MXPA06012992A

MXPA06012992A - Microesferas que comprenden proteina y que muestran inyectabilidad en altas concentraciones de este agente.

Info

Publication number: MXPA06012992A
Application number: MXPA06012992A
Authority: MX
Inventors: Larry Brown; Julia Rashba-Step; Debra Lafreniere; Vered Bisker-Leib; John Mcgeehan; Terrence Scott
Original assignee: Baxter Int
Priority date: 2004-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2007-02-12
Also published as: US20060024379A1; JP5634009B2; AU2005244840B2; US8333995B2; AU2005244840A1; CN103393601A; AU2005244840C1; WO2005112893A1; JP2007537283A; CA2566075A1; JP2012224645A; EP1753404A1

Abstract

La presente invencion se refiere a una composicion de microparticulas que comprenden una suspension de microparticulas de proteina sustancialmente amorfas, proporcionando la composicion una concentracion de cuando menos aproximadamente 50 miligramos de dicha proteina por mililitro de la composicion, y la proteina tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Daltones. De acuerdo con el metodo de produccion, el agente activo se disuelve en un solvente acuoso o miscible en agua que contiene un agente potenciador de la separacion de fases (PSEA) disuelto, para formar una solucion en una sola fase liquida. La solucion se somete a una separacion de fases liquida-solida para hacer que el agente activo forme pequenas esferas que son sustancialmente amorfas o no cristalinas, y que se pueden inyectar a traves de las agujas de calibre fino en altas concentraciones. La invencion tiene una aplicacion especial para las proteinas de mas alto peso molecular.

Description

MICROESFERAS QU E COM PREN DE N PROTEI NA Y QU E MU ESTRAN I NYECTA BI LI DAD EN ALTAS CONC ENTRACION ES DE ESTE AGENTE Descripción Cam po Técnico La presente invención se refiere a composiciones de partículas pequeñas, de preferencia de una forma sustancialmente esférica, de un agente activo. Los agentes activos de preferencia son proteínas de alto peso molecular, y de una manera más preferible son formas sustancialmente amorfas de proteínas de alto peso molecular, y de una forma muy preferible son anticuerpos monoclonales sustancialmente amorfos. La invención tiene la capacidad para proporcionar composiciones inyectables o q ue pueden pasar por jeringa de prote ínas de alto peso molecular, incluyendo anticuerpos monoclonales, en altas concentraciones, y de acuerdo con lo anterior, proporciona la capacidad para suministrar una dosis cl ínicamente efectiva de estos agentes activos con un bajo volumen de composición , de preferencia con 1 0 mililitros o menos de composición , y más preferiblemente con un vol umen típicamente encontrado en las aplicaciones de jeringas para inyección, i ncluyendo inyecciones de bajo volumen que pueden pasar por jeringa típicas con las inyecciones de bolos subcutáneas. Esta invención también contempla métodos de producción y métodos de uso de estas composiciones de partículas esféricas peq ueñas de un agente activo. De acuerdo con el método de producción, el agente activo se disuelve en un solvente acuoso o miscible en agua que contiene un agente potenciador de la separación de fases (PSEA) disuelto para formar una solución en una sola fase líquida. Entonces la solución se somete a una separación de fases I íq u id a-sólida que tienen al agente activo comprendiendo la fase sólida, y al agente potenciador de la separación de fases y al solvente comprendiendo la fase líquida. La separación de fases líquida-sólida se puede inducir de numerosas maneras, tales como cambiando la temperatura de la solución o con adición de energía. El método es más adecuado para formar partículas esféricas pequeñas de agentes terapéuticos, que se pueden suministrar a un sujeto que necesite el agente terapéutico. El método también es muy adecuado para formar partículas esféricas pequeñas sólidas de macromoléculas, en particular macromoléculas que son lábiles al calor, tales como proteínas, incluyendo materiales de anticuerpos monoclonales. La invención tiene la capacidad para proporcionar macromoléculas que pueden pasar por jeringa. Antecedentes de la Invención Campo de la Invención Se han empleado varias técnicas en el pasado para la fabricación de nano- y micro-partículas biopoliméricas. Las técnicas convencionales incluyen secado por pulverización y molienda para la formación de las partículas, y se pueden emplear para producir partículas de un tamaño de 5 mieras o menos.

La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número5,654,010 y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,667,808 describen la producción de una forma sólida de hormona de crecimiento humana recombinante, hGH, a través de la formación de complejo con zinc, con el objeto de crear un complejo amorfo, el cual entonces se microniza a través de una boquilla de ultrasonido, y se rocía en nitrógeno líquido con el objeto de congelar las gotitas. Luego se permite que se evapore el nitrógeno líquido a una temperatura de -80°C, y el material resultante se seca por congelación. Las micropartículas y las microesferas son partículas sólidas o semi-sólidas que tienen un diámetro menor a 1 milímetro, más preferiblemente menor a 100 mieras, y de una manera muy preferible menor a 10 mieras, que se pueden formar de una variedad de materiales, incluyendo proteínas, polímeros sintéticos, polisacáridos, y combinaciones de los mismos. Las microesferas se han utilizado en muchas aplicaciones diferentes, primordialmente separaciones, diagnósticos, y suministro de fármacos. Los ejemplos más bien conocidos de las microesferas utilizadas en las técnicas de separación, son aquéllas que se forman de polímeros de origen ya sea sintético o natural, tales como poliacrilamida, hidroxi-apatita, o agarosa. En el área del suministro de fármacos controlado, las moléculas con frecuencia se incorporan en, o se encapsulan dentro de, pequeñas partículas esféricas, o se incorporan en una matriz monolítica para su liberación subsecuente.

Rutinariamente se emplean un número de diferentes técnicas para hacer estas microesferas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturales, proteínas, y polisacáridos, incluyendo separación de fases, evaporación de solvente, coascervación, emulsión, y secado por pulverización. En general, los polímeros forman la estructura de soporte de estas microesferas, y se incorpora el fármaco de interés en la estructura polimérica. Actualmente están disponibles partículas preparadas utilizando lípidos para encapsular fármacos objetivos. Los liposomas son partículas esféricas compuestas de una sola capa o múltiples bicapas de fosfolípido y/o colesterol. Los liposomas son de un tamaño de 100 nanómetros o mayores, y pueden llevar una variedad de fármacos solubles en agua o solubles en lípido. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos configurados en membranas de bicapa rodeando a múltiples compartimientos acuosos para formar partículas, con el fin de encapsular los fármacos solubles en agua para su suministro subsecuente, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,422,120 a Sinil Kim. Las perlas esféricas han estado comercialmente disponibles como una herramienta para los bioquímicos durante muchos años. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados con perlas crean partículas relativamente grandes que tienen una especificidad de enlace para ligandos particulares. Se utilizan rutinariamente anticuerpos para enlazarse con los receptores sobre la superficie de una célula para la activación celular, se enlazan a una fase sólida para formar partículas recubiertas de anticuerpo para la purificación por inmunoafinidad, y se pueden utilizar para suministrar un agente terapéutico que se libre lentamente a través del tiempo, utilizando anticuerpos específicos de tejido o de tumor conjugados con las partículas para dirigir el agente hacia el sitio deseado. Existe una necesidad continua de desarrollar nuevos métodos para hacer partículas, en particular aquéllas que se puedan adaptar para utilizarse en las áreas de suministro de fármacos, separación, y diagnóstico. Las partículas más deseables desde un punto de vista de la utilidad, serían pequeñas partículas esféricas que tengan las siguientes características: distribución de tamaños estrecha, sustancialmente esféricas, que consistan sustancialmente en sólo el agente activo, retención de la integridad bioquímica y de la actividad biológica del agente activo. Las partículas deben proporcionar un sólido adecuado que permita la estabilización adicional de las partículas mediante recubrimiento o mediante microencapsulación. Además, el método de fabricación de las partículas esféricas pequeñas tendría las siguientes características deseables: fabricación simple, un proceso esencialmente acuoso, alto rendimiento, y que no requiera de tamización subsecuente. Una proteína es una secuencia de aminoácidos para la que es suficiente la longitud de cadena para producir los niveles más altos de estructura terciaria y/o cuaternaria. Esto es para distinguirla de los "péptidos" u otros fármacos de pequeño peso molecular que no tienen esta estructura.

Un anticuerpo (inmunoglobulina) es una proteína producida por las células del sistema inmune (linfocitos B) en respuesta a una molécula extraña (antígeno) o a un organismo invasor. Un anticuerpo se enlaza con frecuencia a la molécula extraña o a la célula de una manera extremadamente apretada, inactivándola de esta manera o marcándola para la destrucción mediante fagocitosis o lisis inducida por el complemento. La inmunoglobulina (Ig) es una molécula de anticuerpo. Los vertebrados superiores tienen cinco clases de inmunoglobulinas -IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM -, cada una con diferentes papeles en la respuesta inmune. Un anticuerpo monoclonal (mAb) es un anticuerpo purificado altamente específico (molécula de inmunoglobulina) que se deriva a partir de solamente un clon de las células del sistema inmune (linfocitos B), y reconoce un sitio específico de solamente una molécula extraña (antígeno). Los anticuerpos monoclonales se pueden producir en masa mediante manipulaciones de laboratorio (murinos, quiméricos, humanizados). El término "anticuerpo monoclonal" se utiliza en un sentido más amplio, y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales que tienen una región Fe de inmunoglobulina, composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, y moléculas de una sola cadena, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2, y Fv). Los anticuerpos policlonales son un rango de anticuerpos (moléculas de inmunoglobulina) que son específicos para muchos sitios de una sola molécula extraña (antígeno). Las respuestas inmunes naturales son policlonales. Los anticuerpos referidos como moléculas de trampa se componen de fusiones entre dos componentes distintos del receptor, y una porción de una molécula de anticuerpo denominada como la "región Fe", dando como resultado la generación del factor de crecimiento y los bloqueadores de citoquina con una afinidad notoriamente incrementada sobre aquélla ofrecida por los reactivos componentes individuales. Las moléculas de trampa, por ejemplo, han sido desarrolladas por Regeneron Pharmaceuticals. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) pueden ser una población derivada en laboratorio de anticuerpos derivados a partir de un clon de células, y son altamente específicos en el enlace de un sitio de antígeno particular. Son proteínas grandes, del orden de 150 kDa, comprendidas de cuatro cadenas de polipéptido: dos cadenas ligeras de aproximadamente 25 kDa cada una, y dos cadenas pesadas de aproximadamente 50 kDa cada una. Debido a su tamaño, los anticuerpos monoclonales en general son suministrados actualmente mediante inyección intravenosa. Los anticuerpos con frecuencia necesitan suministrarse en cantidades relativamente grandes con el objeto de lograr el efecto terapéutico. Por ejemplo, la dosis de suministro para muchos anticuerpos está entre aproximadamente 100 y 800 miligramos. La posibilidad de inyección de estas grandes cantidades de material presenta desafíos sustanciales para la formulación y el suministro. Un pequeño volumen de una dosis tan grande normalmente tendrá una alta viscosidad; por consiguiente, se necesitan grandes volúmenes, del orden de 10 a 250 mililitros, para suministrarse intravenosamente. El suministro intravenoso es muy incómodo para el paciente, requiere de establecimientos clínicos, y es tanto costoso como tardado. La tecnología de micropartículas de conformidad con la invención, puede ofrecer ventajas significativas para este mercado, debido a que permite la formación de suspensiones altamente concentradas que pueden ser fácilmente solubles después de su inyección. De una manera similar, otros agentes activos que comprendan proteínas de alto peso molecular pueden beneficiarse de la presente invención. La invención describe composiciones que se pueden suministrar en altas concentraciones y en volúmenes relativamente pequeños, y por lo tanto, son composiciones con propiedades de posibilidad de paso por jeringa y de inyección. Antes de la invención, los anticuerpos monoclonales, otros anticuerpos, y otras proteínas de alto peso molecular con un peso molecular mayor de aproximadamente 25 kDa, no se podían inyectar utilizando una aguja de calibre fino, tal como una aguja de calibre 20 y más fino utilizada en relación con una jeringa convencional. Ni se podía suministrar esta proteína antes de la invención en un volumen pequeño (10 mililitros o menos) conteniendo una dosis clínicamente efectiva de la proteína. El uso de la tecnología de micropartículas en relación con estas moléculas resuelve el problema de la inyección de alto volumen de estas moléculas como se requería anteriormente. Esta invención también puede ser útil para ayudar en el suministro de materiales de proteína de más bajo peso molecular en altas concentraciones dentro de un volumen de inyección pequeño y durante un tiempo de suministro corto. El proceso de fabricación para un anticuerpo monoclonal es un proceso tedioso, lo cual explica su alto precio. Por consiguiente, es importante que los anticuerpos monoclonales sean precisamente suministrados a una localización objetiva y de una manera muy eficiente y segura. También es importante en la preparación y el suministro de micropartículas, ya sean anticuerpos monoclonales o no, la formación de alto rendimiento de micropartículas o microesferas fácilmente solubles, la retención de sus integridades químicas respectivas, y en el caso de materiales tales como los anticuerpos monoclonales, muy buena posibilidad de inyección que pueda permitir el suministro por las vías subcutánea, ocular, u otras vías de administración. Un aspecto u objeto de la invención es proporcionar una micropartícula de anticuerpo sustancialmente amorfa o no cristalina. Otro aspecto u objeto de la presente invención es proporcionar una composición que se pueda pasar por jeringa, incluyendo micropartículas de anticuerpos sustancialmente amorfas o no cristalinas. Un aspecto u objeto adicional de esta invención es proporcionar una composición que se pueda pasar por jeringa, que proporcione una dosis clínicamente efectiva de proteína en aproximadamente 10 mililitros o menos de la composición, inclusive cuando la proteína tenga un peso molecular de aproximadamente 25,000 Dáltones y mayor. Un aspecto u objeto adicional de la presente invención es proporcionar micropartículas que tengan cuando menos aproximadamente 50 miligramos de agente activo por mililitro de una dosis clínicamente efectiva, encontrando una aplicación especialmente conveniente cuando el agente activo tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Dáltones. Otro aspecto u objeto de la invención es proporcionar un método para utilizar micropartículas de maneras clínicamente efectivas a través del suministro del agente activo mediante inyección en altas concentraciones, tal como, pero no limitándose a, la inyección subcutánea. Un aspecto u objeto adicional de la presente invención es un proceso para la preparación de micropartículas o materiales de proteína de un peso molecular relativamente alto. Otro objeto o aspecto de la presente invención es proporcionar micropartículas, de preferencia microesferas, que sean fácilmente solubles, es decir, que exhiban solubilidad dentro de aproximadamente 10 minutos en un regulador de suero regulado por fosfato a un pH fisiológico, mientras que exhiban integridad química, es decir, que cuando menos aproximadamente el 90 por ciento del compuesto quede químicamente intacto en las micropartículas, y que exhiban posibilidad de inyección, más particularmente en la forma de posibilidad de paso por jeringa, es decir, que formen cuando menos una suspensión de 50 miligramos/mililitro, y que se pueda suministrar la suspensión a través de una aguja de calibre fino sin el uso de una fuerza excesiva. Otros aspectos, objetos, y ventajas de la presente invención serán entendidos a partir de la siguiente descripción, de acuerdo con las modalidades preferidas de la presente invención, incluyendo específicamente las combinaciones mencionadas y no mencionadas de las diferentes características que se describen en la presente, mostrándose la información pertinente con respecto a las cuales en los dibujos en los dibujos acompañantes. Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a micropartículas de proteína que tienen propiedades inyectables en altas dosis. La proteína es un agente activo, y las micropartículas son sustancialmente amorfas o no cristalinas. Con estas composiciones, se pueden suministrar concentraciones muy altas del agente activo en volúmenes muy bajos. El agente activo de la presente invención es de preferencia un agente activo que puede ser un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. En una modalidad preferida de la presente invención, el agente activo es una proteína de macromolécula, incluyendo un anticuerpo monoclonal. En todavía otra modalidad preferida, las partículas q ue contienen al agente activo son adecuadas para su sum inistro in vivo a un sujeto que necesite el agente, por cualq uier vía adecuada, incluyendo la inyección subcutánea y/u ocular, las cuales de otra manera no son factibles para las macromoléculas de estos tipos. La presente invención también se refiere a métodos de producción y a métodos de uso de micropartículas, partículas esféricas pequeñas, o microesferas de un agente activo. De conformidad con un método de producción, el agente activo se d isuelve en un solvente q ue contiene un agente potenciador de la separación de fases disuelto, para formar una solución q ue sea de una sola fase l íq uida. El solvente de preferencia es un solvente acuoso o miscible en agua. Entonces la solución se somete a una separación de fases l íq uida-sólida que tienen al agente activo comprendiendo a la fase sólida, y al agente potenciador de la separación de fases y al solvente comprendiendo la fase l íq uida . La separación de fases l íquida-sólida se puede ind ucir de numerosas maneras , tales como cambiando la temperatura de la solución hasta debajo de la temperatura de transición de fases de la solución. En una modalidad preferida de la presente invención , el método para someter a la solución a una separación de fases l íquida-sólida es mediante el enfriamiento de la solución hasta debajo de la temperatura de transición de fases del agente activo en la solución . Esa temperatura puede ser mayor o menor que el punto de congelación de la solución. Para las soluciones en donde el punto de congelación está arriba de la temperatura de transición de fases, la solución puede incluir un agente depresor del punto de congelación, tal como polietilenglicol o propilenglicol, para reducir el punto de congelación de la solución con el fin de permitir que se presente la separación de fases en la solución sin que se congele la solución. El agente potenciador de la separación de fases de la presente invención potencia o induce la separación de fases líquida-sólida del agente activo en la solución cuando se somete a la solución al paso de cambio de fase en donde se solidifica el agente activo para formar una suspensión de pequeñas partículas esféricas como una fase discontinua, mientras que el agente potenciador de la separación de fases permanece disuelto en la fase continua. Es decir, el agente potenciador de la separación de fases no pasa a través de un cambio de fase, sino que es el agente activo el que pasa a través de un cambio de fase. El método para producir las partículas de la presente invención también puede incluir un paso adicional de controlar la separación de fases líquida-sólida de las partículas, con el fin de controlar el tamaño y la forma de las partículas formadas. Los métodos para controlar la separación de fases incluyen el control de la concentración iónica, el pH, la concentración del agente potenciador de la separación de fases, la concentración del agente activo en la solución, o el control del índice de cambio en la temperatura de la solución, siendo el control de éstos ya sea antes de la separación de fases, o bien un cambio de cualquiera o varios de los mismos con el objeto de inducir la separación de fases. En una modalidad preferida de la presente invención, las partículas estéricas pequeñas se separan del agente potenciador de la separación de fases en la fase continua después de la formación de las partículas. En todavía otra modalidad preferida, el método de separación es lavando la solución que contiene las partículas con un medio líquido en donde no sea soluble el agente activo en el medio líquido, mientras que el agente potenciador de la separación de fases sea soluble en el medio líquido. El medio de lavado líquido puede contener un agente que reduzca la solubilidad del agente activo en el medio líquido. El medio de lavado líquido también puede contener uno o más excipientes. El excipiente puede actuar como un estabilizante para las pequeñas partículas esféricas o para el agente activo o el agente portador. El excipiente también puede imbuir al agente activo o a la partícula con características adicionales, tales como la liberación controlada del agente activo desde las partículas, o la permeación modificada del agente activo a través de los tejidos biológicos. En otra modalidad preferida, aunque las pequeñas partículas no incluyan al agente potenciador de la separación de fases, se pueden cosechar en la presencia de la fase del agente potenciador de la separación de fases para los pasos de procesamiento subsecuentes antes de la separación de la fase del agente potenciador de la separación de fases. En otra modalidad preferida, la solución es una solución acuosa que comprende un solvente acuoso o miscible en ag ua . Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 da imágenes del microscopio óptico de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VI I I , preparadas como se describe en el Ejemplo 3. La Figura proporciona imágenes del microscopio óptico polarizadas de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VI I I , preparadas como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 3 proporciona micrografías de electrones de exploración de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VI I I , vistas como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 4 da imágenes de electroforesis en gel del anticuerpo monoclonal anti-Factor VI I I (material de partida y microesferas disueltas) , como se describen en el Ejemplo 4. La Figura 5 da micrografías de electrones de exploración de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VI I I , vistas como se describen en el Ejemplo 5. La Figura 6 reporta la distribución de tamaños de partículas por número, área superficial , y distribución de volumen , de microesferas de anticuerpo monoclonal a nti-Factor VI I I , como se describen en el Ejemplo 5. La Figura 7 proporciona imágenes del microscopio óptico de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34, preparadas como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 8 es una imagen del microscopio óptico de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34, preparadas como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 9 es una micrografía de electrones de exploración de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34, preparadas como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 10 reporta la distribución de tamaños de partículas por distribución de número de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34, preparadas como se describe en el Ejemplo 6. La Figura 11 da la difracción en polvo de rayos-X de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 (con la configuración de dos ranuras), y de la mezcla de hexatriacontano:silicio, como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 12 reporta el monitoreo de fluorescencia de la estabilidad de conformación de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 durante el enfriamiento con Poloxámero, como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 13 es un diagrama de fase bidimensional que gráfica la concentración del agente activo contra la temperatura. La Figura 14 es un perfil de temperatura de enfriamiento. La Figura 15 es un análisis de HPLC que muestra el mantenimiento global de la estabilidad química de la insulina, cuando se prepara en pequeñas partículas esféricas. Las Figuras 16a y 16b son esquemas que demuestran la reproducibilidad de lote a lote.

La Figura 17a es una gráfica de dicroísmo circular (CD) para la alfa-1-anti-tripsina (AAT). La Figura 17b es una gráfica de la actividad contra el tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente del Ejemplo 21. La Figura 17c es una gráfica de la actividad contra el tiempo de almacenamiento a 4°C del Ejemplo 21. Las Figuras 18-28b son gráficas de calorimetría de exploración diferencial (DSC). La Figura 29 es un diagrama que muestra los datos de estabilidad de la insulina en HFA-134a. La Figura 30 es un diagrama que compara el desempeño aerodinámico de la insulina utilizando tres dispositivos de inhalación.

La Figura 31 es un diagrama de los datos de estabilidad de pequeñas partículas esféricas de insulina, comparándose con el material de partida de insulina almacenado a 25°C. La Figura 32 es una gráfica de los datos de estabilidad de pequeñas partículas esféricas de insulina, comparándose con el material de partida de insulina almacenado a 37°C. La Figura 33 es un diagrama de los datos de estabilidad de pequeñas partículas esféricas de insulina, comparándose con el material de partida de insulina almacenado a 25°C. La Figura 34 es un diagrama de los datos de estabilidad de pequeñas partículas esféricas de insulina, comparándose con el material de partida de insulina almacenado a 37°C. La Figura 35 es un diagrama de los datos de estabilidad de pequeñas partículas esféricas de insulina, comparándose con el material de partida de insulina almacenado a 25°C. La Figura 36 es un diagrama de los datos de estabilidad de pequeñas partículas esféricas de insulina, comparándose con el material de partida de insulina almacenado a 37°C. La Figura 37 es una gráfica de barras de la estabilidad aerodinámica de la insulina utilizando un Cyclohaler DPI. La Figura 38 es una micrografía de luz de pequeñas partículas esféricas de Danés. La Figura 39 es un diagrama de la actividad enzimática de la ADNsa. La Figura 40 es una micrografía de luz de pequeñas partículas esféricas de SOD. La Figura 41 es un diagrama de los datos enzimáticos para pequeñas partículas esféricas de SOD. Las Figuras 42A-B son ilustraciones esquemáticas del reactor de emulsión continua, en donde la Figura 42A es una ilustración esquemática del reactor de emulsión continua cuando se agrega el compuesto de actividad superficial a la fase continua o a la fase dispersa antes de la emulsión, y la Figura 42B es una ilustración esquemática del reactor de emulsión continua cuando se agrega el compuesto de actividad superficial después de la emulsión. Descripción de las Modalidades Preferidas La presente invención es susceptible a modalidades en muchas formas diferentes. Las modalidades preferidas de la invención se dan a conocer con el entendimiento de que la presente divulgación se debe considerar como una ejemplificación de los principios de la invención, y no pretende limitar los amplios aspectos de la invención a las modalidades ilustradas. Como se requiera, en la presente se dan a conocer modalidades detalladas de la presente invención; sin embargo, se debe entender que las modalidades dadas a conocer son meramente un ejemplo de la invención, que se puede incorporar en diferentes formas. Por consiguiente, los detalles específicos dados a conocer en la presente no deben interpretarse como limitantes, sino meramente como una base para las reivindicaciones, y como una base representativa para enseñar a un experto en la materia a emplear de diversas formas la presente invención virtualmente de cualquier manera apropiada. La presente invención se refiere a composiciones de partículas pequeñas sustancialmente amorfas o no cristalinas de un agente activo que es una proteína. La aplicación especial se encuentra cuando el agente activo tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Dáltones. De acuerdo con el método de producción, el agente activo se disuelve en un solvente que contiene un agente potenciador de la separación de fases disuelto para formar una solución que está en una sola fase líquida continua. El solvente de preferencia es un solvente acuoso o miscible en agua. Entonces la solución se somete a un cambio de fase, por ejemplo disminuyendo la temperatura de la solución hasta debajo de la temperatura de transición de fases del agente activo, mediante lo cual, el agente activo pasa a través de una separación de fases líquida-sólida para formar una suspensión de partículas pequeñas sustancialmente amorfas o no cristalinas que constituyen una fase discontinua, mientras que el agente potenciador de la separación de fases permanece en la fase continua. La presente invención se refiere a composiciones de partículas pequeñas, de preferencia de una forma sustancialmente esférica, de un agente activo. Los agentes activos de preferencia son proteínas de alto peso molecular, y de una manera más preferible, son formas sustancialmente amorfas de proteínas de alto peso molecular, y muy preferiblemente son anticuerpos monoclonales sustancialmente amorfos. La invención tiene la capacidad para proporcionar composiciones de proteínas de alto peso molecular inyectables o que pueden pasar por jeringa, incluyendo anticuerpos monoclonales, en altas concentraciones, y de conformidad con lo anterior, proporciona la capacidad para suministrar una dosis clínicamente efectiva de estos agentes activos con un bajo volumen de composición, de preferencia con 10 mililitros o menos de composición, y de una manera muy preferible con un volumen típicamente encontrado en una jeringa convencional. Esta invención también contempla métodos de producción y métodos de uso de estas composiciones de partículas esféricas pequeñas de un agente activo. De acuerdo con el método de producción, el agente activo se disuelve en un solvente acuoso o miscible en agua que contiene un agente potenciador de la separación de fases (PSEA) disuelto, para formar una solución en una sola fase líquida. Entonces la solución se somete a una separación de fases líquida-sólida que tiene al agente activo comprendiendo la fase sólida, y al agente potenciador de la separación de fases y al solvente comprendiendo la fase líquida. La separación de fases líquida-sólida se puede inducir de numerosas maneras, tales como cambiando la temperatura de la solución o con adición de energía. El método es más adecuado para formar partículas esféricas pequeñas de agentes terapéuticos, que entonces se pueden suministrar a un sujeto que necesite el agente terapéutico. El método también es muy adecuado para formar partículas esféricas pequeñas sólidas de macromoléculas, en particular macromoléculas que son lábiles al calor, tales como las proteínas, incluyendo materiales de anticuerpos monoclonales. La invención tiene la capacidad para proporcionar macromoléculas que se pueden pasar por jeringa. El Agente Activo El agente activo de la presente invención es una proteína que puede ser un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. Los agentes activos preferidos son las proteínas de alto peso molecular. Los agentes preferidos son las formas amorfas de las proteínas, incluyendo los anticuerpos amorfos. Cuando se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" abarca a los anticuerpos monoclonales, a los anticuerpos policlonales, y a los fragmentos de anticuerpos, en especial a las fracciones de enlace de antígeno generalmente conocidas como fragmentos o regiones "Fab", anticuerpos de una sola cadena, así como anticuerpos monoclonales o policlonales u otros anticuerpos en una forma recombinante, y son lo que actualmente se reconoce en la técnica por la designación de "molécula de trampa". Los anticuerpos también se refieren a cualquiera de las formas de anticuerpos anteriormente mencionadas que sean tratadas, tal como mediante recubrimiento o encapsulación, incluyendo mediante los planteamientos descritos en la presente. Las moléculas de trampa se componen de fusiones entre dos componentes receptores distintos y una porción de una molécula de anticuerpo referida como la "región Fe", dando como resultado la generación del factor de crecimiento y bloqueadores de citoquina con una afinidad notoriamente incrementada sobre aquélla ofrecida por los reactivos de un solo componente. Las siguientes referencias proporcionan información adicional sobre las moléculas de trampa: "Cytokine Traps: Multi-Component, High- Affinity Blockers of Cytokine Action"; Economides AN, Carpenter L. R., Rudge J. S., Wong V., Koehler-Stec E. M., Hartnett C, Pyles E. A., Xu X., Daly T. J., Young M. R., Fandl J. P., Lee F., Carver S., McNay J., Bailey K., Ramakanth S5 Hutabarat R., Huang T. T., Radziejewski C, Yancopoulos G. D., Stahl N; Journal: Nat. Med. (2003); Volumen, (Número), Páginas: 9(1):47-52. "Vascular Endothelial Growth Factor-Trap Decreases Tumor Burden, Inhibits Ascites, and Causes Dramatic Vascular Remodeling in an Ovarían Cáncer Model"; Byrne A. T., Ross L., Holash J., Nakanishi M, Hu L., Hofmann J. I., Yancopoulos G. D., Jaffe R. B.; Journal: Clin. Cáncer Res. (2003); Volumen, (Número), Páginas: 15;9(15):5721-8. "Prevention of Thecal Angiogenesis, Antral Follicular Growth, and Ovulation ¡n the Primate by Treatment with Vascular Endothelial Growth Factor Trap R1R2"; Wulff C, Wilson H., Wiegand S. J., Rudge J. S., Fraser H. M.; Journal: Endocrinology (2002); Volumen, (Número), Páginas: 143(7):2797-807. En una modalidad preferida de la presente invención, el agente activo es un anticuerpo monoclonal, el cual puede ser natural o sintético. Los ejemplos de los anticuerpos monoclonales incluyen, pero no se limitan a: adalimutab (disponible en Abbot bajo el nombre comercial Humira), abciximab (disponible en Centocor bajo el nombre comercial ReoPro); daclizumab (disponible en Roche bajo el nombre comercial Zenapaz), tiruximab (disponible en IDEC/Genentech bajo el nombre comercial Rituxina o Rituxan), basiliximab (disponible en Novartis bajo el nombre comercial Simulect), palivzumab (disponible en Medimmune bajo el nombre comercial Synagis), infliximab (disponible en Centocor bajo el nombre comercial Remicade), trastuzumab (disponible en Genentech bajo el nombre comercial Herceptina), gemtuzumab (disponible en IDEC bajo el nombre comercial Mylotarg), alemzutumab (disponible en Milennium/ILEX bajo el nombre comercial Campath), e ibritumomab (disponible en IDEC bajo el nombre comercial Zevulina). El Líquido Gammagard (disponible en Baxter Healthcare Corporation, Westlake Village, CA) es una preparación líquida estéril lista para usarse de anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) altamente purificados y concentrados. Los ejemplos de las fracciones o regiones de anticuerpo "Fab" incluyen, pero no se limitan a, los siguientes. TGX-6B4, actualmente en desarrollo por ThromboGenics Ltd. de Dublín, Irlanda, es un anticuerpo para GP1b que inhibe la adhesión de las plaquetas, y se indica como un planteamiento novedoso para prevenir los primeros pasos en la trombosis arterial. Se ha reportado que los fragmentos Fab específicos de digoxina son benéficos en el tratamiento de envenenamiento por el veneno del sapo. (Heart. 2003; 89:12-472, Toxalert, 15: Edición 1, 1998). Se ha demostrado que los fragmentos Fab humanizados reconocen el dominio de enlace de IgE del Fc(épsilon)Rlalfa humano en células COS y CHO. (Journal Biochemistry, 2001: Volumen 129, Edición 1, 5-12). Otra información con respecto a la Radioinmunoterapia anti-tumoral utilizando fragmentos Fab' multivalentes se encuentra en el British Journal of Cáncer (1999) 81, 972-980. Los ejemplos de otras proteínas de alto peso molecular incluyen, pero no se limitan a, AAT, ADNsa, dismutasa de superóxido, subtilisina, y otras proteínas. Típicamente, el alto peso molecular indica una proteína que tiene pesos moleculares del orden de aproximadamente 25,000, dependiendo de las necesidades o propiedades particulares de la proteína, o de su uso pretendido. Las proteínas de más bajo peso molecular pueden beneficiarse de la invención hasta el grado en que las mismas necesiten administrarse, por ejemplo mediante inyección, en altas concentraciones. Estas proteínas se conocen en la técnica; ver, por ejemplo, la Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 10/894,410, presentada el 19 de julio de 2004, y 10/896,326 presentada el 21 de julio de 2004. Las micropartículas. partículas esféricas pequeñas. o microesferas Las micropartículas o las microesferas de la presente invención de preferencia tienen un tamaño de partícula geométrico promedio menor a 200 mieras, típicamente de aproximadamente 0.01 mieras a aproximadamente 200 mieras, normalmente no mayores de aproximadamente 50 mieras, más preferiblemente de 0.1 mieras a 10 mieras, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0.5 mieras a aproximadamente 5 mieras, y de una manera muy preferible de aproximadamente 0.5 mieras a aproximadamente 3 mieras, medidas mediante los métodos de dispersión de luz dinámica (por ejemplo, espectroscopia de fotocorrelación, difracción de láser, dispersión de luz de láser de ángulo bajo (LALLS), dispersión de luz de láser de ángulo medio (MALLS)), mediante métodos de oscurecimiento de luz (por ejemplo, método de análisis de Coulter), o mediante otros métodos, tales como reología o microscopía (de luz o de electrones).

Las partículas esféricas pequeñas o microesferas son sustancialmente esféricas. "Sustancialmente esférica" significa que la proporción de las longitudes de los ejes perpendiculares más largo al más corto de la sección transversal de la partícula son menores o iguales a aproximadamente 1.5. Sustancialmente esférica no requiere de una línea de simetría. Además, las partículas pueden tener texturización superficial, tales como líneas o indentaciones o protuberancias que sean de una escala pequeña cuando se comparen con el tamaño global de la partícula, y todavía son sustancialmente esféricas. De una manera más preferible, las proporciones de las longitudes entre los ejes más largo y más corto de la partícula es menor o igual a aproximadamente 1.33. Más preferiblemente, la proporción de las longitudes entre los ejes más largo y más corto de la partícula es menor o igual a aproximadamente 1.25. Se minimiza el contacto superficial en las microesferas que son sustancialmente esféricas, lo cual minimiza la aglomeración indeseable de las partículas sobre su almacenamiento. Muchos cristales u hojuelas tienen superficies planas que pueden permitir que se presenten grandes áreas de contacto superficial en donde se puede presentar aglomeración, mediante las interacciones iónicas o no iónicas. Una esfera permite el contacto sobre un área mucho más pequeña. Las micropartículas también tienen de preferencia sustancialmente el mismo tamaño de partículas. Las partículas que tienen una amplia distribución de tamaños, en donde hay partículas tanto relativamente grandes como pequeñas, permiten que las partículas más pequeñas rellenen los huecos entre las partículas más grandes, creando de esta manera nuevas superficies de contacto. Una amplia distribución de tamaños puede dar como resultado esferas más grandes mediante la creación de muchas oportunidades de contacto para la aglomeración de enlace. Estas micropartículas esféricas de la invención de preferencia están dentro de una distribución de tamaños estrecha, minimizando de esta manera las oportunidades de aglomeración por contacto. "Distribución de tamaños estrecha" significa que es una distribución de tamaños de partículas preferida que tiene una proporción del diámetro del volumen del 90° percentil de las partículas esféricas pequeñas al diámetro de volumen del 10° percentil menor o igual a 5. De una manera más preferible, el diámetro de volumen del 90° percentil de las partículas esféricas pequeñas al diámetro de volumen del 10° percentil es menor o igual a 3. Más preferiblemente, la proporción del diámetro de volumen del 90° percentil de las partículas esféricas pequeñas al diámetro de volumen del 10° percentil es menor o igual a 2. También se puede utilizar la Desviación Estándar Geométrica (GSD) para indicar la distribución de tamaños estrecha. Los cálculos de la Desviación Estándar Geométrica involucraron la determinación del diámetro de corte efectivo (ECD) en el menor acumulativo que los porcentajes del 15.9 por ciento y el 84.1 por ciento. La Desviación Estándar Geométrica es igual a la raíz cuadrada de la proporción del diámetro de corte efectivo menor que el 84.17 por ciento al diámetro de corte efectivo menor que el 15.9 por ciento. La Desviación Estándar Geométrica tiene una distribución de tamaños estrecha cuando GSD <2.5, más preferiblemente menor que 1.8. En una forma preferida de la invención, el agente activo en la micropartícula o microesfera es semi-cristalino o no cristalino, o sustancialmente amorfo. Las microesferas de preferencia están comprendidas de agentes activos que son sustancialmente amorfos o no cristalinos, es decir, están en una forma amorfa o semi-cristalina. Como se utiliza en la presente, "amorfa" se refiere a una forma sólida generalmente aleatoria del agente activo, en donde las celosías cristalinas de las proteínas u otros agentes activos dentro de la microesfera están ausentes, y "semi-cristalina" se refiere a una forma sólida generalmente aleatoria de los agentes activos, en donde el contenido de agente activo de la microesfera está comprendido de menos del 50 por ciento de las formas de la celosía cristalina de los agentes activos. Típicamente, las micropartículas o microesferas son sustancialmente no porosas, y tienen una densidad mayor a 0.5 gramos/centímetro cúbico, más preferiblemente mayor a 0.75 gramos/centímetro cúbico, y de una manera muy preferible mayor a aproximadamente 0.85 gramos/centímetro cúbico. Un intervalo preferido para la densidad es de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2 gramos/centímetro cúbico, y más preferiblemente de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 1.75 gramos/centímetro cúbico, y todavía de una manera muy preferible de aproximadamente 0.85 gramos/centímetro cúbico a aproximadamente 1.5 gramos/centímetro cúbico. Las micropartículas sustancialmente amorfas o no cristalinas de acuerdo con la invención, son más fácilmente solubles, o exhiben un índice de disolución más rápido que las micropartículas que no están así constituidas, tales como las micropartículas cristalinas. Las micropartículas o microesferas de la presente invención pueden exhibir un alto contenido del agente activo. No hay requerimiento alguno de una cantidad significativa de agentes de volumen o excipientes similares que son requeridos por muchos otros métodos para la preparación de micropartículas, aunque se pueden incluir materiales en adición al agente activo según se desee, para lograr un objetivo u objetivos particulares. Por ejemplo, en muchas aplicaciones, las microesferas comprenden igual o más del 95 por ciento en peso de las partículas. Típicamente, el agente activo está presente en de aproximadamente el 20 por ciento al 100 por ciento en peso de la partícula, de preferencia en de aproximadamente el 50 por ciento a aproximadamente el 100 por ciento en peso, más preferiblemente en de aproximadamente el 80 por ciento a aproximadamente el 100 por ciento en peso, y todavía de una manera muy preferible en de aproximadamente el 90 por ciento a aproximadamente el 100 por ciento en peso. Cuando se mencionan los intervalos en la presente, esto significa que incluyen cualquier intervalo o combinación de intervalos en los mismos. Un aspecto adicional de la presente invención es que las micropartículas o microesferas retienen la integridad bioquímica y la actividad biológ ica del agente activo con o sin la inclusión de excipientes. S um inistro de las Partículas in vivo Las micropartículas, pequeñas partículas esféricas, o microesferas que contienen al agente activo de la presente invención , son adecuadas para su suministro in vivo a un sujeto que necesite el agente, por una vía i nyectable . U na vía de suministro preferida es inyectable, la cual incluye intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal , intratecal , epid ural, intra-arterial , intra-articular, y similares. Se podrían practicar otras vías de suministro, tales como tópica, oral, rectal, nasal , pulmonar, vaginal , bucal, subling ual , transdérmica, transmucosa, ótica , o i ntraocular, pero típicamente las ventajas de la invención son más evidentes para las aplicaciones med iante inyección. Para el propósito de esta invención , se prefiere más la vía de sumi nistro por jeringa . Más importante, las micropartículas o microesferas se pueden aspirar en una jeringa , y se pueden inyectar a través de ag ujas finas, a pesar del alto peso molecular de las proteínas o de los agentes activos. U na vía de suministro preferida es la inyección con u na aguja fina , la cual incluye subcutánea , ocular, y simi lares. Una aguja fina significa las agujas de cuando menos un tamaño calibre 20, normalmente entre aproximadamente un calibre 22 y aproximadamente un calibre 30 y mayor. De una manera conveniente, las agujas finas pueden ser cuando menos tan finas como de un calibre 24, más convenientemente cuando menos tan finas como de un calibre 26, y todavía de una manera muy conveniente cuando menos tan finas como de un calibre 28. Las micropartículas o microesferas se pueden inyectar en una concentración de cuando menos aproximadamente 50 miligramos de proteína por mililitro de la composición que se esté inyectando. Por ejemplo, se pueden inyectar de aproximadamente 100 a aproximadamente 800 miligramos de proteína en un volumen de suministro si no es mayor de aproximadamente 10 mililitros, y usualmente de cuando menos aproximadamente 2 mililitros para muchas aplicaciones. También, el suministro se hace durante los períodos de tiempo, de las inyecciones normales. Típicamente, estos períodos de tiempo no son mayores de aproximadamente 20 segundos o menos. El presente método para la formación de partículas, como se estipula en la presente, proporciona la formación de partículas con o sin excipientes u otros componentes o aditivos, según sean deseados o requeridos. La fabricación de micropartículas o microesferas de proteína a partir de la proteína misma, sin aditivos, también es un planteamiento de conformidad con la invención, y en su momento, proporciona ventajas superiores para su uso. Métodos para Fabricar Micropartículas La Fase Continua El método de la presente invención para preparar micropartículas o microesferas de un agente activo empieza proporcionan una solución que tenga al agente activo, y un agente potenciador de la separación de fases disuelto en un primer solvente en una sola fase líquida. La solución puede ser un sistema orgánico que comprenda un solvente orgánico o una mezcla de solventes orgánicos miscibles. La solución también puede ser una solución basada en agua que comprenda un medio acuoso o un solvente orgánico miscible en agua, o una mezcla de solventes orgánicos miscibles en agua, o combinaciones de los mismos. El medio acuoso puede ser agua, suero normal, soluciones con el pH regulado, suero con el pH regulado, y similares. Los solventes orgánicos miscibles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, N-metil-2-pirrolidinona (N-metil-2-pirrolidona), 2-pirrolidinona (2-pirrolidona), 1 ,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMI), sulfóxido de dimetilo, dimetil-acetamida, ácido acético, ácido láctico, acetona, metil-etil-cetona, acetonitrilo, metanol, etanol, isopropanol, 3-pentanol, propanol normal, alcohol bencílico, glicerol, tetrahidrofurano (THF), polietilenglicol (PEG), PEG-4, PEG-8, PEG-9, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-120, PEG-75, PEG-150, esteres de polietilenglicol, dilaurato de PEG-4, dilaurato de PEG-20, isoestearato de PEG-6, palmitoestearato de PEG-8, palmitoestearato de PEG-150, sorbitanes de polietilenglicol, isoestearato de sorbitán de PEG-20, monoalquil-éteres de polietilenglicol, dimetil-éter de PEG-3, dimetil-éter de PEG-4, polipropilenglicol (PPG), alginato de polipropileno, butanodiol de PPG-10, metil-glucosa-éter de PPG-10, metil-glucosa-éter de PPG-20, estearil-éter de PPG-15, dicaprilato-dicaprato de propilenglicol, laurato de propilenglicol, y glicofurol (polietilen-glicol-éter de alcohol tetrahidrofurfurílico), alcanos, incluyendo propano, butano, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, o una combinación de los mismos. La única fase continua se puede preparar proporcionando primero una solución del agente potenciador de la separación de fases, el cual es soluble en, o miscible con, el primer solvente. Esto es seguido por la adición del agente activo a la solución. El agente activo se puede agregar directamente a la solución, o el agente activo se puede disolver primero en un segundo solvente, y luego se agregan juntos a la solución. El segundo solvente puede ser el mismo solvente que el primer solvente, o puede ser otro solvente seleccionado a partir de la lista anterior, y que sea miscible con la solución. Se prefiere que el agente activo se agregue a la solución a temperatura ambiente o más baja, lo cual es importante particularmente para las moléculas lábiles al calor, tales como ciertas proteínas. "Temperatura ambiente" significa una temperatura de alrededor de la temperatura de la habitación, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C. Sin embargo, el sistema también se puede calentar para aumentar la solubilidad del agente activo en el sistema, siempre que el calentamiento no provoque una reducción significativa en la actividad del agente. El Agente Potenciador de la Separación de Fases El agente potenciador de la separación de fases (PSEA) de la presente invención, potencia o induce la separación de fases líquida-sólida del agente activo a partir de la solución, cuando se somete a la solución al paso de separación de fases, en donde el agente activo se hace sólido o semi-sólido para formar una suspensión de pequeñas partículas esféricas como una fase discontinua, mientras que el agente potenciador de la separación de fases permanece disuelto en la fase continua. El agente potenciador de la separación de fases reduce la solubilidad del agente activo cuando se lleva la solución hasta las condiciones de separación de fases. Los agentes potenciadores de la separación de fases adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros o mezclas de polímeros que sean solubles o miscibles con la solución. Los ejemplos de los polímeros adecuados incluyen los polímeros lineales o ramificados, copolímeros, y copolímeros de bloques. Estos polímeros pueden ser solubles en agua, semi-solubles en agua, miscibles con agua, o insolubles. En una forma preferida de la invención, el agente potenciador de la separación de fases es soluble en agua o miscible con agua. Los tipos de polímeros que se pueden utilizar incluyen los polímeros basados en carbohidratos, los poli-alcoholes alifáticos, polímeros de poli-(vinilo), poli-ácidos acrílicos, poli-ácidos orgánicos, poli-aminoácidos, co-polímeros y co-polímeros de bloques (por ejemplo, Poloxámeros, tales como Pluronic F127 ó F68), terpolímeros, poliéteres, polímeros que se presentan naturalmente, poli-imidas, tensoactivos, poliésteres, polímeros ramificados y ciclo-polímeros, y polialdehídos. Los polímeros preferidos son aquéllos que sean aceptables como aditivos farmacéuticos para la vía de administración pretendida de las partículas de agente activo. Los polímeros preferidos son los aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como polietilenglicol (PEG) de diferentes pesos moleculares, tales como PEG 200, PEG 300, PEG 3350, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, etc., y Poloxámeros de diferentes pesos moleculares, tales como Poloxámero 188 y Pluronic F127 ó Pluronic F68. Todavía otro polímero preferido es la polivinil-pirrolidona (PVP). Todavía otro polímero preferido es el almidón de hidroxi-etilo. Otros polímeros anfifílicos se pueden utilizar también solos o en combinaciones. El agente potenciador de la separación de fases también puede ser un no polímero, tal como una mezcla de propilenglicol y etanol. Separación de Fases Líquida-Sólida Se puede inducir una separación de fases líquida-sólida del agente activo en la solución mediante cualquier método conocido en la materia, tal como un cambio en la temperatura (ya sea elevándola o reduciéndola), un cambio en la presión, un cambio en el pH, un cambio en la concentración iónica de la solución, un cambio en la concentración del agente activo, un cambio en la concentración del agente potenciador de la separación de fases, un cambio en la osmolaridad de la solución, combinaciones de los mismos, y similares. En una modalidad preferida de la presente invención, el cambio de fase es un cambio de fase inducido por la temperatura. En muchas modalidades, el cambio de fase inducido por la temperatura se efectúa reduciendo la temperatura debajo de la temperatura de transición de fases del agente activo en la solución. La Figura 1 es un diagrama de fases bidimensional 10 para la solución que contiene solvente, un agente potenciador de la separación de fases, y un agente activo. El diagrama gráfica la concentración del agente activo contra la temperatura de la solución. La concentración del agente potenciador de la separación de fases se mantiene constante. El diagrama de la Figura 1 tiene una curva de saturación 12; una curva de súper-saturación 14; un área metaestable 16 entre las mismas; una primera área 18 debajo de la curva de saturación, en donde el sistema está en una sola fase líquida homogénea, en donde todos los componentes están en la fase líquida; y una segunda área 20 arriba de la curva de súper-saturación, en donde el sistema es un sistema de dos fases que tiene una fase sólida del agente activo y una fase líquida del agente potenciador de la separación de fases y solvente. El diagrama de fases es útil para determinar la temperatura del sistema y la concentración relativa de los componentes en la fase líquida pura, en la fase líquida-sólida, y en las condiciones circundantes a la transición entre estas dos fases. Como se da a conocer en la presente, la preparación de micropartículas o microesferas del agente activo involucra principalmente el enfriamiento a partir de una solución sub-saturada (punto A' en la Figura 1), alcanzando la saturación en el punto A, en donde la solución está en equilibrio con cualquier fase sólida que pueda estar presente. Con un enfriamiento adicional, se alcanza un estado en donde la solución contiene más agente activo que aquél correspondiente a la solubilidad en equilibrio a la temperatura dada; de esta manera, la solución llega a súper-saturarse. La formación espontánea de la fase-sólida no se presenta sino hasta que se alcanza el punto B. El punto B es un punto sobre el límite de la zona metaestable. La anchura de la zona metaestable se puede expresar ya sea mediante el sub-enfriamiento máximo que se pueda obtener ?Tmax = T2-T?, o mediante la súper-saturación ?Cmax=C*2-C*?. Estas dos expresiones son termodinámicamente equivalentes: ?Cmax=C*2-C*1 = j( dC* )dT =. ?Tmax ( dCl ) Ti 3T dT La trayectoria A'-A-B representa un método politérmico para la preparación de una solución metaestable. En un proceso isotérmico, el punto inicial sería A". Mediante el aumento de la concentración a una temperatura constante, nuevamente se alcanzará la saturación en el punto A. Un aumento isotérmico en la concentración (mediante evaporación del solvente o mediante siembra/adición del agente activo, por ejemplo) hasta el punto C, hará que la solución se mueva hasta la región metaestable, hasta que nuevamente se alcance el límite de metaestabilidad. Cuando se excede el límite metaestable, la solución se hace inestable, y se presenta inmediatamente una formación espontánea de la fase sólida. El valor (?Cmax)t=C*3-C*2 obtenido isotérmicamente, puede ser d iferente del valor correspond iente de ?Tma x=T2-T2 obtenido politérmicamente. A medida que se aproxima el l ímite de la zona metaestable, dismi nuye el tiempo necesario para la formación de la partícula sólida , hasta que se alcance el l ímite metaestable. En el proceso politérmico, la velocidad de enfriamiento se hace a una velocidad controlada para controlar el ta maño y la forma de las partículas. U na velocidad controlada significa de aproximadamente 0.2°C/minuto a aproximadamente 50°C/minuto, y más preferiblemente de 0.2°C/minuto a 30°C/minuto. La velocidad de cambio puede ser una velocidad constante o lineal , una velocidad no lineal , intermitente, o una velocidad programada (que tenga múlti ples ciclos de fases). Las partículas se pueden separar del agente potenciador de la separación de fases en la solución , y se pueden purificar lavándolas, como se describe más adelante. La presente invención contempla el ajuste de la concentración del agente activo, la concentración del agente potenciador de la separación de fases, la temperatura , o cualquier combinación de las mismas, para provocar un cambio de fase en donde el agente activo pase desde un estado l íquido hasta un estado sólido, mientras que el agente potenciador de la separación de fases y el solvente no pasen por un cambio de fase y permanezca n como l íquidos. También se contempla el cambio del pH , de la concentración iónica , de la osmolaridad , y similares, para potenciar, promover, controlar, o suprimir el cambio de fase. Para las soluciones en donde el punto de congelación es relativamente alto, o el punto de congelación está arriba de la temperatura de transición de fase, las soluciones pueden incluir un agente depresor del punto de congelación, tal como propilenglicol, sacarosa, etilenglicol, alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol), o mezclas acuosas de agentes de depresión del punto de congelación, para reducir el punto de congelación del sistema con el fin de permitir el cambio de fase en el sistema sin que se congele el sistema. El proceso también se puede llevar a cabo de tal manera que se reduzca la temperatura debajo del punto de congelación del sistema. El proceso descrito en la presente es particularmente adecuado para las moléculas que sean lábiles al calor (por ejemplo, proteínas). Excipientes Opcionales Las micropartículas de la presente invención pueden incluir uno o más excipientes. El excipiente puede imbuir al agente activo o a las micropartículas con características adicionales, tales como una mayor estabilidad de las micropartículas o de los agentes activos o de los agentes portadores, liberación controlada del agente activo a partir de las micropartículas, o permeación modificada del agente activo a través de los tejidos biológicos. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos (por ejemplo, trehalosa, sacarosa, manitol), cationes (por ejemplo, Zn2+, Mg2+, Ca2+), aniones (por ejemplo, S02"), aminoácidos (por ejemplo glicina), lípidos, fosfolípidos, ácidos grasos, tensoactivos, triglicéridos, ácidos biliares o sus sales (por ejemplo, colato o sus sales, tales como colato de sodio; ácido desoxicólico o sus sales), esteres de ácidos grasos, y polím eros presentes en niveles debajo de su fu ncionam iento com o agentes potenciadores de la separación de fases . C ua ndo se utiliza u n excipiente, el excipiente no afecta de u na m anera sig n ificativa al d iag ram a de fases de la solución . Separación y Lavado de las Partícu las En una modalidad preferida de la presente invención , las micropartículas o microesferas se cosechan mediante su separación del agente potenciador de la separación de fases en la solución. En todavía otra modalidad preferida , el método de separación es mediante el lavado de la solución que contiene a las micropartículas o microesferas, con un medio l íquido en donde no sea soluble el agente activo en el medio l íq uido, mientras q ue el agente potenciador de la separación de fases sea soluble en el medio l íquido. Algunos métodos de lavado pueden ser mediante diafiltración o mediante centrifugación. El medio l íquido puede ser un medio acuoso o un solvente orgánico. Para los agentes activos con u na baja solubilidad en agua, el medio l íquido puede ser un medio acuoso, o un medio acuoso q ue contenga agentes q ue reduzcan ia solubilidad en agua del agente activo, tales como cationes divalentes. Para los agentes activos con una alta solubilidad en agua, tales como muchas proteínas, se puede utilizar un solvente orgánico o un solvente acuoso que contenga un agente precipitador de proteína , tal como sulfato de amonio. En una modalidad preferida de la presente invención , las micropartículas o microesferas se cosechan mediante su separación del agente potenciador de la separación de fases en la solución. En todavía otra modalidad preferida, el método de separación es mediante el lavado de la solución que contenga las micropartículas o microesferas, con un medio líquido en donde el agente activo no sea soluble en el medio líquido, mientras que el agente potenciador de la separación de fases sea soluble en el medio líquido. Algunos métodos de lavado pueden ser mediante diafiltración o mediante centrifugación. El medio líquido puede ser un medio acuoso o un solvente orgánico. Para los agentes activos con una baja solubilidad en agua, el medio líquido puede ser un medio acuoso, o un medio acuoso que contenga al agente que reduzca la solubilidad en agua del agente activo, tal como cationes divalentes. Para los agentes activos con una alta solubilidad en agua, tales como muchas proteínas, se puede utilizar un solvente orgánico o un solvente acuoso que contenga un agente precipitador de proteína, tal como sulfato de amonio. Los ejemplos de los solventes orgánicos adecuados para utilizarse como el medio líquido incluyen los solventes orgánicos especificados anteriormente como adecuados para la fase continua, y más preferiblemente cloruro de metileno, cloroformo, acetonitrilo, acetato de etilo, metanol, etanol, pentano, y similares. También se contempla utilizar mezclas de cualquiera de estos solventes. Una mezcla preferida es el cloruro de metileno, o una mezcla de 1:1 de cloruro de metileno y acetona. Se prefiere que el medio líquido tenga un bajo punto de ebullición para su fácil remoción mediante, por ejemplo, liofilización, evaporación, o secado. El medio líquido también puede ser un fluido súper-crítico, tal como dióxido de carbono líquido, o un fluido cerca de su punto súper-crítico. Los fluidos súper-críticos pueden ser solventes adecuados para los agentes potenciadores de la separación de fases, en particular algunos polímeros, pero son no solventes para las partículas de proteína. Los fluidos súper-críticos se pueden utilizar por sí mismos o con un co-solvente. Se pueden utilizar los siguientes fluidos súper-críticos: C02 líquido, etano, o xenón. Los co-solventes potenciales pueden ser acetonitrilo, dicloro-metano, etanol, metanol, agua, o 2-propanol. El medio líquido utilizado para separar las micropartículas o microesferas del agente potenciador de la separación de fases descrito en la presente, puede contener un agente que reduzca la solubilidad del agente activo en el medio líquido. Es más deseable que las partículas exhiban una solubilidad mínima en el medio líquido para maximizar el rendimiento de las micropartículas o microesferas. Para algunas proteínas, tales como insulina, se puede lograr la disminución en la solubilidad mediante la adición de cationes divalentes, tales como Zn2+ a la proteína. Otros iones que se pueden utilizar para formar complejos incluyen, pero no se limitan a, Ca2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, y similares. La solubilidad de los complejos es suficientemente baja para permitir la diafiltración del complejo en una solución acuosa. El medio líquido también puede contener uno o más excipientes, los cuales pueden imbuir al agente activo o a las micropartículas con características adicionales, tales como una mayor estabilidad de las micropartículas y/o del agente activo o del agente portador, una liberación controlada del agente activo a partir de las partículas, o una permeación modificada del agente activo a través de los tejidos biológicos, como se describió anteriormente. En otra forma de la invención, las micropartículas o microesferas no se separan de la solución que contiene al agente potenciador de la separación de fases. Proceso Basado en Agua En otra modalidad preferida, el proceso de fabricación del presente sistema es de un sistema acuoso que incluye un solvente acuoso o un solvente miscible en agua. Los ejemplos de los solventes miscibles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, los identificados anteriormente para la fase continua. Una ventaja de utilizar un proceso basado en agua, es que la solución se puede regular y puede contener excipientes que proporcionen estabilización bioquímica para proteger a los agentes activos. Esto puede ser especialmente conveniente cuando el agente activo es una proteína. Microensapculación de las micropartículas pre-fabricadas Las micropartículas o microesferas de la presente invención se pueden encapsular adicionalmente dentro de matrices de materiales formadores de pared, para formar partículas microencapsuladas. La microencapsulación se puede llevar a cabo mediante cualquier proceso conocido en la técnica. En una modalidad preferida, la microencapsulación de las micropartículas o microesferas de la presente invención se lleva a cabo mediante un proceso de emulsión/extracción con solvente, como se describe más adelante. La matriz puede impartir propiedades de liberación sostenida al agente activo, dando como resultado velocidades de liberación que persistan desde minutos hasta horas, días, o semanas, de acuerdo con las aplicaciones terapéuticas deseadas. Las micropartículas o microesferas microencapsuladas, también pueden producir formulaciones de liberación demorada del agente activo. En esta solicitud se estipulan métodos adicionales para hacer micropartículas y microesferas. En el proceso de emulsión/extracción con solvente, se obtiene la emulsión mezclando dos fases inmiscibles, la fase continua y la fase discontinua (la cual también se conoce como la fase dispersada), para formar una emulsión. En una modalidad preferida, la fase continua es una fase acuosa (o la fase de agua), y la fase discontinua es una fase orgánica (o la fase de aceite), para formar una emulsión de aceite en agua (O/W). La fase discontinua puede contener además una dispersión de partículas sólidas presentes ya sea como una suspensión fina, o bien como una dispersión fina, formando una fase de sólido en aceite (S/O). La fase orgánica de preferencia es un solvente orgánico inmiscible en agua o un solvente orgánico parcialmente miscible en agua. La proporción en peso de la fase orgánica a la fase acuosa es de aproximadamente 1:99 a aproximadamente 99:1, más preferiblemente de 1:99 a aproximadamente 40:60, y de una manera muy preferiblemente de aproximadamente 2:98 a aproximadamente 1:3, o cualquier intervalo o combinación de intervalos en los mismos. En una modalidad preferida, la proporción de la fase orgánica a la fase acuosa es de aproximadamente 1:3. Este aspecto de la presente invención contempla además utilizar emulsiones inversas o una emulsión de agua en aceite (W/O), en donde la fase de aceite forme la fase continua, y la fase de agua forme la fase discontinua. Esto contempla además la utilización de emulsiones que tengan más de dos fases, tales como una emulsión de aceite en agua en aceite (O/W/O), o una emulsión de agua en aceite en agua (W/O/W). En una modalidad preferida de esta variación de la invención, el proceso de microencapsulación utilizando el proceso de emulsión/extracción con solvente, empieza con la preparación de micropartículas o microesferas pre-fabricadas, mediante los métodos descritos anteriormente, y una fase orgánica que contenga al material formador de pared. Las micropartículas o microesferas prefabricadas se dispersan en la fase orgánica del material formador de pared, para formar una fase de sólido en aceite (S/O) que contenga una dispersión de las micropartículas o microesferas pre-fabricadas en la fase de aceite. En una modalidad preferida, la dispersión se lleva a cabo homogeneizando la mezcla de las micropartículas o microesferas y la fase orgánica. Un medio acuoso formará la fase continua. En este caso, el sistema de emulsión formado mediante la emulsión de la fase de sólido en aceite con una fase acuosa, es un sistema de emulsión de sólido en aceite en agua (S/O/W). El material formador de pared se refiere a los materiales capaces de formar la entidad estructural de la matriz individualmente o en combinación. Se prefieren los materiales formadores de pared biodegradables, en especial para las aplicaciones inyectables. Los ejemplos de estos materiales incluyen, pero no se limitan a, la familia de polímeros de poli-láctido/poli-glicólido (PLGA), polímeros de poli-láctido/poli-glicólido conjugados con polietilenglicol (PLGA-PEG), y triglicéridos. En la modalidad en donde se utiliza el polímero de poli-láctico/poli-glicólido, o el polímero de poli-láctico/poli-g I ico lid o conjugado con polietilenglicol, el polímero de poli-láctido/poli-glicólido de preferencia tiene una proporción del poli-láctido al poli-g licólido de 100:0 a 0:100, más preferiblemente de aproximadamente 90:10 a aproximadamente 15:85, y muy preferiblemente de aproximadamente 50:50. En general, mientras más alta sea la proporción del p oli-g I ico I id o al pol i-láctid o en el polímero, más hidrofílicas serán las partículas microencapsuladas, dando como resultado una hidratación más rápida y una degradación más rápida. También se pueden emplear diferentes pesos moleculares del polímero de poli-láctido/poli-glicólido. En general, para la misma proporción de poli-g licólido y poli-láctido en el polímero, mientras más alto sea el peso molecular del polímero de poli-láctido/poli-glicólido, más lenta será la liberación del agente activo, y más amplia la distribución de tamaños de las partículas o esferas microencapsuladas.

Cuando se practica la microencapsulación, el solvente orgánico en la fase orgánica (fase de aceite) de una emulsión de aceite en agua (O/W) o de sólido en aceite en agua (S/O/W) puede ser inmiscible en agua o parcialmente inmiscible en agua. "Solventes inmiscibles en agua" significan los solventes que forman un menisco interfacial cuando se combinan con una solución acuosa en una proporción de 1:1 (aceite en agua). Los solventes inmiscibles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a, alcanos lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o insustituidos, con un número de átomos de carbono de 5 ó mayor; alquenos lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o insustituidos, con un número de átomos de carbono de 5 ó mayor; alquinos lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o insustituidos, con un número de átomos de carbono de 5 ó mayor; hidrocarburos aromáticos completamente o parcialmente halogenados, éteres, esteres, cetonas, mono-, di-, ó tri-glicéridos, aceites nativos, alcoholes, aldehidos, ácidos, aminas, siliconas lineales o cíclicas, hexametil-disiloxano, o cualquier combinación de estos solventes. Los solventes halogenados incluyen, pero no se limitan a, tetracloruro de carbono, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloro-etileno, tricloro-etileno, tricloro-etano, hidrofluoro-carbonos, benceno clorado (mono, di, tri), tricloro-fluoro-metano. Los solventes particularmente adecuados son cloruro de metileno, cloroformo, dietil-éter, tolueno, xileno, y acetato de etilo. "Solventes parcialmente miscibles en agua" significan los solventes que son inmiscibles en agua en una concentración, y miscibles en agua en otra concentración más baja. Estos solventes son de una miscibilidad en agua limitada, y son capaces de tener una formación de emulsión espontánea. Los ejemplos de los solventes parcialmente miscibles en agua son tetrahidrofurano (THF), carbonato de propileno, alcohol bencílico, y acetato de etilo. Se puede agregar un compuesto de actividad superficial en relación con el aspecto de la microencapsulación, por ejemplo, para aumentar las propiedades humectantes de la fase orgánica. El compuesto de actividad superficial se puede agregar antes del proceso de emulsión a la fase acuosa, a la fase orgánica, a tanto el medio acuoso como la solución orgánica, o después del proceso de emulsión para la emulsión. El uso de un compuesto de actividad superficial puede reducir el número de partículas esféricas pequeñas no encapsuladas o parcialmente encapsuladas, dando como resultado una reducción de la ráfaga inicial del agente activo durante la liberación. El compuesto de actividad superficial se puede agregar a la fase orgánica, o a la fase acuosa, o tanto a la fase orgánica como a la fase acuosa, dependiendo de la solubilidad del compuesto.

El término "compuestos de actividad superficial" significa los compuestos tales como un tensoactivo aniónico, un tensoactivo catiónico, un tensoactivo zwiteriónico, un tensoactivo no iónico, o una molécula de actividad superficial biológica. El compuesto de actividad superficial debe estar presente en una cantidad en peso de la fase acuosa o la fase orgánica o la emulsión, cualquiera que pueda ser el caso, desde menos de aproximadamente el 0.01 por ciento hasta aproximadamente el 30 por ciento, más preferiblemente desde aproximadamente el 0.01 por ciento hasta aproximadamente el 10 por ciento, o cualquier intervalo o combinación de intervalos en los mismos. Los tensoactivos aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a: laurato de potasio, lauril-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de sodio, sulfatos de alquil-polioxietileno, alginato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio, fosfatidil-colina, fosfatidil-glicerol, fosfatidil-inosina, fosfatídil-serina, ácido fosfatídico y sus sales, gliceril-ésteres, carboxi-metil-celulosa de sodio, ácido cólico y otros ácidos biliares (por ejemplo, ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido giicodesoxicólico) y sales de los mismos (por ejemplo, desoxicolato de sodio, etc.). Los tensoactivos catiónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, compuestos de amonio cuaternario, tales como cloruro de benzalconio, bromuro de cetil-trimetil-amonio, cloruro de lauril-dimetil-bencil-amonio, clorhidratos de acil-carnitina, o haluros de alquil-piridinio. Como los tensoactivos aniónicos, se pueden utilizar fosfolípidos. Los fosfolípidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfatidil-colina, fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-serina, fosfatidil-inositol, fosfatidil-glicerol, ácido fosfatídico, lisofosfolípidos, fosfolípido de huevo o de semilla de soya, o una combinación de los mismos. El fosfolípido puede ser salado o desalado, hidrogenado o parcialmente hidrogenado, o natural, semisintético, o sintético. Los tensoactivos no iónicos adecuados incluyen: éteres de alcoholes grasos de polioxietileno (Macrogol y Brij), esteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno (Polisorbatos), esteres de ácidos grasos de polioxietileno (Myrj), esteres de sorbitán (Span), monoestearato de glicerol, polietilenglicoles, polipropilenglicoles, alcohol cetílico, alcohol cetoestearílico, alcohol estearílico, poliéter-alcoholes aril-alq uíiicos, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno (poloxomeros), polaxaminas, poli-alcohol vinílico, polivinil-pirrolidona, y polisacáridos (incluyendo almidón y derivados de almidón, tales como almidón de hidroxi-etilo (HES), metil-celulosa, hidroxi-celulosa, hidroxi-propil-celulosa, hidroxi-propil-metil-celulosa, y celulosa no cristalina). En una forma preferida de la invención, el tensoactivo no iónico es un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno, y de preferencia un copolímeros de bloques de propilenglicol y etilenglicol. Estos polímeros se venden bajo el nombre comercial POLOXAMER, también algunas veces referidos como PLURONIC®, y vendidos por varios proveedores, incluyendo Spectrum Chemical and Ruger. Entre los esteres de ácidos grasos de polioxietileno, se incluyen aquéllos que tienen cadenas de alquilo cortas. Un ejemplo de este tensoactivo es SOLUTOL® HS 15, hidroxiestearato de polietileno-660, fabricado por BASF Aktiengesellschaft. Las moléculas biológicas de actividad superficial incluyen moléculas tales como albúmina, caseína, heparina, hirudina, heta-almidón, u otros agentes biocompatibles apropiados. En una forma preferida de la opción de microencapsulación de la invención, la fase acuosa incluye una proteína como el compuesto de actividad superficial. Una proteína preferida es la albúmina. La proteína también puede funcionar como un excipiente. En las modalidades en donde la proteína no es el compuesto de actividad superficial, se pueden incluir otros excipientes en la emulsión, agregándose ya sea antes o después del proceso de emulsión. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sacáridos, disacáridos, y alcoholes de azúcar. Un disacárido preferido es sacarosa, y un alcohol de azúcar preferido es manitol. En adición, el uso de agentes de canalización, tales como polietilenglicol (PEG), puede aumentar el índice de permeación de agua del producto final, lo cual da como resultado la modificación de la cinética de liberación inicial del agente activo a partir de una matriz, cuando está presente una matriz, así como el índice de degradación de la matriz y la cinética de liberación dependiente de la degradación, mediante la modificación del índice de hidratación. La utilización de polietilenglicol como el agente de canalización durante la encapsulación puede ser conveniente en términos de eliminar partes del proceso de lavado durante la fabricación de las pequeñas partículas esféricas en donde se utiliza polietilenglicol como el agente potenciador de la separación de fases. En adición, se pueden variar la salinidad y el pH de la fase continua para afectar las propiedades del polímero y las micropartículas o microesferas resultantes, incluyendo la densidad de empaque de matriz, la carga superficial, la humectación, la porosidad, la viscosidad, la distribución de tamaños de partículas, así como la ráfaga inicial y la cinética de liberación del agente terapéutico encapsulado a partir de la matriz. También se puede utilizar la salinidad de la fase continua para reducir la miscibilidad de las dos fases. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de fosfato, sulfato, acetato y carbonato solubles en agua, Tris, MES, HEPES. En la modalidad en donde se utiliza la sal, la concentración de sal está en el intervalo de 0 a 10 M, más preferiblemente de 1 mM a 1 M, y de una manera muy preferible de 20 a 200 mM. El pH está en el intervalo de 1 a 11, más preferiblemente de 2.5 a 9, y de una manera muy preferible de 6 a 8. Después de dispersar las micropartículas o microesferas en la fase orgánica (fase de aceite), entonces se mezcla vigorosamente la fase continua del medio acuoso (fase de agua), por ejemplo mediante homogeneización o sonicación, con la fase discontinua de la fase orgánica para formar una emulsión que contenga gotitas emulsionadas de partículas microencapsuladas embrionarias. La fase acuosa continua se puede saturar con el solvente orgánico utilizado en la fase orgánica antes de mezclar la fase acuosa y la fase orgánica, con el objeto de minimizar la extracción rápida del solvente orgánico a partir de las gotitas emulsionadas. El proceso de emulsión, cuando se practica, se puede llevar a cabo a cualquier temperatura en la que la mezcla pueda mantener sus propiedades líquidas. La estabilidad de la emulsión es una función de la concentración del compuesto de actividad superficial en la fase orgánica o en la fase acuosa, o en la emulsión, si se agrega el compuesto de actividad superficial a la emulsión después del proceso de emulsión. Éste es uno de los factores que determina el tamaño de la gotita del sistema de emulsión (partículas microencapsuladas embrionarias), y el tamaño y la distribución de tamaños de las partículas microencapsuladas. Otros factores que afectan a la distribución de tamaños de las partículas microencapsuladas son la viscosidad de la fase continua, la viscosidad de la fase discontinua, las fuerzas de desgarre durante la emulsión, el tipo y concentración de compuesto de actividad superficial, y la proporción de aceite/agua. Después de la emulsión, entonces se transfiere la emulsión hacia un medio endurecedor. El medio endurecedor extrae el solvente en la fase discontinua a partir de las partículas microencapsuladas embrionarias, dando como resultado la formación de partículas microencapsuladas sólidas que tienen una matriz polimérica sólida alrededor de las micropartículas o microesferas pre-fabricadas, dentro de la vecindad de las gotitas emulsionadas. En la modalidad de un sistema de aceite en agua o de sólido en aceite en agua, el medio endurecedor es un medio acuoso, el cual puede contener compuestos de actividad superficial, o agentes viscosantes, u otros excipientes. Las partículas microencapsuladas de preferencia son esféricas, y tienen un tamaño de partícula de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 300 mieras, y más preferiblemente de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 60 mieras. Adicionalmente, las partículas microencapsuladas de preferencia tienen una distribución estrecha de tamaños de partículas. Con el objeto de reducir el tiempo de extracción de la fase discontinua, se puede aplicar calor o presión reducida al medio endurecedor. La velocidad de extracción de la fase discontinua a partir de las partículas microencapsuladas embrionarias es un factor importante en el grado de porosidad en las partículas microencapsuladas sólidas finales, debido a que la rápida remoción, por ejemplo por evaporación (efecto de ebullición) de la fase discontinua, da como resultado la destrucción de la continuidad de la matriz. En una modalidad preferida del proceso de emulsión, cuando se practica el mismo, se lleva a cabo en una forma continua en lugar de un proceso por lotes. La Figura 41 ilustra el diseño de un reactor de emulsión continua que se puede utilizar en este aspecto. En otra modalidad, cuando se practica la encapsulación, las matrices poliméricas formadoras de pared endurecidas, que encapsulan a las micropartículas o microesferas del agente activo, se cosechan adicionalmente mediante centrifugación y/o filtración (incluyendo diafiltración), y se lavan con agua. Las fases líquidas restantes se pueden remover adicionalmente mediante un proceso tal como liofilización o evaporación. Las micropartículas o microesferas se pueden encapsular en cuando menos una o más capas de polielectrolitos seleccionados para enmendar las propiedades de las partículas hasta las características objetivas mediante el control de las propiedades funcionales superficiales. Estas micropartículas se sumergen con un polímero de la carga opuesta (poli-ión) en un medio acuoso, para afectar las propiedades superficiales de la partícula. Si las partículas tienen una carga negativa, determinada mediante las mediciones del potencial zeta, entonces la primera capa del polímero será positiva. Si las partículas tienen una carga inicial positiva, entonces la primera capa polimérica será negativa. El depósito de la primera capa puede tener lugar en agua, o en un regulador, o en una solución acuosa que contenga algún solvente orgánico miscible en agua. En el caso de las micropartículas de proteína coloidalmente inestables, se pueden introducir otros agentes reductores de la solubilidad. Para este propósito, se pueden utilizar agentes reductores de la solubilidad/agentes incrementadores de la viscosidad de bajo peso molecular, tales como alcohol, glicerol, etc., así como polímeros, tales como polietilenglicol (PEG) soluble en agua, polivinil-pirrolidona (PVP), heta-almidón, dextrano, etc.. La incubación con el material de recubrimiento se puede llevar a cabo a temperatura ambiente, así como a una temperatura más baja para controlar la solubilidad de las partículas. Las partículas se pueden incubar con el polímero durante la cantidad de tiempo requerida (de minutos a horas). Entonces se puede aislar la suspensión de partículas recubiertas a partir del exceso de polímero no enlazado, ya sea a través de centrifugación o bien diafiltración. Las partículas de preferencia se lavan del polímero residual ya sea en una solución acuosa o en una solución con los agentes reductores de solubilidad anteriormente mencionados. La temperatura se optimiza basándose en las solubilidades del material activo y del material de recubrimiento. Después de que se termina el paso de lavado, se introduce la siguiente capa de polímero con una carga opuesta. El procedimiento se puede repetir como en el ciclo anterior. El número de capas de polímero depositadas puede depender de la aplicación deseada. Se puede variar, por ejemplo, desde una capa para la modificación superficial, hasta 10-20 bicapas para las aplicaciones de liberación sostenida, dependiendo de la cinética de disolución requerida. Los polímeros que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, la siguiente lista: poli-sulfonato de estireno (PSS) y clorhidrato de polialil-amina (PAH), poli-ácido acrílico (PAA), cloruro de poli-(dialil-dimetil)-amonio (PDDA), y polímeros biocompatibles, tales como sulfato de dextrano, quitosano, sulfato de quitosano, polilisina, gelatina, alginato, protamina, sulfato de protamina, goma de xantano, etc., y también lípidos cargados, tales como fosfatidil-colina, fosfatidil-serina, etc. En un planteamiento alternativo de capa por capa, la primera capa del poli-ión también se puede agregar al final de la precipitación controlada de las partículas sin remover el polímero, tal como polietilenglicol, que esté presente en el sistema. Además, se pueden utilizar estructuras de lípido (por ejemplo, liposomas) en un depósito alternado con polímeros opuestamente cargados, y se puede optimizar la proporción entre los lípidos cargados y no cargados para lograr la permeabilidad mínima de la cubierta. En algunos casos, puede ser preferible llevar a cabo el ensamble capa por capa en la presencia de cationes divalentes, tales como zinc. EJEMPLO 1 Este ejemplo proporciona un procedimiento básico para la preparación de lotes de 500 microlitros de micróesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII que se pueden pasar por jeringa. Se preparan 10 lotes de 500 microlitros del anticuerpo monoclonal en tubos Eppendorf como sigue: Preparación de Regulador de Acetato de Amonio 40 mM a un pH = 6.5: Se prepara el regulador AA 40 mM disolviendo 3.08 gramos de AA (Spectrum) en 1 litro de H20 desionizada. El AA es fácilmente soluble y forma una solución reguladora con un pH de aproximadamente 6.4. Se ajusta el pH a un pH = 6.5 con hidróxido de amonio diluido. Preparación de 500 mililitros de solución de Poloxámero 188 al 10 por ciento en regulador AA 40 mM: Se disuelven 50 gramos del Poloxámero 188 (BASF) en 500 mililitros del Regulador AA 40 mM (como se describe en el paso 1), solamente que esta vez no es necesario el ajuste el pH. La disolución de esta cantidad del Poloxámero se puede hacer en varias adiciones. El pH final es de alrededor de un pH de aproximadamente 6.4. La solución se filtra con un filtro de 0.22 mieras, y se mantiene refrigerada. Intercambio de regulador: Se utilizan columnas de desalación 2 PD10 (Amersham Biosciences) para 5 mililitros de la proteína. El volumen total de la columna es de 3.5 mililitros, y se recomienda para el intercambio no más de 2.5 mililitros en cada una. Cada columna se debe enjuagar con no menos de 25 mililitros de regulador de NH4OAc 40 mM para saturar la columna con el regulador. Entonces se insertan 2.5 mililitros del anti-Factor VIII en regulador de fosfato en la columna, seguidos por 1 mililitro adicional del regulador de NH4OAc para llenar la columna. La proteína se recolecta mediante la inyección de 2.5 mililitros adicionales del regulador de NH4OAc 40 mM. Un cartucho de diálisis preferido es un 1 Pierce, con un volumen total de 3 a 12 mililitros, y un corte de peso molecular de 10,000 Dáltones, para reemplazar al regulador para 5 mililitros de la proteína. Se hidrata el cartucho antes de usarse con H20 desionizada, tal como mediante la utilización de una jeringa de 5 a 10 mililitros con una aguja 18G1/2. Primero se inyecta aire en el cartucho para separar las paredes de la membrana. Entonces se inyecta la muestra. Se extrae el aire del cartucho para tener un mejor contacto de la muestra-membrana. Finalmente, se agrega el flotador, y se centrifuga el cartucho a baja velocidad. Como regla, cada intercambio de regulador debe ser de cuando menos 10X en volumen. Concentración de la proteína: La concentración de la proteína se determina midiendo la absorbencia a 280 nanómetros y la curva de calibración. Si es necesario, la proteína puede estar con el regulador de acuerdo con la concentración de procesamiento deseada. El pH de la solución de Poloxámero al 10 por ciento se ajusta con ácido acético a un pH = 6.0 y a un pH = 6.1. Los 5 mililitros de la proteína se dividen en 10 lotes de 500 microlitros. Entonces se agregan 1,000 microlitros del Poloxámero 188 al 10 por ciento en AA 40 mM a un pH = 6.0, a cinco tubos Eppendorf, y se agregan 1,000 microlitros del Poloxámero 188 al 10 por ciento en AA 40 mM a un pH = 6.1 a los otros cinco tubos Eppendorf. Las soluciones se mezclan bien mediante vórtex suave y mezcla manual. Las soluciones se deben ver transparentes a ligeramente nebulosas. Las muestras se incuban durante 1 a 2 horas (aproximadamente 4°C) para alcanzar un enfriamiento lento. Las muestras se enfrían con una mezcla de hielo seco/etanol, y se liofilizan durante la noche, o se colocan en un refrigerador a -80°C, para remover toda la H20 desionizada. Una vez que se remueve toda la H20 desionizada, se agrega 1 mililitro de MeCI2/acetona al 5 por ciento a las muestras secas en cada tubo Eppendorf. Procede la mezcla, y se lleva a cabo la centrifugación a 6,000-800,000 revoluciones por minuto durante 3 minutos. El sobrenadante se remueve cuidadosamente del centrífugo, y se decanta, y se repite el lavado dos veces adicionales.

Después de que se termina el último lavado, se decanta el sobrenadante, y se remueve el solvente adicional utilizando un flujo de N2 bajo y muy suave para evitar la suspensión del polvo. Los tubos secos se colocan sobre el liofilizador para remover el solvente residual, y se recolectan las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII. EJEMPLO 2 Este ejemplo proporciona un procedimiento básico para la preparación de lotes de 500 microlitros de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 en tubos Eppendorf: Preparación del Regulador de Acetato de Amonio 40 mM a un pH = 6.0: Se prepara el regulador de acetato de amonio (AA) 40 mM 6 disolviendo 3.08 gramos de AA (Spectrum) en 1 litro de di-H20 desionizada. El AA es fácilmente soluble, y forma una solución reguladora con un pH de aproximadamente 6.4. Se ajusta el pH a un pH = 6.0 con ácido acético diluido. Preparación de 500 mililitros de una solución de Poloxámero 188 al 15 por ciento en regulador AA 40 mM: Se disuelven 75 gramos de Poloxámero 188 (BASF) en 500 mililitros del Regulador AA 40 mM (como se describe en el paso 1, solamente que esta vez no es necesario el ajuste el pH). La disolución de esta cantidad de Poloxámero se puede hacer en varias adiciones. El pH final es de alrededor de un pH de aproximadamente 6.4. La solución se filtra con un filtro de 0.22 mieras, y se mantiene refrigerada. Intercambio de regulador: Se utilizan columnas de desalación 2 PD10 (Amersham Biosciences) para 5 mililitros de la proteína. El volumen total de la columna es de 3.5 mililitros. Cada columna se enjuaga con no menos de 25 mililitros de regulador de NH OAc 40 mM para saturar la columna con el regulador. Entonces se insertan en la columna 2.5 mililitros del anti-CD34 en regulador de fosfato, seguidos por 1 mililitro adicional del regulador de NH4OAc para llenar la columna. La proteína se recolecta mediante la inyección de 2.5 mililitros adicionales del regulador de NH4OAc 40 mM. Se utiliza un cartucho de diálisis 1 Pierce, con un volumen total de 3 a 12 mililitros, y un corte de peso molecular de 10,000 Dáltones, para reemplazar al regulador para 5 mililitros de la proteína. Se inyecta la muestra. Se agrega el flotador, y se utiliza el cartucho para centrifugar a baja velocidad. La concentración de proteína se determina midiendo la absorbencia a 280 nanómetros y la curva de calibración. Si es necesario, la proteína se diluye con el regulador de acuerdo con la concentración de procesamiento deseada. La concentración de procesamiento para este procedimiento se determina como 1.8 miligramos/mililitro (la concentración final es de 0.9 miligramos/mililitro). El pH de la solución de Poloxámero al 15 por ciento se ajusta con ácido acético a un pH = 5.8 y a un pH = 5.9. Los 5 mililitros de la proteína se dividen en 10 lotes de 500 microlitros. Se agregan 500 microlitros del Poloxámero 188 al 15 por ciento en AA 40 mM a un pH = 5.8, a cinco tubos Eppendorf, y se agregan 500 microlitros de Poloxámero 188 al 15 por ciento en AA 40 mM a un pH = 5.9 a los otros cinco tubos Eppendorf. Las soluciones se mezclan bien mediante vórtex suave y mezcla manual, viéndose las soluciones transparentes a ligeramente nebulosas; las muestras se incuban durante 1 a 2 horas en el "recipiente de pescado" (aproximadamente 4°C), efectuando un enfriamiento lento. Las muestras se secan rápidamente en una mezcla de hielo/etanol, y se liofilizan durante la noche para remover toda la H20 desionizada, o las muestras se colocan en un refrigerador a -80°C. Una vez que se remueve toda la H20 desionizada, se agrega 1 mililitro de MeCI2/acetona al 5 por ciento a cada tubo Eppendorf, seguido por mezcla y centrifugación a 6,000-8,000 revoluciones por minuto durante 3 minutos. El sobrenadante se decanta, y los lavados se repiten dos veces adicionales. Después de que se termina el último lavado, se decanta el sobrenadante, y se remueve el solvente adicional utilizando un flujo de N2 bajo y suave. Los tubos casi secos se colocan sobre el liofilizador para remover el solvente residual, y se recolectan las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII. EJEMPLO 3 El ejemplo describe la preparación de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII con el Poloxámero como solvente, y la formación de microesferas bajo enfriamiento. El anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII en regulador de fosfato 40 mM a un pH = 7.0 y en una concentración de 5.3 a 5.5 miligramos/mililitro (sin cloruro de sodio), fue proporcionado por Baxter Healthcare Corporation (Bioscience División, Hayward, CA). El anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII es un anticuerpo monoclonal de murino con un peso molecular de aproximadamente 150 kD, y se utiliza para propósitos de purificación. Cinco mililitros de este anticuerpo monoclonal en una concentración de 5.3 miligramos/mililitro se filtraron a través de 0.22 mieras, y se dializaron contra un regulador de acetato de amonio 40 mM, pH = 6.5, utilizando el cartucho de diálisis. La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbencia a una densidad óptica de 280 nanómetros. Se preparó una solución al 10 por ciento del Poloxámero 188 NF (Lutrol F68) disponible en BASF Corporation (Florham Park, NJ) a un pH = 6.0y se filtró con un filtro de 0.22 mieras. El acetato de amonio fue proporcionado por Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Un cartucho de diálisis "Slide-A-Lyzer", con un corte de peso molecular de 10,000 Dáltones, y un volumen de muestra de 3 a 12 mililitros, fue proporcionado por Pierce (Rockford, IL). Se insertaron alícuotas de 0.5 mililitros de la solución de anticuerpo monoclonal en 20 tubos microcentrífugos de 1 mililitro. Se agregó 1 mililitro de solución de Poloxámero al 10 por ciento a cada tubo conteniendo 0.5 mililitros del anti-Factor VIII (a 5.3 miligramos/mililitro), y la solución se mezcló suavemente a temperatura ambiente, y se incubó a 29°C durante media hora. Entonces, las soluciones se incubaron a 4°C durante 1 hora. Durante el enfriamiento, al solución transparente se hizo opaca a medida que se formaban las microesferas comprendidas de anticuerpo monoclonal. Entonces se determinó el rendimiento de la incorporación de proteína en las microesferas de la siguiente manera: se removió una alícuota de la suspensión de microesferas, se separaron las microesferas de la solución mediante centrifugación, y se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante midiendo la absorbencia a una densidad óptica de 280 nanómetros. En seguida de la incubación, los tubos se congelaron instantáneamente, y se liofilizaron. Después de la liofilización, el polvo seco contenía a las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII y al Poloxámero. El Poloxámero se removió mediante la adición de 1 mililitro de una solución de cloruro de metileno al 95 por ciento y acetona al 5 por ciento a cada tubo, centrifugación, y remoción del sobrenadante. El procedimiento de lavado se repitió tres veces. Los granulos húmedos se secaron utilizando gas de nitrógeno, y el solvente residual se removió utilizando vacío. El polvo seco se examinó bajo el microscopio de luz. Las imágenes del microscopio de luz (Figura 1) y las imágenes del microscopio de luz polarizada (Figura 2) muestran partículas esféricas en el intervalo de tamaños de 0.5 a 5 mieras. Las muestras se enviaron a SEM (Hitachi S4800, Electron Microscopy Center, Northeastern University, Boston, MA). Una muestra de microesfera de anticuerpo anti-Factor VIII se unió al montaje de la muestra de SEM utilizando una lengüeta adhesiva de carbono conductor de doble lado. Se aplicó una capa conductora delgada (de 10 a 15 nanómetros) de Platino/Paladio, 80:20, a la muestra, mediante evaporación, utilizando un evaporador al vacío Dentón DV-502. Entonces se formó la imagen de la muestra, y se registró digitalmente en un SEM de Emisión de Campo Hitachi S-4800, utilizando un voltaje de aceleración de 2 a 3 kV. Las micrografías de electrones de exploración (Figura 3) muestran partículas esféricas en el intervalo de tamaños de 0.5 a 6 mieras. Cuando pasa una luz polarizada a través de una muestra isotrópica, la muestra no tendrá efecto alguno sobre la luz polarizada, independientemente de la manera en que se oriente la muestra, debido a que todos los ejes del cristal son completamente equivalentes. Este efecto se conoce como extinción completa o isotrópica, y se presenta para los cristales que tienen un alto grado de simetría, tales como los sistemas cúbicos. Las muestras amorfas no cristalinas producen el mismo comportamiento. Las imágenes del microscopio óptico polarizado muestran las microesferas como círculos oscuros rodeados por un halo brillante. Estas imágenes son independientes de la orientación de la muestra, e indican su forma esférica y su estructura amorfa. EJEMPLO 4 Este ejemplo muestra la electroforesis en gel de las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII preparadas de acuerdo con el Ejemplo 3. El gel de Tris-acetato, del 3 al 8 por ciento, 1.5 milímetros x 10 pozos, regulador de ejecución de Tris-acetato/SDS, regulador de muestra NuPage LDS, estándar de peso molecular Mark 12, y la solución de secado "SimpIyBlue SafeStain", fueron proporcionados por Invitrogen (Carlsbad, CA). La electroforesis en gel es una técnica analítica ampliamente utilizada para la separación y caracterización de proteínas y péptidos, y para la estimación del peso molecular de la proteína. Microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII preparadas de acuerdo con el Ejemplo 3 y disueltas en suero regulado con fosfato, pH = 7.4, a 37°C. Cuarenta microlitros de tres lotes diferentes se ejecutaron en paralelo. Cuarenta microlitros de la solución nativa de anti-Factor VIII se ejecutaron en paralelo como un control. El tiempo de ejecución fue de 1 hora, y el voltaje fue de 150 mV. La Figura 4 presenta dos imágenes de gel que muestran que el anticuerpo monoclonal disuelto (liberado desde las microesferas) migró similarmente en el gel, comparándose con el anticuerpo monoclonal nativo. Todas las muestras migraron hasta el marcador de peso molecular de 150 kD, lo cual indica que no se ha cambiado el tamaño de la proteína como un resultado de la formulación. La intensidad del tinte también fue similar, y no hubo tintes en los pozos de gel, lo cual indica que la acumulación molecular fue mínima. EJEMPLO 5 Este ejemplo describe la preparación de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII con PEG/PVP como solvente, y la formación de microesferas bajo calentamiento. El anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII en regulador de fosfato 40 mM (sin cloruro de sodio) de Baxter Healthcare Corporation (Bioscience División, Hayward, CA) se puso en forma de microesferas. Se preparó una solución de PEG/PVP al 25 por ciento (peso/volumen) en regulador de acetato de sodio 100 mM, y a un pH = 5.6, utilizando polietilenglicol (PEG) de 3,350 Dáltones, polivinil-pirrolidona (PVP) de 40,000 Dáltones, y acetato de sodio, disponible en Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Se agregaron 400 microlitros de solución de PEG/PVP al 25 por ciento, a 800 microlitros de la solución de anticuerpo monoclonal anti-Factor VIII en una concentración de 5.3 miligramos/mililitro, a temperatura ambiente. La solución se mezcló y se incubó a 65°C durante media hora. En seguida de la incubación a 65°C, la solución se enfrió rápidamente (se apagó) mediante incubación en agua fría a aproximadamente 20°C. Al enfriarse, la solución se hizo turbia a medida que se formaban microesferas comprendidas del anticuerpo monoclonal. La suspensión se centrifugó, y se removió el sobrenadante. El exceso de PEG/PVP se removió mediante lavados con agua desionizada. La Figura 5 presenta una ¡magen del microscopio de electrones de exploración de microesferas preparadas de acuerdo con el procedimiento de este ejemplo. Se preparó una muestra de las microesferas, y se analizó mediante el microscopio de electrones de exploración AMRAY AMR-1000 (Electron Microscopy Center, Northeastern University, Boston, MA). La muestra se puso sobre una lengüeta de carbono utilizando adhesivo basado en carbono, y se montó sobre la posición de muestras del SEM. La muestra se recubrió con una capa delgada de Platino/Paladio, 80:20, al vacío. Las micrografías de electrones de exploración presentadas en la Figura 9 muestran partículas esféricas en el intervalo de tamaños de 1 a 3 mieras. La distribución de tamaños de partículas mediante dispersión de luz de láser (Beckman Coulter LS 230, Miami, FL) se condujo sobre una suspensión acuosa de microesferas preparadas de acuerdo con este ejemplo. La distribución de los tamaños de partículas fue estrecha, siendo más del 90 por ciento de las partículas menores de 2 mieras. En adición, la distribución de tamaños de partículas por número, por área superficial, y por volumen, se sobrepuso, lo cual indica que todas las partículas fueron de aproximadamente el mismo tamaño, sin agregados aparentes. Ver la Figura 6. EJEMPLO 6 En este ejemplo, se prepararon microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 con un solvente de Poloxámero, y se utilizó enfriamiento en la formación de las microesferas. El anticuerpo monoclonal anti-CD34 es un anticuerpo monoclonal lgG1 lambda de murino con un peso molecular de aproximadamente 146 kD. Este anticuerpo monoclonal se utiliza para la terapia extra-celular, tal como selección de células totipotentes, en conjunto con el Sistema de Selección Celular Magnético Isolex® 300 e Isolex® 300i (Baxter Healthcare Corporation). El sistema de selección de células totipotentes y el tratamiento se indican para el procesamiento de productos de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) autólogas, con el fin de obtener una población enriquecida en células CD34+ pretendida para la reconstitución hematopoiética después de la terapia de mieloablación en pacientes con tumores negativos para CD34. El anticuerpo monoclonal anti-CD34 en regulador de fosfato de sodio 0.02M con cloruro de sodio 0.15M y Tween 80 al 0.001 por ciento, a un pH = 5.5, y en una concentración de 2.3 a 2.5 miligramos/mililitro, fue proporcionado por Baxter Healthcare Corporation (Bioscience División, Hayward, CA). Cinco mililitros del anticuerpo monoclonal, en una concentración de 2.2 miligramos/mililitro, se filtraron a través de 0.22 mieras, y se dializaron contra el regulador de acetato de amonio 40 mM, pH = 6.0. Se preparó una solución al 15 por ciento del Poloxámero 188 NF (Lutrol F68), disponible en BASF Corporation (Florham Park, NJ), estando la solución a un pH = 6.0, y se filtró con un filtro de 0.22 mieras. El acetato de amonio fue proporcionado por Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Un cartucho de diálisis "Slide-A-Lyzer", con un corte de peso molecular de 10,000 Dáltones, y un volumen de muestra de 3 a 12 mililitros, fue proporcionado por Pierce (Rockford, IL). Se insertaron alícuotas de 0.5 mililitros de la solución de anticuerpo monoclonal en 20 tubos microcentrífugos de 1 mililitro. Se agregaron 0.5 mililitros de la solución de Poloxámero al 15 por ciento a cada tubo conteniendo 0.5 mililitros del anti-CD34, en 2.0 miligramos/mililitro, y la solución se mezcló suavemente a temperatura ambiente, y se incubó a 29°C durante media hora. Entonces, las soluciones se incubaron a 4°C durante 1 hora.

Durante el enfriamiento, la solución transparente se hizo opaca a medida que se formaban microesferas comprendidas del anticuerpo monoclonal. Entonces se determinó el rendimiento de incorporación de proteína en las microesferas de la siguiente manera: se removió una alícuota de la suspensión de microesferas, se separaron las microesferas de la solución mediante centrifugación, y se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante midiendo la absorbencia a una densidad óptica de 280 nanómetros. En seguida de la incubación, los tubos se congelaron instantáneamente, y se liofilizaron. Después de la liofilización, el polvo seco contenía las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 y el Poloxámero. El Poloxámero se removió mediante la adición de 1 mililitro de una solución de cloruro de metileno al 95 por ciento y acetona al 5 por ciento a cada tubo, seguido por centrifugación y remoción del sobrenadante. El procedimiento de lavado se repitió tres veces. Los granulos húmedos se secaron utilizando gas de nitrógeno, y el solvente residual se removió utilizando un vacío. El polvo seco se examinó bajo el microscopio de luz, y las muestras se enviaron al SEM. Las imágenes del microscopio de luz (Figura 7) muestran partículas esféricas en el intervalo de tamaños de 0.5 a 5 mieras. Las micrografías de electrones de exploración de las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 se vieron como se describe en el Ejemplo 4 anterior (Figura 9). La distribución de tamaños de partículas mediante medición de tiempo de vuelo aerodinámico (TSI Aerosizer) se condujo sobre 5 miligramos de polvo seco de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 preparadas de acuerdo con este ejemplo. La distribución de los tamaños de partículas por número fue estrecha, con un diámetro aerodinámico de tamaño medio de 1.3 mieras, y el 95 por ciento de las partículas eran más pequeñas que 3.6 mieras (Figura 10). EJEMPLO 7 También se monitoreó la estabilidad de conformación de las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 del Ejemplo 6. En las condiciones descritas en el Ejemplo 6, se mezclaron 1.5 mililitros de anti-CD34 en regulador de acetato de amonio 40 mM, a un pH = 6.0, y en una concentración de 1.6 miligramos/mililitro, con 1.5 mililitros de Poloxámero al 15 por ciento en Acetato de amonio 40 mM (pH = 6.0 a 25°C). Se agregaron 3 mililitros de solución 10 mM de tinte fluorescente de ácido 8-anilino-naftalen-1-sulfónico (ANS), y la solución se mezcló suavemente, y se transfirió a una celda de fluorescencia. La estabilidad de conformación del anticuerpo anti-CD34 se monitoreó utilizando la fluorescencia intrínseca de los residuos de triptófano y tirosina de la proteína, y la fluorescencia extrínseca del tinte de ácido 8-anilino-naftalen-1-sulfónico. La formación de las partículas en la celda de fluorescencia fue seguida utilizando detección del segundo sobre-tono a 500 nanómetros de dispersión elástica de la luz excitada a 250 nanómetros. El ejemplo se llevó a cabo utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse Biomelt equipado con un accesorio sujetador de múltiples celdas con termostato Peltier. La muestra se incubó a 25°C durante 1 minuto, se calentó a 31°C a la velocidad de 0.06 grados Celsius por minuto, se enfrió a 2°C a la velocidad de 5 grados Celsius por minuto, y se incubó a esta temperatura durante 1 hora. Las muestras de control incluyeron ácido 8-anilino-naftalen-1-sulfónico 10 µM en acetato de amonio 40 mM (pH = 6.0), ácido 8-anilino-naftalen-1-sulfónico 10 µM en acetato de amonio 40 mM, Poloxámero al 7.5 por ciento (pH = 6.0), y 0.8 miligramos/mililitro de anticuerpo monoclonal anti-CD34 con ácido 8-anilino-naftalen-1-sulfónico 10 µM en acetato de amonio 40 mM (pH = 6.0). La Figura 12 presenta los resultados del monitoreo de fluorescencia de la estabilidad de conformación del anticuerpo monoclonal anti-CD34. Los datos de fluorescencia apoyan que la conformación de la proteína permaneció intacta durante la formación de las microesferas. EJEMPLO 8 De acuerdo con este ejemplo, se prepararon microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 con el Poloxámero o solventes de PEG/PVP, y se incorporó calentamiento. El anticuerpo monoclonal anti-CD34 en regulador de fosfato de sodio 0.02 M con cloruro de sodio 0.15 M y Tween 80 al 0.001 por ciento, a un pH = 5.5, y en la concentración de 2.3 a 2.5 miligramos/mililitro, fue proporcionado por Baxter Healthcare Corporation (Bioscience División, Hayward, CA). Se utilizaron columnas de desalación en un volumen de muestra de 2.5 mililitros, disponibles en Amersham Bioscience (Piscataway, NJ), para dializar 5 mililitros de anticuerpo monoclonal anti-CD34 contra el regulador de acetato de amonio 40 mM (Spectrum Chemicals, Gardena, CA) a un pH = 6.3. La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbencia a una densidad óptica de 280 nanómetros. Se insertaron alícuotas de 0.5 mililitros de la solución de anticuerpo monoclonal en 10 tubos microcentrífugos de 1 mililitro, y se agregó una alícuota de 0.3 mililitros de Poloxámero 188 NF al 15 por ciento (Lutrol F68 por BASF Corporation, Florham Park, NJ) a un tubo que contenía 0.5 mililitros del anti-CD34, en 2.1 miligramos/mililitro, y la solución se mezcló suavemente a temperatura ambiente, y se incubó a 70°C durante media hora. En seguida de la incubación a 70°C, la solución se enfrió rápidamente (se apagó) mediante incubación en agua fría a 23°C. Después del enfriamiento, la solución transparente se hizo turbia a medida que se formaban las microesferas comprendidas de anticuerpo monoclonal. La suspensión se centrifugó, y se removió el sobrenadante. El exceso de Poloxámero se removió mediante lavados con agua desionizada. La imagen del microscopio óptico (Figura 8) muestra partículas esféricas en el intervalo de tamaños de 0.5 a 5 mieras. EJEMPLO 9 En este ejemplo, se describe la preparación de microesferas de anticuerpo monoclonal anti-CD34 con PEG/PVP como solvente, y la formación de microesferas bajo enfriamiento. El anticuerpo monoclonal anti-CD34 en regulador de fosfato de sodio 0.02M con cloruro de sodio 0.15M y Tween 80 al 0.001 por ciento, a un pH = 5.5, y en la concentración de 2.3 a 2.5 miligramos/mililitro, fue proporcionado por Baxter Healthcare Corporation (Bioscience División, Hayward, CA). El polietilenglicol (PEG) de 3,350 Dáltones, la polivinil-pirrolidona (PVP) de 40,000 Dáltones, y el acetato de sodio, fueron todos proporcionados por Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Se preparó una solución de PEG/PVP al 25 por ciento (pH = 5.6) en regulador de acetato de sodio 100 mM, y se filtró a través de un filtro de 0.22 mieras. Se filtraron 5 mililitros del anticuerpo monoclonal en la concentración de 2.2 miligramos/mililitro a través de un filtro de 0.22 mieras, y se dializaron utilizando un cartucho de diálisis "Slide-A-Lyzer" (corte de peso molecular de 10,000 Dáltones, y volumen de muestra de 3 a 12 mililitros, proporcionado por Pierce (Rockford, IL)). El anticuerpo monoclonal se dializó contra el regulador de acetato de amonio 40 mM, pH = 6.0. Entonces se agregaron 200 microlitros de solución de PEG/PVP al 25 por ciento (peso/volumen) a 500 microlitros del anticuerpo monoclonal anti-CD34, en una concentración de 2.0 miligramos/mililitro, y la solución se mezcló suavemente a temperatura ambiente, y se incubó a 29°C durante media hora. El proceso continuó como se describe en el Ejemplo 6, pero, para la remoción de PEG/PVP, opuestamente al Poloxámero, mediante lavados con una solución de cloruro de metileno al 95 por ciento/acetona al 5 por ciento.

EJE MPLO 10 Este ejemplo muestra la difracción en polvo de rayos-X (XRPD) de microesferas de anticuerpo monoclonal preparadas de acuerdo con el Ejemplo 6. Los análisis de difracción en polvo de rayos-X de alta resolución (XRPD) se adquirieron util izando un difractómetro de polvo de rayos-X Shimadzu XRD-6000, equi pado con un tubo de rayos-X de foco largo y fino, utilizando radiación de Cu, Ka 8SSCI , West Lafayette, I N) . El voltaje y amperaje del tubo se establecieron en 40 kV y 40 mA, respectivamente. Las ranuras de divergencia y d ispersión se establecieron en 1 °, y la ranura de recepción se estableció en 0.1 5 mil ímetros. De una manera alternativa , las ranuras de divergencia y de dispersión se establecieron en 0.5°, y la ranura de recepción se estableció en 0.1 5 mil ímetros. La radiación difractada se detectó med iante un detector de cintilación de Na l . Se utilizó una exploración continua de T-2T a 0.5° por minuto (4.8 segundos por paso de 0.02°) , de 1 a 20° 2T. Se analizó un estándar de silicio para verificar la alineación del instrumento. Los datos se recolectaron y se analizaron utilizando el XRD-6000 v. 4.1 . Se pasó un estándar de áng ulo bajo consistente en una mezcla de 80:20 de hexatriacontano: silicio, para demostrar la resolución i nstrumental en ángulos más bajos para un valor "d" bien definido. La Fig ura 1 1 presenta los patrones de XRPD de las microesferas de anticuerpo monoclonal anti-C D34, y la mezcla de 80:20 de hexatriacontano:silicio. La d ifracción en polvo de rayos-X de la mezcla de hexatriacontano:silicio tiene picos distintivos que indican el estado cristalino, mientras que el patrón de difracción en polvo de rayos-X de las microesferas de anticuerpo es continuo y no tiene picos distintos, lo cual es típico del estado amorfo, no cristalino.

Los resultados muestran que se podrían aspirar e inyectar con éxito altas concentraciones de estas microesferas de proteína en un pedazo de jamón de 5 kilogramos. EJEMPLO 11 El anti-CD34 se formuló en microesferas de acuerdo con la invención, siguiendo en general el Ejemplo 2. Las microesferas se suspendieron en una solución de PEG 3350 al 5 por ciento, en las concentraciones mostradas en la Tabla I. Se aspiró en una jeringa un volumen de microesferas suspendidas, y se suministró a través de una aguja con posibilidad de inyección calibre 25, en un lomo de puerco de 2 kilogramos comprado en la tienda. Cada inyección se llevó a cabo en 20 segundos o menos, sin atascamientos. Los resultados de la posibilidad de paso por jeringa, que en este ejemplo indican la capacidad para aspirar la suspensión de microesfera a través de la aguja calibre 25 y hacia adentro de la jeringa, y de inyectar completamente el contenido de la jeringa en el puerco, se registran en la Tabla I. Tabla I Los resultados reportados en la Tabla I muestran que se pueden aspirar altas concentraciones de estas microesferas de proteína en una aguja fina (calibre 25), y que se pueden inyectar con éxito desde la misma. Esto proporciona una indicación de la posibilidad de inyección en un medio ambiente subcutáneo, a través de la piel, y hacia adentro del músculo. EJEMPLO 12 Se formularon microesferas de insulina conteniendo más del 90 por ciento en peso por peso de insulina humana recombinante, en microesferas de acuerdo con la invención. Las microesferas de insulina se suspendieron en una solución de PEG 3350 al 5 pot> ciento, en las concentraciones mostradas en la Tabla I. Se aspiró 1 mililitro de microesferas suspendidas en la jeringa, y se suministró a través de una aguja de insulina calibre 28, y hacia dentro de un jamón ahumado de 5 kilogramos comprado en la tienda. Cada inyección se llevó a cabo en 20 segundos o menos, sin atascamientos. Los resultados de la posibilidad de paso por jeringa, que en este ejemplo indica la capacidad para aspirar la suspensión de microesferas a través de la aguja calibre 28 y hacia dentro de la jeringa, y la posibilidad de inyección, que en este ejemplo indica la capacidad para inyectar completamente el contenido de la jeringa en el jamón, se registran en la Tabla I. Tabla I Los resultados reportados en la Tabla I muestran que se pueden aspirar altas concentraciones de estas microesferas de proteína en una aguja fina (calibre 28), y que se pueden inyectar con éxito desde la misma en un pedazo de jamón de 5 kilogramos. Éste último paso proporciona una indicación aproximada de la posibilidad de inyección en un medio ambiente subcutáneo. La inyección de 300 miligramos/mililitro se hizo con 5.8 Newtons de fuerza. EJEMPLO 13 Se preparan micropartículas o microesferas de insulina mediante un método general. Se preparó una solución regulada a un pH de 5.65 (regulador de acetato de sodio 0.033M) conteniendo PEG 3350 al 16.67 por ciento. Se agregó una pasta concentrada de insulina cristalina de zinc a esta solución con agitación. La concentración de insulina en la solución final fue de 0.83 miligramos/mililitro. La solución se calentó a aproximadamente 85-90°C. Los cristales de insulina se disolvieron completamente en este intervalo de temperatura dentro de 5 minutos. Las pequeñas partículas esféricas de insulina empezaron a formarse alrededor de 60°C, cuando se redujo la temperatura de la solución a una velocidad controlada. El rendimiento aumentó a medida que se incrementó la concentración de PEG. Este proceso produce micropartículas o microesferas con diferentes distribuciones de tamaños, con una media de 1.4 mieras. Las micropartículas o microesferas de insulina formadas se separaron del PEG lavando las microesferas mediante diafiltración bajo condiciones en las que no se disolvieran las microesferas. Las microesferas de insulina se lavaron de la suspensión utilizando una solución acuosa que contenía Zn2+. El ion de Zn2+ reduce la solubilidad de la insulina, y previene la disolución que reduce el rendimiento y provoca la aglom eración de las microesferas . EJEMPLO 14 La presente invención también se puede utilizar para preparar pequeñas partículas esféricas de Alfa- 1 -Antitripsina (AAT) , las cuales son particularmente adecuadas para la vía de suministro con jeringa preferida de la invención. La AAT tiene un peso molecular de aproximadamente 44 kDa. Este ejemplo reporta sobre la preparación por lotes en colum na encamisada de pequeñas partículas esféricas de AAT (escala de 1 0 a 300 miligramos) . Una solución regulada a un pH de 6.0 con acetato de amonio 1 0 mM , conteniendo PEG 3350 al 1 6 por ciento y Pluronic F68 al 0.02 por ciento, se mezcló con una barra de agitación magnética en un vaso de precipitados encamisado, y se calentó a 30°C . La temperatura del vaso de precipitados se controló utilizando un baño de ag ua circulante. A esta solución se le agregó una solución concentrada de AAT (rAAT) con agitación , y el pH se ajustó a 6.0. La concentración de rAAT en la solución final fue de 2 miligramos/mililitro, la rAAT fue completamente soluble a esta temperatura en esta composición en solución . Todo el contenido del recipiente se transfirió a una columna encamisada , y se calentó a 25-30°C . El baño de agua circulante para la columna se esta bleció para bajar en ram pa hasta -5°C. La colum na y el contenido se enfriaron a aproximadamente 1 °C/minuto, hasta una temperatura de aproximadamente 4°C. Se formaron pequeñas partículas esféricas de rAAT durante el paso de enfriamiento. La suspensión de microesferas se congeló en platos de cristalización de vidrio, y se I i of i I izó para remover el agua y el regulador. Con el objeto de extraer el PEG de las pequeñas partículas esféricas de proteína después de la liofilización, la torta de PEG/proteína se lavó con cloruro de metileno (MeCI2). Otro medio de lavado utilizado fue cloruro de metileno:acetona, 1:1, o cloruro de metileno:pentano, 1:1. El procedimiento de lavado se repitió por un total de tres veces el volumen original de lavados. El granulo final se volvió a suspender en un pequeño volumen de acetona o pentano, y se secó ya sea mediante su exposición directa a gas de nitrógeno, o bien mediante evaporación giratoria. EJEMPLO 15 En este ejemplo, se presenta la preparación por lotes en recipiente encamisado de partículas esféricas pequeñas de AAT (escala de 200 a 2,000 miligramos). Este tipo de preparación se hizo utilizando la misma composición de la formulación que la columna encamisada, pero capaz de acomodar mayores volúmenes, y fue más adecuada para escalar hacia arriba. A esta escala, la formulación se mezcló a 75 revoluciones por minuto con una hélice estilo paleta en forma de A en un recipiente encamisado, usualmente de 500 a 1,000 mililitros, y se calentó a 30°C. La temperatura del recipiente se controló utilizando un baño de agua circulante. Manteniendo la solución en el mismo recipiente, se cambió la fuente del baño de agua desde un baño de 30°C hasta un baño de 2°C. El recipiente y el contenido se enfriaron a aproximadamente 1°C/minuto hasta una temperatura de 4°C. Las partículas esféricas pequeñas de rAAT se formaron durante el paso de enfriamiento. La temperatura se monitoreó utilizando un termocople, y cuando la suspensión alcanzó 4°C, se mantuvo cerca de esta temperatura durante 30 minutos adicionales. Después del paso de sostenimiento, la suspensión de partículas esféricas pequeñas se concentró mediante diafiltración a alrededor de 4°C, para remover aproximadamente el 75 por ciento del polímero y el volumen. La suspensión de partículas esféricas pequeñas restantes se congeló como una capa delgada en una charola de liofilización previamente enfriada, y se I i of i I izó para remover el agua y el regulador restante. Las partículas esféricas pequeñas de proteína se separaron del polímero secado restante ya sea mediante centrifugación con solventes orgánicos (como se describe en el Ejemplo 18), o bien mediante extracción de fluido súper-crítico (SCF). Para la extracción de fluido súper-crítico, el material secado se transfirió a una cámara de extracción de alta presión, la cual se presurizó a 175 kg/cm2 (a temperatura ambiente) con C02. Una vez que se alcanzó la presión operativa, se introdujo etanol en la corriente de fluido de entrada como una mezcla de 70:30 de C02:etanol. Este fluido súper-crítico disolvió el polímero, dejando las partículas esféricas pequeñas. A la conclusión del proceso, el sistema se inundó de etan'ol, y se descomprimió lentamente. EJEMPLO 16 Se fabricaron pequeñas partículas esféricas como se describe en los Ejemplos 15 y 16, y se determinó el rendimiento del proceso. Después de que se terminó el proceso de enfriamiento, se removió una pequeña alícuota de la suspensión, y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras para remover las partículas esféricas pequeñas sólidas. La absorbencia del filtrado, que fue la rAAT restante en solución, se determinó a 280 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro ultravioleta. Entonces se calculó la concentración de rAAT a partir de una curva estándar. El porcentaje de conversión se calculó como: (Concentración de rAA T Inicial - Concentración de rAAT del Filtrado) *100% = % de conversión Concentración de rAA T Inicial Como se muestra en la tabla anterior, un alto porcentaje de la proteína AAT se convirtió en partículas esféricas pequeñas, sin importar la escala del proceso. EJEMPLO 17 Este ejemplo muestra la distribución de tamaños de partículas de las partículas de AAT a diferentes escalas del proceso, con los datos del Aerosizer. Se analizó una muestra de las partículas esféricas pequeñas en polvo seco de AAT finales, en un TSI Aerosizer 3225, el cual mide los tamaños de partículas por las mediciones del tiempo de vuelo. A partir de estas mediciones, se calcularon diferentes proporciones de los diámetros de volumen para demostrar la distribución de tamaños de partículas de las pequeñas partículas esféricas de AAT, y .se utilizaron para compararse con partículas fabricadas mediante métodos diferentes de aquél de la presente invención.

Se pesó una muestra de 5 a 10 miligramos en una cápsula de gel, y se administró en el Andersen Cascade Impactor utilizando el Inhalador de Polvo Seco Cyclohaler, a una velocidad de flujo de 60 litros por minuto (LPM). Las partículas esféricas pequeñas se recolectaron de todos los impactos o etapas, se disolvieron en regulador Tris-HCl 0.2M a un pH de 8.0, y se cuantificaron utilizando HPLC de fase inversa. Los datos se analizaron, y se calculó la desviación estándar geométrica (GSD) como se describe en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP). Los datos demostraron la distribución de tamaños estrecha.

Todos los parámetros de distribución mostrados anteriormente, demostraron la excelente distribución de tamaños de partículas que resulta del método de fabricación de la presente invención. EJEMPLO 18 Este ejemplo ilustra la retención de la bioactividad de la AAT.

Con el fin de determinar la actividad específica, las partículas esféricas pequeñas de rAAT se disolvieron en Tris-HCl 0.2M, pH de 8.0, a temperatura ambiente. La solución resultante se analizó mediante un ensayo que mide la capacidad de la rAAT para inhibir la capacidad de la elastasa pancreática porcina (PPE) para hidrolizar los péptidos sintéticos que contienen un grupo p-nitroanilida en su término-C. Entonces se ensayó la misma solución de partículas esféricas pequeñas de rAAT para determinar la concentración de proteína, utilizando el ensayo de Ácido Bicinoconínico (BCA). También se analizó una solución de material de partida de rAAT de control en ambos ensayos. Debido a que el ensayo de la actividad se desarrolló para determinar la actividad basándose en una concentración de 1 miligramo/mililitro de proteína por muestra. El valor de la actividad se corrigió basándose en la concentración de proteína real, determinada mediante BCA, dando el valor de la actividad específica: 0 Valor de actividad para la muestra = Actividad específica para la muestra Concentración de proteína real Inhibición de la elastasa pancreática porcina mediante rAAT. 5 0 La actividad específica demostró de esta manera la retención de la bioactividad después de la fabricación de AAT en partículas e esféricas pequeñas.

EJEMPLO 19 Este ejemplo describe la preparación de microesferas de anticuerpo monoclonal humanizado con polietilenglicol o Poloxámero como el solvente, y la formación de las microesferas bajo enfriamiento. U na sol ución de 1 mililitro de 4 miligra mos/mililitro de anticuerpo monoclonal humanizado (anticuerpo monoclonal anti- CD25) en reg ulador de acetato de amonio 40 M a un pH = 5.9, se mezcló con 1 mililitro de una solución al 30 por ciento (peso/volumen) de PEG de 3, 350 Dáltones, disponible en Spectrum Chemicals (Gardena , CA) en agua. De una manera alternativa, la solución se mezcló con 1 milil itro de una sol ución al 30 por ciento (peso/volumen) del Poloxámero 1 88 N F (Lutrol F68) , disponible en BASF Corporation (Florham Park, NJ) en agua. Las mezclas se incubaron en un baño de agua durante 1 0 minutos a 35°C, y luego se enfriaron a 2°C a una velocidad de aproximadamente 0.7 grados Celsius por minuto. Entonces las muestras se vieron en el microscopio de luz a una amplificación 10X y 1 00X, y mostraron la formación de las partículas esféricas util izando cualquier pol ímero. La mayoría de las microesferas parecieron ser de aproxi madamente 2 mieras de diámetro, pero alg unas eran más pequeñas. Pocas microesferas fueron mayores de 5 mieras de diámetro. EJ E MPLO 20 Este ejemplo ilustra la retención de la integridad estructural de AAT. U no de los puntos de diferenciación centrales de la tecnolog ía de la separación de fases controlada (CPS) es la formación de partículas bajo condiciones ligeras, utilizando sistemas acuosos durante la formación de las partículas, y evitando otras condiciones inductoras de tensión, tales como una mayor temperatura, esfuerzo cortante, etc. En el campo de la ingeniería de las partículas, las principales preocupaciones son la estabilidad de las proteínas durante la fabricación, y la estabilidad al almacenamiento. Se cree que las sendas de degradación principales, tales como la oxidación, la desamidación, y en especial la acumulación de las proteínas, son responsables de los efectos secundarios de la formulación de las proteínas, incluyendo la inmunogenicidad. Por consiguiente, las preocupaciones regulatorias requieren de un nivel extremadamente bajo de productos de degradación en las formulaciones de partículas finales. Se utilizaron HPLC, caracterización fisicoquímica, tal como CD y DSC, para determinar si se presentaba modificación de la proteína durante la formación. El Dicroísmo Circular (CD) es el método más comúnmente empleado para la evaluación de los cambios estructurales en una proteína sometida a perturbación, o para la comparación de la estructura de una proteína diseñada con la proteína progenitora. El método de Dicroísmo Circular es para evaluar el pliegue de la proteína, y la estructura secundaria y terciaria de la proteína. La estructura secundaria se puede determinar mediante espectroscopia de Dicroísmo Circular en la región espectral "ultravioleta lejana" (190 a 250 nanómetros). En estas longitudes de onda, el cromóforo es el enlace peptídico cuando se localiza en un medio ambiente plegado regular. La hélice-alfa, la hoja-beta, y las estructuras enrolladas aleatorias, cada una dan lugar a una forma y magnitud características del espectro del Dicroísmo Circular. La fracción aproximada de cada tipo de estructura secundaria que esté presente en cualquier proteína, por lo tanto, se puede determinar mediante el análisis de su espectro de Dicroísmo Circular ultravioleta -lejano, como una suma de los múltiplos fraccionarios de los espectros de referencia para cada tipo estructural. El espectro de Dicroísmo Circular de una proteína en la región espectral "casi-ultravioleta" (de 250 a 350 nanómetros) puede ser sensible a ciertos aspectos de la estructura terciaria. En estas longitudes de onda, los cromóforos son los aminoácidos aromáticos y los enlaces de disulfuro, y las señales de Dicroísmo Circular que producen son sensibles a la estructura terciaria global de ia proteína. Las señales en la región de 250 a 270 nanómetros se pueden atribuir a los residuos de fenilalanina; las señales de 270 a 290 nanómetros se pueden atribuir a la tirosina; y aquéllas de 280 a 300 nanómetros se pueden atribuir al triptófano. Los enlaces de disulfuro dan lugar a amplias señales débiles a través de todo el espectro casi-ultravioleta. Los espectros de Dicroísmo Circular ultravioleta-lejano de la solución de suministro de rAAT, y la AAT liberada desde las partículas esféricas pequeñas en regulador de fosfato (pH de 7.4, T = 25°C, concentración de proteína de 0.05 miligramos/mililitro) se muestran en la Figura 13. Cada espectro representa el promedio de 10 exploraciones. Los espectros de Dicroísmo Circular ultravioleta-lejano son indistinguibles, demostrando que la fabricación de AAT en partículas esféricas pequeñas sobre su liberación subsecuente, dio como resultado moléculas de AAT con una estructura idéntica a aquélla del material de AAT de partida. Las partículas esféricas pequeñas se disolvieron en Tris-HCl 0.2M a un pH de 8.0, y se analizaron mediante HPLC de fase inversa. Cuando se compararon con una solución de control de la proteína rAAT de partida, no hubo diferencia aparente en la apariencia de los cromatogramas. Sistema HPLC: Columna de HPLC - Phenomenex Júpiter, 5 mieras, C4, 300A, 250 x 4.6 milímetros. Bomba Waters Alliance 2965/automuestreador. Longitud de onda - 280 nanómetros. Volumen de inyección - 75 microlitros. Gradiente de concentración: Fase móvil 1: ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento en agua. Fase móvil 2: ácido trifluoro-acético al 0.085 por ciento en acetonitrilo al 90 por ciento (c/v) en agua. Tiempo de ejecución - 60 minutos. Velocidad de flujo - 1.0 mililitros/minuto.

Se generaron diagramas de calorimetría de exploración diferencial. Ver las Figuras 15-25b. EJEMPLO 21 Este ejemplo reporta la estabilidad al almacenamiento de las partículas esféricas pequeñas de AAT en relación con aquélla del material de partida de AAT. Se analizaron las partículas esféricas pequeñas para determinar la retención de bioactividad (utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 17) después de su almacenamiento a temperatura ambiente y a 4°C durante una semana, un mes, dos meses, tres meses, seis meses, y doce meses. (Figuras 17b y 17c). El material a granel es la solución de partida de rAAT que se ha dializado y luego liofilizado. Por cada punto del tiempo y condición de almacenamiento, hubo muestras duplicadas que se ensayaron cada una por duplicado. EJEMPLO 22 Se prepararon partículas esféricas pequeñas de ADNsa. La ADNsa tiene un peso molecular de aproximadamente 38 kDa. Ejemplo de formulación: una solución de: 0.18 miligramos/mililitro de ADNsa (de un suministro de 1 miligramo/mililitro), PEG 3350 al 18.2 por ciento (del 25 por ciento de suministro), acetato de amonio 9 mM, pH de 5.15 (de 1M de suministro). Esta suspensión se enfrió en el congelador a -80°C, y una vez congelada, se liofilizó en un liofilizador de múltiple, y subsecuentemente se lavó mediante centrifugación con MeCI2/acetona. Las concentraciones iniciales probadas fueron de 0.1 miligramos/mililitro de ADNsa y PEG 3350 al 20 por ciento. Pero después de tratar de enfriar desde 37°C hasta 0°C y no obtener un precipitado, se agregó otra cantidad de ADNsa para obtener las concentraciones anteriores. Esta solución se enfrió en el congelador a -80°C, y, una vez congelada, se liofilizó en el liofilizador de múltiple. Se lavó mediante centrifugación con MeCI2/acetona. Las concentraciones iniciales probadas fueron de 0.1 miligramos/mililitro de ADNsa y PEG 3350 al 20 por ciento. Pero después de tratar de enfriar desde 37°C hasta 0°C y no obtener un precipitado, se agregó otra cantidad de ADNsa para obtener las concentraciones anteriores. Esta solución se enfrió en el congelador a -80°C, y, una vez congelada, se liofilizó en el liofilizador de múltiple. Se lavó mediante centrifugación con MeCI2/acetona. (Figuras 38 y 39). Actividad (Ensayo para ADNsa-l utilizando ADN-Verde de Metilo, adquirido en Sigma). La actividad teórica para el material de partida se enlista como 775 Ku/miligramo de proteína. La solución de suministro se determinó en 0.145 miligramos/mililitro de proteína. Esta concentración se diluyó en 5 mililitros para una concentración final de 0.0199 miligramos/mililitro. La actividad debe ser de 775 Ku/miligramo*0.0199 miligramos/mililitro = 15.46 Ku/mililitro. Unidades Kunitz/mililitro de solución = ?A640 por minuto de factor de dilución X40X desconocido ?A640 por minuto del conocido Ku/ml = 0.0004 x 40x1/-0.0011 = 14.55 Ku/ml.

Comparación con la teoría: partículas esféricas pequeñas / teoría*100% = % de actividad: 14.55 Ku/ml/15.46 Ku/ml*100% = 94.1%. EJEMPLO 23 Se prepararon partículas esféricas pequeñas de dismutasa de superóxido (peso molecular de aproximadamente 32 kDa). Una solución de 0.68 miligramos/mililitro de SOD (del suministro de 5 miligramos/mililitro), PEG 3350 al 24..15 por ciento (del suministro del 31.25 por ciento), acetato de amonio 9.1 mM (del suministro de 1M), pH final = 4.99, se ajustó con hidróxido de amonio y ácido acético. La solución se enfrió desde 40°C hasta 0°C durante 50 minutos (aproximadamente 0.8°C/minuto), y la precipitación se inició alrededor de 25°C. La suspensión se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido, y se liofilizó en un liofilizador de múltiple, y subsecuentemente se lavó mediante centrifugación con MeCI2/acetona. (Figuras 40 y 41). Se enfrió desde 40°C hasta 0°C durante 50 minutos (aproximadamente 0.8°C/minuto). Se empezó a precipitar alrededor de 25°C. Se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido, y se liofilizó en el liofilizador de múltiple. Se lavó mediante centrifugación con MeCI2/acetona. Se formaron partículas esféricas pequeñas, y se retuvo la mayor parte de la acetona. EJEMPLO 24 Se preparan partículas esféricas pequeñas de subtilisina (peso molecular de aproximadamente 35,230 Dáltones) utilizando agentes potenciadores de la separación de fases no poliméricos. La fase continua del sistema inicial puede contener un agente potenciador de la separación de fases no polimérico para inducir la separación de fases de una proteína durante el enfriamiento. De conformidad con la presente invención, se pueden formar partículas esféricas pequeñas de subtilisina utilizando una mezcla de propilenglicol y etanol, sin el uso de polímeros. El propilenglicol sirve como un agente de depresión del punto de congelación, y el etanol sirve como el agente potenciador de la separación de fases en este sistema. El propilenglicol también ayuda a la formación de una forma esférica de las partículas esféricas pequeñas. Se preparó una solución de 20 miligramos/mililitro de subtilisina en propilenglicol al 35 por ciento - Formato al 10 por ciento - CaCI2 al 0.02 por ciento. Entonces la solución de propilenglicol al 35 por ciento - subtilisina se llevó hasta el etanol al 67 por ciento con mezcla. La solución permaneció transparente a temperatura ambiente. Sin embargo, cuando se enfrió a -20°C durante 1 hora, se formó una suspensión de partículas. Después de la centrifugación para recolectar las partículas, y de lavar con etanol al 90 por ciento, se llevó a cabo el Análisis de Tamaños de Partículas de Coulter, con etanol absoluto como el fluido de suspensión. Las partículas produjeron resultados Coulter, consistentes con las partículas separadas que tenían un diámetro promedio de 2.2 mieras, y el 95 por ciento de las partículas eran de entre 0.46 y 3.94 mieras. La evaluación con el microscopio de luz confirmó estos resultados, mostrando partículas sustancialmente esféricas. El análisis SEM de las partículas confirmó los resultados Coulter. La retención de la actividad enzimática de la subtilisina después de la conversión de la subtilisina en solución hasta partículas esféricas pequeñas de subtilisina, se confirmó mediante un ensayo colorimétrico. Las unidades totales de actividad teóricas para las partículas esféricas pequeñas se calcularon sustrayendo las unidades totales encontradas en el sobrenadante (después de la separación de las partículas de subtilisina) de las unidades totales de subtilisina ensayadas en la solución de etanol-subtilisina-propilenglicol antes del enfriamiento. Las unidades totales reales encontradas para las partículas esféricas pequeñas de subtilisina, divididas entre las unidades teóricas expresadas como un porcentaje, representan la retención de la actividad de subtilisina después de la formación de partículas. Mediante este cálculo, se retuvo el 107 por ciento de la actividad de subtilisina teórica después de la formación de las partículas esféricas pequeñas de subtilisina. Se debe entender que las modalidades dadas a conocer en la presente son meramente un ejemplo de la invención, que se puede incorporar en diferentes formas. Por consiguiente, los detalles específicos dados a conocer en la presente no deben interpretarse como limitantes, sino meramente como una base para las reivindicaciones, y como una base representativa para enseñar a un experto en la materia a emplear diversamente la presente invención virtualmente de cualquier manera apropiada. Las modalidades de la presente invención que se han descrito son ilustrativas de algunas de las aplicaciones de los principios de la presente invención, y se pueden hacer modificaciones, incluyendo las combinaciones de las características que se dan a conocer individualmente o que se reivindican en la presente.

Claims

REIVI NDICACION ES

1 . Una composición inyectable de micropartículas, la cual comprende una suspensión de micropartículas de proteína sustancialmente amorfas, proporcionando la composición una concentración de cuando menos aproximada mente 50 miligramos de esta proteína por mililitro de la composición mencionada , y la proteína tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Dáltones.

2. La composición de la reivindicación 1 , en donde las micropartículas de proteína comprenden anticuerpos.

3. La composición de la reivindicación 1 , en donde las micropartículas de proteína son anticuerpos monoclonales.

4. La composición de la reivind icación 1 , en donde las micropartículas de proteína son microesferas.

5. La composición de la reivindicación 1 , en donde las micropartículas de proteína son no cristalinas.

6. La composición de la reivindicación 1 , en donde las micropartículas de proteína comprenden componentes de anticuerpos monoclonales que se seleccionan a partir del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales, frag mentos de anticuerpos, moléculas de trampa, anticuerpos de una sola cadena, formas recombina ntes de los mismos, y combinaciones de los mismos.

7. La composición de la reivindicación 1 , en donde se dispersa una dosis clínicamente efectiva de la proteína de la composición en no más de aproximadamente 10 mililitros de la composición mencionada.

8. La composición de la reivindicación 6, en donde se dispersa una dosis de la proteína de la composición en no más de aproximadamente 10 mililitros de la composición mencionada.

9. La composición de la reivindicación 6, en donde la proteína tiene un tamaño de partícula promedio no mayor a aproximadamente 50 mieras, y la composición inyectable pasa a través de una aguja para inyección de calibre 20 o más fina.

10. La composición de la reivindicación 1, en donde las micropartículas exhiben una velocidad de disolución después de su inyección que es más rápida que la de ias micropartículas cristalinas que tienen un tamaño de partícula promedio no mayor de aproximadamente 50 mieras, y la composición inyectable pasa a través de una aguja para inyección de calibre 20 ó más fina.

11. La composición de la reivindicación 1, en donde cuando menos aproximadamente el 90 por ciento de la proteína está químicamente intacta como dicha proteína en las micropartículas.

12. La composición de la reivindicación 1, en donde las micropartículas tienen un recubrimiento.

13. La composición de la reivindicación 12, en donde las el recubrimiento encapsula a las micropartículas dentro de matrices.

14. La composición de la reivindicación 12, en donde el recubrimiento encapsula con múltiples capas de electrolitos.

15. La composición de la reivindicación 12, en donde las micropartículas incluyen además un excipiente.

16. Microesferas que comprenden un anticuerpo, siendo este anticuerpo sustancialmente amorfo.

17. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde esta micropartícula es no cristalina.

18. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

19. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde esta micropartícula es una microesfera que tiene un tamaño de partículas no mayor a aproximadamente 50 mieras.

20. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde esta micropartícula comprende un anticuerpo monoclonal seleccionado a partir del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, fragmento de anticuerpo monoclonal, molécula de trampa, anticuerpo de una sola cadena, forma recombinante de los mismos, y combinación de los mismos.

21. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde este anticuerpo tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Dáltones.

22. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde esta micropartícula incluye un recubrimiento.

23. La micropartícula de la reivindicación 22, en donde este recubrimiento encapsula a las micropartículas dentro de matrices.

24. La micropartícula de la reivindicación 22, en donde este recubrimiento encapsula con múltiples capas de electrolitos.

25. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde un recubrimiento encapsula a la micropartícula con un excipiente.

26. La micropartícula de la reivindicación 16, en donde este anticuerpo comprende de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 100 por ciento en peso de la microesfera, basándose en el peso total de la microesfera.

27. La composición que tiene posibilidad de inyección con aguja de calibre fino en altas concentraciones, la cual comprende micropartículas de anticuerpo sustancialmente amorfas.

28. La composición de la reivindicación 27, en donde esta micropartícula es no cristalina.

29. La composición de la reivindicación 27, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

30. La composición de la reivindicación 27, en donde la micropartícula es una microesfera que tiene un tamaño de partícula no mayor a aproximadamente 50 mieras.

31. La composición de la reivindicación 27, en donde las micropartículas de proteína comprenden componentes de anticuerpos monoclonales que se seleccionan a partir del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos monoclonales, moléculas de trampa, formas recombinantes de los mismos, y combinaciones de los mismos.

32. La composición de la reivindicación 27, en donde el anticuerpo tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Dáltones.

33. La composición de la reivindicación 27, la cual incluye además un recubrimiento sobre las micropartículas mencionadas.

34. La composición de la reivindicación 27, en donde las micropartículas incluyen además un excipiente.

35. Un proceso para la preparación de micropartículas, el cual comprende combinar un componente de anticuerpo y un polímero que es soluble en agua o soluble en un solvente miscible en agua, en una solución acuosa, para proporcionar una composición de componente de anticuerpo sustancialmente amorfa, y formar micropartículas a partir de esta composición.

36. El proceso de la reivindicación 35, el cual comprende un paso adicional de cambiar la temperatura de la composición.

37. El proceso de la reivindicación 35, en donde el paso de cambiar la temperatura disminuye la temperatura de la composición.

38. El proceso de la reivindicación 35, en donde el paso de cambiar la temperatura eleva la temperatura de la composición.

39. El proceso de la reivindicación 35, en donde la formación de las micropartículas incluye remover el polímero de la composición.

40. El proceso de la reivindicación 35, en donde el componente de anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, fragmento de anticuerpo monoclonal, molécula de trampa, forma recombinante de los mismos, y combinación de los mismos.

41. Un método para administrar una composición altamente concentrada de un anticuerpo a través de una aguja de una jeringa, el cual comprende: combinar un anticuerpo y un polímero en una solución acuosa para proporcionar una solución de anticuerpo, y formar micropartículas a partir de esta solución; cargar las micropartículas en una unidad de jeringa que tenga una aguja de calibre fino, como una suspensión de no más de aproximadamente 10 mililitros en una concentración de cuando menos aproximadamente 50 miligramos de anticuerpo por mililitro de la composición; y administrar esta dosis de las micropartículas a un individuo mediante la inyección de la suspensión a través de la jeringa mencionada.

42. El método de la reivindicación 41, en donde el componente de anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste en anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, fragmento de anticuerpo monoclonal, molécula de trampa, forma recombinante de los mismos, y combinación de los mismos.

43. El método de la reivindicación 41, en donde la aguja de la carga y administración es de calibre 20 ó más fina. RESU MEN La presente invención se refiere a una composición de micropartículas q ue comprenden una suspensión de micropartículas de proteína sustancialmente amorfas, proporcionando la composición una concentración de cuando menos aproximadamente 50 miligramos de dicha proteína por mililitro de la composición , y la proteína tiene un peso molecular de cuando menos aproximadamente 25,000 Dáltones. De acuerdo con el método de producción , el agente activo se disuelve en un solvente acuoso o miscible en agua q ue contiene un agente potenciador de la separación de fases (PSEA) disuelto, para formar una solución en una sola fase l íq uida . La solución se somete a una separación de fases l íq uida-sólida para hacer que el agente activo forme pequeñas esferas que son sustancialmente amorfas o no cristalinas, y que se pueden inyectar a través de las agujas de cali bre fino en altas concentraciones. La invención tiene una aplicación especial para las proteínas de más alto peso molecular. * * * * *