TW200944245A - Powdered protein compositions and methods of making same - Google Patents

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TW200944245A
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Michael Adler
Hans-Juergen Krause
Michael Siedler
Peter K Lassner
Geoffrey Lee
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Abbott Gmbh & Co Kg
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Description

200944245 六、發明說明： 【先前技術】 ❹
醫藥蛋白質調配物之基本原則為必須克服某些不穩定 性。可將蛋白質之降解路徑分成兩種不同類別，其包括化 學不穩定性及物理不穩定性。化學不穩定性經由鍵形成或 裂解產生對蛋白質的修飾。化學不穩定性問題之實例包括 去醯胺、外消旋、水解、氧化、β消除及雙硫鍵交換。另 一方面，物理不穩定性不會導致蛋白質中共價改變。相反 地，其涉及蛋白質之高次結構（二級及二級以上結構）的改 變。該等改變包括變性、吸附至表面、聚集及沈澱。
Manning等人，P/zar/w.心5· 6,9〇3 (1989)。 在Watson及Crick (1953年）發現DNA結構及後續完成人 類基因圖譜定序計劃之後，對蛋白f化學之關注極速增 長。尤其關注在疾病、組織或發育中基因與其蛋白質產物 之間的關係。Next generation ，第㈣（⑽ publishing Ltd·，2006)。經過其間幾十年，基於蛋白質之 藥物的數目快速增加。現今，可分離或合成、修飾及傳遞 某些蛋白質或肽以減輕或治癒某些病症及疾病。基於蛋白 質之藥物的主要施用路徑仍為液體調配物之靜脈内注射， 但亦已測試及使用其他路徑。 已進行許多努力以將蛋白皙、、交 贫白賢，合液轉換成固體形式。粉；| 組合物提供許多優勢，例如可藉 J』精由涉及更小空間及重量拓 儲存或運輸較大量之蛋白質， θ ^ 且此1沩耗低於在儲存及身 運期間冷部液體調配物所需 W禹之此量沩耗。粉末組合物亦肩 137663.doc 200944245 利於新穎傳遞途徑，諸如吸入（Tzannis等人，國際公開案 第 WO 2005067898 號）或無針注射（Burkoth，
De/ivery Compam.es 76-78 (2001))。已使用若干種 方法以自蛋白質水溶液產生粉末，尤其喷霧乾燥、喷霧冷 ;東乾燥、冷;東乾燥或自超臨界流體或（部分）有機溶液中沈 殿。Winters等人’ Jowma/ 85(6): 586-594 (1996)。與極昂貴且耗時之冷凍乾燥相比，喷霧乾燥為產 生負載蛋白質之固體的有效、高效方法，該等固體為開發 生物藥物新穎傳遞形式（諸如吸入）提供機會。Maa等人， 户Aarm. 16(2): 249-254 (1999)。 噴霧乾燥純蛋白質溶液有導致部分失活之風險，其自動 產生較低品質之藥物。失活可能（例如）係由歸因於高溫、 剪切應力及大的相界面（液體/氣體）之過程相關之物理應力 (諸如變性或聚集）或由化學反應（例如水解或氧化）引起。 【發明内容】 本發明係關於將包含蛋白質及賦形劑之蛋白質調配物喷 霧乾燥的方法。特定言之，本發明之方法及組合物係基於 將含有所關注之蛋白質及賦形劑之溶液喷霧乾燥的喷霧乾 燥過程。 本發明之調配物具有許多優於標準溶液及冷凍乾燥調配 物之優勢。詳言之，本發明之喷霧乾燥方法在周圍溫度下 將過程相關之降解降至最低且增加蛋白質穩定性（例如， 與冷凍乾燥之組合物相比）。此外，噴霧乾燥之調配物亦 更易於運輸且適用於製造高濃度調配物、改良蛋白質之生 137663.doc 200944245 物可用性及開發局部釋放（例如，肺部傳遞）及持續釋放（例 如’脂質體及（聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯））pLGA塗佈之微 球體）調配物。 本發明之方法及組合物可用以提供包括任何所關注之蛋 白質及賦形劑的穩定叔末組合物或調配物。在一態樣中， 將本發明之方法及組合物用於抗體及其片段，包括用於活 • 體内及活體外目的之彼等方法及組合物。在另一實施例 中，抗體片段為免疫球蛋白G(IgG)片段。 參 此外，製備蛋白質及肽調配物所必需之多步驟純化及漠 縮方法通常在組成中引入可變性’以致於各批之間調配物 之精確組成可能有所改變。聯邦條例要求無論製造地點或 批號’藥物調配物中之藥物組成應高度一致。本發明之方 法可用以產生添加有精確量賦形劑之蛋白質的粉末調配 物，進而產生具有精確濃度之賦形劑之蛋白質調配物。 在一態樣中，本發明提供一種製備蛋白質或肽粉末之方 ❹ 該方法包括將包含大於約50 mg/mL之蛋白質或肽及至 少一種賦形劑之溶液嘴霧乾燥，以致製備蛋白質或肽粉 末。在一些實施例中，該溶液包含大於約丨mg/mL之蛋 ' 白質或肽。蛋白質亦可為雙可變結合域（DVD)結合蛋白。 -在-些實施例中’該方法包括製備抗體粉末，其包括將 包含大於約50 mg/mL之抗體或其抗原結合部分及至少一種 賦形劑之溶液喷霧乾燥，以致製備抗體粉末。在-些實施 例中☆液包含大於約1〇〇 mg/mL之抗體或其抗原結合部 刀。抗體或其抗原結合部分可為免疫球蛋白咐G)，例如 137663.doc 200944245 MAK 195F、阿達木單抗（Adalimumab)、ΑΒΤ-325、ΑΒΤ- 3 08或ΑΒΤ-147。在一些實施例中，粉末在周圍溫度及濕 度下至少3個月内係穩定的及/或在4〇它下至少3個月内係穩 定的◊ 賦形劑可包括（例如）海藻糖、蔗糖、 _ ❹
醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸 或其混合物。在一些實施例中，溶液包括介於約〇 27:1〇 與約2.8:1.0之間、介於約〇27:1〇與約14:1〇之間、介於 約0.27:1.0與約0.7:1.〇之間或約〇 7:1 〇之比率的賦形劑蛋 白質比。在-些實施例中’溶液包含介於約2〇視與約3〇 mM之間的賦形劑’或約25 mM賦形劑。 在-些實施例中’方法包括用介於約1〇〇。〇與約刚。C之 間的入口 ^氣溫度（TV)及介於約6(rc與約11(Γς之間的出口 空氣溫度（TaO喷霧乾燥。在某肽實 牡示二耳狍例中，方法包括用約 ⑽之T入及約崎之了出喷霧乾燥。該方法可包括_ ^^液以形成溶液小液滴、用氣體乾燥該等小液滴以形 成粉末且自氣體中回收該粉末。該方法可包括用壓力喷嘴 ==化溶液及/或用旋風分離器自氣體中分離且回收 該方法亦可包括將抗體粉末包埋於醫藥 劑中。該醫藥學上可接受之載劑又載 及/或局部投與所接受。醫藥學上可上4、經口、腸内 體，諸如水。 醫樂學上可接受之栽劑可包括液 在另一態樣中，本發明係針 種醫樂製劑，該醫藥製 137663.doc 200944245 劑包括有效量之根據本文中所述方法之任—者製備的抗體 或其抗原結合部分。在另一態樣中，本發明係針對一種醫 藥製劑，該醫藥製劑包括有效量之根據本文令 任一者製備的蛋白質或肽。 在另一態樣中，本發明捤供—錄台紅疋丄如 a捉供種包括蛋白質或肽及賦形 劑之穩定粉末組合物，其中該組合物包括小於約6%之殘 餘水分，s-些實施射，，组合物包括切約4%或3%之 殘餘水分。蛋白質或肽可包括抗邀或其抗原結合部分諸 如IgG抗體或其抗原結合部分’諸如Μακ ΐ9π、阿達木單 机 ABT-308或ABT-147。蛋白質亦
ΛΟ 1 -0ZD 變結合域（DVD)結合蛋白 —實施例中，該粉末組合物在周圍溫度及濕度下至 少3個月内及/或在約_下至少3個月内係穩定的。在-些 中蛋白質或肽’或抗體，或其抗原結合部分保 其生物活性。
賦形劑可包括(例如)海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二 醇、至·少— -植胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸 或具處合私j . 合物可具有約G.27:1輕約2.8:1·0、約 形劑（例如約G.27:1.G至約G.7:1.G或約G.7:1之靖 質量比。*海藻糖及/或蔗糖）與抗體或其抗原結合部分之 至約合物可具有約〇.27:1·0至約2.8:1.0、、約0·27:1.0 之賦形劑（I/ 約 G.27:1.G 至約 G.7:1.G、約 °·7:1，或約 〇.35:1 量比。》如，山梨糖醇）與抗體或其抗原結合部分之質 137663.doc 200944245 在另一態樣中，本發明提供一種製造醫藥組合物之方 法’該方法包括將有效量之本發明之穩㈣末組合物與醫 樂學上可接受之載劑（例如液體，諸如水）混合。在一些實 施例中’醫藥組合物適於非經腸、經口、腸内或局㈣ 與。該方法可進-步包括在不顯著影響粉末組合物之移定 性的情況下在顯著高於周圍溫度之溫度下加工(例如，溶 融擠出）穩定粉末組合物。 ❹
在某些實施例中，該方法包括（例如）用諸如plga之聚 合物塗佈粉末組合物以形成持續釋放或延遲釋放醫藥組合 物。另外或其他，該方法可包括用腸溶衣塗佈。在—些實 施例中，蛋白質、a、抗體或其抗原結合部分之活性：由 賦形劑保護以避免由有機溶劑（例如pEG 4〇〇、乙醇、 DMSO、NMP或冰醋酸）引起之沈殿、變性或氧化。 當前，幾乎所有公司均使用冷凍塊狀藥物組合物，且面 對諸如冷凍及解凍狀態之重現性、賦形劑在塊狀藥物内出 乎意料的結晶、冷凍期間緩衝液之pH值變化及由於解凍而 造成之長滯後時間（例如在約37°C之溫度下2公升容器）之問 «I。使用喷霧乾燥之塊狀藥物組合物可避免該等問題。此 外’喷霧乾燥之塊狀藥物組合物在混配最終藥物組合物期 間極便於處理且允許製造寬泛濃度範圍。另外，僅添加水 之喷霧乾燥藥物組合物可替代經典混配且因此降低藥物產 品製造期間之風險，同時增加輸出能力。此外，全長/完 全抗體與單株抗體（mAb)片段相比可能較不易於物理降 解。另外’隨著蛋白質濃度增加至100 mg/mL，物理或化 137663.doc 200944245 學降解通常很少增加或不增加。因為較高濃度之溶液將增 加該方法之效率，所以使用100 mg/mL之蛋白質濃度將有 益。 【實施方式】 本文中所揭示之方法及組合物之該等及其他特徵及優勢 將藉由結合隨附圖式參考以下詳細描述而更充分理解。 I.定義 為使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。 > 如本文中所用，術語"酸性組份"係指具有酸性15^1值（亦 即小於7.0)之試劑（包括溶液）。酸性組份之實例包括鱗 酸、鹽酸、.乙酸、摔檬酸、草酸、丁二酸、酒石酸、乳 酸、蘋果酸、乙醇酸及反丁烯二酸。 如本文中所用，術語"抗氧化劑"意欲意謂抑制氧化作用 或充當抗氧化性增效劑且因此用以防止製劑因氧化過程而 變質之試劑。該等化合物包括（例如但不限於）α生育酚（維 I 生素Ε)、抗壞血酸、棕棚酸抗壞▲醋、檸樣酸、丁基化經 基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、依地酸（EDTA，乙二胺四 乙酸鹽）及其鹽、氫亞雄酸（hydrophosphorous acid)、蘋果 酸、單硫代甘油、丙酸、沒食子酸丙酯、f硫胺酸、抗壞 血酸鈉、檸檬酸鈉、硫化鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉 '偏 亞硫酸氫鈉及一般技術者已知之其他化合物。 除非本文中另外指出’否則術語”組合物”及"調配物"可 互換使用。 術語"賦形劑”係指可添加至調配物中以提供所要稠度（例 137663.doc 200944245 如改變塊體特性）、改良穩定性及/或調節滲透重量莫耳濃 度（osmolality)之試劑。常用賦形劑之實例包括（但不限於） 穩定劑、糖、多元醇、胺基酸、界面活性劑、螯合劑及聚 合物。 如本文中關於組合物（例 物"為適用於治療疾病或病症之藥物。
術語”蛋白質”意謂包括鍵長足以產生較高級別之二級結 構及/或二級結構及/或四級結構之胺基酸序列。此不同於 "肽"或不具有此結構之其他小分子量分子。涵蓋於本文中 所用之定義内之蛋白質的實例包括治療性蛋白質。"治療 活性蛋白質"或"治療性蛋白質"係指可用於治療性目的（亦 即用於治療個體之病症）的蛋白質。應注意：儘管治療性 蛋白質可用於治療目的，但本發明不限於此用途，因為該 等蛋白質亦可用於活體外研究。在一較佳實施例中，治療 性蛋白質為融合蛋白或抗體或其抗原結合部分。在一實施 例中，本發明之方法及組合物包含至少兩種不同蛋白質， 將其定義為兩種具有不同胺基酸序列之蛋白質。其他不同 蛋白質不包括蛋白質之降解產物。 術語"蛋白質粉末"係指包含根據本發明之喷霧乾燥方法 製=之蛋白質的組合物。"抗體粉末”係指包括根據 之喷霧乾燥方法製造之抗體或其抗原結合部分的 ㈣"醫藥綱W呈使活性成份之生物活性有效之 形式且因此可為治療性用途而投與個體之製劑。 術語，，溶液”係指至少一種賦形劑或蛋白質或肽於液體内 137663.doc 200944245 之混合物。溶液可包括溶解之蛋白質分子、膠狀溶解之蛋 白質分子、於液體内分散之蛋白質聚集體或晶體或沈澱物 或懸浮物，或其組合。 "穩定"組合物為其中蛋白質（例如）在加工期間及/或儲存 時基本上保留其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活 性之組合物。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術在此 項技術中均可用且評述於（例如）Peptide and Pr〇tein以叫 Delivery，247-301，Vincent Lee編，Marcel Dekk 罾 New Y〇rk，N Y” Pubs. (1991)及 Jones，A. Adv. Drug Deiivery Rev. 10: 29-90(1993)中。在一實施例中，根據溶 液中單體蛋白質之百分比來測定蛋白質之穩定性，其中具 有低百分比之降解蛋白質（例如，片段蛋白質）及/或聚集蛋 白質。舉例而言，包括穩定蛋白質之水性組合物可包括至 少95%之單體蛋白質。或者，本發明之水性組合物可包括 不大於5%之聚集體及/或降解蛋白質。 @ 術語"穩定劑"係指改良或以其他方式增強穩定性之賦形 劑。穩定劑包括（但不限於）α_硫辛酸、α_生育酚、棕櫚酸 抗壞血酯、苄醇、亞硫酸氫鹽、硼、丁基化羥基大茴香醚 (ΒΗΑ)、丁基化羥基曱笨（ΒΗΤ)、抗壞血酸及其酯、類胡 • 蘿蔔素、檸檬酸鈣、乙醯基-L-肉鹼、螯合劑、軟骨素、 硫酸軟骨素、檸檬酸、輔酶q_ 1〇、Edt Α(乙二胺四乙酸； 乙二胺四乙酸二鈉）、異抗壞血酸、反丁烯二酸、沒食子 酸烷酯、葡糖胺（聚葡萄胺糖，破尿酸鈉）、蘋果酸、偏亞 硫酸氫鹽、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、 137663.doc -11. 200944245 亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、酒石酸、硫代硫酸鹽、硫代甘油、 生育盼及其醋（例如，生育酚乙酸酯、生育酚丁二酸酿、 生育三烯醇（tocotrienal)、d-α-生育酚乙酸酯）、維生素 其酯、維生素E及其酯（例如’維生素e乙酸酯），及其組 合0 如本文中所用，術語"張力調節劑"意欲意謂一或多種可 用以調節液體調配物之張力的化合物。合適張力調節劑包 括甘油、乳糖、甘露糖醇、右旋糖、氣化鈉、硫酸鎂、氣 _ 化鎂、硫酸鈉、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、麥芽 糖及一般技術者已知之其他張力調節劑。在一實施例中， 液體調配物之張力接近血液或企漿之張力。 如本文中所提及之術語"抗體"包括全抗體及其任何抗原 結合片段（亦即"抗原結合部分"）或單鏈。"抗體"係指一般 包括由雙硫鍵相互連接之至少兩個重（H)鏈及兩個輕（1^鏈 之醣蛋白，或其抗原結合部分。術語"抗體"亦包括經分離 ❿之其天然存在變異體。各重鏈由重鏈可變區（本文中縮寫 為vH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域、 CHZ及C„3組成。各輕鏈由輕鏈可變區（本文中縮寫為Vl)及 • 輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可將 . vH及vL區進一步細分為散布有較保守之區（稱作構架區 (FR))的高變區（稱作互補判定區（CDR))。各Vh& Vl包含三 個CDR及四個FR，自胺基末端至羧基末端按以下順序排 列.FR1、CDR1、FR2、CDR_2、FR3、CDR3、FR4。重鍵 及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體之恆 137663.doc •12- 200944245 定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統 之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組份 (Clq))的結合。 如本文中所用’術語抗體之"抗原結合部分"（或簡稱為，· 抗體部分"）係指保留與抗原（例如TNFa、IL-12、IL-13)特 異性結合之能力的一或多個抗體片段。可由全長抗體之片 段行使抗體之抗原結合功能。術語抗體之，，抗原結合部分” 内所涵蓋之結合片段的實例包括（i)Fab片段，由Vl、Vh、 CL及CH1結構域組成之單價片段；片段，包含於 鉸鏈區由雙硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；（iii)由 VH及CH1結構域組成之Fd片段；（iv)由抗體單臂之义及％ 結構域組成之Fv片段；（v)dAb片段（ward等人，（1989)
Nature 341:544-546) ’其由vH或VL結構域組成；及（vi)經 分離之互補判定區（CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構 域Vl及VH係由分離基因編碼’但可使用重組方法藉由能將 其製成單一蛋白質鏈之合成連接子將其接合，在該單一蛋 白質鏈中VL及VH區成對以形成單價分子（稱為單鏈
Fv(scFv);例如參見 Bird等人 ’（1988) Science 242:423-426;及 Huston 等人，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5 883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之 ”抗原結合部分"内。該等抗體片段係使用熟習此項技術者 已知之習知技術獲得，且該等片段係以與完整抗體相同之 方式經篩選備用。在本發明之一實施例中，抗體片段係選 自由Fab、Fd、Fd’、單鏈Fv(scFv)、SCFva及結構域抗體 137663.doc 13 200944245 (dAb)組成之群。
^iPnyan〇V 等人 ’（1995) HUman Antib〇dies _ © Hybrid_s 6:93·ι〇υ及使用半胱胺酸殘基、標記狀及q 標記之scFv分子 31:1047-1058) 〇 端聚組胺酸標籤以製造二價及經生物素標記 (Kipriyanov等人，（1994) M〇1 Immun〇1 31:1 可分別使用諸如全抗體之木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化之習 知技術由全抗體製備諸如Fab及F(ab，）2片段之抗體部分。 此外，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免 疫黏附分子。 兩個抗體結構域在其屬於形成同源對或組之結構家族或 源自該等家族且保留此特徵時為"互補的”。舉例而言，抗 體之VH結構域及VL結構域為互補的；兩個vH結構域不互 補，且兩個VL結構域不互補。互補結構域可見於免疫球蛋 白超家族之其他成員中’諸如T細胞受體之Va及νβ(或γ及 δ)結構域。 術語"結構域"係指摺疊蛋白質結構，其保留與蛋白質之 其餘部分無關的其三級結構。一般而言，結構域造成蛋白 質之離散功能特性，且在許多情況下其可在不失去蛋白質 137663.doc 14 200944245 及/或結構域之其餘部分之功能的情況下添加、移除或轉 移至其他蛋白質。單一抗體可變結構域意謂包含具有抗體 可變結構域特徵之序列的摺疊多肽結構域。因此其包括完 全抗體可變結構域及經修飾可變結構域，例如，其中一或 夕個環已經不具有抗體可變結構域特徵之序列置換或已 截斷或包含N末端延伸或c末端延伸之抗體可變結構域， 、及至v 分保留全長結構域之結合活性及特異性的可變 結構域之摺疊片段。 ® 本發明之可變結構域可組合形成結構域組例如，互補 、’。構域可組合，諸如\^結構域與Vh結構域組合。非互補結 構域亦可組合。結構域可以多種方式組合，包括藉由共價 或非共價方法鍵聯結構域。 "dAb"或"結構域抗體”係指特異性結合抗原之單一抗體 可變結構域（VH或VL)多肽。 如本文中所用，術語"抗原結合區”或"抗原結合位點•，係 Φ 指含有與抗原相互作用之胺基酸殘基且賦予抗體以其對於 抗原之特異性及/或親和性之抗體分子部分或其抗原結合 部分β -術語"抗原決定基"意指能夠在抗體之一或多個抗原結合 區處由抗體識別且結合之任何分子的部分。在本發明之上 下文下，應理解第一"抗原決定基"與第二"抗原決定基"為 不同且並非由單一單特異性抗體或其抗原結合部分結合之 抗原決定基。 短語"重組抗體”係指藉由重組方法製備、表現、產生或 137663.doc 15 200944245 分離之抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體 表現之抗體、自重組組合抗體庫分離之抗體、自由人類免 疫球蛋白基因轉殖之動物（例如小鼠）分離之抗體（例如參見
Taylor等人，（1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)或由涉 及特定免疫球蛋白基因序列（諸如人類免疫球蛋白基因序 列）與其他DNA序列之拼接之任何其他方法製備、表現、
• 產生或分離的抗體。重組抗體之實例包括嵌合抗體、CDR 移植抗體及人類化抗體。 ® 術語”人類抗體"係指如（例如）Kabat等人（參見Kabat等 人 ’ （1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest’第5版’美國衛生與公眾服務部（u.S. Department of Health and Human Services)，美國國立衛生研究院公開 案第91-3242號）所述具有對應於或源自人類生殖系免疫球 蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。然而，本發明之人類 抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸 ©殘基（例如’藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發引入 或藉由活體内體細胞突變引入之突變體），例如CDR且尤 其為CDR3。 本發明之重組人類抗體具有可變區且亦可包括源自人類 生殖系免疫球蛋白序列之恆定區（參見Kabat等人，（1991)
Sequences of Proteins Immunological Interest，第 5版，美 國衛生與公眾服務部，美國國立衛生研究院公開案第91_ 3242號）。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體經 受活體外突變誘發（或當使用人類Ig序列轉殖之動物時，經 137663.doc • 16 - 200944245 受活體内體細胞突變誘發）且因此，重組抗體之VhA ^區 之胺基酸序列為雖然源自人類生殖系vH及vL序列且與人類 生殖系VH及VL序列相關但可能在活體内不天然存在於人類 抗體生殖系譜中之序列。然而，在某些實施例中，該等重 組抗體為選擇性突變誘發或回復突變（backmutation)或兩 者之結果。 • 術語"回復突變"係指人類抗體之一些或所有體細胞突變 胺基酸均經來自同源生殖系抗體序列之相應生殖系殘基置 〇 換的過程。將本發明之人類抗體之重鏈及輕鏈序列分別與 VBASE資料庫中之生殖系序列進行比對以鑑別具有最高同 源性之序列。藉由使編碼該（等）不同胺基酸之限定核苦酸 位置發生突變而使本發明之人類抗體之差異恢復至生殖系 序列。應關於在抗原結合中之直接或間接作用研究因此鑑 別為用於回復突變之候選者的各胺基酸之作用，且不應將 在突變之後發現以影響人類抗體之任何需要特徵之任何胺 基酸包括於最終人類抗體中。為最小化經受回復突變之胺 ❹ 基酸的數目，在第二生殖系序列中可保留發現不同於最接 近生殖系序列但與相應胺基酸相同之彼等胺基酸位置，其 ' 限制條件為第二生殖系序列與本發明之人類抗體之序列在 所討論之胺基酸之兩侧上有至少10個、較佳12個胺基酸相 同且共線。回復突變可發生於抗體最佳化之任何階段。 術語"嵌合抗體"係指包含來自一物種之重鍵及輕鏈可變 區序列及來自另一物種之恆定區序列之抗體，諸如具有連 接至人類恆定區之鼠科動物重鏈及輕鏈可變區之抗體。 137663.doc 200944245 術語"CDR移植抗體"係指包含來自一物種之重鏈及輕鏈 可變區序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經 另一物種之CDR序列置換之抗體’諸如具有鼠科動物重鏈 及輕鍵可變區之抗體，其中一或多個鼠科動物CDR(例如 CDR3)已經人類CDR序列置換。 術浯"人類化抗體”係指包含來自非人類物種（例如小鼠） 之重鏈及輕鏈可變區序列之抗體，但其中^^及/或&序列 之至少一部分已變異為更"類人”，亦即，更類似於人類生 ® 殖系可變序列。一類人類化抗體為CDR移植抗體，其中人 類CDR序列經引入非人類vh&Vl序列中以置換相應非人類 CDR序列》 在以下子部分中進一步詳細描述本發明之各種態樣。 π·本發明之方法
本發明之方法及本發明之所得組合物為藥物航運及/或 分配提供多種優勢，例如製劑重量輕且在周圍溫度下穩 定。亦存在關於藥物混配及/或製造之優勢，例如，無本 體溶液在受控速率下之冗長解减。可易於稱出足以用：所 要濃度之量之本發明的乾燥蛋白f粉末，且與所要賦形劑 (諸如水)混合或混配。如同習知製劑一樣，亦無需蛋白質 沈澱物或蛋白質晶體料物之分離及乾I存在關於達到 高漢度調配物、改良之生物可用性、局部釋放(例如，肺 部傳遞）、持續釋放（例如’脂質體及PLGA塗佈微球體）及 可以多種方式（包括經口及局部）投與之新賴固體或水 蛋白質劑型之能力之藥物產品開發的額外優勢。因此，在 137663.doc •18· 200944245 -些實施财，該等方法亦包括進 組合物併入經塗佈持續釋放人物 例如將粉末 沖椅躓釋放組合物、脂質體、plg 微球體中，藉由炫融擠出併入賦形劑基質内及其類似加 工。所得組合物亦為本發明之其他實施例，例如持續釋放 或乾向組合物及/或允許替代性投藥途徑⑽如經口、 及腸内投與)之組合物。另一優勢為與習知製劑相比本發 明之組合物可在較高溫度下進行加卫。舉例而言可藉由
諸如MELTREX溶融擠出技術之炫融擠出技術加卫該等粉 末。 ” 在-態樣中，本發明提供高效且有效地製備包括一或多 種蛋白質或肽之穩定粉末的方法。在某些實施例中，蛋白 質或肽為⑯體及/或其抗原結合部&。用☆製備粉末之方 法包括將蛋白質、&、抗體或其抗原結合部分之溶液喷霧 乾燥。舉例而言，溶液可包括至少約5〇 mg/mL之蛋白質、 肽、抗體或其抗原結合部分。在其他實施例中，溶液可具 有不同濃度’例如更大濃度’例如溶液可包括至少約4〇 mg/mL、50 mg/mL、6〇 mg/mL、7〇 叫就、8〇 吨㈣、 90 mg/mL、100 mg/mL、130 mg/mL、15〇 ㈣灿、⑽ mg/mL·等之蛋白質、肽 可包括一或多種賦形劑 、抗體或其抗原結合部分。溶液亦 。該方法可包括藉由任何已知方法 (包括（例如）超濾）濃縮或進一步濃縮溶液。蛋白質或肽可 為任何合適蛋白質或肽。纟白質^為抗體或其抗原結合部 分，例如免疫球蛋白G(IgG)抗體或其抗原結合部分。在某 些實施例中，抗體或其抗原結合部分為MAK 195f、阿達 137663.doc -19· 200944245 木單抗、ΑΒΤ-325、ABT-308 或 ABT-147。 在一些實施例中，溶液包括賦形劑。合適賦形劑包括 (但不限於）海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一 種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合 物。該方法可進一步包括向溶液或粉末中添加酸性組份、 • 抗氧化劑及/或張力調節劑。 溶液可包括介於約15 mM與約140 mM之間，或介於約2〇 mM與約30 之間的賦形劑。在某些實施例中，溶液包 Ο 括約25 mM賦形劑。在一些實施例中，溶液包含介於約 0.27:1.0與約2.8:1.〇之間、介於約〇27:1〇與約14丄〇之間 或介於約0.27:1.0與約〇j:1〇之間的賦形劑：蛋白質比率。 在某些實施例中，溶液包含約〇.7:1〇之賦形劑：蛋白質比 率。 在一些實施例中，溶液具有低百分比之蛋白質聚集體， 但水性蛋白質調配物具有高濃度之蛋白質聚集體㈣有高 度之水性蛋白質調配物。在一實施例中，包括水及高濃 度之蛋白質（例如抗體）的水溶液即使在不存在界面活性劑 或其他類型賦形劑之情況下亦含有小於約5%之蛋白質聚 集體。在-實施例中，溶液包含不大於約7 3%之聚集體蛋 白質；溶液包含不大於約5%之聚集體蛋白質；溶液包人 不大於約4%之聚集體蛋白質；溶液包含不大於約3 : 集體蛋白質；溶液包含不大於約2%之聚集體蛋白質 溶液包含不大於約1%之聚集體蛋白質。在一實施例中: 溶液包含至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約 137663.doc -20- 200944245 95 /〇、至少約96。/。、至少約97°/。、至少約98°/。或至少約990/〇 之單體蛋白質。介於上述濃度中間的範圍（例如至少約 98.6%之單體蛋白質、不大於約42%之聚集體蛋白質）亦意 欲為本發明之部分。另外，意欲包括使用上述值中任一者 之組合作為上限及/或下限之數值範圍。 在一些實施例中，入口空氣溫度（τ八）在約l〇5(>c與約 175°C之間、約130°c與約155。〇之間、約i2〇t：與約16〇它之 間或約125t與約160t之間。在某些實施例中，Ta為約 130C。在一些實施例中，出口空氣溫度（Τλ)在約⑼艺與約 112(：之間、約60。〇與約9〇。(：之間、約7〇。(：與約9〇。〇之間或 約75 C與約85 C之間。在某些實施例中，τ*為約80°C。 在一些實施例中’本發明之方法包括用介於約1 〇〇。〇與 約180 C之間的入口空氣溫度及介於約6〇它與約u〇(>c 之間的出口空氣溫度（τ①）進行噴霧乾燥。在某些實施例 中，該方法包括用約13〇。〇之1\及約8(TC之T*進行喷霧乾 燥。 在些實施例中，所得粉末組合物之殘餘水分含量在約 1%與約3%之間、約與25%之間、約14%與約2%之 間、約4%與約6%之間或約4 5%與約5%之間。在其他實施 例中’粉末組合物包括約1〇/〇、1 5〇/〇、2%、2 5%、3%、 3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6,5% 或7%之殘餘水 分。 在一實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少3個月内 係穩定的。在一些實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至 137663.doc •21· 200944245 少6個月、9個月、！年、2年、3年或5年内係穩定的。在其 他實施例中，粉末在4〇。〇下至少3個月内係穩定的。在其 他實施例中，粉末在4(rc下至少3個月、6個月、9個月、】 年、2年或5年内係穩定的。 在一些實施例中’喷霧乾燥包括霧化溶液以形成溶液小 液滴用氣體乾燥該等小液滴以形成粉末且自氣體中回收 5亥粉末。可使用(例如)壓力喷嘴霧化器將該溶液霧化。可 ❹ 使用（例如）旋風分離器回收粉末。本文中論述及例示噴霧 乾燥之例示性方法。 在另—態樣中’本發明提供-種製備醫藥製劑之方法， 其可包括本文中所述用於製備粉末之方法中之任一者且 進-：包括將粉末與醫藥學上可接受之載劑混合(例如， 用醫樂學上可接受之載劑包埋或溶解）。醫藥學上可接受 =劑可為非經腸、纟I 口、腸内或局部投與可接受之任何 關T為固體、半固體或液體（例如，水）或其組
呰貫施例中 吻乃沄巴栝於醫藥學上可接受之載劑 中广解抗體或其抗原結合部分粉末。醫藥學 劑可（例如）為韭奴< 姐1 ^戟 法可進與所接受且可包括（例如）水。該方 步l括向醫藥蚯合物中 抗氧化劑及/或張力調節劑。另二：多種酸性組份、 劑、黏度詷H 可將例如緩衝 本發明之醫^組合=劑、著色劑等之合適添加劑添加至 該方法可包括在不顯著影響粉末組合物之穩定性的情況 137663.doc •22- 200944245 下在南於周圍溫度之溫度下進—牛, 步加工本發明之穩定粉末 組合物。舉例而言，該方法可包括 匕枯落融擠出穩定粉末組合 物0 在-些實施例中，將一或多個塗層塗覆於粉末組合物 上，例如以使得離散粒子或粒子之聚集體經塗佈及/或使 得粒子之複合物(例如壓製錠劑)經塗佈。塗層可包括此項 技術中通常使用及已知之任何塗層。該等塗層可包括諸如
PLGA之聚合物以形成持續釋放或延遲釋放醫藥組合物。 塗層可為腸溶衣或可包括腸溶衣。可將組合物囊封於（例 如）明膠膠囊中或.懸浮於水凝膠中某些實施例中，蛋 白質’肽、抗體或其抗原結合部分之活性因此或以其他方 式由賦形劑保護以避免由有機溶劑引起之沈澱、變性或氧 化，藉此允許用諸如PLGa之僅可溶於有機溶劑中之物質 塗佈。該等溶劑可包括常見於醫藥製劑中之溶劑，其包括
(仁不限於）聚乙二醇（例如，低分子量聚乙二醇，諸如pEG )乙醇、二甲亞磾（DMSO)、N-甲基吡咯啶酮（NMP)或 冰醋酸。 噴霧乾燥 。在噴霧乾燥器中，將可泵送流體（溶液、懸浮液、乳液 或漿料）轉化為乾燥微粒形式。該過程藉由將液體饋料霧 …、乾燥介質（通常為空氣或惰性氣體）中而將粒子形成 及乾燥合你jt. ,, 汗馬一步。在本發明之一些實施例中，將濃縮蛋 人質’奋液嘴霧乾燥。因此，本發明之方法可包括使用任何 σ適方法濃縮蛋白質溶液。在一些實施例中，使用切向流 I37663.doc -23· 200944245 式過濾（TFF)技術，此係因為此技術為極快速且平緩之方 法。然而，另外或其他，可使用正常流式過濾或透析。 流艎之霧化使液體之表面增加且因此導致極短之乾燥時 間。舉例而言，將小液滴尺寸由1〇 μιη減小至！ μιη使表面 積由600 m2增加至6000 m2且使其乾燥時間縮短至1/1〇〇(由 0.01 s至 0.0001 s)。stahl，Fenchtigkeit imd Trocknen in der
Pharmazeutischen Technologic Dr. Dieter Steinkopf Verlag GmbH & Co. KG，Darmstadt (1999) 〇 魯 液體饋料與乾燥空氣之間的接觸可以兩種不同模式發 生。在平行流系統中，乾燦空氣及粒子（小液滴）以相同方 向穿過乾燥腔室。因為最熱之空氣接觸潮濕小液滴，所以 此舉對熱敏性物質(諸如蛋白質)而言為較佳模式。當乾燥 空氣及小液滴以相反方向移動時，將此舉稱為逆流模式。 逆流模式中所產生之粒子通常展示與排出空氣相比較高之 溫度《所排出Μ氣本身可離開系統（"開式循環"）或可再 循環（"閉式循環”’ -般用於用惰性氣體蒸發有機溶劑）。 喷霧乾燥方法原理（Spray Drying Pr〇cess Pringles) (<<WWW.nir〇.C〇m>>2007年2月）。藉由選擇各種喷霧乾燥 器設計（尺寸、霧化器、無菌條件等）及調節不同過程參數 (乾無空氣流量、乾燥空氣溫度等），可控制如粒度、形狀 及結構或甚至無菌度之最終粉末特性。若所回收粉末之所 =水分不夠低，則可能需要（例如）呈流化床乾燥器及冷卻 、接觸乾燥器或甚至微波乾燥器形式之後處理。 _奶，—細吨 in —. SprayDryC 咖u I37663.doc -24· 200944245
International ApS; Charlottenlund (2002) ° 喷霧乾燥過程一般包括：霧化液體饋料；乾燥小液滴； 及分離且回收乾燥產物。每一步驟對所得產物具有其自身 影響且亦提供難點，尤其當處理如蛋白質之敏感性物質 時。 ·' 為噴霧乾燥蛋白質或肽，使用穩定佐劑通常有利。諸如 ： 海藻糖及蔗糖之糖為有效蛋白質穩定劑。其不僅可降低在 噴霧乾燥過程中蛋白質之聚集及/或失活，且其亦可對所 Φ 得粉末之儲存穩定性（若在其玻璃轉移溫度以下儲存）具有 積極.影響。Lee, Rational Design of Stable Protein
Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/ Plenum Publishers，2002)。 霧化為使液體斷裂為大量單一小液滴（所謂之喷霧）。霧 化裝置之選擇影響最終產物品質及生產量。Richter， Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martiibersicht 11: 96-100 (1997)。與所有霧化器共同之處為使用能量以分散液體。 ❹ 不同種能量使不同霧化器有所區別。能量在流出液體中產 生湍流。與所施加之空氣力一起，克服液體之表面張力及 黏度且發生崩解。 對於喷霧乾燥操作而言，最合適喷霧為小液滴中之一者 具有不相上下之尺寸。並非所有霧化系統均可為喷霧乾燥 粉末提供窄粒度分布。Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)。蛋白質為極敏感性物質，因此在其涉及剪切力時 137663.doc -25- 200944245 霧化代表應力因素，此為造成不穩定性之可能原因。 Mahler等人發現高剪切力（攪拌及震盪）與IgG丨溶液之聚集 增加之間的相互關係。Mahler等人，Eur J〇urnal 〇f Pharm· and Biopharm. 59: 4〇7_417 (2〇〇5)。溶菌酶溶液在 霧化期間亦展示聚集及活性損失e Yu等人，Eur J〇urnai of Phann· Sci 27: 9-18 (2006)β剪切應力及液體/空氣界面 之突然增大似乎造成此類蛋白質變質。Maa等人，
Biotechnology and Bioengineering 54(6): 503-512 (1997)。 但即使在抽汲程序中出現之剪切力仍可足以對蛋白質溶液 施加應力。Brennan等人，Diabetes 34，353-359 (1985)。 許多不同類型之霧化器均可用於喷霧乾燥程序。 旋轉式霧化器在液體饋料喷放至空氣/氣體氣氛中之前 離心加速該液體饋料。液體饋料居中分布於旋轉輪、圓盤 或杯上。在低圓盤速度下，小液滴之形成主要依賴於液體 之黏度及表面張力。圓盤速度愈高’愈大慣性及空氣摩擦 力開始起作用且有助於小液滴形成機制。此外，小液滴尺 寸受液體馈料速率，其固體含量及密度、霧化器圓盤直徑 及設計影響。不同設計之旋轉式霧化器均可用：無葉圓盤/ 碗/杯或具有彎曲或直葉片之有葉輪。Masters，Spray
Drying Handbook (Wiley & Sons Inc.，New York, 1991)。 旋轉式霧化器具有360。之喷霧角且因此需要特定直徑之 乾燥腔室（以最小化壁沈積）。該等系統通常用於較高容 量。 壓力噴嘴系統藉由將壓力能轉化為動能而獲得自液體本 I37663.doc • 26- 200944245 身喷放液體所需之所有能量。最簡單之單流體喷嘴（one-fluid nozzle)為 用於滴 出單一 小液滴 之管狀 毛細管 。此裝 置僅用於產生少量相等小液滴。藉由增加流動速率可達成 霧化，其中經由湍流將液體射流斷為小液滴。可藉由使液 體經受偏轉、旋轉及回轉來改善流體之崩解，例如藉由使 ' 噴嘴具有漩渦插入物或漩渦腔室。所得小液滴尺寸除先前 所述之參數（黏度、流動速率等）外亦受所施加壓力及喷嘴 直徑的影響。Richter，Verfahrenstechnik, Sonderausgabe 參 Martiibersicht 11: 96-100 (1997)。液體饋料離開呈中空錐 形之孔口，亦即，壓力喷嘴可用於具有低直徑乾燥腔室之 小喷霧乾燥裝置中。大量不同喷嘴設計提供用於霧化溶 液、乳液及懸浮液之可變應用，其僅受粒度（懸浮液）及黏 度（所需之極高壓力）限制。Masters，Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)。 當使用氣動喷嘴霧化時，高速氣態介質（通常為空氣）與 W 液體之撞擊為小液滴形成提供能量。依據流體與氣體碰撞 之位置，來區別内部混合與外部混合系統。Richter， Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martiibersicht 11: 96-100 , (1997)。當必須將高黏性流體分散為細小尺寸之小液滴 時，較佳使用雙流體喷嘴。將氣態介質壓入喷嘴内部（直 至7巴），其有時配備有額外旋渦插入物以產生氣體湍流’ 進而促進液體饋料之崩解。通常藉由低壓泵將液體饋料泵 入，其支持氣流喷射器作用。氣動噴嘴系統產生5 μπι至75 137663.doc •27- 200944245 μιη範圍内之小液滴。缺點為壓縮氣體/空氣及其在乾燥腔 室内部之冷卻作用之成本較高。當處理具有極高黏度之液 體時，亦存在阻塞喷嘴孔口之危險。Masters，Spray Drying in Practice. Spray Dry Consult International ApS; Charlottenlund (2002) 〇 超音波喷嘴使用高頻率聲波以達成霧化。壓電傳感器接 ; 收來自超音波發生器之高頻電能且將其轉化為相同頻率之 振動機械運動。引入液體，其流經喷嘴之長度。當液體饋 ® 料到達孔口時，其吸收振動能，使其霧化。Sono Tek
Corporation :超音波喷霧喷嘴系統（Ultrasonic spray nozzle systems)(SONO TEK Corporation，New York，2007) 〇 音速喷嘴在低壓力下工作（尤其與氣動喷嘴相比）且所得 小液滴具有介於10 μηι與5 0 μπι之間的直徑。使用超音波霧 化器之一大缺點為連續操作之不可預測性，例如當用於含 固體原料時，在喷嘴區域中預先乾燥之風險可能導致污染 產生器/霧化過程。因此，該等系統更通常用於實驗室規 模及前導乾燥器以產生細小喷霧或當非牛頓（non-Newtonian)或高黏性液體不允許使用其他喷嘴系統時使 ; 用。Masters, Spray Drying in Practice. Spray Dry Consult
International ApS; Charlottenlund (2002) ° 由於監控整個喷霧之行為與乾燥腔室内部之非均一狀態 之困難，預計在喷霧乾燥期間喷霧之乾燥動力學係複雜 的。然而，可理論上及實際上研究單一小液滴之乾燥動力 學。Elversson 等人，《/owrwa/ 〇/ Ρ/ζαπ Sci 94(9): 2049- 137663.doc -28- 200944245 2060 (2005) <· 一旦液體饋料經霧化，則其表面與質量比增加且空氣與 小液滴之間的熱轉移加速，且小液滴現在可極快速乾燥。 在小於100 μΐη之常見小液滴尺寸下，蒸發在小於i s内進 行。Nnmbeq等人，Acta Pkarmaceutica Techn〇l〇gica, % (1): 39-67，表3-1 (1980)。涉及兩個對流過程：熱轉移（空 ·’ 氣―小液滴）及水分之質量轉移（小液滴—空氣）。在後者 中，水分必須滲透入圍繞各小液滴之邊界層。轉移速率受 0 肖圍空氣之溫度、濕度、傳輸特性、小液滴直徑及小液滴 與空氣之間的相對速度影響。Masters，Spray mying
Handbook (Wiley & Sons Inc.，New Y0rk，1991)。首先，蒸 發以怪定速率進行（乾燥之第一階段=恆速期）。水分自小 液滴内擴散維持飽和表面狀態。在所謂"臨界點"下，水分 含量變得過低以致不能在小液滴表面維持飽和，且在小液 滴之表面開始形成乾餘層。自彼時起，對於擴散穿過存在 參 額外生長障壁。由於永久性改變小液滴/粒子之狀態，故 蒸發速率降低（降速期=乾燥之第二階段）。Masters，Spray
Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; : Charlottenlund (2002)。在過程中小液滴/粒子之溫度主要 : 受入口乾燥空氣溫度（TA)及液體饋料速率（qlf)影響，在某 種程度上受乾燥空氣流動速率（QDA)及霧化空氣流動速率 (Qaa)影響。該四種參數亦決定τ*。實際上，僅在喷嘴孔 口以下之溫度與1\相比更接近T出，因此T*似乎為小液滴 乾燥速率之控制變數。當然，小液滴内部之溫度d)低於 137663.doc -29- 200944245 其表面上之溫度（Ts)。Ts不久即達到濕球溫度Twb，且在恆 速期内保持於彼溫度。在降速期小液滴表面上有生長結殼 之情況下，Ts及Ti開始增加。Maa等人，
Sz'oewgeweer/wg 53 (6):503-512 (1997)。對於所得粒子形 態，小液滴尺寸以及結殼之紋理均具有決定性作用。 Elversson等人假定小液滴尺寸與粒度之間的線性關係，但 亦暗示液體饋料中之固體含量強烈影響粒度。Elversson等 人，Jowrwa/ o/P/zar/w. /Scz·· 92(4): 900-910 (2003) 〇 © 乾燥涉及另外兩個關於蛋白質之應力因素：熱及脫水。 在蛋白質調配物中蛋白質對於熱應力之穩定性為關鍵變 數。喷霧乾燥過程中溫度之改變對蛋白質穩定性（例如， 過程穩定性、加速穩定性試驗期間之存放期）具有極大影 響。當暴露於高溫時，蛋白質變得更具彈性（氫鍵減弱）， 導致部分展開且其碰撞頻率增加。Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000)。此過程通常可逆，但一旦部分展 開，則蛋白質極易經受如聚集或不當摺疊之進一步降解路 徑，此強烈影響其功能及長期穩定性。 - 對於大多數蛋白質而言，關於最大穩定性之溫度在- . 1 〇°C 與 3 5。(3 之間。Bummer 等人，Proiez·” Formw/aiiow (Marcel Dekker AG，Basel, 2000)。Mumenthaler等 人假定乾燥粒子達到低於T *約25°C之最高溫度。 Mumenthaler等人，尸/zarw. ·及e·?. 1 1(1): 12-20 (1994)。在本 發明中，T*可能在約60°C至約80°C之範圍内。在喷霧乾燥 137663.doc -30· 200944245 期間，一般不將熱變性視作主要不穩定性因素。Maa等 k，Current Pharmaceutical Biotechnology 1(3):283-302 (2000)。 蛋白質之生物活性視其天然、三維結構而定。在水溶液 中，蛋白質藉由於其表面上經非共價結合水分子圍繞而維 持其天然結構。通常非極性胺基酸殘基埋於内部且極性胺 基酸殘基存在於表面上。此導致蛋白質於溶液中極緊密堆 積（與有機分子晶體中相比具較高之堆積密度）》Brange， Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd.，2000)。移除水可能使此堆 積失穩，且可能出現構形改變。 喷霧乾燥過程之最後步驟通常為自空氣/氣體中分離粉 末且移除乾燥產物。在一些實施例中，此步驟儘可能有效 以獲得高粉末產率且防止經由粉末排放至大氣中之空氣污 染。為此目的，可使用乾式及濕式收集設備，如旋風分離 器、袋式過濾器或靜電除塵器。甚至可安裝該等裝置之組 合 ° Masters，Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)。由於其簡單設 計及其有效性，旋風分離器為最常見分離器中之一者且其 用於各種行業中。Coulson 及 Richardson，C/zewic<a/ ，第 4 版，第 2 卷（Butterworth-Heinemann, Oxford, 1991)。旋風分離器内部之粒子運動為兩個相反力 之結果。離心力將粒子移動至旋風分離器壁處，而空氣/ 氣體之拖曳力則試圖將該等粒子攜帶至中央空氣核心以離 137663.doc 31 200944245 開旋風分離器。Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)。粉末及空氣成切線進入旋風分離器且以螺旋形式 向下渦旋至旋風分離器之底部（外旋流）。此時，大多數粒 子離開旋風分離器而經收集於底部安裝容器中，僅含有細 ' 小粒子部分及其他不可分離之粒子的空氣在旋風分離器之 ； 中心（内旋流）盤旋上升且離開頂部。實際上，粒度大於30 μπι即應回收，其亦依賴於喷霧乾燥器之尺寸。Masters， ❿ Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002)。然而，可藉由改變旋風分離 器尺寸而使產率最佳化。Maury等人用新近開發之旋風分 離器經Bttchi B-191喷霧乾燥器達成與標準旋風分離器相比 更高之產率。Maury 等人，Ewr. ·/〇«/*««/ 〇/ P/zar/w. 扪op/zarw· 59(3): 565-573 (2005)。高效旋風分離器（小直 徑）分離更多，包括甚至極小粒子（直徑小於1.5 μηι)。 已對計算旋風分離器效率進行理論研究。一種方法為 ® (例如）藉由以下方程式計算所謂"截止點"：
d/為截止粒徑，η為空氣黏度，η表示内旋流之半徑，vri 為空氣入口處之徑向空氣速度，ps及pg表示固體及氣體之 密度，lli為η處之切線粒子速度》在此點（粒子之直徑）處， 離心力與拖矣力具有相等值。彼尺寸之粒子旋轉而不傾向 137663.doc • 32- 200944245 於内旋流或外旋流，較小粒子由排出空氣帶走，較大粒子 落入收集容器中。Staudinger等人，FZ)/ 1 5 11: 1- 23 (1999)。 飛行時間方法為計算臨界粒徑之另一方法。其考慮到粒 子移動至旋風分離器壁需要多長時間。在此方法中，可考 ' 慮收集容器之幾何形狀，因為其影響旋風分離器内部之氣 : 流。Qian 等人，Chem. Eng. Technol. 29(6): 724-728 (2006)。 〇 喷霧乾燥無任何佐劑之蛋白質水溶液通常導致展開、聚 集及失活。已用各種蛋白質嘗試若干次：氧基血色素 (Labrude等人）、胰蛋白酶原（Tzannis等人）、IgG(Maury等 人，2005)且在所有情況下均觀察到過程不穩定性。 Labrude 等人 » Journal of Pharm. Sci. 78 (3): 223-229 (1989) ; Tzannis等人，《/owrna/ o/P/zarm· Sc/. 88(3): 35 1-3 59 (\999)反 Mamy 專 Eur. Journal of Pharm. and 59(2):251-261 (2005)。因此，在一些實施例 φ 中，在喷霧乾燥過程中以及在儲存期間本發明之組合物保 護活性醫藥成份（API)。在蛋白質之冷凍乾燥中，已將糖 (海藻糖、蔗糖）、胺基酸（精胺酸）或界面活性劑（Tween)用 : 作穩定劑。Lee，Rational Design of Stable Protein
Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/ Plenum Publishers，2002)。關於多元醇、雙醣及胺基酸之 使用而言，已提出若干種穩定理論。其中之一者為由 Arakawa及Timasheff建立之所謂的"優先排除"理論。 137663.doc •33- 200944245
Arakawa 等人，21: 6536-6544 (1982); Arakawa等人，yidvawcei/ Drwg· De/iver少 46: 307- 326 (2001)，及 Timasheff， *Sirwci. 22: 67-97 (1993)。其係基於蛋白質在溶液中優先水 合之前提，因此共溶質排除與蛋白質表面接觸。因為展開 •將產生更大蛋白質表面，所以必須排除共溶劑之面積亦會 ·' 更大。在此情況下，展開產生熱力學上不利之情況，因此 蛋白質仍處於其摺疊天然構形。Arakawa等人， ❹ £>rwg De/z’very 46: 307-326 (2001)。亦可藉由”水 置換"機制保護蛋白質。此理論認為賦形劑藉由與乾燥蛋 白質而非蒸發之水進行氫鍵鍵結而防止展開。Carpenter等 人，Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002)。此外，固定蛋白質之玻璃基質的形成可為乾燥及 儲存時蛋白質穩定之原因。Tzannis等人，/owrwa/ ο/' P/iarm. <SW. 88(3): 360-370 (1999)。因此，需要展示高玻 璃轉移溫度（Tg)之調配物，例如Tg高於儲存溫度以阻止分 子運動。界面活性劑之穩定機制係基於界面活性劑與蛋白 • 質對於佔據界面（例如，液體/空氣界面）之競爭，展示界面 .. 活性劑之熱力學邊緣。由於蛋白質吸附於界面處之可能性 較小，因而展開及聚集之風險顯著降低。Adler等人， Journal of Pharm, Sci., 88 (2), 199-208(1999) ° 尤其在長期儲存期間，濕度為影響蛋白質穩定性之另一 因素。文獻中充分記錄水分對蛋白質粉末之影響。通常， 137663.doc -34- 200944245 固體蛋白質調配物之化學穩定性隨水分含量增加而降低， 此係由於水充當反應物或用作活化反應物之介質。其亦可 造成蛋白質結構之構形改變。此外，喷霧乾燥粉末之Tg亦 受水影響。水充當增塑劑，意謂其降低物質之Tg。可使用 戈登泰勒方程式（Gordon Taylor Equation)計算水之影響， • 該方程式為計算二元混合物之Tg(Tga合物）的方程式。 %混合物 ^gmfx = (ωι·Τε1+Κ^ω^Τ§2)/(ωι+Κ'ω2) K = {p^Tgl)l(p2-Tj ω、Tg及p分別表示不同組份之重量分率、玻璃轉移溫度及 密度。對於Tg為約-138°C之水而言，顯然所得粉末之含水 量應較低。Hancock 等人，尸/zarm. Res. 1 1(4): 471-477 (1994)。然而，含水量與穩定性之間的相互關係似乎並非 線性的。Chang等人在2%-3°/。之中間含水量下獲得凍乾IgG 之最佳穩定。Chang等人，《/σΜΓΛζα/ Sci 94(7): 1427-1444 (2005)。 φ 由於此知識，由喷霧乾燥過程產生之粉末應展示低殘餘 水分以及在儲存期間經保護免於濕氣影響。Maa等人， Pharm. Res. 15(5): 768-775 (1998)。在一定程度上，前者 可受過程條件（入口空氣溫度（T〇、入口空氣之相對濕度 ; (RH))影響；後者為防漏小瓶或可控儲存條件之問題。 III.本發明之調配物 任何合適蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分皆可用於 製備本發明之組合物。舉例而言，其可為IgG類型。例示 137663.doc •35- 200944245 性抗體或其抗原結合部分包括（但不限於）ΜΑΚ 1 95F、阿達 木單抗或ABT-325。熟知適於本發明之用途的抗tnf抗體 (例如，如 ΕΡ-Α-0 260 610、ΕΡ-Α-0 351 789、ΕΡ-Α-0 218 868中所述）。可使用多株抗體與單株抗體。此外，諸如 Fab或F(ab’)2片段之TNF結合抗體片段或單鏈卜片段亦合 適。合適單株抗hTNF-α抗體描述於ΕΡ-Α-0 260 610中，命 名為人1^1-195或1^八10195，其係由以寄存編號87〇5〇8〇3寄 存於ECACC之融合瘤細胞株產生。亦命名為mak 195F(INN :阿非莫單抗（Afelimomab))之鼠科動物抗tnf抗 體片段（F(ab’)2>^合適。 在一實施例中’本發明之調配物包含結合人類TNFa之 抗體或其抗原結合部分’其包括（例如）阿達木單抗（亦稱為 複邁（Humira)或 D2E7; Abbott Laboratories)。在一實施例 中’抗體或其抗原結合片段以lxl〇-8 Μ或lxl〇-8 Μ以下之 Kd及1χ10 s或1x10 s1以下之Koff速率常數（兩者均藉由 表面電漿共振測定）自人類TNFa解離，且在標準活體外 L929檢定中以lxlO·7 Μ或lxlO·7 Μ以下之ICso中和人類 TNFa細胞毒性。製造對人類TNFa具有高親和性之人類中 和抗體（包括抗體之序列）之實例及方法描述於以引用的方 式併入本文中之美國專利第6,090,382號中。 在一實施例中’本發明之調配物包含結合人類介白素_ 12(IL-12)之抗體或其抗原結合部分，其包括（例如）抗體 ABT-874(Abbott Laboratories)(美國專利第 6,914，128號）。 ABT-874為經設計以乾向及中和介白素_i2及介白素_23之 137663.doc • 36 - 200944245 元全人類單株抗體。在一 β τ施例中，抗體或其抗原結合片 奴具有以下特徵中之一 、 * 夕者.其以 3xl〇-7 Μ或 3χ10_7 Μ 以下之Kd自人類IL-1 η鉉M . 1α解離，以5xl0·5 Μ或5xl〇-5 Μ以下之 KD自人類iL-ΐβ解離；且 不結合小鼠IL-la或小鼠IL-Ιβ。製 每對人類IL-12具有咼親和性之人類中和抗體(包括抗體之 序列)之實例及方法描述於以弓丨用的方式併入本文中之美 國專利第6,914，128號中。 參
在一個實施例中，本發明之調配物包含結合人類江_18 之抗體或其抗原結合部分，其包括（例如）抗體abt_ 325(Abbott Laboratories)(參見美國專利申請案第2〇〇5/ 0147 610號）。 在一個實施例中’本發明之調配物包含結合人類IL_12 之抗體或其抗原結合部分，諸如抗體ABT_147(Abb〇tt
Laboratories)(參見 2007年 1月 ila 公開之w〇 2〇〇7/〇〇 56〇8 A2)。 在一個實施例中’本發明之調配物包含結合人類IL_ i 3 之抗體或其抗原結合部分，諸如抗體ABT-308(Abbott
Laboratories)(參見 PCT/US2007/19660)。 可包括於粉末調配物中之蛋白質的實例包括抗體或其抗 原結合片段。可用於本發明中之不同類型之抗體或其抗原 結合片段之實例包括（但不限於）嵌合抗體、人類抗體、人 類化抗體及結構域抗體（dAb)。在一個實施例中，用於本 發明之方法及組合物中之抗體為抗TNFa抗體或其抗原結 合部分，或抗IL-12抗體，或抗IL-13抗體，或其抗原結合 137663.doc -37- 200944245 部分。可用於本發明中之抗體或其抗原結合片段之其他實 例包括（但不限於）ABT-147(Abbott Laboratories)、ABT-325(抗 IL-18 ; Abbott Laboratories)、ABT-308(Abbott Laboratories)、ABT-874(抗 IL_12 ; Abbott Laboratories)、 阿非莫單抗（Fab 2抗 TNF ; Abbott Laboratories)、複邁（阿 達木單抗；Abbott Laboratories)、坎帕斯（Campath)(阿來 • 組單抗（Alemtuzumab)) 、 CEA-Scan阿西莫單抗 (Arcitumomab)(fab片段）、爾必得舒（Erbitux)(西妥昔單抗 © (Cetuximab))、贺癌平（Hereeptin)(曲妥珠單抗 (Trastuzumab))、彌歐辛（Myoscint)(喷替酸英西單抗 (Imciromab Pentetate))、普斯塔辛（ProstaScint)(卡羅單抗 喷地肽（Capromab Pendetide))、雷米卡德（Remicade)(英利 昔單抗（Infliximab))、雷歐普（ReoPro)(阿昔單抗 (Abciximab))、厘度姍（Rituxan)(利妥昔單抗 (Rituximab))、新睦樂（Simulect)(巴利昔單抗 (Basiliximab))、 辛納吉斯（Synagis)(帕利珠單抗 (Palivizumab))、疏諾莫（Verluma)(諾非單抗 (Nofetumomab))、艾克斯歐萊（Xolair)(奥馬珠單抗 : (Omalizumab))、赛尼旅（Zenapax)(達利珠單抗 (Daclizumab))、澤娃靈（Zevalin)(替伊莫單抗（Ibritumomab Tiuxetan))、奥素健體OKT3(Orthoclone OKT3)(莫羅單抗-CD3(Muromonab-CD3))、帕諾瑞（Panorex)(依決洛單抗 (Edrecolomab))及滅鏈瘤（Mylotarg)(吉妥單抗（Gemtuzumab ozogamicin)) 0 137663.doc ·38· 200944245 在一個替代中，蛋白質為融合蛋白質，其包括（但不限 於）百慕時（Pulmozyme)(阿法鍵道酶（Dornase alfa))、立比 扶（Rebif)、 里格拉对（Regranex)(貝卡普明 (Becaplermin))、阿克伐司（Activase)(阿替普酶 (Alteplase))、艾杜拉酶（Aldurazyme)(拉羅尼酶 • (Laronidase))、愛美麗（Amevive)(阿法赛特（Alefacept))、 ·' 安然愛斯普（Aranesp)(阿法達貝泊汀（Darbepoetin alfa))、 貝卡普明濃縮物、倍泰龍（Betaseron)(干擾素β-lb)、 β BOTOX(A型肉毒桿菌毒素）、埃立特（Elitek)(拉布立酶 (Rasburicase))、艾斯帕（Elspar)(天冬醯胺酸酶 (Asparaginase))、益比奥（Epogen)(阿法依泊汀（Epoetin alfa))、恩博（Enbrel)(依那西普（Etanercept))、法布瑞酶 (Fabrazyme)(倍他阿加糖酶（Agalsidase beta))、幹複津 (Infergen)(干擾素alfacon-1)、甘樂能（Intron A)(干擾素α-2a)、金那瑞特（Kineret)(阿那白滯素（Anakinra))、 MYOBLOC(B型肉毒桿菌毒素）、紐拉思塔（Neulasta)(聚乙 二醇化非格司亭（PegHlgrastim))、紐密伽（Neumega)(奥普 瑞介白素（Oprelvekin))、優保津（Neupogen)(非格司亭 (Filgrastim))、昂他克（Ontak)(地尼介白素（Denileukin - diftitox))、PEGASYS(聚乙二醇化干擾素a-2a)、普留淨 (Proleukin)(阿地介白素（Aldesleukin))、百慕時（阿法鍵道 酶）、立比扶（干擾素β-la)、里格拉耐（貝卡普明）、瑞他法 斯（Retavase)(瑞替普酶（Reteplase))、羅飛龍-A(R〇feron-A)(干擾素α-2)、TNK酶（替奈普酶（Tenecteplase))及除栓素 137663.doc -39- 200944245 (Xigris)(阿法替加色羅（Dr〇trec〇gin alfa))。 可包括於本文中所述方法及組合物中之蛋白質的其他實 例包括哺乳動物蛋白質（包括其重組蛋白），諸如生長激 素’包括人生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子； 副甲狀腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α_^抗胰蛋白 酶；胰島素Α-鏈；胰島素Β_鏈；胰島素原；促濾泡激素； 降約素’黃體生成素；升糖素（glucag〇n);凝血因子諸 如因子VIIIC、因子IX、組織因子及溫韋伯氏因子（v〇n Willebrands factor);抗凝血因子，諸如蛋白c ;心房利尿 鈉因子；肺界面活性劑；血纖維蛋白溶酶原活化劑，諸如 尿激柄或組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑（t_pA);邦巴辛 (bombazine);凝血酶；腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子β腦 啡肽酶；RANTES(正常Τ細胞表現及分泌之活性調節因 子）；人類巨噬細胞發炎性蛋白質（MIP-i-α);血清白蛋 白，諸如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物質（muUerian_ inhibiting substance);鬆弛素A_鏈；鬆弛素Β·鏈；鬆弛素 原，小鼠促性腺激素相關肽；去氧核糖核酸酶；抑制素·， 活化素；血管内皮生長因子（VEGF);激素或生長因子之受 體；整合素；蛋白A或D ;類風濕因子；神經營養因子， 諸如骨衍生神經營養因子（BDNF)、神經營養因子_3、神經 營養因子―4、神經營養因子-5或神經營養因子_6(NT_3、 NT4、ΝΤ·5或NT-6)，或神經生長因子’諸wNGF_p ;血小 板衍生生長因子（PDGF);成纖維細胞生長因子，諸如 aFGF及bFGF ·’表皮生長因子（EGF);轉化生長因子 137663.doc -40- 200944245 (TGF)，諸如 TGFcx及 TGF-β，其包括 TGF-βΙ、TGF-P2、 TGF-P3、TGF-P4或TGF-P5 ;胰島素樣生長因子_ι及胰島 素樣生長因子-II(IGF-I及 IGF-II) ; des(l-3)-IGF-I(腦 IGF-I);胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、 CD4、CD8、CD19及CD20 ;紅血球生成素（EPO);血小板 生成素（TPO);骨誘導因子；免疫毒素；骨型態發生蛋白 (BMP);生長及分化因子；干擾素，諸如干擾素_α、干擾 素-β、干擾素-γ ;群落刺激因子（CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF ;介白素（IL)，例如IL-1至IL-10 ;超氧化物 歧化酶；τ細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子（decay accelerating factor; DAF);病毒抗原，諸如 AIDS包膜之 一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；免疫 黏附素；抗體；及以上所列舉之多肽中之任一者的生物學 活性片段或變異體。 多株抗體 多株抗體泛指對某一抗原具特異性，但與該抗原上之不 同抗原決定基結合之抗體的混合物。多株抗體一般藉由多 次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射相關抗原及佐劑而在動物體内 產生。其可用於將相關抗原接合至在待免疫物種中呈免疫 原性之蛋白質（例如匙孔血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀 腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑），其係使用雙功能或衍 生化劑進行，例如順丁烯二醯亞胺苯曱醯磺化丁二醯亞胺 西曰（、座由半胱胺酸殘基結合）、N-羥基丁二醯亞胺（經由離胺 酸殘基）、戊二醛、丁二酸酐、s〇cl2或R〗NCNR，其中尺與 137663.doc -41 - 200944245 R,為不同烷基。用於製造多株抗體之方法在此項技術中已 知且描述（例如）於以引用的方式併入本文中之Antibodies: A Laboratory Manual, Lane及 Harlow (1988)中。 單株抗體 如本文中所用之"單株抗體"意指源自融合瘤之抗體（例 如，由藉由諸如標準柯勒及麥爾斯坦融合瘤法（Kohler and Milstein hybridoma methodology)之融合瘤技術製備之融合 瘤分泌的抗體）。舉例而言，單株抗體可使用首先由Kohler Ο 等人，Nature, 256:495 (1975)所述之融合瘤方法來製備， 或可由重組DNA方法（美國專利第4,816,567號）來製備。因 此，儘管本發明之源自融合瘤之雙特異性抗體對一種以上 單一抗原具有抗原特異性，但仍將其稱為單株抗體。 單株抗體可自大體上均質之抗體群體（亦即除可少量存 在之可能天然存在突變之外構成群體之個別抗體均相同） 獲得。因此，修飾語”單株"表明抗體當不為離散抗體之混 合物時的特性。 在另一實施例中，抗體可自使用McCafferty等人， Nature，348:552-554(1990)中所述之技術產生之抗體噬菌 -· 體庫分離。Clackson等人，Nature，352:624-628 (1991)及
Marks等人，J. Mol. Biol·，222:581-597 (1991)分別描述使 用噬菌體庫對鼠科動物抗體及人類抗體之分離。後續公開 案描述藉由鏈改組產生高親和性（nM範圍）人類抗體（Marks 等人，Bio/Technology，10:779-783 (1992))，以及將組合 感染及活體内再組合作為用於建構極大噬菌體庫之策略 137663.doc -42- 200944245 (Waterhouse等人 ’ Nuc Acids Res 21:2265-2266 (1993))。 因此’該等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合 瘤技術的可行性替代技術。 如美國專利第6,423,538號；第6,696,251號；第 6,699,658 號；第 6,300,065 號；第 6,399,763 號及第
6，114，147號中所述，抗體及抗體片段亦可藉助於表現庫而 自酵母菌及其他真核細胞分離。真核細胞可經工程化以表 現在細胞表面上呈現之庫蛋白質（包括來自組合抗體庫）， 進而允許選擇含具有親和力的抗體庫純系之特定細胞以選 擇目標分子。自經分離細胞回收之後，可自合適哺乳動物 細胞株高量表現編碼所關注之抗體的庫純系。 用於產生所關注之抗體的其他方法包括使用核酸呈現技 術之無細胞篩檢，如美國專利第7，195,880號；第6,951，725 號；第 7,078，197號；第 7,022,479 號；第 6,518,018 號；第 7，125,669 號； 第 6,846,655 號； 第 6,281,344 號； 第 6,207,446 號； 第 6,214,553 號； 第 6,258,558 號； 第 6,261，804 號； 第 6,429,300 號； 第 6,489，116 號； 第 6,436,665 號； 第 6,537,749 號； 第 6,602,685 號； 第 6,623,926 號； 第 6,416,950 號； 第 6,660,473 號； 第 ❹ 6,312,927號；第5,922,545號及第6,348,315號中所述。該 等方法可用於以將蛋白質與其所源自之核酸物理締合或結 合之方式自核酸活體外轉錄蛋白質。藉由選擇用目標分子 表現之蛋白質，亦選擇編碼該蛋白質之核酸。在無細胞篩 檢技術之一種變化中，可分離自免疫系統細胞分離之抗體 137663.doc •43· 200944245 序列且部分隨機化聚合酶鏈反應突變誘發技術可用以增加 抗體多樣性。接著使該等部分隨機化抗體基因在無細胞系 統中表現，其中在核酸與抗體之間產生並存物理締合。 亦可藉由（例如）用人類重鏈及輕鏈恆定結構域的編碼序 列替代同源鼠科動物序列（美國專利第4,816,567號； Morrison 等人，Proc· Natl Acad % USA，8i:685i (1 984))或藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列的全部或部 分與免疫球蛋白編碼序列共價連接來修飾DNA。 通常該等非免疫球蛋白多肽經抗體之恆定結構域取代， 或其經抗體之一個抗原結合位點之可變結構域取代，以產 生包含一個對抗原具有特異性之抗原結合位點及另一個對 不同抗原具有特異性之抗原結合位點的嵌合二價抗體。 亦可使用合成蛋白質化學中之已知方法（包括涉及交聯 劑之彼等方法）活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言， 可使用雙硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來建構免疫毒 素。為此目的，合適試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲 基-4-酼基丁醯亞胺酿。 人類化抗體 此項技術中熟知用於人類化非人類抗體之方法。一般而 言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺 基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常被稱為"引入”殘 基，其通常獲自"引入"可變結構域。可基本上按照Winter 及同事之方法（Jones等人，Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等人，Nature，332:323-327 (1988) ; Verhoeyen 137663.doc • 44 - 200944245 等人，Science，239:1534-1536 (1988))藉由用非人類（例如 齧齒動物）CDR或CDR序列替代相應人類抗體序列來進行 人類化。因此，該等”人類化'•抗體為嵌合抗體（美國專利第 4,816,567號）’其中實質上近似完整之人類可變結構域已 經來自非人類物種之相應序列所取代。實際上，人類化抗 體通常係一些CDR殘基及可能一些構架（FR)殘基經來自齧 齒動物抗體中類似位點之殘基取代的人類抗體。描述人類 化過程之額外參考文獻包括Sims等人，J. Immunol.， 151:2296 (1993) ; Chothia等人，J. Mol. Biol.，196:901 (1987) ; Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:4285 (1992) ; Presta等人，J. Immunol.，151:2623 (1993)，其中 每一者均以引用的方式併入本文中。 人類抗體 或者，目前可產生在無内源性免疫球蛋白產生之情況下 免疫後能夠產生全譜人類抗體之轉殖基因動物（例如小 鼠）。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重 鏈連接區（JH)基因的純合性缺失導致對於内源性抗體產生 之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該 等生殖系突變小鼠體内將會於抗原攻毒後引起人類抗體之 產生。例如參見Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits等人，Nature, 362:255-258 (1993) ; Bruggermann 等人，Year in Immune，7:33 (1993)。人類抗體亦可能源自噬菌體呈現庫（Hoogenboom 等人 ’ J. Mol. Biol.，227:381 (1991); Marks等人，J. Mol. 137663.doc ·45· 200944245
Biol.，222:581-597 (1991))。 雙特異性抗體 雙特異性抗體（BsAb)為對至少兩個不同抗原決定基具有 結合特異性之抗體。該等抗體可源自全長抗體或抗體片段 (例如F(ab')2雙特異性抗體）。 在此項技術中已知用於製造雙特異性抗體之方法。全長 雙特異性抗體之傳統生產係基於兩個免疫球蛋白重鏈·輕 鏈對之共表現’其中該兩個鏈具有不同特異性（Millstein等 〇 人，Nature，305:537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鍵 及輕鏈之隨機分配’該等融合瘤（四源雜交瘤）產生1〇種不 同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性 結構。通常藉由親和性層析步驟進行之正確分子之純化相 當麻煩，且產物產率較低。類似程序揭示於W〇 93/08829 及 Traunecker等人，EMBOJ.，10:3655-3659(1991)中。 根據不同方法，將具有所要結合特異性之抗體可變結構 域（抗體-抗原結合位點）融合於免疫球蛋白恆定結構域序 ’列。 該融合較佳係與包含鉸鏈、Ch2&Ch3區之至少部分之免 疫球蛋白重鏈恆定結構域進行。較佳使存在於至少一個該 等融σ中之第重鍵值定區（CH丨）含有輕鍵結合所必需之位 點。將編碼免疫球蛋白重鍵融合體及（必要時）免疫球蛋白 輕鍵之DNA插入單獨表現載體中，且將其共轉染至合適宿 主生物體中。虽在構建中所使用之三個多狀鍵的不等比率 提供最佳產率時，此在實施例中提供調整三個多狀片段之 137663.doc -46- 200944245 相互比例的極大靈活性〇缺品 ^ ^ . ^ 然而，當相等比率之至少兩個多 肽鏈的表現產生高產率或當比率並非特別重要時，有可能 將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一表現載體中。 在此方法之一較佳實施例中，雙特異性抗體係由在一臂 上具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈，及在另一 臂上之雜交免疫球蛋白重鏈_輕鏈對（提供第二結合特異性） · 組成。已發現由於免疫球蛋白輕鏈僅存在於一半雙特異性 分子中提供一種簡便之分離方式，故此不對稱結構促進所 ❹ 要雙特異性化合物與非所需免疫球蛋白鏈組合之分離。此 方法揭示於1994年3月3日公開之WO 94/04690中》關於產 生雙特異性抗體之進一步細節，例如參見suresh等人，
Methods in Enzymology，121:210 (1986)。 雙特異性抗體包括交聯抗體或"異接合（heter〇c〇nju_ gate)"抗體。舉例而言’異接合物中之一抗體可與抗生物 素蛋白偶合’其他抗體可與生物素偶合。該等抗體據稱 (例如）可使免疫系統細胞靶向不需之細胞（美國專利第 4,676,980號）且可用於治療HIV感染（W0 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何適宜交聯方法製得異 接合抗體。合適交聯劑已在此項技術中所熟知，且揭示於 ； 美國專利第4,676,980號以及大量交聯技術中。 自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻 中。以下技術亦可用於產生未必具雙特異性之二價抗體片 段。舉例而言，自大腸桿菌回收之Fab'片段可在活艘外化 學偶合以形成二價抗體。參見Shalaby等人，j. Exp. Med.， 137663.doc -47- 200944245 175:217-225(1992)。 亦已描述直接自重組細胞培養物製造且分離二價抗體片 段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈define zipper)產生二價異質二聚體。K〇stelny等人，； 148(5): 1547-1553 (1992)。藉由基因融合使來自F〇s及以打 . 蛋白之白胺酸拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab，部分連接。在 鉸鏈區還原抗體均二聚體以形成單體，且接著使其再氧化 以形成抗體異質二聚體。Hollinger等人，Proc. Natl Acad ❹ Sci. USA，90:6444-6448 (1993)所述之"雙功能抗體"技術已 為製造雙特異性/二價抗體片段提供替代性機制。該等片 段包含經連接子連接至輕鏈可變結構域（Vl)之重鍵可變結 構域（VH) ’該連接子過短而使相同鏈上之兩個結構域之間 無法配對。因此’迫使一個片段之Vh及％結構域與另一片 知' 之互補Vl及VH結構域配對，藉此形成兩個抗原結合位 點。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙 . 特異性/二價抗體片段之策略。參見Gruber等人，j.
Immunol·，152:5368 (1994)。 在一實施例中，本發明之調配物包含對IL· 1 (包括il- 1 α 及1L-1P)具雙特異性之抗體。製造雙特異性IL-1抗體之實 例及方法可見於2008年7月10日公開之WO 08/082651中。 雙可變結構域(DVO)結合蛋白 雙可變結構域（DVD)結合蛋白為包括兩個或兩個以上抗 原結合位點之蛋白且為四價或多價結合蛋白。DVD可具單 特異性’亦即能夠結合一個抗原’或可具多特異性，亦即 137663.doc • 48- 200944245 能夠結合兩個或兩個以上抗原。將包含兩個重鏈DVD多肽 及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD IgTM。每一 半DVD Ig包含一個重鏈DVD多肽及一個輕鏈DVD多肽及 兩個抗原結合位點。每一結合位點包含重鏈可變結構域及 輕鏈可變結構域，其中在每個抗原結合位點之抗原結合中 涉及總共6個CDR。在某些實施例中，DVD可包括2007年3 • 月29曰公開之Wu等人之美國專利公開案第20070071675號 (其係以引用的方式併入本文中）中所揭示的DVD中之任一 ❹ 者。 DVD-Ig適用作治療劑以同時阻斷兩個不同目標以增強 功效/安全性及/或增加患者適用範圍。該等目標可包括可 溶性目標（IL-13及TNF)及細胞表面受體目標（VEGFR及 EGFR)。DVD-Ig亦可用以在腫瘤細胞與T細胞（Her2與CD3) 之間誘發重定向細胞毒性以用於癌症治療，或在自身反應 性細胞與效應細胞之間誘發重定向細胞毒性以用於自體免 疫/移植，或在任何靶細胞與效應細胞之間誘發重定向細 胞毒性以消除任何給定疾病中導致疾病之細胞。 另外，DVD-Ig可用以當其經設計以靶向同一受體上之 - 兩個不同抗原決定基時觸發受體叢集及活化。此舉可對製 - 造促效性及拮抗性抗GPCR治療劑具有益處。在此情況 下，DVD-Ig可用以靶向一個細胞上之兩個不同抗原決定 基以叢集/信號轉導（兩個細胞表面分子）或信號轉導（在一 個分子上）。類似地，DVD-Ig分子可經設計以藉由靶向 CTLA4細胞外域之兩個不同抗原決定基（或同一抗原決定 137663.doc • 49· 200944245 基之2個複本）而觸發CTLA，接及陰性信號，進而導致免 疫反應之下調。類似地，DVD_Ig^向細胞表面受趙複 合物之兩個不同成員（例如，IL_12R(^ILi2Rp)。此外， _-Ig可乾向CR1及可溶性蛋白質/病原體以驅動目標可 溶性蛋白質/病原體之快速清除。 . 另外，本發明之DVD-Ig可用於組織特異性傳遞（靶向組 ； 織標記及疾病介體以達成增強之局部PK，因此達成較高功 效及/或較低毒性）’包括細胞内傳遞（靶向内在化受體及細 ❹ 胞内刀子）、傳遞至腦内（挺向轉鐵蛋白受體及CNS疾病介 體以穿過A腦障壁）。DVD_Ig亦可充當載體蛋白以經由與 抗原之未中和抗原決定基結合而將彼抗原傳遞至特定位 置’以及增加抗原之半衰期。 本發明提供包括任何合適蛋白質之穩定粉末組合物蛋 白質包括本文中所述及如本文中所述製備之彼等蛋白質。 舉例而言，粉末可包括蛋白質或肽（例如，抗體或其抗原 • 結合部分）及賦形劑，其中組合物包括小於約6%之殘餘水 分。在某些實施例中，組合物包括小於約5 5%、5%、 4.4%、4%、3.5%或3。/〇之殘餘水分。在一些實施例中，組 合物包括小於2%或1%之殘餘水分。在其他實施例中，組 合物包括由以上值所限制之殘餘水分範圍，例如介於約 4%與6%之間、介於約4.5%與5.5%之間或介於約3%與5%之 間的殘餘水分。在一些實施例中，所得粉末組合物之殘餘 水分含量在約1%與約3%之間、約1.5%與2 5%之間、約 1.4%與約2%之間、約4%與6%之間或約4.5%與約5%之間。 137663.doc -50- 200944245 在其他實施例中，粉末組合物包括約1%、1 5%、2%、 2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5% 或 7%之殘餘水分。 在一些實施例中，蛋白質在所要之時段内保持其生物活 性。在一實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少3個月 内係穩定的。在一些實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下 至少6個月、9個月、1年、2年、3年或5年内係穩定的。在 其他實施例中，粉末在4(rc下至少3個月内係穩定的。在 其他實施例中，粉末在40。〇下至少3個月、6個月、9個 月、1年、2年或5年内係穩定的。在其他實施例中，粉末 在40°C及周圍濕度下至少3個月、6個月、9個月、i年、2 年或5年内係穩定的。 本發明之粉末組合物及/或包括該等粉末組合物之醫藥 組合物可包括賦形劑。合適賦形劑包括（但不限於）海藻 糖、廉糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺 酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。該方法可進一 步包括添加酸性組份、抗氧化劑及/或張力調節劑。 在一些實施例中，組合物具有約〇 27:1 〇至約2 8ι 〇、 約〇.27:1·0至約m.o、約〇.27:1.〇至約〇 7:1 〇或約〇 7】之 賦形劑與抗體或其抗原結合部分之f量比，且該賦形劑為 海薄糖或Ιϋ其他實施例中，組合物具有約G 27:i 〇 至約 2.8:1·0、、約 0.27:1.0 至約 U1.0、、約 〇.27:1.〇 至約 〇.Η·〇、約〇·7:1或約〇.35:1之賦形劑與抗體或其抗原結合 部分之質量比，且該賦形劑為山梨糖醇。 137663.doc 51 200944245 另外’本發明提供包括古 制量之本文中所述粉末之醫藥 製劑。醫藥學上可接受之載劑可為非經腸、經口、腸内或 二部投與所接受之任何裁劑。載劑可為固體、半固體或液 體（例如，水或有機液體）或其組合。 ’ 可將粉末混合(例如，溶解或包埋)於醫藥學上可接受之 載劑中。醫藥學上可 了接受之载劑可（例如）為非經腸投與所 接受且可包括(例如)水。該方法可進-步包括向醫藥組合 中添加《多種酸性組份、抗氧化劑及/或張力調節 劑另外或其他，可將例如緩衝劑、黏度調節劑、調味 劑、著色劑等之合適添加劑添加至本發明之醫藥組合物 中0 粉末醫藥組合物可經熔融擠出、壓製或以其他方式加工 以形成（例如）錠劑或其他固體或半固體組合物。可用（例 如）聚合物（諸如PLGA)塗佈該粉末以形成持續釋放及/或延 遲釋放醫藥組合物。另外或其他’可將組合物用(例如)腸 溶衣囊封或塗佈。可使用塗層及/或賦形劑（例如）以保護藥 物避免由諸如聚乙二醇（例如，PEG 4〇〇)、乙醇、dms〇、 NMP、冰醋酸或其類似物之有機溶劑引起之沈澱、變性或 氧化。 亦涵蓋液體組合物，例如水性組合物。該等組合物可適 於（例如）經口或靜脈内投與，且可包括任何合適賦形劑或 添加劑，諸如張力調節劑或緩衝劑。在一些實施例中，液 體醫藥組合物具有低百分比之蛋白質聚集體，但水性蛋白 質調配物具有高濃度之蛋白質聚集體。在一實施例中，水 137663.doc 52· 200944245 性組合物包括水及高濃度之蛋白質（例如抗體），其即使在 不存在界面活性劑或其他類型賦形劑之情況下亦含有小於 約5。/。之蛋白質聚集體。在一實施例中，組合物包括不大 於約7.3%之聚集體蛋白質；組合物包括不大於約5%之聚 集鱧蛋白質；組合物包括不大於約4%之聚集體蛋白質； 組合物包括不大於約3%之聚集體蛋白質；組合物包括不 大於約2%之聚集體蛋白質；或組合物包括不大於約1%之 聚集體蛋白質。在一實施例中，組合物包括至少約92%、
至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約％%、至少 約97%、至少約98%或至少約99%之單體蛋白質。介於上 述濃度之間的範圍（例如至少約98 6%之單體蛋白質、不大 於約4.2%之聚集體蛋白質）亦意欲為本發明之部分。另 外，意欲包括使用上述值中任一者之組合作為上限及/或 下限之數值範圍。 IV.本發明之用途 本發明之組合物可在治療上（亦即活體内）使用或用作 活體外或原位目的之試劑。如本文巾所述及❹，喷霧乾 燥可用以製備用作產生/製造例如以下各物之起始物質之 乾燥蛋白質粉末：⑷用於㈣潰癌性結腸炎之abt_874的 腸内調配物’ _於糖尿病性潰叙阿達木單抗之局部調 配物，及⑷用於治療哮喘之ΑΒΤ•扇之肺部劑型 ， 喷霧乾燥抗體可用於MELTREX溶體擠出方法，此係 併入玻璃狀賦形劑基皙Η丨 質(例如海澡糖)内之單株抗體(mAb) 可此展現對熱展開7變性之較高穩定性。此可再提供開發 137663.doc -53· 200944245 (例如）用於蛋白質之經口投與之新穎固體蛋白質劑型的機 會。 治療性用途 本發明之方法亦可用以製備具有對於治療性用途有利之 特徵的醫藥組合物。包括液體或固體組合物之醫藥組合物 可以醫藥組合物或調配物形式使用以治療個體之病症。
本發明之組合物可用以治療治療性蛋白質、狀、抗體或 其抗原結合部分適於治療之任何病症。"病症為將自用抗 體進行治療受益之任何病狀4包括慢性及急性病症或疾 病，包括使哺乳動物易患所述病症之彼等病理狀況。在抗 ™Fa抗體之情況下’可投與 >，台療有效量之抗體以治療自 體免疫疾病（諸如類風濕性關節炎^腸病症（諸如克羅恩氏 病（Crohn’s diSease))、脊柱關節病（諸如強直性脊椎炎）或 皮膚病症（諸如牛皮癬）。在抗江_12抗體之情況下，可投與 治療有效量之抗體以治療神經病症（諸如多發性硬化症）或 皮膚病症（諸如牛皮癬）。可使用本發明之組合物治療之病 症的其他實例包括癌症，包括乳癌、白血病、林巴瘤及結 術語"個體”意欲包括活生物體，例如原核生物及真核生 物。個體之實例包括哺乳動物，例如人類、犬、牛、馬、 豬綿羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠及轉殖基因非人類 動物在本發明之特定實施例中，個體為人類。 術居治療"係指治療性治療與防護性或預防性措施。需 要治療者包括已患有病症者以及有待預防病症者。 137663.doc -54- 200944245 可根據已知投與方法向需要治療之哺乳動物（包括人類） 投與水性或固體組合物。投與方法之實例包括靜脈内投與 (諸如大丸劑或藉由經一段時間連續輸注）、肌肉内、腹膜 内、腦脊髓内、皮下、關節内、滑膜内、鞘内、皮内、經 皮、經口、局部或吸入投與》 在一實施例中，藉由皮下投與向哺乳動物投與組合物。 就該等目的而言，可使用注射器以及其他裝置來注入組合 物該等裝置包括/主入裝置（例如，Injecteas及Genject裝 Φ 置）；筆型注射器（諸如GenPen);無針裝置（例如，
Medi Jector及BioJector);及皮下貼片傳遞系統。 本發明亦包括容納組合物之傳遞裝置。該等裝置之實例 包括（但不限於）注射器、筆、植入物及貼片。筆型自動注 射器之實例描述於2007年6月29曰申請之美國申請案第 1 1/824,516號中。 蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分之適當劑量（"治療 φ 有效量"）將視（例如）以下因素而定：待治療之病狀、該病 狀之嚴重性及進程、其係為預防性或治療性目投與、先前 療法、患者之臨床病史及對該蛋白質之反應、所用蛋白質 . 之類型及主治醫師之判斷。本發明之組合物係適當地一次 或經一系列治療投與患者且可自診斷時起在任何時刻投與 患者。可將組合物以單一治療或結合適用於治療所述病狀 之其他藥物或療法投與。 在一實施例中，在治療上使用本發明之組合物，例如包 括阿非莫單抗及/或任何其他合適抗體或其抗原結合部分 137663.doc •55· 200944245 之組合物。在一實施例中，組合物為用於治療敗血症之醫 藥組合物。 敗血症、腫瘤壞死因子-α(ΊΝΡ-α)及阿非莫單抗 敗血症係定義為對感染之全身發炎性反應。該感染可為 (例如）病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染。敗血症最終導致 免疫勝任細胞之活化及與多種細胞因子（TNF-α、IL-1等） ' 之釋放相關的全身發炎性反應。如ACCP(美國胸腔醫師學 會（American College of Chest Physicians))所定義，存在不 ❹ 同階段/種類之敗血症：SIRS(全身發炎性反應症候群 (Systemic Inflammatory Response Syndrome))(各種起源之 全身發炎性反應（感染、紅斑等）；敗血症（由感染所引起之 SIRS);嚴重敗血症（具有器官機能失調/功能障礙之敗血 症）’及敗血性休克（具有休克之敗血症））。為診斷該等種 類之敗血症，必須滿足不同準則。 初次發生之免疫反應藉由多種二次介體配合及擴增。生 ❹ 物體並非處於將炎症侷限於其起始位置（主要是肺部或也 液循環）的狀態。可影響不同器官，其對若干種身體機能 具有強烈影響。因此’敗血症之可能病徵包括體溫過高、 : 呼吸急促、心動過速、血壓過低及精神混亂。由於多種指 ： 示，極難以診斷敗血症，此係造成敗血症患者高死亡率之 因素。 已知治療敗血症患者之不同藥物，尤其阿法替加色羅 (活化蛋白C)及阻斷血液凝固之抗凝血酶ΙΠ及減弱炎症之 可的松（cortisone)(低劑量）。Bloos 等人，Aktuelle 137663.doc « 200944245
Ernahrungsmedizin，28:186-190 (2003)。因為TNF-α為敗血 症之一種主要介體，所以處理敗血症之一種方法為阻斷 TNF-a以避免其起作用。TNF-α之局部釋放增加血流量及 血管滲透性。此使得流入參與宿主防護之流體、細胞及蛋 白質之受感染組織中。為防止感染擴散至血液中，小血管 隨後凝結且流體流至起始適應性免疫反應之淋巴結。在全 身性感染期間，TNF-a以類似方式起作用，導致休克及彌 漫性血管内凝血。結果為凝血因子耗盡、持續出血及多重 器官衰竭。Janeway 等人，Immun〇bi〇1〇gy (Garland
Publishing，1994)。可藉由非經腸投與抗TNF_a抗體來達成 阻斷TNF-a。藉由設計抗體片段阿非莫單抗，應達成較佳 組織穿透以及較低免疫原性問題。 在一些實施例中，本發明包括向個體（例如人類）投與蛋 白質、肽、抗體或其抗原結合蛋白，以使得個體中其目標 之活性得以抑制且達成治療。在一些實施例中，病症係選 自包含以下各病症之群：關節炎、骨關節炎、青少年慢性 關節炎、敗血性關節炎、萊姆關節炎（Lyme arthritis)、牛 皮癬性關I卩炎、反應性關|卩炎、脊柱關節病、全身性紅斑 狼瘡症、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島 素依賴性糖尿病、甲狀腺炎’哮喘、過敏性疾病、牛皮 癬、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反 應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、 動脈粥樣硬化、彌漫性血管内凝血、川崎氏病（Kawasaki,s disease)、格雷夫氏病（Grave、disease)、腎病症候群、慢 137663.doc -57- 200944245 性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫（Wegener，s granulomatosis)、亨偌·絲奇恩賴紫癜（Hen〇ch Sch〇enlein purpurea)、顯微性腎血管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜 炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、敗血症候群、惡病 質、感染性疾病、寄生蟲性疾病、後天免疫缺乏症候群、 急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病（Huntingt〇n,s chorea)、帕金森氏病（parkinson，s disease)、阿茲海默氏病 (Alzheimer's disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化症、溶 血性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病 (Addison's disease)、散發性疾病、I型多腺性缺乏型多 腺性缺乏、.施密特氏症候群（Schmidt’s syndrome)、成人 (急性）呼吸窘迫症候群、禿頭症、斑禿、血清陰性關節 病、關節病、萊特爾氏病（Reiter's disease)、牛皮癬性關節 病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、與衣原體、耶 爾森氏菌（yersinia)及沙門氏菌（salmonella)相關之關節 病、脊柱關節病、動脈粥樣化病/動脈硬化、異位性過 敏、自體免疫水皰病、尋常型天疱瘡、落葉狀天疱瘡、類 天疱瘡、線狀IgA病、自體免疫溶血性貧血、庫姆陽性溶 血性貧血（Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性 貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由疾病（R〇yal Free Disease)、慢性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞性動脈 炎、原發性硬化性肝炎、隱源性自體免疫肝炎、後天性免 疫缺乏病症候群、後天性免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、 C型肝炎、常見可變型免疫缺乏（常見可變型低丙種球蛋白 137663.doc -58- 200944245 血症）、擴張型心肌症、丄 ^ 女性不育症、卵巢衰竭、卵巢早 、纖維化肺病、隱源性纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺 病間質性肺炎、結缔組織疾病相關之間質性肺病、混合 結締組織病相關$ g < 病、系統性硬化症相關之間質性肺 病、類風濕性關節炎相關 人俏關之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡 症相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、修格蘭氏病 (Sjogren's dlsease)相關之肺病、強直性脊椎炎相關之肺 病血管炎彌漫性肺病、血黃素沈積症相關之肺病、藥物 誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、阻塞性細支 氣管炎、慢性嗜伊紅性白血球肺炎、淋巴細胞滲透性肺 病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫肝炎、 1型自體免疫肝炎（經典自體免疫或狼瘡樣肝炎）、2型自體
免疫肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血糖、B 型胰島素抵抗伴黑色棘皮病、副甲狀腺機能不足、與器官 移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾 病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮癣、2型牛 皮癬、特發性白血球減少症、自體免疫性嗜中性球減少 症、腎病NOS、腎小球腎炎、顯微性腎血管炎、萊姆病 (lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS性男性不育 症、精子自體免疫、多發性硬化症（所有亞型）、交感性眼 炎、繼發於結締組織病之肺高壓症、古德帕斯氏症候群 (Goodpasture's syndrome)、結節性多動脈炎之肺部表現、 急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏病（Stiu，s disease)、系統性硬化症、修格蘭氏症候群（sjorgren，s 137663.doc •59· 200944245 syndrome)、高安氏病（Takayasu’s disease)/動脈炎、自體免 疫性血小板減少症、特發血小板減少症、自體免疫曱狀腺 病、甲狀腺機能几進、甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺功能 低下（橋本氏病（Hashimoto’s disease))、萎縮性自體免疫性 甲狀腺功能低下、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜 炎、原發性血管炎、白斑性急性肝病、慢性肝病、酒精性 肝硬化症、酒精誘發之肝臟損傷、膽汁鬱積、特異性肝 病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏及哮 ❿ 喘、；8族鏈球菌（GBS)感染、精神障礙（例如，抑鬱症及精 神分裂症）、Th2型及Thl型介導疾病、急性及慢性疼痛（各 種形式之疼痛）及癌症（諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、 結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌）及造血系 統惡性疾病（白血病及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症、手足發 紺、急性及慢性寄生性或感染性過程、急性白血病、急性 淋巴母細胞白血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性 參或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房 異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性 結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植 :排斥反應、α-1_抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側索硬化症、 貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候 群、抗受體超敏性反應、主動脈及周邊動脈瘤、主動脈剝 離、動脈性高血壓、動脈硬化、動靜脈瘺管、共濟失調、 心房纖維顫動（持續性或陣發性）、心房撲動、房室傳導阻 滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥反應、骨髓移植（bmt)排 137663.doc .60· 200944245 斥反應、房室束支傳導阻滞、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt，s lymphoma)、灼傷、心律失常、心臟頓抑症候群、心臟腫 瘤、心肌病、心肺旁路炎症反應、軟骨移植排斥反應、小 腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多灶性房性心動過速、 化學療法相關之病症、慢性骨髓細胞性白也病（Cml)、慢 性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴球性白血病 -· (CLL)、慢性阻塞性肺病（COPD)、慢性水揚酸中毒、結腸 直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺心症 ❿ （cor Pulmonale)、冠狀動脈病、庫茲德-賈克氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)、培養陰性敗血症、囊狀纖維 化、細胞因子療法相關之病症、拳擊手失智症（Dementia pugilistica)、髓鞘脫失病、登革出血熱、皮炎、皮膚病狀 況、糖尿病（diabetes ; diabetes mellitus)、糖尿病性動脈粥 樣硬化病、彌漫性路易體病（Diffuse Lewy b〇dy disease)、 擴張性充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群 φ (D〇Wn's Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的 藥物誘發之運動障礙、藥物過敏、濕疹、腦脊趙炎、心内 膜炎、内分泌病、會厭炎、艾伯斯坦-巴爾病毒（epstein_ . barr Vlrus)感染、紅斑性肢痛病、錐體束外及小腦病症、 : 家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症、胎兒胸脉植入物 排斥反應、弗立特里希氏共濟失調（Friedreich,s ataxia)、 周邊動脈功能失調症、真菌敗血症、氣壞疽、胃潰瘍、腎 小球性腎炎、任何器官或組織之移植排斥、革蘭氏陰性敗 血症（gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症（gram 137663.doc -61 · 200944245 positive sepsis)、歸因於細胞内生物體之肉芽瘤、毛細胞 白血病、哈勒沃登-施帕茨病（Hallervorden-Spatz disease)、橋本甲狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis)、枯草 熱、心臟移植排斥反應、血色素沉著症、血液透析、溶血 性尿毒症候群/溶解血检血小板減少性紫瘋、出血、A型肝 炎、希氏束心律不齊（His bundle arrythmias)、HIV感染 ' /HIV神經病、霍奇金氏病（Hodgkin’s disease)、過動性運 動障礙、超敏反應、超敏性肺炎、高血壓、運動不足性運 © 動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、特發性阿狄森氏 病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒性、衰弱、嬰兒 脊髓性肌肉萎縮、主動脈炎症、A型流感、電離輻射曝 露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺丘-再灌注損 傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性 肌肉萎縮、卡波濟氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)、腎臟移植排 斥反應、退伍軍人桿菌（iegi〇ne〗ia)、利什曼病 • (leishmaniasis)、麻瘋病、皮質脊髓系統病變、脂肪水 腫、肝臟移植排斥反應、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、 惡性組織細胞增生症、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球 菌血症、代謝性/特發性偏頭痛、線粒體多系統病症、混 合結締組織病、單株丙種球蛋白病變、多發性骨髓瘤、多 系統退化（Mencel、Dejerine_Th〇mas、及
Machado-Joseph)、重症肌無力、細胞内鳥型分枝桿菌結 核分枝桿菌、脊髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血 病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎變性病、神經 137663.doc -62· 200944245 退化性疾病、i型神經源性肌肉萎縮、嗜中性白血球減少 性發熱、非霍奇金氏淋巴瘤（non_h〇cigkins lymphoma)、腹 主動脈及其分支之閉塞、閉塞性動脈病症、okt3療法、睾 丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/輸精管複通術程序、臟器腫大、 骨質疏鬆症、胰腺移植排斥反應、胰腺癌瘤、副腫瘤症候 群/惡性疾病高鈣血症、副甲狀腺移植排斥反應、骨盆發 炎性疾病、全年性鼻炎、心包膜疾病、周邊動脈粥樣硬化 病、周邊血管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎 (Pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群 (多發性神經病、臟器腫大、内分泌病、單株丙種球蛋白 病變及皮膚變化症候群）、灌注後症候群、泵入後症候 群、MI後心切開術症候群、先兆子癇、進行性核上眼神經 麻痹症、原發性肺動脈高壓症、放射療法、雷諾氏現象 (Raynaud’s phenomenon)及疾病、雷諾氏病（Rayn〇ud，s disease)、雷弗素姆氏病（Refsum,s disease)、規則窄qrs心 動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、 肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆、血清 陰性關節病、休克、鐮刀狀細胞貧血症、皮膚同種移植排 異反應、皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、實體腫 瘤、特異性心律不齊、脊趙共濟失調、脊趙小腦退化、鏈 球菌肌炎、小腦結構損傷、亞急性硬化性全腦炎、昏厥、 心血管系統梅毒、全身性過敏反應、全身性發炎反應症候 群王身性發作型青少年類風濕性關節炎、τ細胞或FAB ALL、毛細血管擴張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少、 137663.doc -63 - 200944245 毒！生移植創傷/出血、ΠΙ型超敏反應、W型超敏反 應、不穩定性錢痛、尿毒癥、尿膿毒病、·蓴歸、心臟 瓣膜疾病、靜脈曲張、&其* . 跟血s炎、靜脈疾病、靜脈血栓形 成、心室纖維顫動、症▲β古# β 4 < a 届每及真菌感染、致命腦炎/無菌性 腦膜炎、生命相關之嗟血細胞症候群、韋尼克·高沙可夫 症候群（Wernicke_Korsak〇ff syndr〇me)、威爾森氏病 (WUson’s disease)及任何器官或組織之異種移植排斥反 應。
❹ 非治療性用途 本發明之組合物亦可用於非治療性用途，亦即活體外目 的舉例而5，本文中所述之蛋白質粉末及相關組合物可 用於醫學及生物技術中之診斷性或實驗性方法，包括（但 不限於)基因組學、蛋白質組學、生物資訊學、細胞培 養、植物生物學及細胞生物學中之用途。舉例而言，本文 中所述之組合物可心提供作為標記及侧方W之分子 探針所需的蛋白質。本文中所述組合物之額外用途在於為 製造目的向包括細胞生長及蛋白質產生之細胞培養試劑提 供補充劑。 含有高濃度（例如）抗體之組合物可用作實驗室使用之試 劑。該等高濃度形式之抗體將擴展實驗室實驗之當前限 制。 用於本發明之調配物之另一替代性用途為向食物產品中 提供添加劑。在一些實施例中，因為本發明之組合物基本 上由蛋白質及糖組成，所以其可用以向食品_傳遞高濃度 137663.doc -64- 200944245 之所要蛋白質，諸如營養補充劑。本發明之組合物可因此 提供高濃度之蛋白質。 製品 在本發明之另一實施例中，提供一種製品，其含有本發 明之蛋白質粉末或相關組合物，且提供關於其使用之說明 書。在一實施例中，該製品包含容器。合適容器包括（例 如）一或多個瓶、小瓶（例如，雙腔小瓶）、注射器（包括單 腔及雙腔注射器）、含有針筒之筆型自動注射器及試管。 容器可由諸如玻璃、塑膠或聚碳酸酯之多種材料形成。容 器容納水性調配物且容器上之標籤或與容器相關之標籤可 指示使用說明。舉例而言，標籤可指示組合物適用於或意 欲用於皮下投與。標籤可（例如）指導使用者添加例如無菌 水或生理食鹽水之液體以製備用於藉由（例如）注射投與之 組合物。容納組合物之容器可為允許重複投與（例如，2 6 次投與）例如水性調配物之多用途小瓶。該製品可進—步 包含第二容器。該製品可進一步包括就商業性及使用者觀 點而言合乎需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、 濾紙、針、注射器及具有使用說明書之包裝插頁。 本發明藉由以下實例進一步說明，不應將該等實例理解 為限制性。 本發明之例證 在此實例中，將IgG分子之Fab片段噴霧乾燥且進行分 析。此研究之範疇為找出用於喷霧乾燥當意欲用作儲存中 間物時具有高產率及良好儲存穩定性之Fab片段的合適調 137663.doc -65- 200944245 配物及方法條#。藉自添加不同_來達成在喷霧乾燥過程 及後續儲存中蛋白質之穩定化。對於此研究而言，將海藻 糖、蔗糖及山梨糖醇添加至液體蛋白質濃縮物中。使用來 自各種分析方法（尤其大小排除層析法、動態光散射、濁 度量測及等電聚焦）之資料分析蛋白質穩定性。 材料 MAK 195 F濃縮物
用於此實例之蛋白質為由Abbott Laboratories提供之呈 水溶液形式之阿非莫單抗（MAK 195 F)，其含有：MAK 195 F(12.4 mg/mL) ； NaCl(8.77 mg/mL) ； Na3P04(1.64 mg/mL) ; Pluronie⑧ F68(0.1 mg/mL);及水（適量）。MAK 195 F濃縮物具有7 2之pH值且接近於等張（約286 mosmol/kg)。其具有 0.98i mPas 之黏度（由 Schott Ubbelohde黏度計量測）及丨〇〇86 g/cm3之密度（由來自 Chempro之 DMA 46量測）。 阿非莫單抗蛋白為具有1〇〇千道爾頓（kDa)之近似分子量 的鼠科動物抗TNF-α抗體（IgG3)之F(ab，）2片段。其係由IgG3 單株抗體之胃蛋白酶裂解進而產生各自包含214個胺基酸 之輕鏈及含有233-241個胺基酸之重鏈而產生。約30%之 Fd'片段在SerH222處經糖基化。由於不同糖基化模式，故阿 非莫單抗在7.5至8.8之等電點（IEP)範圍内具有至多7個同 功異型物。 在約400 g之部分中在乾冰下獲得濃縮物。為避免重複 之冷凍·解凍循環及呈液體狀態長期儲存，將濃縮物解凍 137663.doc •66· 200944245 且以40-50 mL份等分試樣，儲存於-80°C下且在使用之前才 解凍。 賦形劑 使用三種不同糖以穩定蛋白質：D_山梨糖醇（Sigma，產 品：S-7547，批號：108H01461);蔗糖（Sigma，產品 S-7903，批號 014K0010);及 D-(+)海藻糖二水合物（Sigma， 產品：T5251，批號：113K3775)。 所有水溶液係用二次蒸館水（Fi-stream 4BD ; Fisons)製 Ο 備，且必要時，經由0.2 μπι膜過濾器（Schleicher & Schuell)過濾。 方法 噴霧乾燥 使用用於粉末回收之高效旋風分離器1用Btichi小型喷霧 乾燥器B-191(圖1)進行喷霧乾燥實驗。使乾燥空氣以8〇〇 Ι/min之氣流速率（90%之吸氣器功率）經由Luwa超濾器2(纖 維玻璃；過遽材料種類：HEP A H13高效率粒子吸收劑）過 濾’隨後進入加熱裝置3及乾燥腔室中。使所有液體饋料 經由0.22 μιη過濾器單元過濾，隨後藉由蠕動泵5(qlf=約3 ·· mL/min ;矽管0=3 mm)傳輸至乾燥腔室4。使用來自室内 ； 供應之壓縮空氣（Qaa=700 Ι/h)藉由雙流體喷嘴6(孔口直 徑：0.7 mm)進行霧化。該雙流體喷嘴裝備有自動清潔系 統，亦使用壓縮空氣（4·5巴）及水冷系統。喷霧乾燥之後， 將所得粉末自收集容器7回收於乾燥空氣手套箱（rh<2%) 中，裝填於玻璃小瓶（氣丁基橡膠塞）中，用封口媒 137663.doc • 67- 200944245 (parafilm)密封且儲存於-80°C下。將粉末產率定義為收集 容器内粉末之量除以液體饋料中之總含固量。旋風分離器 内部上之粉末沈積物未經收集。 大小排除層析法（SEC)
使用大小排除層析法來偵測可溶性聚集體。將由 Amersham Biosciences購買之 Tricorn Superose 12/300 GL • 管柱（分離範圍1-300 kDa)連接至包含200系列LC泵、ISS 200自動取樣器及235C二極體陣列偵測器之Perkin Elmer高 © 壓液相層析（HPLC)系統。在安裝Superose管柱之前，安裝 phenomenex安全防護前管柱（裝載有AJ0-4489濾筒）以避免 由粗粒子污染。移動相（緩衝液A，流動速率：0.5 mL/min) 為添加有氯化鈉（0.5 mol/1)之填酸卸緩衝液（pH 6·9)，將其 經由 0.2 μπι膜過滤·器（Schleicher & Schuell，FP 30/0.2 CA) 過濾且使用氦脫氣約10分鐘。直接量測所有樣品（例如， 液體饋料）或用緩衝液A小心地將其再溶解至1 mg/mL之蛋 白質濃度（喷霧乾燥（sd)粉末）且製備之後立即進行分析。 ¥ 每次操作之注入體積為1〇〇 μΐ，且一般將所有樣品量測兩 次（液體饋料）或三次（喷霧乾燥粉末）以確保可重現結果。 : 使用 Perkin Elmer TotalChrom Navigator軟體 6.2版將所有 ： 層析圖手動積分。 差示掃描熱量測定（DSC) 使用Mettler Toledo DSC 822e研究熱事件。在乾燥空氣 條件（手套箱）下將5-15 mg粉末稱入（Mettler，AT DeltaRange®)铭盤中。將該等銘盤冷密封且插入量熱器 137663.doc -68- 200944245 中，其中使其暴露於依次經過預期Tg之加熱及冷卻之規定 溫度程式（視調配物而定）（加熱/冷卻速率：10°C/min)中。 藉由河6«16『8丁八1^軟體6.10版估計玻璃轉移溫度，在加熱 步驟中預先將其定義為吸熱轉化之中點。僅考慮第二及第 三個加熱循環，以避免其他不可逆吸熱事件之干擾。在整 個實驗中，將量測單元乾燥且用N2氣體淨化。 ·' 廣角X射線繞射（WAXD) 在40 kV/40 mA及25°C下使用具有Cu Κα輻射（λ=0·15418 ❹ mm)之Philips X'pert型MPD藉由X射線粉末繞射研究粉末 之結晶度。將60-80 mg之粉末量填充至鋁樣品固持器中且 立即掃描。在20 = 〇.5。-4〇。之範圍内以0.02。/8之步長量測所 有掃描。藉由使用基於Black及Lovering之方法根據繞射圖 (參見下文）之結晶及非晶形區域計鼻樣品結晶度（結晶程 度)。 Black， Lovering, Journal of Pharmacy and Pharmacology 29:684-687 (1977) ° φ C=Ic/(Ic+Ia)=AUCit»/AUC 嫵=(AUC<*-AUC** 形)/AUC 嫵 C為結晶程度（當乘以100時有時亦描述為結晶度百分 比），Ie及Ia分別表示由結晶區域或非晶形區域散射之X射 線之強度，其等於峰及寬暈（halo)之曲線下面積（AUC)。藉 ： 由自圖中切割結晶峰且使用曲線擬合來計算AUC “形。 動態光散射 用 Zetasizer Nano ZS(Malvern，Germany，軟體：DTS， 版本：4.2)進行動態光散射（DLS)量測以偵測可溶性以及不 137663.doc -69- 200944245 溶性聚集體。Zetasizer使用633 nm之雷射光且在173°下偵 測散射（背向散射偵測）。對於尺寸量測而言，其具有0_6-6000 nm之量測範圍。藉由量測樣品中粒子之布朗運動 (Brownian motion)來測定粒度。Malvern儀器：Zetasizer Nano Series User Manual. MAN 0317，2.0 期，2004 年 3 月。在無任何添加劑之情況下測試液體調配物，且用二次 ·' 蒸餾水（經由0.2 μιη過濾）將粉末稀釋至原始蛋白質濃度。 藉由使用低容量比色管（拋棄式低容量比色管，Malvern)， ® 每次量測僅需0.5 mL溶液。用2 mL比色管測試提供相同結 果（資料未展示）。2分鐘平衡時間（25°C)之後，對每一樣品 進行3次量測，各自操作5次（操作持續時間：30 s，操作之 間的延遲：2 s)。對於每一粉末/溶液樣品而言，將此程序 進行三次。所得圖表以記分表形式輸出且經由MS Excel轉 換成圖表，使每個樣品產生三條繪製曲線，其展示尺寸-體積及尺寸-強度分布。 掃描電子顯微術（SEM) 使用Amray 1810 T掃描電子顯微鏡在20 kV下經由電子 顯微術照片來研究粒度及形態。使用自黏薄膜將小粉末樣 : 品固定於鋁樣品棒（G301，Plano)上。在20 mA/kV下用金濺 ； 鍍（Hummer JR Technics)1.5分鐘之後，將樣品置放於顯微 鏡下且獲取不同放大率（通常為1000倍、2000倍及3000倍） 之照片。一般而言，評估在3000倍之放大率下獲取之照 片。 卡爾費雪滴定（Karl Fischer Titration) 137663.doc -70- 200944245 用 Mitsubishi濕度計（CA_〇6 c〇ulometric)及 Mitsubishi水 蒸發器（VA-06)量測喷霧乾燥（sd)粉末的水分含量。在乾燥 空氣條件（手套箱）下將約70 mg之粉末樣品填充至特定樣 品固持器中。用Mettler AT DeltaRange分析天平稱量空樣 . 品固持器。藉由連接樣品固持器與蒸發器單元，將粉末填 充至經拉入加熱烘箱單元中之玻璃蒸發孤中。當水經蒸發 (15〇°C)且經由氮氣流（約200 mL/min)定量轉移至滴定單元 中時，再稱量樣品固持器以計算實際樣品重量。以$〇 〇1 ® 叫H2〇/min之滴定速率起始滴定。 顯微鏡下可見粒子 用電腦輔助粒子計數裝置注射器（Klotz，Germany，軟 體：SW-CA，版本ι·2)觀察（例如）再溶解之喷霧乾燥粉末 的粒子污染。經由在雷射器前降低至25〇 μιη之直徑的流通 單元吸入液體。當粒子經雷射束擊中時，其偵測強度降 低。雷射光之衰減指示粒度。用二次蒸餾水（經由〇 2 過 _ 濾）將所有粉末復水至其原始濃度，且經由系統泵出0.8 mL溶液（一次用於沖洗系統，三次用於粒子計算）。針對1 mL溶液計算結果。對於f藥應用而言，軟體根據美國藥 - 典（Umted States Pha職c〇P〇eia，USP)或歐洲藥典 (EUropean Pharmacopoeia，Ph. Eur )之條例將粒子分為 8種 不同尺寸範圍（1-50 μηι)之等級。 等電聚焦（IEF) 阿非莫單抗之IEF分離係基於Fd，片段及輕鏈變異體之電 荷差。其主要用作阿非莫單抗之一致性測試，但其亦可用 137663.doc 200944245 作用於穩定性測試之工具。用與Serva Blue Power 3000電 源連接之Pharmacia Multiphor II腔室進行聚焦。將pH梯度 為 6-9之即用凝膠（Servalyt Pr ecotes 6-9，125x125 mm， 厚度0.3 mm ; Serva, Germany)置於冷卻板（4°C，用一些作 為傳熱介質之Bayol F覆蓋）上。將所有樣品稀釋至約4 ' mg/mL之蛋白質濃度，將10 pL置於凝膠上。聚焦程式起 -· 始於200 V且花費約195 min(終點電壓2000 V)。在固定20 分鐘之後，將凝膠用考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue) 〇 染色（20 min)且接著脫色若干次。所用溶液列於以下表1 中〇 表1
溶液名 组合物 量 固定溶液 三氣乙酸 40 g 96%之乙醇 100 mL 二次蒸餾水 100 mL 染色溶液 考馬斯亮藍R250 400 mg 乙酸 40 mL 96%之乙醇 160 mL 二次蒸顧水 補至400mL 脫色溶液 乙酸 50 mL 96%之乙醇 250 mL 二次蒸顧水 補至500mL
用水沖洗且在室溫下乾燥隔夜之後，使用Desaga CAB UVIS VD 40工作站與ProViDoc®軟體（3·20版）檢測且掃描 凝膠。 濁度 濁度為造成光散射及吸收而非以直線透射穿過樣品之光 學特性的表現。其可由包括固體、膠體及氣泡之任何懸浮 粒子造成。儘管濁度並非明確定義之參數，但其係藉由比 137663.doc -72- 200944245 較樣品與例如肼凝膠之乳白光標準物來量測。使用Hach Ratio XR濁度計來評估樣品之濁度單位（nephelometric turbidity units，NTU)。用Hydrazin標準物校準濁度計。在 量測Nessler管之空白值之後，將樣品用二次蒸顧水（經由 0.2 μπι過濾）稀釋或復水至原始蛋白質濃度且接著置於光束 ' 中。為排除玻璃不均一性之影響，重要的是在空白量測期 -· 間標記管之方向且對於樣品量測以同一方向使用管。 顯色
〇 為偵測再溶解之喷霧乾燥粉末之顯色改變，使用LICO 400(Hach Lange，Switzerland)，其為用於透明液體之顏色 量測的比色計。其確定最接近樣品之參考溶液且量化樣品 與參考之間的顏色變化。在此研究中，使用以亮度（L，黑 色-白色）及顏色（土a，紅色-綠色；土b，黃色-藍色）之座標定 義顏色的CIE-Lab色空間（CIE為國際照明委員會 (Commission Internationale d'Eclairage)之縮寫）。使用來自 Ph. Eur.之標準溶液（BG 5-7，棕黃色，經稀釋；B 5-9，棕 W 色）校準LICO 400。將所有粉末樣品復水至原始濃度，將 200 μΐ填充至小容量石英玻璃比色管中。 UV-光譜分析 . 為測定濃縮物或超濾等分試樣之蛋白質濃度，使用
Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS光譜儀。將樣品稀釋至約 0.6 mg/mL之蛋白質濃度。用樣品溶液填充三個石英玻璃 比色管且將其中每一者在波長（λ)=280 nm及λ=320 nm下量 測三次。使用以下方程式使用吸光度值（由UV WinLab 5 ·0 137663.doc -73- 200944245 軟體，Perkin Elmer提供）來計算蛋白質濃度： c=[(A28<rA32〇>*/1.37】xF(mg/niL) 1.37 = 828〇nm-E32〇nin f，= VrH2〇/V* 6 f +1 在該等方程式中，F為稀釋因子，a表示所量測之吸光度， ε為莫耳消光係數（使用丨cm比色管，1 mg/mL溶液之吸光 度）’且V表示在第一稀釋步驟中之體積。 ❿ 交又流過遽 為達成較高濃度之阿非莫單抗溶液，使用Millipore
Labscale® TFF系統超濾濃縮物。將原始阿非莫單抗濃縮物 沿分子量截止（MWCO)為30 kDa之過濾器裝置持久泵入。 除蛋白質外之所有成份皆穿過膜且收集於外部容器中。蛋 白質本身返回至循環流動中。可藉由體積規模大致估計當 别濃度。在過濾過程終止之後使用uv_光譜分析來計算精 確蛋白質濃度。 φ 結果 ΜAK濃縮物之特徵 • 新近解凍之濃縮物通常展示約0.9-1%之聚集（等分試樣 之間可此1存在差異，因此每一等分試樣在解凍之後立即經 由SEC研究）且無可偵測斷裂。根據用分子量標記套組（碳 酸野酶，分早吾“Λ、 置（Mr)=29 kDa;及 β_澱粉酶 ’ Mr=200 kDa) 進仃之實驗’聚集體主要為二聚體。DLS圖表展示單體具 有約10 nm之流體動力學直徑。濃縮物展現相對較低之顯 137663.doc •74· 200944245 微鏡下可見粒子污染及約5 NTU之濁度值。觀察到5種同功 異里物之典型咖譜帶圖案。在所有其他阳實驗中，將純 濃縮物用作標記/標準物，因此直接该測任何差異。 在顯色量測中’濃縮物最接近標準溶液Β9，其為略帶棕 t之幾乎無色溶液。濃縮物具有1〇〇9細3之密度及 0.981 mPas之黏度（兩者均於2〇。〇下量測）。 ' MAK濃縮物之噴霧乾燥 用不含任何額外穩定劑之純漢縮物進行第-嘴霧乾燥實 ® 驗。測定乾燥過程中蛋白質損傷之程度。 MAK之過程穩定性 為測定喷霧乾燥過程中蛋白質如何受損’根據則咖191 上現有之研究(例如Maury)採用第一實驗之過程參數：τ入 = 130。。，QLF’3 mL/min ’ Qaa=7〇〇 "h，Qda=_ ， 使得丁出為約8(TC。Maury等人，細^崎⑽/〇/以職— 价59(3): 565-573 (2005)。 & 所得白色粉末（旋風分離器產率：約6〇%)包含具有多達 13 μπι直徑的球形、環形或凹形粒子。再溶解之粉末（每毫 升水22.9毫克粉末）具有12_13 mg/mL之蛋白質濃度，暗示 粉末之損失係歸因於喷霧乾燥過程及旋風分離器之分離效 食b。不可偵測到蛋白質或賦形劑自蛋白質溶液之優先損 失，此係由於在喷霧乾燥後的非晶形狀態。喷霧乾燥之 MAK濃縮物的X射線繞射圖顯示結晶峰，此係由原料藥物 (bulk dmg substance)之其他組份（例如磷酸鈉及氣化鈉）產 生。該峰型極接近於喷霧乾燥之氣化鈉的峰型。粉末之殘 137663.doc -75- 200944245 餘水分含量為1.4-2%，依該過程中之周圍條件（乾燥空氣 之RH、室溫等）而定。 在SEC中，再溶解之粉末顯示聚集明顯增加（2.5-3 %)。 然而，無穩定劑之蛋白質溶液聚集不多。Maury發現喷霧 乾燥、透析之IgG溶液多達17%。Maury等人，«/owMa/ o/Pharm. 59(2):251-261 (2005)。此表明在 噴霧乾燥期間，片段較全長抗體不敏感，但對於冷凍·解 珠所誘發之聚集並非如此。Wang等人，《/owrwa/ o/P/mrm. ❹ *SW. 96(1):1-26 (2007)。另一可能性為氣化鈉之存在引起的 穩定效應。Arakawa等人發現溶液中蛋白質與氣化鈉之間 穩定相互作用；然而彼等僅研究比此處所用鹽濃度高之鹽 濃度。Arakawa等人，价oc/iemhiry 21:6545-6551 (1982)。 在DLS及IEF結果中亦可見聚集增加。 在等電聚焦期間，在聚焦之起始點出現一新帶。其可歸 因於大聚集體，彼等不可穿透入凝膠且因此不可根據其等 電點移動（根據Serva GmbH，其IEF凝膠之孔具有約200-300 kDa之截止值）。DLS結果顯示另一微米尺寸之峰。該 峰在尺寸-體積分布中難以見到，但在尺寸-強度分布中清 • 晰可見。少數大粒子比許多小粒子散射更多光，因為粒子 : 之散射強度與直徑之6次幂成正比。Malvern Instru ments : Zetasizer Nano Series User Manual· MAN 0317 , 2.0期，2004年3月。該另一峰顯然由蛋白質產生，因為用 安慰劑濃縮物進行之DLS實驗並不顯示該流體動力學直徑 之峰。因為在SEC中未見該等大聚集體，所以彼等必定不 137663.doc • 76· 200944245 Γ容。在所有粒子溶離份中，再溶解粉末之粒子污染辦 。然而’實驗室喷霧乾燥器方法不可完全排除粒子污； (儘管入口乾燥空氣經過心此外，開啟小瓶獲取樣品亦 成為粒子來源。此外，與濃縮物相比，再溶解粉末之濁 ^顯著增加m縮物：5则；噴霧乾燥濃縮物 NTU)。 找到合適1\ Ο 為研究UOUT，是否適於噴霧乾燥阿非莫單抗蛋白， 進行具有不同溫度之實驗系列。將此系列之仪及在QL产約 3 mL/min下所得之列於表2中。意欲找出乾燥效率與蛋 白質過程穩定性之間令人滿意之折衷。
除180C粒子比100°C粒子皺一點之外，未觀察到粒子形 態中之差異，但該等差異極微小。含水量傾向於隨I增加 而降低，在loot與13(TC之間有相當大之向下梯級。在可 偵測聚集中不存在實質差異，因此聚集似乎並非與溫度極 相關。在較咼溫度下粉末產率展示較小改善。所有該等結 果皆推薦使用高T人，但等電聚焦（IEF)及動態光散射（DLS) 結果指示阿非莫單抗之適當τ入在中間範圍内。ief中聚集 譜帶之強度與乾燥空氣入口溫度線性相關。此外，在 18(TC下DLS圖展示較差結果。在較高流體動力學直徑（約 137663.doc •77· 200944245 16 nm)下顯露出單體♦。聚集體似乎不僅如IEF中所呈現 變得更多，而且變得更大。此外，單體峰在形狀（向較小 分布變化）及尺寸上有所變化，指示蛋白質之實質損傷。 在 C下粒子污染亦較尚’尤其在小粒子溶離份（<；i5 pm) 中。根據該等結果，認為僅13(rc及155。〇可為進一步研究 所接受。因為該兩個入口溫度之結果類似，所以選擇 130°C之T入。此溫度下之操作應將蛋白質之熱應力降至最 低’同時提供關於產品品質之總體可接受之結果。 ® 聚集之根源 噴霧乾燥過程包含蛋白質失活之許多根源。一些根源可 藉由用賦形劑改質調配物而減少，而失活之其他根源可能 不受影響。過程中聚集之增加不可明確歸因於單一應力因 素。在某種程度上可藉由選擇適當Ta(此處約13〇。〇來控 制熱應力。為研究不可避免之應力的程度，進行以下實 驗。 _ 蠕動泵之影響 藝 為量化蠕動泵之剪切應力對聚集之影響，使用SEC。將 10 mL阿非莫單抗濃縮物用作液體饋料。使樣品經由Biichi B-191之官及蠕動泵泵入且僅在進入雙流體喷嘴之前收 集。在泵入過程之前及之後測試液體饋料。注意到聚集無 變化。可假定實驗室喷霧乾燥器之蠕動泵不影響或增加阿 非莫單抗蛋白之聚集。由Brennan等人（£)以心34，35% 359 (1985))觀察到之泵誘發之胰島素聚集僅在長期泵入之 後當胰島素離開溶液時出現。因為在此研究中穿過管至多 I37663.doc -78· 200944245 僅需數分鐘，所以損傷之危險極小。 霧化過程之影響 藉由霧化兩個濃縮物樣品（2 mL)且隨後經由SEC及IEF進 行測試來測試霧化期間剪切應力之範圍。在脏中在樣 品之間未能觀察到差異（在譜帶圖案中無額外譜帶或變 化）。SEC結果展示聚集略增加。此增加並非如在整個喷霧 乾燥過程中-般高。因此，可推斷一小部分聚集係由霧化 造成，但如Maa等人所假定，蛋白質損傷可能不僅為剪切 > 力之結果，而是大的空氣/液體界面之結果。Maa等人， ⑻54(6):5〇3 512 (1997)。 熱應力之影響 蛋白質為熱敏性物質，但並非每一蛋白質對熱應力同樣 敏感。為測定阿非莫單抗濃縮物可在何種程度上耐受溫度 (熱應力），將少量蛋白質溶液在不同時期内暴露於不同溫 度下。濃縮物穩定性之準則為溶液之SEC資料、iEF結果 及光學外觀。在凝聚出現之後，終止試驗。結果顯示於以 下表3中。
137663.doc -79- 200944245 起始點出現額外譜帶伴隨著出現混濁。原始譜帶圖案之视 色指示可溶性蛋白質損失。在SEC標案中亦備測到可溶性 蛋白質之損失》單體峰隨溫度及時間增加（縱座標定標）而 縮小。甚至當施用超過24小時時，4(rc仍不影響阿非莫單 &濃縮物。蛋白質之熱應力損傷並非由聚集之增加表示， 而是由片段之外觀表示。聚集峰在很大程度上保持不變。 ·· 因此施加於濃縮物上之熱應力產生斷裂及凝聚，而在噴霧 乾燥期間施加於霧化濃縮物上之熱應力主要產生聚集。阿 ❹ 非莫單抗濃縮物可在短時期内經受至多約抓之溫度。在 約60 C下’ |白質損傷迅速發生。在喷霧乾燥過程中，將 小液滴暴露於濕球溫度（D下，其通常比T出低25_3(rc(在 此研究中通常為80。〇,且暴露時間極短。Mumenthalei^ 人，户/mrm.心心 li(i):12_2〇 (1994)。 小結 並不認為在泵入程序中聚集係由剪切㈣成。在喷霧乾 ❿ 帛過程中霧化部分地造成聚集增加。熱應力對蛋白質穩定 起重要作用’但當施加於漢縮物時，其產生斷裂及不溶 性聚集體。當小液滴在噴霧乾燥中達到約55Ό之臨界溫度 (低於T*25_3〇C，由Mumenthaler等人假定，但僅歷時極短 ' 時期)時’聚集增加似乎係由溫度與霧化之相互作用引 起 ° Mumenthaler 1994。 具有蟓形劑之嘖霧乾燥實驗 為最佳化阿非莫單抗蛋白之穩定，測試不同賦形劑。目 標為在乾燥過程及後續儲存中之充分穩定性。 137663.doc 200944245 10-150 mM山梨糖醇之添加 在當前實例中’將10 mM、25 mM、50 mM、100 mM或 150 mM山梨糖醇添加至阿非莫單抗濃縮物中以測定如表4 中所示之穩定劑與蛋白質之最佳莫耳比率。結果顯示於圖 2及圖3中。對於150 mM山梨糖醇溶液而言，下降至遠 超過方法溫度及甚至室溫’且不可能適當地喷霧乾燥此混 口物，如可見極低產率。混合物不可在其穿過乾燥腔室期
間乾燥，且當進入旋風分離器時其仍具黏性因此大部分 黏附於旋風分離器壁上且不可收集。Maury等人，五π j〇wnai〇fPharm,andBiopharm59(3y565 573 (2〇Q5)〇
由於產率較小’故不可進行該等樣品之卡爾-費雪滴定 ㈣及廣角狀線繞射（WAXD)分析。除1()福山梨糖醇不 夠外’聚集之增加並非極依賴於山梨糖醇之量。不同量之 t梨糖醇並不影響粒子形態；但混合物中存在之賦形劑愈 m用圓形之粒子愈多（參見圖4)。儘管不可能喷霧乾 糖醇溶液(作為對比)，但具有不同山梨糖醇濃度 之女慰劑粉末均展示球形粒子。 兮八純焦：：山错糖醇淨重提高而降低。1EF結果基本上 符&純/農縮物之結粟，甘士 μ 其中右可偵測到額外譜帶，則亦僅 137663.doc •81 · 200944245 可模糊地偵測到。10 mM混合物亦展示出乎意料之dlS 圖。在尺寸體積分布中幾乎不可偵測到微米尺寸下之清晰 峰’因此大聚集體之量極低。然而，25 mM、50 mM及100 mM之所添加山梨糖醇展示幾乎相同之圖。粒子污染似乎 與山梨糖醇（固體）之量線性相關，在1〇 mM與2 5 mM之間 展示最大梯級。然而’該等差異主要限於較小粒子尺寸。 大於15 μηι之粒子的值不相上下。因此，在添加25 mM或 50 mM山梨糖醇之情況下阿非莫單抗濃縮物之充分穩定似 乎可行。該兩種混合物除含水量及因此所得Tg外不展示大 的差異^ 10-100 mM海藻糖之添加 由於在高山梨糖醇量下所測得之結果，故海藻糖測試系 列排除150 mM混合物。添加呈海藻糖二水合物形式之海 藻糖，因此混合物包含於15 mL阿非莫單抗濃縮物中之介 於56.7 mg與567 „^之間的海藻糖二水合物，海藻糖：mak 之質量比可見於表5中。如圖5及圖6中可見，25 mM與1〇〇 mM之間的結果類似。與山梨糖醇相比，在所有濃度上產 率平均值略高。在海藻糖之情況下，獲得極佳穩定，以及 在所有濃度上產率穩定。增加之聚集極小，且僅對於ι〇 mM混合物而言，在SEC中可見聚集之較小增加。
137663.doc -82- 200944245 然而’如DLS圖中可見’在所有混合物中均出現不溶性 聚集。單體之量可與山梨糖醇結果相比。粒子之結晶度及 球度與海藻糖之量成正比。添加海藻糖促使粒子採用圓 形’此係因為純海藻糖之喷霧乾燥提供球形粒子（參見圖 7)。如山梨糖醇實驗中可見，粒子污染似乎受賦形劑濃度 影響，但其又限於小粒子尺寸（$1 5 μηι)β由於海藻糖之高 -· Tg(乾燥海藻糖之1為115。〇，故海藻糖混合物之Tg亦較 高，此對於粉末穩定性研究而言可為有利條件。八以^等
❿ 人，Journal 〇f Pharm. Sci· 88(2): 199-208 (1999)。25 mM 及50 mM似乎為最有希望之海藻糖比例以產生具有適當過 程及儲存穩定性之粉末。與山梨糖醇粉末相比，所得粉末 展示較少殘餘水。由於該等混合物之令人滿意的結果，故 放棄用150 mM海藻糖進行後續測試之選擇。 10-100 mM蔗糖之添加 測試向阿非莫單抗濃縮物中添加25 mM至100 mM蔗糖 ❹（參見表6)。添加25 1111^至1〇〇 mM之蔗糖提供70%至80%之 高粉末產率（圖8及圖9)。在25福下^達到最佳。在整個 所有虞度中聚集增加實質上並無差異。此外，結晶程度 ()隨蔗糖之量線性降低。不同粉末之殘餘水分含量平均 : 4同於對海藻糖混合物所觀察到之殘餘水分含量。粒子之 球度又簾糖之量影響。蛋白質傾向於形成凹入圓球，而嚴 糖傾向於形成球形粒子。 I37663.doc -83· 200944245 表6 mM m軟形*(mg) V壤期物 質量比 賦形劑:MAK 10 51 15 0.27· 1 25 50 __128_ 255 _15__ 15 ——U 1 3·1 100 510 15 ..... 2.7:1 在DLS檔案中，在100 mM蔗糖之情況下與1〇 mM蔗糖相 比單體之量較低，但此印象限於強度_尺寸分布圖。在1〇〇 mM蔗糖之體積-尺寸分布中，難以偵測到聚集峰。在⑺
mM混合物中，可見較大聚集體（>1 μηι^該等額外峰在其 餘蔗糖混合物中並不顯露出。IEF凝膠不展示任何實質不 規則性。對於50 mM及100 mM而言僅可模糊地偵測到額外 譜帶，且可清楚地觀察到濃縮物之原始譜帶圖案。自1〇 mM至100 粒子污染降低，其在1〇爪厘與乃mM之間展 示最大梯級。在較大粒度之情況下，差異變得較小，因此 對於大於15 μχη之粒子而言，所有混合物皆展示類似粒子 量。考慮到所有該等結果，向阿非莫單抗濃縮物中添加1〇 mM蔗糖並不夠；最佳結果係在25 mM&5〇瓜河下得到。 小結 比較不同量之三種賦形劑的結果，顯然在喷霧乾燥過程 中10 之賦形劑不足以提供蛋白質保存。因此，所有賦 形劑之最有利結果係在25福及5〇應下得到；1〇〇囊或 甚至15G mM不會改善結果（對於15〇祕山梨糖醇而言正相 反+)。對於山梨糖醇而言聚集增加之結果略高；其餘結果 (嚴糖及海_糖）大致類似。海藻糖及U在相同程度上保 護阿非莫單抗蛋白且優於山梨糖醇。 137663.doc -84- 200944245 儲存穩定性研究 使喷霧乾燥粉末暴露於不同溫度及殘餘濕度條件下歷時 3個月。測試條件為：冰箱（5。〇，無濕度）；在6〇%相對濕 度下25C(類似於中歐（Central Eur〇pe)、北美洲（N〇灿
America));及在75%相對濕度下4(rc(類似於東南亞 (Southeast Asia)) ° 製備及檢驗方案 儲存純濃縮物以及噴霧乾燥之安慰劑。安慰劑粉末包含 除阿非莫單抗蛋白外與真粉末（verum p〇wder)(喷霧乾燥之 蛋白質_賦形劑混合物）相同之固體。預先計算分析測試所 需之粉末量以估計液體饋料之批量大小。將3批或4批5〇 mL液體饋料在相同條件下喷霧乾燥；將所得粉末以一堆 混合在一起，將計算量之來自其中之粉末填充至具有 Viton密封含氟彈性體及Dur〇plast®螺帽之小鋁瓶中。選 擇具有Viton®密封含氟彈性體之小鋁瓶，此係因為在初步 測試中其僅展示較小水蒸氣滲透性（當在65% RHT在室溫 下儲存10天以上時，未觀察到喷霧乾燥之乳糖的含水量改 變）。在每一檢驗時間（t=1個月、2個月及3個月）下，自不 同的空氣調節腔室移除各混合物之兩個相同樣品（小鋁 瓶）。一個樣品用於分析；將另一個樣品轉移至冷凍箱中 且儲存於-8CTC下（作為可能之額外測試的儲備）。此舉得到 總共152個小瓶，48個為每月自腔室移除（對於每一溫度而 言有4個真粉末、4個真粉末儲備、4個安慰劑、4個安慰劑 儲備）加上儲存於-801下而未經任何額外熱處理之8個小瓶 137663.doc -85- 200944245 (純濃縮物或新近喷霧乾燥之粉末）。 阿非莫單抗濃縮物 SEC結果（參見表7)。SEC層析圖表明在5°C下，濃縮物僅 經受由聚集造成之極小損傷’但似乎該等聚集體主要並非 一聚體。聚集體峰之寬平台指示存在三聚體/募聚物。由 出現斷裂及層析圖之AUC降低可見，較高溫度及較長儲存 期導致嚴重降解。 表7 樣品 峰 峰 時間(min) 面積(％) ' 5°C，1個月 1 聚集體 21.9 Z6 '~~~ 2 單體 24.4 97.4 — 25°C，2個月 1 聚集體 21.6 3.0 _ 2 單體 24.2 874 " 3 片段 27.5 9.6 ~ 40°C，3個月 1 單體 24.6 7.5 2 片段 27.4 92.5 研究不同溶離份之儲存穩定性動力學。然而，在所有溫 度下單體之量不斷下降，在25°C及4(TC下約2個月之後聚 集似乎轉變為斷裂。在40°C下，在層析圖中不再可以單峰 Φ 偵測到聚集，且在3個月之後，峰型主要為斷裂峰。在 40°C下藉由肉眼分析樣品可能已觀察到嚴重損傷。1個月 . 之後’儲存於4〇°C下之濃縮物展示混濁，而5°c及25°c樣品 僅展示用裸眼不可見之較小顯色變化。 濁度量測展示類似結果。僅在40°C下在真粉末（含有蛋 白質之樣品）中以及在安慰劑濃縮物中可偵測濁度之明顯 變化。1個月之後，濃縮物展示大於150 NTU之值，其在以 後各月中仍增加。由於光學混濁，故對於40°C樣品而言終 137663.doc • 86- 200944245 止DLS量測。在較低溫度下，未偵測到變化。粒子量測提 供關於斷裂及聚集之額外資訊。細小粒子溶離份降低（粒 子<25 μιη)，而大粒子之數目不斷增大，可能表示未由SEC 偵測到不溶性聚集體（如由層析圖之AUC降低所呈現）。該 等粒子亦應為造成樣品之可見混濁之粒子。 到目前為止，在25°C下之損傷似乎並不極其嚴重。然 而，當分析IEF凝膠時證明此印象不正確。i個月之後，已 可見譜帶強度之小變化，且3個月之後譜帶圖案明確不同 於原始譜帶圖案。具有最高等電點（IEp)之同功異型物⑽ 8.6-8.7)之譜帶完全消失。贼儲存在i個月之後產生嚴重 損傷，在穩定性測試期間甚至變得更糟。 因此，當在較冷溫度下儲存時，阿非莫單抗濃縮物係相 對穩定的。但-旦將濃縮物置於較高溫度下，即經由不同 路徑發生降解。甚至當長期儲存時室溫…。⑺亦為應力因 素。 ©噴霧乾燥粉末的穩定性 為經由喷霧乾燥提供長期穩定，具有額外賦形劑之阿非 莫單抗濃縮物應展示不次於儲存於饥下之濃縮物之結果 .㈣解。作為額外測試’在喷霧乾燥過程之後立即進行卡 : _費雪滴定及在3個月儲存之後進行卡爾費雪滴定以研办 小銘瓶之密封（迄今為止僅針對短期測試）及/或水分對於二 霧乾燥粉末之穩定性的影響。 濃縮物+ 25 mM山梨糖醇 在3個月内儲存於5t：及25〇C下夕搂口 s ή , 0 L下之樣品展不良好穩定性（如 137663.doc •87- 200944245 表8中所示）》在SEC結果中，未能發現明顯變化（△聚集低 於1%)。在40°C下，發生實質降解，聚集展示強烈增加且 除二聚體峰之外出現大的多聚體。在3個月之後，可偵測 到清晰片段峰。 表8 樣品 峰 峰 時間(min) 面積(％) 25°C，3個3 1 聚集體 22.3 1.9 2 單體 25.1 98.1 40°C，1個月 1 聚集體 21.4 8.6 2 單體 24.6 91.4 401C，3個月 1 聚集體 22.1 12.4 2 單體 25.0 82.4 3 片段 27.2 5.2 然而’儲存於5°C及25。(：下之樣品不展示任何顯色變 化’在1個月之後40°C樣品（再溶解）之顏色稍微改變且在一 段時間内甚至展示可見混濁。此混濁係由蛋白質造成，因 為安慰劑樣品在任何時間或溫度下均不改變顯色。在4〇〇c 下亦獲得濁度量測期間之最顯著結果。在喷霧乾燥後立即 在約20 NTU下起始，3個月之後4(rc樣品達到大於12〇 ❹ NTU之值》然而，20 Ντυ顯著大於純濃縮物所示。扣它為 山梨糖醇混合物之臨界參數，因為其大於Tg，因此不可再 維持玻璃態。 粒子污染展示類似結果。在5。。及25。。下僅存在可偵測 之較小變化。儲存於4(rc/75% RH下之樣品展示顯著增 尤其對於J粒子而έ。此係由於在未觀察到輕微混濁 之情況下粉末不可再溶解。安慰劑樣品中粒子之數目遠低 於真樣品中粒子之數目，其不限於特殊粒子尺寸。儘管初 137663.doc •88· 200944245 步研究表明用於储存粉末之小銘瓶具水蒸氣不渗透性，但 尚不能確保其絕對水蒸氣不滲透。 在喷霧乾燥過程之後立即進行卡爾費雪滴定及在3個月 储存之後進行卡爾費雪滴定。水分吸收不具蛋白質依賴 性’此係因為除初始值略高之外安慰劑樣品展示相等结 #。儘管穴粉末僅展示較小濕度增加，但水分吸收仍依 ' 肖於空氣調節腔室之RH。山梨糖醇與MAK之組合比純賦 形劑更吸渴、’因為安慰劑樣品之值略高於真樣品之值。小 ❿ 之溫度、殘餘濕度及水蒸氣滲透性對X射線繞射圖不具 有任何影響3個月之後’與初始圖（㈣)相比繞射圖案仍 無差異。 甚至粉末之肉眼可見外觀亦受濕度影響。大多數樣品仍 為易流動之鬆散材料，但扣^:樣品熔合（尤其安慰劑樣 品）。由DLS結果證實赋樣品中所示之聚集增加。雖然 穴及25t：仍展示典型圖案（在⑺⑽下之單體峰及微米尺寸 ^ 下之小聚集峰），但觀察到4〇t樣品之不同圖案。甚至在 尺寸-體積分布中，在單體峰處出現小凸肩，其表示在㈣ 月之後甚至更不同之多聚體峰。在ΙΕρ凝膠中，在4〇(?c下 物個月之後可偵測到變化’在起始點出現在較低溫度 下不可見之額外譜帶。 濃缩物七25 mM海漆糖 海藻糖混σ物展示良好穩定性（表9)。在5艺及25乞/6〇〇乂 RH下儲存期間，在整個分析中未能偵測到實質變化。僅 在4(TC/75% RHT，粉末展示略微不同之結果。聚集僅在 J37663.doc -89 - 200944245 4〇°C下增加。3個月之後1測到約2%之總聚集增加。較 低溫度不會對蛋白質產生顯著損傷^但即使在_下，3 個月之後單體之量仍大於95% 在海隸用作穩定劑之情 況下，未觀察到片段形成，至少在層析圖中不存在不同 峰。與完全抗體相比IgG片段在儲存期間對溫度誘發之聚 集可能較不敏感。 表9
在濁度量測期間獲得類似結果。在5。(：及25°C下儲存期 間未能觀察到濁度改變，且甚至40°C樣品亦僅展示較小濁 度增加。混濁在很大程度上又係由蛋白質造成，因為安慰 劑樣品具有接近於零之NTU值。粒子污染不受較高溫度或 較鬲殘餘濕度影響。除真樣品與安慰劑樣品之間的差異 外’經3個月儲存之粒子數目基本上保持相同水平。此亦 由再溶解粉末之光學外觀得以證實。所有樣品均產生澄清 溶液，且甚至在儲存期間顯色量測亦不展示任何差異。 用於穩定性測試之小鋁瓶不可完全排除來自粉末之濕 度。因此，在25°C及40°C下高濕度條件導致粉末之濕度增 加。儲存於5°C下之粉末展示不變之含水量。兩種應力因 素（溫度與增加之RH)對粉末樣品之結晶度不具有任何影 響。繞射圖保持不變。氣化鈉峰型在WAXD圖中仍在主要 137663.doc -90· 200944245 地位。SEC及濁度量測結果符合經由DLS獲得之結果。低 溫及低殘餘濕度並不損害負載有蛋白質之粉末。所有樣品 均展示相同圖案，且甚至儲存於⑽乞下之混合物亦不展示 異常峰或峰凸肩。其展示在約10 nm下可見大峰及在微米 尺寸下可見額外峰的普通圖案。 在IEF結果中’在聚焦之起始點處展示額外譜帶之唯一 凝膠為具有40°C/75% RH樣品之凝膠。儘管如此，在3個月 之後僅觀察到微小藍色斑點（恰好低於"4(rc ")。在所有溫 度及濕度條件下，海藻糖展現對阿非莫單抗蛋白之極佳穩 定能力。 ’ 濃縮物七25 mM蔗糖 尤其在5C及25°C/60% RH下’蔗糖於阿非莫單抗濃縮物 中之溶液展示良好儲存穩定性（表1〇)。在該等條件下未觀 察到聚集改變。5°C及25。(：之所有層析圖均類似。僅對於 40 C /75% RH樣品可見不同結果，其中债測到在3個月内約 2.5%之聚集增加。但此時單體之量仍為約95%。 樣品 時間(min) 面積(％) 25C，3個月 1 22.4 2.7 2 單體 24.9 97.3 40TC，1個月 1 21.6 3.0 2 單體 24.5 97.0 40C，3個月 1 ^s5 22.0 5.0 2 24.9 95.0 所有再溶解粉末看來均光學透明及無色，不可與阿非莫 單抗濃縮物或液體饋料區分。顯色量測展示顏色經3個 月、即使在高溫儲存（4〇。〇後亦無任何改變。溶液仍最接 137663.doc •91 · 200944245 近於參考溶液R6或B5，其為用僅可由視覺輔助設備識別 之略帶紅色或棕色之極稀液體。藉助於濁度計，未觀察到 顯著改變。儘管在40t/75% RH下儲存之後濁度由最初12 NTU增加至20 NTU，但濁度結果與在喷霧乾燥之後立即展 不20 NTU之山梨糖醇及海藻糖相比較佳。安慰劑樣品僅展 示極低濁度，其在整個穩定性測試期内無顯著變化。 如對於濁度而言，真樣品之顯微鏡下可見粒子污染大體 上同於安慰劑樣品。然而，在大粒子溶離份（粒子大於j 〇 μπι)中僅觀察到較小改變。大於40 μπι之粒子的數目通常 接近於零，大於1〇 μηι之粒子的計數低於1〇〇個或為約1〇〇 個（每毫升溶液），且因此總體粒子污染並不極高。在高溫 儲存下之所有降解均符合卡爾費雪分析之結果。經調節儲 存腔室中之殘餘濕度愈高，溶解粉末之水的量愈高。蔗糖 樣品在真粉末與安慰劑粉末之間並未展示大的差異。 儘管在較高殘餘濕度條件下含水量增加，但水之吸收對 粉末之結晶度不具有任何影響。在3個月之後所有溫度下 之WAXD圖均展示相同繞射圖案，其與噴霧乾燥後立即 (t=〇)獲得之WAXD圖相同。在DLS圖及IEF凝膠中僅偵測 到極小降解。在4〇°C及75% RH下3個月之後，蔗糖樣品展 不與噴霧乾燥之後立即獲得之光散射圖極類似的光散射 圖。清晰單體峰處於1〇 nm流體動力學直徑處，且極小峰 處於微米尺寸處（見於陡直上升部分）。40°C及75% RH亦為 造成IEF譜帶圖案與濃縮物之IEF譜帶圖案不同之唯一條 件。聚焦起始點處之微小譜帶指示一些大的聚集體，但如 137663.doc •92· 200944245 DLS圖中可見，其數目不具有實質意義。 比較及小結
穩定性實驗表明不同穩定劑產生不同結果^改變賦形劑 或儲存條件似乎對粒子形態不具有影響。在喷霧乾燥之後 立即獲得之喷霧乾燥之山梨糖醇混合物的SEM影像幾乎不 可與在40°C及75。/。RH下儲存3個月之海藻糖樣品相區分。 5C不產生嚴重蛋白質損傷；甚至阿非莫單抗濃縮物在該 等條件下經3個月亦不展示實質降解。當儲存於坑6〇% RH或40°C 75% RH下時，純濃縮物藉由展示聚集及斷裂來 回應。 海藻糖及蔗糖展示普遍一致之結果。該等粉末具有極佳 穩定性。即使在40。(：及75% RH下’亦僅彳貞測到較小改 變。然❿’吸濕性為展示海藥糖與蔬糖之不同結果的參數 中之者合物相比，包含海藻糖之喷霧乾燥粉 末在喷霧㈣之後總體展錄低含水#。因為用於穩定性 測試之小銘瓶對於水蒸氣並非完全不可滲透，所以3個月 之後嚴糖粉末亦具有較高含水量，此係由於噴霧乾燥之嚴 糖比海藻糖吸濕性更大。 蔗糖與海藻糖之間的另一差異見於濁度量測中。與海藻 糖粉末相比隸混合物展示較小的在喷霧乾燥後立即得到 之NTU。濁度量測亦揭示另一出乎意料之特徵。對於蛋白 質-賦形劑混合物而言’喷霧乾燥過程似乎比高溫储存具 更大應力。當喷霧乾燥時，至少當在低於噴霧乾燥粉末之 Tg下儲存時’粉末展示足夠穩定性。 137663.doc •93- 200944245 山梨糖醇亦具有穩定可能性。在5°C及25°C下其展示良 好結果。然而，包括山梨糖醇之喷霧乾燥粉末不能長時期 經受較高溫度。該等結果之臨界參數似乎為山梨糖醇之低 g超過此/JD度（如40 C健存之結果可見）使玻璃狀調配物 轉變為黏性液體，增強其流動性，開啟各種降解路徑。 试圈降低噴霧乾燥過程中之濁度增加 因為發現濁度為展示噴霧乾燥過程中之可變性的參數， 所以再次改變過程參數以試圖將乾燥過程後之濁度值降至 最小水平。對於該等實驗而言，使用已證實對阿非莫單抗 蛋白產生極小損傷之來自先前乾燥實驗的過程參數。為 此’使用130C及100°C之T入進行添加25 mM及50 mM賦形 劑海藻糖及蔗糖之喷霧乾燥實驗。如上所述，1〇〇t：2T入 展示與在13CTC之下獲得之分析結果接近的分析結果。 降低之τ入降低對蛋白質之熱應力且因此可產生較低Ντυ 值。類似因素適用於50 mM及25 mM賦形劑之添加。在先 前測試中兩種調配物展示類似結果。賦形劑之量的增加可 產生較佳NTU值《因為方法設置中之兩種改變並不顯示先 前測試之實質改變，所以用於該等實驗之唯一分析方法為 濁度量測。 海藻糖之添加 在100C及130°c之T入下將包含25 mM及50 mM海藻糖之 阿非莫單抗濃縮物喷霧乾燥。將每一調配物大量噴霧乾燥 以便可測試來自每一實驗之至少3種喷霧乾燥粉末的濁 度。不論根據TV亦或根據賦形劑之量，粉末產率均不展示 137663.doc -94· 200944245 實質差異。平均產率為約70% ’對於130。(3之T入及25 mM賦 形劑之添加而言展示更高值。濁度量測之結果更不同。 賦形劑之量對濁度不具有大的影響，因為25 及50 mM海藻糖之NTU值並無很大不同。然而，不同τ人導致不 同濁度。130°C之導致較低NTU值及標準偏差。在100〇c 之T入下，NTU值一般較高且亦展示較大可變性。在13〇〇c 及添加25 mM海藻糖之情況下的值亦符合在穩定性測試期 間獲得之濁度結果。 © 簾糖之添加 將添加25 mM及50 mM蔗糖之阿非莫單抗濃縮物之混合 物在100 C及130。(：之1\下喷霧乾燥。不同蔗糖濃度似乎對 喷霧乾燥過程之粉末產率並不具有大的影響。所有混合物 均提供約70%之粉末產率，其中13〇°c粉末展示略小之標準 偏差。甚至更不同的為濁度量測結果。25 mM與5〇 mM之 NTU值極接近，略傾向於在1〇〇t2TAT5〇 mM蔗糖（展示 較低濁度）’及T入=13(TC下25 mM蔗糖之添加。因為該等 傾向並不大，所以賦形劑之量對喷霧乾燥粉末之濁度不具 有大的景/響。更清晰的是關於A之判斷。100«^ 上較一值，有時超過5。謂，該等=在實將f 130。(：粉末在4(TC下儲存3個月期間仍不會達到。此外，在 C2Ta下獲得之大標準偏差並不預示可再現結果。當 在13(TC之l下喷霧乾燥時，再溶解粉末展示⑽卿之 可再現低濁度。該等值亦符合穩定性測試期間所獲得之結 137663.doc •95· 200944245 小結 喷霧乾燥過程中之濁度增加不可藉由降低Τα來降低。在 100°C下含有海藻糖之粉末以及蔗糖混合物均展示較高 NTU值》當使用130°C作為T入時，添加25 mM賦形劑提供 與50 mM相比略低之濁度值。因此，自先前實驗得出之過 ' 程參數（130°C及25 mM添加劑）似乎對於阿非莫單抗蛋白之 -· 噴霧乾燥最佳。關於濁度，蔗糖表現比海藻糖略佳。自含 有25 mM蔗糖之阿非莫單抗濃縮物喷霧乾燥之粉末展示15 Φ NTU之平均值，而類似海藻糖混合物展示17 NTU之平均 值。 更高濃度之MAK 195F溶液之喷霧乾燥 使用海藻糖、蔗糖或山梨糖醇將包含12.4 mg/mL MAK 195F之阿非莫單抗濃縮物以實驗室規模成功喷霧乾燥，產 生穩定粉末。對於按比例增大之乾燥過程而言，加工時間 為一極重要因素。Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund ® (2002)。為減少較大批之加工時間，液體饋料中之較高蛋 白質濃度提高喷霧乾燥器之蛋白質生產量而對其他過程參 • 數無實質影響。為達成較高濃度之MAK 195F溶液，將阿 • 非莫單抗濃縮物超濾。在此過濾過程中，水、鹽及界面活 性劑減少，而蛋白質不可穿過膜。此導致蛋白質濃度增 加，但並不改變其他溶質之濃度。
阿非莫單抗濃縮物5Q.6 mg/mL 在第一超濾過程中，濃縮物達到50·6 mg/mL(蛋白質/毫 137663.doc •96- 200944245 升）之濃度（藉由使用uv光譜學估計）。溶液為光學透明且 幾乎無色（略帶棕色）’用肉眼幾乎不可與原始阿非莫單抗 濃縮物（12.4 mg/mL)區分。SEC及DLS未展示自原始濃縮 物之改變。 聚集仍接近於原始濃縮物（約1 %)且DLS概況完全匹配原 ' 始濃縮物，僅在約10 nm處展示單峰。蛋白質並不會因增 * 加其濃度而損傷。在較高蛋白質濃度之情況下，一些可量 測物理特性可改變。濃縮物50.6 mg/mL展示g/cm3之 _ 密度及丨.375 mPas之黏度（兩者均在2(rc下量測），與原始 濃縮物相比兩者均略高。此外，濃縮物5〇 6 mg/mL之濁度 值高於原始溶液：分別為118 NTU及約5 NTU。預期到此 增加，因為溶液中大分子（蛋白質）之量增加，因此存在更 多可散射或吸收光以降低光強度之大分子。 在超濾過程中粒子量測不展示顯著變化。與濃縮物124 mg/mL相比，濃縮物50·6 mg/mL之所有粒子溶離份均展示 ❿ 相等或較小粒子污染。1EF凝膠亦不展示額外譜帶。可假 定將溶液中MAK 195F之濃度增加至5〇6 mg/mL&不導致 實質損傷或與蛋白質及其功能有關之其他改變。
•.在無賦形劑之情況下噴霧乾燥濃縮物5〇 6n^/mL 當喷霧乾燥時’濃縮物50.6 mg/mL與濃縮物12 4叫就 一樣易受損傷。在喷霧乾燥過程中，聚集增加至約2%， 增加量為1%。粉末產率為約55%，但含水量相對高 (.5 /。）此外，粉末由於其高靜電荷而在處理（填充等）時 顯示一些難點。 I37663.doc -97- 200944245 DLS圖展示清晰單體峰及表示小聚集體（寡聚物）之小凸 肩。與喷霧乾燥之原始濃縮物（丨2.4 mg/mL)相反，未偵測 到在微米尺寸下呈峰形式的大聚集體。因為僅可偵測到小 聚集體，所以在噴霧乾燥過程中未見IEF凝膠之實質改 變。 •在超濾過程中，蛋白質濃度增加，而所有其他溶質 (NaC卜Na3P〇4& Pluronic® F68)均維持其原始濃度。可在 喷霧乾燥之調配物的X射線繞射圖中觀察到此改變之一個 β 景夕響。在喷霧乾燥之後蛋白質為完全非晶形，因此由氣化 鈉產生之結晶峰實質上縮小。除由小液滴中之較高固體量 造成傾向於較大粒子外，未偵測到對粒子形態之任何影 響。 在無任何賦形劑之情況下喷霧乾燥濃縮物5〇.6 mg/mL亦 導致極高粒子污染。與喷霧乾燥之濃縮物12.4 mg/mL相 比，25 μηι以下之所有粒子溶離份均含有較高量之粒子。 _ 藉由在喷霧乾燥之前添加賦形劑，應可改善該等結果。 如在穩定性測試中，對於濃縮物12.4 mg/mL而言以等於25 mM混合物之質量比添加賦形劑。 山梨糖醇之添加 根據濃縮物12.4 mg/mL之25 mM混合物，以〇.35:i之山 4糖醇.MAK 195F質量比添加山梨糖醇。喷霧乾燥之混合 物的粉末產率為約6〇%。粉末具有2〇。〇之1^及23%之含水 量。該等值廣泛符合具有濃縮物124 mg/mL之類似混合物 所獲得之結果（67%粉末產率，2 〇% RH，丁『19它）。將喷 137663.doc -98- 200944245 霧乾燥粉末再溶解產生澄清、幾乎無色溶液，其具有最接 近參考溶液B2之顯色（略帶棕色），正如初始maK 195F濃 縮物 50.6 mg/mL—般。 喷霧乾燥之後’再溶解粉末展示較小聚集增加。與純濃 縮物50.6 mg/mL之約1 %聚集水平相比，sec顯示1.3%之聚 集水平。此外，與添加有25 mM山梨糖醇之喷霧乾燥濃縮 物12.4 mg/mL相比，此無實質改變。
如DLS結果所示，不溶性聚集體之量大體上並未增加。 偵測到10 nm之流體動力學直徑下之清晰單體峰以及微米 尺寸下之聚集峰。當液體饋料之固體含量增加28倍時’ 再溶解粉末之顯微鏡下可見粒子污染增加。詳言之，小粒 子溶離份（<1〇 μπι)展示極高污染程度，而大粒子（>1〇 μπι) 之數目保持在類似於較低濃度溶液之水平上。 改變液體饋料中之蛋白質濃度僅對粒子形態具有較小影 響。該等粒子展示凹入圓冑之典型频，但似乎傾向於較 大粒子。因為每毫升含有12.4毫克阿非莫單抗之溶液的粒 徑為約2.5叫至13 μιη，所以將較高濃度溶液噴霧乾燥部 分地產生大於15 μιη之粒子。 海藻糖之添加 根據穩定性測試系列採用〇.7:丨之賦形劑：μακ丨〇5ρ比 率’對於濃縮物12·4 mg/mL而言使用25福賦形劑添加。 此實驗中賦形劑之量比山梨糖酵實驗中高，因為作為雙酶 之海•糖具有山梨糖醇(單醣)約兩倍高的分子量 料溶液之㈣含量的此增加使其難以獲得與先前喷霧乾』 137663.doc •99- 200944245 實驗中同樣高之粉末產率。噴霧乾燥具有高固體含量之溶 液產生堵塞高效旋風分離器之粉末出口的風險，且產率降 至50〇/〇以下（在此實驗中為約45%)。由於高靜電荷，故粉 末難以處理。其具有3.6%之含水量及約66°C之Tg，在某種 程度上與類似低濃度混合物一致（3.3% RH，Tg=56°C )。再 ✓合解之喷霧乾燥粉末具有最接近略帶棕色之參考溶液B2之 顯色。 海薄糖之穩定可能性良好。在SEC層析圖中不可债測到 可溶性聚集體之增加；聚集維持於1%之水平，不可與原 始濃縮物50.6 mg/mL區分。如DLS檔案中可見，不溶性聚 集體之量亦極低’展示單體峰及由微米尺寸下之峰所表示 之少量大聚集體。 與較低濃度混合物（具有海藻糖之濃縮物12.4 mg/mL)相 比’顯微鏡下可見粒子污染較高。此可藉由高固體含量說 明’其固體含量為使用MAK 195K濃縮物12.4 mg/mL之混 合物的約3倍高。 液體饋料中蛋白質濃度及固體含量之改變對粒子形態不 具有大的影響。除更大濃度粉末中經分離較大粒子之外觀 外’粒子形狀不展示任何實質改變。 廉糖之添加 為維持0.7:1之蔗糖：MAK 195F的質量比（類似於濃縮物 12.4 mg/mL及25 mM賦形劑），用於每一喷霧乾燥實驗之蔗 糖的量必須增加4.08倍（50.6/12.4)。如上文使用此質量比 可見’達成在噴霧乾燥過程中之幾乎全部蛋白質保存。包 I37663.doc 200944245 含此高固體量之溶液之喷霧乾燥產生堵塞具有極小直徑之 旋風分離器粉末出口的風險，尤其對於高效旋風分離器而 言。因此’粉末產率有時降至5〇%以下，而對過程穩定性 不具有任何影響。 因為濃縮物50.6 mg/mL具有與原始濃縮物12.4 mg/mL不 同之顯色’所以預期基於較高濃度之蛋白質溶液的再溶解 之喷霧乾燥粉末亦展示顯色。海藻糖混合物具有最接近略 帶棕色之參考溶液旧之顯色。 聚集保持在1 °/。之水平上，確實與液體濃縮物50 6 mg/mL或甚至原始濃縮物12.4 mg/mL無差別。 DLS分析展示在約1〇 nm流體動力學直徑下之單體峰及 表示少量大聚集體之熟知之微米尺寸下之的小聚集峰。與 低濃度混合物相比’在整個所有粒度溶離份中，顯微鏡下 可見粒子污染略高。 粒子形態與包含相同賦形劑：ΜΑκ 195F比率之先前實驗 中獲得之結果並無不同。由於液體饋料中之較高固體含 量’故觀察到一些經分離較大粒子，其在較低濃度調配物 中不存在。粉末之殘餘水分為26% ’調配物之Tg為約 60 C。兩值均可與在穩定性測試中類似低濃度調配物獲得 之彼等值（2.6% RH，Tg=63°C)相比較。 小結 使液體饋料之蛋白質濃度增加至5〇 6 mg/mL對所得粉末 不具有任何實質影響。幾乎所有分析測試均產生與使用具 有相等賦形劑：MAK 195F質量比之濃縮物12.4 mg/mL之喷 137663.doc •101- 200944245 霧乾燥實驗類彳# w 的…果。因此賦形劑之穩定可能性取決於 賦形劑：MAKl95Ft量比而不取決於莫耳比。 如同使用低濃度液體饋料（12 4叫滅)之實驗中一般， 海薄糖及餘關於㈣莫單抗之健㈣期間的過程穩定 ! 生產生幾乎相同之結果。尤其在聚集中，使用山梨糖醇以 穩定抗W段展示略差結果。高濃度粉末之咖比較展示 "、實質差異所有混合物均展示無額外譜帶（大聚集體）之 原始阿非莫單抗譜帶圖案。 ❿ 根據不同量之賦形劑，在WAXD圖中存在顯著差異。因 為所有所用之糖（以及蛋白質）在喷霧乾燥後為完全非晶 形’所以作為主要結晶成份之氣化鈉的量控制結晶峰之外 觀。阿非莫單抗濃縮物12 4 mg/mL具有38% w〜之氣化鈉 濃度（關於固體）’其在32。之20處展示清晰氣化鈉峰。在噴 霧乾燥之濃縮物中，氣化鈉濃度為約14% w/w，使得結晶 峰高度降低。藉由添加料賦形劑之㈣糖及㈣，氣化 鈉浪度降至9%之值。因此，結晶峰不再遮蔽由蛋白質及 穩定劑產生之非晶形暈。因為山梨糖醇之質量比低於雙醣 之質量比，所以在山梨糖醇混合物之WAXD圖中仍可見氣 化鈉之結晶峰。 張力計算 因為最初形成阿非莫單抗濃縮物且其經調配用於非經腸 投藥，所以等張性為重要因素。Reinhart等人，CWi 29(4):765-769 (2001)。用於靜脈内應用之溶液應 具有大致與血液相同之滲透壓（286 m〇sm〇1/kg)。 137663.doc 102· 200944245
Kommentar zum Europaischen Arzneibuch, Wiss. Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH，Band 2 (5.2) (2006)。可 使用來自 Deutscher Arzneimittelcodex, dt. Apotheker Verlag Stuttgart, Band 1 ( Anlage B)，1-6 (2006)之以下方 程式經由冰點降低計算滲透壓： 1% (w/V)溶液之冰點降低的計算： AT = 心張.1〇
Mr
混合物之ΔΤ的計算： AT =ΣΑΤ 混合物 混合物之滲透壓的計算： 2%6mosmol / kg * 合物- 0.52°c 在以上方程式中，ΔΤ表示與純水相比物質之1°/。（w/V)溶 液的冰點降低，Lw為等張濃度下之冰點降低，且Mr為分 子量。不同電解質之L»*值不同（參見表11)。因為血清之 冰點降低為〇.52°C(等於286 mosmol/kg之滲透壓），所以與 純水相比混合物之1%溶液之冰點降低的值不應超 過0.52°C。具有高分子量之阿非莫單抗對調配物之冰點降 低不具有實質影響，因此其不包括於計算中。 表11 物質 L等％ 實例 非電解質 1.9 蔗糖、海藻糖、 山梨糖醇 單單價電解質 3.4 NaCl 單三價電解質 5.2 Na3P04 137663.doc -103- 200944245 使用該等方程式，不同濃縮物及混合物產生表12中給出 之滲透壓之計算值。 表12 調配物 計算之渗透麈丨_smol/kg】 ί農縮物 12.4 mg/mL 306 濃縮物12.4 mg/mL+25mM山梨糖醇 320 濃縮物12.4 mg/mL+25mM海藻糖 332 漢縮物12.4 mg/mL+25mM簾糖 332 浪縮物50.6 mg/mL 306 濃縮物50.6 mg/mL+山梨糖醇 361 濃縮物50.6 mg/mL+海藻糖 412 濃縮物50.6 mg/mL+蔗糖 412 漢縮物100 mg/mL 307 濃縮物100 mg/mL+山梨糖醇 504 漢縮物100 mg/mL+海藻糖 517 泼縮物100 mg/mL+蔗糖 517 為維持生理滲透壓，當使用較高濃度之MAK 195F溶液 時，需降低氣化鈉之量。原始氯化鈉濃度為8.8 mg/mL。 使用在此研究中估計之賦形劑：MAK 195F質量比（於濃縮物 12·4 mg/mL中之25 mM賦形劑），可將蛋白質濃度提高至約 130 mg/mL，其限制條件為自調配物移除所有氣化鈉。此 產生約300 mosmol/kg之滲透壓。 小結 此研究表明包括喷霧乾燥之製備抗體粉末之例示性方 法。特定言之，在此實例中，將IgG片段；阿非莫單抗 =MAK 195F溶液轉化成乾燥塊狀材料。藉由篩選各種賦形 劑及加工條件，開發提供過程穩定性與儲存穩定性之噴霧 乾燥過程。 藉由使用可偵測蛋白質之物理或化學降解之各種方法來 分析穩定性，例如經由SEC及DLS分析可溶性及不溶性聚 137663.doc • 104- 200944245 集’經由DSC分析熱事件及 燥粉末的满度。降解如歸阳 費雪滴定分析喷霧乾 Π來=溫下t期館存之結果。藉由將糖添加至蛋白 糖、A gG片&。在乾燦及後續儲存期間研究海藻 庶糖及山梨糖醇之穩定可能性。 ❹ ❹ 研&之第σ|5^中’表徵蛋白質濃縮物且接著將其在 何賦形劑之情況下噴霧乾燥以檢查乾燥過程中濃縮物 之敏感性。此外’進行測試系列以㈣恰當過程參數。喷 霧乾燥純濃縮物對蛋白質產生損傷。聚集增加顯著(約 )尤八田计劃後續儲存時。改變應有助於降低聚集 或得到出現最小聚集之過程參數。 ^ 噴霧乾燥過程中之蛋白質損傷似乎係歸因於不同應力因 素（例如’熱、霧化、剪切力）之相互作用。該等應力因素 均不能單獨導致可與喷霧乾燥過程相比之蛋白質變質。 將穩定糖以介於10 111]^與15〇爪厘之間的各種濃度添加至 蛋白質濃縮物中。150 mM似乎不適當，因為液體饋料之 固體含量極高以致於旋風分離器易於阻塞，其導致低粉末 產率。對於所有經測試糖而言，丨〇 mM賦形劑之添加並不 夠。藉由添加25 mM而獲得最佳結果，其相當於對於海藻 糖及薦糖而言賦形劑：MAK 195F質量比為0.7:1且對於山梨 糖醇而言賦形劑：MAK 195F質量比為0.35:1。50 mM產生 類似結果’但目的為在可能程度上降低添加劑之量。比較 喷霧乾燥過程之穩定可能性，海藻糖與蔗糖產生類似結 果。山梨糖醇似乎略次於雙醣。但在小質量比中並未發現 137663.doc 200944245 此現象纟中更多山梨糖醇之添加不會改善結果 mi /re 3¾ 程穩疋性，推薦較佳添加25祕之海藻糖或廉糖 σ物對於過程穩定性最有效，所以將其用 於紐期穩疋性測試（3個月）。連同類似安慰劑混合物及液體 ^縮物起’使喷霧乾燥粉末暴露於3種不同常用氣候（冰 箱 5 C ’ 中歐· 25 C/60% RH，東南亞：45。〇/75% RH) 下。如所預期，液體濃縮物不可經受任何高溫，其在1個 月之後產生嚴重蛋白質損傷（聚集、斷裂及光學混濁）。具 有賦形劑之喷霧乾燥粉末經3個月仍展示良好穩定性。當 儲存於4(TC/75% RH下時海蒸糖以及廉糖調配物僅遭受實 質損傷（聚集增加2%)。除較小聚集增加（〇5%)外甚至 2—5以6〇% RH亦對粉末不具有影響。作為所涉及之過程穩 定性之結果’山梨糖醇亦為儲存期間之最弱穩定劑。在 5。(：及25t下儲存之具有其他賦形劑的混合物具類似穩定 性’但對於山梨糖醇·蛋白f混合物而言贼為臨界參 數。贼超過混合物之Tg ’因此不再能保證由蛋白質固定 產生之儲存穩定性。此導致約12%之聚集增加其在此研 究之任何初步測試中均未觀察到。顯微鏡下可見粒子及 度量測產生令人不滿意之結果。該等樣品主要展示視 濁或甚至凝聚。穩定性研究之主要問題為用於儲存粉末i 小銘瓶。其未展示完全之水蒸氣不可渗透性，因此吸 末之殘餘水分含量不可保持恆定。 、乃 在敏感性調配物之情況下’可將幾乎所有蛋白質改 至最小程度。仍展*實質改變之唯—參數為濁度。未錄 137663.doc -106- 200944245 存、但喷霧乾燥過程導致濁度增加。試圖藉由添加更多賦 形劑或使用較低乾燥溫度來降低此增加並未成功。不可避 免濁度由約5 NTU(濃縮物）增加至15_2〇 NTU(喷霧乾燥之 混合物）。在喷霧乾燥蛋白質_糖調配物期間，其他分析方 法不展示實質改變。 在此研究之最後部分中，液體饋料中之蛋白質濃度隨達 成喷霧乾燥器之較高生產量之目的而增加。進行蛋白質濃 度為50.6 mg/mL之情況下的實驗。超濾以及噴霧乾燥更大 β 濃度之蛋白質溶液（具有經鑑別最佳質量比之糖添加劑）的 過程對阿非莫單抗蛋白之穩定性不具有實質影響。大多數 結果（除粒子污染或濁度外，根據較高固體含量）可與在濃 縮物12.4 mg/mL之情況下的類似實驗相比》若可防止旋風 为離器出口之堵塞，則1〇〇 mg/mLi濃度的喷霧乾燥應可 行°甚至可在不產生低滲壓或高滲壓之風險的情況下非經 腸投與更大濃度之粉末，此係因為原始緩衝液含有足夠氣 p 化鈉，其可與穩定劑交換移除。高達130 mg/mL之蛋白質 濃度可為可能的。 抗體調配物之組合物 如先前所述用Bttchi小型喷霧乾燥器B-19i進行噴霧乾燥 實驗。簡言之，使乾燥空氣經由Luwa超濾器2(纖維玻璃； 過濾材料種類：HEpA H13)過濾，隨後進入加熱裝置及乾 燥腔室中。使所有液體饋料經由0.22 μπι過濾單元過濾， 隨後藉由碟動泵傳輸至乾燥腔室（QLF=約3 mL/min ;矽管 0一3 mm)。使用乾燥氮氣（Qaa=7〇〇 Ι/h)藉由雙流體噴嘴進 137663.doc 200944245 行霧化。喷霧乾燥之後，將所得粉末自收集容器回收且填 充於玻璃小瓶（溴丁基橡膠塞）中，用封口膜密封。組合物 概述於表13中。藉由使用UV/VIS、SEC、IEC、PCS、 DSC、XRD及卡爾-費雪方法進行蛋白質表徵。 表13
磷酸鈞 氣化鈉 組胺酸 海藻糖 泊洛尼克 (Pluronic)F68 MAK 195F 95 mg/mL 1.64 mg/mL 8.77 mg/mL — 65.58 mg/mL 0.1 mg/mL 阿達木單抗100 mg/mL — — 2.33 mg/mL 69.03 mg/mL 0.1 mg/mL ABT-325 100 mg/mL — — 2.33 mg/mL 69.03 mg/mL 0.1 mg/mL 如以上所討論，使用MAK 195F作為模型化合物使用12 mg/mL·之濃度評估調配物及過程參數。圖10包括兩個描述 喷霧乾燥之MAK 195F調配物之SEC物理穩定性資料的柱 形圖：（A)山梨糖醇、海藻糖及蔗糖之影響（c=25 mM)及 (B)在40°C/75 RH下儲存3個月之後穩定劑濃度對蛋白質聚 集量的影響。圖10A中給出之資料揭示海藻糖及蔗糖提供 最穩定產品，而山梨糖醇不提供適當長期蛋白質穩定性。 在25 mM(相當於賦形劑··蛋白質之質量比為〇.7:1)下測定穩 定劑之最小量（參見圖10B)。在圖10A中，各組中之條柱由 左至右分別表示MAK 195F(塊體）、MAK 195F+山梨糖 醇、MAK 195F+海藻糖及MAK 195F+蔗糖。在圖10B中， 各組中之條柱由左至右分別表示山梨糖醇、海藻糖及蔗 糖。 藉由使用在12 mg/mL、50 mg/mL及100 mg/mL範圍内之 蛋白質濃度再現該等參數。所有調配物均提供可接受之粉 137663.doc • 108 · 200944245 末。表14中所示之平均殘餘水分在4.6重量％(MAK 195F) 與5.5重量％(阿達木單抗）之間，且因此與典型值低於1%之 凍乾調配物相比顯著更高。然而，量測MAK 195F之玻璃 轉移溫度為60°C且對於兩種完整抗體而言約為70°C，表明 至少在5°C儲存溫度下之合適穩定性《該等高濃度（100 mg/mL)喷霧乾燥之MAK 195F、阿達木單抗及ABT-325調 配物之初步分析資料呈現於圖11中。圖11具有兩個柱形 圖，其描述在200 mM海藻糖溶液中對於喷霧乾燥之高濃 ❹ 度MAK 195F、阿達木單抗及ABT-325而言（A)加工及在 40°C/75% RH下儲存3個月對藉由使用SEC方法得到之物理 穩定性的影響，及（B)加工及在40°C/75% RH下儲存3個月 對藉由IEC方法測定之化學穩定性（加工後標準化為100%) 的影響。在圖11A中，各組中之條柱由左至右分別表示 MAK 195F(95 mg/mL，經喷霧乾燥）；阿達木單抗（1〇〇 mg/mL，經喷霧乾燥）；ABT-325(100 mg/mL，經喷霧乾 燥）；及ABT-325(100 mg/mL，經凍乾）（無 ABT-325(100 mg/mL，經凍乾）之1個月儲存資料且無MAK 195F(95 mg/mL，經噴霧乾燥）之3個月儲存資料）。 表14 調配物 殘餘水分 ί重量％1 Tg 【°CI 經噴霧乾燥之MAK 195F _ 95 mg/mL_ 4.58 59.3 經喷霧乾燥之阿達木單抗 100 mg/mL 5.46 70.4 經喷霧乾燥之ABT-325 100 mg/mL 4.88 71.3 經凍乾之ABT-325 100 mg/mL 0.29 — 137663.doc •109- 200944245 所有測試調配物之資料均證實蛋白質在加工及在4〇〇c下 儲存至多3個月期間之可接受的物理穩定性，與ABT_325 凍乾物等效。然而，相應PCS資料（未圖示）表明對蛋白質 特徵之影響，其必須更詳細地分析。關於化學穩定性，圖 UB甲之資料證實喷霧乾燥調配物與標準冷凍乾燥調配物 相比類似之結果。在圖ΠΒ中，各組中之條柱由左至右分 別表示ΑΒΤ·325(100 mg/mL，經噴霧乾燥）、abt_325(1〇〇 mg/mL ’經滚乾）及阿達木單抗（1 〇〇 mg/mL，經嗔霧乾 ❹ 燥）。 小結 此證實由具有至多100 mg/mL之濃度的mAb溶液成功製 4喷霧乾燥抗體粉末的一般可行性。MAK 195F、阿達木 單抗及ABT-325之呈示資料既不展示在加工期間亦不展示 在加速穩定性研究期間關於蛋白質之物理或化學穩定性之 顯著影響。然而，應更詳細地分析所觀察到之喷霧乾燥蛋 _ 白質的多分散性》 此外，調配物内需要充足量之穩定劑以達成長期儲存。 然而，由於此技術之通用性，其提供關於塊狀藥 物調配物 以及關於新穎劑型及投藥途徑之有趣前景。 以引用的方式併入 整個本申請案中可引用之所有引用參考文獻(包括文獻 參考、專利、專利申請案及網站)的内容係以引用的方式 明確併入本文中。除非另外指出，否則本發明之實施將利 用在此項技術中熟知之喷霧乾燥及蛋白質冑配之習知技 137663.doc -110· 200944245 術。 等效物 僅使用常規實驗，熟習此項技術者將識別或能夠確定本 文中所述之本發明之特定實施例的眾多等效物。該等等效 物意欲涵蓋於以下申請專利範圍中。在整個本申請案中所 引用之所有參考文獻、專利及公開之專利申請案的内容均 • 係以引用的方式併入本文中。 【圖式簡單說明】 © 圖1描述如實例中所用之Biichi喷霧乾燥器B-191 ; 圖2描述不同山梨糖醇-MAK混合物之產率及Tg ; 圖3描述不同山梨糖醇-MAK混合物之聚集、結晶度及含 水量； 圖4提供山梨糖醇-MAK混合物之掃描電子顯微鏡（SEM) 影像（3000倍）：（a)25 mM，（b)100 mM ; 圖5描述不同海藻糖-MAK混合物之產率及Tg ; 圖6描述不同海藻糖-MAK混合物之聚集、結晶度及含水 量； 圖7提供海藻糖混合物之SEM影像（3000倍）：（a) 10 mM海 ' 藻糖，（b) 100 mM海藻糖，及（c)喷霧乾燥之純海藻糖； • 圖8描述不同蔗糖-MAK混合物之產率及Tg ; 圖9描述不同蔗糖-MAK混合物之聚集、結晶度及含水 量； 圖10描述噴霧乾燥之MAK 195F調配物的大小排除層析 法（SEC)物理穩定性資料：（A)山梨糖醇、海藻糖及蔗糖之 137663.doc -111 - 200944245 影響及（B)穩定劑濃度對蛋白質聚集量之影響；及 圖11描述對於喷霧乾燥之高濃度MAK 195F、阿達木單 抗及ABT-325於200 mM海藻糖中之溶液而言加工及3個月 儲存對（A)物理穩定性及（B)化學穩定性之影響。 【主要元件符號說明】 2 3 參 4 5 6 7 高效旋風分離器 Luwa超渡器 加熱裝置 乾燥腔室 蠕動泵 雙流體喷嘴 收集容器
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Claims (1)

  1. 200944245 七、申請專利範園： 1' 種製備蛋白質或狀粉末之方法’該方法包含以下步 驟： 將一種包含大於約50 mg/mL之蛋白質或肽及至少一種 賦形劑的溶液喷霧乾燥，以製備蛋白質或肽粉末。 2. 如咕求項】之方法，其中該溶液包含大於約】〇〇 l之 該蛋白質或肽。 3. 如刚述請求項中任—項之方法，其包含製備抗體粉末， 其包含： 將—種包含大於約50 mg/mL之抗體或其抗原結合部分 4. 及至少-種賦形劑的溶液喷霧乾燥，以製備抗體粉末。 如請求項3之方法，其中該溶液包含大於約100 mg/mL之 該抗體或其抗原結合部分。 月求項3或4之方法’其中該抗體或其抗原結合部分為 免疫球蛋白G(IgG彡。 6·如請求項3至5中任一頂夕士、+ $ <方法’其中該抗體或其抗原結 合部分為MAK 1 95F、阿達木單抗（Adalim_b)、ABT- 325 ' ABT-308或 ABT-147。 其中該粉末在周圍溫度 其中該粉末在40°C下穩 7·如前述請求項中任一項之方法 及濕度下穩定至少三個月。 8.如前述請求項中任一項之方法 定至少三個月。 9·如前述請求項中任一 ^ 方法’其中該賦形劑為海藻 糖、蔗糖、山梨糖醇、 眾乙二醇、至少一種胺基酸、組 137663.doc 200944245 胺酸、丙胺醆、精胺酸、甘胺酸或其混合物。 ίο.如前述請求項_任一瑁之古、土 項之方法，其中該溶液包含介於約 0.27:1.0與約2_8:1 〇之間的賦形劑：蛋白質比率。 U.如前述請求項中任一項之方法’其中該溶液包含介於約 0.27:1.0與約in』之間的賦形劑：蛋白質質量比。 A如前述請求項中任-項之方法，其中該溶液包含介於約 0.27:1.0與約〇.7:1.〇之間的賦形船蛋白質質量比。
    如前述請求射任-項之方法，其中該溶液包含約〇7: 1.0之賦形劑：蛋白質質量比。 14. 如前述請求項中任—項之方法，其中該溶液包含介於約 20 mM與約30 mM之間的賦形劑。 15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含約25 mM之賦形劑。 16. 如前述請求項中任一項之方法，其包含用介於約i〇〇c>c與 約180°C之間的入口空氣溫度（Ta)及介於約6〇χ：與約 ll〇°C之間的出口空氣溫度（Ti〇進行喷霧乾燥。 17. 如前述請求項中任一項之方法，其包含用約13〇艽之丁八 及約80°C之1^進行喷霧乾燥。 18. 如前述請求項中任一項之方法，其中嘴霧乾燥包含： 霧化該溶液以形成溶液小液滴； 用氣體乾燥該等小液滴以形成粉末；及 自該氣體回收該粉末。 19. 如凊求項18之方法，其包含用一個壓力喷嘴霧化器霧化 該溶液》 137663.doc -2 - ❿ 參 200944245 20. 如請求項18或19之方法 —自該氣體分離且回收該抗體 21. -種製備醫藥組合物之方法 據前述請求項中任—項製備粉含Μ步驟··根 • 製備泰末，及將該抗體粉末與醫 樂學上可接受之載劑混合。 本兴醫 22. 如請求項21之方法，其中該醫 非經腸、經口、腸內$ 了接又之載劑可為 腸内或局部投與所接受。 23. 如請求項21或22之方法，其中該 六丁晉樂學上可接受之恭 包含液體。 』按又之載劑 24. 如請求項21、22¾ 23之古、土 ^ . ㈣w。 ㈣之方法，其中該醫藥學上可接受之 載劑包含水。 25. —種醫藥製劑，其包会右 丹匕3有效量之根據前述請求項中任一 項製備之抗體或其抗原結合部分。 26. —種醫樂製劑，其自合右放县+ 4日& 并巴3有效量之根據請求項1至24中任 一項製備之蛋白質或肽。 27. -種穩定粉末組合物，其包含蛋白f或肽及賦形劑，其 中該組合物包含小於約6%之殘餘水分。 28. 如請求項27之組合物，其中該蛋白質或肽包含抗體或其 抗原結合部分。 29. 如請求項28之組合&，其中該抗體或其抗原結合部分為 IgG抗體》 30. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該抗體或其抗原 結合部分為MAK 195F、阿達木單抗、ABT_325、ABT_ 308或 ABTM47。 137663.doc 200944245 31. 如前述請求項_任一項之組合物，其中該粉末組合物在 周圍溫度及濕度下穩定至少3個月。 32. 如前述請求項中任―項之組合物，其中該粉末組合物在 40°C下穩定至少3個月。 33.如前述請求項中任一項之組合物，其中該賦形劑為海藻 糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組 胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。 ❹
    34. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該組合物具有約 0.27:1.0至約 2.8:1.〇、約 〇 27:1 〇至約】4:1 〇、約 〇 27: ^ 〇 至約〇·7:1.0或約〇·7:1之賦形劑與抗體或其抗原結合部分 的質量比，且其中該賦形劑為海藻糖或蔗糖。 35. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該組合物具有約 0.27:1.0至約 2.8:1.0、約 0.27:1〇至約 14:1〇、約 〇 27: ι 〇 至約0.7丄〇、約0.7:1或約〇.35:1之賦形劑與抗體或其抗 原結合部分的質量比，且其中該賦形劑為山梨糖醇。 36. 如前述請求項中任-項之組合物，其中該粉末之殘餘水 分含量小於約3%。 37. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該蛋白質或肽或 抗體或其抗原結合部分保留其生物活性。 38. -種製造醫藥組合物之方法，該方法包含以下步驟： 將有效量之如前述請求項中任—項之穩定粉末組合物 與醫藥學上可接受之載劑混合。 39·如請求項38之方法，其中該載劑包含液體。 40.如請求項38或39之方法’其中該載劑包含水。 137663.doc 200944245 &如前述請求項中任-項之製造方法，其中該醫藥組合物 適於非經腸、經口、腸内或局部投與。 :別述清求項中任一項之製造方法，其包含在高於周圍 溫度之溫度下進一步加工該穩定粉末組合物不顯著影 響該等粉末組合物之穩定性。 43. 如前述明求項中任一項之製造方法，其包含溶融擠出該 • 穩定粉末組合物。 其包含塗佈該粉末 44. 如前述請求項中任一項之製造方法 ❹ 組合物。 45·如:述π求項中任—項之製造方法，其包含用pLGA塗 佈《亥如末組合物以形成持續釋放或延遲釋放醫藥組合 物。 46. 如前述請求項中任一項之製造方法，其包含用腸 佈。 47. 如前述請求項中任—項之製造方法，其中該蛋白質、 ❿ 肽、抗體或其抗原結合部分之活性係由該賦形劑保護以 避免有機溶劑引起之沈澱、變性或氧化。 48. 如前述請求項中任—項之製造方法，其中該蛋白質、 二：t其抗原結合部分之活性係由該賦形劑保護以 乙醇、DMS0、驗或冰醋酸引起之、、尤 澱、變性或氧化。 & 49. -種醫藥組合物，其係根據前述方法請求項 備。 項取 137663.doc
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