TW201603833A - 粉末蛋白質組合物及其製法 - Google Patents

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麥克 賽得勒
彼得Ｋ 萊斯那
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Abstract

本發明提供一種製備蛋白質或肽粉末之方法，其包括將一種包括大於(例如)約50mg/mL之蛋白質或肽(例如抗體或其抗原結合部分)及至少一種賦形劑之溶液噴霧乾燥。本發明亦提供包括蛋白質及賦形劑之穩定粉末組合物，其具有小於(例如)約6%之殘餘水分。

Description

粉末蛋白質組合物及其製法
醫藥蛋白質調配物之基本原則為必須克服某些不穩定性。可將蛋白質之降解路徑分成兩種不同類別，其包括化學不穩定性及物理不穩定性。化學不穩定性經由鍵形成或裂解產生對蛋白質的修飾。化學不穩定性問題之實例包括去醯胺、外消旋、水解、氧化、β消除及雙硫鍵交換。另一方面，物理不穩定性不會導致蛋白質中共價改變。相反地，其涉及蛋白質之高次結構(二級及二級以上結構)的改變。該等改變包括變性、吸附至表面、聚集及沈澱。Manning等人，Pharm.Res.6,903(1989)。
在Watson及Crick(1953年)發現DNA結構及後續完成人類基因圖譜定序計劃之後，對蛋白質化學之關注極速增長。尤其關注在疾病、組織或發育中基因與其蛋白質產物之間的關係。Next generation pharmaceutical，第6期(GDS publishing Ltd.,2006)。經過其間幾十年，基於蛋白質之藥物的數目快速增加。現今，可分離或合成、修飾及傳遞某些蛋白質或肽以減輕或治癒某些病症及疾病。基於蛋白質之藥物的主要施用路徑仍為液體調配物之靜脈內注射，但亦已測試及使用其他路徑。
已進行許多努力以將蛋白質溶液轉換成固體形式。粉末組合物提供許多優勢，例如可藉由涉及更小空間及重量而儲存或運輸較大量 之蛋白質，且能量消耗低於在儲存及航運期間冷卻液體調配物所需之能量消耗。粉末組合物亦有利於新穎傳遞途徑，諸如吸入(Tzannis等人，國際公開案第WO 2005067898號)或無針注射(Burkoth，The Drug Delivery Companies Report 76-78(2001))。已使用若干種方法以自蛋白質水溶液產生粉末，尤其噴霧乾燥、噴霧冷凍乾燥、冷凍乾燥或自超臨界流體或(部分)有機溶液中沈澱。Winters等人，Journal of Pharm.Sci.85(6)：586-594(1996)。與極昂貴且耗時之冷凍乾燥相比，噴霧乾燥為產生負載蛋白質之固體的有效、高效方法，該等固體為開發生物藥物新穎傳遞形式(諸如吸入)提供機會。Maa等人，Pharm.Res.16(2)：249-254(1999)。
噴霧乾燥純蛋白質溶液有導致部分失活之風險，其自動產生較低品質之藥物。失活可能(例如)係由歸因於高溫、剪切應力及大的相界面(液體/氣體)之過程相關之物理應力(諸如變性或聚集)或由化學反應(例如水解或氧化)引起。
本發明係關於將包含蛋白質及賦形劑之蛋白質調配物噴霧乾燥的方法。特定言之，本發明之方法及組合物係基於將含有所關注之蛋白質及賦形劑之溶液噴霧乾燥的噴霧乾燥過程。
本發明之調配物具有許多優於標準溶液及冷凍乾燥調配物之優勢。詳言之，本發明之噴霧乾燥方法在周圍溫度下將過程相關之降解降至最低且增加蛋白質穩定性(例如，與冷凍乾燥之組合物相比)。此外，噴霧乾燥之調配物亦更易於運輸且適用於製造高濃度調配物、改良蛋白質之生物可用性及開發局部釋放(例如，肺部傳遞)及持續釋放(例如，脂質體及(聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯))PLGA塗佈之微球體)調配物。
本發明之方法及組合物可用以提供包括任何所關注之蛋白質及 賦形劑的穩定粉末組合物或調配物。在一態樣中，將本發明之方法及組合物用於抗體及其片段，包括用於活體內及活體外目的之彼等方法及組合物。在另一實施例中，抗體片段為免疫球蛋白G(IgG)片段。
此外，製備蛋白質及肽調配物所必需之多步驟純化及濃縮方法通常在組成中引入可變性，以致於各批之間調配物之精確組成可能有所改變。聯邦條例要求無論製造地點或批號，藥物調配物中之藥物組成應高度一致。本發明之方法可用以產生添加有精確量賦形劑之蛋白質的粉末調配物，進而產生具有精確濃度之賦形劑之蛋白質調配物。
在一態樣中，本發明提供一種製備蛋白質或肽粉末之方法，該方法包括將包含大於約50mg/mL之蛋白質或肽及至少一種賦形劑之溶液噴霧乾燥，以致製備蛋白質或肽粉末。在一些實施例中，該溶液包含大於約100mg/mL之蛋白質或肽。蛋白質亦可為雙可變結合域(DVD)結合蛋白。
在一些實施例中，該方法包括製備抗體粉末，其包括將包含大於約50mg/mL之抗體或其抗原結合部分及至少一種賦形劑之溶液噴霧乾燥，以致製備抗體粉末。在一些實施例中，溶液包含大於約100mg/mL之抗體或其抗原結合部分。抗體或其抗原結合部分可為免疫球蛋白G(IgG)，例如MAK 195F、阿達木單抗(Adalimumab)、ABT-325、ABT-308或ABT-147。在一些實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少3個月內係穩定的及/或在40℃下至少3個月內係穩定的。
賦形劑可包括(例如)海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。在一些實施例中，溶液包括介於約0.27：1.0與約2.8：1.0之間、介於約0.27：1.0與約1.4：1.0之間、介於約0.27：1.0與約0.7：1.0之間或約0.7：1.0之比率的賦形劑：蛋白質比。在一些實施例中，溶液包含介於約20mM與約30mM之間的賦形劑，或約25mM賦形劑。
在一些實施例中，方法包括用介於約100℃與約180℃之間的入口空氣溫度(T入)及介於約60℃與約110℃之間的出口空氣溫度(T出)噴霧乾燥。在某些實施例中，方法包括用約130℃之T入及約80℃之T出噴霧乾燥。該方法可包括(例如)霧化溶液以形成溶液小液滴、用氣體乾燥該等小液滴以形成粉末且自氣體中回收該粉末。該方法可包括用壓力噴嘴霧化器霧化溶液及/或用旋風分離器自氣體中分離且回收抗體粉末。
該方法亦可包括將抗體粉末包埋於醫藥學上可接受之載劑中。該醫藥學上可接受之載劑可為非經腸、經口、腸內及/或局部投與所接受。醫藥學上可接受之載劑可包括液體，諸如水。
在另一態樣中，本發明係針對一種醫藥製劑，該醫藥製劑包括有效量之根據本文中所述方法之任一者製備的抗體或其抗原結合部分。在另一態樣中，本發明係針對一種醫藥製劑，該醫藥製劑包括有效量之根據本文中所述方法之任一者製備的蛋白質或肽。
在另一態樣中，本發明提供一種包括蛋白質或肽及賦形劑之穩定粉末組合物，其中該組合物包括小於約6%之殘餘水分，在一些實施例中，組合物包括小於約4%或3%之殘餘水分。蛋白質或肽可包括抗體或其抗原結合部分，諸如IgG抗體或其抗原結合部分，諸如MAK 195F、阿達木單抗、ABT-325、ABT-308或ABT-147。蛋白質亦可為雙可變結合域(DVD)結合蛋白。
在一些實施例中，該粉末組合物在周圍溫度及濕度下至少3個月內及/或在約40℃下至少3個月內係穩定的。在一些實施例中，蛋白質或肽，或抗體，或其抗原結合部分保留其生物活性。
賦形劑可包括(例如)海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。組合物可具有約0.27：1.0至約2.8：1.0、約0.27：1.0至約1.4：1.0、約0.27：1.0至約 0.7：1.0或約0.7：1之賦形劑(例如，海藻糖及/或蔗糖)與抗體或其抗原結合部分之質量比。組合物可具有約0.27：1.0至約2.8：1.0、約0.27：1.0至約1.4：1.0、約0.27：1.0至約0.7：1.0、約0.7：1，或約0.35：1之賦形劑(例如，山梨糖醇)與抗體或其抗原結合部分之質量比。
在另一態樣中，本發明提供一種製造醫藥組合物之方法，該方法包括將有效量之本發明之穩定粉末組合物與醫藥學上可接受之載劑(例如液體，諸如水)混合。在一些實施例中，醫藥組合物適於非經腸、經口、腸內或局部投與。該方法可進一步包括在不顯著影響粉末組合物之穩定性的情況下在顯著高於周圍溫度之溫度下加工(例如，熔融擠出)穩定粉末組合物。
在某些實施例中，該方法包括(例如)用諸如PLGA之聚合物塗佈粉末組合物以形成持續釋放或延遲釋放醫藥組合物。另外或其他，該方法可包括用腸溶衣塗佈。在一些實施例中，蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分之活性係由賦形劑保護以避免由有機溶劑(例如PEG 400、乙醇、DMSO、NMP或冰醋酸)引起之沈澱、變性或氧化。
當前，幾乎所有公司均使用冷凍塊狀藥物組合物，且面對諸如冷凍及解凍狀態之重現性、賦形劑在塊狀藥物內出乎意料的結晶、冷凍期間緩衝液之pH值變化及由於解凍而造成之長滯後時間(例如在約37℃之溫度下2公升容器)之問題。使用噴霧乾燥之塊狀藥物組合物可避免該等問題。此外，噴霧乾燥之塊狀藥物組合物在混配最終藥物組合物期間極便於處理且允許製造寬泛濃度範圍。另外，僅添加水之噴霧乾燥藥物組合物可替代經典混配且因此降低藥物產品製造期間之風險，同時增加輸出能力。此外，全長/完全抗體與單株抗體(mAb)片段相比可能較不易於物理降解。另外，隨著蛋白質濃度增加至100mg/mL，物理或化學降解通常很少增加或不增加。因為較高濃度之溶液將增加該方法之效率，所以使用100mg/mL之蛋白質濃度將有益。
1‧‧‧高效旋風分離器
2‧‧‧Luwa超濾器
3‧‧‧加熱裝置
4‧‧‧乾燥腔室
5‧‧‧蠕動泵
6‧‧‧雙流體噴嘴
7‧‧‧收集容器
圖1描述如實例中所用之Büchi噴霧乾燥器B-191；圖2描述不同山梨糖醇-MAK混合物之產率及Tg；圖3描述不同山梨糖醇-MAK混合物之聚集、結晶度及含水量；圖4提供山梨糖醇-MAK混合物之掃描電子顯微鏡(SEM)影像(3000倍)：(a)25mM，(b)100mM；圖5描述不同海藻糖-MAK混合物之產率及Tg；圖6描述不同海藻糖-MAK混合物之聚集、結晶度及含水量；圖7提供海藻糖混合物之SEM影像(3000倍)：(a)10mM海藻糖，(b)100mM海藻糖，及(c)噴霧乾燥之純海藻糖；圖8描述不同蔗糖-MAK混合物之產率及Tg；圖9描述不同蔗糖-MAK混合物之聚集、結晶度及含水量；圖10描述噴霧乾燥之MAK 195F調配物的大小排除層析法(SEC)物理穩定性資料：(A)山梨糖醇、海藻糖及蔗糖之影響及(B)穩定劑濃度對蛋白質聚集量之影響；及圖11描述對於噴霧乾燥之高濃度MAK 195F、阿達木單抗及ABT-325於200mM海藻糖中之溶液而言加工及3個月儲存對(A)物理穩定性及(B)化學穩定性之影響。
本文中所揭示之方法及組合物之該等及其他特徵及優勢將藉由結合隨附圖式參考以下詳細描述而更充分理解。
I.定義
為使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。
如本文中所用，術語"酸性組份"係指具有酸性pH值(亦即小於7.0)之試劑(包括溶液)。酸性組份之實例包括磷酸、鹽酸、乙酸、檸檬酸、草酸、丁二酸、酒石酸、乳酸、蘋果酸、乙醇酸及反丁烯二 酸。
如本文中所用，術語"抗氧化劑"意欲意謂抑制氧化作用或充當抗氧化性增效劑且因此用以防止製劑因氧化過程而變質之試劑。該等化合物包括(例如但不限於)α生育酚(維生素E)、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酯、檸檬酸、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、依地酸(EDTA，乙二胺四乙酸鹽)及其鹽、氫亞磷酸(hydrophosphorous acid)、蘋果酸、單硫代甘油、丙酸、沒食子酸丙酯、甲硫胺酸、抗壞血酸鈉、檸檬酸鈉、硫化鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉及一般技術者已知之其他化合物。
除非本文中另外指出，否則術語"組合物"及"調配物"可互換使用。
術語"賦形劑"係指可添加至調配物中以提供所要稠度(例如改變塊體特性)、改良穩定性及/或調節滲透重量莫耳濃度(osmolality)之試劑。常用賦形劑之實例包括(但不限於)穩定劑、糖、多元醇、胺基酸、界面活性劑、螯合劑及聚合物。
如本文中關於組合物(例如，水性調配物)所用之術語"藥物"為適用於治療疾病或病症之藥物。
術語"蛋白質"意謂包括鏈長足以產生較高級別之二級結構及/或三級結構及/或四級結構之胺基酸序列。此不同於"肽"或不具有此結構之其他小分子量分子。涵蓋於本文中所用之定義內之蛋白質的實例包括治療性蛋白質。"治療活性蛋白質"或"治療性蛋白質"係指可用於治療性目的(亦即用於治療個體之病症)的蛋白質。應注意：儘管治療性蛋白質可用於治療目的，但本發明不限於此用途，因為該等蛋白質亦可用於活體外研究。在一較佳實施例中，治療性蛋白質為融合蛋白或抗體或其抗原結合部分。在一實施例中，本發明之方法及組合物包含至少兩種不同蛋白質，將其定義為兩種具有不同胺基酸序列之蛋白 質。其他不同蛋白質不包括蛋白質之降解產物。
術語"蛋白質粉末"係指包含根據本發明之噴霧乾燥方法製造之蛋白質的組合物。"抗體粉末"係指包括根據本發明之噴霧乾燥方法製造之抗體或其抗原結合部分的組合物。
術語"醫藥調配物"係指呈使活性成份之生物活性有效之形式且因此可為治療性用途而投與個體之製劑。
術語"溶液"係指至少一種賦形劑或蛋白質或肽於液體內之混合物。溶液可包括溶解之蛋白質分子、膠狀溶解之蛋白質分子、於液體內分散之蛋白質聚集體或晶體或沈澱物或懸浮物，或其組合。
"穩定"組合物為其中蛋白質(例如)在加工期間及/或儲存時基本上保留其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性之組合物。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術在此項技術中均可用且評述於(例如)Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee編，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。在一實施例中，根據溶液中單體蛋白質之百分比來測定蛋白質之穩定性，其中具有低百分比之降解蛋白質(例如，片段蛋白質)及/或聚集蛋白質。舉例而言，包括穩定蛋白質之水性組合物可包括至少95%之單體蛋白質。或者，本發明之水性組合物可包括不大於5%之聚集體及/或降解蛋白質。
術語"穩定劑"係指改良或以其他方式增強穩定性之賦形劑。穩定劑包括(但不限於)α-硫辛酸、α-生育酚、棕櫚酸抗壞血酯、苄醇、亞硫酸氫鹽、硼、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、抗壞血酸及其酯、類胡蘿蔔素、檸檬酸鈣、乙醯基-L-肉鹼、螯合劑、軟骨素、硫酸軟骨素、檸檬酸、輔酶Q-10、EDTA(乙二胺四乙酸；乙二胺四乙酸二鈉)、異抗壞血酸、反丁烯二酸、沒食子酸烷酯、葡糖胺(聚葡萄胺糖，玻尿酸鈉)、蘋果酸、偏亞硫酸氫鹽、沒食 子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、酒石酸、硫代硫酸鹽、硫代甘油、生育酚及其酯(例如，生育酚乙酸酯、生育酚丁二酸酯、生育三烯醇(tocotrienal)、d-α-生育酚乙酸酯)、維生素C及其酯、維生素E及其酯(例如，維生素E乙酸酯)，及其組合。
如本文中所用，術語"張力調節劑"意欲意謂一或多種可用以調節液體調配物之張力的化合物。合適張力調節劑包括甘油、乳糖、甘露糖醇、右旋糖、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸鈉、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、麥芽糖及一般技術者已知之其他張力調節劑。在一實施例中，液體調配物之張力接近血液或血漿之張力。
如本文中所提及之術語"抗體"包括全抗體及其任何抗原結合片段(亦即"抗原結合部分")或單鏈。"抗體"係指一般包括由雙硫鍵相互連接之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之醣蛋白，或其抗原結合部分。術語"抗體"亦包括經分離之其天然存在變異體。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2及CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。可將VH及VL區進一步細分為散布有較保守之區(稱作構架區(FR))的高變區(稱作互補判定區(CDR))。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))的結合。
如本文中所用，術語抗體之"抗原結合部分"(或簡稱為"抗體部分")係指保留與抗原(例如TNFα、IL-12、IL-13)特異性結合之能力的一或多個抗體片段。可由全長抗體之片段行使抗體之抗原結合功能。術語抗體之"抗原結合部分"內所涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段， 由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含於鉸鏈區由雙硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH或VL結構域組成；及(vi)經分離之互補判定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由分離基因編碼，但可使用重組方法藉由能將其製成單一蛋白質鏈之合成連接子將其接合，在該單一蛋白質鏈中VL及VH區成對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；例如參見Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之"抗原結合部分"內。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段係以與完整抗體相同之方式經篩選備用。在本發明之一實施例中，抗體片段係選自由Fab、Fd、Fd'、單鏈Fv(scFv)、scFva及結構域抗體(dAb)組成之群。
另外，抗體或其抗原結合部分可為藉由抗體或抗體部分與一或多個其它蛋白質或肽之共價或非共價締合而形成之較大免疫黏附分子的部分。該等其他蛋白質或肽可具有使抗體或其抗原結合部分純化或使其彼此或與其他分子締合之官能基。因此，該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區以製造四聚單鏈可變片段(scFv)分子(Kipriyanov等人，(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C末端聚組胺酸標籤以製造二價及經生物素標記之scFv分子(Kipriyanov等人，(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。可分別使用諸如全抗體之木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化之習知技術由全抗體製備諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分。此外，可使用標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。
兩個抗體結構域在其屬於形成同源對或組之結構家族或源自該 等家族且保留此特徵時為"互補的"。舉例而言，抗體之VH結構域及VL結構域為互補的；兩個VH結構域不互補，且兩個VL結構域不互補。互補結構域可見於免疫球蛋白超家族之其他成員中，諸如T細胞受體之Vα及Vβ(或γ及δ)結構域。
術語"結構域"係指摺疊蛋白質結構，其保留與蛋白質之其餘部分無關的其三級結構。一般而言，結構域造成蛋白質之離散功能特性，且在許多情況下其可在不失去蛋白質及/或結構域之其餘部分之功能的情況下添加、移除或轉移至其他蛋白質。單一抗體可變結構域意謂包含具有抗體可變結構域特徵之序列的摺疊多肽結構域。因此其包括完全抗體可變結構域及經修飾可變結構域，例如，其中一或多個環已經不具有抗體可變結構域特徵之序列置換，或已截斷或包含N末端延伸或C末端延伸之抗體可變結構域，以及至少部分保留全長結構域之結合活性及特異性的可變結構域之摺疊片段。
本發明之可變結構域可組合形成結構域組；例如，互補結構域可組合，諸如VL結構域與VH結構域組合。非互補結構域亦可組合。 結構域可以多種方式組合，包括藉由共價或非共價方法鍵聯結構域。
"dAb"或"結構域抗體"係指特異性結合抗原之單一抗體可變結構域(VH或VL)多肽。
如本文中所用，術語"抗原結合區"或"抗原結合位點"係指含有與抗原相互作用之胺基酸殘基且賦予抗體以其對於抗原之特異性及/或親和性之抗體分子部分或其抗原結合部分。
術語"抗原決定基"意指能夠在抗體之一或多個抗原結合區處由抗體識別且結合之任何分子的部分。在本發明之上下文下，應理解第一"抗原決定基"與第二"抗原決定基"為不同且並非由單一單特異性抗體或其抗原結合部分結合之抗原決定基。
短語"重組抗體"係指藉由重組方法製備、表現、產生或分離之抗 體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體、自重組組合抗體庫分離之抗體、自由人類免疫球蛋白基因轉殖之動物(例如小鼠)分離之抗體(例如參見Taylor等人，(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或由涉及特定免疫球蛋白基因序列(諸如人類免疫球蛋白基因序列)與其他DNA序列之拼接之任何其他方法製備、表現、產生或分離的抗體。重組抗體之實例包括嵌合抗體、CDR移植抗體及人類化抗體。
術語"人類抗體"係指如(例如)Kabat等人(參見Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部(U.S.Department of Health and Human Services)，美國國立衛生研究院公開案第91-3242號)所述具有對應於或源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。然而，本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發引入或藉由活體內體細胞突變引入之突變體)，例如CDR且尤其為CDR3。
本發明之重組人類抗體具有可變區且亦可包括源自人類生殖系免疫球蛋白序列之恆定區(參見Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾服務部，美國國立衛生研究院公開案第91-3242號)。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列轉殖之動物時，經受活體內體細胞突變誘發)且因此，重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然源自人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列相關但可能在活體內不天然存在於人類抗體生殖系譜中之序列。然而，在某些實施例中，該等重組抗體為選擇性突變誘發或回復突變(backmutation)或兩者之結果。
術語"回復突變"係指人類抗體之一些或所有體細胞突變胺基酸均 經來自同源生殖系抗體序列之相應生殖系殘基置換的過程。將本發明之人類抗體之重鏈及輕鏈序列分別與VBASE資料庫中之生殖系序列進行比對以鑑別具有最高同源性之序列。藉由使編碼該(等)不同胺基酸之限定核苷酸位置發生突變而使本發明之人類抗體之差異恢復至生殖系序列。應關於在抗原結合中之直接或間接作用研究因此鑑別為用於回復突變之候選者的各胺基酸之作用，且不應將在突變之後發現以影響人類抗體之任何需要特徵之任何胺基酸包括於最終人類抗體中。為最小化經受回復突變之胺基酸的數目，在第二生殖系序列中可保留發現不同於最接近生殖系序列但與相應胺基酸相同之彼等胺基酸位置，其限制條件為第二生殖系序列與本發明之人類抗體之序列在所討論之胺基酸之兩側上有至少10個、較佳12個胺基酸相同且共線。回復突變可發生於抗體最佳化之任何階段。
術語"嵌合抗體"係指包含來自一物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列之抗體，諸如具有連接至人類恆定區之鼠科動物重鏈及輕鏈可變區之抗體。
術語"CDR移植抗體"係指包含來自一物種之重鏈及輕鏈可變區序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換之抗體，諸如具有鼠科動物重鏈及輕鏈可變區之抗體，其中一或多個鼠科動物CDR(例如CDR3)已經人類CDR序列置換。
術語"人類化抗體"係指包含來自非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列之抗體，但其中VH及/或VL序列之至少一部分已變異為更"類人"，亦即，更類似於人類生殖系可變序列。一類人類化抗體為CDR移植抗體，其中人類CDR序列經引入非人類VH及VL序列中以置換相應非人類CDR序列。
在以下子部分中進一步詳細描述本發明之各種態樣。
II.本發明之方法
本發明之方法及本發明之所得組合物為藥物航運及/或分配提供多種優勢，例如製劑重量輕且在周圍溫度下穩定。亦存在關於藥物混配及/或製造之優勢，例如，無本體溶液在受控速率下之冗長解凍。可易於稱出足以用於所要濃度之量之本發明的乾燥蛋白質粉末，且與所要賦形劑(諸如水)混合或混配。如同習知製劑一樣，亦無需蛋白質沈澱物或蛋白質晶體懸浮物之分離及乾燥。存在關於達到高濃度調配物、改良之生物可用性、局部釋放(例如，肺部傳遞)、持續釋放(例如，脂質體及PLGA塗佈微球體)及可以多種方式(包括經口及局部)投與之新穎固體或水凝膠蛋白質劑型之能力之藥物產品開發的額外優勢。因此，在一些實施例中，該等方法亦包括進一步加工，例如將粉末組合物併入經塗佈持續釋放組合物、脂質體、PLGA塗佈微球體中，藉由熔融擠出併入賦形劑基質內及其類似加工。所得組合物亦為本發明之其他實施例，例如持續釋放或靶向組合物及/或允許替代性投藥途徑(例如經口、經皮及腸內投與)之組合物。另一優勢為與習知製劑相比本發明之組合物可在較高溫度下進行加工。舉例而言，可藉由諸如MELTREX熔融擠出技術之熔融擠出技術加工該等粉末。
在一態樣中，本發明提供高效且有效地製備包括一或多種蛋白質或肽之穩定粉末的方法。在某些實施例中，蛋白質或肽為抗體及/或其抗原結合部分。用於製備粉末之方法包括將蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分之溶液噴霧乾燥。舉例而言，溶液可包括至少約50mg/mL之蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分。在其他實施例中，溶液可具有不同濃度，例如更大濃度，例如溶液可包括至少約40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、130mg/mL、150mg/mL、180mg/mL等之蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分。溶液亦可包括一或多種賦形劑。該方法可包括藉由任何已知方法(包括(例如)超濾)濃縮或進一步濃縮溶液。蛋白 質或肽可為任何合適蛋白質或肽。蛋白質可為抗體或其抗原結合部分，例如免疫球蛋白G(IgG)抗體或其抗原結合部分。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分為MAK 195F、阿達木單抗、ABT-325、ABT-308或ABT-147。
在一些實施例中，溶液包括賦形劑。合適賦形劑包括(但不限於)海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。該方法可進一步包括向溶液或粉末中添加酸性組份、抗氧化劑及/或張力調節劑。
溶液可包括介於約15mM與約140mM之間，或介於約20mM與約30mM之間的賦形劑。在某些實施例中，溶液包括約25mM賦形劑。在一些實施例中，溶液包含介於約0.27：1.0與約2.8：1.0之間、介於約0.27：1.0與約1.4：1.0之間或介於約0.27：1.0與約0.7：1.0之間的賦形劑：蛋白質比率。在某些實施例中，溶液包含約0.7：1.0之賦形劑：蛋白質比率。
在一些實施例中，溶液具有低百分比之蛋白質聚集體，但水性蛋白質調配物具有高濃度之蛋白質聚集體儘管有高濃度之水性蛋白質調配物。在一實施例中，包括水及高濃度之蛋白質(例如抗體)的水溶液即使在不存在界面活性劑或其他類型賦形劑之情況下亦含有小於約5%之蛋白質聚集體。在一實施例中，溶液包含不大於約7.3%之聚集體蛋白質；溶液包含不大於約5%之聚集體蛋白質；溶液包含不大於約4%之聚集體蛋白質；溶液包含不大於約3%之聚集體蛋白質；溶液包含不大於約2%之聚集體蛋白質；或溶液包含不大於約1%之聚集體蛋白質。在一實施例中，溶液包含至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之單體蛋白質。介於上述濃度中間的範圍(例如至少約98.6%之單體蛋白質、不大於約4.2%之聚集體蛋白質)亦意欲為本發明之部分。 另外，意欲包括使用上述值中任一者之組合作為上限及/或下限之數值範圍。
在一些實施例中，入口空氣溫度(T入)在約105℃與約175℃之間、約130℃與約155℃之間、約120℃與約160℃之間或約125℃與約160℃之間。在某些實施例中，T入為約130℃。在一些實施例中，出口空氣溫度(T出)在約60℃與約112℃之間、約60℃與約90℃之間、約70℃與約90℃之間或約75℃與約85℃之間。在某些實施例中，T出為約80℃。
在一些實施例中，本發明之方法包括用介於約100℃與約180℃之間的入口空氣溫度(T入)及介於約60℃與約110℃之間的出口空氣溫度(T出)進行噴霧乾燥。在某些實施例中，該方法包括用約130℃之T入及約80℃之T出進行噴霧乾燥。
在一些實施例中，所得粉末組合物之殘餘水分含量在約1%與約3%之間、約1.5%與2.5%之間、約1.4%與約2%之間、約4%與約6%之間或約4.5%與約5%之間。在其他實施例中，粉末組合物包括約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%或7%之殘餘水分。
在一實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少3個月內係穩定的。在一些實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少6個月、9個月、1年、2年、3年或5年內係穩定的。在其他實施例中，粉末在40℃下至少3個月內係穩定的。在其他實施例中，粉末在40℃下至少3個月、6個月、9個月、1年、2年或5年內係穩定的。
在一些實施例中，噴霧乾燥包括霧化溶液以形成溶液小液滴、用氣體乾燥該等小液滴以形成粉末且自氣體中回收該粉末。可使用(例如)壓力噴嘴霧化器將該溶液霧化。可使用(例如)旋風分離器回收粉末。本文中論述及例示噴霧乾燥之例示性方法。
在另一態樣中，本發明提供一種製備醫藥製劑之方法，其可包括本文中所述用於製備粉末之方法中之任一者，且進一步包括將粉末與醫藥學上可接受之載劑混合(例如，用醫藥學上可接受之載劑包埋或溶解)。醫藥學上可接受之載劑可為非經腸、經口、腸內或局部投與可接受之任何載劑。載劑可為固體、半固體或液體(例如，水)或其組合。
在一些實施例中，該方法包括於醫藥學上可接受之載劑中溶解抗體或其抗原結合部分粉末。醫藥學上可接受之載劑可(例如)為非經腸投與所接受且可包括(例如)水。該方法可進一步包括向醫藥組合物中添加一或多種酸性組份、抗氧化劑及/或張力調節劑。另外或其他，可將例如緩衝劑、黏度調節劑、調味劑、著色劑等之合適添加劑添加至本發明之醫藥組合物中。
該方法可包括在不顯著影響粉末組合物之穩定性的情況下在高於周圍溫度之溫度下進一步加工本發明之穩定粉末組合物。舉例而言，該方法可包括熔融擠出穩定粉末組合物。
在一些實施例中，將一或多個塗層塗覆於粉末組合物上，例如以使得離散粒子或粒子之聚集體經塗佈及/或使得粒子之複合物(例如壓製錠劑)經塗佈。塗層可包括此項技術中通常使用及已知之任何塗層。該等塗層可包括諸如PLGA之聚合物以形成持續釋放或延遲釋放醫藥組合物。塗層可為腸溶衣或可包括腸溶衣。可將組合物囊封於(例如)明膠膠囊中或懸浮於水凝膠中。在某些實施例中，蛋白質，肽、抗體或其抗原結合部分之活性因此或以其他方式由賦形劑保護以避免由有機溶劑引起之沈澱、變性或氧化，藉此允許用諸如PLGA之僅可溶於有機溶劑中之物質塗佈。該等溶劑可包括常見於醫藥製劑中之溶劑，其包括(但不限於)聚乙二醇(例如，低分子量聚乙二醇，諸如PEG 400)、乙醇、二甲亞碸(DMSO)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)或冰醋 酸。
噴霧乾燥
在噴霧乾燥器中，將可泵送流體(溶液、懸浮液、乳液或漿料)轉化為乾燥微粒形式。該過程藉由將液體饋料霧化至熱乾燥介質(通常為空氣或惰性氣體)中而將粒子形成及乾燥合併為一步。在本發明之一些實施例中，將濃縮蛋白質溶液噴霧乾燥。因此，本發明之方法可包括使用任何合適方法濃縮蛋白質溶液。在一些實施例中，使用切向流式過濾(TFF)技術，此係因為此技術為極快速且平緩之方法。然而，另外或其他，可使用正常流式過濾或透析。
流體之霧化使液體之表面增加且因此導致極短之乾燥時間。舉例而言，將小液滴尺寸由10μm減小至1μm使表面積由600m2增加至6000m2且使其乾燥時間縮短至1/100(由0.01s至0.0001s)。Stahl,Feuchtigkeit und Trocknen in der Pharmazeutischen Technologic Dr.Dieter Steinkopf Verlag GmbH & Co.KG,Darmstadt(1999)。
液體饋料與乾燥空氣之間的接觸可以兩種不同模式發生。在平行流系統中，乾燥空氣及粒子(小液滴)以相同方向穿過乾燥腔室。因為最熱之空氣接觸潮濕小液滴，所以此舉對熱敏性物質(諸如蛋白質)而言為較佳模式。當乾燥空氣及小液滴以相反方向移動時，將此舉稱為逆流模式。逆流模式中所產生之粒子通常展示與排出空氣相比較高之溫度。所排出之空氣本身可離開系統("開式循環")或可再循環("閉式循環"，一般用於用惰性氣體蒸發有機溶劑)。噴霧乾燥方法原理(Spray Drying Process Principles)(<<www.niro.com>>2007年2月)。藉由選擇各種噴霧乾燥器設計(尺寸、霧化器、無菌條件等)及調節不同過程參數(乾燥空氣流量、乾燥空氣溫度等)，可控制如粒度、形狀及結構或甚至無菌度之最終粉末特性。若所回收粉末之所得水分不夠低，則可能需要(例如)呈流化床乾燥器及冷卻器、接觸乾燥器或甚至 微波乾燥器形式之後處理。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。
噴霧乾燥過程一般包括：霧化液體饋料；乾燥小液滴；及分離且回收乾燥產物。每一步驟對所得產物具有其自身影響且亦提供難點，尤其當處理如蛋白質之敏感性物質時。
為噴霧乾燥蛋白質或肽，使用穩定佐劑通常有利。諸如海藻糖及蔗糖之糖為有效蛋白質穩定劑。其不僅可降低在噴霧乾燥過程中蛋白質之聚集及/或失活，且其亦可對所得粉末之儲存穩定性(若在其玻璃轉移溫度以下儲存)具有積極影響。Lee,Rational Design of Stable Protein Formulations,Theory and Practice(Kluwer Academic/Plenum Publishers,2002)。
霧化為使液體斷裂為大量單一小液滴(所謂之噴霧)。霧化裝置之選擇影響最終產物品質及生產量。Richter,Verfahrenstechnik,Sonderausgabe Martübersicht 11：96-100(1997)。與所有霧化器共同之處為使用能量以分散液體。不同種能量使不同霧化器有所區別。能量在流出液體中產生湍流。與所施加之空氣力一起，克服液體之表面張力及黏度且發生崩解。
對於噴霧乾燥操作而言，最合適噴霧為小液滴中之一者具有不相上下之尺寸。並非所有霧化系統均可為噴霧乾燥粉末提供窄粒度分布。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。蛋白質為極敏感性物質，因此在其涉及剪切力時霧化代表應力因素，此為造成不穩定性之可能原因。Mahler等人發現高剪切力(攪拌及震盪)與IgG1溶液之聚集增加之間的相互關係。Mahler等人，Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59：407-417(2005)。溶菌酶溶液在霧化期間亦展示聚集及活性損失。Yu等人，Eur.Journal of Pharm.Sci 27：9-18(2006)。剪切應力及液體/空氣界面 之突然增大似乎造成此類蛋白質變質。Maa等人，Biotechnology and Bioengineering 54(6)：503-512(1997)。但即使在抽汲程序中出現之剪切力仍可足以對蛋白質溶液施加應力。Brennan等人，Diabetes 34,353-359(1985)。許多不同類型之霧化器均可用於噴霧乾燥程序。
旋轉式霧化器在液體饋料噴放至空氣/氣體氣氛中之前離心加速該液體饋料。液體饋料居中分布於旋轉輪、圓盤或杯上。在低圓盤速度下，小液滴之形成主要依賴於液體之黏度及表面張力。圓盤速度愈高，愈大慣性及空氣摩擦力開始起作用且有助於小液滴形成機制。此外，小液滴尺寸受液體饋料速率，其固體含量及密度、霧化器圓盤直徑及設計影響。不同設計之旋轉式霧化器均可用：無葉圓盤/碗/杯或具有彎曲或直葉片之有葉輪。Masters,Spray Drying Handbook(Wiley & Sons Inc.,New York,1991)。
旋轉式霧化器具有360°之噴霧角且因此需要特定直徑之乾燥腔室(以最小化壁沈積)。該等系統通常用於較高容量。
壓力噴嘴系統藉由將壓力能轉化為動能而獲得自液體本身噴放液體所需之所有能量。最簡單之單流體噴嘴(one-fluid nozzle)為用於滴出單一小液滴之管狀毛細管。此裝置僅用於產生少量相等小液滴。藉由增加流動速率可達成霧化，其中經由湍流將液體射流斷為小液滴。可藉由使液體經受偏轉、旋轉及回轉來改善流體之崩解，例如藉由使噴嘴具有漩渦插入物或漩渦腔室。所得小液滴尺寸除先前所述之參數(黏度、流動速率等)外亦受所施加壓力及噴嘴直徑的影響。Richter,Verfahrenstechnik,Sonderausgabe Martübersicht 11：96-100(1997)。液體饋料離開呈中空錐形之孔口，亦即，壓力噴嘴可用於具有低直徑乾燥腔室之小噴霧乾燥裝置中。大量不同噴嘴設計提供用於霧化溶液、乳液及懸浮液之可變應用，其僅受粒度(懸浮液)及黏度(所需之極高壓力)限制。Masters,Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。
當使用氣動噴嘴霧化時，高速氣態介質(通常為空氣)與液體之撞擊為小液滴形成提供能量。依據流體與氣體碰撞之位置，來區別內部混合與外部混合系統。Richter,Verfahrenstechnik,Sonderausgabe Martübersicht 11：96-100(1997)。當必須將高黏性流體分散為細小尺寸之小液滴時，較佳使用雙流體噴嘴。將氣態介質壓入噴嘴內部(直至7巴)，其有時配備有額外漩渦插入物以產生氣體湍流，進而促進液體饋料之崩解。通常藉由低壓泵將液體饋料泵入，其支持氣流噴射器作用。氣動噴嘴系統產生5μm至75μm範圍內之小液滴。缺點為壓縮氣體/空氣及其在乾燥腔室內部之冷卻作用之成本較高。當處理具有極高黏度之液體時，亦存在阻塞噴嘴孔口之危險。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。
超音波噴嘴使用高頻率聲波以達成霧化。壓電傳感器接收來自超音波發生器之高頻電能且將其轉化為相同頻率之振動機械運動。引入液體，其流經噴嘴之長度。當液體饋料到達孔口時，其吸收振動能，使其霧化。Sono Tek Corporation：超音波噴霧噴嘴系統(Ultrasonic spray nozzle systems)(SONO TEK Corporation,New York,2007)。
音速噴嘴在低壓力下工作(尤其與氣動噴嘴相比)且所得小液滴具有介於10μm與50μm之間的直徑。使用超音波霧化器之一大缺點為連續操作之不可預測性，例如當用於含固體原料時，在噴嘴區域中預先乾燥之風險可能導致污染產生器/霧化過程。因此，該等系統更通常用於實驗室規模及前導乾燥器以產生細小噴霧或當非牛頓(non-Newtonian)或高黏性液體不允許使用其他噴嘴系統時使用。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS； Charlottenlund(2002)。
由於監控整個噴霧之行為與乾燥腔室內部之非均一狀態之困難，預計在噴霧乾燥期間噴霧之乾燥動力學係複雜的。然而，可理論上及實際上研究單一小液滴之乾燥動力學。Elversson等人，Journal of Pharm.Sci 94(9)：2049-2060(2005)。
一旦液體饋料經霧化，則其表面與質量比增加且空氣與小液滴之間的熱轉移加速，且小液滴現在可極快速乾燥。在小於100μm之常見小液滴尺寸下，蒸發在小於1s內進行。Nürnberg等人，Acta Pharmaceutica Technologica,26(1)：39-67，表3-1(1980)。涉及兩個對流過程：熱轉移(空氣→小液滴)及水分之質量轉移(小液滴→空氣)。在後者中，水分必須滲透入圍繞各小液滴之邊界層。轉移速率受周圍空氣之溫度、濕度、傳輸特性、小液滴直徑及小液滴與空氣之間的相對速度影響。Masters,Spray Drying Handbook(Wiley & Sons Inc.,New York,1991)。首先，蒸發以恆定速率進行(乾燥之第一階段=恆速期)。水分自小液滴內擴散維持飽和表面狀態。在所謂"臨界點"下，水分含量變得過低以致不能在小液滴表面維持飽和，且在小液滴之表面開始形成乾燥層。自彼時起，對於擴散穿過存在額外生長障壁。由於永久性改變小液滴/粒子之狀態，故蒸發速率降低(降速期=乾燥之第二階段)。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。在過程中小液滴/粒子之溫度主要受入口乾燥空氣溫度(T入)及液體饋料速率(QLF)影響，在某種程度上受乾燥空氣流動速率(QDA)及霧化空氣流動速率(QAA)影響。該四種參數亦決定T出。實際上，僅在噴嘴孔口以下之溫度與T入相比更接近T出，因此T出似乎為小液滴乾燥速率之控制變數。當然，小液滴內部之溫度(Ti)低於其表面上之溫度(Ts)。Ts不久即達到濕球溫度TWb，且在恆速期內保持於彼溫度。在降速期小液滴表面上有生長結殼之情 況下，Ts及Ti開始增加。Maa等人，Biotechnology and Bioengeneering 53(6)：503-512(1997)。對於所得粒子形態，小液滴尺寸以及結殼之紋理均具有決定性作用。Elversson等人假定小液滴尺寸與粒度之間的線性關係，但亦暗示液體饋料中之固體含量強烈影響粒度。Elversson等人，Journal of Pharm.Sci.92(4)：900-910(2003)。
乾燥涉及另外兩個關於蛋白質之應力因素：熱及脫水。在蛋白質調配物中蛋白質對於熱應力之穩定性為關鍵變數。噴霧乾燥過程中溫度之改變對蛋白質穩定性(例如，過程穩定性、加速穩定性試驗期間之存放期)具有極大影響。當暴露於高溫時，蛋白質變得更具彈性(氫鍵減弱)，導致部分展開且其碰撞頻率增加。Brange,Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins(Taylor & Francis Ltd.,2000)。此過程通常可逆，但一旦部分展開，則蛋白質極易經受如聚集或不當摺疊之進一步降解路徑，此強烈影響其功能及長期穩定性。
對於大多數蛋白質而言，關於最大穩定性之溫度在-10℃與35℃之間。Bummer等人，Protein Formulation and Delivery(Marcel Dekker AG,Basel,2000)。Mumenthaler等人假定乾燥粒子達到低於T出約25℃之最高溫度。Mumenthaler等人，Pharm.Res.11(1)：12-20(1994)。在本發明中，T出可能在約60℃至約80℃之範圍內。在噴霧乾燥期間，一般不將熱變性視作主要不穩定性因素。Maa等人，Current Pharmaceutical Biotechnology 1(3)：283-302(2000)。
蛋白質之生物活性視其天然、三維結構而定。在水溶液中，蛋白質藉由於其表面上經非共價結合水分子圍繞而維持其天然結構。通常非極性胺基酸殘基埋於內部且極性胺基酸殘基存在於表面上。此導致蛋白質於溶液中極緊密堆積(與有機分子晶體中相比具較高之堆積密度)。Brange,Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins(Taylor & Francis Ltd.,2000)。移除水可能使此堆積失穩，且可能出現構形改變。
噴霧乾燥過程之最後步驟通常為自空氣/氣體中分離粉末且移除乾燥產物。在一些實施例中，此步驟儘可能有效以獲得高粉末產率且防止經由粉末排放至大氣中之空氣污染。為此目的，可使用乾式及濕式收集設備，如旋風分離器、袋式過濾器或靜電除塵器。甚至可安裝該等裝置之組合。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。由於其簡單設計及其有效性，旋風分離器為最常見分離器中之一者且其用於各種行業中。Coulson及Richardson,Chemical Engineering，第4版，第2卷(Butterworth-Heinemann,Oxford,1991)。旋風分離器內部之粒子運動為兩個相反力之結果。離心力將粒子移動至旋風分離器壁處，而空氣/氣體之拖曳力則試圖將該等粒子攜帶至中央空氣核心以離開旋風分離器。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。粉末及空氣成切線進入旋風分離器且以螺旋形式向下渦旋至旋風分離器之底部(外旋流)。此時，大多數粒子離開旋風分離器而經收集於底部安裝容器中，僅含有細小粒子部分及其他不可分離之粒子的空氣在旋風分離器之中心(內旋流)盤旋上升且離開頂部。實際上，粒度大於30μm即應回收，其亦依賴於噴霧乾燥器之尺寸。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。然而，可藉由改變旋風分離器尺寸而使產率最佳化。Maury等人用新近開發之旋風分離器經Büchi B-191噴霧乾燥器達成與標準旋風分離器相比更高之產率。Maury等人，Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(3)：565-573(2005)。高效旋風分離器(小直徑)分離更多，包括甚至極小粒子(直徑小於1.5μm)。
已對計算旋風分離器效率進行理論研究。一種方法為(例如)藉由以下方程式計算所謂"截止點"： dp *為截止粒徑，η為空氣黏度，ri表示內旋流之半徑，vri為空氣入口處之徑向空氣速度，ρs及ρg表示固體及氣體之密度，ui為ri處之切線粒子速度。在此點(粒子之直徑)處，離心力與拖曳力具有相等值。彼尺寸之粒子旋轉而不傾向於內旋流或外旋流，較小粒子由排出空氣帶走，較大粒子落入收集容器中。Staudinger等人，VDI Berichte 1511：1-23(1999)。
飛行時間方法為計算臨界粒徑之另一方法。其考慮到粒子移動至旋風分離器壁需要多長時間。在此方法中，可考慮收集容器之幾何形狀，因為其影響旋風分離器內部之氣流。Qian等人，Chem.Eng.Technol.29(6)：724-728(2006)。
噴霧乾燥無任何佐劑之蛋白質水溶液通常導致展開、聚集及失活。已用各種蛋白質嘗試若干次：氧基血色素(Labrude等人)、胰蛋白酶原(Tzannis等人)、IgG(Maury等人，2005)且在所有情況下均觀察到過程不穩定性。Labrude等人，Journal of Pharm.Sci.78(3)：223-229(1989)；Tzannis等人，Journal of Pharm.Sci.88(3)：351-359(1999)及Maury等人，Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(2)：251-261(2005)。因此，在一些實施例中，在噴霧乾燥過程中以及在儲存期間本發明之組合物保護活性醫藥成份(API)。在蛋白質之冷凍乾燥中，已將糖(海藻糖、蔗糖)、胺基酸(精胺酸)或界面活性劑(Tween)用作穩定劑。Lee,Rational Design of Stable Protein Formulations,Theory and Practice(Kluwer Academic/Plenum Publishers,2002)。關於多元醇、 雙醣及胺基酸之使用而言，已提出若干種穩定理論。其中之一者為由Arakawa及Timasheff建立之所謂的"優先排除"理論。Arakawa等人，Biochemistry 21：6536-6544(1982)；Arakawa等人，Advanced Drug Delivery Reviews 46：307-326(2001)，及Timasheff,Annual Reviews Biophys.Biomol Struct.22：67-97(1993)。其係基於蛋白質在溶液中優先水合之前提，因此共溶質排除與蛋白質表面接觸。因為展開將產生更大蛋白質表面，所以必須排除共溶劑之面積亦會更大。在此情況下，展開產生熱力學上不利之情況，因此蛋白質仍處於其摺疊天然構形。Arakawa等人，Advanced Drug Delivery Reviews 46：307-326(2001)。亦可藉由"水置換"機制保護蛋白質。此理論認為賦形劑藉由與乾燥蛋白質而非蒸發之水進行氫鍵鍵結而防止展開。Carpenter等人，Rational Design of Stable Protein Formulations,Theory and Practice(Kluwer Academic/Plenum Publishers,2002)。此外，固定蛋白質之玻璃基質的形成可為乾燥及儲存時蛋白質穩定之原因。Tzannis等人，Journal of Pharm.Sci.88(3)：360-370(1999)。因此，需要展示高玻璃轉移溫度(Tg)之調配物，例如Tg高於儲存溫度以阻止分子運動。界面活性劑之穩定機制係基於界面活性劑與蛋白質對於佔據界面(例如，液體/空氣界面)之競爭，展示界面活性劑之熱力學邊緣。由於蛋白質吸附於界面處之可能性較小，因而展開及聚集之風險顯著降低。Adler等人，Journal of Pharm.Sci.,88(2),199-208(1999)。
尤其在長期儲存期間，濕度為影響蛋白質穩定性之另一因素。文獻中充分記錄水分對蛋白質粉末之影響。通常，固體蛋白質調配物之化學穩定性隨水分含量增加而降低，此係由於水充當反應物或用作活化反應物之介質。其亦可造成蛋白質結構之構形改變。此外，噴霧乾燥粉末之Tg亦受水影響。水充當增塑劑，意謂其降低物質之Tg。可使用戈登泰勒方程式(Gordon Taylor Equation)計算水之影響，該方 程式為計算二元混合物之Tg(Tg混合物)的方程式。
ω、Tg及ρ分別表示不同組份之重量分率、玻璃轉移溫度及密度。對於Tg為約-138℃之水而言，顯然所得粉末之含水量應較低。Hancock等人，Pharm.Res.11(4)：471-477(1994)。然而，含水量與穩定性之間的相互關係似乎並非線性的。Chang等人在2%-3%之中間含水量下獲得凍乾IgG之最佳穩定。Chang等人，Journal of Pharm.Sci 94(7)：1427-1444(2005)。
由於此知識，由噴霧乾燥過程產生之粉末應展示低殘餘水分以及在儲存期間經保護免於濕氣影響。Maa等人，Pharm.Res.15(5)：768-775(1998)。在一定程度上，前者可受過程條件(入口空氣溫度(T入)、入口空氣之相對濕度(RH))影響；後者為防漏小瓶或可控儲存條件之問題。
III.本發明之調配物
任何合適蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分皆可用於製備本發明之組合物。舉例而言，其可為IgG類型。例示性抗體或其抗原結合部分包括(但不限於)MAK 195F、阿達木單抗或ABT-325。熟知適於本發明之用途的抗TNF抗體(例如，如EP-A-0 260 610、EP-A-0 351 789、EP-A-0 218 868中所述)。可使用多株抗體與單株抗體。此外，諸如Fab或F(ab')2片段之TNF結合抗體片段或單鏈Fv片段亦合適。合適單株抗hTNF-α抗體描述於EP-A-0 260 610中，命名為AM-195或MAK-195，其係由以寄存編號87 050803寄存於ECACC之融合瘤細胞株產生。亦命名為MAK 195F(INN：阿非莫單抗(Afelimomab))之鼠科動物抗TNF抗體片段(F(ab')2)亦合適。
在一實施例中，本發明之調配物包含結合人類TNFα之抗體或其抗原結合部分，其包括(例如)阿達木單抗(亦稱為複邁(Humira)或D2E7；Abbott Laboratories)。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段以1×10-8M或1×10-8M以下之Kd及1×10-3s-1或1×10-3s-1以下之Koff速率常數(兩者均藉由表面電漿共振測定)自人類TNFα解離，且在標準活體外L929檢定中以1×10-7M或1×10-7M以下之IC50中和人類TNFα細胞毒性。製造對人類TNFα具有高親和性之人類中和抗體(包括抗體之序列)之實例及方法描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第6,090,382號中。
在一實施例中，本發明之調配物包含結合人類介白素-12(IL-12)之抗體或其抗原結合部分，其包括(例如)抗體ABT-874(Abbott Laboratories)(美國專利第6,914,128號)。ABT-874為經設計以靶向及中和介白素-12及介白素-23之完全人類單株抗體。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段具有以下特徵中之一或多者：其以3×10-7M或3×10-7M以下之KD自人類IL-1α解離；以5×10-5M或5×10-5M以下之KD自人類IL-1β解離；且不結合小鼠IL-1α或小鼠IL-1β。製造對人類IL-12具有高親和性之人類中和抗體(包括抗體之序列)之實例及方法描述於以引用的方式併入本文中之美國專利第6,914,128號中。
在一個實施例中，本發明之調配物包含結合人類IL-18之抗體或其抗原結合部分，其包括(例如)抗體ABT-325(Abbott Laboratories)(參見美國專利申請案第2005/0147610號)。
在一個實施例中，本發明之調配物包含結合人類IL-12之抗體或其抗原結合部分，諸如抗體ABT-147(Abbott Laboratories)(參見2007年1月11日公開之WO 2007/00 5608 A2)。
在一個實施例中，本發明之調配物包含結合人類IL-13之抗體或其抗原結合部分，諸如抗體ABT-308(Abbott Laboratories)(參見 PCT/US2007/19660)。
可包括於粉末調配物中之蛋白質的實例包括抗體或其抗原結合片段。可用於本發明中之不同類型之抗體或其抗原結合片段之實例包括(但不限於)嵌合抗體、人類抗體、人類化抗體及結構域抗體(dAb)。在一個實施例中，用於本發明之方法及組合物中之抗體為抗TNFα抗體或其抗原結合部分，或抗IL-12抗體，或抗IL-13抗體，或其抗原結合部分。可用於本發明中之抗體或其抗原結合片段之其他實例包括(但不限於)ABT-147(Abbott Laboratories)、ABT-325(抗IL-18；Abbott Laboratories)、ABT-308(Abbott Laboratories)、ABT-874(抗IL-12；Abbott Laboratories)、阿非莫單抗(Fab 2抗TNF；Abbott Laboratories)、複邁(阿達木單抗；Abbott Laboratories)、坎帕斯(Campath)(阿來組單抗(Alemtuzumab))、CEA-Scan阿西莫單抗(Arcitumomab)(fab片段)、爾必得舒(Erbitux)(西妥昔單抗(Cetuximab))、賀癌平(Herceptin)(曲妥珠單抗(Trastuzumab))、彌歐辛(Myoscint)(噴替酸英西單抗(Imciromab Pentetate))、普斯塔辛(ProstaScint)(卡羅單抗噴地肽(Capromab Pendetide))、雷米卡德(Remicade)(英利昔單抗(Infliximab))、雷歐普(ReoPro)(阿昔單抗(Abciximab))、厘度姍(Rituxan)(利妥昔單抗(Rituximab))、新睦樂(Simulect)(巴利昔單抗(Basiliximab))、辛納吉斯(Synagis)(帕利珠單抗(Palivizumab))、巰諾莫(Verluma)(諾非單抗(Nofetumomab))、艾克斯歐萊(Xolair)(奧馬珠單抗(Omalizumab))、賽尼哌(Zenapax)(達利珠單抗(Daclizumab))、澤娃靈(Zevalin)(替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan))、奧素健體OKT3(Orthoclone OKT3)(莫羅單抗-CD3(Muromonab-CD3))、帕諾瑞(Panorex)(依決洛單抗(Edrecolomab))及滅髓瘤(Mylotarg)(吉妥單抗(Gemtuzumab ozogamicin))。
在一個替代中，蛋白質為融合蛋白質，其包括(但不限於)百慕時 (Pulmozyme)(阿法鏈道酶(Dornase alfa))、立比扶(Rebif)、里格拉耐(Regranex)(貝卡普明(Becaplermin))、阿克伐司(Activase)(阿替普酶(Alteplase))、艾杜拉酶(Aldurazyme)(拉羅尼酶(Laronidase))、愛美麗(Amevive)(阿法賽特(Alefacept))、安然愛斯普(Aranesp)(阿法達貝泊汀(Darbepoetin alfa))、貝卡普明濃縮物、倍泰龍(Betaseron)(干擾素β-1b)、BOTOX(A型肉毒桿菌毒素)、埃立特(Elitek)(拉布立酶(Rasburicase))、艾斯帕(Elspar)(天冬醯胺酸酶(Asparaginase))、益比奧(Epogen)(阿法依泊汀(Epoetin alfa))、恩博(Enbrel)(依那西普(Etanercept))、法布瑞酶(Fabrazyme)(倍他阿加糖酶(Agalsidase beta))、幹複津(Infergen)(干擾素alfacon-1)、甘樂能(Intron A)(干擾素α-2a)、金那瑞特(Kineret)(阿那白滯素(Anakinra))、MYOBLOC(B型肉毒桿菌毒素)、紐拉思塔(Neulasta)(聚乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastim))、紐密伽(Neumega)(奧普瑞介白素(Oprelvekin))、優保津(Neupogen)(非格司亭(Filgrastim))、昂他克(Ontak)(地尼介白素(Denileukin diftitox))、PEGASYS(聚乙二醇化干擾素α-2a)、普留淨(Proleukin)(阿地介白素(Aldesleukin))、百慕時(阿法鏈道酶)、立比扶(干擾素β-1a)、里格拉耐(貝卡普明)、瑞他法斯(Retavase)(瑞替普酶(Reteplase))、羅飛龍-A(Roferon-A)(干擾素α-2)、TNK酶(替奈普酶(Tenecteplase))及除栓素(Xigris)(阿法替加色羅(Drotrecogin alfa))。
可包括於本文中所述方法及組合物中之蛋白質的其他實例包括哺乳動物蛋白質(包括其重組蛋白)，諸如生長激素，包括人生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促濾泡激素；降鈣素；黃體生成素；升糖素(glucagon)；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及溫韋伯氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白C；心房利尿鈉因子；肺界面活性 劑；血纖維蛋白溶酶原活化劑，諸如尿激酶或組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)；邦巴辛(bombazine)；凝血酶；腫瘤壞死因子α及腫瘤壞死因子β腦啡肽酶；RANTES(正常T細胞表現及分泌之活性調節因子)；人類巨噬細胞發炎性蛋白質(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物質(mullerian-inhibiting substance)；鬆弛素A-鏈；鬆弛素B-鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；去氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子之受體；整合素；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨衍生神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3、神經營養因子-4、神經營養因子-5或神經營養因子-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或神經生長因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，諸如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，諸如TGFα及TGF-β，其包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II(IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19及CD20；紅血球生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨誘導因子；免疫毒素；骨型態發生蛋白(BMP)；生長及分化因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子(decay accelerating factor；DAF)；病毒抗原，諸如AIDS包膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；免疫黏附素；抗體；及以上所列舉之多肽中之任一者的生物學活性片段或變異體。
多株抗體
多株抗體泛指對某一抗原具特異性，但與該抗原上之不同抗原 決定基結合之抗體的混合物。多株抗體一般藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑而在動物體內產生。其可用於將相關抗原接合至在待免疫物種中呈免疫原性之蛋白質(例如匙孔血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)，其係使用雙功能或衍生化劑進行，例如順丁烯二醯亞胺苯甲醯磺化丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1NCNR，其中R與R1為不同烷基。用於製造多株抗體之方法在此項技術中已知且描述(例如)於以引用的方式併入本文中之Antibodies：A Laboratory Manual,Lane及Harlow(1988)中。
單株抗體
如本文中所用之"單株抗體"意指源自融合瘤之抗體(例如，由藉由諸如標準柯勒及麥爾斯坦融合瘤法(Kohler and Milstein hybridoma methodology)之融合瘤技術製備之融合瘤分泌的抗體)。舉例而言，單株抗體可使用首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)所述之融合瘤方法來製備，或可由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)來製備。因此，儘管本發明之源自融合瘤之雙特異性抗體對一種以上單一抗原具有抗原特異性，但仍將其稱為單株抗體。
單株抗體可自大體上均質之抗體群體(亦即除可少量存在之可能天然存在突變之外構成群體之個別抗體均相同)獲得。因此，修飾語"單株"表明抗體當不為離散抗體之混合物時的特性。
在另一實施例中，抗體可自使用McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)中所述之技術產生之抗體噬菌體庫分離。Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)分別描述使用噬菌體庫對鼠科動物抗體及人類抗體之分離。後續公開案描述藉由鏈改組產生高親和性(nM範圍)人類抗 體(Marks等人，Bio/Technology,10：779-783(1992))，以及將組合感染及活體內再組合作為用於建構極大噬菌體庫之策略(Waterhouse等人，Nuc Acids Res 21：2265-2266(1993))。因此，該等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術的可行性替代技術。
如美國專利第6,423,538號；第6,696,251號；第6,699,658號；第6,300,065號；第6,399,763號及第6,114,147號中所述，抗體及抗體片段亦可藉助於表現庫而自酵母菌及其他真核細胞分離。真核細胞可經工程化以表現在細胞表面上呈現之庫蛋白質(包括來自組合抗體庫)，進而允許選擇含具有親和力的抗體庫純系之特定細胞以選擇目標分子。自經分離細胞回收之後，可自合適哺乳動物細胞株高量表現編碼所關注之抗體的庫純系。
用於產生所關注之抗體的其他方法包括使用核酸呈現技術之無細胞篩檢，如美國專利第7,195,880號；第6,951,725號；第7,078,197號；第7,022,479號；第6,518,018號；第7,125,669號；第6,846,655號；第6,281,344號；第6,207,446號；第6,214,553號；第6,258,558號；第6,261,804號；第6,429,300號；第6,489,116號；第6,436,665號；第6,537,749號；第6,602,685號；第6,623,926號；第6,416,950號；第6,660,473號；第6,312,927號；第5,922,545號及第6,348,315號中所述。該等方法可用於以將蛋白質與其所源自之核酸物理締合或結合之方式自核酸活體外轉錄蛋白質。藉由選擇用目標分子表現之蛋白質，亦選擇編碼該蛋白質之核酸。在無細胞篩檢技術之一種變化中，可分離自免疫系統細胞分離之抗體序列且部分隨機化聚合酶鏈反應突變誘發技術可用以增加抗體多樣性。接著使該等部分隨機化抗體基因在無細胞系統中表現，其中在核酸與抗體之間產生並存物理締合。
亦可藉由(例如)用人類重鏈及輕鏈恆定結構域的編碼序列替代同源鼠科動物序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA,81：6851(1984))或藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列的全部或部分與免疫球蛋白編碼序列共價連接來修飾DNA。
通常該等非免疫球蛋白多肽經抗體之恆定結構域取代，或其經抗體之一個抗原結合位點之可變結構域取代，以產生包含一個對抗原具有特異性之抗原結合位點及另一個對不同抗原具有特異性之抗原結合位點的嵌合二價抗體。
亦可使用合成蛋白質化學中之已知方法(包括涉及交聯劑之彼等方法)活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言，可使用雙硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來建構免疫毒素。為此目的，合適試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯。
人類化抗體
此項技術中熟知用於人類化非人類抗體之方法。一般而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常被稱為"引入"殘基，其通常獲自"引入"可變結構域。可基本上按照Winter及同事之方法(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))藉由用非人類(例如齧齒動物)CDR或CDR序列替代相應人類抗體序列來進行人類化。因此，該等"人類化"抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上近似完整之人類可變結構域已經來自非人類物種之相應序列所取代。實際上，人類化抗體通常係一些CDR殘基及可能一些構架(FR)殘基經來自齧齒動物抗體中類似位點之殘基取代的人類抗體。描述人類化過程之額外參考文獻包括Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993)，其中每一者均以引用的方式併入本文中。
人類抗體
或者，目前可產生在無內源性免疫球蛋白產生之情況下免疫後能夠產生全譜人類抗體之轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合性缺失導致對於內源性抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該等生殖系突變小鼠體內將會於抗原攻毒後引起人類抗體之產生。例如參見Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immune,7：33(1993)。人類抗體亦可能源自噬菌體呈現庫(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991))。
雙特異性抗體
雙特異性抗體(BsAb)為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。該等抗體可源自全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
在此項技術中已知用於製造雙特異性抗體之方法。全長雙特異性抗體之傳統生產係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該兩個鏈具有不同特異性(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，該等融合瘤(四源雜交瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結構。通常藉由親和性層析步驟進行之正確分子之純化相當麻煩，且產物產率較低。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.,10：3655-3659(1991)中。
根據不同方法，將具有所要結合特異性之抗體可變結構域(抗體-抗原結合位點)融合於免疫球蛋白恆定結構域序列。
該融合較佳係與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少部分之免疫球蛋白 重鏈恆定結構域進行。較佳使存在於至少一個該等融合中之第一重鏈恆定區(CH1)含有輕鏈結合所必需之位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(必要時)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨表現載體中，且將其共轉染至合適宿主生物體中。當在構建中所使用之三個多肽鏈的不等比率提供最佳產率時，此在實施例中提供調整三個多肽片段之相互比例的極大靈活性。然而，當相等比率之至少兩個多肽鏈的表現產生高產率或當比率並非特別重要時，有可能將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一表現載體中。
在此方法之一較佳實施例中，雙特異性抗體係由在一臂上具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈，及在另一臂上之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。已發現由於免疫球蛋白輕鏈僅存在於一半雙特異性分子中提供一種簡便之分離方式，故此不對稱結構促進所要雙特異性化合物與非所需免疫球蛋白鏈組合之分離。此方法揭示於1994年3月3日公開之WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之進一步細節，例如參見Suresh等人，Methods in Enzymology,121：210(1986)。
雙特異性抗體包括交聯抗體或"異接合(heteroconju-gate)"抗體。舉例而言，異接合物中之一抗體可與抗生物素蛋白偶合，其他抗體可與生物素偶合。該等抗體據稱(例如)可使免疫系統細胞靶向不需之細胞(美國專利第4,676,980號)且可用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何適宜交聯方法製得異接合抗體。合適交聯劑已在此項技術中所熟知，且揭示於美國專利第4,676,980號以及大量交聯技術中。
自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。以下技術亦可用於產生未必具雙特異性之二價抗體片段。舉例而言，自大腸桿菌回收之Fab'片段可在活體外化學偶合以形成二價抗體。參見 Shalaby等人，J.Exp.Med.,175：217-225(1992)。
亦已描述直接自重組細胞培養物製造且分離二價抗體片段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈(leucine zipper)產生二價異質二聚體。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)。藉由基因融合使來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab'部分連接。在鉸鏈區還原抗體均二聚體以形成單體，且接著使其再氧化以形成抗體異質二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)所述之"雙功能抗體"技術已為製造雙特異性/二價抗體片段提供替代性機制。該等片段包含經連接子連接至輕鏈可變結構域(VL)之重鏈可變結構域(VH)，該連接子過短而使相同鏈上之兩個結構域之間無法配對。因此，迫使一個片段之VH及VL結構域與另一片段之互補VL及VH結構域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙特異性/二價抗體片段之策略。參見Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994)。
在一實施例中，本發明之調配物包含對IL-1(包括IL-1α及IL-1β)具雙特異性之抗體。製造雙特異性IL-1抗體之實例及方法可見於2008年7月10日公開之WO 08/082651中。
雙可變結構域(DVD)結合蛋白
雙可變結構域(DVD)結合蛋白為包括兩個或兩個以上抗原結合位點之蛋白且為四價或多價結合蛋白。DVD可具單特異性，亦即能夠結合一個抗原，或可具多特異性，亦即能夠結合兩個或兩個以上抗原。將包含兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為DVD IgTM。每一半DVD Ig包含一個重鏈DVD多肽及一個輕鏈DVD多肽及兩個抗原結合位點。每一結合位點包含重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，其中在每個抗原結合位點之抗原結合中涉及總共6個CDR。在某些實施例中，DVD可包括2007年3月29日公開之Wu等人之 美國專利公開案第20070071675號(其係以引用的方式併入本文中)中所揭示的DVD中之任一者。
DVD-Ig適用作治療劑以同時阻斷兩個不同目標以增強功效/安全性及/或增加患者適用範圍。該等目標可包括可溶性目標(IL-13及TNF)及細胞表面受體目標(VEGFR及EGFR)。DVD-Ig亦可用以在腫瘤細胞與T細胞(Her2與CD3)之間誘發重定向細胞毒性以用於癌症治療，或在自身反應性細胞與效應細胞之間誘發重定向細胞毒性以用於自體免疫/移植，或在任何靶細胞與效應細胞之間誘發重定向細胞毒性以消除任何給定疾病中導致疾病之細胞。
另外，DVD-Ig可用以當其經設計以靶向同一受體上之兩個不同抗原決定基時觸發受體叢集及活化。此舉可對製造促效性及拮抗性抗GPCR治療劑具有益處。在此情況下，DVD-Ig可用以靶向一個細胞上之兩個不同抗原決定基以叢集/信號轉導(兩個細胞表面分子)或信號轉導(在一個分子上)。類似地，DVD-Ig分子可經設計以藉由靶向CTLA4細胞外域之兩個不同抗原決定基(或同一抗原決定基之2個複本)而觸發CTLA-4連接及陰性信號，進而導致免疫反應之下調。類似地，DVD-Ig可靶向細胞表面受體複合物之兩個不同成員(例如，IL-12Rα及IL-12Rβ)。此外，DVD-Ig可靶向CR1及可溶性蛋白質/病原體以驅動目標可溶性蛋白質/病原體之快速清除。
另外，本發明之DVD-Ig可用於組織特異性傳遞(靶向組織標記及疾病介體以達成增強之局部PK，因此達成較高功效及/或較低毒性)，包括細胞內傳遞(靶向內在化受體及細胞內分子)、傳遞至腦內(靶向轉鐵蛋白受體及CNS疾病介體以穿過血腦障壁)。DVD-Ig亦可充當載體蛋白以經由與抗原之未中和抗原決定基結合而將彼抗原傳遞至特定位置，以及增加抗原之半衰期。
本發明提供包括任何合適蛋白質之穩定粉末組合物，蛋白質包 括本文中所述及如本文中所述製備之彼等蛋白質。舉例而言，粉末可包括蛋白質或肽(例如，抗體或其抗原結合部分)及賦形劑，其中組合物包括小於約6%之殘餘水分。在某些實施例中，組合物包括小於約5.5%、5%、4.4%、4%、3.5%或3%之殘餘水分。在一些實施例中，組合物包括小於2%或1%之殘餘水分。在其他實施例中，組合物包括由以上值所限制之殘餘水分範圍，例如介於約4%與6%之間、介於約4.5%與5.5%之間或介於約3%與5%之間的殘餘水分。在一些實施例中，所得粉末組合物之殘餘水分含量在約1%與約3%之間、約1.5%與2.5%之間、約1.4%與約2%之間、約4%與6%之間或約4.5%與約5%之間。在其他實施例中，粉末組合物包括約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%或7%之殘餘水分。
在一些實施例中，蛋白質在所要之時段內保持其生物活性。在一實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少3個月內係穩定的。在一些實施例中，粉末在周圍溫度及濕度下至少6個月、9個月、1年、2年、3年或5年內係穩定的。在其他實施例中，粉末在40℃下至少3個月內係穩定的。在其他實施例中，粉末在40℃下至少3個月、6個月、9個月、1年、2年或5年內係穩定的。在其他實施例中，粉末在40℃及周圍濕度下至少3個月、6個月、9個月、1年、2年或5年內係穩定的。
本發明之粉末組合物及/或包括該等粉末組合物之醫藥組合物可包括賦形劑。合適賦形劑包括(但不限於)海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。該方法可進一步包括添加酸性組份、抗氧化劑及/或張力調節劑。
在一些實施例中，組合物具有約0.27：1.0至約2.8：1.0、約0.27：1.0至約1.4：1.0、約0.27：1.0至約0.7：1.0或約0.7：1之賦形劑與抗體或其抗原結合部分之質量比，且該賦形劑為海藻糖或蔗糖。在其他實施例 中，組合物具有約0.27：1.0至約2.8：1.0、約0.27：1.0至約1.4：1.0、約0.27：1.0至約0.7：1.0、約0.7：1或約0.35：1之賦形劑與抗體或其抗原結合部分之質量比，且該賦形劑為山梨糖醇。
另外，本發明提供包括有效量之本文中所述粉末之醫藥製劑。醫藥學上可接受之載劑可為非經腸、經口、腸內或局部投與所接受之任何載劑。載劑可為固體、半固體或液體(例如，水或有機液體)或其組合。
可將粉末混合(例如，溶解或包埋)於醫藥學上可接受之載劑中。醫藥學上可接受之載劑可(例如)為非經腸投與所接受且可包括(例如)水。該方法可進一步包括向醫藥組合物中添加一或多種酸性組份、抗氧化劑及/或張力調節劑。另外或其他，可將例如緩衝劑、黏度調節劑、調味劑、著色劑等之合適添加劑添加至本發明之醫藥組合物中。
粉末醫藥組合物可經熔融擠出、壓製或以其他方式加工以形成(例如)錠劑或其他固體或半固體組合物。可用(例如)聚合物(諸如PLGA)塗佈該粉末以形成持續釋放及/或延遲釋放醫藥組合物。另外或其他，可將組合物用(例如)腸溶衣囊封或塗佈。可使用塗層及/或賦形劑(例如)以保護藥物避免由諸如聚乙二醇(例如，PEG 400)、乙醇、DMSO、NMP、冰醋酸或其類似物之有機溶劑引起之沈澱、變性或氧化。
亦涵蓋液體組合物，例如水性組合物。該等組合物可適於(例如)經口或靜脈內投與，且可包括任何合適賦形劑或添加劑，諸如張力調節劑或緩衝劑。在一些實施例中，液體醫藥組合物具有低百分比之蛋白質聚集體，但水性蛋白質調配物具有高濃度之蛋白質聚集體。在一實施例中，水性組合物包括水及高濃度之蛋白質(例如抗體)，其即使在不存在界面活性劑或其他類型賦形劑之情況下亦含有小於約5%之蛋白質聚集體。在一實施例中，組合物包括不大於約7.3%之聚集體蛋 白質；組合物包括不大於約5%之聚集體蛋白質；組合物包括不大於約4%之聚集體蛋白質；組合物包括不大於約3%之聚集體蛋白質；組合物包括不大於約2%之聚集體蛋白質；或組合物包括不大於約1%之聚集體蛋白質。在一實施例中，組合物包括至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之單體蛋白質。介於上述濃度之間的範圍(例如至少約98.6%之單體蛋白質、不大於約4.2%之聚集體蛋白質)亦意欲為本發明之部分。另外，意欲包括使用上述值中任一者之組合作為上限及/或下限之數值範圍。
IV.本發明之用途
本發明之組合物可在治療上(亦即活體內)使用，或用作活體外或原位目的之試劑。如本文中所述及例示，噴霧乾燥可用以製備用作產生/製造例如以下各物之起始物質之乾燥蛋白質粉末：(a)用於治療潰瘍性結腸炎之ABT-874的腸內調配物，(b)用於糖尿病性潰瘍之阿達木單抗之局部調配物；及(c)用於治療哮喘之ABT-308之肺部劑型。另外，噴霧乾燥抗體可用於MELTREX熔體擠出方法，此係因為併入玻璃狀賦形劑基質(例如海藻糖)內之單株抗體(mAb)可能展現對熱展開/變性之較高穩定性。此可再提供開發(例如)用於蛋白質之經口投與之新穎固體蛋白質劑型的機會。
治療性用途
本發明之方法亦可用以製備具有對於治療性用途有利之特徵的醫藥組合物。包括液體或固體組合物之醫藥組合物可以醫藥組合物或調配物形式使用以治療個體之病症。
本發明之組合物可用以治療治療性蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分適於治療之任何病症。"病症"為將自用抗體進行治療受益之任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所述 病症之彼等病理狀況。在抗TNFα抗體之情況下，可投與治療有效量之抗體以治療自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎)、腸病症(諸如克羅恩氏病(Crohn's disease))、脊柱關節病(諸如強直性脊椎炎)或皮膚病症(諸如牛皮癬)。在抗IL-12抗體之情況下，可投與治療有效量之抗體以治療神經病症(諸如多發性硬化症)或皮膚病症(諸如牛皮癬)。可使用本發明之組合物治療之病症的其他實例包括癌症，包括乳癌、白血病、淋巴瘤及結腸癌。
術語"個體"意欲包括活生物體，例如原核生物及真核生物。個體之實例包括哺乳動物，例如人類、犬、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔、大鼠及轉殖基因非人類動物。在本發明之特定實施例中，個體為人類。
術語"治療"係指治療性治療與防護性或預防性措施。需要治療者包括已患有病症者以及有待預防病症者。
可根據已知投與方法向需要治療之哺乳動物(包括人類)投與水性或固體組合物。投與方法之實例包括靜脈內投與(諸如大丸劑或藉由經一段時間連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、皮內、經皮、經口、局部或吸入投與。
在一實施例中，藉由皮下投與向哺乳動物投與組合物。就該等目的而言，可使用注射器以及其他裝置來注入組合物，該等裝置包括注入裝置(例如，Injecteas及Genject裝置)；筆型注射器(諸如GenPen)；無針裝置(例如，MediJector及BioJector)；及皮下貼片傳遞系統。
本發明亦包括容納組合物之傳遞裝置。該等裝置之實例包括(但不限於)注射器、筆、植入物及貼片。筆型自動注射器之實例描述於2007年6月29日申請之美國申請案第11/824,516號中。
蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分之適當劑量("治療有效量") 將視(例如)以下因素而定：待治療之病狀、該病狀之嚴重性及進程、其係為預防性或治療性目投與、先前療法、患者之臨床病史及對該蛋白質之反應、所用蛋白質之類型及主治醫師之判斷。本發明之組合物係適當地一次或經一系列治療投與患者且可自診斷時起在任何時刻投與患者。可將組合物以單一治療或結合適用於治療所述病狀之其他藥物或療法投與。
在一實施例中，在治療上使用本發明之組合物，例如包括阿非莫單抗及/或任何其他合適抗體或其抗原結合部分之組合物。在一實施例中，組合物為用於治療敗血症之醫藥組合物。
敗血症、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及阿非莫單抗
敗血症係定義為對感染之全身發炎性反應。該感染可為(例如)病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染。敗血症最終導致免疫勝任細胞之活化及與多種細胞因子(TNF-α、IL-1等)之釋放相關的全身發炎性反應。如ACCP(美國胸腔醫師學會(American College of Chest Physicians))所定義，存在不同階段/種類之敗血症：SIRS(全身發炎性反應症候群(Systemic Inflammatory Response Syndrome))(各種起源之全身發炎性反應(感染、紅斑等)；敗血症(由感染所引起之SIRS)；嚴重敗血症(具有器官機能失調/功能障礙之敗血症)；及敗血性休克(具有休克之敗血症))。為診斷該等種類之敗血症，必須滿足不同準則。
初次發生之免疫反應藉由多種二次介體配合及擴增。生物體並非處於將炎症侷限於其起始位置(主要是肺部或血液循環)的狀態。可影響不同器官，其對若干種身體機能具有強烈影響。因此，敗血症之可能病徵包括體溫過高、呼吸急促、心動過速、血壓過低及精神混亂。由於多種指示，極難以診斷敗血症，此係造成敗血症患者高死亡率之因素。
已知治療敗血症患者之不同藥物，尤其阿法替加色羅(活化蛋白 C)及阻斷血液凝固之抗凝血酶III及減弱炎症之可的松(cortisone)(低劑量)。Bloos等人，Aktuelle Ernährungsmedizin,28：186-190(2003)。因為TNF-α為敗血症之一種主要介體，所以處理敗血症之一種方法為阻斷TNF-α以避免其起作用。TNF-α之局部釋放增加血流量及血管滲透性。此使得流入參與宿主防護之流體、細胞及蛋白質之受感染組織中。為防止感染擴散至血液中，小血管隨後凝結且流體流至起始適應性免疫反應之淋巴結。在全身性感染期間，TNF-α以類似方式起作用，導致休克及彌漫性血管內凝血。結果為凝血因子耗盡、持續出血及多重器官衰竭。Janeway等人，Immunobiology(Garland Publishing,1994)。可藉由非經腸投與抗TNF-α抗體來達成阻斷TNF-α。藉由設計抗體片段阿非莫單抗，應達成較佳組織穿透以及較低免疫原性問題。
在一些實施例中，本發明包括向個體(例如人類)投與蛋白質、肽、抗體或其抗原結合蛋白，以使得個體中其目標之活性得以抑制且達成治療。在一些實施例中，病症係選自包含以下各病症之群：關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊柱關節病、全身性紅斑狼瘡症、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎，哮喘、過敏性疾病、牛皮癬、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、彌漫性血管內凝血、川崎氏病(Kawasaki's disease)、格雷夫氏病(Grave's disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、顯微性腎血管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、敗血症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲性疾病、後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)、帕金 森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化症、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病(Addison's disease)、散發性疾病、I型多腺性缺乏及II型多腺性缺乏、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫症候群、禿頭症、斑禿、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病(Reiter's disease)、牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、與衣原體、耶爾森氏菌(yersinia)及沙門氏菌(salmonella)相關之關節病、脊柱關節病、動脈粥樣化病/動脈硬化、異位性過敏、自體免疫水皰病、尋常型天疱瘡、落葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線狀IgA病、自體免疫溶血性貧血、庫姆陽性溶血性貧血(Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由疾病(Royal Free Disease)、慢性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞性動脈炎、原發性硬化性肝炎、隱源性自體免疫肝炎、後天性免疫缺乏病症候群、後天性免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、常見可變型免疫缺乏(常見可變型低丙種球蛋白血症)、擴張型心肌病、女性不育症、卵巢衰竭、卵巢早衰、纖維化肺病、隱源性纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織疾病相關之間質性肺病、混合結締組織病相關之肺病、系統性硬化症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多肌炎相關之肺病、修格蘭氏病(Sjogren's disease)相關之肺病、強直性脊椎炎相關之肺病、血管炎彌漫性肺病、血黃素沈積症相關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、阻塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅性白血球肺炎、淋巴細胞滲透性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫肝炎、1型自體免疫肝炎(經典自體免疫或狼瘡樣肝炎)、2型自體免疫肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫介導之低血糖、B型胰島素抵抗伴 黑色棘皮病、副甲狀腺機能不足、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮癬、2型牛皮癬、特發性白血球減少症、自體免疫性嗜中性球減少症、腎病NOS、腎小球腎炎、顯微性腎血管炎、萊姆病(lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS性男性不育症、精子自體免疫、多發性硬化症(所有亞型)、交感性眼炎、繼發於結締組織病之肺高壓症、古德帕斯氏症候群(Goodpasture's syndrome)、結節性多動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏病(Still's disease)、系統性硬化症、修格蘭氏症候群(Sjorgren's syndrome)、高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少症、特發血小板減少症、自體免疫甲狀腺病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺腫性自體免疫性甲狀腺功能低下(橋本氏病(Hashimoto's disease))、萎縮性自體免疫性甲狀腺功能低下、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性血管炎、白斑性急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化症、酒精誘發之肝臟損傷、膽汁鬱積、特異性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏及哮喘、B族鏈球菌(GBS)感染、精神障礙(例如，抑鬱症及精神分裂症)、Th2型及Th1型介導疾病、急性及慢性疼痛(各種形式之疼痛)及癌症(諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌)及造血系統惡性疾病(白血病及淋巴瘤)、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生性或感染性過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥反應、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側索硬化症、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗受體超敏性反應、主動脈及周邊 動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬化、動靜脈瘺管、共濟失調、心房纖維顫動(持續性或陣發性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥反應、骨髓移植(BMT)排斥反應、房室束支傳導阻滯、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、灼傷、心律失常、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺旁路炎症反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多灶性房性心動過速、化學療法相關之病症、慢性骨髓細胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水楊酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺心症(cor pulmonale)、冠狀動脈病、庫茲德-賈克氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、培養陰性敗血症、囊狀纖維化、細胞因子療法相關之病症、拳擊手失智症(Dementia pugilistica)、髓鞘脫失病、登革出血熱、皮炎、皮膚病狀況、糖尿病(diabetes；diabetes mellitus)、糖尿病性動脈粥樣硬化病、彌漫性路易體病(Diffuse Lewy body disease)、擴張性充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群(Down's Syndrome)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物誘發之運動障礙、藥物過敏、濕疹、腦脊髓炎、心內膜炎、內分泌病、會厭炎、艾伯斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus)感染、紅斑性肢痛病、錐體束外及小腦病症、家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症、胎兒胸腺植入物排斥反應、弗立特里希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)、周邊動脈功能失調症、真菌敗血症、氣壞疽、胃潰瘍、腎小球性腎炎、任何器官或組織之移植排斥、革蘭氏陰性敗血症(gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症(gram positive sepsis)、歸因於細胞內生物體之肉芽瘤、毛細胞白血病、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、橋本甲狀腺炎(hashimoto's thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥反應、血色素沉著症、血液透 析、溶血性尿毒症候群/溶解血栓血小板減少性紫癜、出血、A型肝炎、希氏束心律不齊(His bundle arrythmias)、HIV感染/HIV神經病、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、過動性運動障礙、超敏反應、超敏性肺炎、高血壓、運動不足性運動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、特發性阿狄森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒性、衰弱、嬰兒脊髓性肌肉萎縮、主動脈炎症、A型流感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血-再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性肌肉萎縮、卡波濟氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎臟移植排斥反應、退伍軍人桿菌(legionella)、利什曼病(leishmaniasis)、麻瘋病、皮質脊髓系統病變、脂肪水腫、肝臟移植排斥反應、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增生症、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性偏頭痛、線粒體多系統病症、混合結締組織病、單株丙種球蛋白病變、多發性骨髓瘤、多系統退化(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager及Machado-Joseph)、重症肌無力、細胞內鳥型分枝桿菌、結核分枝桿菌、脊髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎變性病、神經退化性疾病、I型神經源性肌肉萎縮、嗜中性白血球減少性發熱、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkins lymphoma)、腹主動脈及其分支之閉塞、閉塞性動脈病症、okt3療法、睾丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/輸精管複通術程序、臟器腫大、骨質疏鬆症、胰腺移植排斥反應、胰腺癌瘤、副腫瘤症候群/惡性疾病高鈣血症、副甲狀腺移植排斥反應、骨盆發炎性疾病、全年性鼻炎、心包膜疾病、周邊動脈粥樣硬化病、周邊血管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群(多發性神經病、臟器腫大、內分泌病、單株丙種球蛋白病變及皮膚變化症候群)、灌注後症候群、泵入後症候群、MI後心 切開術症候群、先兆子癇、進行性核上眼神經麻痹症、原發性肺動脈高壓症、放射療法、雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon)及疾病、雷諾氏病(Raynoud's disease)、雷弗素姆氏病(Refsum's disease)、規則窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆、血清陰性關節病、休克、鐮刀狀細胞貧血症、皮膚同種移植排異反應、皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、實體腫瘤、特異性心律不齊、脊髓共濟失調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦結構損傷、亞急性硬化性全腦炎、昏厥、心血管系統梅毒、全身性過敏反應、全身性發炎反應症候群、全身性發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細血管擴張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少、毒性、移植、創傷/出血、III型超敏反應、IV型超敏反應、不穩定性心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心室纖維顫動、病毒及真菌感染、致命腦炎/無菌性腦膜炎、生命相關之噬血細胞症候群、韋尼克-高沙可夫症候群(Wernicke-Korsakoff syndrome)、威爾森氏病(Wilson's disease)及任何器官或組織之異種移植排斥反應。
非治療性用途
本發明之組合物亦可用於非治療性用途，亦即活體外目的。舉例而言，本文中所述之蛋白質粉末及相關組合物可用於醫學及生物技術中之診斷性或實驗性方法，包括(但不限於)基因組學、蛋白質組學、生物資訊學、細胞培養、植物生物學及細胞生物學中之用途。舉例而言，本文中所述之組合物可用以提供作為標記及偵測方法中之分子探針所需的蛋白質。本文中所述組合物之額外用途在於為製造目的向包括細胞生長及蛋白質產生之細胞培養試劑提供補充劑。
含有高濃度(例如)抗體之組合物可用作實驗室使用之試劑。該等 高濃度形式之抗體將擴展實驗室實驗之當前限制。
用於本發明之調配物之另一替代性用途為向食物產品中提供添加劑。在一些實施例中，因為本發明之組合物基本上由蛋白質及糖組成，所以其可用以向食品中傳遞高濃度之所要蛋白質，諸如營養補充劑。本發明之組合物可因此提供高濃度之蛋白質。
製品
在本發明之另一實施例中，提供一種製品，其含有本發明之蛋白質粉末或相關組合物，且提供關於其使用之說明書。在一實施例中，該製品包含容器。合適容器包括(例如)一或多個瓶、小瓶(例如，雙腔小瓶)、注射器(包括單腔及雙腔注射器)、含有針筒之筆型自動注射器及試管。容器可由諸如玻璃、塑膠或聚碳酸酯之多種材料形成。容器容納水性調配物且容器上之標籤或與容器相關之標籤可指示使用說明。舉例而言，標籤可指示組合物適用於或意欲用於皮下投與。標籤可(例如)指導使用者添加例如無菌水或生理食鹽水之液體以製備用於藉由(例如)注射投與之組合物。容納組合物之容器可為允許重複投與(例如，2-6次投與)例如水性調配物之多用途小瓶。該製品可進一步包含第二容器。該製品可進一步包括就商業性及使用者觀點而言合乎需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾紙、針、注射器及具有使用說明書之包裝插頁。
本發明藉由以下實例進一步說明，不應將該等實例理解為限制性。
本發明之例證
在此實例中，將IgG分子之Fab片段噴霧乾燥且進行分析。此研究之範疇為找出用於噴霧乾燥當意欲用作儲存中間物時具有高產率及良好儲存穩定性之Fab片段的合適調配物及方法條件。藉由添加不同糖來達成在噴霧乾燥過程及後續儲存中蛋白質之穩定化。對於此研究 而言，將海藻糖、蔗糖及山梨糖醇添加至液體蛋白質濃縮物中。使用來自各種分析方法(尤其大小排除層析法、動態光散射、濁度量測及等電聚焦)之資料分析蛋白質穩定性。
材料 MAK 195 F濃縮物
用於此實例之蛋白質為由Abbott Laboratories提供之呈水溶液形式之阿非莫單抗(MAK 195 F)，其含有：MAK 195 F(12.4mg/mL)；NaCl(8.77mg/mL)；Na3PO4(1.64mg/mL)；Pluronic® F68(0.1mg/mL)；及水(適量)。MAK 195 F濃縮物具有7.2之pH值且接近於等張(約286mosmol/kg)。其具有0.981mPas之黏度(由Schott Ubbelohde黏度計量測)及1.0086g/cm3之密度(由來自Chempro之DMA 46量測)。
阿非莫單抗蛋白為具有100千道爾頓(kDa)之近似分子量的鼠科動物抗TNF-α抗體(IgG3)之F(ab')2片段。其係由IgG3單株抗體之胃蛋白酶裂解進而產生各自包含214個胺基酸之輕鏈及含有233-241個胺基酸之重鏈而產生。約30%之Fd'片段在SerH222處經糖基化。由於不同糖基化模式，故阿非莫單抗在7.5至8.8之等電點(IEP)範圍內具有至多7個同功異型物。
在約400g之部分中在乾冰下獲得濃縮物。為避免重複之冷凍-解凍循環及呈液體狀態長期儲存，將濃縮物解凍且以40-50mL份等分試樣，儲存於-80℃下且在使用之前才解凍。
賦形劑
使用三種不同糖以穩定蛋白質：D-山梨糖醇(Sigma，產品：S-7547，批號：108H01461)；蔗糖(Sigma，產品S-7903，批號014K0010)；及D-(+)海藻糖二水合物(Sigma，產品：T5251，批號：113K3775)。
所有水溶液係用二次蒸餾水(Fi-stream 4BD；Fisons)製備，且必 要時，經由0.2μm膜過濾器(Schleicher & Schuell)過濾。
方法 噴霧乾燥
使用用於粉末回收之高效旋風分離器1用Büchi小型噴霧乾燥器B-191(圖1)進行噴霧乾燥實驗。使乾燥空氣以800l/min之氣流速率(90%之吸氣器功率)經由Luwa超濾器2(纖維玻璃；過濾材料種類：HEPA H13高效率粒子吸收劑)過濾，隨後進入加熱裝置3及乾燥腔室中。使所有液體饋料經由0.22μm過濾器單元過濾，隨後藉由蠕動泵5(QLF=約3mL/min；矽管=3mm)傳輸至乾燥腔室4。使用來自室內供應之壓縮空氣(QAA=700l/h)藉由雙流體噴嘴6(孔口直徑：0.7mm)進行霧化。該雙流體噴嘴裝備有自動清潔系統，亦使用壓縮空氣(4.5巴)及水冷系統。噴霧乾燥之後，將所得粉末自收集容器7回收於乾燥空氣手套箱(RH<2%)中，裝填於玻璃小瓶(氯丁基橡膠塞)中，用封口膜(parafilm)密封且儲存於-80℃下。將粉末產率定義為收集容器內粉末之量除以液體饋料中之總含固量。旋風分離器內部上之粉末沈積物未經收集。
大小排除層析法(SEC)
使用大小排除層析法來偵測可溶性聚集體。將由Amersham Biosciences購買之Tricorn Superose 12/300 GL管柱(分離範圍1-300kDa)連接至包含200系列LC泵、ISS 200自動取樣器及235C二極體陣列偵測器之Perkin Elmer高壓液相層析(HPLC)系統。在安裝Superose管柱之前，安裝phenomenex安全防護前管柱(裝載有AJ0-4489濾筒)以避免由粗粒子污染。移動相(緩衝液A，流動速率：0.5mL/min)為添加有氯化鈉(0.5mol/l)之磷酸鉀緩衝液(pH 6.9)，將其經由0.2μm膜過濾器(Schleicher & Schuell，FP 30/0.2 CA)過濾且使用氦脫氣約10分鐘。直接量測所有樣品(例如，液體饋料)或用緩衝液A小心地將其再 溶解至1mg/mL之蛋白質濃度(噴霧乾燥(sd)粉末)且製備之後立即進行分析。每次操作之注入體積為100μl，且一般將所有樣品量測兩次(液體饋料)或三次(噴霧乾燥粉末)以確保可重現結果。使用Perkin Elmer TotalChrom Navigator軟體6.2版將所有層析圖手動積分。
差示掃描熱量測定(DSC)
使用Mettler Toledo DSC 822e研究熱事件。在乾燥空氣條件(手套箱)下將5-15mg粉末稱入(Mettler,AT DeltaRange®)鋁盤中。將該等鋁盤冷密封且插入量熱器中，其中使其暴露於依次經過預期Tg之加熱及冷卻之規定溫度程式(視調配物而定)(加熱/冷卻速率：10℃/min)中。藉由Mettler STARe軟體6.10版估計玻璃轉移溫度，在加熱步驟中預先將其定義為吸熱轉化之中點。僅考慮第二及第三個加熱循環，以避免其他不可逆吸熱事件之干擾。在整個實驗中，將量測單元乾燥且用N2氣體淨化。
廣角X射線繞射(WAXD)
在40kV/40mA及25℃下使用具有Cu Kα輻射(λ=0.15418mm)之Philips X'pert型MPD藉由X射線粉末繞射研究粉末之結晶度。將60-80mg之粉末量填充至鋁樣品固持器中且立即掃描。在2θ=0.5°-40°之範圍內以0.02°/s之步長量測所有掃描。藉由使用基於Black及Lovering之方法根據繞射圖(參見下文)之結晶及非晶形區域計算樣品結晶度(結晶程度)。Black,Lovering,Journal of Pharmacy and Pharmacology 29：684-687(1977)。
C=I c /(I c +I a )=AUC 結晶 /AUC 總 =(AUC 總 -AUC 非晶形 )/AUC 總
C為結晶程度(當乘以100時有時亦描述為結晶度百分比)，Ic及Ia分別表示由結晶區域或非晶形區域散射之X射線之強度，其等於峰及寬暈(halo)之曲線下面積(AUC)。藉由自圖中切割結晶峰且使用曲線 擬合來計算AUC非晶形。
動態光散射
用Zetasizer Nano ZS(Malvern,Germany，軟體：DTS，版本：4.2)進行動態光散射(DLS)量測以偵測可溶性以及不溶性聚集體。Zetasizer使用633nm之雷射光且在173°下偵測散射(背向散射偵測)。對於尺寸量測而言，其具有0.6-6000nm之量測範圍。藉由量測樣品中粒子之布朗運動(Brownian motion)來測定粒度。Malvern儀器：Zetasizer Nano Series User Manual.MAN 0317，2.0期，2004年3月。在無任何添加劑之情況下測試液體調配物，且用二次蒸餾水(經由0.2μm過濾)將粉末稀釋至原始蛋白質濃度。藉由使用低容量比色管(拋棄式低容量比色管，Malvern)，每次量測僅需0.5mL溶液。用2mL比色管測試提供相同結果(資料未展示)。2分鐘平衡時間(25℃)之後，對每一樣品進行3次量測，各自操作5次(操作持續時間：30s，操作之間的延遲：2s)。對於每一粉末/溶液樣品而言，將此程序進行三次。所得圖表以記分表形式輸出且經由MS Excel轉換成圖表，使每個樣品產生三條繪製曲線，其展示尺寸-體積及尺寸-強度分布。
掃描電子顯微術(SEM)
使用Amray 1810 T掃描電子顯微鏡在20kV下經由電子顯微術照片來研究粒度及形態。使用自黏薄膜將小粉末樣品固定於鋁樣品棒(G301,Plano)上。在20mA/kV下用金濺鍍(Hummer JR Technics)1.5分鐘之後，將樣品置放於顯微鏡下且獲取不同放大率(通常為1000倍、2000倍及3000倍)之照片。一般而言，評估在3000倍之放大率下獲取之照片。
卡爾費雪滴定(Karl Fischer Titration)
用Mitsubishi濕度計(CA-06 Coulometric)及Mitsubishi水蒸發器(VA-06)量測噴霧乾燥(sd)粉末的水分含量。在乾燥空氣條件(手套箱) 下將約70mg之粉末樣品填充至特定樣品固持器中。用Mettler AT DeltaRange分析天平稱量空樣品固持器。藉由連接樣品固持器與蒸發器單元，將粉末填充至經拉入加熱烘箱單元中之玻璃蒸發皿中。當水經蒸發(150℃)且經由氮氣流(約200mL/min)定量轉移至滴定單元中時，再稱量樣品固持器以計算實際樣品重量。以0.01μg H2O/min之滴定速率起始滴定。
顯微鏡下可見粒子
用電腦輔助粒子計數裝置注射器(Klotz,Germany，軟體：SW-CA，版本1.2)觀察(例如)再溶解之噴霧乾燥粉末的粒子污染。經由在雷射器前降低至250μm之直徑的流通單元吸入液體。當粒子經雷射束擊中時，其偵測強度降低。雷射光之衰減指示粒度。用二次蒸餾水(經由0.2μm過濾)將所有粉末復水至其原始濃度，且經由系統泵出0.8mL溶液(一次用於沖洗系統，三次用於粒子計算)。針對1mL溶液計算結果。對於醫藥應用而言，軟體根據美國藥典(United States Pharmacopoeia，USP)或歐洲藥典(European Pharmacopoeia，Ph.Eur.)之條例將粒子分為8種不同尺寸範圍(1-50μm)之等級。
等電聚焦(IEF)
阿非莫單抗之IEF分離係基於Fd'片段及輕鏈變異體之電荷差。其主要用作阿非莫單抗之一致性測試，但其亦可用作用於穩定性測試之工具。用與Serva Blue Power 3000電源連接之Pharmacia Multiphor II腔室進行聚焦。將pH梯度為6-9之即用凝膠(Servalyt Pr ecotes 6-9，125×125mm，厚度0.3mm；Serva,Germany)置於冷卻板(4℃，用一些作為傳熱介質之Bayol F覆蓋)上。將所有樣品稀釋至約4mg/mL之蛋白質濃度，將10μL置於凝膠上。聚焦程式起始於200V且花費約195min(終點電壓2000V)。在固定20分鐘之後，將凝膠用考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色(20min)且接著脫色若干次。所用溶液 列於以下表1中。
用水沖洗且在室溫下乾燥隔夜之後，使用Desaga CAB UVIS VD 40工作站與ProViDoc®軟體(3.20版)檢測且掃描凝膠。
濁度
濁度為造成光散射及吸收而非以直線透射穿過樣品之光學特性的表現。其可由包括固體、膠體及氣泡之任何懸浮粒子造成。儘管濁度並非明確定義之參數，但其係藉由比較樣品與例如肼凝膠之乳白光標準物來量測。使用Hach Ratio XR濁度計來評估樣品之濁度單位(nephelometric turbidity units，NTU)。用Hydrazin標準物校準濁度計。在量測Nessler管之空白值之後，將樣品用二次蒸餾水(經由0.2μm過濾)稀釋或復水至原始蛋白質濃度且接著置於光束中。為排除玻璃不均一性之影響，重要的是在空白量測期間標記管之方向且對於樣品量測以同一方向使用管。
顯色
為偵測再溶解之噴霧乾燥粉末之顯色改變，使用LICO 400(Hach Lange，Switzerland)，其為用於透明液體之顏色量測的比色計。其確 定最接近樣品之參考溶液且量化樣品與參考之間的顏色變化。在此研究中，使用以亮度(L，黑色-白色)及顏色(±a，紅色-綠色；±b，黃色-藍色)之座標定義顏色的CIE-Lab色空間(CIE為國際照明委員會(Commission Internationale d'Eclairage)之縮寫)。使用來自Ph.Eur.之標準溶液(BG 5-7，棕黃色，經稀釋；B 5-9，棕色)校準LICO 400。將所有粉末樣品復水至原始濃度，將200μl填充至小容量石英玻璃比色管中。
UV-光譜分析
為測定濃縮物或超濾等分試樣之蛋白質濃度，使用Perkin Elmer Lambda 25UV/VIS光譜儀。將樣品稀釋至約0.6mg/mL之蛋白質濃度。用樣品溶液填充三個石英玻璃比色管且將其中每一者在波長(λ)=280nm及λ=320nm下量測三次。使用以下方程式使用吸光度值(由UV WinLab 5.0軟體，Perkin Elmer提供)來計算蛋白質濃度：c=[(A 280 -A 320 ) 平均 /1.37]×F(mg/mL) 1.37=ε 280nm -ε 320nm F=V H2O /V 蛋白質 +1在該等方程式中，F為稀釋因子，A表示所量測之吸光度，ε為莫耳消光係數(使用1cm比色管，1mg/mL溶液之吸光度)，且V表示在第一稀釋步驟中之體積。
交叉流過濾
為達成較高濃度之阿非莫單抗溶液，使用Millipore Labscale® TFF系統超濾濃縮物。將原始阿非莫單抗濃縮物沿分子量截止(MWCO)為30kDa之過濾器裝置持久泵入。除蛋白質外之所有成份皆穿過膜且收集於外部容器中。蛋白質本身返回至循環流動中。可藉由體積規模大致估計當前濃度。在過濾過程終止之後使用UV-光譜分析 來計算精確蛋白質濃度。
結果 MAK濃縮物之特徵
新近解凍之濃縮物通常展示約0.9-1%之聚集(等分試樣之間可能存在差異，因此每一等分試樣在解凍之後立即經由SEC研究)且無可偵測斷裂。根據用分子量標記套組(碳酸酐酶，分子量(Mr)=29kDa；及β-澱粉酶，Mr=200kDa)進行之實驗，聚集體主要為二聚體。DLS圖表展示單體具有約10nm之流體動力學直徑。濃縮物展現相對較低之顯微鏡下可見粒子污染及約5NTU之濁度值。觀察到5種同功異型物之典型IEF譜帶圖案。在所有其他IEF實驗中，將純濃縮物用作標記/標準物，因此直接偵測任何差異。
在顯色量測中，濃縮物最接近標準溶液B9，其為略帶棕色之幾乎無色溶液。濃縮物具有1.009g/cm3之密度及0.981mPas之黏度(兩者均於20℃下量測)。
MAK濃縮物之噴霧乾燥
用不含任何額外穩定劑之純濃縮物進行第一噴霧乾燥實驗。測定乾燥過程中蛋白質損傷之程度。
MAK之過程穩定性
為測定噴霧乾燥過程中蛋白質如何受損，根據Büchi 191上現有之研究(例如Maury)採用第一實驗之過程參數：T入=130℃，QLF=約3mL/min，QAA=700l/h，QDA=800l/min，使得T出為約80℃。Maury等人，Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(3)：565-573(2005)。
所得白色粉末(旋風分離器產率：約60%)包含具有多達13μm直徑的球形、環形或凹形粒子。再溶解之粉末(每毫升水22.9毫克粉末)具有12-13mg/mL之蛋白質濃度，暗示粉末之損失係歸因於噴霧乾燥過程及旋風分離器之分離效能。不可偵測到蛋白質或賦形劑自蛋白質 溶液之優先損失，此係由於在噴霧乾燥後的非晶形狀態。噴霧乾燥之MAK濃縮物的X射線繞射圖顯示結晶峰，此係由原料藥物(bulk drug substance)之其他組份(例如磷酸鈉及氯化鈉)產生。該峰型極接近於噴霧乾燥之氯化鈉的峰型。粉末之殘餘水分含量為1.4-2%，依該過程中之周圍條件(乾燥空氣之RH、室溫等)而定。
在SEC中，再溶解之粉末顯示聚集明顯增加(2.5-3%)。然而，無穩定劑之蛋白質溶液聚集不多。Maury發現噴霧乾燥、透析之IgG溶液多達17%。Maury等人，Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(2)：251-261(2005)。此表明在噴霧乾燥期間，片段較全長抗體不敏感，但對於冷凍-解凍所誘發之聚集並非如此。Wang等人，Journal of Pharm.Sci.96(1)：1-26(2007)。另一可能性為氯化鈉之存在引起的穩定效應。Arakawa等人發現溶液中蛋白質與氯化鈉之間穩定相互作用；然而彼等僅研究比此處所用鹽濃度高之鹽濃度。Arakawa等人，Biochemistry 21：6545-6551(1982)。在DLS及IEF結果中亦可見聚集增加。
在等電聚焦期間，在聚焦之起始點出現一新帶。其可歸因於大聚集體，彼等不可穿透入凝膠且因此不可根據其等電點移動(根據Serva GmbH，其IEF凝膠之孔具有約200-300kDa之截止值)。DLS結果顯示另一微米尺寸之峰。該峰在尺寸-體積分布中難以見到，但在尺寸-強度分布中清晰可見。少數大粒子比許多小粒子散射更多光，因為粒子之散射強度與直徑之6次冪成正比。Malvern Instru-ments：Zetasizer Nano Series User Manual.MAN 0317，2.0期，2004年3月。該另一峰顯然由蛋白質產生，因為用安慰劑濃縮物進行之DLS實驗並不顯示該流體動力學直徑之峰。因為在SEC中未見該等大聚集體，所以彼等必定不可溶。在所有粒子溶離份中，再溶解粉末之粒子污染增加。然而，實驗室噴霧乾燥器方法不可完全排除粒子污染(儘管入口 乾燥空氣經過濾)。此外，開啟小瓶獲取樣品亦可成為粒子來源。此外，與濃縮物相比，再溶解粉末之濁度顯著增加(濃縮物：5NTU；噴霧乾燥濃縮物：118NTU)。
找到合適T 入
為研究130℃之T入是否適於噴霧乾燥阿非莫單抗蛋白，進行具有不同溫度之實驗系列。將此系列之T入及在QLF=約3mL/min下所得之T出列於表2中。意欲找出乾燥效率與蛋白質過程穩定性之間令人滿意之折衷。
除180℃粒子比100℃粒子皺一點之外，未觀察到粒子形態中之差異，但該等差異極微小。含水量傾向於隨T入增加而降低，在100℃與130℃之間有相當大之向下梯級。在可偵測聚集中不存在實質差異，因此聚集似乎並非與溫度極相關。在較高溫度下粉末產率展示較小改善。所有該等結果皆推薦使用高T入，但等電聚焦(IEF)及動態光散射(DLS)結果指示阿非莫單抗之適當T入在中間範圍內。IEF中聚集譜帶之強度與乾燥空氣入口溫度線性相關。此外，在180℃下DLS圖展示較差結果。在較高流體動力學直徑(約16nm)下顯露出單體峰。聚集體似乎不僅如IEF中所呈現變得更多，而且變得更大。此外，單體峰在形狀(向較小分布變化)及尺寸上有所變化，指示蛋白質之實質損傷。在180℃下粒子污染亦較高，尤其在小粒子溶離份(<15μm)中。根據該等結果，認為僅130℃及155℃可為進一步研究所接受。因 為該兩個入口溫度之結果類似，所以選擇130℃之T入。此溫度下之操作應將蛋白質之熱應力降至最低，同時提供關於產品品質之總體可接受之結果。
聚集之根源
噴霧乾燥過程包含蛋白質失活之許多根源。一些根源可藉由用賦形劑改質調配物而減少，而失活之其他根源可能不受影響。過程中聚集之增加不可明確歸因於單一應力因素。在某種程度上可藉由選擇適當T入(此處約130℃)來控制熱應力。為研究不可避免之應力的程度，進行以下實驗。
蠕動泵之影響
為量化蠕動泵之剪切應力對聚集之影響，使用SEC。將10mL阿非莫單抗濃縮物用作液體饋料。使樣品經由Büchi B-191之管及蠕動泵泵入且僅在進入雙流體噴嘴之前收集。在泵入過程之前及之後測試液體饋料。注意到聚集無變化。可假定實驗室噴霧乾燥器之蠕動泵不影響或增加阿非莫單抗蛋白之聚集。由Brennan等人(Diabetes 34,353-359(1985))觀察到之泵誘發之胰島素聚集僅在長期泵入之後當胰島素離開溶液時出現。因為在此研究中穿過管至多僅需數分鐘，所以損傷之危險極小。
霧化過程之影響
藉由霧化兩個濃縮物樣品(2mL)且隨後經由SEC及IEF進行測試來測試霧化期間剪切應力之範圍。在IEF中，在樣品之間未能觀察到差異(在譜帶圖案中無額外譜帶或變化)。SEC結果展示聚集略增加。此增加並非如在整個噴霧乾燥過程中一般高。因此，可推斷一小部分聚集係由霧化造成，但如Maa等人所假定，蛋白質損傷可能不僅為剪切力之結果，而是大的空氣/液體界面之結果。Maa等人，Biotechnology and Bioengineering 54(6)：503-512(1997)。
熱應力之影響
蛋白質為熱敏性物質，但並非每一蛋白質對熱應力同樣敏感。為測定阿非莫單抗濃縮物可在何種程度上耐受溫度(熱應力)，將少量蛋白質溶液在不同時期內暴露於不同溫度下。濃縮物穩定性之準則為溶液之SEC資料、IEF結果及光學外觀。在凝聚出現之後，終止試驗。結果顯示於以下表3中。
濃縮物不可經受高於約60℃之溫度。在IEF凝膠中，在起始點出現額外譜帶伴隨著出現混濁。原始譜帶圖案之褪色指示可溶性蛋白質損失。在SEC檔案中亦偵測到可溶性蛋白質之損失。單體峰隨溫度及時間增加(縱座標定標)而縮小。甚至當施用超過24小時時，40℃仍不影響阿非莫單抗濃縮物。蛋白質之熱應力損傷並非由聚集之增加表示，而是由片段之外觀表示。聚集峰在很大程度上保持不變。因此施加於濃縮物上之熱應力產生斷裂及凝聚，而在噴霧乾燥期間施加於霧化濃縮物上之熱應力主要產生聚集。阿非莫單抗濃縮物可在短時期內經受至多約50℃之溫度。在約60℃下，蛋白質損傷迅速發生。在噴霧乾燥過程中，將小液滴暴露於濕球溫度(Twb)下，其通常比T出低25-30℃(在此研究中通常為80℃)，且暴露時間極短。Mumenthaler等人，Pharm.Res.11(1)：12-20(1994)。
小結
並不認為在泵入程序中聚集係由剪切力造成。在噴霧乾燥過程中霧化部分地造成聚集增加。熱應力對蛋白質穩定性起重要作用，但當施加於濃縮物時，其產生斷裂及不溶性聚集體。當小液滴在噴霧乾燥中達到約55℃之臨界溫度(低於T出25-30℃，由Mumenthaler等人假定，但僅歷時極短時期)時，聚集增加似乎係由溫度與霧化之相互作用引起。Mumenthaler 1994。
具有賦形劑之噴霧乾燥實驗
為最佳化阿非莫單抗蛋白之穩定，測試不同賦形劑。目標為在乾燥過程及後續儲存中之充分穩定性。
10-150mM山梨糖醇之添加
在當前實例中，將10mM、25mM、50mM、100mM或150mM山梨糖醇添加至阿非莫單抗濃縮物中以測定如表4中所示之穩定劑與蛋白質之最佳莫耳比率。結果顯示於圖2及圖3中。對於150mM山梨糖醇溶液而言，Tg下降至遠超過方法溫度及甚至室溫，且不可能適當地噴霧乾燥此混合物，如可見極低產率。混合物不可在其穿過乾燥腔室期間乾燥，且當進入旋風分離器時其仍具黏性，因此大部分黏附於旋風分離器壁上且不可收集。Maury等人，Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(3)：565-573(2005)。
由於產率較小，故不可進行該等樣品之卡爾-費雪滴定(KF)及廣角X射線繞射(WAXD)分析。除10mM山梨糖醇不夠外，聚集之增加並非極依賴於山梨糖醇之量。不同量之山梨糖醇並不影響粒子形態；但混合物中存在之賦形劑愈多，則採用圓形之粒子愈多(參見圖4)。儘管不可能噴霧乾燥純山梨糖醇溶液(作為對比)，但具有不同山梨糖醇濃度之安慰劑粉末均展示球形粒子。
結晶程度隨山梨糖醇淨重提高而降低。IEF結果基本上符合純濃縮物之結果，其中若可偵測到額外譜帶，則亦僅可模糊地偵測到。10mM混合物亦展示出乎意料之DLS圖。在尺寸體積分布中幾乎不可偵測到微米尺寸下之清晰峰，因此大聚集體之量極低。然而，25mM、50mM及100mM之所添加山梨糖醇展示幾乎相同之圖。粒子污染似乎與山梨糖醇(固體)之量線性相關，在10mM與25mM之間展示最大梯級。然而，該等差異主要限於較小粒子尺寸。大於15μm之粒子的值不相上下。因此，在添加25mM或50mM山梨糖醇之情況下阿非莫單抗濃縮物之充分穩定似乎可行。該兩種混合物除含水量及因此所得Tg外不展示大的差異。
10-100mM海藻糖之添加
由於在高山梨糖醇量下所測得之結果，故海藻糖測試系列排除150mM混合物。添加呈海藻糖二水合物形式之海藻糖，因此混合物包含於15mL阿非莫單抗濃縮物中之介於56.7mg與567mg之間的海藻糖二水合物，海藻糖：MAK之質量比可見於表5中。如圖5及圖6中可見，25mM與100mM之間的結果類似。與山梨糖醇相比，在所有濃度上產率平均值略高。在海藻糖之情況下，獲得極佳穩定，以及在所有濃度上產率穩定。增加之聚集極小，且僅對於10mM混合物而言，在SEC中可見聚集之較小增加。
然而，如DLS圖中可見，在所有混合物中均出現不溶性聚集。單體之量可與山梨糖醇結果相比。粒子之結晶度及球度與海藻糖之量成正比。添加海藻糖促使粒子採用圓形，此係因為純海藻糖之噴霧乾燥提供球形粒子(參見圖7)。如山梨糖醇實驗中可見，粒子污染似乎受賦形劑濃度影響，但其又限於小粒子尺寸(15μm)。由於海藻糖之高Tg(乾燥海藻糖之Tg為115℃)，故海藻糖混合物之Tg亦較高，此對於粉末穩定性研究而言可為有利條件。Adler等人，Journal of Pharm.Sci.88(2)：199-208(1999)。25mM及50mM似乎為最有希望之海藻糖比例以產生具有適當過程及儲存穩定性之粉末。與山梨糖醇粉末相比，所得粉末展示較少殘餘水。由於該等混合物之令人滿意的結果，故放棄用150mM海藻糖進行後續測試之選擇。
10-100mM蔗糖之添加
測試向阿非莫單抗濃縮物中添加25mM至100mM蔗糖(參見表6)。添加25mM至100mM之蔗糖提供70%至80%之高粉末產率(圖8及圖9)。在25mM下Tg達到最佳。在整個所有濃度中聚集增加實質上並無差異。此外，結晶程度(C)隨蔗糖之量線性降低。不同粉末之殘餘水分含量平均略高於對海藻糖混合物所觀察到之殘餘水分含量。粒子之球度受蔗糖之量影響。蛋白質傾向於形成凹入圓球，而蔗糖傾向於形成球形粒子。
在DLS檔案中，在100mM蔗糖之情況下與10mM蔗糖相比單體之量較低，但此印象限於強度-尺寸分布圖。在100mM蔗糖之體積-尺寸分布中，難以偵測到聚集峰。在10mM混合物中，可見較大聚集體(>1μm)。該等額外峰在其餘蔗糖混合物中並不顯露出。IEF凝膠不展示任何實質不規則性。對於50mM及100mM而言僅可模糊地偵測到額外譜帶，且可清楚地觀察到濃縮物之原始譜帶圖案。自10mM至100mM粒子污染降低，其在10mM與25mM之間展示最大梯級。在較大粒度之情況下，差異變得較小，因此對於大於15μm之粒子而言，所有混合物皆展示類似粒子量。考慮到所有該等結果，向阿非莫單抗濃縮物中添加10mM蔗糖並不夠；最佳結果係在25mM及50mM下得到。
小結
比較不同量之三種賦形劑的結果，顯然在噴霧乾燥過程中10mM之賦形劑不足以提供蛋白質保存。因此，所有賦形劑之最有利結果係在25mM及50mM下得到；100mM或甚至150mM不會改善結果(對於150mM山梨糖醇而言正相反)。對於山梨糖醇而言聚集增加之結果略高；其餘結果(蔗糖及海藻糖)大致類似。海藻糖及蔗糖在相同程度上保護阿非莫單抗蛋白且優於山梨糖醇。
儲存穩定性研究
使噴霧乾燥粉末暴露於不同溫度及殘餘濕度條件下歷時3個月。 測試條件為：冰箱(5℃，無濕度)；在60%相對濕度下25℃(類似於中歐(Central Europe)、北美洲(North America))；及在75%相對濕度下40℃(類似於東南亞(Southeast Asia))。
製備及檢驗方案
儲存純濃縮物以及噴霧乾燥之安慰劑。安慰劑粉末包含除阿非莫單抗蛋白外與真粉末(verum powder)(噴霧乾燥之蛋白質-賦形劑混合物)相同之固體。預先計算分析測試所需之粉末量以估計液體饋料之批量大小。將3批或4批50mL液體饋料在相同條件下噴霧乾燥；將所得粉末以一堆混合在一起，將計算量之來自其中之粉末填充至具有Viton®密封含氟彈性體及Duroplast®-螺帽之小鋁瓶中。選擇具有Viton®密封含氟彈性體之小鋁瓶，此係因為在初步測試中其僅展示較小水蒸氣滲透性(當在65% RH下在室溫下儲存10天以上時，未觀察到噴霧乾燥之乳糖的含水量改變)。在每一檢驗時間(t=1個月、2個月及3個月)下，自不同的空氣調節腔室移除各混合物之兩個相同樣品(小鋁瓶)。一個樣品用於分析；將另一個樣品轉移至冷凍箱中且儲存於-80℃下(作為可能之額外測試的儲備)。此舉得到總共152個小瓶，48個為每月自腔室移除(對於每一溫度而言有4個真粉末、4個真粉末儲備、4個安慰劑、4個安慰劑儲備)加上儲存於-80℃下而未經任何額外熱處理之8個小瓶(純濃縮物或新近噴霧乾燥之粉末)。
阿非莫單抗濃縮物
SEC結果(參見表7)。SEC層析圖表明在5℃下，濃縮物僅經受由聚集造成之極小損傷，但似乎該等聚集體主要並非二聚體。聚集體峰之寬平台指示存在三聚體/寡聚物。由出現斷裂及層析圖之AUC降低可見，較高溫度及較長儲存期導致嚴重降解。
研究不同溶離份之儲存穩定性動力學。然而，在所有溫度下單體之量不斷下降，在25℃及40℃下約2個月之後聚集似乎轉變為斷裂。在40℃下，在層析圖中不再可以單峰偵測到聚集，且在3個月之後，峰型主要為斷裂峰。在40℃下藉由肉眼分析樣品可能已觀察到嚴重損傷。1個月之後，儲存於40℃下之濃縮物展示混濁，而5℃及25℃樣品僅展示用裸眼不可見之較小顯色變化。
濁度量測展示類似結果。僅在40℃下在真粉末(含有蛋白質之樣品)中以及在安慰劑濃縮物中可偵測濁度之明顯變化。1個月之後，濃縮物展示大於150NTU之值，其在以後各月中仍增加。由於光學混濁，故對於40℃樣品而言終止DLS量測。在較低溫度下，未偵測到變化。粒子量測提供關於斷裂及聚集之額外資訊。細小粒子溶離份降低(粒子<25μm)，而大粒子之數目不斷增大，可能表示未由SEC偵測到不溶性聚集體(如由層析圖之AUC降低所呈現)。該等粒子亦應為造成樣品之可見混濁之粒子。
到目前為止，在25℃下之損傷似乎並不極其嚴重。然而，當分析IEF凝膠時證明此印象不正確。1個月之後，已可見譜帶強度之小變化，且3個月之後譜帶圖案明確不同於原始譜帶圖案。具有最高等電點(IEP)之同功異型物(pH 8.6-8.7)之譜帶完全消失。40℃儲存在1個月 之後產生嚴重損傷，在穩定性測試期間甚至變得更糟。
因此，當在較冷溫度下儲存時，阿非莫單抗濃縮物係相對穩定的。但一旦將濃縮物置於較高溫度下，即經由不同路徑發生降解。甚至當長期儲存時室溫(25℃)亦為應力因素。
噴霧乾燥粉末的穩定性
為經由噴霧乾燥提供長期穩定，具有額外賦形劑之阿非莫單抗濃縮物應展示不次於儲存於25℃下之濃縮物之結果的降解。作為額外測試，在噴霧乾燥過程之後立即進行卡爾費雪滴定及在3個月儲存之後進行卡爾費雪滴定以研究小鋁瓶之密封(迄今為止僅針對短期測試)及/或水分對於噴霧乾燥粉末之穩定性的影響。
濃縮物+25mM山梨糖醇
在3個月內儲存於5℃及25℃下之樣品展示良好穩定性(如表8中所示)。在SEC結果中，未能發現明顯變化(△聚集低於1%)。在40℃下，發生實質降解，聚集展示強烈增加且除二聚體峰之外出現大的多聚體。在3個月之後，可偵測到清晰片段峰。
然而，儲存於5℃及25℃下之樣品不展示任何顯色變化，在1個月之後40℃樣品(再溶解)之顏色稍微改變且在一段時間內甚至展示可見混濁。此混濁係由蛋白質造成，因為安慰劑樣品在任何時間或溫度 下均不改變顯色。在40℃下亦獲得濁度量測期間之最顯著結果。在噴霧乾燥後立即在約20NTU下起始，3個月之後40℃樣品達到大於120NTU之值。然而，20NTU顯著大於純濃縮物所示。40℃為山梨糖醇混合物之臨界參數，因為其大於Tg，因此不可再維持玻璃態。
粒子污染展示類似結果。在5℃及25℃下僅存在可偵測之較小變化。儲存於40℃/75% RH下之樣品展示顯著增加，尤其對於小粒子而言。此係由於在未觀察到輕微混濁之情況下粉末不可再溶解。安慰劑樣品中粒子之數目遠低於真樣品中粒子之數目，其不限於特殊粒子尺寸。儘管初步研究表明用於儲存粉末之小鋁瓶具水蒸氣不滲透性，但尚不能確保其絕對水蒸氣不滲透。
在噴霧乾燥過程之後立即進行卡爾費雪滴定及在3個月儲存之後進行卡爾費雪滴定。水分吸收不具蛋白質依賴性，此係因為除初始值略高之外安慰劑樣品展示相等結果。儘管5℃粉末僅展示較小濕度增加，但水分吸收仍依賴於空氣調節腔室之RH。山梨糖醇與MAK之組合比純賦形劑更吸濕，因為安慰劑樣品之值略高於真樣品之值。小瓶之溫度、殘餘濕度及水蒸氣滲透性對X射線繞射圖不具有任何影響。3個月之後，與初始圖(t=0)相比繞射圖案仍無差異。
甚至粉末之肉眼可見外觀亦受濕度影響。大多數樣品仍為易流動之鬆散材料，但40℃樣品熔合(尤其安慰劑樣品)。由DLS結果證實40℃樣品中所示之聚集增加。雖然5℃及25℃仍展示典型圖案(在10nm下之單體峰及微米尺寸下之小聚集峰)，但觀察到40℃樣品之不同圖案。甚至在尺寸-體積分布中，在單體峰處出現小凸肩，其表示在3個月之後甚至更不同之多聚體峰。在IEF凝膠中，在40℃下儲存2個月之後可偵測到變化，在起始點出現在較低溫度下不可見之額外譜帶。
濃縮物+25mM海藻糖
海藻糖混合物展示良好穩定性(表9)。在5℃及25℃/60% RH下儲 存期間，在整個分析中未能偵測到實質變化。僅在40℃/75% RH下，粉末展示略微不同之結果。聚集僅在40℃下增加。3個月之後，偵測到約2%之總聚集增加。較低溫度不會對蛋白質產生顯著損傷。但即使在40℃下，3個月之後單體之量仍大於95%。在海藻糖用作穩定劑之情況下，未觀察到片段形成，至少在層析圖中不存在不同峰。與完全抗體相比IgG片段在儲存期間對溫度誘發之聚集可能較不敏感。
在濁度量測期間獲得類似結果。在5℃及25℃下儲存期間未能觀察到濁度改變，且甚至40℃樣品亦僅展示較小濁度增加。混濁在很大程度上又係由蛋白質造成，因為安慰劑樣品具有接近於零之NTU值。粒子污染不受較高溫度或較高殘餘濕度影響。除真樣品與安慰劑樣品之間的差異外，經3個月儲存之粒子數目基本上保持相同水平。此亦由再溶解粉末之光學外觀得以證實。所有樣品均產生澄清溶液，且甚至在儲存期間顯色量測亦不展示任何差異。
用於穩定性測試之小鋁瓶不可完全排除來自粉末之濕度。因此，在25℃及40℃下高濕度條件導致粉末之濕度增加。儲存於5℃下之粉末展示不變之含水量。兩種應力因素(溫度與增加之RH)對粉末樣品之結晶度不具有任何影響。繞射圖保持不變。氯化鈉峰型在WAXD圖中仍在主要地位。SEC及濁度量測結果符合經由DLS獲得之結果。低溫及低殘餘濕度並不損害負載有蛋白質之粉末。所有樣品均展示相 同圖案，且甚至儲存於40℃下之混合物亦不展示異常峰或峰凸肩。其展示在約10nm下可見大峰及在微米尺寸下可見額外峰的普通圖案。
在IEF結果中，在聚焦之起始點處展示額外譜帶之唯一凝膠為具有40℃/75% RH樣品之凝膠。儘管如此，在3個月之後僅觀察到微小藍色斑點(恰好低於"40℃")。在所有溫度及濕度條件下，海藻糖展現對阿非莫單抗蛋白之極佳穩定能力。
濃縮物+25mM蔗糖
尤其在5℃及25℃/60% RH下，蔗糖於阿非莫單抗濃縮物中之溶液展示良好儲存穩定性(表10)。在該等條件下未觀察到聚集改變。5℃及25℃之所有層析圖均類似。僅對於40℃/75% RH樣品可見不同結果，其中偵測到在3個月內約2.5%之聚集增加。但此時單體之量仍為約95%。
所有再溶解粉末看來均光學透明及無色，不可與阿非莫單抗濃縮物或液體饋料區分。顯色量測展示顏色經3個月、即使在高溫儲存(40℃)後亦無任何改變。溶液仍最接近於參考溶液R6或B5，其為用僅可由視覺輔助設備識別之略帶紅色或棕色之極稀液體。藉助於濁度計，未觀察到顯著改變。儘管在40℃/75% RH下儲存之後濁度由最初12NTU增加至20NTU，但濁度結果與在噴霧乾燥之後立即展示20NTU之山梨糖醇及海藻糖相比較佳。安慰劑樣品僅展示極低濁度，其 在整個穩定性測試期內無顯著變化。
如對於濁度而言，真樣品之顯微鏡下可見粒子污染大體上高於安慰劑樣品。然而，在大粒子溶離份(粒子大於10μm)中，僅觀察到較小改變。大於40μm之粒子的數目通常接近於零，大於10μm之粒子的計數低於100個或為約100個(每毫升溶液)，且因此總體粒子污染並不極高。在高溫儲存下之所有降解均符合卡爾費雪分析之結果。經調節儲存腔室中之殘餘濕度愈高，溶解粉末之水的量愈高。蔗糖樣品在真粉末與安慰劑粉末之間並未展示大的差異。
儘管在較高殘餘濕度條件下含水量增加，但水之吸收對粉末之結晶度不具有任何影響。在3個月之後所有溫度下之WAXD圖均展示相同繞射圖案，其與噴霧乾燥後立即(t=0)獲得之WAXD圖相同。在DLS圖及IEF凝膠中僅偵測到極小降解。在40℃及75% RH下3個月之後，蔗糖樣品展示與噴霧乾燥之後立即獲得之光散射圖極類似的光散射圖。清晰單體峰處於10nm流體動力學直徑處，且極小峰處於微米尺寸處(見於陡直上升部分)。40℃及75% RH亦為造成IEF譜帶圖案與濃縮物之IEF譜帶圖案不同之唯一條件。聚焦起始點處之微小譜帶指示一些大的聚集體，但如DLS圖中可見，其數目不具有實質意義。
比較及小結
穩定性實驗表明不同穩定劑產生不同結果。改變賦形劑或儲存條件似乎對粒子形態不具有影響。在噴霧乾燥之後立即獲得之噴霧乾燥之山梨糖醇混合物的SEM影像幾乎不可與在40℃及75% RH下儲存3個月之海藻糖樣品相區分。5℃不產生嚴重蛋白質損傷；甚至阿非莫單抗濃縮物在該等條件下經3個月亦不展示實質降解。當儲存於25℃60% RH或40℃ 75% RH下時，純濃縮物藉由展示聚集及斷裂來回應。
海藻糖及蔗糖展示普遍一致之結果。該等粉末具有極佳穩定 性。即使在40℃及75% RH下，亦僅偵測到較小改變。然而，吸濕性為展示海藻糖與蔗糖之不同結果的參數中之一者。與蔗糖混合物相比，包含海藻糖之噴霧乾燥粉末在噴霧乾燥之後總體展示較低含水量。因為用於穩定性測試之小鋁瓶對於水蒸氣並非完全不可滲透，所以3個月之後蔗糖粉末亦具有較高含水量，此係由於噴霧乾燥之蔗糖比海藻糖吸濕性更大。
蔗糖與海藻糖之間的另一差異見於濁度量測中。與海藻糖粉末相比蔗糖混合物展示較小的在噴霧乾燥後立即得到之NTU。濁度量測亦揭示另一出乎意料之特徵。對於蛋白質-賦形劑混合物而言，噴霧乾燥過程似乎比高溫儲存具更大應力。當噴霧乾燥時，至少當在低於噴霧乾燥粉末之Tg下儲存時，粉末展示足夠穩定性。
山梨糖醇亦具有穩定可能性。在5℃及25℃下其展示良好結果。然而，包括山梨糖醇之噴霧乾燥粉末不能長時期經受較高溫度。該等結果之臨界參數似乎為山梨糖醇之低Tg。超過此溫度(如40℃儲存之結果可見)使玻璃狀調配物轉變為黏性液體，增強其流動性，開啟各種降解路徑。
試圖降低噴霧乾燥過程中之濁度增加
因為發現濁度為展示噴霧乾燥過程中之可變性的參數，所以再次改變過程參數以試圖將乾燥過程後之濁度值降至最小水平。對於該等實驗而言，使用已證實對阿非莫單抗蛋白產生極小損傷之來自先前乾燥實驗的過程參數。為此，使用130℃及100℃之T入進行添加25mM及50mM賦形劑海藻糖及蔗糖之噴霧乾燥實驗。如上所述，100℃之T入展示與在130℃之T入下獲得之分析結果接近的分析結果。降低之T入降低對蛋白質之熱應力且因此可產生較低NTU值。類似因素適用於50mM及25mM賦形劑之添加。在先前測試中兩種調配物展示類似結果。賦形劑之量的增加可產生較佳NTU值。因為方法設置中之兩種改 變並不顯示先前測試之實質改變，所以用於該等實驗之唯一分析方法為濁度量測。
海藻糖之添加
在100℃及130℃之T入下將包含25mM及50mM海藻糖之阿非莫單抗濃縮物噴霧乾燥。將每一調配物大量噴霧乾燥以便可測試來自每一實驗之至少3種噴霧乾燥粉末的濁度。不論根據T入亦或根據賦形劑之量，粉末產率均不展示實質差異。平均產率為約70%，對於130℃之T入及25mM賦形劑之添加而言展示更高值。濁度量測之結果更不同。
賦形劑之量對濁度不具有大的影響，因為25mM及50mM海藻糖之NTU值並無很大不同。然而，不同T入導致不同濁度。130℃之T入導致較低NTU值及標準偏差。在100℃之T入下，NTU值一般較高且亦展示較大可變性。在130℃及添加25mM海藻糖之情況下的值亦符合在穩定性測試期間獲得之濁度結果。
蔗糖之添加
將添加25mM及50mM蔗糖之阿非莫單抗濃縮物之混合物在100℃及130℃之T入下噴霧乾燥。不同蔗糖濃度似乎對噴霧乾燥過程之粉末產率並不具有大的影響。所有混合物均提供約70%之粉末產率，其中130℃粉末展示略小之標準偏差。甚至更不同的為濁度量測結果。25mM與50mM之NTU值極接近，略傾向於在100℃之T入下50mM蔗糖(展示較低濁度)，及T入=130℃下25mM蔗糖之添加。因為該等傾向並不大，所以賦形劑之量對噴霧乾燥粉末之濁度不具有大的影響。更清晰的是關於T入之判斷。100℃提供實質上較高之NTU值，有時超過50NTU，該等值甚至在將130℃粉末在40℃下儲存3個月期間仍不會達到。此外，在100℃之T入下獲得之大標準偏差並不預示可再現結果。當在130℃之T入下噴霧乾燥時，再溶解粉末展示約20NTU之可再現低濁度。該等值亦符合穩定性測試期間所獲得之結果。
小結
噴霧乾燥過程中之濁度增加不可藉由降低T入來降低。在100℃下含有海藻糖之粉末以及蔗糖混合物均展示較高NTU值。當使用130℃作為T入時，添加25mM賦形劑提供與50mM相比略低之濁度值。因此，自先前實驗得出之過程參數(130℃及25mM添加劑)似乎對於阿非莫單抗蛋白之噴霧乾燥最佳。關於濁度，蔗糖表現比海藻糖略佳。自含有25mM蔗糖之阿非莫單抗濃縮物噴霧乾燥之粉末展示15NTU之平均值，而類似海藻糖混合物展示17NTU之平均值。
更高濃度之MAK 195F溶液之噴霧乾燥
使用海藻糖、蔗糖或山梨糖醇將包含12.4mg/mL MAK 195F之阿非莫單抗濃縮物以實驗室規模成功噴霧乾燥，產生穩定粉末。對於按比例增大之乾燥過程而言，加工時間為一極重要因素。Masters,Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS；Charlottenlund(2002)。為減少較大批之加工時間，液體饋料中之較高蛋白質濃度提高噴霧乾燥器之蛋白質生產量而對其他過程參數無實質影響。為達成較高濃度之MAK 195F溶液，將阿非莫單抗濃縮物超濾。在此過濾過程中，水、鹽及界面活性劑減少，而蛋白質不可穿過膜。此導致蛋白質濃度增加，但並不改變其他溶質之濃度。
阿非莫單抗濃縮物50.6mg/mL
在第一超濾過程中，濃縮物達到50.6mg/mL(蛋白質/毫升)之濃度(藉由使用UV光譜學估計)。溶液為光學透明且幾乎無色(略帶棕色)，用肉眼幾乎不可與原始阿非莫單抗濃縮物(12.4mg/mL)區分。SEC及DLS未展示自原始濃縮物之改變。
聚集仍接近於原始濃縮物(約1%)且DLS概況完全匹配原始濃縮物，僅在約10nm處展示單峰。蛋白質並不會因增加其濃度而損傷。在較高蛋白質濃度之情況下，一些可量測物理特性可改變。濃縮物 50.6mg/mL展示1.017g/cm3之密度及1.375mPas之黏度(兩者均在20℃下量測)，與原始濃縮物相比兩者均略高。此外，濃縮物50.6mg/mL之濁度值高於原始溶液：分別為118NTU及約5NTU。預期到此增加，因為溶液中大分子(蛋白質)之量增加，因此存在更多可散射或吸收光以降低光強度之大分子。
在超濾過程中粒子量測不展示顯著變化。與濃縮物12.4mg/mL相比，濃縮物50.6mg/mL之所有粒子溶離份均展示相等或較小粒子污染。IEF凝膠亦不展示額外譜帶。可假定將溶液中MAK 195F之濃度增加至50.6mg/mL並不導致實質損傷或與蛋白質及其功能有關之其他改變。
在無賦形劑之情況下噴霧乾燥濃縮物50.6mg/mL
當噴霧乾燥時，濃縮物50.6mg/mL與濃縮物12.4mg/mL一樣易受損傷。在噴霧乾燥過程中，聚集增加至約2%，增加量為1%。粉末產率為約55%，但含水量相對高(3.5%)。此外，粉末由於其高靜電荷而在處理(填充等)時顯示一些難點。
DLS圖展示清晰單體峰及表示小聚集體(寡聚物)之小凸肩。與噴霧乾燥之原始濃縮物(12.4mg/mL)相反，未偵測到在微米尺寸下呈峰形式的大聚集體。因為僅可偵測到小聚集體，所以在噴霧乾燥過程中未見IEF凝膠之實質改變。
在超濾過程中，蛋白質濃度增加，而所有其他溶質(NaCl、Na3PO4及Pluronic® F68)均維持其原始濃度。可在噴霧乾燥之調配物的X射線繞射圖中觀察到此改變之一個影響。在噴霧乾燥之後蛋白質為完全非晶形，因此由氯化鈉產生之結晶峰實質上縮小。除由小液滴中之較高固體量造成傾向於較大粒子外，未偵測到對粒子形態之任何影響。
在無任何賦形劑之情況下噴霧乾燥濃縮物50.6mg/mL亦導致極高 粒子污染。與噴霧乾燥之濃縮物12.4mg/mL相比，25μm以下之所有粒子溶離份均含有較高量之粒子。
藉由在噴霧乾燥之前添加賦形劑，應可改善該等結果。如在穩定性測試中，對於濃縮物12.4mg/mL而言以等於25mM混合物之質量比添加賦形劑。
山梨糖醇之添加
根據濃縮物12.4mg/mL之25mM混合物，以0.35：1之山梨糖醇：MAK 195F質量比添加山梨糖醇。噴霧乾燥之混合物的粉末產率為約60%。粉末具有20℃之Tg及2.3%之含水量。該等值廣泛符合具有濃縮物12.4mg/mL之類似混合物所獲得之結果(67%粉末產率，2.0% RH，Tg=19℃)。將噴霧乾燥粉末再溶解產生澄清、幾乎無色溶液，其具有最接近參考溶液B2之顯色(略帶棕色)，正如初始MAK 195F濃縮物50.6mg/mL一般。
噴霧乾燥之後，再溶解粉末展示較小聚集增加。與純濃縮物50.6mg/mL之約1%聚集水平相比，SEC顯示1.3%之聚集水平。此外，與添加有25mM山梨糖醇之噴霧乾燥濃縮物12.4mg/mL相比，此無實質改變。
如DLS結果所示，不溶性聚集體之量大體上並未增加。偵測到10nm之流體動力學直徑下之清晰單體峰以及微米尺寸下之聚集峰。當液體饋料之固體含量增加2.8倍時，再溶解粉末之顯微鏡下可見粒子污染增加。詳言之，小粒子溶離份(<10μm)展示極高污染程度，而大粒子(>10μm)之數目保持在類似於較低濃度溶液之水平上。
改變液體饋料中之蛋白質濃度僅對粒子形態具有較小影響。該等粒子展示凹入圓球之典型形狀，但似乎傾向於較大粒子。因為每毫升含有12.4毫克阿非莫單抗之溶液的粒徑為約2.5μm至13μm，所以將較高濃度溶液噴霧乾燥部分地產生大於15μm之粒子。
海藻糖之添加
根據穩定性測試系列採用0.7：1之賦形劑：MAK 105F比率，對於濃縮物12.4mg/mL而言使用25mM賦形劑添加。此實驗中賦形劑之量比山梨糖醇實驗中高，因為作為雙醣之海藻糖具有山梨糖醇(單醣)約兩倍高的分子量。液體饋料溶液之固體含量的此增加使其難以獲得與先前噴霧乾燥實驗中同樣高之粉末產率。噴霧乾燥具有高固體含量之溶液產生堵塞高效旋風分離器之粉末出口的風險，且產率降至50%以下(在此實驗中為約45%)。由於高靜電荷，故粉末難以處理。其具有3.6%之含水量及約66℃之Tg，在某種程度上與類似低濃度混合物一致(3.3% RH，Tg=56℃)。再溶解之噴霧乾燥粉末具有最接近略帶棕色之參考溶液B2之顯色。
海藻糖之穩定可能性良好。在SEC層析圖中不可偵測到可溶性聚集體之增加；聚集維持於1%之水平，不可與原始濃縮物50.6mg/mL區分。如DLS檔案中可見，不溶性聚集體之量亦極低，展示單體峰及由微米尺寸下之峰所表示之少量大聚集體。
與較低濃度混合物(具有海藻糖之濃縮物12.4mg/mL)相比，顯微鏡下可見粒子污染較高。此可藉由高固體含量說明，其固體含量為使用MAK 195K濃縮物12.4mg/mL之混合物的約3倍高。
液體饋料中蛋白質濃度及固體含量之改變對粒子形態不具有大的影響。除更大濃度粉末中經分離較大粒子之外觀外，粒子形狀不展示任何實質改變。
蔗糖之添加
為維持0.7：1之蔗糖：MAK 195F的質量比(類似於濃縮物12.4mg/mL及25mM賦形劑)，用於每一噴霧乾燥實驗之蔗糖的量必須增加4.08倍(50.6/12.4)。如上文使用此質量比可見，達成在噴霧乾燥過程中之幾乎全部蛋白質保存。包含此高固體量之溶液之噴霧乾燥產生堵 塞具有極小直徑之旋風分離器粉末出口的風險，尤其對於高效旋風分離器而言。因此，粉末產率有時降至50%以下，而對過程穩定性不具有任何影響。
因為濃縮物50.6mg/mL具有與原始濃縮物12.4mg/mL不同之顯色，所以預期基於較高濃度之蛋白質溶液的再溶解之噴霧乾燥粉末亦展示顯色。海藻糖混合物具有最接近略帶棕色之參考溶液B1之顯色。
聚集保持在1%之水平上，確實與液體濃縮物50.6mg/mL或甚至原始濃縮物12.4mg/mL無差別。
DLS分析展示在約10nm流體動力學直徑下之單體峰及表示少量大聚集體之熟知之微米尺寸下之的小聚集峰。與低濃度混合物相比，在整個所有粒度溶離份中，顯微鏡下可見粒子污染略高。
粒子形態與包含相同賦形劑：MAK 195F比率之先前實驗中獲得之結果並無不同。由於液體饋料中之較高固體含量，故觀察到一些經分離較大粒子，其在較低濃度調配物中不存在。粉末之殘餘水分為2.6%，調配物之Tg為約60℃。兩值均可與在穩定性測試中類似低濃度調配物獲得之彼等值(2.6% RH，Tg=63℃)相比較。
小結
使液體饋料之蛋白質濃度增加至50.6mg/mL對所得粉末不具有任何實質影響。幾乎所有分析測試均產生與使用具有相等賦形劑：MAK 195F質量比之濃縮物12.4mg/mL之噴霧乾燥實驗類似的結果。因此賦形劑之穩定可能性取決於賦形劑：MAK 195F質量比而不取決於莫耳比。
如同使用低濃度液體饋料(12.4mg/mL)之實驗中一般，海藻糖及蔗糖關於阿非莫單抗之噴霧乾燥期間的過程穩定性產生幾乎相同之結果。尤其在聚集中，使用山梨糖醇以穩定抗體片段展示略差結果。高 濃度粉末之IEF比較展示無實質差異，所有混合物均展示無額外譜帶(大聚集體)之原始阿非莫單抗譜帶圖案。
根據不同量之賦形劑，在WAXD圖中存在顯著差異。因為所有所用之糖(以及蛋白質)在噴霧乾燥後為完全非晶形，所以作為主要結晶成份之氯化鈉的量控制結晶峰之外觀。阿非莫單抗濃縮物12.4mg/mL具有38% w/w之氯化鈉濃度(關於固體)，其在32°之2θ處展示清晰氯化鈉峰。在噴霧乾燥之濃縮物中，氯化鈉濃度為約14% w/w，使得結晶峰高度降低。藉由添加作為賦形劑之海藻糖及蔗糖，氯化鈉濃度降至9%之值。因此，結晶峰不再遮蔽由蛋白質及穩定劑產生之非晶形暈。因為山梨糖醇之質量比低於雙醣之質量比，所以在山梨糖醇混合物之WAXD圖中仍可見氯化鈉之結晶峰。
張力計算
因為最初形成阿非莫單抗濃縮物且其經調配用於非經腸投藥，所以等張性為重要因素。Reinhart等人，Crit Care Medicine 29(4)：765-769(2001)。用於靜脈內應用之溶液應具有大致與血液相同之滲透壓(286mosmol/kg)。Kommentar zum Europäischen Arzneibuch,Wiss.Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH,Band 2(5.2)(2006)。可使用來自Deutscher Arzneimittelcodex,dt.Apotheker Verlag Stuttgart,Band 1(Anlage B),1-6(2006)之以下方程式經由冰點降低計算滲透壓：
1%(w/V)溶液之冰點降低的計算：
混合物之△T的計算：△T 混合物=Σ△T
混合物之滲透壓的計算：
在以上方程式中，△T表示與純水相比物質之1%(w/V)溶液的冰點降低，L等張為等張濃度下之冰點降低，且Mr為分子量。不同電解質之L等張值不同(參見表11)。因為血清之冰點降低為0.52℃(等於286mosmol/kg之滲透壓)，所以與純水相比混合物之1%溶液之冰點降低的值(△T混合物)不應超過0.52℃。具有高分子量之阿非莫單抗對調配物之冰點降低不具有實質影響，因此其不包括於計算中。
使用該等方程式，不同濃縮物及混合物產生表12中給出之滲透壓之計算值。
為維持生理滲透壓，當使用較高濃度之MAK 195F溶液時，需降低氯化鈉之量。原始氯化鈉濃度為8.8mg/mL。使用在此研究中估計之賦形劑：MAK 195F質量比(於濃縮物12.4mg/mL中之25mM賦形劑)，可將蛋白質濃度提高至約130mg/mL，其限制條件為自調配物移除所有氯化鈉。此產生約300mosmol/kg之滲透壓。
小結
此研究表明包括噴霧乾燥之製備抗體粉末之例示性方法。特定言之，在此實例中，將IgG片段；阿非莫單抗=MAK 195F溶液轉化成乾燥塊狀材料。藉由篩選各種賦形劑及加工條件，開發提供過程穩定性與儲存穩定性之噴霧乾燥過程。
藉由使用可偵測蛋白質之物理或化學降解之各種方法來分析穩定性，例如經由SEC及DLS分析可溶性及不溶性聚集，經由DSC分析熱事件及經由卡爾費雪滴定分析噴霧乾燥粉末的濕度。降解如歸因於若干應力因素在乾燥過程中發生，或為高溫下長期儲存之結果。藉由將糖添加至蛋白質中來穩定IgG片段。在乾燥及後續儲存期間研究海藻糖、蔗糖及山梨糖醇之穩定可能性。
在研究之第一部分中，表徵蛋白質濃縮物且接著將其在無任何賦形劑之情況下噴霧乾燥以檢查乾燥過程中濃縮物之敏感性。此外，進行測試系列以得到恰當過程參數。噴霧乾燥純濃縮物對蛋白質產生損傷。聚集增加顯著(約2%)，尤其當計劃後續儲存時。改變T入應有助於降低聚集或得到出現最小聚集之過程參數。
噴霧乾燥過程中之蛋白質損傷似乎係歸因於不同應力因素(例如，熱、霧化、剪切力)之相互作用。該等應力因素均不能單獨導致可與噴霧乾燥過程相比之蛋白質變質。
將穩定糖以介於10mM與150mM之間的各種濃度添加至蛋白質濃縮物中。150mM似乎不適當，因為液體饋料之固體含量極高以致 於旋風分離器易於阻塞，其導致低粉末產率。對於所有經測試糖而言，10mM賦形劑之添加並不夠。藉由添加25mM而獲得最佳結果，其相當於對於海藻糖及蔗糖而言賦形劑：MAK 195F質量比為0.7：1且對於山梨糖醇而言賦形劑：MAK 195F質量比為0.35：1。50mM產生類似結果，但目的為在可能程度上降低添加劑之量。比較噴霧乾燥過程之穩定可能性，海藻糖與蔗糖產生類似結果。山梨糖醇似乎略次於雙醣。但在小質量比中並未發現此現象，其中更多山梨糖醇之添加不會改善結果。關於過程穩定性，推薦較佳添加25mM之海藻糖或蔗糖。
因為25mM混合物對於過程穩定性最有效，所以將其用於短期穩定性測試(3個月)。連同類似安慰劑混合物及液體濃縮物一起，使噴霧乾燥粉末暴露於3種不同常用氣候(冰箱：5℃，中歐：25℃/60% RH，東南亞：45℃/75% RH)下。如所預期，液體濃縮物不可經受任何高溫，其在1個月之後產生嚴重蛋白質損傷(聚集、斷裂及光學混濁)。具有賦形劑之噴霧乾燥粉末經3個月仍展示良好穩定性。當儲存於40℃/75% RH下時海藻糖以及蔗糖調配物僅遭受實質損傷(聚集增加2%)。除較小聚集增加(0.5%)外，甚至25℃/60% RH亦對粉末不具有影響。作為所涉及之過程穩定性之結果，山梨糖醇亦為儲存期間之最弱穩定劑。在5℃及25℃下儲存之具有其他賦形劑的混合物具類似穩定性，但對於山梨糖醇-蛋白質混合物而言40℃為臨界參數。40℃超過混合物之Tg，因此不再能保證由蛋白質固定產生之儲存穩定性。此導致約12%之聚集增加，其在此研究之任何初步測試中均未觀察到。顯微鏡下可見粒子及濁度量測產生令人不滿意之結果。該等樣品主要展示視覺混濁或甚至凝聚。穩定性研究之主要問題為用於儲存粉末之小鋁瓶。其未展示完全之水蒸氣不可滲透性，因此吸濕粉末之殘餘水分含量不可保持恆定。
在敏感性調配物之情況下，可將幾乎所有蛋白質改變降至最小 程度。仍展示實質改變之唯一參數為濁度。未儲存、但噴霧乾燥過程導致濁度增加。試圖藉由添加更多賦形劑或使用較低乾燥溫度來降低此增加並未成功。不可避免濁度由約5NTU(濃縮物)增加至15-20NTU(噴霧乾燥之混合物)。在噴霧乾燥蛋白質-糖調配物期間，其他分析方法不展示實質改變。
在此研究之最後部分中，液體饋料中之蛋白質濃度隨達成噴霧乾燥器之較高生產量之目的而增加。進行蛋白質濃度為50.6mg/mL之情況下的實驗。超濾以及噴霧乾燥更大濃度之蛋白質溶液(具有經鑑別最佳質量比之糖添加劑)的過程對阿非莫單抗蛋白之穩定性不具有實質影響。大多數結果(除粒子污染或濁度外，根據較高固體含量)可與在濃縮物12.4mg/mL之情況下的類似實驗相比。若可防止旋風分離器出口之堵塞，則100mg/mL之濃度的噴霧乾燥應可行。甚至可在不產生低滲壓或高滲壓之風險的情況下非經腸投與更大濃度之粉末，此係因為原始緩衝液含有足夠氯化鈉，其可與穩定劑交換移除。高達130mg/mL之蛋白質濃度可為可能的。
抗體調配物之組合物
如先前所述用Büchi小型噴霧乾燥器B-191進行噴霧乾燥實驗。簡言之，使乾燥空氣經由Luwa超濾器2(纖維玻璃；過濾材料種類：HEPA H13)過濾，隨後進入加熱裝置及乾燥腔室中。使所有液體饋料經由0.22μm過濾單元過濾，隨後藉由蠕動泵傳輸至乾燥腔室(QLF=約3mL/min；矽管=3mm)。使用乾燥氮氣(QAA=700l/h)藉由雙流體噴嘴進行霧化。噴霧乾燥之後，將所得粉末自收集容器回收且填充於玻璃小瓶(溴丁基橡膠塞)中，用封口膜密封。組合物概述於表13中。藉由使用UV/VIS、SEC、IEC、PCS、DSC、XRD及卡爾-費雪方法進行蛋白質表徵。
如以上所討論，使用MAK 195F作為模型化合物使用12mg/mL之濃度評估調配物及過程參數。圖10包括兩個描述噴霧乾燥之MAK 195F調配物之SEC物理穩定性資料的柱形圖：(A)山梨糖醇、海藻糖及蔗糖之影響(c=25mM)及(B)在40℃/75 RH下儲存3個月之後穩定劑濃度對蛋白質聚集量的影響。圖10A中給出之資料揭示海藻糖及蔗糖提供最穩定產品，而山梨糖醇不提供適當長期蛋白質穩定性。在25mM(相當於賦形劑：蛋白質之質量比為0.7：1)下測定穩定劑之最小量(參見圖10B)。在圖10A中，各組中之條柱由左至右分別表示MAK 195F(塊體)、MAK 195F+山梨糖醇、MAK 195F+海藻糖及MAK 195F+蔗糖。在圖10B中，各組中之條柱由左至右分別表示山梨糖醇、海藻糖及蔗糖。
藉由使用在12mg/mL、50mg/mL及100mg/mL範圍內之蛋白質濃度再現該等參數。所有調配物均提供可接受之粉末。表14中所示之平均殘餘水分在4.6重量%(MAK 195F)與5.5重量%(阿達木單抗)之間，且因此與典型值低於1%之凍乾調配物相比顯著更高。然而，量測MAK 195F之玻璃轉移溫度為60℃且對於兩種完整抗體而言約為70℃，表明至少在5℃儲存溫度下之合適穩定性。該等高濃度(100mg/mL)噴霧乾燥之MAK 195F、阿達木單抗及ABT-325調配物之初步分析資料呈現於圖11中。圖11具有兩個柱形圖，其描述在200mM海 藻糖溶液中對於噴霧乾燥之高濃度MAK 195F、阿達木單抗及ABT-325而言(A)加工及在40℃/75% RH下儲存3個月對藉由使用SEC方法得到之物理穩定性的影響，及(B)加工及在40℃/75% RH下儲存3個月對藉由IEC方法測定之化學穩定性(加工後標準化為100%)的影響。在圖11A中，各組中之條柱由左至右分別表示MAK 195F(95mg/mL，經噴霧乾燥)；阿達木單抗(100mg/mL，經噴霧乾燥)；ABT-325(100mg/mL，經噴霧乾燥)；及ABT-325(100mg/mL，經凍乾)(無ABT-325(100mg/mL，經凍乾)之1個月儲存資料且無MAK 195F(95mg/mL，經噴霧乾燥)之3個月儲存資料)。
所有測試調配物之資料均證實蛋白質在加工及在40℃下儲存至多3個月期間之可接受的物理穩定性，與ABT-325凍乾物等效。然而，相應PCS資料(未圖示)表明對蛋白質特徵之影響，其必須更詳細地分析。關於化學穩定性，圖11B中之資料證實噴霧乾燥調配物與標準冷凍乾燥調配物相比類似之結果。在圖11B中，各組中之條柱由左至右分別表示ABT-325(100mg/mL，經噴霧乾燥)、ABT-325(100mg/mL，經凍乾)及阿達木單抗(100mg/mL，經噴霧乾燥)。
小結
此證實由具有至多100mg/mL之濃度的mAb溶液成功製造噴霧乾燥抗體粉末的一般可行性。MAK 195F、阿達木單抗及ABT-325之呈示資料既不展示在加工期間亦不展示在加速穩定性研究期間關於蛋白質之物理或化學穩定性之顯著影響。然而，應更詳細地分析所觀察到之噴霧乾燥蛋白質的多分散性。
此外，調配物內需要充足量之穩定劑以達成長期儲存。然而，由於此技術之通用性，其提供關於塊狀藥物調配物以及關於新穎劑型及投藥途徑之有趣前景。
以引用的方式併入
整個本申請案中可引用之所有引用參考文獻(包括文獻參考、專利、專利申請案及網站)的內容係以引用的方式明確併入本文中。除非另外指出，否則本發明之實施將利用在此項技術中熟知之噴霧乾燥及蛋白質調配之習知技術。
等效物
僅使用常規實驗，熟習此項技術者將識別或能夠確定本文中所述之本發明之特定實施例的眾多等效物。該等等效物意欲涵蓋於以下申請專利範圍中。在整個本申請案中所引用之所有參考文獻、專利及公開之專利申請案的內容均係以引用的方式併入本文中。

Claims (49)

  1. 一種製備蛋白質或肽粉末之方法，該方法包含以下步驟：將一種包含大於約50mg/mL之蛋白質或肽及至少一種賦形劑的溶液噴霧乾燥，以製備蛋白質或肽粉末。
  2. 如請求項1之方法，其中該溶液包含大於約100mg/mL之該蛋白質或肽。
  3. 如前述請求項中任一項之方法，其包含製備抗體粉末，其包含：將一種包含大於約50mg/mL之抗體或其抗原結合部分及至少一種賦形劑的溶液噴霧乾燥，以製備抗體粉末。
  4. 如請求項3之方法，其中該溶液包含大於約100mg/mL之該抗體或其抗原結合部分。
  5. 如請求項3或4之方法，其中該抗體或其抗原結合部分為免疫球蛋白G(IgG)。
  6. 如請求項3至5中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合部分為MAK 195F、阿達木單抗(Adalimumab)、ABT-325、ABT-308或ABT-147。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該粉末在周圍溫度及濕度下穩定至少三個月。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該粉末在40℃下穩定至少三個月。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中該賦形劑為海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含介於約0.27：1.0 與約2.8：1.0之間的賦形劑：蛋白質比率。
  11. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含介於約0.27：1.0與約1.4：1.0之間的賦形劑：蛋白質質量比。
  12. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含介於約0.27：1.0與約0.7：1.0之間的賦形劑：蛋白質質量比。
  13. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含約0.7：1.0之賦形劑：蛋白質質量比。
  14. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含介於約20mM與約30mM之間的賦形劑。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中該溶液包含約25mM之賦形劑。
  16. 如前述請求項中任一項之方法，其包含用介於約100℃與約180℃之間的入口空氣溫度(T入)及介於約60℃與約110℃之間的出口空氣溫度(T出)進行噴霧乾燥。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，其包含用約130℃之T入及約80℃之T出進行噴霧乾燥。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其中噴霧乾燥包含：霧化該溶液以形成溶液小液滴；用氣體乾燥該等小液滴以形成粉末；及自該氣體回收該粉末。
  19. 如請求項18之方法，其包含用一個壓力噴嘴霧化器霧化該溶液。
  20. 如請求項18或19之方法，其包含用一個旋風分離器(cyclone)自該氣體分離且回收該抗體粉末。
  21. 一種製備醫藥組合物之方法，該方法包含以下步驟：根據前述請求項中任一項製備粉末，及將該抗體粉末與醫藥學上可接受 之載劑混合。
  22. 如請求項21之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑可為非經腸、經口、腸內或局部投與所接受。
  23. 如請求項21或22之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑包含液體。
  24. 如請求項21、22或23之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑包含水。
  25. 一種醫藥製劑，其包含有效量之根據前述請求項中任一項製備之抗體或其抗原結合部分。
  26. 一種醫藥製劑，其包含有效量之根據請求項1至24中任一項製備之蛋白質或肽。
  27. 一種穩定粉末組合物，其包含蛋白質或肽及賦形劑，其中該組合物包含小於約6%之殘餘水分。
  28. 如請求項27之組合物，其中該蛋白質或肽包含抗體或其抗原結合部分。
  29. 如請求項28之組合物，其中該抗體或其抗原結合部分為IgG抗體。
  30. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該抗體或其抗原結合部分為MAK 195F、阿達木單抗、ABT-325、ABT-308或ABT-147。
  31. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該粉末組合物在周圍溫度及濕度下穩定至少3個月。
  32. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該粉末組合物在40℃下穩定至少3個月。
  33. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該賦形劑為海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一種胺基酸、組胺酸、丙胺酸、精胺酸、甘胺酸或其混合物。
  34. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該組合物具有約0.27：1.0至約2.8：1.0、約0.27：1.0至約1.4：1.0、約0.27：1.0至約0.7：1.0或約0.7：1之賦形劑與抗體或其抗原結合部分的質量比，且其中該賦形劑為海藻糖或蔗糖。
  35. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該組合物具有約0.27：1.0至約2.8：1.0、約0.27：1.0至約1.4：1.0、約0.27：1.0至約0.7：1.0、約0.7：1或約0.35：1之賦形劑與抗體或其抗原結合部分的質量比，且其中該賦形劑為山梨糖醇。
  36. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該粉末之殘餘水分含量小於約3%。
  37. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該蛋白質或肽或抗體或其抗原結合部分保留其生物活性。
  38. 一種製造醫藥組合物之方法，該方法包含以下步驟：將有效量之如前述請求項中任一項之穩定粉末組合物與醫藥學上可接受之載劑混合。
  39. 如請求項38之方法，其中該載劑包含液體。
  40. 如請求項38或39之方法，其中該載劑包含水。
  41. 如前述請求項中任一項之製造方法，其中該醫藥組合物適於非經腸、經口、腸內或局部投與。
  42. 如前述請求項中任一項之製造方法，其包含在高於周圍溫度之溫度下進一步加工該穩定粉末組合物，不顯著影響該等粉末組合物之穩定性。
  43. 如前述請求項中任一項之製造方法，其包含熔融擠出該穩定粉末組合物。
  44. 如前述請求項中任一項之製造方法，其包含塗佈該粉末組合物。
  45. 如前述請求項中任一項之製造方法，其包含用PLGA塗佈該粉末組合物以形成持續釋放或延遲釋放醫藥組合物。
  46. 如前述請求項中任一項之製造方法，其包含用腸溶衣塗佈。
  47. 如前述請求項中任一項之製造方法，其中該蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分之活性係由該賦形劑保護以避免有機溶劑引起之沈澱、變性或氧化。
  48. 如前述請求項中任一項之製造方法，其中該蛋白質、肽、抗體或其抗原結合部分之活性係由該賦形劑保護以避免PEG 400、乙醇、DMSO、NMP或冰醋酸引起之沈澱、變性或氧化。
  49. 一種醫藥組合物，其係根據前述方法請求項中任一項製備。
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