윈터 (Winter) 및 그의 공동 연구자들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라, 또는 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 대응하는 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인보다 적은 서열이 비인간 종의 대응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하기 위해 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 도메인 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트핏 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용한다[Sims et al., J. Immunol, 151:2296(1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901(1987)]. 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 다수의 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623(1993)].
항원에 대한 높은 친화도와 다른 이로운 생물학적 특성을 보유하면서 항체를 인간화시키는 것 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 과정에 의해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 당업계의 기술자가 이용가능하고, 이들에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 배위 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이를 점검하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 끼치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가와 같은 목적하는 항체의 특성을 성취하도록, 수용자 및 임포트 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 결합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 끼치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
다양한 형태의 인간화 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있고, 이는 임의로 하나 이상의 세포독성제(들)와 컨쥬게이션되어 면역컨쥬게이트를 생성한다. 별법으로, 인간화 항체는 온전한 항체, 예를 들어 온전한 IgG1 항체일 수 있다.
4) 인간 항체
인간화의 대안으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시키면 내인성 면역글로불린을 생산하지 않고 완전한 인간 항체 레파토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 현재 생산 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 (joining) 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제되는 것으로 개시되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 상기 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551(1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258(1993); Bruggermann et al., Year in Immuno ., 7:33(1993); 미국 특허 제5,591,669호 및 WO97/17852 참조.
별법으로, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 비면역화 공여체로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 인간 항체 단편을 시험관내에서 제조할 수 있다. 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]; 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol. 227:381 (1991)]. 상기 기술에 따라서, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파지의 주요 또는 소수 코팅 단백질 유전자로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질에 기초한 선택은 또한 상기 입자를 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 가져온다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질을 일부 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct . Biol. 3:564-571 (1993)]에서 검토된 바와 같다. 다양한 원천의 V-유전자 분절을 파지 디스플레이에 이용할 수 있다. 문헌[Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래하는 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터의 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여체로부터 V 유전자의 레퍼토리가 구성될 수 있고, 다양한 어레이의 항원(자가-항원을 포함함)에 대한 항체를 본질적으로 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 문헌[Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라서 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조.
콜(Cole) 등 및 보에르너(Boerner) 등의 기술이 또한 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 좌위를 내재 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물(예: 마우스)로 도입하는 것에 의해 제조될 수 있다. 시도하면, 유전자 재배열, 조합 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 측면에서 인간에서 나타나는 것과 밀접하게 닮은 인간 항체 생산이 관찰된다. 상기 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 하기 과학 논문에 기재되어 있다: 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]; 문헌[Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; 문헌[Morrison, Nature 368:812-13 (1994)], 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)], 문헌[Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)] 및 문헌[Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)].
마지막으로, 인간 항체는 또한 활성화된 B 세포에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).
5) 항체 단편
특정 환경에서, 전체 항체 보다 항체 단편을 이용하는 것이 유익하다. 더 작은 단편 크기는 신속한 소실을 가능하게 하고, 고형 종양에 대한 접근이 개선될 수 있다.
항체 단편의 제조를 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해성 분해를 통하여 유도되었다(예를 들면, 문헌[Morimoto et al.,J Biochem Biophys. Method. 24: 107-117 (1992)]; 및 문헌[Brennan et al., Science 229: 81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 분비될 수 있으며, 이는 따라서 다량의 상기 단편의 용이한 제조가 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al, Bio/ Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 는 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 다른 실시태양에서, 선택 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185, 미국 특허 제5,571,894호 및 미국 특허 제5,587,458호 참조. 항체 단편은 예를 들면, 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 것과 같은 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
6) 항체 의존성 효소 매개 프로드럭 요법(Antibody Dependent Enzyme-Mediated Prodrug Therapy; ADEPT)
본 발명의 항체는 또한 항체를 프로드럭(예를 들면, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환하는 프로드럭-활성화 효소에 컨쥬게이션하는 것에 의해 ADEPT에 이용될 수 있다. 예를 들면, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조.
ADEPT에 유용한 면역컨쥬게이트의 효소 성분은 프로드럭을 그의 보다 활성 세포독성 형태로 전환할 수 있도록 하는 방식으로 프로드럭에 작용가능한 임의의 효소를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 효소는 글리코시다제, 글루코스 옥시다제, 인간 리소자임, 인간 글루쿠로니다제, 포스페이트 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환하는데 유용한 알칼라인 포스파타제; 술페이트 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환하는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 시토신 디아미나제; 펩티드 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환하는데 유용한, 세라티아 프로테아제, 테르몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제(예: 카르복시펩티다제 G2 및 카르복시펩티다제 A) 및 카텝신(예: 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환기를 함유하는 프로드럭을 전환하는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 프로드럭을 유리 약물로 전환하는데 유용한 β-갈라토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 β-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기를 갖는 아민 질소로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 페니실린 바미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 별법으로, 또한 당업계에 "아브자임(abzymes)"으로 공지된 효소 활성을 갖는 항체를 이용하여 본 발명의 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환할 수 있다(예를 들면, 문헌[Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조). 항체-아브자임 컨쥬게이트를 아브자임을 종양 세포 군집에 전달하도록 본원에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
상기 효소는 상기한 바와 같은 헤테로이관능성 가교결합제를 이용하는 것과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체에 공유 결합될 수 있다. 별법으로, 적어도 본 발명의 효소의 관능성 활성 부분에 연결된 적어도 본 발명의 항체의 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질을 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다(예를 들면, 문헌[Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)] 참조).
7) 이중특이적 및 다중특이적 항체
이중특이적 항체(BsAbs)는 동일 또는 다른 단백질 상의 것을 포함하는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 별법으로, 1 단(arm)은 표적 항원에 결합 상태가 될 수 있고, 다른 단은 T-세포 수용체 분자(예: CD3)와 같은 백혈구, 또는 FcγR1 (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR) 상에 유발 분자를 결합하는 단과 결합되어 표적 항원 발현 세포에 대한 세포 방어 기전을 집중 및 국소화시킬 수 있다. 상기 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예: F(ab')2 이중특이적 항체)로부터 유도될 수 있다.
또한, 이중특이적 항체를 이용하여 세포독성제를 표적 항원을 발현하는 세포에 국소화할 수 있다. 상기 항체는 요망되는 항원에 결합하는 1 단 및 세포독성제(예: 사포닌, 항-인터페론-a, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메톡트렉세이트 또는 방사활성 동위원소 합텐)에 결합하는 다른 단을 갖는다. 공지된 이중특이적 항체의 예는 항-ErbB2/항-FcgRIII (WO 96/16673), 항-ErbB2/항-FcgRI (미국 특허 제5,837,234호) 및 항-ErbB2/항-CD3 (미국 특허 제5,821,337호)를 포함한다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지의 상이한 항체 분자 혼합물을 생성할 수 있으며, 이 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계로 수행되는 올바른 분자의 정제는 까다롭고, 생산 수율이 낮다. 유사한 방법이 문헌 [WO 제93/08829호, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역 글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이 융합은 바람직하게는, 적어도 힌지의 일부와 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 적어도 하나의 융합물에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체에 코트랜스펙션시킨다. 이는 제작에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 비동등비가 최적 수율을 제공하는 경우의 실시태양에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 분율을 조절하는데 큰 유연성을 부여한다. 그러나, 동등비의 2종 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 가져오는 경우 또는 비가 특정 의미가 없는 경우에는 2 또는 모든 3종의 폴리펩티드를 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 1 단에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 단에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 단지 한쪽 절반에서의 면역글로불린 경쇄의 존재는 용이한 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 요망되는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진함을 발견하였다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 문헌 [예를 들면, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
WO 96/27011 또는 미국 특허 제5,731,168호에 기술된 다른 접근법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 적어도 일부의 CH3 영역을 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 1 이상의 작은 아미노산 쇄가 더 큰 측쇄(예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 대한 동일 또는 유사한 크기의 상보적 "공동(cavities)"이 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하는 것에 의해 제2 항체 분자의 경계면에 생성된다. 이는 호모다이머와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 대하여 헤테로다이머의 수율을 증가시키는 기전을 제공한다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]는 온전한 항체가 단백분해성 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 과정을 기술한다. 이들 단편은 디티올 복합제 아비산나트륨의 존재하에서 환원되어 비시날 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 이어서 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나가 Fab'-TNB 유도체로 재전환되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체를 선택적 효소 고정화를 위한 약제로 이용할 수 있다.
Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌[Shalaby et al., J. Exp. med. 175:217-225 (1992)]는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되고, 시험관내에서 지향성 화학 커플링되어 이중특이적 항체를 형성한다. 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합하고, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 2가 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들면, 2가 헤테로다이머는 류신 지퍼를 이용하여 생산될 수 있다. 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 호모다이머는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성하고, 이어서 재산화되어 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적/2가 항체 단편을 제조하기 위한 별도 기전을 제공한다. 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 간의 접합을 허용하기에는 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제접합되고, 이에 의해 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv (sFv) 다이머의 이용에 의한 이중특이적/2가 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되어 있다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)].
2 보다 많은 원자가를 갖는 항체가 고안되었다. 예를 들면, 3중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
예시적 이중특이적 항체는 주어진 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합될 수 있다. 별법으로, 항-단백질 단은 T-세포 수용체 분자(예: CD2, CD3, CD28 또는 B7)와 같은 백혈구, 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16) 상의 유발분자에 결합되는 단과 결합되어 세포 방어 기전을 특정 단백질을 발현하는 세포에 집중시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 이용하여 세포독성제를 특정 단백질을 발현하는 세포에 국소화시킬 수 있다. 상기 항체는 단백질-결합 단, 및 세포독성제 또는 방사뉴클라이드 킬레이터(예: EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA)에 결합하는 단을 갖는다. 목적하는 다른 이중특이적 항체는 목적 단백질에 결합하고 조직 인자(tissue factor; TF)에 추가로 결합한다.
6) 헤테로컨쥬게이트 항체
헤테로컨쥬게이트 항체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 공유 결합적으로 연결된 2개의 항체로 구성된다. 예를 들면, 헤테로컨쥬게이트 중 한 항체는 아비딘에, 다른 하나는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호) HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호 및 EP 제0308936호) 제안되었다. 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 비롯한 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소가 디술피드 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 제작될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 포함된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 다수의 가교결합 기술과 함께, 적당한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
7) 이펙터 기능 조작
암의 치료에 있어 항체의 효능을 증강시키기 위해, 이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입하여 이 영역에서 사슬간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머 항체는 내부화(internalization) 능력이 개선되고(거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성 (ADCC)이 증대될 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med ., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol ., 148:2918-2922 (1992)] 참조. 또한, 문헌 [Wolff et al,. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 헤테로이관능성 가교결합제를 사용하여 항-종양 활성이 증대된 호모다이머 항체를 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조.
8) 면역컨쥬게이트
본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소(예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사선 동위원소 (즉, 방사선컨쥬게이트)와 컨쥬게이트 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다.
이러한 면역컨쥬게이트의 생성에 유용한 화학요법제로는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 아드리아마이신 및 5-플루오로우라실을 들 수 있다.
사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데크신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 샤란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오디드를 항체에 컨쥬게이트시키는 예시적인 킬레이트제이다 (WO 제94/11026호 참조). 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 분해성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992))가 이용될 수 있다.
추가로, 칼리케아마이신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 및 CC1065와 같은 작은 분자 독소가 또한 본 발명의 제형에 사용하기 위한 컨쥬게이션 가능한 독소로 예상된다. 일 실시태양에서, 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 1 이상의 메이탄시노이드 분자(예를 들면, 항체 분자 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄시노이드 분자)에 컨쥬게이션될 수 있다. 메이탄시노이드는 투불린 중합을 억제하는 것에 의해 작용하는 세포분열 억제제이다. 메이탄신, 메이탄시날 및 이의 유도체 및 유사체를 포함하는, 천연 공급원으로부터 단리되거나 또는 합성적으로 제조된 메이탄시노이드는 예를 들면, 미국 특허 제5,208,020호 및 본원에 인용된 참고문헌(칼럼 2, 제53행 내지 칼럼 3, 제10행 참조) 및 미국 특허 제3,896,111호 및 제4,151,042호에 기술되어 있다. 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 제조방법은 또한 미국 특허 제5,208,020호에 기술되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 메이탄시노이드는 디술피드 또는 다른 황-함유 링커기를 통하여 항체에 연결된다. 메이탄신은 예를 들면, May-SH3로 환원될 수 있는 May-SS-Me로 전환되고, 개질된 항체와 반응하여 메이탄시노이드-항체 면역컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]. 항체는 공지된 방법에 의해 개질될 수 있고, 유리 또는 보호된 티올기를 함유한 항체는 디술피드 함유 메이탄시노이드와 반응하여 컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은 시험관내 또는 생체내에서 공지된 방법 및 IC50 결정에 의해 측정될 수 있다.
칼리케아마이신은 다른 목적 면역컨쥬게이트이다. 칼리케아마이신 군의 항생제는 피코몰 이하 농도에서 이중 나선 DNA 파괴를 일으킬 수 있다. 이용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조 유사체는 γ1 1, α2 1, α3 1, N-아세틸-γ1 1, PSAG 및 θ1 1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993) 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)). 항체가 컨쥬게이트될 수 있는 다른 항-종양 약물은 항폴레이트인 QFA를 포함한다. 칼리케아마이신 및 QFA는 세포간 작용 부위를 가지고, 혈장 막을 용이하게 통과하지 않는다. 따라서, 항체 매개된 내재화를 통한 이들 약제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증가시킨다.
항체 및 뉴클레오분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들면, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 데옥시리보뉴클레아제, DNase) 간에 형성된 면역컨쥬게이트가 또한 예상된다.
항체는 또한 높은 방사활성 원자에 컨쥬게이션될 수 있다. 다양한 방사핵종이 방사컨쥬게이션된 항체의 제조를 위하여 이용가능한다. 예로는 At211, Bi212, I131, In131, Y90, Re186, Re188, Sm153, P32 및 Pb212 및 Lu의 방사활성 동위원소를 들 수 있다. 컨쥬게이트가 진단용으로 이용되는 경우, 이는 신티그램촬영 연구용 방사활성 원자(예: Tc99 또는 I123) 또는 핵 자기 공명(nmr) 영상화(또한, 자기 공명 영상화, mri로 알려짐)용 스핀 라벨, 예를 들면, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사- 또는 다른 라벨은 공지된 방법으로 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 불소-19를 제 위치에 또는 수소를 함유하는 적당한 아미노산 전구체를 이용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있거나 또는 생합성될 수 있다. Tc99 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 라벨은 펩티드 중 시스테인 잔기에 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착될 수 있다. 요도겐(IODOGEN
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) 방법을 이용하여 요오드-123을 혼입할 수 있다. 문헌[Fraker et al., Biohem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978)]. 방사뉴클리드를 컨쥬게이션하는 다른 방법은 문헌["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에 기술되어 있다.
별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 또는 컨쥬게이트의 요망되는 성질을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된 컨쥬게이트의 2 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 종양 예비표적화에 사용하기 위해서 항체를 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 컨쥬게이트시키고, 이 항체-수용체 컨쥬게이트를 대상체에게 투여한 다음, 제거제를 사용하여 순환계로부터 결합되지 않은 컨쥬게이트를 제거하고, 세포독성제 (예를 들어, 방사선뉴클레오티드)에 컨쥬게이트된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여할 수 있다.
9) 면역리포좀
본원에 개시된 항체는 면역리포좀으로 제형화할 수도 있다. "리포좀(liposome)"은 약물을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 소포이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc . Natl Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호]에 기재된 방법으로 제조된다. 증강된 순환시간을 가진 리포좀은 미국특허 제5,013,556호에 기술된다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법으로 생성될 수 있다. 규정된 세공 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드 상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 컨쥬게이트시킬 수 있다. 임의로, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신)를 리포좀 내에 함유시킬 수 있다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조.
10) 다른 항체 개질
항체의 다른 개질이 본원에서 예상된다. 예를 들면, 항체는 다양한 비단백성 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체) 중 하나에 연결될 수 있다. 항체는 또한 예를 들면, 코아세르베이션 기술에 의해서 또는 계면 중합에 의해서(예를 들면, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐) 제조되는 마이크로캡슐 중에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 중에, 또는 마이크로에멀젼 중에 봉입될 수 있다. 상기 기술 및 다른 적당한 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)]에 개시되어 있다.
C. 동결건조 제형
본원에 기술된 제형은 또한 재구성 동결건조 제형으로 제조될 수 있다. 본원에 기술된 단백질 또는 항체는 동결건조되고, 이어서 재구성되어 본 발명의 감소된-점도의 안정한 액체 제형을 생성한다 상기 특정 실시태양에서, 상기 기술된 바와 같은 목적 단백질의 제조 후, "전-동결건조 제형"이 생산된다. 전-동결건조 제형 중에 존재하는 단백질의 양은 목적하는 용량 부피, 투여 양식 등을 고려하여 결정된다. 예를 들면, 온전한 항체의 출발 농도는 약 2 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 바람직하게는 약 5 mg/ml 내지 약 40 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 20-30 mg/ml일 수 있다.
1) 동결건조 제형의 제조
제형화되는 단백질은 일반적으로 용액으로 존재한다. 예를 들면, 증가된 이온 강도의 본 발명의 감소된 점도 제형 중, 단백질은 약 4-8, 바람직하게는 약 5-7의 pH에서 pH-완충 용액 중에 존재할 수 있다. 완충액 농도는 예를 들면 완충액 및 제형(예; 재구성 제형)의 목적하는 탄력성에 따라서 약 1 mM 내지 약 20 mM, 별법으로는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 예시적 완충액 및(또는) 염은 제약적으로 허용가능한 것이고, 적당한 산, 염기 또는 이의 염, 예를 들면 "제약적으로 허용가능한" 산, 염기 또는 완충액 하에서 규정된 것들로부터 생성될 수 있다.
일 실시태양에서, 동결보호제가 전-동결건조 제형에 첨가된다. 전-동결건조 제형 중 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성함에 따라 얻은 제형이 등장성이 될 정도이다. 그러나, 고장성 재구성 제형이 또한 적당할 수 있다. 또한, 동결보호제의 양은 허용가능하지 양의 단백질의 분해.응집이 동결건조에 따라 발생할 정도로 낮은 양이어서는 안 된다. 그러나, 전-동결건조 제형 중 예시적 동결보호제의 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 별법으로 약 30 mM 내지 약 300 mM, 별법으로 약 50 mM 내지 약 100 mM이다. 예시적 동결보호제는 당 및 당 알콜, 예를 들면 수크로스, 만노스, 트레할로스, 글루코스, 소르비톨, 만니톨을 포함한다. 그러나, 구체적 환경하에서, 특정 동결보호제가 또한 제형의 점도 증가에 기여할 수 있다. 이와 같이, 상기 효과를 최소화 또는 중화하는 구체적 동결보호제를 선택하도록 주의를 기울여야 한다. 추가 동결보호제는 본원에서 또한 "제약적으로 허용가능한 당"으로 지칭하는, "동결보호제"의 정의 하에 상기 기술된 바와 같다.
단백질 대 동결보호제의 비는 각각의 구체적인 단백질 또는 항체 및 동결보호제 조합에 대하여 상이할 수 있다. 높은 단백질 농도는 갖는 등장성 재구성 제형을 생성하기 위한 선택 단백질로서의 항체 및 동결보호제로서의 당(예: 수크로스 또는 트레할로스)의 경우에, 동결보호제 대 항체의 비는 1 mole 항체에 대하여 약 100 내지 약 1500 mole 동결보호제, 바람직하게는 1 mole 항체에 대하여 약 200 내지 약 1000 mole 동결보호제, 예를 들면 1 mole 항체에 대하여 약 200 내지 약 600 mole 동결보호제일 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 계면활성제를 전-동결건조된 제형에 첨가할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 계면활성제가 동결건조 제형 및(또는) 재구성 제형에 첨가될 수 있다. 예시적 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트(예: 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴리옥사머(예: 폴록사머 188); 트리톤(Triton); 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리노레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리노레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인(예: 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일- 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUA(상품명) 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체(예: Pluronics, PF68 등)을 포함한다. 첨가되는 계면활성제의 양은 재구성된 단백질의 구체적 제형을 감소시키고, 재구성 후 입자의 형성을 최소화하는 양이다. 예를 들면, 계면활성제는 약 0.001-0.5%, 별법으로 약 0.005-0.05%의 양으로 전-동결건조된 제형 중에 존재할 수 있다.
동결보호제(예: 수크로스 및 트레할로스) 및 벌크제(bulking agent)(예를 들면 만니톨 또는 글리신)의 혼합물이 전-동결건조 제형의 제조에 사용될 수 있다. 벌크제는 과다한 포켓 없이 균일한 동결건조 케이크의 생산을 가능하게 할 수 있다. 다른 제약적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제, 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed. (1980)]에 기술된 것이 전-동결건조 제형 (및/또는 동결건조 제형 및/또는 재구성 제형) 중에 함유될 수 있고, 단 이들은 제형의 요망되는 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 추가 완충제; 보존제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 금속 복합체(예: Zn-단백질 복합체); 생분해성 중합체, 예를 들면 폴리에스테르; 및(또는) 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 구체적 적응증에 필요한 1종 보다 많은 단백질, 바람직하게는 다른 단백질에 부정적인 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들면, 단일 제형 중 요망되는 표적(예: 수용체 또는 항원)에 결합하는 2 이상의 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 단백질은 바람직하게는 의도하는 목적에 효과적인 양의 조합으로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성에 선행하여 또는 이어서 무균 여과 막을 통하여 여과하는 것에 의해 용이하게 달성된다. 별법으로, 완전 혼합물의 무균성은 단백질을 제외하고는 예를 들면, 약 120℃에서 약 30 분 동안 성분을 오토클레이브하는 것에 의해 달성될 수 있다.
단백질, 임의로 동결보호제 및 다른 임의 성분을 함께 혼합한 후, 제형을 동결건조한다. 많은 상이한 냉동-건조기가 상기 목적을 위하여 이용가능하고, 예를 들면 Hull50(상품명) (Hull, USA) 또는 GT20(상품명) (Leybold-Heraeus, Germany) 동결-건조기가 있다. 냉동-건조는 제형을 냉동시키고, 이어서 일차건조에 적당한온도에서 냉동된 성분으로부터 얼음을 승화시키는 것에 의해 달성된다. 상기 조건 하에서, 생성물 온도는 공융점 또는 제형의 붕괴 온도 이하이다. 통상적으로, 일차 건조를 위한 선반 온도는 적당한 압력(통상적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위)에서 약 -30 내지 25℃이다(단, 생성물은 일차 건조 도중에 냉동된 채로 남아있다). 제형, 샘플을 보유하는 용기(예: 유리 바이알)의 크기 및 유형, 및 액체의 부피가 건조에 요구되는 시간을 주로 지시할 수 있고, 몇 시간 내지 수 일(예: 40-60 시간)의 범위일 수 있다. 임의로, 생성물 중 원하는 잔류 습도 수준에 따라서 2차 건조 단계가 또한 수행될 수 있다. 일차적으로 용기의 유형 및 크기 및 이용되는 단백질의 유형에 따라서, 2차 건조가 수행되는 온도는 약 0-40℃ 범위이다. 예를 들면, 동결건조의 전체 수분 제거 상을 통한 선반 온도는 약 15-30℃(예: 약 20℃)일 수 있다. 2차 건조를 위하여 요구되는 시간 및 압력은 예를 들면, 온도 및 다른 변수에 따라서 적당한 동결건조 케이크를 생성하는 것일 수 있다. 2차 건조 시간은 생성물 중 요망되는 잔류 수분 수준에 의해 지시되고, 통상적으로 적어도 약 5 시간 (예: 10-15 시간)이 걸린다. 압력은 1차 건조 단계 도중에 이용된 것과 동일할 수 있다. 냉동-건조 조건은 제형 및 바이알 크기에 따라서 상이할 수 있다.
2. 동결건조 제형의 재구성
대상체에 대한 투여 전, 재구성 제형 중 단백질 농도가 적어도 약 50 mg/ml, 예를 들면 약 50 mg/ml 내지 약 400 mg/ml, 별법으로 약 80 mg/ml 내지 약 300 mg/ml, 별법으로 약 90 mg/ml 내지 약 150 mg/ml이도록 동결건조 제형이 제약적으로 허용가능한 희석액으로 재구성된다. 재구성 제형 중 상기 높은 단백질 농도는 재구성 제형의 피하 전달이 의도되는 경우 특히 유용한 것으로 여겨진다. 그러나, 다른 투여 경로, 예 Y 들면 정맥내 투여에 대하여, 재구성 제형 중 낮은 농도의 단백질이 바람직할 수 있다(예를 들면, 재구성 제형 중 약 5-50 mg/ml 또는 약 10-40 mg/ml 단백질). 특정 실시태양에서, 재구성 제형 중 단백질 농도는 전-동결건조 제형 중의 것보다 유의하게 높을 수 있다. 예를 들면, 재구성 제형 중 단백질 농도는 전-동결건조 제형의 것보다 약 2-40배, 별법으로 3-10배, 별법으로 3-6배(예를 들면 3배 이상 또는 4배 이상)일 수 있다.
비록 다른 온도가 요망되는 바에 따라서 이용될 수 있지만, 완전한 수화를 보장하도록 재구성은 일반적으로 약 25℃의 온도에서 일어난다. 재구성에 요구되는 시간은 예를 들면, 희석액의 종류, 부형제(들) 및 단백질의 양에 의존할 수 있다. 희석액의 예로는 무균수, 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection; BWFI), pH 완충 용액(예: 인산염-완충 식염수), 무균 식염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 들 수 있다. 희석액은 임의로 보존제를 함유할 수 있다. 예시적인 보존제는 상기 기술한 바 있으며, 방향족 알콜, 예를 들면 벤질 또는 페놀 알콜이 바람직한 보존제이다. 이용되는 보존제의 양은 단백질과의 상용성에 대한 상이한 보존제 농도를 평가하고 보존제 효능 시험에 의해 결정된다. 예를 들면, 보존제가 방향족 알콜(예: 벤질 알콜)인 경우, 이는 약 0.1-2.0%, 바람직하게는 약 0.5-1.5%, 가장 바람직하게는 약 1.0-1.2%의 양으로 존재할 수 있다.
바람직하게는, 재구성 제형은 크기 ≥10 ㎛인 바이알 당 6000 입자 미만을 갖는다.
D. 액체 제형
치료 제형은 요망되는 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 제약적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990])과 혼합하는 것에 의해 저장용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충액, 아스코르빈산, 메티오닌, 비타민 E, 나트륨 메타비술파이트를 비롯한 항산화제, 보존제, 등장화제, 안정화제, 금속 복합체(예: Zn-단백질 복합제), EDTA와 같은 킬레이트화제 및(또는) 비이온성 계면활성제를 포함한다.
치료제가 항체 단편인 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들면, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 유지하는 항체 단편 또는 나아가 펩티드 분자가 디자인될 수 있다. 상기 펩티드는 화학적으로 합성되고(되거나) 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다(예를 들면, 문헌[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 [1993] 참조).
완충액을 이용하여 특히 안정성이 pH 의존적인 경우 치료 유효성을 최적화하는 범위로 pH를 조절한다. 완충액은 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에 사용하기 위한 적당한 완충제는 유기 및 무기산 양자 모두 및 이의 염을 포함한다. 예를 들면, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트가 있다. 추가로, 완충액은 히스티딘 및 트리메틸아민염(예: 트리스)를 포함할 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위하여 첨가되고, 통상적으로 0.2% - 1.0% (w/v) 범위로 존재한다. 본 발명에 사용하기 위한 적당한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드(예: 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 벤제토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레솔을 포함한다.
때로는 "안정화제"로 알려진 등장화제는 액체 조성물의 등장성을 조정하거나 유지하기 위해 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 크고 하전된 생체분자를 이용하는 경우, 이들은 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하여 분자간 및 분자내 상호작용 가능성을 줄일 수 있기 때문에 종종 "안정화제"로 지칭된다. 등장화제는 다른 성분의 상대량을 고려하여, 0.1 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 내지 5%의 양으로 존재할 수 있다. 등장화제는 다가 당 알콜, 바람직하게는 삼가 또는 더 높은 당 알콜, 예를 들면 글리세린, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가 부형제는 다음 중 하나 이상으로 작용할 수 있는 약제를 포함한다: (1) 벌크화제, (2) 용해도 증강제, (3) 안정화제 및 (4) 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 방지하는 약제. 안정화제는 활성 단백질 또는 항체 중량 당 0.1 내지 10,000 부의 범위로 존재할 수 있다. 통상적 안정화제는 다음을 포함한다: 다가 당 알콜 (상기 열거한 것들); 아미노산, 예를 들면 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들면 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 마이오이니시토스, 마이오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 시클리톨(예: 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예를 들면 우레아, 글루타티온, 티옥틱산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 술페이트; 저분자량 단백질, 예를 들면 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 모노사카라이드(예: 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스); 디사카라이드(예: 락토스, 말토스, 수크로스); 트리사카라이드, 예를 들면 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들면 덱스트린 또는 덱스트란.
비이온성 계면활성제 또는 세제(또한 "습윤제"로 공지됨)는 치료제의 가용화를 보조하고, 치료 단백질을 진탕에 의해 유도되는 응집에 대해 보호하기 위해 존재한다(이는 또한 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 유발함이 없이 제형이 전단 표면 스트레스에 노출되는 것을 허용한다). 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재한다.
적당한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉(Pluronic
Figure 112005055918210-pct00007
) 폴리올, 트리톤(Triton
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), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (트윈(Tween)
Figure 112005055918210-pct00009
-20, 트윈
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-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 비이온성 세제는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.
제형을 생체내 투여용으로 사용하기 위하여서는, 무균이어야 한다. 제형은 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 무균으로 될 수 있다. 본원의 치료 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알 또는 정맥내 용액 백에 둔다.
투여 경로는 공지되고 허용되는 방법에 따르고, 예를 들면 단일 또는 다회 볼러스(bolus) 또는 장시간에 걸친 주입으로 적당한 방식, 예를 들면 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 손상내 또는 관절내 경로로의 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입에 의해서 또는 지속방출 또는 연장방출 방식이다.
본원의 제형은 또한 치료되는 구체적 적응증에 필요한 1종 보다 많은 활성 화합물, 바람직하게는 다른 것에 부정적인 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 조성물은 세포독성제, 사이토카인 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 바람직하게는 의도하는 목적에 효과적인 양의 조합으로 존재한다.
또한, 활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼 중에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 상기한 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition]에 개시되어 있다.
지속방출 제제가 제조될 수 있다. 지속방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 지속방출용 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론(rhIFN-), 인터류킨-2 및 MN rpg 120으로 성공적으로 수행된 바 있다. 문헌[Johnson et al., Nat. Med. 2:795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccine Using Polylactide Polyglycolide Micosphere Systems," in Vaccine Design; The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum and Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; 및 미국 특허 제5,654,010호].
상기 단백질의 지속방출 제형은 이의 생체상용성 및 넓은 범위의 생분해성 성질로 인하여 폴리 젖산-코글리콜산(PLGA)를 이용하여 개발될 수 있다. PLGA의 분해 생성물인 젖산 및 글리콜산은 인체 내에서 신속히 소실될 수 있다. 나아가, 상기 중합체의 분해성은 이의 분자량 및 조성에 따라서 몇 개월에서 몇 년까지 조정될 수 있다. 문헌[Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin and R. Langer (Eds.) pp. 1-41].
에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 한편, 특정 히드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 체내에 긴 시간 동안 남아있는 경우, 이들은 37℃에서 습도에 노출된 결과 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화를 가져올 수 있다. 관여하는 기전에 따라서 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들면, 응집 기전이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합인 것으로 밝혀진 경우, 술프히드릴 잔기를 개질하는 것, 산성 용액으부터 동결건조하는 것, 습기 함량을 조절하는 것, 적합한 첨가제를 사용하는 것, 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발하는 것에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
리포좀성 또는 프로테이노이드(proteinoid) 조성물이 또한 본원에 개시된 단백질 또는 항체를 제형화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,925,673호 및 제5,013,556호 참조.
본원에 기술된 단백질 및 항체의 안정성은 비독성 "수용성 다가 금속 염"의 사용을 통하여 증가될 수 있다. 예로는 Ca2 +, Mg2 +, Zn2 +, Fe2 +, Fe3 +, Cu2 +, Sn2 +, Sn4+, Al2 + 및 Al3 +를 포함한다. 상기한 다가 금속 양이온과 수용성 염을 형성할 수 있는 음이온의 예로는 무기산 및(또는) 유기산으로부터 형성된 것을 들 수 있다. 상기 수용성 염은 물 (20℃) 중에서 적어도 약 20 mg/ml, 별법으로 적어도 약 100 mg/ml, 별법으로 적어도 약 200 mg/ml의 용해도를 갖는다.
상기 "수용성 다가 금속염"을 형성하는데 사용될 수 있는 적당한 무기산은 염산, 아세트산, 황산, 질산, 티오시안산 및 인산을 포함한다. 사용될 수 있는 적당한 유기산은 지방족 카르복실산 및 방향족 산을 포함한다. 이러한 정의의 지방족 산은 포화 또는 불포화 C2 -9 카르복실산(예: 지방족 모노-, 디- 및 트리-카르복실산)으로 정의될 수 있다. 예를 들면, 이러한 정의내의 예시적 모노카르복실산은 포화 C2 -9 모노카르복실산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 에난트산, 카프릴산, 페라르곤산 및 카프리온산, 및 불포화 C2 -9 모노카르복실산, 아크릴산, 프로프리올산, 메타크릴산, 크로톤산 및 이소크로톤산을 포함한다. 예시적 디카르복실산은 포화 C2 -9 디카르복실산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산 및 피멜산을 포함하고, 불포화 C2 -9 디카르복실산은 말레산, 푸마르산, 시트라콘산 및 메사콘산을 포함한다. 예시적 트리카르복실산은 포화 C2 -9 트리카르복실산, 트리카르발릴산 및 1,2,3-부탄트리카르복실산을 포함한다. 추가로, 이러한 정의 카르복실산은 또한 1 또는 2개의 히드록실기를 포함하여 히드록시 카르복실산을 형성할 수 있다. 예시적 히드록시 카르복실산은 글리콜산, 젖산, 글리세르산, 타르트론산, 말산, 타르타르산 및 시트르산을 포함한다. 이러한 정의의 방향족 산은 벤조산 및 살리실산을 포함한다.
본 발명의 캡슐화 폴리펩티드를 안정화하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있는 통상적으로 이용되는 수용성 다가 금속 염은 예를 들면, (1) 할라이드(예: 아연 클로라이드, 칼슘 클로라이드), 술페이트, 니트레이트, 포스페이트 및 티오시아네이트의 무기산 금속 염, (2) 지방족 카르복실산 금속염(예: 칼슘 아세테이트, 아연 아세테이트, 칼슘 프로피오네이트, 아연 글리콜레이트, 칼슘 락테이트, 아연 락테이트 및 아연 타르트레이트), 및 (3) 벤조에이트(예: 아연 벤조에이트) 및 살리실레이트의 방향족 카르복실산 금속 염을 포함한다.
E. 치료 방법
질환의 예방 또는 치료를 위하여, 활성 약제의 적합한 용량은 상기 정의한 바와 같은 치료되는 질환의 유형, 질환의 심각도 및 경과, 상기 성분이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료법, 대상체의 임상 기록 및 약제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 의존할 수 있다. 상기 약제는 적합하게는 대상체에 1회 또는 일련의 치료로서 투여될 수 있다.
바람직한 치료 방법은 IgE-매개 장애의 치료이다. IgE-매개 장애는 많은 통상적인 자연 발생 흡입 및 섭취 항원에 대해 면역적으로 반응을 나타내는 유전적 성향 및 IgE 항체의 지속적 생산을 특징으로 하는 아토피 장애를 포함한다. 특정 아토피 장애는 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 및 알레르기성 위장관병증을 포함한다. 아토피 대상체는 종종 복수의 알레르기를 갖고, 이는 상기 대상체들이 화분, 진균(예: 곰팡이), 동물 및 곤충 파편 및 특정 식품을 비롯한 많은 환경 알레르기원에 대한 IgE 항체 및 이들로부터의 증후군을 갖는다는 것을 의미한다.
그러나, 증가된 IgE 수준과 연관된 장애는 유전적 (아토피) 병인으로 인한 것에 한정되지 않는다. IgE-매개된 것으로 나타나고 본 발명의 제형으로 치료가능한, 증가된 IgE 수준과 연관된 다른 장애는 과민증(예: 아나필락시 과민증), 습진, 두드러기, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 기생충성 질환, 과-IgE 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증(ataxia-telangiectasia), 위스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 흉선성 림프형성부전증, IgE 골수종 및 이색편-대-숙주 반응을 포함한다.
알레르기성 비염(또한 알레르기 코결절결막염 또는 건초열로 알려짐)은 흡입 알레르기원에 대한 아토피 반응의 가장 흔한 징후이고, 이의 심각도 및 지속은 종종 알레르기원에 대한 노출 강도 및 길이와 연관된다. 이는 임의의 연령에서 첫번째로 나타날 수 있는 만성 질환이나, 보통 개시는 아동기 또는 사춘기 도중이다. 통상적인 발병은 풍부한 맑은 콧물, 발작성 재채기, 코막힘, 및 코 및 구개의 가려움으로 이루어진다. 비후의 점막 배액은 또한 목 아픔, 목의 소해(throat clearing) 및 기침을 일으킨다. 또한, 결막 및 눈꺼풀의 강한 가려움, 발적, 눈물 및 눈부심을 수반하는 알레르기 눈꺼풀결막염의 증상이 있을 수 있다. 심각한 발병은 종종 전신적 권태감, 쇠약, 피로, 및 종종 강한 재채기 기간 후 근육 통종을 수반한다.
천식(또한 가역적 폐쇄성 기도 질환으로 알려짐)은 자발적으로 또는 치료를 이용하여 가역적인 쌕쌕거림, 호흡곤란, 흉부 조임 및 기침의 발병을 일으키는, 호흡기 자극원 및 기관지수축 화학물질에 대한 기관지기관계의 과반응증을 특징으로 한다. 이는 전체 기관이 관여하는 만성 질환이나, 간헐성 경증 일과성 에피소드부터 중증, 만성, 생명을 위협하는 기관지 폐쇄까지 심각도가 다양하다. 천식 및 아토피는 공존할 수 있으며, 천식의 약 반수만이 또한 아토피성이고, 더 작은 분율의 아토피 대상체가 또한 천식을 갖는다. 그러나, 천식은 비아토피 개인 중에서 보다 아토피 개인 중에서 더욱 흔하게 발생(특히 아동기 도중에)한다는 점에서 아토피 및 천식은 완전히 독립적이지 않다. 천식은 외인성 천식 및 내인성 천식의 2개의 하위군으로 역사적으로 더 나뉘어진다.
외인성 천식(또한 알레르기, 아토피 또는 면역성 천식으로 알려짐)은 일반적으로 생의 초기, 통상적으로 유아기 또는 아동기 도중에 천식을 발전시키는 대상체를 기술하는 것이다. 습진 또는 알레르기 비염을 비롯한 아토피의 다른 징후가 종종 공존한다. 천식성 발병은 화분(pollen) 계절 도중에, 동물의 존재하에서, 또는 집 먼지, 베개 깃털 또는 다른 알레르기원에 대한 노출시 발생할 수 있다. 피부 시험은 원인 알레르기원에 대해 양성 팽진-및-발적(wheal-and-flare) 반응을 나타낸다. 흥미롭게도, 총 혈청 IgE 농도가 종종 증가되나, 때로는 정상이다.
내인성 천식(또한 비알레르기 또는 특발성 천식으로 알려짐)은 통상적으로 (외견상) 호흡기 감염 후, 성인기 도중에 최초로 발생한다. 증상은 화분 계절 또는 다른 알레르기원에 대한 노출과 연관되지 않은 만성 또는 재발성 기관지 폐쇄를 포함한다. 피부 시험은 통상적 아토피 알레르기원에 대해 음성이고, 혈청 IgE 농도는 정상이다. 추가 증상은 혈액 가래 및 호산구증가증을 포함한다. 아스피린-민감성, 운동-유발성, 감염원성 및 심리성과 같은 천식을 하위군으로 분류하기 위한 다른 안은 단지 다른 사람들보다 특정 대상체들에 대해 더 영향을 미치는 외부 유발 인자를 정의한다.
마지막으로, 일부 분류법은 역사적으로 IgE 의존성을 갖는 알레르기성 천식과만 연관되어 있지만, 현재 IgE 및 천식(알레르기성 천식 및 비알레르기성 천식 모두) 간의 상관성을 나타내는 강한 통계적으로 유의한 데이터가 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 문헌[Chapter 27, "The Atopic Disease", A.I. Terr in Medical Immunology, 9th Ed., Simon and Schuster, Stites et al, Ed. (1997)]. 결과적으로, 상기 대상체 적용을 위한 용어 "IgE-매개 장애"는 알레르기성 및 비알레르기성 천식 모두를 포함한다.
천식의 물리적 징후는 빠른호흡, 들을 수 있는 쌕쌕거림 및 호흡의 보조 근육의 사용을 포함한다. 빠른 맥박 및 혈압 상승 또한 통상적으로 존재하고, 말초 혈액 및 비(nasal) 분비물 중 호산구의 수준이 증가한다. 폐 기능은 흐름 속도 및 1초 강제 날숨량(1 second forced expiratory volume; FEV1)의 감소를 나타낸다. 총 폐 용량 및 기능적 잔류 용량은 통상적으로 정상이거나 약간 증가하나, 극심한 기관지연축에서 감소할 수 있다.
천식의 병리는 초기 단계 및 후기 단계 반응으로 구분될 수 있다. 초기 단계는 평활근 수축, 부종 및 과다분비를 특징으로 하는 반면, 후기 단계 반응은 세포성 염증을 특징으로 한다. 천식은 감염(예: 바이러스 호흡기 감염), 생리적 인자(예: 운동, 과다호흡, 깊은 호흡, 정신적 인자), 대기 인자(예: 이산화황, 암모니아, 차가운 공기, 오존, 증류수 증기), 섭취물(예: 프로프라놀롤, 아스피린, 비스테로이드성 항염증 약물), 실험실 흡입제(예: 고장성 용액, 시트르산, 히스타민, 메타콜린, 프로스타글란딘 F2α) 및 직업상 흡입물(예: 이소시아네이트)를 비롯한 다양한 비특이적 유발물에 의해 유도될 수 있다. 알레르기성 천식을 일으키는 다른 추가의 직업상 또는 환경 알레르기원은 동물 생성물, 곤충 먼지, 해양 생물, 식물 생성물, 과일, 씨앗, 잎 및 화분(pollen), 유기 염료 및 잉크, 미생물제, 효소, 치료제, 살균제, 무기 및 유기 화학물질을 포함할 수 있다.
아토피성 피부염(또한 습진, 신경피부염, 아토피 습진 또는 베스니어 가려움발진(Besnier's prurigo)로 알려짐)은 아토피의 가족적 및 면역적 특질을 갖는 대상체 집단에 특이적인 통상적 만성 피부 장애이다. 주요 특질은 특정 부위에 대한 전방향성을 갖는 특징적인 대칭적으로 분포하는 피부 발진을 포함하는, 가려움성 피부 염증성 반응이다. 또한, B 림프구에 의한 빈번한 IgE의 과다생성이 있다. 아토피 피부염이 알레르기성 비염 및 천식 및 높은 IgE 수준과 연관되어 있기 때문에 아토피의 피하 형태로 분류되나, 피부염의 심각도는 피부 실험 상의 알레르기원에 대한 노출과 항상 연관이 있지는 않으며, (다른 알레르기 질환과 달리) 탈감작은 효과적인 치료가 아니다. 높은 혈청 IgE가 알레르기 천식의 진단의 확증인 반면, 정상 수준이 이를 배제하는 것은 아니다. 질환의 개시는 임의의 연령에서 발생할 수 있으며, 손상은 급성으로 홍반 부종성 구진 또는 비늘성 플라크(plaque with scaling)을 수반하기 시작한다. 가려움은 삼출 및 각질, 이어서 만성 태선화에 이른다. 세포 수준에서, 급성 손상은 부종성이고, 진피는 단핵세포, CD4 림프구로 침윤된다. 호중구, 호산구, 혈장 세포 및 호염구는 드물지만, 탈과립 비만세포가 존재한다. 만성 손상은 표피 증식, 각화과다증 및 이상각화증을 특징으로 하고, 진피는 단핵 세포, 랑게르한스 세포 및 비만 세포로 침윤된다. 작은 신경의 신경다발막의 관여를 비롯한 국소 부위의 섬유증이 또한 존재할 수 있다.
알레르기성 위장관병증(또한 호산성 위장관병증으로 알려짐)은 복수의 IgE 식품 민감성이 국소 위장관 점막 반응과 연관된 비통상적 아토피 소견이다. 이는 성인에는 드물지만, 유아에서는 더욱 통상적이나 일시적이다. 섭취된 식품 알레르기원이 공장 점막에서 국소 IgE 항체와 반응하였을 때의 상태 결과는 비만세포 매개체를 유리시키고, 식사 직후 위장관 증상을 일으킨다. 지속적 노출은 만성 염증을 일으켜서, 위장관 단백질 손상 및 과단백혈증 부종에 이른다. 염증을 일으킨 소장 점막을 통한 혈액 손실은 철 결핍 빈혈을 일으킬 정도로 상당할 수 있다. 알레르기 반응은 알레르기원 노출에 이어서 상부 위장관 점막에서 국소적으로 일어나지만, 알레르기원 회피로 해결된다.
아나필락시스 및 두드러기는 명백히 IgE-매개성이나, 이들은 유전적 결정물이 결여되어 있고, 아토피 개체에 대한 선입적애호가 없다. 아나필락시스는 다수의 기관계, 통상적으로 심혈관, 호흡기, 피하 및 위장관이 동시에 관여하는 급성의 일반화된 알레르기 반응이다. 반응은 면역적으로 매개되고, 대상이 미리 감작된 알레르기원에 노출됨에 따라 발생한다. 두드러기 및 혈관부종은 표재성 피부 혈액관 중의 히스타민 자극 수용체로부터 유래하는 물리적 부종, 홍반 및 가려움을 지칭하고, 전신성 아나필락시스의 특징적 피부 특성이다. 전신성 아나필락시스는 약물, 곤충 독 또는 식품으로 인한 복수의 기관에서의 동시적 IgE-매개 반응의 발생이다. 이는 알레르기원 유도성, 비만세포 로딩 IgE에 의해 급작스럽게 일어나고, 다양한 생명유지 기관의 기능에 깊고 생명을 위협하는 변화를 가져온다. 항상 동일 정도는 아닐지라도, 혈관 허탈(vascular collapse), 급성 기도 폐쇄, 피부 혈관확장 및 부종, 및 위장관 및 비뇨생식 근육 연축이 거의 동시에 발생한다.
아나필락시스의 병리는 혈관부종 및 과다팽창된 폐와 함께 기도의 점막 막힘 및 국소 무기폐(focal atelectasis)를 포함한다. 세포 수준에서, 폐는 급성 천식 발병 도중의 것과 유사하게 보이고, 기관 점막하 샘의 과다분비, 점막 및 점막하 부종, 기관지주위 혈관 울혈 및 기관벽의 호산구증을 갖는다. 폐 부종 및 출혈이 존재할 수 있다. 기관지 근육 연축, 과다침윤, 및 심지어 허파꽈리의 터짐이 또한 존재할 수 있다. 인간 아나필락시스의 중요 특성은 부종, 혈관 울혈, 및 후두, 기관, 후두개 및 하인두의 고유판에서의 호산구증가증이다.
알레르기원에 대한 노출은 섭취, 주사, 흡입, 또는 피부 또는 점막과의 접촉을 통한 것일 수 있다. 반응은 알레르기원에 대한 노출 수초 내지 수분 내에 시작한다. 초기의 싸움 또는 임박한 운명의 감각 및 이어서 심혈관, 호흡기, 피부 및 위장관의 1 이상의 표적 기관계에서의 증상이 급속히 수반될 수 있다.
아나필락시스의 원인인 알레르기원은 아토피와 통상적으로 연관된 것과 상이하다. 식품, 약물, 곤충 독 또는 라텍스가 통상적인 원천이다. 식품 알레르기원은 갑각류(crustacean), 패류(molusk)(예를 들면, 랍스터, 새우, 게), 생선, 콩류(예: 땅콩, 완두콩, 콩, 감초), 씨앗류(예: 참깨, 목화씨, 캐러웨이, 머스타르(mustar), 아마인, 해바리기), 견과류, 장과류(berries), 난백, 메밀 및 우유에서 발견되는 것을 포함한다. 약물 알레르기원은 이종 단백질 및 폴리펩티드, 폴리사카라이드 및 합텐성 약물에서 발견되는 것을 포함한다. 곤충 알레르기원은 꿀벌, 말벌(yellow jacket), 호넷(말벌, hornet), 와스프(말벌, wasp) 및 불개미를 비롯한 히메노프테라 (Hymenoptera) 곤충을 포함한다.
에피네프린이 아나필락시스에 대한 통상적 치료법이지만, 항히스타민 또는 다른 히스타민 차단제가 덜 심각한 두드러기 또는 혈관부종 반응에 통상적으로 처방된다.
F. 병용 요법
본 발명의 방법은 IgE-매개 장애에 대한 공지된 치료 방법과 병용하여 또는 추가 치료 단계로서 또는 추가 치료 제형 성분으로서 병용될 수 있다.
예를 들면, 항히스타민, 특히 비-진정성(non-sedating) 항히스타민이 본 발명의 항-IgE 항체 전에, 선행하여 또는 동반하여 투여될 수 있다. 적당한 항히스타민은 알킬아민(예: 클로르페니라민), 에탄올아민(예: 디페닐히드라민) 및 페노티아진(예: 프로메타진)계 항히스티민을 포함한다. 많은 항히스타민이 이펙터 세포 상의 수용체 부위를 봉쇄하는 것에 의해 히스타민의 약리학적 효과를 길항하나, 다른 통상적 항히스타민 약물은 감작되고 항원-특이성 IgE를 갖춘 비만 세포로부터의 히스타민 방출을 봉쇄하는 것에 의해 작동한다(예: 크로몰린 나트륨). 예시적 항히스타민은 아스테미졸, 아자타딘 말레에이트, 브로페니라민 말레에이트, 카르비녹사민 말레에이트, 세티리진 히드로클로라이드, 클레마스틴 푸마레이트, 사이프로헵타딘 히드로클로라이드, 덱스브롬페니라민 말레에이트, 덱스클로르페니라민 말레에이트, 디멘히드리네이트, 디펜히드라민 히드로클로라이드, 독실아민 숙시네이트, 펙소펜다딘 히드로클로라이드, 테르페나딘 히드로클로라이드, 히드록시진 히드로클로라이드, 로라티딘, 메클리진 히드로클로라이드, 트리펠란나민 시트레이트, 트리펠렌나민 히드로클로라이드, 트리프롤리딘 히드로클로라이드를 포함한다.
IgE-매개 장애의 구체적 증상(예: 조기 반응)은 교감신경모방제(sympathomimetics) 또는 기관확장 효과를 갖는 약물로 완화될 수 있다. 에피네프린은 종종 0.2-0.5 mL의 1:100 수용액의 용량을 피하 투여되는 광범위 작용 알파 및 베타-아드레날린제이다. 1:200 현탁액 중의 더 긴 작용 형태의 에피네프린(즉, 터부탈린)이 또한 더 긴 지속 효과가 요망되는 경우 사용된다. 적당한 추가 베타-아드레날린제는 비강(예를 들면, 휴대용 네뷸라이저, 간헐적 양압 흡입 장치 또는 정량 압축 흡입기) 또는 경구로 투여하기 위한 알부테롤, 피르부테롤, 메타프로테레놀, 살메테롤, 이소에타린 및 포르모테롤을 포함한다.
기관지확장은 또한 크산틴, 특히 상기 교감신경모방 약물과 병용하여 투여되는 경우의 크산틴의 투여를 통하여 달성될 수 있다. 예시적 크산틴은 아미노필린(iv. 250-500 mg) 및 테오필린 (경구, 10-20 ㎍/ml 혈장 농도)를 포함한다.
다양한 IgE-매개 장애(예를 들면, 후기상 반응)으로 인한 다른 증상은 당질코르티코이드 또는 항-염증성 효과를 갖는 다른 약물을 이용한 치료에 의해 약화될 수 있다. 프레드니손 (일일 30-60 mg)은 심각한 발병에 대해 전신적으로 투여되는 한편, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토니드 및 플루니솔라이드는 장기간 지속 치료법으로서 에어로솔화된 형태로 투여된다. 항-염증 효과를 갖는 추가 코르티코스테로이드는 베타메타손, 부데소나이드, 덱사메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 플루니솔라이드, 플루티카손 프로피오네이트, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론을 포함한다.
또한 본 발명의 치료 방법과 병용하여 사용될 수 있는 비스테로이드성 항염증 약물은 아세트아미노펜, 아스피린, 브롬페낙 나트륨, 디클로페낙 나트륨, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜 칼슘, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트 나트륨, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 나프록센 나트륨, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캄, 술릭닥, 톨메틴 나트륨을 포함한다.
추가로, 최대 치료 이익은 또한 비충혈제(예: 페닐에프린, 페닐프로판올아민, 슈도에파드린), 기침 저해제(예: 덱스트로메토르판, 코데인, 또는 히드로코돈) 또는 진통제(예: 아세트아미노펜, 아스피린)의 투여로 달성될 수 있다.
알레르기원 탈감작은 알레르기원이 알레르기 반응을 감소 또는 제거하기 위한 목적으로 대상체에 주사되는 치료 형태이다. 이는 또한 알레르기원 면역치료법, 저감작 또는 알레르기 주사 요법으로 알려져 있다. 이는 종종 다른 알레르기 치료법과 병용하여 사용되나, 일차 치료로는 흔히 사용되지 않는다. 이는 알레르기원 회피가 불가능한 경우 성공적으로 이용되어 왔다. 통상적 알레르기원 탈감작 치료법은 주사 부위에서 일시적으로 작은 국소 영역의 염증이 생성되는 용량에 이를 때까지 1주에 1회 또는 2회 용량을 증가시키면서 무균 알레르기원을 피하 주사하는 것을 포함한다. 이어서, 상기 용량이 매 2-4 주에 1회의 유지 스케쥴로 주어진다. 알레르기 탈감작은 알레르기성 천식 및 알레르기성 비염의 치료에 가장 자주 사용되지만, 이는 아나필락시스의 치료에도 성공을 거두어 왔다. 탈감작은 또한 미네랄 오일 중의 수성 항원의 에멀젼인 불완전 프로인트 애주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 같은 애주번트의 사용을 통하여 효과적으로 이용되어 왔다. 생리적 효과는 알레르기원 소적이 점진적으로 방출되는 불용성 액체 데포(depot)를 생성한다. 다른 형태의 알레르기원 탈감작은 단량체 알레르기원을 글루타르알데히드로 중합하여 상대적으로 낮은 알레르기원성(즉, 알레르기 반응을 일으키는 것)을 가지나 효과적인 정도의 면역원성을 유지하는 분자를 생성하는 것이다.
G. 약제학적 투여량
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 요망되는 약물 농도는 고려되는 특정 용도에 따라서 변화될 수 있다. 적합한 투여량 및 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료에 대한 효과적인 용량의 결정에 대한 신뢰가능한 지침을 제공한다. 유효량의 종간의 용량비교는 문헌[Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics." In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46]에 제시된 원칙에 따라 수행될 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드 또는 항체의 생체내 투여가 이용되는 경우, 정상 투여량은 투여 경로에 따라서 하루에 포유동물 체중의 약 10 ng/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 이상, 바람직하게는 1 mg/kg/일 또는 10 mg/kg/일로 변화될 수 있다. 구체적인 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌, 예를 들면 미국 특허 제4,657,760호, 제5,206,344호 또는 제5,225,212호에 제공된다. 상이한 제형이 상이한 치료법 및 상이한 장애에 효과적일 수 있으며, 특정 기관 또는 조직을 치료하기 위한 투여가 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 양식으로의 전달을 필요로 할 수 있다는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 나아가, 투여량은 1회 이상의 별개 투여에 의해서, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 상태에 따라서, 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여에 대하여, 치료는 요망되는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있다. 그러나, 다른 투여 계획이 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정법에 의해 용이하게 모니터링된다.
H. 제형의 투여
재구성된 제형을 포함하나 이에 한정되지 않는 본 발명의 제형은 단백질 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게, 공지된 방법에 따라서, 예를 들면 볼러스(bolus)와 같은 정맥내 투여, 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해서, 근육내, 복강내, 뇌척수액내, 피하, 관절내, 활액내, 낭내(intrathecal), 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해서 투여된다.
바람직한 실시태양에서, 상기 제형은 포유동물에게 피하(즉, 피부 아래) 투여에 의해 투여된다. 상기 목적을 위하여, 제형은 주사기를 이용하여 주사된다. 그러나, 주사 장치(예를 들면, Inject-easeTM 및 GenjectTM 장치); 주사기 펜(예를 들면, GenPenTM); 자동-주입기 장치, 무바늘 장치(예: MediJectorTM 및 BioJectorTM) 및 피하 패치 전달 시스템과 같은 상기 제형의 투여를 위한 다른 장치를 이용가능하다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 단일 용량 투여 단위를 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 단일 또는 복수 챔버의 미리 충전된 주사기를 비롯한, 치료 단백질 또는 항체의 수성 제형의 용기를 포함한다. 예시적 미리 충전된 주사기는 독일 라벤스버그 소재 베터 게엠베하(Vetter GmbH)로부터 입수가능하다.
단백질의 적합한 투여량("치료 유효량")은 예를 들면, 치료되는 상태, 상태의 심각도 및 경과, 단백질이 치료 또는 예방 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 대상체의 임상력 및 단백질에 대한 반응, 사용되는 단백질의 유형, 및 주치의의 판단에 의존할 수 있다. 단백질은 적합하게는 대상체에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐서 투여되고, 대상체에게 진단 이후 임의의 시점에 투여될 수 있다. 단백질은 단독 치료로서, 또는 문제되는 상태의 치료에 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.
선택 단백질이 항체인 경우, 예를 들면 1회 이상의 개별 투여에 의하여 약 0.1-20 mg/kg가 대상체에 대한 초기 후보 용량이다. 그러나, 다른 투여량의 계획이 유용할 수 있다. 상기 요법의 경과는 통상적인 기술에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다.
항-IgE 제형(예: rhuMAbE-25, rhMAbE-26, Hu-901)의 사용은 예를 들면, IgE-매개 알레르기 질환, 기생충 감염, 간질 방광염 및 천식의 치료 또는 예방을 포함한다. 치료되는 질환 또는 장애에 따라서, 항-IgE 항체의 치료 유효량(예를 들면, 약 1-15 mg/kg)가 대상체에게 투여된다.
I. 제품
본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 제형을 함유하는 제품이 제공되는데, 이는 그의 사용 설명서를 바람직하게 제공한다. 제품은 용기를 포함한다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이알(예: 이중 챔버 바이알), 주사기(예: 단일 또는 이중 챔버 주사기) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 재료로 형성될 수 있다. 용기는 제형, 및 용기 상의 또는 용기에 부속된 라벨을 보유하고, 용기는 재구성 및(또는) 사용 지침을 나타낼 수 있다. 라벨은 추가로 제형이 피하 투여에 유용하거나 피하 투여를 의도함을 나타낼 수 있다. 제형을 보유하는 용기는 재구성 제형의 반복 투여(예: 2-6회 투여)를 허용하는 다회 사용 바이알일 수 있다. 제품은 추가로 적당한 희석액(예: BWFI)을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 희석액 및 동결건조 제형과 혼합함에 따라 재구성된 제형 중 최종 단백질 농도는 일반적으로 50 mg/ml 이상일 수 있다. 제품은 추가로 다른 완충액, 희석액, 필터, 침, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 첨부문서를 비롯한 상용 및 사용자의 견지에서 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 충분히 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본원 개시내용에 걸친 모든 인용은 본원에 명시적으로 참고문헌으로 삽입된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 자동-주입기 장치로 투여하기 위한 본원에 기술된 제형을 포함하는 제품을 제공한다. 자동-주입기는 활성화됨에 따라서 함량을 대상체 또는 투여자로부터 추가 필요한 작용없이 전달할 수 있는 주사 장치로 기술될 수 있다. 이들은 특히 전달 속도가 일정하여야 하고, 전달 시간이 수 분 보다 긴 경우 치료 제형의 자동-투약에 특히 적합하다.
실시예 1
항- IgE rhu MAbE25 (" E25 ") 제형의 제조
모노클로날 항-IgE 항체 rhuMAbE25의 제형을 E25 벌크 잔류 로트 K9094A (40 mg/ml rhuMAb E25, 85 mM 트레할로스, 5 mM 히스티딘, pH 6, 0.01% 트윈 20) 또는 rhuMAbE25 Q-Pool (5 mg/ml rhuMAb E25, 25 mM 트리스, 200 mM NaCl)로부터 제조하였다.
rhuMAbE25의 수용액을 슬라이드-A-라이저 투석 카세트(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette; Pierce)를 이용하여 2-8℃에서 상이한 완충액(20 mM His-HCl 및 200 mM Arg-HCl, pH 6.0)으로 투석에 의해 제조하였다. 이어서, 샘플을 센트리콘(Centricon)-30 원심분리 마이크로농축기(Amicon)의 샘플 저장기로 전이하였다. 단백질을 요망되는 단백질 농도가 달성될 때 까지 4000-5000 g에서 센트리콘-3 농축기에서 회전시키는 것에 의해 농축하였다.
이어서, 샘플을 한외여과를 이용하여 ~150 mg/ml의 rhuMAb E25로 농축하였다. 트윈 20을 각 제제에 최종 농도 0.02%로 첨가하였다. 모든 제형을 여과하고 3 cc 포르마비트룸(FormaVitrum) 바이알로 무균 충전하였으며, 클래스 100 룸에서 13-mM 다이아쿄 스토퍼(Diakyo stopper)로 스토핑하였다.
실시예 2
방법 및 재료:
안정성 연구: 모든 제형을 클라스(Class) 100 무균 충전 스위트(suite)내에서 3 cc 포르마비트룸 유리 바이알에 1ml로 충전하고 13-mm 다이아쿄 스토퍼로 막았다. 바이알을 비광투과성 용기에 -70, 2-8, 15, 30 및 40 ℃에 넣었다.
교반 연구: 각 제형의 분취액을 유리 바이알에 넣었다. 바이알을 실온에서 글라스-콜 (Glas-Col) 벤치 탑 진탕기에서 수평으로 교반했다. 진탕기를 70, 암 길이를 30 cm (최대)로 설정했다. 교반 후, 샘플을 검사하고 하기 프로토콜에 따라 분석했다.
냉동-해동 연구: E25 샘플에 냉동-해동의 3 주기를 행했다. 각 주기는 밤새 -70 ℃에서 냉동한 후 실온에서 약 1시간 동안 해동함으로써 이루어졌다. 각 주기 후, 샘플을 액체의 색상 및 투명도를 평가하기 위해 라이트 박스를 이용해 시각적으로 검사했다. 탁도 및 가용성 응집물을 하기 프로토콜에 따라 측정했다.
분석 방법: 안정성 샘플을 표 1에 개요된 방법에 의해 분석했다.
분석 방법
검정법 목적
색상, 투명도, 외관a 액체 제형의 시각적 검사
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)b 단량체, 가용성 응집물 및 저분자량 성분%를 측정
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)c Asp-32 이성체화도 및 유리 티올의 측정
UV Spec 스캔 (중량측정)f 단백질 농도 측정
탁도 (평균 OD 340-360 nm)d 가용성 및 불용성 응집물의 측정
활성도e 항-IgE의 결합 활성 결정
a 색상, 외관 및 투명도에 대한 패스:
샘플의 색상, 외관 및 투명도는 검사체의 흰색 및 검은색 배경에 대비해 시각적으로 평가하고 음성 대조군의 동등 부피와 비교했다. 샘플을 균질한 혼합을 보장하기 위해 조심스럽게 와류시켜야 하지만, 공기 방울을 생성하도록 격렬해서는 안된다.
b 크기 배제 크로마토그래피:
TSK 슈퍼(SUPER) SW3000 (4.6 x 300 mm) 칼럼을 HP 1100 크로마토그래피 시스템에 사용했다. 칼럼을 20㎍ 단백질로 로딩하고 0.1 M 인산 칼륨, pH 6.8로 용리했다. 샘플을 UV 검출기에 의해 280 nm에서 측정했다.
c 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC):
HIC 실험을 HP 1100 액체 크로마토그래피 시스템상에서 TSK 페닐-5PW (7.5 x 75 mm) 칼럼 (TosoHaas)을 사용해 수행했다. 칼럼을 28㎍ 파파인 분해 Fab 단편으로 로딩하고 20 mM 트리스 완충액 중의 황산 암모늄 농도 구배 2 M 내지 0 M로 용리했다. 피크를 UV 검출기에 의해 210 nm에서 모니터링했다.
d 탁도:
샘플의 탁도를 1-cm 경로 길이 큐벳에서 HP 분광광도계를 사용해 결정했다. 탁도는 340-360 nm의 평균 흡광도로서 계산했다.
e항-IgE 모노클로날 항체의 활성을 수용체 결합 억제 검정법에 의해 결정했다. 인산 완충액, 0.5% BSA, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.01% 티메로솔을 함유하는 검정 희석액 중에 100 내지 1.56 ㎍/ml로 표준 곡선 범위내에 속하도록 샘플을 희석했다. 마이크로타이터 플레이트를 IgE 수용체로 코팅한 후 IgE-바이오틴 및 희석된 항-IgE 샘플로 인큐베이팅했다. 항-IgE 모노클로날 항체의 활성과 비례하는, 수용체에 결합한 IgE-바이오틴의 양을 스트렙타비딘-HRP을 사용해 측정했다. 데이터를 4-매개변수 로지스틱 곡선-피팅 프로그램을 사용해 분석했다.
f항체 농도를 1-cm 석영 큐벳터를 갖춘 휴렛 패커드 8453 다이오드 어레이 분광광도계 상에서 얻었다. 1.5 cm-1 (mg/ml)-1 흡광도를 사용해 농도를 계산했다.
액체 제형의 요약
제형 단백질 범위 완충액/범위 부형제/범위
80 mg/ml E25
50 mM 히스티딘-HCl
150 mM 트레할로스
0.05% 폴리소르베이트 20
pH 6.0		 40-150 mg/ml His-HCl 또는 His-아세테이트
범위:10 mM-100 mM		 트레할로스 또는 수크로스
당 범위: 20mM-350 mM
폴리소르베이트: 0.01%-0.1%
150 mg/ml E25
20 mM 히스티딘-HCl
200 mM ArgHCI
0.02% 폴리소르베이트 20
pH 6.0		 40-260 mg/ml His-HCl 또는 His-아세테이트
범위:10 mM-100 mM		 ArgHCI
범위: 50mM-200 mM
폴리소르베이트: 0.01%-0.1%
히스티딘 중의 150mg/ml E25 및 ArgHCl 제형의 안정성 데이터
온도 (℃) 시간 (개월) 시각 pH SECa
단량체 %		 HICb
주요부의 %		 효능C 탁도d
5 0
1
3
16		 패스
패스
패스
패스		 6.2
6.0
6.0
6.0		 99.0
99.2
99.3
98.9		 64
63
63
62		 106
100
111
83		 0.25
0.27
0.25
0.27
30 1
3
16		 패스
패스
패스		 5.9
6.1
6.0		 98.43
97.53
90.63		 54
42
19		 91
65
28		 0.25
0.30
0.54
히스티딘 중의 80mg/ml E25 및 트레할로스 제형의 안정성 데이터
온도 (℃) 시간 (개월) 시각 pH SECa
단량체 %		 HICb
주요부의 %		 효능C 탁도d
5 0
1
3
6
14
24		 패스
패스
패스
패스
패스
패스		 5.7
5.8
5.7
5.7
5.7
5.7		 99.1
98.7
98.8
99.1
99.0
98.8		 64
63
63
63
62
62		 100
92
124
97
83
84		 0.20
0.20
0.20
0.21
0.21
0.20
30 1
3
6
14		 패스
패스
패스
패스		 5.8
5.7
5.8
5.7		 98.7
97.4
95.5
93.1		 55
41
31
22		 77
76
48
30		 0.20
0.29
0.38
0.48
a. 가용성 응집물 및 단편을 측정하기 위한 크기 배제 크로마토그래피
b. 파파인 분해 E25에 대한 소수성 상호작용 크로마토그래피
c. IgE 수용체 결합 억제 검정법
d. 평균 OD (340-360nm)
교반 연구:
TO 3일 후 진탕
제형 시각 SEC(단량체 %) 탁도 시각 SEC(단량체 %) 탁도
1
2		 패스 99.5 0.18
패스 99.0 0.19		 패스 99.3 0.18
패스 99.4 0.19
제형 1: 156mg/ml E25, 200 mM ArgCl, 23 mM His, 0.02 % T20
제형 2: 150mg/ml E25, 182 mM ArgCl, 20 mM His, 0.02 % T20
냉동 해동 연구:
TO 1 주기 후 3 주기 후
제형 시각 SEC(단량체 %) 탁도 시각 SEC(단량체 %) 탁도 시각 SEC(단량체 %) 탁도
1
2		 패스 99.5 0.18
패스 99.0 0.19		 패스 99.3 0.17
패스 99.2 0.19		 패스 99.4 0.17
패스 99.2 0.18
제형 1: 156 mg/ml E25, 200 mM ArgCl, 23 mM His, 0.02 % T20
제형 2: 150 mg/ml E25, 182 mM ArgCl, 20 mM His, 0.02 % T20
실시예 3
항-IgE 모노클로날 항체 (E26) 액체 제형의 샘플을 20 mM 완충액에서 제조한 후 30 ℃ 및 40 ℃에서 저장했다. E26의 안정성을 크로마토그래피 및 활성 측정법에 의해 결정했다. 크기 배제 크로마토그래피를 가용성 응집물을 결정하기 위해 사용하고, 펩신 분해 샘플의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이성체화도를 측정하기 위해 사용했다. 샘플의 활성을 IgE 수용체 결합 억제 검정법을 사용해 모니터링했다. 도 1, 2 및 3에서와 같이, E26 분해는 완충액의 pH에 매우 의존한다. E26는 pH 6.0 근처에서 가장 안정한 것으로 보인다.
실시예 4
입자 제형은 스트레스 조건하에서 단백질의 농도가 증가함에 따라 증가하므로, 고농도 액체 제형의 제조에 주된 난관을 제공한다. 도 4는 농축된 E26 액체 제형의 교반 연구 결과를 보여준다. 제형을 pH 6.0에서 상이한 농도의 폴리소르베이트 20과 함께 20 mM 숙시네이트, 192 mM 트레할로스에서 제조했다. 입자 제형을 탁도 측정에 의해 모니터링했다. E26 용액의 탁도가 교반 시간에 따라 증가됨을 결과는 보여준다. 0.01% 이상의 폴리소르베이트 첨가는 스트레스 조건하에서 입자 형성을 감소시키는데 필수적이다. 유사한 결과를 또한 농축된 E25 액체 제형에 대해 관찰하였다.
실시예 5
도 5는 동결건조된 E25의 재구성에 의해 제조된 150 mg/ml E25의 액체 제형을 보여준다. 염 농도의 증가는 가역성 입자 형성을 억제하고 탁도 판독치를 감소케 한다. 모든 시험된 염 중에서, Arg-HCl와의 제형이 가장 최소의 탁도를 가진것으로 보인다. 염 농도의 탁도 판독치 감소 효과는 또한 TFF 방법을 사용해 제조된 E25에 대해서도 관찰되었다.
실시예 6
ArgHCl의 존재하 E25의 액체 제형은 또한 다른 액체 제형보다 양호한 안정성을 보인다. 도 6 및 7은 ArgHCl, CaCl2 및 MgCl2를 함유하는 액체 제형 중의 150mg/ml E25의 안정성 연구를 보여준다. 수크로스를 함유하거나 함유하지 않는 ArgHCl 함유 액체 제형에 대해, 탁도, 이성체화도 및 단편화의 측면에서 그의 안정성에 차이가 거의 없다. ArgHCl 함유 액체 제형은 CaCl2 및 MgCl2를 함유하는 제형보다 안정하다.
실시예 7
도 8은 아세테이트와의 E25 액체 제형 및 히스티딘 제형의 안정성 연구의 결과를 보여준다. 히스티딘과의 제형은 아세테이트 제형 보다 높은 pH를 가진다. 결과는 히스티딘, ArgHCl 액체 제형 중의 E25가 다른 조건하에서의 것보다 더 안정함을 명백히 보여주었다.
실시예 8
고농도의 E25는 시트레이트, 숙시네이트 및 술페이트와 같은 소정의 이온의 존재하에 특히 저장 온도 2-8℃에서 고형 겔을 형성할 수 있다 (표 I). 아르기닌-HCl을 부형제로서 사용함은 겔 또는 침전물 형성 없이 200mg/ml 초과까지의 E25를 제형화하도록 해준다.
다양한 부형제의 E25 겔화에 대한 125 mg/ml, pH~6.0에서의 효과
부형제 부형제
농도 MM		 제제 TO에서의 탁도(340-360nm) 항체 농도
mg/ml		 시각적 외관
SWFI Lyo Recon 0.21 125 투명
NaCl 188 Lyo Recon 0.25 125 투명
숙시네이트 94 Lyo Recon 0.31 125 겔
숙시네이트 19 Lyo Recon 0.28 125 겔
시트레이트 188 Lyo Recon 미결정 125 겔
시트레이트 19 Lyo Recon 미결정 125 겔
Na2S04 미결정 Lyo Recon 미결정 125 겔
Na2S04 미결정 Lyo Recon 미결정 125 불투명
포스페이트 미결정 Lyo Recon 미결정 125 불투명
아세테이트 188 Lyo Recon 미결정 125 투명
아세테이트 94 Lyo Recon 미결정 125 투명
아세테이트 19 Lyo Recon 미결정 125 투명
히스티딘 94 Lyo Recon 0.19 125 투명
히스티딘 47 Lyo Recon 0.24 125 투명
아르기닌-
HCl		 150 Lyo Recon 0.25 137 투명
아르기닌-
HCl		 200 TFF 0.19 162 투명
아르기닌-SO4 150 Lyo Recon 0.27 137 겔
CaCl2 125 TFF 0.32 147 투명
MgCl2 125 TFF 0.48 147 불투명
실시예 9
이. 콜라이에서의 단백질 또는 항체 발현
이 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합 발현에 의한 원하는 단백질 또는 항체의 글리코실화되지 않은 형태의 제조를 예시한다.
원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상에 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 함유하여야 한다. 각종 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적당한 벡터의 예는 암피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하는 pBR322 (이. 콜라이에서 유래; 문헌[Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)] 참조)이다. 벡터를 제한 효소로 절단하고, 탈인산화하였다. 그후 PCR 증폭된 서열을 벡터내로 결찰하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리His 리더 (처음의 6개의 STII 코돈, 폴리His 서열, 및 엔테로키나제 절단 부위 포함), 원하는 단백질 또는 항체 코딩 영역, 람다 전사 종결자, 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다. 또한, 벡터는 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 천연 서열 핵산의 비번역 5' 및 3' 영역의 상당 부분 이상을 포함할 수 있다.
그 후 결찰 혼합물을 사용하여 상기 문헌[Sambrook et al.]에 기재한 방법을 사용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환하였다. 형질전환체를 LB 플레이트 상에서 성장하는 그의 능력으로 확인하고, 그 후 항생제 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA는 제한 분석 및 DNA 서열분석으로 단리하고 확인할 수 있다.
선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 성장시켰다. 이어서 밤새 배양하여 보다 큰 규모 배양물을 접종하는데 사용하였다. 그 후 발현 프로모터가 켜지는 동안 세포를 바람직한 광학 밀도까지 성장시켰다.
세포를 추가의 몇 시간 동안 배양한 후, 세포를 원심분리에 의하여 수집하였다. 원심분리에 의하여 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 각종 약제를 사용하여 용해할 수 있고, 용해된 원하는 단백질 또는 항체를 예를들어 가용화 단백질 또는 항체에 단단하게 결합하도록 하는 조건하에서 금속 킬레이팅 칼럼을 사용하여 정제할 수 있었다.
원하는 단백질 또는 항체는 하기 과정을 이용해 폴리-His 태그 형태로 이. 콜라이에서 발현될 수 있다. 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상에 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위, 효율적이고 믿을 수 있는 번역 개시, 금속 킬레이션 칼럼 상의 신속한 정제 및 엔테로키나제로의 단백분해적 제거를 위한 다른 유용한 서열을 함유할 것이다. 그 후 PCR-증폭된 폴리-His 태그된 서열을 발현 벡터내로 결찰하고, 이를 사용하여 균주 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq))에 기초한 이. 콜라이 숙주를 형질전환하였다. 형질전환체를 처음에는 O.D.600이 3-5가 될 때까지 진탕하면서 30 ℃에서 50 mg/ml 카르베니실린를 함유하는 LB에서 성장시켰다. 그 후 배양물을 CRAP 배지 (3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g 소듐 시트레이트 ?2H20, 1.07 g KC1, 5.36 g 디프코 효모 (Difco yeast) 추출물, 5.36 g 쉬필드 하이케이스 (Sheffield hycase)SF (500 mL 물 중), 및 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55 % (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조)에 50-100 배 희석하고, 진탕하면서 30 ℃에서 대략 20-30 시간 동안 성장시켰다. SDS-PAGE 분석에 의하여 발현을 확인하기 위하여 샘플을 제거하였고, 벌크 배양물을 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 정제되고 리폴딩될 때까지 동결하였다.
0.5 내지 1 L 발효물 (6-10 g 펠렛)로부터의 이. 콜라이 페이스트를 7 M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 8 완충액 중에 10 부피 (w/v)로 재현탁하였다. 고체 소듐 술피트 및 소듐 테트라티오네이트를 각각 0.1 M 및 0.02 M 최종 농도가 되도록 첨가하고, 용액을 4 ℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계는 모든 시스테인 잔기가 술피톨화에 의하여 차단된 변성된 단백질을 야기하였다. 용액을 벡크만 초원심분리기 (Beckman Ultracentrifuge)에서 30 분 동안 40,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 3-5 부피의 금속 킬레이트 칼럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 7.4)로 희석하고, 0.22 마이크론 필터를 통하여 여과하여 정제하였다. 정제된 추출물을 금속 킬레이트 칼럼 완충액 중에서 평형화된 5 ml 키아겐 (Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 칼럼 상으로 로딩하였다. 칼럼을 50 mM 이미다졸 (칼바이오켐 (Calbiochem), Utrol grade)을 함유하는 추가의 완충액 (pH 7.4)로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액로 용리하였다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 합치고, 4 ℃에서 보관하였다. 단백질 농도를, 그의 아미노산 서열에 기초해 계산된 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 그의 흡광도에 의하여 추정하였다.
단백질을 샘플을 천천히 하기로 이루어진 신선하게 제조된 리폴딩 완충액로 희석하여 리폴딩하였다: 20 mM 트리스, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA. 리폴딩 부피를 최종 단백질 농도가 50 내지 100 μg/ml가 되도록 선택하였다. 리폴딩 용액을 4 ℃에서 12-36 시간 동안 부드럽게 교반하였다. 최종 농도 0.4 % (대략 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 켄칭하였다. 단백질을 추가로 정제하기 전에, 용액을 0.22 마이크론 필터를 통하여 여과하고, 아세토니트릴을 2-10 % 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 리폴딩된 단백질을 아세토니트릴 10 내지 80 %의 구배로 용리하여 0.1 % TFA 이동성 완충액을 사용하여 포로스 (Poros) R1/H 역상 칼럼 상에서 크로마토그래프하였다. A280 흡광도를 갖는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하고, 균질하게 리폴딩된 단백질을 함유하는 분획을 합쳤다. 일반적으로, 대부분의 단백질의 적당하게 리폴딩된 종은, 이들 종이 역상 수지와의 상호작용으로부터 차폐된 그의 소수성 내측과 가장 치밀하기 때문에 아세토니트릴의 최저의 농도에서 용리하였다. 응집된 종은 보통 보다 높은 아세토니트릴 농도에서 용리하였다. 원하는 형태로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리하는 것 이외에, 역상 단계는 또한 샘플로부터 내독소를 제거한다.
각각 바람직하게 폴딩된 원하는 단백질 또는 항체를 함유하는 분획을 합치고, 아세토니트릴을 용액 방향의 부드러운 질소 기류를 사용하여 제거하였다. 단백질을 제형 완충액 중에서 평형화되고 무균 여과된 G25 수퍼파인 (Superfine) (파마시아 (Pharmacia)) 수지를 사용하여 겔 여과에 의하여 또는 투석에 의하여 0.14 M 염화 나트륨 및 4% 만니톨을 갖는 20 mM Hepes (pH 6.8)내로 제형화하였다.
실시예 10
포유동물 세포 중의 단백질 또는 항체의 발현
이 실시예는 포유동물 세포의 재조합 발현에 의한 원하는 단백질 또는 항체의 잠재적으로 글리코실화 형태의 제조를 예시한다.
벡터 pRK5 (1989년 3월 15일에 출판된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로서 사용하였다. 임의적으로, 상기 문헌[Sambrook et al.]에 기재된 것과 같은 결찰 방법을 사용하여 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 삽입하도록 하는 선택된 제한 효소로 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 pRK5내에 결찰하였다.
한 실시태양에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 우태아 혈청 및 임의로 영양 성분 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM과 같은 배지 중에서 조직 배양 플레이트에서 콘플루언스까지 성장시켰다. pRK5내로 결찰된 약 10 μg의 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 VA RNA 유전자 [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)]를 코딩하는 약 1 μg DNA와 혼합하고, 500 ㎕의 1 mM 트리스-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl2에 용해하였다. 이 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaP04를 적가하고, 침전물을 10 분 동안 25 ℃에서 형성시켰다. 침전물을 현탁하고, 293 세포에 첨가하고, 약 4 시간 동안 37 ℃에서 정치하였다. 배양 배지를 흡인해내고, PBS 중의 20 % 글리세롤 2 ml을 30 초 동안 첨가하였다. 그 후 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 약 5 일 동안 인큐베이션하였다.
트랜스펙션 대략 24 시간 후에, 배양 배지를 제거하고, 배양 배지 (단독) 또는 200 μCi/ml 35S-시스테인 및 200 μCi/ml 35S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 교체하였다. 인큐베이션 12 시간 후에, 조절된 배지를 수집하고, 스핀 필터 상에서 농축하고, 15 % SDS 겔 상으로 로딩하였다. 처리된 겔을 건조하고, 원하는 단백질 또는 항체의 존재를 밝히는 선택된 시간 동안 필름에 노출시킬 수 있다. 트랜스펙션된 세포를 함유하는 배양물을 추가 인큐베이션할 수 있고 (무혈청 배지), 배지를 선택된 생물학적 검정법으로 시험하였다.
다른 기법에서, 원하는 단백질 또는 항체를 문헌[Somparyrac et al., Proc . Natl . Acad . Sci, 12: 7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 일시적으로 293 세포로 도입할 수 있었다. 293 세포를 스피너 플라스크에서 최대 밀도로 성장시키고, pRK5내로 결찰된 700 μg의 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 첨가하였다. 세포를 처음에 원심분리에 의하여 스피너 플라스크로부터 농축시키고, PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포에 90 초 동안 20 % 글리세롤을 처리하고, 조직 배양 배지로 세척하고, 조직 배양 배지, 5 μg/ml 소 인슐린 및 0.1 μg/ml 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크로 다시 도입하였다. 약 4일 후, 조절된 배지를 원심분리하고, 세포 및 파편을 제거하기 위하여 여과하였다. 그 후, 발현된 원하는 단백질 또는 항체를 함유하는 샘플을 농축하고, 임의의 선택된 방법, 예를 들어 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피로 정제할 수 있었다.
다른 실시태양에서, 원하는 단백질 또는 항체를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5내로 결찰된 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 CaP04 또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포에 트랜스펙션할 수 있었다. 앞서 기재한 바와 같이, 세포 배양물을 인큐베이션하고, 배지를 배양 배지 (단독) 또는 35S-메티오닌과 같은 방사성 표지를 함유하는 배지로 교체할 수 있었다. 원하는 단백질 또는 항체의 존재를 결정한 후에, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있었다. 바람직하게는, 배양을 약 6 일 동안 인큐베이션하고, 그 후 조절된 배지를 수집하였다. 그 후 발현된 원하는 단백질 또는 항체를 함유하는 배지를 임의의 선택된 방법으로 농축하고 정제할 수 있었다.
에피토프-태그된 원하는 단백질 또는 항체의 변이체를 또한 숙주 CHO 세포에서 발현시킬 수 있었다. pRK5내로 결찰된 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를 pRK5 벡터로부터 밖으로 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입체는 PCR을 거쳐 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그와 동일한 프레임으로 바큘로바이러스 발현 벡터내로 융합될 수 있었다. 그 후, 폴리-His 태그된 원하는 단백질 또는 항체 삽입체를 코딩하는 DNA는 안정한 클론을 선택하기 위한 DHFR과 같은 선택 마커를 함유하는 SV40 구동 벡터내로 서브클로닝될 수 있었다. 결국, CHO 세포는 (상기와 같이) SV40 구동 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 발현을 확인하기 위하여 상기와 같이 표지를 수행할 수 있다. 그 후, 발현된 폴리-His 태그된 원하는 단백질 또는 항체를 함유하는 배양 배지를 농축하고 임의의 선택된 방법, 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화도 크로마토그래피로 정제할 수 있었다.
원하는 단백질 또는 항체를 일시적 발현 과정에 의해 CHO 및(또는) COS 세포에서, 또는 기타 안정한 발현 과정에 의하여 CHO 세포에서 발현할 수 있다.
CHO 세포에서의 안정한 발현은 하기 과정을 사용하여 수행하였다. 단백질을 IgG 제작물 (면역어드헤신)으로서 발현하였고, 여기서 각각 단백질의 가용성 형태 (예를 들어, 세포외 도메인)을 위한 코딩 서열을 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 함유하는 IgGl 불변 영역 서열으로 및(또는) 폴리-His 태그된 형태로서 융합하였다.
PCR 증폭 후에, 각각의 DNA를 문헌[Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 기법을 사용하여 CHO 발현 벡터내로 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터를 cDNA의 편리한 왕복을 가능하게 하는 목적 DNA의 상용성 제한 부위 5' 및 3'을 갖도록 제작하였다. CHO 세포에서의 발현을 위하여 여기서 사용되는 벡터는 문헌[Lucas et al., Nucl . Acids Res. 24: 9 1774-1779 (1996)]에 기재된 바와 같고, 목적 cDNA 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)의 발현을 구동하는 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현은 트랜스펙션에 따른 플라스미드의 안정한 유지를 위한 선택을 가능하게 한다.
12 μg의 바람직한 플라스미드 DNA를 시판되는 트랜스펙션 시약 수퍼펙트？ (Superfect？) (키아겐), 도스퍼？ (Dosper？) 또는 푸겐？ (Fugen？) (베링거 만하임 (Boehringer Mannheim))을 사용하여 약 1,000만 개의 CHO 세포로 도입하였다. 세포를 상기 문헌[Lucas et al.]에 기재한 바와 같이 성장시켰다. 대략 3 x 107개의 세포를 추가의 성장 및 생산을 위하여 하기와 같이 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 함유하는 앰플을 수조에 위치시켜 해동하고, 와류에 의하여 혼합하였다. 함량을 10 mL의 배지를 함유하는 원심분리 튜브내로 피펫팅하고, 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 흡인하고, 세포를 10 mL의 선택성 배지 (5 % 우태아 혈청을 0.2㎛ 투석여과한 0.2㎛ 여과된 PS20) 중에 재현탁하였다. 그 후 세포를 90 mL의 선택성 배지를 함유하는 100 mL 스피너내로 분취하였다. 1-2일 후, 세포를 150 mL 선택성 성장 배지로 채운 250 mL 스피너로 이동시키고, 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 또다른 2-3일 후에, 250 mL, 500 mL 및 2000 mL 스피너를 3 x 105 세포/mL로 시딩하였다. 세포 배지를 생산 배지 중에 원심분리하고 재현탁함으로써 신선한 배지로 교환하였다. 임의의 적당한 CHO 배지를 사용할 수 있지만, 1992년 6월 16일에 등록된 미국 특허 제5,122,469호에 기재된 생산 배지를 실제로 사용하였다. 3L 생산 스피너에 1.2 x 106 세포/mL로 시딩하였다. 제0일에, 세포 수 및 pH를 측정하였다. 제1일에, 스피너를 채취하고, 여과된 공기로 살포를 시작하였다. 제2일에, 스피너를 채취하고, 온도를 33℃로 이동시키고, 30 mL의 500 g/L 글루코스 및 0.6 mL의 10 % 거품억제제 (antifoam) (예를 들어, 35% 폴리디메틸실록산 에멀젼, 다우 코닝 (Dow Corning) 365 의료 등급 (Medical Grade) 에멀젼)을 가하였다. 생산을 통하여, 필요한 경우 pH를 약 7.2로 유지하도록 조절하였다. 10일 후에 또는 생육성이 70 % 미만으로 떨어졌을 때, 세포 배양물을 원심분리에 의하여 수집하고, 0.22㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 여과물을 4℃에서 보관하거나, 정제를 위하여 칼럼 상으로 즉시 로딩하였다.
폴리-His 태그된 제작물에 있어서, 단백질을 Ni-NTA 칼럼 (키아겐)을 사용하여 정제하였다. 정제하기 전에, 이미다졸을 5 mM 농도가 되도록 조절된 배지에 첨가하였다. 조절된 배지를 4 ℃에서 4-5 ml/분의 유속으로 20 mM Hepes (pH 7.4) 완충액 (0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 완충액)에 평형된 6 ml Ni-NTA 칼럼 상으로 펌핑하였다. 로딩 후에, 칼럼을 추가의 평형 완충액로 세척하고, 단백질을 0.25 M 이미다졸을 함유하는 평형 완충액로 용리하였다. 고도로 정제된 단백질을 이어서 25 ml G25 수퍼파인 (파마시아) 칼럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH 6.8)로 탈염하고, -80℃에서 보관하였다.
면역어드헤신 (Fc 함유) 제작물을 이하와 같이 조절된 배지로부터 정제하였다. 조절된 배지를 20 mM Na 포스페이트 완충액 (pH 6.8) 중에서 평형된 5 ml 단백질 A 칼럼 (파마시아) 상으로 펌핑하였다. 로딩 후에, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용리하기 전에 평형 완충액으로 칼럼을 철저히 세척하였다. 1 ml 분획을 275 ㎕의 1 M 트리스 완충액 (pH 9)을 함유하는 튜브로 수집함으로써 용리된 단백질을 즉시 중화하였다. 고도로 정제된 단백질을 이어서 상기와 같이 폴리-His 태그된 단백질에 대하여 저장 완충액로 탈염하였다. 균질성을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 및 에드만 분해 (Edman degradation)에 의한 N-말단 아미노산 서열분석에 의하여 측정하였다.
실시예 11
효모에서의 단백질 또는 항체의 발현
하기 방법은 효모에서의 원하는 단백질 또는 항체의 재조합 발현을 기재한다.
첫째로, 효모 발현 벡터를 원하는 단백질 또는 항체의 세포내 생산 또는 분비를 위하여 ADH2/GAPDH 프로모터로부터 제작하였다. 원하는 단백질 또는 항체 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 세포내 발현을 지시하는 선택된 플라스미드 중에서 적당한 제한 효소 부위로 삽입하였다. 분비를 위하여, 원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 DNA를, 원하는 단백질 또는 항체의 발현을 위한 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 신호 펩티드 또는 기타 포유동물 신호 펩티드, 예를 들면 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 및 링커 서열 (필요한 경우)를 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드내로 클로닝할 수 있었다.
그 후 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110를 상기 발현 플라스미드로 형질전환할 수 있고, 선택된 발효 배지 중에서 배양하였다. 형질전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전 및 SDS-PAGE에 의한 분리, 이어서 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) 염색으로 겔을 염색함으로써 분석할 수 있었다.
재조합 단백질 또는 항체를 이어서 단리하고, 발효 배지로부터 효모 세포를 원심분리에 의하여 제거함으로써 정제하고, 그 후 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축할 수 있었다. 재조합 단백질 또는 항체를 함유하는 농축물을 추가로 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 정제할 수 있었다.
실시예 12
바큘로바이러스 -감염된 곤충 세포에서 단백질 또는 항체의 발현
하기 방법은 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포에서 원하는 단백질 또는 항체의 재조합 발현을 기재한다.
원하는 단백질 또는 항체를 코딩하는 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터내에 함유된 에피토프 태그의 상류와 융합하였다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 면역글로불린 태그 (예를 들어 IgG의 Fc 영역)를 포함한다. pVL1393 (노바겐 (Novagen))과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래된 플라스미드를 포함하는 각종 플라스미드를 사용할 수 있다. 요약하면, 단백질 또는 항체의 원하는 부분 (예를 들어 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외에 존재하는 경우 성숙 단백질을 코딩하는 서열)을 코딩하는 DNA를 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머로 PCR에 의하여 증폭하였다. 5' 프라이머에 플랭킹 (선택된) 제한 효소 부위를 도입할 수 있었다. 그 후 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하고, 발현 벡터내로 서브클로닝하였다.
재조합 바큘로바이러스를 상기 플라스미드 및 BACULOGOLDTM 바이러스 DNA (파르밍겐 (Pharmingen))를 리포펙틴 (GIBCO-BRL에서 시판)을 사용하여 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포(ATCC CRL 1711)내로 공동-트랜스펙션하여 생성하였다. 28 ℃에서 4-5일 동안 인큐베이션한 후에, 유리된 바이러스를 수집하고, 추가 증폭을 위하여 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현을 문헌[O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
그 후 발현된 폴리-His 태그된 단백질 또는 항체를 예를 들어 하기와 같은 Ni2+-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의하여 정제할 수 있었다. 추출물을 문헌[Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993)]에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조하였다. 요약하여, Sf9 세포를 세척하고, 초음파처리 완충액 (25 mL Hepes (pH 7.9); 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10 % 글리세롤; 0.1 % NP-40; 0.4 M KCl)중에서 재현탁하고, 얼음 상에서 20 초 동안 2 회 초음파처리하였다. 초음파처리물을 원심분리에 의하여 맑게하고, 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10 % 글리세롤, pH 7.8)에서 50 배 희석하고, 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. Ni2 +-NTA 아가로오스 칼럼 (키아겐에서 시판)은 5 ml의 베드 부피로 준비하고, 25 mL의 물로 세척하고, 25 mL의 로딩 완충액로 평형화하였다. 여과된 세포 추출물을 분 당 0.5 mL로 칼럼 상으로 로딩하였다. 칼럼을 로딩 완충액로 기준선 A280까지 세척한 후 분획 수집을 시작하였다. 다음으로, 비특이적 결합 단백질을 용리하는 제2 세척 완충액 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10 % 글리세롤, pH 6.0)로 칼럼을 세척하였다. 다시 A280 기준선에 도달한 후에, 칼럼을 제2 세척 완충액 중에서 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개하였다. 1 mL의 분획을 수집하고 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리 포스파타제 (키아겐)에 컨쥬게이션된 Ni2 +-NTA로의 웨스턴 블로팅에 의하여 분석하였다. 용리된 His10-태그된 단백질 또는 항체를 함유하는 분획을 합치고, 로딩 완충액에 대하여 투석하였다.
다르게는, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) 단백질 또는 항체의 정제를 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 크로마토그래피를 비롯한 공지된 크로마토그래피 기법을 사용하여 수행할 수 있었다.
실시예 13
항체의 제조
이 실시예는 관심대상인 단백질 또는 원하는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 예시한다.
모노클로날 항체의 생산 기법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 상기 [Goding]에 기재되었다. 사용될 수 있는 면역원은 정제된 원하는 단백질 또는 표적 항체, 원하는 단백질 또는 표적 항원을 함유하는 융합 단백질, 및 세포 표면 상에 재조합 단백질 또는 항원을 발현하는 세포를 포함한다. 면역원의 선택은 과도한 실험 없이 당업자에 의하여 이루어질 수 있다.
BALB/c와 같은 마우스를 완전 프로인트 애주번트에 에멀젼화한 원하는 단백질 또는 표적 항원 면역원으로 면역화하고, 1-100 μg의 양으로 피하 또는 복강내 주사하였다. 다르게는, 면역원을 MPL-TDM 애주번트 (리비 이뮤노케미칼 리서치 (Ribi Immunochemical Research), 몬타나주, 해밀턴) 중에서 에멀젼화하고, 동물의 뒷발 패드로 주사하였다. 그 후, 면역화된 마우스를 선택된 애주번트 중에 에멀젼화된 추가의 면역원으로 10 내지 12 일 후에 재면역화했다. 그 후, 몇 주 후에, 마우스를 또한 추가의 면역화 주사로 재면역화시킬 수 있다. 원하는 단백질 또는 항원에 대한 항체를 검출하기 위하여 ELISA 검정법에서 시험하기 위하여 마우스로부터 혈청 샘플을 후안구 출혈에 의하여 주기적으로 얻을 수 있다.
적절한 항체 역가를 검출한 후에, 항체에 대하여 "양성"인 동물에 원하는 단백질 또는 표적 항원을 최종 정맥내 주사로 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후에, 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 수집하였다. 그 후 비장 세포를 P3X63AgU.1 (ATCC, No. CRL 1597로부터 얻을 수 있음)와 같은 선택된 마우스 골수종 세포주에 융합하였다 (35 % 폴리에틸렌 글리콜을 사용). 융합은 그 후에 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제하기 위하여 HAT (히포크잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅 할 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
하이브리도마 세포를 원하는 단백질 또는 표적 항원에 대한 반응성에 대하여 ELISA에서 스크리닝할 수 있다. 상기 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 것은 당업자의 능력 내이다.
양성 하이브리도마 세포를 상기 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 생산하기 위하여 동종 BALB/c 마우스로 복강내 주사할 수 있다. 다르게는, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 성장시킬 수 있다. 복수에서 생산된 모노클로날 항체의 정제는 암모늄 술페이트 침전, 이어서 겔 배제 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다. 다르게는, 단백질 A 또는 단백질 G에의 항체의 결합에 기초한 친화도 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
실시예 14
특이 항체를 이용한 원하는 단백질의 정제
천연 또는 재조합 형태의 원하는 단백질은 단백질 정제 업계의 다양한 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 원하는 단백질의 프로-폴리펩티드, 성숙 폴리펩티드, 또는 전구-폴리펩티드 형태가 원하는 단백질에 특이한 항체를 사용해 면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 일반적으로, 면역친화도 칼럼은 원하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 활성 크로마토그래피 수지에 공유적으로 결합시켜 제작했다.
폴리클로날 면역글로불린을 황산 암모늄과의 침전 또는 고정화 단백질 A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) 상의 정제에 의해 면역 혈청으로부터 제조했다. 유사하게, 모노클로날 항체를 황산 암모늄 침전 또는 고정화 단백질 A 상의 크로마토그래피에 의해 마우스의 복수액(ascites fluid)으로부터 제조했다. 부분적으로 정제된 면역글로불린을 CnBr-활성화 SEPHAROSETM (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유적으로 결합했다. 항체를 수지에 결합시키고, 수지를 차단하며, 유도체 수지를 제조자 지시에 따라 세척했다.
원하는 단백질을 가용성 형태로 발현하는 세포 분획을 제조하여, 상기 면역친화도 칼럼을 원하는 단백질의 정제에 사용했다. 세제의 첨가 또는 기타 업계에 잘 알려진 방법에 의해 편차 원심분리를 통해 얻어진 세포내 분획 또는 전체 세포를 가용화하여 상기 제조물을 유도했다. 별법적으로, 신호 서열을 함유하는 가용성 단백질을 세포가 성장한 배지내로 유용한 양으로 배출할 수 있다.
원하는 단백질을 함유하는 가용화 제조물을 면역친화도 칼럼상에 통과시키고, 칼럼을 원하는 단백질의 바람직한 흡광도를 부여하는 조건하에서 세척했다(예를 들면, 세제 존재하의 고 이온 강도 완충액). 그 후, 칼럼을 항체의 단백질에의 결합을 붕괴하는 조건하에 용리하고 (예를 들면, 낮은 pH 완충액, 예를 들면 대략 pH 2-3, 또는 고 농도의 케오트로프(chaotrope), 예를 들면 우레아 또는 티오시아네이트 이온), 원하는 단백질을 그 후 수거했다.
Sequence Listing <110> Genentech, Inc. <120> High Concentration Antibody and Protein Formulations <130> P2026R1-PCT <140> PCT/US2004/009613 <141> 2004-03-29 <150> US 60/460,659 <151> 2003-04-04 <160> 6 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> E25, light chain <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp 20 25 30 Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 2 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> E26, light chain <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly 95 100 105 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 115 120 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 125 130 135 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 140 145 150 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 155 160 165 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 185 190 195 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 200 205 210 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hu-901, light chain <400> 3 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 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Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 170 175 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 350 355 360 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 380 385 390 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450 Lys <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> E26, heavy chain <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr 20 25 30 Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His 95 100 105 Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 125 130 135 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 140 145 150 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 155 160 165 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 170 175 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 185 190 195 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 200 205 210 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 215 220 225 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 320 325 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 335 340 345 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 350 355 360 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 370 375 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 380 385 390 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 395 400 405 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 410 415 420 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 425 430 435 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 445 450 Lys <210> 6 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Hu-901, heavy chain <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Ala Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser 95 100 105 Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 125 130 135 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 145 150 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160 165 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 180 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 185 190 195 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 200 205 210 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 215 220 225 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 320 325 330 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 335 340 345 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 350 355 360 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 365 370 375 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 380 385 390 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 395 400 405 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 410 415 420 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 425 430 435 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 440 445 450 Pro Gly Lys

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  20. (a) 서열 4의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 1의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 150 mg/ml 양의 항-IgE 항체, (b) 200 mM 양의 아르기닌-HCl, (c) 20 mM 양의 히스티딘, 및 (d) 0.01 내지 0.1% 양의 폴리소르베이트를 포함하고, pH가 6.0인, 저탁도의 안정한 액체 제형.
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  22. 제20항의 제형이 동봉된 용기를 포함하는 제품.
  23. 제22항에 있어서, 용기가 주사기인 제품.
  24. 제23항에 있어서, 주사기가 추가로 주입 장치내에 포함된 것인 제품.
  25. 제24항에 있어서, 주입 장치가 자동-주입기인 제품.
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  28. 제20항에 있어서, IgE-매개 장애의 치료에 사용되는 것인 제형.
  29. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 천식, 비-알레르기성 천식, 아토피성 피부염 및 위장관병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제형.
  30. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 알레르기성 비염인 제형.
  31. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 알레르기성 천식인 제형.
  32. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 천식인 제형.
  33. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 아토피성 피부염인 제형.
  34. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 과민증, 알레르기성 기관지-폐 아스페길루스증, 기생충성 질환, 간질성 방광염, 과-IgE 증후군, 모세혈관확장성 운동실조증, 위스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 흉선성 림프형성 부전증, IgE 골수종 및 이식편-대-숙주 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제형.
  35. 제28항에 있어서, IgE-매개 장애가 과민증인 제형.
  36. 제35항에 있어서, 과민증 장애가 아나필락시스, 담마진 및 식품 알레르기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제형.
  37. 제36항에 있어서, 과민증 장애가 식품 알레르기인 제형.
  38. 제37항에 있어서, 식품 알레르기가 콩과 식물에의 노출에 기인한 것인 제형.
  39. 제38항에 있어서, 콩과 식물이 땅콩인 제형.
  40. 제20항에 있어서, IgE-매개 장애의 치료에 있어서 항히스타민제와 병행하여 사용되는 것인 제형.
  41. 제20항에 있어서, 항히스타민제 투여와 병행하여 IgE-매개 장애의 치료에 사용되는 것인 제형.
  42. 제20항에 있어서, IgE-매개 장애의 치료에 있어서 기관지 확장제와 병행하여 사용되는 것인 제형.
  43. 제20항에 있어서, 기관지 확장제 투여와 병행하여 IgE-매개 장애의 치료에 사용되는 것인 제형.
  44. 제20항에 있어서, IgE-매개 장애의 치료에 있어서 당질코르티코이드와 병행하여 사용되는 것인 제형.
  45. 제20항에 있어서, 당질코르티코이드 투여와 병행하여 IgE-매개 장애의 치료에 사용되는 것인 제형.
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  48. 제20항에 있어서, 알레르겐 탈감작제 투여와 병행하여 IgE-매개 장애의 치료에 사용되는 것인 제형.
  49. 제20항에 있어서, IgE-매개 장애의 치료에 있어서 NSAID(non-steroidal anti-inflammatory drug)와 병행하여 사용되는 것인 제형.
  50. 제20항에 있어서, NSAID 투여와 병행하여 IgE-매개 장애의 치료에 사용되는 것인 제형.
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