DE69931166T2

DE69931166T2 - Co-lyophilisierter komplex umfassend einen nukleinsäurevektor und ein formulierungsagens

Info

Publication number: DE69931166T2
Application number: DE69931166T
Authority: DE
Inventors: Maria The Woodlands BRUNO; Jenna Houston TAGLIAFERRI; Luke Spring LAWSON; J. Mark The Woodlands LOGAN; Russ The Woodlands MUMPER
Original assignee: Urigen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Genetronics Inc
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: AU5345999A; EP1104309A2; JP4538150B2; CA2340416A1; US6534483B1; WO2000009086A2; DE69931166D1; ATE324913T1; CA2340416C; EP1104309B8; JP2002522468A; EP1104309B1; WO2000009086A3

Description

Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen colyophilisierten Komplex mit einem Nucleinsäurevektor und einem Formulierungswirkstoff.
Allgemeiner Stand der Technik
Keine der hierin bereitgestellten Informationen ist als Stand der Technik in Bezug auf die vorliegende Erfindung anerkannt, sondern wird lediglich um Unterstützen des Verständnisses des Lesers bereitgestellt.
Die Gentherapie hat sich zu einem Hauptforschungsbereich bei der Entwicklung von Arzneimitteln entwickelt. Praktischere und effektivere Genzuführungsverfahren helfen weiterhin bei der Weiterentwicklung der klinischen und/oder kommerziellen Anwendungen der Gentherapie, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie das Produkt in ausreichenden Mengen den targetierten Zellen zuführen.
In der Vergangenheit war die Inkorporation von Nucleinsäure in eine herkömmliche Dosisform aufgrund des chemischen Abbaus oder der physikalischen Aggregation der Nucleinsäure vor der Verabreichung eine Herausforderung. Das bevorzugte Verfahren zur Verabreichung eines Nucleinsäurekomplexes ist in einer flüssigen Form, daher umfassten frühere Verfahren das Lagern der Nucleinsäure in einer separaten Ampulle und das Vereinen der erforderlichen Komponenten kurz vor der Verabreichung. Dabei handelte es sich um ein im Allgemeinen wirksames Verfahren; es war jedoch verhältnismäßig kostenaufwändig und schwierig einzurichten und es brachte ein eher instabiles Produkt hervor, das etwas schwer zu verab reichen war. Die Stabilisierung von Polynucleotidkomplexen mittels Zugabe einer Kälteschutzmittelverbindung und Lyophilisieren der resultierenden Formulierung ist in Szoka et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 96/41873, veröffentlicht am 27. Dezember 1996, mit dem Titel „Dry Powder Formulations of Polynucleotide Complexes", beschrieben. WO9300807 beschreibt den Kälteschutz von verschiedenen Biomaterialien unter Verwendung einer Kombination von PEG, PVP, Hydroxyethylstärke, Dextran oder Ficoll, kombiniert mit einem Zucker, einer Aminosäure, einem Polyhydroxyalkohol oder einem Methylamin. WO 96/24664 beschreibt Zusammensetzungen zur Stabilisierung von lyophilisierten Enzymen. WO 96/34109 beschreibt das Einfrieren von Komplexen aus DNA und kationischem Lipid in 1%-igem Glycerin.
Mumper et al., Pharmaceutical Research, 13, Nr. 5, Seite 701 (1996), und Mumper et al., Journal of Controlled Release, 52, Nr. 1-2, Seiten 191-203, beschreiben die Verwendung von nicht kondensierenden Polymeren, insbesondere PVP und PVA, als Transfektionsagenzien.
In früheren Versuchen, Nucleinsäureformulierungen herzustellen, bestand das Mischverfahren in der Regel in einem herkömmlichen, langsamen (nicht jedoch kontrollierten) Mischen des DNA-Komplexes und des Formulierungswirkstoffs (Formulierungsagens). Das Ergebnis war ein inhomogener Komplex mit Teilchen von verhältnismäßig beträchtlicher Größe (ungefähr 150 Nanometer). Zur einfachen Verabreichung des DNA-Komplexes wäre es wünschenswert, eine kleinere und einheitlichere Teilchengröße zu haben. Folglich besteht trotz des Obigen Bedarf an einer homogenisierten Nucleinsäure-Einzelampullenformulierung mit einer verhältnismäßig kleinen und einheitlichen Teilchengröße, insbesondere einer vor Abbau geschützten und mit einer gesteigerten Fähigkeit zum Transfizieren von Zellen hinsichtlich der nicht formulierten Nucleinsäure, sowie an einfacheren Verfahren zur Herstellung und Lagerung.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung zeichnet sich durch Zusammensetzungen von isolierten, angereicherten oder gereinigten Nucleinsäuren, vorzugsweise DNA-Plasmid, in einer herkömmlichen Dosisform ohne erhebliche Minderung ihrer biologischen Aktivität aus. Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen colyophilisierten Komplex mit einem Nucleinsäurevektor und einem Formulierungswirkstoff, der Transfektionsraten erhöht, bereit, wobei eine den Nucleinsäurevektor enthaltende Lösung und eine den Formulierungswirkstoff enthaltende Lösung zugemischt werden, um vor der Colyophilisation eine Lyophilisationslösung zu bilden, und wobei der Formulierungswirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, zu der gehören: ein Polyvinylpyrrolidon (PVP), ein Polyvinylalkohol (PVA), ein PVP-PVA-Copolymer, ein Poloxamer und ein Poloxamin. Die Formulierungen der Erfindung können als ein homogenisierter Einzelampullenkomplex, der mittels Inline-Mischen erzeugt wurde, wobei der resultierende Komplex zur Lagerung lyophilisiert und zur Verabreichung aufhydriert wird. Das Inline-Mischen setzt vorzugsweise zwei Rohre ein, die in einem Mischer münden und die zum Produzieren einer Mischung aus einer Nucleinsäure und einem Formulierungswirkstoff dienen. Der Komplex in dieser Erfindung, obgleich er in einer einzigen Ampulle formuliert wurde, bewahrt die günstigen physikalischen Eigenschaften und die günstige Wirksamkeit. Die Verwendung dieser Einzelampullenformu lierung wird in Folgendem resultieren: (1) verringerte Herstellungskosten, (2) einfache Herstellung und Qualitätskontrollprüfung, (3) Produktstabilität und (4) verbesserte Doktor/Patient-Compliance und relativ einfache Verabreichung. Diese Merkmale und die folgenden Einzelheiten bieten gegenüber den zuvor verwendeten Formulierungen Vorteile.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einem „Inline-Mischer" hergestellt werden, womit eine Vorrichtung gemeint ist, durch die miteinander in Kontakt zu bringende Flüssigkeiten geleitet werden und die für kontinuierliche oder halbkontinuierliche Verfahren verwendet wird. Der Mischer kann Rohrleitungen beinhalten und bildet zusammen mit der Flüssigkeit ein eingeschränktes Fließsystem. Das Flüssigkeitsvolumen im Mischer wird nur von der Größe und der Form des Mischers begrenzt.
Die Mischer können mechanisches Rühren einsetzen, wenn jedoch kein mechanisches Rühren angewendet wird, können andere Verfahren, wie Strahlmischer, Injektoren, Öffnungen, Mischdüsen, Ventile und Pumpen verwendet werden. Viele Inline-Mischer werden großtechnisch in chemischen und Verfahrenstechnikanwendungen verwendet, wie bei der Behandlung von Erdöldestillaten, dem Veredeln von pflanzlichen Ölen, in manchem Metallextraktionen und anderen Anwendungen. Da viele Typen dieser Mischer im Handel zur Verwendung in der Chemie und Verfahrenstechnik verfügbar sind, könnten Fachmänner andere Inline-Mischer leicht mit geringfügigen Abänderungen entwerfen und herstellen, die noch immer zum Behandeln von Nucleinsäuren, wie hierin beschrieben, geeignet wären.
Der Inline-Mischer setzt sich vorzugsweise aus zwei Einlässen in einer Y-förmigen Anordnung zusammen, die sich an einem Schnittpunkt verbinden, um einen einzigen Auslass zu bilden. In einer Ausführungsform der Erfindung beinhaltet der Inline-Mischer einen statischen Mischer hinter dem Y-förmigen Schnittpunkt.
Mit „Nucleinsäuremolekülen" sind Polynucleotide gemeint, d. h. ein Polymer von Desoxyribonucleotiden (DNA) oder Ribonucleotiden (RNA), wozu nackte DNA, eine Nucleinsäurekassette, nackte RNA, in Vektoren oder Viren enthaltene Nucleinsäure, sowohl RNA und DNA, einschließlich: cDNA, genomische DNA, Plasmid-DNA oder kondensierte Nucleinsäure, mit kationischen Lipiden formulierte Nucleinsäure, mit Peptiden formulierte Nucleinsäure, Antisense-Moleküle, kationische Substanzen, RNA oder mRNA zählen. Zu Beispielen geeigneter Nucleinsäuremoleküle zählen die in Szoka et al., internationale Anmeldung „Dry Powder Formulations of Polynucleotide Complexes", internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 96/41873, veröffentlicht am 27. Dezember 1996, und Rolland et al., internationale Patentveröffentlichung WO 96/21470, veröffentlicht am 18. Juli 1996, mit dem Titel "Formulated Nucleic Acid Compositions and Methods of Administering the Same for Gene Therapy", beschriebenen. Dies sind nur Beispiele und nicht einschränkend gedacht. Darüber hinaus können die Nucleinsäuremoleküle ein oder mehrere Plasmide mit einem eukaryontischen Promotor sein, der ein oder mehrere therapeutische Moleküle exprimiert. Die Nucleinsäuremoleküle sind in bestimmten Gesichtspunkten und Ausführungsformen isoliert, gereinigt oder angereichert, wie im Folgenden in der ausführlichen Beschreibung im Abschnitt I.D. definiert.
Das Nucleinsäuremolekül kann aus einer natürlichen Quelle mittels cDNA-Klonierung oder Subtraktionshybridisierung isoliert oder von Hand synthetisiert werden. Das Nucleinsäuremolekül kann von Hand mittels des Triester-Syntheseverfahrens oder Verwendung eines DNA-Syntheseautomats synthetisiert werden.
Der Ausdruck „cDNA-Klonierung" bezieht sich auf das Hybridisieren eines kleinen Nucleinsäuremoleküls, einer Sonde, an genomische cDNA. Die Sonde hybridisiert (bindet) an komplementäre Sequenzen von cDNA.
Der Ausdruck „komplementär" beschreibt zwei Nucleotide, die miteinander mehrere günstige Wechselwirkungen bilden können. Adenin beispielsweise ist zu Thymin komplementär, da sie zwei Wasserstoffbrückenbindungen bilden können. Analog dazu sind Guanin und Cytosin komplementär, da sie drei Wasserstoffbrückenbindungen bilden können. Wenn eine Nucleinsäuresequenz die folgende Sequenz von Basen enthält: Thymin, Adenin, Guanin und Cytosin, wäre ein „Komplement" dieses Nucleinsäuremoleküls folglich ein Molekül, das Adenin an Stelle von Thymin, Thymin an Stelle von Adenin, Cytosin an Stelle von Guanin und Guanin an Stelle von Cytosin enthält. Da das Komplement eine Nucleinsäuresequenz enthalten kann, die optimale Wechselwirkungen mit dem Mutternucleinsäuremolekül bildet, kann ein solches Komplement mit hoher Affinität an sein Muttermolekül binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die verabreichte Nucleinsäure Plasmid-DNA, die einen „Vektor" enthält. Die Nucleinsäure kann ein Plasmid-DNA-Vektor mit einem eukaryontischen Promotor, der ein Protein mit potentieller therapeutischer Wirkung exprimiert, wie beispielsweise: hGH, VEGF, EPO, IGF-1, TPO, Faktor IX, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-12 oder dergleichen, sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Plasmid" auf ein Konstrukt, das sich aus genetischem Material (d. h. Nucleinsäuren) zusammensetzt. Es enthält genetische Elemente, die derart angeordnet sind, dass eine inserierte kodierende Sequenz in eukaryontischen Zellen transkribiert werden kann. Folglich ist das Plasmid vorzugsweise ein extrachromosomales genetisches Element, das aus einer zirkulären (kreisförmigen) Duplex-DNA besteht, die sich unabhängig von chromosomaler DNA replizieren kann. Plasmide werden beim Gentransfer als das Vehikel verwendet, über das DNA-Fragmente in einen Wirtsorganismus eingeführt werden, und stehen mit der Übertragung von Antibiotikaresistenz in Zusammenhang.
Der Ausdruck „Vektor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Konstruktion, die sich aus genetischem Material zusammensetzt, das zur direkten Transformation einer targetierten Zelle entworfen ist. Ein Vektor enthält mehrere genetische Materialien, vorzugsweise angrenzende DNA- oder RNA-Fragmente, z. B. von einem Plasmid, Cosmid, Plasmid oder Bakteriophagen abgeleitete oder mittels chemischen oder enzymatischen Mitteln synthetisierte DNA, die derart positionell und sequentiell mit anderen erforderlichen Elementen ausgerichtet sind, dass die Nucleinsäure transkribiert und bei Bedarf in die transfizierten Zellen translatiert werden kann. Der Vektor kann zu diesem Zweck eine oder mehrere einzigartige Restriktionsstellen enthalten und kann zur autonomen Replikation in einem definierten Wirt oder Organismus in der Lage sein, so dass die klonierte Sequenz reproduziert wird. Der Vektor kann eine lineare, zirkuläre oder supergeknäuelte Anordnung (supercoiled) aufweisen und kann mit anderen Vektoren oder anderen Materialien zu bestimmten Zwecken komplexiert sein. Die Komponenten eines Vektors können ein DNA-Molekül beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, das Folgendes inkorporiert: (1) eine Sequenz, die für ein therapeutisches oder gewünschtes Produkt kodiert; und (2) regulatorische Elemente für Transkription, Translation, RNA-Stabilität und Replikation.
In der vorliegenden Erfindung umfasst der bevorzugte Vektor die folgenden Elemente, die sequentiell in einem entsprechenden Abstand verknüpft sind, um eine funktionale Expression zu ermöglichen: einen Promotor, eine 5'-mRNA-Leader-Sequenz, eine Translationsinitiationsstelle, eine Nuclein säurekassette, die die zu exprimierende Sequenz enthält, eine 3'-untranslatierte Region und eine Polyadenylierungssignalsequenz. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Expressionsvektor" auf einen DNA-Vektor, der alle Informationen enthält, die zum Produzieren eines rekombinanten Proteins in einer heterologen Zelle erforderlich sind.
Darüber hinaus kann der Ausdruck „Vektor", wie hierin verwendet, auch virale Vektoren einschließen, obgleich nichtvirale Vektoren bevorzugt sind. Ein „viraler Vektor" ist in diesem Sinne einer, der mittels der Inklusion eines Teils eines viralen Genoms in dem Vektor, z. B. einem Verpackungssignal, physikalisch in ein Viruspartikel inkorporiert ist, und ist nicht lediglich DNA oder ein lokalisiertes Gen, das aus einem Teil einer viralen Nucleinsäure entnommen wurde. Obgleich ein Teil eines viralen Genoms in einem Vektor der vorliegenden Erfindung vorliegen kann, verursacht dieser Teil somit keine Inkorporation des Plasmids in ein Viruspartikel und ist folglich nicht in der Lage, ein infektiöses Viruspartikel zu produzieren.
Ein Vektor, wie hierin verwendet, kann außerdem DNA-Sequenzelemente enthalten, die eine extrachromosomale (episomale) Replikation der DNA ermöglichen. Vektoren, die zur episomalen Replikation in der Lage sind, werden als extrachromosomale Moleküle erhalten und können sich replizieren. Diese Vektoren werden nicht durch einfachen Abbau eliminiert, sondern werden weiter kopiert. Diese Elemente können von einem viralen Genom oder einem Genom eines Säugers abgeleitet sein. Sie stellen eine längerfristige oder „andauernde" Expression bereit, wie unten beschrieben.
Der Ausdruck „andauernde Expression", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung von Genen in die Zelle zusammen mit genetischen Elementen, die episomale (d. h. extrachromosomale) Replikation ermöglichen. Dies kann in einer offenbar stabilen Transformation der Zelle ohne den Einbau des neuartigen genetischen . Materials in das Chromosom der Wirtszelle resultieren.
„Stabile Expression", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Einbau von genetischem Material in Chromosomen der targetierten Zelle, wo es zu einer dauerhaften Komponente des genetischen Materials in jener Zelle wird. Eine Genexpression nach stabilem Einbau kann die Charakteristika der Zelle und deren Nachkommen, die bei der Replikation entstehen, dauerhaft verändern, was in einer stabilen Transformation resultiert.
Der Vektor kann zum Bereitstellen von Expression einer Nucleinsäuresequenz in Gewebe verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird diese Expression vorzugsweise verstärkt, indem einem mRNA-Transkript aus der Nucleinsäuresequenz Stabilität verliehen und/oder Sekretion des therapeutischen Proteins bereitgestellt wird. Die Expression schließt die effektive Transkription eines inserierten Gens oder einer Nucleinsäuresequenz in dem Vektor ein. Expressionsprodukte können Proteine sein, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, reinem Protein (Polypeptid), Glykoprotein, Lipoprotein, Phosphoprotein oder Kernprotein. Expressionsprodukte können auch RNA sein. Die Nucleinsäuresequenz ist in einer Nucleinsäurekassette enthalten. Die Expression der Nucleinsäure kann kontinuierlich oder von endogenen oder exogenen Stimuli gesteuert sein.
Der Ausdruck „steuern" oder „gesteuert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Expression von Genprodukten (Protein oder RNA) in ausreichend hohen Niveaus, so dass eine therapeutische Wirkung erzielt wird. Niveaus, die für eine therapeutische Wirkung ausreichend sind, sind niedriger als toxische Niveaus. Expressionsniveaus für eine therapeutische Wirkung in ausgewählten Geweben entsprechen reproduzierbarer Kinetik der Aufnahme, Eliminierung aus der Zelle, posttranslationelle Verarbeitung und Genexpressionsniveaus und in bestimmten Fällen regulierte Expression als Antwort auf bestimmte endogene oder exogene Stimuli (z. B. Hormone, Arzneimittel).
Der Ausdruck „Nucleinsäurekassette", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das betreffende genetische Material, das für ein Protein oder eine RNA kodiert. Die Nucleinsäurekassette ist in dem Vektor derart positionell und sequen tiell ausgerichtet, dass die Nucleinsäure in der Kassette in RNA transkribiert und bei Bedarf in ein Protein in dem transformierten Gewebe oder der transformierten Zelle translatiert werden kann. Vorzugsweise weist die Kassette 3'- und 5'-Enden auf, die zur einfachen Insertion in einen Vektor eingerichtet sind, z. B. weist sie an jedem Ende Restriktionsendonucleasestellen auf.
Der Ausdruck „Gewebe", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Ansammlung von Zellen, die darauf spezialisiert sind, eine bestimmte Funktion durchzuführen, oder kann eine einzige Zelle einschließen. Die Zellen können von ein und derselben Art oder verschiedener Art sein.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Nucleinsäure eine kodierende Region, die transkriptionell mit einer Transkriptionskontrollsequenz verknüpft ist.
In diesem Zusammenhang bedeutet „transkriptionell verknüpft", dass die Transkription in einem zur Transkription geeigneten System unter der Leitung der Kontrollsequenz bzw. den Kontrollsequenzen initiieren und durch Sequenzen fortfahren wird, die transkriptionell mit jener Kontrollsequenz bzw. jenen Kontrollsequenzen verknüpft sind. Vorzugsweise wird in dem resultierenden Transkript keine Mutation geschaffen, die das resultierende Translationsprodukt verändern würde.
Der Ausdruck „kodierende Region" oder „kodierende Sequenz" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes Genprodukt kodiert, dessen Expression gewünscht ist, entsprechend den normalen Basenpaarungs- und Codongebrauchsbeziehungen. Folglich muss die kodierende Sequenz in eine solche Beziehung zu Transkriptionskontrollsequenzen (die möglicherweise Kontrollelemente und Translationsinitiations- und Stoppcodons enthalten) gebracht werden, dass ein Transkript entsprechender Länge produziert und in der Translation im entsprechenden Leseraster resultieren wird, um ein funktionales gewünschtes Produkt zu produzieren.
Der Ausdruck „Transkriptionskontrollsequenz" bezieht sich auf Sequenzen, die die Rate der Transkription einer transkriptionell verknüpften kodierenden Region steuern. Folglich kann der Ausdruck Elemente wie Promotoren, Operatoren und Enhancer beinhalten. Für eine bestimmte Transkriptionseinheit wird die Transkriptionskontrollsequenz mindestens eine Promotorsequenz enthalten.
Das Plasmid kann in bevorzugten Ausführungsformen außerdem eine 3'-untranslatierte Region eines Wachstumshormons enthalten, vorzugsweise von einem humanen Wachstumshormongen.
Eine „3'-untranslatierte Region eines Wachstumshormons" ist eine Sequenz, die sich stromabwärts (d. h. 3') der Region befindet, die für Materialpolypeptid kodiert, und die zumindest einen Teil der Sequenz des natürlichen 3'-UTR/-Poly(A)-Signals von einem Wachstumshormongen, vorzugsweise dem humanen Wachstumshormongen, enthält. Diese Region wird im Allgemeinen transkribiert, jedoch nicht translatiert. Für die Expression in eukaryontischen Zellen ist es im Allgemeinen bevorzugt, die Sequenz einzubinden, die die Zugabe eines Poly-A-Schwanzes signalisiert. Wie auch andere synthetische genetische Elemente weist ein synthetisches 3'-UTR/Poly(A)-Signal eine Sequenz auf, die sich von natürlich vorkommenden UTR-Elementen unterscheidet. Die Sequenz kann modifiziert sein, beispielsweise durch die Deletion von ALU-Wiederholungssequenzen. Die Deletion solcher ALU-Wiederholungssequenzen dient dazu, die Möglichkeit homologer Rekombination zwischen der Expressionskassette und genomischem Material in einer transfizierten Zelle zu verringern.
Das Plasmid enthält vorzugsweise einen Promotor, eine TATA-Box, eine CAP-Stelle und ein erstes Intron und eine Intron/Exon-Grenze in einer zur Expression der kodierenden Sequenz geeigneten Beziehung. Das Plasmid kann außerdem eine 5'-mRNA-Leader-Sequenz, die zwischen dem Promotor und der kodierenden Sequenz inseriert ist, oder eine Intron/5'-UTR von einem α-Actingen aus einem Hühnerskelett enthalten. Zudem kann das Plasmid eine Nucleotidsequenz aufweisen, bei der es sich um ein und dieselbe Plasmidnucleotidsequenz eines beliebigen der hierin beschriebenen Plasmide handelt.
Das Plasmid kann auch Folgendes enthalten: (a) eine erste Transkriptionseinheit, die eine erste Transkriptionskontrollsequenz enthält, die transkriptionell mit einer ersten 5'-untranslatierten Region, einem ersten Intron, einer ersten kodierenden Sequenz und einem ersten 3'-UTR/Poly(A)-Signal (UTR = untranslatierte Region) verknüpft ist, wobei das erste Intron zwischen der Kontrollsequenz und der ersten kodierenden Sequenz inseriert ist; und (b) eine zweite Transkriptionseinheit, die eine zweite Transkriptionskontrollsequenz enthält, die transkriptionell mit einer zweiten 5'-untranslatierten Region, einem zweiten Intron, einer zweiten kodierenden Sequenz und einem zweiten 3'-UTR/Poly(A)-Signal verknüpft ist, wobei das zweite Intron zwischen der Kontrollsequenz und der zweiten kodierenden Sequenz inseriert ist.
Darüber hinaus kann der Inline-Mischer eine oder mehrere Flüssigkeiten enthalten, von denen mindestens eine ein Formulierungswirkstoff ist. Der Formulierungswirkstoff ist vorzugsweise ein Lipid, ein Peptid, ein Polymer oder ein kleines Molekül wie Europium. In einer Ausführungsform ist der Formulierungswirkstoff auch eine schützende, wechselwirkende, nicht kondensierende Verbindung.
Formulierungswirkstoffe sind Verbindungen, die die lokalisierte Bioverfügbarkeit einer Nucleinsäure verlängern: d. h. Polyvinylpyrrolidone; Polyvinylalkohole; Poloxamere (Pluronics) (Blockcopolymere von Propylenoxid und Ethylenoxid; die relativen Mengen der zwei Teileinheiten können in verschiedenen Poloxameren variieren); Poloxamine (Tetronics). Manche dieser Verbindungen können als schützende, wechselwirkende, nicht kondensierende Verbindungen (protective, interactive, non-condensing compounds, PINC) verwendet und als solche betrachtet werden und andere können Retardverbindungen sein, wohingegen manche unter den jeweiligen geeigneten Bedingungen auf jede der beiden Weisen verwendet werden können.
Mit „die lokalisierte Bioverfügbarkeit einer Nucleinsäure verlängern" ist gemeint, dass eine an einen Organismus in einer Zusammensetzung, die einen Formulierungswirkstoff umfasst, verabreichte Nucleinsäure für einen längeren Zeitraum zur Aufnahme durch Zellen verfügbar sein wird, als wenn sie in einer Zusammensetzung ohne eine solche Verbindung verabreicht wird, beispielsweise wenn sie in einer Kochsalzlösung verabreicht wird. Diese gesteigerte Verfügbarkeit von Nucleinsäure für Zellen könnte beispielsweise aufgrund einer verlängerten Dauer des Kontakts zwischen der Zusammensetzung, die die Nucleinsäure enthält, und einer Zelle oder aufgrund des Schutzes der Nucleinsäure vor einem Angriff von Nucleasen eintreten. Die Verbindungen, die die lokalisierte Bioverfügbarkeit einer Nucleinsäure verlängern, sind zur inneren Verabreichung geeignet.
Mit „zur inneren Verabreichung geeignet" ist gemeint, dass die Verbindungen dazu geeignet sind, in das Gewebe eines Organismus verabreicht zu werden, beispielsweise in einen Muskel oder in einen Gelenkraum, epidermal, intrakutan oder subkutan. Zu Eigenschaften, die eine Verbindung zur inneren Verabreichung geeignet machen, zählen beispielsweise das Fehlen eines hohen Grads an Toxizität für den Organismus insgesamt.
Die PINC fördert die Zuführung des Nucleinsäuremoleküls an Säugerzellen in vivo und vorzugsweise enthält das Nucleinsäuremolekül eine kodierende Sequenz für ein in der Zelle zu exprimierendes Genprodukt. In vielen Fällen ist das entsprechende Genprodukt ein Polypeptid oder Protein. Vorzugsweise wird die PINC unter derartigen Bedingungen verwendet, dass die PINC kein Gel bildet oder dass zum Zeitpunkt der Verabreichung bei etwa 30-40 °C keine Gelform vorliegt. Somit liegt die PINC in diesen Zusammensetzungen in einer Konzentration von 30 (w/v) oder weniger vor. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die PINC-Konzentration noch geringer, beispielsweise 20 % oder weniger, 10 % oder weniger, 5 % oder weniger oder 1 % oder weniger. Somit unterscheiden sich diese Zusammensetzungen hinsichtlich der Verbindungskonzentration und funktionalen Wirkung von Anwendungen dieser oder ähnlicher Verbindungen, bei denen die Verbindungen in höheren Konzen trationen verwendet werden, beispielsweise bei der von Ethylenglykol vermittelten Transfektion von pflanzlichen Protoplasten oder der Bildung von Gelen zur Arzneimittel- oder Nucleinsäurezuführung. Im Allgemeinen sind die PINCs unter den Bedingungen, in denen sie als PINCs verwendet werden, nicht in Gelform, obwohl bestimmte der Verbindungen unter manchen Bedingungen Gele bilden können.
In Verbindung mit den schützenden, wechselwirkenden, nicht kondensierenden Verbindungen bedeutet der Ausdruck „nicht kondensierend", dass eine assoziierte Nucleinsäure durch die Wechselwirkung mit der PINC in den Konzentrationen, die in den Zusammensetzungen angewendet werden, nicht kondensiert oder kollabiert wird. Folglich unterscheiden sich die PINCs von der Art und/oder Konzentration von solchen Kondensationspolymeren. Zu Beispielen von allgemein verwendeten Kondensationspolymeren zählen Polylysin und Kaskadenpolymere (sphärische Polykationen).
Der Ausdruck „schützt" oder „schützend" oder „geschützt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Effekt der Wechselwirkung zwischen einer solchen Verbindung und einer Nucleinsäure, so dass die Rate des Abbaus der Nucleinsäure in einer bestimmten Umgebung verlangsamt wird, wodurch die lokalisierte Bioverfügbarkeit des Nucleinsäuremoleküls verlängert wird. Ein derartiger Abbau kann in einer Vielfalt an unterschiedlichen Faktoren begründet sein, die spezifisch die enzymatische Wirkung einer Nuclease einschließen. Die Schutzwirkung kann auf verschiedene Weisen bereitgestellt werden, beispielsweise mittels Ausschluss der Nucleasemoleküle oder Ausschluss von Wasser.
Der Ausdruck „wechselwirkend", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Wechselwirkung zwischen PINCs und Nucleinsäuremolekülen und/oder Zellwandkomponenten. Vorzugsweise sind PINC-Polymere zum direkten Wechselwirken mit Teilen von Nucleinsäuremolekülen und/oder Zellwandkomponenten in der Lage. Diese Wechselwirkungen können die Transfektion erleichtern, indem sie beispielsweise dabei helfen, den Komplex aus Nucleinsäuremolekül und PINC als Resultat biochemischer Wechselwirkungen zwischen der PINC und der Zellwand eng mit der Zellwand assoziieren und dadurch die Transfektion vermitteln. Diese Wechselwirkungen können außerdem durch enges Assoziieren mit dem Nucleinsäuremolekül Schutz vor Nucleasen liefern.
Ebenfalls in Verbindung mit derartigen Verbindungen und einem assoziierten Nucleinsäuremolekül bedeutet der Ausdruck „fördert die Zuführung", dass zumindest unter derartigen Bedingungen, dass die Mengen von PINC und Nucleinsäure optimiert sind, eine größere biologische Wirkung als bei der Zuführung von Nucleinsäure in Kochsalzlösung erzielt wird. Folglich ist in Fällen, in denen die Expression eines von der Nucleinsäure kodierten Genprodukts gewünscht ist, das Expressionsniveau, das mit der Zusammensetzung aus PINC und Nucleinsäure erreicht wird, höher als die mit derselben Nucleinsäurenmenge in Kochsalzlösung erzielte Expression, für die Zuführung mit einem Verfahren, das für die bestimmte Kombination aus PINC und kodierender Sequenz geeignet ist.
In bevorzugten Ausführungsformen der obigen Zusammensetzungen ist die PINC Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA) oder ein PVP-PVA-Copolymer. In Zusammensetzungen, in denen ein Poloxamer (Pluronics) verwendet wird, ist die Nucleinsäure vorzugsweise kein viraler Vektor, d. h. die Nucleinsäure ist ein nichtviraler Vektor.
Die PINC kann mit einem Targeting-Liganden gebunden sein. Derartige Targeting-Liganden können in einer Vielfalt an verschiedenen Arten vorliegen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Galactosylreste, Fucosalreste, Mannosylreste, Carnitinderivate, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Peptidliganden und DNA-bindende Proteine. Die Targeting-Liganden können mit Rezeptoren auf Zellen binden, wie antigenpräsentierende Zellen, Hepatozyten, Myozyten, Epithelzellen, Endothelzellen und Krebszellen.
In Verbindung mit der Assoziation eines Targeting-Liganden und einer PINC bedeutet der Ausdruck „gebunden mit", dass die Teile eine Wechselwirkung miteinander haben, so dass die physikalische Assoziation thermodynamisch begünstigt ist, was zumindest ein lokales Minimum der freien Energiefunktion für diese Assoziation darstellt. Eine solche Wechselwirkung kann kovalente Bindung oder nichtkovalente Wechselwirkungen, wie ionische Wechselwirkungen, Ausbildung von Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Kombinationen solcher Wechselwirkungen involvieren.
Obgleich der Targeting-Ligand verschiedener Art sein kann, ist der Ligand in einer Ausführungsform ein Antikörper. Sowohl monoklonale Antikörper als auch polyklonale Antikörper können eingesetzt werden.
Die Nucleinsäure kann auch in verschiedenen Formen vorliegen. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure nicht mit einer Verbindung bzw. Verbindungen assoziiert, die die physikalische Form verändert bzw. verändern; in anderen Ausführungsformen wird die Nucleinsäure jedoch kondensiert (wie mit einem Kondensationspolymer), mit kationischen Lipiden formuliert, mit Peptiden formuliert oder mit kationischen Polymeren formuliert.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die schützende, wechselwirkende, nicht kondensierende Verbindung Polyvinylpyrrolidon und/oder das Plasmid ist in einer Lösung mit 0,5 % bis 50 % PVP, mehr bevorzugt etwa 5 % PVP. Die DNA ist vorzugsweise zu mindestens etwa 80 % supergeknäuelt, mehr bevorzugt zu mindestens etwa 90 % supergeknäuelt und am meisten bevorzugt zu mindestens etwa 95 % supergeknäuelt.
Der Formulierungswirkstoff kann auch die Nucleinsäure vor dem Gefrieren schützen und erhöht die Transfektionsraten. Die Wirksamkeit des Formulierungswirkstoffs in Bezug auf diese zwei Funktionen lässt sich beispielsweise bei einem Vergleich von Ergebnissen von Gelelektrophoresen sowohl der Nucleinsäure für sich als auch mit dem Formulierungswirkstoff erkennen, die nach dem Auftauen der Lösungen ausgeführt wurden. Das resultierende Gel der Nucleinsäure mit dem Formulierungswirkstoff zeigt einen viel höheren Prozentanteil an supergeknäueltem Plasmid. Dieser höhere Prozentanteil an supergeknäueltem Plasmid wird folglich in einer höheren Transfektionsrate resultieren.
Der Ausdruck „Formulierungswirkstoff", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Wirkstoff (ein Agens), der mit der Nucleinsäure einen Komplex bildet. Dieser Molekülkomplex ist mit dem Nucleinsäuremolekül entweder auf kovalente oder nichtkovalente Weise assoziiert. Der Formulierungswirkstoff sollte dazu in der Lage sein, Nucleinsäuremoleküle in einem stabilen Zustand zu transportieren und die gebundenen Nucleinsäuremoleküle in das Zellinnere freizusetzen. DNA-Extraktionsverfahren, Immunfluoreszenzverfahren oder wohl bekannte Reportergenverfahren, wie beispielsweise CAT oder Plasmide enthaltendes LacZ, könnten zum Bestimmen der Transfektionseffizienz verwendet werden. Der Formulierungswirkstoff sollte außerdem dazu in der Lage sein, mit Nucleinsäuremolekülen assoziiert und lyophilisiert oder gefriergetrocknet und vor der Zuführung aufhydriert zu werden.
Darüber hinaus kann der Formulierungswirkstoff den lysosomalen Abbau der Nucleinsäuremoleküle mittels Endosomenlyse verhindern. Des Weiteren kann der Formulierungswirkstoff einen effizienten Transport des Nucleinsäuremoleküls durch das Zytoplasma der Zelle zur Kernmembran und in den Zellkern ermöglichen und Schutz bieten.
In bevorzugten Ausführungsformen verlängert der Formulierungswirkstoff die Dauer und/oder verstärkt die Intensität der Expression des gewünschten Gens.
Mit „Dauer" ist die Zeitspanne gemeint, in der ein gewünschtes Gen exprimiert wird, wie beispielsweise in Monaten, Wochen, Tagen, Stunden, Minuten und/oder Sekunden gemessen.
Mit „Intensität" ist die Geschwindigkeit gemeint, mit der ein gewünschtes Gen exprimiert wird, beispielsweise Masse oder Volumen, geteilt durch Zeit.
Mit „Expression" ist die Produktion des kodierten Produkts gemeint, vorzugsweise mittels Transkription und Translation des gewünschten Gens oder der gewünschten Nucleinsäure sequenz.
Mit „gewünschtem Gen" ist eine Bezugnahme auf ein beliebiges Gen oder eine beliebige Nucleinsäuresequenz gemeint, das bzw. die für ein Produkt kodiert, das von der Person gewünscht wird, die den formulierten Nucleinsäurekomplex verwendet. Zu Beispielen von gewünschten Genen zählen CAT und therapeutische Agenzien (die dazu in der Lage sind, ein oder mehrere Symptome einer Erkrankung zumindest teilweise zu reduzieren oder verhindern), wie IL-2 und alle anderen Cytokine, als auch intrazelluläre Proteine (z. B. Thymidinkinase).
Mit dem Ausdruck „Cytokine" ist eine Bezugnahme auf die konventionell anerkannte Gruppe von immunogenen Proteinen gemeint, wie IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-18, TNF-α, INF-α, IFN-α und IFN-γ.
Es wird ein Verfahren zum Herstellen eines Inline-Mischers beschrieben, der Nucleinsäuremoleküle enthält, wie oben beschrieben. Das Verfahren umfasst den Schritt des Gebens der Nucleinsäuremoleküle in den Inline-Mischer.
Der Winkel zwischen den zwei Einlässen beträgt vorzugsweise zwischen 45 und 300 Grad, mehr bevorzugt zwischen 90 und 240 Grad und beträgt am meisten bevorzugt zwischen 120 und 180 Grad.
Es wird außerdem ein Verfahren zum Verwenden eines Inline-Mischers beschrieben, das den Schritt des Mischens der Nucleinsäuremoleküle mit einer oder mehreren anderen Flüssigkeiten (einschließlich Emulsionen, Kolloidsuspensionen und anderen Lösungen) in dem Inline-Mischer umfasst, vorzugsweise an der Stelle, an der die Flüssigkeiten kontinuierlich gemischt werden. Während die Flüssigkeiten gemischt werden, werden sie vorzugsweise mittels einer Pumpe in die Y-förmige Anordnung gegeben, wobei die Flüssigkeiten auf kontinuierliche, einer Spritze ähnliche Weise zugegeben werden. Die Flüssigkeiten können mit einer bestimmten Reynolds-Zahl zugegeben werden, vorzugsweise höher als 373, mehr bevorzugt höher als 560, am meisten bevorzugt höher als 746, zur optimalen Verhinderung der Aggregation der Formulierung. Nicht-Newtonsches Fließen (Reynolds-Zahlen, die höher als 1000 sind, unter Erzeugung von Turbulenzen beim Mischen) kann möglich sein.
Mit „Reynolds-Zahlen" ist der Quotient der Trägheitskräfte in der Apparatur, geteilt durch die Viskositätskräfte in der Apparatur gemeint.
Die Flüssigkeiten können unter Bedingungen vereint werden, die eine im Wesentlichen homogene Mischung mit Teilchen mit einer bevorzugten einheitlichen Größe von vorzugsweise weniger als oder gleich 100 nm, mehr bevorzugt weniger als oder gleich 75 nm, am meisten bevorzugt weniger als oder gleich 50 nm produzieren.
Mit „einheitliche Größe" ist gemeint, dass die meisten Teilchen in dem Komplex ungefähr dieselbe Größe aufweisen und kleiner als der spezifizierte Wert sind. Um eine einheitliche Größe aufzuweisen, müssen die Teilchen nicht eine identische Größe aufweisen, aber einheitlich kleiner als die erwartete Größe sein. In einer anderen Ausführungsform kann die Flüssigkeit von Nucleinsäuremolekülen mit einer, zwei, drei oder mehr anderen Flüssigkeiten vereint werden.
Die Erfindung zeichnet sich durch einen colyophilisierten Komplex aus, der mittels der Colyophilisation eines Nucleinsäuremoleküls in einem Vektor mit einem Formulierungswirkstoff, der das Nucleinsäuremolekül vor dem Gefrieren schützt und die Transfektionsraten erhöht, produziert wurde.
Mit „colyophilisiert" ist das Verfahren gemeint, mit dem die Mischung der zwei oder mehr Flüssigkeiten gefriergetrocknet wird, um sie vor der Instabilität der Nucleinsäure in Lösung zu schützen. Die Aufhydrierung findet vorzugsweise statt, während das Produkt sich in einem gefrorenen Zustand und unter einem Vakuum befindet. Die allgemeine Theorie, Ausrüstung und Methodik hinsichtlich der Lyophilisation anderer Materialien ist wohl bekannt und Fachmänner könnten daher leicht die entsprechenden Parameter für eine effektive Lyophilisation wählen. Siehe FTS Systems, Basic Theory of Freeze Drying/Lyophilization, Produkthilfeinformation, Mitteilungsblatt Nr. 1:1-19; Nail et al., Develop. Biol. Standard., Bd. 74, S. 137-151 (1991); Jennings et al., D&Cl, S. 43-52 (1980); Reiter, American Laboratory, „Significant Design Changes in Laboratory/Research Freeze Dryers" (1991); Thompson et al., InTech, „Evolving Instrumentation for Freeze-Drying" (1995); Jennings, Journal of Parenteral Science and Technology, Bd. 42:118-121 (1988); Jennings, MD&DI, S. 49-56 (1980); Livesey et al., Journal of Parenteral Science & Technology, Bd. 41, Nr. 5:169-171 (1987); Jennings, Journal of Parenteral Science & Technology, S. 95-97 (1986); Leebron et al., Journal of Parenteral Science & Technology, Bd. 35, Nr. 3:100-105 (1981); Williams et al., Journal of Parenteral Science & Technology, Bd. 40, Nr. 4: 135-141 (1986); Roy et al., Research Article, Bd. 43, Nr. 2:60-66 (1989); Armstrong, Journal of the Parenteral Drug Association, Bd. 34, Nr. 6: 473-483 (1980); Jennings, Journal of the Parenteral Drug Association, Bd. 34, Nr. 1:62-69 (1980).
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Formulierungswirkstoff eine schützende, wechselwirkende, nicht kondensierende Verbindung sein, insbesondere kann der Formulierungswirkstoff vorher neutralisiertes Polyvinylpyrrolidon sein, vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 2,5 % oder einem Molekulargewicht von mindestens 80 kDa. Der Formulierungswirkstoff kann auch Polyvinylalkohol sein, der in einem Gewichtsverhältnis mit dem Formulierungswirkstoff von etwa 1 bis 17 vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex in einer Lösung mit einem pH-Wert von vorzugsweise 3,5 bis 9,0, mehr bevorzugt 6,5 bis 8,0 vorliegen, um die Nucleinsäureexpression zu maximieren.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann der Komplex auch ein antimikrobielles Agens, ein Antioxidans, ein Puffer oder ein Kälteschutzmittel enthalten.
Mit „antimikrobiellem Agens" ist eine beliebige Chemikalie oder Verbindung gemeint, die zum Zerstören oder Inhibieren des Wachstums von Mikroorganismen in der Lage ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das antimikrobielle Agens Benzalkoniumchlorid, Benzylalkohol, Chlorcresol, Phenylquecksilbernitrat oder Acetat sein.
Mit „Antioxidans" ist eine chemische Verbindung oder Substanz gemeint, die die Oxidation inhibiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Antioxidans Askorbin säure, Butylhydroxyanisol (BHA), Cystein, Natriumbisulfat (Natriumhydrogensulfat) oder Gluthathion sein.
Mit einem „Puffer" ist eine Substanz gemeint, die die Änderung des pH-Werts einer Lösung minimiert, wenn der Lösung eine Säure oder Base zugesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Puffer Essigsäure und Salz, Sukzinsäure (Bernsteinsäure) und Borax, Formiat und HCl oder Natriumcitratpuffer sein.
Mit „Kälteschutzmittel" ist eine beliebige Chemikalie oder Verbindung gemeint, die zum Schützen einer Substanz beim Gefrieren dienen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Kälteschutzmittel Lactose, Saccharose, Mannitol (Mannit), Trehalose oder Polyvinylpyrrolidon sein.
Es wird weiterhin das Herstellen eines colyophilisierten Komplexes beschrieben, der vorzugsweise mittels Vereinen einer Flüssigkeit von Nucleinsäuremolekülen und einem flüssigen Formulierungswirkstoff hergestellt wird. Vorzugsweise werden die zwei Flüssigkeiten durch einen Inline-Mischer geleitet und kontinuierlich gemischt. Die Flüssigkeiten können mit einer bestimmten Reynolds-Zahl zugegeben werden, vorzugsweise höher als 373, mehr bevorzugt höher als 560, am meisten bevorzugt höher als 746, zur optimalen Verhinderung der Aggregation der Formulierung. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Flüssigkeiten unter Bedingungen vereint werden, die eine im Wesentlichen homogene Mischung mit Teilchen mit einer bevorzugten einheitlichen Größe von vorzugsweise weniger als oder gleich 100 nm, mehr bevorzugt weniger als oder gleich 75 nm, am meisten bevorzugt weniger als oder gleich 50 nm produzieren. In einer anderen Ausführungsform kann die Flüssigkeit von Nucleinsäuremolekülen mit einer, zwei, drei oder mehr anderen Flüssigkeiten vereint werden.
Es wird weiterhin ein Verfahren zum Verwenden des Komplexes, der aus dem Inline-Mischen resultiert, mittels Aufhydrierung beschrieben.
Mit „Aufhydrierung" ist gemeint, dass bewirkt wird, dass der Komplex Flüssigkeit aufnimmt, vorzugsweise eine pharmazeutisch verträgliche (unbedenkliche) Lösung, wie isotonische Kochsalzlösung, Puffer oder eine andere Lösung.
Es wird außerdem ein Verfahren zum Verwenden des Komplexes bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Störung mittels Verabreichung des Komplexes in einer beliebigen der obigen Formen an einen einer solchen Behandlung bedürftigen Patienten beschrieben.
Mit „Verabreichung" ist die Route der Einführung eines Vektors oder DNA-Trägers in den Körper gemeint. Die Verabreichung kann intravenös, intramuskulär, topisch, oral oder mittels Genkanone oder Hypospraytechnik sein. Sie kann direkt an ein Zielgewebe oder über Systemübermittlung sein. Die Verabreichung wird eine Vielfalt an Verfahren beinhalten, wie direkter Gentransfer in Hautgewebe mittels Liposomen, Proteoliposomen, mit Calciumphosphat copräzipitierter DNA, an makromolekulare Komplexe gekoppelter DNA, DNA-Transporter, an Mikroprojektile kodierter DNA, kodierter Plasmide, direkter Mikroinjektion sowie Hauttransplantation. Direkter Gentransfer von Vektoren kann mittels direkter Mikroinjektion, nadelfreier Injektion (siehe Barry et al., „Needle-Free Injection of Formulated Nucleic Acid Molecules", US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 60/069,754, eingereicht am 6. Dezember 1997, vor der WO99/31262 Priorität in Anspruch nimmt), Sonoporation, Elektroporation, Liposomen, Proteoliposomen, Calciumphosphat-Copräzipitation, Hauttransplantation, retroviralen Vektoren, an makromolekulare Komplexe gekoppelter DNA, DNA-Transporter und Mikroprojektilen verabreicht werden. Zu Verabreichungsrouten zählen intramuskulär, Aerosol, oral, topisch, systemisch, okular, intraperitoneal und/oder intrathekal. Siehe z. B. Woo et al., internationale Anmeldung Nr. PCT/US93/02725, eingereicht am 19. März 1993, internationale Anmeldung Nr. WO 93/18759, veröffentlicht am 30. September 1993, mit dem Titel „A DNA Transporter System and Method of Use" und den Abschnitt zu Verabreichung im Abschnitt der ausführlichen Beschreibung im Folgenden.
Mit „behandeln" ist die Verabreichung der Nucleinsäure wie hierin beschrieben gemeint, um eine gewünschte Nucleinsäure einer Zelle oder einem Gewebe zum Zweck der Expression der Nucleinsäure durch die Zelle oder das Gewebe zuzuführen. Zell- oder Gewebearten von Interesse beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Leber, Muskel, Lunge, Endothel, Gelenke, Haut, Knochen, Tumore und Blut.
Mit „verhindern" ist das Stoppen oder Verhindern des Auftretens der Störung mittels einer Aktion im Voraus, der Zuführung der Nucleinsäure an die Zelle, um die Zelle daran zu hindern, die Aktion abzuschließen, die sie zum Exprimieren einer solchen Störung erfahren würde.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Bereitstellen einer therapeutisch wirksamen Menge des Komplexes.
Eine „therapeutisch wirksame Menge" ist eine Menge, die dazu ausreicht, eine zumindest zeitweilige Entlastung oder Verbesserung eines Symptoms oder Anzeichens einer Erkrankung oder eines Zustands zu bewirken. Folglich ist die Menge auch ausreichend, wenn sie eine pharmakologische Wirkung hervorruft. Die Menge der Zusammensetzung muss keine dauerhafte Verbesserung oder Verbesserung aller Symptome oder Anzeichen bewirken. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Krebstherapeutikums wäre eine solche, die die Tumorlast im Fall einer metastatischen Erkrankung insgesamt reduziert (d. h. die Zahl der Metastasen oder deren Größe), oder eine solche, die die Masse des Tumors in lokalisierten Karzinomen reduziert.
Die behandelte Störung kann eine lokalisierte oder systemische Erkrankung oder ein lokalisierter oder systemischer Zustand sein.
Eine „lokalisierte" Erkrankung oder ein „lokalisierter" Zustand bezieht sich auf diejenigen, in denen ein spezifischer Nerven- oder Muskelschädigung oder eine Atrophie eines definierten und begrenzten Bereichs des Körpers vorliegt. Ein spezifisches Beispiel ist eine Inaktivitätsatrophie.
Eine „systemische" Erkrankung oder ein „systemischer" Zustand bezieht sich auf diejenigen, die den gesamten Organismus betreffen oder an einer Reihe von Stellen im Körper weit verbreitet sind. Zu Beispielen zählen Wachstumsstörungen, Neuropathien und Muskeldystrophie.
Es wird außerdem ein Verfahren zum Zuführen des Komplexes mittels Verabreichung in einer beliebigen der obigen Formen an einen Organismus, vorzugsweise ein Tier, beschrieben.
Mit „Zuführung" oder „zuführen" ist die Beförderung von Nucleinsäuremolekülen an gewünschte Zellen oder beliebige Zellen gemeint. Die Nucleinsäuremoleküle können mehreren Zelllinien, einschließlich des gewünschten Ziels, zugeführt werden. Die Zuführung resultiert darin, dass die Nucleinsäuremoleküle mit der Zelloberfläche, mit der Zellmembran, mit dem Zellendosom, in der Zellmembran, mit dem Zellkern oder in dem Zellkern oder mit einem beliebigen anderen Bereich der Zelle, von dem aus eine Transfektion erfolgen kann, in einer Vielfalt an Zelllinien in Kontakt kommen, die die folgenden beinhalten können, jedoch nicht darauf beschränkt sind: Tumorzellen, Epithelzellen, Langerhans'-Zellen, Langhans'-Zellen, wandständige Makrophagen vom Blut- und Lymphsinus, Keratinozyten, dendritische Zellen, Makrophagenzellen, Kupffer'-Zellen, Muskelzellen, Lymphozyten und Lymphknoten.
Vorzugsweise kommt der Vektor nach der Verabreichung mit der bevorzugten Zielzelle in Kontakt. Die Verabreichung kann, wie oben erwähnt, Injektion mit einer Nadel in Zellen, Gewebe, Flüssigkeitsräume oder Blutgefäße, Elektroporation, Transfektion, Hypospray, Iontophorese, Teilchenbeschuss oder Transplantation von ex vivo genetisch modifizierten Zellen. Zu Verabreichungsbeispielen zählen intravenös, intramuskulär, Aerosol, oral, topisch, systemisch, Okular, intraperitoneal und/oder intrathekal.
Das bevorzugte Mittel zur Verabreichung von oben beschriebenen Vektoren umfasst die Verwendung von Formulierungen zur Zuführung an die Zielzelle, wobei der Vektor mit Elementen wie Lipiden, Proteinen, Kohlenhydraten, synthetischen organischen Verbindungen oder anorganischen Verbindungen assoziiert wird, die den Eintritt des Vektors in den Zellkern der Zielzelle fördern, in dem die Genexpression stattfinden kann. Ein bestimmtes Beispiel ist Polyvinylpyrrolidon (PVP).
Der Ausdruck „Formulierung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Material, das nicht genetisch ist und das in einer Lösung, einer Suspension oder einem Kolloid mit dem Vektor vereint wurde und die Zuführung des Vektors an ein Gewebe, die Aufnahme durch Zellen im Gewebe, intrazelluläre Transportmechanismen durch die Membran, das Endosom oder das Zytoplasma im Zellkern, die Stabilität des Vektors in extrazellulären oder intrazellulären Kompartimenten und/oder die Expression von genetischem Material durch die Zelle fördert.
Der Vektor und die Formulierung können ein Nanopartikel umfassen, das als eine Suspension oder ein Kolloid verabreicht wird. Die Formulierung kann Lipide, Proteine, Kohlenhydrate, synthetische organische Verbindungen oder anorganische Verbindungen enthalten. Beispiele von Elementen, die in eine Formulierung eingebunden werden, sind Lipide, die Liposome bilden können, kationische Lipide, hydrophile Polymere, Polykationen (z. B. Protamin, Polybren, Spermidin, Polylysin), ein Peptid oder synthetischer Ligand, das bzw. der Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzellen erkennt, ein Peptid oder synthetischer Ligand, das bzw. der die Endosomenlyse induzieren kann, ein Peptid oder synthetischer Ligand, das bzw. der Materialien zum Zellkern leiten kann, Gele, Matrizen mit langsamer Freisetzung, Salze, Kohlenhydrate, Nährstoffe oder lösliche oder unlösliche Teilchen als auch Analoga oder Derivate derartiger Elemente. Dies beinhaltet Formulierungselemente, die die Zuführung, Aufnahme, Stabilität und/oder Expression von genetischem Material in Zellen fördert. Diese Liste wurde lediglich zur Veranschaulichung eingefügt und soll in keinerlei Weise einschränkend sein.
Der Ausdruck „Organismus", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den allgemeinen Sprachgebrauch von einem Durchschnittsfachmann. Der Organismus kann beinhalten: Mikroorganismen, wie Hefe oder Bakterien, Pflanzen, Vögel, Reptilien, Fische oder Säuger. Der Organismus kann ein Begleitertier oder ein Heimtier sein. Vorzugsweise ist der Organismus ein Säuger und folglich ein beliebiger warmblütiger Organismus. Mehr bevorzugt ist der Säuger ein Mensch.
Der Ausdruck „Begleitertier", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenigen Tiere, die herkömmlich als „Haustiere" behandelt werden, wie beispielsweise Hunde, Katzen, Pferde, Vögel, Reptilien, Mäuse, Kaninchen, Hamster und dergleichen.
Der Ausdruck „Heimtier", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenigen Tiere, die herkömmlich als gezähmt erachtet werden, wobei dazu Tiere wie die als „Begleitertiere" erachteten zusammen mit Tieren wie Schweinen, Hühnern, Enten, Kühen, Ziegen, Lämmern und dergleichen zählen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können dazu verwendet werden, eine Immunantwort zu bewirken, vorzugsweise eine humorale Immunantwort, die das Proteinprodukt targetiert, das von dem Nucleinsäuremolekül kodiert wird, wie eine Antikörperantwort. In anderen Situationen ist die Immunantwort vorzugsweise eine zytotoxische T-Lymphozyten-Antwort.
Der Ausdruck „Immunantwort", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den natürlichen Abwehrmechanismus eines Säugers, der eintreten kann, wenn ein Fremdstoff internalisiert wird. Die Immunantwort kann eine umfassende Immunantwort sein, die die Immunsystembestandteile in ihrer Gesamtheit einbezieht. Vorzugsweise resultiert die Immunantwort aus dem Proteinprodukt, das von dem formulierten Nucleinsäuremolekül kodiert wird. Die Immunantwort kann Folgendes sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt: Antikörperproduktion, T-Zellproliferation/-differenzierung, Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten und/oder Aktivierung von natürlichen Killerzellen. Vorzugsweise ist die Immunantwort eine humorale Immunantwort. In anderen Situationen ist die Immunantwort jedoch, wie oben erwähnt, vorzugsweise eine zytotoxische T-Lymphozyten-Antwort.
Der Ausdruck „humorale Immunantwort" bezieht sich auf die Produktion von Antikörpern als Reaktion auf einen internalisierten Fremdstoff. Vorzugsweise ist der Fremdstoff das Proteinprodukt, das von einem formulierten Nucleinsäuremolekül kodiert wird.
Die Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung resultiert in einer verstärkten Transfektion von Zellen. Die verstärkte Transfektion kann mittels in der Technik allgemein bekannten Transfektionsreporterverfahren gemessen werden, wie beispielsweise Assays auf CAT-Genprodukt-Aktivität oder LacZ-Genprodukt-Aktivität und dergleichen.
Der Ausdruck „wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ausreichend Vektor, der Menschen, Tieren oder in Gewebekultur verabreicht wird, um die adäquaten Niveaus von Protein oder RNA zu produzieren. Ein Fachmann erkennt, dass das adäquate Niveau von Protein oder RNA von der Verwendung des bestimmten Vektors abhängen wird. Diese Niveaus werden sich je nach der Art der Verabreichung und der Behandlung oder Impfung unterscheiden.
Zu den wie hierin offenbarten Verfahren zum Behandeln von Erkrankungen zählen die Behandlung mit biologischen Produkten (insbesondere wie oben definierte Proteine), wobei die behandelte Erkrankung erfordert, dass das Protein mittels des allgemeinen Kreislaufs durch den Körper zirkuliert. Zum Beispiel zählen zu Erkrankungen, die mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden könnten, Osteoporose mittels Expression von GHRH oder dessen Bindeproteinen. Die Auswahl des entsprechenden Proteins zum Behandeln verschiedener Erkrankungen wird für einen Fachmann offensichtlich sein.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können beim Behandeln einer Erkrankung verwendet werden und stellen ein Mittel zum Erreichen der folgenden Ziele bereit: (1) ausreichend hohe Niveaus eines bestimmten Proteins zum Erzielen einer therapeutischen Wirkung; (2) eine gesteuerte Expression des Produkts auf Niveaus, die für eine therapeutische Wirkung ausreichen und geringer als die toxischen Niveaus sind; (3) eine gesteuerte Expression in bestimmten Geweben, um eine reproduzierbare Pharmakokinetik und reproduzierbare Genexpressionsniveaus zu erzielen; und (4) eine Zuführung unter Verwendung klinisch und pharmazeutisch unbedenklicher Mittel zur Verabreichung und Formulierung anstelle einer Transplantation gentechnisch veränderter und ausgewählter Zellen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können eine homogene Mischung sein, bei der es sich um mehrere beliebige der oben spezifizierten Komplexe handelt, wobei jeder Komplex Teilchen mit einer im Wesentlichen einheitlichen Größe aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jeder der Komplete Teilchen aufweisen, die ungefähr sphärisch sind und einen Durchmesser von vorzugsweise 500 nm oder weniger, mehr bevorzugt 200 nm oder weniger, am meisten bevorzugt 100 nm oder weniger aufweisen.
Zusammensetzungen der Erfindung können in einem Kit bereitgestellt werden. Das Kit enthält einen formulierten Nucleinsäurekomplex der Erfindung, vorzugsweise in einem Behältnis und/oder mit Anleitungen, die erläutern, wie die formulierten Nucleinsäuremoleküle zuzuführen sind.
Folglich kann das „Behältnis" Anleitungen enthalten, die dazu geliefert werden, einem Durchschnittsfachmann zu ermöglichen, die formulierten Nucleinsäuremoleküle zu verwenden. Die Anleitungen werden Schritte zum Verwenden der formulierten Nucleinsäuremoleküle liefern. Darüber hinaus können die Anleitungen Verfahren zum Prüfen der formulierten Nucleinsäuremoleküle enthalten, die zur Ermittlung führen, ob die formulierten Nucleinsäuremoleküle beschädigt sind. Das Kit kann auch eine Mitteilung zu einer Verwendung und zu Anleitungen, die von der FDA genehmigt wurden, enthalten.
Der Ausdruck „Transfektion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Prozess des Einführens von DNA (z. B. formuliertem DNA-Expressionsvektor) in eine Zelle. Nach Eintritt in die Zelle kann die transfizierte DNA: (1) sich mit der des Wirts neu kombinieren; (2) sich unabhängig als ein Plasmid oder temperenter Phage replizieren oder (3) als ein Episom ohne Replikation vor der Eliminierung erhalten werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Transformation" auf vorübergehende oder dauerhafte Veränderungen der Charakteristika (des exprimierten Phänotyps) einer Zelle, die von der Aufnahme eines Vektors durch diese Zelle induziert werden. Genetisches Material wird in eine Zelle in einer Form eingeführt, in der es ein spezifisches Genprodukt exprimiert oder die Expression oder Wirkung von endogenen Genprodukten verändert.
Die Transformation der Zelle kann mit der Produktion einer Vielfalt an Genprodukten, einschließlich Protein und RNA, assoziiert sein. Diese Produkte können als intrazelluläre oder extrazelluläre Strukturelemente, Liganden, Hormone, Neurotransmitter, wachstumsregulierende Faktoren, Enzyme, Chemotaxine, Serumproteine, Rezeptoren, Träger für Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, Arzneimittel, Immunmodulatoren, Onkogene, Tumorsuppressoren, Toxine, Tumorantigene, Antigene, Antisense-Inhibitoren, Dreifachstränge bildende Inhibitoren, Ribozyme oder als ein Ligand, der spezifische, die Struktur bestimmende Faktoren an zellulären Strukturen zum Zweck des Modifizierens von deren Aktivität erkennt, fungieren. Diese Liste ist nur ein Beispiel und soll nicht einschränkend sein.
Die Zusammenfassung der oben beschriebenen Erfindung ist nicht einschränkend und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschrei bung der bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen offensichtlich werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Darstellung des bevorzugten Aufbaus der Inline-Mischeinrichtung in der vorliegenden Erfindung. Die zwei Flüssigkeiten werden in die Einlässe gespeist und von einer Pumpe zum „Y-Verbindungsglied" getrieben. Sobald die zwei Flüssigkeiten in Kontakt gebracht wurden, werden sie durch einen statischen Mischer laufen gelassen, um einen homogenen Komplex mit Teilchen mit ungefähr einheitlicher Größe zu produzieren.
2 ist ein Diagramm, das die unterschiedlichen Arten von Reaktionen in mehreren Ampullen zum Erstellen einer Plasmid enthaltenden Dosis aus einem Plasmid/PINC-Komplex, wie in den Beispielen dargelegt, vergleicht. In einem Vierampullenkomplex kann eine Dosis mittels Vereinen der vier Elemente WFI, Plasmid, 25%-igem PVP und NaCl kurz vor der Verabreichung hergestellt werden. In einem Dreiampullenkomplex werden die Elemente Plasmid und NaCl kurz vor der Verabreichung mit lyophilisiertem PVP vereint. In einem Einzelampullenkomplex wird einem Komplex aus colyophilisiertem Plasmid/PVP NaCl zugegeben, um ihn vor der Verabreichung aufzuhydrieren. In dem zuvor neutralisierten Einzelampullenkomplex wird Natriumcitratpuffer mit einem pH-Wert von 4 zugegeben, um einen Komplex aus colyophilisiertem Plasmid/PVP, der einen pH-Wert von 7 aufweist, kurz vor der Verabreichung aufzuhydrieren.
Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgerecht. Bestimmte Merkmale der Erfindung können zu Gunsten der Übersichtlichkeit und Kürze in Bezug auf den Maßstab übertrieben und in schematischer Form gezeigt sein.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Die vorliegende Erfindung bezieht sich, wie oben erwähnt, allgemein auf die Inkorporation von Plasmid in eine herkömmliche Dosisform und insbesondere auf die Produktion eines homogenisierten Einzelampullenkomplexes aus Plasmid und Polymer mit wünschenswerten physikalischen Charakteristika. Verfahren zum Herstellen, Lagern und Verwenden eines derartigen Komplexes werden ebenfalls bereitgestellt und im Folgenden ausführlich beschrieben. Derartige Produkte und Verfahren werden zweckmäßigere und kosteneffektivere Komplexe bereitstellen, die vor chemischem Abbau und/oder physikalischer Aggregation ihrer Komponenten geschützt sein werden und für eine relativ einfache Verabreichung sorgen. Somit stellt die vorliegende Erfindung einen effektiveren Komplex zur Plasmidzuführung und ein Verfahren zur Inkorporation dieses Plasmids in eine herkömmliche Dosisform bereit.
I. Herstellung der Formulierungen.
A. Inline-Mischen.
Das Mischverfahren wird vorzugsweise im Allgemeinen wie hierin dargelegt durchgeführt. Das Mischen von Komplexen, wie einer DNA/Lipid-Formulierung, kann auf vielerlei Art vorgenommen werden. Es wird herkömmlich oder konventionell durch einfaches Vermischen der beiden ausgeführt. Dies ist zum Mischen der beiden effektiv, der resultierende Komplex weist jedoch Teilchen mit unterschiedlichen Größen auf.
Folglich wird das Mischen vor Komplexen unter Anwendung von Inline-Mischen in einer homogeneren Mischung mit Teilchen mit einer einheitlicheren Größe resultieren.
Es gibt viele Arten von Inline-Mischern, von denen die meisten sich im Allgemeinen durch die Tatsache auszeichnen, dass die zwei gemischten Flüssigkeiten einen kurzen Zeitraum lang miteinander in Kontakt stehen. Wenn Flüssigkeiten inline gemischt werden, kann die Zugabe von Flüssigkeit mittels vieler verschiedener Verfahren erfolgen. In einem Strahlmischer wird eine der Flüssigkeiten in einen fließenden Strom der anderen Flüssigkeit gepumpt und beide Flüssigkeiten werden gepumpt. Bei Injektoren wird der Fluss einer Flüssigkeit vom Fluss der anderen induziert, wobei nur die Flüssigkeit, die die Majorität ausmacht, mit einer verhältnismäßig hohen Geschwindigkeit gepumpt wird. Eine andere Art von Inline-Mischen pumpt beide Flüssigkeiten durch Verengungen in einem Rohr und der Druckabfall wird zum Teil zum Erzeugen der Dispersion eingesetzt. Die Verengungen können Öffnungen oder Düsen sein, entweder einzeln oder in Serie. Die Verwendung von Ventilen kann einen Mischdüsenmischer einstellbar machen. Im Allgemeinen werden die Flüssigkeiten beim Inline-Mischen gepumpt. Die Verwendung der Kreiselpumpe ist am aufwändigsten, wobei die Flüssigkeiten in die Saugseite der Pumpe gespeist werden. Perry's Chemical Engineer's Handbook, Abschn. 21, S. 57-59 (6. Ausg. 1984).
Der Inline-Mischer in der vorliegenden Erfindung kann eine Einrichtung mit zwei Einlässen in einer Y-Form beinhalten, die zum Mischer der zwei Flüssigkeiten zusammentreffen. Die Flüssigkeiten werden in die Einlässe gegeben und, wenn die zwei Flüssigkeiten aufeinander treffen, werden sie kurz danach gemischt, vorzugsweise mittels eines statischen Mischens. Statisches Mischen wird angewendet, weil es regelbar, skalierbar und reproduzierbar ist. Das herkömmliche Dosierungsmischverfahren resultiert nicht in einem kontinuierlichen oder skalierbaren Ergebnis.
B. Nucleinsäureformulierungen.
Formulierungen von Nucleinsäuremolekülen können wie hierin offenbart hergestellt werden und im Allgemeinen wird ein Gewichtsverhältnis von zwischen 1:30 und 1:1, vorzugsweise zwischen 1:20 und 1:7, mehr bevorzugt etwa 1:17 oder etwa 1:10 des Plasmids zum Formulierungswirkstoff angewendet. Die Zuführung und Expression von Nucleinsäuren ist in vielen Formulierungen, wie in Kochsalzlösung, aufgrund des Abbaus der Nucleinsäure durch zelluläre Bestandteile von Organismen, wie beispielsweise Nucleasen, eingeschränkt. Folglich kann der Schutz der Nucleinsäuren die resultierende Expression bei Zuführung in vivo beträchtlich fördern und dadurch eine gewünschte pharmakologische oder therapeutische Wirkung verstärken. Es wurde festgestellt, dass bestimmte Arten von Verbindungen, die mit einer Nucleinsäure in Lösung wechselwirken (z. B. DNA), die Nucleinsäure jedoch nicht kondensieren, die Nucleinsäure in vivo mit Schutz versehen und die Expression eines kodierten Genprodukts entsprechend fördern. Einige dieser Verbindungen wurden in Smith et al., US-Patentschrift Nr. 08/484,777, eingereicht am 7. Juni 1995, mit dem Titel „Nucleic Acid Transporters for Delivery of Nucleic Acids into a Cell" (Lyon & Lyon Aktenz. 211/270); Smith et al., internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US96/05679, eingereicht am 23. April 1996, mit dem Titel „Nucleic Acid Transporters for Delivery of Nucleic Acids into a Cell" (Lyon & Lyon Aktenz. 211/270 PCT); und Wadwah et al., US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 60/045,295, eingereicht am 2. Mai 1997, mit dem Titel „Transporters for Specific Delivery of Macromolecules to Cells" (Lyon & Lyon Aktenz. 225/003), die alle hierin in ihrer Gesamtheit, einschließlich etwaiger Zeichnungen, durch Bezugnahme aufgenommen sind, erörtert.
Die Verwendung von Zuführungssystemen, die zum Wechselwirken mit Plasmiden und zum Schützen von Plasmiden vor schnellem extrazellulärem Nucleaseabbau entworfen sind, sind in R.J. Mumper et al., 1996, Pharm. Res. 13:701-709, beschrieben. Ein Charakteristikum der PINC-Systeme ist, dass sie nichtkondensierende Systeme sind, die ermöglichen, dass das Plasmid die Flexibilität bewahrt und sich frei durch den Muskel verbreitet, während es gleichzeitig vor Nucleaseabbau geschützt ist. Obgleich im Folgenden vor allem die PINC-Systeme erörtert werden, versteht es sich, dass auf kationischen Lipiden basierte Systeme und Systeme, die sowohl PINCs als auch kationische Lipide einsetzen, ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Eine übliche Strukturkomponente der PINC-Systeme ist, dass sie amphipathische Moleküle sind, die sowohl einen hydrophilen als auch einen hydrophoben Anteil aufweisen. Der hydrophile Anteil der PINC soll mit Plasmiden mittels Ausbildung von Wasserstoffbrücken (über Wasserstoffbrückenbindungsakzeptor- oder -donorgruppen), Van-der-Waals-Wechselwirkungen und/oder ionische Wechselwirkungen Wechselwirken. PVP und 2-Methyl-2-pyrrolidon (NM2P) beispielsweise sind Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren, wohingegen PVA und Propylenglykol (PG) Wasserstoffbrückenbindungsdonoren sind.
Von allen vier Molekülen wurde berichtet, dass sie mit verschiedenen (poly)anionischen Molekülen Komplexe bilden [V. Buhler, BASF Aktiengesellschaft Feinchemie, Ludwigshafen, S. 39-42; Y. Galaev et al., J. Chrom. A. 684:45-54 (1994); R. Tarantino et al., J. Pharm. Sci. 83:1213-1216 (1994); H. Zia et al., Pharm. Res. 8:502-504 (1991)]. Der hydrophobe Anteil der PINC-Systeme ist dazu entworfen, in einem Überzug auf dem Plasmid zu resultieren, der dessen Oberfläche hydrophober macht. Kabanov et al. haben zuvor die Verwendung von kationischen Polyvinylderivaten zur Plasmidkondensation beschrieben, die dazu konzipiert ist, die Hydrophobie des Plasmids zu erhöhen, das Plasmid vor Nucleaseabbau zu schützen und dessen Affinität für biologische Membranen zu steigern [A.V. Kabanov und V.A. Kabanov, 1995, Bioconj. Chem. 6:7-20; A.V. Kabanov et al., 1991, Biopolymers 31:1437-1443; A.A. Yaroslavov et al., 1996, FEBS Letters 384:177-180].
1. Zusammenfassung der Wechselwirkungen zwischen einem PINC-Polymer (PVP) und einem Plasmid
Obwohl Expressionssysteme wie die oben beschriebenen das Potential zur Expression bereitstellen, wenn sie einer entsprechenden Stelle zugeführt werden, ist es förderlich, das Expressionssystemkonstrukt bzw. die Expressionssystemkonstrukte in einem Zuführungssystem bereitzustellen, das sowohl die Zuführung als auch die zelluläre Aufnahme des Konstrukts unterstützen kann. Folglich stellt diese Erfindung auch bestimmte Formulierungen bereit, die ein oder mehrere Expressionssystemkonstrukte (z. B. wie oben beschriebene DNA-Plasmide) und eine schützende, wechselwirkende, nichtkondensierende Verbindung enthalten.
Ein weiterer wesentlicher Faktor im Hinblick auf das Plasmidkonstrukt ist der Prozentanteil von Plasmiden, die anstelle in offenzirkulärer (open circular, OC) Form in einer supergeknäuelten (supercoiled, SC) Form vorliegen.
Molekülmodellierung hat aufgezeigt, dass ein beispielhaftes PINC-Polymer, PVP, mit den Basenpaaren eines Plasmids in dessen Hauptfurche Wasserstoffbrückenbindungen bildet und aufgrund des Vinylrückgrats von PVP in einer hydrophoben Oberfläche auf dem Plasmid resultiert. Diese Wechselwirkungen werden von der Modulation des Zetapotentials des Plasmids durch PVP sowie von der Inhibition von Ethidiumbromid-Interkalierung in komplexiertes Plasmid unterstützt. Die offensichtliche Bindung zwischen PVP und Plasmid wurde mit dem pH-Wert und der Salzkonzentration korreliert und hat die Wirkung dieser Parameter auf β-gal-Expression nach intramuskulärer Injektion von Plasmid/PVP-Komplexen gezeigt [R.J. Mumper et al., 1997. Gene Therapy übermittelt]. Eine Zusammenfassung der physikochemischen Eigenschaften von Plasmid/PVP-Komplexen ist in der Tabelle I unten aufgeführt.
2. Histologie der Expression in Muskel
Immunhistochemie für β-gal unter Verwendung einer Objektträgerscantechnologie hat die gleichmäßige Verteilung von β-gal-Expressionsstellen über die gesamten Querschnitte von Tibialis der Ratte hinweg offenbart. Sehr lokalisierte Bereiche wurden positiv auf β-gal gefärbt, wenn CMV-β-gal-Plasmid in Kochsalzlösung formuliert wurde. β-gal-positive Zellen wurden ausschließlich um den Nadeltrakt herum beobachtet, wenn Plasmid in Kochsalzlösung injiziert wurde. Dies stimmt mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen überein [J.A. Wolff et al., 1990, Science 247:1465-68; H.L. Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4:151-159; H.L. Davis et al., 1993, Hum. Gene. Ther. 4:733-740].
Im Vergleich dazu wurde nach intramuskulärer Injektion von Komplex von CMV-β-gal-Plasmid und PVP (1:17 w/w) in 150 mM NaCl Immunreaktivität für β-gal in einem weiten Muskelgewebebereich beobachtet. Es schien, dass sich die Mehrheit der positiven Muskelfasern am Rand von Muskelbündeln befand. Folglich demonstrierte die Färbung auf β-gal in Rattenmuskel, dass die Zahl von positiv auf β-gal gefärbten Muskelfasern bei Verwendung eines Plasmid/PVP-Komplexes ungefähr acht Mal größer war, als sie bei Verwendung einer Kochsalzlösungsformulierung festgestellt wurde. Positiv gefärbte Muskelfasern wurden bei Verwendung des Plasmid/PVP-Komplexes auch über einen viel größeren Bereich im Muskelgewebe hinweg beobachtet, was einen Beweis dafür liefert, dass das injizierte Plasmid nach intramuskulärer Injektion weit verteilt ist.
Eine Folgerung ist, dass die verstärkte Plasmidverbreitung und -expression in Rattenskelettmuskel ein Resultat sowohl des Schutzes vor extrazellulärem Nucleaseabbau aufgrund von Komplexbildung als auch hyperosmotischer Effekte des Plasmid/PVP-Komplexes war. Dowty und Wolff et al. haben jedoch aufgezeigt, dass Osmolarität von bis zu der doppelten physiologischen Osmolarität die Genexpression in Muskel nicht wesentlich beeinflusste [M.E. Dowty und J.A. Wolff in: J.A. Wolff (Hrsg.), 1994, Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer. Birkhauser, Boston, S. 82-98]. Dies legt nahe, dass die verstärke Expression von Plasmid aufgrund von PVP-Komplexbildung am wahrscheinlichsten im Nucleaseschutz und weniger in osmotischen Effekten begründet liegt. Des Weiteren kann die Oberflächenmodifizierung von Plasmiden durch PVP (z. B. erhöhte Hydrophobie und reduzierte negative Oberflächenladung) außerdem die Aufnahme von Plasmiden durch Muskelzellen erleichtern.
3. Struktur-Aktivität-Beziehung von PINC-Polymeren
Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Struktur einer Reihe von Copolymeren von Vinylpyrrolidon und Vinylacetat und den Niveaus der Genexpression in Rattenmuskel festgestellt. Außerdem resultiert die Substitution von einigen Vinylpyrrolidon-Monomeren durch Vinylacetat-Monomere in PVP in einem Copolymer mit verringerter Befähigung zum Bilden von Wasserstoffbrückenbindungen mit Plasmiden. Die reduzierte Wechselwirkung führte anschließend zu verringerten Niveaus der Genexpression in Rattenmuskel nach intramuskulärer Injektion. Die Expression von β-gal nahm linear ab (R = 0,97), während das Ausmaß des Gehalts an Vinylpyrrolidon-Monomers (VPM) in den Copolymeren nachließ.
Diese Daten demonstrieren, dass der pH-Wert und die Viskosität nicht die wichtigsten Parameter sind, die die Zuführung von Plasmid an Muskelzellen bewirken, da diese Werte für alle Komplexe gleich sind. Diese Daten legen nahe, dass eine verstärkte Bindung der PINC-Polymere an Plasmid in einem größeren Schutz und einer erhöhten Bioverfügbarkeit von Plasmid in Muskel resultiert.
4. Weitere PINC-Systeme
Die oben beschriebene Struktur-Aktivität-Beziehung kann zum Entwerfen neuartiger Copolymere angewendet werden, die ebenfalls eine verstärkte Wechselwirkung mit Plasmiden aufweisen werden. Es wird erwartet, dass „ein wechselwirkendes Gelegenheitsfenster" vorliegt, wodurch eine verstärkte Bindungsaffinität der PINC-Systeme nach deren intramuskulärer Injektion aufgrund eines umfassenderen Schutzes von Plasmiden vor Nucleaseabbau in einer weiteren Verstärkung der Genexpression resultieren wird. Es wird erwartet, dass eine optimale Wechselwirkung vorliegen wird, jenseits derer entweder die Kondensierung von Plasmiden oder die Bildung von „triplexartigen" Strukturen stattfinden wird, die beide in einer verringerten Bioverfügbarkeit in Muskel und demzufolge einer reduzierten Genexpression resultieren können.
Wie oben angedeutet sind die PINC-Verbindungen im Allgemeinen amphipathische Verbindungen mit sowohl einem hydrophoben Anteil als auch einem hydrophilen Anteil. In vielen Fällen wird der hydrophile Anteil von einer polaren Gruppe gebildet. Es ist in der Technik anerkannt, dass derartige polare Gruppen von Gruppen gebildet werden können, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Pyrrolidon-, Alkohol-, Acetat-, Amin- oder heterocyclischen Gruppen, wie die auf S. 2-73 und 2-74 des CRC Handbook of Chemistry and Physics (72. Ausgabe), David R. Lide, Herausgeber, gezeigten, einschließlich Pyrrolen, Pyrazolen, Imidazolen, Triazolen, Dithiolen, Oxazolen, (Iso)thiazolen, Oxadiazolen, Oxatriazolen, Dioxazolen, Oxathiolen, Pyronen, Dioxinen, Pyridinen, Pyridazinen, Pyrimidinen, Pyrazinen, Piperazinen, (Iso)oxazinen, Indolen, Indazolen, Carbazolen und Purinen und Derivaten dieser Gruppe, die hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Verbindungen können auch hydrophobe Gruppen enthalten, die im Fall eines Polymers in der Regel im Rückgrat des Moleküls enthalten sind, aber auch Teil eines nichtpolymeren Moleküls sein können. Beispiele derartiger hydro phober Rückgratgruppen beinhalten Vinyle, Ethyle, Acrylate, Acrylamide, Ester, Cellulosen, Amide, Hydride, Ether, Carbonate, Phosphazene, Sulfone, Propylene und Derivate dieser Gruppen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Polaritätscharakteristika verschiedener Gruppen sind Fachmännern recht gut bekannt, wie beispielsweise durch Erörterungen der Polarität in jedem Lehrbuch zur Einführung in die organische Chemie belegt.
Die Befähigung derartiger Moleküle zum Wechselwirken mit Nucleinsäuren wird von Fachmännern ebenfalls verstanden und kann mittels Verwendung von Computerprogrammen, die solche intermolekulare Wechselwirkungen modellieren, vorhergesagt werden. Alternativ oder zusätzlich zu einer solchen Modellbildung können wirksame Verbindungen leicht identifiziert werden, indem ein oder mehrere Tests wie 1) Bestimmung der Inhibierung der Nucleaseverdaurate, 2) der Veränderung des Zetapotentials der DNA, die einen DNA-Überzug anzeigt, oder 3) der Inhibierung der Befähigung von Interkalierungsagenzien, wie Ethidiumbromid, zum Interkalieren mit DNA angewendet werden.
5. Targeting-Ziganden
Neben den oben beschriebenen Nucleinsäure/PINC-Komplexen zur Zuführung und Expression von Nucleinsäuresequenzen ist es in bestimmten Ausführungsformen auch dienlich, einen Targeting-Liganden bereitzustellen, um vorzugsweise eine Expression in bestimmten Geweben, Zellen oder Zellregionen oder -kompartimenten zu erzielen.
Ein solcher targetierter PINC-Komplex enthält ein PINC-System (eine monomere oder polymere PINC-Verbindung), das an Plasmid (oder ein anderes Nucleinsäuremolekül) komplexiert wurde. Das PINC-System ist kovalent oder nichtkovalent mit einem Targeting-Liganden (TL) verbunden (an diesen gebunden), der Rezeptoren mit einer Affinität für den Liganden bindet. Derartige Rezeptoren können auf der Oberfläche oder in Kompartimenten einer Zelle sein. Eine solche Steuerung sorgt für eine erhöhte Aufnahme oder verstärkte intrazelluläre Transportmechanismen der Nucleinsäure.
Der Targeting-Ligand kann Galactosylreste, Fucosalreste, Mannosylreste, Carnitinderivate, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Peptidliganden und DNA-bindende Proteine beinhalten, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele von Zellen, die brauchbar targetiert werden können, beinhalten antigenpräsentierende Zellen, Hepatozyten, Myozyten, Epithelzellen, Endothelzellen und Krebszellen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Bildung eines solchen targetierten Komplexes wird von dem folgenden Beispiel eines kovalent mit einem PINC-System verbundenen Targeting-Liganden (TL) veranschaulicht:
TL-PINC + Plasmid ----------> TL-PINC::::::Plasmid
Die Bildung eines solchen targetierten Komplexes wird auch von dem folgenden Beispiel eines nichtkovalent mit einem PINC-System verbundenen Targeting-Liganden (TL) veranschaulicht:
TL::::::PINC + Plasmid --------> TL::::::PINC::::::Plasmid
oder alternativ
PINC + Plasmid ------------> PINC:::::::Plasmid + TL ----- ------> TL::::::PINC:::::::Plasmid
In diesen Beispielen ist :::::::: eine nichtkovalente Wechselwirkung, wie ionische Wechselwirkung, Ausbildung von Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung oder Kombinationen solcher Wechselwirkungen.
Ein Targetierungsverfahren für zytotoxische Agenzien ist in Subramanian et al., internationale Anmeldung Nr. PCT/US96/08852, internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/39124, beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt die Verwendung von Polymeraffinitätssystemen zum Targetieren von zytotoxischen Materialien mit einem aus zwei Schritten bestehenden Targetierungsverfahren, das Zip-Polymere einbezieht, d. h. Paare wechselwirkender Polymere. Ein mit einem der wechselwirkenden Polymere verbundener Antikörper bindet an ein zelluläres Ziel. Dieses Polymer fungiert dann als ein Ziel für ein zweites Polymer, das mit einem zytotoxischen Agens verbunden ist. Wie in Subraminan et al. angegeben, werden auch andere aus zwei Schritten (oder mehreren Schritten) bestehenden Systeme zur Zuführung von toxischen Agenzien beschrieben.
In einem anderen Gesichtspunkt können kodierende Sequenzen einer Nucleinsäure unter Anwendung eines aus zwei Schritten bestehenden Targetierungsansatzes zugeführt und exprimiert werden, der ein nichtnatürliches Ziel für ein PINC-System oder einen PINC/Targeting-Ligand-Komplex einbezieht. So kann beispielsweise ein PINC/Plasmid-Komplex ein Bindungspaarelement targetieren, das selbst mit einem Liganden verbunden ist, der an ein zelluläres Ziel (z. B. einen mAb) bindet. Bindungspaare für bestimmte der hierin als PINC- Verbindungen identifizierten Verbindungen werden in Subraminan et al. identifiziert. Alternativ kann die PINC an einen Targeting-Liganden, wie einen Antikörper, komplexiert werden. Dieser Antikörper kann zu einem nichtnatürlichen Ziel targetiert werden, das beispielsweise an einen zweiten Antikörper bindet.
C. Lagerung des resultierenden Plasmid/PINC-Komplexes
Häufig besteht Bedarf daran, den Plasmid/PINC-Komplex lange vor der Verabreichung herzustellen. Lyophilisation kann zum Lagern des Komplexes in einer Form, die die Reduzierung der biologischen Aktivität des Plasmids minimiert, angewendet werden.
Beim Verfahren der Lyophilisation, im Wesentlichen Gefriertrocknung, wird der Komplex niedrigeren Drücken ausgesetzt, bei denen die Verdampfungspunkte der Lösemittel ebenfalls gesenkt werden, und die Flüssigkeit wird bei dieser niedrigeren Temperatur abgezogen. Weitere Einzelheiten hinsichtlich des Lyophilisationsverfahrens können in den Literaturhinweisen im obigen Abschnitt der Zusammenfassung der Erfindung gefunden werden, die durch Bezugnahme aufgenommen sind.
D. Beschaffenheit von Nucleinsäure
Die Nucleinsäuremoleküle wurden in manchen Gesichtspunkten und Ausführungsformen isoliert, gereinigt oder angereichert.
Mit „isoliert" in Bezug auf Nucleinsäure ist ein Polymer mit 14, 17, 21 oder mehr Nucleotiden gemeint, die aneinander konjugiert sind und die DNA oder RNA enthalten, die aus einer natürlichen Quelle isoliert oder synthetisiert ist. Die isolierte Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung ist in dem Sinne einzigartig, dass sie in der Natur nicht in einem reinen oder gesonderten Zustand vorgefunden wird. Die Verwendung des Ausdrucks „isoliert" weist darauf hin, dass eine natürlich vorkommende Sequenz aus ihrer normalen zellulären (d. h. chromosomalen) Umgebung entfernt wurde. Folglich kann die Sequenz in einer zellfreien Lösung vorliegen oder in einer anderen zellulären Umgebung angeordnet sein. Der Ausdruck impliziert nicht, dass die Sequenz die einzige vorhandene Nucleotidsequenz ist, sie ist jedoch im Wesentlichen frei (mindestens zu etwa 90-95 % rein) von Nicht-Nucleotidmaterial, das natürlich mit ihr assoziiert ist, und ist folglich dazu gedacht, sie von isolierten Chromosomen zu unterscheiden.
Mit der Verwendung des Ausdrucks „angereichert" in Bezug auf Nucleinsäure ist gemeint, dass die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz einen beträchtlich höheren Anteil (2- bis 5-fach) der gesamten DNA oder RNA, die in den betreffenden Zellen oder der betreffenden Lösung vorliegt, als in normalen oder kranken Zellen oder in den Zellen, denen die Sequenz entnommen wurde, ausmacht. Dies könnte von einer Person mittels begünstigter Verringerung der Menge anderer vorliegender DNA oder RNA oder mittels einer begünstigten Anhebung der Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz oder mittels einer Kombination der beiden bewirkt werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass „angereichert" nicht impliziert, dass keine anderen DNA- oder RNA-Sequenzen vorliegen, sondern nur dass die relative Menge der betreffenden Sequenz beträchtlich angehoben wurde.
Der Ausdruck „beträchtlich" wird hier dazu verwendet, anzuzeigen, dass das Ausmaß der Anhebung für die Person, die eine solche Anhebung vornimmt, dienlich ist, und steht im Allgemeinen für eine etwa mindestens 2-fache, mehr bevorzugt mindestens 5- oder 10-fache oder sogar höhere Anhebung in Bezug auf andere Nucleinsäuren. Der Ausdruck impliziert gleichfalls nicht, dass keine DNA oder RNA aus anderen Quellen vorliegt. Die DNA aus einer anderen Quelle kann beispielsweise DNA aus einem Hefe- oder Bakteriengenom oder einen Klonierungsvektor, wie pUC19, umfassen. Dieser Ausdruck unterscheidet die Sequenz von natürlich auftretenden Anreicherungsereignissen, wie Virusinfektion; oder tumorartigen Wüchsen, bei denen das Niveau einer mRNA in Bezug auf andere mRNA-Spezies natürlich erhöht sein kann. Das heißt, der Ausdruck soll lediglich jene Situationen umfassen, in denen eine Person eingegriffen hat, um den Anteil der gewünschten Nucleinsäure zu erhöhen.
Für manche Zwecke ist es auch vorteilhaft, dass eine Nucleotidsequenz in gereinigter Form ist. Der Ausdruck gereinigt in Bezug auf Nucleinsäure bedingt keine absolute Reinheit, wie ein homogenes Präparat; stattdessen stellt es einen Hinweis darauf dar, dass die Sequenz verhältnismäßig reiner als in der natürlichen Umgebung ist (im Vergleich zum natürlichen Niveau sollte dieses Niveau mindestens 2- bis 5-fach höher sein, z. B. in Form von mg/mL). Individuelle, aus einer cDNA-Bibliothek isolierte Klone können zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt werden. Die aus diesen Klonen erhaltenen DNA-Moleküle könnten direkt aus Gesamt-DNA oder aus Gesamt-RNA erhalten werden. Die cDNA-Klone kommen nicht natürlich vor, sondern werden vorzugsweise mittels Manipulation einer teilgereinigten, natürlich vorkommenden Substanz (Messenger-RNA) erhalten. Die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus mRNA umfasst das Erzeugen einer synthetischen Substanz (cDNA), und reine individuelle cDNA-Klone können mittels Klonselektion der Zellen, die die cDNA-Bibliothek tragen, aus der synthetischen Bibliothek isoliert werden. Somit ergibt das Verfahren, das die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus mRNA und die Isolierung von einzelnen cDNA-Klonen beinhaltet, eine ungefähr 10⁵-fache Reinigung der nativen Message. Folglich wird die Reinigung mit mindestens einer Zehnerpotenz, vorzugsweise zwei oder drei Zehnerpotenzen und mehr bevorzugt vier oder fünf Zehnerpotenzen ausdrücklich vorgesehen. Der Ausdruck wird auch dazu gewählt, Klone zu unterscheiden, die bereits existieren, aber nicht aus anderen Klonen in einer Bibliothek von Klonen isoliert wurden.
IV. Merkmale bevorzugter Plasmide und Vektoren der Erfindung.
Der Vektor und die Nucleinsäuremoleküle, die hierin beschrieben sind, können isolierte und/oder gereinigte DNA-Moleküle sein.
Ein Promotor kann mit einer wie hierin beschriebenen kodierenden Sequenz verknüpft werden und ist dadurch zum Exprimieren eines Peptids in der Lage. Das Polypeptid kann aus Zellen gereinigt werden, die zum Exprimieren des Polypeptids verändert wurden. Von einer Zelle wird gesagt, dass sie „zum Exprimieren eines gewünschten Polypeptids verändert wurde", wenn die Zelle mittels Genmanipulation dazu gebracht wird, ein Protein zu produzieren, das sie normalerweise nicht produziert oder das die Zelle normalerweise in niedrigeren Niveaus bereitstellt. Ein Fachmann kann leicht Methoden zum Einführen und Exprimieren von entweder genomischen, cDNA- oder synthetischen Sequenzen in entweder eukaryontische oder prokaryontische Zellen anpassen.
Von einem Nucleinsäuremolekül wie DNA wird gesagt, dass es „zum Exprimieren eines Polypeptids in der Lage ist", wenn es Nucleotidsequenzen enthält, die Transkriptions- und Translationsregulationsinformationen enthalten, und derartige Sequenzen werden mit Nucleotidsequenzen „funktionsfähig verknüpft", die für das Polypeptid kodieren. Eine funktionsfähige Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, auf eine solche Art und Weise verbunden werden, das die Expression der Gensequenz ermöglicht wird. Die exakte Beschaffenheit der regulatorischen Regionen, die zur Expression der Gensequenz erforderlich sind, kann sich von Organismus zu Organismus unterscheiden, wird aber im Allgemeinen eine Promotorregion enthalten, die in Prokaryonten sowohl den Promotor (der die Initiierung der RNA-Transkription steuert) als auch die DNA-Sequenzen enthält, die, wenn sie in RNA transkribiert werden, die Initiierung der Synthese signalisieren werden. Solche Regionen werden normalerweise jene 5'-nichtkodierenden Sequenzen enthalten, die an der Initiierung der Transkription und Translation beteiligt sind, wie die TATA-Box, die Capping-Sequenz, die CAAT-Sequenz und dergleichen.
Auf Wunsch kann die nichtkodierende Sequenz 3' zur Sequenz, die für ein gewünschtes Gen kodiert, mittels der oben beschriebenen Klonierungsverfahren erhalten werden. Diese Region kann für ihre regulatorischen Transkriptionsterminationssequenzen, wie Termination und Polyadenylierung, beibehalten werden. Durch Beibehalten der 3'-Region, die naturgemäß an die DNA-Sequenz angrenzt, die für ein gewünschtes Gen kodiert, kann somit das Transkriptionsterminationssignal bereitgestellt werden. Wenn die Transkriptionsterminationssignale in der Expressionswirtszelle nicht ausreichend funktional sind, kann eine in der Wirtszelle funktionale 3'-Region substituiert werden.
Bei zwei DNA-Sequenzen (wie einer Promotorregionsequenz und einer gewünschten Sequenz), von denen gesagt wird, dass sie funktionsfähig verknüpft sind, kann über die Beschaffenheit der Verknüpfung zwischen den zwei DNA-Sequenzen Folgendes gesagt werden: (1) sie resultiert nicht in der Einführung einer Rasterverschiebungsmutation, (2) sie stört nicht die Befähigung der Promotorregionsequenz, die Transkription einer gewünschten Gensequenz zu steuern, oder (3) sie stört nicht die Befähigung einer gewünschten Gensequenz, von der Promotorregionsequenz transkribiert zu werden. Somit wäre eine Promotorregion funktionsfähig mit einer DNA-Sequenz verknüpft, wenn der Promotor dazu in der Lage wäre, die Transkription dieser DNA-Sequenz zu bewirken. Folglich sind zum Exprimieren eines gewünschten Gens Transkriptions- und Translationssignale erforderlich, die von einem entsprechenden Wirt erkannt werden.
Die Komplexe der Erfindung sind vorzugsweise dazu gedacht, die Expression eines gewünschten Gens (oder eines funktionalen Derivats davon) in entweder prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen zu erzielen. Prokaryontische Wirte sind im Allgemeinen sehr effizient und für die Produktion von rekombinanten Proteinen zweckmäßig und sind folglich eine Art eines bevorzugten Expressionssystems für ein gewünschtes Gen. Prokaryonten werden am häufigsten von verschiedenen Trans von E. coli dargestellt. Andere Mikrobenstämme können jedoch ebenfalls verwendet werden, einschließlich anderer Bakterienstämme.
In prokaryontischen Systemen können Plasmidvektoren, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen, die von einer mit dem Wirt kompatiblen Spezies abgeleitet wurden, verwendet werden. Zu Beispielen von geeigneten Plasmidvektoren können pBR322, pUC118, pUC119 und dergleichen zählen; zu geeigneten Phagen- oder Bakteriophagenvektoren können λgt10, λgt11 und dergleichen zählen; und zu geeigneten Virusvektoren können pMAM-neo, pKRC und dergleichen zählen. Vorzugsweise weist der gewählte Vektor der vorliegenden Erfindung das Vermögen zum Replizieren in der gewählten Wirtszelle auf.
Zu anerkannten prokaryontischen Wirten zählen Bakterien, wie eine E. coli und jene von allgemeinen wie Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia und dergleichen. Unter derartigen Bedingungen wird das Polypeptid jedoch nicht glykosyliert sein. Der prokaryontische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
Um ein gewünschtes Gen (oder ein funktionales Derivat davon) in einer prokaryontischen Zelle zu exprimieren, ist es erforderlich, eine gewünschte Sequenz funktionsfähig mit einem funktionalen prokaryontischen Promotor, wie dem modifizierten CMV-Promotor der Erfindung; zu verknüpfen.
Die korrekte Expression in einer prokaryontischen Zelle bedingt außerdem die Gegenwart einer Ribosom-Bindungsstelle stromaufwärts der für die Gensequenz kodierenden Sequenz. Derartige Ribosom-Bindungsstellen werden beispielsweise von Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404, 1981) offenbart. Die Auswahl von Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren, Transformationsverfahren und dergleichen hängt von der Art der Wirtszelle ab, die zum Exprimieren des Gens verwendet wird.
Wie hierin verwendet, können Zelle, „Zelllinie" und Zellkultur austauschbar verwendet werden und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Nachkommen. Folglich beinhalten die Wörter „Transformanten" oder „transformierten Zellen" die primäre betreffende Zelle und davon abgeleitete Kulturen ungeachtet der Anzahl der Transfers. Es versteht sich außerdem, dass alle Nachkommen möglicherweise in Bezug auf den DNA-Gehalt aufgrund von absichtlichen oder versehentlichen Mutationen nicht exakt identisch sind. Wie definiert weisen Mutantennachkommen jedoch dieselbe Funktionalität wie die der ursprünglich transformierten Zelle auf.
Wirtszellen, die in den Expressionssystemen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nicht strengstens eingeschränkt, vorausgesetzt, dass sie zur Verwendung bei der Expression eines betreffenden Peptids geeignet sind. Zu geeigneten Wirten können oftmals eukaryontische Zellen zählen. Zu bevorzugten eukaryontischen Wirten zählen beispielsweise Hefe, Pilze, Insektenzellen, Säugerzellen entweder in vivo oder in Gewebekultur. Zu Säugerzellen, die als Wirte dienlich sein können, zählen HeLa-Zellen, Zellen mit Fibroblastursprung, wie VERO, 3T3 oder CHO-K1, oder Zellen mit Lymphursprung (wie 32D-Zellen) und deren Derivate. Zu bevorzugten Säugerwirtszellen zählen SP2/0 und J558L sowie Neuroblastomzelllinien, wie IMR332 und PC12, die bessere Eigenschaften zur korrekten posttranslatio nellen Verarbeitung bereitstellen können.
Darüber hinaus stehen Pflanzenzellen ebenfalls als Wirte zur Verfügung und mit Pflanzenzellen kompatible Kontrollsequenzen sind verfügbar, wie der Blumenkohlmosaikvirus 35S und 19S und Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Ein anderer bevorzugter Wirt ist eine Insektenzelle, beispielsweise die Drosophila-Larven. Unter Verwendung von Insektenzellen als Wirten kann der Drosophila-Alkoholdehydrogenase-Promotor angewendet werden (Rubin, Science 240:1453-1459, 1988). Alternativ können Baculovirusvektoren derart konstruiert werden, dass sie große Mengen eines gewünschten Peptids oder Proteins in Insektenzellen exprimieren (Jasny, Science 238:1653 (1987); Miller et al. in: Genetic Engineering (1986), J.K. Setlow et al., Hrsg., Plenum, Bd. 8, S. 277-297).
Ein beliebiges einer Reihe von Hefegensequenz-Expressionssystemen kann eingesetzt werden, die Promotor- und Terminationselemente aus den aktiv exprimierten Gensequenzen inkorporieren, die für glykolytische Enzyme kodieren, die in großen Mengen produziert werden, wenn Hefe in an Glukose reichen Medien gewachsen wird. Bekannte glykolytische Gensequenzen können auch sehr effektive Transkriptionskontrollsignale bereitstellen. Hefe bietet insofern beträchtliche Vorteile, dass sie auch posttranslationelle Peptidmodifikationen durchführen kann. Es existiert eine Reihe von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und eine hohe Kopiezahl von Plasmiden einsetzen, die zur Produktion der gewünschten Proteine in Hefe angewendet werden können. Hefe erkennt Leader-Sequenzen auf klonierten Säugergensequenzprodukten und sezerniert Peptide, die Leader-Sequenzen tragen (d. h. Präpeptide).
Für einen Säugerwirt stehen mehrere mögliche Vektorsysteme zur Expression von gewünschten Genen zur Verfügung.
Eine große Vielfalt an Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen können je nach Beschaffenheit des Wirts eingesetzt werden. Die Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen können von Virusquellen abgeleitet werden, wie Adenovirus, Rinderpapillomvirus, Zytomegalievirus, Simian-Virus oder dergleichen, wobei die regulatorischen Signale mit einer bestimmten Gensequenz assoziiert werden, die ein hohes Expressionsniveau aufweist. Alternativ können Promotoren aus Säugerexpressionsprodukten, wie Actin, Collagen, Myosin und dergleichen, eingesetzt werden. Es können regulatorische Transkriptionsinitiationssignale gewählt werden, die eine Reprimierung oder Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der Gensequenzen moduliert werden kann. Von Interesse sind regulatorische Signale, die temperaturempfindlich sind, so dass die Expression mittels Variieren der Temperatur reprimiert oder initiiert werden kann, oder die einer chemischen Regulation (wie Metabolitregulation) unterliegen.
Die Translation von eukaryontischer mRNA wird am Codon initiiert, das für das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer DNA-Sequenz, die für ein gewünschtes Peptid oder Protein kodiert, keine dazwischen liegenden Codons enthält, die zum Kodieren eines Methionins in der Lage sind (d. h. AUG). Die Gegenwart solcher Codone resultiert entweder in einer Bildung eines Fusionproteins (wenn sich das AUG-Codon im selben Leseraster wie eine gewünschte kodierende Sequenz befindet) oder einer Rasterverschiebungsmutation (wenn sich das AUG- Codon nicht im selben Leseraster wie eine gewünschte kodierende Sequenz befindet).
Ein gewünschtes Nucleinsäuremolekül und ein funktionsfähig verknüpfter Promotor können in eine prokaryontische oder eukaryontische Empfängerzelle entweder als ein nicht replizierendes DNA-Molekül (oder RNA-Molekül) eingeführt werden, bei dem es sich entweder um ein lineares Molekül oder mehr bevorzugt ein geschlossenes kovalentes zirkuläres Molekül (ein Plasmid) handeln kann. Da solche Moleküle nicht zur autonomen Replikation in der Lage sind, kann die Expression des Gens über die vorübergehende Expression der eingeführten Sequenz erfolgen. Alternativ kann eine dauerhafte oder stabile Expression über die Integration der eingeführten DNA-Sequenz in das Wirtschromosom erfolgen.
Es kann ein Vektor eingesetzt werden, der zum Integrieren der gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellchromosom in der Lage ist. Zellen, die die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können selektiert werden, indem auch ein oder mehrere Marker eingeführt werden, die die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann einen auxotrophen Wirt mit Prototrophie, Biozidresistenz, z. B. Antibiotika oder Schwermetalle wie Kupfer, oder dergleichen, ausstatten. Die selektierbare Markergensequenz kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen verknüpft oder mittels Cotransfektion in dieselbe Zelle eingeführt werden. Weitere Elemente können ebenfalls zur optimalen Synthese von mRNA eines einkettigen Bindeproteins erforderlich sein. Zu diesen Elementen können Spleißsignale sowie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale zählen. Zu cDNA-Expressionsvektoren, die derartige Elemente inkor porieren, zählen die von Okayama, Molec. Cell. Bio. 3:280 (1983), beschriebenen.
Das eingeführte Nucleinsäuremolekül kann in ein Plasmid oder einen viralen Vektor inkorporiert werden, das bzw. der zur autonomen Replikation im Empfängerwirt in der Lage ist. Ein beliebiger einer großen Vielfalt an Vektoren kann für diesen Zweck eingesetzt werden. Zu wichtigen Faktoren beim Auswählen eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors zählen: die Einfachheit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von jenen Empfängerzellen, die den Vektor nicht enthalten, selektiert werden können; die Anzahl von Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht wird; und ob es wünschenswert ist, zum „Shutteln" des Vektors zwischen Wirtszellen verschiedener Spezies in der Lage zu sein.
Zu bevorzugten prokaryontischen Vektoren zählen Plasmide, wie jene, die zur Replikation in E. coli in der Lage sind (wie beispielsweise pBR322, ColE1, pSC101, pACYCl84, pVX). Solche Plasmide werden beispielsweise von Sambrook offenbart (vgl. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Zu Bacillus-Plasmiden zählen pC194, pC221, pT127 und dergleichen. Solche Plasmide werden von Gryczan offenbart (in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, USA (1982), S. 307-329). Zu geeigneten Streptomyces-Plasmiden zählen p1J101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987) und Streptomyces-Bakteriophagen wie fC31 (Chater et al. in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), S. 45-54). Pseudomonas-Plasmide werden von John et al. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704, 1986) und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978) besprochen.
Zu bevorzugten eukaryontischen Plasmiden zählen beispielsweise BPV, Vakzinia, SV40, „2-micron circle" und dergleichen oder deren Derivate. Solche Plasmide sind in der Technik wohl bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-274, 1982); Broach in: „The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, S. 445-470 (1981); Broach, Cell 28:203-204 (1982); Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, USA, S. 563-608 (1980).
Sobald der Vektor oder das Nucleinsäuremolekül, der bzw. das Konstrukt bzw. die Konstrukte enthält, zur Expression vorbereitet wurde, kann bzw, können das DNA-Konstrukt bzw. die DNA-Konstrukte in eine entsprechende Wirtszelle über ein beliebiges einer Vielfalt an geeigneten Mitteln eingeführt werden, d. h. Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Partikelkanonentechnologie, Calciumphosphat-Präzipitation, direkter Mikroinjektion und dergleichen. Nach der Einführung des Vektors werden Empfängerzellen in einem ausgewählten Medium gewachsen, das für das Wachstum von Vektor enthaltenden Zellen selektiert. Die Expression des klonierten Genmoleküls bzw. der klonierten Genmoleküle resultiert in der Produktion des gewünschten Peptids oder Proteins. Dies kann in den transformierten Zellen as solchen oder nach der Auslösung der Differenzierung dieser Zellen (beispielsweise mittels Verabreichung von Bromdesoxyuracil an Neuroblastomzellen oder dergleichen) erfolgen. Eine Vielfalt an Inkubationsbedingungen kann zum Bilden des Peptids der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die am meisten bevorzugten Bedingungen sind jene, die physiologische Bedingungen nachahmen.
Die hierin beschriebenen Verfahren zum Formulieren wären zur Verwendung mit einer großen Vielfalt an Genen und Plasmiden geeignet, einschließlich IL-2, IL-12, Interferonalpha und IGF-1, wie jeweils in Coleman et al., US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/974,572, mit dem Titel „IGF-I Expression System and Methods of Use", eingereicht am 19. November 1997, vor der WO98/24922 Priorität in Anspruch nimmt, beschrieben.
VI. Verabreichung
Verabreichung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Route der Einführung eines Vektors oder DNA-Trägers in den Körper. Die Verabreichung kann direkt an ein Zielgewebe oder mittels targetierter Zuführung an das Zielgewebe nach systemischer Verabreichung erfolgen. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung zum Behandeln einer Erkrankung mittels Verabreichung des Vektors an den Körper verwendet werden, um eine gesteuerte Expression einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in Geweben auf bestimmte Niveaus einzurichten, die für die Gentherapie geeignet sind.
Die bevorzugten Mittel zur Verabreichung des Vektors und die bevorzugte Verwendung von Formulierungen zur Zuführung sind oben beschrieben. Die bevorzugte Ausführungsform ist mittels direkter Injektion unter Verwendung von Injektion mit einer Nadel oder Hypospray.
Die Verabreichungsroute eines beliebigen gewählten Vektorkonstrukts wird von der bestimmten Verwendung der Expressionsvektoren abhängen. Im Allgemeinen wird sich eine spezifische Formulierung für jedes verwendete Vektorkonstrukt auf die Vektoraufnahme in Bezug auf das bestimmte targetierte Gewebe, gefolgt von einer Demonstration der Wirksamkeit konzentrieren. Zu Aufnahmestudien werden Aufnahmeassays zum Bewerten der zellulären Aufnahme. der Vektoren und der Expression der gewählten gewebespezifischen DNA zählen. Solche Assays werden auch die Lokalisierung der Ziel-DNA nach der Aufnahme bestimmen und die Erfordernisse zur Aufrechterhaltung von Steady-State-Konzentrationen des exprimierten Proteins festlegen. Dann können die Wirksamkeit und die Zytotoxizität geprüft werden. Die Toxizität wird nicht nur die Lebensfähigkeit der Zelle, sondern auch die Zellfunktion einbeziehen.
Muskelzellen haben die einzigartige Fähigkeit, DNA nach einfacher Injektion von DNA-Teilchen als eine Lösung, eine Suspension oder ein Kolloid in den Muskel aus dem extrazellulären Raum aufzunehmen. Die Expression der DNA mittels dieses Verfahrens kann mehrere Monate lang aufrechterhalten werden.
Die Zuführung formulierter DNA-Vektoren umfasst das Inkorporieren von DNA in makromolekulare Komplexe, die Endozytose von der Zielzelle unterzogen werden. Zu derartigen Komplexen können Lipide, Proteine, Kohlenhydrate, synthetische organische Verbindungen oder anorganische Verbindungen zählen. Die Charakteristika des mit dem Vektor gebildeten Komplexes (Größe, Ladung, Oberflächencharakteristika, Zusammensetzung) bestimmen die Bioverfügbarkeit des Vektors im Körper. Andere Elemente der Formulierung fungieren als Ligand, der mit spezifischen Rezeptoren auf der Oberfläche oder im Inneren der Zelle wechselwirkt. Andere Elemente der Formulierung fungieren dahingehend, dass sie den Eintritt in die Zelle, die Freisetzung aus dem Endosom und den Eintritt in den Zellkern fördern.
Die Zuführung kann auch mittels Verwendung von DNA-Transportern erfolgen. DNA-Transporter bezieht sich auf Moleküle, die an DNA-Vektoren binden und von Epidermiszellen aufgenommen werden können. DNA-Transporter enthalten einen Molekülkomplex, der zum nichtkovalenten Binden an DNA und effizienten Transportieren der DNA durch die Zellmembran in der Lage ist. Es ist bevorzugt, dass der Transporter auch die DNA durch die Zellkernmembran transportiert. Siehe z. B. die folgenden Anmeldungen: Woo et al., PCT/US93/02725, eingereicht am 19. März 1993, internationale Veröffentl. WO93/18759, mit dem Titel „A DNA Transporter System and method of Use" (die die USA und andere Länder benennt); und Szoka et al., PCT/US93/03406, eingereicht am 5. April 1993, internationale Veröffentl. WO93/19768, mit dem Titel „Self-Assembling Polynucleotide Delivery System" (die die USA und andere Länder benennt).
Der Transfer von Genen direkt in Muskel war sehr effektiv. Versuche zeigen, dass eine Verabreichung mittels direkter Injektion von DNA in Muskelzellen in der Expression des Gens im Bereich der Injektion resultiert. Die Injektion von Plasmiden, die GHRH enthalten, resultiert in der Expression des Gens über Monate bei verhältnismäßig konstanten Niveaus. Die injizierte DNA scheint in einem nicht integrierten extrachromosomalen Zustand zu bleiben. Bei diesem Transfermittel handelt es sich um die bevorzugte Ausführung.
Ein weiteres bevorzugtes Zuführungsverfahren umfasst ein DNA-Transportersystem. Das DNA-Transportersystem besteht aus Teilchen, die mehrere Elemente enthalten, die unabhängig und nichtkovalent an DNA gebunden sind. Jedes Element besteht aus einem Liganden, der spezifische Rezeptoren oder andere Funktionsgruppen erkennt, wie ein Protein, das mit einer kationischen Gruppe komplexiert ist, die an DNA bindet. Beispiele von Kationen, die verwendet werden können, sind Spermin, Sperminderivate, Histon, kationische Peptide und/oder Polylysin. Ein Element ist zum Binden sowohl an den DNA-Vektor als auch an einen Zelloberflächenrezeptor auf der Zielzelle in der Lage. Beispiele solcher Elemente sind organische Verbindungen, die mit dem Asialoglykoprotein-Rezeptor, dem Folat-Rezeptor, dem Mannose-6-phosphat-Rezeptor oder dem Carnitin-Rezeptor wechselwirken. Ein zweites Element ist zum Binden sowohl an den DNA-Vektor als auch an einen Rezeptor auf der Zellkernmembran in der Lage. Der Zellkernligand kann ein Transportersystem erkennen und durch eine Zellkernmembran transportieren. Ein Beispiel eines derartigen Liganden ist die Zellkern-Targeting-Sequenz vom großen T-Antigen oder Histon von SV40. Ein drittes Element ist zum Binden sowohl an den DNA-Vektor als auch an Elemente, die Episomenlyse induzieren, in der Lage. Zu Beispielen zählen inaktivierte Viruspartikel, wie Adenovirus, mit dem Influenzavirus-Hämagglutinin verwandte Peptide oder das im oben zitierten Szoka-Patent beschriebene GALA-Peptid.
Die Verabreichung kann auch Lipide einbeziehen. Die Lipide können Liposome bilden, bei denen es sich um hohle sphärische Vesikel handelt, die sich aus Lipiden, die auf unilamellare, bilamellare oder multilamellare Art und Weise angeordnet sind, und einem inneren wässrigen Raum zum Einfangen von wasserlöslichen Verbindungen, wie DNA, zusammensetzen und deren Durchmesser von 0,05 bis mehrere Mikrometer reicht. Lipide können nützlich sein, ohne dass sie Liposome bilden. Zu spezifischen Beispielen zählen die Verwendung von kationischen Lipiden und Komplexen, die DOPE enthalten, das mit DNA und mit der Membran der Zielzelle wechselwirkt, um den Eintritt der DNA in die Zelle zu erleichtern.
Die Genzuführung kann auch mittels Transplantieren gentechnisch veränderter Zellen durchgeführt werden. Zum Beispiel können unentwickelte Muskelzellen, die Myoblasten genannt werden, zum Befördern von Genen in die Muskelfasern verwendet werden. Myoblasten, die zum Exprimieren von rekombinantem humanem Wachstumshormon gentechnisch verändert wurden, können das Wachstumshormon in das Blut eines Tiers sezernieren. Die Sekretion des inkorporierten Gens kann über Zeitspannen von bis zu 3 Monaten aufrechterhalten werden.
Myoblasten differenzieren letztendlich und fusionieren an bestehendes Muskelgewebe. Da die Zelle in eine bestehende Struktur inkorporiert ist, wird sie nicht nur toleriert, sondern auch genährt. Myoblasten können leicht erhalten werden, indem Muskelgewebe von einer Person, die einer Gentherapie bedarf, genommen wird, und die gentechnisch veränderten Zellen können auch leicht wieder in das Gewebe gegeben werden, ohne eine Schädigung des Muskels des Patienten zu verursachen. Analog dazu können Keratinozyten zum Zuführen von Genen an Gewebe verwendet werden. Große Zahlen von Keratinozyten können mittels Kultivierung einer kleinen Biopsie erzeugt werden. Die Kulturen können als geschichtete Platten präpariert werden und erzeugen bei Verpflanzung an Menschen Epidermis, deren histotypische Güte sich über viele Jahre weiter verbessert. Die Keratinozyten werden gentechnisch verändert, während sie in Kultur sind, indem die Keratinozyten mit dem entsprechenden Vektor transfiziert werden. Obgleich Keratinozyten von der Basalmembran, die die Epidermis von der Dermis abteilt, vom Kreislauf getrennt werden, sezernieren humane Keratinozyten im Kreislauf das produzierte Protein.
Die Zuführung kann auch die Verwendung von viralen Vektoren einbeziehen. Zum Beispiel kann ein adenoviraler Vektor konstruiert werden, indem die E1-Region des Virusgenoms durch die in dieser Erfindung beschriebenen Vektorelemente, die Promotor, 5'-UTR, 3'-U'TR und Nucleinsäurekassette enthalten, ersetzt und dieses rekombinante Genom in 293-Zellen eingeführt wird, die dieses Gen in ein infektiöses Viruspartikel verpacken werden. Virus aus dieser Zelle kann dann zum Infizieren von Gewebe ex vivo oder in vivo verwendet werden, um den Vektor in Gewebe einzuführen, was zur Expression des Gens in der Nucleinsäurekassette führt.
Das gewählte Zuführungsverfahren sollte in der Expression des Genprodukts resultieren, das in der Nucleinsäurekassette in Niveaus kodiert wird, die eine entsprechende biologische Wirkung ausüben. Die Expressionsrate wird von der Erkrankung, den Pharmakokinetiken des Vektors und des Genprodukts und der Verabreichungsroute abhängen, sollte jedoch zwischen 1-1000 mg/kg Körpergewicht/Tag liegen. Diese Konzentration ist mit Standardverfahren leicht ermittelbar. Es könnte je nach der optimalen Dosierung mehr oder weniger betragen. Die Dauer der Behandlung wird sich über den Verlauf der Erkrankungssymptome, möglicherweise konti nuierlich erstrecken. Die Anzahl von Dosen wird von der Erkrankung, dem Zuführungsvehikel und den Wirksamkeitsdaten aus klinischen Prüfungen abhängen.
VII. Zelltransfektion und -transformation
Wie hierin verwendet, ist „Transformation" vorzugsweise die Veränderung der phänotypischen Charakteristika einer Zelle durch die Aktion eines Gens, das ein Genprodukt exprimiert. Das Gen, das die Veränderung der phänotypischen Charakteristika verursacht, wurde in die Zelle transfiziert.
Der Ausdruck „Transfektion", wie hierin verwendet, bezieht sich vorzugsweise auf einen Gentransfermechanismus, der die Aufnahme von DNA durch eine Zelle oder einen Organismus einbindet. Nach Eintritt in die Zelle kann sich die transformierende DNA mit der des Wirts neu kombinieren, indem sie sich physikalisch in die Chromosomen der Wirtszelle integriert, kann vorübergehend als ein episomales Element erhalten werden, ohne repliziert zu werden, oder kann sich unabhängig als ein Plasmid replizieren. Vorzugsweise integriert sich die transformierende DNA nicht.
Die Transfektion kann mittels wie im Folgenden beschriebenen In-vivo-Techniken oder mittels Ex-vivo-Techniken, bei denen Zellen mit einem Vektor cotransfiziert werden, der einen selektierbaren Marker enthält, durchgeführt werden. Dieser selektierbare Marker wird zum Selektieren jener Zellen verwendet, die transformiert wurden. Fachmännern ist die Art von selektierbaren Markern, die mit Transfektions/Transformationsstudien zu verwenden sind, wohl bekannt. Ein Beispiel eines solchen Markers ist ein neo-Gen, das Neomycin-/Kanamycinresistenz bereitstellt.
Die Transfektion/Transformation kann gewebespezifisch sein, d. h. die Verwendung von myogenen spezifischen Vektoren einbeziehen, die die Expression der Nucleinsäurekassette vorwiegend im gewählten Gewebe bewirken. Gewebespezifität kann insbesondere auf myogene Zellen gerichtet werden, indem ein Promotor und/oder 3'-UTR- und/oder 3'-NCR-Sequenzen, die für die Expression von myogenem Gewebe spezifisch sind, verwendet werden.
Sobald die Zellen transfiziert wurden, werden die transformierten Zellen das Protein oder die RNA, das bzw. die von der Nucleinsäurekassette kodiert wurde, exprimieren. Beispiele von Proteinen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Polypeptid, Glykoprotein, Lipoprotein, Phosphoprotein oder Nucleoprotein.
Die Nucleinsäurekassette, die das betreffende genetische Material enthält, ist in den Vektoren derart positionell und sequentiell ausgerichtet, dass die Nucleinsäure in der Kassette in RNA transkribiert und bei Bedarf in Proteine oder Polypeptide in den transformierten Zellen translatiert werden kann.
Eine Vielfalt an Proteinen kann von der Sequenz in der Nucleinsäurekassette in den transformierten Zellen exprimiert werden. Jene Proteine, die exprimiert werden können, können sich im Zytoplasma, im Zellkern, in den Membranen (einschließlich des Plasmalemmas, der Zellkernmembran, des endoplasmatischen Retikulums oder anderer innerer Membrankompartimente), in Organellen (einschließlich des Mitochondrions, des Peroxisoms, des Lysosoms, des Endosoms oder anderer Organellen) befinden oder sezerniert sein. Diese Proteine können als intrazelluläre oder extrazelluläre Strukturelemente, Ligand, Hormone, Neurotransmitter, wachstumsregulierende Faktoren, Differenzierungsfaktoren, die Genexpression regulierende Faktoren, DNA-assoziierte Proteine, Enzyme, Serumproteine, Rezeptoren, Träger für organische oder anorganische Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, Arzneimittel, Immunmodulatoren, Onkogene, Tumorsuppressoren, Toxine, Tumorantigene oder Antigene fungieren. Diese Proteine können eine natürliche Sequenz oder eine mutierte Sequenz zum Verstärken, Inhibieren, Regulieren oder Eliminieren ihrer biologischen Aktivität aufweisen. Ein spezifisches Beispiel eines zu exprimierenden Proteins ist hGHRH.
Darüber hinaus kann die Nucleinsäurekassette für RNA kodieren. Die RNA kann als eine Matrize für Translation, als ein Antisense-Inhibitor von Genexpression, als ein Dreifachstränge bildender Inhibitor von Genexpression, als ein Enzym (Ribozym) oder als ein Ligand, der spezifische, die Struktur bestimmende Faktoren an zellulären Strukturen zum Zweck des Modifizierens von deren Aktivität erkennt, fungieren. Zu spezifischen Beispielen zählen RNA-Moleküle zum Inhibieren der Expression oder Funktion von Prostaglandinsynthase, Lipoxygenase, Histokompatibilitäts-Antigenen (Klasse I oder Klasse II), Zelladhäsionsmolekülen, Stickstoffmonoxidsynthase, β₂-Mikroglobulin, Onkogenen und Wachstumsfaktoren.
Die Verbindungen, die inkorporiert werden können, werden nur durch die Verfügbarkeit der Nucleinsäuresequenz für das zu inkorporierende Protein oder Polypeptid eingeschränkt. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass, wenn mehr Proteine und Polypeptide identifiziert werden, diese in das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung integriert und in tierischem oder menschlichem Gewebe exprimiert werden können.
Die Transfektion kann entweder mittels In-vivo- oder Exvivo-Techniken vorgenommen werden. Zum Beispiel können Muskelzellen in Kultur vermehrt, mit dem transformierenden Gen transfiziert und dann in Muskelgewebe transplantiert werden. Alternativ können die Vektoren mittels der oben erörterten Verfahren an die Zellen verabreicht werden.
Eine Vielfalt an Proteinen oder deren genetischen Sequenzen, sowohl mutiert als auch nicht mutiert, werden ebenfalls in der Gentherapie nützlich sein (in Miller, Nature 357:455-460 (1992) besprochen). Miller konstatiert, dass Fortschritte in praktischen Ansätzen der menschlichen Gentherapie resultiert haben, die positive Anfangsresultate aufzeigten. Die grundlegende Wissenschaft der Gentherapie ist in Mulligan, Science 160:926-931 (1993), beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Expressionsvektor, der eine kodierende Sequenz enthält, in Zellen inseriert, die Zellen werden in vitro gewachsen und dann in großen Anzahlen in Patienten infundiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA-Segment, das einen gewählten Promotor (beispielsweise einen starken Promotor) enthält, derart in Zellen, die ein endogenes gewünschtes Gen enthalten, übertragen, dass das Promotorsegment die Expression des endogenen gewünschten Gens verstärkt (zum Beispiel wird das Promotorsegment so auf die Zelle übertragen, dass diese direkt mit dem endogenen gewünschten Gen verknüpft wird).
Die Gentherapie kann die Verwendung eines Adenovirus, der cDNA des gewünschten Gens enthält, die auf eine entsprechende Zellart gerichtet wird, die systemische Mehrung des gewünschten Gens mittels Einpflanzung von veränderten Zellen, die Injektion mit dem Virus des gewünschten Gens oder die Injektion von nackter DNA des gewünschten Gens in entsprechende Zellen oder Gewebe, beispielsweise Neuronen, umfassen.
Von Viren, wie Retroviren, Vakziniavirus, Adenovirus, adeno-assoziiertem Virus, Herpesviren, mehreren RNA-Viren oder Rinderpapillomvirus, abgeleitete Expressionsvektoren können zur Zuführung von Nucleotidsequenzen (z. B. cDNA), die für rekombinantes Protein kodieren, in die targetierte Zellpopulation (z. B. Tumorzellen oder Neuronen) verwendet werden. Verfahren, die Fachmännern wohl bekannt sind, können zum Konstruieren rekombinanter viraler Vektoren, die kodierende Sequenzen enthalten, verwendet werden. Siehe beispielsweise die in Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA (1989), und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, USA (1989), beschriebenen Techniken. Alternativ können rekombinante Nucleinsäuremoleküle, die für Proteinsequenzen kodieren, als nackte DNA oder in rekonstituierten Systemen, z. B. Liposomen oder anderen Lipidsystemen, zur Zuführung an Zielzellen verwendet werden (siehe z. B. Felgner et al., Nature 337:387-388, 1989). Mehrere andere Verfahren zum direkten Transfer von Plasmid-DNA in Zellen existieren zur Anwendung in der menschlichen Gentherapie und umfassen das Richten der DNA auf Rezeptoren auf Zellen mittels Komplexieren der Plasmid-DNA an Proteine. Siehe Miller, oben.
In seiner einfachsten Form kann der Gentransfer durch einfaches Injizieren winziger DNA-Mengen in den Zellkern einer Zelle mittels eines Mikroinjektionsvorgangs durchgeführt werden. (M.R. Capecchi, Cell 22 479-488, 1980). Sobald rekombinante Gene in eine Zelle eingeführt werden, können sie von den normalen Mechanismen der Zellen zur Transkription und Translation erkannt werden und ein Genprodukt wird exprimiert. Es sind ebenfalls andere Verfahren zum Einführen von DNA in größere Anzahlen von Zellen ausprobiert worden. Zu diesen Verfahren zählen: Transfektion, bei der DNA mit CaPO₄ präzipitiert und mittels Pinozytose in Zellen überführt wird (C. Chen und H. Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987); Elektroporation, bei der Zellen großen Spannungsimpulsen ausgesetzt werden, um Löcher in die Membran einzubringen (G. Chu et al., Nucleic Acids Res., 15:1311-1326, 1987); Lipofektion/Liposomenfusion, bei der DNA in liphophile Vesikel verpackt wird, die mit einer Zielzelle verschmelzen (P.L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987); und Teilchenbeschuss unter Verwendung von an kleine Projektile gebundener DNA (N.S. Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572, 1990). Ein anderes Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen besteht darin, die DNA an chemisch modifizierte Proteine zu koppeln.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Adenovirusproteine Endosomen destabilisieren und die Aufnahme von DNA in Zellen fördern können. Das Zumischen von Adenovirus zu Lösungen, die DNA-Komplexe enthalten, oder das Binden von DNA an Polylysin, das kovalent mit Adenovirus verbunden ist, unter Verwendung von Proteinvernetzungsmitteln verbessert die Aufnahme und die Expression des rekombinanten Gens wesentlich. D.T. Curiel et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6:247-252, 1992).
Wie hierin verwendet, steht „Gentransfer" für den Vorgang des Einführens eines Fremd-Nucleinsäuremoleküls in eine Zelle. Der Gentransfer wird üblicherweise zum Ermöglichen der Expression eines bestimmten Produkts, das von dem Gen kodiert wird, durchgeführt. Das Produkt kann ein Protein, ein Polypeptid, eine Antisense-DNA oder -RNA oder eine enzymatisch aktive RNA beinhalten. Der Gentransfer kann in kultivierten Zellen oder mittels direkter Verabreichung in Tiere durchgeführt werden. Im Allgemeinen umfasst der Gentransfer den Vorgang des Kontakts der Nucleinsäure mit einer Zielzelle mittels nicht spezifischer oder rezeptorvermittelter Wechselwirkungen, die Aufnahme der Nucleinsäure in die Zelle durch die Membran oder mittels Endozytose und die Freisetzung der Nucleinsäure in das Zytoplasma von der Plasmamembran oder dem Endosom. Die Expression kann darüber hinaus die Bewegung der Nucleinsäure in den Kern der Zelle und das Binden an entsprechende Zellkernfaktoren zur Transkription bedingen.
Wie hierin verwendet, ist „Gentherapie" eine Form von Gentransfer und ist von der Definition von Gentransfer, wie hierin verwendet, umfasst und bezieht sich spezifisch auf Gentransfer zum Exprimieren eines therapeutischen Produkts aus einer Zelle in vivo oder in vitro. Der Gentransfer kann ex vivo an Zellen durchgeführt werden, die dann in einen Patienten transplantiert werden, oder kann mittels direkter Verabreichung der Nucleinsäure oder des Nucleinsäure/-Protein-Komplexes in den Patienten durchgeführt werden.
Ein Vektor mit Nucleinsäuresequenzen, die für ein gewünsch tes Protein kodieren, können bereitgestellt werden, wobei die Nucleinsäuresequenz nur in spezifischem Gewebe exprimiert wird. Verfahren zum Erzielen gewebespezifischer Genexpression sind in Schwartz et al., internationale Anmeldung Nr. PCT/US92/09353, internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/09236, eingereicht am 3. November 1992 und veröffentlicht am 13. Mai 1993, mit dem Titel „Myogenic Vector Systems", dargelegt.
In allen vorstehenden Vektoren, die oben dargelegt sind, besteht ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung darin, dass die Nucleinsäuresequenz, die im Vektor enthalten ist, Additionen, Deletionen oder Modifikationen an einem Teil oder der gesamten Sequenz der Nucleinsäure enthalten kann, wie oben definiert.
Es wird ein Verfahren des Genaustauschs dargelegt. „Genaustausch", wie hierin verwendet, steht für das Liefern einer Nucleinsäuresequenz, die in vivo in einem Tier exprimiert werden kann und dadurch die Funktion eines endogenen Gens bereitstellt oder verstärkt, die in dem Tier fehlt oder defekt ist.
VIII. Behandlungen und Verwendungen der Komplexe.
Die vorliegende Erfindung kann bei der Behandlung einer großen Vielfalt an Erkrankungen, je nach dem gewählten Vektor, verwendet werden. Verschiedene Vektoren entsprechen der Behandlung verschiedener Erkrankungen, wie unten aufgeführt. Die folgende Liste soll in keinerlei Weise die Erfindung einschränken.
Der Zustand oder die Erkrankung ist vorzugsweise ein Karzinom, wie Carcinoma adenomatosum, einschließlich Adenom und Adenokarzinom; squamöses und Übergangskarzinom, einschließlich Polypen-, papilläres, Plattenepithel- und Übergangszellkarzinom; Bindegewebskrebs, einschließlich gewebetyppositiver Krebs, Sarkom und andere (-ome); hämopoetisches und lymphoretikuläres Karzinom, einschließlich Lymphom, Leukämie und Hodgkin-Krankheit; Krebs des Nervengewebes, einschließlich Neurom, Sarkom, Neurofibrom und Blastom; Krebs gemischter Ursprungsgewebe, einschließlich Teratom und Teratokarzinom. Zu anderen kanzerösen Zuständen, die zur Behandlung geeignet sind, zählt Krebs eines beliebigen der folgenden: Nebenniere, Anus, Gallengang, Blase, Hirntumore: Hirntumore Erwachsener, Brust, Krebs einer unbekannten primären Stelle, Karzinoide des Magen-Darm-Trakts, Zervix, Kinderkrebsarten, Dickdarm und Mastdarm, Speiseröhre, Gallenblase, Kopf und Hals, Inselzell- und andere Pankreaskarzinome, Kaposi-Sarkom, Niere, Leukämie, Leber, Lunge: nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Lunge: kleinzelliger Lungenkrebs, Lymphom: AIDS-assoziiertes Lymphom, Lymphom: Hodgkin-Krankheit, Lymphome: Non-Hodgkin-Krankheit, Melanom, Mesotheliom, metastisierendes Karzinom, multiples Myelom, Eierstock, Keimzelltumore des Ovars, Pankreas, Nebenschilddrüse, Penis, Hypophyse, Prostata, Knochen- und Weichteilsarkome, Haut, Dünndarm, Magen, Hoden, Thymus, Schilddrüse, Trophoblastenerkrankung, Gebärmutter: Endometriumkarzinom, Gebärmutter: Gebärmuttersarkome, Vagina oder Vulva.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird in Verbindung mit den folgenden spezifischen Beispielen vollständiger beschrieben, die in keinerlei Weise als den Schutzumfang der Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollten.
Regelgrößen, die sich auf die langfristige Lagerungsbeständigkeit von Plasmid/PVP-Komplexen (PVP = Polyvinylpyrrolidon) und Plasmid/PVA-Komplexen (PVA = Polyvinylalkohol) auswirken, wurden als Teil eines laufenden Projekts zum Entwickeln einer Formulierung für den klinischen Gebrauch geprüft.
Ein Einampullenkomplex von Plasmid und PVP (1:17 w/w) oder ein Einampullenkomplex von Plasmid und PVA (1:10 w/w) wird hierin bereitgestellt und ist aufgrund von (1) reduzierter Herstellungskosten, (2) einfacher Herstellung und Qualitätskontrollprüfung, (3) Produktstabilität und (4) verbesserter Doktor/Patient-Compliance und relativ einfacher Verabreichung wünschenswert. Eine Formulierung, bei der es sich um ein lyophilisiertes Einampullenprodukt handelt, das dieselben physikalischen Eigenschaften und dieselbe Wirksamkeit wie die des frisch präparierten Vierampullenkomplexes bewahrt, ist hierin dargestellt. Obgleich die Stabilität und Wirksamkeit des Produkts vorrangig waren, wurden auch Charakteristika wie einfache Herstellung und Fähigkeit zur Aufhydrierung berücksichtigt. Die in Frage kommenden Komplexe wurden auf Zusammensetzung, Plasmidtopologie, Osmolalität, pH-Wert, In-vitro-Wirksamkeit und In-vivo-Wirksamkeit analysiert.
In Abwesenheit von Kälteschutzmittel lyophilisiertes Plasmid resultierte in einem Rückgang des Prozentanteils supergeknäuelter Fraktion und vergrößerte die abatische Schädigung bei gleichzeitigem Aktivitätsrückgang.
Die Zugabe von Zucker (10 % Lactose) zu unseren Komplexen stabilisiert den Komplex hinsichtlich der physikalischen Form, vermindert jedoch die In-vivo-Aktivität 6-fach im Vergleich zu einer Formulierung, die mit 150 mM NaCl isotonisch gemacht wurde und den gleichen pH-Wert aufwies. Ohne sich an eine bestimmte Theorie bezüglich der Arbeitsweise der Erfindung binden zu wollen, kann diese Abnahme der In-vivo-Aktivität im Wettstreit zwischen dem Zucker und dem Plasmid, Wasserstoffbrückenbindungen mit dem PVP zu bilden, begründet liegen.
Eine der Schwierigkeiten beim Verwenden von PVP in einem Komplex besteht darin, dass der pH-Wert der optimalen Formulierung ungefähr 4,0 beträgt und es ist wohl bekannt, dass sich Plasmid bei diesem pH-Wert abbauen wird. Ein weiteres mit dem Halten des Plasmids auf einem niedrigen pH-Wert zusammenhängendes Problem ist die Neigung zum Bilden von abatischen Stellen. Dieses so genannte „Nicking" des Plasmids könnte eine effektive Transkription des Plasmids inhibieren, wenn „Nicks" in der kodierenden Region auftreten. Der Fokus der hier dargestellten Versuche liegt auf dem Einampullen-PVP-Komplex (ZN); eine Einampullenflüssigkeit und eine Einampullenflüssigkeit und dann ein gefrorener Komplex wären jedoch gleichfalls durchführbar. Die Plasmid/PVA-Komplexe weisen dieselben Maßgaben wie die Plasmid/PVP-Komplexe auf, mit der Ausnahme, dass der pH-Wert des PVA von Natur aus höher ist, ~ 5,75-6,0, so dass der Plasmidabbau nicht so ein großes Problem wie mit PVP darstellt. Eine achtwöchige Studie der Stabilität eines Einampullen-Plasmid/PVA-Komplexes wurde vorgenommen, um den am besten geeigneten PVA-Lieferanten und die optimalen Lagerbedingungen für die Komplexe (d. h. flüssig, gefroren oder lyophilisiert) zu ermitteln.
Der Vierampullenkomplex von Plasmid und PVP (1:17 w/w) [3 mg/ml Plasmid] in 150 mM NaCl wurde für den Großteil der vorklinischen Versuche verwendet, da er leicht iⁿ verhältnismäßig kurzer Zeit formuliert werden kann. Diese Formulierung hat sich im Vergleich zu „nacktem" Plasmid in vivo als besser gezeigt, sie ist jedoch im Zeitablauf bei 4 °C nicht stabil. Die Instabilität dieser Formulierung liegt im von Natur aus niedrigem pH-Wert der Formulierung, der eine Depurinierung des Plasmids bewirkt. Die Depurinierung des Plasmids kann einen Rückgang der biologischen Aktivität zum Transformieren von Plasmid verursachen. T. Lindahl und B. Nyberg, „Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid.", Biochemistry, Bd. 11, Nr. 19, 1972. Ein weiteres Problem mit der Stabilität der Vierampullenformulierung betrifft die Tatsache, dass die Stammlösung von 25%-igem Plasmid zur Sterilisierung autoklaviert werden muss. Dieses, Verfahren kann das PVP über einen oxidativen Vorgang schädigen und zudem zur Bildung von Peroxiden führen, die letztendlich das Plasmid schädigen können. Zum Beispiel ist der UV₃₂₀-Messwert von frisch hergestelltem 5%-igem PVP ungefähr ≤ 0,1500, verglichen mit > 0,4000 für autoklaviertes 25%-iges PVP.
Zur Entwicklung einer Einampullenformulierung von Plasmid und PVP (1:17 w/w) wurden die wichtigsten Faktoren, die zum Plasmidabbau und zum Rückgang der In-vivo-Wirksamkeit führen, bestimmt. Es wurde festgestellt, dass der pH-Wert der Formulierung ein wichtiger Faktor bei den Expressionsniveaus des Tieres war. Die Formulierung exprimierte am stärksten, wenn sie ihren inhärenten pH-Wert von 3 – ⁴ aufwies, und obwohl das Plasmid bei einem höheren pH-Wert stabiler ist, nehmen die In-vivo-Expressionsniveaus erheblich ab, selbst wenn der pH-Wert auf 5,5 angehoben wird.
Da es erforderlich war, dass die Formulierung einen niedrigen pH-Wert aufweist (d. h. pH 3,0-4,0), war die nächste Frage, wie die Stabilität der physikalischen Charakteristika der Formulierungen im Zeitablauf aufrechtzuerhalten ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde mit mehreren in Frage kommenden Formulierungen eine Stabilitätsstudie durchgeführt. Die Dreiampullenformulierung wurde gewählt, da das Plasmid und das PVP in separaten Behältnissen sein würden und das Plasmid daher nicht vom niedrigen pH-Wert des PVP beeinträchtigt werden würde. Die Einampullenformulierung wurde gewählt, da das Lyophilisationsverfahren das Fortschreiten des Abbaus verlangsamen könnte und das PVP als ein ausreichendes Kälteschutzmittel fungieren könnte. Die Einampullenformulierung (ZN) wurde aus im Wesentlichen denselben Gründen wie die Einampullenformulierung gewählt; sie wies jedoch den zusätzlichen Vorteil der Lagerung mit pH 7 auf. Das zuvor neutralisierte PVP würde verhindern, dass sich das Plasmid während der Lagerung abbaut und die Formulierung würde bei Aufhydrierung mit Natriumcitratpuffer (pH 4) in vivo aktiv sein. Die Vierampullenformulierung wurde bei der Stabilität als eine Kontrolle eingesetzt, da der Großteil der vorklinischen Versuche mit dieser Formulierung vorgenommen wurde und sie als eine Richtlinie für die anderen Formulierungen dienen könnte.
Eine der Anforderungen zum Herstellen der Vierampullenformulierung und der Dreiampullenformulierung besteht darin, dass die Plasmidkonzentration ≥ 4 mg/mL betragen muss, so dass die Plasmidendkonzentration 3 mg/mL sein kann (siehe 2). Mit einer Konzentration von < 4 mg/mL erhaltenes Plasmid muss lyophilisiert und auf die gewünschte Konzentration aufhydriert werden. Dieser Vorgang schädigt das Plasmid stark und führt zudem zu einem Rückgang der In- vivo-Expression. Die Einampullenkomplexe weisen den zusätzlichen Vorteil auf, dass sie eine beliebige Plasmidausgangskonzentration anwenden können, wobei das Endprodukt dennoch 3 mg/mL aufweist.
Die Plasmidform oder spezifischer der Prozentanteil supergeknäuelten Plasmids war ein hervorragender Indikator der Stabilität und korrelierte sehr gut mit den In-vivo-Daten. Die Einampullenformulierung (ZN) und die Dreiampullenformulierung waren die einzigen Formulierungen, die zum Zeitpunkt von sechs Monaten in vivo exprimierten. Zu diesem Zeitpunkt von sechs Monaten war klar, dass die zwei besten Formulierungen hinsichtlich der Stabilität supergeknäuelter DNA die Einampullenformulierung (ZN) und die Dreiampullenformulierung waren. Die Daten zeigen deutlich, dass PVP insofern ein ausreichendes Kälteschutzmittel für Plasmide ist, dass es vor einem Rückgang supergeknäuelten Plasmids und abatischer Schädigung schützt und gleichzeitig die In-vivo-Wirksamkeit des Plasmids bewahrt.
Die Stabilitätsresultate für die Einampullen-Plasmid/PVA-Komplexe unterschieden sich ziemlich von den Plasmid/PVA-Resultaten. Von lyophilisierten Plasmid/PVA-Komplexen wurde festgestellt, dass diese schwer aufzuhydrieren waren, was zu Schwankungen bei den Viskositäten von Ampulle zu Ampulle führte. Der pH-Wert des Komplexes war hoch genug, so dass das Plasmid nicht abgebaut wurde, und die Komplexe waren mindestens acht Wochen lang stabil, In-vivo-Studien wurden jedoch nicht mit dem Stabilitätsmaterial vorgenommen, um zu bestätigen, dass die Aktivität des Komplexes während der gesamten Stabilitätsstudie gleich blieb.
Materialien:
Polyvinylpyrrolidon (PVP) in Injektionsqualität (Plasdone C-30, MG von 50 kDa) stammte von ISP Technologies (Wayne, NY, USA). PVA war von Aldrich (St. Louis, MO, USA), Mowiol^® PVA von Gehring-Montgomery, Inc. (Warminster, PA, USA), PVA von Spectrum (Gardena, CA, USA), Plasmide, die einen CMV-Promotor und entweder Chloramphenicolacetyltransferase (CMV-CAT) oder insulinartigen Wachstumsfaktor I (insulinlike growth factor, IGF-I) enthielten, wurden bei Genemedicine, Inc. hergestellt und gereinigt. Spectra/Por CE-Membrane (CE = Celluloseester) mit einem MG-Grenzwert von 25 kDa stammten von Spectrum (Houston, TX, USA). Natriumhydroxid, NF, gekörnte wasserfreie Citronensäure, USP, und Lactose-monohydrat waren von Penta Manufacturing (Livingston, NJ, USA). Steriles Wasser zum Spülen, USP (Wasser für Injektionszwecke, WFI), und 0,9%-ige Natriumchlorid-Spülung, USP, stammten von Baxter Healthcare Corporation (Deerfield, IL, USA). Lyophilisationsampullen (10 mL) waren von The West Company (Lionville, PA, USA). 1%-iges Seakem^® Gold-Agarosegel, 1X in TAE-Puffer, für DNA von > 1 kb stammte von FMC (Rockland, ME, USA). Die verwendete DMED-Lösung (DMED = N,N'-Dimethylethylendiamin, 99%-ig) stammte von Aldrich (Milwaukee, WI, USA).
Ausrüstung
Die folgende Ausrüstung wurde zum Herstellen und Analysieren der Formulierungen und/oder Bestandteile verwendet. Osmometer ONE-TEN von FISKE (Norwood, MA, USA), Spektrophotometer Modell DU640 von Beckman, pH-Messgerät Modell 370 von Orion, Gefriertrockenapparat von FTS Systems^TM (Stone Ridge, NY, USA), F1uorImager Modell 575 von Molecular Dynamics, programmierbares Rheometer DV-III von Brookfield und das Vortex Genie 2 von VWR Scientific.
VERFAHREN:
Herstellung von Plasmid/PVP-Komplexen - Vierampullenkomplex: Dieser Komplex wurde hergestellt, indem entsprechende Volumina von WFI, Plasmid (lyophilisiert und auf eine Konzentration von ~ 4 mg/mL aufhydriert) und 25%-iges PVP zusammengegeben und von Hand gemischt wurden. Nach einer Wartezeit von mindestens 5 Minuten wurde dem Komplex zur Isotonie 5 M NaCl zugegeben und es wurde erneut von Hand gemischt. Der endgültige Komplex war ein Vierampullenkomplex von Plasmid und PVP (1:17 w/w) [3 mg/mL Plasmid] in 150 mM NaCl und jede Ampulle enthielt 1 mL des Komplexes (2).
Herstellung von Plasmid/PVP-Komplexen - Dreiampullenkomplex:
Diese Formulierung wurde hergestellt, indem eine Stammlösung von 5%-igem PVP hergestellt und das entsprechende Volumen in 10-mL-Ampullen von West in Aliquots aufgeteilt wurde. Diese Ampullen wurden unter Anwendung eines automatischen Zyklus lyophilisiert, bei dem für die Sensorsonde eine 5%-ige PVP-Lösung mit gleichem Volumen eingesetzt wurde. Zum Herstellen des endgültigen Komplexes wurde das entsprechende Plasmidvolumen in eine Ampulle gegeben, die das lyophilisierte PVP enthielt. Dieser Komplex wurde auf einem Schüttelmischer mit Teller (Vortex Genie 2) bei einer Geschwindigkeit von Eins (1) gemischt, bis er komplett aufhydriert war. Sobald der Komplex komplett aufhydriert war, wurde dem Komplex ein entsprechendes Volumen von 1 M NaCl zugegeben, so dass der endgültige Komplex ein Drei ampullenkomplex von Plasmid und PVP (1:17 w/w) [3 mg/mL Plasmid] in 150 mM NaCl war, und jede Ampulle enthielt 1,2 mL des Komplexes (2).
Herstellung von Plasmid/PVP-Komplexen – Einampullenkomplex:
Diese Formulierung wurde mittels Colyophilisieren von Plasmid und PVP hergestellt. Eine Stammlösung von Plasmid (ungef. 5 mg/mL) und eine Lösung von PVP (50 mg/mL) wurden zusammengegeben und alle fünf Minuten wurde ungefähr 30 Minuten lang von Hand gemischt. Diese Lösung wurde in Ampullen in Aliquots aufgeteilt, so dass jede Ampulle 3,6 mg Plasmid und 60 mg PVP enthielt. Diese Ampullen wurden unter Anwendung eines automatischen Zyklus lyophilisiert und für die Sensorkontrolle wurde eine Plasmid/PVP-Formulierung mit gleichem Volumen eingesetzt. Zum Herstellen der endgültigen Formulierung wurden dem lyophilisierten Kuchen unter Verwendung einer 3-cm³-Spritze und einer Nadel mit einem Kaliber von 21 1,1 mL 0,9%-iges NaCl zugegeben und diese Mischung wurde dann auf einem Schüttelmischer mit Teller bei einer Geschwindigkeit von Eins (1) gemischt, bis sie komplett aufhydriert war. Der endgültige Komplex war ein Einampullenkomplex von Plasmid und PVP (1:17 w/w) [3 mg/mL Plasmid] in 150 mM NaCl. Anstelle von 1,2 mL des NaCl wurde zum Aufhydrieren des Komplexes ein Volumen von 1,1 mL zugegeben, um den Volumenausschluss auszugleichen (2).
Herstellung von Plasmid/PVP-Komplexen – Zuvor neutralisierter (ZN) Einampullenkomplex:
Dieser Komplex wurde mittels Colyophilisieren von Plasmid und PVP (auf pH 7 neutralisiert) hergestellt. Eine Stammlösung von Plasmid (ungef. 5 mg/mL) und eine Lösung von PVP (50 mg/mL), pH 7, wurden zusammengegeben und alle fünf Minuten wurde ungefähr 30 Minuten lang von Hand gemischt.
Diese Lösung wurde in Ampullen in Aliquots aufgeteilt, so dass jede Ampulle 3,6 mg Plasmid und 60 mg PVP (pH 7) enthielt. Diese Ampullen wurden unter Anwendung eines automatischen Zyklus lyophilisiert und für die Sensorkontrolle wurde ein Plasmid/PVP-Komplex mit gleichem Volumen eingesetzt. Zum Herstellen des endgültigen Komplexes wurden dem lyophilisierten Kuchen unter Verwendung einer 3-cm³-Spritze und einer Nadel mit einem Kaliber von 21 1,1 mL 25 mM Natriumcitratpuffer (pH 4) in 150 mM NaCl zugegeben und diese Mischung wurde dann auf einem Schüttelmischer mit Teller bei einer Geschwindigkeit von Eins (1) gemischt, bis sie komplett aufhydriert war. Der endgültige Komplex war ein Komplex von Plasmid und PVP (1:17 w/w) [3 mg/mL Plasmid] in 25 mM Natriumcitratpuffer (pH 4) in 150 mM NaCl.
Anstelle von 1,2 mL des NaCl wurde zum Aufhydrieren des Komplexes ein Volumen von 1,1 mL zugegeben, um den Volumenausschluss auszugleichen (2).
Plasmid/PVP-Stabilitätsstudie
Die Komplexe wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, zusammen mit entsprechenden Kontrolllösungen. Diese Ampullen wurden bei 4 °C, 25 °C und 37 °C gelagert und an den Tagen 0, 3, 7, 14, 28 und in den Monaten 4, 6, 8, 10 und 12 wurden einige Prüfungen vorgenommen. Die Komplexe wurden am Prüfdatum aufhydriert und auf pH-Wert, Osmolalität, Prozentanteil supergeknäuelten Plasmids mittels Gelelektrophorese, Zusammensetzung, In-vitro-Wirksamkeit und In-vivo-Wirksamkeit geprüft.
Herstellung von Plasmid/PVA-Komplexen - Einampullenflüssigkeit und gefrorener Komplex (Aldrich und Mowiol^®):
Dieser Komplex wurde hergestellt, indem eine Stammlösung von 15%-igem PVA hergestellt und das entsprechende Volumen in 5-mL-Ampullen von West in Aliquots aufgeteilt wurde, so dass die PVA-Endkonzentration 3 mg betrug. Jeder der Ampullen, die PVA enthielten, wurde eine entsprechende Plasmidmenge zugegeben, so dass die Plasmidkonzentration 3 mg betrug. Die Plasmid/PVA-Komplexe wurden von Hand gemischt, bis der Komplex optisch homogen war. Den Komplexen wurde eine entsprechende Menge von 5 M NaCl zugegeben, so dass die NaCl-Endkonzentration 150 mM NaCl war, und dann wurden die Komplexe von Hand gemischt. Der endgültige Komplex war ein Komplex von Plasmid und PVA (1:10 w/w) (3 mg/mL Plasmid) in 150 mM NaCl. Die „flüssigen" Komplexe wurden sofort bei 4 °C gelagert. Die „gefrorenen" Komplexe wurden sofort in einem Ethanol/Trockeneis-Bad schockgefroren und dann bei –20 °C gelagert.
Herstellung von Plasmid/PVA-Komplexen - Einampullenflüssigkeit und gefrorener Komplex (Spectrum):
Dieser Komplex wurde hergestellt, indem eine Stammlösung von 7,5%-igem PVA hergestellt und das entsprechende Volumen in 5-mL-Ampullen von West in Aliquots aufgeteilt wurde, so dass die PVA-Endkonzentration 1,5 mg betrug. Jeder der Ampullen, die PVA enthielten, wurde eine entsprechende Plasmidmenge zugegeben, so dass die Plasmidkonzentration 3 mg betrug. Die Plasmid/PVA-Komplexe wurden von Hand gemischt, bis der Komplex optisch homogen war. Nach dem Mischen wurden den Komplexen 30 μL 5 M NaCl zugegeben, so dass die NaCl-Endkonzentration 150 mM NaCl war, und dann wurden die Komplexe von Hand gemischt. Der endgültige Komplex war ein Komplex von Plasmid und PVA (1:5 w/w) (3 mg/mL Plasmid) in 150 mM NaCl. Die „flüssigen" Komplexe wurden sofort bei 4 °C gelagert. Die „gefrorenen" Komplexe wurden sofort in einem Ethanol/Trockeneis-Bad schockgefroren und dann bei –20 °C gelagert.
Herstellung von Plasmid/PVA-Komplexen – Lyophilisierter Einampullenkomplex (Aldrich und Mowiol^®):
Dieser Komplex wurde mittels Colyophilisieren von Plasmid und PVA hergestellt. Eine Stammlösung von Plasmid (ungef. 3 mg/mL) und eine Lösung von PVA (150 mg/mL) wurden zusammengegeben und alle fünf Minuten wurde ungefähr 30 Minuten lang von Hand gemischt. Diese Lösung wurde in Ampullen in Aliquots aufgeteilt, so dass jede Ampulle 3 mg Plasmid und 30 mg PVA enthielt. Diese Ampullen wurden unter Anwendung eines automatischen Zyklus lyophilisiert und für die Sensorkontrolle wurde ein Plasmid/PVA-Komplex mit gleichem Volumen eingesetzt. Die lyophilisierten Komplexe wurden sofort bis zum Prüfen bei 4 °C gelagert. Zum Aufhydrieren des Komplexes wurde dem lyophilisierten Kuchen unter Verwendung einer 3-cm³-Spritze und einer Nadel mit einem Kaliber von 21 1 mL 0,9%-iges NaCl zugegeben und diese Mischung wurde dann auf einem Schüttelmischer mit Teller bei einer Geschwindigkeit von Eins (1) gemischt, bis sie komplett aufhydriert war. Der endgültige Komplex war ein Komplex von Plasmid und PVA (1:10 w/w) (3 mg/mL Plasmid) in 150 mM NaCl.
Herstellung von Plasmid/PVA-Komplexen – Lyophilisierter Einampullenkomplex (Spectrum):
Dieser Komplex wurde mittels Colyophilisieren von Plasmid und PVA hergestellt. Eine Stammlösung von Plasmid (ungef. 3 mg/mL) und eine Lösung von PVA (75 mg/mL) wurden zusammengegeben und alle fünf Minuten wurde ungefähr 30 Minuten lang von Hand gemischt. Diese Lösung wurde in Ampullen in Aliquots aufgeteilt, so dass jede Ampulle 3 mg Plasmid und 15 mg PVA enthielt. Diese Ampullen wurden unter Anwendung eines automatischen Zyklus lyophilisiert und für die Sensorkontrolle wurde ein Plasmid/PVA-Komplex mit gleichem Volumen eingesetzt. Die lyophilisierten Komplexe wurden sofort bis zum Prüfen bei 4 °C gelagert. Zum Aufhydrieren des Komplexes wurde dem lyophilisierten Kuchen unter Verwendung einer 3-cm³-Spritze und einer Nadel mit einem Kaliber von 21 1 mL 0,9%-iges NaCl zugegeben und diese Mischung wurde dann auf einem Schüttelmischer mit Teller bei einer Geschwindigkeit von Eins (1) gemischt, bis sie komplett aufhydriert war. Der endgültige Komplex war ein Komplex von Plasmid und PVA (1:5 w/w) (3 mg/mL Plasmid) in 150 mM NaCl.
Plasmid/PVA-Stabilitätsstudie:
Die Komplexe wurden wie oben beschrieben hergestellt, zusammen mit entsprechenden Kontrolllösungen. Die gefrorenen Komplexe wurden bis zum Prüfen bei –20 °C gelagert und die flüssigen und lyophilisierten Komplexe wurden bis zum Prüfen bei 4 °C gelagert. Die Plasmid/PVA-Komplexe wurden an Tag 0 und in Woche 1, 2, 4, 6 und 8 geprüft. Die Komplexe wurden auf pH-Wert, Osmolalität, Prozentanteil supergeknäuelten Plasmids mittels Gelelektrophorese, Zusammensetzung und Viskosität geprüft. Die lyophilisierten Komplexe wurden am Tag der Prüfung aufhydriert.
Herstellung von PVP-Stammlösungen:
Stammlösungen von Polymeren wurden hergestellt, indem die Polymere auf einer Gewichts-/Volumenbasis (% w/v) in WFI gelöst wurden. Das 5%-ige PVP (ZN) wurde hergestellt, indem dem Stamm ein entsprechendes Volumen von 5 M NaOH zugegeben wurde, bevor die Lösung qs war, so dass der End-pH-Wert 7 war. Die 25%-ige PVP-Stammlösung wurde mittels Autoklavieren zu 120 Minuten für 20 Minuten sterilisiert. Das 5%-ige PVP und das 5%-ige PVP (ZN) wurden mittels Filtern durch eine 0,2-μm-Filtereinheit von Nalgene sterilisiert.
Herstellung von PVA-Stammlösungen:
PVA-Stammlösungen wurden hergestellt, indem das Polymer auf einer Gewichts-/Volumenbasis (% w/v) in WFI gelöst wurde. Die Lösungen wurden unter Mischen auf einer Rührplatte erhitzt, bis das Polymer gelöst war; dann wurden die Lösungen auf Raumtemperatur abgekühlt und dann qs zum Füllpegel aufgefüllt. Alle PVA-Stammlösungen wurden mittels Filtern durch eine 0,2-μm-Filtereinheit von Nalgene sterilisiert.
Herstellung von 25 mM Natriumcitratpuffer (pH 4) in 150 mM NaCl:
Diese Lösung wurde hergestellt, indem 100 mL wasserfreie Citronensäure auf einer Gewichts-/Volumenbasis (% w/v) in 0,9%-igem NaCl gelöst wurden, so dass die Endkonzentration 50 mM Citronensäure in 250 mM NaCl war. Es wurde eine weitere Lösung von NaOH hergestellt, indem 100 mL NaOH auf einer Gewichts-/Volumenbasis (% w/v) in 0,9%-igem NaCl gelöst wurden, so dass die Endkonzentration 50 mM NaOH in 150 mM NaCl war. Diese Lösungen wurden zusammengegeben, so dass die endgültige Lösung 25 mM Natriumcitratpuffer in 150 mM NaCl war. Als Nächstes wurde dem Puffer eine kleine Menge von 5 M NaOH zugegeben, so dass der End-pH-Wert 7 war. Diese Lösung wurde mittels Filtern durch eine 0,2-μm-Filtereinheit von Nalgene sterilisiert.
Herstellung von 25%-iger Lactoselösung:
Die Lactosestammlösungen wurden hergestellt, indem die Lactose auf einer Gewichts-/Volumenbasis (% w/v) in WFI gelöst wurde. Die 25%-ige Lactose wurde mittels Filtern durch eine 0,2-μm-Filtereinheit von Nalgene sterilisiert.
In-vivo-Studien in Muskel:
Die Formulierungen wurden fünf bis sechs Wochen alten männlichen Ratten (Stamm Fischer 344, 120-130 Gramm) von Harlan Sprague Dawley Laboratories verabreicht. Es wurde an anästhetisierten Ratten ein aseptischer Einschnitt in die Haut von 2-4 mm vorgenommen und 50 μL der Formulierung wurden unter Verwendung einer Nadel mit Kaliber 28 in den Tibialis beider Beine injiziert. Die Ratten wurden 7 Tage nach der Verabreichung geopfert, die Tibialis wurden entnommen und es wurden Muskelextrakte präpariert. Die CAT-Expressionsniveaus wurden gemäß dem kolometrischen CAT-ELISA-Enzymassay von Boehringer-Mannheim (Mannheim, Deutschland) bestimmt. Die CAT-Expression wurde auf Gesamtmuskelprotein in der Probe standardisiert, das mit einem auf Coomassie Blue G250 basierten Assay (Bio-Rad; Hercules, CA, USA) gemessen wurde. Die NIH-Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren wurden beachtet. Die CAT in Skelettmuskelextrakten wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen ELISR-Kits von Boehringer-Mannheim quantifiziert.
In-vivo-Studien in festem Tumor:
Die Komplexe wurden 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen (C3H-Stamm, 20-25 g) von Charles River Laboratories verabreicht, die zwei SCCVII-Tumore (durchschnittlich ~ 35 mm³) subkutan am linken und am rechten Bereich über der Leiste der Flanke trugen. Zum Erstellen des Modells wurde die Implantationsstelle rasiert und SCCVII-Zellen (4E5/30 μL) wurden unter Verwendung einer Nadel mit Kaliber 28 subkutan in jeden Bereich (rechte und linke Flanke) eingepflanzt. Die Tumore wurden bis fünf Tage nach der Implantation wachsen gelassen, um die oben erwähnte Größe zu erreichen. An Tag 5 nach der Implantation wurden die Tiere intraperitoneal mit 2,5 mg/kg Acepromazin sediert. Nach dem Sedieren wurden die Tumore mit 70%-igem Isopropylalkohol abgetupft und unter Verwendung einer Nadel mit Kaliber 28 mit 50 μL des Komplexes injiziert. Die Mäuse wurden zu 24 Stunden nach der Injektion human eingeschläfert; die Tumore wurden entnommen und in Röhrchen mit „Beads" (Kügelchen) gelagert und in flüssigen Stickstoff gegeben. Die NIH-Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren wurden angewendet. Die Tumore wurden mittels „Bead-Beating" homogenisiert und der Überstand wurde auf CAT-Expression untersucht.
In-vitro-Studien:
Die Transfektionseffizienz der Komplexe von Plasmid und PVP (1:17 w/w) [3 mg/mL Plasmid] in 150 mM NaCl wurde in der Zelllinie von Mausmyoblasten, C₂C₁₂, studiert. Diese Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gewachsen, das mit 10 % fetalem Kalbserum supplementiert war. Die Transfektionen wurden in Platten mit sechs Näpfchen bei einer Zelldichte von 60-80 % mit 5 μg Plasmid und 30 μg Lipofectamine^TM pro Näpfchen durchgeführt. Das Kulturmedium wurde entfernt und durch DMEM, das 2 Pferdeserum enthielt, zur Einleitung der Myotubedifferenzierungsvorgangs 16 Stunden nach der anfänglichen Transfektion ersetzt. Die Überstände der Zellen wurden 96 Stunden später zur IGF-I-Analyse entnommen.
Gelelektrophorese:
Die Plasmidkonzentration wurde mit A₂₆₀ ermittelt und die Proben wurden in 20 mM Tris-HCl auf 100 μg/mL verdünnt. 3 μL dieser Proben wurden in 0,5-mL-Röhrchen mit 7 μL 1X Ladefarbstoff in Aliquots aufgeteilt. Die Proben mit Farbstoff wurden auf ein 1%-iges FMC Reliant^®-Gel geladen. Die Gele wurden ungefähr 1 Stunde bei 100 Volt laufen gelassen. Die Gele wurden ungefähr 20 Minuten mit SYBR^® Green II gefärbt und ungefähr 30 Minuten in destilliertem Wasser entfärbt. Die Gele wurden auf dem F1uorImager gescannt und mit ImageQuant^TM-Software analysiert.
Abatische Schädigung mittels Gelelektrophorese:
100 mM DMED-Lösung wurden hergestellt, indem 2,5 mL WFI, 26,6 μL DMED-Lösung und 20 μL konzentrierte Essigsäure zusammengegeben wurden. Der End-pH-Wert lag zwischen 7,3 und 7,4. Die Versuchsproben wurden in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, auf 100 μg/mL verdünnt. Aus der vorherigen Verdünnung wurden Proben hergestellt, indem 1 μL der Probe zu 19 μL 20 mM Tris gegeben wurden; dies ist die Kontrollprobe. Die Versuchsprobe wurde hergestellt, indem 1 μL der Probe zu 19 μL der DMED-Lösung gegeben wurden. Diese Reaktionsmischun gen wurden 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde den Proben 2 μL 10X Ladefarbstoff zugesetzt. 5 μL der Proben wurden auf ein 0,4%-iges Gel geladen. Das Gel wurde in SYBR^® Green II gefärbt und dann auf dem FluorImager gescannt, wobei die Plasmidbanden quantifiziert wurden. Die folgende Gleichung wurde zum Bestimmen der abatischen Stellen pro Plasmidmolekül verwendet:
Abatische Stellen pro Plasmid:
Ln % SG Plasmid/% SG Plasmid [mit DMED behandelt]
Viskosität:
Die Viskosität der Plasmid/PVR-Komplexe wurde mit einem Viskosimeter Modell DV-III von Brookfield gemessen. Vor jeder Probenmessreihe wurde ein Viskositätsstandard gemessen. Die Viskosität jedes Komplexes wurde aufgrund der für diesen Test erforderlichen Probengröße nur einmal gemessen. Die Viskositätsergebnisse werden in Centipoise (cP) aufgezeichnet.
BEISPIEL 1 - PLASMID/PVP-BEISPIELE:
pH-Wert:
Bei den bei 4 °C gelagerten Formulierungen behielt die Vierampullenformulierung ihren pH-Wert von ungefähr 4 bei, der als optimal für die In-vivo-Wirksamkeit ermittelt wurde. Die Dreiampullenformulierung wies nach Aufhydrierung einen durchschnittlichen pH-Wert von ungefähr 4,3 auf, wobei einzelne pH-Werte um bis zu 0,3 pH-Werteinheiten schwanken. Die Einampullenformulierung zeigte nach Aufhydrierung einen durchschnittlichen pH-Wert von 4,1 mit einer Abweichung von 0,3 pH-Werteinheiten. Die Einampullenformulierung (ZN), die mit Natriumcitratpuffer (pH 4,0) aufhydriert wurde, zeigte keine Änderung zum pH-Wert des Puffers. Die Lagertemperaturen schienen keine Auswirkung auf die pH-Werte zu haben.
Osmolalität:
Von den bei 4 °C gelagerten Formulierungen waren sowohl die Vierampullenformulierung als auch die Dreiampullenformulierung hypertonischer als die Einampullenformulierung, die nur moderate Hypertonie zeigte. Die Dreiampullenformulierung ist hypertonischer, da dem Komplex 200 μL 1 M NaCl zugesetzt wurden, mit einem Endvolumen von 1,1 mL. Dies ergibt die NaCl-Endkonzentration von 181,8 mM, wohingegen die Vierampullenformulierung, die Einampullenformulierung und die Einampullenformulierung (ZN) mit einer Endkonzentration von 150 mM NaCl hergestellt wurden. Die Einampullenformulierung (ZN) war leicht hypertonisch, mit einem durchschnittlichen Wert von 270 mOsm. Die Lagerbedingungen hatten keine offensichtliche Auswirkung auf die Osmolalität der Formulierungen.
Supergeknäueltes Plasmid mittels Gelelektrophorese:
Vierampullenformulierung:
Der Einfluss der Lagertemperatur hatte eine erhebliche Auswirkung auf die Menge supergeknäuelten Plasmids in der Vierampullenformulierung. Nach nur drei Tagen lag kein verbleibendes supergeknäueltes Plasmid in der bei 37 °C gelagerten Formulierung vor. Formulierungen, die bei 25 °C gelagert wurden, hatten zu Tag 3 50 % der supergeknäuelten Form eingebüßt und nach vier Monaten war kein verbleibendes supergeknäueltes Plasmid augenscheinlich. Die bei 4 °C gelagerten Formulierungen bewahrten ihr supergeknäueltes Plasmid bis zu zwei Wochen, mit einem beträchtlichen Abfall nach einem Monat. Nach sechs Monaten verblieb weniger als 10 % supergeknäueltes Plasmid in der Vierampullenformulierung. Dieser Mangel an Stabilität liegt am wahrscheinlichsten in der Tatsache begründet, dass das Plasmid in Abwesenheit eines Kälteschutzmittels lyophilisiert wurde.
Dreiampullenformulierung:
Die Dreiampullenformulierung bewahrte ihr supergeknäueltes Plasmid bei allen drei Lagerbedingungen bis zu 1 Monat. Nach 1 Monat wies das bei 37 °C gelagerte Material kein verbleibendes SG-Plasmid auf und das Material bei 25 °C begann bis Monat 12, sein SG-Plasmid einzubüßen, wobei zu diesem Monat das SG-Plasmid nicht mehr augenscheinlich war. Das Material bei 4 °C bewahrte sein SG-Plasmid während des gesamten Verlaufs der Prüfung.
Einampullenformulierung:
Die bei 37 °C gelagerten Formulierungen büßten bis Tag 13 ihr gesamtes supergeknäueltes Plasmid ein und die bei 25 °C gelagerten Formulierungen zeigten nach vier Monaten kein verbleibendes SG-Plasmid. Das SG-Plasmid der Einampullenformulierung wurde lediglich beim bei 4 °C gelagerten Material bewahrt, das über 12 Monate einen leichten (20 %) Rückgang zeigte.
Einampullenformulierung (ZN):
Bei der Einampullenformulierung (ZN) schienen die Daten zu der Einampullenformulierung sehr ähnlich zu sein, wobei das bei 37 °C gelagerte Material bis zu einem Monat etwas SG-Plasmid aufwies. Wiederum bewahrte das bei 4 °C gelagerte Material den Großteil seines SG-Plasmids über die gesamten 12 Monate.
Ein Vergleich des supergeknäuelten Plasmids der Vierampullenformulierung, der Dreiampullenformulierung, der Einampullenformulierung und der Einampullenformulierung (ZN) im Zeitablauf bei 4 °C zeigt, dass die Dreiampullenformulierung und die Einampullenformulierung (PN), die den Großteil ihrer supergeknäuelten Form bewahrten, stabiler sind als die Einampullenformulierung und die Vierampullenformulierung. Die Vierampullenformulierung weist nach sechs Monaten weniger als 10 % supergeknäuelte Form auf.
Ein Vergleich der Einampullenformulierung (ZN) mit lyophilisiertem Plasmid bei 4 °C demonstriert, dass die Einampullenformulierung (ZN) das Plasmid vor Abbau hinsichtlich der supergeknäuelten Form schützt. Die Einampullenformulierung (ZN) weist im Zeitablauf etwas Rückgang der supergeknäuelten Form auf, 41 % über 12 Monate, wohingegen das lyophilisierte Plasmid im Zeitablauf einen viel größeren Rückgang der supergeknäuelten Form aufweist, 75 % Rückgang nach vier Monaten und 100 % Rückgang nach 12 Monaten Lagerung. Das Plasmid wurde auch bei 25 °C gelagert, um die gesteigerte Stabilität der Plasmide zu demonstrieren. Die Daten sind im Wesentlichen mit den Daten für 4 °C identisch; beide in Wasser gelagerten Plasmide sind stabiler als das lyophilisierte Plasmid.
Ein Vergleich des Prozentanteils supergeknäuelten Plasmids von in Wasser gelagertem Plasmid mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen und von im Zeitablauf bei 4 °C gelagertem lyophilisiertem Plasmid zeigt, dass beide flüssigen Plasmide im Zeitablauf sehr stabil sind und den Großteil ihrer supergeknäuelten Form bewahren; das lyophilisierte Plasmid begann jedoch nach einer Woche, seine supergeknäuelte Form einzubüßen, und hatte nach einem Monat 90-100 % seiner supergeknäuelten Form eingebüßt.
Es wurde auch ein Vergleich supergeknäuelten Plasmids von dem Plasmid in Wasser, dem lyophilisierten Plasmid und der Einampullenformulierung (ZN) angestellt. Diese Daten zeigen, dass das in einer wässrigen Lösung gelagerte Plasmid viel stabiler ist als das lyophilisierte Plasmid und dass die Einampullenformulierung (ZN) das Plasmid während des Lyophilisationsverfahrens vor demselben Abbau schützt, der vom nur lyophilisierten Plasmid erleidet.
Abatische Stellen pro Plasmidmolekül mittels Gelelektrophorese:
Es wurde ein Assay für nur einen Monat der Stabilitätsstudie vorgenommen und dieses zeigte die abatische Schädigung für das wässrige Plasmid, das lyophilisierte Plasmid und die vier unterschiedlichen Formulierungen von Plasmid und PVP (1:17 w/w). Es liegt kein reeller numerischer Wert vor, der als ein Grenzwert für abatische Schädigung angegeben werden kann, daher müssen die angegebenen Werte miteinander verglichen werden.
In-vitro-Wirksamkeit
Die Expression von IGF-I nach In-vitro-Transfektion von C₂C₁₂-Zellen mit den vier Formulierungen nach Lagerung bei 4 °C zeigte einen gewissen Grad an Schwankung im Assay, zwischen den vier Formulierungen schien jedoch kein Unterschied bei der Transfektionseffizienz vorzuliegen.
In-vivo-Wirksamkeit
Zwischen den vier Formulierungen war kein signifikanter Unterschied bei der Expression von CMV-CAT in Mausgastroknemius bis zu einem Monat nach intramuskulärer Verabreichung der bei 4 °C gelagerten Stabilitätsformulierungen augenscheinlich. Zum nächsten geprüften Zeitpunkt, 6 Monate, zeigten nur die Einampullenformulierung (ZN) und die Dreiampullenformulierung etwas Expression und diese war mit der zu Tag 0 beobachteten Expression vergleichbar.
Die mit den Formulierungen von pH 3,0-4,0 injizierten Tiere ergaben in vivo um das 4-fache höhere β-gal-Expressionsniveaus einer Formulierung von Plasmid und 5%-igem PVP als die mit den Formulierungen von pH 5,5-6,0 und 7,0-7,5 injizierten.
Beispiel 2 - Plasmid/PVA-Ergebnisse:
pH-Wert-Ergebnisse:
Die pH-Wert-Ergebnisse der verschiedenen Plasmid/PVP-Komplexe unterscheiden sich ziemlich voneinander. Die pH-Werte der flüssigen, der gefrorenen und der lyophilisierten Aldrich-Komplexe betragen ungefähr 5,0 und sind einander sehr ähnlich. Die Mowiol^®-Komplexe unterscheiden sich insofern, dass die flüssigen und die gefrorenen Komplexe ungefähr 5,5 betragen, wohingegen der pH-Wert der lyophilisierten Komplexe etwa 5,0 ist. Die pH-Werte der Spectrum-PVA-Komplexe unterscheiden sich ebenfalls insofern von den anderen, dass die pH-Werte der flüssigen und der gefrorenen Komplexe zwischen 5,5 und 6,0 liegen, die lyophilisierten Komplexe liegen jedoch zwischen 4,25 und 4,5. Dies ist der größte Unterschied zwischen Lagerbedingungen. Der Spectrum-PVA ist gegenüber anderen Herstellern vorteilhaft, da der pH-Wert der flüssigen und der gefrorenen Komplexe höher ist, und das Plasmid wird bei diesem pH-Wert stabiler sein.
Osmolalitätsergebnisse:
Die Osmolalität der Plasmid/PVA-Komplexe ist unbeachtlich. Die Osmolalität der Aldrich-Komplexe betrug ungefähr 320 mOsm, die Mowiol^®-Komplexe waren ebenfalls ungefähr 320 mOsm und die Spectrum-Komplexe waren im Durchschnitt ungefähr 310 mOsm.
Gelelektrophoreseergebnisse:
Die Gelelektrophoreseergebnisse der verschiedenen Plasmid/-PVA-Komplexe waren einander sehr ähnlich. Die flüssigen und die gefrorenen Aldrich, Mowiol^®- und Spectrum-Komplexe lagen alle bei 60-80 % supergeknäueltem Plasmid. Die lyophilisierten Komplexe lagen für jeden der Hersteller wesentlich geringer als die flüssigen und die gefrorenen Komplexe, zwischen 40 und 60 % supergeknäueltem Plasmid, was darauf hinweist, dass die lyophilisierten Komplexe weniger stabil sind als die flüssigen und die gefrorenen Komplexe.
Abatische Stellen pro Plasmidmolekül mittels Gelelektrophorese:
Es besteht keine offensichtliche Tendenz zur abatischen Schädigung durch die Plasmid/PVA-Komplexe vor.
Viskositätsergebnisse:
Die Viskositäten der flüssigen und der gefrorenen Aldrich- und Mowiol^®-Komplexe betrugen ungefähr 7-8 cP und waren einander ähnlich. Die Viskosität der lyophilisierten Aldrich- und Mowiol^®-Komplexe waren sehr inkonsistent und reichten von 5,5 bis 11 cP zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Viskositäten der Spectrum-Komplexe sind den anderen Materialien ähnlich, da die lyophilisierten Komplexe ebenfalls für jeden Zeitpunkt inkonsistent sind und von 8 bis 14 cP reichen. Die Viskosität des Spectrum-Materials ist an sich höher als die der Aldrich- und Mowiol^®-Materialien, so dass die flüssigen und gefrorenen Komplexe im Durchschnitt 9 cP betragen. Die lyophilisierten Komplexe waren schwer zu lyophilisieren und selbst nach vier Stunden Aufhydrierungszeit war in den Ampullen etwas Feststoff zu erkennen. Die inkonsistenten Viskositätsmessungen liegen am wahrscheinlichsten in der Problematik der Aufhydrierung begründet.
In-vivo-Ergebnisse
Diese Daten zeigen, dass der Komplex von Plasmid und PVA (1:10 w/w) ungefähr die doppelten CAT-Expressionsniveaus in dem Tumor ergibt als nur das Plasmid in derselben Dosis.
Ein Fachmann würde leicht verstehen, dass die vorliegende Erfindung gut darauf ausgelegt ist, die Aufgaben auszuführen und die erwähnten Ziele und Vorteile, wie die darin inhärenten, zu erreichen. Die Molekülkomplexe und die hierin beschriebenen Verfahren, Vorgehensweisen, Behandlungen, Moleküle und spezifischen Verbindungen sind derzeit repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen, beispielhaft und nicht als Einschränkungen des Schutzumfangs der Erfindung gedacht. Fachmännern werden Veränderungen daran und andere Verwendungen in den Sinn kommen, die vom Erfindungsgedanken umfasst sind, der vom Schutzumfang der Ansprüche definiert wird.
Es wird einem Fachmann leicht offensichtlich sein, dass an der hierin offenbarten Erfindung verschiedene Substitutionen und Abänderungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang und Gedanken der Erfindung abzuweichen.
Alle in der Spezifikation erwähnten Patente und Veröffentlichungen weisen auf die Wissensstände der Fachmänner der Technik hin, die die Erfindung betrifft.
Die hierin veranschaulichend beschriebene Erfindung kann auf geeignete Weise bei Fehlen eines beliebigen Elements oder beliebiger Elemente, einer beliebigen Einschränkung oder beliebigen Einschränkungen ausgeübt werden, die hierin nicht spezifisch offenbart sind. Somit kann beispielsweise in jedem Fall hierin ein beliebiger der Ausdrücke „umfassend", „im Wesentlichen bestehend aus" und „bestehend aus" durch einen der anderen zwei Ausdrücke ausgetauscht werden. Die Ausdrücke und Begriffe, die eingesetzt wurden, werden als Ausdrücke zur Beschreibung und nicht zur Einschränkung verwendet und es liegt keine Absicht dahingehend vor, dass durch Verwendung derartiger Ausdrücke und Begriffe beliebige Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausgeschlossen sind; es wird jedoch anerkannt, dass verschiedene Abänderungen innerhalb des beanspruchten Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.
Darüber hinaus werden Fachmänner, wenn Merkmale oder Gesichtspunkte der Erfindung im Sinne von Markush-Gruppen beschrieben werden, anerkennen, dass die Erfindung dadurch auch im Sinne eines beliebigen Elements oder einer beliebigen Untergruppe von Elementen der Markush-Gruppe beschrieben wird. Wenn beispielsweise X als aus der Gruppe ausgewählt, zu der Brom, Chlor und Iod gehören, beschrieben wird, werden Ansprüche, dass X Brom ist, und Ansprüche, dass X Brom und Chlor ist, komplett beschrieben.
Mit „umfassend" ist enthaltend, jedoch nicht darauf beschränkt, was auch immer auf das Wort „umfassend" folgt, gemeint. Somit zeigt die Verwendung des Ausdrucks „umfassend" an, dass die aufgeführten Elemente erforderlich oder obligatorisch sind, dass andere Elemente jedoch optional sind und vorliegen können oder auch nicht. Mit „bestehend aus" ist enthaltend und darauf beschränkt, was auch immer auf die Wendung „bestehend aus" folgt, gemeint. Somit zeigt die Wendung „bestehend aus" an, dass die aufgeführten Elemente erforderlich oder obligatorisch sind und dass keine anderen Elemente vorliegen können. Mit „im Wesentlichen bestehend aus" ist jegliche nach der Wendung aufgeführte Elemente enthaltend und auf andere Elemente beschränkt, die die in der Offenbarung für die aufgeführten Elemente spezifizierte Aktivität oder Aktion nicht stören oder zu dieser beitragen, gemeint. Somit zeigt die Wendung „im Wesentlichen bestehend aus" an, dass die aufgeführten Elemente erforderlich oder obligatorisch sind, dass andere Elemente jedoch optional sind und vorliegen können oder auch nicht, je nachdem, ob sie die Aktivität oder Aktion der aufgeführten Elemente beeinträchtigen oder nicht.
Andere Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen aufgeführt.

Claims

Colyophilisierter Komplex mit einem Nucleinsäurevektor und einem Formulierungswirkstoff, der Transfektionsraten erhöht, wobei eine den Nucleinsäurevektor enthaltende Lösung und eine den Formulierungswirkstoff enthaltende Lösung zugemischt werden, um vor der Colyophilisation eine Lyophilisationslösung zu bilden, und wobei der Formulierungswirkstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, zu der gehören: ein Polyvinyl-Pyrrolidon (PVP), ein Polyvinylalkohol (PVA), ein PVP-PVA-Copolymer, ein Poloxamer und ein Poloxamin.
Komplex nach Anspruch 1, bei dem der Formulierungswirkstoff vor dem Zumischen der Nucleinsäure Polyvinyl-Pyrrolidon mit einem neutralen pH-Wert enthält.
Komplex nach Anspruch 2, bei dem der Nucleinsäurevektor und das Polyvinyl-Pyrrolidon in dem colyophilisierten Komplex in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:17 vorhanden sind.
Komplex nach Anspruch 1, bei dem der Nucleinsäurevektor und der Polyvinylalkohol in dem colyophilisierten Komplex in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:10 vorhanden sind.
Komplex nach Anspruch 1, bei dem die Lyophilisa tionslösung einen pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 9, vorzugsweise von etwa 6,5 bis etwa 8, aufweist.
Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der Nucleinsäurevektor und der Formulierungswirkstoff in einer Einzelampullenformulierung colyophilisiert sind, die nach Hinzufügen einer Aufhydrierungslösung eine pharmazeutisch verträgliche Formulierung ergeben.
Komplex nach Anspruch 6, bei dem die Aufhydrierungslösung 0,9 % NaCl aufweist.
Komplex nach Anspruch 6, bei dem die Aufhydrierungslösung einen Puffer aufweist, der der pharmazeutisch verträglichen Formulierung einen transfektionsoptimierenden pH-Wert verleiht.
Komplex nach Anspruch 3, bei dem die Aufhydrierungslösung einen pH-Wert von etwa 3-4 aufweist.
Komplex nach Anspruch 8, bei dem der Formulierungswirkstoff Polyvinyl-Pyrrolidon mit einem neutralen pH-Wert ist, und der Puffer der pharmazeutisch verträglichen Formulierung einen sauren pH-Wert verleiht.
Komplex nach Anspruch 10, bei dem die pharmazeutisch verträgliche Formulierung etwa 5 % Polyvinyl-Pyrrolidon und etwa 25 mM Natriumcitratpuffer mit einem pH-Wert von etwa 4 aufweist.
Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 11, ferner mit einer. oder mehreren der folgenden zusätzlichen Komponenten: antimikrobielle Agenzien, Salze, Antioxidanzien, Puffer und/oder Kälteschutzmittel.
Komplex nach Anspruch 12, bei dem die antimikrobiellen Agenzien aus der Gruppe ausgewählt werden, zu der gehören: Benzalkoniumchlorid, Benzylalkohol, Chlorcresol, Phenylquecksilbernitrat und Azetat.
Komplex nach Anspruch 12, bei dem die Antioxidanzien aus der Gruppe ausgewählt werden, zu der gehören_: Askorbinsäure, Butylhydroxyanisol (BHA), Cystein, Natriumbisulfat und Glutathion.
Komplex nach Anspruch 12, bei dem die Puffer aus der Gruppe ausgewählt werden, zu der gehören: Essigsäure und Salz, Sukzinsäure und Borax, Formiat und HCl, und Natriumcitratpuffer.
Komplex nach Anspruch 12, bei dem die Kälteschutzmittel aus der Gruppe ausgewählt werden, zu der gehören: Lactose, Sacharose, Mannitol, Trehalose und Polyvinyl-Pyrrolidon.
Komplex nach einem der Ansprüche 2 bis 16, bei dem der Nucleinsäurevektor für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt wird, zu der gehören: hGH, VEGF, RPO, IGF-1, TPO, Faktor IX, IFN-α, IFN-β, IL-2 und IL-12.