MX2010007728A - Composiciones proteinicas en polvo y metodos para elaborar las mismas. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para preparar un polvo de proteína o péptido que incluye secar por aspersión una solución que incluye más de, por ejemplo, aproximadamente 50 mg/ml de una proteína o péptido (por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo), y por lo menos un excipiente. También se proporcionan composiciones en polvo estables que incluyen una proteína y un excipiente que tiene menos de, por ejemplo, aproximadamente 6 por ciento de humedad residual.

Description

COMPOSICIONES PROTEINICAS EN POLVO Y METODOS PARA ELABORAR LAS M IS M AS SOLIC ITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la prioridad d|e la solicitud de patente Norteamericana provisional número 61 /021 [298 , presentada el 15 de Enero del 2008, cuyo contenido se incorpora en su totalidad en la presente para referencia.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCION Un principio básico de las formulaciones proteín icas farmacéuticas es que es necesario, superar ciertas inestabilidades Las. rutas de degradación de las proteínas pueden separarse en dos I clases distintas, las que tienen que ver con la inestabilidad qu m ica y la inestabilidad física. Las inestabilidades quím icas provocan la modificación de la proteína a través de la formación de enlaces o división . Los ejemplos de problemas de inestabilidad qu mica incluyen desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación , beta eliminación e intercambio de bisulfuro. Por otro lado , las I inestabilidades físicas no provocan cambios covalentes en las proteínas. En lugar de ello, tienen que ver con cambios en la estructura de orden superior (secundario y su perior) de las proteínas. Estos incluyen desnaturalización , adsorción en superficies, agregación y precipitación. Manning et al. , Pharm . Res. r i 6, 903 ( 1 989). ¡ Después del descubrimiento de la estructura del ADN por Watson y Crick (1953) y la conclusión subsiguiente del proyecto de secuenciacíón del genoma humano, el interés en la química de las proteínas creció con gran rapidez. La relación entre los genes y sus productos proteínicos en la enfermedad, tejidos o desarrollo fue de particular interés. Next generation pharmaceutical, Publicación 6 (GDS publishing Ltd., 2006). Durante las décadas que transcurr eron en ese período, el número de farmacéuticos a base de proteínéis se incrementó muy rápido. Hoy día, ciertas proteínas o péptidos pueden aislarse o sintetizarse.^ modificarse y liberarse para aliviar o curar ciertos trastornos y enfermedades. La ruta de aplicación principal para los farmacéuticos a base de proteínas aún es la inyección intravenosa de formulaciones líquidas, pero también se han probado y utilizado otras rutas.

Se han realizado muchos esfuerzos para transformar soluc ones proteínicas en forma sólida. Las composiciones en polvo ofrecen muchas ventajas, por ejemplo, es posible almacenar otras o transportar mayores cantidades de proteínas utilizando mucho enos espacio y peso y el consumo de energía es menor que el requerido para enfriar las formulaciones líquidas durante el almacenamiento y el envío. Las composiciones en polvo también facilitan nuevas rutas de liberación, tales como inhalación (Tzannis et a/, International Publication No. WO 2005067898), o inyección sin aguja (Burkoth, The Drug Delivery Companies Report 76-78 (2001)). Se han empleado varios métodos para producir polvos a partir de soluc ones proteínicas acuosas, entre estos se encuentra el secado] por aspersión, liofilización por aspersión, liofilización o precipitación de fluidos supercríticos o soluciones (parcialmente) orgánicas. Wnters et al., Journal of Pharm. Sci 85(6): 586-594 (1996). A diferencia de la liofilización, que es muy costosa y lenta, el secado por aspersión es un medio efectivo y eficiente para producir sólidos cargados con proteínas que proporcionan oportunidades para el desarrollo de nuevas formas de liberación para los biofarmacéuticos, tales como la inhalación. aa el al., Pharm. Res. 16(2): 249-254 (1999).

Liofilizar una solución proteínica pura implica el riesgo de provocar una desactivación parcial, que de manera automática lleva a un producto farmacéutico de menor calidad. Por ejemplo, la desactivación puede provocarse por la tensión física relacionad! con el proceso debido a altas temperaturas, tensión cortante y lá gran interfaz de fases (líquida/gaseosa), tal como la desnaturalizac ón o agregación o por reacciones químicas, por ejemplo, hidrólisis u oxidación.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con métodos ! | para formulaciones proteínicas de secado por aspersión que comprenden una proteína y un excipiente. De manera específica, los métodos y composiciones de la invención se basan en un proceso de secado por aspersión en donde una solución que contiene la proteína de interés y un excipiente se seca por aspersión.

La formulación de la invención tiene muchas ventajas sobre las soluciones y formulaciones de liofilización estándar. En particular, los métodos de secado por aspersión de la invención minimizan la degradación relacionada con el proceso e incrementan la estabi idad proteínica a temperaturas ambiente (por ejemplo, en comparación con las composiciones de liofilización). Además, las formulaciones de secado por aspersión también son fáciles de transportar y son i útiles para la fabricación de formulaciones con alta concentración, lo que mejora la biodisponibilidad de la proteína y el desarrollo de formulaciones de liberación local (por ejemplo, liberación pulmonar) y formulaciones de liberación lenta (por ejemplo, liposomales y microesferas recubiertas con PLGA (poli(D,L-láctido-co-glicólidó)). i Los métodos y composiciones de la invención pueden utilizarse para proporcionar una composición o formulación en polvo estable que incluye cualquier proteína de interés-excipiente. En un aspecto, los métodos y composiciones de la invención se utilizan para anticuerpos y fragmentos de los mismos, que incluyen aquellos utilizados para propósitos in vivo e in vitro. En una modalidad adicional, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de • ¦ i inmunoglobulina G (IgG). ! Además, los procesos de purificación y concentráció i de etapas múltiples que son necesarios para preparar las formulac ones proteínicas y peptídicas a menudo introducen variabilidad en las composiciones, de modo que la composición precisa de una formulación, puede variar de un lote a otro. Los reglamentos federales requieren que las composiciones farmacológicas sean altamente consistentes en sus formulaciones, sin importar la ubicación de fabricación o número de lote. Los métodos de la invención pueden utilizarse para crearse formulaciones en polvo de proteínas a las que se añaden excipientes en cantidades precisas , lo que permite la creación de formulaciones proteínicas | con concentraciones precisas de excipientes. 1 En un aspecto, la invención proporciona un método para preparar un polvo proteínico o peptídico que incluye una sol ución de secado por aspersión que comprende más de alrededor de 50 ¡mg/ml de una proteína o un péptido, y se prepara , por lo menos un excipiente, tal como un polvo proteínico o peptídico . En algu nas modalidades, la solución comprende más de alrededor de 1 00 mg/m l de la proteína o péptido. La proteína también puede ser una pro eína de unión de dominio de unión variable doble (DVD).

En algunas modalidades, el método incluye preparar u n polvo de anticuerpos, que incluye una solución de secado por aspersión i que comprende más de alrededor de 50 mg/ml de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo y se prepara por lo menos un excipiente, tal como un polvo de anticuerpos. u nas modalidades, la solución comprende más de alrededor de 1 00 mg/m l del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede ser una inmunoglobulina G (IgG), por ejemplo, MAK 195F, Adalimumab ; A BT-325, ABT-308 o ABT- 147. En algunas modalidades, el pol l o es estable a temperaturas y humedad ambiente durante por lo menos tres meses y/o es estable a 40°C durante por lo menos tres meses .

El excipiente puede incluir, por ejemplo, trehalosa, sacarosa , sorbitol , polietilen glicol, por lo menos un aminoácido, histidina , alanina , arginina, glicina, o una mezcla de los mismos. En algunas modalidades, la solución incluye una proporción de excipiente: proteína de entre alrededor de 0.27: 1 .0 y alrededor de 2.8: 1 .0, entre alrededor de 0.27: 1 .0 y alrededor de 1 .4: 1 .0, entre alrededor de 0.27: 1 .0 y alrededor de 0.7: 1 .0, o una proporción de j alrededor de 0.7: 1 .0. En algunas modalidades, la solución com prende entre alrededor de 20 y alrededor de 30 mM de excipiente, o alrededor de 25 mM de excipiente.

En algunas modalidades, el método incluye secar por aspersión i con una temperatura de aire de entrada (Ten.) entre alrededor de 100°C y alrededor de 1 80°C, y una temperatura de aire de sal ida (Tsai .) entre alrededor de 60°C y alrededor de 1 10°C. En ci srtas modalidades, el método incluye secar por aspersión con una fe n de alrededor de 130°C y una Tsai. de alrededor de 80°C . El método puede incluir, por ejemplo, atomizar la solución para formar gotas pequeñas de la solución, secar las gotas pequeñas con un gas para formar un polvo, y recuperar el polvo a partir del gas. El método puede incluir atomizar la solución con un atomizador de boquil la presurizada y/o separar y recuperar el polvo de anticuerpos a jarti r del gas con un ciclón.

El método también puede incluir integrar el polvo de anticuerpos en un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser aceptable pa ra administración parental, oral, enteral, y/o tópica. El portador farmacéuticamente aceptable puede incluir un líquido tal como agua .

En otro aspecto, la invención se enfoca en una preparación farmacéutica que incluye una cantidad efectiva de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, preparada de acu erdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. En aún otro aspecto, la invención se enfoca en una preparación, farmacéutica que incluye una cantidad efectiva de una proteína o un péptido, preparado de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente.

En aún otro aspecto, la invención proporciona una composición en polvo estable que incluye una proteína o péptido, y un excipiente, en donde la composición incluye menos de alrededor de 6% de humedad residual, en algunas modalidades, menos de alrededor de 4% o 3% de humedad residual. La proteína o péptido puede inclu i r u n anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, tal como un anticuerpo de IgG o porción de unión a antígeno del mismo, tal como, por ejemplo, MAK 195F, Adalimumab, ABT-325, A BT-308 o ABT- 147. La proteína también puede ser una proteína de u nión de dominio de unión variable doble (DVD).

En algunas modalidades, la composición en polvo es estable a j temperaturas y humedad ambiente durante por lo menos tres meses y/o en alrededor de 40°C durante por lo menos tres meses . En por lo tanto, disminuir el riesgo durante la fabricación de productos farmacológicos, a incrementar la capacidad de salida . Además , los anticuerpos de longitud total/completos pueden ser menos propensos I a la degradación física en comparación con los fragmentos de anticuerpos monoclonales (mAb). Además, con frecuencia , existe un incremento m ínimo o nulo en la degradación física o qu ím ica con el incremento de concentración proteínica de hasta 100 mg/ml . Debido a que las soluciones con mayor concentración incrementarán la eficiencia del proceso, el uso de concentraciones proteínicas de 100 mg/ml será benéfico.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Estas y otras características y ventajas de los métodos y composiciones descritos en la presente se entenderán dé manera t más completa con referencia a la siguiente descripción detallada , en combinación con los dibujos anexos, en los que: La Figura 1 representa un secador por aspersión Büchi B- 191 como el que se utiliza en los ejemplos; La Figura 2 representa el rendimiento y Tg de diferentes mezclas de sorbitol-MAK; La Figura 3 representa la agregación, cristalinidad y contenido de agua de diferentes mezclas de sorbitol-MAK; La Figura 4 proporciona imágenes de microscopía de barrido de electrones (SEM) de mezclas de sorbitol-MAK a 3000x (a) 25mM (b) La Figura 5 representa el rendimiento y Tg de diferentes mezclas de trehalosa-MAK; La Figura 6 representa la agregación, cristalinidad y cont'enido de agua de diferentes mezclas de trehalosa-MAK; La Figura 7 proporciona imágenes de SEM de mezclas de trehalosa (3000x) (a) 10mM de trehalosa; (b) 100mM de trehalosa, y (c) trehalosa pura de secado por aspersión; La Figura 8 representa el rendimiento y la Tg de diferentes mezclas de sacarosa-MAK; La Figura 9 representa la agregación, cristalinidad y contenido de agua de diferentes mezclas de sacarosa-MAK; Las Figuras 10A-10B representan los datos de estabilidad física de la cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) de las formulaciones de MAK 195F de secado por aspersión: (A) efec o del sorbitol, trehalosa y sacarosa y (B) efecto de la concentración estabilizadora en la cantidad de agregación proteínica; y Las Figuras 11A-11B representan el efecto del procesamiénto y almacenamiento de 3 meses (A) en la estabilidad física y (B) en la estabilidad química de MAK 195F de concentración elevaca de secado por aspersión, Adalimumab, y ABT-325 en soluciones de trehalosa de 200 nM.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I. Definiciones Para que la presente invención pueda entenderse con mayor facilidad , primero se definirán ciertos términos.

Como se utiliza en la presente, el término "componente acido" se refiere a un agente, que incluye una solución, que tiene un pH ácido, es decir, menor que 7.0. Ejemplos de componentes ácidos incluyen ácido fosfórico, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido mélico, ácido glicólico y ácido fumárico.

Como se utiliza en la presente, el término "antioxidante" ¡tiene como propósito significar un agente que inhibe la oxidación o actúa como un sinérgico antioxidante y, por lo tanto, se utiliza para im ped i r el deterioro de las preparaciones mediante el proceso oxidante . Tales compuestos incluyen a modo de ejemplo y sin limitación, Alfa tocoferol (Vitamina E), ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, ácido cítrico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido edético (EDTA, edetato) y sales de los mismos, ácido hidrofosforoso, ácido málico, monotioglicerol, ácido propiónico, galato de propilo, metionina, ascorbato de sodio, citrato de sodio, sulfuro de sodio, sulfito de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, y; otros conocidos para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica .

A menos que se indique lo contrario en la presenté, los términos "composición" y "formulación" se utilizan de manera indistinta.

El término "excipiente" se refiere a un agente que puede i añadirse a una formulación para proporcionar una consistencia deseada, por ejemplo, alterar las propiedades a granel, para mejorar la estabilidad y/o ajustar la osmolalidad. Los ejemplos de excipientes utilizados con frecuencia incluyen, pero sin limitarse a, agentes estabilizadores, azúcares, polioles, aminoácidos, tensioactjivos, agentes quelantes y polímeros.

El término "producto farmacéutico" como se utiliza e|n la presente con referencia a una composición, por ejemplo, una formulación acuosa, es un producto útil para tratar una enfermedad o i un trastorno. J El término "proteína" tiene como propósito incluir una secuencia de aminoácidos para que la longitud de la cadena suficiente para producir los niveles más elevados de una estructura secundaria y/o terciaria y/o cuaternaria. Esto es para distinguir a de los "péptidos" u otras moléculas de peso molecular pequeño que no tienen tal estructura. Los ejemplos de proteínas comprendidas dentro de la definición utilizada en la presente incluyen ¡proteínas terapéuticas. Una "proteína terapéuticamente activa" o "proteína terapéutica" se refiere a una proteína que puede utilizarse para propósitos terapéuticos, es decir, para el tratamiento de un trastorno en un sujeto. Debe observarse que aunque es posible utilizar proteínas terapéuticas para propósitos de tratamiento, la invención no se limita a tal uso, ya que las proteínas también pueden utilizarse para estudios in vitro. En una modalidad preferida, la prpteína terapéutica es una proteína de fusión o un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo. En una modalidad, los métodos y i composiciones de la invención comprenden por lo menos dos proteínas distintas, que se definen como dos proteínas que tienen I distintas secuencias aminoácido. Las proteínas distintas ad icionales no incluyen productos de degradación de una proteína.

El término "polvo proteínico" se refiere a una composición que comprende una proteína que está elaborada de acuerdo con lo métodos de secado por aspersión de la invención . U n "polvo de anticuerpo" se refiere a una composición que incluye un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, elaborada de acuerdo con los métodos de secado por aspersión de la invención.

El término "formulación farmacéutica" se refieré preparaciones que están en una forma tal que permiten que la actividad biológica de los ingredientes activos sea efectiva y, por lo tanto, puedan administrarse a un sujeto para uso terapéutico.

El término "solución'' se refiere a una mezcla de por lo menos un excipiente o una proteína o péptido dentro de un l íqu ido . La solución puede incluir moléculas proteínicas disueltas, moléculas proteínicas disueltas coloidales, agregados o cristales proteí iicos dispersos o precipitados o suspensiones dentro del l íq u ido , o combinaciones de los mismos.

Una composición "estable" es una en la que la proteína que se encuentra en ésta, por ejemplo, conserva en esencia su estabil idad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica d uran :e el I procesamiento y/o almacenamiento. Varias técnicas anal íticas pa ra medir la estabilidad proteínica se encuentra disponibles en la té cnica y se mencionan en, por ejemplo, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., Pubs. (1991) y Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). En una modalidad, la estabilidad de la proteína se determina de acuerdo con el porcentaje de proteína monomérica en la solución, con un bajo porcentaje de proteína degradada (por ejemplo, fragmentada) y/o agregada. Por ejemplo, una composición acuosa que incluye una proteína estable puede incluir por lo menos 95% de proteína monomérica. De manera alternativa, una composición acuosa de la invención puede incluir no más de 5% de proteína agregada y/o degradada.

El término "agente estabilizador'' se refiere a un excipiente que mejora o de otra manera aumenta la estabilidad. Los agentes estabilizadores incluyen, pero sin limitarse a, ácido a-lipoic , a-tocoferol, palmitato de ascorbilo, alcohol bencílico, bisulfitos, joro, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), ácido ascórbico y sus ésteres, carotenoides, citrato de calcio, acetil-L-carnitina, agentes quelantes, condroitina, sulfato de condroitina, ácido cítrico, coenzima Q-10, EDTA (ácido etilendiamino tetraacético; edetato disódico), ácido eritórbico, ácido fumárico, alquil galatos, glucosamina (quitosan, hialuronato de sodio), ácido mélico, metabisulfito, galato de propilo, bisulfito dé isodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, sulfito de potasio, ácido tartárico, tiosulfatos, tioglicerol, tocoferol y sus ésteres, por ejemplo, acetato de tocoferol, succinato de tocoferol, tocotrienal, acetato de d-a-tocoferol, vitamina C y sus ésteres, vitamina E y sus ésteres, por ejemplo, acetato de vitamina E, y combinaciones de los mismos;. j Como se utiliza en la presente, el término "modificador de tonicidad" pretende significar un compuesto o compuestos q ue pueden utilizarse para ajusfar la tonicidad de una formulación líquida. Los modificadores de tonicidad adecuados incluyen glicerina , lactosa, manitol, dextrosa, cloruro de sodio, sulfato de mag nesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, sorbitol , trehalosa, sacarosa , rafi nosa , maltosa y otros conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. En una modalidad, la tonicidad de i formulación líquida es aproximadamente similar a la de la tonicidad de la sangre o plasma.

El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente incluye anticuerpos completos o cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas únicas del mismo . U n "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que por lo general incl uye por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de bisulfuro o una porción dé uni ón a antígeno de los mismos. El término "anticuerpo" también in cluye variantes naturales aisladas del mismo. Cada cadena pesada está comprendida dentro de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Cm , CH2 y CH3 Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente corro VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL- Las regiones H! y Vt pueden subdividirse además en regiones de hiper variabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CjDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y c jatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno Las regiones constantes de los anticuerpos pueden intervenir en la unión de la inmunoglobulina con tejidos huésped o factores que incluyen varias células del sistema inmunológico (por ejemplo, celdas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema] de complementos convencional.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se utiliza en la presente, , t se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad para unirse de manera específica con un antígeno (por ejemplo, TNFa, IL-12, IL-13). La función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un Fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHi¡ (ü) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos Fragmento Fabs unidos por un puente de bisulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmen o Fd que consiste de los dominios VH y CHi ; (iv) un fragmentó Fv¡ que consiste de los dominios L y VH de un solo brazo de un anticuerpo , (v) un fragmento dAb (Ward et al. , (1989) Nature 341 :544-546) que consiste de un dominio de VH o VL; y (vi) una región determinan e de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dom i n ios del fragmento Fv, VL y VH se codifican por genes separados, pueden un irse, utilizando métodos recombinantes, mediante un conectó ' que les permite constituirse como una cadena de una sola proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv) ; véase , por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. ( 1 988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende que tales anticuerpos de una sola cadena estén comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo . Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando téc nicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la técnica y los fragmentos se seleccionan para detectar su utilidad en la misma manera que los anticuerpos intactos. En una modalidad de la invención, el fragmento de anticuerpo se selecciona de un grupo que consiste de un Fab, un Fd, un Fd', un Fv de una sola cadena (scFv) , un scFva, y un anticuerpo de dominio (dAb) .

Además, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mas grande, formada por asociación covalente o monocovalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Estas otras proteínas o péptidos pueden tener func ones que permiten la purificación de los anticuerpos o porción de unión a antígenos de los mismos o permitir su asociación con cada molécula o cada una de las moléculas. De esta manera, los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de una región ce ntral de estreptavidina para generar moléculas de fragmentos variables de una sola cadena tetramérica (scFv) (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina e n C-terminal para generar moléculas bivalentes y de scFv biotinilado (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2,' p'ueden prepararse a partir de anticuerpos completos utilizando técticas convencionales, tales como digestión por papaína o pepsine, de manera respectiva, anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpos y moléculas de inmunoadhesión puje den obtenerse utilizando técnicas de ADN recombinante estándar Dos dominios de anticuerpos son "complementarios" cuando pertenecen a familias o estructuras que forman pares o grupos cognados o se derivan de tales familias y conservan | esta característica. Por ejemplo, un dominio VH y dominio VL dé un anticuerpo son complementarios; dos dominios VH no son complementarios, y dos dominios VL no son complementarios. Los dominios complementarios pueden encontrarse en otros mieínbros de la superfamilia de la ¡nmunoglobulina, tal como los dominios Va y \/ß (o gama y delta) del receptor de linfocitos T.

El término "dominio" se refiere a una estructura prote ín ica plegada que conserva su estructura terciaria de mi nera independiente del resto de la proteína. En general, los dominios son responsables por las propiedades funcionales discretas de las proteínas y, en muchos casos, pueden añadirse , extraerse o transferirse a otras proteínas sin perder la función del resto de la proteína y/o del dominio. Un dominio variable de un solo anticuerpo significa un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de anticuerpos . Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpo completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más buclés han sido reemplazados por secuencias que no son características ele los dominios variables de anticuerpos o los dominios variable ; de anticuerpos que se han truncado o comprenden extensiones en N- o C-terminal, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan por lo menos en parte la actividad de unión y la especificidad del dominio de longitud total.

Los dominios variables de la invención pueden combinarse para formar un grupo de dominios; por ejemplo, dominios complementarios pueden combinarse, tales como dominios VL pueden combinarse con dominios VH- Los dominios no complementarios también pu eden combinarse. Los dominios pueden combinarse en varias maneras, que tienen que ver con la unión de los dominios mediante medios covalentes o no covalentes.

Un "dAb" o "dominio de anticuerpo" se refiere a un pólipeptido de dominio variable de un solo anticuerpo (VH o VL) que se une de manera específica con un antígeno.

Como se utiliza en la presente, el término "región dé un ón a antígeno" o "sitio de unión a antígeno" se refiere a la porción o porciones de una molécula de anticuerpo o una porción de un ón a antígeno del mismo, que contiene los residuos de aminoácidos que i interactúan con un antígeno y proporcionan al anticuerpo su especificidad y/o habilidad para el antígeno.

El término "epítopo" se refiere a la porción de cualquier i molécula capaz de ser reconocida y unida por un anticuerpo en una o más de las regiones de unión de antígeno del anticuerpo. En el contexto de la presente invención, se entiende que el prinrer y segundo "epítopos" son epítopos que no son los mismos y no se unen mediante un solo anticuerpo monoespecífico o porción de unión a antígeno del mismo.

La frase "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan a través de medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una [célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmun glo!bulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que tenga que ver con dividir secuencias genéticas de inmunoglobulina particulares (tales j :omo secuencias genéticas de inmunoglobulina humana) en ; otras secuencias de ADN. Los ejemplos de anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados.

El término "anticuerpo humano9 se refiere a anticuerpos que tienen regiones constantes y variables que corresponden a, o se derivan de, secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana como se describe por, por ejemplo, Kabat ef al. (Véase, Kabat, et al. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and H uman Services, NIH Publication No. 91-3242). Sin embargo, los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por i mutagénesis aleatoria o sitio específica in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo las CDRs y en particular CDR3. i Los anticuerpos recombinantes humanos de la invención tienen regiones variables y también pueden incluir regiones constantes, derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea gemina! humana (Véase, Kabat ef al. (1991) Sequences of Prqteírs of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Sin embargo, en ciertas modalidades, tales anticuerpos recombinantes humanos se someten a una mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un an imal I transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y de ésta, las secuencias aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunq ue se derivan de y se relacionan con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de manera natural dentro del repertorio in vivo de la línea germinal de anticuerpos humanos . Sin embargo, en ciertas modalidades, tales anticuerpos recombi na ntes son el resultado de mutagénesis selectiva o retromutación o am bas .

El térm ino "retromutación" se refiere a un proceso n é que algunos o todos los aminoácidos que mutan de manera somática de un anticuerpo humano son reemplazados por residuos de la l ínea germinal correspondiente de una secuencia de anticuerpos de la línea germinal homologa. Las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano de la invención se alinear por separado con las secuencias de la l ínea germinal en la base de datos VBASE para identificar las secuencias con la homolog ía más elevada . Las diferencias en el anticuerpo humano de la inve nción aparecen en la secuencia de la línea germinal al mutar posiciones de nucleótidos definidos que codifican tal aminoácido o aminoácidos diferentes. El papel de cada aminoácido se identifica de esta manera como candidato para retromutación y debe investigarse para detectar su papel directo o indirecto en la unión a antígenos y cualquier aminoácido que, después de la mutación, admite cualquier característica deseable del anticuerpo humano, no debe incluirse en el anticuerpo humano final. Para minimizar el número de aminoácidos sujetos a retromutación , las posiciones de aminoácido que se encuentran son diferentes de la secuencia de la línea germinal mas cercana pero idénticas al aminoácido correspondiente en una secuencia de línea germinal pueden permanecer, siempre que la segunda secuencia de la línea germinal sea idéntica y colinéal con la secuencia del anticuerpo humano de la invención durante por lo menos 1 0, de preferencia 12 aminoácidos, en ambos lados del aminoácido en cuestión. La retromutación puede ocurrir en cualquier etapa de la optimización del anticuerpo.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos qu e comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera de una especie y secuencias de región constan e de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera de murino unidas con regiones constantes humanas.

El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región de cadena pesada y cadena ligera de un especie, pero en las que las secuencias de una o más regiones de CDR de VH y/o L se reemplazan con secuencias de CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de murino en las que una o más de las CDR de murino (por ejem p l o C DR3) han sido reemplazadas con secuencias CDR humanas. j i El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos caso de las preparaciones convencionales. Existen venjtajas adicionales para el desarrollo de productos farmacológicos! con respecto a la capacidad para obtener formulaciones de | alta concentración , biodisponibilidad mejorada, liberación local (por ejemplo, liberación pulmonar), liberación lenta (por ejemplo, liposomas y microesferas recubiertas con PLGA) y nuevas formas d e dosificación proteínicas sólidas o en hidrogel que pueden administrarse en una variedad de maneras, que incluyen por vis oral y tópica . En consecuencia, en algunas modalidades, los mél odos también incluyen procesamiento adicional, por ejem plo , incorporación de la composición en polvo en composiciones de liberación lenta recubierta, liposomas, microesferas recubiertás con P LGA, incorporación dentro de matrices de excipientes mediante extrusión por fusión y similares. Las composiciones resultantes también son modalidades adicionales de la presente invención , por ejemplo, composiciones de liberación lenta o dirigida y/o composiciones que permiten vías de administración alternativas, por ejemplo, administración oral, dérmica y enteral. Otra ventaja es q ue las composiciones de la presente invención pueden procesar se a temperaturas más elevadas que las preparaciones convencionales Por ejemplo, los polvos pueden procesarse a través de tecnolog ía de extrusión por fusión, tal como la tecnología de extrusión por fusión M ELTREX. ! En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para preparar de manera eficiente y efectiva polvos estables que inc uyan una o más proteínas o péptidos. En ciertas modalidades,! las proteínas o péptidos son anticuerpos y/o una porción de unión a antígeno de los mismos. El método para preparar el polvo incluye secar por aspersión una solución de una proteína, péptido , anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo. Por ejemp o , la solución puede incluir por lo menos alrededor de 50 mg/ml de la proteína, péptido, anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo. En modalidades adicionales, la solución puede tener u na concentración diferente, por ejemplo, entre más concentrada por i ejemplo, la solución puede incluir por lo menos alrededor de j¦ 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 1 30 mg/ml, 1 50 mg/ml, 180 mg/ml, etc. de la prote ína , I péptido, anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo. La solución también puede incluir uno o más excipientes. El método puede incluir concentrar o concentrar de manera adicional la solución a través de cualquier método conocido, que incl uye, por ejemplo, ultrafiltración. La proteína o péptido puede ser cualquier proteína o péptido adecuado. La proteína puede ser un anticue po o porción de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo de inmunoglobulina G (IgG) o porción de unión a antígeno del mismo .

I En ciertas modalidades, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, es MAK 195F, Adalimumab, ABT-325, ABT-308 o¡ A BT-147. ! En algunas modalidades, la solución incluye un excipiente Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitarse a , trehallosa , sacarosa , sorbitol, políetilen glicol, por lo menos un aminoácido, histidina, alanina, arginina, glicina o una mezcla de los m ismos . El método puede incluir además añadir un componente ácido, antioxidante, y/o modificador de tonicidad a la solución o al polvo.

La solución puede incluir entre alrededor de 15 y alrededor de 140 mM, o entre alrededor de 20 y alrededor de 30 mM de excipi ente . En ciertas modalidades, la solución incluye alrededor de 25 m vi de excipiente. En algunas modalidades, la solución comprende una proporción de excipiente: proteína de entre alrededor de 0.27: 1 .0 y alrededor de 2.8: 1 .0, entre alrededor de 0.27: 1 .0 y alrededor de 1 .4 : 1 .0, o entre alrededor de 0.27: 1 .0 y alrededor de 0.7: 1 .0. En ciertas modalidades, la solución comprende una proporción I de excipiente: proteína de alrededor de 0.7: 1 .0.

En algunas modalidades, la solución tiene un bajo porcentaje de agregados proteínicos, a pesar de la alta concentración de la formulación proteínica acuosa. En una modalidad , la solución acuosa i ncluye agua y una alta concentración de una proteína, por ejemplo, anticuerpos, contiene menos de alrededor de 5% de agregados proteínicos, incluso en la ausencia de un tensioactivo u otro tipo de excipiente. En una modalidad, la solución comprende no más de alrededor de 7.3% de agregado proteínico; la solución comprende no más de alrededor de 5% de agregado proteínico; la solución comprende no más de alrededor de 4% de agregado proteínico ; la solución comprende no más de alrededor de 3% de agregado proteínico; la solución comprende no más de alrededor de 2% de secar por aspersión con una temperatura de aire de entrada (Te n¡.) de entre alrededor de 1 00°C y alrededor de 1 80°C y una temperatura de aire de salida (Tsa, ) de entre al rededor de 60°C y alrededor de 1 1 0°C . En ciertas modalidades, el método incluye secar por aspersión con una Te nt. de alrededor de 130°C y una Tsa . de alrededor de 80°C.

En algunas modalidades, el contenido de humedad residua l de la composición en polvo resultante es de entre alrededor de 1 % y alrededor de 3%, entre alrededor de 1 .5% y 2.5%, entre alrededor de 1 .4% y alrededor de 2%, entre alrededor de 4% y alrededor de 6% , o entre alrededor de 4.5% y alrededor de 5%. En otras modalidades la composición en polvo incluye alrededor de 1 %, 1 .5%, 2%, 2.5% 3% , 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, o 7% de humedad residual .

En una modalidad, el polvo es estable a temperaturas y humedad ambiente durante por lo menos 3 meses. En alg u nas modalidades, el polvo es estable durante por lo menos 6 meses, 9 meses, 1 año, 2 años, 3 años o 5 años a temperaturas y humedad ambiente. En otras modalidades, el polvo es estable a 40°C du ante por lo menos 3 meses. En modalidades adicionales, el polvo es estable a 40°C durante por lo menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1 año, 2 años o 5 años.

En algunas modalidades, el secado por aspersión i ncluye atomizar la solución para formar gotas pequeñas de la sol u ción , secar las gotas pequeñas con un gas para formar un pol vo y recuperar el polvo a partir del gas. La solución puede atomizarse empleando, por ejemplo, un atomizador de boquilla presurizada. El polvo puede recuperarse empleando, por ejemplo, un ciclón ! Los métodos ejemplares de secado por aspersión se presentan y ejemplifican en la presente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método |para preparar una preparación farmacéutica que puede incluir cualquiera de los métodos descritos en la presente para preparar un polvo y además incluye mezclar (por ejemplo, integrar o disolver) el polvo I con un portador farmacéuticamente aceptable. El por ador farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier portador aceptable para administración parental, oral, enteral, o tópica. El por ador puede ser sólido, semi-sólido o líquido (por ejemplo, agua) o combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, el método incluye disolver el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, el polvo en un portador farmacéuticamente aceptable. El por ador farmacéuticamente aceptable puede, por ejemplo, ser aceptable para administración parental y puede incluir, por ejemplo, agua. Él método puede incluir además añadir uno o más componentes ácidos, antioxidantes y/o modificadores de tonicidad a la composición t farmacéutica. De manera adicional o alternativa, se pueden añadir aditivos adecuados a las composiciones farmacéuticas de la invención, por ejemplo, reguladores, modificadores de viscosidad, saborizantes, colorantes, etc. i j El método puede incluir además procesar una composición en ácido acético glacial.

Secado por Aspersión En una secadora por aspersión, un fluido bombeable (sol ución , suspensión , emulsión o pasta) se transforma en una forma de partículas secas. El proceso combina la formación de partículas y el i secado en una etapa al atomizar el l íquido introducido en un medio de secado caliente (por lo general, aire o gases inertes) . En alg unas modalidades de la presente invención, las soluciones proteín icas concentradas se secan por aspersión. En consecuencia, los métodos de la invención pueden incluir concentrar soluciones prote ín icas empleando cualquier método adecuado. En algunas modalidades , se emplean técnicas de Filtración de Flujo Tangencial (TFF) ya que se trata de un método muy rápido y sutil. Sin embargo, es posible utilizar de manera adicional o alternativa filtración de flujo o d iál isis normal .

La atomización del fluido resulta en un incremento en la superficie del líquido y, por lo tanto lleva a tiempos de secado muy cortos. Por ejemplo, dism inuir el tamaño de las gotas pequeñas de 10 pm a 1 pm resulta en un incremento en el área superficial de; 600 a 6000 m2 y disminuye su tiempo de secado por un factor 100 (de 0.01 segundo a 0.0001 segundos). Stahl, Feuchtigkeit und Trocknen in der Pharmazeutischen Technologie. Dr. Dieter Steinkopf Verlag GmbH & Co. KG, Darmstadt ( 1999).

El contacto entre el líquido introducido y el aire de secado puede ocurrir en dos modos diferentes. En un sistema co-corri inte , el aire de secado y las partículas (gotas pequeñas) se mueven a través de la cámara de secado en la misma dirección. Este es el modo preferido para material sensible al calor (tal como las proteínas), debido a que el aire más caliente entra en contacto con i las gotas pequeñas húmedas. Cuando el aire de secado y las gotas pequeñas se mueven en una dirección opuesta, ésta se denomina un modo de contracorriente. Las partículas producidas en el modo de contracorriente por lo general muestran una temperatura! más elevada que el gas de escape. El gas de escape per se puede dejar el sistema ("ciclo abierto") o puede recircular ("ciclo cerrado" esto se utiliza por lo general para evaporar solventes orgánicos con gases inertes). Principios de Proceso de Secado por Aspersión I («www. niro.com» , febrero de 2007). Seleccionar de entre v arios j diseños de secadora por aspersión (tamaño, atomizador, condiciones asépticas, etc. ) y ajustar los diferentes parámetros del proceso (fl ujo de aire de secado, temperatura del aire de secado, etc. ) , las propiedades del polvo final como el tamaño de partículas, for na y estructura o incluso esterilidad de las mismas puede controlarse. Si la humedad resultante del polvo recuperado no es lo suficientemente baja, puede requerirse un post-tratamiento, por ejemplo, en la forma de secadoras y enfriadores de lecho de fluido, secado a ras de I contacto o incluso secadoras por microondas. Masters, Spráy D rying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenl u nd (2002).

El proceso de secado por aspersión incluye por lo general: atomización del líquido introducido, secado de las gotas pequeñas; y separación y recuperación del producto seco. Cada etapa tiene su propia influencia en el producto resultante y también presenta dificultades, en especial, al manejar material sensible como las proteínas.

Para secar por aspersión una proteína o péptido, a menudo es ventajoso utilizar adyuvantes estabilizadores. Los azúcares [tales como trehalosa y sacarosa son estabilizadores proteínicos efectivos. No sólo pueden reducir la agregación y/o desactivación de las proteínas durante el proceso de secado por aspersión, sino que también tienen efectos positivos en la estabilidad de almacenamiento del polvo resultante, si se almacena por debajo de su temperatu a de transición vitrea. Lee, Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002).

La atomización es la fragmentación de un líquido en una multitud de gotas pequeñas únicas, lo que se denomina aspersión. La selección de dispositivo de atomización determina la calidad y rendimiento del producto final. Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe MartObersicht 11:96-100 (1997). El uso de energía i para dividir un líquido es común para todos los atomizadores.

Diferentes tipos de energía distinguen a los diferentes atomizadores. La energía lleva a turbulencia en el líquido emitido. Junto coi las fuerzas del aire aplicadas, la tensión superficial y la vjscpsidad superficial del líquido se superan y ocurre la desintegración.

Para operaciones de secado por aspersión, la aspersión rnás adecuada es una con gotas pequeñas de un tamaño más o menos igual. No todos los sistemas de atomización pueden proporcionar una distribución compacta del tamaño de partículas para los polvos de secado por aspersión. Masters, Spray Drying in Práctice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Las proteínas son materiales muy sensibles, de modo que la atomización I representa un factor de tensión, ya que implica fuerzas de corte una posible causa de inestabilidad. Mahler et al. encontraron una correlación entre fuerzas de corte elevadas (movimiento y agitación) y un incremento en la agregación de una solución de lgG1. Mahler et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59:407-417 (2005) Una solución lisocimática también mostró agregación y pérdida de actividad durante la atomización. Yu et al., Eur: Journal of P arm. Sci 27:9-18 (2006). La tensión de corte y la ampliación abrupta de la interfaz de líquido/aire parece ser responsable por este tipo de deterioro en las proteínas. Maa et al., Biotechnolügy and Bioengineering 54(6):503-512 (1997). Pero incluso las fuerzas de corte que ocurren en los procedimientos de bombeo pueder ser suficientes para tensionar una solución proteínica. Brennan et al., Diabetes 34,353-359 (1985). Muchos tipos diferentes de atomizadores se encuentran disponibles para procedimientos de secado por aspersión.

Los atomizadores giratorios aceleran la introducción de líquido de manera centrífuga antes de que sea descargado en la atmósfera de aire/gas. El líquido introducido se distribuye de manera centr a l en j una rueda giratoria, disco o copa. Con una velocidad de disco baja , la formación de gotas pequeñas depende de manera principal de la viscosidad y la tensión superficial de líquido. Entre mayor sea la velocidad del disco, mayor será la inercia y fricción con el a ire y contribuirá al mecanismo de formación de gotas pequeñas. Además , el tamaño de las gotas pequeñas se ve influenciado por la velocidad de suministro de l íquido, su contenido sólido y densidad, el diánetro y el diseño del disco del atomizador. Diferentes diseño de atomizadores giratorios se encuentran disponibles: discos s i n aspas/tazas/copas o ruedas con aspas con aspas curvas o rectas. Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc. , New ¡ york, 1991 ).

Los atomizadores giratorios tienen un ángulo de aspersión de 360° y por lo tanto requieren cierto diámetro de la cámara de secado (para minimizar la deposición de las paredes). Estos sistemas se utilizan por lo general para mayores capacidades.

Los sistemas de boquilla presuriza obtienen toda la energ ía requerida para descarga de líquido desde el líquido per se al convertir la energía de presión en energía cinética. La boquilla de un fluido más simple es una estructura capilar tubular utilizada | para expulsar gotas pequeñas únicas. Este dispositivo sólo se utiliza para generar pequeñas cantidades de gotas pequeñas iguales] Al incrementar el índice de flujo, puede lograrse la atomización , en donde el chorro de líquido se fragmenta en gotas pequeñas mediante turbulencia. La desintegración del fluido puede mejorar al hacer que el líquido experimente desviaciones, giros y vueltas, por ejemp o, al proporcionar la boquilla con inserciones de turbulencia y cámaras de turbulencia. El tamaño resultante de las gotas pequeñas se ve influenciado por la presión aplicada y el diámetro de la boquilla, además de los parámetros mencionados en lo anterior (viscosidad, índice de flujo, etc.). Richter, Verfahrenstechnik, Sondéraüsgabe Martübersichi 11; 96-100 (1997). El suministro del líquido deja el orificio como un cono hueco, es decir, se pueden utilizar boquillas presurizadas en pequeñas instalaciones de secado por aspersión con cámaras de secado de diámetro pequeño. Un gran número de diseños de boquillas diferentes ofrecen varias aplicaciones para atomizar i soluciones, emulsiones y suspensiones, que sólo se limitan por el tamaño de las partículas (suspensiones) y viscosidad (se requiere presión muy elevada). Masters, Spray Drying in Practice.

SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).

Al emplear una atomización de boquilla neumática, el impacto de un medio de alta velocidad (por lo general, aire) con el líquido proporciona la energía para la formación de gotas pequ ñas.

Dependiendo del lugar donde choquen el fluido y gas, los sistemas de mezclado interno y sistemas de mezclado externo pueden distinguirse. Richter, Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martübersichi 11:96-100 (1997). De preferencia, se utiljzaiji dos boquillas de fluido al tener que separar fluidos muy viscosos en gotas pequeñas de tamaño fino. El medio gaseoso se presura dentro de la boquilla (hasta 7 barias), la cual se equipa algunas veces con una inserción adicional de turbulencia para generar turbulencias de gas que facilite la desintegración del suministro de líquido. El último se bombea por lo general mediante bombas de baja presión que soportan el efecto expulsor de flujo. Los sistemas de boquilla neumática producen gotas pequeñas en un margen de 5 a 75 pm Las desventajas son los costos elevados para el gas/aire comprimido y su efecto de enfriamiento dentro de la cámara de secado. Al manejar líquidos con viscosidad muy elevada, también existe el riesgo de bloquear el orificio de la boquilla. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).

Las boquillas ultrasónicas emplean ondas de sonido de alta i frecuencia para lograr la atomización. Los transductores piezoeléctricos reciben energía eléctrica de alta frecuencia de un Generador Ultrasónico y lo convierten en un movimiento mecánico vibratorio en la misma frecuencia. El líquido se introduce a lo argo de la longitud de la boquilla. Cuando el líquido suministrado alcanza el orificio, éste absorbe la energía vibratoria, lo que hace que se atomice, Sonó Tek Corporation; Ultrasonic spray nozzle systems (SONO TEK Corporation, New York, 2007).

Las boquillas sónicas funcionan con bajas presiones (en especial, en comparación con las boquillas neumáticas) y las gotas pequeñas resultantes tienen un diámetro entre 10 y 50 pm. Una gran desventaja de utilizar atomizadores ultrasónicos es la imprevisibilidad de operación continua, por ejemplo, cuando se utiliza para materias primas que contienen sólidos, el riesgo de pre-secar en el área de la boquilla puede llevar a arruinar el proceso del generador/atomización. Por lo tanto, esos sistemas ya no se usan a escala de laboratorio y secadoras de piloto para generar aspersiones finas o cuando los líquidos muy viscosos o no Newtonianos no permiten el uso de otros sistemas de boquilla. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).

Predecir la cinética de secado de las aspersiones durante el secado por aspersión es complicado, tanto por las dificultades al monitorear el comportamiento de una aspersión completa como por las condiciones no uniformes dentro de la cámara de secado Sin embargo, la cinética de secado de las gotas pequeñas únicas puede estudiarse de manera teórica y práctica. Elversson et al., Journal of Pharm. Sci 94(9):2049-2060 (2005).

Tan pronto como el suministro de líquido se atomice', su superficie respecto a la proporción de masa se incrementa y la transferencia de calor entre el aire y las gotas pequeñas se acelera y, ahora, con las gotas pequeñas pueden secarse muy rápido. En tamaños comunes de gotas pequeñas de <100 µp?, la evaporación ocurre en menos de 1 segundo. Nürnberg et al., Acta Pharmaceutica Technologica, 26(1):39-67, Tab 3-1 (1980). Esto tiene que ver con dos procesos de convección. Transferencia de calor (aire gota pequeña) y transferencia de masa de humedad (gota pequeña aire). En la última, la humedad tiene que permearse dentro de la capa límite que rodea a cada gota pequeña. Las tasas de transferencia se ven influenciadas por la temperatura, humedad , propiedades de transporte del aire circundante, el diámetro de las gotas pequeñas y la velocidad relativa entre la gota pequeña y el aire. Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons I nc. Níewj York, 1991 ). Al principio, la evaporación ocurre en un índice cons tante (pri mer etapa de secado = periodo de índice constante) . La difusión de la humedad del interior de la gota pequeña mantiene saturadas las condiciones superficiales. Y el denominado "punto crítico" , el contenido de humedad disminuye demasiado para mantener la saturación en la superficie de la gota pequeña y comienza a formarse una capa seca en la superficie de la gota pequeña. A partir de ese momento, existe una barrera adicional en aumento que i debe atravesarse mediante difusión . Como resultado de las condiciones que cambian de manera permanente de la gota pequeña/partícu a , el índice de evaporación disminuye (periodo de índice de caí da = segunda etapa de secado). Masters, Spray Drying in Practice . SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002) . La temperatura de las gotas pequeñas/partículas durante el proceso se ve influenciada de manera principal por la temperatura del ajre de secado de entrada (Te„t.) y el índice de suministro de l íquido ( Q L F ) , hasta cierto punto por el índice de flujo de aire de secado (Q DA) y el índice de flujo del aire de atomización (QAA)- Estos cuatro parámetros también determinan Tsa). En la práctica, la temperatura que se encuentra justo por abajo del orificio de la boquilla es mucho más próxima a Tsai. que a Tem., de modo que parece que Tsai. es la variable dominante para el índice de secado de las gotas pequeñas. Desde luego, la temperatura dentro de la gota pequeña (T¡) es rr enor que en su superficie (Ts). Ts alcanza con rapidez la temperatura de termómetro en húmedo, Twb, y se conserva a ese nivel durante el periodo de índice constante. Con la capa creciente en la supe'ficie de las gotas pequeñas en el periodo de índice de caída, Ts y T¡ comienzan a aumentar. Maa et al., Biotechnology and Bioengeneering 53(6):503-512 (1997). Para la partícula resultante, el tamaño morfológico de las gotas pequeñas, así como la textura de la capa, desempeñan un papel vital. Elversson et al. postularon una relación lineal entre el tamaño de las gotas pequeñas y el tamaño de las partículas, pero también sugirieron que el contenido sólido en el suministro de líquido tiene una influencia importante sobre el tamaño de las partículas. Elversson et al., Journal of Pharm. Sci 92(4)¡900 910 (2003).

El secado implica, dos factores de tensión adicionales para las proteínas: el calor y la deshidratación. La estabilidad dej las proteínas a la tensión térmica es una variable vital en la formulación de proteínas. Los cambios en la temperatura durante el proceso de secado por aspersión tienen un gran impacto en la estabilidad de las proteínas (por ejemplo, estabilidad del proceso, vida útil durante las pruebas de estabilidad acelerada). Cuando se exponen a temperaturas elevadas, las proteínas se hacen más flexibles (se debilitan los enlaces de hidrógeno), lo que lleva a un desbordamiento parcial y aumenta su frecuencia de colisión. Brange, Pharmaceiiitical I Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000). Este proceso por lo general es reversible, pero una vez que se desdoblan de manera parcial, las proteínas son muy susceptibles a rutas de degradación adicionales como agregac ón o plegamientb incorrecto, con un impacto importante en su func ón y estabilidad a largo plazo.

La temperatura para la estabilidad máxima se encuentra! entre -10 y 35°C para la mayoría de las proteínas. Bummer et al., fírotein Formulation and Delivery (Marcel Dekker AG, Basel, 2000). Mumenthaler et al. asumieron que las partículas de secado alcanzaban una temperatura máxima de alrededor de 25°C por d bajo de Tsai.. Mumenthaler et al., Pharm. Res. 11 (1 ): 12-20 (1994). En la presente invención, Tsai. puede ir de alrededor de 60°C a alrededor i de 80°C. La desnaturalización por calor por lo general no se considera el factor de inestabilidad principal durante el secado por aspersión. Maa et al., Current Pharmaceutical Biotech ology 1(3):283-302 (2000).

La actividad biológica de las proteínas depende de su estructura tridimensional original. En una solución acuosa, las proteínas mantienen su estructura original al estar rodeadas por moléculas de agua unidas de manera no covalente en su super icie. Normalmente, los residuos de aminoácidos no polares quedan ocultos en el interior y los residuos de aminoácidos polares se encuentran presentes en la superficie. Esto lleva a una aglomeración muy estrecha de las proteínas en la solución (densidad de aglomeración más elevada que en los cristales de moléculas orgánicas). Brange, Pharmaceutical Formulation Developmert of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000). Extraer el agua puede desestabilizar esta aglomeración y es posible que ocurran cambios conformacionales.

La última etapa de un proceso de secado por aspersión es por lo general la separación del polvo del aire/gas y la extracción del producto seco. En algunas modalidades, esta etapa es tan efectiva como sea posible para obtener grandes rendimientos en polvo y para impedir la contaminación del aire a través de la emisión del po vo a la atmósfera. Para ello, puede utilizarse equipo de recolección en seco y en húmedo, como ciclones, filtros de bolsa o precipitadores electrostáticos. Incluso es posible instalar combinaciones de ¡estas unidades. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryCbnsult International ApS; Charlottenlund (2002). Debido a su diseño simple y efectividad, el separador de ciclón es uno de los separadores utilizados con mayor frecuencia en varias industrias. Coulson and Richardson, Chemical Engineeríng, 4th, Vol.2 (Butterworth-Heinemann, Oxford, 1991). El movimiento de las partículas dentro del ciclón es el resultado de dos fuerzas opuestas. La fuerza centrífuga mueve las partículas a la pared del ciclón, mientras que la fuerza de arrastre del aire/gas trata de transportar las partículas al núcleo central de aire para dejar el ciclón. Masters, Spray Drying in dp* es el diámetro límite de las partículas, ? es la viscosidad del aire, r¡ representa el radio del vórtice interior, vr¡ es la velocidad el aire radial en la entrada del aire, ps y pg representa las densic ades del sólido y el gas, u¡, es la velocidad de partícula tangencial en r¡.

En este punto (diámetro de la partícula) la fuerza centrífuga y la fuerza de arrastre tienen valores iguales. Las partículas de ese tamaño giran sin tendencia al vórtice interior o exterior, las partículas más pequeñas son arrastradas por el aire de escape, las partículas más grandes caen en el recipiente de recolección Staudinger et al., VDI Berichte 1511; 1-23 (1999). ! El método del tiempo de vuelo es otra manera para calcular el í diámetro crítico de las partículas. Éste considera cuánto tiempo le lleva a una partícula desplazarse a la pared del ciclón. En este método, la geometría del recipiente de recolección puede tenerse en cuenta, debido a que tiene influencias sobre la corriente de gas dentro del ciclón. Qian et al., Chem. Eng. Technol, 29(6):724-728 (2006).

El secado por aspersión de una solución proteínica acuosa sin ningún adyuvante por lo general lleva al desdoblamiento, agreg ación y desactivación. En varias ocasiones, se ha experimentado con varias proteínas: oxihemoglobina (Labrude et al.), tripsinógeno (Tzannis et al.), IgG (Maury et al. 2005) y en todos los casos, se contenido de humedad en aumento, debido a que el agua funciona como un reactivo o como un medio para la movilización de los reactivos. Ésta puede ser responsable por cambios conformacionales en la estructura de la proteína. Además de ello, la Tg de los polvos de secado por absorción también se ve influenciada por el agua. E agua actúa como plastificante, lo que significa que disminuye lia Tg i de una sustancia. La influencia del agua puede calcularse utilizando la Ecuación de Gordon Taylor, una ecuación para calcular la Tg de mezclas binarias (Tgrnix).

Tgmlx = (?? · ? + K · ?2 · ?ß2)/(? + K · ?2) ? = ( fTg,)/(/¾-Te2) ?> Tg, y ? representan la fracción de peso, la temperatura de , i transición vitrea y la densidad de los diferentes componéntés, de manera respectiva. Para el agua que tiene una Tg! de aproximadamente -138°C, es evidente que el contenido de agua de los polvos resultantes debe ser bajo. Hancock et al., Pharm} Res. i 11 (4):471-477 (1994). Sin embargo la correlación entre el contenido de agua y la estabilidad no parece ser lineal. Chang et al., obtuvo una estabilización óptima de una IgG liofilizada en un contenido de i agua intermedio de 2-3%. Chang et al., Journal of Pharm. Sci 94(7):1427-1444 (2005).

Como resultado de este conocimiento, el polvo resultante del proceso de secado por aspersión debe mostrar una humedad residual baja y también debe estar protegido de la humedad durante el almacenamiento. Maa et al., Pharm. Res. 15(5):768-775 (1998).

Hasta cierto punto, el primero puede estar influenciado por las condiciones del proceso (temperatura del aire de entrada (Tent.) , humedad relativa (RH) del aire de entrada); esto último tiene que ver con frascos anti-derrames o condiciones de almacenamiento controlables.

III. Formulaciones de la Invención Cualquier proteína, péptido, anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo adecuado, puede emplearse para preparar las j, composiciones de la presente invención. Por ejemplo, éste puede ser del tipo IgG. Los anticuerpos ejemplares o porciones de unión a i antígenos de los mismos, incluyen, pero sin limitarse a, MAK 195F, Adalimumab o ABT-325. Los anticuerpos anti-TNF adecuados para su i uso de acuerdo a la invención se conocen bien (por ejemplo, como se describe en EP-A-0 260 610, EP-A-0 351 789, EP-A-0 218 868). Es posible utilizar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. i Además, los fragmentos de anticuerpo de unión con TNF talesj como fragmentos Fab o F(ab')2 o fragmentos Fv de una sola cadena también son adecuados. Un anticuerpo anti-hTNF-alfa monojclonal i adecuado se describe en EP-A-0 260 610, denominado A -¡195 o I i MAK-195, que se produce mediante una línea celular de hibri.onria depositada con el ECACC con el número de registro 87 050803. El i fragmento de anticuerpo anti-TNF mu riño (F(ab')2) también designado MAK 195F (INN; Afelimomab) también es adecuado.

En una modalidad, la formulación de la invención comprende un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, qüe sé une con TNFa humano, que incluye, por ejemplo, adalimumab (también denominado como Humira o D2E7; Abbott Laboratories). En una modalidad, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se disocia del TNFa humano con un Kd de 1 x 10"8 M o Jenos y una constante de índice de KDff de 1 x 10"3 s"1 o menos, ambos determinados mediante resonancia de plasmones superficiales y neutraliza la citotoxicidad de TNFa en un ensayo estándar in vit'o de L929 con una ICS0 de 1 x 10"7 M o menos. Los ejemplos y mélodos para crear anticuerpos neutralizantes humanos con alta afinidad para TNFa humano, que incluyen secuencias de los anticuerpos, se describen en la Patente Norteamericana No. 6,090,382, incorporada en la presente para referencia.

En una modalidad, la formulación de la invención comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se ine a interleucina-12 humana (IL- 2), que incluye, por ejemplc, el anticuerpo ABT-874 (Abbott Laboratories) (Patente Norteamericana No. 6,914,128). ABT-874 es un anticuerpo monoclonal completamente humano diseñado para dirigirse a y neutralizar la interleucina-12 y la interleucina-23. En una modalidad, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene una o más de las siguientes características: se disocia del IL-1a humano con un KD de 3 x 1?~7 M o menos; se disocia del I L- 1 ß humano con un KD de 5 x 10"5 M o menos; y no se une con IL-1a de ratón o I L- 1 ß de ratón. Los ejemplos y métodos para crear anticuerpos neutralizantes humanos, que tienen una alta afinidad para I L- 12 humano, que incluy† las secuencias del anticuerpo, se describen en la Paítente ¡ Norteamericana No. 6,914, 128, incorporada en la presentej para referencia. j En una modalidad, la formulación de la invención comprende un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, que se u ne con I L- 1 8 humana, que incluye, por ejemplo, el anticuerpo A BT-325 (Abbott Laboratories) (véase la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0147610).

En una modalidad, la formulación de la invención comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se une con I L- 12 humana, tal como el anticuerpo ABT-147 (Abbott Laboratories) (véase, WO 2007/005608 A2, publicada el 1 de enero de 2007) .

En una modalidad, la formulación de la invención comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se une con I L- 13 humana, tal como el anticuerpo ABT-308 (Abbott Laboratories) (véase. PCT/US2007/19660).

Ejemplos de proteínas que pueden incluirse en la formulación j en polvo incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos. Ejemplos de diferentes tipos de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que pueden utilizarse en la invención incluyen , pero sin limitarse a, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado' y u n anticuerpo de dominio (dAb). En una modalidad , el anticuerpo utilizado en los métodos y las composiciones de la invención es un alfacon- 1 ), Intron A (Interferon alfa-2a), Kineret (Anaki|nra) , MYOBLOC (Botulinum Toxin Type B), Neulasta (Pegfiígras'tim) , Neumega (Oprelvekin), Neupogen (Filgrastim) , Ontak (Denillu kin j diftitox), PEGASYS (Peginterferon alfa-2a) , Proleukin (AldesleX kin) , Pulmozyme (Domase alfa), Rebif (Interferon beta-1 a), Regranex (Becaplermin), Retavase (Reteplase), Roferon-A (I nterferon alf|a-2) , TN Kase (Tenecteplase), y Xigris (Drotrecogin alfa) .

Otros ejemplos de proteínas que pueden incluirse en los métodos y composiciones descritos en la presente, inc uyen proteínas de mam íferos, que incluyen proteínas recombinantes de los mismos, tales como, por ejemplo, hormona del crecim iento, qu e incluye la hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona partiroidea; hormona de estimulación ti roidea ; j lipoproteínas; a- 1 -antitripsina; cadena de insulina A; caden a de insulina B; proinsulina; hormona de estimulación de fol ículos; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulación tales como el factor VI I IC, factor IX, factor tisular, y factor di von Willebrands; o factores anti-coagulantes tales como Proteín a C ; factor natriuretico atrial; tensioactivo pulmonar; un activador plasminogénico, tal como uroquinasa o un activador plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombazina; trombina; factor a y ß encefa li naia de necrosis tumoral; RANTES (reguladas con la activación , por lo ' I general expresadas y secretadas por linfocitos T); pro teína inflamatoria de macrofagos humanos (???-1 -a); albúmina de ¡ suero de migración celular; adresinas; proteínas reguladoras; inmunoadesinas; anticuerpos; y fragmentos biológicamente activos o variantes de cualquiera de los polipéptidos mencionados en lo anterior.

Anticuerpos Policlonales Por lo general, los anticuerpos policlonales se refieren á una mezcla de anticuerpos que son específicos para cierto antígeno que se unen con diferentes epítopos en el antígeno. Los anticuerpos policlonales por lo general se introducen en animales mediante varias inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Esto puede ser útil para conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica un la especie a inmunizar (por ejemplo, hemocianina extraída de la lapa de ojo de la cerradura, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya), que utilizan un agente bifuncional jo de derivación, por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida áister (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida i (a través residuos de Usina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOC12. o R1NCNR, donde R y , son diferentes grupos alquilo Los métodos para generar anticuerpos policlonales se conocen en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, Lañe y Harlow (1988), incorporado en la presente; para referencia.

Anticuerpos Monoclonales Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo monoclonál" se refiere a un anticuerpo derivado de hibridoma (por ejemplo, un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado mediante tecnología de hibridomas, tal como la metodología estándar de hibridomas de Kohler y Milstein). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden generarse utilizando el método de hibridoma descrito primero por Kohler ef. al., Nature, 256:495(1975), o pueden crearse mediante métodos de ADN recombinante (Patente Norteamericana. No. 4,816,567). De esta manera, un anticuerpo de especificidad doble derivada de hibridoma de la invención aún se denomina un anticuerpo monoclonál, aunque tenga especificidad antigénica para más de un antígeno.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos en esencia homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, salvo por posibles mutaciones naturales que puede estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonál" indica, según su naturaleza, que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

En una modalidad adicional, los anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en cCafferty et al., Nature, 348:552-554 (¡1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks ef al,, jj. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), que describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando I bibliotecas de fago. Las publicaciones siguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (margen nM ) mediante trasposición de cadenas (Marks et al. , Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación I in vivo como una estrategia para reconstruir bibl iotecas de fagos m uy grandes (Waterhouse et al. , Nuc. Acids. Res. , 21 :2265-2266 ( 1 993)) . De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para la herramienta de anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo también puede aislarse de la levadura y otras células eucarióticas con el uso de bibliotecas de expresión, como se describe en las Patentes i Norteamericanas Nos. 6,423,538; 6,696,251 ; 6,699,658; 6 , 300 , 065 ; 6, 399, 763; y 6, 1 14, 147. Las células eucarióticas pueden modificarse mediante ingeniería genética para expresar proteínas de la biblioteca, que incluyen bibliotecas de anticuerpos combinatorias, para despliegue en la superficie celular, lo que permite la selección i de células particulares que contienen clones de la biblioteca para anticuerpos con afinidad para seleccionar moléculas objetivo. Después de la recuperación de una célula aislada, el clon de la biblioteca que codifica el anticuerpo de interés puede expresa rse a niveles más elevados a partir de una l ínea celular de mamíferos adecuada.

Los métodos adicionales para desarrollar anticuerpos de I aminoácidos no humanos a menudo se denomina residuos "importados", que por lo general se toman de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse en esencia siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321Í522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen ef al., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de CDR o CDR no humanas (por ejemplo, de roedor) para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Norteamericana. No. 4,816,567), en donde en esencia se ha sustituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente a partir de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son por lo general anticuerpos humanos en los que algún residuo de GDR y quizá algún residuo estructural (FR) se sustituye con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Referencias adiciónales que describen el proceso de humanización incluyen Sims ef al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia ef al., J. Mol. Biol. , 196:901 (1987); Cárter ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993), cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia Anticuerpos Humanos De manera alternativa, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, pon la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, esto se ha descrito en la supresión homocigotica del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en resultados de ratones mutantes de la ínea germinal y quimérica en la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la disposición genética de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal resulta en la producción de anticuerpos humanos con la exposición de los antígenos. Véase por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de biblioteca de despliegue en fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)) Anticuerpos [¡¡específicos Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para cuando menos dos epí opos diferentes. Tales anticuerpos pueden derivarse a partir de anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

Los métodos para crear anticuerpos biespecíficos se conocen I en la técnica. La producción tradicional de. anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulina de cadena pesada-cadena ligera, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al orden aleatorio de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica i correcta. La purificación de la molécula correcta, que por lo general se realiza mediante etapas de cromatografía por afinidad, es muy compleja y el producto producido es muy poco. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829 y en Traunecker et al., E BO J., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un método diferente, los dominios variablés de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de antígeno-anticuerpo) se fusionan con las secuetcias de dominio constante de inmunoglobulina.

De preferencia, la fusión se lleva a cabo con un dómino constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte las regiones CH2, y CH3 de bisagra. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CHi) contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente eh cuando menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera i de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados i y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. | Esto proporciona gran flexibilidad para ajusfar las proporciones mutuas de tres fragmentos polipeptídicos en las modalidades en las que al utilizar proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptidicas en la construcción proporciona los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertas las secuencias de codificación paré dos o tres cadenas polipeptidicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptidicas en proporciones iguales resulta en rendimientos elevados o cuando las proporciones no tengan importancia particular. j En una modalidad preferida de este método, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que está estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de la cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera de separación sencilla. Este método se describe en WO 94/04690 i publicada el 3 de marzo de 1994. Para detalles adicionales sobre cómo generar anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). 1 Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticujados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos | en e heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biiojtina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas (Patente Norteamericana. No. 4,676,980), y para el tratamiento de la Infección de VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden crearse utilizando cualquier método de I reticulación convencional. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la técnica, y se describen en la Pa ente Norteamericana. No. 4,676,980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Las siguientes técnicas también pueden utilizarse para la producción de fragmentos de anticuerpo bivalentes que no necesariamente son biespecíficos. Por ejemplo, los fragmentos Fab' recuperados de E. coli pueden acoplarse a nivel químico in vitro para formar anticuerpos bivalentes. Véase, Shalaby et al., J. Exp. Med., 175 217-225 (1992).

Varias técnicas para generar y aislar fragmentos de i anticuerpos bivalentes de manera directa a partir de un cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, se han producido heterodímeros bivalentes utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) Los péptidos de la cremallera de leucina de proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de los anticuerpos se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha demostrado ser un mecanismo alternativo para crear fragmentos de anticuerpos biespecíficos/bivalentes. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento ntre los dos dominios en la misma cadena. Como consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento son obligados a emparejarse con los dominios L y VH complementarios de otro fragmento, con lo que se forman dos sitios de unión con antigenos. Otra estrategia para generar fragmentos de anticuerpos biespecíficos/bival ntes utilizando dímeros Fv de una sola cadena (sFv) también se ha documentado. Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) En una modalidad, la formulación de la invención comprende un anticuerpo que es biespecífico para IL-1 (que incluye IL-1a e I Lj- 1 ß ) . Los ejemplos y métodos para crear anticuerpos de IL-1 biespecíf icos pueden encontrarse en WO 08/082651, publicada el 10 de julio de 2008.

Proteínas de unión de dominio variable doble (DVD) Las proteínas de unión de dominio variable doble (DVD) son proteínas que incluyen dos o más sitios de unión con antígenos, y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Las |DVD pueden ser monoespecíficas, es decir, capaces de unirse con un antígeno o multiespecíficas, es decir, capaces de unirse con dos o más antígenos. Las proteínas de unión DVD comprenden dos polipéptidos DVD de cadena pesada y dos polipéptidos DVD de cadena ligera se denominan DVD Ig™. Cada mitad de Ig DVD comprende un polipéptido DVD de cadena pesada, y un polipéptido DVD de cadena ligera y dos sitios de unión con antígenos. Cadálsitio de unión comprende un domino variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena con un total de seis CDR involucrada s en la unión de antígenos por cada sitio de unión con antígenos. En ciertas modalidades, la DVD puede incluir cualquier de DVD descrita en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20070071675 de Wu et al., publicada el 29 de marzo de 2007, que se incorporal en la presente para referencia.

Las Ig-DVD son útiles como agentes terapéuticos para bloquear de manera simultanea dos objetivos diferentes, con el fin de mJjorar la eficacia/seguridad y/o incrementar la cobertura en el pacíante. Tales objetivos pueden incluir objetivos solubles (IL-13 y TNF) y objetivos receptores de la superficie celular (VEGFR y EGFR). Esa también puede utilizarse para inducir citotoxicidad redirigida j sntre células tumorales y linfocitos (Her2 y CD3) para terapia contra el cáncer, o entre células autoreactivas y células efectoras para autoinmunología/transplante, o entre cualquier célula objetivo y célula efectora para eliminar células que provocan enfermedades en cualquier enfermedad determinada.

Además, la Ig-DVD puede utilizarse para desencadenar el agrupamiento de receptores y activación de los mismos cuand o se diseña para tener como objetivo dos epítopos diferentes en el mismo receptor. Esto puede ser benéfico para crear productos terapéuticos anti-G PCR agonistas y antagonistas. En este caso , la Ig-DVD puede utilizarse para tener como objetivo dos epítopos diferentes en una célula para agrupar/señalar (dos moléculas de la superficie celular) o señalar (en una molécula). De manera similar, una molécula de Ig-DVD puede diseñarse para desencadenar la ligadura de CTL/ -4 y una señal negativa al tener como objetivo dos epítopos diferentes (o i 2 copias del mismo epítopo) del dominio extracelular CTLA4, lo que lleva a una reducción en la respuesta inmunológica. De manera similar, la Ig-DVD puede tener como objetivo dos mie rr bros diferentes de un complejo del receptor de la superficie celula r (por ejemplo, I L- 12 R alfa y beta). Además, la Ig-DVD puede tener como objetivo CR 1 y una proteína/patógeno soluble para dirigi r l una depuración rápida de la proteína/patógeno soluble objetivo .

De manera adicional, la Ig-DVD de la invención puede emplearse para liberación específica de un tejido (que tiene como objetivo un marcador tisular y un mediador de una enfermedad para i una PK local mejorada, con lo que se obtiene mayor eficaciíi y/o menor toxicidad), que incluye liberación intracelular (tiene ' como objetivo un receptor de interiorización y una molécula intracelular) , i que se libera en el interior del cerebro (que tiene como objetivo el receptor de transferiría y un mediator de enfermedades CN S para atravesar la barrera hemato-encefálica) . La Ig-DVD también puede servi r como una proteína portadora para liberar un antígeno en una ubicación específica a través de la unión con un epítopo no neutralizante de ese antígeno y para incrementar también la hem i-vida del antígeno.

La invención proporciona composiciones en polvo estables que incluyen cualquier proteína adecuada, que incluye aquellas descritas I en la presente, y que se preparan como se describe en la presente . ¦ i Por ejemplo, el polvo puede incluir una proteína o péptido (por ejemplo, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo) y un excipiente, en donde la composición incluye menos de alrededor de 6% de humedad residual. En ciertas modalidades, la composición incluye menos de alrededor de 5.5%, 5%, 4.4% , 4%, 3.5%, ó 3% de humedad residual. En algunas modalidades, la composición inc luye menos de 2% ó 1 % de humedad residual . En otras modalidades , la composición incluye un margen de humedad residual unidos por los valores anteriores, por ejemplo, entre alrededor de 4% y 6% , entre alrededor de 4.5% y 5.5%, o entre alrededor de 3% y 5% de humedad residual. En algunas modalidades, el contenido de humedad res d ual de la composición en polvo resultante es de entre alrededor de 1 % y alrededor de 3%, entre alrededor de 1 .5% y 2.5%, entre alrededor de 1 .4% y alrededor de 2%, entre alrededor de 4% y 6%, o entre alrededor de 4.5% y alrededor de 5%. En otras modalidades , la composición en polvo incluye alrededor de 1 %, 1 .5%, 2%, 2 , 5% ,| 3% , 3.5% , 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, ó 7% de humedad residual En algunas modalidades, la proteína conserva su actividad biológica durante un periodo deseado. En una modalidad , el polv o es estable a temperaturas y humedad ambiente durante por lo menos 3 meses. En algunas modalidades, el polvo es estable durante por lo I menos 6 meses, 9 meses, 1 año, 2 años, 3 años o 5 años a temperaturas y humedad ambiente. En otras modalidades, el polvo es estable a 40°C durante por lo menos 3 meses. En modalidades ! adicionales, el polvo es estable a 40°C durante por lo menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1 año, 2 años o 5 años. En aún j otras modalidades adicionales, el polvo es estable a 40°C a h um edad ambiente durante por lo menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1 a ! n Lo, 2 años o 5 años.

Las composiciones en polvo de la invención y/o composiciones farmacéuticas que incluyen las composiciones en polvo pueden incluir un excipiente. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitarse a, trehalosa, sacarosa, sorbitol, polietilen glicoí, por lo :' ¡ menos un aminoácido, histidina, alanina, arginina, glicina o mé;.clas de los mismos. El método puede incluir además añadir un componente ácido, un antioxidante, y/o un modificador de tonicidad .

En algunas modalidades, la composición tiene una propo ción de masa de excipiente respecto a anticuerpo o porción de un ión a antígeno del mismo de alrededor de 0.27: 1 .0 a alrededor de 2.8 : 1 .0 , alrededor de 0.27: 1 .0 a alrededor de 1 .4: 1 .0, alrededor de 0.27j: L O a alrededor de 0.7: 1 .0 o alrededor de 0.7: 1 y el excipiente es trehalosa I o sacarosa. En otras modalidades, la composición tiene I una proporción de masa de excipiente respecto a anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de alrededor de 0.27:1.0 a alrededor de 2,8:1.0, alrededor de 0.27:1.0 a alrededor de 1.4:1.0, alrededor de 0.27:1.0 a alrededor de 0.7:1.0, alrededor de 0.7:1 o alrededor de 0.35: 1 y el excipiente es sorbitol.

De manera adicional, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que incluyen una cantidad efectiva de los polvos descritos en la presente. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier portador aceptable ! para administración parental, oral, entera!, o tópica. El portador puede ser sólido, semi-sólido o líquido (por ejemplo, agua o un líquido orgánico) o combinaciones de los mismos.

Los polvos pueden mezclarse (por ejemplo, disolverse o integrarse) en un portador farmacéuticamente aceptable. El por ador farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, aceptable para administración parental y puede incluir, por ejemplo, agua. El método puede incluir además añadir uno o más componentes ácidos, antioxidantes y/o modificadores de tonicidad a la composición I farmacéutica. De manera adicional o alternativa, los: aditivos adecuados pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas de la invención, por ejemplo, reguladores, modificadores de viscos|idad, saborizantes, colorantes, etc Las composiciones farmacéuticas en polvo pueden extruirse por fusión, prensarse o de otro modo procesarse para formar, por ejemplo, tabletas u otras composiciones sólidas o semi-sólidas Los polvos pueden recubrirse con, por ejemplo, pol ímeros tales como PLGA para formar composiciones farmacéuticas de liberación enta y/o liberación retardada. De manera adicional o alternativa, las composiciones pueden encapsularse o recubrirse con, por ejemplo, un recubrimiento entérico. Los recubrimientos y/o excipientes pueden emplearse, por ejemplo, para proteger al fármaco contra la precipitación, desnaturalización u oxidación mediante solventes orgánicos tales como polietilen glicol, (por ejemplo, PEG 400) , etanol, DMSO, N MP, ácido acético glacial, o similares.

Las composiciones líquidas, por ejemplo, com posiciones acuosas también se contemplan. Tales composiciones pueden ser adecuadas, por ejemplo, para administración oral o intravenosa y pueden incluir cualquier excipiente o aditivo adecuado tal corr o un modificador o reguladores de tonicidad. En algunas modalidades , las composiciones farmacéuticas líquidas tienen un bajo porcentaje de agregados proteínicos, a pesar de la alta concentración c e la formulación proteínica acuosa. En una modalidad, la composición acuosa incluye agua y una alta concentración de una proteína , por ejemplo, anticuerpos, que contiene menos de alrededor del 5 % de agregados proteínicos, incluso en la ausencia de un tensioactivo u otro tipo de excipiente. En una modalidad, la composición i ncluye no más que alrededor de 7.3% de agregado proteínico; la composición i ncluye no más de alrededor de 5% de agregado proteínico; la composición incluye no más de alrededor de 4% de agregado proteínico; la composición incluye no más de alrededor de 3% de agregado proteínico; la composición incluye no más de alrededor de 2% de agregado proteínico; o la composición incluye no más de alrededor de 1% de agregado proteínico. En una modalidad, la composición incluye por lo menos alrededor de 92%, por lo menos alrededor de 93%, por lo menos alrededor de 94%, por lo menos alrededor de 95%, por lo menos alrededor de 96%, por lo menos alrededor de 97%, por lo menos alrededor de 98%, o por |o menos alrededor de 99% : de proteína monomérica. Los márgenes intermedios a las concentraciones mencionadas en lo anterior por ejemplo, por lo menos alrededor de 98.6% de proteína monomérica, no más de alrededor de 4.2% de agregado proteínico, también pretenden ser parte de esta invención. Además, se pretende que los márgenes de los valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores mencionados en lo anterior como limite superior y/o inferior estén incluidos.

IV. Uso de la Invención Las composiciones de la invención pueden utilizarse tanto de manera terapéutica, es decir, in vivo, o como reactivos para propósitos in vitro o in situ. Como se describe y ejemplifica en la presente, es posible utilizar secado por aspersión para preparar polvos proteínicos secos para utilizarlos como material inicial para el desarrollo/fabricación de, por ejemplo: (a) una formulación enteral de ABT-874 para tratamiento de Colitis Ulcerosa, (b)una formulación tópica de adalimumab para ulceras diabéticas; y (c) una forma de dosificación pulmonar de ABT-308 para el tratamiento de asma. Además, los anticuerpos secados por aspersión pueden utilizarse con un proceso de extrusión por fusión MELTREX, debido a qus es posible que el anticuerpo monocional (mAb) incorporado dentro; Je la i matriz de excipientes de vidrio (por ejemplo, trehalosa) muestre una estabilidad mayor hacia el desdoblamiento/desnaturalización térmica.

Esto puede ofrecer nuevamente oportunidades para el desarrol o de nuevas formas de dosificación proteínicas sólidas, por ejemplo, para la administración oral de proteínas.

Usos terapéuticos Los métodos de la invención también pueden utilizarse para i preparar composiciones farmacéuticas que tienen características ventajosas para el uso terapéutico. Las composiciones farmacéuticas, que incluyen composiciones líquidas o sólidas, pueden utilizarse como una composición o formulación farmacéutica para tratar un trastorno en un sujeto.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse para tratar cualquier trastorno para el cual sea apropiado para tratamiento la proteína terapéutica, péptido, anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo. Un "trastorno" es cualquier padecimiento; en el que pudiera ofrecerse un beneficio por el tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellos padecimientos patológicos I que predisponen a los mamíferos al trastorno en cuestión. En el caso de un anticuerpo anti-TNFa, es posible administrar una cari ¡dad terapéuticamente efectiva del anticuerpo para tratar una enfermedad autoinmunológica, tal como artritis reumatoide, un trastorno intestinal, tal como la enfermedad de Crohn , una espondiloartroplatía , como espondilitis anquilosante, o un trastorno epidérmico , tal como psoriasis. En el caso de un anticuerpo anti-I L- 12, puede administrarse una cantidad terapéutica efectiva del anticuerpo para tratar un trastornó neurológico, tal como esclerosis mú ltiple , :o u n trastorno cutáneo, tal como psoriasis. Otros ejemplos de trastornos ; i en los que pueden usarse las composiciones de la invención para tratar los mismos incluyen cáncer, que incluye cáncer de mama , leucemia, linfoma, y cáncer de colón.

El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos, por ejemplo, procariotes y eucariotes. Ejemplos de sujetos incluyen mam íferos, por ejemplo, humanos, perros, vacas, caballos, ce dos , ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas, y animales transgénicos no humanos. En modalidades específicas de la invención, el sujeto es un humano.

El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. Aquéllos q ue necesitan el tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el I trastorno, así como aquellos en los que se puede prevenir el trastorno.

Las composiciones acuosas o sólidas pueden administrarse a un mamífero, que incluye un humano, que necesite el tratamiento de acuerdo con métodos conocidos de administración . Ejemplos de métodos de administración incluyen administración intravenosa , tales como inyección en bolo o infusión continua durante un per odo, administración intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal , intradérm ica , transdérmica, oral, tópica, o inhalación.

En una modalidad, la composición se administra al mam ífero mediante administración subcutánea. Para tales propósitos, la I composición puede inyectarse utilizando una jeringa, así como otros dispositivos que incluyen dispositivos de inyección (por eje mplo, los dispositivo Inject-eas y Genject); plumas para inyección (tales como la GenPen); dispositivo sin aguja (por ejemplo, MediJectpr y BioJector); y sistema de liberación con parche subcutáneo.

En la invención también se incluyen dispositivos de liberación que alojan la composición. Ejemplos de tales dispositivos incluyen , pero sin limitarse a, una jeringa, una pluma, un implante, ¡y un parche. Un ejemplo de una pluma de autoinyección se describe, en la i I Solicitud Norteamericana. No. 1 1 /824,516, presentada el 29' de ¡jun io de 2007.

La dosificación apropiada ("cantidad terapéuticamente efectiva") de la proteína, péptido, anticuerpo o porción dé unión a i antígeno del mismo, dependerá, por ejemplo, del padeci mie to a tratar, la gravedad y el trascurso del padecimiento, si se administra i para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa , el historial cl ínico del paciente y la respuesta a la proteína, el tipo de proteína utilizada, y el criterio del médico tratante. ! Las composiciones de la invención se administran de manera adecuada al paciente una vez o varias o en una serie de tratamiento y pueden administrarse al paciente en cualquier momento a parti r del i diagnóstico en adelante. Las composiciones pueden administrarse como tratamiento único o en combinación con otros fármacos o terapias útiles para tratar el padecimiento en cuestión .

En una modalidad, las composiciones de la presente invención , por ejemplo, aquellas que incluyen afelimomab y/o cualquier otro anticuerpo adecuado o porción de unión a antígeno del mismo, se emplean terapéuticamente. En una modalidad, las composiciones son composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de septicemia.

Septicemia, Factor-a de Necrosis Tumoral (TNF-a) y Afelimoma b La septicemia se define como una respuesta inflamé toria sistémica a una infección. La infección puede ser, por ejemplo, t/iral , bacteriana, fúngica o parasítica. La septicemia lleva finalmente a una activación de las células inmunocompetentes y una respuesta inflamatoria sistémica asociada con la liberación de citocinas (T N F-a, I L- 1 , etc.) . Existen diferentes etapas/tipos de septicemia, como define el ACCP (Colegio Americano de Médicos Toráxicos) : S I RS (Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica) (respuesta inflamatoria sistémica de varios orígenes (infección, eritema, etc. ) ; septicemia (SIRS provocada por una infección); septicemia severa (septicemia con anomalía/disfunción de órganos); y choque séptico (septicemia con choque)). Para diagnosticar estos tiposl de septicemia, se deben cumplir diferentes criterios.

La respuesta inmunológica que se presenta de manera principal instrumenta y amplifica una variedad de mediadores secundarios. El i organismo no puede limitar la inflamación al lugar de su origen (en su mayoría, los pulmones o la circulación sanguínea). Diferentes órganos pueden ser afectados, lo que tiene un impacto importarl e en varias funcjones corporales. Por lo tanto, posibles signos de septicemia incluyen hipertermia, taquipnea, taquicardia, hipotensión y confusión. Debido de la variedad de indicadores, la septicem a es i difícil de diagnosticar, lo que es un factor que contribuye al alto i índice de mortalidad en pacientes con septicemia.

Se conocen diferentes medicamentos para tratar pacientes con septicemia, entre ellos se encuentra el drotrecogin a (proteína C activa) y antitrombina III para bloquear la coagulación sanguínea y cortisona (en dosis bajas) para atenuar la inflamación. Bloos et al., Aktuelle Ernahrungsmedizin, 28:186-190 (2003). Como una TNF-a es I uno de los principales mediadores de la septicemia, un método para tratar la septicemia es bloquear la TNF-a para evitar sus efectos. La liberación local de TNF-a incrementa el flujo sanguíneo |y la permeabilidad bascular. Eso permite la entrada de fluidos al ¡tejido i infectado, células y proteínas que participan en la defensa del huésped. Para impedir la difusión de la infección en la sangre, pequeños vasos coagulan después y el fluido es drenado a los nodos , l infáticos, donde inicia la respuesta inmunológica adaptativa . Durante las infecciones sistémicas, la TNF-a funciona de manera simi lar, lo que lleva a un choque y a una coagulación intravascula r diseminada. Los resultados son un agotamiento de los factores de coagulación, sangrado constante e insuficiencia de múltiples órganos. Janeway et al. , I mmunobiology (Garland Publishing, 1994) . Bloquear la TN F-a puede lograrse mediante la adm i n istré ción parenteral de un anticuerpo anti-TN F-a. Al diseñar el fragment o de anticuerpo afelimomab, debe obtenerse una mejor penetración tisular combinada con menos problemas inmunogénicos. j En algunas modalidades, la invención incluye adm in istra n la u n i sujeto (por ejemplo, a un humano), una proteína, un péptido , anticuerpo o porción o proteína de unión a antígeno del mismo, de modo que la actividad de su objetivo u objetivos en el sujeto se inhiba y se logre el tratamiento. En algunas modalidades, el trastorno se selecciona del grupo que comprende artriti s , osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme , artritis soriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémicó eritematoso, enfermedad de Crohn , Col itis U lcerosa , síndrome del intestino irritable, diabetes mellitus depend iente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis , dermatitis esclerodermia, enfermedad del injerto contra el huésped , rechazo de transplante de órganos, enfermedad inmunológica ag uda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoid osis , ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch- Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de septicemia, caquexia, enfermedades infecciosas , enfermedades parasíticas, s índrome de inmunodeficiencia adqu i rida , mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemol ítica, malignidades, deficiencia cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison , deficiencia poliglandular esporádica tipo I y deficiencia poliglandular tipo I I , síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) en adultos, alopecia, alopecia areata, artopatía seronegativa , artropatia , enfermedad de Reiter, artropatia psoriásica, artropatia cp ítica ulcerosa , sinovitis enteropática, clamidia, artropatia asociada con yersinia y salmonela, espondiloartopatia, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmune, · pemfigo vulgar, pemfigo foliáceo, penficoide , enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis mialgica/enfermedad del Royal ree , candidiasis mococutánea crónica, arteritis de células g igalntes , hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune nica , síndrome de enfermedad de Inmunodeficiencia adquirida , trastornos motores hipercinético, reacciones de hipersensibi lidad pneumonitis de hipersensiblidad, hipertensión , trastornos motores hipocinéticos, evaluación del eje hipotálamo-pituitaria-adronal , enfermedad idiopática de Addison , fibrosis pulmonar id iopá tica , citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscula r espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a : i radiación ionizante, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica , isquemia , lesión por isquemia-reperfusión, accidentes cerebro vascular isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular es pi nal juvenil , sarcoma de Kaposi, rechazo a trasplante de riñon, legionela , leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticospinal, l ipedema , rechazo a transplante de hígado, linfederma, paludismo ,; l i n oma Maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meni ng itis , meningococemia, metabólica/idiopática, dolor de cabeza por migr aña , trastorno multisistémico mitocondrial, enfermedad de jt sjido I conductivo mezclada, gamopatia monoclonal, mieloma m últi ple , degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi- Drager y Machado-Joseph), miastemia gravis, micobacterium á I vium intracelular, tuberculosis por micobacterium, síndrome mielodiplástico, infarto al m iocardio, trastornos isquém icos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crón ica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I , fiebre neutropénica, linfoma que no es de Hodgkins, oclusión de la aorta abdomi nal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia okt3 , orcitis/epidimitis, orcitis/procedimientos para revertir la vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo a trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome para neoplásico/hipercalcemia maligna, rechazo a trasplante paratiroideo, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis crónica, enfermedad pericárdica, enfermedad arteriosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocistis carini, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, y síndrome de cambios cutáneo), síndrome post perfusión, síndrome post bombeo, sínd ome de cardiotomia post-MI, preeclampsia, supranuclear progresiva de Palsy, hipertensión pulmonar primaria, terapia por radiación, j fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Rayroud, enfermedad de Refsum, taquicardia de QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomio satia restrictiva, sarcomas, escloroderma, corea senil, demencia senil del tipo de cuerpo de Lewy, artropatías cero negativas, choque, anemia de células, rechazo de aloinjertos cutáneos, síndrome de cambios cutáneos, rechazo de trasplante del intestino delgado, tumores sólidos, arritmias especificas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptocócica, lesiones estructurales en el cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, sincope, sífilis del sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de o -¡gen sistémico, ALL de linfocitos T o FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, transplarjites, trauma/hemorragia, reactivos por hipersensibilidad tipo hipersensibilidad tipo IV, angina inestable, uremia, urosepticemia, I urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculítis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones fúngicas y virales, encefalitis viral/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado con virus, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, y rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido.

Usos no terapéuticos Las composiciones de la invención también pueden emplearse para usos no terapéuticos, es decir, propósitos in vitro. Por ejemplo, los polvos proteínicos y composiciones relacionadas descritas e n la presente pueden utilizarse para métodos de diagnóstico o experimentales en medicina y biotecnología, que incluyen, pero sin limitarse a, uso genómico, proteómico, bioinformático, de cultivo celular, biología vegetal y biología celular. Por ejemplo, las composiciones descritas en la presente pueden utilizarse para proporcionar una proteína necesaria como una sonda molecular en un método de etiquetado y detección. Un uso adicional para las composiciones descritas en la presente es proporcionar complementos para reactivos de cultivo celulares, que incljyen crecimiento celular y producción de proteínas para propósitos de fabricación. con el recipiente puede indicar instrucciones para su uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la composición es útil o está diseñada para administración subcutánea. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar al usuario que añada un líquido, por ejemplo , agua estéril o solución salina para preparar la composición para administración, por ejemplo, mediante inyección. El recipiente que contiene la composición puede ser un frasco multiusos que permita i varias administraciones (por ejemplo, de dos a , sei s i administraciones) de, por ejemplo, una formulación acuosa. E l artícu lo de fabricación puede comprender además un seg jndo I recipiente. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas , jeringas, inserciones de envase e instrucciones de uso Esta invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes.

EJEM PLIFICACION DE LA INVENCION En este ejemplo, un fragmento Fab de una molécula IgG se secó por aspersión y se analizó. El alcance de este estud io fue encontrar condiciones para formulaciones y procesos adecuados |pa ra secado por aspersión del fragmento Fab con un alto rendimiento y buena estabilidad de almacenamiento, ya que se prevee que sea utilizado como un intermediario de almacenamiento. La estabil ización de la proteína durante el proceso de secado por aspersión! y el diferentes patrones de glicosilación, el afelimomab tiene hasta; siete isoformas en un margen de puntos isoeléctricos (???) de 7.5 a 8.8.

El concentrado se obtuvo con hielo hidrolizado en porciones de alrededor de 400 g. para evitar ciclos repetidos de congelamiento-descongelamiento y almacenamiento a largo plazo en el estado líquido el concentrado se descongeló y se diluyó en alícuotas en porciones de 40-50 mi, se almacenó a -80°C y se descongeló de nuevo antes de su uso.

Excipientes Se utilizaron tres diferentes azúcares para estabilizar la proteína: D-Sorbitol (Sigma, Producto: S-7547, Lote: 108H01461); Sacarosa (Sigma, Producto S-7903, Lote 014K0010); y ¡ D-(+) dihidrato de trehalosa (Sigma, Producto: T5251, Lote: 113K3775).

Todas las soluciones acuosas se prepararon con agua destilada dos veces (Fi-stream 4BD; Fisons) y, si era necesario, filtrada a través de un filtro de membrana de 0.2pm (Schieicher & Schüell) Métodos Secado por Aspersión Los experimentos de secado por aspersión se realizaron en una Mini-Secadora por Aspersión Büchi B-191 (Figura 1) utilizando el ciclón 1 de alto rendimiento para recuperación de energía. El aire de secado se filtró a través de un Ultrafiltro 2 Luwa (fibra de vidrio; clase de filtro: HEPA H13 Agente de Absorción de Partículas de Alta Eficiencia) a un índice de flujo de aire de 800 l/min (energía ele la aspiradora 90%) antes de entrar en el dispositivo 3 de calentam ento y la cámara de secado. Todos los suministro líquidos se filtraron a través de un filtro de una unidad de filtro de 0.22 µ?t? antes de transportarse a la cámara 4 de secado mediante una bomba 5 peristáltica ml/min; tubo de silicona de 0 = 3mm). La I atomización se realizó mediante una boquilla 6 para dos fluidos (diámetro del orificio: 0.7mM) utilizando aire comprimido del suministro interno (QAA = 700 l/h). La boquilla para dos fluido se equipó con un sistema de limpieza automático, también utilizando aire comprimido (4.5 barias) y un sistema de enfriamiento de agua. Después del secado por aspersión, se recuperaron los polvos I resultantes del receptáculo 7 de recolección en una caja sellada con aire seco (RH < 2%), llena con frascos de vidrio (tapones de caucho de clorobutilo), sellados con papel de filtro parafilme y almacenados a -80°C. El rendimiento del polvo se definió como la cantidad de polvo dentro del receptáculo de recolección dividido entre el total de sólidos en el suministro líquido. Las deposiciones del polvo en el interior del ciclón no se recolectaron. | i Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) La cromatografía de exclusión por tamaño se utilizó para i detectar agregados solubles. Una columna Tricorn Superóse 12/300 GL (margen de separación de 1-300 kDa) comprada por Amersham Biosciences se conecto a un sistema de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) Perkin Elmer que comprendía una bomba serie 200 LC, un tomador de muestras automático ISS 200 y un detector de ordenación de diodos 235C. Antes de la columna Superóse , se instaló una precolumna de protección de seguridad fenomenex (cargada con cartuchos AJ0-4489) para evitar contaminación con partículas abrasivas. La fase móvil (regulador A , índice de l ujo : 0.5mL/min) fue un regulador de fosfato de potasio (pH 6.9) con la adición de cloruro de sodio (0.5 mol/1), filtrada a través de un filtro de membrana de 0.2 pm (Schleicher&Schuell, FP 30/0.2 C!A) y desgasificada durante alrededor de 10 minutos con el uso de hel io . Todas las muestras se midieron de manera directa (por ejemplo , suministro líquido) o se redisolvieron con cuidado con regulado ' A a una concentración proteínica de 1 mg/ml (polvos secados por aspersión (sd)) y se analizaron de manera breve después de la preparación. El volumen de inyección por corrida fue de 1 00 µ?, y en general todas las muestras se midieron dos veces (suministro j l íquido) o tres veces (polvos sd) para asegurar resultados que pudieran reproducirse. Todos los cromatogramas se integraron de manera manual utilizando el software TotalChrom Navigator de Perkin Elmer, versión 6.2.

Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC) Los eventos térmicos se investigaron utilizando un Méttler Toledo DSC 822e. Se toleraron 5- 15 mg de polvo (Mettler, AT Delta Range®) en bandejas de aluminio en condiciones de airé seco (caja sellada). Las bandejas de aluminio se sellaron en frío y se insertaron en un calorímetro, donde se expusieron a un programa de temperatura definida (dependiendo de la formulación) de calentamiento y enfriamiento a su vez con la Tg esperada (índice de calentamiento/enfriamiento: 10°C/min). La temperatura de transición vitrea se estimó mediante el software Mettler STARe V 6.10, definido de manera preliminar como el punto medio de la transición endotérmica durante la etapa de calentamiento. Solo se tomaron en cuenta el segundo y tercer ciclo de calentamiento para evitar interferencia con otros eventos endotérminos no reversibles. En todo el experimento, la celda de medición se secó y se purgo con gas de N2.

Difracción de Rayos X de Ángulo Amplio (WAXD) La cristalinidad de los polvos se investigó mediante difracción de polvos por rayos x utilizando un Philips modelo X'pert MPD con radiación Cu ?a (? = 0.15418mM) a 40 kV/40 mA y 25°C. Las cantidades de polvo de 60-80 mg se llenaron en la base ¡de la muestra de aluminio y se sometieron a barrido de inmediato. Todos los. barridos se midieron en el margen 2T = 0.5° - 40° con un tartaño de etapa de 0.02°7s. La cristalinidad de las muestras (grado de cristalinidad) se calculó a partir de las áreas cristalinas y i amorfas del diagrama de difracción (véase lo siguiente) al utilizar un método con base entre de Black y Lovering. Black, Lovering Journal of Pharmacy and Pharmacology 29:684-687 (1977).

C = lc/(lc+la) = AUCcr¡stal¡no/AUCtotal = (AUCTotal - A U Camorfo)/ A U G,otal C es el grado de cristalinidad (algunas veces descrito también como cristalinidad porcentual, cuando se multiplica por 100), lc !e la representan las intensidades de los rayos X dispersos por las regiones cristalina o amorfa, que es igual al área bajo la curva (AUC) de los picos y los halos amplios, de manera respectiva. AUCam¿rro se calculó al cortar los picos cristalinos de los diagramas y utilizar un ajuste de curva.

Difusión Dinámica de Luz Las mediciones de difusión dinámica de luz (DLS) se realizaron con un Zetasizer Nano ZS (Malvern, Alemania, software: DTS versión: 4.2) para detectar agregados solubles así como insolubles El Zetasizer utiliza una luz láser de 633 nm y detecta difusión á|173' (detección de difusión posterior). Este tiene un margen de medición i de 0.6 - 6000 nm para mediciones de tamaño. El tamaño de las partículas se determinó al medir ei movimiento Brownianp de las partículas en la muestra. Instrumentos de Malvern: Manual de Usuario de la Serie Zetasizer Nano. MAN 0317, Emisión 2.0, Marzo de 2004. Las formulaciones líquidas se sometieron a prueba:; sin i ningún aditivo, y los polvos se diluyeron con agua destilada dos veces (filtrada a través de 0.2 µp?) hasta la concentración proteínica original. Al utilizar cubetas de bajo volumen (cubetas de1 bajo volumen desechables, Malvern) solo se necesitó 0.5 mi ce la solución por medición. Las pruebas con cubetas de 2 mi arrojaron los mismos resultados (datos no mostrados). Después de 2 minutos de tiempo de equilibrio (25°C) se realizaron 3 mediciones de cada muestra con 5 corridas cada una (duración de corrida: 30 s, retraso entre corridas 2 s). Este procedimiento se realizó tres veces para cada muestra de polvo/solución. Los diagramas resultantes se exportaron como Cuadros de puntuación y se convirtieror en diagramas a través de MS Excel, lo que llevó a tres cu rvas graficadas por muestra, que muestran las distribuciones de tamaño-volumen y tamaño-intensidad.

Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) El tamaño y morfología de las partículas se analizó a través de imágenes de microscopía electrónica utilizando un microscopio Scanning Electron Amray 1810 T a 20 kV. Pequeñas muestras de polvo se fijaron en tubos de muestra A1 (G301 , Plano) utilizando películas auto-adheribles. Después de sujetarlas con Au a 20 mA/kV (H ummer J R Technics) durante 1 .5 minutos las muestras se colocaron bajo el microscopio y se tomaron imágenes de diferentes amplificaciones (normalmente 1000x, 2000x y 3000x) . En general , se evaluaron las imágenes tomadas con una amplificación de 3000x.

Titulación Karl Fischer El contenido de humedad de los polvos secados por aspe rsión (sd) se midió con un Medidor de Humedad Mitsubishi (CA-06 Coulometric) y un vaporizador de agua Mitsubishi (VA-06). Las solución. Para aplicaciones farmacéuticas, el software clasificó partículas en 8 diferentes márgenes de tamaño (1 -50 pm) de acuerdo con el reglamento de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) o la Farmacopea Europea (Ph. Eur.).

Enfoque Isoeléctrico (IEF) La separación por I EF de afelimomab se basó en la diferencia de carga del fragmento Fd' y las variantes de cadena ligera . De manera principal, esta sirvió como una prueba de identidad pa ~a el I afelimomab, pero también puede utilizarse como una herramienta para las pruebas de estabilidad. El enfoque se realizó con una cámara Pharmacia Multiphor I I unida a un suministro de eperg ía Serva Blue Power 3000. Se colocaron geles listos para usar co n u n gradiente de pH de 6-9 (Servalyt Precotes 6-9, de 125x125mM , grosor de 0.3m ; Serva, Alemania) en la placa de enfriamiento 4°C , cubierta con un poco de Bayol F como medio de transferencia de i calor). Todas las muestras se diluyeron a una concentración proteínica de alrededor de 4 mg/ml, se colocaron 10 pL en el gel. El programa de enfoque comenzó a 200 V y tomó alrededor de 195 i minutos (voltaje de valor de referencia de 2000 V). Después de fijar durante 20 minutos, los geles se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie (20 min) y luego se destilaron varias veces. Las soluciones utilizadas se mencionan en el Cuadro 1 siguiente, j Cuadro 1 Después de enjuagar con agua y secar durante la noc ie a temperatura ambiente, los geles se inspeccionaron y sometieron a barrido utilizando una estación de trabajo Desaga CAB UVI S V D 40 con el Software ProViDoc® (Versión 3.20) .

Opacidad La opacidad es una expresión de la propiedad óptica que hace que la luz se difunda y sea absorbida en lugar de ser transm itida en líneas rectas a través de la muestra. Esto puede deberse a cualquier partícula suspendida, que incluye sólidos, coloides y burbujas de gas. Dado que la opacidad no es un parámetro bien definido, ésta se midió al comparar las muestras con estándares de opalescencia , por i ejemplo, geles de hidracina. Se utilizó un turbidímetro Hach Ratio XR para estimar las unidades de opacidad nefelométricas (NTU) de las muestras. El turbidímetro se calibró con estándares de Hidracina Después de medir un valor vacío para los tubos Nessler, las muestras se diluyeron o reconstituyeron con agua destilada dos veces, (filtrada a través de 0.2 pm) hasta la concentración original de proteínas y luego se colocaron en el rayo de luz. Para excluir la i influencia de la carencia de homogeneidad de vidrio fue importante marcar la dirección de los tubos durante la medición vacía para ¡ utilizar el tubo en la misma dirección para la misma medición.

Coloración Para detectar cambios en la coloración de los polvos sd redisueltos, se utilizó un LICO 400 (Hach Lange, Suiza), que es un colorímetro para la medición de color de líquidos transparentes. Este determinó la solución de referencia más cercana a la muestra y cuantificó la variación de color entre la muestra y la referencia. En este estudio, el espacio y color CIE-Lab, que define los coloresj como coordenadas de luminosidad (L, negro-blanco) y color (±a, ; Ojo-verde; ±b, amarillo-azul), se utilizó (CIE es la abreviatura de Comisión Internacional de Iluminación). El LICO 400 se cé libró i utilizando las soluciones estándar de la Ph. Eur. (BG 5-7, marrón-amarillo, diluido; B 5-9, marrón). Todas las muestras de polvo se reconstituyeron a su porcentaje original 200 µ? se llenaron en una pequeña cubeta de vidrio de cuarzo de pequeño volumen. incolora con un leve matiz de marrón. El concentrado tenía una densidad de 1.009 g/cm3 y una viscosidad de 0.981 mPas (ambos medidos a 20°C).

Secado por Aspersión del Concentrado de MAK Los primeros experimentos de secaron por aspersión y se realizaron con el concentrado puro libre de cualquier estabilizador j adicional. Se determinó el grado de daño proteínico durante el proceso de secado.

Estabilidad del Proceso de MAK Para determinar cómo sufre la proteína durante el proceso de I· secado por aspersión los parámetros del proceso para los primeros experimentos, se adoptaron a partir de estudios existentes jen el Büchi 191, por ejemplo, Maury: ~3 ml/min, QAA = 700 1/h, 800 l/min, lo que resulta en una TSaiJ de aproximadamente 80°C. Maury el al, Eur. Journal of Pharm.l and Biopharm. 59(3): 565-573 (2005). i El polvo blanco resultante (rendimiento del ciclón: ~60%) comprendió partículas esféricas, en forma de dona o dentada con un diámetro de hasta 13 pm. El polvo redisuelto (22.9 mg de polvo/ml de agua) tuvo una concentración proteínica de 12-13 mg/ml, lo que sugiere que la pérdida de polvo fue provocada por el proceso de secado por aspersión y el rendimiento de separación del ciclón. No pudo detectarse ninguna pérdida preferencial de proteíra o excipiente de las soluciones proteínicas, debido a su estado amorfo después del secado por aspersión. El diagrama de difracción por rayos X del concentrado sd de MAK mostró picos cristalinos, provocados por los otros componentes de la sustancia farmacológica a granel (por ejemplo, fosfato de sodio y cloruro de sodio). El píitrón de los picos fue muy parecido al del cloruro de sodio sd. El contenido de humedad residual del polvo fue 1.4-2%, que resultó ser dependiente de las condiciones ambiente durante el proceso (RH del aire seco, temperatura ambiente, etc.).

En la SEC, el polvo redisuelto mostró un incremento distintió en agregación (2.5-3%). Sin embargo, esto no fue mucho para una solución proteinica sin estabilizadores. Maury encontró hasta i 17% para la solución de IgG dializada secada por aspersión. Maury ef al. Eur. Journal of Pharm. and Biopharm. 59(2):251-261 (2005). Esto indica que los fragmentos son menos sensibles durante el secado por aspersión que los anticuerpos de longitud total, aunque esto no ocurre para la agregación inducida por congelamiento-descongelamiento. Wang ef al., Journal of Pharm. Sci. 96(1); 1-26 (2007). Otra posibilidad es que se haya presentado un efecto estabilizador provocado por la presencia de cloruro de .sodio. Arakawa et al., experimentaron interacciones estabilizadores entre proteínas y cloruro de sodio en las soluciones; sin embargo solo investigaron concentraciones más altas en sal que las que se utilizaron en este caso. Arakawa et al., Biochemistry 21:6545- 6551 (1982). El incremento en la agregación también se observó resultados de DLS e I EF.

Durante el enfoque isoeléctrico, apareció una nueva banda en el punto inicial del enfoque. Esto pudo haberse atribuido a gra ides agregados que no pudieron penetrar en el gel y, por lo tanto no pudieron moverse de acuerdo con su punto isoeléctrico (de acuerdo con Serva GmbH los poros de sus geles de I EF tienen un l ímite de alrededor de 200-300 kDa). Los resultados de DLS mostraron un pico adicional en el tamaño en pm. El pico fue difícil de observar en la distribución de tamaño-volumen, pero fue claro en la distribución de tamaño-intensidad. Pocas partículas grandes difunden mucha más luz que muchas partículas pequeñas, debido a que la intensida d de difusión de una partícula es proporcional a la sexta potencia ¡de su diámetro. Instrumentos alvern: Manual de Usuario de la Serie Zetaseizer Nano. MAN 031 7, Edición 2.0, Marzo de 2004, El pico adicional fue causado aparentemente por la proteína, debido a que los experimentos del DLS con un concentrado placebo no most aron I un pico de ese diámetro hidrodinámico. Debido a que estos agregados grandes no se observaron en la SEC deben ser i nsolu bles . i La contaminación de partículas del polvo redisuelto se incre men tó en todas las fracciones de partículas. Sin embargo, el proceso del secado por aspersión en el laboratorio no pudo excluir por completo la contaminación de partículas (aunque se filtró el aire seco de entrada). Además, abrir el frasco para tomar muestras también puede haber sido una fuente de partículas. Además, la opacidad del iolvo redisuelto se incremento de manera significativa en comparación con elevadas. Todos estos resultados recomendaron el uso de una | i e n i . alta , pero los resultados del enfoque isoeléctrico (l EF) y la difusión dinámica de luz (DLS) indicaron que la Tent. apropiada para el afelimomab se encontraba en el margen medio. La intensidad c e la banda de agregación en la l EF fue dependiente de manera lineal de i la temperatura de- entrada del aire de secado. Así mismo, los diagramas de DLS mostraron resultados inferiores a 180°C . El pico monomérico mostró una mayor diámetro hidrodinámico (alrededor de j 16nm). Los agregados no solo parecieron volverse más numerosos , como se asumió en la lEF, sino más grandes. Además, el pico monomérico cambio de forma (a una distribución más pequeña) y tamaño, lo que indicó un daño sustancial en la proteína La contaminación de partículas fue mayor a °180°C también, en especial en las fracciones de partículas pequeñas (< 15pm). De acuerdo con estos resultados, solo 130°C y 155°C pueden conside arse aceptables para investigaciones posteriores. Debido a que los I resultados de estas dos temperaturas de entrada son similares , se seleccionó una Tent de 1 30°C. Operar a esta temperatura debe I minimizar la tensión térmica en la proteína, y proporcionar al nr ismo tiempo resultados aceptables generales para la calidad del producto .

Fuentes de agregación El proceso de secado por aspersión comprende un número de fuentes de desactivación para proteínas. Algunas pueden reducirse al modificar la formulación con excipientes, mientras que ! jotras fuentes de desactivación no pueden ser influenciadas. El incremento en la agregación de multiproceso no puede atribuirse de manera clara a un solo factor de tensión. La tensión térmica es controlable I hasta cierto punto al seleccionar la Tent. correcta en este ¡caso alrededor de 130°C. Para descubrir el grado de tensiones inevitables, se realizaron los siguientes experimentos.

Influencia de la bomba peristáltica Para cuantificar la influencia de la tensión cortante de la bomba peristáltica en la agregación, se utilizó una SEC. Se utilizaron I diez mi del concentrado de afelimomab como un suministro líquido. La muestra se bombeó a través de los conductos y la bomba peristáltica del BOchi B- 91 y se recolectó justo antes de entrar a la I boquilla de dos fluidos. El suministro líquido se probó antes y después del proceso de bombeo. No se observó ningún cambio en la agregación. Puede asumirse que la bomba peristáltica de la secadora por aspersión de laboratorio no tiene influencia o incrementa la i agregación de la proteína afelimomab. La agregación de insjlina inducida por la bomba, observada por Brennan et al. (Diabetes 34, 353-359 (1985)), solo ocurrió cuando la insulina se extrajo ce la solución después de un bombeo a largo plazo. Debido a que pasar a través de los conductos en este estudio lleva cuando mucho lunos cuantos minutos, el riesgo de sufrir daño es muy pequeño.

Influencia en el proceso de atomización El grado de tensión cortante durante la atomización se sometió a prueba al atomizar dos muestras de concentrado (2ml_) y someterlas a prueba mediante SEC e IEF después de ello. En la|IEF, no pudieron observarse diferencias entre las muestras (no hubo bandas o cambios adicionales en el patrón de banda). Los resultados de la SEC mostraron un pequeño incremento en la agregación.! Este incremento no fue tan elevado como el que ocurrió durante toco el proceso de secado por aspersión. Por lo tanto, puede concluirse que una pequeña parte de la agregación fue provocada p · la atomización, pero como asumió Maa et al., el daño a la proteína puede ser el resultado no solo de las fuerzas cortantes, sino ide la interfaz de aire/líquido grande. Maa et al., Biotechnology and Bioengineering 54(6):503-512 (1997).

Influencia de la tensión térmica Las proteínas son materiales sensibles al calor, pero no tjodas las proteínas son igualmente sensibles a la tensión térmica. |Para determinar hasta que punto el concentrado de afelimomab puede resistir la temperatura (tensión térmica) se expusieron pequeñas cantidades de solución proteínica a diferentes temperaturas durante diferentes periodos. Los criterios para la estabilidad del concentrado fueron los datos de SEC, los resultados de la IEF y la apariencia óptica de la solución. Después de la aparición de coagulación, terminaron los ensayos. Los resultados se muestran en el Cuadro 3, a continuación.

Cuadro 3 El concentrado no pudo soportar temperaturas mayores que alrededor de 60°C. En los geles de IEF, la ocurrencia de opacidad estuvo acompañada por la aparición de una banda adicional je n el punto inicial. La decoloración del patrón de banda original indica una pérdida de proteína soluble. También se detectó una pérdida de proteína soluble en los archivos de SEC. El pico monomérico disminuyó con mayor temperatura y tiempo (escala ordenada)', U na temperatura de 40°C no influenció el concentrado de afelimpjmab, incluso al aplicarse durante 24 horas. El daño por tensión térm ica de la proteína no se presentó con un incremento de agregación, sino por la aparición de fragmentos. El pico de agregación permaneció en gran medida sin cambios. La tensión térmica aplicada al i concentrado, por lo tanto, resulto en la fragmentación y coag ulación , mientras que la tensión térmica aplicáda al concentrado atomizador durante la sd resultó de manera principal en agregación . El concentrado de afelimomab pudo soportar temperaturas de hasta alrededor de 50°C durante periodos breves. A alrededor de 60°C el daño en las proteínas ocurrió rápidamente. Durante el proceso de secado por aspersión, las gotas pequeñas se expusieron a temperatura de termómetro húmedo (TWb), que es normalmente 25-30°C por debajo de Tsa). (en este estudio, normalmente 80°C)¿ y el tiempo de exposición fue muy breve. Mumenthaler et al., Pharm. Res. 11(1):12-20 (1994).

Resumen J No se considera que la agregación haya sido causada por las fuerzas cortantes durante el procedimiento de bombeo. I La atomización fue responsable por las partes del incremento en i agregación durante el proceso de secado por aspersión. La tinción térmica desempeño un papel principal para la estabilidad protei nica, pero al aplicarse al concentrado, resultó en la fragmentación; y en agregados insolubles. Debido a que las gotas pequeñas alcanzaron la temperatura crítica de alrededor de 55°C durante la sd (25-30°C por debajo de Tsai., postulado por Mumenthaler et al., pero solo durante un periodo breve), pero parece que el incremento en la agregación fue causado por la interacción de temperatura y atomización. Mumenthaler 1994.

Experimentos de Secado por Aspersión con Excipientes Para optimizar la estabilización de la proteína afelimomab, se 25mM a 100mM la adición de sacarosa proporcionó ¡altos rendimientos de polvo de 70 a 80% (Figuras 8 y 9) . La Tg alcanzó un punto óptimo a 25mM. El incremento de la agregación no fue distinto de manera sustancial en todas las concentraciones. De nuevo , el grado de cristalinidad (C) desminuyo de manera lineal con la cantidad de sacarosa. El contenido de agua residual de los diferentes polvos promedió un valor ligeramente más elevado q e el observado para las mezclas de trehalosa. La forma esférica de las partículas se vio influenciada por la cantidad de sacarosa ! La ¡ proteína tiende a formar esferas dentadas, mientras que la saca|rosa tendió a formar partículas esféricas.

Cuadro 6 En los archivos de DLS, la cantidad de monómeros fue menor que 100mM de sacarosa en comparación con 10mM, pero esta impresión se limitó a los diagramas de distribución de intensidad- I tamaño. En la distribución de volumen-tamaño para 100m de sacarosa, el pico de agregación fue difícil de detectar. En la mezcla de 1 0mM pudieron observarse agregados más grande (> 1 µp?) . Estos picos adicionales no aparecieron en el resto de las mezclas de sacarosa . Los geles de I EF no mostraron ninguna irregularidad sustancial. Una banda adicional solo fue detectable de manera vaga para 50 y 100m , y el patrón de banda original del concent rado puede observarse de manera clara. La contaminación de partículas disminuyó de 10mM a 100mM , lo que mostró la etapa más g rande entre 10mM y 25mM . Con un tamaño de partícula mayor, las diferencias fueron más pequeñas, así que para partículas mayores que 1 5 µ?? todas las mezclas mostraron cantidades de partículas ¡ similares. Al considerar todos estos resultados, la adición de ¡l Om M de sacarosa al concentrado de afelimomab fue insuficiente;! los mejores resultados se obtuvieron con 25mM y 50mM .

Resumen Al comparar los resultados para los tres excipientes en diferentes cantidades resulta evidente que 1 0mM de excipiente no es suficiente para proporcionar una conservación de la proteína durante el proceso de secado por aspersión. Los resultados más favorables para todos los excipientes se obtuvieron de esta manera con 25m y 50mM; 100mM o incluso 150mM no mejoraron los resultados (para 150mM de sorbitol fue totalmente lo contrario). Los resultados para el incremento de agregación fueron un poco más elevados para sorbitol; el resto de los resultados (sacarosa y trehalosa) fuere n en general similares. La trehalosa y sacarosa protegieron a la proteina de afelimomab en el mismo grado y fueron superiores al sorbitol.

Estudio sobre Estabilidad durante el Almacenamiento Los polvos secados por aspersión se expusieron a diferente temperatura y condiciones de humedad residual durante 3 meses. Las condiciones de prueba fueron: un refrigerador (5°C | sin humedad), 25°C a 60% de humedad relativa (similar a Europa Central, Norteamérica); y 40°C a 75% de humedad relativa (similar al Sureste Asiático).

Plan de Preparación e Inspección Se almacenó el concentrado puro, así como el placebo secado por aspersión. Los polvos de placebo comprenden los mismos só idos que los polvos reales (mezclas de proteínas y excipientes secadas por aspersión) salvo para la proteína afelimomab. Las cantidades de polvo necesarias para las pruebas analíticas se calcularon de i antemano para estimar el tamaño de lote del suministro líquido! Tres o cuatro lotes de 50 mi de suministro líquido se secaron por aspersión en las mismas condiciones, los polvos resultantes se mezclaron entre sí como una mezcla a granel a partir de lá cu al se llenaron las cantidades calculadas en pequeños frascos A1 con un floroelastómero sellador Viton® y una tapa roscada Duroplast®. Los frascos A1 con el fluoroelastómero sellador Viton® se selección aron, i debido a que solo mostraron una leve permeabilidad al vapor de agua en pruebas preliminares (no hubo cambio en el contenido de agua de la lactosa liofilizada por aspersión al almacenarla con humedad i residual de 65% a temperatura ambiente durante diez días). En |cada Cuadro 7 Se estudió la cinética de estabilidad de almacenamiento de las diferentes fracciones. Mientras que la cantidad de mono ñero disminuyó de manera constante en todas las temperaturas la agregación pareció cambiar a fragmentación después de alrededor de 2 meses a 25°C y 40°C. A 40°C la agregación ya no fue detec :able como un pico separado en el cromatograma y después de tres meses , el patrón de pico fue superado por el pico de fragmentación El daño severo a 40°C podría observarse al analizar macroscópicamente la muestra. Después de un mes, el concentrado almacenado a: 40°C mostró opacidad, mientras que las muestras a 5°C y 25°C sol o mostraron un pequeño cambio de coloración , no visible a si mple vista. ! Las mediciones de opacidad mostraron resu ltados equiparables. Los cambios claros en la opacidad solo fueron i detectables a 40°C y la muestra real (muestra que contenía prot sína) así como en el concentrado del placebo. Después de un mes, el concentrado mostró un valor de más de 150 NTE que aú n se incrementó en los meses siguientes. Debido a la opacidad óptica!, las mediciones de DLS terminaron para las muestras a 40°jCj. A temperaturas más bajas, no se detectaron cambios. Las mediciones de partículas proporcionaron información adicional sobre la fragmentación y agregación. La fracción de partículas linas disminuyó (partículas < 25 pm), mientras que el número de partículas grandes aumento de manera constante, quizá esto representa los agregados insolubles no detectados por SEC (como se asumió por la disminución de AUC de ios cromatogramas). Estas también deben ser las partículas responsables por la opacidad visible de las muestras.

Hasta ahora, el daño a 25°C no parecía muy serio. Sin embargo, esta intuición se descartó al analizar los geles de IEF. Después de 1 mes, un pequeño cambio en las intensidades ce la banda podía observarse y después de 3 meses, el patrón de banda era definitivamente distinto al original. La banda para la isofarma con el punto isoeléctrico más elevado (IEP) (pH 8.6-8.7) desapareció por completo. El almacenamiento a 40°C provoco un daño ¡grave i después de 1 mes, y empeoró aún más durante las pruebas de estabilidad. j Por lo tanto, el concentrado de afelimomab fue más o menos estable al almacenarse a una temperatura fría. Pero tan pronto como el concentrado se colocó a temperaturas más elevadas, ocurrió degradación a través de diferentes rutas. Incluso a temperatura ambiente (25°C) hubo un factor de tensión al almacenar durante un periodo prolongado.

Estabilidad de los Polvos Secados por Aspersión Para proporcionar una estabilización a largo plazo a través de secado por aspersión, el concentrado de afelimomab con excipientes adicionales no debe mostrar una degradación peor que los resultados para el concentrado almacenado a 25°C. Como una prueba adicional, se realizo una titulación Karl Fischer justo después del proceso de secado por aspersión y después de 3 meses de almacenamiento, para analizar el sello de los frascos A1 (hasta ese momento fueron I sometidos a prueba durante periodos cortos) y/o la influencia de la humedad en la estabilidad de los polvos secados por aspersión.

Concentrado + 25mM de sorbitol Las muestras almacenadas a 5°C y 25°C mostraron bjuena estabilidad durante 3 meses (como se muestra en el Cuadro 8). En los resultados de SEC, no pudieron encontrarse variaciones .claras (? agregación está por debajo del 1%). A 40°C ocurrió una degradación sustancial, la agregación mostró un incremento importante y aparecieron multímeros grandes además pico d dímeros. Después de 3 meses, puedo detectarse un claro pico de fragmentación. notable, en especial para partículas pequeñas. Esto se debió al hecho de que el polvo no pudo redisolverse sin observar una leve opacidad. En las muestras de placebo, el numero partículas fue mucho menor que en las muestras reales, sin limitarse a tamaños de partícula especiales. Los frascos A1 utilizados para almacenamiento de polvos no aseguraron una impermeabilidad al vapor de ; agua absoluta, aunque los estudios preliminares lo sugirieron.

La titulación de Karl Fischer se llevó a cabo diariamente después del proceso de secado por aspersión y después de 3 meses de almacenamiento. La captación de agua no dependió dé las proteínas, ya que las muestras de placebo mostraron resultados iguales, aparte de un valor inicial un poco más elevado. Debido a que los polvos a 5°C solo mostraron un pequeño incremento en humedad, la captación de agua dependió de la HR de las cámaras I con aire acondicionado. La combinación de sorbitol y MAK fue más hidroscópica que el excipiente puro, pues los valores paré las muestras de placebo fueron un poco más elevados que para las muestras reales. La temperatura, la humedad residual j y la permeabilidad al vapor de agua de los frascos no tuvieron ninguna influencia en los diagramas de difracción por rayos X. Después de 3 meses aún no se observaban evidencias en el patrón de difracción en comparación con el diagrama inicial (t=0).

Incluso la apariencia macroscópica del polvo se ve influenciada por la humedad. La mayoría de las muestras aún eran material a granel fluido, pero las muestras a 40°C se fusionaron (en espacial las muestras de placebo). El incremento en la agregación observado en las muestras a 40°C se confirmó con los resultados de DLS.

Mientras que 5°C y 25°C aún mostraban el patrón típico ¡(pico monomérico a 10 nm y un pico de agregación en pm-tamaño) se observó un patrón distinto para la muestra a 40°C. Incluso la distribución de tamaño-volumen, apareció una franja en el pico monomérico, que representaba un pico multimérico que incluso resultó ser distinto después de 3 meses. En los geles de IEF, pueden detectarse cambios después del almacenamiento a 40°C durarte 2 meses, aparece una banda adicional en el punto inicial y no se observa a temperaturas más bajas Concentrado +25mM de Trehalosa Las mezclas de trehalosa mostraron buena estabilidad (Cuadro 9). Durante el almacenamiento a 5°C y 25°C/60% de HR no pudieron detectarse cambios sustanciales en todo el análisis. So o a 40°C/75% de HR los polvos mostraron resultados un poco diferentes. La agregación solo se incremento a 40°C. Después de 3 meses se detectó un incremento en la agregación total alrededor de 2%. Temperaturas más bajas no resultaron en un daño significativo^ en la proteína. Pero incluso a 40°C la cantidad de monómero después de 3 meses aún estando por encima de 95%. Con la trehalosa útil zada I como estabilizador, no se observo la formación de fragmentos, ¡por lo menos no se presentó un pico distinto en los cromatogramas Los fragmentos de IgG pueden ser menos susceptibles a la agregación inducida por temperatura durante el almacenamiento que un anticuerpo completo.

Cuadro 9 Se obtuvieron resultados similares durante las mediciones de opacidad. No pudieron observarse cambios en la opacidad durante el almacenamiento a 5°C y 25°C e incluso la muestra a 4Ó°CÍ |solo mostró un pequeño incremento en la opacidad. La mayoría de la opacidad fue provocada nuevamente por la proteína, debido a que las muestras de placebo presentaron valores de NTU cercanos a cero. La contaminación de partículas no se vio influenciada por temperaturas más elevadas o humedad residual más elevada. A sarte de la diferencia entre las muestras reales y de placebo, el número de partículas conservó en gran medida el mismo nivel durante ¡los 3 meses de almacenamiento. Esto también se confirmó mediante la apariencia óptica de los polvos redisueltos. Todas las muestras produjeron una solución clara e incluso las mediciones dé coloración no mostraron ninguna diferencia durante el almacenamiento.

Los frascos A1 utilizados para las pruebas de estabilidad no pudieron excluir por completo la humedad de los polvos. Las condiciones de humedad elevada a 25°C y 40°C, por lo tanto, llevaron a un incremento en la humedad en los polvos. Los polvos almacenados a 5% mostraron contenidos de agua no alterados. Tanto los factores de tensión, como los de temperatura y HR incrementada no tuvieron ninguna influencia sobre la cristalinidad de las muestras en polvo. Los diagramas de difracción permanecieron sin alteración. El patrón del pico de cloruro de sodio aún era predominante en el diagrama de WAXD. Los resultados de la medición de SEC y la opacidad coincidieron con los resultados obtenidos a través de DLS. Las bajas temperaturas y la baja humedad residual no perjudicaron a los polvos cargados con proteínas. Todas las muestras mostraron el mismo patrón e incluso la muestra almacenada a 40°C no mostró i picos extraordinarios o franjas en los picos. Esta mostró el patrón usual observado con un pico grande alrededor de 10 mM y un pico i adicional en pm-tamaño. ' En los resultados de IEF, el único gel que mostró una banda I adicional en el punto inicial del enfoque fue el de las muestias a 40°C/75% de HR. Incluso en ese caso solo se observó una leve mancha azul (justo debajo de "40°C) después de tres meses. S obre todas las temperaturas y condiciones de humedad, la trehalosa mostró muy buena capacidad de estabilización para la prpjteína afelimomab.

Concentrado +25 mM de sacarosa Las soluciones de sacarosa en concentrados de afelimóma b mostraron una buena estabilidad de almacenamiento, en espec al a 5°C y 25°C/60%H R (Cuadro 10). No se observaron alteraciones en la agregación en estas condiciones. Todos los cromatogramas para 5°C y 25°C fueron similares. Solo pudieron observarse resultados distintos para la muestras a 40°C/75% de H R, donde se detectó un incremento en la agregación de alrededor de 2.5% durante; los tres meses. Aún así, la cantidad monomérica fue de alrededor de 95%.

Cuadro 10 Todos los polvos redisueltos lucían ópticamente claros y acromáticos, indistinguibles del concentrado de afelimómab; o el suministro l íquido. Las mediciones de coloración no most aron i ninguna alteración en el color durante los 3 meses, incluso después de un almacenamiento a alta temperatura (40°C) . Las soluciones a ú n eran similares a las soluciones de R6 o B5 de referencia, que son l íquidos muy diluidos con un toque de rojo o marrón que solo puede identificarse con un auxiliar visual. Con la ayuda del turbid ímetro , no se observaron alteraciones importantes. Aunque hubo un incremento en la opacidad desde inicialmente 12 NTU a 20 NTU después del almacenamiento a 40°C/75% H R, los resultados de opacidad fueron mejores para el sorbitol y la trehalosa, que ya habían mostrado 20 NTU inmediatamente después del secado por aspersión. Las muestras de placebo solo mostraron muy poca opacidad sin cahr bios i significativos en todo el periodo de prueba de estabilidad . ¡ La contaminación de partículas subvisibles para las muestras reales, como para la opacidad fueron sustancialmente mayores que para las muestra de placebo. Sin embargo, en las fraccione s de partículas granes (partículas mayores que 10 pm), solo se observaron pequeñas alteraciones. El número de partículas mayores que 40 µp? fue de manera normal similar a cero, los conteos par a las partículas más grandes que 10 pm estuvieron por debajo o alrec edor de 100 (por mi de solución), y concordar por ello la contaminación general de las partículas no fue muy alta. Todas las degradaciones i en el almacenamiento a alta temperatura coincidieron con los resultados del análisis de Karl Fischer. Entre mayor sea la humedad residual en las cámaras de almacenamiento acondicionada , mayores son las cantidades de agua captada por los polvos. Las muestras de sacarosa no mostraron grandes diferencias entre los polvos reales y el placebo.

Aunque el contenido de agua aumento en condicionéis de i humedad residual más elevada, la absorción de agua no I tu b o ninguna influencia en la cristalinidad de los polvos. Los diagramas de WAXD después de 3 meses mostraron el mismo patrór de difracción para todas las temperaturas, idéntico al diagrama de WAXD tomada inmediatamente después del secado por aspersión (t=0). Solo se detecto una degradación mínima en los diagramas de DLS y los geles de IEF. Después de 3 meses at 40°C y 75% de HR I las muestras de sacarosa mostraron un diagrama con unaj leve difusión muy similar a la que ocurrió inmediatamente después del secado por aspersión. El pico monomérico claro tenía 10 nn de diámetro hidrodinámico y un pico muy pequeño en tamaño en i micrómetros (observado en la sección ampliada). 40°C y 75% de HR también fueron las únicas condiciones que provocaron un patrón de banda de IEF distinto al del concentrado. Una leve banda en el punto inicial del enfoque indicó la presencia de algunos agregados grandes, pero como se observa en el diagrama de DLS, su número no tuvo una importancia sustancial.

Comparación y Síntesis Los experimentos de estabilidad demostraron que diferentes agentes de estabilidad llegan a diferentes resultados. Altera* los excipientes o condiciones de almacenamiento no pareció tener una influencia sobre la morfología de las partículas. Las imágenes de SEM de una mezcla de sorbitol sd inmediatamente después del secado por aspersión apenas podían distinguirse de las muestre s de trehalosa almacenadas a 40°C y 75% de HR durante 3 meses. El valor de 5°C no produjo un daño grave en las proteínas; incluso el concentrado de afelimomab no mostró degradación sustancial durante 3 meses en estas condiciones. Al almacenarse a 25°Cj 60% de HR o a 40°C 75% de HR, el concentrado puro respondió al mostrar agregación y fragmentación.

La trehalosa y la sacarosa mostraron resultados ' muy uniformes. Los polvos presentaron buena estabilidad. Incluso a 40°C y 75% de HR, solo se detectaron pequeñas alteraciones. Sin embargo la higroscopicidad fue uno de los parámetros qué mostró resultados diferentes para la trehalosa y la sacarosa. Los polvcs sd que comprendían trehalosa mostraron en general un bajo contenido de agua después del secado por aspersión y comparación con las mezclas de sacarosa. Como los frascos A1 utilizados para las pruebas de estabilidad no eran completamente impermeables al vapor de agua, los polvos de sacarosa también tuvieron un alto contenido de agua después de 3 meses, debido al hecho de que la sacarosa sd es más higroscópica que la trialosa.

Otra diferencia entre la sacarosa y la trialosa se observa en las mediciones de opacidad. Las mezclas de sacarosa mostraron menos NTU inmediatamente después del secado por aspersión que los polvos de trehalosa. Las mediciones de opacidad también most aron otra característica inesperada. Los procesos de secado por aspersión no mostraron aplicar tensión para las mezclas de proteína- i excipiente que el almacenamiento a temperaturas elevadas. Cuando se secaron por aspersión, los polvos mostraron estabilidad adecuada al menos al ser almacenados por debajo de Tg del polvo de sd.

El sorbitol también mostró un potencial de estabilización. Este mostró buenos resultados a 5°C y 25°C. Sin embargo, los polvos sd i que incluían sorbitol no soportaron temperaturas más elevadas durante un periodo prolongado. Parece que un parámetro crítico (para estos resultados es la Tg baja del sorbitol. Exceder esta temperatura (como se observa en los resultados para el almacenamiento a 0°C) transformó la formulación vitrea en un líquido viscoso, lo que mejoró su movilidad, y abrió varias rutas de degradación.

Intentos para reducir el incremento en la opacidad durante el proceso de secado por aspersión Debido a que se encontró que la opacidad era un parámetro que mostraba variabilidad durante los procesos de secado por aspersión, los parámetros del proceso variaron de nuevo en un intento por reducir los valores de opacidad después del proceso de secado a un nivel mínimo. Para estos experimentos, se utilizaron parámetros del proceso correspondientes a los experimentos de secado anteriores que ya habían demostrado tener como resu tado un daño mínimo en la proteína afelimomab. Para este fin, se I realizaron experimentos de secado por aspersión con adición de 25mM y 50m de los excipientes de trehalosa y sacarosa, utilizando una Tcnt. de 130°C y 100°C. Como se mencionó en lo antérior una Tent. de 100°C mostró resultados analíticos cercanos a los obtenidos con una Teni de 130°C. La disminución de Tenl. redujo la tensión térmica para proteína y, por lo tanto, pudo producir valores dé|NTU NTU en general fueron mayores y también mostraron mjayor variabilidad. Los valores para 130°C y 25mM de adición de trehalosa también coincidieron con los resultados de opacidad obtenidos durante las pruebas de estabilidad.

Adición de sacarosa Las mezclas de concentrado de afelimomab con adición de 25 mM y 50mM de sacarosa se secaron por aspersión con una TeM. de 100°C y 130°C. Las diferentes concentraciones de sacarosa no parecieron tener gran impacto en el rendimiento del pol!vo ni el proceso de secado por aspersión. Todas las mezclas proporcionaron rendimientos de polvo de alrededor del 70%, donde los polvos a 130°C mostraron una desviación estándar un poco menor. Aún más distintos fueron los resultados de las mediciones de opacidad. Los i valores de NTU para 25mM y 50mM fueron muy similares, con una tendencia a una Tent. de 100°C, ligeramente hacia 50 mM de saccirosa (que muestra menor opacidad), y a una adición de 25mM de sacarosa para Te„t. = 130°C. Como estas tendencias no fueron significativas, la cantidad de excipiente no tuvo gran impacto en la i opacidad de los polvos secados por aspersión. Mucho más ciar a fue la decisión relacionada con la Tent. de 100°C, que proporcionó valores de NTU sustancialmente más elevados, que en ocas ones excedieron 50 NTU, que ni siquiera pudieron alcanzarse durante los 3 meses de almacenamiento a 40°C para los polvos a 130°C. Además, la desviación estándar grande obtenida a una Tenl. de 100°C no prometía resultados que pudieran reproducirse. Cuando se seco por aspersión a una Te„t. de 130°C los polvos redisueltos mostearon una opacidad baja que podría reproducirse de alrededor de 20 NTU. Estos valores también coinciden con los resultados obtenidos durante las pruebas de estabilidad.

Resumen El incremento en la opacidad durante el proceso de secado por aspersión no puede reducirse al disminuir la Tent. Los polvos que í contiene trehalosa, así como las mezclas de sacarosa mostearon valores más elevados de NTU a 100°C. Al utilizar 130°C como ent. la adición de,25mM de excipiente proporcionó valores de opacidad un poco más bajos que 50mM. Los parámetros del proceso coincidieron con experimentos previos (130°C y 25mM de aditivo) por lo anto parecen ser óptimos para la secado por aspersión de la proteína afelimomab. En cuanto a la opacidad, la sacarosa tuvo un i rendimiento un poco mejor que la trehalosa. Los polvos secados por | aspersión ni el concentrado de afelimomab que contenía 25m de sacarosa mostraron un promedio de 15 NTU, mientras que las mezclas análogas de trehalosa mostraron un promedio de 17 NTU.

Secado por aspersión de soluciones más concentradas de MAK 195F El concentrado de afelimomab que comprendía 12.4 mg/rnl de MAK 195F se secó por aspersión de manera exitosa a nivel de laboratorio utilizando trehalosa, sacarosa o sorbitol, lo que resultó en polvos estables. Para aumentar la escala de los procesos de secado, el tiempo del proceso es un factor muy importe. asters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Para reducir el tiempo de proceso para lotes más grandes, una mayor concentración proteínica en el suminlistro líquido mejoró el rendimiento de la proteína de la secadora por aspersión sin impacto sustancial en otros parámetros del proceso Para obtener soluciones de MAK 195F más concentradas] el concentrado de afelimomab se sometió a ultrafiltración. Durante proceso de filtración, se redujeron el agua, sales y tensoactivos, mientras que la proteína no pudo atravesar la membrana. Esto llevó a un incremento en la concentración proteínica, pero no alteró la concentración de los otros solutos. 50.6 mg/ml de concentrado de afelimomab En un primer proceso de ultrafiltración, el concentrado alcanzó una concentración de 50.6 mg/ml de proteína por mi (estimada í utilizando una espectroscopia UV). La solución parecía ópticamente clara y casi acromática (un poco marrón), apenas distinguible del concentrado original de afelimomab (12.4 mg/ml). La SEC y DLS no mostraron alteraciones del concentrado original.

La agregación aún era similar al concentrado original (~1%) y i el perfil de DLS coincidió de manera exacta con el concentrado original, y solo mostró un pico único alrededor de 10 nm. La proteína no se daño al incrementar su concentración. Con una concentración incrementó alrededor de 2%, en incremento de 1%. El rendimiento I del polvo fue alrededor de 55%, pero el contenido de agua es más o menos elevado (3.5%). Además, los polvos presentaron ciertas j dificultades para su manejo (llenado, etc.) .debido a su alta carga estática.

El diagrama de DLS mostró un pico monomérico claro y una pequeña franja que representa los pequeños agregados (oligómé ros).

De manera contraria al concentrado original secado por aspersión (12.4 mg/ml), no se detectaron agregados grandes en la forma de un pico en el tamaño de pm. Como solo se detectaron pequeños agregados, no se observó una alteración sustancial en el gél de IEF durante el proceso de secado por aspersión.

Durante el proceso de ultrafiltración, la concentración proteínica se incrementó, mientras que todos los demás so utos (NaCI, Na3P04 y Pluronic® F68) mantuvieron su concentración original. Un impacto de esta alteración puede observarse jen el patrón de difracción de rayos X de la formulación secada por aspersión. Las proteínas se encontraban complemente amorfas después del secado por aspersión, de modo que los picos cristalinos provocados por el cloruro de sodio redujeron su tamaño de mé ñera sustancia. No se detectó ninguna influencia en la morfología d 3 las partículas, salvo por una tendencia a presentar partículas más i grandes, provocada por la mayor cantidad de sólidos en las gotas pequeñas.

Secar por Aspersión en un concentrado de 50.6 mg/mll sin ningún excipiente también produjo una contaminación de partículas muy elevada. En comparación con el concentrado de 12.4 mg/ml sd i i todas las fracciones de partícula por debajo de 25 µp? contenían cantidades más elevadas de partículas.

Al añadir excipientes antes de secar por aspersión éstos resultados deben mejorar. Como en las pruebas de estabilidad, se añaden excipientes en proporciones de masa iguales a las mezclas de 25mM para el concentrado de 12.4 mg/ml.

Adición de sorbitol Se añadió sorbitol en una proporción de masa de sorbitol MAK 195F de 0.35:1, de acuerdo con la mezcla de 25mM para el concentrado de 12.4 mg/ml. El rendimiento del polvo de la mezcla secada por aspersión fue alrededor de 60%. El polvo tenía una Tg de 20°C y un contenido de agua de 2.3%. Estos valores coincidían ampliamente con los resultados obtenidos para las mezclas análogas con el concentrado de 12.4 mg/ml (67% de rendimiento de polvo, I 2.0% de RH, Tg = 190°C). Redisolver el polvo sd produjo una solución clara casi acromática, con una coloración muy similar a la solución B2 de referencia (un poco marrón), justo como el concentrado inicial de MAK 195F de 50.6 mg/ml.

Después del secado por aspersión, el polvo redisueltó mostró un pequeño incremento de en la agregación. La SEC mostró un nivel de agregación de 1.3%, en comparación con alrededor de 1% para e i concentrado puro de 50.6 mg/ml. De nuevo, esta no fue | una alteración sustancial comparada con el concentrado de 12.4 mg/ml secado por aspersión con la adición de 25mM de sorbitol.

La cantidad de agregados insolubles no se incrementó de manera sustancial, como se observó en los resultados de DLS. Se detectó un claro pico monomérico con un diámetro hidrodinámico de 10 nm, así como un pico de agregación en el tamaño en pm. Debido a que el contenido sólido del suministro líquido se incremento pe r un factor de 2.8, la contaminación de partículas subvisibles del polvo redisuelto se incremento. En particular, las fracciones de partículas pequeñas (<10 pm) mostraron altos niveles de contaminación, mientras que el número de partículas grande (>10 pm) permaneció en un nivel similar al de las soluciones con concentración más baja.

Alterar la concentración proteínica en el suministro líquido solo tomó un pequeño impacto en la morfología de las partículas. Las partículas muestran la forma usual de esferas vendadas, pero perece que existe una tendencia a presentar partículas más grandes. Debido a que el diámetro de la partículas para las soluciones que contenían 12.4 mg de afelimomab por mi fue de alrededor de 2.5 a 13 pm, secar por aspersión soluciones con concentraciones más eleyadas produjo en parte partículas mayores que 15 pm.

Adición de trehalosa La proporción de excipiente:MAK 105F de 0.7:1 se adoptó a partir de la serie de pruebas de estabilidad, utilizando 25 mlyl de adición de excipiente para el concentrado de 12.4 mg/ml- La can idad trehalosa). Esto puede explicarse por el alto contenido de sólidos que fue alrededor de tres veces mayor que en las mezclas que utilizaron el concentrado de MAK 195K de 12.4 mg/ml.

Las alteraciones en la concentración proteínica y en el contenido sólido en el suministro l íquido no tuvieron una gran influencia en la morfología de las partículas. La forma de las partículas no muestra ninguna alteración sustancial , salvo la apariencia de partículas aisladas más grandes en el polvo mas concentrado.

A dición de Sacarosa Para mantener una proporción de masa de sacarosa : MA K ¡1 95 F de 0.7: 1 (análoga al concentrado de 12 ,4 mg/ml y 25m de excipiente) la cantidad de sacarosa para cada experimento de ; Í secado por aspersión debía incrementarse por un factor de 4.08 (50.6/12.4). Como se muestra en lo anterior al utilizar , esta proporción de masa, se obtuvo una conservación proteínica casi completa durante el proceso de secado por aspersión. Secar por aspersión las soluciones que comprenden esta alta cantida i de sólidos, implica el riesgo de atascar la salida de polvo del ci clón , que tiene un diámetro muy pequeño, en especial para el ciclón de alto rendimiento. Por lo tanto, en ocasiones, el rendimiento de polvo disminuye por debajo del 50%, sin tener ningún impacto Jn la estabilidad del proceso.

Como el concentrado de 50.6 mg/ml tiene una coloración afelimomab de 12.4 mg/ml tenía una concentración de cloruró de sodio de 38% en p/p (con respecto a los sólidos) que mostraba un claro pico de cloruro de sodio a °2 Theta de 32. En el concentrado secado por aspersión, la concentración de cloruro de sodio fue de alrededor de 14% en p/p, lo que llevó a una disminución en la altura del pico cristalino. Al añadir trehalosa y sacarosa como un excipiente, la concentración de cloruro de sodio disminuyó a un valor de 9%. Como consecuencia, el pico cristalino ya no fue predominante en el halo amorfo provocado por la proteína y el estabilizador. Debido a que la proporción de masa de sorbitol era menor que la de los disacáridos, el pico cristalino de cloruro de sodio aún puede observarse en el diagrama de WAXD de la mezcla de sorbitol.

Cálculos de tonicidad Debido a que, de manera original, el concentrado' de afelimomab se desarrolló y formuló para administración parenteral, la isotonicidad era un factor importante. Reinhart et al., Crit Care Medicine 29(4):765-769(2001). Las soluciones para aplicación intravenosa deben tener aproximadamente la misma presión osmótica I que la sangre (286 mosmol/kg). Kommentar zum Europáischen Arzneibuch, Wiss. Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH, Band 2(5.2) (2006). La presión osmótico puede calcularse a través de una disminución en el punto de congelación, con el uso de las siguientes i ecuaciones de Deutscher Arzneimittelcodex, dt. Apotheker Verlag Stuttgart, Band 1 (Anlage B), 1-6 (2006): Cálculo de la disminución del punto de congelación solución al 1 % (p/V) : I -10 ?G = Isc Mr Cálculo de ?? de las mezclas: Cálculo de la presión osmótica de una mezcla: 286mosmol ! kg · Tmi3 "m 0.52°C En las ecuaciones anteriores, ?? representa la disminución en el punto de congelación de una solución al 1 % (p/V) de la su stancia en comparación con el agua pura, Liso es la disminución en el fondo de congelación en la concentración isotónico y Mr es el peso molecular. Los valores de Liso varían para diferentes electrólitos I (véase el Cuadro 1 1 ). Debido a que la disminución del pu nto de congelación del suero es de 0.52°C (que es igual a una presión osmótica de 286 mosmol/kg), el valor para la disminución en el punto de congelación de una solución al 1 % de la mezcla en comparación con agua pura (ATmix) no debe exceder 0.52°C . El afelimomab cln su alto peso molecular no presentó un impacto sustancial en la disminución del punto de congelación de las formulaciones, as que no se incluyó en los cálculos.

Cuadro 11 Con el uso de estas ecuaciones, los diferentes concentrados y mezclas producen los valores calculados de presión osmótica proporcionados en el Cuadro 12.

Cuadro 12 Para mantener la presión osmótica fisiológica, fue necel sano reducir la cantidad de cloruro de sodio al utilizar soluciones de MAK 195F muy concentradas. La concentración original de cloruro de sodio fue de 8.8 mg/ml. Al utilizar proporciones de masa de excipiente: MAK 195F calculadas en este estudio (25 miV de excipiente en el concentrado de 12.4 mg/ml), la concentración proteínica pudo aumentar de alrededor de 130 mg/ml, siempre y cuando todo el cloruro de sodio fuera extraído de la formulación. Esto resultó en una presión osmótica de alrededor de | 300 masmol/kg. ; Resumen Este estudio demuestra un método ejemplar para preparar un polvo de anticuerpos que incluye secado por aspersión. Dé manera específica, en este ejemplo, un fragmento IgG; una solución de I afelimomob=MAK 195F se transformó en un material a granel secado Al detectar varios excipientes y condiciones de proceso, se desarrolló un proceso de secado por aspersión que proporcionó una estabilidad de proceso combinada con estabilidad durante el almacenamiento.

La estabilidad se analizó utilizando varios métodos que pueden detectar la degradación física o química de la proteína, por ejemplo agregación soluble e insoluble a través de SEC y DLS, eventos térmicos a través de OSC y humedad de los polvos sd a través de la titulación de Karl Fischer. La degradación ocurrió durante el proceso secado, provocada por varios factores de tensión como resultado de almacenamiento a largo plazo a temperatura elevada. El i fragmento de IgG se estabilizó al añadir azúcares a la proteína. Se estudiaron la trehalosa, sacarosa y sorbitol para detectar su j potencial de estabilización durante el secado y almacenamiento subsiguiente.

En la primera parte del estudio, el concentrado proteíniCo se caracterizó y luego se secó por aspersión sin ningún excipiente para verificar la susceptibilidad del concentrado durante el proceso de secado. Además, se realizó una serie de pruebas para encontrar los parámetros de proceso correctos. El secado por aspersión del concentrado puro produjo un daño en la proteína. El incremento en la agregación fue sustancial (alrededor de 2%), en particular, cuando se planeaba un almacenamiento subsiguiente. Variar la Tenl. debe ayudar a reducir la agregación o encontrar los parámetros de proceso en los que ocurra menos agregación.

El daño a las proteínas durante el proceso de secado por aspersión pareció ser provocado por la interacción de diferentes factores de tensión (por ejemplo, calor, atomización, fue rzas cortantes). Ninguno de estos factores de tensión puede provocar por sí solo la deterioración de la proteína equiparable al proceso de secado por aspersión.

Se añadieron azúcares estabilizadores al concentrado de proteína en varias concentraciones entre 10 mM y 150 mM. P¡é rece que 150 mM son inadecuados, debido a que el contenido sólido del suministro líquido era demasiado elevado, y el separador del |c i c I ó n tend ía a atascarse, lo que resultó en un bajo rendimiento del polvo.

La adición de mM de excipiente fue insuficiente para todos los azúcares sometidos a prueba. Los mejores resultados se obtuvieron con la adición de 25 mM, lo que es igual a una proporción de nasa I de excipiente: MAK 195F=0.7U : 1 para trehalosa y sacarosa y 0.35: 1 para sorbitol. El valor de 50 m M que produjo resultados equiparables, pero el propósito era minimizar las cantidades de ad itivos en la medida de lo posible. La comparación del potencial de estabilización para el proceso de secado produjo result ados similares para la trehalosa y la sacarosa. Parece que el sorbitol es su poco inferior a los disacáridos. Pero esto no se basó en la pequeña proporción de . masa, donde la adición de más sorbitol no mejoró los resultados. Respecto a la estabilidad del proceso, se recomienda una adición de 25 mM de preferencia , treha losa o i sacarosa.

! Debido a que las mezclas de 25 mM fueron más efectivas para la estabilidad del proceso, éstas se utilizaron para pruebas estabilizadas a corto plazo (3 meses). J unto con mezclas de pla cebo análogos y el concentrado líquido, los productos se expusieron a 3 diferentes climas comunes (refrigerador: 5°C, Europa Central : i 25°C/60% R H , Sureste Asiático: 45°C/75% RH). Como se esperaba , el concentrado líquido no pudo soportar ninguna de las tempera uras elevadas, lo que resultó en un grave daño a las proteínas después de 1 mes (agregación , fragmentación y opacidad óptica). Los polvos j sd con excipientes mostraron una buena estabilidad durante 3 ? meses. Las formulaciones de trehalosa, así como de sacarosa sólo sufrieron un daño sustancial al almacenarse a 45°C/75% RH (incremento de agregación de 2%). Incluso 25°C/60% RH no tuvo impacto en los polvos, excepto por un pequeño incremento en la agregación (0.5%). Como sugirieron los resultados para estabi ¡dad del proceso, el sorbitol también fue el estabilizador más débil durante el almacenamiento. Las mezclas almacenadas a 5°C y 25°C fueron estables de manera similar con los otros excipientes, pero 40°C fue un parámetro crítico para la mezcla de sorbitol y protíína. El valor de 40°C excedió la Tg de la mezcla, así que la estabi idad de almacenamiento provocado por la inmovilización de la proteír a ya no pudo garantizarse. Esto llevó a un incremento en la agregación de alrededor de 12%, que no se había observado en ninguna prueba preliminar de este estudio. Las mediciones de partículas sub-visibles y opacidad llevaron a resultados no satisfactorios. Estas muestras mostraron en su mayoría opacidad visual o incluso coagulación. El problema principal de los estudios de estabilidad fue los frascos A1 utilizados para el almacenamiento de los polvos. Éstos no mostraron impermeabilidad completa al vapor de agua, así que el contenió o de : j agua residual de los polvos higroscópicos no pudo mantenerse constante.

Con la formulación apropiada, casi todos los cambios éh las i í * proteínas pudieron reducirse a un nivel mínimo. El único paránetro que aún mostraba un cambio sustancial era la opacidad. No 5s el almacenamiento, sino el proceso de secado por aspersión el que produce un incremento en la opacidad. Los intentos por disminuir este incremento mediante la adición de más excipiente o el uso de temperaturas de secado más bajas fallaron. Un incremento en la opacidad de alrededor de 5 NTU (concentrado) a 15-20 NTU (mezclas i sd) no pudo evitarse. Sin embargo, los otros métodos analíticos no mostraron cambios sustanciales durante el secado por aspersión de las formulaciones de proteína-azúcar En la última parte de este estudio, la concentración de proteínas en el suministro líquido se incrementó con el propósito de obtener una producción más elevada de la secadora por aspersión.

Se realizaron experimentos con una concentración proteínica dé 50.6 mg/ml. El proceso de ultraf iltración, así como ei secado por aspersión de la solución proteínica más concentrada (con la proporción de masa mejor identificada de aditivo de azúcar) no tuvo i un impacto sustancial en la estabilidad de la proteína afelimoma:». La mayoría de los resultados (excepto por la contaminación de partículas u opacidad, de acuerdo con el contenido de sólidos más elevado) fueron equiparables a los experimentos análogos con el concentrado de 12.4 mg/ml. El secado por aspersión de las concentraciones de 100 mg/ml debe ser viable si es posible im|ped¡r i el atascamiento de la salida del ciclón. Incluso los polvosi más concentrados pudieron administrarse de manera parenteral sin correr el riesgo de presentar hipo o hipertonía, debido a que el regulador original contiene suficiente cloruro de sodio, que puede extraerse a cambio de los agentes estabilizadores. Concentraciones proteílnicas Como se presenta en lo anterior, los parámetros de la formulación y el proceso se evaluaron utilizando MAK 195F como un compuesto modelo, utilizando una concentración de 12 mg/ml. Las Figuras 10A-10B incluyen dos gráficas de barras que representen los datos de estabilidad física de SEC para las formulaciones de MAK 195F secadas por aspersión: (A) efecto del sorbitol, trehalosa y sacarosa (c=25 mM) y (B) efecto de la concentración estabilizadora en la cantidad de agregación proteínica después de 3 meses de almacenamiento a 40°C/75% RH. Los datos proporcionados en la Figura 10A revelan que la trehalosa y la sacarosa proporcionen los productos más estables, mientras que el producto no proporcionó una estabilidad proteínica a largo plazo adecuada. La cantidad mínima de estabilizador se determinó a 25 mM, que es igual a la proporción de masa de excipiente:proteína = 0.7:1 (ver Figura 10B). En la Figura 10A, las barras en cada agrupación, de izquierda a derecha, representan MAK 195F (a granel), MAK 195F + sorbitol, MAK 195F+trehalosa y MAK 195F + sacarosa, respectivamente. En la Figura 10B, las barras en cada agrupación, de izquierda a derecha, representan sorbitol, trehalosa y sacarosa de manera respective.

Estos parámetros se reprodujeron utilizando concentraciones proteínicas de 12, 50 y 100 mg/ml. Todas las formulaciones proporcionaron polvos aceptables. La mezcla residual pronedio mostrada en el Cuadro 14 se encontraba en 4.6% en peso (MAK 195F) y 5.5% en peso (Adalimumab) y, por lo tanto, fiueron considerablemente más elevadas, en comparación las formulaciones liofilizadas con valores típicos por debajo de 1%'. Sin embargo, las temperaturas de transición vitrea se midieron a 60°C para MAK 195F y alrededor de 70°C para ambos anticuerpos completos, lo que sugiere una estabilidad adecuada por lo menos a una temperatura de almacenamiento de 5°C. Los datos anal ticos preliminares de estas formulaciones altamente concentradas (100 mg/ml) de MAK 195F, Adalimumab y ABT-325 secadas por aspersión se presentan en las Figuras 11A-11B. Las Figuras 11A-11B tienen dos gráficas de barras que representan (A) el efecto de procesamiento y 3 meses de almacenamiento a 40°C/75% RH en la estabilidad física al utilizar el método SEC, y (B) en la estabilidad química (estandarizada al 100% después del proceso) determinada por el método de IEC, para el MAK 195F, Adalimumab, y ABT-325 con alta concentración y secadas por aspersión en soluciones de 200 mm de trehalosa. En la Figura 11A, las barras de cada agrupación, de izquierda a derecha, representan MAK 195F (95 mg/ml, secado por aspersión), adalimumab (100 mg/ml, secado por aspersión); ABT-325 (100 mg/ml, secado por aspersión); y ABT-325 (100 mg/ml, liofilizado), respectivamente (salvo porque no existen datos de almacenamiento para un mes para ABT-325 (100 mg/ml, liofilizado) ni datos de almacenamiento para 3 meses para MAK 195F (95 mg/ml, secado por aspersión)).

Cuadro 14 Los datos para todas las formulaciones probadas demuestran estabilidad física aceptable de la proteína durante el procesamiento y almacenamiento durante hasta tres meses a 40°C, equivalerte al ABT-325 liofilizado. Sin embargo, los Datos que corresponden a la PCS (no mostrados) sugieren un efecto en las características de las proteínas, que debe analizarse con mayor detalle. Con respecto a la estabilidad química, los datos en la Figura 11 B demuestran resultados equiparables para la formulación secada por aspersión en comparación con una formulación liofilizada estándar. En la Figura 11B, las barras de cada agrupación, de izquierda a derecha, representan ABT-325 (100 mg/ml, secado por aspersión), AB -325 (100 mg/ml, liofilizado); y adalimumab (100 mg/ml, secado por aspersión), de manera respectiva.

Breve Explicación Esto demuestra la viabilidad general de fabricar de manera exitosa polvos de anticuerpos secados por aspersión a partir de soluciones mAb con concentraciones de hasta 100 mg/ml. Los datos presentados para MAK 195F, Adalimumab y ABT-325 no muestran un j efecto significativo durante el procesamiento ni durante los estudios de estabilidad acelerada con respecto a la estabilidad física o i química de la proteína. Sin embargo, la polidispersión observada de las proteínas secadas por aspersión debe analizarse con m íayor detalle Además, se requiere una cantidad suficiente de estabilizador dentro de la formulación para obtener un almacenamiento' a Ijargo plazo. Sin embargo, debido a la versatilidad de esa técnica, | ésta ofrece prospectos interesantes con respecto a la formulación de sustancias farmacológicas a granel, así como con respecto ja las nuevas formas de dosificación y vías de administración.

INCORPORACION PARA REFERENCIA Los contenidos de todas las referencias mencionadas (que incluyen referencias a la literatura, patentes, solicitudes de patente y sitios web) que puedan mencionarse en toda esta solicitud se incorporan de manera expresa en la patente para referencia. La práctica de la invención empleará, a menos que se indiqué dé otro modo, técnicas convencionales de secado por aspersión y formulación de proteínas, que se conocen bien en la técnica, EQUIVALENTES Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán o serán i capaces de distinguir sin utilizar más que experimentos de rutina,

Claims (1)

1. REIVI DICACIONES 1 . Un método para preparar un polvo proteínico o peptídicp, el método comprende las etapas de: secar por aspersión una solución que comprende más de alrededor de 50 mg/ml de una proteína o un péptido, y por lo m ;nos un excipiente, de manera que se prepara un polvo proteínico o peptídico. 2. El método de la reivindicación 1 , en donde la solución comprende más de alrededor de 100 mg/ml de la proteína o péptido . 3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaci ones precedentes, que comprende preparar un polvo de anticuerpos, que comprende: secar por aspersión una solución que comprende má > de alrededor de 50 mg/ml de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo y por lo menos un excipiente, de manera que se prepara un polvo de anticuerpos. 4. El método de la reivindicación 3, en donde la sol ución comprende más de alrededor de 100 mg/ml del anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 , en donde al anticuerpo o porción de unión a antígeno del mis mo es u na inmunoglobulina G (IgG). 6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del proporción de masa de excipiente: proteína de entre alrededojr de 0.7: 1 .0. 14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la solución comprende entre alrededor de 20 y alrededor de 30 mM de excipiente. 1 5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la solución comprende alrededor de 25 mM de excipiente. 16. El método de acuerdo con cualq uiera de las i reivindicaciones precedentes, que comprende secar por aspe rsión con una temperatura de aire de entrada (Te„.) entre alrededor de 100°C y alrededor de 1 80°C, y una temperatura de aire de sal ida (Tsai . ) entre alrededor de 60°C y alrededor de 1 10°C. 17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende secar por aspersión con una ??„. de alrededor de 1 30°C y una Ts ai . de alrededor de 80°C . 18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el secado por aspersión comprende: atomizar la solución para formar gotas pequeñas de solución secar las gotas pequeñas con un gas para formar u n polvój y recuperar el polvo a partir de un gas. i 19. El método de acuerdo con la reivindicación 1 8, que comprende atomizar la solución con un atomizador de boqui l la presurizada. ¡ i 20. El método de acuerdo con la reivindicación 1 8 ó 1 9, que comprende separar y recuperar el polvo de anticuerpos a parti r del gas con un ciclón. 21 . Un método para preparar una composición farmacéutica , el método comprende las etapas de preparar un polvo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y mezclar e l polv o d e anticuerpos con un portador farmacéuticamente aceptable . 22. El método de acuerdo con la reivindicación 21 , en donde el portador farmacéuticamente aceptable es aceptable para administración parenteral, oral, enteral o tópica. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22 , en donde el portador farmacéuticamente aceptable comprende! un l íquido. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 21 , 22 ó 23 , en donde el portador farmacéuticamente aceptable comprende agua 25. Una preparación farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, preparada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 26. U na preparación farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de una proteína o péptido, preparada de acuerdó con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24. 27. Una composición en polvo estable que com prendé u na proteína o péptido y un excipiente, en donde la composición comprende menos de alrededor de 6% de humedad residual. 28. La composición de la reivindicación 27, en dondje la proteína o péptido comprende un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo. 29. La composición de la reivindicación 28 , en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es un anticu erpo I gG . 30. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es MAK 195F, Adalimumab, A BT{325 , A BT-308 o ABT-147. 31 . La composición de acuerdo con cualquiera del las reivindicaciones precedentes, en donde la composición en polvo es estable a temperatura y humedad ambiente durante por lo menos tres meses. 32. La composición de acuerdo con cualquiera dé las reivindicaciones precedentes, en donde la composición en polvo es i estable a 40°C durante por lo menos tres meses. 33. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el excipiente es trehalosa , sacarosa, sorbitol, polietilen glicol, por lo menos un aminoácido , histidina, alanina, arginina, glicina o una mezcla de los m ismos 34. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición tiene una proporción de masa de excipiente a anticuerpo o porción de ant geno del mismo de al rededor de 0.27: 1 .0 a alrededor de 2.8: 1 .0, alrededor protegida por el excipiente contra precipitación, desnaturalización, u oxidación por solventes orgánicos. 48. El método de fabricación de acuerdo con cualquiera dé las reivindicaciones precedentes, en donde la actividad de la proteína , péptido, anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo está protegida por el excipiente contra precipitación, desnaturalización, u oxidación por PEG 400, etanol, DMSO, N MP, o ácido acético g lacial . 49. Una composición farmacéutica preparada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de métodos precedentes. 167 RESU M EN Se proporciona un método para preparar un polvo proteín co o peptídico que incluye secar por aspersión una solución que incluye más de, por ejemplo, alrededor de 50 mg/ml de una proteína o péptido (por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión a antí geno del mismo) y por lo menos un excipiente. También se proporcionan composiciones en polvo estables que incluyen una proteína y un excipiente que tiene menos de, por ejemplo, alrededor de 6% de humedad residual.