MX2011005051A - Metodo y formulacion para reducir la agregacion de una macromolecula bajo condiciones fisiologicas. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un método para reducir la agregación e inhibir la floculación de una macromolécula, tal como una proteína, bajo condiciones fisiológicas, mediante la adición de ciclodextrinas (CDs). La invención proporciona además un método para reducir al mínimo la inflamación en el sitio de inyección durante la administración subcutánea de una macromolécula y formulaciones farmacéuticas para dicha administración. Además, la invención proporciona métodos para tratar un cáncer CD20 positivo o una enfermedad autoinmune, que comprende administrar un anticuerpo anti-CD20 humanizado en una formulación farmacéutica de la invención. La invención proporciona además un método dé diálisis in vitro para evaluar la capacidad de un excipiente de reducir la agregación de un anticuerpo u otra macromolécula bajo condiciones fisiológicas.

Description

MÉTODO Y FORMULACIÓN PARA REDUCIR LA AGREGACIÓN DE UNA MACROMOLÉCULA BAJO CONDICIONES FISIOLÓGICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método para reducir al mínimo la inflamación en el sitio de inyección para la administración subcutánea de una macromolécula reduciendo la agregación bajo condiciones fisiológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En las dos últimas décadas, la tecnología de ADN recombinante ha conducido a un aumento significativo en la cantidad de medicamentos que son biomoléculas, en particular, proteínas. El aumento en medicamentos que son biomoléculas ha conducido a nuevos desafíos en la formulación de fármacos. Las elevadas dosis de agentes terapéuticos proteicos tales como anticuerpos pueden administrarse al paciente mediante infusión intravenosa pero esta ruta de administración farmacológica es inconveniente y es en general preferible formular el agente terapéutico proteico para la inyección subcutánea donde resulte posible. Sin embargo, la solución del fármaco para inyección subcutánea es en un volumen mucho más pequeño que para la infusión i.v. de modo que la proteína está necesariamente presente en una concentración más elevada. A concentraciones proteicas terapéuticas elevadas de décimos de miligramos por cada mililitro, es importante mantener a las proteínas terapéuticas establemente disueltas durante períodos prolongados de tiempo. Las soluciones de elevada concentración de proteínas aumentan la probabilidad de interacción entre proteína y proteína que favorecen la agregación; la prevención de la agregación se ha convertido en un problema principal para la formulación de fármacos de proteínas. La agregación conduce a una cantidad de problemas, incluyendo una disminución de la biodisponibilidad de la proteína activa, farmacocinética alterada, e inmunogenicidad no deseada. (Frokjaer, S. y Otzen, D.E., Nat. Rev. Drug. Discov. 4: 298-306 (2005); Jiskoot, W. y Crommelin, D.J.A., EJHP Practice 12:20-21 (2006)).

La prevención de la agregación sigue siendo en gran parte empírica, ya que los detalles moleculares del proceso de agregación son generalmente desconocidos. Una estrategia típica consiste en agregar estabilizantes a una solución proteica. Los estabilizantes comúnmente utilizados incluyen azúcares, sales, aminoácidos libres tales como L-arginina y L-glutamina (Golovanov, A.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 126:8933-8939 (2004)), polioles (Singh, S. y Singh, J., AAPS Pharm. Sci. Tech 4: 1-9 (2003); Mishra, R. et al., J. Biol. Chem. 280:15553-15560 (2005)), polietilenglicoles (PEGs), y otros polímeros, tales como polisorbatos o poloxámeros que pueden reducir las interacciones proteína-proteína (Frokjaer y Otzen, supra; Lee, R.C. et al., Ann. Biomed. Eng. 34: 1190-1200 (2006); (Nema, S. et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51 : 166-171 (1997)).

Las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos que tienen unidades d-glucopiranosa ligadas con enlaces alfa-(1 ,4) glicosídicos. CDs son producidas del maíz o de otros almidones a través de la acción de la amilasa, transglucosilasa de ciclodextrina. Las ciclodextrinas naturales más comunes son alfa-ciclodextrina, beta-ciclodextrina y gamma-ciclodextrina, que consisten en 6, 7 y 8 unidades glucopiranosa, respectivamente. Como las ciclodextrinas naturales, beta-ciclodextrina en particular, tienen baja solubilidad acuosa, se han sintetizado una cantidad de derivados que tienen solubilidad mejorada y otras propiedades físico-químicas. Los derivados de CD disponibles en el mercado incluyen CDs metiladas, CDs 2-hidroxipropiladas, CDs acetiladas, CDs ramificadas y CDs sulfobutiladas. Los sinónimos de ciclodextrina incluyen Cavitron, oligosacárido cíclico, cicloamulosa, y cicloglucano. (Para una revisión, véase Loftsson, T., y Brewster, M.E., J. Pharm. Sci. 85:101 - (1996); Uekama, K. et al., Chem. Rev. 98:2045-2076 (1998); Irie, T. y Uekama, K., Advanced Drug Delivery Reviews 36:101-123 (1999); y Szjetli, J., Puré Appl. Chem. 76:1825-1845 (2004)). Las ciclodextrinas tienen un peso molecular inferior a 25.000 daltons y, por ende, pueden ser eliminadas de la circulación sistémica mediante filtración glomerular y no se espera que se acumulen en el cuerpo. La falta de toxicidad de las ciclodextrinas naturales así como también de una cantidad de derivados farmacéuticamente relevantes tales como hidroxipropil-beta-CD y sulfobutil-beta-CD ha sido bien documentada (Uekama et al., más arriba; Szjetli, más arriba).

Las ciclodextrinas adoptan la forma de un cono truncado donde el interior es hidrófobo y el exterior es hidrófilo. La cavidad hidrófoba proporciona un entorno en el cual pueden incluirse compuestos no polares de tamaño apropiado y forman complejos. CD y sus derivados' se han utilizado como solubilizantes para fármacos pobremente solubles en agua. Por ejemplo, el ¡traconazol (Sporanox™) es solubilizado con hidroxipropil beta-CD y el mesilato de ziprasidona (Geodon™) es solubilizado con sulfobutil éter beta-CD. Otros usos de CD incluyen estabilización farmacológica, enmascaramiento del sabor y adsorbente para aceites esenciales. Los productos farmacológicos disponibles en la actualidad que contienen ciclodextrina incluyen Sporanox™ (Janssen, Bélgica), Prostavasin™ (Ono, Japón; Schwarz, Alemania), Prostandin 500™ (Ono, Japón), Geodon™ (Pfizer, USA), VFEND™ (Pfizer, USA), MitoExtra Mitozytrex™ (Novartis, Suiza), y Voltaren (Novartis, Suiza). Véase además la Tabla 1 de Szjetli, más arriba. Estas formulaciones están todas limitadas a compuestos de moléculas pequeñas.

Las moléculas farmacológicas grandes tales como péptidos y proteínas también pueden formar complejos con ciclodextrinas. La biodisponibilidad mejorada de fármacos peptídicos complejados con CDs se cree que se debe en parte del efecto inhibitorio de CDs en bombas de eflujo celular (Challa, R. et al., AAPS Pharm. Sci. Tech. 6:E329-357 (2005)). El mecanismo de estabilización para las proteínas y péptidos es también cualitativamente diferente que en el caso de fármacos de moléculas pequeñas. Si bien CDs pueden formar complejos de inclusión con fármacos de moléculas pequeñas, CDs parecen unirse a residuos de aminoácidos expuestos a solvente específicos de la proteína o péptido (Aachmann, F.L. et al., Protein Engineering 16:905-912 (2003)). Se obtiene generalmente un beneficio máximo a bajas concentraciones de ciclodextrina, y los beneficios son a menudo solamente en parte dependientes de la concentración. Por ejemplo, la agregación de IL-2 fue óptimamente inhibida mediante 0,5% de HP-beta-ciclodextrina. (Loftsson y Brewster, más arriba). La solubilidad de la hormona de crecimiento humano fue mejorada mediante CDs presentes en aproximadamente 2-6%, encontrándose que alfa y gamma CDs son varias veces menos eficaces que beta CDs. (Otzen, D.E. eí al., Protein Sci. 11 :1779-1787 (2002)).

El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación restringida a linfocitos B humanos, Bp35) es una proteína de transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD situada en linfocitos pre-B y B maduros (Valentine er a/., J. Biol. Chem.. 264(19): 11282-11287 (1989); y Einfeld ef al., EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). El antígeno es también expresado en más del 90% de los linfomas no Hodgkin de células B (NHL) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), pero no es encontrado en células madre hematopoyéticas, células pro-B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder et al., J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). Se cree que CD20 regula uno o más pasos tempranos en el proceso de activación para la iniciación y diferenciación del ciclo celular (Tedder et al., más arriba) y posiblemente funciona como un canal de iones del calcio (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).

Dada la expresión de CD20 en linfomas de células B, este antígeno ha sido un objetivo terapéutico útil para tratar ese tipo de linfomas. Por ejemplo, el anticuerpo rituximab (RITUXAN®, MABTHERA®), el cual es un anticuerpo monoclonal murino/ humano quimérico genéticamente modificado dirigido contra el antígeno CD20 humano (disponible en el mercado de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California, U.S. y F.Hoffmann-La Roche AG, Basilea, Suiza), se utiliza para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin de células B, CD20 positivo, de bajo grado de recidiva o refractario o folicular. Rituximab es el anticuerpo denominado "C2B8" en la Patente de los Estados Unidos No. 5.736.137 concedida el 7 de abril, 1998 (Anderson ef al.) y en la Patente de los Estados Unidos No. 5.776.456. Otros anticuerpos anti-CD20 indicados para el tratamiento de NHL incluyen el anticuerpo murino Zevalin™ en cual está vinculado con el radioisótopo ltrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), y Bexxar™ el cual es otro anticuerpo completamente murino conjugado a 1-131 (Corixa, WA).

CD20 es además un antígeno objetivo útil para tratar enfermedades autoinmunes. Rituximab también ha sido estudiado en una variedad de trastornos autoinmunes no malignos, en donde las células B y los autoanticuerpos parecen jugar un rol en la fitopatología de la enfermedad, incluyendo Edwards et al., Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002). Se ha informado que Rituximab alivia potencialmente los signos y síntomas de, por ejemplo, la artritis reumatoidea (AR) (Leandro et al., Ann. Rheum. Dis. 61 :883-888 (2002); Edwards et al., Arthritis Rheum., 46 (Supl. 9): S46 (2002); Stahl eí al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Supl. 1): OP004 (2003); Emery et al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), lupus (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003); Leandro et al. Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al., Lupus, 13: 312-316 (2004)), púrpura trombocitopénica inmune (D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al., Blood, 98: 952-957 (2001 ); Saleh eí al., Semin. Oncol., 27 (Sup 12):99-103 (2000); Zaia eí al., Haematolgica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn eí al., Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)), aplasia pura de células rojas (Auner eí al., Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002)); anemia autoinmune (Zaja eí al., Haematologica 87:189-195 (2002) (errata aparece en Haematologica 87:336 (2002)), enfermedad por aglutininas frías (Layios eí al., Leukemia, 15: 187-8 (2001) ; Berentsen eí al., Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen eí al., Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001 ); Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001 ); Damiani eí al., Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001 )), síndrome tipo B de resistencia a la insulina severa (Coll eí al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004), crioglobulinemia mixta (DeVita eí al., Arthritis Rheum. 46 Supl. 9:S206/S469 (2002) ), miastenia gravis (Zaja eí al., Neurology, 55: 1062-63 (2000); Wylam eí al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), granulomatosis de Wegener (Specks eí al., Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001 )), pénfigo vulgar refractario (Dupuy eí al., Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)), dermatomiositis (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Supl. 9):S1299 (2002)), síndrome de Sjogren (Somer eí al., Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), crioglobulinemia mixta tipo II activa (Zaja et al., Blood, 101 : 3827-3834 (2003)), pénfigo vulgar (Dupay et al., Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004)), neuropatía autoinmune (Pestronk et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)), síndrome de opsoclono-mioclono paraneoplásico (Pranzatelli er al. Neurology 60(Supl. 1) P05.128:A395 (2003)), y esclerosis múltiple recidivante- remitente (RRMS, según sus siglas en inglés). Cross et al. (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Múltiple Sclerosis ("Resultados preliminares de un ensayo en fase II de Rituximab en EM" Octava Reunión Anual del Comité de las Américas para la Investigación y Tratamiento de la Esclerosis Múltiple), 20-21 (2003).

La presente invención proporciona métodos y formulaciones para prevenir la agregación de macromoléculas, tales como anticuerpos, bajo condiciones fisiológicas. Los métodos de la invención ofrecen ventajas en la preparación de formulaciones de proteínas terapéuticas tales como los anticuerpos anti-CD20 descritos en la memoria descriptiva. Estas ventajas incluyen la capacidad de preparar formulaciones para la inyección subcutánea que proporcionarán una mayor biodisponibilidad del anticuerpo terapéutico y una reducción de la inflamación en el sitio de inyección, así como también ventajas adicionales que serán evidentes a partir de la descripción detallada que aparece a continuación.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN Las ciclodextrinas han sido utilizadas por los bioquímicos como solubilizantes para fármacos pobremente solubles en agua. Nuestros hallazgos acerca de que diferentes tipos de ciclodextrinas (por ej., sulfo-butil éter, hidroxi propil gamma, hidroxi propil beta) inhibían la agregación y floculación de una proteína, en particular, un anticuerpo, son inesperados ya que los anticuerpos son altamente solubles en agua. El hallazgo de que las ciclodextrinas inhibían la agregación y floculación de un anticuerpo a elevadas concentraciones, por ende, representa un novedoso uso para la ciclodextrina. También hemos desarrollado un novedoso método de screening ¡n vitro el cual incluye el uso de tubos de diálisis con corte de peso molecular (PM) definido y medios de liberación diseñados en forma personalizada, ambos imitan las condiciones fisiológicas en el sitio de inyección.

La invención proporciona un método para reducir la agregación y para inhibir la floculación de una macromolécula, tal como una proteína, bajo condiciones fisiológicas, mediante la adición de 2% a 30% de ciclodextrinas (CDs), donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por hidroxi propil beta (HP-Beta), hidroxi propil gamma (HP-Gamma) y sulfo-butil éter (SBE) ciclodextrina. La reducción significativa en la agregación y floculación mediante la adición de CDs también se correlacionó con una reducción significativa en la inflamación en el sitio de inyección subcutánea en ratas. La invención proporciona además un método para reducir al mínimo la inflamación en el sitio de inyección durante la administración subcutánea de una macromolécula, tal como una proteína, mediante la adición de 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina a la formulación subcutánea. En diversas realizaciones de la invención, la macromolécula es un anticuerpo. En otras realizaciones de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo terapéutico o un anticuerpo de diagnóstico.

En diversas realizaciones de la invención, la macromolécula es un anticuerpo anti-CD20. En ciertas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo humanizado. En ciertas realizaciones de la invención, el anticuerpo anti-CD20 comprende una de las variantes A, B, C, D, F, G, H o I de la Tabla 1. La invención proporciona además métodos y formulaciones donde el anticuerpo anti-CD20 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1-15. En realizaciones adicionales de la invención, el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:1 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:2, o el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:3 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:4, o el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:3 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:5. La invención proporciona además métodos y formulaciones donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:6 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, o SEC ID NO:15. La invención proporciona además métodos y formulaciones donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:10, SEC ID NO:11 , SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:14.

En otros aspectos, la invención proporciona una formulación farmacéutica para la administración subcutánea de una macromolécula, tal como una proteína, que comprende 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina. En algunas realizaciones, la invención proporciona una formulación farmacéutica para la administración subcutánea de un anticuerpo que comprende un anticuerpo en un rango de concentración de 10mg/ml a 200mg/ml, y 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE 1 ciclodextrina. En ciertas realizaciones, el rango de concentración del anticuerpo es de 30-150 mg/ml. En realizaciones adicionales, el rango de concentración de anticuerpo es de 100-150 mg/ml. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Beta ciclodextrina en una concentración de 5% a 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de 5% a 20%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 200 mM. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende SBE ciclodextrina en una concentración de 2% a 9%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo en una concentración de aproximadamente 100 mg/ml y HP-Beta ciclodextrina en una concentración de 15% a 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo en una concentración de aproximadamente 150 mg/ml y HP-Beta ciclodextrina en una concentración de aproximadamente 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo en una concentración de aproximadamente 150 mg/ml y HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de aproximadamente 10%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 200 mM. En una realización específica, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo 2H7 humanizado en un rango de concentración de 100 mg/ml a 150 mg/ml, HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de 15% a 30%, y succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 100 mM. En realizaciones adicionales, la composición farmacéutica comprende además 30 mM de acetato de sodio; 5% de dihidrato de trehalosa; y 0,03% de Polisorbato 20, a pH 5,3.

La invención proporciona además cualquiera de las formulaciones antes mencionadas que comprende un anticuerpo anti-CD20 humanizado que consiste en cualquiera de los anticuerpos mencionados en la Tabla 1. La invención proporciona además formulaciones en las que el anticuerpo anti-CD20 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1-15. En realizaciones adicionales de la invención, el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:1 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:2, o el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:3 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:4. La invención proporciona además métodos y formulaciones en donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:6 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, o SEC ID NO:15. La invención proporciona además métodos y formulaciones donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:10, SEC ID NO:11 , SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:14.

La invención proporciona además un método para tratar un cáncer de células B que expresan CD20 que comprende administrar cualquiera de los anticuerpos anti-CD20 humanizados de la Tabla 1 en una formulación farmacéutica que comprende 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina. El cáncer de células B CD20 positivo es preferentemente un linfoma o leucemia de células B. En realizaciones específicas, las formulaciones que comprenden los anticuerpos 2H7 humanizados que unen CD20 humano (hCD20) y sus fragmentos funcionales se utilizan para tratar el linfoma no Hodgkin (NHL), NHL indolente incluyendo NHL indolente recidivante y NHL indolente refractario a rituximab, enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia linfocítica crónica (CLL). En realizaciones específicas, las formulaciones que comprenden anticuerpos de unión CD20 humanizados, en particular, las variantes A, B, C, D o H de la Tabla 1 , o sus fragmentos funcionales, se utilizan para tratar los cánceres de células B CD20 positivos mencionados anteriormente.

La invención proporciona además un método para tratar una enfermedad autoinmune, que comprende administrar a un paciente que sufre de la enfermedad autoinmune, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo 2H7 humanizado de la Tabla 1 en una formulación farmacéutica que comprende de 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina. En realizaciones específicas, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por artritis reumatoidea (AR) y artritis reumatoidea juvenil, y los pacientes con AR son respondedores inadecuados a metotrexato (Mtx) y respondedores inadecuados al antagonista TNFa, pacientes recidivantes o refractarios a rituximab. En una realización, un paciente con AR es refractario o recidivante con respecto a otro anticuerpo terapéutico anti-CD20. En otras realizaciones, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por lupus sistémico eritematoso (LES) incluyendo nefritis lúpica, esclerosis múltiple (EM), incluyendo esclerosis múltiple recidivante remitente (RRMS), enfermedad de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerativa, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, miastenia grave, vasculitis asociada con ANCA, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, Neuromielitis Óptica (NMO) y glomerulonefritis.

En realizaciones específicas, las formulaciones que comprenden anticuerpos de unión CD20 humanizados, en particular, las variantes A, B, C, D o H de la Tabla 1 , o sus fragmentos funcionales, se utilizan para tratar las enfermedades autoinmunes enlistadas anteriormente.

En ciertas realizaciones de los métodos para tratar las enfermedades antes mencionadas, el sujeto o paciente que sufre de la enfermedad es un primate, preferentemente un ser humano.

La invención proporciona además un método para mejorar o mantener la solubilización de o reducir al mínimo la precipitación de un anticuerpo en una formulación subcutánea acuosa luego de la inyección en el sitio de inyección de un paciente, que comprende agregar de 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina a la formulación subcutánea acuosa. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Beta ciclodextrina en una concentración de 5% a 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de 5% a 20%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 200 mM. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende SBE ciclodextrina en una concentración de 2% a 9.

La invención proporciona además un método para aumentar la biodisponibilidad de un anticuerpo a ser administrado subcutáneamente, que comprende agregar de 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina a una formulación subcutánea acuosa que comprende el anticuerpo. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Beta ciclodextrina en una concentración de 5% a 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de 5% a 20%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 200 mM. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende SBE ciclodextrina en una concentración de 2% a 9.

La invención proporciona además un método de diálisis in vitro para evaluar la capacidad de un excipiente para reducir la agregación de un anticuerpo o de otra macromolécula bajo condiciones fisiológicas, que comprende: dializar formulaciones de la macromolécula con y sin el excipiente de ensayo contra un medio de ensayo para simular condiciones fisiológicas a 37°C con agitación constante; muestrear la solución de medio modificada; y medir la aparición de dicha turbidez de las muestras y la cantidad de proteína presente en el medio de liberación donde se mide mediante métodos tales como un barrido fotométrico de UV, donde la mayor concentración proteica y la turbidez reducida en el medio de liberación en el ensayo que contiene el excipiente de ensayo en comparación con el control que carece de excipiente son indicativos de la capacidad del excipiente de ensayo para reducir la agregación de la macromolécula. En realizaciones específicas, el medio se refiere a solución de PBS modificada tal como conteniendo 167mM de Sodio, 140mM de Cloruro, 17mM de Fosfato, 4m de Potasio. En realizaciones específicas del método, el tubo de diálisis tiene un corte de peso molecular de 1 millón de Daltons. En realizaciones específicas adicionales del método, la concentración proteica y la turbidez en las muestras de ensayo se miden utilizando espectrometría de UV. En realizaciones adicionales del método, el método incluye inspeccionar visualmente el medio de liberación modificado y la solución dentro del tubo de diálisis para la precipitación, donde la precipitación reducida en el tubo de diálisis que contiene el excipiente de ensayo en comparación con el control que carece de excipiente es indicativo de la capacidad del excipiente de ensayo de reducir la agregación de la macromolécula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra la agregación de 2H7 bajo condiciones fisiológicas. 2H7 a 150 mg/ml se dializó en PBS durante dos días a 37°C.

La FIG. 2 muestra el modelo de diálisis in vitro utilizado para evaluar los efectos de lo excipientes en la agregación de 2H7 bajo condiciones fisiológicas. Se llena una jarra de vidrio de 250 mi con 220 mi de solución de PBS modificada (167mM de Sodio, 140mM de Cloruro, 17mM de Fosfato, 4mM de Potasio) a 37°C. Una longitud de 6 cm de tubo de diálisis de 12 mm se sujeta en un extremo, cargado con aproximadamente 1 mi de muestra de ensayo, se elimina el aire en exceso, y el otro extremo del tubo es sujetado al sello. La jarra se coloca a 37°C con constante agitación.

La FIG. 3 muestra el comportamiento de los controles en el modelo de diálisis in vitro. Tanto 2H7 como rhuMab CD11a se analizaron en el modelo mostrado en la Figura 2. El porcentaje acumulativo de proteína liberada en la solución de PBS se midió en puntos en el tiempo de 2,5, 6, 12, 24 , 33 y 48 horas.

La FIG. 4 muestra el efecto de 2-9% de SBE-ciclodextrina sobre la liberación de 2H7 en el mpdelo in vitro.

La FIG. 5 muestra el efecto de 5-20% de HP-Gamma-ciclodextrina sobre la liberación de 2H7 en el modelo in vitro.

La FIG. 6 muestra el efecto de 5-20% de HP-Beta-ciclodextrina sobre la liberación de 2H7 en el modelo in vitro.

La FIG. 7 muestra el efecto de HP-Gamma-ciclodextrina y succinato de arginina sobre la liberación de 2H7 en el modelo in vitro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES Las diversas formas del verbo "agregar" se refieren a un proceso mediante el cual moléculas proteicas individuales o complejos se asocian para formar agregados. Un "agregado" es un conjunto polimérico que comprende moléculas o complejos de proteína. La agregación puede proceder en la medida que se forme un precipitado visible. La formación de dicho precipitado visible es también denominada en la presente "floculación".

La cantidad relativa de precipitación de una macromolécula puede determinarse, por ejemplo, mediante comparación con un control visual. Los métodos adicionales de ensayo de la precipitación son conocidos en la técnica y descritos más adelante, por ej., el método de diálisis in vitro descrito en detalle en el Ejemplo 2, o el modelo in vivo descrito en el Ejemplo 3.

El término "biodisponibilidad" se refiere al grado al cual o índice al cual un fármaco u otra sustancia es absorbido o se torna disponible en el sitio de actividad fisiológica después de la administración. La biodisponibilidad de una macromolécula puede analizarse mediante métodos farmacocinéticos in vivo conocidos en la técnica.

El término "macromolécula" se refiere a una molécula con un peso molecular de por lo menos 10.000 daltons, y puede incluir proteínas, tales como anticuerpos.

Los términos "excipiente" o "excipiente farmacéutico" se refieren a compuestos los cuales pueden disminuir la agregación de una macromolécula. Los excipientes pueden incluir azúcares, sales, aminoácidos libres tales como L- arginina y L-glutam¡na, polioles, polietilenglicoles (PEGs), y otros polímeros, tales como polisorbatos, poloxámeros o polivinilpirrolidona.

El término "ciclodextrina" (o "CD") se refiere a oligosacáridos cíclicos que tienen unidades d-glucopiranosa ligadas con enlaces alfa-(1 ,4) glicosídicos. Las ciclodextrinas naturales más comunes son las alfa-ciclodextrina, beta-ciclodextrina y gamma-ciclodextrina, que consisten en 6, 7 y 8 unidades glucopiranosa, respectivamente. Los sinónimos de ciclodextrina incluyen Cavitron, oligosacárido cíclico, cicloamulosa, y cicloglucano. El término "ciclodextrina" como se utiliza en la presente invención, puede incluir además derivados de ciclodextrina, incluyendo, aunque sin limitarse a, CDs metiladas, CDs 2-hidroxipropiladas, CDs acetiladas, CDs ramificadas y sulfobutil CDs.

El término "anticuerpo terapéutico" se refiere a un anticuerpo que se utiliza en el tratamiento de una enfermedad. Un anticuerpo terapéutico puede tener diversos mecanismos de acción. Un anticuerpo terapéutico puede unir y neutralizar la función normal de un objetivo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de la proteína necesaria para la supervivencia de una célula cancerígena causa la muerte celular. Otro anticuerpo monoclonal terapéutico puede unir y activar la función normal de un objetivo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal puede unirse a una proteína en una célula y activar una señal de apoptosis. Finalmente, si un anticuerpo monoclonal se une a un objetivo expresado solamente en tejido enfermo, la conjugación de una carga tóxica (agente eficaz), tal como un agente quimioterapéutico o radiactivo, al anticuerpo monoclonal puede crear un agente para la administración específica de la carga tóxica al tejido enfermo, reduciendo el daño al tejido sano.

El término "anticuerpo de diagnóstico" se refiere a un anticuerpo que se utiliza como un reactivo de diagnóstico para una enfermedad. El anticuerpo de diagnóstico puede unirse a un objetivo que está específicamente asociado con, o muestra mayor expresión en, una enfermedad en particular. El anticuerpo de diagnóstico puede utilizarse, por ejemplo, para detectar un objetivo en una muestra biológica de un paciente, o en imágenes de diagnóstico de sitios de enfermedad, tal como tumores, en un paciente.

El antígeno "CD20" es una fosfoproteína de transmémbrana no glicosilada, con un peso molecular, de aproximadamente 35 kD que se encuentra sobre la superficie de más del 90% de células B de sangre periférica u órganos linfoides. CD20 se expresa durante el desarrollo de pre-células B temprano y permanece hasta la diferenciación celular plasmática; No es encontrado en células madre humanas, células progenitoras linfoides o células plasmáticas normales. CD20 está presente en células B normales así como también en células B malignas. Otros nombres para CD20 en la bibliografía técnica incluyen "antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 es descrito en, por ejemplo, Clark y Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989) y Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989).

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos multiespecíficos (por ej., anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando exhiban la actividad o función biológica deseada.

La actividad biológica de los anticuerpos de unión a CD20 humanizados de la invención incluirá por lo menos la unión del anticuerpo al CD20 humano, más preferentemente la unión a CD20 humano y de otros primates (incluyendo monos, monos rhesus, chimpancés). Los anticuerpos unen CD20 con un valor de Ka de no más de 1 x 10"8, con preferencia un valor de Kd no superior a aproximadamente 1 x 10"9, y pueden matar o agotar células B in vivo, con preferencia en al menos 20% cuando se compara con el control negativo apropiado el cual no es tratado con dicho anticuerpo. El agotamiento de células B puede ser un resultado de uno o más de ADCC, CDC, apoptosis, u otro mecanismo. En algunas realizaciones de tratamiento de una enfermedad de la presente invención, las funciones o mecanismos efectores específicos pueden ser deseados con respecto a otros y ciertas variantes del 2H7 humanizado son preferidas para lograr aquellas funciones biológicas, tales como ADCC.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, . en general la región de unión al antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo el cual contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno liviano en asociación no covalente estrecha. A partir del pliegue de estos dos dominios emanan seis lazos hipervariables (3 lazos cada uno de la cadena H y L) que contribuyen los residuos aminoácidos para la unión al antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, si bien a una afinidad inferior que el sitio de unión entero.

El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en esta invención se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo o mismos epítopos, excepto por las posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando en general dichas variantes presentes en cantidades menores. Dicho anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a un objetivo, donde la secuencia polipeptídica de unión al objetivo se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a un objetivo de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un único clon de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Debería entenderse que la secuencia de unión a un objetivo seleccionada puede ser adicionalmente alterada, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo, para humanizar la secuencia de unión al objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, efe, y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión al objetivo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales es dirigido contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en el sentido de que están típicamente sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (por ej., Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 , (Elsevier, N.Y., 1981 )), métodos de ADN recombinante (véase por ej., la Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567), técnicas de exhibición de fagos (véase, por ej., Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991 ); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1 -2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o tipo humanos en animales que tienen partes o todos los sitios de inmunoglobulina humanos o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ej., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741 ; Jakobovits ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; WO 1997/17852; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; and 5.661.016; Marks et al., Bio/Technoloav. 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature. 368: 856-859 (1994); orrison, Nature. 368: 812-813 (1994); Fishwild ef al., Nature Biotechnoloav, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnolopy, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

"Fragmentos funcionales" de los anticuerpos de unión a CD20 de la invención son aquellos fragmentos que retienen la unión a CD20 con sustancialmente la misma afinidad que la molécula de longitud completa intacta de la cual derivan y muestran actividades biológica incluyendo agotamiento de células B según lo medido mediante ensayos in vitro o in vivo tales como aquellos descritos en la presente invención.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio V interviene en la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo en particular para su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones de estructura (FRs, según sus siglas en inglés) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables" que tienen cada una, una longitud de 9-12 aminoácidos. Los dominios variables de cadenas pesada y liviana naturales cada uno comprende cuatro FRs, adoptando en gran parte una configuración de lámina ß, conectados por tres regiones hipervariables, las cuales forman lazos que se conectan, y en algunos casos formando parte de, la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en proximidad cercana por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen con la formación del sitio de unión al antígeno de anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, Quinta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D. (1991 )). Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, según sus siglas en inglés).

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en esta invención se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ej., alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1 ), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, Quinta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (por ej., los residuos 26-32 (L1 ), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la VL, y 26-32 (H1 ), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en la VH (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Según se hace referencia en esta invención, la "secuencia consenso" o secuencia de dominio V de consenso es una secuencia artificial derivada de una comparación de las secuencias de aminoácidos de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana conocidas. En base a estas comparaciones, se prepararon secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los aminoácidos de dominio V que son un consenso de las secuencias derivadas de los dominios V de subgrupo III de cadena H humana y ? humana. La secuencia V consenso no tiene ninguna especificidad de unión o afinidad con un anticuerpo conocido.

Los anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) tienen una porción de la cadena pesada y/o liviana idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto y en cuanto exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)). Anticuerpo humanizado como se utiliza en esta invención es un subconjunto de anticuerpos quiméricos.

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ej., murinos) son anticuerpos quiméricos los cuales contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o aceptor) en donde los residuos de la región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Por añadidura, los anticuerpos 5 humanizados pueden comprender residuos los cuales no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos tal como la afinidad de unión. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de los lazos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana si bien las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión. La cantidad de estas sustituciones de aminoácidos en la FR son típicamente no más de 6 en la cadena H, y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la ruta del complemento clásica es iniciada mediante la unión del primer componente del sistema de complementos (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC, por ej. según lo descrito en Gazzano-Santoro er al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

A lo largo de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, la numeración de los residuos en los dominios constantes de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina es aquella del índice EU como en Kabat eí al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), incorporada expresamente en esta invención como referencia. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de lgG1 humana. Los residuos en la región V son numerados de acuerdo con la numeración de Kabat a menos que se indique específicamente otro sistema secuencial o de numeración.

Los anticuerpos de CD20 incluyen: "C2B8," el cual es ahora denominado "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente de los Estados Unidos No. 5.736.137); el anticuerpo murino 2B8 rotulado con itrio-[90] designado ?2?8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) disponible en el mercado de IDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente de los Estados Unidos No. 5.736.137; 2B8 depositado en ATCC bajo el número de acceso HB11388 el 22 de junio, 1993); lgG2a murino "B1 ," también denominado "Tositumomab," opcionalmente rotulado con 1311 para generar el anticuerpo ? 31 ?-?1" o "yodo 1131 tositumomab" (BEXXAR™, GlaxoSmithKIine, véase, además, la Patente de los Estados Unidos No. 5.595.721 ); anticuerpo monoclonal murino "1 F5" (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987) y sus variantes incluyendo "framework patched" o 1 F5 humanizado (WO 2003/002607, Leung, S.; depósito en ATCC HB-96450); anticuerpo 2H7 murino y 2H7 quimérico (Patente de los Estados Unidos No. 5.677.180); un anticuerpo 2H7 humanizado (WO 2004/056312 (Lowman er a/.) y según lo expuesto más adelante); HuMAX-CD20™ un anticuerpo totalmente humano (Genmab, Dinamarca; ver, por ejemplo, Glennie y van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) y Cragg et al., Blood 101 : 1045-1052 (2003)); los anticuerpos monoclonales humanos expuestos en 7 WO 2004/035607 (Teeling et al.); los anticuerpos que tienen cadenas de azúcares ligadas a N-glucósidos complejas unidas a la región Fe descrita en US 2004/0093621 (Shitara et al.); moléculas de unión a CD20 tales como la serie AME de anticuerpos, por ej., los anticuerpos AME-133™ según lo expuesto en WO 2004/103404 (Watkins er al., Applied Molecular Evolution); el anticuerpo A20 o sus variantes tales como el anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, IMMU-106 a.k.a. hA20, respectivamente (US 2003/0219433, US 2005/0025764; Immunomedics); y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1 B3, B-C1 o NU-B2 disponibles de the International Leukocyte Typing Workshop (El Taller de Tipificación de Leucocitos Internacional) (Valentine et al., En: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). Los anticuerpos de CD20 preferidos en esta invención son anticuerpos contra CD20 humanizados, quiméricos o humanos, más preferentemente, un anticuerpo 2H7 humanizado, rituximab, anticuerpo A20 quimérico o humanizado (Immunomedics), y anticuerpo contra CD20 humano HuMAX-CD20™ (Genmab).

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales los cuales interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo será purificado (1 ) a más del 95% en peso de anticuerpo según lo determinado por el método Lowry, y con máxima preferencia, más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, coloración con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, comúnmente, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos un paso de purificación.

Composiciones y Métodos de la Invención La invención proporciona composiciones farmacéuticas para la administración subcutánea de una macromolécula, tal como una proteína, que comprende de 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina. En algunas realizaciones, la invención proporciona una formulación farmacéutica para la administración subcutánea de un anticuerpo que comprende un anticuerpo en un rango de concentración de 10mg/ml a 200mg/ml, y de 2% a 30% de HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, o SBE ciclodextrina. En ciertas realizaciones, el rango de concentración de anticuerpo es de 30-150 mg/ml. En realizaciones adicionales, el rango de concentración de anticuerpo es de 100-150 mg/ml. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Beta ciclodextrina en una concentración de 5% a 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de 5% a 20%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 200 mM. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende SBE ciclodextrina en una concentración de 2% a 9%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo en una concentración de aproximadamente 100 mg/ml y HP-Beta ciclodextrina en una concentración de 15% a 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo en una concentración de aproximadamente 150 mg/ml y HP-Beta ciclodextrina en una concentración de aproximadamente 30%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo en una concentración de aproximadamente 150 mg/ml y HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de aproximadamente 10%. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 200 mM. En una realización específica, la formulación farmacéutica comprende un anticuerpo 2H7 humanizado en un rango de concentración de 100 mg/ml a 150 mg/ml, HP-Gamma ciclodextrina en una concentración de 15% a 30%, y succinato de arginina en una concentración de 50 mM a 100 mM. En realizaciones adicionales, la composición farmacéutica comprende además 30 mM de acetato de sodio; 5% de dihidrato de trehalosa; y 0,03% de Polisorbato 20, a pH 5,3.

En diversas realizaciones, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos 2H7 humanizados (también denominados en esta invención hu2H7). En realizaciones específicas, el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo enlistado en la Tabla 1.

TABLA 1 - Anticuerpo anti-CD20 Humanizado y Sus Variantes Variante de Cadena L Cadena H 2H7 VL VH Completa completa SEC ID SEC ID NO.

NO. SEC ID NO. SEC ID NO.

A 1 2 6 7 B 1 2 6 8 C 3 4 9 10 D 3 4 9 11 F 3 4 9 12 G 3 4 9 13 H 3 5 9 14 1 1 2 6 15 Cada una de las variantes de anticuerpos A, B y I de la Tabla 1 comprende la secuencia variable de cadena liviana (VL): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLAS GVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEC ID NO:1); y la secuencia variable de cadena pesada (VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWG QGTLVTV SS (SEC ID NO: 2).

Cada una de las variantes de anticuerpo C, D, F y G de la Tabla 1 comprende la secuencia variable de cadena liviana (VL): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLAS GVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEC ID NO: 3), y la secuencia variable de cadena pesada (VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQ GTLVTV SS (SEC ID NO: 4).

La variante de anticuerpo H de la Tabla 1 comprende la secuencia variable de cadena liviana (VL) de SEC ID NO:3 (antes mencionada) y la secuencia variable de cadena pesada (VH): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWG QGTLVTV SS (SEC ID NO. 5).

Cada una de las variantes de anticuerpos A, B y I de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena liviana de longitud completa: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLAS GVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS - LSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC ID NO: 6).

La Variante A de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWG QGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT • KPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 7).

La variante B de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYN HWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWG QGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 8).

La variante I de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWG QGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 15).

Cada una de las variantes de anticuerpos C, D, F, G y H de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena liviana de longitud completa: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLAS GVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC ID NO:9).

La variante C de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQ GTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NOMO).

La variante D de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQ GTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO:11).

La variante F de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYN HWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQ GTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO:12).

La variante G de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSASYWYFDVWGQ GTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 13).

La variante H de la Tabla 1 comprende la secuencia de cadena pesada de longitud completa: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYN HWVRQAPGKGLEWVGAIYP GNGATSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWG QGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYT LPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO 14).

En ciertas realizaciones, el anticuerpo 2H7 humanizado de la invención comprende además alteraciones de aminoácidos en el Fe de IgG y exhibe mayor afinidad de unión para FcRn humano con respecto a un anticuerpo que tiene Fe de IgG del tipo salvaje, en al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, más preferentemente al menos 100 veces, con preferencia al menos 125 veces, aun más preferentemente al menos 150 veces hasta alrededor de 170 veces.

El sitio de N-glicosilación en IgG está en Asn297 en el dominio de CH2. Las composiciones del anticuerpo 2H7 humanizado de la presente invención incluyen composiciones de cualquiera de los anticuerpos 2H7 humanizados precedentes que tienen una región Fe, donde alrededor del 80-100% (y con preferencia alrededor del 90-99%) del anticuerpo en la composición comprende una estructura de carbohidrato núcleo madura la cual carece de fucosa, unida a la región Fe de la glicoproteína. Se ha demostrado en la presente invención que ese tipo de composiciones exhiben una mejora sorprendente en la unión a Fc(RIIIA(F158), lo cual no es tan eficaz como Fc(RIIIA (V158) en la interacción con IgG humana. Fc(RIIIA (F158) es más común que Fc(RIIIA (V158) en Afroamericanos y Caucásicos sanos normales. Véase Lehrnbecher et al. Blood 94:4220 (1999).

Históricamente, los anticuerpos producidos en Células de Ovario de Hámster Chino (CHO, siglas correspondientes a "Chínese Hámster Ovary Cells), uno de los huéspedes industriales más comúnmente utilizados, contienen aproximadamente de 2 a 6% en la población que son no fucosilados. YB2/0 y Lec13, sin embargo, pueden producir anticuerpos con 78 a 98% de especies no fucosiladas. Shinkawa et al. J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003), informaron que los anticuerpos producidos.en células YB2/0 y Lec13, las cuales tienen menos actividad de FUT8, muestran actividad de ADCC in vitro significativamente aumentada. La producción de anticuerpos con contenido de fucosa reducido es también descrita en por ej., Li et al. (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" en la publicación en Internet de Nature Biology del 22 de enero, 2006; Niwa R. et al. Cáncer Res. 64(6):2127-2133 (2004); US 2003/0157108 (Presta); US 6.602.684 y US 2003/0175884 (Glycart Biotechnology); US 2004/0093621 , US 2004/0110704, US 2004/0132140 (todas de Kyowa Hakko Kogyo).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según lo necesario para la indicación en particular que se está tratando, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente de citoquinas o inmunosupresor (por ej., uno que actúe sobre las células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que une células T, por ej., uno que une LFA-1 ). La cantidad eficaz de ese tipo de otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y de otros factores descritos anteriormente. Estos son generalmente utilizados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración según lo descrito en esta invención o aproximadamente entre 1 y 99% de las dosis empleadas hasta ahora.

Las formulaciones a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de filtros estériles.

Producción de anticuerpos Anticuerpos monoclonales Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando el método del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567).

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado según lo descrito con anterioridad para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Luego de la inmunización, los linfocitos son aislados y luego fusionados con una línea de células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de ese modo son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo adecuado, medio que con preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas (también denominadas compañero de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), dichas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma compañeras de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, respaldan la producción estable a niveles elevados de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las células párenteles no fusionadas. Las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de the Salk Institute Cell Distribution Center (Centro de Distribución de Células del Instituto Salk), San Diego, California, Estados Unidos de América, y SP-2 y derivados, por ej., las células X63-Ag8-653 disponibles de the American Type Culture Collection (Recolección Americana de Cultivos Tipificados), Rockville, Maryland, Estados Unidos de América. Las líneas celulares de heteromieloma de ratón- humanas y de mieloma humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur ef al., Monoclonal Antibody Production Technlques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el cual están creciendo las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Con preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorbencia ligada a las enzimas (ELISA, según sus siglas en inglés).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Una vez que las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas son identificadas, los clones pueden ser subclonados limitando los procedimientos de dilución y cultivadas mediante métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Por añadidura, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como ascitis tumorales en un animal, por ej., mediante inyección i.p. de las células en ratones.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son adecuadamente separados del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ej., utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ej., utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y liviana de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, los cuales son luego transfectados en células huéspedes tales como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra eí al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

En una realización adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de genotecas de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson er a/., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991 ) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando genotecas de fagos. Las subsiguientes publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (rango nM) mediante barajado de cadenas (chain shuffling) (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como también infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir genotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21 :2265-2266 (1993)). Por consiguiente, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN que codifica el anticuerpo puede ser modificado para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o de fusión, por ejemplo, sustituyendo secuencias humanas de dominio constante de cadena pesada y de cadena liviana (CH y CL) por las secuencias murinas homologas (Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984)), o fusionando la secuencia codificadora de inmunoglobulina con la totalidad o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptido no inmunoglobulina pueden sustituir a los dominios constantes de un anticuerpo, o son sustituidas por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad para un antígeno diferente.

Anticuerpos humanizados Se han descrito en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Con preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos son a menudo denominados residuos "importados", los cuales son tomados típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de regiones hipervariables por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por lo tanto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567) donde se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, tanto livianos como pesados, a ser utilizados en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta a HAMA (siglas correspondientes a anticuerpo anti-ratón humano) cuando el anticuerpo está destinado al uso terapéutico humano. De acuerdo con el llamado método "best-fit", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la genoteca entera de secuencias de dominios variables humanas conocidas. La secuencia de dominio V humana la cual es más cercana a aquella del roedor es identificada y la región de estructura (FR, siglas correspondientes a framework región) humana dentro de la misma es aceptada para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura en particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas livianas o pesadas. La misma estructura puede utilizarse para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati.-Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151 :2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos sean humanizados con retención de afinidad de unión elevada para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos los cuales ¡lustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el anáfisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De este modo, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR de las secuencias de receptor e importadas de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como mayor afinidad para el o los antígenos objetivos. En general, los residuos de región hipervariable están directamente y más sustancialmente involucrados en la influencia de la unión al antígeno.

El anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, el cual es opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de longitud completa, tal como un anticuerpo de lgG1 de longitud completa.

Anticuerpos humanos y metodología de exhibición de fagos Como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ej., ratones) que sean capaces, luego de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de región de unión a la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del arreglo de genes de inmunoglobulina de línea germinal humano en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos luego de la prueba de antígenos. Véase, por ej., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y WO 97/17852.

Alternativamente, puede utilizarse tecnología de exhibición de fagos (McCafferty ef al., Nature 348:552-553

[1990]) para producir anticuerpos humanos · y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con • esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo son clonados en marco en un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhibidos como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Por consiguiente, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición de fagos puede realizarse en una variedad de formatos, véase, por ej., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden utilizarse para la exhibición de fagos diversas fuentes de segmentos genéticos V. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991 ) aislaron un grupo diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una genoteca combinatoria al azar pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y anticuerpos contra un grupo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 ), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, además , las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.565.332 y 5.573.905.

Según lo descrito anteriormente, también pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.567.610 y 5.229.275).

Fragmentos de Anticuerpos En ciertas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, más que de anticuerpos enteros. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite la rápida evacuación, y puede conducir a un acceso mejorado a tumores sólidos.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan er al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ser ahora producidos directamente mediante células huéspedes recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden ser todos expresados en y secretados de E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Pueden aislarse fragmentos de anticuerpos a partir de genotecas de fagos de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser directamente recuperados de E. coli y químicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro método, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células huéspedes recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 con mayor vida media in vivo que comprenden un residuo de epítopo de unión del receptor salvaje son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). Ver WO 93/16185; Patente de los Estados Unidos No. 5.571.894; y Patente de los Estados Unidos No. 5.587.458. Fv y sFv son la única especie con sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes; por lo tanto, son adecuados para la unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse para proporcionar la fusión de una proteína efectora al término amino o al término carboxi de un sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ej., según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5.641.870 por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Otras modificaciones de secuencias de aminoácidos Se contemplan una o más modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de unión a CD20 descritos en esta invención. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo anti-CD20, o mediante síntesis peptídica. Ese tipo de modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20. Se reajiza cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para arribar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traducción del anticuerpo anti-CD20, tal como cambiando el número o posición de sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-CD20 que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" según lo descrito por Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989). En este punto, un residuo o grupo de residuos objetivos son identificados (por ej., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (con máxima preferencia alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el antígeno CD20. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego son refinadas introduciendo variantes adicionales y otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, si bien el sitio para introducir una variación de secuencias de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no debe ser necesariamente predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se lleva a cabo barrido de ala o mutagénesis al azar en el codón o región objetivo y las variantes expresadas de anticuerpo anti-CD20 son seleccionadas para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de terminal amino- y/o carboxilo que oscilan en longitud entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones intrasecuencias de residuos aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-CD20 con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo anti-CD20 incluyen la fusión al término N o C del anticuerpo anti-CD20 a una enzima (por ej., para ADEPT) o un polipéptido el cual aumenta la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-CD20 reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero las alteraciones de FR son también contempladas. Las sustituciones conservadoras son mostradas en la Tabla que aparece a continuación bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla, o según lo descrito adicionalmente a continuación con referencia a clases de aminoácidos, pueden introducirse y los productos seleccionarse.

TABLA 2 - Sustituciones de Aminoácidos Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo son logradas seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura del armazón pblipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la masa de la cadena lateral. Los residuos naturales están divididos en grupos en base a propiedades comunes de cadenas laterales: (1 ) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen sobre la orientación de cadenas: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras abarcarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo cisteína no involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo anti-CD20 también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de Ja molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden agregarse el o los enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ej., un anticuerpo humanizado o humano). En general, el o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo parental del cual son generadas. Un modo conveniente de generar ese tipo de variantes sustitucionales involucra la maduración por afinidad utilizando exhibición de fagos. Brevemente, diversos sitios de región hipervariable (por ej., 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas son exhibidas en una forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto genético III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes exhibidas en fago son luego seleccionadas por su actividad biológica (por ej., afinidad de unión) según lo descrito en esta invención. A fin de identificar sitios de regiones hipervariables candidatos para modificación, puede llevarse a cabo una mutagénesis por barrido con alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente con la unión al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno- anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y CD20 humano. Ese tipo de residuos de contacto y residuos lindantes son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en esta invención. Una vez que dichas variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a screening según lo descrito en esta invención y pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para el desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Alteración quiere decir supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de anticuerpos es típicamente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuenciás tripéptidas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno dé los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, si bien también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo tal que contenga una o más de las secuencias tripéptidas antes descritas (para sitios de glicosilación ligada a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligada a O).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-CD20 se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitarse a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por casetes de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-CD20.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ej., de modo de aumentar la citotoxicidad mediada por células dependiente del antígeno (ADCC, según sus siglas en inglés) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, según sus siglas en inglés) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, puede introducirse residuo(s) cisteína en la región Fe, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o mayor matanza de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también pueden ser preparados utilizando entrecruzadores heterobifuncionales según lo descrito en Wolff er al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede modificarse un anticuerpo el cual tiene regiones duales Fe y de ese modo puede tener capacidades de ADCC y lisis mediada por complemento mejoradas. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Usos Terapéuticos Los métodos y composiciones descritos que comprenden anticuerpos de unión a CD20 2H7 humanizados de la invención son útiles para tratar una cantidad de enfermedades malignas y no malignas incluyendo cánceres de células B CD20 positivos tales como linfomas de células B y leucemia y enfermedades autoinmunes. Las células madre (progenitoras de células B) en la médula ósea carecen del antígeno CD20, permitiendo que las células B sanas se regeneren después del tratamiento y regresen a los niveles normales dentro de varios meses.

Los cánceres de células B CD20 positivos son aquellos que comprenden la proliferación anormal de células B que expresan CD20 sobre la superficie celular. Los neoplasmas de células B CD20 positivos incluyen la enfermedad de Hodgkin CD20-positiva incluyendo enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD); linfoma no Hodgkin (NHL); linfomas de células centrales foliculares (FCC); leucemia linfocítica aguda (ALL); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia de células pilosas.

El término "linfoma no Hodgkin" o "NHL", como se utiliza en esta invención, se refiere a un cáncer del sistema linfático que no es linfomas de Hodgkin. Los linfomas de Hodgkin pueden generalmente distinguirse de los linfomas no Hodgkin por la presencia de células Reed-Sternberg en los linfomas de Hodgkin y la ausencia de dichas células en los linfomas no Hodgkin. Los ejemplos de linfomas no Hodgkin abarcados por el término como se utiliza en esta invención incluyen cualquiera que sería identificado como tal por un experto en la técnica (por ej., un oncólogo o patólogo) de acuerdo con los esquemas de clasificación conocidos en la técnica, tal como el esquema de Linfoma Europeo- Americano Revisado (REAL, siglas correspondientes a "Revised European-American Lymphoma") según lo descrito en Color Atlas of Clinical Hematology (tercera edición), A. Víctor Hoffbrand y John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). Véase, en particular, las listas en Fig. 11.57, 11.58 y 11.59. Los ejemplos más específicos incluyen, aunque sin limitarse a, NHL recidivante o refractario, NHL de grado bajo de línea frontal, NHL de Etapa lll/IV, NHL resistente a quimioterapia, leucemia linfoblástica B precursora y/o linfoma, linfoma linfocítico pequeño, leucemia linfocítica crónica de células B y/o leucemia prolinfocítica y/o linfoma linfocítico pequeño, linfoma prolinfocítico de células B, inmunocitoma y/o linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células B de zona marginal, linfoma de zona marginal esplénico, linfoma MALT de zona marginal extranodal, linfoma de zona marginal nodal, leucemia de células pilosas, plasmacitoma y/o mieloma de células plasmáticas, linfoma de grado bajo/folicular, NHL de grado intermedio /folicular, linfoma de células del manto, linfoma central de folículo (folicular), NHL difuso de grado intermedio, linfoma de células B grandes difuso, NHL agresivo (incluyendo NHL de línea frontal agresivo y NHL recidivante agresivo), NHL recidivante después o refractario a transplante de células madre autólogas, linfoma de células B grandes de mediastino primarias, linfoma de efusión primaria, NHL inmunoblástico de grado elevado, NHL linfoblástico de grado elevado, NHL de células no disociadas pequeñas de grado elevado, NHL de enfermedad de gran masa, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica de gránulos grandes (periféricos) precursores, micosis fungoides y/o síndrome de Sezary, linfomas de la piel (cutáneos), linfoma de células grandes anaplásicas, linfoma angiocéntrico.

En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de unión a CD20 humanizados y sus fragmentos funcionales se utilizan para tratar el linfoma no Hodgkin (NHL), enfermedad de Hodgkin linfocito- predominante (LPHD), linfoma linfocítico pequeño (SLL), y leucemia linfocítica crónica (CLL), incluyendo recaídas de estas condiciones.

El linfoma indolente es una enfermedad incurable de crecimiento lento en la cual el paciente promedio sobrevive entre seis y 10 años luego de numerosos períodos de remisión y recidiva. En una realización, los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o sus. fragmentos funcionales se utilizan para tratar NHL indolente incluyendo NHL indolente recidivante y NHL indolente refractario a rituximab. Los pacientes con NHL indolente recidivantes pueden ser respondedores a Rituximab quienes han recibido previamente un tratamiento con Rituximab y han respondido durante > 6 meses.

Los presentes anticuerpos 2H7 humanizados o sus fragmentos funcionales son útiles como un tratamiento de único agente (monoterapia) en, por ej., para NHL de células B, CD20, positivo, de grado bajo o folicular refractario o recidivante, o pueden administrarse a pacientes en conjunto con otros fármacos en un régimen de múltiples fármacos.

Los anticuerpos 2H7 humanizados o los fragmentos funcionales de la invención pueden utilizarse como terapia de primera línea. La invención también contempla el uso de estos anticuerpos para el tratamiento de pacientes con neoplasmas de células B CD20 positivos que no son respondedores o que tienen una respuesta inadecuada al tratamiento con cualquiera de los siguientes fármacos: rituximab (Genentech); ibritumomab tiuxetan (Zevalin™, Biogen Idee); tositumomab (Bexxar™, GlaxoSmithKIine); HuMAX-CD20™ (GenMab); IMMU-106 (el cual es un a.k.a. anti-CD20 humanizado hA20 o 90Y-hLL2, Immunomedics); AME-133 (Applied Molecular Evolution/Eli Lilly); gentuzumab ozogamicina (Mylotarg™, un anticuerpo anti-CD33 humanizado, Wyeth/PDL); alemtuzumab (Campath™, un anticuerpo anti-CD52, Schering Plough/Genzyme); epratuzumab (IMMU-103™, un anticuerpo anti-CD22 humanizado, Immunomedics), o han recaído después del tratamiento con estos fármacos.

La invención proporciona además un método para tratar pacientes con CLL incluyendo aquellos quienes no han respondido a la terapia con fludarabina, con los anticuerpos 2H7 humanizados de la invención.

Una "enfermedad autoinmune" en la presente invención es una enfermedad o trastorno que surge de y se dirige contra el tejido del propio individuo o un cosegregado o su manifestación o condición resultante de la misma. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes o trastornos incluyen, aunque sin limitarse a artritis (artritis reumatoidea tal como artritis aguda, artritis reumatoidea crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis soriática, artritis vertebral, y artritis reumatoidea de inicio en la juventud, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante), enfermedades cutáneas hiperproliferativas inflamatorias, soriasis tal como soriasis en placas, soriasis gutatte, soriasis pustular, y soriasis de las uñas, atopía incluyendo enfermedades atópicas, tales como la fiebre del heno y el síndrome de Job, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiformis, y dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM ligada a x, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmune crónica, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrolisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistémica), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) tal como EM espino-óptica, EM progresiva primaria (PPMS), y EM recidivante remitente (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis disseminata, y esclerosis atáxica, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas autoinmunes, colitis tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad intestinal inflamatoria autoinmune), pioderma gangrenosum, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de insuficiencia respiratoria, incluyendo síndrome de insuficiencia respiratoria adulta o aguda (ARDS, según sus siglas en inglés), meningitis, inflamación de la totalidad o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmune, espondilitis reumatoidea, sordera súbita, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis del tallo cerebral y/o límbica, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior, o uveítis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica y aguda tal como GN primaria, GN mediada inmune, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membrano- o membranosa (MPGN), incluyendo Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, afecciones y respuestas alérgicas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma tal como asma bronquial, y asma auto-inmune, afecciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunes contra antígenos extraños tales como grupos sanguíneos A-B-0 fetales durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión leucocitaria, lupus eritematoso sistémico (LES) o lupus sistémico eritematodes tal como LES cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome lúpico neonatal (NLE, según sus siglas en inglés), lupus eritematoso disseminatus, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, extra renal, discoide, alopecia), diabetes mellitus de inicio en la juventud (Tipo I), incluyendo diabetes mellitus insulino-dependiente pediátrico (IDDM, según sus siglas en inglés), diabetes mellitus de inicio en la adultez (diabetes Tipo II), diabetes autoinmune, diabetes insipidus idiopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda o retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitides, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poluarteritis nodosa/periarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vasculitis necrotizante, cutánea o de hipersensibilidad, Vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada a ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)), arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica autoinmune (AIHA, según sus siglas en inglés), anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia pura de glóbulos rojos o aplasia (PRCA, según sus siglas en inglés), deficiencia de Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que involucran diapedesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión de múltiples órganos tal como aquellos secundarios a septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades mediada por complejo antígeno- anticuerpo, enfermedad de la membrana del basamento anti-glomerular, síndrome de anticuerpo antifosfolipídico, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, pénfigo tal como pénfigo ampolloso y pénfigo cutáneo, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo muco-membrana penfigoide, y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis de complejo inmune, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica tal como polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (como es desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura postransfusión (PTP), trombocitopenia inducida por heparina, y trombocitopenia autoinmune o mediada inmune tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) incluyendo ITP crónica o aguda, enfermedad autoinmune de los testículos y ovario incluyendo orquitis y ooforitis autoinmune, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatías poliglandulares), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome de hombre tieso o de persona tiesa, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave asociada a timomas, degeneración cerebelar, neuromiotonia, síndrome opsoclono o opsoclono mioclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterans (no transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía IgA), nefropatía de IgA idiopática, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, esprue celíaco (enteropatía por gluten), esprue refractario, esprue idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrófica (ALS, según sus siglas en inglés; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de arterias coronarias, enfermedad del oído autoinmune tal como enfermedad del oído interno autoinmune (AIED, según sus siglas en inglés), sordera autoinmune, síndrome de opsoclono mioclono (OMS, según sus siglas en inglés), policondritis tal como policondritis refractaria o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, la cual incluye linfocitosis de células B monoclonales (por ej., gammopatía monoclonal benigna y gammopatía monoclonal de significancia indeterminada, MGUS, según sus siglas en inglés), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatias tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canalopatias del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS, según sus siglas en inglés), oftalmopatia endocrina, uveoretinitis, corioretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunes y polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia, y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, enfermedad de tejidos conectivos mixta, mal de Chagas, fiebre reumática, abortos recurrentes, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome postcardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón del avicultor, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción por transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis, kipanosomiasis, 2 esquistosomiasis, ascariasis, aspergillosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetalis, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica), o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección por echovirus, cardiomiopatia, mal de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus rubéola, síndromes postvacunación, infección de rubéola congénita, infección por virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis post estreptocócica, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsalis, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftalmopatia endocrina, neumonitis por hipersensibilidad crónica, keratoconjuntivitis sicca, keratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatia de cambio mínimo, lesión por isquemia- reperfusión y familiar benigna, autoinmunidad retinal, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad de las vías respiratorias obstructiva crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, espermiogénesis, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmía facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, sordera sensoneural, hemoglobinuria paroxistíca, hipogonadismo, ileítis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, poliradiculitis aguda, pioderma 3 gangrenosa, tireoiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, infertilidad debido a anticuerpos antiespermatozoicos, timoma no maligno, vitíligo, SCID y enfermedades asociadas al virus Epstein-Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades parasitarias tales como Leishmania, síndrome de choque tóxico, envenenamiento con alimento, afecciones que involucran infiltración de células T, deficiencia de adhesión leucocitaria, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, enfermedades que involucran diapedesis leucocitaria, síndrome de lesión de múltiples órganos, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana del basamento antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatias autoinmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune, oftalmía simpatética, enfermedades reumáticas, enfermedad de tejidos conectivos mixtos, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio en la adultez (AOIH, según sus siglas en inglés), alopecia totalis, cardiomiopatía dilatada, epidermólisis ampollosa adquirida (EBA, según sus siglas en inglés), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoide, frontal, maxilar, o esfenoide, un trastorno relacionado con eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia con infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinófila crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclera, epiesclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, linfadenitis, trastorno de reperfusión isquémica, reducción en la respuesta a la presión sanguínea, disfunción vascular, angiectasis, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral, y enfermedad que acompaña la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de tejidos del miocardio u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citoquinas, inflamación seria aguda, inflamación crónica resistente al tratamiento, pielitis, neumonocirrosis, retinopatia diabética, trastorno de arterias grandes diabético, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis.

En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos 2H7 humanizados y sus fragmentos funcionales se utilizan para tratar la artritis reumatoidea y la artritis reumatoidea juvenil, lupus eritematoso sistémico (LES) incluyendo nefritis lúpica, enfermedad de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerativa, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP, según sus siglas en inglés), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, según sus siglas en inglés), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple incluyendo EM recidivamente remitente, soriasis, nefropatía de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculitis asociada con ANCA, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, Neuromielitis óptica (NMO) y glomerulonefritis.

"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere al tratamiento terapéutico donde el objeto consiste en ralentizar (reducir) si no curar la afección o trastorno patológico que se busca tratar o evitar la recurrencia de la afección. Un sujeto es exitosamente "tratado" por una enfermedad autoinmune o una enfermedad de células B CD20 positiva si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención de acuerdo con los métodos de la presente invención, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más signos y síntomas de la enfermedad en particular. Por ejemplo, para el cáncer, una reducción significativa en la cantidad de células cancerígenas o ausencia de las células cancerígenas; reducción en el tamaño tumoral; inhibición (es decir, ralentizar hasta cierto grado y con preferencia detener) de la metástasis tumoral; inhibición, hasta cierto grado, del crecimiento tumoral; aumento de la longitud de la remisión, ralentización en el progreso de la enfermedad, y/o alivio en cierta medida, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbidez y mortalidad reducidas, y mejora en la calidad de vida. La reducción de los signos o síntomas de una enfermedad también puede sentirse por el paciente. El tratamiento puede lograr una respuesta completa, definida como la desaparición de todos los signos de cáncer, o una respuesta parcial, donde el tamaño del tumor es reducido, con preferencia en más del 50 por ciento, más preferentemente en 75%. Un paciente es también considerado tratado si el paciente experimenta una enfermedad estable. En un criterio, los anticuerpos h2H7 de la invención logran > 95% de agotamiento de células B sanguíneas periféricas y las células B regresan al 25% del punto de partida. En realizaciones preferidas, el tratamiento con los anticuerpos de la invención es eficaz para dar como resultado que los pacientes con cáncer estén libres de progreso del cáncer 4 meses luego del tratamiento, con preferencia 6 meses, más preferentemente un año, aun más preferentemente 2 años o más luego del tratamiento. Estos parámetros para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina conocidos por un médico con conocimientos adecuados de la técnica.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o de un fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir la cantidad de células cancerígenas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y con preferencia detener) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y, con preferencia, detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición precedente de "tratar". En el caso de una enfermedad autoinmune, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o de otro fármaco es eficaz para reducir los signos y los síntomas de la enfermedad.

Los parámetros para evaluar la eficacia o el éxito del tratamiento del neoplasma serán conocidos por el médico que conoce la enfermedad apropiada. En general, el médico experto buscará la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Los parámetros pueden incluir un tiempo medio a la progresión de la enfermedad, tiempo en remisión, enfermedad estable.

Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, sus diagnósticos, tratamiento y procedimientos médicos estándares para medir la eficacia del tratamiento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Filadelfia, 1998; van Besien K y Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Cap. 70, pp 1293-1338, en: Hematology , Basic Principies and Practice, 3ra ed. Hoffman et al. (editores). Churchill Livingstone, Filadelfia, 2000; y Rai, K y Patel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Cap. 72, pp 1350-1362, en: Hematology , Basic Principies and Practice, 3ra ed. Hoffman et al. (editores). Churchill Livingstone, Filadelfia, 2000.

Los parámetros para evaluar la eficacia o el éxito del tratamiento de una enfermedad autoinmune o relacionada autoinmune serán conocidos por el experto en la enfermedad apropiada. En general, el médico buscará la reducción de los signos y síntomas de la enfermedad específica. Lo que sigue son ejemplos.

En una realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos 2H7 humanizados se utilizan para tratar la artritis reumatoidea.

La AR es una enfermedad autoinmune debilitante que afecta a más de dos millones de americanos e impide la realización de las actividades diarias de los que la padecen. La AR se produce cuando el sistema inmunológico del propio cuerpo ataca inapropiadamente el tejido articular y causa la inflamación crónica que destruye al tejido sano y produce daños dentro de las articulaciones. Los síntomas incluyen inflamación de las articulaciones, hinchazón, tiesura, y dolor. Por añadidura, puesto que la AR es una enfermedad sistémica, puede tener efectos en otros tejidos tales como los pulmones, los ojos y la médula ósea. No existe cura alguna conocida. Los tratamientos incluyen una variedad de fármacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunosupresivos, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs, según sus siglas en inglés), y agentes biológicos. Sin embargo, muchos pacientes siguen teniendo una respuesta inadecuada al tratamiento.

Los anticuerpos pueden utilizarse como terapia de primera línea en pacientes con AR temprana (es decir, sin tratamiento previo con metotrexato (MTX)) y como monoterapia, o en combinación con o luego de, por ej., MTX o ciclofosfamida. O, los anticuerpos pueden utilizarse en el tratamiento como terapia de segunda línea para pacientes quienes fueron refractarios a DMARD y/o MTX, y como monoterapia o en combinación con, por ej., MTX. Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados son útiles para prevenir y controlar el daño articular, retardar el daño estructural, disminuir el dolor asociado con la inflamación en la AR, y reducir en general los signos y síntomas en la AR moderada a severa. El paciente con AR puede ser tratado con el anticuerpo de CD20 humanizado con anterioridad a, luego de o en forma conjunta con el tratamiento con otros fármacos utilizados en el tratamiento de la AR (véase terapia de combinación más adelante). En una realización, los pacientes quienes no han respondido previamente a fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad y/o que han tenido una respuesta inadecuada a metotrexato solo son tratados con un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención. En una realización de este tratamiento, los pacientes están en un régimen de tratamiento de 17 días que reciben anticuerpo de unión a CD20 humanizado solo (infusiones i.v. de 1g en los días 1 y 15); anticuerpo de unión a CD20 más ciclofosfamida (infusión i.v. de 750 mg en los días 3 y 17); o anticuerpo de unión a CD20 más metotrexato.

Debido a que el cuerpo produce factor alfa de necrosis tumoral (TNFa) durante la AR, se han utilizado inhibidores de TNFa para la terapia de dicha enfermedad. Sin embargo, los inhibidores de TNFa tales como Etanercept (ENBREL®), Infliximab (REMICADE®) y Adalimumab (HUMIRA™) pueden producir efectos secundarios negativos tales como infección, insuficiencia cardiaca y desmielinizacion. Por lo tanto, en una realización, los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o sus fragmentos biológicamente funcionales son útiles, por ejemplo como terapia de primera línea, para tratar pacientes con AR para reducir el riesgo de estos efectos secundarios negativos experimentados con los fármacos inhibidores de TNFa o para tratar pacientes que son considerados propensos a experimentar una toxicidad, por ej. toxicidad cardiaca. Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o sus fragmentos biológicamente funcionales son también útiles en un método para tratar a un sujeto que sufre de AR quien ha sido tratado con un inhibidor de TNFa pero que es no respondedor, tiene una respuesta inadecuada al inhibidor de TNFa (pacientes TNF-IR), o tiene una recidiva de la enfermedad después de cierto tiempo de respuesta, o se determina que es un paciente que posiblemente no responderá a la terapia con un inhibidor de TNFa. En una realización, los TNF-IR son tratados con una dosis baja tal como inferior a 100mg, con anterioridad al tratamiento con un inhibidor de TNFa. · Un método para evaluar la eficacia del tratamiento en AR se basa en los criterios de American College of Rheumatology (ACR) (Universidad Americana de Reumatología), el cual mide el porcentaje de mejora en articulaciones blandas e hinchadas, entre otras cosas. El paciente con AR puede ser calificado en por ejemplo, ACR 20 (20 por ciento de mejora) comparado con ningún tratamiento con anticuerpos (por ej., punto de partida antes del tratamiento) o tratamiento con placebo. Otras formas de evaluar la eficacia del tratamiento con anticuerpos incluyen calificación con rayos X tal como el puntaje Sharp X-ray utilizado para 7 calificar el daño estructural tal como la erosión ósea y el angostamiento del espacio articular. Los pacientes pueden ser también evaluados para la prevención de, o mejora en la incapacidad en base al puntaje del Cuestionario de Evaluación de la Salud (Health Assessment Questionnaire) [HAQ], puntaje AIMS, SF-36 en períodos de tiempo durante o después del tratamiento. Los criterios de ACR 20 pueden incluir 20% de mejora tanto en el recuento de articulaciones blandas (dolorosas) como en el recuento de articulaciones hinchadas más un 20% de mejora en al menos 3 de 5 mediciones adicionales: 1. evaluación del dolor sufrido por el paciente mediante escala visual analógica (VAS, según sus siglas en inglés), 2. evaluación global del paciente de la actividad de la enfermedad (VAS), 3. evaluación global del médico de la actividad de la enfermedad (VAS), 4. incapacidad autoevaluada del paciente medida por el Cuestionario de Evaluación de Salud (Health Assessment Questionnaire), y 5. reactantes en fase aguda, CRP o ESR.

La ACR 50 y 70 son definidos de manera análoga. Con preferencia, se le administra al paciente una cantidad de un anticuerpo de unión a CD20 de la invención eficaz para lograr al menos un puntaje de ACR 20, con preferencia al menos ACR 30, más preferentemente al menos ACR50, aun más preferentemente al menos ACR70, con máxima preferencia al menos ACR 75 y más elevado.

La artritis soriática tiene características radiográficas únicas y distintivas. Para la artritis soriática, la erosión articular y el angostamiento del espacio articular pueden evaluarse mediante el puntaje Sharp también. Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados de la invención pueden utilizarse para prevenir el daño articular así como también reducir los signos de la enfermedad y los síntomas del trastorno.

Aun otro aspecto de la invención es un método para tratar el LES o lupus nefritis administrando a un sujeto que sufre del trastorno, una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención. Los puntajes SLEDAI proporcionan una cuantificación numérica de la actividad de la enfermedad. El SLEDAI es un índice ponderado de 24 parámetros clínicos y de laboratorio que se sabe que se correlacionan con la actividad de la enfermedad, con un rango numérico de 0-103. Ver Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" ¡n Current Opinión in Rheumatology 2002, 14:515-521. Otros métodos de puntuación incluyen la puntuación BILAG. Se cree que los anticuerpos contra ADN de doble hebra causan exacerbaciones renales y otras manifestaciones de lupus. Los pacientes que están bajo tratamiento con anticuerpos pueden ser monitoreados para determinar el tiempo hasta la exacerbación renal, lo cual es definido como un aumento significativo y reproducible en la creatinina sérica, la proteína en orina o la sangre en la orina. Alternativa o adicionalmente, los pacientes pueden ser monitoreados para determinar los niveles de anticuerpos antinucleares y anticuerpos contra ADN de doble hebra. Los tratamientos para LES incluyen corticosteroides en dosis elevadas y/o ciclofosfamida (HDCC). En la presente, un tratamiento exitoso de lupus reduciría la exacerbación, es decir, reduciría la severidad y/o el tiempo hasta la siguiente exacerbación.

Las espondiloartropatias son un grupo de trastornos de las articulaciones, incluyendo la espondilitis anquilosante, la artritis soriática y la enfermedad de Crohn. El éxito del tratamiento puede determinarse por herramientas de medición para la evaluación global por parte del paciente y del médico validadas.

Con respecto a la vasculitis, aproximadamente 75% de los pacientes con vasculitis sistémica tienen anticuerpo citoplásmico anti-neutrófilos y agrupamiento en una de tres condiciones que afectan a los vasos de tamaño pequeño/ mediano: granulomatosis de Wegener (WG), poliangiitis microscópica (MPA) y síndrome de Churg Strauss (CSS), colectivamente conocidos como vasculitis asociada con ANCA (AAV).

La eficacia del tratamiento para la soriasis es evaluada monitoreando los cambios en los signos clínicos y síntomas de la enfermedad incluyendo los cambios en la Evaluación Global del Médico (PGA) y puntajes del índice del Área de la Soriasis y Severidad de la misma (PASI), Evaluación de los Síntomas de la Soriasis (PSA), en comparación con la condición del punto de partida. El paciente con soriasis tratado con un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención tal como hu2H7.v511 puede ser medido periódicamente a lo largo del tratamiento en la escala visual analógica utilizada para indicar el grado de picazón experimentado en puntos temporales específicos.

Los pacientes pueden experimentar una reacción de infusión o síntomas relacionados con infusión con su primera infusión de un anticuerpo terapéutico. Estos síntomas varían en severidad y en general son reversibles con la intervención médica. Estos síntomas incluyen, aunque sin limitarse a, fiebre del tipo resfrío, escalofríos moderados/intensos, náuseas, urticaria, dolor de cabeza, broncoespasmo, angioedema. Sería conveniente que los métodos de tratamiento de la enfermedad de la presente invención reduzcan al mínimo las reacciones de la infusión. Para aliviar o reducir al mínimo dichos eventos adversos, el paciente puede recibir una o más dosis de acondicionamiento o de tolerancia iniciales del anticuerpo seguido por una dosis terapéuticamente eficaz. La o las dosis de acondicionamiento serán más bajas que la dosis terapéuticamente eficaz para acondicionar al paciente a tolerar dosis más elevadas.

Dosificación Dependiendo de la indicación a ser tratada y de factores relevantes a la dosificación de conocimiento por parte del médico capacitado en el campo, los anticuerpos de la invención serán administrados en una dosis que es eficaz para el tratamiento de esa indicación reduciendo al mínimo la toxicidad y los efectos colaterales. La dosis deseada puede depender de la enfermedad y de la severidad de la enfermedad, de la etapa de la enfermedad, del nivel de modulación de células B deseado, y de otros factores conocidos por el experto en la técnica.

Para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, puede ser conveniente modular el grado de depleción de células B dependiendo de la enfermedad y/o de la severidad de la afección en el paciente individual, ajusfando la dosis de anticuerpo 2H7 humanizado. La depleción de células B puede ser, aunque no necesariamente, completa. O, puede desearse la depleción total de las células B en el tratamiento inicial pero en tratamientos subsiguientes, la dosis puede ser ajustada para lograr solamente la depleción parcial. En una realización, la depleción de células B es de al menos 20%, es decir, 80% o menos de células B CD20 positivas permanecen en comparación con el nivel del punto de partida antes del tratamiento. En otras realizaciones, la depleción de células B es 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o superior. Con preferencia, la depleción de células B es suficiente para detener el progreso de la enfermedad, más preferentemente para aliviar los signos y síntomas de la enfermedad en particular bajo tratamiento, aun más preferentemente para curar la enfermedad.

Los anticuerpos de la invención pueden ser administrados en diversas frecuencias de dosificación, por ej. semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, etc. En un ejemplo, la frecuencia de dosificación es una dosis cada seis meses, o dos dosis espaciadas a lo largo de dos semanas cada seis meses. El volumen de la solución de anticuerpo a ser inyectado puede oscilar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 3 mi por inyección, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 mi y aproximadamente 1 ,5 mi por inyección. La cantidad total de anticuerpo 2H7 humanizado administrado en una inyección puede ser de hasta aproximadamente 150 mg por inyección. Pueden utilizarse múltiples inyecciones a fin de lograr una dosis deseada.

Los pacientes que tienen una enfermedad autoinmune o una enfermedad de células B para quienes una o más terapias actuales fueron ineficaces, pobremente toleradas, o contraindicadas pueden ser tratados utilizado cualquiera de los regímenes de dosificación de la presente invención. Por ejemplo, la invención contempla los presentes métodos de tratamiento para pacientes con AR quienes han tenido una respuesta inadecuada a las terapias con inhibidor del factor de necrosis tumoral (TNF) o a la terapia con fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (D ARD).

La administración "crónica" se refiere a la administración del o de los agentes en un modo continuo en oposición a un modo agudo, de modo de mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un período prolongado de tiempo. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino más bien que es de naturaleza cíclica.

Terapia Combinada Al tratar los neoplasmas de células B descritos anteriormente, el paciente puede ser tratado con los anticuerpos 2H7 humanizados de la presente invención en conjunto con uno o más agentes terapéuticos tales como un agente quimioterapéutico en un régimen multidrogas. El anticuerpo 2H7 humanizado puede ser administrado concurrentemente, consecutivamente, o alternando con el agente quimioterapéutico, o después de no obtener respuesta alguna con otra terapia. La quimioterapia convencional para el tratamiento del linfoma puede incluir ciclofosfamida, citarabina, melfalan'y mitoxantrona más melfalan. CHOP es uno de los regímenes de quimioterapia más comunes para tratar el linfoma no Hodgkin. Lo que sigue son los fármacos utilizados en el régimen de CHOP: ciclofosfamida (nombres comerciales cytoxan, neosar); adriamicina (doxorrubicina / hidroxidoxorrubicina); vincristina (Oncovin); y prednisolona (algunas veces denominada Deltasona u Orasona). En realizaciones particulares, el anticuerpo de unión a CD20 es administrado a un paciente que lo necesita en combinación con uno o más de los siguientes agentes quimioterapéuticos de doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona. En una realización específica, un paciente que sufre de un linfoma (tal como un linfoma no Hodgkin) es tratado con un anticuerpo 2H7 humanizado de la presente invención en conjunto con terapia de CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona). En otra realización, el paciente con cáncer puede ser tratado con un anticuerpo de unión a CD20 2H7 humanizado de la invención en combinación con quimioterapia con CVP (ciclofosfamida, vincristina, y prednisona). En una realización específica, el paciente que sufre de NHL CD20-positivo recibe una administración de 2H7.v511 o v114 humanizado en conjunto con CVP, por ejemplo, cada 3 semanas durante 8 ciclos. En una realización específica del tratamiento de CLL, el anticuerpo hu2H7.v511 es administrado en conjunto con quimioterapia con uno o ambos de fludarabina y citoxan.

Un "agente quimioterapéutico" es . un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, tríetilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrah¡drocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (¡rinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina); bnostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposide; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1 ); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ¡fosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; bisfosfonatos, tales como clodronato; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ej., calicheamicina, especialmente calicheamicina gammal l y calicheamicina omegaM (ver, por ej., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) y antraciclinas tales como annamicina, AD 32, aclarubicina, daunorubicina, dexrazoxano, DX-52-1 , epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluyendo dinemicina A, una esperamicina, cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, doxorubicina liposómica, y desoxidoxorubicina), esorubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, y zorubicina; análogos del ácido fólico tales como denopterina, pteropterina, y trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, y floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, y testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, y trilostano; recargador de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorina); aceglatona; agentes antineoplásicos anti-folato tales como ALIMTA®, LY231514 pemetrexado, 7 inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como metotrexato, anti-metabolitos tales como 5-fluorouracil (5-FU) y sus profármacos tales como UFT, S-1 y capecitabina, e inhibidores de timidilato sintasa e inhibidores de glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexado (TOMUDEXRM, TDX); inhibidores de dihidropirimidina deshidrogenasa tal como eniluracil; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxántrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxanos, por ej., TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación en nanopartículas modificada con albúmina, libre de Cremofor ABRAXANE™ de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platino; análogos de platino o análogos de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); alcaloides de la vinca; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ¡bandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales aceptables para uso farmacéutico, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como también combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

También se incluye en esta definición a los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivos (SERMs, según sus siglas en inglés), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifenoe, keoxifeno, LY117018, onapfistona, y toremifeno FARESTON®; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, la cual regula la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exemestano, formestano, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como también troxacitabina (un análogo de 1 ,3-dioxolano nucleósido citosina); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en la señalización de rutas implicadas en la proliferación de células aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN®, y la vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y las sales aceptables para uso farmacéutico, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

Adicionalmente, los anticuerpos hu2H7 y sus fragmentos funcionales pueden utilizarse para tratar un neoplasma de células B que expresa CD20 (por ej, NHL) en conjunto con un agente de la angiogénesis antitumoral tal como un antagonista del Factor del Crecimiento Endotélico Vascular (VEGF, según sus siglas en inglés). Un "agente anti-angiogénesis " o "inhibidor de la angiogénesis" se refiere a una sustancia de peso molecular pequeño, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o sus conjugados o sus proteínas de fusión, que inhibe la angiogénesis, vasculogénesis, o permeablidad vascular indeseable, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, un agente anti-angiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista de un agente angiogénico según lo definido anteriormente, por ej., anticuerpos contra VEGF, anticuerpos contra receptores de VEGF, moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (por ej., PTK787/ZK2284, SU6668). Un "antagonista de VEGF" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir, o interferir con las actividades de VEGF incluyendo su unión a uno o más receptores de VEGF. En una realización, un paciente que sufre de dicho neoplasma de células B se trata con 2H7.v511 o 2H7.v114 en conjunto con Avastin® (bevacizumab; Genentech). El anticuerpo anti-VEGF "bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "Avastin®", es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997).

Los anticuerpos hu2H7 y sus fragmentos funcionales son útiles en un método para tratar un neoplasma de células B que expresa CD20 en conjunto con 1 un miembro de la familia de TNF de citoquinas tales como ligando Apo-2 también denominado TRAIL. El ligando Apo-2 humano de secuencia natural de longitud completa es una proteína de 281 aminoácidos de largo, de transmembrana del Tipo II de la familia de factores de necrosis tumoral de citoquinas. Las formas solubles del ligando Apo-2, tales como aquellas que comprenden un dominio extracelular (ECD, según sus siglas en inglés) o sus porciones, se ha descubierto que tienen diversas actividades, incluyendo actividad apoptótica en células cancerígenas de mamífero. Apo2L/TRAIL (descrito en WO 97/01633 y WO 97/25428) es una proteína humana soluble la cual es un fragmento del ECD, que comprende los aminoácidos 114-281 de la proteína Apo-2L de longitud completa.

En el tratamiento de las enfermedades autoinmunes o afecciones relacionada con el sistema autoinmune descritas anteriormente, el paciente puede ser tratado con uno o más anticuerpos hu2H7, en conjunto con un segundo agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor, tal como en un régimen multidrogas. El anticuerpo hu2H7 puede ser administrado concurrentemente, consecutivamente o alternando con el agente inmünosupresivo o luego de la no respuesta con otra terapia. El agente inmünosupresivo puede ser administrado a la misma dosis o en una dosis menor que la establecida en la técnica. El agente inmünosupresivo coadyuvante preferido dependerá de muchos factores, incluyendo el tipo de trastorno que se está tratando así como también la historia del paciente.

"Agente inmünosupresivo" como se utiliza en esta invención para terapia coadyuvante se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune de un paciente. Dichos . agentes incluirían sustancias que suprimen la producción de citoquinas, regulan descendentemente o suprimen la expresión de autoantígenos, o enmascaran los antígenos MHC. Los ejemplos de ese tipo de agente incluyen esteroides tales como glucocorticosteroides, por ej., prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; pirimidinas 2-amino-6-arll-5-sustituidas (ver la Patente de los Estados Unidos No. 4.665.077), azatioprina (o ciclofosfamida, si existe una reacción adversa a azatioprina); bromocriptina; glutaraldehído (el cual enmascara a los antígenos MHC, según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4.120.649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos de MHC; ciclosporina A; citoquina o antagonistas del receptor de citoquinas incluyendo anti-interferór)-~(? anticuerpos; anticuerposfdel factor de necrosis antitumoral; anticuerpos, del factor de necrosis anti-tumoral; anticuerpos anti-interleuquina-2 y anticuerpos del receptor anti-IL-2; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocitaria heteróloga; anticuerpos pan-T, con preferencia anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión a LFA-3 (WO 90/08187 publicado 26/7/90); estreptoquinasa; TGF-;; estreptodornasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; desoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (Patente de los Estados Unidos No. 5.114.721); fragmentos de receptor de células T (Offner et al., Science 251 :430-432 (1991 ); WO 90/11294; y WO 91/0 133); y anticuerpos de receptores de células T (EP 340,109) tal como T10B9.

Para el tratamiento de la artritis reumatoidea, el paciente puede ser tratado con un anticuerpo de unión a CD20 de la invención en conjunto con cualquiera o más de los siguientes fármacos: DMARDS (siglas correspondientes a fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad (por ej., metotrexato), NSAI ó NSAID (siglas correspondientes a fármacos antiinflamatorios no esteroideos), inmunosupresores (por ej., azatioprina; micofenolato mofetil (CelICept®; Roche)), analgésicos, glucocorticosteroides, ciclofosfamida, HUMIRA™ (adalimumab; Abbott Laboratories), ARAVA® (leflunomida), REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., de Malvern, Pa), ENBREL® (etanercept; Immunex, WA), ACTEMRA® (tocilizumab; Roche, Suiza), inhibidores de COX-2. DMARDs comúnmente utilizados en AR son hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, Gold (oral), Gold (intramuscular), minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción de proteína A estafilocóccica.

Adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano que se une a TNF. Infliximab es un anticuerpo monoclonal ratón- humano quimérico que se une a TNF. Es un fármaco inmunosupresor indicado para tratar AR y la enfermedad de Crohn. Infliximab ha sido vinculado con reacciones fatales tales como insuficiencia cardiaca e infecciones que incluyen tuberculosis así como también desmielinación dando como resultado EM. Actemra (tocilizumab) es un receptor de interleuquina -6 (IL- 6) anti-humano humanizado.

Etanercept es una proteína de fusión de "inmunoadhesina" que consiste en la porción de unión al ligando extracelular del receptor de factor de necrosis tumoral (TNFR) de 75 kD (p75) humano ligado a la porción Fe de una lgG1 humana. Etanercept (ENBREL®) es un fármaco inyectable aprobado en los Estados Unidos para terapia de AR activa. Etanercept se une a TNFa y sirve para eliminar la mayor parte de TNFa de las articulaciones y sangre, evitando de ese modo que TNFa promueva la inflamación y otros síntomas de artritis reumatoidea. El fármaco ha sido asociado con efectos colaterales negativos incluyendo infecciones serias y sepsis, trastornos del sistema nervioso tales como esclerosis múltiple ( M). Véase, por ej., www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html Para el tratamiento convencional de AR, véase, por ej., "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (Febrero, 2002). En una realización específica, el paciente con AR es tratado con un anticuerpo CD20 hu2H7 de la invención en conjunto con metotrexato (MTX).

Una dosis ejemplar de MTX es de aproximadamente 7,5-25 mg/kg/sem. MTX puede ser administrado por vía oral y subcutánea.

En un ejemplo, los pacientes también reciben MTX concomitante (10-25 mg/semana por vía oral (p.o.) o parenteral), junto con un régimen de corticosteroides que consiste en metilprednisolona 100 mg i.v. 30 minutos antes de las infusiones del anticuerpo CD20 y prednisona 60 mg p.o. en los días 2-7, 30 mg p.o. Los días 8-14, retornando a la dosis del punto de partida alrededor del Día 16. Los pacientes también pueden recibir folato (5 mg/semana) administrado como una dosis única o como dosis diarias divididas. Los pacientes opcionalmente continúan recibiendo cualquier corticosteroide de fondo (10mg/d de prednisona o equivalente) a lo largo del período de tratamiento.

Para el tratamiento de la espondilitis anquilosante, la artritis soriática y la enfermedad de Crohn, el paciente puede ser tratado con un anticuerpo de unión a CD20 de la invención en conjunto con, por ejemplo, Remicade® (infliximab; de Centocor Inc., de Malvern, Pa.), ENBREL (etanercept; Immunex, WA).

Los tratamientos para LES incluyen la combinación el anticuerpo CD20 con corticosteroides a dosis elevadas y/o ciclofosfamida (HDCC). Los pacientes que sufren de LES, AAV y NMO pueden ser tratados con un anticuerpo 2H7 de la invención en combinación con cualquiera de los siguientes: corticosteroides, NSAIDs, analgésicos, inhibidores de COX-2, glucocorticosteriodes, DMARDS convencionales (por ej. metotexato, sulfasalazina, hidroxicloroquina, leflunomida), DMARDs biológicos tales como anti-Blys (por ej., belimumab), anti-IL6R por ej., tocilizumab; CTLA4-lg (abatacept), (anti-CD22 por ej., epratuzumab), inmunosupresores (por ej., azatioprina; micofenolato mofetil (CelICept®; Roche)), y agentes citotóxicos (por ej., ciclofosfamida).

Para el tratamiento de la soriasis, los pacientes pueden recibir una administración de un anticuerpo 2H7 humanizado en conjunto con tratamientos tópicos, tales como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasól, y tazaroteno, o con terapias con metotrexato, retinoides, ciclosporina, PUVA y UVB. En una realización, el paciente con soriasis es tratado con un anticuerpo 2H7 humanizado en forma consecutiva o concurrente con ciclosporina.

Para reducir al mínimo la toxicidad, pueden administrarse terapias sistémicas tradicionales en regímenes de tratamiento rotacionales, consecutivos, combinatorios, o intermitentes, o regímenes de combinación de dosificaciones inferiores con las composiciones del anticuerpo de unión a CD20 hu2H7 en las presentes dosificaciones.

Artículos de Manufactura y Kits Otra realización de la invención es un artículo de manufactura que comprende una formulación de la invención útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas y cánceres CD20 positivos tales como el linfoma no Hodgkin. El artículo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de paquete en o asociado con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Al menos un agente activo en la formulación o composición es un anticuerpo hu2H7 de la invención, estando el anticuerpo presente en el contenedor tal como una jeringa, en una cantidad para administrar la dosis descrita anteriormente bajo dosificación. La concentración del hu2H7 estará en el rango de 10mg/ml a 200mg/ml, puede ser 30-150mg/ml o 100-150 mg/ml. La etiqueta o inserto del paquete indica que la composición se utiliza para tratar la afección en particular. La etiqueta o inserto del paquete comprenderá además instrucciones para administrar la composición del anticuerpo al paciente.

Inserto del paquete se refiere a instrucciones habitualmente incluidas en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos. En una realización, el inserto del paquete indica que la composición es utilizada para tratar el linfoma no Hodgkin.

Por añadidura, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo contenedor que comprende un buffer aceptable para uso farmacéutico, tal como agua de inyección (WFI, según sus siglas en inglés), agua bacteriostática para inyección (BWFI, según sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, cloruro sódico (0,9%) y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros búferes, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Ejemplos Experimentales Ejemplo 1 Formulación Subcutánea Inicial para rhuMab 2H7 Se desarrolló una formulación subcutánea de alta concentración (150 mg/mL) para rhuMAb 2H7. Esta formulación comprende 150 mg/ml 2H7, 30 mM de acetato sódico; 7% de trehalosa dihidrato; 0,03% de Polisorbato 20, a pH 5,3. Esta formulación es estable a largo plazo en el frasco de almacenamiento final bajo las condiciones recomendadas. Las administración de este material por inyecciones subcutáneas en monos cynomolgus dio como resultado una severa •inflamación en el sitio de inyección y baja biodisponibilidad (=30%). Se observó en estos animales infiltración de macrófagos leve a moderada en la capa subcutánea. La causa de la irritación fue atribuida a material corporal extraño (es decir, material de ensayo de 2H7). El análisis de esta formulación bajo condiciones que simularon a lo que estaba expuesto el producto en el sitio de inyección confirmó que la proteína era significativamente agregada bajo condiciones fisiológicas (Figura 1 ) corroborando los resultados de la inflamación observados en monos cynomolgus. La precipitación observada puede ser consistente con un efecto de desalado subsiguiente a un cambio de pH.

Ejemplo 2 Método de diálisis in vitro para analizar la agregación de macromoléculas bajo las condiciones fisiológicas de invección subcutánea.

Se desarrolló un método de diálisis in vitro para analizar la capacidad de diferentes excipientes para reducir la agregación de 2H7 bajo las condiciones fisiológicas encontradas durante la inyección subcutánea. Se desarrolló una solución de PBS modificada (el "medio de liberación") para este modelo para simular el fluido intersticial. Este sistema in vitro se utilizó para evaluar el efecto de los azúcares, polímeros, surfactantes, y de los aminoácidos en el retardo de la agregación de 2H7. Las formulaciones candidatas que mostraron una liberación in vitro del producto mejorada fueron luego analizadas in vivo (modelo subcutáneo de rata; véase el Ejemplo 3) para determinar si esta mejora correspondía a una disminución de la inflamación in vivo.

La instalación del modelo de diálisis in vitro se muestra en la Figura 2. Se llenaron jarras de vidrio de 250 mi con 220 mi de medio de liberación (Sodio 16JmM, Cloruro 140mM, Fosfato 17mM, Potasio 4mM) a 37°C. Se empaparon tubos de diálisis de 6 cm de longitud (Spectra Por 1 Million Molecular Weight Cut Off (MWCO) diámetro de 12 mm de tubo del Diálisis PVDF) en agua purificada. Un extremo del tubo de diálisis se sujetó, y el tubo se cargó con aproximadamente 1 mi de muestra de ensayo (2H7 con excipiente de ensayo). Se eliminó el aire en exceso, y se sujetó el extremo opuesto del tubo al sello de la jarra. La bolsa cargada fue agregada a la jarra de vidrio de 250 mi que contenía el medio de liberación, y la jarra se colocó a 37°C con agitación constante. Se retiraron muestras de 500 µ? del medio de liberación después de 2,5, 6, 12, 24, 33 y 48 horas. La turbidez de las muestras y la cantidad de proteína presente en el medio de liberación se midieron por barrido fotométrico de UV. Por añadidura, el medio de liberación y la solución dentro del tubo de diálisis se inspeccionaron visualmente para precipitación.

Se consideró que un excipiente de ensayo era aceptable en el estudio de agregación in vitro si: • La liberación acumulativa de 2H7 con el excipiente de ensayo era superior al control negativo (formulación original de 2H7 - . 150 mg/ml 2H7, Acetato sódico 30 mM; 7% de trehalosa Dihidrato; 0,03% de Polisorbato 20, a pH 5,3) indicando características de 2H7 mejoradas.

• El control positivo (rhuMAb anti-CD1 1a, también conocido como Raptiva™, un anticuerpo anti-CD11a humanizado administrado subcutáneamente) no mostró precipitación alguna y mayor liberación que el control negativo.

• La precipitación de 2H7 fue reducida o eliminada.

• La turbidez del medio de liberación fue reducida.

Los candidatos que cumplieron con los criterios de aceptación fueron luego analizados en el modelo de rata in vivo para determinar si el retardo de la agregación in vitro se correlacionaba con una disminución de la inflamación in vivo.

Resultados In Vitro: El perfil de liberación típico de los controles de estudio en el método de diálisis in vitro se muestra en la Figura 3. Los controles para este modelo se seleccionaron para clasificar la liberación de una proteína que no se agregaba fácilmente (rhuMAb CD1 1a) y una liberación de proteína que se agregaba típicamente (2H7 original) bajo condiciones fisiológicas. El área entre las dos curvas de liberación mide la capacidad relativa de los excipientes de ensayo para retardar la agregación con relación a los controles.

La liberación acumulativa de la formulación original 2H7 es baja (< 30%). Se observó una mayor turbidez del medio de liberación a medida que 2H7 era liberado de la bolsa de diálisis en el medio de liberación, indicando que el material se estaba agregando en ese medio ambiente. La extensa floculación dentro de la bolsa de diálisis fue observada dentro de 24 horas y correspondía a una disminución dramática en la concentración de 2H7 de 150 mg/mL en el inicio del estudio a 4 hasta 5 mg/mL hacia el final del estudio de 48 horas. Todas estas observaciones indican que 2H7 se agrega fácilmente bajo condiciones fisiológicas. Este comportamiento no es observado cuando la formulación original de 2H7 es almacenada en un frasco de vidrio a 37°C.

Por el contrario, rhuMAb CD1 1a es rápidamente liberado de la bolsa de diálisis en el medio de liberación. El medio de liberación permaneció transparente a lo largo del estudio y no se observó floculación alguna dentro de la bolsa de diálisis, lo cual indica que rhuMÁb CD11a no se agrega bajo condiciones fisiológicas y es relevante como un control para este modelo. La Tabla 3 resume el porcentaje de proteína liberada, la turbidez del medio de liberación y la presencia de floculación.

Tabla 3 Ejemplo 3 Modelo subcutáneo de rata in vivo para analizar la agregación macromolecular El modelo subcutáneo de rata es un modelo relevante basado en la similitud en el carácter dé la inflamación subcutánea. La respuesta inflamatoria de ratas que reciben la formulación original de 2H7 era consistente con la respuesta inflamatoria observada en los monos cynomolgus (ver el Ejemplo 1 ). La coloración inmunohistoquímica para inmunoglobulina humana era positiva en secciones de piel de rata inyectadas con 2H7, lo cual indica la presencia o persistencia del anticuerpo en las áreas de inflamación lo cual respalda la teoría de que la precipitación del artículo de ensayo causó inflamación en el sitio de inyección.

El ensayo de screening de rata in vivo se llevó a cabo de la siguiente manera: Cada formulación de ensayo o control (0,25 mi) fue administrada por vía subcutánea. Los animales fueron sometidos a necropsia a las 72 horas posteriores a recibir la dosis. Se cortaron transversalmente secciones de piel en los sitios de inyección y se fijaron en formalina, y se determinó el efecto del excipiente de ensayo sobre la reducción de la inflamación por histología. Se asignó un puntaje a la inflamación de las secciones histológicas de la siguiente manera: +/-: inflamación mínima/ ligera 1 : inflamación leve 2:moderada 3: severa La presencia de granuloma fue determinada por patología. Se seccionó tejido del sitio de inyección, se tiñó y se visualizó bajo un microscopio luminoso para determinar la presencia o la ausencia de granuloma.

Los criterios de aceptación para el modelo de rata in vivo fueron los siguientes: (1 ) inflamación comparable con rhuMAb CD11a (control negativo), y (2) ausencia de granuloma en sitio de inyección.

Ejemplo 4 Capacidad de surfactantes y otros aditivos de reducir la agregación de 2H7 Se utilizan comúnmente surfactantes para retardar la agregación de macromoléculas. Se evaluó la capacidad de los surfactantes para reducir la agregación y floculación de 2H7 utilizando el modelo in vitro descrito en el Ejemplo 2. Los surfactantes analizados cubren un rango de equilibrios hidrófilos-lipófilos (HLB, según sus siglas en inglés). La adición de los surfactantes polisorbato 20, poloxámero y Span 20 y 80 no mejoró significativamente la liberación de 2H7 con relación a la formulación de 2H7 original. Se observó una mejora modesta en la liberación de 2H7 in vitro con polisorbato 80, pero no se observó una mejora significativa en la liberación de 2H7 con ninguno de los otros surfactantes ensayados (véase la Tabla 4). Sin embargo, se observó floculación dentro de la bolsa de diálisis en todos los casos (Tabla 4). Por lo tanto, los surfactantes, si bien son utilizados tradicionalmente para reducir la agregación proteica, se demostró que no eran eficaces para retardar la agregación de 2H7 en el modelo in vitro.

Tabla 4 Surfactante + 2H7 % de Proteína Liberada HLB Floculación (T=48 horas) dentro de la bolsa de diálisis 2H7 Original 31 N/A Si (control) 10% Poloxámero 15 >28 Si 0.2% Polisorbato 80 59 15 Si 0,05% Span 20 24 8,6 Si 0,02% Span 20 24 8,6 Si 0,05% Span 80 33 4,3 Si 0,02% Span 80 33 4,3 Si rhuMAb CD11a 100 N/A No (control) El impacto del agregado de dextrano (polisacárido), PEG 4000 (polímero), arginina (aminoácido) y Gamma ciclodextrina sobre el retardo de la agregación y la floculacion también fue evaluado y los resultados son sintetizados en las Tablas 5 a 7. No se observó mejora alguna significativa con ninguno de estos aditivos.

Tabla 5 Material de Ensayo + % de Proteína Liberada Floculacion dentro de 2H7 (T=48 horas) bolsa de diálisis 2H7 Original (Control) 58 Sin PBS túrbida 10% 70 KD Dextrano 47 Sin PBS túrbida 10% 2,000KD Dextrano 38 Si (1/2) PBS túrbida rhuMAb CD11a (control) 89 No Tabla 6 Ejemplo 5 Efecto de ciclodextrinas sobré agregación de 2H7 Se analizó el efecto de las ciclodextrinas sobre la agregación de 2H7 en el modelo in vitro. Los materiales utilizados fueron los siguientes: • Sulfo-butil Éter Beta Ciclodextrina, Sal sódica, Cydex, Inc., Captisol Calidad de Investigación • Hidroxipropil-gamma Ciclodextrina, Ciclodextrin Technologies Development, Inc., Trappsol Calidad Farmacéutica • Hidroxipropil-beta Ciclodextrina, Cyclodextrin Technologies Development, Inc., Trappsol Calidad Farmacéutica Los estudios iniciales se llevaron a cabo con 2% a 9% de sulfo-butil éter (SBE) y 5% a 20% de hidroxi propil gamma (HP-Gamma) ciclodextrinas. Tanto la adición de SBE (Figura 4) como de HP-Gamma (Figura 5) ciclodextrinas mejoró significativamente la liberación in vitro de 100 mg/mL de 2H7 con relación al control formulación 2H7 original (Figura 3, Tabla 3). Se observó menos floculación en la bolsa de diálisis con las formulaciones de SBE pero la solución fuera de la bolsa se volvió cada vez más opalescente a medida que la proteína era liberada en el medio. Las formulaciones de HP-Gamma eran más eficaces para reducir la agregación. Había solo una cantidad pequeña de floculación dentro de la bolsa de diálisis y la solución fuera de la bolsa permaneció transparente a lo largo del estudio. En general, la adición de ciclodextrinas ayudó a inhibir la agregación de 2H7 bajo condiciones fisiológicas.

En base a estos resultados prometedores, se evaluó la hidroxi propil beta (HP-Beta) ciclodextrina en el modelo de diálisis in vitro para determinar el impacto de diferentes grupos de sustitución sobre el comportamiento de agregación de 2H7. Se evaluó un rango de concentración de 5% a 20% de HP-Beta ciclodextrina (Figura 6). El porcentaje de proteína liberada fue mejorado con relación a la formulación de 2H7 original pero fue inferior al del rhuMAb CD11a control. El medio de liberación se volvió opalescente a medida que la proteína era liberada en el mismo y apareció floculación dentro de la bolsa de diálisis después de 24 horas de incubación a 37°C. La adición de HP-Beta ciclodextrina era eficaz para reducir la agregación de 2H7 pero parecía cualitativamente menos eficaz que HP-Gamma ciclodextrina (Figura 5).

La combinación de HP-Gamma ciclodextrina y succinato de arginina fue evaluada para determinar su había un efecto aditivo en la reducción de la agregación de 2H7. Se analizaron cuatro relaciones diferentes de succinato de arginina a HP-Gamma ciclodextrina con 100 mg/mL de 2H7 (Figura 7). Se observó una mejora en la liberación de 2H7 en todos los grupos de ensayo con relación a la formulación control de 2H7 original. Las formulaciones de 100 mM de succinato de arginina /10% de HP-Gamma ciclodextrina y 50 mM de succinato de arginina /15% de HP-Gamma ciclodextrina tenía la turbidez más baja después de la liberación en el medio y menos floculación dentro de la bolsa de diálisis con relación a la formulación control de 2H7 original.

Ejemplo 6 Efecto de ciclodextrinas sobre inflamación en el modelo subcutáneo de rata in vivo Las formulaciones de anticuerpo que contenían HP-Gamma y HP-Beta ciclodextrinas que mostraron una mejora significativa en los estudios in vitro fueron luego analizadas en el modelo in vivo subcutáneo de rata. El objetivo de este trabajo fue determinar si eliminando la agregación de 2H7 bajo condiciones fisiológicas in vitro esto se traduciría a la reducción de la inflamación en el sitio de inyección. Los criterios del éxito para el modelo animal fueron: (1 ) baja inflamación comparable en la formulación de ensayo con relación al control de estudio rhuMAb CD1 1a, y (2) sin existencia de granuloma en el sitio de inyección.

Un resumen de los resultados histopatológicos para las formulaciones de HP-Beta ciclodextrina se presenta en la Tabla 8. El control negativo, rhuMAb CD1 1a, indujo la inflamación subcutánea mínima. La formulación original de 150 mg/mL de 2H7 se utilizó como el control positivo y dio como resultado una inflamación moderada a severa (2-3+) en el sitio de inyección. La adición de HP- Beta ciclodextrina redujo significativamente la inflamación en el sitio de inyección. La concentración óptima de 15 o 30% de HP-beta ciclodextrina con 100 mg/mL de 2H7 redujo significativamente la inflamación en el sitio de inyección a leve (1+). El aumento de la concentración de ciclodextrina dio como resultado una reducción en la inflamación incrementada observada con concentraciones superiores de proteína 2H7. La adición de 30% de HP-beta ciclodextrina a concentraciones superiores de 2H7 (150 mg/mL) 2H7 redujo significativamente la inflamación observada de moderada a leve (2-3+) a inflamación leve (1+). Las concentraciones más bajas de HP-beta ciclodextrina (5% y 15%) no tuvieron el mismo efecto.

Tabla 8 Formulación Animal Histología Comentarios Puntaje 150 mg/mL rhuMAb CD11 a 1 +/- 2 +/- Folitis folicular 3 +/- 100 mg/mL 2H7 + 15% HP- 1 1 + Beta 2 1 + Sin comentarios 3 +/- 100 mg/mL 2H7 + 30% HP- 1 1 + Inflamación Beta 2 1 + focalmente extensa 3 1 + 150 mg/mL 2H7 + 5% HP- 1 3+ Inflamación Beta 2 2-3+ focalmente extensa 3 2-3+ con necrosis 150 mg/mL 2H7 + 15% HP- . 1 2+ Inflamación Beta 2 2-3+ focalmente extensa 3 2+ con degeneración neutrófila 150 mg/mL 2H7 + 30% HP- 1 1 + Inflamación Beta 2 1 + focalmente extensa 3 1 + 30% Vehículo HP-Beta 1 +/- Inflamación 2 1-2+ focalmente extensa 3 1 + (animales 2 y 3) 150 mg/mL de formulación 1 2-3+ Inflamación original de 2H7 2 2-3+ focalmente extensa 3 2-3+ con necrosis Puntajes de calificación de inflamación: DLN = dentro de límites normales +/- = mínima/ligera 1 + = leve 2+ = moderada 3+ = severa Los resultados histopatológicos para las formulaciones de HP-Gamma ciclodextrina son sintetizados en la Tabla 9. Se observó una reducción en la inflamación de moderada a severa (2-3+) a leve a moderada (< 2+) cuando se agregó 10% de HP-Gamma ciclodextrina a 2H7. No se observó respuesta significativa alguna de inflamación con el vehículo HP-Gamma.

Tabla 9 Formulación Animal Puntaje de Comentarios Histología 150 mg/mL rhu Ab CD11a 1 +/- 2 +/- Folitis folicular 3 +/- 100 mg/mL 2H7 + 10% HP- 1 1-2+ Sin comentarios Gamma 2 +/- 3 2+ 100 mg/mL 2H7 + 10% HP- 4 1-2+ Inflamación Gamma 5 1 + focalmente extensa 6 1 + 125 mg/mL 2H7 + 10% HP- 1 2+ Sin comentarios Gamma 2 1-2+ 3 2+ 150 mg/mL 2H7 + 10% HP- 1 2+ Inflamación Gamma 2 1-2+ focalmente extensa 3 2+ 10% de Vehículo HP-Gamma 1 1 + Inflamación 2 +/- focalmente extensa; 3 +/- inflamación perivascular 10% de Vehículo HP-Gamma 4 DLN Sin comentarios 5 +/- 6 DLN 150 mg/mL de formulación de 1 2-3+ Inflamación 2H7 original 2 2-3+ focalmente extensa 3 2-3+ con necrosis Puntajes de calificación de inflamación: DLN = Dentro de límites normales +/- = mínima/ligera 1 + = leve 2+ = moderada 3+ = severa Conclusiones: Brevemente, la adición de sulfo-butil éter (SBE), hidroxi propil beta (HP-Beta) e hidroxi propil gamma (HP-Gamma) ciclodextrinas era eficaz para reducir significativamente la agregación de 2H7 y reducir la floculación de 2H7 bajo condiciones fisiológicas. Los resultados con ciclodextrina y 2H7 fueron inesperados en base al uso histórico de ciclodextrina y, por ende, ilustran la novedad y la actividad inventiva del método. También se evaluaron en nuestro modelo in vitro los. surfactantes, tradicionalmente utilizados para reducir la agregación proteica pero ninguno resultó eficaz para retardar la agregación de 2H7. También se analizaron los polímeros (por ej., dextrano) y los aminoácidos (por ej., arginina) pero tampoco lograron reducir significativamente la agregación proteica.

La reducción de la agregación de 2H7 en este entorno finalmente dio como resultado una disminución de la inflamación en el sitio de inyección de animales inyectados con 2H7. La inflamación fue reducida desde severa (2H7 original) a leve hasta moderada para las formulaciones de 2H7 que incluían HP-Beta o HP-Gamma ciclodextrinas. La reducción de la capacidad de la proteína a agregarse bajo estas condiciones pudo potencialmente traducirse a una mayor biodisponibilidad. Por último, hemos desarrollado exitosamente y demostrado la utilidad del modelo de diálisis ¡n vitro para medir la capacidad de un excipiente para reducir la agregación proteica.

Referencias Las referencias citadas, en esta solicitud, incluyendo las patentes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, son incorporadas a la presente a modo de referencia.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular y similares, las cuales son conocidas por el experto en la técnica. Dichas técnicas son explicadas por completo en la bibliografía técnica. Véase por ej., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Bioloqy (F. Ausubel et al., eds., 1987 actualizado); Essential Molecular Bioloqy (T. Brown ed., IRL Press 1991 ); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukarvotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu er al. eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson er al., IRL Press at Oxford University Press 1991 ); Oliqonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnoloqy (M. Butler ed., 1991 ); Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells. 2da Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cvtometrv and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); la serie Methods in Enzvmoloav (Academic Press, Inc.); Wirth M. y Hauser H. (1993); Immunochemistrv in Practice. Tercera edición, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocvtochemistrv. (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunoloqy (J. Coligan et al. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2da ed) Academic Press, Nueva York; Ed Harlow y David Lañe, Antibodies A laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988; Antibodv Enqineerinq. Segunda edición (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); y la serie Annual Review of Immunology; la serie Advances in Immunology.

Claims (56)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma cómo la misma ha de ser llevada a la práctica se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un método para reducir al mínimo la inflamación en el sitio de inyección durante la administración subcutánea de una macromolécula, que comprende agregar a una formulación que contiene la macromolécula de 2% a 30% de ciclodextrina.

2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, y SBE-ciclodextrina.

3. El método de acuerdo con la Reivindicación 2 donde la formulación contiene de 5% a 30% de HP-Beta o HP-Gamma ciclodextrina.

4. El método de acuerdo con. la Reivindicación 3 donde la formulación contiene de 5% a 30% de HP-Beta ciclodextrina.

5. El método de acuerdo con la Reivindicación 3 donde la formulación contiene de 5% a 20% de HP-Gamma ciclodextrina.

6. El método de acuerdo con la Reivindicación 5 donde la formulación comprende además de 50 mM a 200 mM de succinato de arginina.

7. El método de acuerdo con la Reivindicación 2 donde la formulación contiene de 2% a 9% de SBE ciclodextrina.

8. El método de acuerdo con la Reivindicación 1 donde la macromolécula es una proteína.

9. El método de acuerdo con la Reivindicación 8 donde la proteína es un anticuerpo.

10. El método de acuerdo con la Reivindicación 9 donde el anticuerpo es un anticuerpo terapéutico.

11. El método de acuerdo con la Reivindicación 9 donde el anticuerpo es un anticuerpo de diagnóstico.

12. El método de acuerdo con la Reivindicación 9 donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20.

13. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la variante de anticuerpo A, B, C, D, F, G, H o I según lo mostrado en la Tabla 1.

14. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1-15.

15. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:1 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:2.

16. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:3 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:4.

17. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena liviana de SEC ID NO:3 y el dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:5.

18. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:6 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:7.

19. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:6 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO: 15.

20. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:10.

21. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:11.

22. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO: 12.

23. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO:13.

24. El método de acuerdo con la Reivindicación 12 donde el anticuerpo comprende la cadena liviana de longitud completa de SEC ID NO:9 y la cadena pesada de longitud completa de SEC ID NO: 14.

25. Una formulación farmacéutica para la administración subcutánea de un anticuerpo, que comprende un anticuerpo en un rango de concentración de 10 mg/ml a 200 mg/ml, y de 2% a 30% de ciclodextrina.

26. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 25 donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclo dextrina, y SBE-ciclodextrina.

27. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 26 donde la formulación contiene de 5% a 30% de HP-Beta o HP-Gamma ciclodextrina.

28. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 27 donde la formulación contiene de 5% a 30% de HP-Beta ciclodextrina.

29. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 27 donde la formulación contiene de 5% a 20% de HP-Gamma ciclodextrina.

30. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 29 donde la formulación comprende además 50 mM a 200 mM de succinato de arginina.

31. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 26 donde la formulación contiene del 2% al 9% de SBE-ciclodextrina.

32. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 25 donde el anticuerpo está presente en un rango de concentración de 30 mg/ml a 150 mg/ml.

33. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 25 donde el ° anticuerpo está presente en un rango de concentración de 100 mg/ml a 150 mg/ml.

34. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 27 que comprende un anticuerpo 2H7 humanizado a 100 mg/ml y 15% a 30% de HP-Beta ciclodextrina.

35. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 27 que comprende un anticuerpo 2H7 humanizado a 150 mg/ml y 30% de HP-Beta ciclodextrina.

36. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 27 que comprende un anticuerpo 2H7 humanizado a 150 mg/ml y 10% de HP-Gamma ciclodextrina.

37. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 36 donde la formulación comprende además de 50 mM a 200 mM de succinato de arginina.

38. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 37 donde el anticuerpo 2H7 humanizado comprende la variante de anticuerpo A, B, C, D, F, G, H o I según lo mostrado en la Tabla 1.

39. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 37 la cual comprende además 30 mM de acetato sódico; 5% de dihidrato de trehalosa; y 0,03% de Polisorbato 20, a pH 5,3.

40. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 39 donde el anticuerpo 2H7 humanizado comprende la variante de anticuerpo A, B, C, D, F, G, H o I según lo mostrado en la Tabla 1.

41. La formulación de acuerdo con la Reivindicación 27 donde la formulación comprende la variante de anticuerpo 2H7 humanizado A según lo mostrado en la Tabla 1 en un rango de concentración de 100 mg/ml a 150 mg/ml, de 15% a 30% de HP-Gamma ciclodextrina, y de 50 mM a 100 mM de succinato de arginina.

42. Un método para tratar un cáncer de células B CD20 positivo, que comprende administrar a un paciente que tiene el cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo 2R7 humanizado de la Tabla 1 en una formulación farmacéutica que comprende de 2% a 30% de ciclodextrina, donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, y SBE-ciclodextrina.

43. El método de acuerdo con la Reivindicación 42 donde el cáncer de células B CD20 positivo es un linfoma o leucemia de células B.

44. El método de acuerdo con la Reivindicación 43 donde el cáncer de células B CD20 positivo se selecciona del grupo formado por linfoma no Hodgkin (NHL), NHL indolente recidivante y NHL indolente refractario a rituximab, enfermedad de Hodgkin linfocito-predominante (LPHD), linfoma linfocítico pequeño (SLL), y leucemia linfocítica crónica (CLL).

45. El método de acuerdo con la Reivindicación 42 donde el anticuerpo 2H7 humanizado es la variante A, B, C, D o H de la Tabla 1.

46. Un método para tratar una enfermedad autoinmune, que comprende administrar a un paciente que tiene la enfermedad autoinmune una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo 2H7 humanizado de la Tabla 1 en una formulación farmacéutica que comprende de 2% a 30% de ciclodextrina, donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, y SBE-ciclodextrina.

47. El método de acuerdo con la Reivindicación 46 donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por artritis reumatoidea (AR) y artritis reumatoidea juvenil, incluyendo respondedores inadecuados a metotrexato (Mtx) y respondedores inadecuados al antagonista de TNFa, lupus eritematoso sistémico (LES) incluyendo lupus nefritis, esclerosis múltiple (EM), incluyendo esclerosis múltiple recidivante remitente (RRMS), enfermedad de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerativa, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmune, esclerosis múltiple, soriasis, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculitis asociada con ANCA, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, Neuromielitis Óptica (NMO) y glomerulonefritis.

48. El método de acuerdo con la Reivindicación 46 donde el anticuerpo 2H7 humanizado es la variante A, B, C, D o H de la Tabla 1.

49. Un método para mejorar o mantener la solubilización de, o reducir al mínimo la precipitación de, un anticuerpo en una formulación acuosa subcutánea luego de inyección en el sitio de inyección de un paciente, que comprende agregar de 2% a 30% de ciclodextrina, donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, y SBE-ciclodextrina, a la formulación acuosa subcutánea.

50. El método de acuerdo con la Reivindicación 49 donde el anticuerpo es una variante de anticuerpo anti-CD20 humanizado A, B, C, D, F, G, H o I según lo mostrado en la Tabla 1.

51. Un método para aumentar la biodisponibilidad de un anticuerpo a ser administrado por vía subcutánea, que comprende agregar de 2% a 30% de ciclodextrina, donde la ciclodextrina se selecciona del grupo formado por HP-Beta ciclodextrina, HP-Gamma ciclodextrina, y SBE-ciclodextrina, a una formulación acuosa subcutánea que comprende el anticuerpo.

52. El método de acuerdo con la Reivindicación 51 donde el anticuerpo es una variante de anticuerpo anti-CD20 humanizado A, B, C, D, F, G, H o I según lo mostrado en la Tabla 1.

53. Un método de diálisis in vitro para evaluar la capacidad de un excipiente de reducir la agregación de un anticuerpo o de otra macromolécula bajo condiciones fisiológicas, que comprende: (a) dializar formulaciones de la macromolécula con y sin el excipiente de ensayo contra solución de PBS modificada (167mM de Sodio, 140mM de Cloruro, 17mM de Fosfato, 4mM de Potasio) a 37°C con agitación constante; (b) retirar las muestras de ensayo de la solución de PBS modificada; y (c) medir la turbidez y la cantidad de proteína presente en las muestras de ensayo, donde el aumento de la concentración proteica y la reducción de la turbidez en las muestras en el ensayo que contienen el excipiente de ensayo en comparación con el control que carece de excipiente son indicativos de la capacidad del excipiente de ensayo de reducir la agregación de la macromolécula.

54. El método de acuerdo con la Reivindicación 53 donde la formulación es dializada en tubos de diálisis que tienen un corte de peso molecular de 1 millón de Daltons.

55. El método de acuerdo con la Reivindicación 53 donde la concentración -proteica y la turbidez en las muestras de ensayo son medidas utilizando espectrometría de UV.

56. El método de acuerdo con la Reivindicación 53 el cual comprende además la inspección visual de la solución de PBS modificada y de la solución dentro del tubo de diálisis para precipitación, donde la reducción de la precipitación en el tubo de diálisis que contiene el excipiente de ensayo en comparación con el control que carece de excipiente es indicativo de la capacidad del excipiente de ensayo para reducir la agregación de la macromolécula.