CN1980640A - 核酸微球体，其制备和递送 - Google Patents

Abstract

通过将包含核酸的化合物溶解于适当的溶剂或溶剂体系中并从所形成溶液中的形成微球体而制备核酸。将该微球体对个体给药用作对症状的保护，其中核酸的递送用于，例如自身免疫性疾病的治疗。

Description

核酸微球体，其制备和递送

发明领域

本发明一般性地涉及核酸微球体的制备及其递送，特别是为了诱导树突细胞的耐受性以处理医学问题。更特别的，本发明涉及借助于采用含水条件制备的微球体的药物递送技术。所述微球体可掺入干扰RNA，质粒DNA、反义(AS)寡核苷酸或其它核酸。这些微球体用于在体内和原位改变细胞功能。

背景技术

微粒体、微球体和微胶囊是具有小于一毫米，更优选小于100微米直径的固体或半固体颗粒，其可由各种材料，包括合成聚合物、蛋白质和多糖形成。微球体已经被用于很多不同的应用中，主要是分离、诊断和药物递送。

从合成聚合物、天然聚合物、蛋白质和多糖制备这些微球体可应用很多不同的技术，包括相分离、溶剂蒸发、乳化和喷雾干燥。通常，这些聚合物形成这些微球体的支持结构，并且目的药物被掺入到该聚合物结构中。用于形成微球体的示例的聚合物包括：描述于Ruiz的美国专利5,213,812，Reid等人的美国专利5,417,986，Tice等人的美国专利4,530,840，Tice等人的美国专利4,897,268，Tice等人的美国专利5,075,109，Singh等人的美国专利5,102,872，Boyes等人的美国专利5,384,133，Tice等人的美国专利5,360,610和Southern Research Institute的欧洲专利申请公开248,531中的乳酸和乙醇酸的均聚物和共聚物(PLGA)；描述于Illum的美国专利4,904,479中的嵌段共聚物，例如特窗908(tetronic 908)和普罗沙姆407(poloxamer 407)；以及描述于Cohen等人的美国专利5,149,543中的聚偶磷氮(polyphosphazenes)。采用例如这些聚合物制备的微球体表现差的装载率并经常只能够将小百分率的目的药物掺入到所述聚合物结构中。因此，经常必须用相当大量的微球体给药以获得治疗效果。

球状小珠或颗粒作为生物化学家的工具已经商业化很多年了。例如，结合于小珠的抗体形成特异于特定配体的相对大的颗粒。该被抗体包被的大颗粒通常被用于交联在细胞表面上的受体以活化细胞，被结合于固相用于免疫亲和纯化，并可用于递送随时间缓慢释放的治疗剂，利用结合于所述颗粒的组织或肿瘤特异性抗体以使所述治疗剂靶向于所需的位点。

将抗体共价结合到固相基质上的常用方法是：用化学结合试剂衍生小珠，然后将所述抗体结合到该活化的珠上。应用合成聚合物小珠优于应用蛋白质分子，其允许采用比许多蛋白质可以耐受的更苛刻的衍生条件，且相对成本不高，并经常形成稳定于广泛的变性条件的连接。很多衍生化的珠是商业化了的，它们都具有各种不同的组分和大小。由合成聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯或乳胶形成的小珠可购自许多来源，例如Bio-Rad实验室(Richmond，Calif.)和LKB Produkter(Stockholm，Sweden)。由天然高分子和颗粒，例如琼脂糖、交联的琼脂糖、球蛋白、脱氧核糖核酸和脂质体形成的小珠可购自如下来源：例如Bio-Rad实验室，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和IBF(France)。由聚丙烯酰胺和琼脂糖的共聚物形成的小珠可购自如下来源：例如IBF和Pharmacia。有磁性的小珠可购自如下来源：例如Dynal Inc.(Great Neck，N.Y.)。

目前可获得的微粒体或小珠的一个缺点是它们都难于制造和成本高。由这些已知方法制备的微粒体具有宽的粒度分布，经常缺少均匀性，并且当活性组分的浓度高时不表现出长期释放动力学。另外，用于这些已知方法的聚合物需要溶解在有机溶剂中以形成微粒体。因此它们必须在被设计成可处理有机溶剂的特殊设备中制备。这些有机溶剂可使包含于微粒体中的蛋白质或肽变性。残留的有机溶剂当对人和动物用药时可能有毒。

另外，可获得的微粒体几乎没有足够小到适合穿过针头的大小，所述的针头通常用于给药治疗剂或用于通过吸入给药。例如，采用聚乳酸乙醇酸(PLGA)制备的微球体是大的并有聚集的倾向。粒度选择的步骤会导致产品损失，但对于除去对于注射而言过大的颗粒是必须的。用于注射的合适大小的PLGA颗粒，必须通过适应大粒度的大规格针头给药，这经常导致患者的不适。

通常，许多目前可获得的微粒体被活化以在水相介质中释放它们的内含物，因此它们必须被冻干以防止过早的释放。另外，采用PLGA体系制备的这样的颗粒表现出基于侵蚀和扩散两者的释放动力学。在这种类型的体系中，观察到药物的初始突释或快速释放。这种突释效应可在将所述颗粒给药的病人中导致不希望的副作用。

用脂质封装目标药物而制备的微粒体是已知的。例如，在Sinil Kim的美国专利5,422,120中所述的那样，环绕着多种水相隔室的双层膜中排列以形成颗粒的脂质，可以被用来封装水溶性药物用于随后的递送。这些粒度通常大于10微米并被设计用于关节内、鞘内、皮下和硬膜外给药。另外，脂质体已经被用于小分子的静脉递送。脂质体是由单独或多个磷脂和胆固醇的双层组成的球状颗粒。脂质体的大小为30微米或更大并且可以装载多种水溶性或脂溶性药物。脂质体技术已经被如下问题所阻碍，包括脂质组分的纯度、可能的毒性、囊泡异质性和稳定性、过度吸收和生产或保质期困难。

医学协会的目标是将核酸递送到到对象，包括但不限于动物或哺乳动物中的细胞内用于治疗。例如，可将核酸相对有效地递送到在培养物中(体外)的细胞内，但当将核酸递送到动物中时(体内)，核酸酶导致核酸快速降解。

除了保护核酸使其免于核酸酶消化，核酸递送媒介物还必须显示低毒性，必须有效地被细胞吸收并具有明确的、易于生产的配方。如在临床试验中所示，用于递送的病毒载体可能导致严重负面的、甚至致命的体内免疫应答。另外，这种方法具有在体内致突变作用的可能性。通过将核酸封入不同配方的脂质复合物(例如脂质体或阳离子脂质复合物)中而递送，通常在体内是无效的并可能有毒性作用。核酸与各种不同的聚合物或与肽组成的复合物已经显示出不一致的结果并且这些配方的毒性尚被解决。核酸已经被封装入聚合物基质中用于递送，但在这些情况下，这些颗粒具有宽的大小范围并且用于治疗性应用的效果尚未被证明。

因此，对解决核酸的递送问题和提供有效的核酸配方有需要。同样，持续需求开发微球体和制备微球体的新方法。微球体及其制备已经描述于Scott等人的美国专利6,458,387，Woiszwillo等人的美国专利6,268,053、6,090,925、5,981,719和5,599,719，和Woiszwillo的美国专利5,578,709中。这里明确指出的上述参考文献和所有其它的参考文献通过引用并入本发明中。

发明内容

本发明的目的是微球体及其制备方法和应用，所述微球体包含生物活性剂，例如DNA、siRNA(沉默RNA，也公知为双链RNA)、mRNA、tRNA，和所有其它核酸，包括但不限于寡核苷酸。据信本发明的微球体递送方法防止了或阻止了所递送的核酸与细胞核酸酶接触，因此防止了治疗用核酸的过早降解。

包含核酸的微球体可用于治疗各种不同疾病，包括但不限于自身免疫性疾病，例如多发性硬化、1型糖尿病、银屑病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、Berger氏病(IgA肾病)、慢性疲劳综合症、Crohn氏病、皮肌炎、纤维肌痛、Grave氏病、桥本氏甲状腺炎、扁平苔癣、重症肌无力、odopathic血小板减少性紫癜、风湿热、类风湿性关节炎、硬皮病、Sjogren综合症、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎和白癫风。另外，所述微球体可用于治疗其它树突细胞或巨噬细胞相关的疾病或其它的基于吞噬细胞的疾病或症状，包含可以通过反义寡核苷酸或siRNA方法而治疗、调停或减轻的那些疾病，等等。

在本发明的实施方案中，向对象进行AS寡核苷酸的微球体递送，以诱导与发作于个体中的与解决1型糖尿病相关的树突细胞耐受性。包含AS寡核苷酸的微球体用水相条件制备。这些微球体在对象中被用于抑制基因表达并用于防止自身免疫性糖尿病类型病症。本发明的微球体可被用于治疗正在发作的疾病或用作预防性治疗。

本发明的微球体还可包含多种生物活性试剂，包括寡核苷酸。

在本发明优选的实施方案中，合成了靶向于CD40，CD80和CD86初级转录本的三种AS-寡核苷酸，并且制备了寡核苷酸混合物的水溶液并将其与聚合物溶液组合。处理完成后，就得到了包含所述寡核苷酸的微球体。

本发明微球体的制备可以通过使用或不使用交联试剂、聚阳离子、聚阴离子和/或能源，例如热而进行。

本发明的微球体尤其很好地适合于体内并且以原位方法给药，例如直接皮下递送。在这方面的一个应用是用于治疗皮下肿瘤在和治疗病毒感染。所述微球体可通过各种不同的其它给药途径而递送，包括但不限于，口、肺部、鼻腔、静脉、肌内、皮下、局部、眼部、皮内、腹膜内和栓剂给药，及其组合。

本发明的微球体还可用于诊断目的，包括但不限于基因诊断。

本发明的这些和其它的方面、目的、特征和优点，包括各种不同的组合，通过考虑如下详细的说明而可变得明显和清楚地理解。

附图说明

在这一部分说明中，将参考所附附图，其中：

图1为示意图，说明了在1型糖尿病中胰腺的胰岛素生成β细胞的自身免疫破坏中的树突细胞的作用；

图2为包含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA载体的图；

图3显示光学显微照片，其提供了用包含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA(pDNA)微球体转染NIH 3T3纤维原细胞的证据；

图4为无保护的pDNA和本发明的两种pDNA微球体制剂的琼脂糖电泳凝胶的光学显微照片，分别都是暴露于DNA酶后；

图5为在四种不同质粒DNA转染应用中，β-半乳糖苷酶活性的直方图；

图6至图9为AS-寡核苷酸和聚L-赖氨酸聚阳离子的微球体的扫描电子显微图；

图10至图13为包含AS-寡核苷酸和聚L-鸟氨酸聚阳离子的微球体的扫描电子显微图；

图14和图15为无聚阳离子组分而形成的AS-寡核苷酸的微球体的扫描电子显微图；

图16的图概括了用本发明的微球体和根据其它用于递送靶向于三种初级转录本的AS-寡核苷酸的方法治疗的三组NOD小鼠中糖尿病的发病率；和

图17为本发明SiRNA微球体的扫描电子显微图(SEM)。

优选实施方案的描述

所需的本发明详述的实施方案在本文中公开；然而，应当明白，所公开的实施方案仅仅是本发明的示例，其可以以各种不同的形式实施。因此，本文中所公开的特定的细节不应被认为是限制性的，它仅仅是权利要求的基础和教导本领域技术人员以实际上任何适合的方式变化性应用本发明的基础。

通常本发明的微球体包含一种或多种活性剂，这些微球体优选基本上是球状，并具有适合于细胞吸收的基本上窄的大小分布。所述微球体可通过包括非肠道递送的可选择的给药方法、通过口服途径、通过肺部途径、通过眼部途径、通过使用贮库体系和其它给药途径而递送。

所述微球体包含核酸活性剂，例如DNA、RNA、siRNA、mRNA、tRNA和其它类型的核酸，包括但不限于RNA或DNA寡核苷酸，及其组合。本发明优选的微球体包含一种或多种寡核苷酸。所述微球体用作治疗剂用于治疗各种疾病和/或用作诊断工作的工具，包括但不限于功能基因组的。例如，反义寡核苷酸微球体通过阻止mRNA接触核糖体而干扰蛋白质生产过程的翻译阶段。将所述反义微球体递送到患病的细胞、病毒或细菌中，在那里它们特异性结合(杂交)于其靶mRNA。结果，所述mRNA被分解并因此不能由核糖体转录为功能蛋白质。因此反义微球体是一种有效的工具，其抵抗与身体中蛋白质过度表达和/或不足表达有关的疾病，例如在自身免疫性疾病中发生的那样。

反义寡核苷酸的重要优点是它们是高度特异的，因为它们抑制一种基因的表达。同样，反义寡核苷酸也是通用的，因为理论上可以开发出抵抗任何基因及其mRNA的AS寡核苷酸；DNA序列是对于AS核苷的设计唯一需要的信息。AS寡核苷酸对动物或人的培养细胞也是有效的。本发明的反义寡核苷酸微球体也是“可检验的”，因为它们由于具有非常特异性的位置并能用荧光标记物标记而是诊断有用的。

已知寡核苷酸易于被热、摇晃和其它机械和化学处理所破坏，所以它们不能长久附着于靶核酸并阻断它们的作用。同样已知蛋白质、肽、寡核苷酸等在体内具有非常短的寿命(几分钟到几小时)，因此需要有效地递送到细胞，并且在一些情况下，直接向细胞核递送以避免酶降解。因此，一般来说这些试剂不能成功地“无保护”地递送，而是需要被保护或配成制剂以允许它们在体内递送。

本发明的寡核苷酸通过掺入微球体中而保持了它们的生物活性。另外，所述微球体还提供高的装载能力。换句话说，较大剂量的治疗用核酸可以通过剂量给药基于所述微球的总重的高浓度(例如30-100重量％的核酸)的微球而向对象给药。本文中除非另外明确说明，百分比是基于组合物的总重的重量百分比。所述微球体提供用于反义寡核苷酸和其它类型核酸分子的非病毒递送工具。

所述微球包含基本上是球状形式的生物活性化合物。典型地，该微球体据有基本上窄的粒度分布，其平均粒度为不大于50微米。典型地，所述粒度将小于10微米，更典型地小于5微米。优选它们具有窄的大小分布，其中平均粒度约为0.04至约8微米，或者为约0.1至约约4微米，或者约0.2至约4微米，或者约0.4至约4微米，和为了需要约1微米的微球体的应用，优选约1至约3微米。平均粒度可以为例如约2微米，并且所述粒度范围可以调整以适合于所需的应用。

所述微球体优选包含基本上是无定形的或非结晶的核酸，即它们是无定形状态或半结晶形式。如本文中所用的，“无定形”指核酸的通常无规的固态形式，其中在微球体中不存在一种或多种核酸的晶格，而“半结晶”指核酸的通常无规的固态形式，其中微球体的核酸内含物包含小于50％晶格形式的一种或多种核酸。

以具有所需大小的微球体形式递送生物活性化合物可增强药物的功效并减少浪费。这还可以减少由高剂量活性剂导致的反作用。所述微球体的大小可确定它靶向于什么器官。另外，控制用于体内生物试剂递送的微球的优化的粒度是重要的，因为只有特定大小的微球可以被靶细胞吸收。比本文中所描述的更大的微球体可能引发巨噬细胞和其它免疫机制降解所述生物颗粒，而更小的微球体可能溶解过快。

在制造微球体过程中，将所需的生物试剂，典型的为寡核苷酸或其它核酸化合物，溶解于水溶液中。将其与水溶性的一种或多种聚合物相结合，所述聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)及其组合。所述水溶性聚合物不形成所述微球体的基本部分，就算形成，也只是帮助制备微球体。所述核酸可构成微球体组合物的最多至100重量％。典型的，它们将构成至少20重量％，典型地至少约30重量％，优选至少约50重量％，更优选至少70重量％，和最优选至少约90重量％。所述核酸可构成微球体的至少约95重量％。通常优选在含水/水溶性的一种或多种聚合物混合物中，在中等酸度pH下形成微球体。例如经常将一种或多种聚合物溶解于缓冲溶液中，例如pH为约5.3的乙酸钠。通过这种常规技术，微球体还可用其它聚合物制备，例如多糖，包括带正电荷的和带负电荷的多糖和其它生物相容性高分子。组分加入的顺序可以变化以形成具有不同化学和物理性质，例如大小、形态和/或表面电荷的微球体。

在一些微球体的制备中，优选在形成所述微球体前，将核酸与聚阳离子结合。然而避免使用聚阳离子在一些例子中可能是有利的，因为一些阳离子能与毒性问题关联。使用聚阴离子，聚阴离子交联剂，或其它交联试剂也可以用于制备这些微球体。优选的聚阴离子的例子是聚赖氨酸和聚鸟氨酸。其它的包含聚乙烯亚胺(PEI)、醇溶蛋白、精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚精氨酸、乙烯胺，及其组合。

当微球体的制备中和在微球体中包含聚阳离子组分时，它可以以形成微球体的总组合物的约0至约80重量％的水平存在。用聚阳离子制成的微球体可包含至少约2重量％，或者可包含至少约5重量％、或可包含至少约10重量％、或可包含至少约20重量％、或可包含至少约30重量％的聚阳离子，其它的部分，通常包含核酸。

在一些微球体生产的应用中，向所述组合物提供能量(例如以热或其它能源的形式)以利于制备微球体制剂。已经发现能量的加入可用于制备本发明的一些类型的微球体。

所述微球体组合物可包含多种生物活性化合物。因此，所述的微球体，无论单独的或聚集成组微球体，可包含多于一种的核酸，例如，一种或多种寡核苷酸。另外，在核酸微球体形成后可向核酸微球的表面加入其它的分子，包括但不限于抗体、受体配体或化学吸引剂。

尽管很多技术可用于制备本发明微球体(参见通过引用并入本发明的参考文献)，但下文已经发现特别用于制备本发明微球体的方法。

通过包含聚阳离子∶核酸的体积比为约0.5∶1至约4∶1的聚阳离子而制备核酸混合物的水溶液。制备聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇的聚合物溶液并与包含核酸的溶液结合。通过加热或冷却或二者组合而改变组合溶液的温度，并且多次离心和洗涤提供水相浓缩悬浮液，通常将其冷冻和冻干以形成包含一种或多种核酸和聚阳离子的微球体的干燥粉末。在形成微球体之前，混合物的温度可以从室温以约0.1至约400℃/分钟的速度被降低和升高。对于冷却应用，一般将所述混合物从约35℃冷却到约-196℃。并且对于加热应用，将所述混合物从约4℃加热到约100℃。

可将其它的赋形剂加入到最终的组合物中或形成预微球体的混合物中，例如多糖、带正电或负电荷的多糖和其它优选为生物相容性的聚合物。加入的顺序可以改变，其可导致形成具有不同化学和/或物理性质的微球体。其它部分可加到表面上作为，例如，化学吸引剂或受体配体。

本发明的微球体是用于质粒DNA、反义寡核苷酸和其它核酸分子的非病毒递送媒介物。

本发明的微球体组合物可以为液体悬浮体的形式(优选为水相的)，干燥粉末形式，在有机溶剂中的悬浮体或以固体形式微封装入其它聚合物中。

如上所述，本发明的微球体的可通过各种不同的给药途径而剂量给药。活性药物的实际给药剂量、要被剂量给药的制剂的浓度和制剂的体积将由有经验的临床医生决定并通常依赖于许多因素，包括但不限于，要被治疗的对象的要被治疗的疾病或症状、年龄、性别和体重，用于治疗特定靶的核酸的效力，在剂量制剂中核酸的浓度等等。本文中所用的，“有效的量”指本发明微球体防止、治疗或改善在对象中的疾病或症状的量。

本发明微球体具有特殊保护的特征。用β-半乳糖苷酶微球体的体外研究表明该微球体形式保护了所述DNA免受核酸酶破坏。考虑到减缓降解，DNA和寡核苷酸经常被硫醇化。例如一般AS-寡核苷酸为硫醇化的形式。因为微球体的保护特征，对于这种硫醇化形式的需要可以减弱或根本不需要。

本发明优选的方法的目的是将本文中所述的靶向于CD40、CD80和CD86的初级转录本的反义(AS)-寡核苷酸微球体通过配成制剂和注射而防护或改进自身免疫性胰岛素依赖糖尿病。这些寡核苷酸已经被设计为诱导免疫耐受性以防止在NOD小鼠模型中的产生胰岛素的β细胞的破坏。导致这些β细胞破坏的的事件图解于图1中。其说明了1型糖尿病如何通过在NOD小鼠中以及人中的胰腺的产生胰岛素的β细胞的自身免疫破坏而显现出来。在糖尿病临床发作期，人保持10-20％他们剩余的β细胞量。这些残余量的剩余能力可导致足够保持调整葡萄糖水平的胰岛素水平。优选的本发明的微球体被提供以干扰这些β细胞的自身免疫性破坏，这图解于图1中。

应当认识到，树突细胞(DC)可被激活为有效的抗原提呈细胞，这种细胞发现于所有组织中并在皮肤下高度富集。这些抗原提呈树突细胞的功能是通过激活特别是在淋巴结中的T细胞而作为免疫应答的引发剂。

图2描绘了包含β-半乳糖苷酶基因质粒载体，其用于转染NIH 3T3纤维原细胞。用质粒DNA微球体转染NIH 3T3纤维原细胞的体外证据示于图3中，其为响应于加入β-半乳糖苷酶X-gal基质细胞的外观被染成蓝色。

图4图解了体外微球体保护溶液中DNA的能力。该图描绘的琼脂糖电泳凝胶显示通过通常如本发明中指明的那样制备的质粒DNA微球体给予了对核酸酶的保护。在质粒样品1、2和3中，无保护的质粒DNA暴露于DNA酶，用拖尾表示三个水平的的DNA酶暴露中每个水平下质粒DNA的降解。在颗粒1和颗粒2样品中，将质粒DNA微球体制剂暴露于DNA酶。缺少拖尾表明该微球体制剂表现出其防护了质粒DNA使其免于降解。

图5在四种不同的质粒DNA应用中定量转染β-半乳糖苷酶活性的表达水平。无保护的质粒DNA应用显示非常低的水平。对于用脂质体(lipofectamine)，市售的阳离子脂质作为递送媒介物的质粒DNA-阳离子脂质复合物的转染，其显示出一定程度上较大的水平。对于两种质粒DNA微球体制剂，其显示出基本较大的活性，其中微球体1相应于图4的颗粒1，和微球体2相应于图4的颗粒2。

为了进一步详细说明本发明，下文中的实施例列举了本发明的一些特征和优点。这些实施例不应认为是限制性的或另外限定了本发明。

实施例1

靶向于CD40、CD80和CD86初级转录本的三种AS-寡核苷酸通过Pittsburgh(Pittsburgh，Pa.)大学的DNA合成仪器合成。该AS寡核苷酸序列如下，星号表明硫醇化，

Seq ID 1：CD 40-AS：5’C^*AC^*AG^*C C^*GA^*GG^*C^*AA^*A

          GA^*C^*AC^*C A^*T^*G C^*AG^*GG^*C^*A-3’

Seq ID 2：CD80-AS：5’-G^*GG^*AA^*A G^*CC^*AG^*G A^*AT^*CT^*A

          G^*AG^*CC^*A A^*TG G^*A-3’

Seq ID 3：CD86-AS：5’-T^*GG^*GT^*G C^*TT^*CC^*G T^*AA^*

          GT^*T C^*TG^*GA^*A C^*AC^* G^*T^*C-3’

所述寡核苷酸混合物的水溶液通过组合等分的每份都包含一种类型寡核苷酸的三份寡核苷酸溶液制备寡核苷酸混合物的水溶液，以形成10mg/ml的三种类型寡核苷酸溶液。制备四批寡核苷酸混合物水溶液。制备10mg/ml的去离子水中的聚L-赖氨酸·HBr(聚L-赖氨酸·HBr最高至50,000，得自Bachem，King of Prussia，PA)。如表1所述，将聚L-赖氨酸·HBr以体积比为1∶1、2∶1、3∶1和4∶1的比例加入到寡核苷酸溶液中。批次标记为1、2、3和4。将该混合物小心地涡旋振荡。制备25％的聚合物溶液，其包含在pH为5.5的1M乙酸钠(光谱纯，Gardena，CA)中的12.5％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，40,000道尔顿，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3,350道尔顿，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)。将该聚合物溶液以如表1所述的2∶1的体积比加入到批次1-4中，表1表示在批次1-4中的AS寡核苷酸、聚L-赖氨酸·HBr和PEG/PVP的体积：

表1

批号	寡核苷酸	聚L-赖氨酸·HBr	25％PEG/PVP	总体积
					1	750μl	0.75ml	3.0ml	4.50ml
2	750μl	1.50ml	4.5ml	6.75ml
					3	750μl	2.25ml	6.0ml	9.00ml
4	750μl	3.00ml	7.5ml	11.25ml

将所述批次在70℃下温育30分钟，然后冷却到23℃。当冷却时，该溶液变混浊并出现沉淀。然后将该悬浮液离心，除去过量的PEG/PVP。形成的沉淀通过将沉淀再次悬浮于去离子水中，离心和除去上层清液而洗涤。洗涤过程重复三次。将该水相的浓缩悬浮体冷冻并冻干以形成包含寡核苷酸和聚L-赖氨酸的微球体的干燥粉末。

图6表示批次1(聚L-赖氨酸∶寡核苷酸比例为1∶1)的扫描电子显微照片(SEM)。制成的微球体大小为0.5-4μm，平均粒度为大约2.5μm。还观察到未知物质的沉淀。通过HPLC进行的进一步的研究表明该沉淀包括残留的PEG/PVP，主要是PVP。

图7表示批次2(聚L-赖氨酸∶寡核苷酸比例为2∶1)的SEM。制成的微球体大小为0.2-4μm，平均粒度为大约1μm。

图8表示批次3(聚L-赖氨酸∶寡核苷酸比例为3∶1)的SEM。制成的微球体大小为0.2-4μm，平均粒度为约1μm。还观察到未知物质的沉淀。通过HPLC进行的进一步的研究确定该沉淀包括残留的PEG/PVP，主要是PVP。

图9表示批次4(聚L-赖氨酸∶寡核苷酸比例为4∶1)的SEM。制成的微球体大小为0.2-6μm。粒度具有多分散性，其中大约一半的颗粒具有1μm的平均粒度，和一半的颗粒具有5μm的平均粒度。

实施例2

靶向于CD40、CD80和CD86初级转录本的AS寡核苷酸为实施例1的AS寡核苷酸序列。通过组合等分的每份溶液包含一种类型的寡核苷酸的三份寡核苷酸溶液制备寡核苷酸混合物的水溶液，以形成10mg/ml的三种类型寡核苷酸的溶液。制备四批该寡核苷酸混合物的溶液。制备5mg/ml的聚L-鸟氨酸·HBr的(得自Sigma的聚L-鸟氨酸·HBr11,900(vis))去离子水溶液。

将聚L-鸟氨酸·HBr以如表2所述不同的体积比加到寡核苷酸溶液中。批次标记为1、2、3和4。将该混合物温和地涡旋振荡。制备25％的聚合物溶液，其包含在pH为5.5的0.1M乙酸钠(SpectrumChemicals，Gardena，CA)中的12.5％PVP(40,000道尔顿，SpectrumChemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(3,350道尔顿，SpectrumChemicals，Gardena，CA)。将该聚合物溶液以如表2所述的不同体积比加入到批次1-4中。如实施例1所述的那样进行温育和冲洗。表2提供了AS寡核苷酸、聚L-鸟氨酸-HBr和PEG/PVP在批次1-4中的体积：

表2

批号	寡核苷酸	聚L-鸟氨酸-HBr	25％PEG/PVP	25％PEG	总体积
						1	1.5ml	1.5ml	3ml	-	6.0ml
2	1.5ml	3.0ml	8ml	-	12.5ml
						3	1.5ml	1.5ml	-	6ml	9.0ml
4	1.5ml	4.5ml	-	6ml	12.0ml

图10表示批次1(聚L-鸟氨酸∶寡核苷酸比例为1∶1)的SEM。制成的微球体大小为0.2-8μm，平均粒度为约2μm。还观察到未知物质的沉淀。另外的HPLC研究证明该沉淀包括残留的PEG/PVP，主要是PVP。

图11表示批次2(聚L-鸟氨酸∶寡核苷酸比例为2∶1)的SEM。制成的微球体大小为0.2-8μm，平均粒度为约2μm。许多微球体聚集在一起。还观察到未知物质的沉淀。另外的HPLC研究证明该沉淀包括残留的PEG/PVP，主要是PVP。

图12表示批次3(聚L-鸟氨酸∶寡核苷酸比例为1∶1，只有PEG)的SEM。形成无定形的沉淀。这说明在配方中存在的PVP对微球体形成具有重要的作用。

图13表示批次4(聚L-鸟氨酸∶寡核苷酸比例为1∶3，只有PEG)的SEM。形成大小为10-50μm的多孔微球体，碎裂的微球体和2-10μm的系列的聚集的微球体。没有看到单个的微球体。这批表明在配方中存在的PVP对微球体形成具有重要的作用。

实施例3

靶向于CD40、CD80和CD86初级转录本的AS寡核苷酸用具有实施例1的寡核苷酸序列合成。通过组合等分的每份溶液包含一种类型的寡核苷酸的三份寡核苷酸溶液制备寡核苷酸混合物的水溶液，以形成10mg/ml的三种类型寡核苷酸的溶液。制备两批寡核苷酸混合物的溶液。

制备25％的聚合物溶液，其包含在pH为5.5的0.1M乙酸钠(光谱纯化学品，Gardena，CA)中的12.5％PVP(40,000道尔顿，SpectrumChemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(3,350道尔顿，SpectrumChemicals，Gardena，CA)。同样制备25％PEG的0.1M乙酸钠，pH为5.5的溶液。将这些聚合物溶液以如表3所述的不同体积比加入到批次1-2中。如实施例1所述的那样进行温育和冲洗。表3提供了在批次1-2中AS寡核苷酸、PEG/PVP和PEG的体积：

表3

批号	寡核苷酸	25％PEG/PVP	25％PEG	总体积
					1	1.5ml	-	3.0ml	4.5ml
2	1.5ml	3.0ml	-	4.5ml

图14表示批次1(PEG∶寡核苷酸2∶1)的SEM。形成无定形的沉淀。这批再次说明存在PVP对微球体形成具有重要的作用。

图15表示批次2(PEG/PVP∶寡核苷酸2∶1)的SEM。形成具有粒度分布为0.2-6μm的微球体，也观察到未确定来源的长链。这批表明没有聚阳离子微球体也能形成。

实施例4

用具有1型糖尿病的NOD小鼠模型进行体内研究。如图1所述，1型糖尿病通过胰腺的产生胰岛素的β-细胞的的自身免疫破坏而显现。AS寡核苷酸在三种应用中尝试被用于干扰β-细胞的自身免疫破坏。目的是通过靶向于CD40、CD80和CD86的初级转录本而干扰树突细胞功能，所述转录本编码对于激活T细胞所需的树突细胞表面蛋白。具有低水平CD40、CD80和CD86的树突细胞已知用于在体内促进抑制性免疫细胞网络。这些级联反应可导致T细胞在体内对β-细胞反应低下。

在第一组测试动物中，从NOD小鼠的骨髓祖细胞离体增殖树突细胞。将三种靶向于CD40、CD80和CD86初级转录本的AS寡核苷酸组合加入到组织培养的细胞中。温育后，将AS寡核苷酸转染的树突细胞注射到5-8周(尚未有糖尿病)龄的有血缘关系的(syngenetic)受体中。这就是离体递送方式。

平行的，将AS寡核苷酸微球体直接注射到其它同样年龄的NOD小鼠中。在每个如此处理的小鼠上进行单针注射。另一组这些NOD小鼠不被处理并用作对照。

图16显示对照的，未处理的NOD小鼠在23周龄时都出现糖尿病。用离体AS寡核苷酸转染和重新注入树突细胞(AS-ODN DC)而处理的组显示出其延迟了糖尿病发作，其中20％“未发作糖尿病”，这说明葡萄糖水平被保持在非糖尿病范围。直接用微球体在体内注射的NOD小鼠，71％在43周时“未发作糖尿病”。

实施例5

用荧光Cy3标记短链干扰RNA双链，siGLO环孢素A受体BsiRNA(小鼠)，得自Dharmacon(Lafayette，CO)。所述双链RNA序列示如Seq ID 4和它的互补序列Seq ID 5所示：

Seq ID 4：环孢素A受体B siRNA 5’-GGAAAGACUGUUCCAAAAAUU-3’

Seq ID 5：互补序列5’-UUUUUGGAACAGUCUUUCCUU-3’

SiRNA的水溶液被制成为15mg/mL的溶液。同样，制备15mg/mL的聚L-赖氨酸·HBr的去离子水(聚L-赖氨酸30,000-70,00MW，Sigma)。将聚L-赖氨酸以体积比为1∶1加入到siRNA中，如表1所述。将该混合物温和地涡旋振荡。制备25％的聚合物溶液，其包含在pH为5.5的1M乙酸钠(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)中的12.5％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，40,000道尔顿，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3,350道尔顿，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，。将该聚合物溶液以如表4所述的2∶1的体积比加入到siRNA/聚L-赖氨酸混合物中，表4显示siGLO siRNA双链、聚L-赖氨酸·HBr和PEG/PVP的体积。

表4

批号	siGLO siRNA	去离子水	聚L-赖氨酸HBr	25％PEG/PVP	总体积
						1	0.5mL	0.25mL	0.5mL	2.5mL	3.75ml

该批在58℃下温育30分钟，然后在冰上冷却30分钟。在冷却中，溶液变混浊并出现沉淀。然后将悬浮液过滤，除去过量的PEG/PVP。形成的沉淀通过将沉淀再次悬浮于去离子水中，离心和除去上层清液而洗涤。洗涤过程重复三次。将水相的浓缩悬浮液在-80℃下冷冻并冻干以形成包含Cy3标记的siGLO环孢素A受体B siRNA双链和聚L-赖氨酸的微球体干燥粉末。

图17表示一批微球体(聚L-鸟氨酸∶siRNA双链比例为1∶1)的扫描电子显微照片(SEM)。因此制成的微球体大小为0.2-1.4μm，平均粒度为约0.48纳米。

应当这样理解，已描述的本发明的实施方案是本发明原则的应用的一些示例。本领域技术人员可不背离本发明的真实内涵和外延而进行许多改变。本文中描述的各种特征可以任何组合而应用，所述特征不受本文中明确指出的具体的组合的限制。

序列表

<110>巴克斯特国际公司(Baxter International Inc.)

巴克斯特医疗保健股份有限公司(Baxter Healthcare S.A.)

<120>核酸微球体，其制备和递送

(Nucleic acid microspheres，Production and Delivery thereof)

<130>SCT064892-47

<141>2005-05-12

<160>5

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>1

cacagccgag gcaaagacac catgcagggc a 31

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>2

gggaaagcca ggaatctaga gccaatgga 29

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>Mus Musculus

<400>3

tgggtgcttc cgtaagttct ggaacacgtc 30

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>Mus musculus

<400>4

ggaaagacug uuccaaaaau u 21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>Mus musculus

<400>5

uuuuuggaac agucuuuccu u 21

Claims (36)

1.微球体，其包含约20重量％至100重量％的一种或多种核酸，并且具有不大于约50微米的平均粒度。

2.权利要求1的微球体，其中所述的核酸占微球体的约30重量％至约100重量％。

3.权利要求1的微球体，其中所述的核酸占微球体的约50重量％至约100重量％。

4.权利要求1的微球体，其中所述的核酸占微球体的约70重量％至约100重量％。

5.权利要求1的微球体，其中所述的核酸占微球体的约90重量％至约100重量％。

6.权利要求1的微球体，其中所述的核酸占微球体的至少约95重量％。

7.权利要求1的微球体，其中所述的微球体包含至少两种不同的核酸。

8.权利要求1的微球体，其中至少一种所述的核酸为寡核苷酸。

9.权利要求8的微球体，其中所述的微球体包含至少两种不同的寡核苷酸。

10.权利要求1的微球体，其中所述的微球体具有不大于约2微米的平均粒度和约0.04微米至约8微米的粒度分布。

11.权利要求7的微球体，其中所述的微球体具有不大于约2微米的平均粒度和约0.04微米至约8微米的粒度分布。

12.权利要求8的微球体，其中所述的微球体具有不大于约2微米的平均粒度和约0.04微米至约8微米的粒度分布。

13.权利要求1的微球体，其中所述的微球体具有不大于约1微米的平均粒度和约0.2微米至约4微米的粒度分布。

14.权利要求7的微球体，其中所述的微球体具有不大于约1微米的平均粒度和约0.2微米至约4微米的粒度分布。

15.权利要求8的微球体，其中所述的微球体具有不大于约1微米的平均粒度和约0.2微米至约4微米的粒度分布。

16.权利要求1的微球体，其中所述的核酸选自DNA、DNA寡核苷酸、RNA寡聚核糖核苷酸、DNA/RNA杂交寡核苷酸、mRNA、siRNA或tRNA，及其组合。

17.权利要求1的微球体，其中所述的微球体在悬浮液中。

18.权利要求1的微球体，其中所述的微球体在干燥粉末制剂中。

19.治疗对象的方法，其包含将权利要求1的微球体向对象给药。

20.权利要求15的方法，其中递送所述微球体的给药途径选自：静脉内、肌内、皮下、局部、皮内、腹膜内、口腔、肺部、眼部、鼻、颊内、阴道、直肠给药及其组合。

21.防护个体免受自身免疫性疾病的方法，其包括皮下注射权利要求1的微球体。

22.防护个体免受自身免疫性疾病的方法，其包括皮下注射权利要求7的微球体。

23.包含核酸的生物活性微球体的制备方法，其将所述核酸用溶剂溶解以形成组合物并从所述组合物形成微球体，所述的微球体具有不大于约50微米的平均粒度。

24.权利要求23的方法，其中向所述溶剂中加入至少一种聚阳离子。

25.权利要求24的方法，其中所述的聚阳离子选自：聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚乙烯亚胺、醇溶蛋白、精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚精氨酸、乙烯胺及其组合。

26.权利要求25的方法，其中所述的聚阳离子为聚赖氨酸。

27.权利要求25的方法，其中所述的聚阳离子为聚鸟氨酸。

28.权利要求23的方法，其中向所述溶剂中加入至少一种聚阴离子。

29.权利要求23的方法，其中向所述溶剂中加入至少一种聚合物。

30.权利要求29的方法，其中所述的聚合物选自：多糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮及其组合。

31.权利要求23的方法，其中所述的形成是通过向所述组合物中加入交联试剂而进行的。

32.权利要求23的方法，其中所述的形成是通过向所述组合物中加入能量而进行的。

33.权利要求23的方法，其中所述的形成是通过在所述组合物中不含聚阳离子组分而进行的。

34.权利要求23的方法，其中所述的形成是通过在所述组合物中不含交联组分而进行的。

35.权利要求23的方法，其中所述的形成是通过在所述组合物中不含聚阴离子组分而进行的。

36.权利要求23的方法，其中所述的形成是通过不施用能源就从所述组合物中形成微球体而进行的。

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