FI107515B - Menetelmä antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi - Google Patents

Description

107515

Menetelmä antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön aihepiiri

Keksintö koskee vasta-ainevasteen kohdeantigeenille tehostamista sisällyttämällä antigeeni liposomiin lisära-kenneosan ohella, joka sisältää ainakin yhden T-avustajai-musolutunnistuskeskuksen. Tarkemmin keksintö koskee mene-10 telmää antigeenin liposomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi, joka oleellisesti koostuu lipidistä, N-2(2,4-dinitrofenyyli)-E-aminokaproyylifosfatidyylietanoli-amiinikohdeantigeenistä, ja ainakin yhdestä avustajapepti-distä, jossa on ainakin yksi T-avustajasolutunnistuskes-15 kus, jolloin avustajasolutunnistuskeskus on liposomissa tai liposommilla, kohdeantigeeni ja avustajapeptidi eivät ole sidottu toisiinsa ja avustajapeptidi on influenssaviruksen HA2-polypeptidialayksikkö.

2. Kuvaus liittyvästä teknologiasta 20 Rokoteantigeeni tuottaa immuniteetin tartunnalle indusoimalla organismin tuottamaan immuunivasteen. Antigeenien käyttökelpoisuus vaihtelee täten riippuen niiden indusoiman immuunivasteen voimakkuudesta. On olemassa vaihtelevassa määrin luontaisesti voimakkaita ja heikkoja ·; 25 antigeenejä. Lisäksi antigeenit voidaan luokitella ka- teenkorvasta ("T"-) riippuvaisiksi tai T-riippumattomiksi antigeeneiksi sen perusteella, kykenevätkö ne synnyttämään avustaja-aktiivisuutta T-soluista. Tämä T-soluaktiivisuus liittyy IgG- ja IgA-luokkien vasta-aineiden tuotantoon. T-30 riippumattomat antigeenit indusoivat IgM-vasta-aineiden *, tuotannon, mutta eivät indusoi B-soluja vaihtamaan IgG- tai IgA-vasta-aineiden synteesiin. IgM-luokan immunoglobu-liinien tuotanto on ohimenevä vaste laboratorioeläimissä ja ihmisissä kestäen vain muutamia kuukausia; kun taas 35 IgG- ja IgA-luokkien vasta-aineiden tuotanto tavallisesti 107515 2 jatkuu vuosia. T-riippuvaisen vasteen synnyttäminen jollekin nimenomaiselle antigeenille on tämän vuoksi edullista. Hiilihydraatti- tai polysakkaridipohjaiset antigeenit ovat T-riippumattornia antigeenejä ja niiden käyttökelpoisuus 5 rokotteina lapsissa on rajallinen. Samoin monet polypepti-dit, jotka edustavat vasta-ainetunnistuskeskuksia, ovat T-riippumattomia antigeenejä, jolloin ne ovat samoin kykenemättömiä muodostamaan rokotteelta toivottavia IgG- ja IgA-vasta-ainevasteita.

10 Tiedetään, että heikolle antigeenille voidaan syn nyttää voimakkaampi vasta-ainevaste konjugoimalla (kova-lenttisesti kiinnittämällä) antigeeni immuunivastetta tehostavaan avustajaproteiiniin. Esimerkiksi US-patenttijul-kaisussa nro 4 761 283 osoitettiin, että heikko immunogee-15 ninen vaste tietyille bakteerikapselipolymeereille tehostui konjugoimalla antigeeni bakteeriavustajaproteiiniin, joka sinänsä indusoi antigeenivasteen. Toksiinin, kuten esimerkiksi difteriatoksoidin käyttäminen avustajaproteii-nina on tavanomaista. Tällaisen myrkyllisen avustajapro-20 teiinin käyttö luo kuitenkin ongelman, koska avustajapro-teiinin luontainen myrkyllisyys voi rajoittaa antigeeni-avustajaproteiinikonjugaatin annostusta j'a siten rajoittaa sen tehokkuutta.

On samoin tavanomaista, että immuunivaste kohdean-·· 25 tigeenille tukahtuu organismin aiemman immunoinnin avus taj aproteiinille johdosta tämän luodessa epitooppitukah-dutusvaikutuksen. Kun isäntäorganismi on pohjustettu reagoimaan avustajaproteiiniin, organismi poistaa kohdeanti-geeni-avustajaproteiinikonjugaatin elimistöstä ennen kuin 30 organismi voi käynnistää immunologisen vasteen kohdeanti-geenille.

Nämä aiemmin käytetyt konjugaatit muodostetaan kytkemällä antigeeni kovalenttisesti kantaja-avustajaproteiiniin. Immuunivasteen tehostuksella on erityistä mer-35 kitystä T-riippumattomille antigeeneille, jotka voidaan 3 107515 konjugoida peptidiin, joka sisältää ainakin yhden T-avus-tajasolutunnistuskeskuksen, jolloin saadaan T-riippuvainen vaste T-riippumattomalle antigeenille. Tällä hetkellä käytettyjen kovalenttisesti kytkettyjen konjugaattien tehok-5 kuus on kuitenkin rajoitettu, mikä johtuu kovalenttisen sitomisprosessin asettamista rakenteellisista rajoituksista, eli konformaation muutoksista, siitä, ettei sitoutumiskohtia mahdollisesti voida lähestyä, sekä siitä, ettei rakenneosien suhteita voida vaihdella. Lisäksi näillä kon-10 jugaateilla voi ilmetä annosrajoituksia ja epitooppitukah-dutusvaikutus.

Liposomit ovat membraanin käsittäviä rakkuloita, joita muodostetaan dispergoimalla lipidejä vesiväliainee-seen. Menetelmät liposomien valmistamiseksi ovat alan am-15 mattilaisille hyvin tuttuja ja niistä ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, esimerkkejä mitkä tahansa seu-raavat patenttijulkaisut, jotka sisällytetään tähän viitteeksi: US-patenttijulkaisut nro 4 565 696 ja 4 235 871. Liposomeilla on useita in vivo -kantajalta vaadittuja 20 ominaisuuksia: alhainen myrkyllisyys, alhainen immunogee-nisyys ja biohajoavuus. On samoin osoitettu, että liposomit voivat tehostaa vasta-ainevastetta antigeeneille la-boratorioeläimissä. Antigeenit on joko pidätetty liposomin vesirakenneosiin tai ne liittyvät kaksikerrokseen. Esimer-25 kiksi US-patenttijulkaisussa nro 4 565 696 kuvataan menetelmää immunogeenien kytkemiseksi kovalenttisesti liposomin pintakaksikerrokseen ja immuunivasteen tehostamiseksi täten.

Keksinnön yhteenveto 30 Esillä oleva keksintö koskee tehostetun antigeeni- • vasteen tuottamista kohdeantigeenille sisällyttämällä an tigeeni liposomivalmisteeseen ainakin yhden avustajapep-tidin, kuten avustajapeptidin, joka sisältää ainakin yhden T-solutunnistuskeskuksen, ohella. Esillä olevaa keksintöä 35 voidaan käyttää tehostetun antigeenivasteen syn- 4 107515 nyttämiseksi mille tahansa antigeenille mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, polysakkaridit, kuten Hemophilus influenza-. Meningococci-. Pneumococci- ja Streptococci-laiit, ja peptidit, kuten hepatiitti-B-pinta-5 proteiinit, HIV-pintaproteiinit, influenssavirusproteii- nit, parainfluenssaviruspeptidit tai hemagglutiniini, hengitysteihin liittyvät synkytiaaliset viruspintaglyko-proteiinit ja kolerapintaglykoproteiinit.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle antigeenin li-10 posomaalisen immunogeenisen kantajan valmistamiseksi, joka oleellisesti koostuu liposomeja muodostavasta lipidistä, N-2(2,4 -dinitrofenyyli)-E-aminokaproyylifosfatidyy-lietanoliamiinikohdeantigeenistä, ja ainakin yhdestä avusta japeptidistä, jossa on ainakin yksi T-avustajasolutun-15 nistuskeskus, jolloin avustasolutunnistuskeskus on li- posomissa tai liposomilla, kohdeantigeeni ja avustajapep-tidi eivät ole sidottu toisiinsa ja avustajapeptidi on influenssaviruksen HA2-polypeptidialayksikkö, on tunnusomaista se, että kohdeantigeeni ja avustajapeptidi si-20 säilytetään liposomeihin.

Kohdeantigeeni (jolle tehostunutta immunogeenistä vastetta toivotaan) voi olla sisällytetty liposomirakkulaan kiinnittämällä antigeeni yhteen laajasta valikoimasta lipidimateriaaleja, jotka sisältävät aktiivisen funktio-··' 25 naalisuuden. Näitä lipidimateriaaleja ovat fosfatidyyli- eetterit tai fosfatidyyliesterit (esim. fosfatidyyli-etanoliamiini ja fosfatidyylikoliini), glyseridit, kereb-rosidit, gangliosidit, sfingomyeliinit ja steroidit (esim. kolesteroli) jne. US-patenttijulkaisussa nro 4 565 696 ja 30 US-patenttijulkaisussa nro 4 235 871 julkistetaan muita lipidimateriaaleja käytettäviksi liposomien valmistuk- sessa.

Vaihtoehtoisesti kohdeantigeeni voidaan sisällyttää liposomirakkulaan hydrofobisten voimien välityksellä, jos 35 antigeeni käsittää lipofiilisen ryhmän, katso US-patentti- 5 107515 julkaisu nro 4 448 765, tai antigeeniin voidaan kiinnittää hydrofobinen ryhmä.

Avustajapeptidin sisällyttäminen voi myös tapahtua käyttäen joko kovalenttisia tai hydrofobisia vuorovaiku-5 tuksia. Esimerkiksi influenssaviruksen hemagglutiniini (HA) -proteiini koostuu kahdesta polypeptidiketjusta (HAi ja HA2) . HA2-polypeptidiketju sisältää sekvenssin hydrofobisia aminohappoja, joka sijaitsee lähellä polypeptidin karboksyylipäätä ja sisältää ainakin yhden T-avustajaso-10 lutunnistuskeskuksen. Täten HA2-polypeptidiketju voidaan sisällyttää liposomeihin membraanin lävistävän hydrofobisen alueen kautta. US-patenttijulkaisussa nro 4 448 765 kuvataan influenssavirusalayksiköiden sisällyttämistä liposomeihin ja se sisällytetään tähän viitteeksi. Hydrofo-15 binen rakenneosa voidaan vaihtoehtoisesti lisätä avusta-japeptidiin liittymisen liposomimembrääniin helpottamiseksi, tai avustajapeptidi voidaan kiinnittää kovalentti-sesti suoraan lipidimateriaaleihin, jotka sisältävät aktiivisen funktionaalisuuden.

20 Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetulla kantajalla on useita etuja aiemmin käytettyihin antigeeni-kantajakonjugaatteihin nähden, kuten esimerkiksi julkistetaan US-patenttijulkaisussa nro 4 761 283. Kovalenttisesti sidotuissa konjugaateissa muu-·.· 25 tokset kantajaproteiinin konformaatiossa sekä muutokset antigeenin konformaatiossa ovat mahdollisia kovalenttisen sidoksen johdosta. Tämä haitta voidaan voittaa esillä olevassa keksinnössä, jossa kohdeantigeeni ja avustajapeptidi liitetään liposomiin. Esillä olevan keksinnön mu-30 kaisella menetelmällä valmistettu kantaja välttää alan ' · tekniseen tasoon liittyvät myrkyllisyys- ja epitooppitu- « kahdutusvaikutukset. Esillä olevassa keksinnössä käytetään • ei-myrkyllisiä lipidejä ja sitä käytetään edullisesti eristettyjen, ei-myrkyllisten T-avustajakeskuksen sisältä-35 vien peptidien kanssa.

6 107515

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kantaja on samoin edullinen aiemmin käytettyihin konjugaatteihin nähden, koska se sallii modifikaatiot antigeenitiheydessä, kohdeantigeenin suhteessa avustaja-5 peptidiin sekä useamman kuin yhden T-avustajasolutunnis-tuskeskuksen käsittävän avustajapeptidin sisällytyksen. Nämä tekijät voivat vaikuttaa kohdeantigeenia vastaan tuotettujen spesifisten vasta-aineiden määriin. Näitä tekijöitä ei helposti kontrolloida konjugaatteja syntetisoi-10 taessa, koska kyseisten kahden rakenneosan on oltava kova-lenttisesti sidottuja, mikä luo fysikaalisia rajoituksia niiden tekijöiden lukumäärään ja tyyppiin nähden, jotka voidaan liittää yhteen säilyttäen samalla pääsy tunnistus-keskuksiin. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaisella 15 menetelmällä valmistettu kantaja on edullinen konjugaat-teihin nähden, koska antigeenin sisällytyksen liposomiin on osoitettu tehostavan vasta-ainetuotantoa. Täten esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu kantaja käyttää liposomien tätä ominaisuutta vasta-aineiden 20 tuotannon tietylle antigeenille ja etenkin heikoille antigeeneille, jotka eivät aikaansaisi riittävää vasta-ainetuotantoa, edelleen tehostamiseksi.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut liposomirakkulat antavat käyttöön uuden lähestymistavan ·· 25 synteettisten rokotteiden suunnitteluun. Monilukuinen mää rä kohdeantigeenin ja avustajapeptidin tai -peptidien kopioita voidaan sisällyttää mukaan nopeassa ja helpossa menetelmässä. Sen lisäksi, että lähestymistavalla saadaan tehokas ja tehostunut immunointi kohdeantigeenille, se 30 mahdollistaa antigeenien ja avustajapeptidien helpon tes- • · • tauksen. Esimerkiksi keksinnön mukaisella menetelmällä ♦ annetaan käyttöön yksinkertainen väline erilaisten T-avus-tajapeptidien kyvyn tehostaa immunogeenistä vastetta tietylle antigeenille vertailemiseksi. Täten keksinnön mukai- 7 107515 sella menetelmällä annetaan samoin käyttöön käyttökelpoinen väline immuunivasteen mekanismin tutkimiseksi.

Muita ja seuraavia suoritusmuotoja, piirteitä ja etuja ilmenee seuraavasta, keksinnön tällä hetkellä edul-5 lisen suoritusmuodon kuvauksesta.

Yksityiskohtainen kuvaus edullisesta suoritusmuodosta

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavaa rokotekoostumusta voidaan käyttää immuunivasteen mille talo hansa kohdeantigeenille ja edullisimmin T-riippumattomille antigeeneille tehostamiseksi. Esillä olevasta keksinnöstä ja keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun kantajan sovelluksista esitetään esimerkki viitaten DNP-CapPE:hen, jota on runsaasti tutkittu T-riippumattomana antigeeninä.

15 Alan ammattilaiselle olisi kuitenkin ilmeistä, että esillä olevaa keksintöä voidaan soveltaa mihin tahansa antigeeniin. Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa syntetisoidaan synteettinen rokote, joka indusoi T-riippuvaisen immunologisen vasteen T-riippumattomalle an-20 tigeenille. Kohdeantigeeni sisällytetään liposomivalmis teeseen avustajapeptidin tai -peptidien ohella, joka sisältää/ jotka sisältävät T-solutunnistuskeskuksen. Mitä tahansa T-solutunnistuskeskuksen sisältävää peptidiä voidaan käyttää avustajapeptidinä, esimerkiksi natiiveja tai ·· 25 myrkyttömäksi tehtyjä peptidejä sellaisista toksoideista, kuten influenssa-, tetanus-, difteria-, Pseudomonas-. Staphylococcus-. Streptococcus-. pertussis- ia Escherichia coli -lajit. Sen määrittämiseksi, sisältääkö ehdokaspepti-di T-solutunnistuskeskuksen, voidaan suorittaa yksinker-30 täinen testi. Peptidi sisällytetään liposomivalmisteeseen * \ antigeenin, kuten DNP-CapPE:n, ohella, joka sisältää vain B-soluepitoopin. Jos isäntäorganismissa ilmenee IgG-vaste saadulle liposomivalmisteelle, peptidissä on T-solutunnis-tuskeskus, ja se voi toimia esillä olevan keksinnön mu-35 kaisena avustajapeptidinä.

8 107515

Influenssahemagglutiniiniproteiinin HA2-alayksikköä käytettiin edullisesti avustajapeptidinä, koska se on hyvin määritelty ja siinä tiedetään olevan ainakin yksi T-avustajasolutunnistuskeskus mutta ei B-solutunnistus-5 keskusta. Täten tämä peptidi aikaansaa T-riippuvaisen immunologisen vasteen konjugoidulle antigeenille, mutta se ei indusoi vasta-ainevastetta itseään vastaan. Tämä rajoitus ei ole edellytys keksinnön mukaisesti valmistetun kantajan toiminnalle; mitä tahansa B-solutunnistuskeskuk-10 sen sisältävää avustajapeptidiä voidaan myös käyttää, jos immunologista vastetta avustajapeptidille toivotaan ja jos se voidaan hyväksyä vasteen kohdeantigeenille lisäksi. Edullista kuitenkin on, että avustajapeptidi on puhdas T-avustajasoluepitooppi. Samoin mitä tahansa T-sytotoksinen-15 imusolutunnistuskeskuksen sisältävää avustajapeptidiä voi daan myös käyttää, jos sytotoksista vastetta toivotaan tai jos se voidaan hyväksyä vasteen kohdeantigeenille lisäksi.

HA2-alayksikkö on lisäksi tarkoituksenmukainen avustajapeptidinä, koska se käsittää hydrofobisen amino-20 happosekvenssin lähellä karboksyylipäätä, joka normaalisti jatkuu viruksen lipidikuoren läpi. Tämä membraanin lävistävä alue helpottaa liittymistä liposomien lipidikaksiker-roksiin ja HA2 liittyy kvantitatiivisesti liposomi-rakkuloihin. Kuten aiemmin mainittiin, vaihtoehtoiset me-25 netelmät avustajapeptidin sisällyttämiseksi ovat samoin mahdollisia, kuten esimerkiksi peptidin kiinnitys kova-lenttisesti lipidiin, tai hydrofobisen aminohapposekvenssin kiinnitys peptidin yhteen päähän. Alan ammattilaiselle olisi ilmeistä, että erilaiset menetelmät avustajapeptidin 30 sisällyttämiseksi liposomiin ovat mahdollisia.

t < • DNP-CapPE valittiin kohdeantigeeniksi, koska sitä on tutkittu runsaasti ja se on T-riippumaton antigeeni. Täten seuraavissa kokeissa T-riippuvainen vaste DNP-CapPErlle syntyy avustajapeptidin vaikutuksesta. Esillä 35 olevan keksinnön mukaisesti valmistettavaa liposomivalmis- 9 107515 tetta voidaan käyttää yksilön immuunivasteen lisäämiseksi. Ilmaisun "yksilö" tarkoitetaan kattavan minkä tahansa eläimen, edullisesti nisäkkään, joka edullisimmin on koira, kissa, lehmä, hevonen tai ihminen.

5 Esimerkki 1 - Liposomien valmistus

Laajaa valikoimaa lipidimateriaaleja voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, fosfatidyy-lieetterit tai fosfatidyyliesterit (esim. fosfatidyylieta-10 noliamiini ja fosfatidyylikoliini), glyseridit, kerebro-sidit, gangliosidit, sfingomyeliinit ja steroidit (esim. kolesteroli). Seuraava on esimerkki valmistuksesta, jossa käytetään fosfatidyylikoliinia, vaikka alan ammattilainen huomaisikin, että voitaisiin käyttää mitä tahansa liposo-15 mivalmistustekniikkaa, joka mahdollistaa kohdeantigeenin ja avustajaproteiinin tai -proteiinien sisällytyksen. Ennen liposomin valmistusta voi olla välttämätöntä kiinnittää kohdeantigeeni ja/tai avustajapeptidi kovalenttisesti yhteen lipidirakenneosaan yhden hyvin tunnetuista menetel-20 mistä mukaan sisällytyksen helpottamiseksi. Liposomien valmistamiseksi käytettiin fosfatidyylikoliinia (PC) (Avantin polaariset lipidit, Pelham, AL), joka oli puhdistettu kananmunankeltuaisesta (EYPC). EYPC:tä lisättiin pyöreäpohjaiseen kolviin haluttu määrä ja kloroformi .. 25 poistettiin pyöröhaihduttimessa (Buchi 461) . Kuivattua li- pidikalvoa uudelleenlietettiin steriiliin veteen tai fos-faattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) riittäviä määriä 10 mM EYPC-liuoksen saamiseksi. Kun DNP-CapPE-antigeeni sisällytettiin liposomeihin, N-2-(2,4-dinitrofenyyli-E-30 aminokaproyylifosfatidyylietanoliamiinia (DNP-CapPE) li- ' ’· sättiin EYPC:n kloroformiliuokseen. Lipidikalvoon lisät- * tiin myös puhdistettua HA2-alayksikköä (joka saatiin Doris - Bucherilta, Mt. Sinia, NY), joka oli saatu A/USSR-90/77-

HiN-L-viruksen hemagglutiniinista (HA) , liposomeihin sisäl-35 lytettäväksi. Liposomit muodostettiin sitten joko liettä- 10 107515 mällä lipidiseos steriiliin PBSrään tai liuottamalla lipi-diseos n-oktyyliglukosidiin (5 % w/v PBS:ssä), mitä seurasi 16 tunnin dialyysi PBS:ää vastaan. DNP-CapPE:n ja HA2:n määriä, jotka sisällytettiin yksittäisiin liposomivalmis-5 teisiin, vaihdeltiin kokeen tarpeiden täyttämiseksi.

Esimerkki 2 - Liposomin karakterisointi HA2:n liittymisen liposomirakenteisiin määrittämiseksi käytettiin 125I-HA2:ta. DNP-CapPE:n sisällytyksen li-posomeihin määrittämiseksi näyte-eriä (10 μΐ) alkuperää-10 sestä lietteestä liuotettiin 990 ^l:aan metanolia ja luettiin absorbanssi 360 nm.-n aallonpituudella spektrofo-tometrillä. HA2:n liittymisprosentti valmisteissa rekonsti-tuoinnin PBS:ään ja dialyysin jälkeen ei muuttunut merkittävästi HA2-määrien vaihdellessa ja oli yli 90 %. DNP- 15 CapPErn liittymisprosentti valmisteessa oli enemmän kuin 95 % kaikissa valmisteissa. DNP:n vapautumista ei havaittu ruiskeiden välillä. DNP-CapPE pysyi liittyneenä liposomirakenteisiin .

Esimerkki 3 - Immunoinnin menettelyjärjestely 20 Käytettiin 6-8 viikon ikäisiä naaraspuolisia ul- kokasvatettuja albiino-IRC-hiiriä (Timco, Houston, Tx) . Eläimistä otettiin verta häntälaskimosta, minkä jälkeen niille annettiin 0,1 ml lumelääkettä (PBS), verrokkilipo-someja (ei HA2:ta tai hapteenia) tai liposomeja, jotka 25 sisälsivät ilmoitetut määrät hapteenia ja/tai HA2-peptidiä. 3-4 viikkoa myöhemmin hiiristä otettiin verta häntälaskimosta ja niille annettiin tehosterokote samaa valmistetta ja sama määrä kuin alkuperäinen rokote. 9-14 päivää myöhemmin eläimistä otettiin jälleen verta häntälaskimos-30 ta. Hiirille annettiin mahdollisesti 3. rokote 8 viikon • kuluttua viimeisestä ruiskeesta ja niistä otettiin verta 2 viikkoa myöhemmin. Kaikki rokotukset annettiin lihaksensisäisesti (i.m,) takakäpäliin. Hiiriä pidettiin muovihä-keissä (4 eläintä häkkiä kohden), joissa oli välisuodatti-35 met, ja niille annettiin ruokaa ja vettä ad libitum. See- 11 107515 rumi erotettiin sentrifugoimalla 2 000 x g:ssä 5 minuutin ajan 4 °C:ssa ja varastoitiin -20 °C-.seen testaukseen asti. Kaikista seeruminäytteistä kustakin kokeesta määritettiin vasta-ainetuotanto yhdessä testissä.

5 Esimerkki 4 - Antidinitrofenyyli (DNP) -seerumivas- ta-ainetestit

Antigeenin testaamiseksi käytettiin dinitrofenyloi-tua nautaseerumialbumiinia (DNP-BSA). Verrokkiantigeenina käytettiin BSArta, josta ei ollut muodostettu johdannais-10 ta. DNP-BSA valmistettiin lisäämällä dinitrofluoribentsee-niä BSA-liuokseen moolisuhteessa 10:1; trietanoliamiinia lisättiin, kunnes päästiin pH:hon 9 - 9,5. 16 tunnin in-kuboinnin 20 °C:ssa jälkeen sitoutumatta jäänyt DNP poistettiin dialysoimalla PBS:ää vastaan. Alustavissa kokeissa 15 määritettiin, että BSA, josta oli muodostettu johdannainen tässä moolisuhteessa, totesi seerumivasta-aineen tehokkaammin kuin proteiini, joka sisälsi korkeampia tai alhaisempia moolisuhteita DNP:tä. Seerumin vasta-ainetasot määritettiin sekä ELISA- että SPIRA-menettelyillä.

20 ELISA

Immulon I -levyjä (Dynatech, Detroit, MI) päällystettiin DNP-BSA:11a (10 μg kuoppaa kohden) 0,05 M karbo- naattipuskurissa (pH 9,6), verrokkikuopat päällystettiin 10 μg:lla kuoppaa kohden BSA:ta. 16 tunnin 4 °C:ssa ku-*.· 25 luttua levyt päällystettiin toistamiseen 5-%:isella (v/v) FCS-liuoksella PBS:ssä. Tämän ja kunkin muun inkuboinnin jälkeen levyt pestiin PBS:llä, joka sisälsi 1 %:n FCS:ää ja 0,2 % Tween 20 -valmistetta. Seerumista valmistettiin kaksinkertaisia sarjalaimennoksia rinnakkaismäärityksin 30 lähtien suhteesta 1:100 PBS:ään, joka sisälsi 1 %:n • * ·· * * BSA:ta, ja 0,1 ml:n näytteitä kustakin laimennoksesta li- sättiin antigeeni- ja verrokkikuoppiin. Inkuboitiin 5 tunnin ajan 20 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin vuohivasta-aineita, jotka olivat spesifisiä hiiren IgG:n raskaalle 35 ketjulle, alkaliseen fosfataasiin konjugoituina (Fc-spesi- 12 107515 finen, Cappel Lab, West Chester, PA) , tai vuohen antihiiri-IgG-alaluokkia pitoisuutena, jonka oli alustavissa kokeissa määritetty ylittävän vasta-aineen optimaaliseen toteamiseen tarvittavan pitoisuuden. IgG-alaluok-5 kien kyseessä ollen lisättiin sitten alkaliseen fosfataa-siin konjugoituja sikavasta-aineita, jotka olivat spesifisiä vuohi-IgG:lie. p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml) 10-%:isessa dietanoliamiinipuskurissa, pH 9,8, lisättiin (0,1 ml/kuoppa). Optiset tiheydet 410 nm:ssä luettiin puo-10 Ien tunnin kuluttua Dynatech MR 600 -spektrofotometrillä. Vasta-ainetiitterit ilmaistaan korkeimpana seerumilaimen-noksena, josta saatiin optinen tiheys, joka ylitti ver-rokkikuopat 0,2:11a.

SPIRA

15 DNP-vasta-ainetasojen määritykset SPIRA:11a suori tettiin, kuten kuvattiin ELISA-määr.itykselle, tehden kaksi modifikaatiota. Käytettiin joustavia polyvinyylikloridi-mikrotiitterilevyjä ja 125I-leimattua af f initeettipuhdis-tettua (raskasketjuspesifistä) kaniinin antihiiri-IgG:tä 20 käytettiin DNP-antigeeniin sitoutuneen hiirivasta-aineen toteamiseksi. Vasta-ainetiitterit laskettiin, kuten kuvattiin aiemmin, ja leimattujen kaniinin äntihiirivasta-ai-neiden spesifisyys määritettiin tavanomaisilla ristiviiva-testeillä käyttäen hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, .. 25 jotka ovat spesifisiä influenssaviruksen HA2:lle, kuten on kuvattu.

Vasta-ainetiitterien vertailut tehtiin Mann-Witney-testin mukaan, kun 2 ryhmää hiiriä sisältyi yhteen kokeeseen. Kun vertailut useamman kuin kahden ryhmän välillä 30 olivat kyseessä, käytettiin Krusdall-Wallisin menetelmää.

Esimerkki 5 - DNP-CapPE:tä ja/tai HA2-alayksikön sisältävien liposomien immunogeenisyys

Ryhmiin ulkokasvatettuja hiiriä ruiskutettiin kahdesti 4 viikon välein EYPC-liposomien valmisteita (750 35 /ig) , tai EYPC-liposomeja, jotka sisälsivät HA2:ta (3,7 μg) , 13 107515 DNP-CapPE:tä (30 μg) tai molempia (taulukko 1). IgG- ja IgM-vasteet analysoitiin epäsuoralla ELISA:11a ja ne ilmaistaan vasta-ainetiitterien keskiarvona. Lipidin ja DNP:n ja HA2:n välinen moolisuhde oli 6 000:200:1. ELISA-5 lukemat osoittivat, että kumpikin DNP-CapPE:tä (HA2:n kanssa tai ilman sitä) sisältävä valmiste tuotti IgM-vas-teen seitsemässä seitsemästä hiirestä. Kuitenkin, kun tit-rattiin anti-DNP-IgG-seerumivasta-aineita, tulokset alenivat näyttävästi liposomi-DNP-ryhmässä, jolloin saatiin 10 verrokkiryhmiin nähden samankaltaisia tiittereitä, kun taas DNP/HA2-liposomeilla immunoidut hiiret indusoivat merkittävästi korkeampia tasoja seerumispesifistä anti-DPN-IgG:tä.

15 Taulukko 1

Liposomi- IgG- Vastetuot- IgM- Vastetuot- koostumus tiitteri tajasuhde tiitteri tajasuhde PBS 210 ± 55 3/7 119 + 21 3/7

Liposomi, tyhjä 313 ± 145 3/7 290 + 85 3/7 20 HA2 205 + 65 3/7 384 + 190 3/7 DNP 188 + 73 3/7 1312 + 791 3/7 DNP-CapPE/HAa 1974 ± 925 3/7 1490 + 506 3/7 Tämän muutoksen immunoglobuliiniluokissa voidaan katsoa johtuvan yksinomaan HA2:n ja DNP:n liitosta samoissa 25 liposomirakenteissa, koska IgG-anti-DNP-vasta-aineita ei muodostunut lainkaan, kun hiiret immunoitiin joko seoksella, jossa oli HA2:ta ja DNP-CapPE:tä vesiliuoksessa, tai DNP-CapPE-liposomeilla ja HA2-liposomeilla, jotka ruiskutettiin yhdessä (taulukko 2). Molemmat rakenneosat tarvi-30 taan yhdessä samassa liposomissa IgG-anti-DNP-vasta-ainei- * .. den tuotannon stimuloimiseksi.

14 107515

Taulukko 2

Liposomikoostumus IgG- Vastetuot- IgM- Vastetuot- DNP-CaoPE HAo tiitteri tajasuhde tiitteri tajasuhde lOug lpg 333 + 143 6/6 344 + 134 5/6 5 10pg 3pg 391 + 124 6/6 300 + 165 6/6 lOug 9pg 766 ± 298 6/6 336 + 117 6/6 30pg lpg 358 + 165 6/6 364 + 145 5/6 30pg 3pg 1241 + 336 6/6 396 + 119 6/6 30pg 9pg 2100 + 1127 6/6 1038 + 445 6/6 10 10pg DNP-BSA 2245 + 898 6/6 0 0/6 10pg DNP-CapPE ja 0 0/6 155 + 63 2/6 HA2 vesiliuoksessa 10pg* + lpg* O 0/6 ** 15 3pg* 0 0/6 ** 9pg* 0 0/6 ** * DNP-CapPE ja HA2 sisällytettiin erillisiin lipo-someihin ja annettiin yhdessä.

20 ** Koetta ei suoritettu.

Esimerkki 6 - Annosvasteet liposomaaliseen DNP:hen j a HA2:een Tässä kokeessa tutkittiin 3 immunointiryhmää.

'·' 25 Tiettyä DNP-CapPE-määrää (5, 10, 3 0 ^g/ruiske) kohden vaihtelevia määriä HA2:ta (1, 3 tai 9 μg) sisällytettiin myös EYPC:stä (750 ^g/ruiske) koostuviin liposomival-misteisiin. Eläimistä otettiin verta yksi päivä ennen identtistä tehosteruisketta ja 9 päivän kuluttua siitä.

30 Seerumeista analysoitiin anti-DNP-IgG ja -IgM ELISA-mää-rityksellä. Lisäksi kaksi hiiriryhmää immunoitiin joko 10 μg:lla DNP-BSA:ta, tai DNP-CapPE:llä ja HA2:lla, jotka 011 sekoitettu yhteen vesiliuoksessa.

Analysoitaessa IgM-ELISA-arvoja (taulukko 2) tilas-35 tollisesti ne kaksi ryhmää, jotka edustivat 5 μg ja 10 μg 15 107515 DNP-CapPE:tä, eivät osoittaneet merkitseviä eroja HA2-mää-rän kasvaessa, minkä vuoksi tuloksia 5 μg:n DNP-CapPE-ryhmälle ei esitetä. Kuitenkin merkitsevä ero havaittiin im-munoitaessa hiiret liposomeilla, jotka sisälsivät 30 μg 5 DNP-CapPE:tä ja 1, 3 tai 9 μg HA2:ta, jolloin korkeampi suhde antoi korkeamman IgM-tiitterin. Mitään IgM-vastetta ei havaittu, kun hiiret immunoitiin 10 ^g:lla DNP-BSA:ta, ja vain kaksi kuudesta hiirestä antoi IgM-vasteen ryhmässä, joka immunoitiin DNP-CapPE:llä ja HA2:lla vesiliuok-10 sessa.

Analysoitaessa ELISA-arvoja (taulukko 2) tilastollisesti vasteet tietylle määrälle HA2:ta (1, 3 tai 9 μg) ja kasvavalle määrälle DNP-CapPE:tä (5, 10 tai 30 μg) osoittivat merkitseviä eroja, mikä osoitti annos-vaste-15 vaikutuksen sekä DNP:lle että HA2:lle. Tämä puolestaan osoittaa, että tehostunut IgG-tuotanto johtuu sekä kohde-antigeenin että avustajapeptidin esiintymisestä samassa liposomissa. Hiiret, jotka oli immunoitu DNP-BSA:lla, antoivat IgG-vasteen, jota voitiin verrata ryhmään, joka oli 20 immunoitu korkeimmilla annoksilla HA2:ta ja DNP:tä testa tuissa liposomeissa. IgG-vastetta ei todettu hiirille, jotka oli immunoitu DNP/HA2:lla vesiliuoksessa.

Esimerkki 7 - DNP-CapPE-liposomien 3. ruiskutuksen vaikutus vasta-ainevasteeseen hiirissä, jotka on aiemmin ** 25 immunoitu DNP/HAz-liposomeilla

Muistivasteen DNP-kohdeantigeenia vastaan ilmaantumisen määrittämiseksi immunoitaessa hiiret aiemmin DNP-CapPE/HA2-liposomeilla 7 hiiren ryhmään ruiskutettiin 3. kerralla liposomeja, jotka sisälsivät vain DNP-CapPE :tä 30 (ja antoivat siten käyttöön vain B-solukeskukset). Tämä • .. koe osoittaa, että muistivaste muodostuu vain, kun DNP-

CapPE ja HA2 esiintyvät yhdessä alkuperäisessä liposomi-- valmisteessa. Se osoittaa niinikään, että esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu kantaja tuottaa bona fide 35 kateenkorvasta riippuvaisen immunologisen vasteen ja koh- 16 107515 deantigeenille immunologisen muistin, joka voi tuottaa IgG-vasta-aineita vasteena kohdeantigeenille, ilman että T-solutunnistuSkeskuksen tarvitsee enää olla läsnä.

Kuten esitettiin aiemmin, hiiret, jotka oli immu-5 noitu DNP-CapPE/HA2-liposomeilla, muodostivat IgG-anti-DNP- vasteen. Kun samoihin hiiriin ruiskutettiin sitten 3. kerralla liposomeja, jotka sisälsivät vain DNP-CapPE:tä (ryhmä 1) , SPIRA-lukemat kasvoivat näyttävästi verrattuina ensimmäisiin tai toisiin verenottöihin, mikä osoitti spe-10 sifisten B-solujen restimulaation korkeammalla tasolla, kuin minkä tuotti ensimmäinen immunointi. Hiiret, jotka immunoitiin HA2-liposomeilla ja joita sitten restimuloitiin DNP-CapPE-liposomeilla (ryhmä 3), eivät tuottaneet mitään todettavaa anti-DNP-IgG-vasta-ainetiitteriä. Hiiret, joi-15 hin ruiskutettiin DNP-CapPE/HA2-liposome ja kerran (ryhmä 2) , antoivat primaarisen immunoinnin anti-DNP-IgG-vasta-aineiden tason. Verrokkiryhmä (ryhmä 4), johon ruiskutettiin tyhjiä EYPC-liposomeja, ei osoittanut anti-DNP-IgG-vasta-ainetuotantoa.

2 0 Taulukko 3

Vastetuot-

Ryhmä nro Verenotto nro Tiitteri tajasuhde 1 1 1974 ± 975 7/7 2 817 ± 270 7/7 25 3 4071 ± 1058 7/7 2 1 158 ± 28 3/7 3 288 ± 75 3/7 3 0 - 0 4 0 - 0 30 .. Esimerkki 8 - Ulkomembraani-HA2 verrattuna sisäiseen HA2:een immuunivasteessa

Neljä ryhmää ulkokasvatettuja hiiriä immunoitiin EYPC-liposomeilla, jotka koostuivat 30 μg:sta DNP-CapPE:tä 35 ja vaihtelevista määristä HA2:ta (3, 1, 0,5 ja 0 μg). Li- 17 107515 saksi ryhmä hiiriä immunoitiin DNP-CapPE/HA2-liposomeilla (30 ja vastaavasti 3 μg), kun liposomeja oli aiemmin käsi-* telty bromelaiinilla (100 μg/τnl) . Bromelaiinikäsittely lohkoo pintaproteiineja jättäen vain membraaniin työnty-5 neen jatkeen ja ehyttä sisäistettyä HA2:ta. Analysoitaessa ELISA-tiitteriä tilastollisesti havaittiin jälleen annos-vastevaikutus HA2-määrän kasvaessa; taulukko 4. Niinkin vähän kuin 0,5 μg HA2:ta DNP-CapPE-liposomeissa ruisketta kohden riitti indusoimaan IgG-vasteen, joka poikkesi ti-10 lastollisesti DNP-CapPE-liposomeista. Tilastollista eroa, kun hiiret immunoitiin bromelaiinilla käsitellyillä lipo-someilla, ei kuitenkaan havaittu verrattuna vasteeseen, joka saatiin samoille ei-käsitellyille liposomeille. Nämä tulokset osoittavat, että liposomien ulkoista HA2:ta ei 15 tarvittu ja että liposomeja on prosessoitava, jotta toteutettaisiin B- ja T-soluepitooppien yhteinen esittäminen immunologisesti kykeneville soluille.

Taulukko 4

Liposomikoostumus IgG- Vastetuot- 20 Ryhmä nro DNP-CapPE HAj tiitteri tajasuhde 1 30 μg 3 μg 944 ± 291 7/7 2 30 μg 1 μg 471 ± 97 7/7 3 30 μg 0,5 μg 438 ± 121 7/7 4 30 μg 0 198 ± 88 2/7 25 5 Ryhmä 1 liposomien 808 ±315 7/7 bromelaiinikäsittelyn j älkeen

Esimerkki 9 - IgG-immunoglobuliinialaluokkien ja-30 kauma immuunivasteen aikana * .. ELISA-lukemia analysoitaessa IgGl-vasta-aine oli vallitseva alaluokka.

. Ulkokasvatettujen hiirten IgGl-vaste DNP:lle oli samanlainen alhaisille DNP-CapPE-annoksilie (taulukko 1) 35 eri HA2-pitoisuuksilla. Korkeammalle DNP-CapPE-pitoisuu- 18 107515 delle (30 μg) havaittiin annos-vastevaikutus kasvaville HA2-määrille. Liposomivalmiste, jossa oli EYPC:tä, DNP-CapPE:tä ja HA2:ta 750, 30 ja vastaavasti 9 ^g, antoi IgGl-vasteen, joka oli verrattavissa hiiriryhmään, joka immu-5 noitiin 10 ^g:lla DNP-BSA:ta, tyypillinen hapteenikantaja-systeemi.

Merkittäviä eroja ei havaittu IgG2a- ja IgG2b-vas-ta-aineiden alaluokilla (taulukko 5). Ainoat ryhmät, joille IgG2a- tai IgG2b-vasta-aineita ei voitu todeta, olivat 10 hiiriryhmät, jotka oli immunoitu EYPC-liposomeilla, jotka sisälsivät 1 μg HA2:ta ja 10 μg DNP-CapPE:tä (IgG2a ja IgG2b) ja 3 μg HA2:ta ja 10 μg DNP-CapPE:tä (IgG2b) . Korkeammalle DNP-CapPE- tai HA2-annokselle ei havaittu merkittäviä eroja vasteissa. Vasteet olivat verrattavissa vas-15 teisiin, kun hiiret immunoitiin DNP-BSA:11a.

Merkittäviä eroja ei havaittu IgG3-vasta-aineala-luokalla. Kullekin ryhmälle tiitteri todettiin ja ainakin neljä kuudesta immunoidusta hiirestä tuotti vasteen (taulukko 5). Kuitenkin vain kaksi 10 μg:lla DNP-BSA:ta immu-20 noitua hiirtä tuotti vasteen nostaen tiitterin merkittävästi alemmas kuin liposomivalmisteilla immunoiduissa hii-riryhmissä.

• % 19 107515

Taulukko 5

Liposomikoostumus IaG^ IoG.^

Vastetuot- Vastetuot- DWP-CapPE HA. tajasuhde Tiitteri ta jasuhde Tiitteri 5 lOyg lyg 3/6 180 ± 70 0/6 lOyg 3yg 4/6 222 ± 79 4/6 190 ± 50 lOyg 9yg 6/6 255 ± 52 6/6 241 ± 78 30pg lpg 4/6 275 ± 102 4/6 326 ± 92 10 3Oyg 3yg 6/6 370 + 186 6/6 366 ± 126 30yg 9yg 6/6 803 ± 402 6/6 371 ± 77 10yg DNP-BSA 6/6 941 + 578 6/6 258 + 85 10yg DNP-CapPE 0/6 0/6 ^ 3ug HA2 , vesiliuos

Liposomikoostumus isG2b lg£3

Vastetuot- Vastetuot- DNP-CapPE HA2 tajasuhde Tiitteri tajasuhde Tiitteri 20 lOyg lyg 0/6 180 ± 70 4/6 177 + 20 10yg 3yg 0/6 4/6 217 ± 93 lOyg 9pg 5/6 308 ± 21 5/6 280 ± 96 30yg lyg 2/6 223 ± 104 5/6 280 ± 105 25 30yg 3yg 5/6 250 ± 141 6/6 333 + 110 30yg 9yg 6/6 275 ± 91 6/6 376 ± 71 10pg DNP-BSA 5/6 302 ± 98 2/6 190 + 28 lOyg DNP-CapPE 0/6 0/6 3 g 3yg HAj, vesiliuos *· .. Kun keksintö nyt on täysin kuvattu, alan keskimää- räisellekin taitajalle on ilmeistä, että siihen voidaan tehdä muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta keksinnön tässä esitetyn mukaisesta hengestä tai kattavuudesta.

Claims (7)

107515

1. Menetelmä antigeenin liposomaalisen immunogee-nisen kantajan valmistamiseksi, joka oleellisesti koostuu 5 liposomeja muodostavasta lipidistä, N-2(2,4-dinitro-fenyyli)-E-aminokaproyylifosfatidyylietanoliamiini-kohde-antigeenistä, ja ainakin yhdestä avustajapeptidistä, jossa on ainakin yksi T-avustajasolutunnistuskeskus, jolloin avustajasolutunnistuskeskus on liposomissa tai liposomil-10 la, kohdeantigeeni ja avustajapeptidi eivät ole sidottu toisiinsa ja avustajapeptidi on influenssaviruksen HA2-polypeptidialayksikkö, tunnettu siitä, että kohdeantigeeni ja avustajapeptidi sisällytetään liposomeihin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että lipidi valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fosfatidyylieetteri, fosfatidyyliesteri, kerebrosidi, gangliosidi, sfingomyeliini ja niiden seokset .

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että fosfatidyyliesterit valitaan ryhmästä, jonka muodostavat fosfatidyylietanoliamiini ja fosfatidyylikoliini. ... 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että avustajapeptidi liitetään 25 hydrofobisten vuorovaikutusten avulla liposomin sisälle.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että avustajapeptidi liitetään ko-valenttisella sidoksella liposomeja muodostavaan lipidiin ·· liposomin sisälle.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan liposomaalinen immunogeeninen kantaja, joka sisältää noin yhden HA2-molekyylin 120 000 lipidimolekyyliä kohti.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että lipidi on kolesteroli. 107515