CN102281903A

CN102281903A - 降低大分子在生理条件下聚集的方法和配方

Info

Publication number: CN102281903A
Application number: CN2009801546640A
Authority: CN
Inventors: B·洛博; S·洛; Y·J·王; R·黄
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2009-11-16
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2029-11-16
Also published as: AR074357A1; EP2358395A4; RU2563823C2; CA2742988A1; IL212533A0; BRPI0916072A2; KR20110086705A; CL2011001132A1; US20140093493A1; TW201032826A; MX2011005051A; WO2010057107A1; ZA201103006B; RU2011124550A; JP2016020350A; JP2012509269A; US20110305639A1; AU2009313754A1; CN102281903B; EP2358395A1

Abstract

本发明公开了在生理条件下通过添加某些环糊精(CD)而降低大分子(例如蛋白质)聚集和抑制絮凝的方法。本发明进一步提供了使皮下施用大分子和用于所述施用的药物配方的过程中注射位点处的炎症最小化的方法。本发明进一步提供了治疗CD20阳性的癌症或自身免疫病的方法，包括施用本发明药物配方中的人源化抗CD20抗体。本发明还提供了用于评估在生理条件下，赋形剂降低抗体或其他大分子聚集的能力的体外透析方法。

Description

降低大分子在生理条件下聚集的方法和配方

发明领域

本发明涉及通过降低大分子在生理条件下的聚集，使皮下施用大分子的注射位点处炎症最小化的方法。

发明背景

在过去20年间，重组DNA技术已导致药物数量的显著增加，所述药物是生物分子，特别是蛋白质。生物分子药物的增加导致了对药物配方的新挑战。可以通过静脉内灌注将高剂量的蛋白质治疗剂(如抗体)递送给患者，但该药物施用途径是不方便的，在可以的条件下，一般优选的配制蛋白质治疗剂进行皮下注射。然而，皮下注射的药物溶液处于比静脉灌注小得多的体积，使得蛋白质必然以更高的浓度存在。在每毫升数十毫克的高治疗性蛋白质浓度下，保持治疗性蛋白质在延长的时间段内稳定溶解是重要的。蛋白质的高浓度溶液增加了有利于聚集的蛋白质-蛋白质相互作用的可能性；防止聚集已成为蛋白质药物配方的主要命题。聚集导致大量的问题，包括降低的活性蛋白生物利用率、改变的药物动力学和不需要的免疫原性(Frokjaer，S.和Otzen，D.E.，Nat.Rev.Drug.Discov.4：298-306(2005)；Jiskoot，W.和Crommelin，D.J.A.，EJHP Practice 12：20-21(2006))。

防止聚集仍然大量是经验主义的，因为一般尚不清楚聚集过程的分子细节。典型的策略是向蛋白质溶液中添加稳定剂。常用的稳定剂包括糖、盐、游离的氨基酸如L-精氨酸和L-谷氨酰胺(Golovanov，A.P.等，J.Am.Chem.Soc.126：8933-8939(2004))、多元醇(Singh，S.和Singh，J.，AAPS Pharm.Sci.Tech 4：1-9(2003)；Mishra，R.等，J.Biol.Chem.280：15553-15560(2005))、聚乙二醇(PEG)和可降低蛋白质-蛋白质相互作用的其他聚合物，例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆(Frokjaer和Otzen，见上文；Lee，R.C.等，Ann.Biomed.Eng.34：1190-1200(2006)；Nema，S.等，PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51：166-171(1997))。

环糊精(CD)是环状的寡糖，具有以α-(l，4)糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单位。CD是通过淀粉酶、环糊精转葡糖基酶的作用从玉米或其他淀粉中生产的。最常见的天然存在的环糊精是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，分别由6、7和8个吡喃葡萄糖单位组成。作为天然的环糊精，β-环糊精尤其具有低的水溶性，已合成出大量具有改善的溶解度和其他物理化学特性的衍生物。可商购的CD衍生物包括甲基化CD、2-羟丙基化CD、乙酰化CD、分支的CD和磺丁基CD。环糊精的同义词包括Cavitron、环状寡糖、cycloamulose和环葡聚糖(综述参见Loftsson，T.，和Brewster，M.E.，J.Pharm.Sci.85：101-(1996)；Uekama，K.等，Chem.Rev.98：2045-2076(1998)；Irie，T.和Uekama，K.，Advanced Drug Delivery Reviews 36：101-123(1999)；和Szjetli，J.，PureAppl.Chem.76：1825-1845(2004))。环糊精的分子量小于25000道尔顿，因而可以通过肾小球滤过从体循环中移除，预期不会积累在体内。已普遍记载了天然环糊精缺少毒性以及大量的制药相关性衍生物，例如羟丙基-β-CD和磺丁基-β-CD(Uekama等，见上文；Szjetli，见上文)。

环糊精的形状为截短的锥形，其中内部是疏水的而外部是亲水的。疏水空腔提供了可以包括合适大小的非极性化合物并形成复合物的环境。CD及其衍生物已用作低水溶性药物的助溶剂。例如，含羟丙基β-CD的伊曲康唑(Sporanox^TM)是溶解的，而含磺丁基醚β-CD的甲磺酸齐拉西酮(Geodon^TM)是溶解的。CD的其他用途包括药物稳定性、口味遮蔽和吸附必需油类。目前可获得的含环糊精的药物产品包括Sporanox^TM(Janssen，Belgium)、Prostavasin^TM(Ono，Japan；Schwarz，Germany)、Prostandin 500^TM(Ono，Japan)、Geodon^TM(Pfizer，USA)、VFEND^TM(Pfizer，USA)、MitoExtra Mitozytrex^TM(Novartis，Switzerland)和Voltaren^TM(Novartis，Switzerland)。还参见Szjetli(见上文)的表1。这些配方都限于小分子化合物。

大的药物分子如肽和蛋白质也可以形成含环糊精的复合物。与CD复合的肽类药物的改善的生物利用率被认为是部分由于CD对细胞外流泵的抑制效应造成的(Challa，R.等，AAPS Pharm.Sci.Tech.6：E329-357(2005))。蛋白质和肽稳定化的机制在性质上也与小分子药物的情况不同。当CD可以与小分子药物形成包涵复合物时，CD表现出结合蛋白质或肽的暴露于溶剂的特定氨基酸残基(Aachmann，F.L.等，ProteinEngineering 16：905-912(2003))。最大益处通常在低的环糊精浓度下获得，且所述益处通常只是部分的浓度依赖性的。例如，0.5％HP-β-环糊精最佳的抑制IL-2的聚集(Loftsson和Brewster，见上文)。以约2-6％存在的CD改善了人生长激素的溶解度，其中α和γ型CD比β型CD的效率低若干倍(Otzen，D.E.等，Protein Sci.11：1779-1787(2002))。

CD20抗原(也称为人B-淋巴细胞限制性分化抗原，Bp35)是具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白，分布在前B淋巴细胞和成熟的B淋巴细胞上(Valentine等，J.Biol.Chem..264(19)：11282-11287(1989)；和Einfeld等，EMBO J.7(3)：711-717(1988))。抗原还在多于90％的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等，Blood 63(6)：1424-1433(1984))，但未见于造血干细胞、原B细胞、正常的血清细胞或其他正常的组织(Tedder等，J.Immunol.135(2)：973-979(1985))。CD20被认为调控细胞周期起始和分化的激活过程中的早期步骤(Tedder等，见上文)，并可能作为钙离子通道发挥功能(Tedder等，J.Cell.Biochem.14D：195(1990))。

考虑到CD20在B细胞淋巴瘤中的表达，该抗原已作为治疗此类淋巴瘤的有效治疗靶。例如，用于治疗患复发型或难愈型低度或滤泡状的、CD20阳性的、B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者的利妥昔单抗

抗体，所述抗体是遗传改造的嵌合小鼠/人单克隆抗体，针对人CD20抗原(可从Genentech，Inc.，South SanFrancisco，California，U.S.和F.Hoffmann-La Roche AG，Basel，Switzerland商购)。利妥昔单抗是在1998年4月7日出版的美国专利号5,736,137(Anderson等)和美国专利号5,776,456中被称作“C2B8”的抗体。其他提示用于NHL治疗的抗CD20抗体包括小鼠抗体Zevalin^TM，该抗体与放射性同位素钇-90连接(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)，以及Bexxar^TM，这是与1-131缀合的另一种完全的小鼠抗体(Corixa，WA)。

CD20也是用于治疗自身免疫病的有效靶抗原。也在多种非恶性自身免疫功能障碍中研究了利妥昔单抗，其中B细胞和自身抗体在疾病的病理学中看来发挥了作用，包括Edwards等，Biochem Soc.Trans.30：824-828(2002)。已报道利妥昔单抗潜在的减轻了例如类风湿关节炎(RA)(Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61：883-888(2002)；Edwards等，Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)：S46(2002)；Stahl等，Ann.Rheum.Dis.，62(Suppl.1)：OP004(2003)；Emery等，Arthritis Rheum.48(9)：S439(2003))、狼疮(Eisenberg，Arthritis.Res.Ther.5：157-159(2003)；Leandro等，Arthritis Rheum.46：2673-2677(2002)；Gorman等，Lupus，13：312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D′Arena等，Leuk.Lymphoma 44：561-562(2003)；Stasi等，Blood，98：952-957(2001)；Saleh等，Semin.Oncol，27(Supp 12)：99-103(2000)；Zaia等，Haematolgica，87：189-195(2002)；Ratanatharathorn等，Ann.Int.Med.，133：275-279(2000))、单纯红细胞再生障碍(Auner等，Br.J.Haematol，116：725-728(2002))、自身免疫性贫血(Zaja等，Haematologica 87：189-195(2002)(错字勘误表出现在Haematologica 87：336(2002)中))、冷凝聚素病(Layios等，Leukemia，15：187-8(2001)；Berentsen等，Blood，103：2925-2928(2004)；Berentsen等，Br.J.Haematol，115：79-83(2001)；Bauduer，Br.J.Haematol，112：1083-1090(2001)；Damiani等，Br.J.Haematol，114：229-234(2001))、严重的抗胰岛素性B型综合征(Coll等，N.Engl.J.Med.，350：310-311(2004))、混合型冷球蛋白血症(DeVita等，Arthritis Rheum.46Suppl.9：S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja等，Neurology，55：1062-63(2000)；Wylam等，J.Pediatr.，143：674-677(2003))、Wegener氏肉芽肿(Specks等，Arthritis & Rheumatism 44：2836-2840(2001))、难愈型寻常天疱疮(Dupuy等，Arch Dermatol，140：91-96(2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)：S1299(2002))、干燥综合征(Somer等，Arthritis & Rheumatism，49：394-398(2003))、活性II型混合型冷球蛋白血症(Zaja等，Blood，101：3827-3834(2003))、寻常天疱疮(Dupay等，Arch.Dermatol，140：91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 74：485-489(2003))、副癌性斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli等，Neurology 60(Suppl.1)PO5.128：A395(2003))和复发性缓解型多发性硬化(RRMS)(Cross等(摘要)，″Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS″EighthAnnual Meeting of the Americas Committees for Research andTreatment in Multiple Sclerosis，20-21(2003))的体征和症状。

本发明提供了用于在生理条件下阻止大分子(例如抗体)聚集的方法和配方。本发明的方法提供了在制备治疗性蛋白质配方中的优势，例如本说明书所述的抗CD20抗体。这些优势包括制备皮下注射用配方的能力，所述配方可提供增加的治疗性抗体的生物利用率，并减少注射位点的炎症，以及根据下文详述而显而易见的其他优势。

发明概述

环糊精已被生物化学家用作低水溶性药物的助溶剂。我们出人意料地发现不同类型的环糊精(例如，磺丁基醚、羟丙基γ、羟丙基β)能抑制蛋白质特别是抗体的聚集和絮凝，因为抗体是高水溶性。因此，环糊精抑制高浓度抗体的聚集和絮凝的这一发现代表了环糊精的新用途。我们还发展了新的体外筛选方法，所述方法包括使用具有限定分子量(MW)截留的透析管，以及专门的释放溶液，两者都模拟注射位点的生理条件。

本发明提供了在生理条件下降低大分子(例如蛋白质)聚集和抑制絮凝的方法，通过添加2％至30％环糊精(CD)，其中所述环糊精选自羟丙基β(HP-β)、羟丙基γ(HP-γ)和磺丁基醚(SBE)环糊精。在大鼠中，通过添加CD而显著降低的聚集和絮凝也与皮下注射位点处的炎症的显著降低相关。本发明进一步提供了使皮下施用大分子(例如蛋白质)的过程中注射位点处的炎症最小化的方法，通过向皮下配方中添加2％至30％HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE环糊精。在本发明的各个实施方案中，大分子是抗体。在本发明的进一步的实施方案中，抗体是治疗性抗体或诊断抗体。

在本发明的各个实施方案中，大分子是抗CD20抗体。在本发明的某些实施方案中，抗CD20抗体是人源化抗体。在本发明的某些实施方案中，抗CD20抗体包含表1中的变体A、B、C、D、F、G、H或I之一。本发明进一步提供了方法和配方，其中所述抗CD20抗体包含选自SEQ ID NO：1-15的氨基酸序列。在本发明的进一步的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变结构域和SEQ ID NO：2的重链可变结构域，或SEQ ID NO：3的轻链可变结构域和SEQ ID NO：4的重链可变结构域，或SEQ ID NO：3的轻链可变结构域和SEQ ID NO：5的重链可变结构域。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO：6的全长轻链和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15的全长重链。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的全长重链。

在另一方面，本发明提供了用于皮下施用大分子(例如蛋白质)的药物配方，包含2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE环糊精。在一些实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物配方，包含浓度为10mg/ml至200mg/ml的抗体，和2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE环糊精。在某些实施方案中，抗体的浓度范围是30-150mg/ml。在进一步的实施方案中，抗体的浓度范围是100-150mg/ml。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为5％至30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为5％至20％的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为2％至9％的SBE环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为约100mg/ml的抗体，和浓度为15％至30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为约150mg/ml的抗体，和浓度为约30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为约150mg/ml的抗体，和浓度为约10％的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在具体的实施方案中，药物配方包含浓度为100mg/ml至150mg/ml的人源化2H7抗体，浓度为15％至30％的HP-γ环糊精，以及浓度为50mM至100mM的精氨酸琥珀酸。在进一步的实施方案中，药物组合物进一步包含30mM醋酸钠；5％二水合海藻糖；和0.03％聚山梨醇酯20，pH 5.3。

本发明进一步提供了包含人源化抗CD20抗体的任意上述配方，所述抗体由表1列举的任意抗体组成。本发明进一步提供了这样的配方，其中所述抗CD20抗体包含选自SEQ ID NO：1-15的氨基酸序列。在本方面的进一步的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变结构域和SEQ ID NO：2的重链可变结构域，或SEQ ID NO：3的轻链可变结构域和SEQ ID NO：4的重链可变结构域。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO：6的全长轻链和SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：15的全长重链。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的全长重链。

本发明进一步提供了治疗表达CD20的B细胞癌症的方法，包括以药物配方施用表1的任一种人源化抗CD20抗体，所述配方包含2％至30％HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE环糊精。CD20阳性的B细胞癌优选是B细胞淋巴瘤或白血病。在具体的实施方案中，包含与人CD20(hCD20)结合的人源化2H7抗体及其功能性片段的配方被用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、缓慢生长的NHL，包括复发性缓慢生长的NHL和利妥昔单抗-难愈性缓慢生长的NHL、淋巴细胞为主的霍奇金氏病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在具体的实施方案中，包含人源化CD20结合抗体(尤其是表1的变体A、B、C、D或H)或其功能性片段的配方，被用于治疗上文列举的CD20阳性的B细胞癌。

本发明还提供了治疗自身免疫病的方法，包括向患自身免疫病的患者施用药物配方中的治疗有效量的表1之人源化2H7抗体，所述配方包含2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE环糊精。在具体的实施方案中，自身免疫病选自类风湿关节炎(RA)和幼年类风湿关节炎，并且RA患者是氨甲喋呤(Mtx)-不充分应答者和TNFα拮抗剂不充分应答者、利妥昔单抗-难愈型或复发型患者。在一个实施方案中，RA患者对另一种抗CD20治疗性抗体是难愈型或复发型的。在其他实施方案中，自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、多发性硬化(MS)包括复发缓解型多发性硬化(RRMS)、韦格纳氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、ANCA相关性脉管炎、糖尿病、Reynaud氏综合征、干燥综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。在具体的实施方案中，包含人源化CD20结合抗体(尤其是表1的变体A、B、C、D或H)或其功能性片段的配方，被用于治疗上文列举的自身免疫病。

在上述疾病的治疗方法的某些实施方案中，患病的受试者或患者是灵长类，优选人。

本发明进一步提供了在注射后改善或维持在患者的注射位点的含水皮下配方中的抗体之溶解度的方法，或最小化所述抗体在所述配方中沉淀的方法，包括向含水的皮下配方中添加2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5％至30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5％至20％的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为2％至9％的SBE环糊精。

本发明进一步提供了增加待皮下施用的抗体的生物利用率的方法，包括向包含抗体的含水的皮下配方中添加2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5％至30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5％至20％的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为2％至9％的SBE环糊精。

本发明进一步提供了用于评估在生理条件下，赋形剂降低抗体或其他大分子聚集的能力的体外透析方法，包括：在37℃和持续搅拌的条件下，针对模拟生理条件的测试基质透析含或不含测试赋形剂的大分子配方；取样修饰的基质溶液；和通过例如UV光度计扫描的方法，测量样品的外观如混浊度和在释放溶液中存在的蛋白质的量，其中，相比缺少赋形剂的对照，在含有测试赋形剂的测定中，释放溶液中增加的蛋白质浓度和减少的混浊度是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。在具体的实施方案中，基质涉及修饰的PBS溶液，例如含有167mM钠、140mM氯化物、17mM磷酸盐、4mM钾。在方法的具体实施方案中，透析管具有1百万道尔顿的截留分子量。在方法的进一步的具体实施方案中，使用UV分光光度计测量测试样品中的蛋白质浓度和混浊度。在方法的进一步的具体实施方案中，方法包括目测修饰的释放溶液和在透析管中的溶液的沉淀，其中，相比缺少赋形剂的对照，在含有测试赋形剂的透析管中减少的沉淀是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。

附图简介

图1显示了2H7在生理条件下的聚集。在37℃下，在PBS中将150mg/ml的2H7透析2天。

图2显示了用于评估赋形剂对2H7在生理条件下的聚集的作用的体外透析模型。在37℃下，用220ml修饰的PBS溶液(167mM钠、140mM氯化物、17mM磷酸盐、4mM钾)装入250ml玻璃罐中。在一端夹闭长度为6cm的12mm透析管，装入约1ml的测试样品，去除过多的空气，并将管的另一端夹住至密封。将罐子置于37℃下，持续搅拌。

图3显示了对照在体外透析模型中的行为。在如图2显示的模型中测试2H7和rhuMab CDl1a。在2.5、6、12、24、33和48小时的时间点测量释放到PBS溶液中的蛋白质累积百分比。

图4显示了2-9％SBE-环糊精对2H7在体外模型中的释放的作用。

图5显示了5-20％HP-γ环糊精对2H7在体外模型中的释放的作用。

图6显示了5-20％HP-β环糊精对2H7在体外模型中的释放的作用。

图7显示了HP-γ环糊精和精氨酸琥珀酸对2H7在体外模型中的释放的作用。

实施方案的详述

动词“聚集”的各种形式指单个蛋白质分子或复合物联合形成聚集物的过程。“聚集物”是包含蛋白质分子或复合物的多聚装配体。聚合可以进行至形成可见沉淀的程度。此类可见沉淀的形成在本文中也称为“絮凝”。

可以确定大分子沉淀的相对量，例如，通过与可视对照比较。测定沉淀的其他方法是本领域已知的，并描述在下文中，例如在实施例2中详细描述的体外透析方法，或实施例3中描述的体内模型。

术语“生物利用率”指在施用后，在生理学活性位点处的药物或其他物质吸收或成为可利用的程度或速率。可以通过本领域已知的体内药物动力学方法测定大分子的生物利用率。

术语“大分子”指具有至少10000道尔顿的分子量的分子，并可包括蛋白质，例如抗体。

术语“赋形剂”或“制药赋形剂”指可以降低大分子聚集的化合物。赋形剂可以包括糖、盐、游离的氨基酸如L-精氨酸和L-谷氨酰胺、多元醇、聚乙二醇(PEG)和其他聚合物，如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙烯吡咯烷酮。

术语“环糊精”(或“CD”)指具有用α-(l，4)糖苷键连接的d-吡喃葡萄糖单位的环状寡糖。最常见的天然存在的环糊精是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，分别由6、7和8个吡喃葡萄糖单位组成。环糊精的同义词包括Cavitron、环状寡糖、cycloamulose和环葡聚糖。术语“环糊精”在本文中可以进一步包括环糊精衍生物，包括但不限于甲基化CD、2-羟丙基化CD、乙酰化CD、分支的CD和磺丁基CD。

术语“治疗性抗体”指用于治疗疾病的抗体。治疗性抗体可具有各种作用机制。治疗性抗体可结合和中和靶的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需的蛋白质的活性的单克隆抗体导致所述细胞死亡。另一种治疗性单克隆抗体可结合并激活靶的正常功能。例如，单克隆抗体可以结合细胞上的蛋白质，并触发细胞凋亡的信号。最后，如果单克隆抗体结合仅在疾病组织上表达的靶，则所述单克隆抗体与毒性负载(效应剂)如化疗剂或放射活性剂的缀合可以产生用于特异性递送毒性负载至疾病组织的试剂，降低对健康组织的损害。

术语“诊断抗体”指用作疾病的诊断试剂的抗体。诊断抗体可结合靶，该靶与具体疾病特异性相关，或在具体疾病中表现出增加的表达。诊断抗体可用于例如检测患者的生物学样品中的靶，或用于患者中的疾病位点如肿瘤的诊断性成像。

“CD20”抗原是具有约35kD分子量的非糖基化的跨膜磷蛋白，可见于外周血或淋巴器官中多于90％的B细胞的表面。CD20在早期前B细胞发育的过程中表达，并保留到血浆细胞分化；在人干细胞、淋巴祖细胞或正常的血浆细胞中未发现CD20。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。CD20在文献中的其他名称包括“B-淋巴细胞-限制性分化抗原”和“Bp35”。CD20抗原描述在例如Clark和Ledbetter，Adv.Can.Res.52：81-149(1989)以及Valentine等，J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287(1989)中。

术语“抗体”以广义使用，并特异性的覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和表现出理想的生物学活性或功能的抗体片段。

本发明的人源化CD20结合抗体的生物学活性可至少包括结合人CD20的抗体，更优选的结合人和其他灵长动物(包括食蟹猴(cynomolgus monkey)、恒河猴(rhesus monkey)、黑猩猩)CD20的抗体。抗体可以以不高于1x10^-8的Kd值，优选不高于约1x10^-9的Kd值结合CD20，当相比未用此类抗体处理的恰当的阴性对照时，优选能够在体内杀死或消减B细胞至少20％。B细胞消减可以是ADCC、CDC、凋亡或其他机制的一种或多种的结果。在本文的疾病治疗的一些实施方案中，相对于其他，具体的效应子功能或机制是理想的，而优选人源化2H7的某些变体来实现这类生物学功能，例如ADCC。

“抗体片段”包括全长抗体的一部分，一般是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体、线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fv”是最小抗体片段，含有完整的抗原识别和结合位点。该片段由一条重链和一条轻链可变区结构域的二聚体以紧密的、非共价连接组成。从上述两个结构域的折叠发出六个超变环(H和L链各3个环)，贡献负责抗原结合的氨基酸残基，并产生抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包含对抗原特异性的3个CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然是以比完整结合位点低的亲和力。

术语“单克隆抗体”在本文中指来自基本同质的抗体群体的抗体，即，包含所述群体的独特抗体是相同的和/或结合相同的表位，除非在生产所述单克隆抗体的过程中出现的可能的变体，此类变体一般以极小的量存在。此类单克隆抗体典型的包括含有结合靶的多肽序列的抗体，其中所述靶结合多肽序列是通过这样的过程获得的，所述过程包括从多个的多肽序列中选择单个的靶结合多肽序列。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的池中选择唯一的克隆。应该理解，可以进一步改善所选定的靶结合多肽序列，例如，改善与靶的亲和力、将靶结合序列人源化、改善它在细胞培养中的生产、降低它在体内的免疫原性、产生多特异性抗体，等，并且包含所述改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体制品的优势还在于它们通常未被其他的免疫球蛋白污染。定语“单克隆”表示从基本同质的抗体群体中获得的抗体的特征，但不视为必须通过任何特定的方法生产所述抗体。例如，可以通过多种技术制造根据本发明使用的单克隆抗体，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler等，Nature，256：495(1975)；Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，in：Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA方法(见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(见例如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.MoI.Biol.，222：581-597(1991)；Sidhu等，J.MoI.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))，以及用于在动物中生产人或人样抗体的技术，所述动物具有部分或全部的编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因(见例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year inImmuno.，7：33(1993)；美国专利号5,545,806；5,569,825；5,591,669(均属于GenPharm)；5,545,807；WO 1997/17852；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016；Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14：845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology，14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol，13：65-93(1995))。

本发明的CD20结合抗体的“功能性片段”是这样的片段，所述片段保留了以与其来源的完整全长分子基本相同的亲和力与CD20结合，并表现出包括消减B细胞在内的生物学活性，如通过例如本文所述体外或体内测定所测量的。

术语“可变”指这样的事实，即可变结构域的某些片段的序列在抗体之间广泛的不同。V结构域介导抗原结合，定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，在可变结构域的110-氨基酸范围内，可变性不是均等分布的。反而V区由相对不变的、称为框架区的15-30个氨基酸的骨架组成，其中由分别长9-12个氨基酸的、称为“超变区”的高度变化的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变结构域分别包含4个FR，大部分采用β-片层构象，由3个超变区连接，形成环状连接，并且在一些情况下形成部分的β-片层结构。每条链的超变区通过FR密切的保持在一起，并且与另一条链的超变区一起负责抗体的抗原结合位点的形成(见，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体参与作用。

术语“超变区”当用于本文中时指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，V_L中围绕大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)的，以及V_H中围绕大约残基31-35B(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3)的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“超变环”的残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)的，以及VH中的残基26-32(Hl)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。

如本文中所指的，“共同序列”或共同的V结构域序列是这样的人工序列，所述人工序列源自已知的人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列的比较。基于这类比较，制备了编码V结构域氨基酸的重组核酸序列，所述V结构域氨基酸是源自人κ和人H链亚族III V结构域的共同的序列。共同的V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和力。

“嵌合的”抗体(免疫球蛋白)具有一部分的重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时链的剩余部分与源自另一种物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要所述片段表现出理想的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中使用的人源化抗体是嵌合抗体的子集。

非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形态是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。就绝大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受方或受体抗体)，其中受方的超变区残基被具有理想的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的超变区残基(供体抗体)替换。在一些情况下，通过相应的非人残基替换人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包括未见于受方抗体或供体抗体中的残基。产生这类修饰以进一步改进抗体性能，例如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环，而所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，虽然FR区可能包括一个或多个改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这类氨基酸取代的数量典型的在H链中不超过6个，而在L链中不超过3个。人源化抗体任选的还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的Fc。关于进一步的细节，参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体的条件下靶细胞的溶解。经典补体通路的激活是由补体系统的第一成分(C1q)与(恰当亚类的)抗体的结合启动的，所述抗体结合其关联抗原。为了评估补体激活，可实施CDC测定，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。

在本说明书和权利要求全文中，除非另外指出，免疫球蛋白重链恒定区残基的编号是Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的EU索引，该文献通过引用明确整合到本文中。“Kabat中的EU索引”指人IgGl EU抗体的残基编号。V区的残基是根据Kabat编号来编号的，除非具体的指出了次序或其他编号系统。

CD20抗体包括：“C2B8”，现称为“利妥昔单抗”(美国专利号5,736,137)；钇-[90]-标记的2B8小鼠抗体，名为“Y2B8”或“替伊莫单抗”

可商购自IDEC Pharmaceuticals，Inc.(美国专利号5,736,137；2B8用登录号HBl1388于1993年6月22日保藏在ATCC)；小鼠IgG2a“Bl”，也称为“托西莫单抗”，任选用¹³¹I标记，产生“131I-B1”或“碘I131托西莫单抗”抗体(BEXXAR^TM，GlaxoSmithKline，还参见美国专利号5,595,721)；小鼠单克隆抗体“1F5”(Press等，Blood 69(2)：584-591(1987))及其变体，包括“框架区修补(framework patched)”或人源化1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏HB-96450)；小鼠2H7和嵌合的2H7抗体(美国专利号5,677,180)；人源化2H7(WO 2004/056312(Lowman等)以及如下文所提出的)；HuMAX-CD20^TM，完全的人抗体(Genmab，Denmark；见例如Glennie和van de Winkel，Drug Discovery Today 8：503-510(2003)以及Cragg等，Blood 101：1045-1052(2003))；在WO2004/035607中提出的人单克隆抗体(Teeling等)；具有复杂的N-糖苷键连接的糖链与US 2004/0093621(Shitara等)所述Fc区结合的抗体；CD20结合分子，如AME系列的抗体，例如WO 2004/103404(Watkins等，Applied Molecular Evolution)中提出的AME-133^TM抗体；A20抗体或其变体，如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20、IMMU-106a.k.a.hA20(US 2003/0219433、US 2005/0025764；Immunomedics))；和可购自International Leukocyte Typing Workshop的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-Cl或NU-B2(Valentine等，In：Leukocyte Typing III(McMichael编著，第440页，Oxford University Press(1987))。本文中优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的或人的CD20抗体，更优选的，人源化的2H7抗体、利妥昔单抗、嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)和HuMAX-CD20^TM人CD20抗体(Genmab)。

“分离的”抗体是已鉴别和分离和/或从其天然环境的组分中移出的抗体。其天然环境的污染组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可能包括酶、激素和其他的蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，抗体可以纯化(1)至按抗体重量计大于95％，如Lowry方法确定的，最优选按重量计大于99％，(2)至足以通过转杯式测序仪获得N端或中部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝或优选的银染，在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE中为同质的程度。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分是不存在的。然而，通常通过至少一步纯化步骤制备分离的抗体。

发明的组合物和方法

本发明提供了用于皮下施用大分子，例如蛋白质的药物组合物，包含2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE-环糊精。在一些实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物配方，包含浓度范围为10mg/ml至200mg/ml的抗体，和2％至30％的HP-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE-环糊精。在某些实施方案中，抗体的浓度范围是30-150mg/ml。在进一步的实施方案中，抗体的浓度范围是100-150mg/ml。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5％至30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5％至20％的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为2％至9％的SBE-环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为约100mg/ml的抗体和浓度为15％至30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为约150mg/ml的抗体和浓度为约30％的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为约150mg/ml的抗体和浓度为约10％的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在具体的实施方案中，所述药物配方包含浓度范围为100mg/ml至150mg/ml的人源化2H7抗体，浓度为15％至30％的HP-γ环糊精，和浓度为50mM至100mM的精氨酸琥珀酸。在进一步的实施方案中，所述药物配方进一步包含30mM醋酸钠；5％二水合海藻糖；和0.03％聚山梨醇酯20，pH 5.3。

在各个实施方案中，本发明提供了包含人源化2H7抗体(在本文中也称为hu2H7)的药物组合物。在具体的实施方案中，人源化2H7抗体是表1列举的抗体。

表1——人源化抗CD20抗体及其变体

表1的抗体变体A、B和I的每种包含轻链可变序列(V_L)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)；

和重链可变序列(V_H)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)。

表1的抗体变体C、D、F和G的每种包含轻链可变序列(V_L)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：3)，

和重链可变序列(V_H)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)。

表1的抗体变体H包含SEQ ID NO：3的轻链可变序列(V_L)和重链可变序列(V_H)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.5)。

表1的抗体变体A、B和I的每种包含全长轻链序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：6)。

表1的变体A包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：7)。

表1的变体B包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：8)。

表1的变体I包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：15)。

表1的各种抗体变体C、D、F、G和H包含全长轻链序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：9)。

表1的变体C包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVFPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPRFPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：10)。

表1的变体D包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：11)。

表1的变体F包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRFEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：12)

表1的变体G包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVFWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：13)。

表1的变体H包含全长重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 14)。

在某些实施方案中，本发明的人源化2H7抗体进一步包含在IgG Fc中的氨基酸改变，并表现出与人FcRn增加的结合亲和力，比具有野生型IgG Fc的抗体增加至少60倍、至少70倍、至少80倍，更优选至少100倍、优选至少125倍，甚至更优选至少150倍至约170倍。

IgG中的N糖基化位点是在CH2结构域的Asn297。本发明的人源化2H7抗体组合物包括具有Fc区的任意前述人源化2H7抗体的组合物，其中组合物中约80-100％(优选约90-99％)的抗体包括缺少岩藻糖的成熟的核心碳水化合物结构，附着于糖蛋白的Fc区域。本文中证实此类组合物在结合FcγRIIIA(F158)中表现出令人惊讶的改善，该结合不如FcyRIIIA(V158)与人IgG相互作用有效。在正常、健康的非洲裔美国人与白种人中，FcyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常见。参见Lehrnbecher等，Blood 94：4220(1999)。历史上，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(一种最常用的工业宿主)中生产的抗体，群体中含有约2至6％是非岩藻糖基化的。然而，YB2/0和Led 3可以生产具有78至98％非岩藻糖基化的抗体。Shinkawa等，J Bio.Chem.278(5)，3466-347(2003)报道了在YB2/0和Lee 13细胞中生产的抗体，具有较低的FUT8活性，在体外表现出显著增加的ADCC活性。具有降低的岩藻糖含量的抗体的生产也描述在例如Li等(GlycoFi)“Optimizationof humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris”在NatureBiology，2006年1月22日在线出版；Niwa R.等，Cancer Res.64(6)：2127-2133(2004)；US 2003/0157108(Presta)；US 6,602,684和US 2003/0175884(Glycart Biotechnology)；US 2004/0093621、US2004/0110704、US 2004/0132140(均属于Kyowa Hakko Kogyo)中。

本文中的配方还含有一种以上对待治疗的特定适应症必需的活性化合物，优选彼此未负面影响的具有互补活性的那些。例如，进一步提供细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂是理想的(例如，作用于T细胞，如环孢菌素，或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-I的抗体)。此类其他试剂的有效量取决于配方中存在的抗体的量、疾病或功能障碍或治疗的类型，和上文讨论过的其他因素。它们一般以相同的剂量使用，并使用如本文所述的施用途径，或此前施用剂量的约从1％至99％。

体内施用所使用的配方必须是无菌的。这可以通过无菌滤器过滤方便的实现。

抗体生产

单克隆抗体

可以使用由Kohler等，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤技术，或者通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制造单克隆抗体。

在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。免疫后，可分离淋巴细胞并随后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。

将由此制备的杂交瘤细胞接种和生长在合适的培养基中，所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞(也称为融合伴侣)的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质抑制HGPRT-缺陷型细胞的生长。

优选的融合伴侣骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体，并对选择未融合亲代细胞的选择培养基敏感的那些融合伴侣骨髓瘤细胞系。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如源自由Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，CaliforniaUSA提供的MOPC-2l和MPC-1l小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653细胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol，133：3001(1984)；和Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。

测定生长了杂交瘤细胞的培养基中针对所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)，确定杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。

可通过，例如Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)所述的Scatchard分析来确定单克隆抗体的结合亲合力。

一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，则通过有限稀释对这些细胞克隆进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))使其生长。适合此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，通过例如将细胞腹膜内注射入小鼠中，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。

通过常规的抗体纯化程序，例如亲和层析(如，使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，从培养基、腹水或血清中适当的分离从上述亚克隆分泌的单克隆抗体。

使用传统方法(例如，通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)可容易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，可以将它置入表达载体中，随后将所述载体转染至宿主细胞中如E.coli细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成抗体蛋白的骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion inImmunol，5：256-262(1993)和

Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。

在进一步的实施方案中，可以从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.MoI Biol，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))生产高亲和力(nM范围)人抗体，以及将组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行(viable)选择。

也可采用以下方法对编码抗体的DNA进行修饰以产生嵌合或融合抗体多肽：例如，通过以人重链和轻链恒定区(C_H和C_L)的序列代替同源小鼠序列(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗体的恒定区，或可取代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含针对一个抗原的一个抗原结合位点，和具有对不同抗原的特异性的另一抗原结合位点。

人源化抗体

本领域中已描述了使非人抗体人源化的方法。优选地，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))的方法实施，通过用超变区序列来替换人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中完整人类可变结构域的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些超变区残基以及可能一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。

当抗体预计用于人类治疗用途时，选择在制造人源化抗体中使用的轻链和重链的人可变结构域，对于降低抗原性和HAMA反应(人抗鼠抗体)是非常重要的。根据所谓的“最适”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。鉴定与啮齿类V区序列最接近的人V区序列，并且其中的人框架区(FR)被接受用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol，151：2296(1993)；Chothia等，J.MoIBiol，196：901(1987))。另一种方法使用从具有轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同样的框架区可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol，151：2623(1993))。

重要的是，将抗体人源化后保留对抗原的高结合亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。免疫球蛋白的三维模型是可商购的，且是本领域技术人员所熟悉的。而用于描述和展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序也是可获得的。检查这些展示结果允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。一般而言，超变区残基直接并且最主要的涉及对抗原结合的影响。

人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性制剂偶联以产生免疫偶联物。可选地，人源化抗体可以是全长的抗体，例如全长IgGl抗体。

人抗体和噬菌体展示技术

作为人源化的备选，可制备人抗体。例如，现在可以生产转基因动物(如，小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已描述了在嵌合的和种系突变的小鼠中，抗体重链连接区(J_H)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此种系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。见例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(均属于GenPharm)；5,545,807和WO 97/17852。

可选的，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553[1990])从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库，在体外产生人类抗体和抗体片段。依据该技术，抗体V区基因框内(in-frame)克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要衣壳蛋白基因中，并在噬茵体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能特性进行的选择也导致对编码显示这些特性的抗体的基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些综述见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology3：564-571(1993)。可使用V基因节段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因小随机组合文库中分离出一批多样的抗恶唑酮抗体。可构建来自未免疫的人供体的V基因库，并可基本按照如Marks等，J.MoI.Biol.222：581-597(1991)、或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术，分离针对抗原的多样阵列的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。

如上讨论，也可通过体外活化的B细胞产生人抗体(见美国专利号5,567,610和5,229,275)。

抗体片段

在某些情况下，使用抗体片段比整个抗体更有优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并可导致更好地接近实体肿瘤。

已开发了多种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段通过蛋白水解完整的抗体来衍生(见例如，Morimoto等，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24：107-117(1992)；和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接生产。Fab、Fv和ScFv抗体片段均可在E.coli中表达并从中分泌，从而促进这些片段的大量生产。也可自上述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，Fab’-SH片段可自E.coli中直接回收，并化学偶联的形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)₂片段。美国专利号5,869,046中描述了包括补救受体结合表位残基，并具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点的种类中唯一缺乏恒定区的；因此，其适于在体内应用期间降低非特异结合。可以构建sFv融合蛋白，从而在sFv的氨基或羧基末端融合效应蛋白。见上文的Antibody Engineering，Borrebaeck编著。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利号5,641,870中描述的。此类线性抗体片段可以是单特异或双特异的。

其他的氨基酸序列修饰

预计对本文所述的CD20结合抗体进行氨基酸序列修饰。例如，理想的是改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可通过在抗CD20抗体核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备抗CD20抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，抗CD20抗体的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体具有所需特性。氨基酸的变化还可改变抗CD20抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。

鉴别抗CD20抗体中处于诱变优选位置的某些残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中描述的“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与CD20抗原的相互作用。然后，通过在取代点引入进一步的或其它的变异，而改进那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置。因而，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对预期活性筛选所表达的抗CD20抗体变体。

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多个残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N末端甲硫氨酰残基的抗CD20抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗CD20抗体分子的其它插入变体包括使所述抗CD20抗体的N或C末端与酶(例如ADEPT)或增加所述抗体的血清半衰期的多肽融合形成的融合体。

另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗CD20抗体分子中具有至少一个氨基酸残基被不同残基取代。最有兴趣进行取代诱变的位点包括超变区，也可以考虑改变FR。保守取代显示在下表的“优先取代”的小标题下。如果此类取代引起生物学活性的改变，则可引入下表中名为“示例性取代”一栏中的，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。

表2——氨基酸取代

原始残基	示例性取代	优先取代
			Ala(A)	val；leu；ile	Val
Arg(R)	lys；gln；asn	Lys
			Asn(N)	gln；his；asp，lys；arg	Gln
Asp(D)	glu；asn	Glu
			Cys(C)	ser；ala	Ser
Gln(Q)	asn；glu	Asn
			Glu(E)	asp；gln	Asp
Gly(G)	ala	Ala
			His(H)	asn；gln；lys；arg	Arg
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	Ile
Lys(K)	arg；gln；asn	Arg
			Met(M)	leu；phe；ile	Leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	Tyr
			Pro(P)	ala	Ala
Ser(S)	thr	Thr
			Thr(T)	ser	Ser
Trp(W)	tyr；phe	Tyr
			Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	Phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	Leu

通过选择取代来完成对抗体的生物学特性的实质性修饰，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽框架的结构，例如片层或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然存在的残基根据共有的侧链特性可分为：

(1)疏水性：正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；

(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸；

(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸；

(4)碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；

(5)影响链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸；和

(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。

非保守取代将限定上述某一类的成员替换为另一类。

还可以取代任何不参与维持抗CD20抗体正确构象的半胱氨酸残基，一般用丝氨酸取代，来改善分子的氧化稳定性并防止错误交联。反之，可在抗体中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性(特别当抗体为抗体片段如Fv片段时)。

取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个超变区残基。一般而言，相对于产生所述变体的亲本抗体，获得的经选择用于进一步开发的变体将具有改善的生物学特性。产生此类取代变体的便利方法涉及利用了噬茵体展示的亲和力成熟。简而言之，突变超变区的几个位点(例如6-7个位点)，在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。因而产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定侯选的超变区修饰位点，可实施丙氨酸扫描诱变来鉴别对抗原结合作出主要贡献的超变区残基。可选的或额外的，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与人CD20之间的接触点也是有益的。此类接触残基和邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对变体全部进行筛选，选出在一个或多个相关测定中具有优良特性的抗体供进一步开发。

抗体的另一类型的氨基酸变体改变了所述抗体原始的糖基化模式。所谓改变意指删除了可见于抗体中的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加了一个或多个不存在于所述抗体中的糖基化位点。

抗体的糖基化典型的是N-连接或O-连接的。N-连接指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是使糖组分与天冬酰胺进行侧链酶促相连的识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。因而，多肽中存在任一上述三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。

在抗体分子中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一个或多个上述三肽序列(对于N-连接糖基化位点)而便利的实现。所述改变还可以通过向原始抗体的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生(对于O-连接糖基化位点)。

通过本领域已知的各种方法制备编码抗CD20抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这类方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早期制备的抗CD20抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

也可以理想的针对效应子功能来修饰本发明的抗体，例如，使得增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区导入一个或多个氨基酸取代而实现。可选的或额外的，可以在Fc区导入半胱氨酸残基，从而允许在该区内形成链间二硫键。如此生产的同型二聚体抗体可具有改善的内化能力，和/或增加补体介导的细胞杀伤与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)与Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可以利用如Wolffet等，CancerResearch 53：2560-2565(1993)描述的异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体。可选的，可以改造具有两个Fc区的抗体从而使其具有增强的补体介导的溶解与ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

治疗用途

所公开的包含本发明的人源化2H7CD20结合抗体的方法和组合物可用于治疗多种恶性的和非恶性的疾病，包括CD20阳性B细胞癌，如B细胞淋巴瘤和白血病，以及自身免疫病。骨髓中的干细胞(B细胞前体)缺少CD20抗原，允许健康的B细胞在治疗后再生，并在数月内返回正常水平。

CD20阳性B细胞癌是那些包含B细胞的异常增殖的癌症，所述B细胞在细胞表面表达CD20。CD20阳性B细胞癌包括CD20阳性霍奇金氏病，包括淋巴细胞占优势的霍奇金氏病(LPHD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；多毛细胞白血病。

术语“非霍奇金淋巴瘤”或“NHL”在本文中用于指除霍奇金氏淋巴瘤以外的淋巴系统的癌症。霍奇金氏淋巴瘤一般可以与非霍奇金淋巴瘤区分开，通过霍奇金氏淋巴瘤中存在Reed-Sternberg细胞，而非霍奇金淋巴瘤中缺少所述细胞。本文使用的术语非霍奇金淋巴瘤的实例包括了本领域技术人员(例如，癌症学家或病理学家)根据本领域已知的经典分类可以鉴别的任何例子，例如，Color Atlas of Clinical Hematology(第3版)，A.Victor Hoffbrand和John E.Pettit(编著)(HarcourtPublishers Ltd.，2000)中所述的欧美淋巴瘤修订(REAL)分类。特别参见附图11.57、11.58和11.59中的列表。更具体的实例包括但不限于复发型或难愈型NHL、一线低度NHL、III/IV期NHL、化疗抗性NHL、前体B淋巴母细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或早幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾脏边缘区淋巴瘤、结外边缘区-MALT淋巴瘤、结节边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低度/滤泡状淋巴瘤、中度/滤泡状NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡状)、中度弥漫型NHL、弥漫型大B细胞淋巴瘤、浸润型NHL(包括浸润型一线NHL和浸润型复发型NHL)、在自体干细胞移植后复发的或耐受自体干细胞移植的NHL、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、原发性弥漫型淋巴瘤、高度成免疫细胞性NHL、高度成淋巴细胞性NHL、高度小无核裂细胞性NHL、大肿块型NHL、Burkitt氏淋巴瘤、前体(外周型)大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样真菌病和/或塞扎莱综合征(Sezary syndrome)、皮肤(皮肤)淋巴瘤、退行性大细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。

在具体的实施方案中，包含人源化CD20结合抗体及其功能片段的药物组合物用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞占优势的霍奇金氏病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括这类适应症的复发型。

缓慢生长的淋巴瘤是缓慢增长的、不可治愈的疾病，其中患者平均存活6至10年，经历多个症状缓解与复发周期。在一个实施方案中，人源化CD20结合抗体或其功能性片段用于治疗缓慢生长的NHL，包括复发型缓慢生长的NHL和利妥昔单抗难愈型缓慢生长的NHL。复发型缓慢生长的NHL患者可以是利妥昔单抗的应答者，其之前接受过一次利妥昔单抗疗程，并具有＞6个月的响应。

本发明的人源化2H7抗体或其功能片段可用作单一药剂治疗(单一疗法)，用于例如复发型或难愈型低度或滤泡状CD20阳性的B细胞NHL，或者可以在多种药物治疗方案中与其它药物联合对患者给药。

本发明的人源化2H7抗体或其功能片段可用作一线疗法。本发明还考虑了使用这类抗体治疗患CD20阳性的B细胞瘤的患者，所述B细胞瘤对任一种下列药物的治疗不响应或具有不充分的响应：利妥昔单抗(Genentech)；替伊莫单抗(Zevalin^TM，Biogen Idee)；托西莫单抗(Bexxar^TM，GlaxoSmithKline)；HuMAX-CD20^TM(GenMab)；IMMU-106(是人源化的抗CD20a.k.a.hA20或90Y-hLL2，Immunomedics)；AME-133(Applied Molecular Evolution/Eli Lilly)；吉妥单抗奥佐米星(Mylotarg^TM，人源化的抗CD33抗体，Wyeth/PDL)；阿伦单抗(Campath^TM，抗CD52抗体，Schering Plough/Genzyme)；依帕珠单抗(IMMU-103^TM，人源化的抗CD22抗体，Immunomedics)；或在用这类药物治疗后复发。

本发明进一步提供了用本发明的人源化2H7抗体治疗CLL患者的方法，包括那些经历了失败的氟达拉滨疗法的患者。

本文中“自身免疫病”是来自和针对个体自己的组织或其共分离(co-segregate)或展示物的疾病或功能障碍，或由其导致的适应症。自身免疫病或功能障碍的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增殖性关节炎、牛皮癣关节炎、脊椎关节炎和青春期发作型类风湿性关节炎、骨关节炎、关节炎慢性发展、关节炎变形、慢性原发型多发性关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性过度增生性皮肤病、牛皮癣如斑块状银屑病、滴状牛皮癣(gutatte psoriasis)、脓疱性牛皮癣和灰指甲、特应性包括特应性疾病如干草热和乔布综合征、皮炎包含接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎、X连锁的高IgM综合征、荨麻疹如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹、多肌炎/皮肌炎、青年期皮肌炎、中毒性表皮坏死、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化症如全身性硬化症、多发性硬化(MS)如脊索-视神经MS、原发进行性MS(PPMS)和复发-缓解型MS(RRMS)、进行性全身性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化症、散播性硬化症(sclerosis disseminata)和共济失调型硬化症，炎性肠病(IBD)(例如，局限性回肠炎、自身免疫介导的胃肠道病、结肠炎如溃疡性结肠炎、结肠炎溃疡(colitis ulcerosa)、微观结肠炎、胶原性结肠炎、息肉性结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎和自身免疫性炎性肠病)、坏疽型脓皮症、结节性红斑、原发硬化性胆管炎、巩膜外层炎、呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜的炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液功能障碍、类风湿性脊椎炎、暴聋、IgE介导的疾病如变应性反应和变应性和特应性变应性鼻炎、脑炎如Rasmussen氏脑炎、和边缘叶和/或脑干脑炎、葡萄膜炎如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、有或无肾病综合征的肾小球肾炎(GN)如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜状增殖型GN(MPGN)，包括I型和II型，以及快速进行性GN、过敏性适应症和应答、过敏反应、湿疹包括变应性或特应性湿疹、哮喘如支气管哮喘(asthma bronchiale)、支气管哮喘(bronchial asthma)和自身免疫性哮喘、涉及T细胞渗透和慢性炎性应答的适应症、抗外源抗原的免疫反应如怀孕过程中胎儿A-B-O血型、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)或系统性散播性狼疮如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、散播性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎型、大脑炎型、儿科型、非肾型、肾外型、圆盘型、脱发型)、青春期发作型(I型)糖尿病，包括幼儿胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症、由细胞因子和T淋巴细胞介导的与免疫应答相关的急性和延迟性超敏、结核病、结节病、肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格内氏肉芽肿病、粒细胞缺乏症、脉管炎(vasculitides)，包括脉管炎(vasculitis)(包括大血管型脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu氏)关节炎)、中血管型脉管炎(包括Kawasaki氏病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、镜下多动脉炎、CNS脉管炎、坏死型、皮肤型或超敏型脉管炎、系统性坏死型脉管炎和ANCA相关性脉管炎，如Churg-Strauss脉管炎或综合征(CSS))、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、库氏试验阳性贫血、Diamond Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(anemia perniciosa)、爱迪生氏病、单纯红细胞性贫血或发育不全(PRCA)、凝血因子VIII缺乏、甲型血友病、自身免疫性中性白细胞减少、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞血球渗出的疾病、CNS炎性功能障碍、多器官损伤综合征如从属于败血症、创伤或大出血的、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、Bechet氏病、Castleman综合征、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、雷诺氏综合征(Reynaud′ssyndrome)、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、Stevens-Johnson综合征、类天疱疮如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶性天疱疮(pemphigus foliaceus)、天疱疮粘膜型类天疱疮，和红斑型天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、赖特尔氏病(Reiter′sdisease)或综合征、免疫复合物性肾炎、抗体介导的肾炎、视神经脊髓炎、多神经病、慢性神经病如IgM多神经病或IgM介导的神经病、血小板减少症(例如由心肌梗阻患者出现的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱导的血小板减少症，和自身免疫或免疫介导的血小板减少症如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP、睾丸与卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎与卵巢炎、原发性甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退、自身免疫性内分泌疾病包括甲状腺炎，如自身免疫性甲状腺炎、Hashimoto氏病、慢性甲状腺炎(Hashimoto氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退、格雷夫斯氏病(Grave′s disease)、多腺综合征如自身免疫性多腺综合征(或多腺内分泌病综合征)、副癌综合症，包括神经系统性副癌综合征，如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征、僵人综合征、脑脊髓炎如变应性脑脊髓炎或脑脊髓炎过敏症和实验性变应性脑炎(EAE)、重症肌无力如胸腺瘤相关性重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、斜视眼阵痉或斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病、多灶性运动神经病、希汉氏综合征(Sheehan′s syndrome)、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮性肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动型肝炎或自身免疫性慢性活动型肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)、闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、格-巴二氏综合征、贝尔格尔氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线性IgA皮肤病、原发型胆汁性肝硬化、肺硬变、自身免疫性肠病综合征(autoimmune enteropathy syndrome)、乳糜泻、腹部疾病、乳糜泻(麸质肠病)、难治性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(amylotrophic lateral sclerosis，ALS；Lou Gehrig氏病)、冠状动脉病、自身免疫性耳病如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性失聪、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎如难愈型或复发型多软骨炎、肺泡蛋白沉着病、淀粉样变性病、巩膜炎、非癌性淋巴细胞增多、原发性淋巴细胞增多，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和不典型单克隆丙种球蛋白病，MGUS)、外周神经病、副肿瘤综合征、离子通道病如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉功能障碍、耳聋、目盲、期性麻痹和CNS的离子通道病、孤独症、炎性肌肉病、局灶性节段性肾小球硬化病(FSGS)、内分泌性眼病、眼色素层巩膜炎(uveoretinitis)、脉络视网膜炎、自身免疫性肝脏功能障碍、纤维肌痛、多重内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt′ssyndrome)、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘病如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘多神经病、糖尿病肾病、心肌梗塞后综合征(Dressler′s syndrome)、斑秃、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍(esophageal dysmotility)、指硬皮病和毛细血管扩张)、男女自身免疫性不孕症、混合结缔组织病、南美洲锥虫病、风湿热、反复流产、农民肺、多形性红斑、心脏切开后综合征、柯兴综合征(Cushing′s syndrome)、养鸟人肺、变应性肉芽肿性脉管炎、良性淋巴细胞性脉管炎、阿尔波特氏综合征(Alport′s syndrome)、齿槽炎如变应性齿槽炎和纤维齿槽炎(fibrosing alveolitis)、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter氏综合征、类风湿尘肺综合征(Caplan′ssyndrome)、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化症、弥漫性肺间质纤维化、间质性肺纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、胎儿成红细胞增多、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、输血后紫癜综合征(Shulman′s syndrome)、费耳提氏综合征(Felty′s syndrome)、flariasis、睫状体炎如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch氏睫状体炎、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾可病毒感染(echovirus infection)、心肌症、阿滋海默氏病、细小病毒感染、风疹病毒感染、免疫接种后综合征、特发性风疹感染、EB病毒感染、腮腺炎、伊万氏综合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′s chorea)、链球菌感染后性肾炎、thromboangitis ubiterans、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、内分泌性眼病(endocrine ophthamopathy)、慢性超敏性肺炎、干燥性角膜结膜炎、流行性角膜结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变肾病、家族性良性缺血再灌注损伤、视网膜自身免疫病、关节炎症、支气管炎、慢性呼吸道阻塞病、矽肺、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性功能障碍、aspermiogenese、自身免疫性溶血、伯克氏病(Boeck′s disease)、冷球蛋白血症、杜普征氏掌挛缩(Dupuytren′scontracture)、晶状体变应性眼内炎(endophthalmiaphacoanaphylactica)、enteritis allergica、麻风结节性红斑、特发性面瘫、慢性疲劳综合征、风湿热(febris rheumatica)、Hamman-Rich氏病、感觉神经性失聪、突发性血红素尿、性腺机能减退、局部性回肠炎、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发特发性粘液水肿、肾病、系统性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多神经根炎、坏疽性脓皮症、Quervain氏甲状腺炎(Quervain′s thyreoiditis)、获得性脾脏萎缩、由于抗精子(antispermatozoan)抗体造成的不孕症、非恶性胸腺瘤、白癫风、SCID和EB病毒相关性疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、寄生虫病如利什曼病、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞渗透的适应症、白血球粘着缺乏症、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏反应相关的免疫应答、涉及白血球渗出的疾病、创伤后多器官功能不全综合征(multiple organ injury syndrome)、抗原-抗体复合体介导的疾病、抗肾小球基底膜病、变应性神经炎、自身免疫性多发内分泌病、卵巢炎、原发性粘液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多发内分泌衰竭、外周神经病、自身免疫性多腺性综合征I型、成人发作型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)、全秃、扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita，EBA)、血色沉着病、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性窦炎、急性或慢性窦炎、筛骨型、前额骨型、上颌骨型或蝶骨型窦炎、嗜酸粒细胞相关的功能障碍如嗜酸粒细胞增多、肺嗜酸细胞增多性浸润综合征、嗜酸细胞增多性肌痛综合征、吕弗勒氏综合征(Loffler′s syndrome)、慢性嗜酸粒细胞性肺炎、热带性肺嗜酸性粒细胞浸润症、支气管肺曲霉病、曲霉肿或含嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏反应、seronegativespondyloarthritides、多发内分泌性自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病、Bruton氏综合征、婴儿期一过性低丙种球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调性毛细血管扩张症、与胶原病相关的自身免疫病、风湿病、神经病、淋巴腺炎、缺血再灌注功能障碍、降压应答(reduction in blood pressure response)、血管功能紊乱、antgiectasis、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血，和伴随血管化的疾病、变应性超敏功能障碍、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、再灌注损伤、心肌或其他组织的再灌注损伤、含急性炎症组分的皮肤病、急性化脓性脑膜炎或其他的中枢神经系统炎性功能障碍、眼睛和眼窝的炎性功能障碍、粒细胞输血相关的综合征、细胞因子诱导的毒性、急性重症炎症、慢性难治型炎症、肾盂炎、肺硬变、糖尿病视网膜病、糖尿病大动脉功能障碍、动脉内增生、消化性溃疡、瓣膜炎和子宫内膜异位症。

在具体的实施方案中，包含人源化2H7抗体及其功能片段的药物组合物被用于治疗类风湿性关节炎与幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格内氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化包括复发缓解型MS、牛皮癣、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关性脉管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、干燥综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。

“治疗”或“减轻”指治疗性处理，其中若未治愈所针对的病理适应症或功能障碍，或者未阻止所述适应症的复发，则减慢(减少)所述适应症。如果在接受治疗量的根据本发明方法的本发明的人源化CD20结和抗体后，受试者表现出特定疾病的一种或多种体征和症状的可观察到的和/或可测量的降低或缺失所述一种或多种体征和症状，则所述受试者的自身免疫病或CD20阳性的B细胞恶性肿瘤被成功的“治疗”。例如，对于癌症，癌细胞数量的显著降低或癌细胞的缺失；肿瘤大小的降低；肿瘤转移的抑制(即在一定程度上减缓或者优选停止)；肿瘤生长一定程度的抑制；缓解时间长度的增加；疾病发展的减慢，和/或与特定癌症相关的一种或多种症状的一定程度的减轻；降低的发病率和死亡率；以及生活质量的改善。患者也可以感受到疾病的体征或症状的减轻。治疗可以实现完全有效，定义为所有癌症体征的消失，或者部分有效，其中肿瘤的大小减少优选超过50％，更优选75％。如果患者经历了病情稳定，也认为患者得到了治疗。在一种标准中，本发明的h2H7抗体实现了＞95％外周血B细胞消减，和B细胞恢复到基线的25％。在优选的实施方案中，用本发明的抗体治疗有效地获得了患者在治疗后4个月内，优选6个月内，更优选1年内，甚至更优选2年或多年内癌症无恶化。通过恰当的技术领域的医师所熟悉的常规程序，可方便的测量用于评估治疗和疾病改善的这类参数。

“治疗有效量”指在受试者中有效“治疗”疾病或功能障碍的抗体或药物的量。在癌症的情况下，药物治疗有效量可降低癌细胞的数量；降低肿瘤体积；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞对周围器官的浸润；抑制(即在一定程度上减慢到并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。参见前述对“治疗”的定义。在自身免疫病的情况下，治疗有效量的抗体或其他药物有效地降低疾病的体征和症状。

评估肿瘤治疗效力或成绩的参数对于熟悉该疾病的恰当医师而言是已知的。一般而言，熟练的医师将试图减少该特定疾病的体征和症状。参数可以包括疾病发展的中值时间、症状缓解时间及病情平稳。

以下参考文献描述了淋巴瘤与CLL，其诊断、治疗和用于测量治疗效力的标准医学程序。Canellos GP，Lister，TA，Sklar JL：TheLymphomas.W.B.Saunders Company，Philadelphia，1998；van Besien K和Cabanillas，F：Clinical Manifestations，Staging and Treatment ofNon-Hodgkin′s Lymphoma，第70章，第1293-1338页，在Hematology，Basic Principles and Practice第3版中。Hoffman等(编著)，Churchill Livingstone，Philadelphia，2000中；以及Rai，K和Patel，D：Chronic Lymphocytic Leukemia，第72章，第1350-1362页，在Hematology，Basic Principles and Practice，第3版中。Hoffman等(编著)。Churchill Livingstone，Philadelphia，2000。

评估治疗自身免疫或自身免疫相关疾病的效力或成绩的参数对于熟悉该疾病领域的恰当医师而言是已知的。通常，熟练医师将试图减少该特定疾病的体征和症状。以下通过举例说明。

在一个实施方案中，包含人源化2H7抗体的药物组合物用于治疗类风湿性关节炎。

RA是一类消耗性的自身免疫病，影响超过2百万美国人，妨碍患者的日常活动。RA发生于当机体自身的免疫系统不恰当的攻击关节组织，并导致破坏健康组织和损坏关节内部的慢性炎症。症状包括关节炎症、肿胀、僵硬和疼痛。此外，由于RA是全身疾病，其可影响其它组织，如肺、眼和骨髓。目前尚无已知的治愈方法。治疗包括多种固醇类和非固醇类的抗炎药物、免疫抑制剂、减轻病症的抗风湿病药物(DMARD)和生物制剂。然而，许多患者一直对治疗具有不充分的应答。

抗体可以在早期RA(即未用氨甲喋呤(MTX)治疗的)患者中用作一线疗法，以及作为单一疗法，或者与下列药物联合使用或相继使用：例如MTX或环磷酰胺。或者，抗体可作为二线疗法用于治疗DMARD和/或MTX难愈型患者，以及作为单一疗法，或者与例如MTX联合使用。人源化CD20结合抗体可有效预防和控制关节损害、延缓结构破坏、降低与RA中的炎症相关的疼痛，并且通常降低中度至严重RA中的体征和症状。可以在用其它用于治疗RA的药物治疗之前、之后或过程中用人源化CD20抗体治疗RA患者(见下面的联合治疗)。在一个实施方案中，用本发明的人源化CD20结合抗体治疗这样的患者，所述患者之前具有失败的减轻病症的抗风湿药治疗史和/或对仅用氨甲喋呤治疗反应不足。在该治疗的实施方案中，患者在17天的治疗方案中仅接受人源化CD20结合抗体(在第1与第15天，静脉内输注1g)；CD20结合抗体加环磷酰胺(在第3与第17天，静脉内输注750mg)；或者CD20结合抗体加氨甲喋呤。

由于在RA过程中身体生产肿瘤坏死因子α(TNFα)，故已将TNFα抑制剂用于治疗所述疾病。然而，TNFα抑制剂如依那西普(Etanercept)

英利昔单抗(Infliximab)

和阿达木单抗(Adalimumab)(HUMIRA^TM)可以产生消极副作用，如感染、心力衰竭和脱髓鞘。因此，在一个实施方案中，人源化CD20结合抗体或其生物学功能片段用作例如一线疗法，来治疗RA患者，降低用TNFα抑制剂药物所经历的消极副作用的风险，或者治疗被认为倾向于会经历毒性，例如心脏毒性的患者。人源化CD20结合抗体或其生物学功能片段也用于治疗患RA的患者的方法，所述患者已经用TNFα抑制剂治疗过，但没有应答、对TNFα抑制剂没有充分的应答(TNF-IR患者)或者在应答一些时间后疾病复发，或者是被确定不太可能应答使用TNFα抑制剂的疗法的受试者。在一个实施方案中，在用TNFα抑制剂治疗之前，用低剂量治疗TNF-IR，例如低于100mg。

评价RA治疗效力的一个方法是以美国风湿病学会(ACR)标准为基础，该标准测量在关节触痛与肿胀上改善的百分比，同时测量其它内容。与未用抗体治疗(例如治疗前基线)或用安慰剂治疗相比，RA患者可被评分为，例如ACR20(改善20％)。评价抗体治疗效力的其它途径包括X射线评分，例如Sharp X射线评分，该评分被用于对结构性损伤(例如骨侵蚀与关节间隙变窄)进行评分。在治疗期间或之后，也可基于健康评估调查表[HAQ]评分、AIMS评分、SF-36，评价患者无能的预防或改善。ACR20标准可以包括在触痛(疼痛)关节计数与肿胀关节计数上改善20％，加上在如下5个附加测量标准中至少3个改善20％：

1、通过视觉模拟尺度(VAS)评估患者的疼痛；

2、患者对疾病活动性的综合评估(VAS)；

3、医师对疾病活动性的综合评估(VAS)；

4、患者通过健康评估调查表测量的对无能的自我评估，和

5、急性期反应物、CRP或ESR。

类似的定义ACR50与70。优选地，给予患者有效量的本发明的CD20结合抗体，使评分达到至少ACR20，优选至少ACR30，更优选至少ACR50，甚至更优选地至少ACR70，最优选至少ACR75和更高。

牛皮癣关节炎具有独特的和特殊的放射学特征。对于牛皮癣关节炎而言，也可以通过Sharp记分评估关节侵蚀与关节间隙变窄。本发明的人源化CD20结合抗体可用于防止关节损害和降低所述功能障碍的疾病体征和症状。

本发明的另一方面是通过向患SLE或狼疮的患者施用本发明包含治疗有效量的人源化CD20结合抗体的药物组合物，治疗SLE或狼疮的方法。SLEDAI评分提供了疾病活动性的数值定量。SLEDAI是24个已知与疾病活动性相关的临床与实验室参数的加权指数，数值范围为0-103。见Bryan Gescuk&John Davis，“Noveltherapeutic agent for systemic lupus

erythematosus”在Current Opinion in Rheumatology 2002，14：515-521中。其他评分方法包括BILAG评分。针对双链DNA的抗体被认为导致肾性潮红(renal flares)及其它的狼疮表现。可以对进行抗体治疗的患者随时间监控肾性潮红，所述肾性潮红定义为血清肌酸酐、尿蛋白质或血尿的显著的、可再现的增加。可选的或额外的，可以监控患者的抗核抗体和抗双链DNA抗体的水平。对SLE的治疗包括高剂量皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。在本文中，狼疮的成功治疗将降低潮红，即，降低严重程度和/或至下一次潮红的时间。

脊椎关节病是一类关节的功能障碍，包括强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎与局限性回肠炎。治疗成果可以用验证的患者与医师综合评估测量工具来判定。

关于脉管炎，约75％患系统性脉管炎的患者都具有抗嗜中性细胞质抗体，并聚集成三种影响小/中型血管的适应症之一：韦格纳肉芽肿(WG)、镜下多脉管炎(MPA)和Churg Strauss综合征(CSS)，统称为ANCA相关性脉管炎(AAV)。

通过监控与基础状态相比，疾病临床体征与症状的改变而评估牛皮癣治疗效力，包括医师综合评估(PGA)改变和牛皮癣面积和严重性指数(PASI)评分、牛皮癣症状评估(PSA)。可以在整个治疗过程中，周期性的测量用本发明的人源化CD20结合抗体如hu2H7.v511治疗的牛皮癣患者的视觉模拟等级(Visual analog scale)，所述视觉模拟等级用于表示特定时间点所感受到的痒感程度。

患者在首次输注治疗性抗体时可能经历输注反应或输注相关症状。这些症状的严重程度各异，一般在药物介入后是可逆的。这些症状包括但不限于流感样发热、寒战/寒冷、恶心、荨麻疹、头痛、支气管痉挛、血管性水肿。对本发明的疾病治疗方法而言，将输注反应最小化是理想的。为了减轻或最小化此类负面事件，患者可以在接受最初的适应性或耐受性剂量的抗体后，再接受治疗有效剂量的抗体。适应性剂量将低于治疗有效剂量，从而调试患者使其耐受更高的剂量。

剂量

取决于所要治疗的适应症以及本领域熟练医师所熟悉的与剂量有关的因素，本发明的抗体将以有效治疗适应症同时使毒性与副作用最小化的剂量施用。理想的剂量可取决于疾病和疾病严重程度、疾病的阶段、理想的B细胞调节的水平，和本领域熟练医师所熟悉的其他因素。

对于治疗自身免疫病而言，理想的是通过调节人源化2H7抗体的剂量，根据每个患者的疾病和/或适应症严重程度来调节B细胞消减的程度。可以但不必需完全消减B细胞。或者，总B细胞消减在初次治疗中是理想的，但在随后的治疗中，可以调整剂量来获得仅部分的消减。在一个实施方案中，与治疗前的基线水平相比，B细胞消减至少20％，即，余留80％或者更少的CD20阳性B细胞。在其它实施方案中，B细胞消减25％、30％、40％、50％、60％、70％或者更多。优选地，B细胞消减足以使疾病进展停顿，更优选减轻在治疗下的特定疾病的体征和症状，甚至更优选治愈疾病。

可以以各种给药频率施用本发明的抗体，例如，每周、每两周、每月等。在一个实例中，给药频率是每六个月给药1次，或每六个月间隔2周给药2次。待注射的抗体溶液体积可以在每次注射从约0.1至约3ml的范围，更优选每次注射从约0.5至约1.5ml。在1次注射中施用的人源化2H7抗体的总量可以达到每次注射约150mg。为了获得理想剂量，可以使用多次注射。

可以使用本发明的任何给药方案治疗患自身免疫病或B细胞恶化的患者，对于所述患者而言，一种或多种现有的疗法是无效的、低耐受的或不当的。例如，本发明预计将本治疗方法用于对肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂疗法或对减轻病症的抗风湿病药物(DMARD)疗法应答不充分的RA患者。

“慢性”施用指以与急性模式相反的、连续的方式施用试剂，使得最初的治疗效果(活性)维持一段延长的时间段。“间歇”施用是这样的治疗，所述治疗不是不间断的连续进行的，而本质上是循环的。

联合疗法

在治疗上述B细胞肿瘤时，可以在多药物方案中，用本发明的人源化2H7抗体与一种或多种治疗剂例如化疗剂联合，来治疗患者。人源化2H7抗体可以与化疗剂同时的、依次的或者交替的施用，或在用其它治疗不反应之后进行联合治疗。淋巴瘤治疗的标准化学疗法包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑、和米托蒽醌加美法仑。CHOP是治疗非霍奇金淋巴瘤最常见的化学疗法之一。以下是用于CHOP方案中的药物：环磷酰胺(商品名cytoxan，neosar)；阿霉素(多柔吡星/羟基多柔吡星)；长春新碱(Oncovin)；与泼尼松龙(有时称为氢化可的松(Deltasone)或泼尼松制剂(Orasone))。在特定的实施方案中，CD20结合抗体与下列化疗剂中的一个或多个联合给药至需要的患者：多柔吡星、环磷酰胺、长春新碱与泼尼松龙。在特定的实施方案中，用本发明的人源化2H7抗体与CHOP(环磷酰胺、多柔吡星、长春新碱和泼尼松)联合治疗患淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)的患者。在另一个实施方案中，可以用本发明的人源化2H7CD20联合抗体与CVP(环磷酰胺、长春新碱与泼尼松)化疗联合治疗癌症患者。在特定的实施方案中，向患CD20阳性NHL的患者施用与CVP联合的人源化2H7.v511或v114，例如每3周一次进行8次循环。在治疗CLL的特定实施方案中，hu2H7.v511抗体与使用氟达拉滨与环磷酰胺中的一个或两个的化学疗法联合施用。

“化疗剂”是在癌症治疗中有效的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)和

环膦酰胺；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如苄替哌(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTATM)；乙酸配质(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，

)；β拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康CPT-1l(依立替康、

)、乙酰喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CBl-TMl)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；双膦酸盐如氯屈膦酸盐；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γII和加利车霉素ωII(见例如Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994)))和蒽环类如安那霉素、AD 32、alcarubicin、柔红霉素、右丙亚胺、DX-52-1、表柔比星、GPX-100、伊达比星、KRN5500、美诺立尔、dynemicin，包括dynemicin A、埃斯波霉素、新制癌菌素、生色团及相关的色素蛋白烯二炔类抗生素类生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔吡星(包括吗啉代-多柔吡星、氰基吗啉代-多柔吡星、2-吡咯啉多柔吡星、脂质体多柔吡星和脱氧多柔吡星)、依索比星(esorubicin)、发波霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、鸟苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)、邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid(甲酰四氢叶酸)；醋葡内酯；抗叶酸抗肿瘤剂如

LY231514培美曲塞、二氢叶酸还原酶抑制剂如氨甲喋呤、抗代谢剂如5-氟尿嘧啶(5-FU)及其前体药如UFT、S-I和卡培他滨，以及胸苷酸合成酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶抑制剂如雷替曲塞(TOMUDEX^TM，TDX)；二氢嘧啶脱氢酶的抑制剂，如恩尿嘧啶；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；磷氨氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类(maytansinoids)，如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；

多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；单端孢霉烯族毒素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆胞菌素A和蛇形毒素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(

)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)和紫杉烷类(taxanes)，例如

紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)和ABRAXANE^TM Cremophor-free、白蛋白改造型紫杉醇纳米颗粒配方(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，以及多西他赛(Rhóne-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)

6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂；铂类似物或基于铂的类似物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱

依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱

长春花生物碱；长春瑞宾(vinorelbine)

二羟基蒽酮(novantrone)；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；任意上述的制药可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的联合，如CHOP，环磷酰胺、多柔吡星、长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的缩写；以及FOLFOX，用奥沙利铂(ELOXATIN^TM)与5-FU和甲酰四氢叶酸联合的治疗方案的缩写。

该定义还包括了作用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫西芬(包括

他莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫西芬、曲沃昔芬、他莫西芬盐酸盐(keoxifene)、LYl 17018、奥那司酮和

托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，所述酶调控肾上腺中的雌激素生产，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特、

醋酸甲地孕酮、

依西美坦、formestanie、法倔唑、

伏氯唑、

来曲唑和

阿纳托唑；以及抗雄激素剂，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1，3-二氯戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制参与贴壁细胞增殖的信号通路中的基因表达的，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如基因疗法疫苗，例如疫苗、

疫苗和

疫苗；

rIL-2；

拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；和任意上述物质的制药可接受的盐、酸或衍生物。

额外的，hu2H7抗体及其功能片段可用于与抗肿瘤血管发生剂联合治疗表达CD20的B细胞癌(例如，NHL)，抗肿瘤血管发生剂如血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指直接或间接的抑制血管发生、血管化(vasculogenesis)或不理想的血管渗透性的小分子量的物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白质、抗体或其缀合物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是如上定义的血管发生剂的抗体或其他拮抗剂，例如，VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传递的小分子(例如，PTK787/ZK2284，SU6668)。“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、废除、降低或干扰VEGF活性的分子，包括与一种或多种VEGF受体结合。在一个实施方案中，用

(贝伐单抗；Genentech)与2H7.v511或2H7.vl14联合治疗患此类B细胞癌的患者。抗VEGF抗体“贝伐单抗(BV)”也称为“rhuMAb VEGF”或

是根据Presta等，CancerRes.57：4593-4599(1997)生产的重组的人源化抗VEGF单克隆抗体。

hu2H7抗体及其功能片段可用于与多种TNF家族的细胞因子联合治疗表达CD20的B细胞癌的方法，所述细胞因子例如Apo-2配体(Apo2L)，也称为TRAIL。人Apo-2配体的全长天然序列是肿瘤坏死因子家族的281个氨基酸长度的、II型跨膜蛋白的细胞因子。已发现Apo-2配体的可溶形式(如包含胞外结构域(ECD)或其部分的形式)具有多种活性，包括在哺乳动物癌细胞中的凋亡活性。Apo2L/TRAIL(在WO 97/01633和WO 97/25428中描述的)是可溶性的人蛋白，是ECD的片段，包含全长Apo2L蛋白的114-281位氨基酸。

在治疗上述自身免疫病或自身免疫相关适应症时，在例如多药物方案中，可以用一种或多种hu2H7抗体与第二种治疗剂，如免疫抑制剂，联合治疗患者。hu2H7抗体可以与免疫抑制剂或者基于对其他疗法的无应答性同时的、依次的或替代的施用。可以施用与现有领域所述相同或更低的免疫抑制剂。优选的辅助性免疫抑制剂可依赖于多种因子，包括待治疗的功能障碍的类型以及患者病史。

如本文中用于辅助疗法的，“免疫抑制剂”指作用为抑制或遮蔽患者的免疫系统的物质。此类试剂可以包括抑制细胞因子生产、下调或抑制自身抗原表达，或者遮蔽MHC抗原的物质。此类试剂的实例包括甾醇类，如糖皮质激素类，例如泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松；2-氨基-6-芳香基-5-取代嘧啶(见美国专利号4,665,077)、硫唑嘌呤(或环磷酰胺，如果对硫唑嘌呤有副反应)；溴隐亭；戊二醛(遮蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环胞菌素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗-干扰素-γ、-β或-α抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体；抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗-L3T4抗体；异源性抗淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体；优选抗-CD3或抗-CD4/CD4α抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(7/26/90公开的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；和WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)，如T10B9。

为了治疗类风湿性关节炎，可以用本发明的CD20结合抗体与下述药物中的任何一个或多各联合治疗患者：DMARDS(减轻病症的抗风湿病药物(例如氨甲喋呤)、NSAI或NSAID(非类固醇类抗炎药物)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤；麦考酚酸酯(Roche))、镇痛药、糖皮质激素、环磷酰胺、HUMIRATM(阿达木单抗；Abbott Laboratories)、

(来氟米特)、

(英利昔单抗；Centocor Inc.，of Malvern，Pa)、

(依那西普；Immunex，WA)、

(托珠单抗(tocilizumab)；Roche，Switzerland)、COX-2抑制剂。常用于RA的DMARD是羟氯喹(hydroxycloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、氨甲喋呤、来氟米特、依那西普、英利昔单抗、硫唑嘌呤、D-青霉胺、Gold(口服)、Gold(肌肉内)、米诺环素、环孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。

阿达木单抗是与TNFα结合的人单克隆抗体。英利昔单抗(Infliximab)是与TNFα结合的嵌合小鼠-人单克隆抗体。是处方用于治疗RA和局限性回肠炎的免疫抑制药物。英利昔单抗已与致死反应关联，例如心力衰竭和感染，包括结核病以及MS导致的脱髓鞘。Actemra(托珠单抗)是人源化的抗人白介素-6(IL-6)受体。

依那西普是“免疫粘附素”融合蛋白，包括与人IgG1的Fc部分相连接的人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分。依那西普是获得美国批准用于活性RA疗法中的可注射药物。依那西普结合TNFα，并发挥从关节和血液去除大部分TNFα的作用，从而阻止TNFα对炎症和类风湿性关节炎的其他症状的促进作用。该药物与消极副作用相关，包括严重的感染和脓毒症、神经系统功能障碍如多发性硬化(MS)。见例如www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html。

对于RA的常规治疗，见例如“Guidelines For the management of rheumatoid arthritis”，Arthritis&Rheumatism 46(2)：328-346(2002年2月)。在具体的实施方案中，用本发明的hu2H7CD20抗体联合氨甲喋呤(MTX)治疗RA患者。示例性的MTX剂量为约7.5-25mg/kg/周。MTX可口服和皮下给药。

在一个实例中，患者还接受与皮质类固醇方案伴随的MTX(10-25mg/周/每次口服(p.o.)或不经肠道的)，所述皮质类固醇方案包括在输入CD20抗体的30分钟之前静脉注射(i.v.)100mg甲泼尼龙，和在第2-7天口服(p.o.)60mg，以及第8-14天口服30mg泼尼松，并在第16天回归基线剂量。患者还可以接受作为单次剂量或作为分次的日常剂量给予的叶酸(5mg/周)。患者在整个治疗周期内任选的持续接受任何背景的皮质类固醇(10mg/天泼尼松或等价的)。

对于治疗强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎与局限性回肠炎而言，可以用本发明的CD20结合抗体与例如

(英利昔单抗；来自Centocor Inc.，of Malvern，Pa.)，ENBREL(依那西普；Immunex，WA)联合治疗患者。

对于SLE的治疗包括CD20抗体与高剂量皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)的联合。可以用本发明的2H7抗体与任意下列药物的联合治疗患SLE、AAV和NMO的患者：皮质类固醇、NSAID、镇痛剂、COX-2抑制剂、糖皮质激素、常规的DMARDS(例如，氨甲喋呤、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、来氟米特)、生物DMARDS如抗Blys(例如，贝利单抗(belimumab))、抗-IL6R，例如托珠单抗；CTLA4-Ig(阿贝西普(abatacept))(抗CD22，例如依帕珠单抗(epratuzumab)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤；麦考酚酸酯(

Roche))，和细胞毒性剂(例如，环磷酰胺)。

对于治疗牛皮癣而言，可以向患者施用人源化2H7抗体与局部治疗的联合，例如局部类固醇、蒽林(anthralin)、卡泊三烯、氯倍他索与他佐罗汀，或结合氨甲喋呤、类视黄醇、环孢菌素、PUVA与UVB治疗。在一个实施方案中，用人源化2H7抗体和环孢菌素依次的或者同时的治疗牛皮癣患者。

为了使毒性最小化，可以将传统的系统性疗法与目前剂量的hu2H7CD20结合抗体组合物以轮流的、依次的、联合的或间隔的治疗方案，或者以较低剂量的联合方案施用。

制品和试剂盒

本发明的另一种实施方案是一种制品，包含对治疗自身免疫病与相关病症以及CD20阳性癌症例如非霍奇金淋巴瘤有用的配方。所述制品包含容器和置于所述容器上或与所述容器相关的标签或内置物。合适的容器包括例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可能是由各种材料形成，例如玻璃或塑料。配方或组合物中的至少一种活化剂是本发明的hu2H7抗体，所述抗体存在于容器如注射器中，以在剂量章节中描述的量递送。hu2H7的浓度可以在10mg/ml至200mg/ml的范围，可以是30-150mg/ml或100-150mg/ml。标签或包装内置物指示所述组合物用于治疗特定的适应症。标签或包装内置物将进一步包含向患者施用抗体组合物的说明。

包装内置物指通常包括在治疗产品商业包装中的说明，该说明含有关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方案中，包装内置物指示所述组合物用于治疗非霍奇金淋巴瘤。

额外的，制品可进一步包含第二容器，所述容器包含可药用的缓冲液，例如注射用水(WFI)、抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液、氯化钠(0.9％)与右旋糖溶液。其可进一步包括从商业与用户角度需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头与注射器。

实施例

实施例1：rhuMab 2H7的初始皮下配方

开发了rhuMAb 2H7的高浓度皮下配方(150mg/mL)。该配方包含150mg/ml 2H7，30mM醋酸钠；7％二水合海藻糖；0.03％聚山梨醇酯20，pH5.3。该配方在推荐条件下储藏在最终的小瓶中是长期稳定的。通过皮下注射在食蟹猴中施用该材料导致在注射位点严重的炎症和低生物利用率(≈30％)。在这些动物中观察到皮下层中轻度至中度的巨噬细胞渗透。刺激的起因归因于外源的身体材料(即，2H7测试材料)。在模拟产品在注射位点处所暴露的条件下，测试该配方证实了所述蛋白质在生理条件下是显著聚集的(图1)，确证了在食蟹猴中观察到的发炎结果。观察到的沉淀可与pH改变后的盐析效果一致。

实施例2：用于测试在皮下注射的生理条件下的大分子聚集的体外透析方法

开发了体外透析方法，用于测试不同赋形剂在皮下注射过程中面临的生理条件下降低2H7聚集的能力。开发了用于该模型的修饰的PBS溶液(“释放溶液”)以模拟间质液。该体外系统用于评估糖、聚合物、表面活性剂和氨基酸在延迟2H7聚集中的影响。然后，在体内测试(大鼠皮下模型；见实施例3)表现出改善产物在体外释放的候选配方，确定所述改善是否对应于减少的体内炎症。

图2中显示了体外透析模型的设置。在37℃下，用220ml释放溶液(167mM钠，140mM氯化物，17mM磷酸盐，4mM钾)装入250ml玻璃罐中。将6cm长度的透析管(Spectra Por 1百万分子量截留(MWCO)PVDF透析管12mm直径)浸入纯水中。夹住透析管的一端，用约1ml测试样品(含测试赋形剂的2H7)装入管中。移出过多的空气，并夹住管的相反一端以密封罐。将装满的袋加入含释放溶液的250ml玻璃罐中，并将罐子置于37℃下，持续搅拌。在2.5、6、12、24、33和48小时后，移出500μl的释放溶液的样品。通过UV分光光度计扫描测量释放溶液中存在的样品混浊度和蛋白质的量。此外，目测释放溶液和在透析管内的溶液的沉淀。

如果：

·含测试赋形剂的2H7的积累释放大于阴性对照(原始的2H7配方——150mg/ml 2H7，30mM醋酸钠；7％二水合海藻糖；0.03％聚山梨醇酯20，pH 5.3)，提示改善的2H7特征。

·阳性对照(rhuMAb抗-CD 11a，也称为Raptiva^TM，人源化的抗-CD 11a抗体，皮下施用)没有表现出沉淀，且表现出比阴性对照更大的释放。

·2H7的沉淀是降低的或消除的。

·释放溶液的混浊度降低。

则认为在体外聚集研究中可接受该测试赋形剂。

然后，在体内大鼠模型中测试满足接受规则的候选物，确定体外延迟的聚集是否与体内减少的炎症相关。

体外结果：

图3中显示了在体外透析方法中的研究对照的典型的释放谱。用于该模型的对照挑选包括了在生理条件下不易于聚集的蛋白质(rhuMAbCDl1a)的释放和通常聚集的蛋白质(原始2H7)的释放在内。两条释放曲线之间的面积测量了测试赋形剂相对于对照延迟聚集的相对能力。

原始2H7配方的累积释放是低的(＜30％)。随着2H7从透析袋释放到释放溶液中，观察到释放溶液增加的混浊度，提示材料在所述环境中聚集。在24小时内观察到透析袋中广泛的絮凝，对应于2H7浓度从研究起始时的150mg/mL急剧减少至48小时研究结束时的4至5mg/mL。所有这些观测结果都提示2H7易于在生理条件下聚集。当2H7原始配方在37℃下储存在玻璃小瓶中时，没有观察到上述行为。

相反，rhuMAb CDl1a从透析袋中快速释放入释放溶液中。在整个研究过程中，释放溶液保持清澈，在透析袋内未观察到任何絮凝，提示rhuMAb CDl1a在生理条件下不聚集，并且涉及作为该模型的对照。表3总结了释放蛋白质的百分比、释放溶液混浊度和絮凝的存在。

表3

实施例3

用于测试大分子聚集的体内大鼠皮下模型

大鼠皮下模型是基于皮下炎症特征的相似性的恰当模型。接受原始2H7配方的大鼠的炎症应答与在食蟹猴中观察到的炎症应答一致(见实施例1)。在用2H7注射的大鼠皮肤切片中，对人免疫球蛋白的免疫组化染色是阳性的，提示在炎症区域中存在或持续有抗体，支持了测试品的沉淀导致注射位点炎症的理论。

如下进行体内大鼠筛选测定：

皮下施用各种测试或对照配方(0.25ml)。在给药72小时后对动物进行尸检。横切注射位点处的皮肤切片，并固定在福尔马林中，通过组织学确定测试赋形剂对降低炎症的作用。如下指定组织学切片的炎症评分：

+/-：最小/轻微的炎症

1：轻度炎症

2：中度

3：重度

通过病理学确定肉芽肿的存在。将来自注射位点的组织切片、染色并在光学显微镜下观察肉芽肿的存在或缺少。

体内大鼠模型可接受的规则是：(1)与rhuMAb CDl1a(阴性对照)相当的炎症，和(2)在注射位点缺少肉芽肿。

实施例4：表面活性剂和其他添加剂减少2H7聚集的能力

表面活性剂常用于延迟大分子的聚集。使用实施例2所述的体外模型评估表面活性剂减少2H7的聚集和絮凝的能力。所测试的表面活性剂覆盖了亲水-亲脂平衡的范围(HLB)。相对于原始的2H7配方，加入聚山梨醇酯20、伯洛沙姆和Span 20与80表面活性剂不显著地改善2H7释放。使用聚山梨醇酯80观察到体外2H7释放的中度改善，但使用所测试的任何其他表面活性剂都没有观察到2H7释放的显著改善(见表4)。然而，在所有情况下都观察到了透析袋内的絮凝(表4)。因而，表面活性剂虽然传统的用于降低蛋白质聚集，但没有表现出有效的延迟体外模型中的2H7聚集。

表4

还评估了添加右旋糖(多糖)、PEG 4000(聚合物)、精氨酸(氨基酸)和γ环糊精对延迟聚集和絮凝的影响，结果总结在表5至7中。用任意这类添加剂都没有观察到任何显著的改善。

表5

表6

表7

测试材料+2H7	释放的蛋白质％(T＝48hr)	透析袋内的絮凝
			原始2H7(对照)	13	有
5％γ环糊精	20	有
			10％γ环糊精	2	有
rhuMAb CDl1a(对照)	76	无

实施例5环糊精对2H7聚集的影响

在体外模型中测试了环糊精对2H7聚集的影响。使用的材料是：

·磺丁醚β环糊精，钠盐、Cydex，Inc.，Captisol Research Grade

·羟丙基-γ环糊精，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.，Trappsol Pharmaceutical Grade

·羟丙基-β环糊精，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.，Trappsol Pharmaceutical Grade。

用2％至9％磺丁醚(SBE)和5％至20％羟丙基γ(HP-γ)环糊精进行初步研究。相对于原始的2H7配方对照(图3，表3)，添加SBE(图4)和HP-γ(图5)环糊精都显著改善100mg/mL 2H7的体外释放。在透析袋中观察到含SBE的配方较少的絮凝，但袋外的溶液随着蛋白质释放到其中变成日益加深的乳白色。HP-γ配方更有效的降低聚集。在透析袋内仅有少量的絮凝，而袋外的溶液在整个研究规程中保持清澈。总而言之，加入环糊精帮助抑制了2H7在生理条件下的聚集。

基于这些有希望的结果，在体外透析模型中评估羟丙基β(HP-β)环糊精，确定不同取代基对2H7聚集行为的影响。评估了浓度范围为5％至20％的HP-β环糊精(图6)。相对于原始的2H7配方，释放的蛋白质百分比是提高的，但低于rhuMAb CDl1a对照。释放溶液随着蛋白质释放到其中变成乳白色，并且在37℃下孵育24小时后，透析袋内出现絮凝。添加HP-β环糊精有效降低了2H7的聚集，但性质上表现出不如HP-γ环糊精有效(图5)。

评估了HP-γ环糊精与精氨酸琥珀酸的组合，来确定是否对降低2H7的聚集存在附加效应。用100mg/mL 2H7测试了四种不同比例的精氨酸琥珀酸比HP-γ环糊精(图7)。相对于原始的2H7配方，在所有的测试组中观察到2H7释放的改善。相对于原始的2H7配方对照，在释放到溶液中以后，100mM精氨酸琥珀酸/10％HP-γ环糊精和50mM精氨酸琥珀酸/15％HP-γ环糊精配方具有最低的混浊度，以及在透析袋内较少的絮凝。

实施例6：环糊精对体内大鼠皮下模型中的炎症的作用

然后，在体内大鼠皮下模型中测试了在体外研究中表现出显著改善的含有HP-γ环糊精和HP-β环糊精的抗体配方。该项工作的目标是确定如果在体外生理条件下消除2H7的聚集，能否转变为注射位点炎症的降低。动物模型成功的规则是：(1)相对于rhuMAb CDl1a研究对照，测试配方中相当的低炎症，和(2)在注射位点没有肉芽肿。

表8中呈现了关于HP-β环糊精配方的组织病理学结果的总结。阴性对照rhuMAb CDl1a诱导最少的皮下炎症。将原始的150mg/mL 2H7配方用作阳性对照，获得注射位点处中度至重度(2-3+)的炎症。加入HP-β环糊精显著的降低了注射位点处的炎症。最适浓度的15或30％的HP-β环糊精与100mg/mL 2H7将注射位点处的炎症显著降低至轻度(1+)。增加环糊精的浓度导致用较高2H7蛋白质浓度观察到的增加的炎症的下降。添加30％的HP-β环糊精至更高浓度的2H7(150mg/mL)中，将观察到的炎症从中度至重度(2-3+)显著降低至轻度(1+)。较低浓度的HP-β环糊精(5％和15％)不具有相同的效果。

表8

炎症分级评分：

WNL＝在正常范围内

+/-＝最轻/轻微

1+＝轻度

2+＝中度

3+＝重度

表9中总结了关于HP-γ环糊精配方的组织病理学结果。当向2H7中加入10％的HP-γ环糊精时，观察到炎症从中度至重度(2-3+)向轻度至中度(＜2+)的降低。用HP-γ载体没有观察到任何显著的炎症应答。

表9

炎症分级评分：

WNL＝在正常范围内

+/-＝最轻/轻微

1+＝轻度

2+＝中度

3+＝重度

总结：总而言之，添加磺丁醚(SBE)、羟丙基β(HP-β)和羟丙基γ(HP-γ)环糊精都显著降低了在生理条件下的2H7的聚集，并降低了2H7絮凝。基于环糊精的历史用途，使用环糊精和2H7的结果是不可预知的，所述方法表现出新颖性和创造性。在我们的体外模型中也评估了常规用于降低蛋白质聚集的表面活性剂，但无一有效的延迟了2H7的聚集。还测试了聚合物(例如，葡聚糖)和氨基酸(例如，精氨酸)，但也未能显著的降低蛋白质聚集。

降低2H7在该环境中的聚集最终导致用2H7注射的动物的注射位点处炎症减少。对于包括HP-β或HP-γ环糊精的2H7配方而言，炎症从重度(原始的2H7)降低至轻度至中度。降低蛋白质在这类条件下聚集的能力可以潜在的转变为增加的生物利用率。最后，我们已成功的开发和证实利用体外透析模型测量赋形剂降低蛋白质聚集的能力。

参考文献

本申请中引用的参考文献，包括专利、公开的申请和其他出版物，都通过引用整合到本文中。

除非另外指出，本发明的实践可使用分子生物学等的常规技术，所述技术落入本领域技术人员的知识范围内。此类技术全面的解释在以下文献中，见例如：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)；Current Protocols in Molecular Biology(F.Ausubel等编著，1987更新)；Essential Molecular Biology(T.Brown编著，IRL Press1991)；Gene Expression Technology(Goeddel编著，Academic Press1991)；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A.Bothwell等编著，Bartlett Publ.1990)；Gene Transfer and Expression(M.Kriegler，Stockton Press 1990)；Recombinant DNA MethodologyII(R.Wu等编著，Academic Press 1995)；PCR：A Practical Approach(M.McPherson等人，IRL Press at Oxford University Press 1991)；Oligonucleotide Synthesis(M.Gait编著，1984)；Cell Culture forBiochemists(R.Adams编著，Elsevier Science Publishers 1990)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.Miller & M.Calos编著，1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler编著，1991)；AnimalCell Culture(J.Pollard等编著，Humana Press 1990)；Culture of AnimalCells，第2版(R.Freshney等编著，Alan R.Liss 1987)；Flow Cytometryand Sorting(M.Melamed等编著，Wiley-Liss 1990)；Methods inEnzymology系列(Academic Press，Inc.)；Wirth M.and Hauser H.(1993)；Immunochemistry in Practice，第3版，A.Johnstone & R.Thorpe，Blackwell Science，Cambridge，MA，1996；Techniques inImmunocytochemistry(G.Bullock & P.Petrusz编著，Academic Press1982，1983，1985，1989)；Handbook of Experimental Immunology(D.Weir & C.Blackwell编著)；Current Protocols in Immunology(J.Coligan等编著，1991)；Immunoassay(E.P.Diamandis & T.K.Christopoulos编著，Academic Press，Inc.，1996)；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版)Academic Press，New York；Ed Harlow and David Lane，Antibodies A laboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，1988；Antibody Engineering，第2版(C.Borrebaeck编著，OxfordUniversity Press，1995)；和Annual Review of Immunology系列；Advances in Immunology系列。

Claims

1.使皮下施用大分子的过程中注射位点处的炎症最小化的方法，包括向含有大分子的配方加入2％至30％的环糊精。

2.权利要求1的方法，其中所述环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。

3.权利要求2的方法，其中所述配方含有5％至30％的HP-β或HP-γ环糊精。

4.权利要求3的方法，其中所述配方含有5％至30％的HP-β环糊精。

5.权利要求3的方法，其中所述配方含有5％至20％的HP-γ环糊精。

6.权利要求5的方法，其中所述配方进一步包含50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。

7.权利要求2的方法，其中所述配方含有2％至9％的SBE环糊精。

8.权利要求1的方法，其中所述大分子是蛋白质。

9.权利要求8的方法，其中所述蛋白质是抗体。

10.权利要求9的方法，其中所述抗体是治疗性抗体。

11.权利要求9的方法，其中所述抗体是诊断性抗体。

12.权利要求9的方法，其中所述抗体是抗CD20抗体。

13.权利要求12的方法，其中所述抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。

14.权利要求12的方法，其中所述抗体包含选自SEQ ID NO：1-15的氨基酸序列。

15.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的轻链可变结构域和SEQ ID NO：2的重链可变结构域。

16.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变结构域和SEQ ID NO：4的重链可变结构域。

17.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变结构域和SEQ ID NO：5的重链可变结构域。

18.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：6的全长轻链和SEQ ID NO：7的全长重链。

19.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：6的全长轻链和SEQ ID NO：15的全长重链。

20.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：10的全长重链。

21.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：11的全长重链。

22.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：12的全长重链。

23.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：13的全长重链。

24.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：9的全长轻链和SEQ ID NO：14的全长重链。

25.用于皮下施用抗体的药物配方，包含浓度范围在10mg/ml至200mg/ml的抗体，和2％至30％的环糊精。

26.权利要求25的配方，其中环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。

27.权利要求26的配方，其中配方含有5％至30％的HP-β或HP-γ环糊精。

28.权利要求27的配方，其中所述配方含有5％至30％的HP-β环糊精。

29.权利要求27的配方，其中所述配方含有5％至20％的HP-γ环糊精。

30.权利要求29的配方，其中所述配方进一步包含50mM至200mM精氨酸琥珀酸。

31.权利要求26的配方，其中所述配方含有2％至9％的SBE环糊精。

32.权利要求25的配方，其中所述抗体存在的浓度范围在30mg/ml至150mg/ml。

33.权利要求25的配方，其中所述抗体存在的浓度范围在100mg/ml至150mg/ml。

34.权利要求27的配方，包含100mg/ml的人源化2H7抗体和15％至30％的HP-β环糊精。

35.权利要求27的配方，包含150mg/ml的人源化2H7抗体和30％的HP-β环糊精。

36.权利要求27的配方，包含150mg/ml的人源化2H7抗体和10％的HP-γ环糊精。

37.权利要求36的配方，其中所述配方进一步包含50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。

38.权利要求37的配方，其中所述人源化2H7抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。

39.权利要求37的配方，进一步包含30mM醋酸钠；5％二水合海藻糖；和0.03％聚山梨醇酯20，pH 5.3。

40.权利要求39的配方，其中所述人源化2H7抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。

41.权利要求27的配方，其中所述配方包含浓度范围在100mg/ml至150mg/ml的表1中所示的人源化2H7抗体变体A，15％-30％的HP-γ环糊精，和50mM至100mM精氨酸琥珀酸。

42.治疗CD20阳性B细胞癌的方法，包括向患癌症的患者施用治疗有效量的表1的人源化2H7抗体，所述抗体在包含2％至30％的环糊精的药物配方中，其中环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。

43.权利要求42的方法，其中CD20阳性B细胞癌是B细胞淋巴瘤或白血病。

44.权利要求43的方法，其中CD20阳性B细胞癌选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、复发性缓慢生长的NHL和利妥昔单抗-难愈性缓慢生长的NHL、淋巴细胞占主要的霍奇金氏病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

45.权利要求42的方法，其中人源化2H7抗体是表1的变体A、B、C、D或H。

46.治疗自身免疫病的方法，包括向患自身免疫病的患者施用治疗有效量的表1的人源化2H7抗体，所述抗体在包含2％至30％的环糊精的药物配方中，其中环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。

47.权利要求46的方法，其中自身免疫病选自类风湿关节炎(RA)和幼年类风湿关节炎，包括氨甲喋呤(Mtx)-不充分应答者和TNFα拮抗剂不充分应答者、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、多发性硬化(MS)包括复发缓解型多发性硬化(RRMS)、韦格纳氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、ANCA相关性脉管炎、糖尿病、Reynaud氏综合征、干燥综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。

48.权利要求46的方法，其中人源化2H7抗体是表1的变体A、B、C、D或H。

49.对注射在患者的注射位点后的含水的皮下配方中的抗体，改善或维持所述抗体在所述配方中的溶解，或最小化所述抗体在所述配方中沉淀的方法，包括向含水的皮下配方中添加2％至30％的环糊精，其中所述环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。

50.权利要求49的方法，其中抗体是表1所示的人源化抗CD20抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。

51.增加将皮下施用的抗体的生物利用率的方法，包括向包含抗体的含水的皮下配方中添加2％至30％的环糊精，其中所述环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。

52.权利要求51的方法，其中抗体是表1所示的人源化抗CD20抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。

53.用于评估在生理条件下，赋形剂降低抗体或其他大分子聚集的能力的体外透析方法，包括：

(a)在37℃和持续搅拌的条件下，针对修饰的PBS溶液(167mM钠、140mM氯化物、17mM磷酸、4mM钾)透析含或不含测试赋形剂的大分子配方；

(b)去除修饰的PBS溶液的测试样品；和

(c)测量测试样品的混浊度和存在的蛋白质的量，其中，相比缺少赋形剂的对照，在测定中含有测试赋形剂的样品中增加的蛋白质浓度和减少的混浊度是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。

54.权利要求53的方法，其中配方在具有1百万道尔顿的截留分子量的透析管中进行透析。

55.权利要求53的方法，其中使用UV分光光度计测量测试样品中的蛋白质浓度和混浊度。

56.权利要求53的方法，进一步包括目测修饰的PBS溶液和在透析管中的溶液的沉淀，其中，相比缺少赋形剂的对照，在含有测试赋形剂的透析管中减少的沉淀是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。