ES2313350T3 - Microesferas de acido nucleico, produccion y suministro de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Microesferas que comprenden entre un 20 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de uno o más ácidos nucleicos y que tienen un tamaño medio de partícula no superior a aproximadamente 50 micras, caracterizadas porque dichas microesferas están sustancialmente exentas de un polímero soluble en agua utilizado en la preparación de microesferas.
Description
Microesferas de ácido nucleico, producción y
suministro de las mismas.
En general, la presente invención se refiere a
la preparación de microesferas de ácido nucleico y a su suministro,
en particular con el fin de inducir la tolerancia de las células
dendríticas para abordar temas médicos. Más en particular, la
invención se refiere a la tecnología de suministro de medicamentos
por medio de microesferas que se fabrican utilizando condiciones
acuosas. Las microesferas puede incorporar ARN de interferencia, ADN
plásmido, oligonucleótidos antisentido (AS) u otros ácidos
nucleicos. Estas microesferas se utilizan para la alteración de la
función celular in vivo e in situ.
Las micropartículas, las microesferas y las
microcápsulas son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro
inferior a un milímetro, preferentemente inferior a 100 micras, que
pueden estar compuestas de diversos materiales, incluyendo
polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Las microesferas se
han utilizado en numerosas aplicaciones diferentes, principalmente
para separaciones, diagnósticos y suministro de medicamentos.
Se pueden utilizar diversas técnicas para
fabricar estas microesferas a partir de polímeros sintéticos,
polímeros naturales, proteínas y polisacáridos, incluyendo una
separación de fases, evaporación de disolventes, emulsificación, y
secado por pulverización. Generalmente, los polímeros forman la
estructura de soporte de estas microesferas y el medicamento de
interés se incorpora en la estructura polimérica. Los polímeros
típicamente utilizados para la formación de microesferas incluyen
homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico
(PLGA), tal como se describen en la patente de Estados Unidos Nº
5.213.812 de Ruiz, en la patente de Estados Unidos Nº 5.417.986 de
Reid y col., en la patente de Estados Unidos Nº 4.530.840 de Tice y
col., la patente de Estados Unidos Nº 4.897.268 de Tice y col., la
patente de Estados Unidos Nº 5.075.109 de Tice y col., la patente
de Estados Unidos Nº 5.102.872 de Singh y col., la patente de
Estados Unidos Nº 5.384.133 de Boyes y col., la patente de Estados
Unidos Nº 5.360.610 de Tice y col., y en la solicitud de patente
europea con número de publicación 248.531, de Southern Research
Institute; copolímeros en bloque tales como Tetronic 908 y
Poloxámero 407, tal como se describen en la patente de Estados
Unidos Nº 4.904.479 de Illum; y polifosfacenos, tales como los
descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.149.543 de Cohen y
col. Las microesferas producidas por medio de tales polímeros
presentan un bajo rendimiento de carga y a menudo sólo son capaces
de incorporar un pequeño porcentaje del medicamento de interés en
la estructura polimérica. Por tanto, con frecuencia se deben
administrar cantidades sustanciales de microesferas para conseguir
un efecto terapéutico.
Las perlas o partículas esféricas han estado
comercialmente disponibles como herramienta para los bioquímicos
durante muchos años. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados con
perlas crean partículas relativamente grandes específicas para
ligandos particulares. Las grandes partículas revestidas de
anticuerpos se utilizan habitualmente para reticular los receptores
en la superficie de una célula para la activación celular, se unen a
una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad y se pueden
utilizar para suministrar un agente terapéutico que se libera
lentamente con el tiempo, utilizando anticuerpos específicos contra
tumores o tisulares conjugados con las partículas para dirigir el
agente al sitio deseado.
Un método común de unir de forma covalente un
anticuerpo a una matriz en fase sólida consiste en derivatizar una
perla con un agente químico de conjugación y luego unir el
anticuerpo a la perla activada. La utilización de una perla
polimérica sintética en vez de una molécula proteica permite la
utilización de condiciones de derivatización más rigurosas que
aquellas que pueden mantener muchas proteínas, es relativamente
barato y a menudo genera un enlace que es estable en un amplio
rango de condiciones desnaturalizantes. Se dispone comercialmente
de diversas perlas derivatizadas, todas con diferentes
constituyentes y tamaños. Se dispone comercialmente de perlas
formadas a partir de polímeros sintéticos tales como poliacrilamida,
poliacrilato, poliestireno o látex, procedentes de numerosas
fuentes, como Bio-Rad Laboratories (Richmond,
Calif.) y LKB Produkter (Stockholm, Suecia). Las perlas formadas a
partir de macromoléculas y partículas naturales tales como agarosa,
agarosa reticulada, globulina, ácido desoxirribonucleico y
liposomas están disponibles comercialmente de fuentes tales como
Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, N.J.) e
IBF (Francia). Las perlas formadas a partir de copolímeros de
poliacrilamida y agarosa están comercialmente disponibles de fuentes
tales como IBF y Pharmacia. Perlas magnéticas están disponibles
comercialmente de fuentes tales como Dynal Inc. (Great Neck,
N.Y.).
Un inconveniente de las micropartículas o perlas
actualmente disponibles es que son difíciles y caras de producir.
Las micropartículas producidas por estos métodos conocidos tienen
una amplia distribución de tamaño de partícula, carecen de
uniformidad y no consiguen presentar una cinética de liberación a
largo plazo cuando la concentración de los ingredientes activos es
alta. Además, los polímeros utilizados en estos métodos conocidos se
disuelven en disolventes orgánicos para formar las micropartículas.
Por tanto, deben ser producidas en instalaciones especiales
diseñadas para manipular disolventes orgánicos. Estos disolventes
orgánicos podrían desnaturalizar las proteínas o los péptidos
contenidos en las micropartículas. Los disolventes orgánicos
residuales podrían ser tóxicos cuando se administran a seres
humanos o animales.
Además, las micropartículas disponibles rara vez
tienen un tamaño lo suficientemente pequeño como para encajar en la
abertura del tamaño de una aguja de las habitualmente utilizadas
para administrar los productos terapéuticos o que sirva para la
administración por inhalación. Por ejemplo, las micropartículas
preparadas mediante la utilización de ácido glicólico poliláctico
(PLGA) son grandes y tienden a agregarse. Es necesario un paso de
selección del tamaño, que resulta en una pérdida de producto, para
eliminar las partículas demasiado grandes para su inyección. Las
partículas de PLGA y que tienen un tamaño adecuado para su inyección
deben ser administradas a través de una aguja de gran calibre para
poder alojar el gran tamaño de las partículas, lo que a menudo
causa molestias al paciente.
Generalmente, muchas de las micropartículas
actualmente disponibles se activan para liberar su contenido en
medios acuosos y, por tanto, se deben liofilizar para impedir una
liberación prematura. Además, las partículas tales como las
preparadas por medio del sistema de PLGA muestran una cinética de
liberación basada tanto en la erosión como en la difusión. En este
tipo de sistemas se observa una descarga inicial o una liberación
rápida. Este efecto de descarga puede resultar en efectos
secundarios no deseados en aquellos pacientes a quienes se han
administrado las partículas.
Son conocidas micropartículas preparadas por
medio de lípidos para encapsular medicamentos diana. Por ejemplo,
se pueden utilizar lípidos dispuestos en membranas bicapa que rodean
múltiples compartimentos acuosos para formar partículas para
encapsular medicamentos solubles en agua para su suministro
posterior, tal como se describe en la patente de Estados Unidos Nº
5.422.120, de Sinil Kim. Generalmente estas partículas tienen un
tamaño superior a 10 micras y están diseñadas para la administración
intraarticular, intratecal, subcutánea y epidural.
Alternativamente, se han empleado liposomas para el suministro
intravenoso de pequeñas moléculas. Los liposomas son partículas
esféricas compuestas de una capa o múltiples bicapas de fosfolípidos
y colesterol. Los liposomas tienen un tamaño de 30 micras o
superior y pueden portar diversos medicamentos solubles en agua o
solubles en lípidos. La tecnología de los liposomas se ve
obstaculizada por problemas que incluyen la pureza de los
componentes lipídicos, posible toxicidad, heterogeneidad y
estabilidad de la vesícula, captación excesiva y dificultades de
fabricación o de conservación durante el almacenamiento.
Un objetivo para la comunidad médica es el
suministro de ácidos nucleicos a las células de un sujeto,
incluyendo, pero sin limitarse a, un animal o un mamífero, para su
tratamiento. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden
suministrar a células en cultivos (in vitro) con relativa
eficacia, pero las nucleasas resultan en una alta velocidad de
degradación del ácido nucleico cuando se suministra el ácido
nucleico a los animales (in vivo).
Además de proteger el ácido nucleico contra la
digestión de las nucleasas, el vehículo de suministro del ácido
nucleico debe mostrar poca toxicidad, debe ser captado eficazmente
por las células y tener una formulación bien definida, fácil de
fabricar. Tal como lo demuestran los ensayos clínicos, los vectores
virales para el suministro pueden resultar en una respuesta inmune
gravemente adversa, incluso fatal, in vivo. Además, este
método tiene el potencial de tener efectos mutagénicos in
vivo. En general, el suministro mediante la inclusión del ácido
nucleico en complejos lipídicos de distintas formulaciones (tales
como liposomas o complejos de lípidos catiónicos) ha sido ineficaz
in vivo y puede tener efectos tóxicos. Los complejos de
ácidos nucleicos con diversos polímeros o con péptidos han mostrado
resultados contradictorios y la toxicidad de estas formulaciones no
ha sido resuelta todavía. Los ácidos nucleicos también han sido
encapsulados en matrices poliméricas para su suministro, pero en
estos casos las partículas tienen un amplio rango de tamaño y la
eficacia de estas aplicaciones terapéuticas no ha sido
demostrada.
La WO 00/41679 revela microesferas que contienen
citoquinas fabricadas por coacervación en base a polianiones y
policationes.
En la US 2002146459 se describe una microesfera
de PLGA-ADN de polilisina condensada.
La WO 94/18947 se refiere a un proceso para
proporcionar un complejo de protamina-ADN de alta
pureza que se compone esencialmente de varios pasos.
En la US 2004/014698 la poliornitina y la
poliarginina se conjugaron con ADN que codificaba para GFP y
alginato y se formularon en nanopartículas.
La US 6268053 se refiere a micropartículas que
comprenden macromoléculas (hormona, proteína) y polímeros, donde la
concentración de las macromoléculas en las micropartículas es de al
menos un 40% y menos del 100% en peso. Los polímeros incluyen
polivinilpirrolidona, polietilenglicol, dextrano, etoxilatos de
nonilfenol, alcohol de polivinilo.
La US 6458387 especifica un método para formar
una microesfera que comprende: (1) la formación de una mezcla
acuosa que contiene: (a) una proteína portadora, (b) un polímero
soluble en agua, (c) un primer agente complejante de polisacárido
polianiónico, y (d) un segundo agente de compleción de catión
metálico divalente seleccionado de entre el grupo compuesto por
calcio y magnesio, (2) dejar que se formen las microesferas en la
mezcla acuosa, y (3) la estabilización de las microesferas poniendo
éstas en contacto con un agente reticulante, bajo condiciones
suficientes para estabilizar las microesferas.
En la US 6475995 se muestra una nanopartícula
sólida inferior a 5 micrómetros que comprende un coacervato de un
policatión polimérico y un polianión, donde el policatión polimérico
se selecciona de entre el grupo compuesto por gelatina y quitosano,
y donde el polianión se compone de ácidos nucleicos que codifican un
antígeno, por lo que el antígeno se expresa y provoca una respuesta
inmune en el mamífero.
La US 2003059474 proporciona detalles y métodos
de fabricación para microesferas que comprenden (1) una
macromolécula, (2) un polímero soluble en agua, y (3) un agente
complejante policatiónico.
Por tanto, existe la necesidad de abordar
cuestiones de suministro de ácidos nucleicos y proporcionar
formulaciones eficaces de ácidos nucleicos. Asimismo, existe una
necesidad continua en el desarrollo de microesferas y de nuevos
métodos para fabricar microesferas. Las microesferas y su
preparación han sido descritas en las patentes de Estados Unidos Nº
6.458.387 de Scott y col., Nº 6.268.053, Nº 6.090.925, Nº 5.981.719
y Nº 5.599.719 de Woiszwillo y col., y Nº 5.578.709 de Woiszwillo.
Las referencias anteriores y todas las demás referencias
identificadas aquí se incorporan aquí como referencia.
La presente invención se dirige a microesferas
compuestas de agentes biológicamente activos, tales como ADN, siARN
(ARN silenciador, también conocido como ARN de doble hebra), mARN,
tARN, y todos los demás ácidos nucleicos, incluyendo, pero sin
limitarse a, oligonucleótidos, y a métodos para su preparación, así
como a la utilización de los mismos. Se piensa que la aproximación
de suministro de microesferas de la presente invención impide o
dificulta el acceso de los ácidos nucleicos suministrados a las
nucleasas celulares, impidiendo así la degradación prematura de los
ácidos nucleicos terapéuticos.
El ácido nucleico que contiene las microesferas
se puede utilizar para el tratamiento de diversas enfermedades,
incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades autoinmunes, tales
como esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo 1, psoriasis,
anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad de
Berger (nefropatía por IgA), síndrome de fatiga crónica, enfermedad
de Crohn, dermatomiostis, fibromialgia, enfermedad de Grave,
tiroiditis de Hashimoto, liquen plano, miastenia gravis, púrpura
trombocitopénica idiopática, fiebre reumática, artritis reumatoide,
escleroderma, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso sistémico,
colitis ulcerativa y vitíligo. Además, las microesferas se pueden
utilizar para tratar otras enfermedades relacionadas con las
células dendríticas o macrófagos u otras enfermedades basadas en
células fagocíticas o condiciones que incluyen aquellas que pueden
ser tratadas, mediadas o mitigadas por aproximaciones a siARN u
oligonucleótidos antisentido, o similares.
En una realización de la invención, se lleva a
cabo el suministro de microesferas de oligonucleótidos AS a un
sujeto con el fin de inducir la tolerancia de las células
dendríticas junto con el direccionamiento del inicio de la diabetes
de tipo 1 en individuos. Las microesferas que contienen el
oligonucleótido AS se obtienen utilizando condiciones acuosas.
Estas microesferas se utilizan para inhibir la expresión genética y
para impedir un tipo de condición de diabetes autoinmune en un
sujeto. Las microesferas de la presente invención se pueden emplear
para tratar condiciones continuas o como terapia preventiva.
Las microesferas de la presente invención pueden
estar compuestas también de múltiples agentes biológicamente
activos, incluidos oligonucleótidos.
En una realización preferente de la invención,
se sintetizan tres oligonucleótidos AS dirigidos a los transcritos
primarios CD40, CD80 y CD86 y se prepara una solución acuosa de la
mezcla de oligonucleótidos y se combina con una solución
polimérica. Después del procesamiento, se proporcionan microesferas
que contienen los oligonucleótidos.
La preparación de las microesferas de la
presente invención se puede llevar a cabo con o sin agente
reticulante, policatión, polianión y/o una fuente de energía tal
como el calor.
Las microesferas de acuerdo con la invención son
especialmente adecuadas para ser administradas in vivo y en
un procedimiento in situ, tal como el suministro subcutáneo
directo. Una aplicación al respecto es para el tratamiento de
tumores bajo la piel y para el tratamiento de infecciones virales.
Las microesferas se pueden suministrar por medio de diversas otras
vías de administración, incluyendo, pero sin limitarse a, la
administración oral, pulmonar, nasal, intravenosa, intramuscular,
subcutánea, tópica, ocular, intradérmica, intraperitoneal, y por
supositorios y combinaciones de las mismas.
Las microesferas de la presente invención se
pueden utilizar también con fines de diagnóstico, incluyendo, pero
sin limitarse a, el diagnóstico genético.
Estos y otros aspectos, objetos, características
y ventajas de la presente invención, incluidas las distintas
combinaciones, se harán evidentes y se entenderán claramente
teniendo en cuenta la siguiente descripción detallada.
A lo largo de esta descripción se hará
referencia a las figuras adjuntas, donde:
Fig. 1: ilustración esquemática del papel que
desempeñan las células dendríticas en la destrucción autoinmune de
las células beta pancreáticas que producen insulina en la diabetes
de Tipo 1;
Fig. 2: diagrama del vector de ADN del plásmido
que contiene el gen de la Beta-galactosidasa;
Fig. 3: fotomicrografías que demuestran la
transfección de células fibroblastos 3T3 NIH con microesferas de
ADN (pADN) del plásmido que contiene el gen de la
Beta-galactosidasa;
Fig. 4: fotomicrografía de un gel de agarosa
para electroforesis de pADN desnudo y de dos formulaciones de
microesferas de pADN de acuerdo con la invención, ambas después de
la exposición a ADNasa;
Fig. 5: diagrama de barras de la actividad de la
Beta-galactosidasa en cuatro distintas aplicaciones
de transfección de ADN plásmido;
Fig. 6 a Fig. 9: micrografías electrónicas de
exploración de microesferas de oligonucleótidos AS y policatión de
poli-L-lisina;
Fig. 10 a Fig. 13: micrografías electrónicas de
exploración de microesferas compuestas de oligonucleótidos AS y
policatión de poli-L-ornitina;
Fig. 14 y 15: micrografías electrónicas de
exploración de microesferas de oligonucleótidos AS formadas sin un
componente policatiónico;
Fig. 16: gráfico que resume la incidencia de la
diabetes en tres grupos de ratones NOD tratados con las microesferas
de la presente invención y de acuerdo con otros procedimientos para
el suministro de oligonucléotidos AS dirigidos a tres transcritos
primarios; y
Fig. 17: micrografía electrónica de exploración
(SEM) de microesferas de siARN de acuerdo con la invención.
Según sea necesario, se describen aquí
realizaciones detalladas de la presente invención; sin embargo, se
debe entender que las realizaciones descritas son simplemente a
título de ejemplo de la invención, que se pueden materializar de
varias formas. Por tanto, los detalles específicos aquí descritos no
deben interpretarse como limitativos, sino simplemente como base
para las reivindicaciones y como base representativa para enseñar a
un especialista en la técnica a emplear de diversas formas la
presente invención de manera práctica y adecuada.
En general, las microesferas de la presente
invención se componen de uno o más agentes activos, preferentemente
son sustancialmente esféricas y tienen una distribución de tamaño
sustancialmente estrecha en el rango de tamaños adecuados para la
captación de células. Las microesferas pueden ser suministradas por
vías de administración a elegir, incluyendo el suministro
parenteral, vía oral, vía pulmonar, vía ocular, utilizando un
sistema de depósito, y otras vías de administración.
Las microesferas comprenden agentes activos de
ácido nucleico tales como ADN, ARN, siARN, mARN, tARN y otros tipos
de ácidos nucleicos, incluyendo, pero sin limitarse a,
oligonucleótidos de ARN o ADN, y combinaciones de los mismos. Las
microesferas preferentes de la presente invención se componen de uno
o más oligonucleótidos. Las microesferas sirven como agentes
terapéuticos para el tratamiento de varias enfermedades y/o como
herramientas para las tareas de diagnóstico, incluyendo sin
limitarse a, la genómica funcional. Por ejemplo, las microesferas
de oligonucleótidos antisentido pueden interrumpir la fase de
traducción del proceso de producción de proteínas, impidiendo que
el mARN alcance el ribosoma. Las microesferas antisentido son
suministradas a la célula enferma, virus o bacteria, donde se unen
(hibridizan) específicamente a su mARN diana. En consecuencia, el
mARN se degrada y por tanto no es traducido por el ribosoma a una
proteína funcional. Así, las microesferas antisentido son una
herramienta eficaz para luchar contra la enfermedad asociada a la
sobreexpresión y/o subexpresión de las proteínas en el cuerpo, tal
como ocurre en las enfermedades autoinmunes.
Las importantes ventajas de los oligonucleótidos
antisentido consisten en que son altamente específicos, ya que
muestran la expresión de un gen. Asimismo, los oligonucleótidos
antisentido son universales, ya que, teóricamente, un
oligonucleótido AS se puede desarrollar contra cualquier gen y su
mARN; la secuencia de ADN es la única información necesaria para el
diseño del nucleótido AS. Los oligonucleótidos AS son eficaces
también en células cultivadas de animales y humanos. Las
microesferas de oligonucleótidos antisentido de la presente
invención son también "verificables", ya que son útiles desde
el punto de vista diagnóstico por tener sitios muy específicos y
pueden ser marcadas con un marcador fluorescente.
Se sabe que los oligonucleótidos se dañan
fácilmente con el calor, sacudidas y demás tratamientos mecánicos y
químicos, de modo tal que ya no son capaces de adherirse a un ácido
nucleico diana y bloquean su acción. También se sabe que las
proteínas, péptidos, oligonucleótidos, y similares tienen una vida
muy corta (de unos minutos a unas horas) in vivo, requieren
un suministro eficaz a la célula y, en algunas circunstancias
directamente al núcleo, con el fin de evitar la degradación
enzimática. En consecuencia, estos agentes típicamente no pueden
ser suministrados con éxito "desnudos", sino que necesitan ser
protegidos o formulados de una forma que permita su suministro
in vivo.
\newpage
Los oligonucleótidos de la presente invención
conservan su actividad biológica mediante su incorporación en
microesferas. Además, las microesferas proporcionan también una gran
capacidad de carga. En otras palabras, se pueden administrar dosis
mayores de ácidos nucleicos terapéuticos a un sujeto mediante una
dosificación con microesferas muy concentradas (por ejemplo, un
30-100% en peso de ácido nucleico), en base al peso
total de las microesferas. Salvo que se especifique de otro modo
aquí, los porcentajes son en peso con respecto al peso total de la
composición. Las microesferas proporcionan una herramienta de
suministro no viral para los oligonucléotidos antisentido y otros
tipos de moléculas de ácido nucleico.
Las microesferas están compuestas del compuesto
biológicamente activo en una forma sustancialmente esférica.
Típicamente, las microesferas tienen una distribución de tamaño de
partícula esencialmente estrecha, con un tamaño medio de partícula
no superior a 50 micras. Típicamente, el tamaño de partícula será
inferior a 10 micras, en especial inferior a 5 micras.
Preferentemente, tienen una distribución de tamaño estrecha, con un
tamaño medio de partícula del orden de entre aproximadamente 0,04 a
aproximadamente 8 micras, o entre aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 4 micras, o entre aproximadamente 0,2 a
aproximadamente 4 micras, o entre aproximadamente 0,4 a
aproximadamente 4 micras, y, para aplicaciones en las que se deseen
microesferas de aproximadamente 1 micra, de aproximadamente 1 micra
a aproximadamente 3 micras. Un tamaño medio de partícula puede ser
de aproximadamente 2 micras, por ejemplo, y el rango de tamaño de
partícula se puede adaptar para ajustarse a la aplicación
deseada.
Las microesferas se componen preferentemente de
ácidos nucleicos que son sustancialmente amorfos o no cristalinos,
es decir que se encuentran en una forma amorfa o semicristalina. Tal
como se emplea aquí, "amorfo" se refiere a una forma sólida
generalmente aleatoria de ácido nucleico, donde las redes
cristalinas del(de los) ácido(s) nuclei-
co(s) dentro de las microesferas están ausentes y "semicristalino" se refiere a una forma sólida generalmente aleatoria de ácido nucleico donde el contenido en ácido nucleico de la microesfera se compone de menos del 50% de retículos cristalinos del(de los) ácido(s) nucleico(s).
co(s) dentro de las microesferas están ausentes y "semicristalino" se refiere a una forma sólida generalmente aleatoria de ácido nucleico donde el contenido en ácido nucleico de la microesfera se compone de menos del 50% de retículos cristalinos del(de los) ácido(s) nucleico(s).
El suministro del compuesto biológicamente
activo en la forma de microesfera con el tamaño deseado puede
aumentar la eficacia del medicamento y reducir los residuos. Puede
reducir también los efectos adversos causados por una alta dosis
del agente activo. El tamaño de la microesfera puede determinar a
qué órgano se destina. Además, es importante el control óptimo del
tamaño de partícula de las microesferas para el suministro de
agentes biológicos in vivo, ya que sólo las microesferas de
un tamaño particular pueden ser captadas por las células diana. Una
microesfera de tamaño mayor que el que se describe aquí puede
activar los macrófagos y otros mecanismos inmunes y degradar la
partícula biológica, mientras que un tamaño más pequeño puede
disolverse demasiado rápidamente.
Cuando se fabrican las microesferas, el agente
biológico deseado, típicamente un oligonucleótido u otro compuesto
de ácido nucleico, se disuelve en una solución acuosa. Se combina
con uno o más polímeros solubles en agua, como polivinilpirrolidona
(PVP) y polietilenglicol (PEG) y combinaciones de los mismos. Los
polímeros solubles en agua no forman una parte sustancial de las
microesferas, pero ayudan en su preparación. Los ácidos nucleicos
pueden comprender hasta un 100 por cien en peso de la composición de
microesferas. Típicamente, comprenderán al menos un 20 por ciento
en peso, típicamente al menos aproximadamente un 30 por ciento en
peso, preferentemente al menos aproximadamente un 50 por ciento en
peso, en especial al menos un 70 por ciento en peso, y en particular
al menos aproximadamente un 90 por ciento en peso. Los ácidos
nucleicos pueden incluir al menos aproximadamente un 95 por ciento
en peso de microesferas. Normalmente se prefiere formar las
microesferas en una mezcla de polímero(s) solu-
ble(s) en agua/acuosa a un pH moderadamente ácido. Por ejemplo, a menudo el polímero o los polímeros se disuelven en una solución tampón, tal como acetato de sodio, a un pH de aproximadamente 5,3. Las microesferas según esta técnica general se pueden fabricar también con otros polímeros, tales como polisacáridos, incluidos polisacáridos cargados positiva y negativamente y otros polímeros biocompatibles. El orden de adición de los componentes puede cambiarse para formar microesferas con distintas propiedades químicas y físicas, tales como su tamaño, morfología y/o carga superficial.
ble(s) en agua/acuosa a un pH moderadamente ácido. Por ejemplo, a menudo el polímero o los polímeros se disuelven en una solución tampón, tal como acetato de sodio, a un pH de aproximadamente 5,3. Las microesferas según esta técnica general se pueden fabricar también con otros polímeros, tales como polisacáridos, incluidos polisacáridos cargados positiva y negativamente y otros polímeros biocompatibles. El orden de adición de los componentes puede cambiarse para formar microesferas con distintas propiedades químicas y físicas, tales como su tamaño, morfología y/o carga superficial.
En algunas preparaciones de microesferas, es
preferente combinar los ácidos nucleicos con un policatión antes de
la formación de la microesfera. El hecho de evitar el uso del
policatión, sin embargo, puede resultar ventajoso en algunos casos,
debido a que ciertos cationes se pueden asociar a problemas de
toxicidad. La utilización de un polianión, un agente reticulante
del polianión u otro agente reticulante se puede aplicar también
para fabricar estas microesferas. Ejemplos de policationes
preferentes son poli-lisina y
poli-ornitina. Otros incluyen polietilenimina
(PEI), prolamina, protamina, polivinilpirrolidona (PVP),
poliarginina, vinilamina y combinaciones de las mismas.
Cuando se incluye un componente policatión en la
preparación de las microesferas y también en las microesferas,
puede estar presente a un nivel de aproximadamente el 0 a
aproximadamente el 80 por ciento en peso de la composición total
que forma la microesfera. Las microesferas elaboradas con
policationes pueden contener al menos aproximadamente un 2 por
ciento en peso, o pueden contener al menos aproximadamente un 5 por
ciento en peso, o pueden contener al menos aproximadamente un 10
por ciento en peso, o pueden contener al menos aproximadamente un 20
por ciento en peso, o pueden contener al menos aproximadamente un
30 por ciento en peso, del policatión, comprendiendo el resto
generalmente el ácido nucleico.
En algunas aplicaciones de producción de
microesferas, se suministra energía (por ejemplo en forma de calor
u otras fuentes energéticas) a la composición con el fin de
facilitar la formación de las microesferas. Se ha descubierto que
la adición de energía puede resultar útil para la producción de
algunos tipos de microesferas de la presente invención.
Las composiciones de las microesferas pueden
contener múltiples compuestos biológicamente activos. Así, las
microesferas, individual o colectivamente como un grupo de
microesferas, pueden contener más de un ácido nucleico, por ejemplo
uno o más oligonucleótidos. Además, se pueden añadir otras moléculas
a la superficie de las microesferas de ácido nucleico después de su
formulación, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, ligandos
receptores o quimioatractores.
Aunque puedan emplearse numerosas técnicas para
la preparación de las microesferas de la presente invención (véase
las referencias incorporadas aquí como referencia), se ha
descubierto que lo que sigue es particularmente útil en la
preparación de las microesferas de la presente invención.
Se prepara una solución acuosa de la mezcla de
ácido nucleico incluyendo el policatión en proporciones volumétricas
policatión:ácido nucleico de aproximadamente 0,5:1 a
aproximadamente 4:1. Se preparan soluciones poliméricas de
polivinilpirrolidona y/o de polietilenglicol y se combinan con la
solución que contiene el ácido nucleico. Con el cambio de
temperatura de la solución combinada mediante calor o frío o
combinaciones de los mismos, y con la centrifugación y el lavado
repetido se proporciona una suspensión condensada acuosa, que
típicamente se congela y liofiliza para formar un polvo seco de
microesferas que comprende el(los) nucleótido(s) y el
policatión. La temperatura de la mezcla antes de la formación de las
microesferas se puede bajar o elevar con respecto a la temperatura
ambiente y a una velocidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente
400ºC/minuto. Para las aplicaciones de enfriamiento, la mezcla se
enfría típicamente de aproximadamente 35 a aproximadamente -196ºC.
Y para las aplicaciones de calentamiento, la mezcla se caliente de
aproximadamente 4 a aproximadamente 100ºC.
Se pueden añadir otros excipientes a la
composición final o a la mezcla de formación de
pre-microesferas, tales como polisacáridos,
polisacáridos cargados positiva o negativamente y otros polímeros,
preferentemente biocompatibles. El orden de adición se puede
cambiar, lo que puede resultar en la formación de microesferas con
distintas propiedades químicas y/o físicas. Se pueden añadir otros
restos a la superficie, para que funcionen como quimioatrayentes o
como ligandos receptores, por ejemplo.
Las microesferas de acuerdo con la invención son
vehículos de suministro no viral para el ADN plásmido,
oligonucleótidos antisentido y otras moléculas de ácido nucleico
útiles.
Las composiciones de las microesferas pueden
encontrarse en forma de suspensiones líquidas (siendo
preferentemente acuosas), en forma de polvo seco, en suspensión en
disolventes orgánicos o microencapsuladas en forma sólida con otros
polímeros.
Tal como se establece anteriormente, las
microesferas de la presente invención pueden dosificarse mediante
diversas vías de administración. La cantidad real de dosificación
del agente activo, la concentración de la formulación y el volumen
de la formulación que han de dosificarse serán determinados por los
médicos especialistas y, en general, dependerán de diversos
factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la enfermedad o
condición que ha de ser tratada, la edad, el sexo y el peso del
sujeto a tratar, la potencia del ácido nucleico para tratar el
objetivo particular, la concentración del ácido nucleico en la
formulación de dosificación, etc. Tal como se emplea aquí, una
"cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de microesferas
de la presente invención que previene, trata o mejora una
enfermedad o condición en un sujeto.
Las microesferas de acuerdo con la invención
tienen una característica especialmente protectora. Los estudios
in vitro que utilizan microesferas de
Beta-galactosidasa indican que la forma de la
microesfera protegía el ADN contra las nucleasas. A menudo el ADN y
los oligonucleótidos son tioados con vistas a ralentizar la
degradación. Por ejemplo, los oligonucleótidos AS se encuentran en
forma de tioato. Debido a las características protectoras de las
microesferas, la necesidad de esta forma de tioato se puede reducir
o no utilizar en absoluto.
Un método preferente de la presente invención se
dirige a la prevención o mejora de la diabetes autoinmune
insulinodependiente mediante la formulación e inyección de las
microesferas de oligonucleótidos antisentido (AS) aquí descritas,
que se direccionan a los transcritos primarios de CD40, CD80 y CD86.
Estos oligonucleótidos han sido diseñados para inducir la
tolerancia inmune en un intento de prevenir la destrucción de las
células beta productoras de insulina en el modelo de ratón NOD. Los
eventos que conducen a la destrucción de estas células beta se
ilustran en la Fig. 1. Esta ilustra cómo la diabetes de Tipo 1 se
manifiesta por la destrucción autoinmune de las células
pancreáticas beta productoras de insulina en el ratón NOD, así como
en humanos. En el momento del inicio clínico de la diabetes, los
humanos mantienen un 10-20% de su masa residual de
células beta. La restricción de esta masa residual puede resultar
en un mantenimiento de los niveles de insulina adecuados para
regular los niveles de glucosa. Se proporcionan las microesferas
preferentes de la invención para interferir en la destrucción
autoinmune de las células beta que se ilustra en la Fig. 1.
Se apreciará que las células dendríticas (DC) se
pueden activar para ser potentes células presentadoras de antígeno
que se encuentran en todos los tejidos y que están muy concentradas
bajo de la piel. Estas células dendríticas presentadoras de
antígeno funcionan como iniciadoras de la respuesta inmune mediante
la activación de las células T, en particular en los nodos
linfáticos.
La Fig. 2 es un dibujo de un vector de plásmido
que contiene el gen de la Beta-galactosidasa, que se
puede utilizar para transfectar células fibroblastos NIH 3T3. La
evidencia in vitro para la transfección de las células
fibroblastos NIH 3T3 con microesferas de ADN del plásmido se muestra
en la Fig. 3, donde aparecen células que se tiñen de color azul en
respuesta a la adición del substrato X-gal de
Beta-galactosidasa.
La Fig. 4 ilustra la capacidad in vitro
de las microesferas para proteger el ADN en solución. Esta Figura
muestra un gel de agarosa para electroforesis demostrando la
protección a las nucleasas impartida por la fabricación de
microesferas de ADN de plásmido, producidas generalmente como se
cita aquí. En las muestras de los Plásmidos 1, 2 y 3, el ADN
desnudo del plásmido se expuso a ADNasa, indicando las manchas la
degradación del ADN del plásmido en cada uno de los tres niveles de
exposición a la ADNasa. En las muestras de las Partículas 1 y 2,
las formulaciones de microesferas de ADN del plásmido se expusieron
a ADNasas. La falta de manchas indica que las formulaciones de
microesferas muestran una protección del ADN del plásmido contra la
degradación.
La Fig. 5 cuantifica los niveles de expresión de
la actividad de Beta-galactosidasa transfectada en
cuatros aplicaciones distintas de ADN plásmido. La aplicación de
ADN desnudo del plásmido mostró niveles muy bajos. Se indican
niveles algo más altos para la transfección del complejo lípidos
catiónicos-ADN de plásmido utilizando
lipofectamina, un lípido catiónico comercial, como vehículo de
suministro. Se muestra una actividad sustancialmente mayor para las
dos preparaciones de microesferas de ADN de plásmido, las
microesferas 1 correspondiendo a la Partícula 1 de la Fig. 4, y las
microesferas 2 correspondiendo a la Partícula 2 de la Fig. 4.
Los siguientes Ejemplos ilustran ciertas
características y ventajas de la invención con el fin de ilustrar
más ésta. Los Ejemplos no se deben considerar como limitativos o
restrictivos de la invención.
Se sintetizaron tres oligonucleótidos AS
direccionados a los transcritos primarios CD40, CD80 y CD86 mediante
el equipo de síntesis de ADN de la Universidad de Pittsburgh
(Pittsburgh, PA). Las secuencias de oligonucleótidos AS, indicando
el asterisco la tioación, son:
Se preparó una solución acuosa de la mezcla de
oligonucleótidos combinando partes alícuotas de tres soluciones de
oligonucleótidos, conteniendo cada una un tipo de oligonucleótido,
para formar una solución de 10 mg/ml de los tres tipos de
oligonucleótidos. Se prepararon cuatro lotes de una solución acuosa
de la mezcla de oligonucleótidos. Se prepararon 10 mg/ml de
poli-L-lisina\cdotHBr en agua
desionizada (poli-L-lisina\cdotHBr
hasta 50.000 de Bachem, King of Prussia, PA). Se añadió la
poli-L-lisina\cdotHBr a la
solución de oligonucleótidos en proporciones volumétricas de 1:1,
2:1, 3:1 y 4:1, tal como se describe en la Tabla 1. Se marcaron los
lotes como 1, 2, 3 y 4. Se agitaron suavemente las mezclas. Se
elaboró una solución polimérica al 25% que contenía un 12,5% de PVP
(polivinilpirrolidona, 40.000 Dalton, Spectrum Chemicals, Gardena,
CA) y un 12,5% de PEG (polietilenglicol, 3.350 Dalton, Spectrum
Chemicals, Gardena, CA) en acetato de sodio 1M (Spectrum, Gardena,
CA) a un pH de 5,5. Se añadió la solución polimérica a los lotes
1-4 en una proporción volumétrica de 2:1 tal como se
describe en la Tabla 1, que muestra los volúmenes de
oligonucleótidos AS,
poli-L-lisina\cdotHBr y PEG/PVP en
los lotes 1-4:
Los lotes se incubaron durante 30 minutos a 70ºC
y luego se enfriaron a 23ºC. Al enfriarse, la solución se volvió
turbia y tuvo lugar una precipitación. Luego se centrifugó la
suspensión y se eliminó el exceso de PEG/PVP. El gránulo resultante
se lavó mediante su resuspensión en agua desionizada, centrifugación
y eliminación del sobrenadante. Se repitió tres veces el proceso de
lavado. La suspensión condensada acuosa se congeló y liofilizó para
formar un polvo seco de microesferas que comprendía el
oligonucleótido y la
poli-L-lisina.
La Fig. 6 presenta una micrografía electrónica
de exploración (SEM) del lote Nº 1 (proporción 1:1
poli-L-lisina:oligonucleótido). Se
fabricaron microesferas de 0,5-4 \mum de tamaño
con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 2,5 \mum. Se
observó también la precipitación de un material desconocido.
Estudios adicionales por HPLC determinaron que el precipitado
estaba compuesto de PEG/PVP residual, principalmente PVP.
La Fig. 7 presenta una SEM del lote Nº 2
(proporción 2:1
poli-L-lisina:oligonucleótido). Se
fabricaron microesferas de 0,2-4 \mum de tamaño
con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 1 \mum.
La Fig. 8 presenta una SEM del lote Nº 3
(proporción 3:1 de
poli-L-lisina:oligonucleótido). Se
fabricaron microesferas de 0,2-4 \mum de tamaño
con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 1 \mum. Se
observó también la precipitación de un material desconocido.
Estudios adicionales por HPLC determinaron que el precipitado
estaba compuesto de PEG/PVP residual, principalmente PVP.
La Fig. 9 presenta una SEM del lote Nº 4
(proporción 4:1
poli-L-lisina:oligonucleótido). Se
fabricaron microesferas de 0,2-6 micras de tamaño.
Existe una polidispersión de tamaños, donde aproximadamente la mitad
de las partículas tienen un tamaño medio de partícula de 1 \mum y
la otra mitad de las partículas tienen un tamaño medio de partícula
de 5 \mum.
Los oligonucleótidos AS direccionados a los
transcritos primarios CD40, CD80 y CD86 eran las secuencias de los
oligonucleótidos AS del Ejemplo 1. Se preparó una solución acuosa de
la mezcla de oligonucleótidos combinando partes alícuotas de tres
soluciones de oligonucleótidos, conteniendo cada una un tipo de
oligonucleótido, para formar una solución de 10 mg/ml de los tres
tipos de oligonucleótidos. Se prepararon cuatro lotes de soluciones
de la mezcla de oligonucleótidos. Se prepararon 5 mg/ml de
poli-L-ornitina\cdotHBr en agua
desionizada
(poli-L-ornitina\cdotHBr 11.900
(vis) de Sigma).
Se añadió la
poli-L-ornitina\cdotHBr a la
solución de oligonucleótidos en proporciones volumétricas variables,
tal como se describe en la Tabla 2. Se marcaron los lotes como 1,
2, 3 y 4. Se agitaron suavemente las mezclas. Se elaboró una
solución polimérica al 25% que contenía un 12,5% de PVP (40.000
Dalton, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) y un 12,5% de PEG (3.350
Dalton, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) en acetato de sodio 0,1M
(Spectrum Chemicals, Gardena, CA) a un pH de 5,5. Se añadieron las
soluciones poliméricas a los lotes 1-4 en las
distintas proporciones volumétricas de la Tabla 2. Seguidamente la
incubación y el aclarado tal como se describen en el Ejemplo 1. La
Tabla 2 proporciona los volúmenes de oligonucleótidos AS,
poli-L-ornitina\cdotHBr, PEG/PVP
y PEG en los lotes 1-4:
La Fig. 10 presenta una SEM del lote Nº 1
(proporción 1:1
poli-L-ornitina:oligonucleótido). Se
fabricaron microesferas de 0,2-8 \mum de tamaño,
con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 2 \mum. Se
observó también la precipitación de un material desconocido.
Estudios adicionales por HPLC pudieron demostrar que este
precipitado estaba compuesto de PEG/PVP residual, principalmente
PVP.
La Fig. 11 presenta una SEM del lote Nº 2
(proporción 2:1
poli-L-ornitina:oligonucleótido). Se
fabricaron microesferas, de 0,2-8 \mum de tamaño,
con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 2 \mum. Muchas
microesferas estaban fusionadas juntas. Se observó también la
precipitación de un material desconocido. Estudios adicionales por
HPLC pudieron demostrar que este precipitado estaba compuesto de
PEG/PVP residual, principalmente PVP.
La Fig. 12 presenta una SEM del lote Nº 3
(proporción 1:1
poli-L-ornitina:oligonucleótido,
sólo PEG). Se formó un precipitado de forma amorfa. Esto indicaba
que la presencia de PVP en la formulación desempeñaba un papel
importante en la formación de las microesferas.
La Fig. 13 presenta una SEM del lote Nº 4
(proporción 1:3
poli-L-ornitina:oligonucleótido,
sólo PEG). Se formaron microesferas porosas de
10-50 \mum de tamaño, microesferas rotas y 2
cadenas de 10 \mum de microesferas fusionadas. No se observaron
microesferas solas. Este lote indicaba que la presencia de PVP en la
formulación desempeñaba un papel importante en la formación de las
microesferas.
Se sintetizaron tres oligonucleótidos AS
direccionados a los transcritos primarios CD40, CD80 y CD86 con las
secuencias de oligonucleótidos del Ejemplo 1. Se preparó una
solución acuosa de la mezcla de oligonucleótidos combinando partes
alícuotas de las tres soluciones de oligonucleótidos, conteniendo
cada una un tipo de oligonucleótido, para formar una solución de 10
mg/ml de los tres tipos de oligonucleótidos. Se prepararon dos lotes
de la solución de la mezcla de oligonucleótidos.
Se elaboró una solución polimérica al 25% que
contenía un 12,5% de PVP (40.000 Dalton, Spectrum Chemicals,
Gardena, CA) y un 12,5% de PEG (3.350 Dalton, Spectrum Chemicals,
Gardena, CA) en acetato de sodio 0,1M (Spectrum Chemicals, Gardena,
CA) a un pH de 5,5. También se elaboró un 25% de PEG en acetato de
sodio 0,1M a un pH de 5,5. Se añadieron las soluciones poliméricas
a los lotes 1-2 en las distintas proporciones
volumétricas tal como se describe en la Tabla 3. Seguidamente la
incubación y el aclarado tal como se describe en el Ejemplo 1. La
Tabla 3 proporciona los volúmenes de oligonucleótidos AS, PEG/PVP y
PEG en los lotes 1-2:
La Fig. 14 presenta una SEM del lote 1 (2:1
PEG:oligonucleótido). Se formó un precipitado de forma amorfa. Este
lote mostró de nuevo que la presencia de PVP desempeñaba un papel
importante en la formación de las microesferas.
La Fig. 15 presenta una SEM del lote 2 (2:1
PEG/PVP:oligonucleótido). Se fabricaron microesferas con una
distribución de tamaño de partícula de 0,2-6
\mum, y se ven también largas tiras de una fuente no identificada.
Este lote mostró que se podían formar microesferas sin
policatión.
Se realizaron estudios in vivo utilizando
el modelo de ratón NOD de la diabetes mellitus de Tipo 1. La
diabetes de Tipo 1 se manifiesta por la destrucción autoinmune de
las células pancreáticas beta productoras de insulina tal como se
ilustra en la Fig. 1. Se utilizaron oligonucleótidos AS en tres
aplicaciones en un intento de interferir en la destrucción
autoinmune de las células beta. El objetivo consistía en interferir
en la función de las células dendríticas direccionando los
transcritos primarios de CD40, CD80 y CD86, que codifican las
proteínas de la superficie de las células dendríticas necesarias
para la activación de las células T. Las células dendríticas con
bajos niveles de CD40, CD80 y CD86 son conocidas por favorecer la
red supresora de células inmunes in vivo. Estas cascadas
pueden resultar en la hiporrespuesta de las células T a las células
beta in vivo.
En el primer grupo de animales de prueba, las
células dendríticas se propagaron ex vivo desde los donantes
de médula ósea de ratones NOD. Las combinaciones de los tres
oligonucleótidos AS direccionados a los transcritos primarios de
CD40, CD80 y CD86 se añadieron a las células en cultivo tisular.
Después de la incubación, las células dendríticas transfectadas con
oligonucleótidos AS se inyectaron en receptores singenéticos de 5 a
8 semanas de edad (no diabéticos todavía). Se trata de una
aproximación de suministro ex vivo.
Paralelamente, se inyectaron directamente
microesferas de oligonucleótido AS en otros ratones NOD de la misma
edad. Se llevó a cabo una sola inyección en cada ratón así tratado.
Otro grupo de estos ratones NOD no se trató y sirvió de
control.
La Fig. 16 muestra que los ratones NOD no
tratados, de control, desarrollaron todos la diabetes a la edad de
23 semanas. El grupo tratado con células dendríticas transfectadas y
re-infundidas con oligonucleótido AS
(AS-ODN-DC) ex vivo mostró un
desarrollo retardado de la diabetes, con un 20% restante "Exento
de Diabetes", lo que indica que se mantienen los niveles de
glucosa dentro de un rango no diabético. Entre los ratones NOD
inyectados directamente in vivo con microesferas, un 71%
quedó "Exento de Diabetes" a las 43 semanas.
Un dúplex de ARN de interferencia corto marcado
con Cy3 fluorescente, siGLO Ciclofilina B siARN (Ratón), de
Dharmacon (Lafayette, CO). La secuencia de ARN de doble hebra se
muestra como Seq ID 4 y su complemento, Seq ID 5:
- Seq ID 4:
- Ciclofilina B siARN 5'-GGAAAGACUGUUCCAAAAAUU-3'
- Seq ID 5:
- Complemento 5'-UUUUUGGAACAGUCUUUCCUU-3'
Se preparó una solución acuosa del siARN en
solución de 15 mg/ml. Igualmente, se prepararon 15 mg/ml de
Poli-L-lisina\cdotHBr en agua
desionizada (poli-L-lisina
30.000-70.00 MW, Sigma). Se añadió la
Poli-L-lisina al siARN en una
proporción volumétrica de 1:1, tal como se describe en la Tabla 1.
La mezcla se agitó suavemente. Se elaboró una solución polimérica
al 25% que contenía un 12,5% de PVP (polivinilpirrolidona, 40.000
Dalton, Spectrum Chemicals, Gardena, CA) y un 12,5% de PEG
(polietilenglicol, 3.350 Dalton, Spectrum, Gardena, CA) en acetato
de sodio 1M (Spectrum, Gardena, CA) a un pH de 5,5. Se añadió la
solución polimérica a la mezcla de siARN /
poli-L-lisina en una proporción
volumétrica de 2:1 tal como se describe en la Tabla 4, que muestra
los volúmenes del dúplex siGLO siARN,
poli-L-lisina\cdotHBr y
PEG/PVP:
Se incubó el lote durante 30 minutos a 58ºC y
luego se enfrió sobre hielo durante 30 minutos. Al enfriarse, la
solución se volvió turbia y tuvo lugar una precipitación. Entonces
se centrifugó la suspensión y se eliminó el exceso de PEG/PVP. El
gránulo resultante se lavó mediante resuspensión del gránulo en agua
desionizada, centrifugación y eliminación del sobrenadante. Se
repitió tres veces el proceso de lavado. La suspensión condensada
acuosa se congeló a -80ºC y se liofilizó, para formar un polvo
seco de microesferas que comprendía el dúplex de siARN siGLO
Ciclofilina B marcado con Cy3 y
poli-L-lisina.
La Fig. 17 presenta una micrografía electrónica
de exploración (SEM) de un lote de las microesferas (proporción 1:1
poli-L-lisina:dúplex de siARN). Se
fabricaron así microesferas de 0,2-1,4 micras de
tamaño, con un tamaño medio de partícula de 0,48 nanómetros.
Se entenderá que las realizaciones de la
presente invención que han sido descritas son ilustrativas de
algunas de las aplicaciones de los principios de la presente
invención. Los especialistas en la materia pueden realizar
numerosas modificaciones sin apartarse del espíritu real y del
alcance de la invención. Varias características que se describen
aquí se pueden utilizar en cualquier combinación y no se limitan a
precisar combinaciones que se señalan específicamente aquí.
<110> Brown, Larry R.;
Bisker-Leib, Vered; Scott, Terrence L.; Lafreniere,
Deborah
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Microesferas de Oligonucleótidos,
Producción y Suministro de las mismas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6143PCT-2
(4362-0003)
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
12-05-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
Claims (31)
1. Microesferas que comprenden entre un 20 por
ciento en peso y un 100 por cien en peso de uno o más ácidos
nucleicos y que tienen un tamaño medio de partícula no superior a
aproximadamente 50 micras, caracterizadas porque dichas
microesferas están sustancialmente exentas de un polímero soluble en
agua utilizado en la preparación de microesferas.
2. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos comprenden
entre un 30 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las
microesferas.
3. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos comprenden
entre un 50 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las
microesferas.
4. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos comprenden
entre un 70 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las
microesferas.
5. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos comprenden
entre un 90 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las
microesferas.
6. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos comprenden al
menos un 95 por ciento en peso de las microesferas.
7. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichas microesferas contienen al menos
dos ácidos nucleicos diferentes.
8. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque al menos uno de los ácidos nucleicos es
un oligonucleótido.
9. Microesferas según la reivindicación 8,
caracterizadas porque dichas microesferas contienen al menos
dos oligonucleótidos diferentes.
10. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichas microesferas tienen un tamaño
medio de partícula no superior a 2 micras y una distribución de
tamaño de partícula de 0,04 micras a 8 micras.
11. Microesferas según la reivindicación 7,
caracterizadas porque dichas microesferas tienen un tamaño
medio de partícula no superior a 2 micras y una distribución de
tamaño de partícula de 0,04 micras a 8 micras.
12. Microesferas según la reivindicación 8,
caracterizadas porque dichas microesferas tienen un tamaño
medio de partícula no superior a 2 micras y una distribución de
tamaño de partícula de 0,04 micras a 8 micras.
13. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichas microesferas tienen un tamaño
medio de partícula no superior a 1 micra y una distribución de
tamaño de 0,2 micras a 4 micras.
14. Microesferas según la reivindicación 7,
caracterizadas porque dichas microesferas tienen un tamaño
medio de partícula no superior a 1 micra y una distribución de
tamaño de 0,2 micras a 4 micras.
15. Microesferas según la reivindicación 8,
caracterizadas porque dichas microesferas tienen un tamaño
medio de partícula no superior a 1 micra y una distribución de
tamaño de 0,2 micras a 4 micras.
16. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos se seleccionan
de entre el grupo compuesto de ADN, oligonucleótidos de ADN,
oligorribonucleótidos de ARN, oligonucleótidos híbridos de ADN/ARN,
mARN, siARN o tARN, y combinaciones de los mismos.
17. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichas microesferas se encuentran en
una suspensión.
18. Microesferas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque dichas microesferas se encuentran en
una formulación de polvo seco.
19. Proceso para producir microesferas
biológicamente activas que comprenden ácidos nucleicos mediante la
disolución de los ácidos nucleicos con un disolvente acuoso para
formar una composición, caracterizado porque se añade al
menos un polímero soluble en agua al disolvente, y enfriamiento de
dicha composición, caracterizado porque dichas microesferas
se forman durante dicho enfriamiento, teniendo dichas microesferas
un tamaño medio de partícula no superior a aproximadamente 50
micras.
20. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque se añade al menos un policatión a dicho
disolvente.
21. Proceso según la reivindicación 20,
caracterizado porque dicho policatión se selecciona de entre
el grupo compuesto de poli-lisina,
poli-ornitina, polietilenimina, prolamina,
protamina, polivinilpirrolidona, poliarginina, vinilamina y
combinaciones de las mismos.
22. Proceso según la reivindicación 21,
caracterizado porque dicho policatión es
poli-lisina.
23. Proceso según la reivindicación 21,
caracterizado porque dicho policatión es
poli-ornitina.
24. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque se añade al menos un polianión a dicho
disolvente.
25. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque dicho polímero
se selecciona de entre el grupo compuesto de un polisacárido,
polietilenglicol, polivinilpirrolidona y combinaciones de los
mismos.
26. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha formación se lleva a cabo con la
adición de un agente reticulante a la composición.
27. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha formación se lleva a cabo con la
adición de energía a la composición.
28. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha formación se lleva a cabo en
ausencia de un componente policatiónico en dicha composición.
29. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha formación se lleva a cabo en
ausencia de un componente reticulante en dicha composición.
30. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha formación se lleva a cabo en
ausencia de un componente polianiónico en dicha composición.
31. Proceso según la reivindicación 19,
caracterizado porque dicha formación se lleva a cabo en
ausencia de la aplicación de una fuente de energía para formar
dichas microesferas a partir de dicha composición.
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