JP2010535771A - 抗体を結晶化させるための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「抗体結晶の形成を可能にする条件」とは非撹拌条件下で結晶形成を生じる溶液の任意条件を意味する。これは混合物のpHや温度等の所与条件下で時間の経過と共に結晶形成を開始するために十分な濃度の少なくとも1種の結晶化剤と抗体分子を含有する溶液を準備することを意味する。
特に指定しない限り、本発明の晶析方法は任意抗体又は抗体フラグメントに適用可能である。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体は各々糖鎖付加又は非糖鎖付加型のキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト抗体(例えばマウス抗体)とすることができる。抗体は例えば二重特異性抗体(dsAb)又は二重可変領域抗体(DADAb)でもよい。
ローラー容器容積:約450〜約550ml、好ましくは約500ml
ローラー容器直径:約6〜約10cm、好ましくは約8cm
ローラー速度:約1〜約100rpmの値に設定
充填:約5〜約15、好ましくは約10容量%
温度:約15〜約25、好ましくは約20℃
期間:約2〜約20、好ましくは約5〜約10日間。
別の側面において、本発明は少なくとも1種のキャリヤー/賦形剤と共に抗体結晶を含有する組成物及び製剤を提供する。製剤は固体、半固体又は液体とすることができる。
−酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸及び酒石酸等の酸性化剤;
−ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン及びトリクロロモノフルオロメタン等のエアゾール用噴射剤;
−二酸化炭素及び窒素等の空気置換剤;
−メチルイソブチルケトン及びオクタ酢酸スクロース等のアルコール変性剤;
−アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及びトロラミン等のアルカリ化剤;
−ジメチコン及びシメチコン等の消泡剤;
−塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズアルコニウム溶液、塩化ベンズエトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール及びチモール等の抗菌防腐剤;
−アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、トコフェロール及びトコフェロール賦形剤等の酸化防止剤;
−酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、第一リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム溶液、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、ヒスチジン等の緩衝剤;
−エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸及び塩並びにエデト酸等のキレート剤;
−カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、医薬品用艶出し剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステメ、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、シェラック、スクロース、二酸化チタン、カルナウバ蝋、微結晶蝋、ゼイン、ポリアミノ酸、他のポリマー(例えばPLGA等)、及びSAIB等のコーティング剤;
−酸化第二鉄等の着色剤;
−エチレンジアミン四酸化及び塩(EDTA)、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミド及び硫酸オキシキノリン等の錯化剤;
−塩化カルシウム、硫酸カルシウム及び二酸化ケイ素等の乾燥剤;
−アラビアガム、コレステロール、ジエタノールアミン(付加物)、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ及びジグリセリド、モノエタノールアミン(付加物)、オレイン酸(付加物)、オレイルアルコール(安定剤)、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシエチレン50、ポリオキシル35ヒマシ油、ポリオキシル40水素化ヒマシ油、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポリオキシル20セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコールジアセテート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン及び乳化蝋等の乳化剤及び/又は可溶化剤;
−粉末セルロース及び精製珪藻土等の濾過助剤;
−アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、オレンジ花油、ハッカ、ハッカ油、ハッカ精、バラ油、高濃度バラ水、チモール、トルーバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキ及びバニリン等のフレーバー及び香料;
−ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素及びタルク等の流動促進剤及び/又は凝結防止剤;
−グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール及びソルビトール等の湿潤剤;
−ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色ペトロラタム、バラ水軟膏及びスクアレン等の軟膏基剤;
−ヒマシ油、ラノリン、鉱物油、ペトロラタム、ギ酸ベンジル、クロロブタノール、フタル酸ジエチル、ソルビトール、ジアセチル化モノグリセリド、フタル酸ジアセチル、グリセリン、グリセロール、モノ及びジアセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリエチル及びエタノール等の可塑剤;
−低分子量(約10残基未満)等のポリペプチド;
−血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等の蛋白質;
−酢酸セルロース膜等のポリマー膜;
−アセトン、アルコール、希アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱物油、落花生油、ポリエチレングリコール、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、胡麻油、注射用水、注射用滅菌水、洗浄用滅菌水、精製水、液体トリグリセリド、液体蝋及び高級アルコール等の溶剤;
−粉末セルロース、活性炭、精製珪藻土、二酸化炭素吸着剤、水酸化バリウム、石灰及びソーダ石灰等の吸着剤;
−水素化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステル蝋、硬質脂肪、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化蝋、白蝋及び黄蝋等の硬化剤;
−カカオバター、硬質脂肪及びポリエチレングリコール等の坐剤基剤;
−アラビアガム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー934p、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム12、カラギーナン、微結晶及びカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコールエステル、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントガム及びキサンタンガム等の懸濁剤及び/又は増粘剤;
−アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、デキストロース賦形剤、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクロース、圧縮糖、粉糖及びシロップ等の甘味剤;
−アラビアガム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポビドン、糊化デンプン及びシロップ等の錠剤結合剤;
−炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、糊化デンプン、スクロース、圧縮糖及び粉糖等の錠剤及び/又はカプセル希釈剤;
−アルギン酸、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン及び糊化デンプン等の錠剤崩壊剤;
−ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、軽鉱物油、ポリエチレングリコール、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、精製ステアリン酸、タルク、水素化植物油及びステアリン酸亜鉛等の錠剤及び/又はカプセル滑沢剤;
−デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤;
−フレーバー入り及び/又は甘味剤入り芳香エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソアルコールエリキシル、ハッカ水、ソルビトール溶液、シロップ及びトルーバルサムシロップ等の溶媒;
−油性アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽鉱物油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、杏仁油、胡麻油、大豆油、スクアレン、固体キャリヤー粒状糖、注射用滅菌静菌水、静菌塩化ナトリウム注射液、液体トリグリセリド、液体蝋及び高級アルコール等の溶媒;
−シクロメチコン、ジメチコン及びシメチコン等の撥水剤;
−塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクサートナトリウム、ノノキシノール9、ノノキシノール10、オクトキシノール9、ポロキサマー、ポリオキシル35ヒマシ油、ポリオキシル40、水素化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシル50、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポリオキシル20、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン及びチロキサポール等の湿潤剤及び/又は可溶化剤。
−グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びヒスチジン等のアミノ酸の塩;
−グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース及びリボース等の単糖類;
−ラクトース、トレハロース、マルトース及びスクロース等の二糖類;
−マルトデキストリン、デキストラン、デンプン及びグリコーゲン等の多糖類;
−マンニトール、キシリトール、ラクチトール及びソルビトール等のアルジトール;
−グルクロン酸及びガラクツロン酸;
−メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−(3−シクロデキストリン)等のシクロデキストリン類;
−塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸、炭酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類;
−酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩及び乳酸塩等の有機塩類;
−アラビアガム、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン及び他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、蝋、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体等の乳化剤又は可溶化剤;並びに
−寒天、アルギン酸とその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースとその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール及びチロキサポール等の増粘剤。
MAK195FはAfelimomab(登録商標)とも呼ばれ、概算分子量100kDaの腫瘍壊死因子α(TNFα)に特異的なマウスIgG3モノクローナル抗体のF(ab’)2フラグメントである。F(ab’)2フラグメントはIgG3モノクローナル抗体のペプチド消化物により産生され、2個のヘテロ二量体から構成される。ヘテロ二量体はIgG3抗体の軽鎖ポリペプチドと重鎖ポリペプチドのFd’部分から構成される。抗体分子の4本の鎖は内部でジスルフィド結合により相互に結合されている。軽鎖と重鎖のFd’部分の全システイン残基がジスルフィド結合に関与している。以下のシステイン残基対がジスルフィド結合により結合されると予想される。軽鎖内の結合:L23−L88とL134−L194、Fd’フラグメント内の結合:H22−H95とH144−H198、軽鎖とFd’フラグメント間の結合:L214−H132、Fd’フラグメント間の結合:H229−H229。予想されるジスルフィドパターンはAfelimomab(登録商標)ポリペプチドのアミノ酸配列と、既知ジスルフィド構造をもつIgG抗体の高度に相同のアミノ酸配列との比較に基づく。ジスルフィド結合の形成は全ジスルフィド結合である程度まで不完全であり、F(ab’)2分子1個当たり約0.3個のシステイン残基が遊離システインとして存在することが分かっている。
A.材料
a)蛋白質
全実験はMAK195FロットG008.01E/PZ0105P025を初期mAb濃度12.39mg/mLで使用して実施した。
酢酸ナトリウムはGrussing GmbH,Filsumから入手した。ポリエチレングリコール4,000はClariant GmbH,Sulzbachから入手した。更に、所定のマイクロスケール実験には市販結晶化スクリーニングキット及び試薬(Hampton Research,Emerald BioStructures,Jena Bioscience)を使用した。全化学薬品はSigma−Aldrich,Steinheim又はMerck,Darmstadtから入手した。
a)Afelimomab(登録商標)(MAK195F)原薬の融解
MAK195Fは撹拌下の水浴中で25℃にて融解した。
MAK195F溶液のアリコートをSLIDE−A−LYZER透析カセット(Pierce Biotechnology Inc.)に注入した。選択緩衝液を充填したビーカーに透析カセットを入れ、4℃で一晩撹拌下に緩衝液交換を行った。蛋白質濃度の調整後、0.2μmシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
MAK195F溶液のアリコートを30KDa MWCO Vivaspin 4コンセントレーター(Vivascience)にピペットで注入した。蛋白質サンプルを新しい緩衝液で4倍に希釈し、4℃にて10,000×gで遠心(Sigma 4K 15実験室用遠心機)することにより、サンプル容量を元のサンプル容量に戻した。希釈/遠心工程を2回繰返し、元のサンプル緩衝液の64倍に希釈した。蛋白質濃度の調整後、0.2μmシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
MAK195F溶液のアリコートを30KDa MWCO Vivaspin 20コンセントレーター(Vivascience)にピペットで注入した。蛋白質サンプルを新しい緩衝液で10倍に希釈し、4℃にて5,000×gで遠心(Sigma 4K 15実験室用遠心機)することにより、サンプル容量を元のサンプル容量に戻した。希釈/遠心工程を1回繰返し、元のサンプル緩衝液の100倍に希釈した。蛋白質濃度の調整後、0.2μmシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
MAK195F溶液のアリコートを30KDa MWCO Vivaspin 20コンセントレーター(Vivascience)にピペットで注入した。蛋白質サンプルを4℃にて5,000×gで遠心(Sigma 4K 15実験室用遠心機)することにより元の容量の10倍まで濃縮した。次に、濃縮したサンプルを新しい緩衝液で元のサンプル容量まで希釈した。遠心/希釈工程を1回繰返し、元のサンプル緩衝液の100倍に希釈した。蛋白質濃度の調整後、0.2μmシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
MAK195F溶液のアリコートをビーカーに加えた。30KDa MWCO Vivaspin 50コンセントレーター(Vivascience)を超純水でリンスし、Masterflex EasyLoad IIポンプを使用して元のサンプル容量を4倍に濃縮した。次に蛋白質サンプルを元の容量まで希釈した。濃縮/希釈工程を3回繰返し、元の緩衝液の総希釈倍率256倍とした。蛋白質濃度の調整後、0.2μmシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
ThermoSpectronics UV1装置を使用し、消光係数1.37cm2mg−1を適用して波長280nmで蛋白質濃度を推定した。このために、結晶化スラリーのアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の残留蛋白質濃度を測定した。
pH測定はMettler Toledo MP220 pH計を使用して実施した。 Inlab 413電極とInlab 423微小電極を利用した。
Hydra II結晶化ロボットとGreiner 96ウェルプレート(3ドロップウェル,Hampton Research)を使用して初期結晶化スクリーニングを実施した。プレートをセットアップ後、ウェルをClearsealフィルム(Hampton Research)で密閉した。
VDXプレート(シーラント付き,Hampton Research)と夫々OptiClearプラスチックカバースライド(正方形,Hampton Research)又はシリコンコートガラスカバースライド(円形,Hampton Research)を使用してハンギングドロップ蒸気拡散実験を実施した。リザーバ溶液の調製後、カバースライド上でリザーバ溶液1滴を蛋白質溶液1滴と混合し、液滴がリザーバの上に垂れ下がるようにカバースライドを裏返してウェルを密閉した。
ウェル内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルを接着テープで密閉した。
1.5mL又は2mLエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。
50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。
50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。蓋をした直後にチューブを実験室用振盪器(GFL3013又はGFL3015)に載せるか、あるいはローリングにより撹拌した。これらの方法を適用することにより、サンプルに撹拌器を挿入するのを避けた。
滅菌した1リットルポリプロピレンびん内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。蓋をした直後に容器をローリングにより撹拌又は撹拌しなかった。これらの方法を適用することにより、サンプルに撹拌器を挿入するのを避けた。
蛋白質濃度を8μg/20μLに調整することによりサンプルを作製した。ブロモフェノールブルーを添加したSDS/Tris/グリセリンでサンプルを希釈した。
Zeiss Axiovert 25又はNikon Labophot顕微鏡を使用して結晶を観察した。後者には偏光フィルターセットとJVC TK C1380カラービデオカメラを接続した。
Nikon Labophot顕微鏡とJVC Digital Screen Measurement Cometソフトウェアバージョン3.52aを使用して概算結晶寸法を測定した。
MAK195Fサンプルの凝集レベルをSE−HPLCにより推定した。Dionex P680ポンプと、ASI−100オートサンプラーと、UVD170U検出器を使用した。批准Abbott標準プロトコール(Afelimomab(登録商標)−原薬)を適用して2本の直列に接続したAmersham Bioscience Agarose 12 10/300 GLゲル濾過カラムにより凝集種を単量体から分離した。
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液とリザーバ溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
蒸気拡散法による条件の初期スクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。Hydra II結晶化ロボットを使用し、数種類の市販結晶化スクリーニングキットを使用して96ウェルGreinerプレートを周囲温度でセットアップした。蛋白質溶液と結晶化剤を1:1比で混合した。以下のスクリーニングキットを使用した。Hampton Crystal Screen 1及び2(Hampton Research)、Wizard Screen I及びII(Emerald BioStructures)、Hampton Index Screen(Hampton Research)、Jena Screens 1−8(Jena Bioscience)。当分野で周知の結晶化剤に(条件毎に1滴ずつ)蛋白質を添加後、プレートをClearsealフィルムで密閉し、周囲温度で保存した。翌日から7日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
−0.1Mカコジル酸ナトリウムpH6.5,0.2M酢酸カルシウム,18% w/v PEG8,000
(Hampton Crystal Screen,D10)
−0.1M MES pH6.5,12% w/v PEG20,000
(Hampton Crystal Screen,F10)
−0.1Mクエン酸塩,pH5.5,20% w/v PEG3,000
(Wizard Screen I & II,A6)
−0.1M酢酸塩,pH4.5,20% w/v PEG3,000
(Wizard Screen I & II,D9)
−0.1M Bis−Tris pH6.5,45% v/vポリプロピレングリコールP400
(Hampton Index,E10)
−0.1M HEPES pH7.5,0.02M塩化マグネシウム,22% w/vポリアクリル酸5,100ナトリウム塩
(Hampton Index,E11)
−0.1M Tris pH8.5,0.2MトリメチルアミンN−オキシド2水和物,20% w/v PEG MME 2000
(Hampton Index,F2)
−0.2Mクエン酸ナトリウム2水和物,20% w/v PEG3,350
(Hampton Index,H10)
−10% PEG4,000,0.1MナトリウムHEPES pH7.5,20%イソプロパノール
(JENA 1−4,E5)
−15% PEG4,000,0.1Mクエン酸ナトリウムpH5.6,0.2M硫酸アンモニウム
(JENA 1−4,F2)
−20% PEG4,000,0.1Mクエン酸ナトリウムpH5.6,0.2M硫酸アンモニウム(JENA 1−4,G6)。
結晶は長さ約10〜150μmの針状形態を示した。
Hampton PEG/イオンスクリーンを使用したハンギングドロップ蒸気拡散法
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。48種類の緩衝液製剤各1mLをウェルにピペットで注入した。蛋白質サンプル約1μLをカバースライドにピペットで滴下した後、特定ウェルのリザーバ溶液約1μLと混合した。カバースライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から7日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
−0.2Mクエン酸三カリウム1水和物,20% w/v PEG3,350 pH8.3。
結晶は寸法約10〜50μmの針束状形態を示した。
Hampton低イオン強度スクリーンを使用したハンギングドロップ蒸気拡散法
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。24%w/v PEG3,350脱水和溶液1mLを108ウェルにピペットで注入した。蛋白質サンプル約2μLをカバースライドにピペットで滴下した後、18種類の特定緩衝液試薬の1種約1μLと混合した。その後、6種類の異なる濃度のうちの1種のPEG3,350沈殿剤約2.5μLを液滴に加えた。カバースライドを裏返してウェルを密閉し、108回の異なるハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から7日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液と(完全に脱塩し、場合により予め蒸留した)ミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液1mLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約20%w/vで一定に維持した。pHを約4.2から約6.5まで0.1刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。一晩保存後、液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液1mLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約10%w/v、15%w/v、20%w/v及び25%w/vで添加した。pHを約5.0から約6.5まで0.3刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。一晩保存後、液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液1mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000濃度を約20%w/vで一定に維持した。pHを約3.6から約5.6まで0.1刻みで変化させ、21種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から7日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液1mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約10%w/v、15%w/v、25%w/v、30%w/v、35%w/v及び40%w/vの濃度で添加した。pHを約3.9、4.2、4.8及び5.1とし、24種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から7日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000濃度を約20%w/vで一定に維持した。pHを約4.2から約6.5まで0.1刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から21日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約16%w/v、18%w/v、22%w/v及び24%w/vの濃度で添加した。pHを約4.2、4.7、5.2、5.7、6.2及び6.5とし、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から21日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、pHを約5.7で一定に維持した。PEG4,000を約10%w/v、12%w/v、14%w/v、16%w/v、18%w/v及び20%w/vの濃度で添加した。従って、6種類の異なる条件を4回ずつ評価した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から21日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
結晶は針状又は針束状形態を示した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約8%w/v、10%w/v、12%w/v及び14%w/vの濃度で添加した。pHを約4.2、4.7、5.2、5.7、6.2及び6.5とし、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から21日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000濃度を約20%w/vで一定に維持した。pHを約4.2から約6.5まで0.1pH刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から9日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約16%w/v、18%w/v、22%w/v及び24%w/vの濃度で添加した。pHを約4.2から約6.5まで0.5pH刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から9日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
MAK195Fをその標準原薬緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.01% Pluronic F68,pH7.2中12.39mg/mL MAK195F)中で使用した。Abbottから公表されている緩衝液組成は10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.01% Pluronic F68,pH7.2中12.4mg/mL MAK195Fであった。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約20%w/vの濃度で一定に維持した。pHを約4.2から約6.5まで0.1pH刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から6日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
蛋白質緩衝液を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
MAK195Fをその標準原薬緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.01% Pluronic F68,pH7.2中12.39mg/mL MAK195F)中で使用した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約16%w/v、18%w/v、22%w/v及び24%w/vの濃度で添加した。pHを約4.2から約6.5まで0.5pH刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から6日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
ハンギングドロップ蒸気拡散法による酢酸亜鉛/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と酢酸亜鉛とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸亜鉛を約0.05M、0.1M、0.5M及び0.9Mの濃度で使用した。pHを約4.2から約6.5まで0.5pH刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から21日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるマンニトール/クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液とマンニトールとミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、マンニトールを約0.05M、0.1M、0.5M及び0.9Mの濃度で使用した。pHを約4.2から約6.5まで0.5pH刻みで変化させ、24種類の異なる条件を設定した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から6日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
温度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000を約10%w/v、12%w/v、18%w/v及び20%w/vの濃度で添加した。pHは全工程で約5.6とした。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを4℃で保存した。一晩保存後、液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。陽性対照として、同一条件で第2のプレートをセットアップし、周囲温度で保存した。
蛋白質緩衝液を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。グリース付きVDXプレートと正方形OptiClearプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、PEG4,000濃度を約12%w/vから約26%w/vまで2%刻みで変化させた。pHは全工程で約5.5とした。各条件を3回ずつ評価した。正方形OptiClearプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約1μLを特定リザーバ溶液約1μLと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から14日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液と結晶化溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
特に指定しない限り、全pH値は結晶化剤等の他の物質を加える前の緩衝液ストック(酢酸又はクエン酸緩衝液)のpHを表す。
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸又はクエン酸を使用して実施したpH調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウム濃度を表す。
50μL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約25μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液25μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.05Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHは全工程で約5.7とした。PEG4,000濃度を約12%w/vから約4%w/vまで1%刻みで変化させた。各条件を2回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。3日後にウェルの顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更した50μL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約25μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液25μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHは全工程で約5.7とした。PEG4,000濃度を約14%w/vから約36%w/vまで2%刻みで変化させた。各条件を2回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から7日間、ウェルの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
300μL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約150μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液150μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHは全工程で約5.7とした。PEG4,000濃度を約18%w/vから約24%w/vまで2%刻みで変化させた。各条件を2回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から14日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
蛋白質緩衝液を変更した300μL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
MAK195Fをその標準原薬緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、0.01% Pluronic F68,pH7.2中12.39mg/mL MAK195F)中で使用した。ウェル内で蛋白質溶液約150μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液150μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHは全工程で約5.7とした。PEG4,000濃度を約18%w/vから約24%w/vまで2%刻みで変化させた。各条件を1回評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から14日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
1mL超までの大規模化の主要条件を見出す150μL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約75μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液75μLを調製した。本実施例では、緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、緩衝液pHを約4.2、4.7、5.2、5.7及び6.2とした。PEG4,000濃度を約6%w/vから約28%w/vまで2%刻みで変化させた。各条件を3回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。夫々1、2、3及び7日後に液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。また、1条件3個のウェルのうちの2個から粒状物質の収率をOD280により測定した。100μLアリコートを14,000×gで遠心し、上清の蛋白質濃度を評価した。
1mL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。1.5mLエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約500μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより特定結晶化溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHを約4.7又は5.2とした。PEG4,000を約16%w/vと約18%w/vの2種類の濃度で添加した。各条件を2回ずつ評価した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から1カ月間、各チューブの1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
蛋白質緩衝液を変更した150μL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約75μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液75μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHは全工程で約5.5とした。PEG4,000を18%w/vと20%w/vの濃度で使用した。各条件を2回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から12日間、ウェルの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
(実施例27)
蛋白質緩衝液を変更した1mL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.0又は5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約500μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。各ウェル内で酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水を混合することにより特定結晶化溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mで一定に維持し、酢酸緩衝液pHは全工程で約5.0又は5.5とした。pH5.5に緩衝した蛋白質をpH5.5の結晶化溶液と混合し、pH5.0に緩衝した蛋白質緩衝液でも同様とした。PEG4,000濃度を約16%w/vから約24%w/vまで2%刻みで変化させて使用した。各条件を3回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から1カ月間、ウェルの顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
設定を変更した1mL容量バッチ法によるPEG4,000/酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.0又は5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約500μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。各ウェル内で蒸留水と50%w/v PEG4,000溶液を混合することにより特定結晶化溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を0Mとし、即ち実験における唯一の酢酸緩衝液は元のMAK195F溶液中に存在するものとした。PEG4,000は約22%w/vから約26%w/vまで2%刻みで濃度を変化させて使用した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から1カ月間、ウェルの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
ポリソルベート80添加の影響下における1mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。ポリソルベート80を蛋白質溶液に約1%、0.1%、0.01%及び0.001%の濃度で加えた。ポリソルベート80を含有しない溶液を対照として準備した。結晶化実験を開始する前に溶液を一晩インキュベートした。1.5mLエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約500μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液500μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.5とした。PEG4,000を20%w/vの濃度で使用した。各ポリソルベート80濃度を2回ずつ評価した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から1カ月間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
結晶化核生成剤としての各種鉱物の影響下における100μLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。49種類の異なる鉱物1組(ミュンヘン州立鉱物学博物館(Mineralogische Staatssammlung Munchen)所有)を結晶化核生成剤として評価した。この実験の背景の思想は標準針状又は針束状形態とは異なる多形結晶形態の成長用表面としてのこのような鉱物の使用可能性を検討することであった。各鉱物を新たに分割し、50〜250μmの寸法の粒子をウェルに入れた。各鉱物を2回ずつ試験し、鉱物を添加しない多数のウェルを対照として準備した。ウェル内で蛋白質溶液約50μLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をウェル内で混合することにより結晶化溶液50μLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約16%w/vの濃度で使用した。翌日から2週間、ウェルプレートの顕微鏡観察を実施した。
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液と結晶化溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
特に指定しない限り、全pH値は結晶化剤等の他の物質を加える前の緩衝液ストック(酢酸又はクエン酸緩衝液)のpHを表す。
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸又はクエン酸を使用して実施したpH調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウム濃度を表す。
10mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を18%w/vの濃度で使用した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から数カ月間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、OD280により結晶収率を測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
撹拌導入下の10mlバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
20mM HEPES/150mM塩化ナトリウム緩衝液(pH7.4)でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を18%w/vの濃度で使用した。バッチを実験室用振盪器で撹拌しながらチューブを周囲温度で保存した。翌日から数カ月間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、OD280により結晶収率を測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
蛋白質緩衝液を変更した10mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.5とした。PEG4,000を約20%w/v及び22%w/vの濃度で使用した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から1カ月間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、バッチの結晶収率をOD280により測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
蛋白質緩衝液を変更し、非撹拌下と撹拌下のバッチを比較した10mlバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。非撹拌下と実験室用振盪器で撹拌下にチューブを周囲温度で保存した。翌日から21日間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をOD280により測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
蛋白質緩衝液を変更し、非撹拌下と撹拌下のバッチを比較した10mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.5の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.5とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。非撹拌下と実験室用振盪器で撹拌下にチューブを周囲温度で保存した。翌日から21日間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をOD280により測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
250mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。1リットルポリプロピレン容器内で蛋白質溶液約125mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液125mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。容器を周囲温度で保存した。容器を約60rpmでローリングすることにより撹拌を実施した。翌日から数カ月間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をOD280により測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
容器材料を変更した10mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLガラス(クラスI)バイアル内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。バイアルをテフロン(登録商標)ストッパーで密閉し、実験室用振盪器で撹拌下に周囲温度で保存した。翌日から21日間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
温度を変更した10mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。50mLファルコンチューブ内で蛋白質溶液約5mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液5mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。チューブを実験室用振盪器で撹拌下に周囲温度で保存した。翌日から10日間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。4℃で10日間保存後、バッチを周囲温度に戻した。
1Lバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。1リットルポリプロピレン容器内で蛋白質溶液約500mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液500mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。容器を周囲温度で保存した。容器を約60rpmでローリングすることにより撹拌を実施した。翌日から数週間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をOD280により測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
非撹拌下の400mLバッチ容量でのPEG4,000/酢酸ナトリウム結晶化条件
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈した。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。1リットルポリプロピレン容器内で蛋白質溶液約200mLを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と50%w/v PEG4,000溶液とミリQ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液200mLを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約0.1Mとし、酢酸緩衝液pHを約5.2とした。PEG4,000を約20%w/vの濃度で使用した。容器を周囲温度で保存した。翌日から数週間、溶液の1μLアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、OD280により結晶収率を測定した。懸濁液のアリコートを14,000rpmで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
(実施例41)
結晶の洗浄
結晶の形成後は、結晶を再溶解させない洗浄工程が有利である。従って、実施例36に記載したような結晶化工程の終了後、結晶スラリーを遠心管に移し、500〜1000×gで20分間遠心した。遠心は4℃又は周囲温度で実施した。遠心後、上清を捨て、約0.1M酢酸ナトリウム中に約24%w/v PEG4,000を含有するpH約5.2の緩衝液に結晶ペレットを容易に再懸濁した。OD280により分析した処、このような洗浄用緩衝液中に測定可能なMAK195F結晶は溶解していなかった。次いで遠心/再懸濁工程を1〜3回繰返し、この洗浄工程後に、ペレットを再懸濁し、保存した。
晶析工程の収率増加
晶析工程の終点は結晶化スラリーの上清のアリコートのOD280測定値が例えばその後3日間一定となる時点として定義することができる。結晶化スラリーの上清に所定量のPEG4,000(pH約5.2の約0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中50%w/v溶液)を補充することにより収率増加が可能であることが判明した。最初に晶出した結晶と同一形状の結晶がその後の数日間に形成された。この手順を適用すると、沈殿を導入せずに総収率は容易に90%を超えた。
SDS PAGEによる結晶の分析
結晶の蛋白性を確認するために、実施例41のプロトコルに従って実施例36からの結晶を洗浄した。数回の洗浄段階後、洗浄用緩衝液上清中に測定可能な量の溶解蛋白質が存在していないことをOD280により確認した。上清を捨てた後、結晶を蒸留水に溶解した。この溶液のOD280測定によると、UV吸光度が有意に高いことから、溶解蛋白質が存在するようになったことが判明した。この溶液のSDS−PAGE分析は、MAK195F標準に比較して同一パターンを示した。
SE−HPLCによる結晶の分析
MAK195F結晶の凝集種の含量を調べるために、実施例36からの洗浄した結晶のアリコートを遠心し、標準方法に従ってSE−HPLCランニング緩衝液に再溶解した。晶析工程の完了後(本実施例では周囲温度で7日)に、凝集物含量は約0.9%から約1.3〜1.4%まで僅かに増加した。このような凝集物がMAK195F結晶の固有特徴であるのか、又は例えば非結晶化可溶性MAK195F単量体が結晶表面に凝集したのかはまだ不明である。
これらの実験の目的は抗体(例えばMAD195F)の実施容易なバッチ晶析法に及ぼす撹拌速度の影響を検討することであった。他の全結晶化パラメータを一定に維持することにより、5個の連続バッチ(10、20、40、60及び80rpm)で撹拌の程度を変えた。結晶化速度、総収率、粒子形状及び粒度分布に及ぼす影響を検討した。
制御条件下のMAK195Fの結晶化
材料
−MAK195F,ロットG008.01E/PZ0105P025(Abbott Laboratories)
−無水酢酸ナトリウム(Gruessing)
−氷酢酸(Merck)
−ポリエチレングリコール4,000(Clariant)
−ポリプロピレンびん,直径8cm,高さ10cm。
(500mlポリプロピレンびんに入れて−80℃で保存した)凍結MAK195Fを周囲温度で2時間以内に融解させた。融解後、原薬溶液は透明であり、肉眼で汚染性粒子は認められなかった。蛋白質緩衝液を以下のように調製した。酢酸ナトリウム41.02gを精製水に溶解することにより酢酸緩衝液500mLを調製した。容量を500.0mLに調整し、氷酢酸でpHを5.2に調整した。この緩衝液400mLを精製水で総容量4.0Lまで希釈した。この緩衝液を5回の各バッチ晶析前に新たに調製した。
結晶収率[%]=C(総蛋白質)−C(蛋白質上清)/C(総蛋白質)×100%
結晶の光学顕微鏡写真を次のように撮影した。8日間撹拌後、10μLアリコートを対物レンズホルダーにピペットで滴下した後、ガラスカバースライドをかぶせた。E−PI 10倍接眼レンズと40倍対物レンズを装着したZeiss Axiovert 25倒立型光学顕微鏡を使用して調製物を分析した。デジタルカメラ(Sony Cybershot DSC S75)を使用して写真撮影した。
I)手動評価
8日間撹拌後、10μLアリコートを対物レンズホルダーにピペットで滴下した後、ガラスカバースライドをかぶせた。CFW 10倍接眼レンズと20倍対物レンズを装着したNikon Labophot顕微鏡を使用した。JVC TK C1380カラービデオカメラを介して顕微鏡写真をコンピュータスクリーンに転送し、JVC Digital Screen Measurement Cometソフトウェアバージョン3.52aにより100個の結晶の長さを測定することにより、結晶寸法(最大長)を推定した。これらの100回の測定から粒度分布と最大長の平均値を特定した。
統計的有意に基づいてサンプルの粒度分布を検討するために、PS Prozesstechnik XPT−C Optical Particle Analysis System(PS Prozesstechnik GmbH,Basel,Switzerland)で更に懸濁液を分析した。Feretmax(全粒子方向の最長距離)値を記録した。サンプル当たりの粒子数は夫々5,000超であった。
−誘導期(1日及び2日),収率ゼロ;
−主結晶化期(3〜5日),結晶化率>10%(収率に比較)に達する。
−低結晶化期及び停滞期(6〜8日),結晶化率<10%,SE−HPLC分析による最大MAK195F純度。
粒子形状に及ぼす撹拌速度の影響を図2に示す。全バッチ晶析は針状の結晶物を生じた。
−写真A:MAK195F結晶,10rpm
−写真B:MAK195F結晶,20rpm
−写真C:MAK195F結晶,40rpm
−写真D:MAK195F結晶,60rpm
−写真F:MAK195F結晶,80rpm。
(実施例46)
固体結晶化剤
約0.1M酢酸ナトリウムを含有するpH約5.2の緩衝液でMAK195Fを希釈する。蛋白質濃度を10mg/mLに調整した。
別の緩衝液調製プロトコール及び結晶の作製
本実施例では、次のように酢酸緩衝液を調製する。氷酢酸60gを精製水約840mLで希釈する。水酸化ナトリウム溶液でpHを調整し、容量を1,000mLに調整する。この場合には、総酢酸塩量を1M(蛋白質溶液、結晶化溶液及び結晶化混合物中100mM)に固定する。
封入結晶の作製
実施例36で得られた結晶はMalvern Instruments Zetasizer nanoを使用するゼータ電位測定によると正に荷電している。
封入/包埋結晶の作製
実施例36に記載したように結晶を得る。
結晶性を維持する賦形剤を含有する緩衝液で結晶を洗浄懸濁する。
その後、当分野で公知の方法を使用し、
−結晶を乾燥し、これらの乾燥した結晶を例えば圧縮、溶融分散等によりキャリヤーと混合することにより結晶を包埋することができる。
−結晶懸濁液を水不混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を封入/包埋することができる。キャリヤーから溶媒の除去後にキャリヤーは沈殿する。その後、材料を乾燥する。
−結晶懸濁液を水混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を封入/包埋することができる。キャリヤーは混合物中でその溶解度限界を越えると沈殿する。
−乾燥した結晶又は結晶懸濁液を水混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を包埋することができる。
−乾燥した結晶を水不混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を包埋することができる。
H1.生物活性試験
結晶MAK195Fの生物活性の維持
a)一般方法
指標としてマウスL−929細胞を96ウェルマイクロタイタープレートで規定量のrHuTNFと共に37℃で各種濃度のAfelimomab(登録商標)の存在下に48時間インキュベートすることによりrHuTNFの細胞傷害作用に対するAfelimomab(登録商標)溶液の中和作用を測定する。生存細胞はクリスタルバイオレットで染色される。マイクロタイタープレートの個々のウェルで分光法により色強度を測定し、評価する。IC50、即ち細胞の50%が生存するようにL−929細胞に及ぼすrHuTNFの細胞傷害作用を低減するAfelimomab(登録商標)の濃度を測定する。
参照標準に対するサンプル(洗浄済み結晶;実施例41に記載の洗浄プロトコル,実施例39に記載のバッチに由来する結晶)の生物活性の比較として試験を実施した。吸光度値をAfelimomab(登録商標)の濃度に対してプロットし、4パラメータ非線形回帰により評価した処、抗体によるTNF効果の阻害のIC50値が判明した。両方のサンプルをマイクロプレート1枚で4回ずつ繰返して試験したので、夫々Afelimomab(登録商標)参照標準とサンプルに4個のIC50値を得た。次に、参照標準のIC50値の平均を計算し、参照標準の平均IC50値をサンプルの該当IC50値で割り、100%を掛けることによりサンプルの各反復の相対活性を評価した。
(実施例51)
MAK195Fの結晶の顕微鏡による特性決定
a)mAb結晶バッチサンプルの光学分析
均質化後、1〜10μLサンプル容量のアリコートを対物レンズホルダープレートにピペットで滴下し、ガラスカバースライドをかぶせた。E−PI 10倍接眼レンズと夫々10倍、20倍及び40倍対物レンズを装着したZeiss Axiovert 25倒立型光学顕微鏡を使用して結晶調製物を評価した。デジタルカメラ(Sony Cybershot DSC S75)を使用して写真撮影した。
複屈折挙動を検出するために、CFW 10倍接眼レンズと4倍、10倍、20倍及び40倍対物レンズを装着したNikon Labophot顕微鏡を使用した。更に、顕微鏡にフィルターセット(検光子及び偏光子ユニット)を装着した。
結晶中に取込まれた蛋白質150mg/mLを実施例41からの洗浄用緩衝液に配合したMAK195F結晶懸濁液は27G針で注射可能である。
18% PEG4,000m/v
0.01%ポロキサマー188
10mMリン酸ナトリウム緩衝液
pHを水酸化ナトリウム溶液で7.2に調整した。
Henke Sass Wolf GmbH 1mL Norm−Jectシリンジに、
−Henke Sass Wolf GmbH Fine−Ject(登録商標)20G針
−Terumo(登録商標)23G針
−Neopoint(登録商標)26G針
を装着した。
BD HyPak SCF(登録商標)1mLの長いシリンジに27.5G RNS針38800 Le Pont du Claixを装着した。
(実施例52)
結晶化/結晶の再溶解後の天然二次構造の維持
Bruker Optics Tensor 27でConfocheckシステムを使用してIRスペクトルを記録した。MicroBiolytics AquaSpecセルを使用して液体サンプルを分析した。Harrick BioATRIIセル(登録商標)を使用して蛋白質懸濁液の測定を実施した。25℃で120〜500個のスキャンの測定を少なくとも2回実施して各サンプルを評価した。ブランク緩衝液スペクトルを蛋白質スペクトルから夫々差し引いた。フーリエ変換により蛋白質二次導関数スペクトルを作成し、相対比較のために1580〜1720cm−1からベクトルを正規化した。
(実施例53)
Peg/リン酸緩衝液中の12カ月安定性データ(Se Hplc,Ft−Ir,形態)
実施例39に記載した結晶化手順を使用してMAK195Fを結晶化させた。この場合には18%(w/v)PEG4,000と、0.01%ポロキサマー188と、10mMリン酸ナトリウムを含有する緩衝液(pH7.2)を使用し、実施例41に記載したように結晶を洗浄した。次に、結晶を遠心により夫々5mg/mL及び200mg/mL蛋白質含量まで濃縮し、2〜8℃で保存した。5/200mg/mL結晶MAK195Fを2〜8℃で12カ月間保存後の安定性データは90%を上回る単量体の維持を明白に示す。
分散緩衝液:
18% PEG4,000m/v
0.01%ポロキサマー188
10mMリン酸ナトリウム緩衝液
pHを水酸化ナトリウム溶液で7.2に調整した。
Bruker Optics Tensor 27でConfocheckを使用してIRスペクトルを記録した。MicroBiolytics AquaSpecセルを使用して液体サンプルを分析した。Harrick BioATRIIセル(登録商標)を使用して蛋白質懸濁液の測定を実施した。25℃で120〜500個のスキャンの測定を少なくとも2回実施して各サンプルを評価した。ブランク緩衝液スペクトルを蛋白質スペクトルから夫々差し引いた。フーリエ変換により蛋白質二次導関数スペクトルを作成し、相対比較のために1580〜1720cm−1からベクトルを正規化した。
1〜10μLサンプル容量のアリコートを対物レンズホルダープレートにピペットで滴下し、製剤化用緩衝液(20%PEG)で希釈し、ガラスカバースライドをかぶせた。E−PI 10倍接眼レンズと夫々10倍、20倍及び40倍対物レンズを装着したZeiss Axiovert 25倒立型光学顕微鏡を使用して調製物を評価した。2〜8℃で12カ月間保存後に結晶の光学顕微鏡分析で顕著な形態変化は認められなかった。
(実施例54)
DSC分析
200mg/mLのストレスなしのサンプルで示差走査熱量測定(DSC)を実施した。パラグラフ3)に記載したように調製した結晶懸濁液と、液体製剤(0.01%ポロキサマー188、150mM塩化ナトリウム及び10mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.2を含有する緩衝液中のMAK195F)と、プラセボ18% PEG4,000結晶懸濁緩衝液を比較した。
(実施例55)
MAK195F結晶の走査型電子顕微鏡(SEM)による特性決定
実施例39に記載したように調製したMAK195F結晶懸濁液のアリコートを遠心した。上清のデカント後、ペレットを無水エタノールに再懸濁した。遠心/エタノール再懸濁工程を数回連続して実施した後、懸濁液1滴をSEMサンプルホルダーに移し、室温で乾燥した。サンプルに炭素スパッタリングし、Oxford Instruments 7418検出器に接続したJEOL JSM 6500F走査型電子顕微鏡でデータを集めた。図7はMAK195F結晶の典型例を示す。
(実施例56)
設定を変更して連続法とした晶析工程の収率増加
晶析工程の終点は結晶化スラリーの上清のアリコートのOD280測定値が例えばその後3日間一定となる時点として定義することができる。結晶化スラリーの上清に所定量のPEG4,000(pH約5.2の約0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中50%w/v溶液)を補充することにより収率増加が可能である。最初に晶出した結晶と同一晶癖の結晶がその後の数日間形成される。この手順を適用すると、沈殿を導入せずに総収率は容易に90%を超える。
(実施例57)
MAK195F結晶化バッチの種晶添加
実施例39に記載したようにMAK195F結晶化バッチを調製する。蛋白質溶液を結晶化用緩衝液と混合後、混合物に既存MAK195F結晶を均質種晶添加する。例えば、約60〜70%の結晶収率を示す実施例39に記載したように調製した結晶懸濁液のアリコートを例えば1/20比(v/v)で結晶化バッチに加える(本実施例では、50mLを1 ,000mLに加える)。このストラテジーを適用し、より短時間の処理時間で収率を高めるように総結晶収率と処理時間を更に最適化する。
(実施例58)
ラットにおけるPK/tox試験(下記参照)用サンプルの調製
4種類の異なる製剤を調製した:
−MAK195F液体製剤,50mg/mL
−MAK195F結晶懸濁液,50mg/mL,撹拌下の工程(より短い針状物を生じる)
−MAK195F結晶懸濁液,200mg/mL,撹拌下の工程
−MAK195F結晶懸濁液,200mg/mL,非撹拌下の工程(より長い針状物を生じる)。
MAK195F溶液の融解
MAK195F(LOT G008.01E/PZ0105P025,c=12.4mg/mL)の溶液20mLを撹拌下の25℃の水浴中で2時間以内に融解した。
準備の容易なVivaspin 20チューブ(30kDa PES MWCO)を使用してMAK195F溶液20mLを5mLまで濃縮し、容量が5mLに減少するまで5,000×gで4℃にて遠心した。溶液を滅菌濾過した。
得られたMAK195F溶液の濃度をOD280により測定し、蒸留水1990mLで希釈した蛋白質溶液10μLを蒸留水に対して測定した。
A=0.353/0.359/0.354,c=51.9mg/mL。
MAK195F 51.9mg/mL
Pluronic F 68 0.1mg/mL
リン酸2水素ナトリウム2水和物 1.56mg/mL
塩化ナトリウム 8.77mg/mL
水酸化ナトリウム pH調整7.2。
1.バッチ晶析:
MAK195F溶液の融解
MAK195F(LOT G008.01 E/PZ0105P025,c=12.4mg/mL)の溶液400mLを撹拌下の25℃の水浴中で2時間以内に融解した。溶液を1000mLビーカーに移した。
水400mLが濾液容器に流入するまでVivaflow 50(30000 MWCO,PES)カートリッジを蒸留水500mLでリンスした。
緩衝液A(1M酢酸ナトリウム緩衝液 pH5.2)
500mLメスフラスコ内で酢酸ナトリウム41.02gを蒸留水約450mLに溶解した。更に蒸留水を加えることにより容量を500mLに調整した。濃酢酸を加えることにより緩衝液のpHを5.2に調整した。
5000mLビーカー内で緩衝液A250mLを蒸留水で総容量2500mLまで希釈した。
緩衝液A150mLと300gのPEG4000を1500mLメスフラスコに移し、蒸留水を総容量1500mLまで充填した。次に緩衝液を層流ベンチ下におき、滅菌濾過した(細孔寸法0.22μmフィルターディスク2枚)。
準備の容易なVivaflow 50カートリッジを使用することによりMAK195F溶液400mLを50mLまで濃縮した。この濃縮溶液(c=約100mg/mL)を1000mLビーカー内で緩衝液B450mLで希釈した。準備の容易なVivaflow 50カートリッジを使用し、容量を50mLに戻した。この手順を1回繰返した。最終段階で50mLを緩衝液B450mLで希釈したが、容量は減らさず、蛋白質濃度を約10mg/mLとなるようにした。元のMAK195F緩衝液の総希釈倍率は1000倍である。
得られたMAK195F溶液の緩衝液B中の濃度をOD280により測定し、蒸留水1960μLで希釈した蛋白質溶液40μLを蒸留水に対して測定した。
A=0.258 c=9.4mg/mL
mAb溶液470mLを層流ベンチ下におき、滅菌濾過した(細孔寸法0.22μmフィルターディスク2枚)。溶液260mLを1000mLメスシリンダーに移し、緩衝液C260mLと混合した。混液を1000mLポリプロピレン容器びんに移した。びんをパラフィルムで密閉し、20℃で保存した。びんを約60rpmで撹拌した(「撹拌下の工程」)。溶液210mLを1000mLメスシリンダーに移し、緩衝液C210mLと混合した。混液を1000mLポリプロピレン容器びんに移した。びんをパラフィルムで密閉し、20℃で保存した。びんを撹拌しなかった(「非撹拌下の工程」)。
製剤緩衝液調製
まず、0.5Mリン酸ストック溶液50mLを調製した。リン酸2水素ナトリウム2水和物3.9gを精製水約40mLに溶解した後、水酸化ナトリウムでpHを7.2に調整した。容量を50mLに調整した。360gのPEG4,000とストック溶液40mLと0.2gのPluronic F68を精製水2000mLに溶解した。
得られたMAK195F結晶化バッチの濃度をOD280により測定した。150μLアリコートを14,000rpmで20分間遠心した。上清100μLを蒸留水1900μLで希釈し、蒸留水に対して測定した。
上清I:A=0.158
上清II:A=0.154 c=2.3mg/mL 結晶収率54%。
全遠心工程は容易に再懸濁可能なペレットが形成され、上清中に残留固体が残らないように500〜2,000rpmの速度で実施した。結晶スラリーを滅菌50mLポリプロピレンチューブ10本に分注し、遠心した。上清を捨て、ペレットを夫々18% PEG4,000緩衝液20mLに再懸濁し、全チューブを50mlポリプロピレンチューブ4本にプールした。チューブを再び遠心し、上清を捨て、ペレットを夫々18% PEG4,000緩衝液20mLに再懸濁後、結晶スラリーをチューブ2本にプールし、遠心した。洗浄と遠心を更に1回実施し、緩衝液を捨てた後、新鮮な緩衝液で濃度を50mg/mLに調整した。アリコートの濃度をOD280により測定した(水1990μL中10μL)。
A=0.345/0.358/0.356,c=51.5mg/mL。
このスラリーを15mL滅菌ポリプロピレンチューブ2本に容量2及び3mLで充填した。残りのスラリーを遠心により200mg/mLまで濃縮した。アリコートの濃度をOD280により測定した(水1995μL中5μL)。
A=0.656/0.659/0.652,c=191.4mg/mL。
このスラリーを2mL滅菌エッペンドルフ反応チューブに充填した。
MAK195F 51.5/191.4mg/mL
PEG4,000 18% m/v
Pluronic F 68 0.1mg/mL
リン酸2水素ナトリウム2水和物 1.56mg/mL
水酸化ナトリウム pH調整7.2。
緩衝液調製(緩衝液MAK195F+PEG)
まず、0.5Mリン酸ストック溶液50mLを調製した。リン酸2水素ナトリウム2水和物3.9gを精製水約40mLに溶解した後、水酸化ナトリウムでpHを7.2に調整した。容量を50mLに調整した。360gのPEG4,000とストック溶液40mLと0.2gのPluronic F68を精製水2000mLに溶解した。
得られたMAK195F結晶化バッチの濃度をOD280により測定した。150μLアリコートを14,000rpmで20分間遠心した。上清100μLを蒸留水1900μLで希釈し、蒸留水に対して測定した。
上清I:A=0.192
上清II:A=0.193 c=2.8mg/mL 結晶収率44%。
全遠心工程は容易に再懸濁可能なペレットが形成され、上清中に残留固体が残らないように500〜2,000rpmの速度で実施した。結晶スラリーを滅菌50mLポリプロピレンチューブ9本に分注し、遠心した。上清を捨て、ペレットを夫々18% PEG4,000緩衝液20mLに再懸濁し、全チューブを50mlポリプロピレンチューブ4本にプールした。チューブを再び遠心し、上清を捨て、ペレットを夫々18% PEG4,000緩衝液20mLに再懸濁後、結晶スラリーをチューブ2本にプールし、遠心した。洗浄と遠心を更に1回実施し、緩衝液を捨てた後、新鮮な緩衝液で濃度を200mg/mLに調整した。アリコートの濃度をOD280により測定した(水1995μL中5μL)。A=0.685/0.652/0.651,c=193.5mg/mL。
MAK195F 193.5mg/mL
PEG4,000 18% m/v
Pluronic F 68 0.1mg/mL
リン酸2水素ナトリウム2水和物 1.56mg/mL
水酸化ナトリウム pH調整7.2。
サンプルのSE−HPLC分析の結果、全4個のサンプルは97.5%超の単量体種を含有することが判明した。
単回皮下投与後の雄性Sprague−DawleyラットにおけるMAK195F(Afelimomab)結晶の局所耐性及び毒性に関する適性試験
本試験の目的は新規型の製剤におけるTNFαに対する抗体であるMAK195F(afelimomab)の局所耐性を試験することであった。更に、本試験では製剤の全身毒性及び毒物動態データに関する他の情報について検討した。雄性Sprague−Dawleyラット(Charles River Laboratories,69592 L’Arbresle,France)にMAK195F(afelimomab)の各種製剤の単回皮下注射後に種々の観察期間後にMAK195F(afelimomab)の局所耐性と毒物動態及び病理作用を試験した(表6及び7参照)。投与容量は1mL/kg体重とした。
−群01、02所見なし。
−群03及び05では軽度〜中度の汎発性皮下炎症。
−群03(8日及び15日)と05群(3日)では最軽度〜軽度の皮下浮腫。
−06群では最軽度の混合細胞浸潤(15日)以外に所見なし。
本明細書の随所に引用する全引用文献(文献資料、特許、特許出願及びウェブサイトを含む)の内容を特に本明細書に援用する。特に指定しない限り、本発明の実施には当分野で周知の従来の小規模及び大規模蛋白質結晶化及び製剤化技術を利用する。
本発明はその精神又は本質的特徴から逸脱せずに他の特定形態で実施することができる。従って、上記態様は本明細書に記載する発明を制限するものではなく、あらゆる点において例証とみなすべきである。即ち、本発明の範囲は以上の記載により指定されるのではなく、特許請求の範囲により指定され、従って、特許請求の範囲と等価の意味及び範囲内に該当するあらゆる変更も本発明に含むものとする。
Claims (73)
- 所望の実質的に均一寸法の抗体結晶の製造方法であって、
a)抗体結晶の形成を可能にする条件下で抗体と少なくとも1種の結晶化剤を含有する水性結晶化混合物を準備する段階と;
a)前記結晶化混合物を制御条件下で撹拌し、所望の平均寸法範囲の抗体結晶を形成する段階を含む前記方法。 - 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約1〜約200rpmの範囲の速度で撹拌することに対応する請求項1に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物を直径約2〜約100cmの範囲のローラー容器に入れて撹拌することに対応する請求項2に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応し、前記ローラー容器の総容積の約1〜約100%に結晶化混合物を充填する請求項2に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応し、前記ローラー容器の総容積の約1〜約100%に結晶化混合物を充填する請求項3に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約30分間〜約20日間撹拌することに対応する請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約−15〜約+50℃の範囲の温度で撹拌することに対応する請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記撹拌が前記結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び/又はタンブリングを含む請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 結晶化剤がポリアルキレンポリオールである請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 結晶化剤がポリアルキレングリコールである請求項9に記載の方法。
- 結晶化剤がポリエチレングリコールである請求項10に記載の方法。
- 結晶が約1〜約1000μmの範囲内の均一な結晶粒径及び/又は粒長を含む請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が抗体フラグメントである請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体フラグメントが抗hTNFα抗体フラグメントである請求項13に記載の方法。
- 抗体フラグメントがFab又はF(ab’)2フラグメントである請求項13に記載の方法。
- 抗体フラグメントが寄託番号ECACC87050801のハイブリドーマ細胞株により産生されるMAK195のF(ab’)2フラグメントであるMAK195Fである請求項15に記載の方法。
- MAK195Fが約0.5〜約280mg/mlの範囲の初期蛋白質濃度で存在しており、ローラー容器に入れて約15〜約25℃の範囲の温度にて約5〜約100rpmの範囲の速度で約1〜約60日間撹拌する請求項16に記載の方法。
- 前記結晶が約1〜約200μmの範囲の制御された平均結晶粒長を含む請求項17に記載の方法。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶。
- 抗hTNFα抗体結合フラグメントを結晶化するためのバッチ晶析方法であって、
(a)抗体と、結晶化剤としての少なくとも1種のポリアルキレングリコールを含有する水性結晶化混合物を準備する段階と;
(b)前記抗体の結晶が形成されるまで前記水性結晶化混合物をインキュベートする段階を含み、
前記少なくとも1種のポリアルキレングリコールを(a)1段階又は(b)2段階以上で提供し、ある段階で形成された前記抗体結晶を次段階で取出さない前記方法。 - 抗体が抗体フラグメントである請求項20に記載の方法。
- 前記水性結晶化混合物のpHが約pH4〜約6.5の範囲である請求項20に記載の方法。
- 前記水性結晶化混合物が緩衝液を含有している請求項23に記載の方法。
- 前記緩衝液が酢酸緩衝液及び/又はクエン酸緩衝液を含む請求項23に記載の方法。
- 前記緩衝液が酢酸ナトリウム及び/又はクエン酸ナトリウムを含む請求項23に記載の方法。
- 前記緩衝液が水性結晶化混合物中に約0.5Mまでの濃度で存在する請求項23に記載の方法。
- ポリアルキレングリコールが約400〜約10,000g/molの範囲の平均分子量をもつ請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
- ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項27に記載の方法。
- ポリアルキレングリコールが総容量の約5〜約30%(w/v)の範囲の最終濃度で結晶化混合物中に存在する請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
- ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項29に記載の方法。
- 以下の付加的な結晶化条件:
a)インキュベーションを約1時間〜約250日間実施する;
b)インキュベーションを約−15℃〜+約50℃の温度で実施する;
c)抗体混合物が約0.5〜約280mg/mlの範囲の濃度で抗体フラグメントを含有する
のうちの少なくとも1つを満足する請求項1から5及び20から22のいずれか一項に記載の方法。 - 更に前記結晶を乾燥する段階を含む請求項1から5及び20から22のいずれか一項に記載の方法。
- 更に前記結晶を乾燥する段階を含む請求項31に記載の方法。
- 結晶化混合物が結晶と天然母液を含有しており、方法が更に天然母液を人工母液と交換する段階を含む請求項31に記載の方法。
- 結晶化混合物が約1ml〜約20,000リットルの範囲のバッチ容量を含む請求項1から5及び20から22のいずれか一項に記載の方法。
- 結晶寸法制御条件下で結晶化を実施する請求項20に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約1〜約200rpmの範囲の速度で撹拌することを含む請求項36に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物を直径約2〜約100cmの範囲のローラー容器に入れて撹拌することを含む請求項36に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することを含み、前記ローラー容器の総容積の約1〜約100%に結晶化混合物を充填する請求項36に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することを含み、前記ローラー容器の総容積の約1〜約100%に結晶化混合物を充填する請求項37に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約30分間〜約20日間撹拌することを含む請求項36から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約−15〜約+50℃の範囲の温度で撹拌することを含む請求項36から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記撹拌が前記結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び/又はタンブリングを含む請求項36から40のいずれか一項に記載の方法。
- 抗hTNFα抗体フラグメントの結晶。
- 請求項1から5、20から22及び36から40のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗hTNFα抗体フラグメントの結晶。
- 結晶が針状形態を含む請求項44に記載の結晶。
- 結晶が針状形態を含む請求項45に記載の結晶。
- 前記抗体フラグメントがポリクローナル抗体フラグメント又はモノクローナル抗体フラグメントである請求項36に記載の方法により取得可能な結晶。
- 前記抗体フラグメントがキメラ抗体、ヒト化抗体、非糖鎖付加抗体、ヒト抗体及びマウス抗体のフラグメントから構成される群から選択される請求項36に記載の方法により取得可能な結晶。
- 前記抗体フラグメントがIgG抗体のフラグメントである請求項36に記載の方法により取得可能な結晶。
- 前記抗体がIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4抗体から構成される群から選択される請求項50に記載の結晶。
- 前記抗体がFab又はF(ab’)2フラグメントである請求項48から51のいずれか一項に記載の結晶。
- 抗体フラグメントが寄託番号ECACC87050801のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体MAK195のF(ab’)2フラグメントであるMAK195Fである請求項52に記載の結晶。
- (a)請求項1から5、20から22及び36から40のいずれか一項に記載の方法に従って製造された抗体の結晶と、(b)少なくとも1種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物であって、組成物が固体、半固体又は液体製剤として提供される前記組成物。
- (a)請求項1から5、20から22及び36から40のいずれか一項に記載の方法に従って製造された抗体の結晶と、(b)少なくとも1種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物であって、賦形剤が前記結晶を包埋又は封入する前記組成物。
- 前記抗体が約1mg/mlを上回る濃度で存在する請求項54に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が約200mg/mlを上回る濃度で存在する請求項54に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が約1mg/mlを上回る濃度で存在する請求項55に記載の医薬組成物。
- 前記抗体が約200mg/mlを上回る濃度で存在する請求項55に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が0.1〜99.9%(w/w)の抗体結晶を含有する固体である請求項54又は55に記載の組成物。
- 前記賦形剤が少なくとも1種の生分解性もしくは非生分解性ポリマーキャリヤー及び/又は少なくとも1種の油性もしくは脂質キャリヤーを含む請求項54又は55に記載の組成物。
- 前記ポリマーキャリヤーがポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(酸無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸コポリマーないしPLGA、ポリ(β−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ(オルガノ)ホスファゼン、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、そのブレンド及びコポリマーから構成される群から選択される少なくとも1種のポリマーを含む請求項61に記載の組成物。
- 請求項1から5、20から22及び36から40のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶を含有する注射用液体組成物であって、抗体が約10〜約400mg/mlの範囲の濃度で存在する前記組成物。
- 請求項1から5、20から22及び36から40のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶を含有する結晶スラリー組成物であって、抗体が約100mg/mlを上回る濃度で存在する前記組成物。
- 請求項1から5、20から22及び36から40のいずれか一項に記載の方法により取得可能な有効量の抗体結晶を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
- 有効量の請求項54に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
- 有効量の請求項55に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
- 非経口経路、経口経路又は注射により組成物を投与する請求項66又は67に記載の方法。
- 治療有効量の請求項19及び46から51のいずれか一項に記載の抗体結晶を投与する段階を含む対象におけるhTNFα関連疾患の治療方法。
- 前記hTNFα関連疾患が自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症及び痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎及びネフローゼ症候群;感染症、移植拒絶反応ないし移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再潅流障害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症及び放射線傷害;脊椎関節症、肺障害、冠動脈障害、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、又は血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ(JRA)、C型肝炎ウイルス感染、乾癬、乾癬性関節炎、及び慢性プラーク乾癬、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳損傷、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、薬物反応、脊髄内及び/又は周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、線維症、糸球体腎炎(例えば連鎖球菌感染後糸球体腎炎やIgA腎症)、人工器官の緩み、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、癌及び悪液質、多臓器障害、骨髄異形成症候群、睾丸炎、骨溶解、急性、慢性及び膵膿瘍を含む膵炎、歯周病、多発性筋炎、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心臓病、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復(TAAA)、TNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)、黄熱病ワクチン接種関連症候群、耳関連炎症性疾患、慢性耳炎症、又は小児耳炎症、ぶどう膜炎、座骨神経痛、前立腺炎、子宮内膜症、脈絡膜血管新生、狼瘡、ショーグレン症候群、並びに滲出型黄斑変性症から構成される群から選択される請求項69に記載の方法。
- 前記hTNFα関連疾患が後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、後天性悪性貧血、急性冠症候群、急性及び慢性疼痛、急性特発性多発性神経炎、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、急性肝疾患、急性リウマチ熱、急性横断性脊髄炎、アジソン病、成人(急性)呼吸窮迫症候群、成人スティル病、アルコール性肝硬変、アルコール性肝障害、アレルギー性疾患、アレルギー、脱毛症、円形脱毛症、アルツハイマー病、過敏症、強直性脊椎炎、強直性脊椎炎関連肺疾患、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、関節症、喘息、アテローム性疾患/動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、自己免疫性水疱症、自己免疫性皮膚炎、自己免疫性糖尿病、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群(ALPS)、自己免疫性低血糖症、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性早発卵巣不全、自己免疫性血小板減少症(AITP)、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性ぶどう膜炎、閉塞性細気管支炎、ベーチェット病、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、悪液質、心血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸部脊椎症、クラミジア感染症、胆汁鬱滞、慢性活動性肝炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、慢性虚血、慢性肝疾患、慢性皮膚粘膜カンジダ症、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群(CIS)、分類不能型免疫不全症、分類不能型低ガンマグロブリン血症、結合組織病関連間質性肺疾患、結膜炎、クームス陽性溶血性貧血、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、クローン病、特発性自己免疫性肝炎、特発性線維化性肺胞炎、涙嚢炎、鬱病、強皮症皮膚炎、皮膚筋炎、皮膚筋炎/多発性筋炎関連肺疾患、糖尿病網膜症、糖尿病、拡張型心筋症、円板状エリテマトーデス、椎間板ヘルニア、椎間板脱肛、播種性血管内凝固症、薬物性肝炎、薬物性間質性肺疾患、薬物性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、腸疾患性滑膜炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、女性不妊症、線維症、線維性肺疾患、妊娠性類天疱瘡、巨細胞動脈炎(GCA)、糸球体腎炎、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、移植片対宿主病(GVHD)、グレーブス病、B群連鎖球菌(GBS)感染症、ギラン・バレー症候群(GBS)、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、花粉症、心不全、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、B型肝炎、C型肝炎、ヒューズ症候群、ハンチントン舞踏病、甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、特発性白血球減少症、特発性血小板減少症、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、特異体質性肝疾患、IgE介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染症、感染性眼炎症性疾患、炎症性腸疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、インスリン依存性糖尿病、間質性肺疾患、IPF/UIP、虹彩炎、若年性慢性関節炎、若年性悪性貧血、若年性関節リウマチ、川崎病、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、線状IgA疾患、網状皮斑、ライム関節炎、リンパ球浸潤性肺疾患、黄斑変性症、特発性又はNOS男性不妊症、悪性腫瘍、顕微鏡的腎血管炎、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病関連肺疾患、強直性脊椎炎、運動ニューロン疾患、粘膜類天疱瘡、多発性硬化症(全サブタイプ:一次進行型、二次進行型、再発寛解型等)、多臓器不全、筋痛性脳炎/ロイヤルフリー病、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋炎、ネフローゼ症候群、神経根障害、神経障害、非アルコール性脂肪肝炎、非A非B肝炎、視神経炎、臓器移植拒絶反応、変形性関節症、骨溶解症、卵巣癌、卵巣不全、膵炎、寄生虫症、パーキンソン病、少関節型JRA、類天疱瘡、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患(PAD)、水晶体起因性ぶどう膜炎、静脈炎、結節性多発動脈炎(ないし結節性動脈周囲炎)、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型JRA、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、多腺性内分泌不全症I型及び多腺性内分泌不全症II型、リウマチ性多発筋痛症(PMR)、感染後間質性肺疾患、炎症後間質性肺疾患、ポストポンプ症候群、早発卵巣不全、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、原発性パーキンソン病、原発性硬化性胆管炎、原発性硬化性肝炎、原発性血管炎、前立腺癌及び直腸癌及び造血器悪性腫瘍(白血病及びリンパ腫)、前立腺炎、乾癬、1型乾癬、2型乾癬、乾癬性関節炎、乾癬性関節症、結合組織病続発性肺高血圧、結節性多発動脈炎の肺症状、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、放射線線維症、反応性関節炎、ライター病、再発性視神経脊髄炎、NOS腎疾患、再狭窄、関節リウマチ、関節リウマチ関連間質性肺疾患、リウマチ性心臓病、SAPHO(滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎)、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、胸膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、敗血症症候群、敗血症性関節炎、敗血症性ショック、血清反応陰性関節症、シリコン関連結合組織病、ショーグレン病関連肺疾患、ショーグレン症候群、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、精子自己免疫疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)、スティル病、脳卒中、交感性眼炎、全身免疫応答症候群、全身性エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、全身性硬化症、全身性硬化症関連間質性肺疾患、高安病/動脈炎、側頭動脈炎、Th2型及びTh1型介在性疾患、甲状腺炎、中毒性ショック症候群、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、TRAPS(腫瘍壊死因子受容体)、黒色表皮症を伴うB型インスリン抵抗性、1型アレルギー反応、1型自己免疫性肝炎(古典的自己免疫性ないしルポイド肝炎)、2型自己免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、II型糖尿病、潰瘍性大腸炎性関節症、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹、通常型間質性肺炎(UIP)、ぶどう膜炎、血管炎性びまん性肺疾患、血管炎、春季カタル、ウイルス網膜炎、白斑、フォークト・小柳・原田症候群(VKH症候群)、ウェゲナー肉芽腫症、滲出型黄斑変性症、創傷治癒、並びにエルシニア及びサルモネラ関連関節症から構成される群から選択される請求項69に記載の方法。
- TNFα関連疾患治療用医薬組成物の製造用としての請求項19に記載の抗体結晶の使用。
- hTNF阻害剤の結晶を含有する医薬組成物であって、結晶の生体利用性又は安全性がhTNF阻害剤の液体組成物に比較して低下していない前記組成物。
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