ES2641375T3 - Composición que comprende macroagregados de citoquinas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende citoquinas, en la que al menos el 20% de dichas citoquinas están presentes en macroagregados de citoquinas con un diámetro promedio de al menos 50 nm, y en la que dichos macroagregados de citoquinas están asociados entre sí mediante: - adsorción a un material de depósito, y/o - encapsulación en liposomas.

Description

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Composicion que comprende macroagregados de citoquinas Campo de la invencion

La presente invencion proporciona metodos y composiciones para la estimulacion de respuestas inmunes. En particular, la presente invencion proporciona composiciones (por ejemplo, vacunas) y metodos de uso de las mismas para la induccion de respuestas inmunes (por ejemplo, respuestas inmunes innatas y adaptativas (por ejemplo, para generar la inmunidad del huesped contra el cancer (por ejemplo, un tumor) o contra cualquier tipo de antigeno (por ejemplo, bacteriano, viral, derivado de parasitos)). Las composiciones y metodos de la presente invencion encuentran uso, entre otras cosas, en aplicaciones clmicas (por ejemplo, medicina profilactica, terapeutica y preventiva (por ejemplo, vacunacion)) y de investigacion.

Se refiere particularmente al area de inmunoterapia espedfica activa del cancer ("vacunas contra el cancer"), y proporciona procedimientos de preparacion de vacunas terapeuticas que pueden eliminar celulas cancerosas. Tambien se refiere al area de inmunizacion contra patogenos.

Estas vacunas estan construidas de tal manera que imitan la liberacion e intercambio de citoquinas y otras biomoleculas entre celulas a nivel celular local a medida que ocurren durante la induccion de respuestas inmunes naturales.

Antecedentes de la invencion

La vacunacion es un procedimiento extremadamente complejo, que imita los procedimientos moleculares y celulares que ocurren durante la induccion de respuestas inmunes naturales despues de una lesion e infecciones microbiologicas y que implica dos reacciones estrictamente locales: una a nivel del sitio de inoculacion y otra al nivel del(los) ganglio(s) linfatico(s) drenante(s).

En tales respuestas inmunes naturales, las interacciones entre las celulas del sistema inmune estan reguladas y dirigidas por el intercambio de citoquinas en la red de citoquinas. La mayor parte de nuestro conocimiento sobre las interacciones entre las celulas del sistema inmune y sobre las acciones de las citoquinas en estas interacciones se ha elaborado mediante la experimentacion in vitro. Sobre la base de dichos resultados se acepta generalmente que muchos tipos de celulas del sistema inmune innato y adaptable son secretores "profesionales".

Tienen la maquinaria intracelular para producir, almacenar y liberar una variedad de citoquinas, quimiocinas y otras sustancias secretadas (mediadoras, por ejemplo, serotonina, histamina).

Los resultados de investigaciones recientes (Huse, Morgan, B.F. Lillemeier. M.S. Kuhns, D.S. Chen & M.M. Davis) muestran que las celulas T utilizan dos vfas direccionalmente distintas para la secrecion de citoquinas. 2006 Nature Immunology 7, 247-255; Stanley, C. Amanda and Lacy Paige Pathways for Cytokine secretion. 2010. Reviews. Physiology 25, 218-229) han demostrado que las moleculas de citoquinas se pueden liberar

- ya sea por exocitosis hacia el exterior de las celulas o dirigidas a sinapsis a traves de las cuales las celulas estan en contacto entre sf, por ejemplo, a las sinapsis inmunologicas entre linfocitos T y celulas presentadoras de antfgeno,

- o a traves de vfas multidireccionales (por ejemplo, por liberacion de citoquinas constitutivas por vesfculas portadoras que transportan carga a la membrana plasmatica para liberacion inmediata (en cuestion de minutos de estimulacion) o por degranulacion fragmentaria de pequenas vesfculas secretoras),

- o mediante la secrecion bimodal dirigida (la liberacion de diferentes cargas (= citoquinas) en diferentes direcciones) permite que las celulas se involucren simultaneamente tanto en celulas "publicas" (a todas las celulas cercanas) como "privadas" (a una celula en contacto) "conversacion".

Por consiguiente, las concentraciones de citoquinas en el sitio de lesion o inflamacion seran dependientes;

• en la posicion momentanea de las celulas en relacion entre sf;

• en el estado de activacion/estimulacion de las celulas implicadas;

• en la forma en que se liberan las moleculas de citoquinas (sincronizacion, goteo o rafaga); y

• sobre la movilidad de las moleculas de citoquinas liberadas en el fluido extracelular (velocidad de difusion, gradiente de concentracion, distancia que las moleculas pueden emigrar).

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La farmacologfa actual no ha encontrado todavfa caminos y procedimientos para interactuar e imitar estos procedimientos intercelulares del sistema inmune a nivel celular local. Hasta ahora practicamente todas las interacciones farmaceuticas se basan en aplicaciones sistemicas (i.v., s.c., i.d.). Sin embargo, si las moleculas moleculares del mensajero, tales como citoquinas, se aplican sistematicamente, tienden a inundar el organismo y a hacer realmente las interacciones locales de la celula a la celula imposible. Sin embargo, en circunstancias espedficas, pueden inducir y modificar reacciones inmunes, por ejemplo, en el tratamiento del cancer mediante la activacion de linfocitos que han infiltrado lesiones tumorales o metastasis (TIL: linfocitos infiltrantes en el tumor) y han sido suministrados inertes por las celulas tumorales.

Las celulas del sistema inmune son capaces de producir, almacenar y liberar mas de una unica citoquina. Tambien se puede suponer que cada citoquina se libera para un proposito diferente. De este modo, es bastante improbable que todas las citoquinas se almacenen en las mismas vesfculas y siempre se liberan juntos. Esto tambien se ha demostrado experimentalmente. Los mecanismos de esta maquinaria molecular finamente sintonizada que regula la secrecion de decenas de citoquinas, quimiocinas y otros mediadores de moleculas pequenas (por ejemplo, por mastocitos) no se entiende hoy en dfa, pero debe ser responsable de los procedimientos de liberacion.

Las moleculas de citoquinas se liberan cuando una vesfcula que contiene citoquina se fusiona con la membrana de la celula y se abre hacia el exterior o a traves de una sinapsis en otra celula. Dicho procedimiento no puede resultar en un flujo lento y continuo de moleculas de citoquinas desde la celula hasta su exterior, sino que tiene que ser de tipo rafaga, "disparar" las moleculas de citoquinas hacia el entorno extracelular o a traves de una sinapsis hacia una celula vecina.

En las vesfculas, las moleculas de citoquinas estan densamente empaquetadas. Por consiguiente, cerca del punto de liberacion, cerca de la superficie de las celulas, las concentraciones de citoquinas son extremadamente altas. Pero despues de unos pocos diametros de difusion de celulas se reduciran a las concentraciones requeridas para la union a receptores de citoquinas. Algunas de las moleculas de citoquinas podnan llegar al sistema vascular; la mayona solo se perderan en el espacio extracelular.

En 1996 David R. Kaplan publico una revision (Kaplan, David R. Autocrine secretion and the physiological concentration of cytokines. 1996 Trends. Immunology Today 17, 303-304), en la que ha resumido datos de otros investigadores. Basandose en estos datos, ha hecho la siguiente estimacion:

1. un solo linfocito T activado es capaz de liberar aproximadamente 0.04 pg de IL-2 por hora, correspondiente a aproximadamente 106 moleculas de IL-2.

2. estos 0.04 pg de IL-2 se almacenan en 20-2,000 vesfculas en una densidad extremadamente alta de 1-100 mM (correspondiente a 12-1.200 gramos de IL-2 por litro).

3. despues de la fusion de una vesfcula que contiene citoquina con la membrana de la celula y la apertura de la vesfcula al exterior de las celulas, la concentracion de IL-2 estara en el mismo intervalo de 1-100 mM.

4. esta concentracion es demasiado alta para unirse al receptor de celulas T en la misma membrana de la celula.

5. despues de la difusion durante aproximadamente 100 segundos y en una distancia de pocos diametros celulares del linfocito secretor, la concentracion de IL-2 alcanza el nivel requerido para la union a receptores de citoquina.

Por consiguiente, en una reaccion inmune, cada celula T activada rompena una lluvia de aproximadamente

1.000. 000 de moleculas de IL-2 liberadas entre 20 y 2,000 vesfculas de diferentes tamanos (= entre 500-50,000 moleculas por vesfcula)

Con el fin de imitar dichas reacciones, no es suficiente liberar un goteo de moleculas de IL-2, como es el caso de las celulas tumorales transfectadas con el gen de citoquina, como se han aplicado en vacunas contra el cancer (por ejemplo, Nemunaitis et al. J. Natl. Cancer Inst. (2004) 96:326-331).

Tambien la inyeccion local de varios cientos de microgramos de citoquinas como se hace en el tratamiento sistemico de citoquinas esta muy lejos del procedimiento natural: una inmensa cantidad de trillones (mas de

1.000. 000.000.000) de moleculas de citoquinas no es capaz de imitar el patron de liberacion natural de una celula secretora profesional.

La liberacion local de dicha cantidad tan grande de moleculas de citoquina, que corresponde a la liberacion simultanea de varios millones de linfocitos activados, nunca ocurrira bajo condiciones naturales y causara un caos absoluto en y alrededor del sitio de inoculacion y - despues de alcanzar el sistema vascular - tambien podna causar estragos en lugares lejanos.

La aplicacion directa de IL-2 bajo el nombre comercial de Proleukin (Chiron Corp.) ha sido aprobada por la FDA de los Estados Unidos para el tratamiento de adultos con carcinoma de celulas renales metastasico y melanoma

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metastasico. Ya desde las primeras etapas de la investigacion sobre composiciones farmaceuticas que conteman IL- 2, era evidente que se necesitaban agentes de prevencion de la agregacion para asegurar la solubilidad de IL-2. Por ejemplo, en US4604377, que describe las composiciones farmaceuticas mas tempranas de IL-2, indica que deben estar presentes aproximadamente 100 a aproximadamente 250 |ig de dodecilsulfato de sodio (SDS) para evitar la agregacion de IL-2 y asegurar la solubilidad.

El documento EP1688146, que describe entre otros el procedimiento para obtener la composicion de Proleukin, detalla mas la importancia de la cantidad de SDS en la composicion. Se considera que la cantidad necesaria de SDS es de 95 a 250 |ig por mg de IL-2, concentracion a la que la IL-2 esta presente en microagregados de aproximadamente 25-60 moleculas de IL-2 por agregado. La cantidad preferida de SDS, como tambien esta presente en la formulacion de Proleukin, es 160 |ig de SDS por mg de IL-2, lo que conduce a microagregados de aproximadamente 27 moleculas de IL-2, con un diametro de aproximadamente 12 nm. A medida que la concentracion de SDS cae por debajo de 95 |ig/mg, los tamanos de los agregados aumentan bruscamente, lo que conduce a una peor farmacocinetica in vivo. La tasa de eliminacion en ratas se encontro incluso que era 30 veces mayor para una composicion que contema 25 |ig de SDS por mg de IL-2 en comparacion con la composicion preferida de 160 |ig de SDS por mg de IL-2.

Una interesante variacion de la inyeccion directa de IL-2, tal como la inyeccion de Proleukin, se presenta en el documento US6406689. En dicha patente, la formulacion de IL-2 Proleukin mencionada anteriormente (que comprende SDS en un intervalo de 95 a 250 |ig por mg) se adsorbe a hidroxido de aluminio. A continuacion, se mezcla con celulas tumorales irradiadas y se inyecta en ratones en los que se induce carcinoma renal. Mientras que las tasas de supervivencia cuando mas alta para IL-2 en combinacion con celulas tumorales irradiadas en comparacion con las celulas tumorales irradiadas solo, la tasa de supervivencia aumento aun mas cuando la IL-2 se adsorbe a hidroxido de aluminio.

El inventor de la presente invencion ha encontrado sorprendentemente que la generacion de macroagregados de citoquinas de, por ejemplo, IL-2 y la adsorcion de estos a un material de deposito, tal como hidroxido de aluminio, conduce a composiciones con propiedades farmaceuticas mejoradas. En lugar de la farmacocinetica in vivo peor esperada asociada con estos macroagregados sistematicamente aplicados como se describe en el documento EP1688146, estos macroagregados mejoran realmente el resultado in vivo en comparacion con los microagregados, cuando se adsorben a un material de deposito y se aplican como adyuvantes en vacunas, como se describira a continuacion.

De este modo, ha sido un objeto de la presente invencion proporcionar una composicion mejorada para inducir respuestas inmunes, en particular para el tratamiento de tumores, tal como para la vacunacion contra el cancer.

Ademas de la sorpresa del inventor, dicha composicion que comprende macroagregados de citoquinas adsorbidos en un material de deposito y material antigenico parece imitar de cerca el sistema inmune natural. Como se describira con mas detalle en lo que sigue, se ha descubierto que las moleculas de citoquinas o pequenos agregados se liberan de los macroagregados en rafagas localizadas, similares a la liberacion de vesfculas observada en los eventos secretores de las celulas del sistema inmune. Ademas, dicha formulacion de vacuna se caracteriza por participar en procedimientos inmunoestimulantes no solo localmente en el sitio de inoculacion, sino tambien en el/los nodulo(s) linfatico(s) que drena(n) la zona del sitio de inoculacion. Sin desear estar limitado por la teona, actualmente se supone que el receptor CD25A podna desempenar un papel en este efecto. Las celulas dendnticas CD86+ maduras llevan el receptor de IL-2 CD25A de baja afinidad. Debido a sus propiedades de baja afinidad, el receptor de baja afinidad CD25a en las celulas dendnticas CD86+ se une a los agregados de IL-2 en lugar de a las moleculas de IL-2 aisladas. Esta podna ser la razon por la cual las celulas dendnticas CD86+ llevan tanto los fragmentos antigenicos como los agregados de IL-2 a los ganglios linfaticos.

De este modo, es tambien un objeto de la presente invencion proporcionar el uso de una composicion que comprende tales macroagregados de citoquinas al imitar el sistema inmune natural y estimularlo, no solo en el sitio de inoculacion, sino tambien en el(los) ganglio(s) linfatico(s) drenando la zona del sitio de inoculacion.

Breve descripcion de los dibujos

Con referencia espedfica ahora a las figuras en detalle, se hace hincapie en que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusion ilustrativa de las diferentes realizaciones de la presente invencion solamente, y se presentan en la causa de proporcionar lo que se cree que es la descripcion mas util y facil de los principios y aspectos conceptuales de la invencion. A este respecto, no se intenta mostrar detalles estructurales de la invencion con mas detalle de lo que es necesario para una comprension fundamental de la invencion, la descripcion tomada con los dibujos haciendo evidente para los expertos en la tecnica como se pueden realizar las diversas formas de la invencion en la practica.

Figura 1. Vistas detalladas de la composicion de la invencion que consisten en macroagregados de IL-2 adsorbidos en las partfculas de alumbre

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la. La composicion de la invencion que comprende macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre. La IL-2 se identifica por incubacion con un anticuerpo IgG monoclonal espedfico para la IL-2 humana seguido por incubacion con un anticuerpo IgG anti raton (h&I) de cabra marcado con AlexaFluor 488. Los macroagregados de IL-2 se pueden reconocer en localizaciones como puntos (1) en un gran conglomerado de alumbre. El gran agregado de alumbre que se muestra en esta imagen tiene un tamano de aproximadamente 20 x 60 |im. El tamano de los agregados de IL-2 semejantes a punto sobre la matriz de alumbre se puede estimar entre 50 nm y 6000 nm. Se hicieron observaciones similares para macroagregados de IL-2 adsorbidos en perlas de latex.

lb. La composicion de la invencion. La IL-2 se tino de color verde, el alumbre se tino de rojo. Despues de la conversion a escala de grises como en la figura 1b, IL-2 se muestra en un tono mas claro de gris que el alumbre. La imagen muestra una imagen de microscopfa de barrido por laser de un detalle de una partfcula de alumbre (2) con macroagregados de IL-2 (1) adsorbidos en el mismo. Tambien se pueden observar algunos macroagregados de IL-2 (3) pequenos adsorbidos en la partfcula de alumbre.

Figura 2. Formulacion de vacuna contra el cancer de acuerdo con la presente invencion. Partfculas de alumbre cargadas con macroagregados de IL-2 (2) y celulas tumorales marcadas con Texas Red (1). La IL-2 se identifico por incubacion con un anticuerpo IgG monoclonal espedfico para la IL-2 humana, seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antiraton (h&I) de cabra marcado con AlexaFluor 488.

Los macroagregados de IL-2 se pueden reconocer en localizaciones como puntos (2) sobre un gran conglomerado de alumbre. Las celulas tumorales y los fragmentos de celulas tumorales (1) se identifican mediante la fluorescencia roja de las celulas tumorales marcadas con Texas Red.

Figura 3. Formulacion de vacuna contra el cancer de acuerdo con la presente invencion. Las celulas de melanoma murino B16 irradiadas cargadas con macroagregados de IL-2. La IL-2 unida a celulas se identifico usando un anticuerpo IgG espedfico de IL-2, seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antiraton de cabra marcado con fluorescema.

Figura 4. Composiciones preparadas sin formacion de macroagregados de citoquinas

4a. Partfcula de alumbre con IL-2 preparada usando una solucion reguladora que contiene SDS en lugar de la formulacion de la presente invencion.

4b. Partfcula de alumbre preparada segun el documento US20020176845. Comparada con la partfcula de alumbre mostrada en la figura 1, la IL-2 que se identifica por incubacion con un anticuerpo monoclonal de IgG espedfico para IL-2 humana seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antiraton (h&I) de cabra marcado con AlexaFluor 488, se distribuye homogeneamente sobre la partfcula de alumbre de las figuras 4a y 4b.

Figura 5. Efecto sinergico de GM-CSF macroagregado e IL-4 en la vacunacion terapeutica con RenCa. Grafica de supervivencia para un estudio de vacunacion terapeutica con RenCa con una administracion subcutanea con celulas tumorales irradiadas y diferentes preparaciones de macroagregados de depositos de citoquinas, esto es, GM-CSF murino recombinante (rmuGM-CSF), rmuIL-4 y la combinacion de los mismos.

Figura 6a-f. Fotograffas de cortes de tejido preparadas a partir de los sitios de inoculacion de preparaciones de vacuna aplicadas a ratones. Las fotograffas se convirtieron a escala de grises para esta solicitud de patente, con lo que las visualizaciones rojas y verdes se volvieron grises.

6a Una preparacion de vacuna de control que contiene, como marcador, una pequena dosis de albumina de suero bovino marcada con Texas Red unida a hidroxido de aluminio ("alumbre"). Las macroagregados de citoquinas adsorbidas en alumbre no se adicionaron a la preparacion de la vacuna. Se prepararon cortes de tejido (7 mm) a partir de material congelado por choque extirpado del sitio de inoculacion 11 dfas despues de la vacunacion y se incubaron con anticuerpo monoclonal de rata espedfico para celulas endoteliales murinas (anti-CD31), seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antirata (h&I) de burro marcada con AlexaFluor 488. La tincion fluorescente roja (1) identifica el material inoculado; la tincion fluorescente verde (2) muestra la presencia de capilares en el tejido normal de la piel del raton. No se observan capilares en y alrededor del inoculo.

6b Se inyecto un raton con una composicion de acuerdo con la invencion que contema celulas de tumor murino irradiadas y albumina de suero bovino marcada con Texas Red unida a hidroxido de aluminio y

-10 |ig de macroagregados de IL2 recombinante humana adsorbidos en alumbre

-2 |ig de macroagregados de IL4 murino recombinante adsorbidos en alumbre

-3 |ig de macroagregados de interferon alfa recombinante humano adsorbidos en alumbre

-3 |ig de macroagregados de GM-SCF murino recombinante adsorbidos en alumbre

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Se prepararon cortes de tejidos (7 |im) a partir de material congelado por choque obtenido del sitio de inoculacion 11 dfas despues de la vacunacion y se incubaron con anticuerpo monoclonal de rata espedfico para celulas endoteliales murinas (anti-CD31), seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antirata (h&I) de burro marcada con AlexaFluor 488.

La tincion fluorescente roja (1) identifica el material inoculado, la tincion fluorescente verde (2) muestra el brote de capilares dentro y alrededor del inoculo.

6c La misma composicion que en 6b arriba. Se prepararon cortes de tejido (7 |im) a partir de material de tejido congelado por choque obtenido del sitio de inoculacion 19 dfas despues de la vacunacion y se incubaron con un anticuerpo de rata monoclonal espedfico para fibroblastos reticulares murinos (ER-TR7), seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antirata (h&I) de burro marcada con AlexaFluor 488. La tincion fluorescente roja (1) identifica el material inoculado, la tincion fluorescente verde (2) muestra la capsula formada por fibroblastos alrededor del inoculo.

6d La misma composicion que en 6b-c arriba. Se prepararon cortes de tejido (7 |im) a partir de material de tejido congelado por choque obtenido del sitio de inoculacion 19 dfas despues de la vacunacion y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de rata espedfico para celulas T CD4 murinas (H129.19), seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antirata (h&I) de burro marcada con AlexaFluor 488.

La tincion fluorescente roja (1) identifica el material inoculado, la tincion fluorescente verde (2) muestra celulas T auxiliares CD4 que invaden la capsula y el inoculo.

6e Se inyecto un raton con una composicion de la invencion que comprendfa celulas tumorales irradiadas y macroagregados de IL-2 adsorbidos en partfculas de alumbre. 24 horas despues de la inyeccion, se prepararon cortes de tejido del sitio del inoculo y se tineron (IL-2: verde, celulas tumorales: rojo). La imagen fue convertida a escala de grises e invertida, haciendo que el material manchado fuera de color gris oscuro o negro. El inoculo (1) se muestra en negro debido a la abundante presencia de celulas tumorales e IL-2 de la composicion de la vacuna. Toda la zona que rodea el sitio del inoculo esta rodeada de macroagregados de IL-2, que se muestran como manchas negras, algunas de los cuales estan indicados por las flechas (2). Se puede observar una celula dendntica (3) que une los fragmentos tumorales (4) y los agregados de IL-2 (2).

6f Se prepararon cortes de tejido del ganglio linfatico que drena el sitio del inoculo a partir del raton como se describe en 6e. Los macroagregados de IL-2 transportados al ganglio linfatico se pueden ver en el espacio intercelular (manchas blancas).

Figura 7. A La liberacion in vivo de IL-2 a partir de macroagregados de IL-2 inyectados subcutaneamente adsorbidos en deposito de alumbre y de IL-2 libre inyectada subcutaneamente. La IL-2 libre muestra un pico de liberacion alto de aproximadamente 1.750 ng y cae a cero despues de aproximadamente 6 horas. Los macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre muestran un pico inferior de aproximadamente 250 ng, seguido por una liberacion lenta en el intervalo de 50-100 ng hasta despues de aproximadamente 30 horas. B La liberacion in vitro de IL-2 a partir de macroagregados de IL-2 adsorbidos en el deposito de alumbre, 10 |ig de macroagregados de IL-2 fueron adsorbidos en 10 |ig, 30 |ig y 100 |ig de alumbre, respectivamente. Muestra de nuevo el pico inicial seguido de una liberacion sostenida de aproximadamente 50 ng/24 horas, con un optimo para la carga saturada del alumbre. Como se puede ver en esta figura, la subcarga de la citoquina al deposito (30 |ig y 100 |ig de alumbre) tiene un efecto negativo global sobre la liberacion de IL-2 desde el deposito.

Figura 8. Grafico de supervivencia para un estudio de vacunacion terapeutica con RenCa con una administracion subcutanea con diferentes cargas de macroagregados de IL-2 del deposito de alumbre. El primer numero da la cantidad de alumbre, el segundo la cantidad de citoquina macroagregada. De este modo, parece que para alumbre/IL-2 existe un optimo de 10/10 a 30/10. Si la IL-2 se adsorbe a un exceso de alumbre, como con 100/10, esto tiene un efecto negativo sobre las supervivencias observadas.

Figura 9. Incremento significativo de los tttulos de anticuerpos de HBsAg en ratones vacunados mediante inyeccion de una vacuna comercialmente disponible de Hepatitis B (por ejemplo, Recombivax HB) adicionalmente adyuvada por citoquinas unidas al alumbre (IL-2, GM-CSF). Para esta investigacion, se utilizo la vacuna Recombivax HB comercialmente disponible (40 |ig de HBsAg adsorbida en un compuesto de alumbre en una dosis inyectable de 1.0 ml). Se selecciono 1/40 de la dosis humana como una dosis apropiada para la vacunacion de ratones. Se mezclaron 50 |il de la dosis humana (equivalente a 1.0 |ig de HBsAg) con 50 |il de IL-2 unida al alumbre (10 |ig de rhulL-2 unida a 10 |ig de alumbre) o GM-CSF unido a alumbre (3.0 |ig de rmuGM-CSF unido a 10 |ig de alumbre) y se aplico intramuscularmente al musculo de la pata trasera del raton. Se recogio sangre 15 dfas despues de una sola inyeccion.

Los tftulos de anticuerpos IgG se determinaron en un ELISA con HBsAg recombinante unido a una fase solida (Serum Institute of India).

De la figura se desprende claramente que la adicion de cualquiera de los 2 adyuvantes de citoquina, la IL-2 ("Al10") unida a alumbre y GM-CSF unida a alumbre ("GM3/10"), a la vacuna Recombivax HB da lugar a tftulos de anticuerpos mejorados significativamente. Los tftulos de anticuerpos inducidos por GM-CSF unido al alumbre se encuentran considerablemente mas altos que los tftulos de anticuerpos inducidos por IL-2 unida a alumbre como 5 adyuvante (p = 0.06).

Figura 10. Tftulos de anticuerpos en ratones vacunados por via intraperitoneal antes y despues de un desaffo con HBsAg soluble. Los ratones se vacunaron 3 veces con una vacuna que no inclrna macroagregados de IL-2 (grupo 1) o que comprendfa macroagregados de IL-2 (grupo 2). Despues de completar el curso de vacunacion, los ratones se dejaron sin tratar durante 139 dfas. Entonces se desafiaron con una sola dosis de HBsAg soluble, no adsorbido en 10 alumbre. Tal desaffo con el anffgeno libre despues de un largo tiempo de "descanso" se asemeja a una infeccion. Los tftulos de anticuerpo se determinaron antes y despues del desaffo con HBsAg soluble. El eje Y muestra los tftulos de anticuerpos observados, el eje X presenta los diferentes grupos. 1 bC: Grupo 1 antes del desaffo; 1 aC: Grupo 1 despues del desaffo; 2 bC: grupo 2 antes del desaffo; 2 aC: grupo 2 despues del desaffo. Las diferencias significativas se muestran con asteriscos, el valor mediano se representa con una lrnea. Los animales previamente 15 vacunados con macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre como adyuvante muestran no solo un anticuerpo significativamente mejorado despues de la exposicion, sino que tambien muestran tftulos de anticuerpos mejorados extremadamente significativos cuando se comparan con los tftulos observados en animales vacunados con HBsAg sin el adyuvante de alumbre IL.

Figura 11. Cambios dependientes del tiempo en la distribucion de tamanos de IL2 - aglomeracion determinada por la 20 medicion de la intensidad de la dispersion (t=0, t=1h, t=2h, t=3h, t=4h, t=5h).

Figura 12. Tftulos de anticuerpos 14 dfas despues de la inyeccion secundaria en ratones vacunados con 1.0 |ig de HBsAg adsorbidos en 10 |ig de alumbre mezclado con 10 |ig de rhuIL-2 adsorbidos en 10 |ig de alumbre en ausencia (izquierda) y presencia (derecha) de SDS.

Descripcion de la invencion

25 Una composicion que comprende citoquinas, en la que al menos el 20% de dichas citoquinas estan presentes en macroagregados de citoquinas con un diametro promedio de al menos 50 nm, y en el que dichos macroagregados de citoquinas estan asociados entre sf mediante:

- adsorcion a un material de deposito, y/o

- encapsulacion en liposomas.

30 El termino "agregados" se refiere a una combinacion de moleculas, en particular moleculas de citoquinas que se reunen para formar un cuerpo individual. En una realizacion preferida, los agregados contienen moleculas que interaction de forma no covalente entre si

El termino "macroagregados de citoquinas" o "macroagregados" significa agregados de moleculas de citoquina que son mas grandes que microagregados, que contienen por lo general de 2 a aproximadamente 30 moleculas, que 35 tienen tamanos de diametro de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 nm. Los macroagregados se pueden definir por su diametro. En una realizacion preferida, los macroagregados son agregados que tienen un diametro mayor de 50 nm. En una realizacion adicional, los macroagregados tienen un diametro mayor de 75 nm, mas en particular mayor de 100 nm. Se conocen diferentes tecnicas para el experto en el arte para medir tamanos de diametro de agregados, tales como dispersion dinamica de luz o mediciones de microscopfa de electrones. Los 40 macroagregados tambien se pueden definir por el numero de moleculas de citoquinas contenidas en los mismos. En una realizacion preferida, los macroagregados son agregados que contienen al menos 100 moleculas. En una realizacion adicional, los macroagregados son agregados que contienen al menos 200, 300, 500, 750 o 1000 moleculas. En otra realizacion adicional, los macroagregados son agregados que contienen al menos 104, 105 o 106 moleculas.

45 En el contexto de la invencion, "una cantidad sustancial de dichas citoquinas esta presente en macroagregados de citoquinas" significa que una parte no despreciable de las citoquinas comprendidas por la composicion esta presente en macroagregados. De este modo, parte de las citoquinas puede estar presente en forma de moleculas de citoquina individuales y/o microagregados con tamanos por debajo de 20-50 nm. Por ejemplo, parte de las citoquinas (por ejemplo, IL-2) puede estar presente en microagregados de 9-17 nm, tales como, por ejemplo, encontrada en 50 una solucion ffpica de Proleukin®. En una realizacion particular, al menos 25, 30, 35 o 40% de dichas citoquinas estan presentes en macroagregados de citoquinas. En una realizacion adicional, al menos el 50% de dichas citoquinas estan presentes en macroagregados de citoquinas. En otra realizacion, el diametro promedio de los agregados de citoquinas comprendidos por la composicion es mayor de 50 nm. En otra realizacion particular, el diametro promedio de los agregados de citoquinas asociados entre sf es mayor de 50 nm. En otra realizacion mas, 55 dicho diametro promedio de agregados de citoquinas es al menos 60, 75, 100, 150 o 200 nm.

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Es bien sabido que la mayona de los Bio-Farmaceuticos producidos por tecnologfa recombinante sufren de una tendencia a formar agregados (Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. Int J Pharm. 1999;185:129-188).

Hay varias razones para eso:

1. la mayona de estas protemas farmaceuticamente activas son pequenas y muestran un alto grado de hidrofobicidad

2. debido a la falta de glicosilacion, la hidrofobicidad se incrementa adicionalmente cuando la protema se produce mediante tecnologfa recombinante en E. coli.

La agregacion tambien depende del pH (mas agregados a pH mas alto), de la concentracion, de la temperatura y de la salinidad de la solucion de citoquinas. En el pasado, era comunmente aceptado que la agregacion de los principios activos dentro de estos Bio-Farmaceuticos se debe evitar. Por lo tanto, cuando se usan, estos productos BioFarmaceuticos se disuelven en soluciones reguladoras que comprenden agentes que impiden la agregacion, como el dodecilsulfato de sodio, para evitar la agregacion de moleculas a moleculas con la formacion de grandes agregados. Tal como se describe por ejemplo en el documento EP 1 688 146 A1, en el que se requiere una cantidad minima de SDS como agente de prevencion de la agregacion para obtener microagregados de IL-2 con las caractensticas terapeuticas deseadas.

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que las composiciones que comprenden citoquinas unidas a depositos en estados macroagregados tan grandes son mas eficaces que cuando estan en estado microagregado en la generacion de una inmunoterapia espedfica activa para canceres.

Dentro de una realizacion tfpica de la presente solicitud, las citoquinas estan presentes como agregados de diversas masas moleculares. Tales agregados se pueden obtener en ausencia de agentes de prevencion de la agregacion, o en presencia de un agente de prevencion de la agregacion en una cantidad suficientemente baja para permitir la formacion de macroagregados de citoquinas. Se apreciara por el experto en el arte que los macroagregados de citoquinas en una composicion de la invencion se pueden formar de varias maneras. Se pueden formar agregados de citoquinas antes de mezclar las citoquinas (macroagregados) con los otros componentes de la composicion, o citoquinas (no agregadas o microagregadas) se pueden mezclar directamente con otros componentes en condiciones que permitan o estimulen la formacion de macroagregados de citoquinas.

En una realizacion particular, la composicion de la invencion comprende un tipo de citoquina, seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, e IFN-alfa. En una realizacion adicional preferida, la composicion de la invencion comprende macroagregados de IL-2.

En otra realizacion particular, la composicion de la invencion comprende diferentes citoquinas en forma de macroagregados. Particularmente citoquinas independientemente seleccionadas del grupo que consiste en IL-2, IL- 4, IL-12, GM-CSF, e IFN-alfa. En una realizacion adicional preferida, al menos una citoquina es IL-2. En otra realizacion preferida, la composicion de la invencion comprende IL-2 y una o mas citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en IL-4, Il-12, GM-CSF e IFN-alfa; en particular IL-4 o GM-CSF; mas en particular GM-CSF. Dicha composicion que comprende macroagregados de diferentes citoquinas se puede obtener de varias maneras. Como ejemplo, se pueden preparar macroagregados de una primera citoquina y se pueden preparar macroagregados de una segunda citoquina y estos se pueden mezclar antes de asociarlos unos con otros adsorbiendolos en un material de deposito y/o encapsularlos en liposomas. Otra opcion ejemplar es generar macroagregados directamente a partir de una solucion que contiene varios tipos de citoquinas, generando asf macroagregados que contienen citoquinas diferentes y usando estos macroagregados para asociarlos entre sf. Un tercer ejemplo es preparar macroagregados de una primera citoquina y asociarlos entre sf; preparar macroagregados de una segunda citoquina y asociarlos entre sf; y posteriormente mezclar los macroagregados asociados. Cuando se utiliza la adsorcion en un deposito como medio para asociar macroagregados, esta ultima opcion permite generar materiales de deposito con la densidad mas alta posible de una citoquina particular. Por ejemplo, una partfcula de alumbre puede estar cubierta por macroagregados de IL-2, mientras que una segunda partfcula de alumbre puede estar cubierta por macroagregados de IL-4.

Puesto que uno de los objetivos de la presente invencion es proporcionar que las presentes composiciones y sus componentes, en particular como formulacion de vacuna, participaran tanto en los procedimientos locales en el sitio del sitio de inoculacion como en los ganglios linfaticos donde se induce el procedimiento inmune espedfico real, es deseable combinar diferentes citoquinas en forma de macroagregados en la composicion. Usando diferentes citoquinas, es posible estimular varias armas del sistema inmune, por ejemplo, IL-2 estimula las celulas T y aumenta la actividad de las celulas NK; GM-CSF & IL-4 esta involucrado en el reclutamiento y maduracion de celulas dendnticas; GM-CSF ademas induce la vascularizacion del inoculo; IL-12 activa celulas dendnticas y otras inmunes; y el IFN-alfa recluta y activa las celulas NK.

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De este modo, en una realizacion particular de la presente invencion, una o una pluralidad de citoquinas diferentes esta presente como macroagregados dentro de la composicion; y en particular cada citoquina se selecciona independientemente del grupo que consiste en IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF e IFN-alfa.

Como sera evidente para el experto en el arte, las citoquinas mencionadas anteriormente se proporcionan solamente como ejemplos posibles y no tienen intencion de restringir los macroagregados de citoquinas usados en las composiciones de la presente invencion. Dichas citoquinas han sido seleccionadas sobre la base del conocimiento actualmente disponible sobre la accion de la citoquina, pero tambien sobre la base de la disponibilidad ffsica de estas citoquinas en calidad farmaceutica. En el futuro, otras citoquinas pueden estar disponibles y anadirse a las composiciones de la presente invencion de acuerdo con su actividad descrita.

En principio, dicha combinacion de diferentes macroagregados de citoquinas adsorbidos en el deposito se puede conseguir mezclando los macroagregados de citoquinas/citoquinas antes de asociarlos entre sf, pero en una realizacion preferida las diferentes macroagregados de citoquinas/citoquinas se adsorben por separado al material de deposito y se mezclan posteriormente.

Como se ha descrito anteriormente, en la composicion de la presente invencion, los macroagregados de citoquinas estan asociados entre sf por adsorcion a un material de deposito y/o encapsulacion en liposomas. De este modo, en una realizacion particular, la composicion de la presente invencion comprende macroagregados de citoquinas que estan asociados entre sf por adsorcion a un material de deposito. En otra realizacion particular, los macroagregados de citoquinas estan asociados entre sf por encapsulacion en liposomas. En una realizacion adicional, parte de los macroagregados de citoquinas estan asociados entre sf por adsorcion a un material de deposito y parte de los macroagregados de citoquinas estan asociados entre sf por encapsulacion en liposomas y a continuacion, se mezclan los macroagregados de citoquinas adsorbidos y los encapsulados en liposomas.

En las composiciones de la presente invencion, los macroagregados de citoquinas unidos a depositos estan unidos no covalentemente al material de deposito o unidos covalentemente a ellos usando procedimientos conocidos en la tecnica. El termino "adsorbido", como se utiliza en la presente solicitud, abarca de este modo cualquier tipo de adsorcion, esto es, la adsorcion puede ser una fisisorcion o quimisorcion causada por atraccion electrostatica, fuerzas de van der Waals y/o union covalente.

En cualquier caso, cuando se une covalentemente al material de deposito, la union covalente debe ser reversible de tal manera que las citoquinas puedan ser liberadas del material de deposito. El experto en el arte sabe muy bien como unir de forma covalente y reversible macroagregados de citoquinas a un material de deposito. Por ejemplo, se pueden usar enlaces que se pueden degradar por enzimas (naturales) o por degradacion qmmica. Por ejemplo, se puede usar un puente disulfuro como enlazante, que se escinde por medio de reductasas en el organismo vivo; o enlazantes esteres que se pueden degradar por esterasas.

En principio, se puede usar cualquier material de deposito usado por lo general en la fabricacion de composiciones de vacuna y capaz de unirse a los macroagregados de citoquinas. En una realizacion, y dado el hecho de que los macroagregados de citoquinas son capaces de unirse directamente a las celulas irradiadas, el material de deposito consiste en las celulas tumorales irradiadas. Por consiguiente, y en una realizacion particular de la presente invencion, el material de deposito se selecciona del grupo que consiste en hidroxido de aluminio, fosfato de calcio, perlas de latex, microesferas o nanopartfculas basadas en acido polilactico y celulas tumorales irradiadas (incluyendo celulas tumorales autologas irradiadas, celulas tumorales alogenicas irradiadas y celulas tumorales xenogenicas irradiadas). En otra realizacion particular, el material de deposito se selecciona del grupo que consiste en hidroxido de aluminio, fosfato de calcio, perlas de latex y microesferas o nanopartfculas basadas en acido polilactico; en particular el material de deposito es el hidroxido de aluminio. En otra realizacion particular, el material de deposito es perlas de latex o carbon medicinal.

Como se ha descrito en este documento anteriormente, en otra realizacion las composiciones de acuerdo con la presente invencion se caracterizan ademas porque las citoquinas y/o los agregados de citoquinas estan asociados entre sf por encapsulacion en liposomas. En una realizacion preferida se utilizan liposomas de DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina), pero tambien se pueden usar otros componentes (por ejemplo, fosfolfpidos) para la preparacion de liposomas.

Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la tecnica para preparar liposomas (por ejemplo, DMPC); por ejemplo, es posible un procedimiento sencillo en el que las citoquinas no se tratan bajo condiciones de estres. En dicho procedimiento se adiciona simplemente DMPC cristalizado/liofilizado a una solucion concentrada de citoquina que contiene una cantidad sustancial de macroagregados de citoquinas y se mezcla, se congela y se descongela en varios ciclos. El resultado son liposomas pequenos que han encapsulado los macroagregados de citoquinas.

El procedimiento ejemplar:

Se adicionan 300 mg de DMPC liofilizado (esterilizado por irradiacion) a una suspension de 1.0 mg de macroagregados de citoquina/citoquina en 1.0 ml de solucion reguladora.

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La mezcla se agita en vortex durante 1 min. y se somete a ultrasonidos en un bano de ultrasonidos durante 1 min.

A continuacion, la suspension se congela durante 5 minutos en un bano de hielo seco en etanol y se descongela en un bano de agua a 37°C.

Este procedimiento se repite 3 veces.

En la suspension obtenida, la mayona de los macroagregados de citoquinas en el material de partida se encapsulan en los liposomas generados, parte de la misma esta todavfa libre en la suspension.

Se aplican almuotas de toda la suspension obtenida de este modo, y que contienen la cantidad deseada de macroagregados de citoquinas en la composicion de la invencion.

En una realizacion preferida, la composicion de la invencion comprende ademas material antigenico. De acuerdo con lo anterior, tambien dentro de la presente invencion se proporciona el uso de macroagregados de citoquinas unidos a depositos, que opcionalmente incluyen moleculas de citoquinas libres o microagregados de citoquinas, en una composicion con material antigenico. En una realizacion particular, dicho material antigenico es un material antigenico microbiano o asociado a un tumor. En una realizacion mas particular, dicho material antigenico es material antigenico asociado a microbios. Los antfgenos microbianos son antfgenos de un microorganismo e incluyen, pero no se limitan a, antfgenos virales, bacterianos, parasitarios y fungicos. Los antfgenos microbianos pueden ser microorganismos intactos, y los aislados naturales, fragmentos o derivados de los mismos, compuestos sinteticos que son identicos o similares a antfgenos microbianos de origen natural y, preferiblemente, inducen una respuesta inmune espedfica para el microorganismo correspondiente (de la cual el antfgeno microbiano de origen natural originado). En una realizacion, el antfgeno es un antfgeno viral. En otra realizacion, el antfgeno es un antfgeno bacteriano. En otra realizacion particular, el antfgeno es un antfgeno parasitario. En otra realizacion mas, el antfgeno es un antfgeno patogenico. En otras realizaciones particulares, el antfgeno patogeno es un antfgeno sintetico o recombinante.

En otra realizacion particular, el material antigenico es material antigenico tumoral, tal como material seleccionado del grupo que consiste en celulas tumorales autologas irradiadas, celulas tumorales alogenicas irradiadas, celulas tumorales xenogenicas irradiadas, homogenados de celulas tumorales, extractos de celulas tumorales, antfgenos tumorales individuales (naturales o recombinantes), mezclas de antfgenos tumorales (naturales o recombinantes), peptidos de antfgenos tumorales (naturales o recombinantes). En una realizacion preferida, los antfgenos solubles en agua, especialmente los antfgenos no particulados, se hacen partfculas uniendolos a un material de deposito.

En cualquier caso, en la fabricacion de una composicion de acuerdo con la presente invencion, en la que los macroagregados de citoquinas se adsorben a un material de deposito, los macroagregados de citoquinas se aplican al material de deposito en la densidad mas alta posible (|ig de citoquina por |ig de material de deposito). Bajo dichas circunstancias, la citoquina se libera del deposito con niveles de liberacion que estan en el mismo intervalo que los observados en ensayos clmicos con celulas (tumor) transfectadas con el gen de citoquina. Sin embargo, en contraste con la liberacion estatica de citoquinas observada en los ensayos clmicos con celulas transfectadas con el gen de citoquina, la liberacion de citoquinas de los macroagregados de citoquinas asociados por adsorcion a un deposito es dinamica, con una explosion de liberacion elevada dentro de las primeras horas y una liberacion a largo plazo de bajo nivel (vease la figura 7A). Como es evidente a partir de la figura 7B, la subcarga del deposito tiene un efecto negativo sobre los niveles de liberacion y patron de liberacion y supervivencia (vease el grafico de supervivencia de Kaplan Meyer - Figura 8).

En una realizacion particular de las composiciones como se describe en este documento, el deposito es hidroxido de aluminio (alumbre) y la proporcion en peso de alumbre a citoquina (tambien llamada densidad) esta entre 1:10 y 30:1; mas en particular entre 1:1 y 3:1; aun mas en particular 1:1.

Se menciona una composicion preferida de acuerdo con la presente invencion, en la que 1-30 |ig de IL-2 recombinante (Proleukin), 1-30 |ig de GM-CSF recombinante, 1-30 |ig de IL-4 recombinante, 1-30 |ig de IL-12 recombinante o 1-30 |ig del IFNalfa recombinante se adsorben en una proporcion entre 10:1 y 1:10 de citoquina en alumbre.

Una composicion mas particular de la presente invencion es dicha composicion, en la que 10 |ig de IL-2 recombinante (Proleukin), 10 |ig de GM-CSF recombinante, 10 |ig de IL-4 recombinante, 3 |ig de IL-12 recombinante, o 10 |ig de IFNalfa recombinante se adsorben cada una en una proporcion de 1:1 de citoquina en hidroxido de aluminio.

Como sera evidente a partir de la parte experimental en lo que sigue, las composiciones de la presente invencion son particularmente utiles para la estimulacion de respuestas inmunes, tales como por ejemplo en la generacion de inmunidad del huesped contra el cancer (por ejemplo, un tumor) o un patogeno (por ejemplo, bacterias infecciosas o virus o subunidades (antfgenos) de ellos). De acuerdo con lo anterior, es una realizacion de la presente invencion

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proporcionar una composicion como la descrita en este documento antes para su uso como medicamento; en particular para uso como medicina humana o veterinaria. En otra realizacion, la presente invencion proporciona composiciones para uso como vacuna. En una realizacion particular, la presente invencion proporciona composiciones para uso como vacuna microbiana. En otra realizacion particular, la presente invencion proporciona composiciones para su uso como una vacuna contra el cancer.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona una composicion para uso en el tratamiento de una enfermedad en un mairnfero, en particular para uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o cancer. En una realizacion adicional, la presente invencion proporciona una composicion para uso en el tratamiento de cancer; en particular un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer renal, hepatico, de pulmon, de ovario, de prostata, del pancreas, estomago, de cabeza y cuello, carcinoma testicular, fibrosarcoma, melanoma, glioblastoma, linfomas, leucemias y mielomas. En una realizacion adicional, la invencion proporciona una composicion para uso en el tratamiento y/o prevencion de un cancer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma renal, carcinoma pancreatico, carcinoma de colon, carcinoma de prostata y melanoma; en particular carcinoma renal y pancreatico y melanoma. En otra realizacion, la invencion proporciona una composicion para uso en el tratamiento y/o prevencion de carcinoma renal y melanoma. En una realizacion particular, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento y/o prevencion de una enfermedad, tal como una enfermedad infecciosa o cancer, comprendiendo dicho metodo administrar una composicion de la invencion a un sujeto que lo necesite.

Se refiere particularmente al area de inmunoterapia espedfica activa del cancer ("vacunas contra el cancer"), y proporciona el uso de las composiciones como se describe en este documento, en la preparacion de vacunas terapeuticas que pueden eliminar las celulas cancerosas. En comparacion con y diferentes de las formulaciones depot de citoquinas conocidas en la tecnica, las formulaciones depot de macroagregados de citoquinas de la presente invencion extienden la reaccion inmune mas alla de las reacciones locales en el sitio de inoculacion e incluso mejoran la induccion de reacciones inmunes espedficas de tumores a nivel de los ganglios linfaticos.

En otra realizacion particular, la presente invencion proporciona una composicion para el tratamiento y/o prevencion de una enfermedad infecciosa, tal como una enfermedad causada por patogenos infecciosos (microbianos), incluyendo bacterias, virus, parasitos y hongos. En algunas realizaciones, el tratamiento como se usa en este documento con referencia a patogenos infecciosos se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto a la infeccion con un patogeno o disminuye la probabilidad de que el sujeto se infecte con el patogeno; y/o tratamiento despues de que el sujeto se ha infectado con el fin de combatir la infeccion, por ejemplo, reducir o eliminar la infeccion o evitar que empeore. En una realizacion particular, el metodo es un tratamiento profilactico.

Bajo la influencia de las formulaciones depot de macroagregados de citoquinas de la presente invencion, los autores de la presente invencion han encontrado que las celulas precursoras dendnticas se diferencian en celulas dendnticas maduras in situ, esto es en el sitio de inoculacion. Esto en sf ya es una mejora significativa cuando se compara con la maduracion de celulas dendnticas in vitro complicada como se aplica actualmente en las vacunas basadas en celulas dendnticas, pero ademas de la maduracion in situ de celulas precursoras dendnticas, las formulaciones depot macroagregados de citoquinas de la presente invencion tambien potencian las reacciones inmunes antigenicas a nivel de los ganglios linfaticos. Hasta tal punto, las celulas dendnticas se unen y/o absorben, ademas de fragmentos antigenicos, agregados de citoquinas, adsorbidos o no todavfa en partfculas de alumbre, en el sitio de inoculacion y los llevan a los ganglios linfaticos que drenan dicho sitio de inoculacion. En los ganglios linfaticos se presentan fragmentos de antfgeno (por ejemplo, de una celula tumoral, una bacteria o un virus) a celulas T y celulas NK en el ganglio linfatico, activando de este modo las celulas anteriores en celulas T citotoxicas y espedficas de antfgeno y celulas NK. La presencia de partfculas cargadas de citoquina en los ganglios linfaticos interactua con estos procedimientos y refuerza ademas la presentacion del antfgeno y la estimulacion celular.

La importacion de agregados de citoquinas en el entorno de ganglios linfaticos altamente organizados es una posibilidad hasta ahora desconocida para manipular las reacciones inmunes en el nivel de los ganglios linfaticos.

Se pueden observar otros efectos de las formulaciones depot de macroagregados de citoquinas de la presente invencion en el sitio del inoculo. De nuevo en comparacion con y diferentes de las formulaciones depot conocidas en la tecnica, el inoculo basado en las formulaciones depot con macroagregados de citoquinas unidos a depositos de la presente invencion se convierte en un nodulo vascularizado, preservando el material antigenico (por ejemplo, celulas tumorales irradiadas) y el material de deposito de citoquina. Como tal, este nodulo vascularizado aparece en las celulas T, que han sido activadas espedficamente en los ganglios linfaticos, como un tumor artificial o sitio de infeccion y permite la reestimulacion de las celulas T activadas por las citoquinas restantes y el material antigenico original. Este procedimiento de contacto renovado con los antfgenos de vacuna mejora adicionalmente la estimulacion de las respuestas inmunes mediante las formulaciones depot de citoquinas de la presente invencion.

Ademas, se ha observado que las composiciones de vacuna de la presente invencion proporcionan una respuesta inmunogenica mas rapida y mas alta que las composiciones comparables que carecen de macroagregados de citoquinas. Por lo tanto, las composiciones de la presente invencion permiten una inmunizacion mas rapida y permiten la inmunizacion de sujetos que de otro modo no respondieran.

Es un objeto adicional proporcionar un procedimiento de preparacion de la composicion de la invencion, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una solucion acuosa que comprende una citoquina; en el que dicha solucion acuosa no contiene agente de prevencion de la agregacion o un agente de prevencion de la agregacion en una cantidad suficientemente

5 baja para permitir la formacion de macroagregados de citoquinas con un diametro mayor de 50 nm;

b) incubar dicha solucion acuosa durante un tiempo suficiente para agregar al menos el 20% de dichas citoquinas en macroagregados de citoquinas con un diametro mayor de 50 nm;

c) asociar dichos macroagregados de citoquinas mediante

- mezcla de dicha solucion acuosa con el material de deposito, para adsorber dichos agregados de citoquinas al 10 material de deposito; y/o

- encapsulacion de dichos agregados de citoquinas en los liposomas.

Dada la importancia de obtener macroagregados de citoquinas, se prefiere proporcionar una solucion acuosa que comprende una citoquina, en la que dicha solucion no contiene un agente de prevencion de la agregacion, o un agente de prevencion de la agregacion en una cantidad suficientemente baja para permitir la formacion de 15 macroagregados de citoquinas. Por ejemplo, II-2 se distribuye a menudo en presencia de SDS como un agente de prevencion de la agregacion, ya que se ha encontrado que, para aplicaciones de la tecnica anterior, cuando SDS esta presente en una cantidad mayor o igual a 95 |ig de SDS por mg de citoquina, se evita la formacion de macroagregados (vease, por ejemplo, EP1688146). Cuando se prepara la composicion de la invencion, tales macroagregados son exactamente requeridos; por lo tanto, cuando se parte de dicha solucion que contiene SDS, la 20 solucion se puede diluir de manera que contenga menos de 95 |ig de SDS por mg de citoquina. En una realizacion particular, la dilucion se realiza en solucion salina reguladora con fosfato (PBS).

Los inventores han encontrado que la formacion de agregados tiende a ser un procedimiento dependiente del tiempo, esto es, cuando se permite la formacion de agregados, los agregados tienden a crecer con el tiempo. Los macroagregados se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento. Por ejemplo, 25 diluyendo una solucion de citoquina que contiene SDS con PBS, de modo que la concentracion de SDS se reduce por debajo de 95 |ig por mg de citoquina, a cuya concentracion se forman macromoleculas con relativa rapidez. Sin embargo, tambien se pueden formar macroagregados a concentraciones aun mas bajas de SDS, o la ausencia completa de agentes que previenen la agregacion, reduciendo asf el tiempo en el que se obtienen macroagregados. Viceversa, los agentes de prevencion de la agregacion se pueden presentar en cantidades ligeramente mayores, lo 30 que requiere tiempos de incubacion mas largos para la formacion de macroagregados, pero todavfa permiten la formacion de macroagregados para obtener una composicion de la invencion.

Cuando la composicion de la invencion comprende material antigenico, como se ha descrito anteriormente, el procedimiento anterior puede comprender ademas la etapa

d) poner en contacto dicha solucion que comprende macroagregados de citoquinas asociados con material

35 antigenico.

Ejemplos

Ejemplo 1

Union de IL-2 a alumbre usando IL-2 diluida en PBS

Se uso IL-2 humana recombinante (rhulL-2, Proleukin/Roche) para este experimento. 1.1 mg de la protema 40 recombinante liofilizada de se disolvieron en 1.1 ml de agua pura. 180 |ig de SDS estan presentes como un agente de prevencion de la agregacion en el producto Proleukin, de este modo, la solucion contiene aprox. 164 |ig por mg de IL-2. A esta concentracion, la IL-2 esta predominantemente presente en microagregados de aprox. 9-17 nm.

La vacuna se preparo para la vacunacion de 8 animales, recibiendo cada uno 0.2 ml con un exceso de aproximadamente 20%.

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Se uso Rehydragel HPA, gel fluido (Reheis Inc. Berkeley heights NJ).

Concentracion: 2.0% (= 20 g/l) de oxido de aluminio.

Preparacion de los componentes de la vacuna:

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1. se prepararon 500 |il de suspension de alumbre, conteniendo 100 |ig de alumbre a partir del stock de gel fluido Rehydragel por dilucion con solucion reguladora de PBS.

2. Se prepararon 500 |il de solucion de macroagregados de IL-2 diluyendo 100 ul de la solucion de rhulL-2 con 400 |il de solucion reguladora de PBS. Por consiguiente, la concentracion de SDS se reduce a aproximadamente 33 |ig por mg de IL-2, permitiendo asf la formacion de macroagregados como se demuestra ademas en el experimento de distribucion de tamanos mostrado en la figura 11.

Preparacion de los macroagregados de citoquinas adsorbidos en alumbre

Con el fin de mezclar los dos componentes muy rapidamente, se mezclaron ambas soluciones pipeteandolas simultaneamente muy rapidamente en un tubo, que al mismo tiempo se agito vigorosamente en un vortex. La mezcla se incuba adicionalmente durante 1 h en un rodillo a temperatura ambiente.

El resultado es una suspension de macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre a una concentracion de 10 |ig de IL-2 adsorbida a 10 mg de alumbre en 1.0 ml.

En la figura 1a-d, se muestran los macroagregados de alumbre cargados con IL-2. La IL-2 se identifica por incubacion con un anticuerpo IgG monoclonal espedfico para la IL-2 humana seguido por incubacion con un anticuerpo IgG antiraton (h&I) de cabra marcado con AlexaFluor 488.

Los macroagregados de IL-2 se pueden reconocer en localizaciones como puntos sobre un gran conglomerado de alumbre (Figuras 1a y 1b). La partfcula de alumbre grande mostrada en la figura 1 tiene un tamano de aproximadamente 20 x 60 |im. El tamano de los macroagregados de IL-2 como puntos sobre la matriz de alumbre se puede estimar entre 50 nm y 6000 nm. Los macroagregados de IL-2 de aproximadamente 100 nm de tamano contienen aproximadamente 106 moleculas de IL-2, y estos agregados pesan aproximadamente 10 femtogramos. Se estima que los macroagregados de IL-2 mas grandes de la figura 1a contienen aproximadamente 109 moleculas de IL-2 y pesan aproximadamente 10 picogramos. Dado que las diferentes citoquinas son de tamanos moleculares similares, este calculo se refiere tambien a ellas.

Preparacion de una vacuna que comprende material antigenico tumoral

Las celulas de carcinoma renal murino RenCa irradiadas se marcan con Texas Red N-Hidroxisuccinimida ester.

Las celulas tumorales irradiadas marcadas con Texas Red se suspenden en PBS en una densidad de 10 x 106 celulas por ml.

Se mezclaron poco antes de la aplicacion 1.0 ml de los macroagregados de IL-2 adsorbidos en suspension de alumbre y 1.0 ml de la suspension de celulas.

Cada raton recibe una inyeccion de 200 |il que contiene:

-106 celulas tumorales irradiadas

-10 |ig de IL-2 adsorbida en

-10 |ig de alumbre

Cuando las celulas tumorales (tenidas con Texas Red) se adicionan a los macroagregados de IL-2 en alumbre, adicionalmente se agregan con los conglomerados de alumbre cargados con IL-2, como se ve en la figura 2. La IL-2 se identifica por incubacion con un anticuerpo IgG monoclonal espedfico para la IL-2 humana, seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antiraton (h&I) de cabra marcado con AlexaFluor 488. Los macroagregados de IL- 2 se pueden reconocer en localizaciones como puntos (2) sobre un gran conglomerado de alumbre. En la figura 2 se muestra una partfcula de alumbre tfpica con agregados de citoquinas unidos en combinacion con material antigenico. El tamano de la partfcula de alumbre ("conglomerado") es de aproximadamente 20 x 80 |im. La dosis completa de vacuna "lista para inyeccion" esta compuesta por un millon o mas de tales partfculas de alumbre recubiertas de macroagregado de diferentes tamanos (que contienen un total de 10 |ig de IL-2 unidos a 10 |ig de alumbre y 10 x 106 celulas tumorales).

Las celulas tumorales y los fragmentos de celulas tumorales (1) se identifican mediante la fluorescencia roja de las celulas tumorales marcadas con Texas Red. La conversion a escala de grises los vuelve grises.

Ejemplo 2

Union de IL-2 al alumbre usando IL-2 diluida en la solucion reguladora que contiene SDS original.

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Pero para la solucion reguladora utilizada, el procedimiento es exactamente el mismo que el descrito para el ejemplo 1 anterior. En lugar de PBS se utiliza una solucion reguladora que contiene todos los ingredientes, entre ellos sDs, ya que estan contenidos en el liofilizado original en el que rhuIL-2 (Proleukin) es proporcionado por Novartis.

Las etapas adicionales en la fabricacion de la IL-2 adsorbida en alumbre y la vacuna completa que contiene celulas tumorales de RenCa irradiadas fueron las mismas que se describieron en el procedimiento para el ejemplo 1.

En contraste con el patron de tincion de fluorescencia inmune obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1, el patron obtenido usando la solucion reguladora que contiene SDS es completamente diferente: la rhulL-2 unido al aluminio esta distribuido uniformemente/homogeneamente sobre las partfculas de alumbre, mostrando solamente ligeras agregaciones en alguna localizacion (vease la figura 4a). Como se describe en la informacion de prescripcion de Proleukin, la IL-2 tratada mediante este procedimiento (180 |ig de SDS por mg de IL- 2) esta presente en forma de microagregados solubles de aproximadamente 27 moleculas de IL-2 por agregados. Tales pequenos microagregados, que corresponden a una masa molecular de aprox. 500 kDa, no pueden ser identificados como agregados aislados, tal como se muestra en la figura 2, pero muestran la presente distribucion de tincion homogenea en su lugar.

Se obtuvo la misma composicion cuando se preparo una IL-2 adsorbida en un material de deposito siguiendo las instrucciones del documento US2002176845 (vease la figura 4b). La figura 4b muestra que las composiciones generadas usando los procedimientos del documento US2002176845 no contienen agregados con un diametro mayor de 50 nm.

Ejemplo 3

Comparacion de formulaciones de la tecnica anterior y una composicion de la invencion Los dos tipos de vacunas se aplicaron en experimentos de supervivencia terapeutica.

En estos experimentos terapeuticos, los animales se trataron con una dosis letal de 105 celulas tumorales RenCa vitales.

4 dfas mas tarde se vacunaron los animales con vacunas que conteman 106 celulas tumorales RenCa irradiadas y 10 |ig de IL-2 adsorbida a 10 |ig de alumina

- ya sea en PBS (Ejemplo 1)

- o en una solucion reguladora que contiene SDS (Ejemplo 2).

Cuando se trataron con vacunas que conteman la IL-2 en forma de macroagregados adsorbidos en alumbre (Ejemplo 1), mas animales sobrevivieron que en el grupo en el que los animales fueron tratados con vacunas que conteman IL-2 en forma monomerica o de microagregados (Ejemplo 2).

Observaciones similares se hicieron en experimentos en los que se usaron otras citoquinas.

Ejemplo 4

Uso de celulas tumorales irradiadas como un material de deposito

En estos experimentos se incubaron 10 x 106 celulas de melanoma murino B16 con 100 |ig de rhulL-2 (Proleukin) en forma de macroagregados, producida por dilucion en PBS.

Despues de la incubacion, se centrifugaron las celulas y se ensayo el sobrenadante para determinar la presencia de IL-2 no unida mediante ELISA y mediante un ensayo biologico aplicando celulas CTLL-2 como indicadores de IL-2. 86% de la IL-2 adicionada se unio a las celulas tumorales.

En una serie de experimentos, otras celulas tumorales irradiadas:

- carcinoma renal murino RenCa,

- carcinoma de colon murino C26 Dunning,

- carcinoma de prostata de rata,

- celulas de carcinoma renal humano FA 144 aisladas del carcinoma renal de un paciente,

- celulas de carcinoma renal humano FA 152 aisladas del carcinoma renal de un paciente.

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tambien fueron "cargadas" con macroagregados de IL-2.

La tasa promedio de carga fue del 85%.

Esto indica que las celulas tumorales irradiadas se unen de forma no espedfica a macroagregados de IL-2, y se pueden usar como un material de deposito en las formulaciones de la presente invencion.

Despues de la carga, las celulas cargadas con macroagregados de IL-2 se lavaron y la IL-2 unida a las celulas se identifico usando un anticuerpo IgG espedfico de IL-2, seguido de incubacion con un anticuerpo IgG antiraton de cabra marcado con fluorescema.

En la figura 3 se muestra un ejemplo de celula de melanoma murino B16 cargada con macroagregados de IL-2. Como se puede ver claramente, la tincion no es homogenea sino irregular, lo que indica que los macroagregados de IL-2 se han unido a la superficie celular, cuando se utiliza PBS libre SDS para la formacion y carga de macroagregados.

Suponiendo un diametro de celula de 10 |im, el tamano de los agregados de IL-2 adsorbidos se puede estimar como que esta en el intervalo de 50-100 nm.

Tales celulas cargadas con macroagregados de IL-2 se han usado en experimentos de vacunacion terapeutica, en los que los ratones se vacunaron con 106 celulas de carcinoma renal RenCa cargadas con macroagregados de IL-2 irradiadas.

En estos experimentos la tasa de supervivencia mas alta se obtuvo cuando los ratones fueron vacunados con 106 celulas tumorales irradiadas cargadas con 30 |ig de IL-2, de las cuales una cantidad sustancial esta presente en forma de macroagregados.

Se obtuvieron observaciones similares con las otras celulas tumorales indicadas anteriormente. Por consiguiente, en una realizacion particular de acuerdo con la presente invencion, el material de deposito, presente dentro de las composiciones como se describe en este documento, consiste en celulas irradiadas, en particular celulas tumorales irradiadas.

Ejemplo 5

Aplicacion de diferentes citoquinas en forma de macroagregados.

Con el fin de estimular varias armas del sistema inmune, se puede aplicar una combinacion de citoquinas.

IL-2 estimula las celulas T y mejora la actividad de las celulas NK

GM-CSF & IL-4 estan involucrados en el reclutamiento y maduracion de celulas dendnticas GM-CSF induce la vascularizacion del inoculo IL-12 activa las celulas dendnticas IFNalfa recluta y activa las celulas NK.

Mediante el uso de dicha mezcla de citoquinas se activan varias vfas, esto es, celulas T CD8, celulas NK, celulas NKT, y anticuerpos, que son importantes para la induccion de una respuesta inmune antitumoral eficaz.

En un esfuerzo por evaluar los beneficios de una combinacion de diferentes citoquinas en las formulaciones depot de la presente invencion, se han realizado experimentos de vacunacion en los que los ratones fueron vacunados contra celulas RenCa con ya sea; macroagregados de GM-CSF adsorbidos en alumbre;

macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre;

macroagregados de IL-4 adsorbidos en alumbre;

macroagregados de interferon alfa (IFNalfa) adsorbidos en alumbre;

la combinacion de macroagregados de IL-4 y macroagregados de GM-CSF adsorbidos en alumbre;

la combinacion de macroagregados de IL-4, macroagregados de GM-CSF, macroagregados de IL-2 y macroagregados de IFNalfa adsorbidos en alumbre.

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En la preparacion de estas vacunas de multiples citoquinas se puede cargar cada citoquina por separado sobre el deposito (alumbre) y posteriormente mezclar los adsorbatos de citoquina-alumbre, o se pueden mezclar las citoquinas y adsorberlas como una mezcla en el deposito (alumbre).

Para cada una de las citoquinas se determino la dosis optima de citoquina unida al alumbre, y cuando se usaron en combinacion con alumbre como deposito, se determinaron las siguientes dosis de citoquinas:

Para IL-2: 10 |ig por dosis de vacuna

Para IL-4: 3-10 |ig por dosis de vacuna

Para GM-CSF: 3-10 |ig por dosis de vacuna

Para IL-12: 1-3 |ig por dosis de vacuna

Para IFN alfa: 10-30 |ig por dosis de vacuna.

La proporcion de union de citoquina a alumbre debe ser tal que el alumbre este saturado con la citoquina, la mayona de las cuales estan en forma de macroagregados; en particular en una proporcion de entre aproximadamente 3:1 y 1:1; mas en particular en una proporcion de aproximadamente 1:1.

Para un primer experimento de vacunacion se usaron las siguientes preparaciones:

3 |ig de macroagregados de IL-4 fueron adsorbidos en 3 |ig de alumbre;

3 |ig de macroagregados de GM-CSF fueron adsorbidos en 3 |ig de alumbre;

y una mezcla de los mismos.

Despues de la incubacion y laminacion, los adsorbatos de citoquina-alumbre se mezclaron y celulas tumorales irradiadas.

En cada dosis de vacuna se incluyeron aproximadamente 43 |ig de alumbre cargado con citoquina 106 celulas tumorales irradiadas.

Un total de 43 |ig de alumbre por dosis de vacuna sigue siendo muy bajo en comparacion con la contenida en las vacunas convencionales.

La vacuna se utilizo para experimentos de vacunacion terapeutica de tumor.

Para un segundo experimento de vacunacion se usaron las siguientes preparaciones:

Una preparacion de control que contiene un antfgeno marcado con Texas Red, un deposito de alumbre pero que carece de macroagregados de citoquinas adsorbidos en alumbre; y

una preparacion de citoquinas macroagregadas que contiene un antfgeno marcado con Texas Red y macroagregados de citoquinas adsorbidas en alumbre que consisten en;

10 |ig de macroagregados de IL-2 fueron adsorbidos en 10 |ig de alumbre;

2 |ig de macroagregados de IL-4 fueron adsorbidos en 2 |ig de alumbre;

3 |ig de macroagregados de interferon alfa fueron adsorbidos en 3 |ig de alumbre; y 3 |ig de macroagregados de GM-CSF fueron adsorbidos en 3 |ig de alumbre.

Se inyectaron ratones con dichas formulaciones depot y en diversos dfas se obtuvieron microfotograffas de cortes de tejido preparados a partir de la inoculacion situada de los ratones. (Veanse las figuras 6a-d).

Ni la formacion de capsulas, ni cualquier brote de capilares en y alrededor del inoculo se observan 11 dfas despues de la vacunacion, en los cortes de tejido de la preparacion de control (Figura 6a). En los cortes de tejido para la preparacion de macroagregados de citoquinas, al contrario, a los 11 dfas despues de la vacunacion, se produce una clara formacion de capsulas y brote de capilares dentro y alrededor del inoculo (Figura 6b).

se adicionaron a macroagregada y dosis de alumbre

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Despues de 19 d^as, el inoculo de las preparaciones de macroagregados de citoquinas esta completamente encapsulado (Figura 6c) y la vascularizacion de esta capsula y el sitio de inoculacion (Figura 6b) permite que las celulas T auxiliares CD4 invaden la capsula y el inoculo (Figura 6d).

Para un tercer experimento de vacunacion, se uso la siguiente preparacion:

Una vacuna que contema celulas tumorales irradiadas marcadas con Texas Red, y macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre. 24 horas despues de la inyeccion, se prepararon y tineron cortes de tejido del sitio del inoculo y del ganglio linfatico drenante (Figura 6e y 6f, respectivamente). El area que rodea el lado del inoculo esta rodeada de macroagregados de IL-2. Se observa que una celula dendntica que aloja material antigenico tumoral, asf como macroagregados de IL-2 de union. Estas celulas dendnticas transportan los macroagregados de citoquinas al ganglio linfatico que drena la zona del inoculo. Esto se evidencia por la presencia de pequenos agregados de IL-2 en dichos ganglios linfaticos (figura 6f). De interes es que, en presencia de IL-2, las celulas dendnticas CD86+ exponen CD25, lo que aumenta la afinidad del receptor de IL-2 por su ligando (Boyment & Sprent, Nature Reviews Immunology 12: 180-190). Es probable que estos receptores de afinidad aumentados que se unen a los macroagregados de IL-2, permitiendo asf su transporte al ganglio linfatico.

La abundancia de agregados de IL-2 que rodean el sitio del inoculo y su aparicion en las fotograffas puede explicarse de la siguiente manera: se inyectan macroagregados de citoquinas grandes asociados entre sf. En el entorno del fluido inflamatorio que rodea al inoculo, los macroagregados de citoquinas ya no estan completamente estables y "explotan" y liberan macroagregados de menor tamano. Estos infestan el medio ambiente del inoculo con agregados de citoquinas mas pequenos (esto es, micro- asf como macroagregados) y citoquinas monomericas.

Los resultados obtenidos mostraron claramente que la mezcla de citoquinas adsorbidas en alumbre indujo mejores respuestas inmunes que los macroagregados de citoquinas adsorbidas en alumbre individuales y un mayor porcentaje de animales sobrevivio (Figura 5).

Por otra parte, la aplicacion de mezclas de macroagregados de citoquinas adsorbidos en alumbre en las vacunas produjo resultados aun mejores que el macroagregados de una sola citoquina adsorbidos en alumbre. Como es evidente a partir de lo anterior, cuando se usa en combinacion el inoculo de las preparaciones de citoquinas desarrolla propiedades de un organo inmune artificial, comparable a un granuloma vascularizado.

Este organo artificial tipo nodulo tiene varias propiedades muy espedficas:

1. Mantiene las celulas tumorales inoculadas y las citoquinas adsorbidas en alumbre durante mucho tiempo en su lugar;

2. Induce fibroblastos para formar una capsula alrededor de este;

3. Induce el brote de capilares en la capsula y el inoculo, y, por ello, proporciona "supervivencia" y "nutricion" durante mucho tiempo y evita la degradacion y eliminacion del inoculo;

4. Las celulas dendnticas interactuan con el material de la celula tumoral antigenica y con los macroagregados de citoquinas y transportan estos al ganglio linfatico; y

5. Los linfocitos T (y las celulas NK) que han sido activados espedficamente en el ganglio linfatico por los antfgenos tumorales presentados por celulas dendnticas, patrullan el organismo y buscan sus celulas tumorales objetivo. Los capilares les permiten entrar en el inoculo y finalmente encuentran su objetivo "real": las celulas tumorales.

Por consiguiente, en algun aspecto, el inoculo imita un tumor. Teniendo los macroagregados de citoquinas cargados en alumbre en proximidad cercana a las celulas tumorales irradiadas en el inoculo, las primeras reestimulan dichas celulas T circulantes (y otras celulas) cuando cumplen su objetivo en el sitio de inoculacion.

Tomadas en conjunto, las propiedades especiales de estas preparaciones depot de macroagregados de citoquinas permiten la manipulacion de la respuesta inmune a nivel del inoculo y al nivel del ganglio linfatico. Este procedimiento abre una manera de manipular las reacciones inmunes en el ganglio linfatico mediante el transporte de depositos multi-moleculares de citoquinas biologicamente activas en el ganglio linfatico.

Ejemplo 6

Preparacion de la vacuna contra la difteria

Se prepararon macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre de acuerdo con el ejemplo 1.

El toxoide difterico se adsorbio en alumbre como material de deposito. 1 |ig de toxoide adsorbido sobre 1 |ig de alumbre estaba presente por dosis de vacunacion. Esto se mezclo con diferentes cantidades de complejos de

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macroagregados de IL-2/alumbre (0, 1, 3 o 10 |ig por dosis) para evaluar la adicion de los macroagregados de citoquinas adsorbidos depot a vacunas virales.

Los ratones se inyectaron 3 veces con las vacunas y 14 dfas despues de la ultima aplicacion, se recogieron sueros del plexo retroorbital. Los tftulos de anticuerpos en sueros se ensayaron usando ELISA con toxoide tetanico adsorbido en fase solida. Los tftulos de anticuerpo se definieron como la dilucion a la que la densidad optica a 450 nm alcanzo 1.0 en el ELISA indirecto.

Dosis de macroagregados de IL-2

Tftulo de anticuerpo

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1

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3

300

10

10000

Como puede observarse a partir de los resultados, la adicion de macroagregados de citoquinas adsorbidos depot mejora en gran medida los tftulos de anticuerpos en una proporcion dependiente de la dosis. La adicion de 10 |ig de alumbre de IL-2 incrementa los tftulos de anticuerpos de difteria aproximadamente 10000 veces. De este modo, incluso cuando se usan cantidades muy bajas de material antigenico, las composiciones de la invencion permiten la generacion de tftulos de anticuerpos altos.

Ejemplo 7

Preparacion de la vacuna contra el tetanos

De forma similar al ejemplo 6, las vacunas contra el tetanos se crearon usando toxoide tetanico en lugar de toxoide difterico. De manera similar, incluso cuando se usan cantidades muy bajas de macroagregados de citoquinas, los tftulos de anticuerpos aumentaron significativamente.

Ejemplo 8

Preparacion de las vacunas contra la hepatitis B

Se prepararon macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre de acuerdo con el ejemplo 1.

Se utilizo 1 |ig de antfgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) adsorbida en 10 |ig de alumbre por dosis de vacunacion. La vacuna comprendfa adicionalmente ya sea no o 10 |ig de macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre. Se inyectaron por via subcutanea las vacunas a ratones hembras Balb/cJRj de 5-6 meses. Los sueros se recogieron 33 dfas despues de la inyeccion primaria y 14 dfas despues de la inyeccion secundaria. Los tftulos de anticuerpos se ensayaron en ELISA indirecto. Para este proposito, se aplicaron muestras de 100 |il de diluciones en serie de los sueros individuales a los pozos recubiertos con HBsAg de placas ELISA (0,1 |ig HBsAg en 100 |il de solucion reguladora de recubrimiento por pozo). La union de anticuerpos se determino aplicando anticuerpos IgG antiraton de cabra (Fcy) secundarios marcados con POD. Despues de la adicion del sustrato POD, se determino el OD450 para varias diluciones de los antisueros. Los tftulos de union se definieron como la dilucion a la que la densidad optica a 450 nm alcanzaba 1.0.

A los 33 dfas despues de la inyeccion primaria, el grupo que recibio la vacuna de HBsAg sin citoquinas adsorbidas en depositos contema 1 respondedor alto (tftulo mediano = 300) y 7 no respondedores (tftulo mediano = 0). Por el contrario, el grupo que recibio HBsAg con 10 |ig de macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre consistio en 4 respondedores altos (tftulo mediano de 1500), 3 respondedores bajos (tftulo mediano de 60) y 1 no respondedor (tftulo mediano = 0).

A los 14 dfas despues de la segunda inyeccion, la vacuna de HBsAg dio lugar a 5 respondedores altos (tftulo medio de 1500), 2 respondedores bajos (tftulo mediano de 20) y 1 no respondedor (tftulo mediano de 0). El grupo vacunado con la composicion de la invencion (HBsAg y 10 |ig de macroagregados de IL-2 adsorbidos en alumbre) consistfa en 7 respondedores altos (tftulo mediano de 3810) y 1 no respondedor (tftulo mediano = 0).

De este modo, no solo las composiciones de la presente invencion condujeron a tftulos de anticuerpos mas altos, sino que tambien generaron respuestas mas temprano. Ya 33 dfas despues de una sola inyeccion, el grupo que

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recibio la vacuna con macroagregados de citoquinas adsorbidos en deposito tema un perfil de anticuerpos similar al del grupo que recibio una dosificacion doble de la vacuna estandar.

Ademas, se preparo una vacuna con IL-2 adsorbida en alumbre, en la que la IL-2 estaba presente como microagregados en lugar de macroagregados. A continuacion, la IL-2 recombinante (Proleukin) se diluyo en una solucion reguladora que contema SDS para evitar la formacion de macroagregados. Una dosis de vacuna contema de este modo 1 |ig de HBsAg, 10 |ig de IL-2 adsorbida en alumbre, disuelta en una solucion reguladora que contema 160 |ig de SDS por mg de IL-2, esto es, correspondiente a la solucion reguladora de Proleukin. Este grupo fue peor que el grupo vacunado con la vacuna estandar (HBsAg).

Ejemplo 9

Vacunas contra la hepatitis B para pacientes intermedios y no respondedores

Similar al ejemplo 8, se prepararon diferentes vacunas de HBsAg. La vacuna estandar contema 1 |ig de HBsAg adsorbido en 10 |ig de alumbre. Otras vacunas conteman, ademas:

-10 |ig de alumbre

-10 |ig de macroagregados de IL-2 adsorbidos en 10 |ig de alumina -3 |ig de macroagregados de GM-CSF adsorbidos en 10 |ig de alumina

-10 |ig de macroagregados de IL-2 adsorbidos en 10 |ig de alumbre + 3 |ig de macroagregados de GM-CSF adsorbidos en 10 |ig de alumina

Se vacunaron ratones de tres diferentes cepas de raton con las vacunas. Los ratones Balb-c son de respondedores altos, los ratones C57BI/6 son respondedores intermedios, mientras que los SJL son no respondedores. Los sueros se recogieron xxx dfas despues de la inyeccion y se determinaron los tttulos como en el ejemplo 8.

Tabla 2: Mediana de tttulos de anticuerpos de HBsAg por grupo

Balb-c (resp. alta) C57BI/6 (resp. int.) SJL (sin resp.)

HBsAg

350 150 100

HBsAg + AL

1300 780 30

HBsAg + IL-2/AL

4000 9000 2000

HBsAg + GM-CSF/AL

4800 1700 600

HBsAg + GM-CSF/AL + IL-2/AL

37000 16000 1600

De este modo, la adicion de macroagregados de IL-2 o GM-CSF adsorbidos en alumbre conduce a mayores tftulos de anticuerpos. Ademas, la combinacion de macroagregados de IL-2 y GM-CSF conduce a una inmunizacion aun mejor. Sorprendentemente, se obtienen buenos tftulos de anticuerpos en ratones no respondedores cuando se usan las composiciones de la presente invencion. Cuando se usa HBsAg en combinacion con macroagregados de citoquinas adsorbidas en alumbre, los ratones no respondedores muestran tftulos de anticuerpos mas altos que los ratones de alta respuesta que se vacunan con la vacuna estandar.

Ejemplo 10

Recuperacion de la memoria de la hepatitis B

Las vacunas de hepatitis B se prepararon de acuerdo con el ejemplo 8 y conteman ya sea 10 |ig de alumbre o 10 |ig de alumbre a los que se adsorbfan 10 |ig de macroagregados de IL-2. Los ratones fueron vacunados por inyeccion intraperitoneal a 0, 4 y 8 semanas. Ademas, se realizaron experimentos separados de la misma manera, excepto que las inyecciones se realizaron por via intramuscular, subcutanea o intradermica.

A los 139 dfas despues de la ultima inyeccion, los ratones se desafiaron con 1.0 |ig de HBsAg soluble (esto es sin alumbre o IL-2). Esto tiene como objetivo imitar una infeccion natural de hepatitis B, que provocana una respuesta inmune en un animal vacunado. Los tftulos de anticuerpo se determinaron como en el ejemplo 8, antes del desaffo

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con HBsAG soluble y 14 dfas despues. Los resultados para el experimento de inyeccion intraperitoneal de desaffo se muestran en la figura 10. Como se puede ver, el desaffo da lugar a tftulos de anticuerpos aumentados en ratones vacunados con la vacuna "estandar" (que no contiene macroagregados de citoquinas). De hecho, en este grupo (1) los tftulos de anticuerpos son mayores despues del desaffo (aC) que antes del desaffo (bC). Sin embargo, los tftulos aumentan mucho mas en ratones que han sido vacunados con la vacuna de acuerdo con la invencion (grupo 2). Observaciones similares se han hecho para ratones vacunados por via intramuscular, subcutanea o intradermica.

Ejemplo 11

Distribucion de tamanos de macroagregados de citoquinas

Como en el ejemplo 1 anterior, en el presente experimento se utilizo IL-2 (Proleukin) de Novartis. 1 mg de IL-2 se contema liofilizado en una ampolla de inyeccion.

El liofilizado contema, ademas de 1.0 mg de IL-2, sustancias de solucion reguladora y SDS (0.160 |ig de SDS por mg de IL-2). El liofilizado se disolvio por inyeccion de 1.0 ml de agua esteril, filtrada por 25 nm. La solucion transparente se retiro de la ampolla de inyeccion y se diluyo con 5 ml de solucion salina reguladora con fosfato (PBS) esteril, filtrada por 25 nm.

Inmediatamente despues de la dilucion se lleno una muestra en una cubeta y se coloco en una maquina Zetasizer nano ZF. La dispersion de la luz se determino a una longitud de onda de 633 nm en los puntos de tiempo 0h, 1h, 2h, 3h y 4h. La intensidad de dispersion de la luz se represento frente al tamano de parffcula de 1 nm a 10,000 nm.

Los resultados mostrados en la figura 11 proporcionan:

en el punto de tiempo 0h: la IL-2 esta presente en la solucion como una mezcla de principalmente nano agregados grandes de 20 nm. Ademas, se observan algunas parffculas de 80 nm y pocas parffculas de 300 nm. Sobre la base de un area bajo el analisis de la curva, este primer pico de parffculas grandes principalmente de 20 nm (intervalo de aproximadamente 10 a 40 nm) representa aproximadamente el 65% del material, en el que el pico de las parffculas de 80 nm mas grandes (intervalo de aproximadamente 40 a 100 nm) representa aproximadamente el 25% y el pico restante de parffculas de 300 nm (intervalo de aproximadamente 200 a 450 nm) representa aproximadamente el 10%. En otras palabras, desde el inicio y en ausencia de SDS, ya mas del 25% de la IL2 esta presente en la forma de macroagregados.

Despues de 1 h, la mayoffa de las parffculas estaban presentes como parffculas de 110 nm. En dicho ejemplo, el pico de 20 nm ha desaparecido completamente y no se han encontrado parffculas por debajo de 15 nm. Ademas, solo se encontraron unas pocas parffculas de 20 nm. Basandose en un area bajo el analisis de la curva, este primer pico de parffculas principalmente de 20 nm representa solamente aproximadamente el 6.5% del material.

Durante el curso posterior del experimento, el tamano de las parffculas solo aumento adicionalmente:

- despues de 2 horas un pico de 80 nm y un pico de parffculas de 200 nm, sin parffculas por debajo de 60 nm y el pico de arrastre que representa aproximadamente el 17% del material.

- despues de 3 h un pico de 200 nm y un pico de parffculas de 700 nm, sin parffculas por debajo de 100 nm.

- despues de 4 h un pico de 200 nm y un pico de parffculas de 1100 nm, sin parffculas por debajo de 150 nm;

- despues de 5 h, un pico de 500 nm y un pico de parffculas de 3000 nm (datos no mostrados)

Ejemplo 12

Influencia del tamano de parffcula sobre los tftulos de anticuerpos

En estos experimentos se investigo el efecto del tamano de parffcula sobre los tftulos de anticuerpos en una configuracion de vacunacion. El tamano de parffcula de los agregados de citoquinas se controlo por la presencia o ausencia de SDS en la preparacion de la vacuna, en el presente caso usando el anffgeno del virus de la hepatitis B (HBsAg).

El experimento se realizo de la siguiente manera:

cada raton se inyecto con 1.0 |ig de HBsAg adsorbidos en 10 |jg de alumbre mezclado con 10 |ig de rhulL-2 adsorbidos en 10 |ig de alumbre, en donde en el grupo control se preparo la rhulL-2 adsorbida en 10 |ig de alumbre en ausencia de SDS con la formacion de macroagregados de la presente invencion y en el grupo experimental se preparo la rhulL-2 adsorbida a 10 |ig de alumbre en presencia de SDS para mantener los microagregados.

Para el grupo experimental, el adyuvante de IL-2-alumbre se preparo de la siguiente manera:

La IL-2 (Proleukin) de Novartis se obtuvo como un liofilizado en una ampolla de inyeccion.

El liofilizado contema, ademas de la rhulL-2, todas las sustancias de la solucion reguladora

Con el fin de limitar la agregacion 160 |ig de SDS por mg de IL-2 estaban contenidos en el 5 disolvio por inyeccion de 1.0 ml de agua esteril en la ampolla de inyeccion. A continuacion, ampolla de inyeccion y se diluyo 5 veces.

Para el grupo experimental, el PBS usado para la dilucion contema 180 |ig/ml de SDS.

Para los grupos de control se utilizo PBS sin SDS.

Despues de varias horas, se adiciono una suspension de alumbre en la concentracion/densidad requerida.

10 El PBS sin SDS que contema solucion de IL-2 desarrollo turbidez en un tiempo muy corto.

El PBS con SDS que contema solucion de IL-2 no desarrollo turbidez. preparacion de la vacuna:

la solucion que contema alumbre y la solucion que contema IL-2 se mezclaron e incubaron en un rodillo durante una hora. Las vacunas obtenidas de este modo se inyectaron por via subcutanea o intramuscular en ratones BALB/c.

15 Despues de tres semanas, los ratones fueron reforzados con la misma vacuna siguiendo el mismo procedimiento.

De la sangre obtenida por puncion del plexo retro-orbital se preparo el suero.

Los tftulos de anticuerpo se determinaron mediante ELISA indirecto con anticuerpos IgG antiraton (espedficos de Fc) de cabra marcados con peroxidasa.

Se definieron los tftulos de anticuerpo como la dilucion a la cual se obtuvo una densidad optica a 450 nm de 1.0.

20 Para cada grupo se graficaron los tftulos de anticuerpos y la media

Como puede verse claramente en la figura 12, los anticuerpos obtenidos en ratones despues de la inmunizacion con una vacuna que contema SDS eran significativamente mas bajos que los tftulos de anticuerpos obtenidos de ratones que habfan sido vacunados con la vacuna "normal", que no contiene SDS.

necesarias.

liofilizado. El liofilizado se la solucion se retiro de la

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   1. Una composicion que comprende citoquinas, en la que al menos el 20% de dichas citoquinas estan presentes en macroagregados de citoquinas con un diametro promedio de al menos 50 nm, y en la que dichos macroagregados de citoquinas estan asociados entre sf mediante:

   - adsorcion a un material de deposito, y/o

   - encapsulacion en liposomas.
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, que comprende citoquinas diferentes en forma de macroagregados.
3. 3. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha(s) citoquina(s) se seleccionan independientemente del grupo que consiste en IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, e IFN-alfa, en particular en la que al menos una citoquina es IL-2.
4. 4. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho material de deposito se selecciona del grupo que consiste en hidroxido de aluminio, fosfato de calcio, perlas de latex y microesferas o nanopartfculas basadas en acido polilactico.
5. 5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos liposomas son liposomas de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC).
6. 6. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas material antigenico.
7. 7. La composicion de la reivindicacion 6, en la que el material antigenico se selecciona del grupo que consiste en celulas tumorales autologas irradiadas, celulas tumorales alogenicas irradiadas, celulas tumorales xenogenicas irradiadas, homogenados de celulas tumorales, extractos de celulas tumorales, antfgenos tumorales individuales (naturales o recombinantes), mezclas de antfgenos tumorales (naturales o recombinantes), peptidos de antfgenos tumorales (naturales o recombinantes).
8. 8. La composicion de la reivindicacion 6, en la que el material antigenico es material antigenico microbiano y/o parasftico.
9. 9. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como medicamento.
10. 10. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento y/o prevencion de cancer, tal como un cancer seleccionado del grupo que consiste en el cancer renal, hepatico, de pulmon, de ovario, de prostata, del pancreas, estomago, de cabeza y cuello, carcinoma testicular, fibrosarcoma, melanoma, glioblastoma, linfomas, leucemias y mielomas; en particular carcinoma renal, carcinoma pancreatico, carcinoma de colon, carcinoma de prostata, y melanoma; mas en particular carcinoma pancreatico y renal y melanoma.
11. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8, para uso en el tratamiento y/o prevencion de una enfermedad infecciosa.
12. 12. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables y opcionalmente un ingrediente farmaceutico adicional.
13. 13. Un procedimiento de preparacion de la composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de:

    a) proporcionar una solucion acuosa que comprende una citoquina; en el que dicha solucion acuosa no contiene ningun agente que impida la agregacion, o un agente de prevencion de la agregacion en una cantidad suficientemente baja para permitir la formacion de macroagregados de citoquinas con un diametro mayor de 50 nm;

    b) incubar dicha solucion acuosa durante un tiempo suficiente para agregar al menos el 20% de dichas citoquinas en macroagregados de citoquinas con un diametro promedio de al menos 50 nm;

    c) asociar dichos macroagregados de citoquinas mediante

    - mezcla de dicha solucion acuosa con el material de deposito, para adsorber dichos macroagregados de citoquinas al material de deposito; y/o

    - encapsulacion de dichos macroagregados de citoquinas en los liposomas.
14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que dicha solucion acuosa comprende menos de 95 mg de SDS por mg de citoquina.
15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 13 o 14, de preparacion de la composicion segun la reivindicacion 6, que comprende ademas la etapa

    5 d) mezclar dicha solucion que comprende macroagregados de citoquinas asociados con material antigenico.