TWI357820B - High concentration antibody and protein formulatio - Google Patents

High concentration antibody and protein formulatio

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TWI357820B
TWI357820B TW093109166A TW93109166A TWI357820B TW I357820 B TWI357820 B TW I357820B TW 093109166 A TW093109166 A TW 093109166A TW 93109166 A TW93109166 A TW 93109166A TW I357820 B TWI357820 B TW I357820B
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TW
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antibody
liquid formulation
formulation according
stable liquid
protein
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TW093109166A
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TW200505480A (en
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Jun Liu
Steven J Shire
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Genentech Inc
Novartis Ag
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    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation

Description

1357820 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於高度濃縮之抗體調配物，其係特別適合皮下 投藥。本發明進一步提供安定、高度濃縮（例如^ 1〇〇毫克/ 毫升蛋白質）液體調配物》 【先前技術】 對於向度濃縮之液體抗體調配物有顯著需求。但是，高度 ;辰縮之蛋白質調配物呈現數項問題。一項問題是由於微粒 子形成所致之不安定性。隨著重配之凍乾製劑以產生液體 調配物，此項問題已經由利用界面活性劑（例如聚花楸酸酯） 而被尋求解決’但界面活性劑不適合液體調配物，因其會 賦與進一步加工處理困難。再者，界面活性劑更不會降低 由於來自抗體巨分子本性之許多分子間交互作用之結果所 造成之增加黏度。 雖然界面活性劑已被註實會顯著地降低蛋白質微粒子形成 之程度’但其並未尋求解決增加黏度之問題，此問題會造 成濃縮抗體調配物之操控與投藥困難《抗體易於形成高濃 度下之黏稠溶液’此係由於其巨分子本性與分子間交互作 用之可能性所致。再者，藥學上可接受之糖類經常以大量 作為安定劑使用。此種糖類可增強分子間交互作用，於是 增加調配物之黏度。高度黏稠調配物係難以製造、吸取至 注射器中及以皮下方式注射。在處理黏稠調配物時利用力 ，會導致過度起泡’其可能會導致活性生物製劑之變性與 失活。此項問題之令人滿意解答正缺乏中。 92129 1357820 雖然先前技藝指示許多可適當地被採用以產生醫藥調配物 之賦形劑實例，但極少蛋白質已被成功地調配高於1〇〇毫克 /毫升，或如此進行之技術極少已被描述。 申請人已發現精胺酸，明確言之為精胺酸_HC1，係特別適 合高度濃縮之液體蛋白質或抗體調配物。 女定等滲性經凍乾蛋白質調配物係揭示於1997年2月13曰 公告之PCT公報W〇97/0侧+，其全部揭* h容係據此特別 并；本文供參考。所揭示之經束乾調配物可被重配以產生 同蛋白質濃度液體調配物，而無顯見之安定性損失。但是 ，與重配調配物之高黏度有關聯之潛在問題，並未被尋求 解決。蛋白質聚集已在先前經由添加糖類而被降低，但如 此進行可急驟地增加黏度與體積滲莫濃度，於是使得加工 處理與利用上不實用。 申叫人之PCT申清案，2002年4月18日公告之公報W002/30463 係揭不高蛋白質濃度，但低黏度調配物，以下述方式達 成：i)經過低pH (約4.〇至5.3) ; 2)高pH (約6 5至12 〇)，或3)藉 =添加鹽或緩衝劑增加調配物之總離子強度》但是，雖： j 、、子強度，譬如經由添加NaCl，確實會降低調配物之 黏度、’但其亦可造成增加之溶液混濁度，其經常與蛋白質 粒子之形成(例如聚集)有關聯。因此，最適宜高濃度蛋白 質调配物必須古α 、〜 ^克服文疋性、黏度、體積滲莫濃度及混濁度 之挑喊。 【發明内容】 本發明係關於高度濃縮之蛋白質或抗體調配物，其係為安 92129 1357820 定，且具有低黏度與混濁度。 特定言之，本發明係關於低混濁度之高度濃縮抗體調配物 ，其包含蛋白質或抗體（100-260毫克/毫升）、組胺酸（10-100 福）、精胺酸^(：1(50-200福）及聚花楸酸酯（0.01%-0.1%)，具 有pH值為5.5-7.0，黏度為50厘史或較低，且體積滲莫濃度為 200 mOsm /公斤-450 mOsm /公斤。或者，在調配物中之蛋白 質或抗體，其範圍可為120-260毫克/毫升，或者150-260毫克 /毫升，或者180-260毫克/毫升，或者200-260毫克/毫升蛋 白質或抗體。或者，體積滲莫濃度範圍為250mOsm/公斤-350 mOsm/公斤。或者，精胺酸-HC1之濃度範圍為100-200mM， 或者 150-200 mM，或者 180-200 mM。 或者，本發明係關於低混濁度之高度濃縮抗體調配物，其 包含抗體（40-150毫克/毫升）、組胺酸（10-100mM)、糖（例如 海藻糖或蔗糖，20-350 mM)及聚花楸酸酯（0.01% -0.1% )。 在一項特定具體實施例中，本發明係提供一種調配物，其 含有高濃度之大分子量蛋白質，譬如抗體或免疫球蛋白。 此等抗體可為例如針對抵抗特別預定抗原之抗體。在一特 定方面，抗原係為IgE (例如rhuMAbE-25與rhuMAbE-26，描述於 美國專利6,329,509與WO 99/01556中）。或者，抗-IgE抗體可為 CGP-5101 (Hu-901)，描述於Come 等人，J.C7z>i./«ve说迎(5): 879-887 .(1997)，WO 92/17207 中，及 ATTC 寄存物編號 BRL-10706 與 11130, 11131, 11132, 11133。或者，抗原可包括：CD蛋白質 CD3，CD4，CD8, CD19, CD20, CD34 及 CD40 ; HER 受體族群，譬如 EGF 受體 HER2, HER3或HER4受體；2C4,4D5,PSCA，LDP-2，細胞黏連分子，譬 92129 1357820 所謂"蛋白質"係指胺基酸順序，其鏈長係足以產生較高含 量之二級及/或四級結構。因此，蛋白質係與”肽"有區別 ，肽亦為胺基酸系之分子，未具有此種結構。典型上，供 此處使用之蛋白質將具有分子量為至少約15_2〇kD，較佳為 至少約20 kD。 被涵蓋在本文定義中之蛋白質實例，包括哺乳動物蛋白質 ，譬如生長激素，包括人類生長激素與牛生長激素；生長 激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白； α-ι-抗胰蛋白酶；胰島素A_鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促 卵泡成熟激素；降血_素；促黃體生成激素；冑高血糖素 ;塊凝因子’譬如因子歡、因子κ、組織因子及 vonWillebrands因子；抗凝血因子，譬如蛋白質c;心房利鈉 尿因子；肺部界面活性劑；血纖維蛋白溶酶原活化劑，兹 如尿激酶或組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑㈣，例： Active、TNKase®、Retevase@);彭巴啡;凝血酶； 腫瘤壞夕匕因子-a與·点；腦啡肤酶；職顶（於正常τ·細胞表 現與分泌之活化作用上調節）；Α類巨嗤細胞炎性蛋白質 (ΜΠΜ-a);血清白蛋白，譬如人類血清白蛋白；目勒氏抑制 物質；弛緩素Α-鏈；弛緩素Β_鏈；弛緩素原；老鼠促性腺激 素有關聯肽；DNase;抑㈣；活性素；血管内皮生長因子(VEGF) :激素或生長因子之受體；整合素；蛋白質A或D;風濕性 、子神’里S養因子’譬如骨頭^生之神經營養因子(BDNF) 神.吕養素-3、-4、-5 或-6 (NT-3、NT-4、NT-5 或 NT-6)，或 神經生長因子，譬如NGF_^血小㈣生之生長因子（PDGF) 92129 1357820 ;成纖維細胞生長因子，譬如aFGF與bFGF;表皮生長因子（EGF) ;轉變生長因予（TGF)，譬如TGF-α與TGF-/?，包括TGF-/31、 TGF-召2、TGF-灼、TGF-泠4或TGF-冷5 ;似胰島素生長因子-I與 -II (IGF-I 與 IGF-II) ; des(l-3)-IGF-I (腦部 IGF-I);似胰島素生長因 子結合蛋白質；CD蛋白質，譬如CD3、CD4、CD8、CD19及 CD20 ;促紅血球生成素（EPO);血栓造血素（TPO);骨謗發因 子；免疫毒素；骨頭形態發生蛋白質（BMP);干擾素，譬如 干擾素-α、-石及-γ;菌落刺激因子（CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF ;間白血球活素（IL)，例如IL-1至IL-10 ;超氧化歧 化酶；Τ-細胞受體；表面膜蛋白質；衰變加速因子（DAF);病 毒抗原，例如AIDS包膜之一部份；輸送蛋白質；導航受體 ，選址素，調郎蛋白質；免疫黏連素；抗體；及任何上文 列示多肽之生物活性片段或變種。 經調配之蛋白質較佳為基本上純，且期望上為基本上均質 (意即不含污染蛋白質）。"基本上純”蛋白質係意謂組合物 包含至少約90重量％蛋白質，以組合物之總重量為基準， 較佳為至少約95重量％。"基本上均質”蛋白質係意謂組合 物包含至少約99重量％蛋白質，以組合物之總重量為基準。 在某些具體實施例中，蛋白質為抗體。抗體可結合至例如 任何上文所提及之分子。被本發明所涵蓋之抗體用之舉例 分子標的，係包括Ige，CD蛋白質CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34及CD40 ; HER受體族群之成員，譬如EGF受體，HER2、 HER3 或 HER4 受體；2c4、4D5、PSCA、LDP-2，細胞黏連分子 ，譬如 LFA-1，Macl，pl50, 95, VLA-4, ICAM-1，VCAM，及 αν/；53 整合 92129 -11 - 1357820 素，包括☆與少亞單位（例如抗-CDlla、抗-CD18或抗-CDllb 抗體）；生長因子，譬如VEGF ;血液抗原；flk2/flt3受體；肥 胖（OB)受體；mpl受體、CTLA-4及蛋白質C。 當於其中使用時，”抗體"一詞係包括單株抗體（包括具有 免疫球蛋白Fc區域全長抗體）、具有多抗原決定部位專一性 之抗體組合物、多專一性抗體（例如雙專一性抗體、雙抗體 及單鏈分子，以及抗體片段（例如Fab、F(ab')2及Fv)。”免疫 球蛋白”（Ig) —詞可與本文中之”抗體”交換使用。 基本4-鏈抗體單位為由兩個相同輕（L)鏈與兩個相同重（H) 鏈所組成之雜四聚體糖蛋白。IgM抗體包含5個基本雜四聚 體單位伴隨著另一個稱為J鏈之多肽，且含有10個抗原結合 位置，而IgA抗體包含2-5個基本4-鏈單位，其可聚合以形成 併用J鏈之多價組裝。在IgG之情況中，此4-鏈單位一般為約 150,000道爾呑。各L鏈係藉由一個共價二硫鍵連接至Η鏈， 而兩個Η鏈係藉由一或多個二硫鍵連結至彼此，依Η鏈同型 物而定。各Η與L鏈亦具有規則間隔之鏈内二硫化物橋基。 各Η鏈在Ν-末端，對各α與7鏈，具有一個可變功能部位（VH) ，接著為三個恒定功能部位（CH)，而對//與e同型物為四個 CH功能部位。各L鏈在N-末端具有一個可變功能部位（VL)， 接著為一個恒定功能部位在其另一端。VL係與VH對準，而CL 係與重鏈之第一個恒定功能部位（CH 1)對準。咸認特定胺基 酸殘基係在輕鏈與重鏈可變功能部位之間形成界面。VH與VL 之配對係一起形成單一抗原結合位置。關於不同種類抗體 之結構與性質，可參閱例如J褚輿玆扇启瘦荸，第8版， 92129 -12- 1357820
Daniel P. Sties, Abba I. Terr 及 Tristram G. Parsolw (編著),Appleton & Lange, Norwalk, CT，1994,第 71 頁及第 6 章。 得自任何脊椎動物物種之L鏈可歸屬於兩種顯然不同類型 之一，稱為/c與λ，以其恒定功能部位之胺基酸順序為基礎 。依其重鏈（CH)恒定功能部位之胺基酸順序而定，免疫球蛋 白可歸屬於不同種類或同型物。有五種類之免疫球蛋白：IgA 、IgD、IgE、IgG及IgM，具有個別被稱為α、（5、ε、τ*及 仁之重鏈。了與//種類係以CH順序與功能中之相對較小差 異為基礎，進一步被區分成亞組，例如人類表現下列亞組 :IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2。 ”可變”一詞係指可變功能部位之某些鏈段在抗體中之順序 上廣泛地不同之事實。V功能部位係媒介抗原結合及界定特 定抗體對其特定抗原之專一性。但是，變異性並未橫越可 變功能部位之整體全長均勻地分佈。替代地，V區域包含相 對較不可變伸長，稱為骨架區域（FR)，為約15-30個胺基酸殘 基，被極端變異性之較短區域分隔，稱為"高可變區域"或 有時稱為”互補性決定區域"(CDR)，各為大约9-12個胺基酸殘 基長度。原本重與輕鏈之可變功能部位各包含四個FR，大 部份採取占-薄片型態，藉由三個高可變區域連接，其係形 成圈環，連接/5-薄片結構，而在一些情況中形成其一部份 。於各鏈中之高可變區域係藉由FR保持緊密接近在一起， 並與得自另一鏈之高可變區域，有助於抗體抗原結合位置 之形成（參閱Kabat等人，潯充瘦荸择之蛋冷貧膺多，第5 版，國家衛生研究所公共衛生服務，Bethesda, MD (1991))。恒定 92129 -13· 1357820 功能部位未直接涉及使抗體結合至抗原，但顯示各種效應 子功能，譬如參與抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。 "高可變區域π —詞（亦稱為”互補性決定區域"或CDR)當於 本文中使用時，係指抗體之胺基酸殘基，其係（經常為極端 順序變異性之三或四個短區域）在免疫球蛋白之V-區域功能 部位内，其係形成抗原結合位置，且為抗原專一性之主要 決定子。有至少兩種確認CDR殘基之方法：（1) 一種以雜交 物種順序變異性為基礎之途徑（意即Kabat等人，#名虔# f 要沒之蛋白：T腐多（國家衛生研究所，Bethesda,MS 1991);與（2) 一種以抗原-抗體複合物之結晶學研究為基礎之途徑 (Chothia, C.等人，J·施/.历〇/. JM : 901-917 (1987))。但是，達兩種 殘基確認技術界定重疊區域但非相同區域之程度，其可合 併以界定雜種CDR。 於本文中使用之”單株抗體”一詞，係指得自實質上均質抗 體個體群之抗體，意即包含該個體群之個別抗體，係為相 同，惟可以少量存在之可能天然生成之突變型及/或轉譯後 改質物（例如異構化作用、醯胺化作用）除外。單株抗體係 為高度地專一性，被導引針對單一抗原位置。再者，與典 型上包含被導引針對不同決定子（抗原決定部位）之不同抗 體之習用（多株）抗體製劑成對比，各單株抗體係被導引針 對抗原上之單一決定子。單株抗體除了其專一性以外，有 利之處在於其係藉由雜種瘤培養物合成，未被其他免疫球 蛋白污染。修飾用語"單株"係表示抗體之特性為得自抗體 之實質上均質個體群，並非欲被解釋為需要藉任何特定方 92129 -14- 1357820 法製造抗體。例如，根據本發明欲被使用之單株抗體可藉 由最初由Kohler等人，25ά : 495 (1975)所述之雜種瘤方法 製成，或可藉由重組DNA方法製成（參閱，例如美國專利 4,816,567)。”單株抗體”亦可使用例如Clackson等人，TVaft/relSl :624-628 (1991)與 /· Mo/.所0/.,222 : 581-597 (1991)中所述之技術 ，單離自噬菌體抗體庫。 此處之單株抗體係明確地包括"嵌合”抗體（免疫球蛋白）， 其中一部份重及/或輕鏈係相同或類似於衍生自特定物種或 歸屬於特定抗體種類或亞組之抗體中之相應順序，而鏈之 其餘部份係相同或類似於衍生自另一物種或歸屬於另一抗 體種類或亞組之抗體中之相應順序，以及此種抗體之片段 ，只要其顯示所要之生物學活性即可（美國專利4,816,567 ; Morrison 等人，P/oc. TVai/. ylcai/· «Sd. t/5L4,紅：6851-6855 (1984))。此處 吾人感興趣之嵌合抗體包括"靈長類化"抗體，其包含衍生 自非人類靈長類動物（例如古老世界猴子、無尾猿等）之可 變功能部位抗原結合順序與人類恒定區域順序。 "完整"抗體為包含抗原結合位置，以及CL及至少重鏈功 能部位CH1、CH2及CH3之抗體。恒定功能部位可為原本順 序恒定功能部位（例如人類原本順序恒定功能部位）或其胺 基酸順序變種。完整抗體較佳係具有一或多種效應子功能。 "抗體片段"包含完整抗體之一部份，較佳為該完整抗體之 抗原結合及/或可變區域。抗體片段之實例包括Fab、FaW、 F(ab')2及Fv片段；雙抗體；線性抗體（參閱美國專利5,641，87〇 ，實例 2 ; Zapata 等人，Pro如>z 五《g. 8(10) : 1057-1062 [1995]);由抗 92129 15 1357820 體片段形成之單鏈抗體分子與多專一性抗體。 抗體之木瓜酯素消化產生兩個相同抗原結合片段，稱為 "Fab”片段與殘留之"Fc”片段，一種反映出易於結晶能力之名 稱。Fab片段包含整個L鏈，伴隨著Η鏈之可變區域功能部位 (VH)，及一個重鏈之第一個恒定功能部位（CH 1)。各Fab片段 關於抗原結合係為單價，意即其具有單一抗原結合位置。 抗體之胃蛋白酶處理產生單一大F(ab')2片段，其大致上相應 於兩個具有不同抗原結合活性之二硫化物連結之Fab片段， 且仍然能夠使抗原交聯。Fab'片段與Fab片段不同之處在於 具有少數其他殘基在CH1功能部位之羧基末端，包括來自抗 體鉸鏈區域之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH係為此處對於其中 恒定功能部位之半胱胺酸殘基帶有自由態硫醇基之Fab1之名 稱。F(aV)2抗體片段最初係以成對Fab’片段產生，其具有鉸鏈 半胱胺酸在彼等之間。抗體片段之其他化學偶合亦為已知。
Fc片段包含藉由二硫化物保持在一起之兩個Η鏈之羧基末 端部份。抗體之效應子功能係決定於Fc區域中之順序，此 區域亦被某些細胞類型上所發現之Fc受體（FcR)所辨識。 ”Fv"為最小抗體片段，其含有完整抗原-辨識與-結合位置 。此片段包含一個重鏈與一個輕鏈可變區域功能部位呈緊 密非共價缔合之二聚體。自此兩個功能部位之折疊係放出 六個高可變圈環（各3個圈環，來自Η與L鏈），其有助於胺 基酸殘基對抗原結合，且賦予對抗體之抗原結合專一性。 但是，即使是單一可變功能部位（或一半Fv，僅包含三個對 抗原為專一之CDR)亦具有辨識與結合抗原之能力，惟係在 92129 16· 1357820 比整個結合位置較低之親和力下。 亦被縮寫成nsFv"或"scFv"之"單鏈Fv”，係為抗體片段，其 包含被連接至單一多肽鏈之VH與VL抗體功能部位。sFv多肽 較佳係進一步包含多肽鏈結在VH與功能部位之間，其使 得sFv能夠形成對抗原結合所要之結構。關於sFv之回顧，可 參閱Pluckthun，##我禮之桌理學，第113卷，Rosenburg與Moore編 著，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁（1994)。 π雙抗體” 一詞係指使用VH與Ve功能部位間之短連結基（約 5-10個殘基），藉由建構sFv片段（參閱前文段落）所製成之小 抗體片段，以致達成V功能部位之鏈間而非鏈内配對，於是 造成二價片段，意即具有兩個抗原結合位置之片段。雙專 一性雙抗體為兩個"交換"sFv片段之異種二聚體，其中兩個 抗體之VH與VL功能部位係存在於不同多肽鏈上。雙抗體係 更詳細地描述於例如EP 404,097 ; WO 93/11161 ; Hollinger等人， /Voc. Ato/· Jai/· Sd. t/似迎：6444-6448 (1993)中。 ”專一性地結合至''特定多肽或特定多肽上之抗原決定部位 ，或”對其為專一"之抗體，係為會結合至該特定多肽或特 定多肽上之抗原決定部位，而不會實質上結合至任何其他 多肽或多肽抗原決定部位者。 •I固相”一詞係描述本發明抗體可黏著至其上之非水性基質 。本文所涵蓋固相之實例，包括部份或完全由玻璃（例如經 控制孔隙玻璃）、多醣（例如瓊脂糖）、聚丙烯醯胺、聚苯乙 烯、聚乙烯醇及聚矽氧所形成者。在某些具體實施例中， 依内文而定，固相可包含檢測板之井；在其他情況中，其 92129 -17- 1357820 係為純化管柱（例如親和力層析管柱）。此術語亦包括離 粒子之不連續固相，譬如在美國專利中所述者。 非人類（例如老鼠）抗體之”人化”形式係為大部份人類順序 之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（譬如抗體之卜 、Fab、Fab’、F(ab')2或其他抗原結合亞順序），其含有衍生自 非人類免疫料自之最小順序。大部份人化抗體係為人類 免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接受者之高可變區域 (亦為CDR)之殘基，係被來自非人類物種（供體抗體）之高可 變區域之殘基置換，該非人類物種譬如具有所要專一性、 親和力及容量之老鼠、大白鼠或兔子。於一些情況中，人 類免疫球蛋白之Fv骨架區域(FR)殘基係被相應非人類殘基置 換。再者，於本文中使用之”人化抗體"亦可包含既非在接 受者抗體亦非在供體抗體中發現之殘基。施行此等改質， 以進一步精製及使抗體性能達最佳化。人化抗體最適宜亦 將包含至少一部份免疫球蛋白恒定區域(Fc)，典型上為人類 免疫球蛋白之恒定區域。關於進一步細節，可參閱J〇nes等 人，伽㈣ 121: 522_525 (1986); Reich脑m 等人，胸咖,孤：323 329 (1988) ’ 及 presta，CWr. 0/7. «Sirwci·历〇/.，2 : 593-596 (1992)。 ”物種依存性抗體"，例如哺乳動物抗人類IgE抗體，為對 於來自第一種哺乳動物物種之抗原，比其對於來自第二種 哺乳動物物種之該抗原同系物所具有者，具有較強結合親 和力之柷體。於正常情況下，物種依存性抗體係"專一性地 結合”至人類抗原（意即具有結合親和力（Kd)值不超過約 1x10_7M ’或者，不超過約lxl0-sM，或者，不超過約1χ1〇·9Μ) 92129 1357820 ，但對於來自第二種非人類哺乳動物物種之該抗原同系物 具有之結合親和力，係比其對於非人類抗原之結合親和力 弱至少約50倍，至少約500倍或至少約1000倍。物種依存性 抗體可為如上文定義之任何各種類型之抗體，但較佳為人 化或人類抗體。 抗體π效應子功能”係指可歸因於抗體之Fc區域（原本順序 Fc區域或胺基酸順序變種Fc區域）之生物學活性，且隨著抗 體同型物而改變。抗體效應子功能之實例包括：Clq結合與 補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞所媒 介之細胞毒性（ADCC);呑噬作用；細胞表面受體之向下調節 (例如B細胞受體）；及B細胞活化作用。 •'抗體依賴性細胞所媒介之細胞毒性”或ADCC係指細胞毒 性形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞（例如天然殺 傷（NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上之Fc受體（FcR)上 之所分泌Ig，使得此等細胞毒性效應子細胞能夠專一性地結 合至帶有抗原之標的細胞，且接著以細胞毒素殺死標的細 胞。抗體係”武裝”細胞毒性細胞，且係為藉此機制殺死標 的細胞所需要。會媒介ADCC之初生細胞，NK細胞，係僅表 現Fc yRIII，然而單細胞係表現Fc 7*RI、Fc 及Fc T*RIII。於 造血細胞上之Fc表現，係摘錄於Ravetch與Kinet, i?ev. /wmw⑽/. 2 : 457-92 (1991)第464頁上之表3中。為評估吾人感興 趣分子之ADCC活性，可進行活體外ACDD檢測，譬如在美國 專利5,500,362或5,821，337中所述者。可用於此種檢測之效應子 細胞，包括末梢血液單核細胞（PBMC)與天然殺傷（NK)細胞。 92129 -19- 1357820 替代或另外，吾人感興趣分子之adcc活性可於活體内評估 ’例如於動物模式中，譬如在Clynes等人，尸迟：652-656 (1998)中所揭示者。 "Fc受體”或"FcR"係描述一種結合至抗體之Fc區域之受體。 較佳FcR為原本順序人類fcr。再者，較佳FcR為結合IgG抗 體之受體（7焚體）’且包括pc yRI、pc 及Fc 亞組之 .受體，包括此等受體之對偶質變種與替代疊接形式，Fc<rRII 受體包括Fc rRIIA (”活化受體"）與Fc yRIIB ("抑制受體"），其具 有類似胺基酸順序’主要差異在其細胞質功能部位上。活 化受體Fc rRHA含有免疫受體酪胺酸系活化主體（ITAM)在其 細胞質功能部位上。抑制受體Fc rRIIB含有免疫受體酪胺酸 系抑制主體（ITIM)在其細胞質功能部位上（參閱，m. Daeron， immw⑽/_ ϋ : 203-234 (1997))。FcR 係被回顧於 Ravetch 與 Kinet，如⑽· /wmwzo/. 2 : 457-92 (1991) ; Capel 等人，/w/mm⑽ 4 : 25-34 (1994);及 de Haas 等人，J·切汶 αζ·«_ Merf. 12ά ： 330-41 (1995) 中。其他FcR，包括欲在未來被確認者，係被此處之，'FcR” 一 巧所涵蓋。此術語亦包括初生受體FcRn，其係負責母IgG轉 主胎兒。Guyer 等人，·/. 112 : 587 (1976)與 Kim 等人， J' Irnmun〇l. 24 ： 249 (1994) 〇 人類效應子細胞"為白血球，其係表現一或多種FcR，且 施行效應子功能。此等細胞較佳係表現至少Fc rRIII，且施 订ADcc效應子功能。媒介ADCC之人類白血球之實例，包括 末梢血液單核細胞（PBMC)、天然殺傷（NK)細胞、單細胞、細 胞毒性T細胞及嗜中性白血球，其中以PBMC與MNK細胞為 92129 •20- 1357820 較佳。效應子細胞可單離自原本來源，例如血液。 "CDC"之"補體依賴性細胞毒性丨丨係指標的細胞於補體存在 下之溶胞作用。古典補體途徑之活化作用係藉由結合補體 系統之第一種成份（Clq)至抗體（適當亞組之抗體）而被引發 ，該抗體係結合至其同系抗原。為評估補體活化作用，可 進行 CDC 檢測，例如在 Gazzano-Santoro 等人，J· /mmwwo/. Me认<9办 202 :163 (1996)中所述者。 "經單離'’，當用以描述本文中所揭示之各種多肽與抗體時 ，係意謂已自其製造環境之成份被確認、分離及/或回收之 多肽或抗體。經單離之多肽較佳為未與來自其製造環境之 所有其他成份缔合。其製造環境之污染成份，譬如由於重 組轉染細胞所造成者，係為典型上會干擾多肽之診斷或治 療用途之物質，且可包括酵素、激素及其他蛋白質性或非 蛋白質性溶質。在較佳具體實施例中，多肽將被純化⑴至 足以獲得N-末端或内部胺基酸順序之至少15個殘基之程度 ，利用旋轉杯定序儀，或（2)在非還原或還原條件下，使用 柯麥西（Coomassie)藍色或較佳為銀染色，藉由SDS-PAGE至均 一性。但是，一般而言，經單離之多肽或抗體係藉由至少 一個純化步驟製成。 使本文之多肽與抗體編碼之"經單離"核酸分子，係為經確 認且分離自通常在製造環境中與其缔合之至少一種污染物 核酸分子之核酸分子。經單離之核酸較佳係為未與製造環 境有關聯之所有成份缔合。使本文之多肽與抗體編碼之經 單離核酸分子，係呈一種形式，其不為本性上所發現之形 92129 • 21 - 13^7820 in。因此，經單離核酸分予係與使本文之自然地存 ”V.田月《多肤與抗體編碼之核酸有區別。 ”控制順序"一詞係指在 . 在待疋佰王生物體中用以表現可操作 地連結之編碼順戽所 斤’、么、疋dna順序。適用於例如原核生 物疋控制順序，包括啟 動子，視情況為操縱子順序及核糖 肖这、、’t>泛位^置。pj >4t7古±> , 、核，，田胞係利用啟動子、聚腺甞酸化作 用訊息及增強子。
當核酸被放置於盥其 ^^ A β , 興另—種核酸順序之功能性關係中時，其 係為"可操作地逵处" 連〜。例如，供預順序或分泌前導物用之 DNA係可操作地連結至 夕 供多肽用<DNA，若其被表現為參與 二肽分泌之預蛋白質時；啟動子或增強子係可操作地連結 ^編碼順序’若其影響順序之轉錄時；或核糖體結合位置 =操作料結至編碼婦，若其係被定位以㈣轉譯時 叙而δ ’可操作地連結"係意謂被連結之順序為 ，接’而在分泌前導物之情況中為鄰接且在讀取期中。但 疋’增強子並非必須是鄰接。連結係在合宜限制位置，藉 由連接而達成。若此種位置未存在，則合成寡料酸接: 子或連結基’係根據習用實務使用。 "經抗原衫部位標記"-詞’當^本文中使用時，係指包 含經稠合至”標記多肽”之本文中所述多肽或抗體之甚合多 肽。標記多肽具有足夠殘基，以提供抗原^部位，抗^ 可對其製成’而又足夠短’以致其不會干擾其所稠合多： ^活性。標記多肽較佳亦為相當地獨特，Μ抗^會實 質上與其他抗原*定部位交又反應。適當標記多狀一般具 92129 22· 1357820 有至少六個胺基酸殘基，且經常在約8與50個胺基酸殘基之 間（較佳係在約10與20個胺基酸殘基之間）。 於本文中使用之"免疫黏連素"一詞係指稱似抗體分子，其 係將異種蛋白質（”黏連素"）之結合專一性與免疫球蛋白恒定 功能部位之效應子功能合併。於結構上，免疫黏連素係包 含胺基酸順序與免疫球蛋白恒定功能部位順序之融合物， 該胺基酸順序具有所要之結合專一性，其係不為抗體之抗 原辨識與結合位置（意即係為”異種”）。免疫黏連素分子之黏 連素部份，典型上為鄰接胺基酸順序，至少包含受體或配 位體之結合位置。在免疫黏連素中之免疫球蛋白恒定功能 部位順序，可得自任何免疫球蛋白，譬如IgG-1、IgG-2、IgG-3 或 IgG-4 亞型，IgA (包括 IgA-1 與 IgA-2)、IgE、IgD 或 IgM。Ig 融 合物較佳係包括本文中所述多肽或抗體之功能部位在Ig分子 内之至少一個可變區域位置上之取代。在一項特佳具體實 施例中，免疫球蛋白融合物包括IgGI分子之鉸鏈、CH2及CH3 ，或鉸鏈、CHI、CH2及CH3區域。免疫球蛋白融合物之製 造，亦參閱1995年6月27日頒予之美國專利5,428，130。 ”安定”調配物為在儲存時，於其中之蛋白質基本上保持其 物理與化學安定性及完整性之調配物。用於度量蛋白質安 定性之各種分析技術，可於此項技藝中取得，且係被回顧 於废蛋冷 f 桌###, 247-301，Vincent Lee 編著，Marcel Dekker 公司，New York, New York, Pubs. (1991)，與 Jones, A. IQ : 29-90 (1993)。安定性可在所選定之溫度下，歷經所選 定之時期進行度量。關於快速篩檢，可將調配物在40°C下保 92129 -23- 1357820 持2週至1個月，此時度量安定性。在調配物欲被儲存於2_8 °C下之情況中’通常調配物應在3〇。(：或4(TC下安定達至少i個 月，及/或在2_8°C下安定達至少2年。在調配物欲被儲存於3〇 °C下之情況中，通常調配物應在3〇它下安定達至少2年，及 /或在40°C下安定達至少6個月《例如，在儲存期間聚集之 程度可作為蛋白質安定性之指標使用。因此，"安定"調配 物可為其中低於約10%，而較佳係低於約5%之蛋白質以聚 集體存在於調配物中之調配物。在其他具體實施例中，於 調配物儲存期間之聚集體形成上之任何增加均可測得。 經重配"之調配物為已藉由使已凍乾之蛋白質或抗體調配 物溶解於稀釋劑中，以致使蛋白質遍及於其中而製成之調 配物。經重配之調配物係適合對欲以吾人感興趣之蛋白質 治療之病患投藥（例如非經腸投藥），而在本發明之某些具 體實施例中，可為適合皮下投藥者。 "等渗性"調配物為具有基本上與人類血液相同滲透壓者。 等滲性調配物一般係具有滲透壓約250至350 mOsm。”低滲性 ”一詞係描述具有低於人類血液滲透壓之調配物。相應地， 咼滲性” 一詞係用以描述具有高於人類血液滲透壓之調配 物。等滲性可使用例如蒸氣壓或冰冷凍型滲透壓力計度量 。由於添加鹽及/或緩衝劑之結果，故本發明之調配物為高 滲性。 經重配”調配物為已藉由使已凍乾之蛋白質調配物溶解於 稀釋劑中’以致使蛋白質被分散於經重配調配物中而製成 之配凋配。經重配調配物係適合對欲以吾人感興趣之蛋白 92129 -24- 1357820 質治療之病患投藥（例如非經腸投藥），而在本發明之某些 具體實施例中，可為適合皮下投藥者。 "藥學上可接受之酸"包括無機與有機酸，其在經調配之濃 度與方式下為與毒性。例如，適當無機酸包括鹽酸、過氯 酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、磺胺 酸、磷酸、碳酸等。適當有機酸包括直鏈與分枝鏈烷基、 芳族、環狀、環脂族、芳基脂族、雜環族，飽和、不飽和 ，單、二-及三-羧酸，包括例如甲酸、醋酸、2_羥基醋酸、 三氟醋酸、苯基醋酸、三甲基醋酸、第三_丁基醋酸、鄰胺 基苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-氧基丙酸、丙二酸、環戊 丙酸、環戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、 3-(4-羥苯甲醯基）苯甲酸、2-乙醯氧基-苯甲酸、抗壞血酸、桂 皮酸、月桂基硫酸、硬脂酸、黏康酸、苯乙醇酸、琥泊酸 、雙羥莕酸、反丁缔二酸、蘋果酸 '順丁埽二酸、幾基順 丁烯二酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、糖 酸、葡萄糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥j自酸 、柳酸、苯二甲酸、棕櫚酸、棕美（palme⑹酸、硫氰酸、甲 烷磺酸、乙烷磺酸、1，2-乙烷二磺酸、2-羥基乙烷磺酸、苯 磺酸、4-氣苯磺酸、萘-2-磺酸' 對-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4_ 曱基雙環并[2.2_2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4，-亞曱基雙_3_ (禮基-2-埽-1-羧酸）、羥基蓁甲酸。 ”藥學上可接受之鹼”包括無機與有機鹼，其在經調配之濃 度與方式下為無毒性。例如，適當鹼包括製自可形成無機 鹼者’金屬，譬如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅 92129 •25· 1357820 、短、銘’ N-甲基葡萄糖胺、嗎福，林、六氫p比淀，及有機 無毒鹼’包括一級、二級及三級胺，經取代之胺類、環狀 胺類，及驗性離子交換樹脂[例如N(R')4 + (其中R，係獨立為η 或Ci _4燒基，例如按' Tris)]，例如異丙胺 '三甲胺、二乙胺 、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙胺基乙醇、三甲胺、二 環己基胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡驗、普魯卡因 、海巴胺、膽驗、甜菜驗、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄 糖胺、可可鹼、嘌呤、六氫吡畊、六氫吡啶、N乙基六氫吡 峻、聚胺樹脂等。特佳有機無毒鹼為異丙胺、二乙胺、乙 醇胺、三甲胺 '二環己基胺、膽鹼及咖啡鹼。 可與本發明一起使用之其他藥學上可接受之酸與鹼，包括 衍生自胺基酸者，例如組胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、天門 冬胺酸、麩胺酸、離胺酸及天冬素。 "藥學上可接受"之緩衝劑與鹽，包括衍生自上文指示之酸 與驗，酸與驗加成鹽者°特定緩衝劑及/或鹽包括組胺酸、 號拍酸鹽及醋破鹽。 ":乾劑”為一種分子，當其與吾人感興趣之蛋白質合 ;乾及P遠後儲存時，會顯著地防止 之化學及/或物珥τα八 义平低蛋白賀 ϋ @、 、女疋性。舉例之凍乾保護劑包括糖類及 其相應之糖醇類；胺其 、 ν 胺，嬖如甜菜路._、’ s如麩胺酸單鈉或組胺酸；甲 # ^ ，易溶鹽，譬如硫酸鎂；多元醇，蓉如二 工或較同分子量糖醇類，例如甘 ： 阿拉伯糖醇、木擁萨 ^赤絲溱醇、 糖％、花楸醇及甘露醇；丙-醇，@ 7 -醇；PlUr〇nics® ;及並 內一醉，聚乙一 八、，且合。其他舉例之滚乾保護劑包括甘油 92129 -26 - 丄力7820 ^月膠，及糖類，蜜二糖、落葉松糖、植物蜜糖、甘露三 糖及水蘇四糖。還原糖之實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖 麥牙果糖、異麥芽果糖及乳果糖。非還原糖之實例包括 ^自糖醇類及其他直鏈多元醇之多經基化合物之非還原糖 較佳糖醇類為單料，尤其是藉由雙酷譬如乳糖、、麥 牙糖 '乳果糖及麥芽果糖之還原所獲得之化合物。糖誓倒 基:為無論是葡萄糖菩或半乳糖答。糖醇類之其他實例為 ::糖醇、:麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽果糖。較佳凍乾保 4诏為非還原糖海藻糖或蔗糖。 ;立乾保叹山系以凍乾保護量”被添加至預凍乾調配物，其 係:謂於滚乾保護量之凌乾保護劑存在下，在蛋白質冷= 乾燥《後，於凍乾與儲存時， 7 化學安定性及完整性。 負基本上保持其物理與 =製備本發明之降㈣度調㈣時， 《賦形劑以及其他添加劑 更用上又列舉 才不會增加調配物之黏度。“…濃度下添加時， ”藥學上可接受之糖"為—種分 a 白質合併時，會顯著地防止或降低二、^人感興趣之蛋 及/或物理不安定性。當調二:=在:存時之化學 :藥學上可接受之糖類，，亦可稱重配時： 類及其相應糖醇類包括：胺基酸w舉例之糖 酸胺，譬如甜菜驗；易溶鹽，=域胺酸單納或組胺 譬如三羥或較高分子量糖醇類&如硫酸鎂’·多元醇， 漢醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、花二露:聚:::絲 92129 •27· 1357820 聚乙二醇；Plur〇nics® ;及其組合。其他 括甘油與明膠，及糖類，蜜二糖 ^乾保護劑包 甘露三糖及水蘇四糖。還原糖之實萄=糖、 ^ 葡句糖、麥芽擁 、芽果糖、異麥芽果糖及乳果糖。非還原糖之: 自糖醇類及其他直鏈多元醇之多窥基化合物之: 運原糖甘。較佳糖醇類為單料，尤其是藉由雙㈣ 芽、乳果糖及麥芽果糖之還原所獲得之化合物。： 相基可為無論是㈣料或半乳料。料類之其他2 例為“糖每、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽果糖。較佳藥 學上可接受之糖類為非還原糖海藻糖或蔗糖。 藥學上可接受之糖類係以"保護量"被添加至調配物（例如 預束乾），其係意謂蛋白質在儲存期間(例如在重配 後）基本上保持其物理與化學安定性及完整性。 此處吾人感興趣之"稀釋劑”為藥學上可接受（對於投予人 類為安全且無毒性）且可用於製備液體調配物者，譬如於凍 乾後經重配之調配物。舉例之稀釋劑包括無菌水、注射用 制菌水(BWFI)、pH緩衝之溶液（例如磷酸鹽緩衝之鹽水）、無 菌鹽水洛液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在一項替代具髎 實施例中’稀釋劑可包括鹽及/或緩衝劑之水溶液。、 "防腐#1"為-種可被加人本文之調啤物中以降低細菌活性 之化合物。防腐劑之添加可例如幫助多次使用（多重劑量） 調配物之製造。有效防腐劑之實例包括氯化十八基二甲基 卞基铵、氯化六甲雙按、氯化爷貌氧銨（氯化燒基宇基二甲 基銨之/m 口物，其中燒基為長鏈化合物）及氣化芊乙氧銨。 92129 -28- 其他防腐劑類型包括芳族醇 垸基對羥基苯甲酸酯類，壁 兒条驗、間苯二盼、環己醇 佳防腐劑為芊醇。 類，譬如酚、丁基與苄基醇， 如對羥基苯甲酸甲酯或丙醋、 3-戊醇及間-甲紛。本文之最 /口療係指治療處理及預防 朴杨止措施。需要治療者包括 已，、有病症者’以及其中病症係欲被預防者。 對治療目的而言’ ”哺乳動物，，係指被分類為哺乳動物之任 何動物，包括人類，家庭與農場動物，及動物 寵Γ動物’譬如狗、馬、兔子、牛、諸、大頻氣、沙鼠 老乳3 、大白鼠、料。哺乳動物較佳為人類。 ”病症:為將得利於以蛋白質治療之任何症狀。其包括慢性 陡病症或疾病’包括使哺乳動物易罹患討論中病症之 病理學症狀。於本文中欲被治療病症之非限制性實例，包 括癌瘤與過敏反應。 "治療上有效量"係為至少是為達成特定病症之可度量改善 或預防所需要之最低濃度。已知蛋白質之治療上有效量係 為此項技藝中所習&，而後文所發現蛋白質之有效量，可 藉由標準技術測定’其係良好地在熟練技師譬如—般醫師 之技術範圍内。 於本文中使用之"黏度"可為"動黏度”或，，絕對黏度"。π動 黏度"為流體在重力影響下抵抗流動之一種度量方式。當兩 種等sa積流體被放置在相同毛細管黏度計中，且允許藉由 重力流動時，黏稠流體係比較不黏稠流體花費較長時間流 經毛細管。若一種流體花費2〇〇秒以完成其流動，而另—種 92129 -29· 1357820 流體花費400秒’則於動黏度尺度上，第二種流體係為第一 種之兩倍黏稠。"絕對黏度"，有時稱為動態或單純黏度， 係為動黏度與流體密度之乘積： 絕對黏度=動黏度X密度 動黏度之尺度為L2/T，其中L為長度，而T為時間。通常 ，動黏度係以厘史（cSt)表示。動黏度之SI單位為平方毫米/ 秒，其係為1 cSt。絕對黏度係以厘泊（cP)為單位表示。絕對 黏度之SI單位為毫巴斯卡-秒（mPa-s)，其中1 cP = 1 mPa-s。 於本文中使用之"抗組織胺”為一種拮抗組織胺生理作用之 藥劑。組織胺結合至其受體氏與H2，會造成特徵性過敏性 病徵與作用或搔癢、發紅、腫脹等。許多抗組織胺類係藉. 由阻斷組織胺結合至其受體HI、H2而發生作用；但是，咸 認其他係藉由抑制組織胺釋出進行操作。抗組織胺類之實 例為氯吩尼拉明（chlorpheniramine)、苯海拉明（diphenhydramine)、 異丙11 井（promethazine)、色甘酸納、阿斯特米唾（astemizole)、氮 塔丁（azatadine)順丁烯二酸鹽、溴苯吡胺順丁烯二酸鹽、吡氯 _氧胺順丁缔二酸鹽、西替利11 井（cetirizine)鹽酸鹽、克列馬斯 ί丁（clemastine)反丁烯二酸鹽、西普洛庚汀（cyproheptadine)鹽酸鹽 、地溴苯p比胺（dexbrompheniramine)順丁蹄二酸鹽、地氯苯p比胺 (dexchlorpheniramine)順丁晞二酸鹽、乘暈寧（dimenhydrinate)、鹽 酸苯海拉明、苯p比拉明（doxylamine)號珀酸鹽、非克索吩達定 (fexofendadine)鹽酸鹽、特吩拿定（terphenadine)鹽酸鹽、井鹽 酸鹽、若拉提定（loratidine)、敏克靜（meclizine)鹽酸鹽、p比甲胺 (tripelennamine)檸檬酸鹽、ρ比甲胺鹽酸鹽、三普利定（triprolidine) 92129 -30- 1357820 鹽酸鹽。 於本文中使用之"枝氣管擴張藥”係描述拮抗或逆轉枝氣管 縮小之藥劑，其為一種典型上發生在早期氣喘反應中，造 成降低肺容量與寬度短小之生理事件。枝氣管擴張藥之實 例包括腎上腺素，一種寬廣作用之α與/3-腎上腺素能劑，及 /3-腎上腺素能藥物舒喘寧（albuterol)、峨丁特醇(pirbuterol)、間 丙特端醇（metaproterenol)、沙美特醇（salmeterol)及新異丙腎上腺 素。枝氣管擴大亦可經過黃嘌呤之投藥而達成，其包括胺 基非林與茶驗。 於本文中使用之”類皮質糖"係描述具有消炎活性之類固醇 為基礎之藥劑。類皮質糖係常用以使晚期氣喘反應減弱。 類皮質糖之實例包括潑尼松、二丙酸氯地米松、丙酮化氟 羥脫氫皮留醇、氟尼梭來、/5-美塞松、布蝶松化物、地塞 米松、氟氫化可體松醋酸鹽、氟尼梭來、丙酸福路替卡松 (fluticasone propionate)、氫基可體松、甲基氫化潑尼松、氫化潑 尼松、潑尼松及氟羥脫氫皮質留醇。 於本文中使用之’'非類固醇消炎藥物”或"NSAID”，係描述 並非以類固醇為基礎之具有消炎活性之藥劑。NSAID之實例 包括乙酿胺吩（acetaminophen)、阿斯匹靈、溴吩拿克（bromfenac) 鈉、二氯苯胺苯乙酸鈉、二氟苯柳酸、依托多拉克（etodolac) 、菲諾丙吩（fenoprofen) #5、敦雙丙吩、異丁苯丙酸（ibuprofen) 、'^卜朵美薩辛(indomethacin)、酮基丙吩（ketoprofen)、甲氯滅酸 鹽納、甲滅酸、那布美東（nabumetone)、那丙新（naproxen)、那 丙新鈉、氧基苯基保泰松、苯基保泰松、p比氧胺（piroxicam) 92129 -31 - 1357820 、沙林達克（sulindac)、四苯醮ι»比p各乙酸（tolmetin)鋼。 II.進行本發明之模式 A.多肽與抗體製劑 下文說明主要係關於本文中所述多肽或抗體之製造，其方 式是將已使用含有使其編碼之核酸之載體所轉變或轉染之 細胞進行培養，並純化所形成之蛋白質或抗體。當然，意 欲涵蓋替代方法，其係為此項技藝中所習知，可被採用以 製備此種多肽或抗體。例如，此種順序或其部份可藉由直 接肽合成，使用固相技術製成[參閱，例如Stewart等人，琢希 双合 4，W.H. Freeman 公司，San Francisco, CA (1969) ; Merrifield, /· /m· C/zew. &c.，Si : 2149-2154 (1963)]。活體外蛋白質合成可使用手 動技術或藉由自動化進行。自動化合成可例如使用應用生 物系統肽合成器（Foster City，CA)，使用製造者之說明書達成。 本文中所述蛋白質或抗體之不同部份可以化學方式個別地 合成，且使用化學或酵素方法合併。 1. 使本文中所述蛋白質編碼之DNA之單離 使本文中所述蛋白質編碼之DNA可得自cDNA基因庫，其 係製自咸認具有其相應niRNA且使其在可偵測含量下表現之 組織。因此，此種人類蛋白質編碼用之DNA可合宜地得自 製自人類組織之cDNA基因庫，譬如在實例中所述者。蛋白 質編碼用之基因亦可由基因組庫或藉已知合成程序（例如自 動化核酸合成）獲得。 基因庫可以經設計以確認吾人感興趣基因之探測物（譬如 至少約20-80個鹼基之寡核苷酸）篩檢。以所選擇之探測物篩 92129 -32- 1357820 檢cDNA或基因組庫，可使用標準程序進行，譬如在Sambrook 等人，分子為^貪禮.*紫發皇手母(New York : Cold Spring Harbor 實驗室出版社，1989)中所述者。一種使所要基因編碼之基因 單離之替代方式，是使用PCR操作法[Sambrook等人，如前文出 處；Dieffenbach 等人，尸Ci?歹/ #.* 紫發 t 手艰（Cold Spring Harbor 實驗室出版社，1995)]。 下文實例係描述篩檢cDNA基因庫之技術。經選擇作為探 測物之寡核甞酸順序，應具有足夠長度且足夠不含糊，以 致偽陽性係被降至最低。此寡核苷酸較佳係經標識，以致 使其在雜化至被篩檢基因庫中之DNA時可被檢出。標識方 法係為此項技藝中所習知，且包括利用放射性標識物，例 如32P-標識之ATP，生物素基化作用或酵素標識。包括中等 嚴厲與高嚴厲之雜化條件，係被提供於Sambrook等人，如前文 出處中。 在此種基因庫篩檢方法中確認之順序，可與經寄存並可於 公開資料庫譬如基因銀行（Genbank)或其他私人順序資料庫中 取得之其他已知順序比較與對準。在此分子或橫越全長順 序之經界定區域内之順序同一性（在無論是胺基酸或核甞酸 層次下），可使用此項技藝中已知及如本文中所述之方法測 得。 具有蛋白質編碼順序之核酸可以下述方式獲得，使用本文 中所揭示第一次推論之胺基酸順序，篩檢經選擇之cDNA或 基因組庫，且若必要則使用如在Sambrook等人，如前文出處中 所述之習用引物增長程序，以偵測mRNA之先質與處理中間 92129 -33- 1357820 物，其可能未曾被逆轉錄至cDNA中。 2. 皇主細胞之選擇與轉變 宿主細胞係以表現或無性繁殖載體進行轉染或轉變，該載 體含有本文中所述用於製造之蛋白質或抗體，並在習用營 養物培養基中培養，該培養基係按適當方式變性，以誘發 啟動子、選擇轉化株或放大使所要順序編碼之基因。培養 條件，譬如培養基、溫度、pH等，可由熟練技師選擇，無 需過度實驗。一般而言，關於使細胞培養物之生產率達到 最大程度之原理、擬案及實用技術，可參閱嘑舁鳶#鈿應 立##街··#居途徑，M. Butler編著（IRL出版社，1991)與 Sambrook等人，如前文出處。 真核細胞轉移感染與原核細胞轉變之方法係為一般熟練技 師所已知，例如CaCl2、CaP04、微脂粒所媒介及電擊穿孔。 依所使用之宿主細胞而定，轉變係使用對此種細胞適當之 標準技術進行。採用氯化#5之#5處理，如在Sambrook等人，如 前文出處中所述者，或電擊穿孔，一般係用於原核生物。 以廣邊土禮#菌感染係用於某些植物細胞之轉變，如由Shaw 等人，Gene，21 : 315 (1983)及 1989 年 6 月 29 曰公告之 WO 89/05859 所述者。對於未具有此種細胞壁之哺乳動物細胞，可採用 Graham 與 van der Eb，Wro/ogy，52 : 456-457 (1978)之磷酸鈣沉澱方法 。哺乳動物細胞宿主系統轉移感染之一般方面，已被描述 於美國專利4,399,216中。轉變至酵母中，典型上係根據 VanSolingen 等人，: 946(1977)與 Hsiao 等人， 灰«Scz·. : 3829 (1979)之方法進行。但是，引進DNA至 92129 -34- 1357820 細胞中之其他方法，譬如藉由核顯微注射，電擊穿孔，與 完整細胞之細菌原生質體融合，或聚陽離子，例如聚布蘭 (polybrene)、聚鳥胺酸，亦可使用。關於轉變哺乳動物細胞 之各種技術，可參閱Keown等人，游荸才法，185 : 527-537 (1990) 與 Mansour 等人，Mz/wre, 336 : 348-352 (1988)。 用於無性繁殖或表現本文載體中之DNA之適當宿主細胞， 包括原核生物、酵母或較高等真核生物細胞。適當原核生 物包括但不限於真細菌，譬如革蘭陰性或革蘭陽性生物體 ，例如腸桿菌科，譬如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌種係公 開地可取得，譬如大腸桿菌K12菌種MM294 (ATCC 31,446);大 腸桿菌 X1776 (ATCC 31，537);大腸桿菌菌種 W3110 (ATCC 27,325) 及K5 772 (ATCC 53,635)。其他適當原核生物宿主細胞包括腸桿 菌科，譬如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌，腸桿菌屬、歐文 氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形菌屬，沙門桿菌屬，例如鼠 傷寒沙門氏桿菌，沙雷氏菌屬，例如黏質沙雷氏菌，及志 賀氏菌屬，以及桿菌，譬如枯草桿菌與地衣芽孢桿菌（例如 地衣芽孢桿菌41P，揭示於1989年4月12日公告之DD 266,710 中），假單胞菌屬，譬如綠膿假單胞菌與鏈霉菌。此等實例 係為說明性而非限制性。菌種W3110為一種特佳宿主或母體 宿主，因其係為一種供重組DNA產物發酵用之共同宿主菌 種。宿主細胞較佳係分泌最少量之蛋白分解酵素。例如， 菌種W3110可被變性，以在使對於宿主為内源之蛋白質編碼 之基因中達成基因突變，其中此種宿主之實例包括大腸桿 菌W3110菌種1A2，其具有完全基因型tod ;大腸桿菌W3110 92129 -35- 1357820 菌種9E4，其具有完全基因型如;大腸桿菌W3110菌種 27C7 (ATCC 55,244)，其具有完全基因型 £75 (WgF- /acj/矽;大腸桿菌W3110菌種37D6，其具有完全 基租雙 tonA ptr3 phoA El5 (argF-lac)169 degP ompTrbs7 ilvG kanr ·，大 腸桿菌W3110菌種40B4，其係為菌種37D6，具有非康霉素抗 藥性degP缺失突變；及具有突變型胞漿周圍蛋白酶之大腸桿 菌菌種，揭示於1990年8月7曰頒予之美國專利4,946,783中。 或者，無性繁殖之活體外方法，例如PCR或其他核酸聚合酶 反應，均適合。 除了原核生物以外，真核細胞微生物，譬如絲狀真菌或酵 母，係為使本文中所述蛋白質或抗體編碼之載體用之適當 無性繁殖或表現宿主。釀酒酵母係為常用較低等真核生物 宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母（Beach與Nurse，Atowre, 22Q :140 [1981] ; 1985年5月2日公告之EP 139,383);克魯維酵母宿 主（美國專利 4,943,529 ; Fleer 等人，所o/：Tec/mo/(?gy，2 : 968-975 (1991)) ，譬如乳酸克魯維酵母（MW98-8C、CBS683、CBS4574; Louvencourt 等人，J.Bacterio!.，154(2) : 737-42 [1983])、脆壁克魯維酵母 (ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母（ATCC 16,045)、威克克魯 維酵母（ATCC 24，178)、華提克魯維酵母（ATCC 56,500)、果德克 魯維酵母（ATCC 36,906 ; Van den Berg 等人，历o/rec/zw/ogy, K : 135 (1990))、耐溫克魯維酵母及馬克斯克魯維酵母；yarrowia (EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母（EP 183,070 ; Sreekrishna 等人， /及加28 : 265-278 [1988]);假絲酵母屬；裸異壺木霉 (EP 244,234);粗糙脈孢菌（Case 等人，Pmc.他仏 Zcail 5W. 及： 92129 •36· 1357820 5259-5263 [1979]);許旺酵母屬，譬如西方許旺酵母（1990年10 月31日公告之EP 394,538);及絲狀真菌，譬如脈孢菌屬、青 霉屬、Tolypocladium(1991 年 1 月 10 曰公告之 WO 91/00357)，以及 曲霉屬宿主，譬如構巢曲霉（Ballance等人，历oc/iem.所op/听. Commun·，ill : 284-289 [1983] ; Tilbum 等人，: 205-221 [1983] ;Yelton 等人，尸rac. Α^/·也以.to·. : 1470-1474 [1984])與黑曲 霉（Kelly 與 Hynes，£·Μ5(9/·，1 : 475-479 [1985])。親甲基酵母係適 合此處，且包括但不限於能夠在曱醇上生長之酵母，選自 包括漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克勒克酵母屬、畢赤酵母 屬、酵母屬、球擬酵母科及紅酵母屬之種屬。舉例之此酵 母種類之特定物種清單可參閱C. Anthony，f差###之立# 死學，269 (1982)。 用於表現本文中所述多肽與抗體之糖基化形式之適當宿主 細胞，係衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包 括昆蟲細胞，譬如蜂蠅屬S2與夜蛾Sf9，以及植物細胞。可 使用哺乳動物宿主細胞系之實例包括中國大頰鼠卵巢（CHO) 與COS細胞。更特殊實例包括藉由SV40轉變之猴子腎臟CV1 細胞系（COS-7, ATCC CRL 1651);人類胚胎腎臟細胞系（293或293 細胞，經次代無性繁殖於懸浮培養物中供生長，Graham等人， /. Gen Hro/.，36 : 59 (1977));中國大頰鼠卵巢細胞 / -DHFR (CHO, Urlaub 與 Chasin，PradiHflii Sci：·. 77 : 4216 (1980));老 鼠赛托利氏細胞（TM4, Mather，历〇/. i?印r〇i/.，23 : 243-251 (1980));人
C 類肺細胞（W138, ATCC CCL 75);人類肝臟細胞（Hep G2, HB 8065) :及老鼠乳房腫瘤（MMT 060562, ATCC CCL 51)。咸認適當宿主 92129 -37· 1357820 細胞之選擇係在此項技藝之技術範圍内。 1 可複製載體擇邀剎田 使本文中所述多肽與抗體編碼之核酸（例如CDNA或基因組 DNA)可被插入可複製載體中，供無性繁殖之放大）或供 表現。各種載體係公開地可取得。載體可呈例如質粒、黏 接質體、病毒粒子或噬菌體之形式。適當核酸順序可藉由 多種程序插入載體中。一般而言，DNA係使用此項技藝中 已知（技術插入適當核酸内切限制酶位置。載體成份一般 係包括但不限於一或多個訊息順序、一個複製來源、—或 多個標記基因、一個增強子構件、一個啟動子及一個轉錄 終止順序。含有一或多個此等成份之適當載體之建構，係 採用熟練技師已知之標準連接技術。 多肽或抗體之重組製造可不僅直接地達成，而且作為與異 種多肽之融合多肽。異種部份可為訊息順序或其他多肽， 具有成熟蛋白質或多肽之專一分裂位置在N_末端。一般而 T ’訊息順序可為載體之成份，或其可為使多肽或抗體編 碼之DNA之一部份，其係被插入載體中。訊息順序可為原 核細胞訊息順序’選自例如鹼性辯酸酶、青霉素酶、㈣或 熱安定腸毒素Π前導物。對酵母分泌物而言，此訊息順序可 為例如酵母轉化酶前導物’ α因子前導物（包括酵母屬與克 魯維酵母因予前導物，後者係描述於美國專利5,010，182中） 或酸性磷酸酯酶前導物，白假絲酵母葡糖澱粉酶前導物（199〇 年4月4日公告之ερ362，179)，或在199〇年11月15日公告之 WO 90/13646中所述之訊息。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動 92129 •38· 1357820 物訊息順序可用以導引蛋白質之分泌，譬如來自相同或相 關物種所分泌多肽之訊息順序，以及病毒分泌前導物。 表現與無性繁殖兩種載體均含有使得載體能夠在一或多種 經選擇宿主細胞中複製之核酸順序。此種順序對多種細菌 、酵母及病毒係為習知。得自質粒PBR322之複製來源，係適 用於大部份革蘭陰性細菌，2/z質粒來源係適用於酵母，而 各種病毒來源（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用 於哺乳動物細胞中之無性繁殖載體。 表現與無性繁殖載體典型上含有選擇基因，亦稱為可選擇 標記物。典型選擇基因係使碼蛋白質編碼，該蛋白質⑻係 賦予對於抗生素或其他毒素之抗藥性，例如胺苄青霉素、 新霉素、胺甲喋呤或四環素，（b)補充需特別生長因子缺陷 ，或（c)供應無法得自複雜培養基之關鍵營養物，例如使桿 菌之D-丙胺酸消旋酶編碼之基因。 哺乳動物細胞之適當可選擇標記物之實例，係為使得能夠 確認細胞足以吸收使本文中所述之多肽或抗體編碼之DNA 順序者，譬如DHFR或胸腺核甞激酶。當採用野生型DHFR時 ，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之CHO細胞系，按Urlaub等 人，Proc. Ato/·如以.22 : 4216 (1980)所述之方式製備與繁 殖。供使用於酵母之適當選擇基因，係為存在於酵母質粒 YRp7 中之 trpl 基因[Stinchcomb 等人，iVaiwre, 282· 39(1979)； Kingsman 等人，Gene. 2: 141 (1979); Tschemper 等人，10 : 157 (1980)]。trpl 基因係對於缺乏在色胺酸中生長能力之酵母之突變型菌種 提供選擇標記物，例如ATCC編號44076或PEP4-1 [Jones，遣/#荸， 92129 -39- 1357820
Si: 12(1977)]。 表現與無性繁殖載體經常含有可操作地連結至此種DNA順 序之啟動子，以導引mRNA合成。被多種潛在宿主細胞辨識 之啟動子係為習知。適合與原核細胞宿主一起使用之啟動 子，包括石-内醯胺酶與乳糖啟動子系統[Chang等人，Mz/wre, 22^ :615 (1978) ; Goeddel 等人，iVaft/re, 2S1 : 544 (1979)]、鹼性磷酸酶 、色胺酸（trp)啟動子系統[Goeddel，M/c/eid^i?^s_，盆：4057 (1980) ;EP 36,776]，及雜種啟動子，譬如tac啟動子[deBoer等人， Proc. Mzi/· Jaw/· <Sa·· C/&4, Μ : 21-25 (1983)]。供使用於細菌系統中 之啟動子，亦將含有可操作地連結至此種DNA順序之Shine-Dalgamo (S.D_)順序。 與酵母宿主一起使用之適當促進順序之實例，包括對3-磷 酸甘油酸激酶之啟動子[Hitzeman等人，《/· 5w/· C/im.，251: 2073 (1980)]或其他糖原酵解酵素[Hess 等人，《/. /ί/ν.五2 : 149 (1968); Holland,历oc/iem加〇；，17: 4900(1978)]，譬如烯醇酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖 激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸 激酶、鱗酸丙糖異構酶、鱗酸葡萄糖異構酶及葡萄糖激酶。 其他酵母啟動子，其係為具有其他藉由生長條件控制之轉 錄優點之可謗發啟動子，其係為對乙醇去氫酶2、異細胞色 素C、酸性磷酸酯酶、與氮新陳代謝作用有關聯之降解性酵 素、金屬硫酮素、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及負責麥芽糖與半 乳糖利用性之酵素之啟動子區域。供使用於酵母表現之適 當載體與啟動子，係進一步描述於EP73,657中。 92129 -40- 1357820 來自哺乳動物宿主細胞中載體之轉錄可加以控制，例如藉 由得自病毒基因組之啟動子，該病毒譬如多瘤病毒、鳥痘 病毒（1989年7月5日公告之船，211，5〇4)、腺病毒（譬如腺病毒 2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄 酶病毒、肝炎·Β病毒及猿病毒4〇(SV4〇)，得自異種哺乳動物 啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，及得 自熱衝擊啟動’其條件{此種啟動子可與宿纟細胞系統 相容。 使本文多肽或抗體編碼之核酸藉由較高等真核生物之轉錄 ，可藉由插入增強子順序至載體中而被增加。增強子係為 DNA4順式作用元素，經常為約1〇至鳩p，其係作用於啟 動子上，以增加其轉錄。許多增強子順序目前係得知自哺 乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、心胎蛋白及 胰島素）。但是，典型上吾人將使用增強子真核細胞病毒。 實例包括在#製來源遲生侧上之Μ㈣強子伽1〇〇肩，巨 細胞病毒早期啟動子増強子，在複製來源遲生侧上之多瘤 病毒增強子及腺病毒增強h增強子可在對編碼順序之位 置5或3處’疊接至载體中，但較佳係位於來自啟動子之位 置5丨。 被使用於真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、 動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）中之表現 載體’亦將含有終止轉錄及使她NA安定化所必須之順序。 此種順序通常可得自真核生物或病毒DNA或eDNA之5,及有 時為3,未轉譯區域。此等區域含有核#酸鏈段，在使本文中 92129 -41· 1357820 所述多肽或抗體編碼之mRNA之未轉譯部份中，被轉錄為聚 腺苷酸化片段。 適用於重組脊椎動物細胞培養物中合成本文中所述多肽或 抗體之又其他方法、載體及宿主細胞，係描述於Gething等人， Nature, 291 : 620-625 (1981) ; Mantei 等人，2E1 ： 40-46(1979)； EP 117,060;及 EP 117,058 中。 4. 偵測基因放大作用/表現 基因放大作用及/或表現可在試樣中直接度量，例如藉習 用Southern沾吸、Northern沾吸以定量mRNA之轉錄[Thomas, Prac.A^/· 乂 cad *Scz_.C/&4，ZZ: 5201-5205 (1980)]，點沾吸（DNA分析） 或原位雜化，使用經適當標識之探測物，以本文中所提供 之順序為基礎。或者，可採用可辨識特定雙螺旋之抗體， 包括DNA雙螺旋、RNA雙螺旋及DNA-RNA雜種雙螺旋或DNA-蛋白質雙螺旋。此等抗體依次可經標識，且可進行檢測， 其中雙螺旋係結合至一種表面，以致在雙螺旋於該表面上 形成時，經結合至雙螺旋之抗體之存在可被檢出。 或者，基因表現可藉由免疫學方法度量，譬如細胞或組織 切片之免疫組織化學染色，及細胞培養物或體液之檢測， 以直接定量基因產物之表現。可用於試樣流體之免疫組織 化學染色及/或檢測之抗體，可為無論是單株或多株抗體， 且可在任何哺乳動物中製備。可合宜地製備抗體，針對本 文中所述之多肽，或針對合成肽，以本文中所提供之DNA 順序為基礎，或針對經融合至使此種多肽與抗體編碼及使 專一抗體抗原決定部位編碼之DNA之外源順序。 92129 -42- 1357820 5. 多肽之純化 諸形式可自培養基或自宿主細胞溶胞產物回收。若經細胞 膜結合，則其可使用適當清潔劑溶液（例如Triton-X 100)或藉 由酵素分裂，自細胞膜釋出。被採用於表現本文中所述多 肽或抗體之細胞，可藉由各種物理或化學方式瓦解，譬如 冷凍-解凍循環、音振、機械瓦解或細胞溶解劑。 可能需要自重組細胞蛋白質或其他多肽純化本文中所述之 多肽或抗體。下述程序係為舉例之適當純化程序：在離子 交換管柱上藉由分級分離；乙醇沉澱作用；逆相HPLC ;於 矽膠上或於陽離子交換樹脂譬如DEAE上層析；聚焦層析； SDS-PAGE ;硫酸銨沉澱作用；凝膠過濾，使用例如交聯葡聚 糖（Sephadex) G-75 ;蛋白質A瓊脂糖管柱，以移除污染物，譬 如IgG ;及金屬螯合管柱，以結合多肽或抗體之抗原決定部 位標記形式。蛋白質純化之各種方法均可採用，且此種方 法係為此項技藝中已知，及描述於例如Deutscher,游學方法， 152(1990) ; Scopes,香冷 # 翔允.·及理與 f 藏，Springer-Verlag， New York (1982)中。經選擇之純化步驟係依例如所使用製造方 法及所製成特定多肽或抗體之性質而定。 B. 抗體製劑 在本發明之某些具體實施例中，所選擇之蛋白質係為抗體 。製造抗體包括多株、單株、人化、雙專一性及雜共軛抗 體之技術如下。 1)多株抗體. 多株抗體一般係在動物中，藉由有關聯抗原與佐劑之多重 92129 -43- 1357820 皮下（sc)或腹膜腔内（ip)注射而被提升。其可用以使有關聯之 抗原共軛至欲被免疫物種中為免疫原之蛋白質，例如鍵孔 青貝血藍質（KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆騰 蛋白酶抑制劑’使用雙官能性或衍化劑，例如順丁晞二酿 亞胺基苯甲醯基績酸基琥珀醯亞胺酯（經過半胱胺酸殘基之 共軛作用）、N-幾基琥珀醯亞胺（經過離胺酸殘基）、戊二越 、琥珀酐、SOC12或WNiCsNR，其中R與Ri係獨立為低碳烷 基。可被採用之佐劑實例包括Freund氏完整佐劑與MpL—mM 佐劑（單鱗酿基脂質A、合成海藻糖二可利諾酸鹽(dic〇ryn〇myc〇late)) 。免疫作用擬案可由熟諳此藝者選擇，無需過度實驗。 動物係針對該抗原、免疫原共軛物或衍生物經免疫，其方 式是將例如100微克或5微克之蛋白質或共軛物（個別對免子 或老鼠）與3體積Freund氏完整佐劑合併，將此溶液以皮内方 式注射在多重位置處。—個月後，動物係㈣至㈣最初量 <肽或共軛物，在Freund氏完整佐劑中，在多重位置處藉由 皮下注射而妹加速。七至十四天後，將動物採血，並檢測 血清之抗體滴定度。動物係被加速直到滴定度平穩為止。 共輕物5F可在重組細胞培養物中製成蛋白質融合物。 劑譬如明礬’亦適合用以加強免疫回應。 ^ 2)單株抗體. 體體係、得自Μ上均f抗體之個體群，意即包含該個 :、（固別柷體係為相同，惟可以少量存在之可能天然生 ，之大變型及/或轉譯後改質物 作用)除外。因此，修飾用"=表構化 巾用N早株係表不抗體之特性為並 92129 •44- 1357820 非分立抗體之混合物。 例如，單株抗體可使用首先由Kohler等人，Λ⑹256: 495 (1975) 所描述之雜種瘤方法製成，或可藉由重組DNA方法（美國專 利 4,816,567)製成。 在雜種瘤方法中，老鼠或其他適當宿主動物，譬如大頰鼠 係如前文所述經免疫，以誘使淋巴細胞產生或能夠產生抗 體，其將專一性地結合至用於免疫作用之蛋白質。或者， 淋巴細胞可於活體外經免疫。然後，使用適當融合劑，譬 如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓細胞瘤細胞融合，以形成 雜種瘤細胞（Goding，罩#犮鱧.·及理輿#潦，第59-103頁（大學 出版社，1986)。 致免疫劑典型上係包括抗原蛋白質或其融合物變種。一般 而言，若需要人類來源之細胞，則使用末梢血液淋巴細胞 ("PBL”），或者若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾臟細胞 或淋巴節細胞。然後，使用適當融合劑，譬如聚乙二醇， 使淋巴細胞與不滅細胞系融合，以形成雜種瘤細胞。Goding, 單#犮鱧.·#湮輿#澇，大學出版社（1986)，第59-103頁。 不滅細胞系經常為經轉變之哺乳動物細胞，特別是齧齒動 物、牛及人類來源之骨髓細胞瘤細胞。通常，係採用大白 鼠或老鼠骨髓細胞瘤細胞系。經如此製成之雜種瘤細胞係 經接種且生長於適當培養基中，其較佳係含有一或多種抑 制未融合母體骨髓細胞瘤細胞生長或存活之物質。例如， 若母體骨髓細胞瘤細胞缺乏酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖 基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則供雜種瘤用之培養基典型上將 92129 •45- 1357820 包含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷（HAT培養基），此等物質係 防止HGPRT-缺乏細胞之生長。 較佳不滅骨髓細胞瘤細胞係為有效地融合，藉由所選定之 產生抗體細胞支持抗體之安定、高含量生產，且對培養基 譬如HAT培養基敏感者。其中，較佳者為老鼠骨髓細胞瘤細 胞系，譬如衍生自MOPC-21與MPC-11老鼠腫瘤者，其可得自 Salk學會細胞分佈中心（San Diego, California USA)，及SP-2細胞 (及其衍生物，例如X63-Ag8-653)，其可得自美國培養物類型 收集處（Manassus, Virginia USA)。人類骨髓細胞瘤與老鼠-人類 雜骨髓細胞瘤細胞系，亦已被描述關於人類單株抗體之製 造（Kozbor，/· immtmo/·，m : 3001 (1984) ; Brodeur 等人，單# 犮鱧農/ 造沒游1 典邊居，第 51-63 頁（Marcel Dekker 公司，New York, 1987))。 其中雜種瘤細胞正在生長之培養基，係對於被導引針對抗 原之單株抗體之製造進行檢測。藉由雜種瘤細胞製成之單 株抗體之結合專一性，較佳係藉由免疫沉澱作用或藉由活 體外結合檢測，譬如放射免疫檢測（RIA)或酵素-連結免疫吸 收性檢測（ELISA)，進行測定。 可檢測其中培養雜種瘤細胞之培養基，關於被導引針對所 要抗原之單株抗體之存在。單株抗體之結合親和力與專一 性，較佳可藉由免疫沉澱作用或藉由活體外結合檢測，譬 如放射免疫檢測（RIA)或酵素-連結檢測（ELISA)，進行測定。 此種技術與檢測在此項技藝上係為已知。例如，結合親和 力可藉由 Munson 等人，乂似/·及‘oc/zem·，ΙϋΖ : 220 (1980)之 Scatchard 分 析進行測定。 92129 •46- 1357820 在雜種瘤細胞被確認為會產生具有所要專一性、親和力及 /或活性之抗體後，無性繁殖系可藉由限制稀釋程序進行次 代無性繁殖，且藉由標準方法生長（Goding，同前文出處）。供 此項目的使用之適當培養基，包括例如D-MEM或RPMI-1640 培養基。此外，雜種瘤細胞可於活體内生長為哺乳動物中 之水腹腫瘤。 藉由次代無性繁殖系分泌之單株抗體，係適當地自培養基 、水腹流體或血清，藉習用免疫球蛋白純化程序分離，例 如蛋白質A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親 和層析法。 單株抗體亦可藉由重組DNA方法製成，譬如在美國專利 4,816,567中所述者，及如上述。使單株抗體編碼之DNA係容 易地使用習用程序單離與定序（例如，利用寡核I酸探測物 ，其能夠專一性地結合至使老鼠抗體之重與輕鏈編碼之基 因）。雜種瘤細胞係充作此種DNA之較佳來源。一旦經單離 ，即可將DNA置於表現載體中，然後使其轉移感染至宿主 細胞，譬如大腸桿菌細胞、猿猴cos細胞、中國大頰鼠卵巢 (CHO)細胞，或在其他情況下不會產生免疫球蛋白蛋白質之 骨髓細胞瘤細胞，以在此種重組宿主細胞中合成單株抗體 。關於使抗體編碼之DNA在細菌中之重組表現之回顧論文 ，係包括 Skerra 等人，Cwrr. : 256-262 (1993)與
Pluckthun, Immunol Revs. 130 ： 151-188 (1992) ° 於進一步具體實施例中，抗體可單離自使用McCafferty等人， iVaiwre, : 552-554 (1990)中所述之技術所產生之抗體噬菌體 92129 -47- 1357820 庫。Clackson 等人，iVlaiMre, 352 : 624-628 (1991)與Μσ/.历〇/.，222 : 581-597 (1991)描述老鼠與人類抗體個別使用噬菌體庫之單離 。後續刊物描述高親和力（ηΜ範圍）人類抗體之製造，其方 式是鏈滑移（Marks 等人，历o/Tec/iwo/ogy, ill : 779-783 (1992))，以及 結合感染與活體内重組，作為建構極大噬菌體庫之策略 (Waterhouse 等人，愚〇；/. 乂c此及es·，21: 2265-2266(1993))。因此，此 等技術係為單離單株抗體之傳統單株抗體雜種瘤技術之可 實行替代方式。 此DNA亦可被修正，例如經由以編碼順序取代同系老鼠順 序位置中之人類重與輕鏈恒定功能部位（美國專利4,816,567 ; Morrison 等人，外oc. ·. S1: 6851 (1984))，或經由使 非免疫球蛋白多肽之所有或部份編碼順序，以共價方式接 合至免疫球蛋白編碼順序。典型上，此種非免疫球蛋白多 肽係用以取代抗體之恒定功能部位，或其係用以取代抗體 之一個抗原組合位置之可變功能部位，以產生嵌合二價抗 體，其包含一個抗原組合位置，具有對抗原之專一性，及 另一個抗原組合位置，具有對不同抗原之專一性。 本文中所述之單株抗體，可藉由單價，其製備係為此項技 藝中所習知。例如，一種方法係涉及免疫球蛋白輕鏈與經 改質重鍵之重組表現。此重鏈一般係在Fc區域中之任何點 處經截頭，以防止重鏈交聯。或者，有關聯之半胱胺酸殘 基可被另一種胺基酸殘基取代，或被刪除，以防止交聯。 活體外方法亦適合製備單價抗體。抗體之消化以產生其片 段，特別是Fab片段，可使用此項技藝中已知之例行技術達 92129 -48- 1357820 成0 用合成蛋白質化學上已知 ’例如，免疫毒素可使用 嵌合或雜種抗體亦可於活體外使 之方法製成，包括涉及交聯劑者 一硫化物-交換反應或藉由形成妒酿 啤〜成梳醚鍵而構成。供此項目的 使用之適當試劑之實例，包括砟脸其拉e 匕括亞胺基瓴i?·化物與4-巯基丁醯 亞胺酸曱酯。 3) 人化抗體. 本發明之抗體可進—步包含人化或人類抗體。非人類(例 如老鼠）抗體之人化形式，係為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋 白鏈或其片段（譬如抗體之Fv、Fab、秘.、F⑽)2或其他抗原 結合亞順序），其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小順序 。人化抗體包括人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中得自 接受者之互補性決定區域(CDR)之殘基，係被得自非人類物 種（供體抗體）之CDR之殘基置換，該非人類物種譬如老鼠、 大白鼠或兔子，具有所要之專一性、親和力及容量。於一 些情況中，人類免疫球蛋白之Fv骨架殘基，係被相應非人 類殘基置換。人.化抗體亦可包含既非在接受者抗體中，亦 非在經輸入CDR或骨架順序中發現之殘基。一般而言，人化 抗體將包含實質上所有至少一個，且典型上為兩個之可變 功能部位，其中所有或實質上所有CDR區域係相應於非人類 免疫球蛋白’且所有或實質上所有FR區域係為人類免疫球 蛋白同感順序^人化抗體最適宜亦將包含至少一部份免疫 球蛋白恒定區域(Fc) ’典型上為人類免疫球蛋白。J〇nes等人，
Mziwre 221: 522-525 (1986); Riechmann 等人，Mz/wre 231' 323-329(1988) 92129 -49· 1357820 及 Presta，Cwrr. ppz>z. 所〇/. 2 : 593-596 (1992)。 使非人類抗體人化之方法，係為此項技藝中所習知。一般 而言，人化抗體具有一或多個來自非人類來源之胺基酸殘 基被引進其中。此等非人類胺基酸殘基經常被稱為"輸入" 殘基，其典型上係取自"輸入"可變功能部位。人化作用基 本上可按照Winter與共同研究者，Jones等人，iVaiwre 321 ： 522-525 (1986); Riechmann 等人.Nature 332 : 323-327 (1988) ; Verhoeyen 等人， Sc細ce 225: 1534-1536 (1988)之方法進行，或經由將齧齒動物CDR 或CDR順序取代其相應之人類抗體順序。因此，此種”人化” 抗體係為嵌合抗體（美國專利4,816,567)，其中實質上小於完 整人類可變功能部位已被來自非人類物種之相應順序取代 。實際上，人化抗體典型上為人類抗體，其中一些CDR殘基 與可能之一些FR殘基係被來自齧齒動物抗體中之類似位置 之殘基取代。 欲被用於製造人化抗體之人類輕與重可變功能部位兩者， 其選擇極為重要，以降低抗原性。根據所謂"最良好吻合" 方法，齧齒動物兢體之可變功能部位順序係針對已知人類 可變功能部位順序之整個資料庫進行篩選。然後接受最接 近齧齒動物之人類順序，作為供人化抗體用之人類骨架（FR) 。Sims 等人，《/· 151 : 2296 (1993); Chothia 等人，/ Μσ/.历σ/·， : 901 (1987)。另一種方法係使用衍生自輕或重鏈特定亞 組之所有人類抗體之同感順序之特定骨架。相同骨架可用 於數種不同人化抗體。Carter等人，Pwc. Mzi/. Jcac/. &ζ·. 似，纽： 4285 (1992) ; Presta 等人，J· /mmm?/·，lil : 2623 (1993)。 92129 -50- 057820 更重要的是抗體應被人化並保留對抗原之高親和力，及其 他有利生物學性質。為達成此目#，根據較佳方法，人化 抗體係藉由母體順序與各種概念人化產物之分析程序，使 !，體與人化順序之三次元模型製成。三次元免疫球蛋白 模土係為一般可取得，且為熟諳此藝者所熟悉。圖解與顯 '^所選擇候選免疫球蛋自順序之可能三次元構形結構之電 月旬心式可取得。此等顯示之檢查允許分析殘基在候選免疫 ••蛋白順序之m之可能角色，意即分析殘基影響候選 免疫球蛋白結合其抗原之能力。依此方式，FR殘基可自接 受者與輸入順序進行選擇與合併，以致所要之抗體特性， 譬如增加對標的抗原之親和力’係、被達成。-般而言，CDR 殘基係直接1最實質上涉及影響抗原 結合。 、人化抗體之各種形式係意欲涵蓋在内。例如，人化抗體可 為抗體片段，譬如Fab，其作滿，]i主v+ . 弁係視^況與一或多種細胞毒劑共 輛，以產生免疫共軛物。哎去 或耆人化杬體可為完整抗體， 譬如芫整IgGl抗體。 4) 人類抗·體
作為人化作用之一種替代古々 A , 万式，可產生人類抗體。例如， 目前能夠產生轉基因動物（例 .^ (例如老鼠），其能夠在免疫作用 時，於内源免疫球蛋白生產存 、廿士士 4存在下，產生人類抗體之全 滿存庫。例如，已描述在嵌人 與 胞系哭變老鼠中抗體 重鏈接合區域（JH)基因之同合 、、 于缺失會造成内源抗體生產 (冤全抑制。人類胚細胞系穿 兒疫球蛋白基因陣列在此種胚 細胞系突變老鼠中之轉移， 对曰I成人4柷體在抗原激發 92129 -51 _ 1357820 時產生。參閱，例如 Jakobovits 等人，proc. A^/. «SW. t/似，迎： 2551 (1993); Jakobovits 等人，Mziwre, 3^2 ： 255-258 (1993) ； Bruggermann 等人，fear z>z/mmw«a，：L: 33 (1993);美國專利案號 5,591,669 及 WO 97/17852。 或者，噬菌體顯示技術可由來自未經免疫供體之免疫球蛋 白可變（V)功能部位基因存庫，用以在活體外產生人類抗體 與抗體片段。McCafferty 等人，552-553 (1990); Hoogenboom 與 Winter, «/· Μσ/·历σ/. 2ZL : 381 (1991)。根據此項技術 ，抗體V功能部位基因係於架構内無性繁殖至絲狀噬菌體之 無論是主要或較少病毒外殼蛋白基因，譬如Μ13或fd，並以 功能性抗體片段顯示在噬菌體粒子之表面上。由於絲狀粒 子含有噬菌體基因組之單股DNA複製，故以抗體功能性質 為基礎之選擇，亦會造成使顯示此等性質之抗體編碼之基 因之選擇。因此，噬菌體係模擬B-細胞之一些性質。噬菌 體顯示可在多種格式中進行，其係回顧於例如Johnson，KevinS. 與 Chiswell，David J·，Cwrr. iSirwci. 2_ : 564-571 (1993)中。V-基 因鏈段之數種來源可被使用於噬菌體顯示。Clackson等人 ，252 : 624-628 (1991)係從衍生自經免疫老鼠脾臟之V基 因之小的隨機結合庫，單離多種陣列之抗-11号吐酮抗體。可 建構來自未經免疫人類供體之V基因存庫，而對多種陣列抗 原（包括自體抗原）之抗體，基本上可按照由Marks等人， /· Mo/_ 伤〇/. 222 : 581-597 (1991)或 Griffith 等人，五12 : 725-734 (1993)所述之技術單離。亦參閱美國專利5,565,332與5,573,905。
Cole等人與Boemer等人關於製備人類單株抗體之技術亦可 92129 -52- 1357820 取得（Cole等人，單株抗體與癌症療法，Alan R.Liss，第77頁（1985) 與 Boemer 等人，J. ImmunoL 147(1) : 86-95 (1991))。同樣地，人類 抗體可藉由引進人類免疫球蛋白位點至轉基因動物中而製 成，例如其中内源免疫球蛋白基因已被部份或完全失活之 老鼠。於激發時，發現人類抗體產生，其係於各方面密切 地相似人類中所見及者，包括基因重排、組裝及抗體存庫 。此途徑係描述於例如美國專利案號5,545,807 ; 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661，016 中，及在下列科學刊物中 :Marks 等人，历Ιβ: 779-783 (1992); Lonberg 等人，iViziwre 368 : 856-859(1994)； Momson, Nature MR : 812-13 (1994) > Fishwild 等人，Mziwre所845-51 (1996)，Neuberger，Atowre Biotechnology 1A ' 826 (1996)，及 Lonberg 與 Huszar，/«iem.及ev./w服/«〇/. 11 : 65-93 (1995)。 最後，人類抗體亦可於活體外藉由經活化B細胞產生（參 閱美國專利 5,567,610 與 5,229,275)。 5) 抗體片段 在某些狀況下；使用抗體片段而非整個抗體有其優點。片 段大小愈小，允許快速清除，並可導致經改良之進入固態 腫瘤中。 已發展各種技術，以製造抗體片段。傳統上，此等片段係 經由完整抗體之蛋白分解消化而衍生（參閱，例如Morimoto等 人，/_ 所oc/iem 历句λϊ. 24： : 107-117 (1992);與 Brennan 等人，
Science 229. : 81 (1985》。但是，此等片段目前可直接藉由重組 宿主細胞製成。Fab、Fv及scFv抗體片段可全部表現於且分 92129 •53· 1357820 泌自大腸桿菌，因此允許容易生產大量此等片段。抗體片 段可單離自上文所討論之抗體噬菌體庫。或者，Fab’-SH片段 可直接回收自大腸桿菌，並以化學方式偶合以形成F(ab')2片 段（Carter 等人.Bio/Technologv 10 : 163-167 (1992))。根據另一種途 徑，F(ab’)2片段可直接單離自重組宿主細胞培養物。具有增 加活體内半生期之Fab與F(ab')2係描述於美國專利5,869,046中 。在其他具體實施例中，所選擇之抗體為單鏈Fv片段（scFv) 。參閱WO 93/16185 ;美國專利5,571,894與美國專利5,587,458。 抗體片段亦可為”線性抗體”，例如在美國專利5,641，870中所 述者。此種線性抗體片段可為單專一性或雙專一性。 ' 6) 抗體依賴性酵素所媒介之前體藥物療法(ADEPT) 本發明抗體亦可使用於ADEPT中，其方式是使抗體共軛至 前體藥物活化酵素，其係使前體藥物（例如肽基化學治療劑 ，參閱WO 81/01145)轉化成活性抗癌藥物。參閱，例如 WO 88/07378 與美國專利 4,975,278。 可用於ADEPT之免疫共軛物之酵素成份，包括能夠以使其 轉化成其較具活性細胞毒性形式之方式，作用於前體藥物 上之任何酵素。 可使用於本發明方法中之酵素，包括但不限於糖苷酶、葡 萄糖氧化酶、人類溶菌酶、人類葡萄糖嘗酸酶、驗性磷酸 酶，可用於使含磷酸鹽之前體藥物轉化成自由態藥物；芳 基硫酸酯酶，可用於使含硫酸鹽前體藥物轉化成自由態藥 物；胞嘧啶脫胺基酶，可用於使無毒性5-氟基胞嘧啶轉化成 抗癌藥物5-氟尿喊淀；蛋白酶，譬如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜 92129 •54· 1357820 熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶（例如羧肽酶G2與 羧基肽酶A)及組織蛋白酶（譬如組織蛋白酶b與L)，可用於 使含肽前體藥物轉化成自由態藥物；D_丙胺醯基羧基肽酶， 可用於轉化含有D-胺基酸取代基之前體藥物；碳水化合物_ 刀裂酵素，譬如沒-半乳糖:y：酶與神經胺糖酸苷酶，可用於 使糖基化前體藥物轉化成自由態藥物；糸内醯胺酶，可用 於使以/9-内醯胺衍化之藥物轉化成自由態藥物；及青霉素 醯胺酶，譬如青霉素V醯胺酶或青霉素（5醯胺酶，可用於使 在其胺氮處個別以苯氧基乙醯基或苯乙醯基衍化之藥物轉 化成自由態藥物。或者，具有酵素活性之抗體，於此項技 藝中亦稱為”抗體酶（abzyme)”可用以使本發明之前體藥物轉 化成自由態活性攀物（參閱，例如Massey, Nature 328 : 457-458 (1987))。抗體-杬體酶共軛物可按本文中所述製備，用於傳輪 抗體酶至腫瘤細胞個體群。 上述酵素可藉此項技藝中所習知之技術，共價結合至本文 中所述之多肽或抗體，譬如利用上文所討論之異雙官能性 交聯劑。或者’包含本發明抗體之至少抗原結合區域，而 經連結至本發明酵素之至少功能性上活性部份之融合蛋白 質，可使用此項技藝中所習知之重組DNA技術建構（參閱， 例如 Neuberger 等人，312 : 604-608 (1984))。 雙專一性與多專一性抗體 雙專一性抗體（BsAb)係為對至少兩個不同抗原決定部位具 有結合專一性之抗體，包括在相同或另一種蛋白質上抗原 決定部位。或者’ 一自臂可被武裝以結合至標的抗原，而 92129 -55· 1357820 另一個臂可與一個臂合併，後者係結合至白血球上之觸發 分子，譬如T-細胞受體分子（例如CD3)或對IgG之Fc受體（Fc 7 R)，譬如FcrRl(CD64)、FcrRII(CD32)及 FcrRHI(CD16)，以使 細胞防禦機制聚焦與定位至標的抗原-表現細胞。此種抗體 可衍生自全長抗體或抗體片段（例如F(abi)2雙專一性抗體）。 亦可使用雙專一性抗體，以使細胞毒劑定位至表現標的抗 原之細胞。此種抗體具有一個結合所要抗原之臂，及另一 個結合細胞毒劑之臂（例如沙孢素（saporin)、抗-干擾素-a、長 春花生物鹼、蓖麻毒素A鏈、胺甲喋呤或放射性同位素附著 素）。已知雙專一性抗體之實例包括抗-ErbB2 /抗-FcgRIII (W〇 96/16673)、抗-ErbB2 / 抗-FcgRI (美國專利 5,837,234)、抗-ErbB2 / 抗-CD3 (美國專利 5,821,337)。 製造雙專一性抗體之方法係為此項技藝中已知。全長雙專 一性抗體之傳統製造，係以兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之 共表現為基礎，其中此兩鏈具有不同專一性。Millstein等人， Nature,: 537-539 (1983)。由於免疫球蛋白重與輕鏈之隨機 揀選，故此等雜種瘤（四重瘤）係產生1〇種不同抗體分子之 可能混合物，其中只有一種具有正確雙專一性結構。正確 分子之純化，其經常藉由親和層析步驟達成’是頗為麻煩 的，且產物產率很低。類似程序係揭示於WO 93/08829中’及 在1^111^1^等人，烈纽〇人 10:3655-3659(1991)中。 根據不同途徑，具有所要結合專一性之抗體可變功能部位 (抗體-抗原組合位置）係融合至免疫球蛋白恒定功能部位順 序。融合物較佳係具有免疫球蛋白重鏈恒定功能部位，包 92129 -56- 含：少部份鉸鏈、CH2及CH3區域。較佳係具有第一個重鏈 杈疋區域（CH1)，含有輕鏈結合所必須之位置，存在於至少 :個融合物中。冑免疫球蛋白重㈣合物編碼之順及^ *要時 < 免疫球蛋白輕鏈，係被插人個別表現載體中，且 被共轉染至適#宿主生物體中。當於建構中使用不相等比 例之三種多肽鏈提供最適宜產率時之具體實施例中，這在 :整三個多肽片段之相互比例上提供大的靈活性。但是， =至 > 兩個呈相等比例之多肽鏈之表現造成高產率時，或 當，等比例未具有特別重要性時，可將對於兩個或全部三 個夕肽鏈之編碼順序插入一個表現載體中。 於此途揸之一項較佳具體實施例中，雙專一性抗體係由在 筹中具有第一個結合專一性之雜種免疫球蛋白重鏈，與 在另身中之雜種免疫球蛋白重鏈_輕鏈對（提供第二個結 口專性）所組成。已發現此不對稱結構有助於所要雙專一 性化合物自不想要之免疫球蛋白鏈組合中分離，因免疫球 蛋白輕鏈存在於只有一半之雙專一性分子中，係提供一種 谷易之分離方式。此途徑係揭示於w〇94/〇469〇中。關於產生 雙專一性抗體之進一步細節，可參閱例如Suresh等人，鱒學才 法111: 210(1986)。 根據另一種描述於w〇96/27〇11或美國專利5,731，168中之途 徑，於一對抗體分子間之界面可經設計，以使異種二聚體 之百刀比達到取大程度’其係回收自重組細胞培養物。較 佳界面包含抗體恒定功能部位CH3區域之至少一部份。於此 万法中’來自第一個抗體分子界面之一或多個小胺基酸側 92129 -57- 1357820 鏈，係被較大側鏈（例如酪胺酸或色胺酸）置換。與該大側 鏈相同或類似大小之補償”孔穴"係在第二個抗體分子界面 產生，其方式是以較小側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）置換大 胺基酸側鏈。這提供一種機制，以增加異種二聚體之產率 ，勝過其他不想要之最終產物，譬如同種二聚體。 自抗體片段產生雙專一性抗體之技術，已被描述於文獻中 。例如，雙專一性抗體可使用化學鏈結製備。Brennan等人， Sdewam : 81 (1985)描述一種程序，其中完整抗體係以蛋白 分解方式分裂以產生F(ab，)2片段。此等片段係於雙硫醇錯合 劑亞坤酸鈉存在下被還原，以使毗雙硫醇安定化，並防止 分子間二硫化物形成。然後，使所產生之Fab'片段轉化成硫 基硝基苯甲酸鹽（TNB)衍生物。接著，使Fab'-TNB衍生物之一 再轉化成Faiy-TNB衍生物，以形成雙專一性抗體。所製成之 雙專一性抗體可作為藥劑用於酵素之選擇性固定化作用。
Fab'片段可直接回收自大腸桿菌，並以化學方式偶合以形 式雙專一性抗體。Shalaby 等人，《/·及;?. MM. Π1 : 217-225 (1992)係 描述完全人化雙專一性抗體F(ab’)2分子之製造。各Fab’片段係 個別分泌自大腸桿菌，並接受經導引之活體外化學偶合以 形成雙專一性抗體。如此形成之雙專一性抗體能夠結合至 過度表現ErbB2受體之細胞與正常人類T細胞，以及觸發人 類細胞毒性淋巴細胞之溶解活性，針對人類乳房腫瘤標的。 直接自重組細胞培養物製造與單離二價抗體片段之各種技 術，亦已被描述。例如，二價異種二聚體已使用白胺酸拉 鍊對製成。Kostelny 等人，·/· 148(5) : 1547-1553 (1992)。得 92129 •58- 1357820 自Fos與Jun蛋白質之白胺酸拉鍊肽係藉由基因融合，連結至 兩種不同柷體之Fab'部份。抗體同種二聚體係在鉸鏈區域被 還原，以形成單體，然後再氧化以形成抗體異種二聚體。 由 Hollinger 等人，Proc. Α/αί/· ，迎：6444-6448 (1993)所述 之"雙抗體"技術，已提供製造雙專一性/二價抗體片段之 替代機制。此等片段包含重鏈可變功能部位^)，藉由連結 基，連接至輕鏈可變功能部位（VL)，該連結基太短，以致不 允5午在相同鏈上之兩個功能部位之間配對。因此，一個片 段之VH與VL功能部位係被強迫與另—個片段之互補vL與vH 功能部位成對’於是形成兩個抗原結合位置。利用單鏈Fv (SFV) 二聚體製造雙專一性/二價抗體片段之另一種策略，亦已被 報告過。參閱 Gruber 寺人，/· ///wzwwo/.，^^2 : 5368 (1994)。 具有超過兩個價鍵之抗體係意欲涵蓋在内。例如，可製備 參專一性抗體。Tutt 等人，《/· /wmtmo/. J47 : 60 (1991)。 舉例之雙專一性抗體可結合至特定分子上之兩個不同抗原 決定部位。或者，抗蛋白質臂可與一個臂合併，後者係結 合至白血球上之觸發分子，譬如T-細胞受體分子（例如CD2 、CD3、CD28 或 B7)，或對 IgG 之 Fc 受體（Fc rR)，譬如 Fc rRI (CD64) 、Fc rRII (CD32)及Fc rRIII (CD16)，以使細胞防禦機制聚焦至 表現特定蛋白質之細胞。雙專一性抗體亦可用以使細胞毒 劑定位至表現特定蛋白質之細胞。此種抗體具有蛋白質結 合臂，及結合細胞毒劑或放射性核素螯合劑譬如EOTUBE ' DPTA、DOTA或TETA之臂。另一種吾人感興趣之雙專一性抗 體係結合吾人感興趣之蛋白質，及進一步結合組織因子(TF)。 92129 -59- 1357820 8) 雜共軛抗體 雜共軛抗體亦在本發明之範圍内。雜共輛抗體係由兩個以 共價方式接合之抗體所組成。例如，雜共輛物之抗體之一 可偶合至抗生物素蛋白，另一個偶合至生物素。例如，此 種抗體已被提出，使免疫系統細胞成為不想要細胞之標的 ，美國專利4,676,980，及用於治療HIV感染。WO 91/00360、 WO 92/200373及EP 0308936。意欲涵蓋的是，抗體可於活體外 ，使用合成蛋白質化學上已知之方法製備，包括涉及交聯 劑者。例如，免疫毒素可使用二硫化物交換反應或藉由形 成硫醚鍵而構成。供此項目的用之適當試劑之實例，包括 亞胺基硫醇化物與4-巯基丁醯亞胺酸甲酯，及在例如美國專 利4,676,980中揭示者。雜共軛抗體可使用任何合宜交聯方法 製成。適當交聯劑係為此項技藝中所習知，且係揭示於美 國專利4,676,980中，伴隨著許多交聯技術。 9) 故應子功能工程 一般可能期望針對效應子功能，修改本發明抗體，以加強 抗體在治療癌症上之有效性。例如，半胱胺酸殘基可被引 進Fc區域中，藉以允許鏈間二硫鍵在此區域中形成。經如 此產生之同種二聚體抗體可具有經改良之内部化作用能力 及/或增加之補體所媒介細胞殺死與抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) ° ^ Caron ^ KJ. Exp. Med. 12ά: 1191-1195 (1992)與 Shopes, J. /mmwm?/.遣：2918-2922 (1992) »具有加強抗腫瘤活性之同種 二聚體抗體，亦可使用異雙官能性交聯劑製成，如在Wolff 等人，癍症砑宏ϋ : 2560-2565 (1993)中所述者。 92129 -60· 1357820 或者，抗體可經設計而具有雙Fc區域，且於是可具有加強 之補體溶解與ADCC能力。參閱Stevenson等人，技邊桌#窥 :219-230(1989)。 10)免疫共概物 本發明亦關於免疫共輛物，其包含經共輛至細胞毒劑之抗 體，該細胞毒劑譬如化學治療劑、毒素（例如細菌、真菌、| 植物或動物來源之具酵素活性毒素或其片段），或放射性同 位素（意即放射共輛物）。 可用於產生此種免疫共軛物之化學治療劑包括BCNU、鏈 霉亞硝基素、長春新鹼、長春花鹼、亞德里亞霉素及5-氟尿 P密淀。 可使用之具酵素活性毒素及其片段，包括白喉A鏈、白喉 毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（得自綠膿桿菌）、蓖麻 毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫地毒素（modeccin) A鏈、α -帚 曲菌素、油桐蛋白質、二嗯新（dianthin)蛋白質、十蕊商陸蛋 白質（PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、瀉果樹素、巴豆毒 蛋白、肥皂草抑制劑、地百合素、絲裂吉林（mitogellin)、局 限曲菌素、驗霉素、恩諾霉素（enomycin)及單端孢素。 抗體與細胞毒劑之共軛物係使用多種雙官能性蛋白質-偶 合劑製成，譬如N-琥珀醯亞胺醯基-3-(2-吡啶基雙硫醇）丙酸 鹽（SPDP)、亞胺基硫伍圜（IT)、醯亞胺基酯類之雙官能性衍 生物（譬如己二醯亞胺酸二曱酯HC1)、活性酯類（譬如辛二酸 二琥珀醯亞胺醯基酯）、醛類（譬如戊二醛）、雙-疊氮基化合 物（譬如雙（對-疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙-重氮衍生物（譬 92129 -61 - 1357820 如雙-(對-重氮苯甲醯羞）-乙二胺）、二異氰酸酯（譬如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙-活性氟化合物（譬如1，5-二氟-2,4-二硝基苯） 。例如，藏麻蛋白免疫毒素可按Vitetta等人，Sczbzce，21S. : 1098 (1987)中所述製成。破-14-標識之1-異硫氰基苄基-3-甲基二乙 三胺五醋酸（MX-DTPA)係為供放射核甞酸共輛至抗體之舉例 螯合劑。.參閱WO 94/11026。連結基可為有助於細胞毒素藥物 在細胞中釋出之”可分裂連結基”。例如，酸不安定連結基 、月太酶敏感性連結基、二甲基連結基或含二硫化物連結基 (Chari 等人，52 : 127-131 (1992))均可使用。 此夕卜，小分子毒素，譬如躬血霉素（calicheamicin)、美坦生（ 美國專利5,208,020)、單端孢素及CC1065，亦意欲涵蓋為可共 軛毒素，與本發明調配物一起使用^於一項具體實施例中 ，全長抗體或其抗原結合片段可共軛至一或多個美坦習諾 (maytansinoid)分子（例如每一抗體分子約1至約10個美坦習諾 分子）。美坦習諾為絲裂毒素抑制劑，其係藉由抑制微管蛋 白聚合反應而發生作用。美坦習諾，單離自天然來源或以 合成方式製備，係包括美坦生、美坦生醛及其衍生物與類 似物，已被描述，參閱，例如美國專利5,208,020及其中引述 之參考資料（參閱第2欄第53行至第3欄第10行），以及美國 專利3,896,111與4，151，042。製備抗體-美坦習諾共軛物之方法 ，亦描述於美國專利5,208,020中。於一項較佳具體實施例中 ，美坦習諾係經由二硫化物或其他含硫連結基連接至抗體 。美坦生可例如被轉化成May-SS-Me，其可被還原成May-SH3 並與經變性之抗體反應，以產生美坦習諾-抗體免疫共軛物 92129 -62- 1357820 。Chari 等人，Cc^iceri?es· 52 : 127-131 (1992)。抗體可藉已知方法 變性，然後使含有自由態或經保護硫醇基之抗體，與含有 二硫化物之美坦習諾反應，以產生共軛物。抗體-美坦習諾 共軛物之細胞毒性可於活體外或活體内藉已知方法度量， 並測定IC5〇。 妈血霉素（calicheamicin)為另一種吾人感興趣之免疫共輛物 。抗生素之鈣血霉素族群係能夠在亞微微莫耳濃度下產生 雙股DNA斷裂。可使用之鈣血霉素結構類似物，包括但不 限於、A1、A1、N-乙醯基-n1、PSAG 及 eSCHinman 等 人，Cancer Res. 51. : 3336-3342 (1993)與 Lode 等人，Cancer : 2925-2928 (1998))。抗體可共輛之其他抗腫瘤藥物包括QFA， 其係為抗葉酸鹽。鈣血霉素與QFA兩者均具有胞内作用位置 ，且不會立即越過漿膜。因此，此等藥劑經過抗體所媒介 内部化作用之細胞吸收，係大為增強其細胞毒性作用。 於抗體與具有核分解活性之化合物（例如核糖核酸酶或 DNA核酸内切酶，譬如脫氧核糖核酸酶、DNase)之間形成之 免疫共輛物，亦意欲涵蓋在内。 抗體亦可共軛至高度放射性原子。多種放射性核素可用於 製造經放射共軛之抗體。實例包括At211，Bi212,I131，In131， 丫90，1^186，1^188,8111153，？32及？1)212，以及1^之放射性同位素 。當共軛物被使用於診斷時，其可包含供閃爍描記研究之 放射性原子，例如Tc99或I123，或供核磁共振（nmr)成像（亦稱 為磁共振成像mri)之自旋標識，譬如蛾-123、破-131、銦-111 、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。 92129 -63- 1357820 放射-或其他標識物可以已知方式併入共軛物中。例如， 肽可經生物合成或可藉由化學胺基酸合成法合成，使用適 當胺基酸先質，涉及例如氟-19取代氫。標識物譬如^"或^23 、心、’及心，可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。 此-90可經由離胺酸殘基連接。I〇D〇GEN®方法可用以併入琪 123，Fraker 等人，所―肌历op咖.to. Cwm細·尬：49_57 (1978)。 使放射性核素共軛之其他方法，係描述於"免疫閃燦描記法 中之單株抗體”（Chatal，CRC出版社1989)。 或者，包含抗體與細胞毒劑之融合蛋白質，可藉由重組技 術或肽合成製成。DNA之長度可包含使共軛物之兩個部份 編碼之個別區域，該兩個部份無論是互相鄰近或被使連結 基肽編碼而不會破壞共軛物之所要性質之區域分隔。 於另一項具體實施例中，抗體可被共軛至"受體"（譬如鏈 霉胺基酸），供使用於腫瘤預成為標的，其中抗體-受體共 軛物係被投予病患，接著自循環使用澄清劑移除未結合共 軛物，然後投予”配位體”（例如抗生物素蛋白），其係共軛 至細胞毒劑（例如放射核苷酸）。 11)免疫微脂粒 於本文中揭示之抗體亦可被調配成免疫微脂粒。，，微脂粒" 為小泡囊，由各種類型之脂質、磷脂及/或界面活性劑所組 成’其可用於傳輸藥物至哺乳動物。微脂粒之成份常被安 排在雙層構造中，類似生物膜之脂質排列。 含有抗體之微脂粒係藉此項技藝中已知之方法製成，嬖如 描述於 Epstein 等人，尸wc.肠汶也仏制.C/&4, S2 : 3688 (1985) ; Hwang 92129 -64- 1357820 等人，Pr〇c_ C/別，22: 4030 (1980);及美國專利 M85,045 與4,544,545中。具有加強循環時間之微脂粒’係揭示於美國 專利 5,013,556 中。 特別有用之微脂粒吁藉由逆相蒸發方法產生’使用包含磷 脂醯膽鹼、膽固醇及衍化磷脂臨乙醇胺（PEG-pE)之脂質 組合物。微脂粒係經過限定孔隙大小之滤器壓出’而產生 具有所要直徑之微脂粒。本發明抗體之Fab’片段可共軛至微 脂粒，如在Martin等人，/历从252 : 286-288 (1982)中所述 者，經由二硫化物-交換反應。化學治療劑（譬如多克索紅菌 素）係視情況被包含在微脂粒中。參閱Gabizon等人，iVariowa/ Cancer/碰&1(19) : 1484 (1989)。 12)其他抗體變性物 抗體之其他變性物係意欲涵蓋在本文中。例如，抗體可連 結至多種非蛋白質性聚合體之一，例如聚乙二醇、聚丙二 醇、聚氧化烯，或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物^抗體亦 可被捕獲在所製成之微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由 界面聚合（例如個別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚（甲 基丙烯酸曱酯）微膠囊），在膠態藥物傳輸系統（例如微脂粒 、白蛋白微球體、微乳化液、毫微粒子及毫微膠囊）中，或 在巨乳化液中。此種技術及其他適當調配物係揭示於 «皮⑽.·農7襄存學輿f藏，第20版，Alfonso Gennaro編著， Philadelphia大學藥學與科學（2000)中。 C. 經凍乾調配物 本文中所述之調配物亦可被製成經重配凍乾調配物。本文 92129 -65- 1357820 中所述之蛋白質或抗體係經凍乾，然後重配以產生本發明 <降低黏度安定液體調配物。在此特定具體實施例中，於 如上述之吾人感興趣之蛋白質製備後，係產生"預凍乾調配 物"。蛋白質存在於預凍乾調配物中之量，係考量所要之劑 量、體積、投藥模式等作測定。例如，完整抗體之起始濃 度可為約2毫克/毫升至約5〇毫克/毫升，較佳為約5毫克/ 宅升至約40耄克/耄升，而最佳為約2〇_3〇毫克/毫升。 1) 經凍乾調配物之攀嘴_ 欲被調配之蛋白質一般係存在於溶液中。例如，在本發明 之提高離子強度降低黏度調配物中，蛋白質可存在於PH_緩 衝冷液巾於pH、約4-8 ’且較佳為約5_7 τ。緩衝劑濃度可為 約ImM至約20福，或者約3應至約15應，依例如調配物 (例如經重配調配物）之緩衝劑及所要之滲透性而定。舉例 之緩衝劑及/或鹽係為藥學上可接受者，且可自適當酸、鹼 及其鹽產i ’譬如在"藥學上可接受之酸、驗或緩衝劑中 所定義者。 於—項具體實施例中，係將柬乾保護劑添加至預象乾調配 物中。凍乾保護劑在預凍乾調配物中之量，—般係致使在 重配時所形成之靠物將為料性⑨重配調 配物亦可為適當。此外，凍乾保護劑之量不得太低，以致 使無法令人接受量之蛋白質降冑/聚集於來乾時發生。但是 ’在預凍乾調配物中之舉例凍乾保護劑濃度係為约川應至 約撕mM，或者約30mM至約3〇〇視，或者約5〇_至約謂禮 。舉例之凍乾保護劑包括糖類與糖醇類，譬如蔗糖、甘露 92129 -66- 1357820 糖、海⑽、葡萄糖、花楸醇、甘露醇 況下，某些壤乾保護劑亦可寶助增加調配物之黏Γ狀 ，應小心選擇會使此作用降至 黏度。因此 劑。其他滚乾保護劑係描述於上文:凌乾二 ，亦於此處稱為"藥學上可接受之糖類"。 疋我中 蛋:質對’東乾保護劑之比例，可針對各特定蛋 及康乾保護餘合而改變4抗體料所選擇之蛋白2 糖i例如藏糖或海藻糖）作為决乾保護劑以產生具有高i白 質辰度之等滲經重配調配物之^ '社K 物<清况中，凍乾保護劑對抗體 《莫耳比可為约10〇至約！莫耳來乾保護劑對！莫耳抗_， 且較佳為約200至約_莫耳滚乾保護劑對a耳抗體，：如 約200至約600莫耳凍乾保護劑對丨莫耳抗體。 於-項較佳具體實施例中，一般可能期望添加界面活性咧 至預滚乾調配物中。替代或另外，可將界面活性劑添力^ 經珠乾調配物及/或經重調配物中。舉例之界面活性劑包 括非離子性界面活性劑’譬如聚花楸㈣（例如聚花揪S 20或80)，聚氧體（例如聚氧體加丨敗啦句18幻；Tri加；辛基糖 苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基…亞麻仁油基_或硬脂基_磺酸基 甜菜驗；月桂基-、肉豆養基_、亞麻仁油基·或硬脂基肌胺 酸，亞麻仁油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基_甜菜鹼；月桂醯胺 丙基_、椰子酿胺丙基_、亞麻仁油驢胺丙基_、肉豆蔻酸胺 丙基-、棕櫚醯胺丙基-或異硬脂醯胺基丙基_甜菜鹼（例如月 桂縫胺丙基）；肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚醯胺丙基-或異硬脂 驢胺基丙基-二甲胺；鈉甲基椰子基-或二鈉甲基油基-牛續 92129 -67- 1357820 酸鹽；及 MONAQUAtm 系列（Mona 工業公司，Paterson，New Jersey) 、聚乙二醇、聚丙二醇’及乙二醇與丙二醇之共聚物（例如 Pluronics，PF68等）。所添加界面活性劑之量，係致使其降低重 配蛋白質之微粒子形成’及使重配後之微粒子形成降至最 低。例如，界面活性劑可存在於預凍乾調配物中，其量為 約 0.001-0.5%，或者約 0.005-0.05%。
凍乾保護劑（譬如蔗糖或海藻糖）與膨鬆劑（例如甘露醇或 甘胺酸）之混合物’可用於製備預凍乾調配物。膨鬆劑可允 許製造均勻凍乾餅，而無過量空洞於其中等等。其他藥學 上可接受之載劑、賦形劑或安定劑，譬如在^^所以式馨藥 #學第16版，Osol，A.編著（1980)中所述者，可被包含在預康乾 調配物（及/或經凍乾調配物及/或經重配調配物）中，其條 件是不會不利地影響所要之調配物特性。可接受之載劑、 賦形劑或安定劑，係在所採用之劑量與濃度下，對接受者 為無毒性，且包括其他緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗^化 劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；整合劑，譬如edta;金屬 錯合物（例如Zn-蛋白質錯合物）；生物可降解之聚合體，馨如 聚酯；及/或可形成鹽之抗衡離子，譬如鈉。 ° 本文之調配物亦可含有—種以上之蛋白質，按被治療之特 定適應徵之需要而定，較佳為具有不會不利地影響 白質之互補活性者。例如，一舯 、 此期望提供兩種或多種 抗體，其係在早一調配物中結合 女< %的（例如卺體志 ^)。此《自地以料所意欲目时 存 在於組合中。 〜主π 92129 -68- 1357820 欲被使用於活體内投藥之調配物必須是無菌的。這容易在 /東乾與重配之前或之後，藉由過濾經過無菌過濾薄膜而達 成。或者，整體混合物之無菌可經由使諸成份，惟蛋白質 除外’在例如約120t下進行熱壓鍋法，歷經約3〇分鐘而達 成。 在將蛋白質、選用之凍乾保護劑及其他選用成份混合在一 起之後，使調配物凍乾。許多不同冷凍乾燥器可用於此項 目的，譬如Hu1150tm(題，)或 GT2〇TM(Leyb〇id_He_s，Ge_^) 冷凍乾燥器。冷凍乾燥係經由使調配物冷凍，接著在適合 初期乾燥之溫度下，使冰自冷來内含物中昇華而達成。於 此條件下，產物溫度係低於調配物之低共溶點或陷縮溫度 。典型上，初期乾燥之貯架溫度範園為約·3〇至25它（並侔件 是產物在初期乾燥期間仍然保持冷旬在適當壓力下，範圍 =型上為約5〇至250毫托。調配物，容納試樣之容器（例如小 玻瓶)<大小與類型’及液體體積，將主 要之時間，i浐固π 如 乎乾尿所而 '範圍可為數小時至數天（例如40-60小時）。亦 了視’!>)況進扞-外許降 量而定。推 階段’依產物中所要之殘餘水份含 容器之心Λ—μ燥之溫度範園為約㈣°c，主要係依於 與大小及所採用蛋白質之類型而定。例如，於 令燥之整個水移除期 、 约耽）。二、^@ 木/皿度，可為約15趙（例如 康乾餅者 所需要之時_力，係為會產生適當 =者，依例如溫度及其他參 被產物中> & Λ 入托床呼間係 物中《所要殘餘水份含量 約5小時（例如UM5小時）。壓力^ 〜上化費至少 壓力可與初期乾燥步騾期間所採 92129 -69- 1357820 用者相同。冷凍乾燥條件可以改變，依調配物與小玻瓶大 小而定。 2· 速乾詷配物之重西;>. 在對病患投藥之前，經凍乾調配物係以藥學上可接受之稀 釋劑重配，以致使經重配調配物中之蛋白質濃度係為至少 、·勺50笔克/鼋升，例如約50毫克/毫升至約4〇〇毫克/毫升 ’或者約80毫克/毫升至約3〇〇毫克/毫彳，或者約9〇毫克 /=升至約150毫克/毫升。在經重配調配物中之此種高蛋 白質很度，在意欲皮下傳輸經重配調配物之情況中，係被 認為特別有用。但是，對其他投藥途徑，譬如靜脈内投藥 古可^要經重配調配物中之較低濃度蛋白質（例如約W 笔克/愛升或約1 _毫克/毫升蛋白質，在經重配調配物中） 在某些具體實施例中，經重配調配物中之蛋白質濃度， 係顯著地^在料乾調配物中者。例如，在經重配二配 物中I蛋白質液度可為預;東乾調配物中之約2·如倍，或者Μ。 倍，或者3-6倍（例如至少三倍或至少四倍）。 重配-般係在約机之溫度下進行，以確保完全水合，惟 了採用其他溫度’ #需要而定。重配所需要之時間係依 如稀釋劑之類型、賦形劑與 W畀蛋白質之里而疋。舉例之稀釋 ::供菌水、注射用制菌水(議)、阳缓衝溶液(例如磷 一㈣^水）、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右 劑視：況含有防腐劑。舉例之防腐劑已被描述於 上文’其中以知族醇麵，链a a甘> 6一 、 頰譬如卞基或酚醉為較佳防腐劑。 所採用防腐劑之量係與士 &仏 你猎由汗估不同防腐劑濃度與蛋白質之 92129 •70- 1357820 相容性，及防腐劑功效測試而測得。例如，若防腐劑為芳 族醇類（譬如芊醇），則其存在量可為約αΐ_2 〇%，且較佳為 約0.5-1.5%，但最佳為約1.0-1.2%。 經重配調配物較佳係具有每小玻瓶低於6〇〇〇個粒子，其係 為2 10微米大小。 D. 液體調配物 治療調配物係被製成以供儲存，其方式是將具有所要純度 之活性成份與選用之藥學上可接受之載劑、賦形劑或安定 劑混合(办肋⑽戌縈桌存學第丨8版，Mack出版公司（Eagt〇n，pa ) 18042 [1990])。可接受之載劑、賦形劑或安定劑，在所採用之 劑I與濃度’對接受者係為無毒性，且包括緩衝劑，抗氧 化劑，包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素£、偏亞硫酸氫納 ;防腐劑、等滲化劑、安定劑、金屬錯合物(例如ζη·蛋白質 錯口物）’螯合劑，譬如EDTA，及/或非離子性界面活性劑。 當治療劑為抗體片段時，專一性地結合至標的蛋白質結合 功能部位之最小抑制片段為較佳。例如，以抗體之可變區 域順序為基礎，抗體片段或甚至是肽分子可經設計，其係 保留結合標的蛋白質順序之能力。此種肽可以化學方式合 成及/或藉由重組DNA技術製成（參閱，例如m露。等人， Proc.他以如汶 9〇 : 7889 7893 [⑼习）。 缓衝劑係用以控舍J Η # A ^古 、 ^ ΡΉ值在使治療有效性達最佳化之範圍 内尤，、疋右女疋性為？11依賴性時。緩衝劑較佳係在约 至約250 mM範圍乏普；ήι «ρ六士 λ 辰度下存在。與本發明一起使用之適當 緩衝劑包括有機與盔機醢 ......礪毆及其鹽。例如，擰檬酸鹽、磷酸 92129 •71 - 1357820 鹽'琥珀酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、 草酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽。此外，緩衝劑可包含組胺酸與 三甲胺鹽，譬如Tris。 添加防腐劑係為阻滯微生物生長，且典型上係以 %(w/v)之範圍存在》與本發明一起使用之適當防腐劑包=_ (譬如氯化十八基二甲基字基錄；氯化六甲雙铵；亨燒氧錄 鹵化物（例如氯化物、溴化物、碘化物）、氯化苄乙氧銨. 硫柳汞、•、丁基或苄基醇；對羥基苯甲酸烷酯類虱：如 對經基苯甲酸f醋或丙醋；兒茶齡；間苯二紛；冑己醇、 戊醇及間-甲酚。 渗透性劑，有時稱為"安定劑"，係存在以調整或保持液體 組合物之滲透性。當與大的帶電荷生質分予譬如蛋白質與 抗體一起使用時，其經常被稱為”安定劑，，，因其可與胺基 酸側鏈之帶電荷基團交互作用’於是減少分子間與子内 又互作用之可能性。滲透性劑可以〇1至25重量％間之任何 量存在’較佳為⑴％，考量其他成份之相對量。涂透性 劑包括多㈣醇類，較佳為三幾或較高糖醇類，壁如甘、由 、赤絲藻醇、阿拉伯_、木㈣、花㈣及甘露醇。， :他賦心劑包括可无當下列一或多種之作用劑：⑴膨歡 二：溶解度增強劑，⑶安定劑，及(4)防止變性或黏二 Μ 土之作用劑。安定劑可以每重量活性蛋白質或抗體 ’從0.1至10,000份之範圍存力曲洛丨、 豆 類（上文所列舉）；胺基酸，嬖 工糖鲜 »如丙版鉍、甘胺酸、越 天冬素、組胺酸、精胺酸、離 Ρ妝跑' 鳥胺酸、白胺酸、2-苯 92J29 -72- 1357820 丙胺酸、驗酸、蘇胺酸等；有機糖類或 捧、& ... β 警如蔗 :礼糖、礼糖醉、海藥糖、菜豆糖、甘露糖、花楸糖、 糖、核糖、核糖醇、肌醇糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇 、甘油、環多醇（例如肌醇）、聚乙二醇；含硫還原劑^ =尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、㈣乙酸_、硫基甘油、二 早硫基甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白 、、主 只-如人類血 巧白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水 2聚合體，譬如聚乙稀基四氫，比咯酮；單醣（例如木糖、甘 路糖、果糖、葡萄糖；雙醣（例如乳糖、麥芽糖、蔗糖”= 醣，譬如植物蜜糖；及多醣，譬如糊精或葡聚醣。 非離子性界面活性劑或清潔劑（亦稱為"潤濕劑I，）係存在以 幫助治療劑溶解’以及保護治療蛋白質，防止攪拌所引致 <聚集’纟亦允許調配物被曝露於剪切表面應力，而不會 造成活性治療蛋白質或抗體之變性作用。非離子性界面: 性劑係以約0.05毫克/毫升至約L〇毫纟/毫升，較佳為約〇 〇7 當克/毫升至.約0.2毫克/毫升之範圍存在。 適當非離子性界面活性劑包括聚花楸酸酯（2〇, 4〇, 6〇,仍，8〇等） 、聚氧體（184, 1S8等）、Huronic®多元醇、Trit〇n®、聚氧化乙晞 花楸聚糖單醚類（Tween®-2〇, TWeen®-80等）、月桂基聚乙二醇4⑻ 、多氧基40硬脂酸酯，聚氧化乙埽氫化蓖麻油1〇、5〇及6〇 ，單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基 纖維素。可使用之陰離子性清潔劑包括月桂基硫酸鈉、磺 酸基琥珀酸二辛基鈉及磺酸二辛基鈉。陽離子性清潔劑包 括氯化芊烷氧銨或氯化苄乙氧銨。 92129 •73- 1357820 為使調配物被使用於活體内投藥，其必須是盔 .、岡。調配 物可藉由經過無菌過濾薄膜過濾使其無菌。此處之治療矣 合物一般係被置於具有無菌入口之容器中，例如，具有^ 被皮下注射針頭貫穿之塞子之靜脈内溶液袋或小玻瓶。° 投藥途徑係根據已知且所接受之方法，譬如藉由單—曳多 重大丸劑或灌注劑，以適當方式歷經一段長時間，例如^ :皮下：靜脈内、腹膜腔内、肌内、動脈内、病灶内或： 即内途徑注射或灌注，局部投藥、吸人或藉由持續釋 長期釋出裝置。 ~ ―本又之調配物亦可含有超過一種活性化合物，按被治療特 疋適應徵之需要而$ ’較佳為具有不會不利地影響彼此之 互補活性者。替代或另夕卜此组合物可包含細胞毒劑、細 胞活素或生長抑制劑。此種分子係適當地以對於所意欲目 的有效之量存在於組合中。 j性成份亦可被捕獲輕膠囊中，其係例如藉由凝聚技術 $藉由界面1合作用製《，例如個別之幾甲基纖維素或明 勝-微膠囊及聚（甲基丙晞酸甲酉旨）微膠囊’在膠態藥物傳輸 ^統（例如微脂粒、白蛋白微球體、微乳化液、毫微粒子及 $微膠囊）’或在巨乳化液中。此種技術係揭示於 代醫藥科學第18版，同前文出處中。 可I備持續释出製劑。持續釋出製劑之適當實例包括含有 說缸《固體疏水性聚合體之半透性基質，此基質係呈成形 2件形 < ’例如冑膜或微膠囊。持續釋出基質之實例包括 κ酉曰水狹膠（例如聚（甲基丙烯酸2_羥乙酯）或聚（乙烯醇》、 92129 -74- 1357820 聚内交酯（美國專利3,773,919)、L-越胺酸與r-乙基-L-麩胺酸酯 之共聚物、不可降解乙缔-醋酸乙晞酯，可降解乳酸-乙醇 酸共聚物，譬如LUPRONDEPOTtm(由乳酸-乙醇酸共聚物與 留普内酯（leuprolide)醋酸鹽所組成之可注射微球體）及聚D-㈠-3-羥丁酸。供持續釋出用之重組蛋白質之微包膠，已被成功 地以人類生長激素（rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、間白血球活素-2 及 MN rpg 120 進行。Johnson 等人，ΑΓαί· Med 2: 795-799 (1996); Yasuda 等人，Biomed. Ther. 21 ·· 122Ί-1223 (1993) Horn 等人，Bio/Technology S : 755-758 (1990) ; Cleland，"使用聚内交酯聚乙交酯微球體系統 之單一免疫作用疫苗之設計與製造"，產銨詨疗.·至覃位與佐 途控，Powell 與 Newman 編著，(Plenum 出版社：New YorK 1995)， 第 439-462 頁；WO 97/03692 ; WO 96/40072 ; WO 96/07399 ;及美國 專利 5,654,010。 此等蛋白質之持續釋出調配物可使用聚乳酸-共乙醇酸 (PLGA)聚合體發展’此係由於其生物相容性與廣範圍生物可 降解性質所致。PLGA之降解產物，乳酸與乙醇酸，可在人 類身體中迅速地被去除。再者，此聚合體之降解能力可被 調整，從數個月至數年，依其分子量與組合物而定。Lewis， "生物活性劑自内交酯/乙交酯聚合體之受控釋出"，斧4桌 # 摩# 廣廣之立 摩1 摩聚合禮(Marcel Dekker; New York, 1990)， M. Chasin 與 R. Langer (編著）第 1-41 頁。 雖然譬如乙埽·醋酸乙烯酯與乳酸-乙醇酸之聚合體使得能 夠釋出分子，歷經超過100天，但某些水凝膠釋出蛋白質係 歷經較短時間。當經包膠之抗體留在身體中歷經長時間時 92129 •75- 1357820 -可由於曝露至37 c下水份之結果，而變性或聚集，造成 生物學活性之損失，及致免疫性上之可能改變。可對安定 化作用設計出合理策略，依所涉及之機制而定。例如，若 發現聚集機制係為分子間s_s鍵，經過硫基二硫化物交換形 成’則安定化作用可藉由修改氫硫基殘基、自酸性溶液;東 乾控制水份含量、使用適當添加劑及發展特定聚合體基 質組合物而達成。 a 微脂粒或類蛋白組合物亦可用以調配本文中所揭示之蛋白 質或抗體。參閱美國專利案號4,925,673與5,〇13,556。 本又中所述蛋白質與抗體之安定性，可經由使用無毒性 水洛性多價金屬鹽，，而被加強。實例包括Ca2 +，Mg2 +，Zn2 + ,
Fe2+’Fe'cu2'sn2+，sn4+，A121A13+。可與上述多價金屬陽 離子形成水溶性鹽之陰離子實例，包括製自無機酸及/或有 機酸類者。此種水溶性鹽具有在水中之溶解度（於2〇tT)為 至少約20毫克/毫升，或者至少約1〇〇毫克/毫升或者至 少約200毫克/毫升。 可用以形成"水洛性多價金屬鹽"之適當無機酸，包括鹽酸 、醋酸、疏酸、硝酸、硫氰酸及磷酸。可使用之適當有機 酸類包括脂族叛酸與芳族酸。在此定義内之脂族酸可被定 義為飽和或不飽和C：2·9羧酸類（例如脂族單-、二-及三羧酸 類）。例如’在此定羲内之舉例單羧酸包择飽和C2 9單羧酸 ，酷酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸及 癸酸’及不飽和C2-9單幾酸，丙烯酸、丙酸、甲基丙烯酸、 巴豆酸及異巴豆酸。舉例之二羧酸類包括飽和C2-9二羧酸類 92129 •76· 1357820 ，丙一酸、琥泊酸、戊二酸、己二酸及庚二酸，而不飽和c -羧酸力員包括順丁烯二酸、反丁晞二酸、甲基順丁缔二酸 及甲基反1'埽二酸。舉例之三羧酸類包括飽和c2.9三叛酸， 丙三酸與u，m幾酸。此外，此定義之a酸類亦可含有 =兩個幾基’以形成經錢酸。舉例之減幾酸包:乙 醇酸、礼酸、甘油酸、羥基丙二酸、蘋果酸、酒石酸及棒 樣酸。在此定義内之芳族酸包括苯甲酸與柳酸。 可用以幫助使本發明經包膠多肽安定化之常用水溶性多價 金j鹽，包括例如：⑴無機酸之南化物金屬鹽（例如氯化辞 a =化鈣）、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽及硫氰酸鹽；（2)脂族 #复酸金屬鹽（例如醋_、醋酸鋅、丙_、乙醇酸鋅 '曰乳 _1酸鋅及酒石酸鋅）；及(3)苯甲酸鹽（例如苯甲酸 與柳酸鹽之芳族羧酸金屬鹽。 E. 途療方法： 疾媽（預防或治療而言’活性劑之適當劑量係依如上文 十、被/〇療疾病之類型，疾病之嚴重性與期間，該藥 -系為預防或者治療目的而投藥，先前療法，$患之臨床 該藥劑回m負責醫師之騎而定。此藥劑 、两地'入或歷經—系列治療投予病患。 ^治療方法為IgE所媒介病症之治療。賊所媒介之病症 夕Ά病症，其特徵為遺傳傾向，以免疫學方式回應許 。天然生成之吸入與攝取之抗原，及不斷生產之職 :二位f症包括過敏性氣喘過敏性鼻炎' 異位性 過敏性月腸祸。異位病患經常具有多重過敏反應， 92129 •77- 1357820 道’但於嚴重性上改變，從偶爾溫和短暫偶發事件至嚴重 :::、威脅生命枝氣管阻塞。氣喘與特異反應性可共存 有、’力一半氧喘者亦為異位性，而又更小百分比之異 士〜亦具有氣11而。但是，特異反應性與氣喘並非完全獨 立，、因為相較於在非異位個人中，氣喘係較頻繁地發生在 :位者中’尤其是在童年期間。氣喘已進—步歷史性地被 分解為兩個亞族群，外因性氣喘與内因性氣喘。 *外因性氣喘，亦稱為過敏性、異位或免疫學氣喘，係為病 之描述，其一般係在生命早期中發展氣喘，經常在嬰兒 期或童年期間。特異反應性之其他表象，包括濕瘆或過敏 !·生鼻夂經常共存。氣喘發作可發生在花粉季節期間，於動 物存在下，或在曝露至屋内粉塵、羽毛枕頭或其他過敏原 時。皮膚試驗顯示對成因性過敏原之陽性條痕與閃光反應 。令人感興趣的是，總血清IgE濃度經常被提高，但有時正 常。 内因性氣喘，亦稱為非過敏性或自發性氣喘，典型上係首 先發生在成人生命期間，在明瞭呼吸道感染後。病徵包括 fe性或復發枝氣管阻塞，與花粉季節或曝露至其他過敏原 無關聯。皮膚試驗對一般異位過敏原為陰性，血清IgE濃度 係為正常。其他病徵包括痰血與嗜伊紅血球過多。將氣喘 分類為亞族群之其他體系，例如阿斯匹靈敏感性、運動所 引致、傳染性及心理學，僅只是定義影響某些病患比他人 較多之外部觸發因素而已。 取後，重要而應指出的是’雖然一些分類在歷史上僅與具 92129 •79- 1357820 有IgE依賴性之過敏性氣喘有關聯’但目前有強烈統計學上 有思義之數據顯示在IgE與氣喘（過敏性與非過敏性）間之相 互關係。第27章，”異位疾病”，A.I. Terr，醫療免疫學，第9版，
Simon與Schuster, Stites等人編.著（I"7)。因此，"igjg所媒介之病 症 ^，對本專利申請案之目的而言，係包括過敏性與非 過敏性氣喘。 氣喘發作之身體徵候包括呼吸促迫、可聽見哮鳴及使用呼 吸作用之副肌。快速脈搏與提高血壓典型上亦存在，其係 為同3量之嗜伊紅體在末梢血液與鼻分泌物中。肺功能顯 丁降低流率與丨秒強制呼氣體積师')。總肺容量與功能性 殘留谷置，典型上為正常或稍微增加，但可隨著極端枝氣 管痙攣而降低。 ' 氣喘之病理學可被區別為早期與晚期反應。早期之特徵為 :滑肌收縮、水腫及過度分泌，而晚期反應為細胞發炎。 氣喘可藉由各種非專一性觸發被引致，包括感染(例如病毒 呼吸道感染)、生理學因素(例如運動、換氣過度、深呼吸 、：理：因素）、大氣因素(例如二氧化硫、氨、冷空氣、 臭2㈣水蒸氣）、食入劑（例如丙嗓羅㈣職⑹）、 、：檬^類Γ辱t炎樂物^實驗吸入物(例如高滲性溶液 了象-'、，且織胺、乙酿甲膽驗、前列腺素f&)及職業性 口入物(例如異氰酸醋）。造成過敏性氣喘之各種其他職業 :::r敏原，括動物產物、昆蟲粉塵、海= 微生物”、果貫、種子、葉子與花粉'有機染料與油墨、 被生物劑、酵素、治療劑、殺菌劑、無機與有機化學 92129 1357820 異位羥犮炎，亦稱為濕疹、神經皮炎、異位性濕疹或Bes也打 氏癢疹，係為對患有特異反應性之家族性與免疫學特徵之 病患子集專一（常見慢性皮膚病症。基本特徵為瘙癢皮膚 炎性回應，其係引致特徵性對稱分佈之皮膚疹，伴隨著偏 愛某些位置。亦有IgE被Β淋巴細胞之頻繁過度產生。雖然 八位性皮炎被分類為特異反應性之皮膚形式，因其係伴隨 著過敏性鼻炎與氣喘及高IgE含量，但是，皮炎之嚴重性未 必與曝露至皮膚測試上之過敏原產生關冑，且脫敏作用（不 像八他過敏性疾病）並非有效治療。雖然高血清賊為過敏性 氣喘診斷之證實’但正常含量並未將其排除在外。此疾病 之展開可發生於任何年齡，且損害係急性地開#，伴隨著 、X腫丘療或具有脫皮之斑點。搔疼會導致渗漏與結 痂’然後是慢性苔癖化作用。於細胞層次上，急性損害為 水腫’且真皮係被單核細胞’ CD4淋巴細胞浸潤。嗜中性白 血球、嗜伊紅體、漿細胞及嗜鹼細胞是稀少的，但有去顆 粒化肥大細胞存在。慢性損害之特徵為表皮增生、角化過 、全角化且真皮係被單核細胞、Langerhan氏細胞及肥 大細胞浸潤。亦可能有纖維變性之病灶區域，包括小神經 之神經束衣之涉入^ 過録貧㈣，亦稱為嗜伊紅胃腸病，為-種不尋常異位 表象’其中多重啡食物敏感性係與局部胃腸道黏膜反應有 關聯。其在成人Φ你，丨,、古 .^ 、成人中很少t，但在幼兒中較常見，但短暫。 當所攝取之食物過敏原盥 ,、^ 〃、細黏膜中之局部IgE抗體反應時 ’此症狀結果會釋出肥大細 肥A體，而在用餐之後不久即 92129 •81 - 丄妁7820 ^成胃腸病徵。持續曝露會產生慢性發炎，而造成胃腸蛋 :質損失與蛋白過少水腫。經過發炎腸黏膜之血液流失可 能足夠顯著，造成鐵缺乏貧血。此過敏性反應係在過敏原 曝露後局部發生於上胃腸黏膜中，但以過敏原避免解決。 過敏裡犮肩瘅拳扇疹係明顯地為IgE所媒介，但其缺乏基 、決疋子且/又有偏愛異位個人。過敏性反應為急性全身 化變應性反應’伴隨著同時涉及數種器官系統，經常為心 血g、哞吸道、皮膚及胃腸。此反應係為免疫學上所媒介 且其係發生在曝露至病患已在先前對其敏感之過敏原時 。蓴麻療與血管神經性水腫係指身體腫脹、紅斑及播療， 由於表面皮膚血管中之組織胺刺激之受體所造成，且係為 王身過敏之正字標記皮膚特徵。全身過敏係為igE所媒介之 反應同時發生在多重器官中，由於藥物、昆蟲毒液或食物 2造成。其係突然因過敏原所引致之肥大細胞負載之所 k成，而在各種重要器官之功能上造成深遠且威脅生命之 =。血管虚脫、急性氣道阻塞、皮膚血管擴張與水腫及 胃腸與生殖泌尿肌肉痙攣，幾乎同時發生，惟未必達相同 程度。 ic敏f生反應之病理學疾病包括血管神經性水腫與膨大過度 之肺臟，伴隨著氣道义黏液堵塞與病灶膨脹不全。於細胞 層次上，肺臟係以類似如同在急性氣喘發作期間之方式呈 現，伴隨著枝氣管黏膜下腺之過度分泌、黏膜與黏膜下水 腫、枝氣管周圍血管充血及在枝氣管壁中之嗜伊紅血球過 夕肺水腫與出血可能存在。枝氣管肌肉痙攣、高膨脹及 92129 -82- 1357820 甚至是肺胞之破裂亦可能存在。人類過敏性反應之重要特 徵包括水腫、血管充血及嗜伊紅血球過多，在喉、氣管、 會厭及下咽腔之固有層中。 曝露至過敏原可經過攝食、注射、吸入或與皮膚或黏膜接 觸。反應係在曝露至過敏原後數秒或數分鐘内開始。可能 有急迫命運之最初驚嚇或感覺’接著迅速為在一或多種標 的益 S系統中之病徵：心血管、呼吸道、皮膚及胃腸。 負責過敏性反應之過敏原，係與一般和特異反應性有關聯 者不同。食物、藥物、昆蟲毒液或乳膠係為常見來源。食 物過敏原包括在甲殼類動物、軟體動物（例如龍蝦、小蝦、 蟹）、魚 '莢果（例如花生、碗豆、豆子、甘草）、種子（例如 芝麻、棉#'香旱芽菜子、芬子、亞麻子' 向日葵卜堅果 、草莓、1白、蕎麥蔓及牛乳中所發現者。藥物過敏原包 括在異種蛋白質與多肽、多醣及附著素藥物中所發現者。 包括_目（Hymen_a)昆蟲’包括蜜蜂、黃蜂 、大黃蜂、土蜂及火犧。 雖然腎上腺素為過敏性反應之典型治療劑，但抗组織胺或 2組織胺阻斷劑典型上係對較不嚴㈣祕或血管神經 性水腫反應開立。 F. 本發明方法可併用p
θ ^ 已知>α療所媒介病症之方法，無I 疋彳乍為合併或另外 成份。 σ療步驟，或作為治療調配物之附乂 例如，抗組織胺類 尤其是非鎮靜抗組織胺類，可在本發 92129 -83- 1357820 明抗-IgE抗體之前或伴隨投藥。適當抗組織胺類包括烷基胺 (例如氯苯比胺（chlorpheniramine))、乙醇胺（例如苯海拉明 (diphenhydramine))及驗遠 p井（例如異丙 17井（promethazine))。雖然許 多抗組織胺類係藉由阻斷效應子細胞上之受體部位，以拮 抗組織胺之藥理學作用，但其他常用抗組織胺藥物係藉由 阻斷組織胺從已被敏化且具備過敏原專一性IgE之肥大細胞 釋出而進行操作（例如色甘酸鈉）。抗組織胺類之實例包括 阿斯特米也（astemizole)、氮塔丁（azatadine)順丁烯二酸鹽、溴苯 叶匕胺順丁埽二酸鹽、p比氯爷氧胺順丁稀二酸鹽、西替利51 井 (cetirizine)鹽酸鹽、克列馬斯汗（clemastine)反丁烯二酸鹽、西普 洛庚汀（cyproheptadine)鹽酸鹽、地溴苯峨胺順丁稀二酸鹽、地 氯苯'^比胺（dexchlorpheniramine)順丁綿·二酸鹽、乘暈寧 (dimenhydrinate)、鹽酸苯海拉明、苯p比拉明（doxylamine)破珀酸 鹽、非克索吩達定(fexofendadine)鹽酸鹽、特吩拿定（terphenadine) 鹽酸鹽、經_鹽酸鹽、若拉提定（loratidine)、敏克靜（meclizine) 鹽酸鹽、p比甲胺（tripelennamine)檸檬酸鹽、p比甲胺鹽酸鹽、三 普利定（triprolidine)鹽酸鹽。
IgE所媒介病症之特定病徵（例如早期反應）可以擬交感藥 或具有枝氣管擴張作用之藥物改善。腎上腺素為一種寬廣 作用之α與；5-腎上腺素能劑，經常以皮下方式投藥，其劑 量為0.2-0.5毫升之1 : 100水溶液。當需要較長持久作用時， 亦使用腎上腺素（意即間經第三丁腎上腺素（terbutaline))在1 : 200懸浮液中之較長久作用形式。適當其他点-腎上腺素能藥 物包括舒喘寧（albuterol)、吡丁特醇（phtuterol)、間丙特瑞醇 92129 • 84· 1357820 (metaproterenol)、沙美特醇（salmeterol)、新異丙腎上腺素及弗莫 特醇（formoterol)，供經鼻方式（例如手握式霧化罐、間歇性正 壓力呼吸裝置或經計量之劑量加壓吸入器）或經口方式投藥。 枝氣管擴大亦可經過黃嘌呤之投藥而達成，尤其是當莫併 用上述擬交感藥物一起投藥時。黃嘌呤之實例包括胺基非 林（靜脈内250-500毫克）與茶鹼（口服10-20微克/毫升血清濃 度）。 各種IgE所媒介病症之其他病徵（例如晚期反應）可經由以 類皮質糖或其他具有消炎作用之藥物治療而被減弱。潑尼 松（每曰30-60毫克）係對嚴重發作系統地投藥，而二丙酸氯 地米松、丙酮化氟羥脫氫皮留醇及氟尼梭來係呈氣溶膠化 形式’以長期維持療法投藥。其他具有消炎作用之皮質類 固醇包括：少美塞松、布蝶松化物、地塞米松、氟氫化可 體松醋酸鹽、氟尼梭來、丙酸福路替卡松（fluticasone propionate) '氫基可體松、甲基氫化潑尼松、氫化潑尼松、潑尼松、 氟幾脫氫皮質留醇。 亦可與本發明之治療方法合併使用之非類固醇消炎藥物， 包括乙醯胺吩（acetaminophen)、阿斯匹靈、溴吩拿克（bromfenac) 執、二氯苯胺苯乙酸鈉、二氟苯柳酸、依托多拉克（etodolac) 菲諾丙吩（fenoprofen)鈣、氟雙丙吩、異丁苯丙酸（ibuprofen) 叫丨u来美薩辛(indomethacin)、酮基丙吩（ketoprofen)、曱氣滅酸 ‘#、甲減酸、那布美東（nabumetone)、那丙新（naproxen)、那丙 新(naPr〇xen)鈉、氧基苯基保泰松、苯基保泰松、吡氧胺(piroxicam) '少林達克（sulindac)、四苯醯吡咯乙酸（tolmetin)鈉。 92129 1^57820 此外’取大治療利益亦可以紐卩人、 了 乂解除充血劑（例如苯腎上腺素 、苯丙醇胺、假麻黃鹼） 5職）、咳嗷抑制劑（例如右美沙芬 (dextromethorphan)、可待因或 _ 4 —虱可待因酮）或止痛劑（例如乙 酿胺吩（__phen)、阿斯匹靈）之投藥而達成。 過敏原脫敏作用為-種治療形式，其中過敏原係被注入病 〜、中以達降低或/肖除過敏性回應之目的。其亦被稱為過 敏原免疫療法、脫敏作用赤e — 吓^ 4過敏反應注射療法。其經常與 其他過敏反應治療藥品合稱 σ衍使用，但不常作為主要治療。 當過敏原避免為不可能時，纟已被成功地採用。典型過敏 原脫敏治療係在漸增劑量中摻人無菌過敏原之皮下注射， 一週一次或兩次，直到達成會在注射位置產生短暫小局部 發炎區域之劑量為止。然後，以維持時間表給予此劑量， 每2-4週一次。過敏性脫敏作用最常被使用於治療過敏性氣 喘與過敏性鼻炎，惟其已成功地治療過敏性反應。脫敏作 用亦已經由利用佐劑被有效地使用，譬如不完全Freund氏佐 劑’其係為含水抗原在礦油中之乳化液。生理作用會產生 不溶性液體積貯’過敏原之液滴係慢慢自其釋出。過敏原 脫敏作用之另一種形式’係使單體性過敏原與戊二醛聚合 ，以產生具有相對較低過敏原性之分子（意即造成過敏性回 應），同時保持有效程度之致免疫性。 G. 醫藥劑量： 本發明醫藥組合物之劑量與所要藥物濃度，可依所設想之 特定用途而改變。適當劑量或投藥途徑之測定，係良好地 在一般技師之技術範圍内。動物實驗係提供測定人類療法 92129 -86- 1357820 有效劑量之可信賴指引。有效劑量之物種間比例法，可按 照由Mordenti，J.與Chappell，W. ”物種間比例法在毒性動力學中 之利用"，毒羟僉力#痒誇桌##屬，Yacobi等人，編著，Peigam〇n 出版社，New York，1989,第42-46頁，所設下之原理進行。 當使用本文中所述多肽或抗體之活體内投藥時，正常劑量 可以改變，從每天約1〇毫微克/公斤至高達約1〇〇毫克/公 斤哺乳動物體重，或更多，較佳為約1毫克/公斤/天至1〇 宅克/公斤/天，依投藥途徑而定。關於特定劑量與傳輸方 法之4曰引係提供於文獻上；參閱，例如美國專利4,657,760 ; 5,206,344 ;或5,225,212。不同調配物將對不同治療與不同病症 有效’且意欲治療特定器官或組織之投藥可使得必須以不 同於另一種器官或組織之方式傳輸，係在本發明之範圍内 。再者’劑量可藉由一或多次個別投藥或藉由連續灌注投 藥。對於重複投藥歷經數天或較長時間，依症狀而定，治 療係被持續著直到發生疾病徵候之所要壓抑為止。但是， 可使用其他劑量服用法。此療法之進展係容易地藉習用技 術與檢測監控。 H. 調配物之授藥 本發明之調配物’包括但不限於經重配調配物，係被投予 需要以此蛋白質治療之哺乳動物，較佳為人類，根據已知 方法’譬如以大丸劑之靜脈内投藥，或藉由連續灌注歷經 一段時間’藉由肌内、腹膜腔内、腦脊髓内、皮下、關節 内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途徑。 在較佳具體實施例中’調配物係藉由皮下（意即皮膚下方） 92129 • 87- 1357820 投藥’投予哺乳動物。為達此項目的，可將調配物使用注 射。〇/主射但疋，可採用供此調配物投藥之其他裝置，蓉 如注射裝置（例如Inject-easeT Μ與GenjectT M裝置）；注射筆（座如 GenPen-V自動注射裝置、無針裝置（例如 BioJectorTM);及皮下貼藥傳輸系統。 在一項特殊具體實施例中’本發明係針對供單—劑量投藥 單位用（套件。此種套件包含治療蛋白質或抗體之各水調 配物之容器，包括單-或多分室預充填注射器。舉:之預 无填注射器可得自 Vetter GmbH，Ravensburg，（3ermany。 蛋白貝之適當劑量（"治療上有效量"）係依例如待治療之症 狀’症狀之嚴重性與期間，蛋白質係供預防或者治療目的 投藥，先前療法，冑患之臨床病歷與對蛋白質之回應，所 使用之蛋白質類型，及負責醫師之判斷而冑。此蛋白質係 適當地以-次投予病患或歷經一系列治療，且可在從診斷 ，何時間下投予病患。此蛋白質可以單獨治療或搭配 其他可用於治療討論中症狀之藥物或療法投藥。 在所選擇之蛋白質為抗體之情況中，約0.1-20毫克/公斤 係為投予病患之最初候選劑量，無論是例如藉由一或多次 個別投藥。但是，可使用其他劑量服用法。此療法之進展 係容易地藉習用技術監控。 關於抗-IgE調配物（例如rhuMAbE_25、細細-26、之 用途’係包括例如IgE所媒介過敏性疾病、寄生感染、間質 ^耽炎及氣喘之治療或預防。依欲被治療之疾病或病症 疋，係將治療上有效量（例如約丨_15毫克/公斤）之抗· 92129 • 88 - 1357820 抗體投予病患。 I. 製造之物# 於本發明之另一項且鞞金 /、體3減例中，係提供製造物件，其含 有調配物，且較佳係提俾 /、/、使用之說明書。製造物件包括 容器。適當容器包括例如 瓶子、小玻瓶（例如雙室小玻瓶） 、注射器（譬如單一或雔会、+ ή —又至〉王射器）及試管。容器可製自多 種材料，譬如玻璃或塑膠。空 咏奋崧係容納此調配物，而在該 谷器上或μ其、σ之;^籤係指示關於重配及/或使用之指引 此標籤可4步扣不凋配物可用於或意欲用於皮下投藥 。容納此調配物之容器可為多次使用之小玻瓶，其允許經 重配調配物之重複投藥（例如2_6次投藥）。製造物件可進一 步包括第二個容器，其包含適當稀釋劑（例如Bwpi)。在稀 釋劑與經凍乾調配物混合時，於經重配調配物中之最後蛋 白質濃度，一般係為至少50毫克/毫升，製造物件可進一步 包含從商業與使用者觀點為所期望之其他物質，包括其他 缓衝劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器及具有使用說明書 之包裝插圖。 參考下述實例，將更充分瞭解本發明。但是，其不應被解 釋為限制本發明之範圍。在整個揭示内容中之所有引文， 係據此特別併於本文供參考。 於另一項具體實施例中’本發明係提供一種製造物件，其 包含本文中所述之調配物，供自動注射器裝置之投藥。自 動注射器可被描述為一種注射裝置，於啟動時，將傳輸其 内容物，無需來自病患或投藥者之其他必要動作。當傳輪 92129 •89- 1357820 速率必須恒定，且傳輸時間係大於數時刻時，其特別適合 治療調配物之自動藥療法。 【實施方式】 實例1 抗-IgE rhuMAbE25 ΓΈ25”）調配物之製備 單株抗-IgE抗體rhuMAbE25之調配物係製自E25整體殘留批 號K9094A (40毫克/毫升rhuMAb E25, 85 mM海藻糖，5 mM組胺酸， pH 6, 0.01% Tween 20)或 rhuMAbE25 Q-Pool (5 毫克 / 毫升 rhuMAb E25, 25mMTris，200mMNaCl)。 rhuMAbE25之水溶液係於2-8°C下，使用Slide-A-Lyzer滲析卡匣 (Pierce)，藉由滲析至不同緩衝劑（20 mM His-HCl與200 mM Arg-HC1, pH 6.0)中而製成。然後，將試樣轉移至Centricon-30離心微 型濃縮器（Amicon)之試樣儲槽中。經由使Centricon-3濃縮器在 4000-5000克下旋轉’使蛋白質濃縮，直到達成所要之蛋白質 濃度為止。 接著，使用.超過濾’使試樣濃縮至〜150毫克/毫升rhuMAb E25。將Tween 20添加至各製備物中，達最後濃度0.02%。將 所有調配物過滤，以無菌方式填入3 cc FormaVitrum小玻瓶中 ，並在種類100室中，以13-毫米Diakyo塞子塞住。 實例2 方法與物質： 安定性研究：將所有調配物於1毫升下，裝填在3 cc FormaVitrum小玻瓶中’並在種類1〇〇無菌裝填套組中，以u 毫米Diakyo塞子塞住。將小玻瓶於-70、2-8、15、30及4(TC下 92129 •90· 135782〇 ’放置在不透光容器中》 、挽拌研究：將各_物之液份放置在小玻瓶中。將小破瓶 於室溫下，在Glas-Col工作台上振盪器上，以水平方式攪拌 將振盪器設定在70，具有長臂3〇公分（最大）^於攪拌後 ’檢查試樣’並根據下列擬案分析。 乂冷凍·解凍研究：使E25試樣遭受三次冷凍_解凍循環。各 循環包括在-70 C下冷凍過夜，接著於室溫下解凍約—小時 。於各循環後，使用光線箱，以目視方式檢查試樣以評 估液體之顏色與清澈性。混濁度與可溶性聚集體係按照下 述擬案度量。 分析方法：安定性試樣係藉由表丨中所概述之方法分析 表1 :分析方法 — 目的 顏色、清澈性、外觀a 液體調配物之目視檢杏 尺寸排阻層析（SEC)b 度量％單體、可溶性聚集 體及低分子量成份 疏水性交互作用層析（HIC)C 度量Asp-32異構化 程度與自由態硫醇 UV光譜掃描（重量分析）f 度量蛋白質濃度 混濁度（平均OD 340-360毫微米）d 度量可溶性與不溶性 聚集體 活性e 測定抗-IgE之結合活性 a顏色、外觀及清澈性之通過： 試樣之顏色、外觀及清澈性係以目視方式，對著白色與黑 色之檢查背景評估，並與等體積之負對照組比較。應使試 樣小心地旋渦打轉，以確保均勻混合，但不太過激烈以致 92129 -91 - 1357820 產生氣泡。 b尺寸排阻層析： 於HP 1100層析系統中，使用TSK SUPER SW3000 (4.6 X 300毫米） 管柱。將管柱裝填20微克蛋白質，並在0.1 Μ磷酸鉀pH 6.8中 溶離。試樣係於280毫微米下，藉由UV偵測器度量。 e疏水性交互作用層析（HIC): HIC實驗係於HP 1100液相層析系統上，使用TSK苯基-5PW (7.5 X 75毫米）管柱（TosoHaas)進行。將管柱裝填28微克木瓜酯 素消化之Fab片段，並以硫酸銨在20 mM Tris緩衝劑中之濃度 梯度液，從2M至0M進行溶離。吸收峰係於210毫微米下， 藉由UV偵測器監測。 d混濁度： 試樣之混濁度係使用HP光譜儀，在1-公分行程長度比色杯 中測定。混濁度係經計算為得自340-360毫微米之平均吸光率。 6抗-IgE單株抗體之活性係藉由受體結合抑制檢測測定。試 樣係在含有磷酸鹽緩衝劑、0.5% BSA、0.05%聚花楸酸酯20 、0.01%硫柳汞之檢測稀釋劑中，被稀釋以落在100與1.56微 克/毫升之標準曲線範圍内。以IgE受體塗覆微滴定板，然 後以IgE-生物素與稀抗-IgE試樣培養。IgE-生物素結合至與抗-IgE單株抗體活性有關聯受體之量，係使用鏈黴胺基酸-HRP 度量。數據係使用4-參數計算術曲線吻合程式分析。 〔抗體之濃度係在Hewlett Packard 8453二極體陣列分光光度計 上，以1-公分石英比色杯獲得。濃度係使用1.5公分_1 (毫克 /.毫升）_ 1之吸收率計算。 92129 -92- 1357820 液體調配物之摘述 調配物 杳白質範圍 緩衝劑/範圍 賦形劑/範圍 80毫克/毫升E25 50 mM組胺酸-HC1 150 mM海藥糖 0.05%聚花楸酸酯 20 pH 6.0 40-150 毫克/毫升 His-HCl 或 His-醋酸鹽 範圍：10 mM-100 mM 海藻糖或薦糖 範圍：20 mM-350 mM 聚花楸酸酯：0.01 % -0.1% 150毫克/毫升E25 20mM组胺酸-HC1 200 Mm ArgHCl 0.02%聚花楸酸酯 20 pH 6.0 40-260 毫克/毫升 His^iCl 或 His-醋酸鹽 範圍：10 mM-100 mM ArgHCl 範圍： 50 mM-200 mM 聚花楸酸酯：0.01 % -0.1% 組胺酸與ArgHCl掴配物中150毫克/毫升E25之安定性數據 溫度 (°〇 時間 (月） 目視 PH SECa% 單體 HICb% 主要 功效e 混濁度d 5 0 通過 6.2 99.0 64 106 0.25 1 通過 6.0 99.2 63 100 0.27 3 通過 6.0 99.3 63 111 0.25 16 通過 6.0 98.9 62 83 0.27 30 1 通過 5.9 98.43 54 91 0.25 3 通過 6.1 97.53 42 65 0.30 16 通過 6.0 90.63 19 28 0.54 組胺g ?斑海蔆糖調配物中80毫克/毫升E25之安定性數據 溫度 時間 目視 pH SECa% HICb% 功效e 混濁度d _(°C) (月） 單體 主要 5 0 通過 5.7 99.1 64 100 0.20 1 通過 5.8 98.7 63 92 0.20 3 通過 5.7 98.8 63 124 0.20 6 通過 5.7 99.1 63 97 0.21 14 通過 5.7 99.0 62 83 0.21 24 通過 5.7 98.8 62 84 0.20 30 1 通過 5.8 98.7 55 77 0.20 3 通過 5.7 97.4 41 76 0.29 6 通過 5.8 95.5 31 48 0.38 14 通過 5.7 93.1 22 30 0.48 92129 •93- 1357820 a. 用於度量可溶性聚集體與片段之尺寸排阻層析 b. 對於木瓜酯素消化之E25之疏水性交互作用層析 c. IgE受體結合抑制檢測 d. 平均OD (340-360毫微米） 攪拌研究： T0 3天後振盪 調配物 目視 SEC (%單體） 混濁度 目視 SEC (%單體） 混濁度 1 2 通過 99.5 0.18 通過 99.0 0.19 通過 99.3 0.18 通過 99.4 0.19 調配物 1 : 156 毫克 / 毫升 E25, 200 mM ArgCl, 23 mM His, 0.02% T20 調配物 2 : 150 毫克 / 毫升 E25, 182 mM ArgCl, 20 mM His, 0,02% T20 冷凍解凍研究： T0 第1循環。 11 第3循環。 f麦 調配物 目視 SEC% 單體 混濁度 目視 SEC% 單體 混濁度 目視 SEC% 單體 混 >蜀度 1 2 通過 99.5 0.18 通過 99.0 0.19 通過 99.3 0.17 通過 99.2 0.19 通過 99.4 0.17 通過 99.2 0.18 調配物 1 : 156 毫克 / 毫升 E25, 200 mM ArgCl，23 mM His, 0.02% T20 調配物 2 : 150 毫克 / 毫升 E25, 182 mM ArgCl, 20 mM His，0.02% T20 實例3
抗-IgE單株抗體（E26)液體調配物之試樣係在20 mM緩衝劑 中製成，然後於30°C與40°C下儲存。E26之安定性係藉由層析 與活性度量法測定。尺寸排阻層析係用於測定可溶性聚集 體，而胃蛋白酶消化試樣之疏水性交互作用層析係用於度 量異構化作用。試樣之活性係利用IgE受體結合抑制檢測監 測。如圖1、2及3中所示，E26之降解係高度地依緩衝劑之pH 92129 -94- 1357820 值而定。E26顯示在約pH 6.0為最安定。 實例4 微粒子調配物為製造高濃度液體調配物之主要挑戰，因其 通常係隨著蛋白質濃度於壓力條件下之增加而增加。圖4顯 示濃E26液體調配物之攪拌研究結果。調配物係在20mM琥 珀酸鹽、192 mM海藻糖（pH 6.0)及不同濃度之聚花楸酸酯20 · 中製成。微粒子調配物係藉由混濁度度量法監測。其結果 顯示E26溶液之混濁度會隨著攪拌時間而增加。至少0.01%聚 花楸酸酯之添加，對於減少壓力條件下之微粒子形成是必 須的。對濃E25液體調配物亦發現類似結果。 實例5 圖5顯示150毫克/毫升E25之液體調配物，藉由經凍乾E25 之重配而製成。鹽濃度之增加會抑制可逆微粒子形成，並 造成混濁度讀數之減少。在所有經測試之鹽中，具有Arg-HCl 之調配物係顯示具有最小混濁度。對於使用TFF方法所製成 之E25，亦已發現鹽濃度對於降低混濁度讀數之作用。 實例6 E25於ArgHCl存在下之液體調配物，亦顯示具有比其他液 體調配物較佳之安定性。圖6與7顯示E25於150毫克/毫升 下，在含有ArgHCl、CaCl2及MgCl2之液體調配物中之安定性 研究。對於含有ArgHCl，具有或未具有蔗糖之液體調配物而 言，以混濁度、異構化作用及碎裂觀之，在其安定性上只 有極少差異。含有ArgHCl之液體調配物係比含有MgCl2與CaCl2 之調配物更安定。 92129 -95- 1357820 實例7 圖8顯示具有醋酸鹽與組胺酸調配物之E25液體調配物之安 定性研究結果。具有組胺酸之調配物具有比醋酸鹽調配物 較高之pH值。此等結果清楚地顯示E25在組胺酸、ArgHCl液 體調配物中，係比在其他條件下更安定。 實例8 高濃度之E25可於某些離子存在下形成固態凝膠，譬如擰 檬酸根、琥珀酸根及硫酸根（表I)，特別是在2-8°C之儲存溫 度下。使用精胺酸-HC1作為賦形劑，允許吾人調配E25至高 達超過200毫克/毫升，而無凝膠或沉澱物形成。 92129 96- 1357820 表1 :各種賦形劑對於E25在125毫克/毫升pH 4.0下之凝膠 化與黏度之作用 賦形劑 賦形劑 濃度 MM 製劑 於TO (340-360 毫微米） 下之混濁度 抗體濃度 毫克/亳升 目視外觀 SWFI Lyo Recon 0.21 125 透明 NaCl 188 Lyo Recon 0.25 125 透明 琥珀酸鹽 94 Lyo Recon 0.31 125 凝膠 琥珀酸鹽 19 Lyo Recon 0.28 125 凝膠 棒權酸鹽 188 Lyo Recon 未定 125 凝膠 檸檬酸鹽 19 Lyo Recon 未定 125 凝膠 Na2 S04 未定 Lyo Recon 未定 125 凝膠 Na2 SO4 未定 Lyo Recon 未定 125 乳白色 磷酸鹽 未定 Lyo Recon 未定 125 乳白色 醋酸鹽 188 Lyo Recon 未定 125 透明 醋酸鹽 94 Lyo Recon 未定 125 透明 醋酸鹽 19 Lyo Recon 未定 125 透明 組胺酸 94 Lyo Recon 0.19 125 透明 組胺酸 47 Lyo Recon 0.24 125 透明 精胺酸-HC1 150 Lyo Recon 0.25 137 透明 精胺酸-HC1 200 TFF 0.19 162 透明 精胺酸-S04 150 Lyo Recon 0.27 137 凝膠 CaCl2 125 TFF 0.32 147 透明 MgCl2 125 TFF 0.48 147 乳白色 實例9 蛋白質或抗體在大腸桿菌中之表現 此實例係說明藉由在大腸桿菌中之重組表現，製備所要蛋 白質或抗體之未經糖基化形式。 使所要蛋白質或抗體編碼之DNA順序，係首先使用經選擇 之PCR引物放大。引物應含有限制酵素位置，其係相應於所 92129 -97- 1357820 選定表現載體上之限制酵素位置。可採用多種表現載體。 週當載體之實例為PBR322 (衍生自大腸桿菌；參閱B〇livar等 人，: 95 (1977))，其含有對胺苄青霉素與四環素抗藥性 之基因。將載體以限制酵素消化，並脫磷醯基化。然後， 將PCR放大之順序連接至載體中。此載體較佳係包含一些順 序，其係對抗生素抗藥性基因、吨啟動子、多Ms前導物（包 括瑕初六個STII密碼子、多他順序及腸激酶分裂位置）、所 要蛋白質或抗體之密碼區域、λ轉錄終止劑及argu基因進行 編碼。此外，載體可包含使所要蛋白質或抗體編碼之原本 順序核酸之未轉譯5,與3,區段之至少非無意義部份。 接著，使用Sambrook等人，如前文出處中所述之方法，使用 連接混合物轉化所敎之大腸桿菌冑#。轉化株係藉由其 生長於LB板上之能力作確認，然後選擇抗生素抗藥性菌落 可將質粒DNA單離，並藉由限制分析與DNA定序作確認。 ^選擇之無性繁殖系可在液體培養物培養基中生長過夜， 譬如補充抗生素之培養基。接著，可將過夜培養物用以接 種較大規模培養物。然後，使細胞生長至所要之光密度， 於此段期間内，起動表現啟動子。 使細胞再培養數小時後，可藉離心採集細胞。藉由離心分 離所獲得之細胞丸粒，可❹此項技藝中已知之各種作用 劑增溶二接著，可使已增落之所要蛋白質或抗體，使用金 屬螯合管柱，於允許已增溶之蛋白質或抗體緊密結合 件下純化。 崎 所要之蛋白質或抗體可使用下述程序，在大腸桿菌中，以 92129 1357820 多His標記之形式表現。使所要蛋白質或抗體編碼之DNA， 係首先使用經選擇之PCR引物放大。引物係含有限制酵素位 置，其係相應於所選定表現載體上之限制酵素位置，及其 他有用順序，以提供有效與可靠轉譯引發，於金屬螯合管 柱上之迅速純化，及以腸激酶之蛋白分解移除。然後，將PCR 放大之多His標記之順序連接至表現載體中，其係用以轉化 大腸桿菌宿主，以菌種 52 (W3110 fohA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)為基礎。首先，使轉化株於30EC下，生長在含有50 毫克/毫升羧苄青霉素之LB中，並振盪直到達成3-5之O.D.600 為止。接著，將培養物稀釋50-100倍至CRAP培養基（經由將500 毫升水中之3.57克（NH4)2S04、0.71克檸檬酸鈉2H20、1.07克KC1 、5.36 克 Difco 酵母萃取物、5.36 克 Sheffield hycase SF，以及 110mMMPOS,pH7.3,0.55% (w/v)葡萄糖及 7mMMgS04 混合而製 成）中，並在30EC下生長大約20-30小時，且振盪。移除試樣 ，以藉SDS-PAGE分析確認表現，並使整體培養物離心，以 使細胞形成丸粒。使細胞丸粒冷凉，直到純化與再折疊為 止。 使0.5至1升發酵之大腸桿菌糊劑（6-10克丸粒）以10體積（w/v) ，再懸浮於7 Μ胍，20 mM Tris，pH 8緩衝劑中。添加固體亞硫酸 鈉與連四硫酸鈉，使得最後濃度個別為0.1M與0.02 Μ，並將 溶液於4EC下攪拌過夜。此步驟造成變性蛋白，其中所有半 胱胺酸殘基均藉由亞硫酸基化作用被阻斷。使溶液於40,000 rpm下，在Beckman UltracentifUge中離心30分鐘。將上層清液以 3-5體積金屬螯合管柱緩衝劑（6 Μ胍，20 mM Tris，pH 7.4)稀釋， 92129 -99- 1357820 並經過0.22微米遽器過遽，以進行淨化。將已淨化之萃取物 裝填至5毫升QiagenNi-NTA金屬螯合管柱上，在金屬螯合管 柱緩衝劑中達成平衡。將管柱以含有5〇mM咪唑（Calbiochem，
Utrol級）之另外缓衝劑pH 7 4洗滌。將此蛋白質以含有25〇 _ ·. 咪唑之緩衝劑溶離。匯集含有所要蛋白質之溶離份，並儲 — 存於4EC下。蛋白質濃度係使用以其胺基酸順序為基礎計算 而得之消光係數，藉由其在280毫微米下之吸光率評估。
經由將試樣慢慢稀釋至剛製成之再折疊緩衝劑中，使蛋白 籲 質再折疊，該缓衝劑包含：20mMTris，pH86,〇3MNaC1，25M 尿素，5mM半胱胺酸，2〇mM甘胺酸及lmMEDTA。再折疊體 積係經選擇，以致使最後蛋白質濃度係在5〇至1〇〇微克/毫 升又間。將再折疊之溶液在4EC下溫和攪拌12_36小時。藉由 添加TFA達最後濃度〇.4%(pH值大約3)，使再折疊之反應物 伞滅於蛋白質進—步純化之前，使溶液經過〇 22微米濾器 過遽，並添加乙猜’以達2，·最後濃度。使再折φ之蛋白 質於Poros Rl/Η逆相管柱上層析，使用〇1%皿之可移動緩衝 φ ，，並以Η)·%乙腈之梯度液溶離。使具有謹吸光率之 洛離液份在SDS聚丙埽醯胺凝膠上分析，並匯集含有均勻再 # ®蛋白質之溶離份。一般而言’大部份蛋白質之適當再 折邊物種係在最低乙腈濃度下溶離出，因為此等物種係與 生内部物處最緊密’該内部物質係經隔離以免與& · :樹月日人互作用'每聚集之物種通常係在較高乙腈濃度下 谷離出Ρ余了將蛋白質之折疊錯誤形式自所要之形式中解 析以外’逆相步驟亦將内毒素自試樣移除。 92129 •100- 1357820 匯集含有經折疊之所要蛋白質或抗體之溶離份，並使用被 引導朝向溶液之溫和氮氣流，移除乙腈。蛋白質係被調配 至20 mM Hepes，pH 6.8，具有0.14 Μ氯化納與4%甘露醇，藉由 滲析或藉由凝膠過濾，使用G25特級(Pharmacia)樹脂，在調配 物缓衝劑中達成平衡，並經殺菌過滤。 實例10 哺乳動物細胞中蛋白質或抗體之表現 此實例係說明藉由在哺乳動物細胞中重組表現，製備所要 蛋白質或抗體之.潛在糖基化形式。 載體pRK5 (參閱EP 307,247，1989年3月15日公告）係被採用 作為表現載體。視情況，使用譬如Sambrook等人如前文出處 中所述之連接方法，將使所要蛋白質或抗體編碼之DNA， 以經選擇之限制酵素連接至pRK5中，以允許插入此種DNA。 於一項具體實施例中，經選擇之宿主細胞可為293細胞。 於組織培養板中，使人類293細胞（ATCC CCL 1573)在培養基中 生長至匯合’該培養基譬如補充牛胎兒血清及視情況選用 之營養物成份及/或抗生素之DMEM。將約10微克使所要蛋 白質或抗體編碼而已連接至pRK5之DNA，與約1微克使 VA RNA 基因編碼之 DNA [Thimmappaya 等人，〇//, II : 543 (1982)] 混合，並溶於 500 微升 1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，0.227 M CaCl2 中。於此混合物中，逐滴添加500微升50mMHEPES(pH7.35)， 280mMNaCl, 1.5mMNaP04，且於25°C下形成沉澱物，歷經10分 鐘。使沉澱物懸浮並添加至293細胞中，並使其於37°C下靜 止約四小時。吸出培養基，並於30秒内，添加2毫升PBS中 92129 -101 - 1357820 之2〇%甘油。然後，將293細胞以不含血清培養基洗滌，添 加新培養基，並使細胞培養約5天。 於轉移感染後大約24小時，移除培養基，並以培養基（單 獨）或含有200 μα /毫升35S-半胱胺酸與200 "Ci /毫升35S-甲 ‘ 硫胺酸之培養基置換。培養12小時後，收集經調理之培養 ^ 基’於旋轉濾器上濃縮，並裝填至15% SDS凝膠上。可使經 處理之凝膠乾燥，並曝露至薄膜，歷經所選擇之時期，以 顯tf所要蛋白質或抗體存在。含有轉染細胞之培養物可進 籲 行進一步培養（在不含血清培養基中），並在經選擇之生物 檢測中測試培養基。 於一種替代技術中，可將所要之蛋白質或抗體暫時引進293 田胞中，使用 Sompg^ac 等人，ϋ,，: 7575 (1981) 所述之葡聚醣疏酸鹽法。使293細胞在轉子燒瓶中生長至最 大密度，並添加700微克已連接至pRK5中之使所要蛋白質或 抗體編碼之DNA。使細胞首先藉由離心分離，自轉子燒瓶 濃縮，並以PBS洗滌。使DNA_葡聚醣沉澱物於細胞丸粒上培 讀 養四小時。將細胞以20%甘油處理90秒，以組織培養基洗滌 ，並再引進含有组織培養基、5微克/毫升牛騰㈣及〇1微 克/毫升牛鐵傳遞蛋白之轉子燒瓶中。於約四天後，使經調 理之培養基離心，並過濾，以移除細胞與碎屑。然後，可 · 使含有經表現所要蛋白質或抗體之試樣濃縮，並藉任何經 . 選擇之方法純化，譬如滲析及/或管柱層析。 於另一項具體實施例中，所要之蛋白質或抗體可在咖細 胞中表現W連接至卿之所要蛋白質或抗體編碼用之職 92129 102· 1357820 ，可使用已知試劑，譬如CaP04或DEAE-葡聚醣，轉移感染至 CHO細胞中。如上文所述，可培養細胞培養物，並將培養基 以培養基（單獨）或含有放射性標識譬如35 S-甲硫胺酸之培養 基置換。於測定所要蛋白質或抗體之存在後，可將培養基 以不含血清培養基置換。較佳係將培養物培養約6天，接著 採集經調理之培養基。然後，可使含有已表現之所要蛋白 質或抗體之培養基濃縮，並藉任何經選擇之方法純化。 所要蛋白質或抗體之經抗原決定部位標記之變種，亦可在 宿主CHO細胞中表現。已連接至pRK5中之所要蛋白質或抗 體編碼用之DNA .，可自pRK5載體次代無性繁殖。次代無性 繁殖插入物可進行PCR，以在骨架中，與經選擇之抗原決定 部位標記，譬如多His標記，融合至桿狀病毒表現載體中。 接著，可使多His標記之使所要蛋白質或抗體插入物編碼之 DNA，經次代無性繁殖至SV40驅動載體，其含有選擇標記 物，譬如DHFR，供安定無性繁殖系之選擇。最後，可以SV40 驅動載體使CHO細胞轉移感染（按前述）。標識可按前述進行 ，以確認表現。然後，可使含有已表現之多His標記之所要 蛋白質或抗體之培養基濃縮，並藉任何經選擇之方法純化 ，譬如藉由Ni2 + -螯合物親和層析法。 所要之蛋白質或抗體亦可藉由短暫表現程序，在CHO及/ 或COS細胞中表現，或藉由另一種安定表現程序，在CHO細 胞中表現。 CH0細胞中之安定表現係使用下述程序進行。蛋白質係以 IgG構造物（免疫黏連素）表現，其中個別蛋白質可溶性形式（ 92129 -103- 1357820 例如胞外功能部位）用之編碼順序，係融合至含有鉸鏈、CH2 及CH2功能部位之IgGl恒定區域順序，及/或係為多His標記 之形式。 於PCR放大之後，使個別DNA次代無性繁殖在CHO表現載 體中，使用如Ausubel等人，分子立#荸之趨擬案，單元 3.16, John Wiley & Sons (1997)中所述之標準技術。CHO表現載體 係被建構成具有吾人感興趣DNA之可相容限制位置5=與3= ，以允許cDNA=s之合宜穿梭。CHO細胞中載體所使用之表 現，係如 Lucas 等人，iViuc/. A;油及從 Μ : 9 (1774-1779 (1996)中所述 ，並使用SV40早期啟動子/增強子，以驅動吾人感興趣之 cDNA與二氫葉酸鹽還原酶（DHFR)之表現。DHFR表現允許選 擇質粒在轉移感染後之安定維持。 使用市購可得之轉移感染試劑Superfect7 (Quiagen)、Dosper7或 Fugene7 (Boehringer Mannheim)，將十二微克所要之質粒DNA引進 大約1千萬個CHO細胞中。使細胞按Lucas等人如前文出處中 所述生長。使大約3xl0_7個細胞在安瓿中冷凍，以如下文所 述進一步生長與生產。 使含有質粒DNA之安瓿，藉由安置於水浴中而解凍，並藉 由形成旋渦進行混合。將内容物以吸量管吸取至含有10毫 升培養基之離心管中，並在1000 rpm下離心5分鐘。抽吸上層 清液，並使細胞再懸浮於10毫升選擇性培養基（0.2 Φ m過濾 之PS20與5% 0.2 Φ m滲濾之牛胎兒血清）中。然後，將細胞分 成數液份至含有90毫升選擇性培養基之1〇〇毫升轉子中。於 1-2天後，將細胞轉移至裝滿150毫升選擇性生長培養基之250 92129 -104- 1357820 毫升轉子中，並在37°C下培養。於再2_3天後，將25〇毫升5〇〇 毫升與2000毫升轉子以3xl〇5個細胞/毫升接種。藉由離心 刀離，並再懸浮於生產培養基中，將細胞培養基與新培養 基交換。雖然可採用任何適當CHO培養基，但實際上可使用 1992年6月16日頒予之美國專利5，丨22,469中所述之生產培養基 。將3升生產轉子在1·2χ1〇6個細胞/毫升下接種。於第〇天 ，測定細胞數目與？11值。於第丄天，將轉子取樣，並開始以 經過濾之空氣喷射。於第2天，將轉子取樣，使溫度轉變至 33°C，並採用30毫升500克/升葡萄糖與〇·6毫升1〇%消泡劑 (例如35%聚一曱基珍氧燒乳化液’ D〇w Coming 365醫藥級乳 化液）。在整個製造期間，pH值係按需要調整，以使其保持 在約7.2下。10天後或直到存活力下降低於7〇%為止，藉由 離心並經過0_22 Φ m濾器過濾，採集細胞培養物。將濾液無 論是儲存於4°C下，或立即裝填至管柱上，以供純化。 對於多His標記之構造物，係將蛋白質使用Νί·ΝΤΑ管柱 (Qiagen)純化。.於純化之前，將咪吐添加至經調理培養基中 ’達5 mM濃度。使經調理之培養基泵送至6毫升Ni_NTA管柱 上，於 4°C 下，在含有 0.3 M NaCl 與 5 mM 咪唑之 20 mM Hqjes (pH 7.4) 緩衝劑中，於4-5毫升/分鐘流率下達成平衡。於裝填後， 將管柱以另外之平衡緩衝液洗滌，並以含有〇 25 Μ咪唑之平 衡緩衝液溶離蛋白質。接著，使已高度純化之蛋白質，以25 毫升G25超細（Pharmacia)管柱，脫鹽至含有lOmM Hepes，0.14 Μ NaCl及4%甘露醇pH 6.8之儲存缓衝劑中，並儲存於_8〇t下。 使免疫黏連素（含Fc)構造物按下述自已經調理之培養基純 92129 -105- 1357820 化。將經調理之培養基泵送至5毫升蛋白質A管柱（Pharmacia) 上，其已經在20 mM磷酸Na緩衝劑（pH 6.8)中達成平衡。於裝 填後，在以100 mM檸檬酸(pH 3.5)溶離之前，將管柱廣泛地以 平衡缓衝液洗滌。經由將1毫升溶離份收集至含有275 Φ L之 1 Μ三羥甲基胺基曱烷（Tris)緩衝液pH 9之管件中，使已溶離 之蛋白質立即中和。接著，使已高度純化之蛋白質如上文 關於多His標記蛋白質所述，脫鹽至儲存缓衝劑中。均一性 係藉由SDS聚丙烯醯胺凝膠，及藉由Edman降解之N-末端胺 基酸定序進行評估。 實例11 蛋白質或抗體在酵母中之表現 下述方法係說明酵母中所要蛋白質或抗體之重組表現。 首先，建構酵母表現載體，以供所要之蛋白質或抗體自 ADH2/GAPDH啟動子之胞内產生或分泌。將使所要之蛋白質 或抗體及啟動子編碼之DNA插入經選擇質粒中之適當限制 酵素位置内，以導引胞内表現。關於分泌，可將使所要蛋 白質或抗體編碼之DNA無性繁殖至經選擇之質粒中，伴隨 著使ADH2/GAPDH啟動子編碼之DNA，原本訊息肽或其他哺 乳動物訊息肤，或例如酵母（2-因子或轉化酶分泌訊息/前導 物順序，及鏈結順序（若需要），以供表現所要之蛋白質或 抗體。 然後，可使酵母細胞，譬如酵母菌種AB110，以上述之表 現質粒轉變，並在經選擇之發酵媒質中培養。已轉變之酵 母上層清液可經由與10%三氯醋酸之沉澱作用，及藉SDS- 92129 -106· 1357820 PAGE分離，接著以柯麥西（Coomassie)藍色染料將凝膠染色， 進行分析。 接著，可將重組蛋白質或抗體單離，並藉由離心分離，自 發酵培養基移除酵母細胞，然後使用經選擇之藥筒濾器使 培養基濃縮而純化。可使含有重組蛋白質或抗體之濃縮液 ，使用經選擇之管柱層析樹脂進一步純化。 實例12 蛋白質或抗體在桿狀病毒感染之昆蟲細胞中 下述方法係說明所要蛋白質或抗體在桿狀病毒感染之昆蟲 細胞中之重組表現。 對所要之蛋白質或抗體進行編碼之順序，為被包含在桿狀 病毒表現載體内之抗原決定部位標記之融合上游。此種抗 原決定部位標記包括多His標記與免疫球蛋白標記（例如IgG 之Fc區域）。可採用多種質粒，包括衍生自市購可得質粒譬 如pVL1393 (Novagen)之質粒。簡言之，使所要部份蛋白質或抗 體編碼之順序，譬如使跨膜蛋白質之胞外功能部位編碼之 順序，或使成熟蛋白質編碼之順序，若此蛋白質為胞外， 則係藉由PCR，以互補至5'與3'區域之引物放大。5'引物可 摻入側面相接（經選擇）限制酵素位置。然後，使產物以此 等經選擇之限制酵素消化，且次代無性繁殖至表現載體中。 重組桿狀病毒係使用帶脂素（可市購得自GIBCO-BRL)，藉 由將上述質粒與BaculoGoldT M病毒DNA (Pharmingen)共同轉染至 草地黏蟲（Spodopterafrugiperda)("Sf9”）細胞（ATCC CRL 1711)中而產 生。於28°C下培養4-5天後，採集所釋出之病毒，並用於進 92129 -107· 1357820 一步放大。病毒感染與蛋白質表現係按O’Reilley等人，#欢启 #4趨廣鱧.·#發贫手靡，Oxford :牛津大學出版社（1994)所 述表現。 然後，可使已表現之多His標記蛋白質或抗體，例如藉由 Ni2 + -鳌合物親和層析法，按下述純化。萃取物係製自重組 病毒感染之 Sf9 細胞，按 Rupert 等人，Atowre, 362 : 175-179 (1993) 所述。簡言之，將Sf9細胞洗滌，再懸浮於音振緩衝劑（25毫 升 Hepes，pH7.9; 12.5mMMgCl2 ; O.lmMEDTA; 10%甘油；0.1% NP-40 ; 0.4 M KC1)中，並在冰上音振兩次，歷經20秒。使音 振物藉由離心分離而透明，並將上層清液在裝填緩衝劑 (50 mM磷酸鹽，300 mM NaCl, 10%甘油，pH 7.8)中稀釋50倍，並 經過0.45 Φ m濾器過濾。Ni2 + -NTA瓊脂糖管柱（可市購得自 Qiagen)係經製成具有床體積為5毫升，以25毫升水洗滌，並 以25毫升裝填缓衝劑達成平衡。將已過濾之細胞萃取物在 每分鐘0.5毫升下，裝填至管柱上。將管柱以裝填緩衝劑洗 滌至基線A280，此時開始收集溶離份。接著，將管柱以二次 洗滌緩衝劑（50 mM磷酸鹽；300 mM NaCl, 10%甘油，pH 6.0)洗滌 ，其係溶離出非專一性地結合之蛋白質。再一次抵達A2 80基 線後，將管柱以在二次洗滌缓衝劑中之0至500 mM咪唑梯度 液展開。收集 > 毫升溶離份，並藉由SDS-PAGE及銀染色或 Western氏沾吸，具有Ni2 + -NTA-共輛至驗性磷酸酶（Qiagen)，進 行分析。匯集含有經溶離His10-標記蛋白質或抗體之溶離份 ，並對著裝填緩衝劑滲析。 或者，IgG標記（或Fc標記）之蛋白質或抗體之純化，可使 92129 -108· 1357820 用已知層析技術進行 析。 包括例如蛋白質A或蛋白質G管柱層 實例13 拯體之n 此實例係說明單接P # 早株抗义製備，其可專一性地結合吾人感 興趣之蛋白質或所要之抗原。 關於製造單株抗體之技術係為此項技藝中已知，且係描述 於例如Goding，同前文出處中。可採用之免疫原包括已純化之 :要蛋：質或標的抗體’含有所要蛋白質或標的抗原之融 口蛋白質’及在細胞表面上表現此種重組蛋白質或抗原之 細胞。免疫原之選擇可由熟練技師施行，無需過度實驗。 使譬如Balb/c之老鼠免s，其方式是使用在完全版㈣氏佐 劑中礼化〈所要蛋白f或標的抗原免疫原，並以皮下或腹 膜腔内方式 以1_1〇〇微克之量注射。或者，使免疫原在 TDM佐劑（Rjbi免疫化學研究，Hamiit〇n, MT)中乳化，並注 射至動物後足部肉趾中。然後，在10至12天後，使用已在 經選擇佐劑中乳化之另外免疫原，使該經免疫之老鼠加速 。接著，歷經數週，亦可使老鼠以另外之免疫注射加速。 血清試樣可藉由後眶採血，週期性地得自老鼠，以在ELISA 檢測中測試，以偵測導引至所要蛋白質或抗原之抗體。 在適當抗體滴定度已被偵測後，對抗體為”陽性，，之動物可 以最後靜脈内注射所要之蛋白質或標的抗原進行注射。三 至四天後’使老鼠犧牲’並採集脾臟細胞。然後，使脾臟 細胞融合（使用35%聚乙二醇）至經選擇之老鼠骨髓細胞瘤細 92129 1357820 胞系，譬如P3X63AgU.l，可得自ATCC編號CRL 1597。此融合 會產生雜種瘤細胞，其接著可被覆蓋在含有HAT (次黃嘌呤 、胺基喋呤及胸：y：)培養基之96井組織培養板中，以抑制非 融合細胞、骨髓細胞瘤雜種及脾臟細胞雜種之增生。 此雜種瘤細胞係在ELISA中，篩檢抵抗所要蛋白質或標的 抗原之反應性。分泌此種單株抗體之陽性”雜種瘤細胞之 測定，係在此項技藝之技術範圍内。 陽性雜種瘤細胞可以腹膜腔内方式注射至同基因Balb/c老 鼠中，以製造含有此種單株抗體之水腹。或者，雜種瘤細 胞可在組織培養燒瓶或滾筒。瓶中生長。在水腹中產生之單 株抗體之純化，可使用硫酸銨沉澱作用，接著以凝膠排阻 層析法達成。或者，可採用以抗體之結合至蛋白質A或蛋白 負G為基礎之親和層析法。 見要蛋白質使I專一抗體夕鈦π 呈無論是原本或重組形式之所要蛋白質，可藉由蛋白質純 化技藝中之多種標準技術純化。例如，所要蛋白質之前多 肚、成熟多肽或前多肽形式，可藉由免疫親和力層析，使 7所要蛋白質專一之抗體純化。一般而言，免疫親和力 官枉係經由將會專-性地結合所要蛋白f之抗體，以共價 方式結合至經活化之層析樹脂而構成。 二:免疫球蛋白係製自免疫血清，無論是藉由與硫酸按之 /作用，或藉由在固定化蛋白質A (pha_ 職^，叫上之純化。同樣地，單株抗體係藉由硫2 92129 1357820 殿作用或於固定化蛋白¥ A卜方爲 曰資A上尤層析’製自老鼠水腹流體。 經部份純化之免疫球蛋白係以共價方式連接至層析樹脂， 譬如C活化之生物技術）。抗體 係偶合至樹脂’樹脂係、經阻斷’騎生之樹脂係根據製造 者之說明書洗務。 此種免疫親和力管柱係被使用於所要蛋白質之純化上，其 方式是自將其表現之細胞製備離份，呈可溶性形式。此製 劑係將經由差別離心所獲得之全細胞或亞細胞離份，藉由 添加清潔劑或藉由此項技藝中所習知之其他方法，藉増溶 而衍生。或者’可使含有訊息順序之可溶性蛋白質，以可 使用之量，分泌至其中生長細胞之培養基中。 使含有所要蛋白質之可溶性製劑通過免疫親和力管柱上方 ’並在允許所要蛋白質之較佳吸光率之條件下洗滌管柱（例 如局離子強度緩衝劑’於清潔劑存在下）。然後，將管柱在 使抗體對蛋白質結合瓦解之條件下溶離（例如低pH緩衝劑， 譬如大約pH 2-3 ’或高濃度促溶劑，譬如尿素或硫氰酸根離 子），接著收集想要之蛋白質。 【圖式簡單說明】 圖1.胃蛋白酶消化之抗-IgE單株抗體之疏水性交互作用層 析。試樣係在不同pH與緩衝劑下調配：（·）20 mM醋酸鹽、 (△)20mM琥珀酸鹽、（▲)20mMNa2HPO4、（八）2〇111]\41^2?〇4及 (*) 20 mM Tris緩衝劑。試樣係於30°C下儲存6個月。 圖2.於40°C下儲存6個月之抗-IgE單株抗體之尺寸排阻層析 。試樣係在不同pH與緩衝劑下調配：（_) 20 mM麩胺酸鹽、 92129 -111 - 1357820 (#)20mM醋酸鹽、（△pOmM琥珀酸鹽、（[I])20mM組胺酸、 (▲)20mMNa2HP〇4、P04 及（*) 20 mMTris 緩衝劑。 圖3.於30°C下儲存6個月之抗-IgE單株抗體之活性。試樣係 在不同pH與緩衝劑下調配：（鲁）2〇mM醋酸鹽、（△) 20mM琥 珀酸鹽、02011^ 組胺酸、（▲)20mMNa2HP04、(T)20mMK2P04 及（*) 20 mM Tris緩衝劑。 圖4.聚花楸酸酯2〇對於經加壓抗_igE單株抗體混濁度之作 用。試樣含有100毫克/毫升抗體、20mM琥珀酸鹽、192mM 海藻糖及各種量之聚花楸酸酯20，在pH 6.0下。聚花楸酸酯 濃度為（)〇、（▲) 0.01%、（#)0.02% 及（^)0.05%。 圖5.抗-IgE單株抗體在〜15〇毫克/毫升下，具有不同賦形 劑（▲) CaCl2、（▽) MgCl2及（△)精胺酸-HC1之混濁度。 圖6·抗-IgE單株抗體在〜150毫克/毫升下，具有各種賦形 劑之混濁度。試樣係被儲存於（▲)-70°C、（_)2-8°C、 、（111)30°(：及（V)40°C 下。 圓7.木瓜酯素消化之抗-IgE單株抗體之疏水性交互作用層 析分析。試樣係在〜150毫克/毫升下，以各種賦形劑調配’ 並儲存於（^)-70。(：、（_)2-8。(：、〇4)15。(：、（^)30。0及（口）40(： 下。
圖8.抗-IgE單株抗體在〜150毫克/毫升下’在（||)2〇〇11^精 胺酸-11(：1，23111]\1組胺酸，？116.0,〇)182碰精胺酸-11(：1，20碰 組胺酸邛116.0，（#)182111]\4精胺酸-1^1，2〇111]\1組胺酸，9111^薦 糖，pH6.0，（口）50碰]^(：12,27毫克/毫升海藻糖，〇.〇1%醋酞 鹽，（△WOmMMgCl^OmMMgAChO.Ol% 醋酸鹽’及（〇）5〇mM 92129 •112- 1357820
MgCl2，45 mM MgAc2，0.01%醋酸鹽中之尺寸排阻層析。試樣係 於30°C下儲存6個月。 圖9·木瓜酯素消化之抗-IgE單株抗體之疏水性交互作用層 析分析。試樣係在（_)200mM精胺酸-HCl，23mM組胺酸，（▲) 182 mM 精胺酸-HC1，20 mM 組胺酸，（# ) 182 mM 精胺酸-HC1， 20mM組胺酸，91mM蔗糖，（□WOmMMgCLJ?毫克/毫升海 藻糖，0.01% 醋酸鹽，（△)50mMMgCl2,30mMMgAc2,0.01% 醋酸 鹽，及（〇）50mMMgCl2,45mMMgAc2,0.01%醋酸鹽中調配。試 樣係於30°C下儲存6個月。 圖10.顯示抗-IgE抗體E25、E26及Hu-901之全長順序（可變與 恒定鏈）之比較。Hu-901之CDR區域係藉由底線顯示。對E25 與E26，如由Chothia所定義之CDR區域，係以粗體字顯示， 而如由Kabat所定義之CDR區域，係以括弧描繪。圖10A顯示 E25、E26及Hu-901之輕鏈順序（順序識別碼：1-3)，而圖10B 顯示E25、E26及Hu-901之重鏈順序（順序識別碼：4-6)。 92129 -113-

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093109166號專利申請案 文申請專利範圍替換本(100年10月） 請專利範圍： 一種低混濁度之安定液體調配物，其包含⑻抗_IgE抗體， 其量為約1 5 0至260毫克/毫升’（b)精胺酸-HC卜其量為100 至200 mM，（c)組胺酸’其量為10至1〇〇 mM，（d)聚花楸酸酯 ，其量為0.01至0.1% ’其中調配物進一步具有pH值範圍為 5.5至7.0 ’動黏度為約50厘史或較低，且體積滲莫濃度範 圍為200 mOsm /公斤至450 mOsm /公斤。 2. 根據申請專利範圍第1項之安定液體調配物，其中該抗 -IgE抗體之濃度範圍為180毫克/毫升至26〇毫克/毫升。 3. 根據申請專利範圍第1項之安定液體調配物，其中該抗 -IgE抗體之濃度範圍為2〇〇毫克/毫升至260毫克/毫升》 4. 根據申請專利範圍第！項之安定液體調配物，其中該抗 -IgE抗體之濃度為約150毫克/毫升。 5. 根據申請專利範圍第丨項之安定液體調配物，其中體積滲 莫濃度範圍為250 mOsm /公斤至350 mOsm /公斤。 6. 根據申請專利範圍第1項之安定液體調配物，其中精胺酸 -HC1之濃度範圍為i5〇mM至200 mM。 7 .根據申請專利範圍第丨項之安定液體調配物，其中精胺酸 -HC1之濃度範圍為至2〇〇 。 8 ·根據申請專利範圍第丨項之安定液體調配物，其中精胺酸 -HC1之濃度為2〇〇 mM。 9.根據申請專利範圍第丨項之安定液體調配物，其十抗_Ig£ 抗體為抗-IgE單株抗體。 ίο.根據申凊專利範圍第9項之安定液體調配物，其中抗_IgE 92129-1001007.doc 1357820 單株抗體包含一輕鏈，其包含順序識別碼：1所 不胺基酸序列，及一重鏈，其包含順序識別碼： 4所示胺基酸序列。 11·根據申請專利範圍第9項之安定液體調配物，其中抗_IgE 單株抗體包含一輕鏈，其包含順序識別碼：2所 不胺基酸序列，及一重鏈，其包含順序識別碼： 5所示胺基酸序列。 12·根據申請專利範圍第9項之安定液體調配物，其中抗-Ig£ 單株抗體包含一輕鏈，其包含順序識別碼：3所 不胺基酸序列’及一重鏈，其包含順序識別碼： 6所示胺基酸序列。 13.根據申請專利範圍第〖〇至1 2項中任一項之安定液體調配 物’其中抗-IgE單株抗體包含兩個相同輕鏈及兩個 相同重鍵。 14· 一種低混濁度之安定液體調配物，其包含⑷抗_IgE抗體， 其量為約150毫克/毫升，⑼精胺酸_HC1，其量為2〇〇 _ ，（c)組胺酸，其量為2〇 ^，⑷聚花楸酸酯，其量為〇 01 至1%，其中調配物進一步具有pH值為6 〇。 15. 根據申請專利範圍第14項之安定液體調配物，其中聚花楸 酸酯之量為0.02%。 16. 根據申請專利範圍第丨4項之安定液體調配物其中抗-ig£抗 體為E25 » Π. —種製造物件’其包含圍繞根據申請專利範圍第1項之調 配物之容器。 92129-1001007.doc 1357820 18.根據申請專利範圍第17項之製造物件其中容器為注射 器。 19·根據φ請專利範圍第1 8項之製造物件，纟中注射器係進 一步被包含在注射裝置中。 20. 根據申請專利範圍第丨9項之製造物件其中注射裝置為 自動注射器。 21. 根據申請專利範圍第14項之安定液體調配物，其係有效 治療IgE所媒介之病症。 22·根據申請專利範圍第2 1項之安定液體調配物，其中IgE所 媒介之病症係選自包括過敏性鼻炎、氣喘、過敏性氣喘、 #過敏性氣喘、異位性皮炎及胃腸病。 23. 根據申請專利範圍第2丨項之安定液體調配物，其中lg£所 媒介之病症為過敏性鼻炎。 24. 根據申請專利範圍第2丨項之安定液體調配物，其中IgE所 媒介之病症為過敏性氣喘。 25. 根據申請專利範圍第2丨項之安定液體調配物，其中IgE所 媒’I之病症為氣喘。 26根據申請專利範圍第2 i項之安定液體調配物，其中IgE所 媒介之病症為異位性皮炎。 27.根據申請專利範圍第2 1項之安定液體調配物，其中IgE所 媒介之病症係選自包括過敏性、過敏性枝氣管與肺麴菌病 、寄生疾病、間質性膀胱炎、高·IgE徵候簇、失調毛細管 擴張、威斯科特-奥爾德里奇（Wisk〇tt_Aldrich)徵候群、胸腺 淋巴生成不全、IgE骨髓細胞瘤及移植物·對_宿主反應。 92129-1001007.doc 叫/820 28. 根據申請專利範圍第2 1項之妾定液體調配物，其中igE所 媒介之病症為過敏性。 29. 根據申請專利範圍第2 8項之安定液體調配物，其中過敏 性病症係選自包括過敏性反應、蓴麻疹及食物過敏。 30·根據申請專利範圍第2 9項之安定液體調配物，其中過敏 性病症為食物過敏。 31·根據申請專利範圍第30項之安定液體調配物，其中食物 過敏係由於曝露至莢果所造成。 32. 根據申請專利範圍第3 1項之安定液體調配物，其中莢果 為花生。 33. —種醫藥組合物，其包含治療上有效量之根據申請專利範 圍第14項之安定液體調配物，且併用抗組織胺。 34· 一種醫藥組合物，其包含治療上有效量之板據申請專利範 圍第14項之安定液體調配物，且併用枝氣詧擴張劑。 35· 一種醫藥組合物，其包含治療上有效量之根據申請專利範 圍第14項之安定液體調配物，且併用類皮質糖。 36_ —種醫藥組合物，其包含治療上有效量之根據申請專利範 圍第14項之安定液體調配物，且併用NsAiD。 92129-1001007.doc
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