CN112284861B - 用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用。本方法提供的固定液采用融化的明胶和甘油水合剂混合制备而成，该方法得到的固定液，透光性好、相变温度安全，该方法简便、快捷，既可用于批量生产，也可在急需时，进行临时配置。上述固定液用于固定真姬菇担孢子，既不会影响真姬菇担孢子的其他处理效果，比如染色，又能够延长曝光时间，提高获得的真姬菇担孢子影像数据的质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织学技术领域，具体而言，涉及用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用。
背景技术
真姬菇(Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow)又名玉蕈、斑玉蕈，属于担子亚门、层菌纲、伞菌目白蘑科、玉蕈属，外形美观，质地脆嫩，味道鲜美，是重要的工厂化栽培食用菌。目前可人工栽培的真姬菇有褐色和纯白两个品系，褐色通常称为“蟹味菇”；纯白称为“海鲜菇”或“白玉菇”。担孢子是食用菌最初的繁殖单位，多数食用菌的生活史都由担孢子经过萌发、融合、结实再形成担孢子的过程组成。因此，对担孢子的形态观察也成为食用菌研究中不可少的研究内容。一般食用菌孢子很小，长直径为10μm左右，肉眼无法鉴别，因此显微镜观察就成了担孢子研究中最主要的研究手段。但由于担孢子极小，在悬浮液或染色缓冲液中极易产生布朗运动现象，即担孢子在显微镜头下一直不停的做无规律移动，导致图像拍摄无法良好的聚焦，这严重影响了孢子观察结果的呈现。其中，尤其以真姬菇担孢子布朗运动最为严重，因其相比其他食用菌担孢子更小，长直径为5μm左右，在显微观察中，尤其是高倍镜头下，其担孢子无规律移动尤其明显，严重影响了真姬菇的担孢子研究工作。因而，需要提供一种能够有效固定真菌担孢子的方法，将真菌担孢子固定后用于显微观察。
染色是真菌担孢子在显微观察过程中一项重要的处理手段，经过染色，科研人员能够更好地观察到真菌担孢子不同组织结构之间的关系，目前对于真菌担孢子的染色手段已十分成熟，包括荧光染色、普通染料染色等。但由于现有技术中没有对真菌担孢子进行固定的报道，因此，如何设置真菌担孢子的固定和染色步骤，以实现减弱或消除真菌担孢子布朗运动的同时，又不会影响染色结果的技术效果是目前急需解决的难题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于真菌担孢子显微观察的固定液，以期采用该固定液对真菌担孢子进行固定时不会对真菌担孢子的染色结果造成不良影响。
本发明的另一个目的在于，提供上述固定液的制备方法。
本发明还有一个目的在于，提供上述固定液在真菌担孢子固定中的应用，并提供相应的固定方法。
本发明还有一个目的在于，提供采用上述固定液固定真菌担孢子后形成的含有固定液组分的固定样本。
本发明的最后一个目的在于，提供上述固定样本在真菌担孢子质量评价中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种用于真菌担孢子显微观察的固定液，包括明胶和甘油水合剂。
上述的甘油水合剂是指由甘油和水按照体积进行配比得到的用于溶解高分子组分的溶剂。现有技术中，明胶、甘油和水三种组分组成的溶液具有安全的相变温度，且透光性好，被广泛用作胶囊药品的囊壁的主要组分，但并未见有用于阻碍微米粒子布朗运动的报道。
在可选的实施方式中，所述固定液由明胶与甘油水合剂组成，且固定液中所述明胶的质量体积浓度为15％～45％。
在可选的实施方式中，所述固定液中所述明胶的质量体积浓度为20％～40％；进一步优选为30％。
在可选的实施方式中，所述甘油水合剂包括体积比为1:0.5～2的甘油和水；进一步优选地，所述甘油水合剂包括体积比为1:1的甘油和水。
第二方面，本发明实施例提供前述实施方式任一项所述的固定液的制备方法，所述制备方法包括，使融化的明胶与甘油水合剂混匀得到固定液。
在可选的实施方式中，所述的制备方法包括将明胶加入到甘油水合剂中加热使明胶融化，混匀得到固定液。该方法将常温下凝固状态的明胶加入到甘油水合剂中，通过加热使明胶融化，在明胶由表及里逐渐融化过程中，能够使得明胶融化后立刻即可被甘油水合剂分散成均匀溶液，而若加入顺序改为向凝固的明胶中甘油水合剂，则会使得贴壁的明胶表面在升温过程中融化后不能及时地被甘油水合剂溶解，导致溶解不均匀。
优选地，所述加热的温度为50～65℃；进一步优选为60℃。
第三方面，本发明实施例提供前述实施方式所述的固定液或采用前述实施方式所述的制备方法制备得到的固定液在真菌担孢子显微观察固定中的应用。
优选地，所述真菌包括平菇、草菇或真姬菇。
第四方面，本发明实施例提供一种真菌担孢子的固定方法，所述固定方法的步骤包括，抽取上述固定液与真菌担孢子混合均匀，凝固后得到固定液。
优选地，所述真菌担孢子在固定之前，还包括染色步骤。
优选地，所述染色步骤包括向真菌担孢子中加入染色剂，避光保存。
优选地，所述染色剂包括VBL、苯胺蓝或calcofluor white。
优选地，所述真菌担孢子在染色之后经过清洗。
优选地，所述清洗步骤包括使用无菌水和/或PBS缓冲液洗涤后离心，去除上清液。
优选地，所述固定有真菌担孢子的固定液中，真菌担孢子浓度为103-106个/ml。
第五方面，本发明实施例提供采用前述实施方式所述的固定方法得到的含有真菌担孢子的固定样本。
最后一个方面，本发明实施例还提供了将上述固定样本在真菌担孢子质量评价中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本方法采用明胶与甘油水合剂两种试剂，对真菌担孢子进行快速凝固，在不影响真菌担孢子其他处理方式取得效果的同时，可在照相设备长时间曝光和扫描的状态下获得清晰的真菌担孢子图像。
本发明提供了固定液的制备方法，该方法将融化的明胶与甘油水合剂混匀得到固定液，形成透光性好、相变温度安全的固定液，方法简便、快捷，既可用于批量生产，也可在急需时，进行临时配置。
本发明还提供了上述固定液在真菌担孢子显微观察中的应用，上述固定液用于固定真菌担孢子，既不会影响真菌担孢子的其他处理效果，比如染色，又能够延长曝光时间，提高获得的真菌担孢子影像数据的质量。
本发明还提供了应用上述固定液的固定方法，该固定方法为将固定液与真菌担孢子混合至均匀即可，操作简单，便于实验人员掌握，由于操作简单，使得不同实验人员进行固定操作，取得的固定效果差异小，适于推广。
本发明还提供了采用上述固定方法固定得到的真菌担孢子固定样本，该固定样本由上述固定液包裹真菌担孢子后形成，该固定液凝固后透光性好，并能够延长曝光时间，使得得到的固定样本适合显微观察。
本发明还提供了上述固定样本在真菌担孢子质量评价中的应用，合适放大倍数的显微镜下，上述固定样本中能够清晰观察到真菌担孢子的组织结构，并且避免了布朗运动带来的像散问题，使得采用上述固定样本对真菌担孢子的质量进行评价的结果更加可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中采用实施例8提供的固定样本获得的真姬菇担孢子立体形态构建图；
图2为实验例1中采用对比例4提供的制片样本获得的真姬菇担孢子立体形态构建图；
图3为实验例2中采用实施例8提供的固定样本曝光时间1.1s获得的真姬菇担孢子的显微图片；
图4为实验例2中采用实施例8提供的固定样本曝光时间3s获得的真姬菇担孢子的显微图片；
图5为实验例2中采用对比例4提供的制片样本曝光时间3s获得的真姬菇担孢子的显微图片；
图6为实验例2中采用对比例4提供的制片样本曝光时间1.1s获得的真姬菇担孢子的显微图片；
图7为实验例4中实施例7～9以及对比例1～4所得样品的荧光检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
具体实施方式一
本具体实施方式提供了一种用于真菌担孢子显微观察的固定液，所述固定液，包括明胶和甘油水合剂，其中明胶的质量体积浓度为20％～40％，甘油水合剂中甘油和水的体积比为1:1。
具体实施方式二
本具体实施方式提供了具体实施方式一中所述固定液的制备方法，所述制备方法包括将明胶加入到甘油水合剂中加热使明胶融化，混匀得到固定液，所述加热温度为50～65℃。
具体实施方式三
本具体实施方式提供了采用具体实施方式二制备得到的固定液对真菌担孢子进行固定的方法，包括以下步骤：
(1)真菌担孢子悬浮液的制备
用移液器吸取200μl无菌水于真菌担孢子印上进行吸打洗涤，将混有真菌担孢子的无菌水放入1.5ml离心管中，制成真菌担孢子悬浮液。
(2)真菌担孢子的染色
将步骤(1)中得到的真菌担孢子悬浮液于3000rpm进行离心，去掉上清液后，加入calcofluor white(1g/l)染色液100μl，避光保存10min后，加入过量PBS溶液，经振荡洗涤后，去除上清液。
(3)固定和样品的观察
向步骤(2)中染色后的固定样品中加入具体实施方式二制备的固定液，使孢子最终密度为104个/ml，反复缓慢吸打1min后滴加到观察皿或载玻片上，盖好观察皿上盖或盖玻片，而后避光保存20min后置于显微镜下观察。
实施例1～3
本组实施例提供了如具体实施方式一所述的固定液，具体固定液组成见表1。
表1实施例1～3中固定液的组成表
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 明胶质量体积浓度 | 20％ | 30％ | 40％ |
| 甘油和水的体积比 | 1:1 | 1:1 | 1:1 |
实施例4～6
本组实施例分别提供了实施例1～3提供的固定液的制备方法，为将明胶加入到甘油水合剂中加热使明胶融化，混匀得到固定液，所述加热温度为60℃。
实施例7
本实施例提供了采用实施例1所述的固定液对真姬菇担孢子进行固定的方法，具体步骤为：
(1)真姬菇担孢子悬浮液的制备
用移液器吸取200μl无菌水于真姬菇担孢子印上进行吸打洗涤，将混有真姬菇担孢子的无菌水放入1.5ml离心管中，制成真姬菇担孢子悬浮液。
(2)真姬菇担孢子的染色
将步骤(1)中得到的真姬菇担孢子悬浮液于3000rpm进行离心，去掉上清液后，加入calcofluor white(1g/l)染色液100μl，10min后，加入过量PBS溶液，经振荡洗涤后，去除上清液。
(3)固定和样品的观察
加入实施例1制备的固定液，使孢子最终密度为104个/ml，反复缓慢吸打1min后滴加到观察皿或载玻片上，盖好观察皿上盖或盖玻片，而后避光保存20min后置于显微镜下观察。
实施例8
本实施例提供了采用实施例2所述制备方法得到的固定液对真姬菇担孢子进行固定的方法，具体步骤为：
(1)真姬菇担孢子悬浮液的制备
用移液器吸取200μl无菌水于真姬菇担孢子印上进行吸打洗涤，将混有真姬菇担孢子的无菌水放入1.5ml离心管中，制成真姬菇担孢子悬浮液。
(2)真姬菇担孢子的染色
将步骤(1)中得到的真姬菇担孢子悬浮液于3000rpm进行离心，去掉上清液后，加入calcofluor white(1g/l)染色液100μl，10min后，加入过量PBS溶液，经振荡洗涤后，去除上清液。
(3)固定和样品的观察
加入实施例2制备的固定液，使孢子最终密度为104个/ml，反复缓慢吸打1min后滴加到观察皿或载玻片上，盖好观察皿上盖或盖玻片，而后避光保存20min后置于显微镜下观察。
实施例9
本实施例提供了采用实施例3所述制备方法得到的固定液对真姬菇担孢子进行固定的方法，具体步骤为：
(1)真姬菇担孢子悬浮液的制备
用移液器吸取200μl无菌水于真姬菇担孢子印上进行吸打洗涤，将混有真姬菇担孢子的无菌水放入1.5ml离心管中，制成真姬菇担孢子悬浮液。
(2)真姬菇担孢子的染色
将步骤(1)中得到的真姬菇担孢子悬浮液于3000rpm进行离心，去掉上清液后，加入calcofluor white(1g/l)染色液100μl，10min后，加入过量PBS溶液，经振荡洗涤后，去除上清液。
(3)固定和样品的观察
加入实施例3制备的固定液，使孢子最终密度为104个/ml，反复缓慢吸打1min后滴加到观察皿或载玻片上，盖好观察皿上盖或盖玻片，而后避光保存20min后置于显微镜下观察。
对比例1
本对比例与实施例8的区别在于，明胶的质量体积浓度为1％。
对比例2
本对比例与实施例8的区别在于，明胶的质量体积浓度为10％。
对比例3
本对比例与实施例8的区别在于，明胶的质量体积浓度为50％。
对比例4
本对比例与实施例8的区别在于，未使用固定液，而是使用PBS缓冲液对真姬菇担孢子进行的染色制片。
实验例1
将实施例8获得的固定样本和对比例4获得的制片置于放大倍数为1000倍(目镜放大倍数10倍，物镜放大倍数100倍)的蔡司LSM880激光共聚焦显微镜下观察，并拍取真姬菇担孢子的影像数据。
图1和图2分别为实施例8和对比例4所得到的真姬菇担孢子立体形态构建图。由于光聚焦显微镜进行立体形态构建时采用的是分层扫描功能，即在一定的时间内(十秒以上)对目标真姬菇担孢子进行分层扫描再将这些分层扫描图进行合成，最后输出目标真姬菇担孢子的立体结构形态。图2可以表明，在对目标真姬菇担孢子进行分层扫描的一段时间内，由于真姬菇担孢子的布朗运动，真姬菇担孢子一直在无序移动状态，使分层扫描图像发生严重偏移，最终导致无法获得准确的立体结构形态。图1表明，采用本发明提供的固定样本，可最大限度的降低担孢子的无规则移动，从而获得准确、清晰的真姬菇担孢子立体结构图像。
实验例2
将实施例8获得的固定样本和对比例4获得的制片置于放大倍数为1000倍(目镜放大倍数10倍，物镜放大倍数100倍)的蔡司LSM880激光共聚焦显微镜明场下观察，并拍取真姬菇担孢子的影像数据。
图3和图4分别为实施例8所得到的固定样本曝光1.1s和3s后捕获的显微图片，图5和图6分别为对比例4所得到的制片样本曝光3s和1.1s后捕获的显微图片。由图3和图4可知，在1000倍放大条件下，在曝光1.1s和3s下，采用实施例8提供的固定样本可最大限度的抑制真姬菇担孢子无规则运动，从而获得清晰的真姬菇担孢子图像。而由图5和图6可以看出来，在1000倍放大条件下，采用对比例4提供的制片样本，真姬菇孢子布朗运动尤其明显，在曝光时间3s和1.1s下，目标孢子聚焦困难，所拍摄图像模糊，无法准确表达孢子形态。
实验例3
对实施例7～9和对比例1～3制备固定样本过程中的凝固时间进行统计，结果见表2。
表2实施例7～9和对比例1～3样品凝固时间对比表
| 实施例 | 明胶与甘油水合剂质量体积比 | 凝固时间 |
| 实施例7 | 1：5 | 4-5min |
| 实施例8 | 1：3 | 3-4min |
| 实施例9 | 1:2.5 | 2-3min |
| 对比例1 | 1:100 | 30min以上 |
| 对比例2 | 1:10 | 30min以上 |
| 对比例3 | 1:2 | 2min以下 |
如表2所示，在明胶与甘油水合剂质量体积比为20％～40％时，凝固时间为2～5分钟，此时间既可对真姬菇担孢子进行充分的吸打混匀，又可最大程度的保持样本细胞活性和染色剂成像效果。当明胶与甘油水合剂质量体积比大于等于1:2时，凝固时间在2min以下，来不及采用移液器吸进行充分的吸打混匀操作，且凝固后容易产生皱缩，破坏样品状态，影响染色及观察效果；当体积比小于1:10时，凝固时间会达到30min以上甚至数小时后还未凝固，会影响工作效率。
实验例4
本实验例使用型号为axio observer3的卡尔蔡司荧光显微镜，采用20％能量强度的紫外光对实施例7～9和对比例1～3得到的固定样品以及对比例4得到的染色制片曝光320ms，而后测定各真姬菇担孢子孢子样品的荧光强度，结果如图7所示。根据染色效果越好，检测得到的荧光强度越高的原理，以对比例4为对照组，考察实施例7～9和对比例1～3所得真姬菇担孢子的染色效果。
由图7可以看出，对比例1、对比例2、实施例7、实施例8及实施例9(即明胶与甘油水合剂质量体积比1:100、1:10、1：5、1:3及1:2.5)处理下，固定液的凝固时间均在2min以上，真姬菇担孢子荧光强度相差较小，其均优于对比例4，由此可见，在保证凝固时间在2min以上的情况下，使用固定液的染色效果要优于PBS的染色制片，而明胶与甘油水合剂的质量体积比对染色效果影响不大，但当由于明胶质量体积比过大导致固定样品凝固速度缩短到2min以内时，其染色效果明显下降。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种真菌担孢子的观察方法，其特征在于，观察步骤包括，抽取固定液与真菌担孢子混合均匀，凝固后置于光聚焦显微镜下观察；
所述固定液的制备方法为：将明胶加入到甘油水合剂中加热至50～65℃使明胶融化，而后混匀得到固定液；
所述甘油水合剂中甘油和水的体积比为1:1；
所述明胶与甘油水合剂的质量体积比为1:2.5～5。
2.根据权利要求1所述的观察方法，其特征在于，所述加热的温度为60℃。
3.根据权利要求1所述的观察方法，其特征在于，所述真菌包括平菇、草菇或真姬菇。
4.根据权利要求1～3任一项所述的观察方法，其特征在于，所述真菌担孢子在与固定液混合之前，还包括染色步骤。
5.根据权利要求4所述的观察方法，其特征在于，所述染色步骤包括向真菌担孢子中加入染色剂，避光保存。
6.根据权利要求5所述的观察方法，其特征在于，所述染色剂包括VBL、苯胺蓝或calcofluor white。
7.根据权利要求4所述的观察方法，其特征在于，所述真菌担孢子在染色之后经过清洗。
8.根据权利要求7所述的观察方法，其特征在于，所述清洗步骤包括使用无菌水和/或PBS缓冲液洗涤后离心，去除上清液。
9.根据权利要求1所述的观察方法，其特征在于，所述固定有真菌担孢子的固定液中，真菌担孢子浓度为103～106个/ml。
10.权利要求1～9任一项所述观察方法在真菌担孢子质量评价中的应用。
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