NO311167B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogenb¶rer for antigener - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en liposomal immunogenbærer for antigener.

Et vaksineantigen gir immunitet overfor infeksjoner ved å bevirke at organismen produserer en immunrespons.

Antigener er derfor av varierende nytte avhengig av styrken av immunoresponsen de gir. Det finnes varierende grader av sterke og svake antigener. I tillegg kan antigener bli klassifisert som tymisk ("T")-avhengig eller T-uavhengig antigener basert på om de er istand til å utløse hjelpeakti-vitet til T-celler. Denne T-celleaktiviteten er forbundet med produksjonen av antistoffer av IgG- og IgA-klassene. T-uavhengig antigener bevirker produksjonen av IgM-antistoffer , men bevirker ikke B-cellene skiftet til syntesen av IgG-eller IgA-antistoffer. Produksjonen av immunoglobuliner i IgM-klassen, er en forbigående respons i laboratoriedyr og mennesker, og varer kun noen få måneder, mens produksjonen av antistoffer i IgG- og IgA-klassene vanligvis varer i flere år. Det er derfor fordelaktig å bevirke en T-avhengig respons for et bestemt antigen. Karbohydrat eller polysakkaridbaserte antigener, er T-uavhengige antigener, og har en begrenset utnyttelse som vaksiner for barn. Tilsvarende er mange polypeptider som representerer antistoff-gjenkjenningsseter, T-uavhengige antigener, og er derfor likeledes ikke istand til å generere IgG og IgA antiresponsene som er ønsket for en vaksine.

Det er kjent at en sterkere antistoffrespons kan bli utløst overfor et svakt antigen ved å konjugere (kovalent bindende) antigenet til et hjelpeprotein som forsterker immunresponsen. For eksempel er det vist i US-PS 4.761.283 at den svake immunogeniske responsen overfor visse bakterielle kapsulaere polymerer ble øket ved konjugering av antigenet til et bakterielt hjelpeprotein som i seg selv gir en antigenrespons. Det er vanlig å benytte et toksin som hjelpeproteinet, slik som for eksempel difteritoksoid. Anvendelse av et slikt toksisk hjelpeprotein skaper riktignok et problem, fordi den reelle toksisiteten til hjelpeproteinet kan begrense doseringen av antigen-hjelpeproteinkonjugatet, og derfor begrense dets effektivitet.

Det er også vanlig at immunresponsen overfor målantigenet blir undertrykket på grunn av tidligere immunisering av organismen overfor hjelpeproteinet som danner en epitopundertrykkende effekt. Når vertsorganismen på forhånd er forberedt på å reagere mot hjelpeproteinet, vil organismen rense kroppen for målantigen-hjelpeproteinkonjugatet før organismen kan starte en immunologisk respons overfor målantigenet.

Disse tidligere konjugatene er dannet ved kovalent binding av antigenet til bærer-hjelpeproteinet. Immunresponsøkningen er spesielt viktig for T-uavhengig antigener, som kan, konjugeres til et peptid som inneholder minst ett T-hjelpe-cellegjen-kjenningssete, og derved fremkalle en T-avhengig respons overfor et T-uavhengig antigen. De nå benyttede kovalent bundede konjugatene, er riktignok begrenset i sin effektivitet, på grunn av de strukturelle begrensningene som er gitt ved den kovalente bindingsprosessen, dvs. endringer i konformasjonen, mulig utilgjengelighet til bindingsseter, og manglende mulighet for å variere forholdene av disse komponentene. I tillegg kommer at disse konjugatene kan utvise dosebegrensninger og en epitopundertrykkende effekt.

Liposomer er membranvesikler som er dannet ved dispersjon av lipider i vandig medium. Fremgangsmåter for fremstilling av liposomer er velkjent for fagmannen og er eksemplifisert, men ikke begrenset til, et hvilket som helst av de følgende patentene som herved innlemmes som referanse: US-PS 4.565.696 og 4.235.871. Liposomer innehar flere egenskaper som er nødvendige for en in vivo-bærer: Lav toksisitet, lav immunogenitet og biodegraderbarhet. Det er også blitt vist at liposomer kan styrke antistoffresponsen overfor antigener i laboratoriedyr. Antigenene er enten innkapslet i de vandige delene i liposomene, eller forbundet med bilaget. For eksempel beskriver US-PS 4.565.696 en fremgangsmåte for kovalent binding av immunogener til overflatebilaget i liposomene, og styrker derved immunresponsen.

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer for antigener, kjennetegnet ved at den omfatter et liposomdannende lipid, et DNP-CapPE-målantigen og minst ett hjelpepeptid som har minst ett T-hjelpecelle-gjenkjenningssete, der nevnte T-hjelpecelle-gjenkjenningssete er i eller på liposomet, nevnte antigen og hjelpepeptid er ikke bundet til hverandre og nevnte hjelpepeptid er HAg-polypeptidsubenhet fra influensavirus.

Foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for å reise en forsterket antigenrespons overfor et hvilket som helst antigen inkludert, men ikke begrenset til, polysakkarider slik som Hemophilus influenza, Meningococci, Pneumococci og Streptococci og peptider slik som hepatitis B overflateproteiner, HIV overflateproteiner, influensavirusproteiner, parainfluensa-viruspeptider eller hemagglutinin, respira-torisk syncytial virusoverflate-glykoproteiner og kolera-overflate-glykoproteiner.

Målantigenet (overfor hvilket den økede immunresponsen er ønsket) kan bli innlemmet i den liposomale vesikelen ved å binde antigenet til én av flere 1ipidmaterialer som inneholder en aktiv funksjonalitet. Disse lipidmaterialene omfatter fosfatidyletere eller fosfatidylestere (f.eks. fosfatidyletanolamin og fosfatidylcholin), glyserider, serebrosider, gangliosider, sfingomyeliner og steroider (f.eks. kolesterol), osv. US-PS 4.565.696 og US-PS 4.235.871, beskriver ytterligere lipidmaterialer for anvendelse i fremstillingen av liposomer.

Alternativt kan målantigenet bli innlemmet i den liposomale vesikelen via hydrofobe krefter, dersom angtigenet bærer en lipofil gruppe, se US-PS 4.448.765, eller en hydrofob gruppe kan bli bundet til antigenet.

Innlemming av hjelpepeptidet kan også skje ved bruk av enten kovalente eller hydrofobe interaksjoner. For eksempel er hemagglutinin (HA)-protein fra influensavirus, sammensatt av to polypeptidkjeder (HA^, og HA2)• HA2-polypeptidkjeden inneholder en sekvens av hydrofobe aminosyrer som er lokalisert nær karboksyterminalen av polypeptidet og inneholder minst ett T-hjelpecelle-gjenkjenningssete. HA2-polypeptidkjeden kan således bli innlemmet i liposomer via den transmembrane hydrofobe regionen. US-PS 4.448.765, beskriver innlemmingen av influensavirus-subenheter i liposomer, og er tatt med her som referanse. Den hydrofobe komponenten kan alternativt bli tilsatt hjelpepeptidet for å muliggjøre forbindingen med liposommembranen, eller hjelpepeptidet kan bli kovalent bundet direkte til 1ipidmaterialer som inneholder en aktiv funksjonalitet.

Foreliggende oppfinnelse har flere fordeler overfor tidligere benyttede antigenbærerkonjugater, som for eksempel beskrevet i US-PS 4.761.283. I de kovalent bundede konjugatene, er forandringer i bærerproteinkonformasjonen så vel som forandringer i antigenkonformasjonen, mulige på grunn av den kovalente bindingen. Denne ulempen kan overvinnes ved foreliggende oppfinnelse, hvor målantigenet og hjelpepeptidet er forbundet med et liposom. Foreliggende oppfinnelse overvinner også toksisiteten og epitopundertrykkingseffekten som er forbundet ved den kjente teknikken. Foreliggende oppfinnelse benytter ikke-toksiske lipider, og er fortrinnsvis benyttet med isolerte, ikke-toksiske T-hjelpesete inneholdende peptider.

Foreliggende oppfinnelse er også fordelaktig i forhold til tidligere benyttede konjugater, fordi den tillater modifika-sjoner i antigentettheten, forholdet av målantigen til hjelpepeptid og innlemmelsen av mer enn ett T-hjelpecelle-gjenkjenningssetebaerende hjelpepeptid. Disse faktorene kan påvirke mengdene av spesifikke antistoffer som blir produsert overfor målantigene. Disse faktorene er ikke enkle å kontrollere når konjugatene blir syntetisert, fordi de to komponentene må være kovalent bundet, og skaper derved fysiske begrensninger også til det antall og typene av faktorene som kan bli forbundet sammen samtidig som tilgangen til gjenkjenningssetene opprettholdes. I tillegg er foreliggende oppfinnelse fordelaktig overfor konjugatene, fordi innlemmelsen av et antigen i et liposom har blitt vist å øke antistoffproduksjonen. Foreliggende oppfinnelse benytter således denne egenskapen til liposomer for ytterligere å øke produksjonen av antistoffer overfor et gitt antigen, og spesielt overfor svake antigener som ikke ville forårsake tilstrekkelig antistoffproduksjon.

Fremgangsmåten for fremstilling av de liposomale vesiklene ifølge oppfinnelsen, gir en ny tilnærming for utformingen av syntetiske vaksiner. Flere kopier av målantigenet og hjelpepeptidet eller peptidene, kan bli innlemmet i en hurtig og enkel metode. I tillegg til å gi effektiv og øket immunisering overfor målantigenet, tillater tilnærmingen enkel testing av antigener og hjelpepeptider. For eksempel, i foreliggende oppfinnelse en enkel bærer for sammenligning av evnen til forskjellige T-hjelpepeptider å øke den immunogeniske responsen overfor et gitt antigen. Således gir foreliggende oppfinnelse også en nyttig bærer for testing av mekanismen i immunresponsen.

Andre og ytterligere utførelser, egenskaper og fordeler, vil bli tydelige fra den følgende beskrivelsen av den foretrukne utførelsesformen av oppfinnelsen.

Vaksinesammensetningen kan bli benyttet for å styrke immunresponsen overfor et hvilket som helst antigen, og er mest foretrukket for T-uavhengig antigener. Foreliggende oppfinnelse blir eksemplifisert med referanse til DNP-CapPE som er blitt grundig studert som et T-uavhengig antigen. Det skulle imidlertid være klart for fagmannen at foreliggende oppfinnelse kan anvendes for et hvilket som helst antigen. Det blir syntetisert en syntetisk vaksine som induserer en T-avhengig immunologisk respons overfor et T-uavhengig antigen. Målantigenet blir innlemmet i et liposompreparat sammen med et hjelpeptid, eller et peptid som inneholder et T-celle-gjenkjenningssete . Et hvilket som helst peptid som inneholder et T-celle gjenkjenningssete, kan bli benyttet som hjelpepeptidet, for eksempel native elleer detoksifiserte peptider av toksoider slik som influenza, tetanus, diphteria pseudomas, staphylococcus, streptococcus, pertussis og Escherichia Coli. En enkelt test kan bli utført for å bestemme om et aktuelt peptid inneholder et T-celle-gjenkjenningssete. Peptidet ble innlemmet i et liposomalt preparat sammen med et antigen slik som DNP-CapPE, som inneholder kun en B-celle-epitop. Dersom det er en IgG-respons overfor det resulterende liposomale preparatet hos vertsorganismen, har peptidet et T-celle-gjenkjenningssete, og kan tjene som et hjelpeptid i foreliggende oppfinnelse.

HÅ2-subenheten på influensa-hemagglutininproteinet blir fortrinnsvis benyttet som hjelpepeptid, på grunn av at det er vel definert og er kjent å ha minst et T-hjelpecelle-gjenkjenningssete, men ikke noe B-celle-gjenkjenningssete. Dette peptidet forårsaker således en T-avhengig immunologisk respons til et konjugert antigen, men induserer ikke en antistoffrespons mot seg selv. Denne begrensningen er ikke nødvendig for funksjonen av oppfinnelsen. Et hvilken som helst hjelpepeptid som inneholder et B-celle-gjenkjenningssete kan også bli benyttet, dersom det er ønskelig eller akseptabelt med en immunologisk respons overfor hjelpepeptidet i tillegg til en respons overfor målantigenet. Det er riktignok foretrukket at hjelpepeptidet skal være en ren T-hjelpecelle-epitope. Et hvilket som helst hjelpepeptid som inneholder et T-cytotoksisk lymfocytt-gjenkjenningssete, vil likeledes også bli benyttet dersom en cytotoksisk respons er ønskelig eller akseptabel i tillegg til responsen overfor målantigenet.

HÅ2 subenheten passer videre som et hjelpepeptid, fordi den bærer en hydrofob sekvens av aminosyrer nær karboksyterminalen, normalt gjennom lipidkappen til viruset. Denne transmem-branregionen sørger for forbindelsen med lipid-dobbeltlaget til liposomene, og HAg blir kvantitativt forbundet med de liposomale vesiklene. Som diskutert over, er alternative metoder for innlemming av hjelpepeptidet også mulig, slik som for eksempel kovalent binding av peptidet til et lipid, eller festing av en hydrofob sekvens av aminosyrer til en av endene til peptidet. Det skulle også være klart for fagmannen at det også er mulig med forskjellige metoder for innlemming av hjelpepeptidet i liposomet.

DNP-CapPE ble valgt som målantigen fordi det er blitt grundig studert, og er et T-uavhengig antigen. I de følgende eksperimentene oppstår en T-avhengig respons overfor DNP-CapPE av påvirkningen av hjelpepeptidet. Det liposomale preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for å øke immunresponsen i et individ. Uttrykket "individ" er ment å omfatte et hvilket som helst dyr, fortrinnsvis et pattedyr, eller helst en hund, katt, ku, hest eller menneske.

EKSEMPEL 1 - Fremstilling av liposomer.

Stor variasjon av lipidmaterialer kan bli benyttet for utførelsen av foreliggende oppfinnelse inkludert, men ikke begrenset til, fosfatidyletere eller fosfatidylestere (f.eks. fosfatidyletanolamin og fosfatidylcholin), glyserider, cerebrosider, gangliosider, sfingomyeliner og steroider (f.eks. kolesterol). Følgende er et eksempel for fremstilling ved bruk av fosfatidylcholin, selv om fagmannen vil forstå at en hvilket som helst liposomal fremstillingsteknikk som tillater innlemmingen av målantigenet og hjelpeproteinet eller proteinene, kan oli benyttet. Før fremstillingen av liposomene, kan det være nødvendig å kovalent binde målantigenet og/eller hjelpepetidet til en av 1ipidkomponentene i overensstemmelse med en av de velkjente metodene, for å muliggjøre innlemmelsen.

Fosfatidylcholin (PC) (Avanti polar lipids, Pelham, AL) renset fra eggeplomme (EYPC), ble benyttet for å fremstille liposomene. EYPC ble tilsatt til en rundbundet flaske i den ønskede mengden og kloroform fjernet i en rotajsonsavdamper (Buchi 461). Den tørkede lipidfilmen ble resuspendert i sterilt vann og fosfatbuffret saltvannsoppløsning (PBS) ble tilsatt i mengder som var tilstrekkelige for å gi en 10 mM oppløsning av EYPC. Når DNP-CapPE antigenet ble innlemmet i liposomene, ble N-2(2,4-dinitrofenyl E-aminokaproylfos-fatidyletanolamin (DNP-CapPE) tilsatt til kloroformoppløs-ningen av EYPC. Renset HAg-subenhet (fremskaffet av Doris Bucher, Mt. Sinia, NY) avledet fra hemagglutinin (HA) av A/USRR-890/77 E1' N1 , ble også tilsatt til lipidfilmen for innlemmelse i liposomene. Liposomer ble så dannet enten ved suspenjonen av lipidblandingen i steril PBS eller oppløsning av lipidblandingen i n-oktylglukosid (5 volum-# i PBS) fulgt av dialyse mot PBS i 16 timer. Mengende av inkludert DNP-CapPE og HA.2 i individuelle liposompreparater, ble variert for å innfri eksperimentenes behov.

EKSEMPEL 2 - Liposomkarakterisering:

For å analysere forbindelsene av HA2 til 1iposomstrukturen, ble det benyttet I^<S>jjj^ -pil analyseinnlemmelsen av DNP-CapPE til liposomene, ble prøver (10 pl) av den opprinnelige suspensjonen oppløst i 990 pl metanol, og absorbansen ved en bølgelengde på 360 mM ble avlest på et spektrofotometer. Den prosentvise assosieringen av HA2 i preparatene, etter rekonstituering med PBS og dialyse, forandret seg ikke signifikant med varierende mengde av HA2, og var over 90$. Den prosentvise assosieringen av DNP-CapPE i fremstillingen, var større enn 95% for alle fremstillinger. Ingen frigiving av DNP ble observert mellom injeksjoner. DNP-CapPE forble forbundet med de liposomale strukturene.

EKSEMPEL 3 - Immuniseringsprotokoll

Avlede albino IRC-hunnmus (Timco, Houston, Tx) med en alder på fra 6 til 8 uker, ble benyttet. Dyrene ble årelatt fra nålevenen og så gitt 0,1 ml placebo (PBS), kontroll-liposomer (ikke noe HAg eller hapten) eller liposomer som inneholder de angitte mengdene av hapten og/eller RA^-peptid. Tre til fire uker senere ble musene årelatt fra halevenen, og gitt en forsterkende inokulasjon med det samme preparatet og den samme mengden som ved den opprinnelige inokulasjonen. 9 til 14 dager senere ble dyrene igjen årelatt fra halevenen. Til sist ble musene gitt en tredje inokulasjon åtte uker etter den siste injeksjonen, og de ble årelatt to uker senere. Alle inokulasjonene ble gitt intramuskulært (IM) i bakbenene. Musene ble holdt i plastikkbur (4 dyr pr. bur) med barriere-filtere og vann og mat ad libitum. Serum ble separert ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 min. ved 4°C, og lagret ved -20" C inntil de ble testet. Alle serumprøvene fra hvert eksperiment ble analysert for antistoffproduksjon i en eneste test.

EKSEMPEL 4 - Antidinitrofenvl ( DNP) serum- antistofftester. Dinitrofenylert bovint serumalbumin (DNP-BSA) ble benyttet for å teste antigenet. Ikke-derivatisert BSA ble benyttet som kontrollantigen. DNP-BSA ble fremstilt ved tilsetning av dinitrofluorbenzen til en oppløsning av BSA ved et molart forhold på 10:1; trietanolamin ble tilsatt til en pH på 9 til 9,5 ble nådd. Etter inkubering ved 20° C i 16 timer, ble DNP som ikke var bundet, fjernet ved dialyse mot PBS. Tidligere eksperimenter fastslo at BSA som var derivatisert ved dette molare forholdet, detekterte serum-antistoff mer effektivt enn protein som inneholdt høyere eller lavere molare forhold av DNP. Serum antistoff-nivået ble bestemt ved både ELISA og SPIRA-prosedyre.

ELISA: Immunlon I-plater (Dynatech, Detroit MI) ble belagt med DNP-BSA (10 pg pr. brønn) i 0,05 M karbonatbuf f er (pH 9,6), kontrollbrønner ble belagt med 10 pg BSA pr. brønn. Etter 16 timer ved 4°C, ble platene etterbelagt med 5$

(volum/volum) FCS i PBS. Etter denne og alle andre inkubasjo-ner, ble platene vasket med PBS som inneholdt 1% FCS og 0,2$ Tween 20. To-gangers seriefortynninger av serum, med et utgangspunkt på 1:100, ble fremstilt i PBS som inneholdt 1% BSA i duplikat, og 0,1 ml prøver av hver fortynning ble tilsatt til antigen og kontrollbønner. Etter inkubasjon i 5 timer ved 20°C, ble geite-antistoffer som var spesifikke for muse-IgG- tungkjedealkalisk fosfatasekonjugert, (Fc spsifikk, Cappel lab, West Chester, PA), eller geiteantimuse-IgG-subklasser tilsatt til en konsentrasjon som var bestemt i f orhåndseksper imenter å være i overskudd av hva som var nødvendig for optimal detektering av antistoff. I tilfellet IgG-subklasser, ble alkalisk fosfatasekonjugert svinean-tistoff som var spesifikk for geit IgG, tilsatt. P-nitro-fenylfosfat (1 mg/ml) i 10% dietanolaminbuf f er med pH 9,8, ble tilsatt (0,1 ml pr. brønn). Optisk tetthet ved 410 nm ble avlest en halv time sener i en Dynatech MR 600 spektrofotometer. Antistofftitere er uttrykt som det høyest fortynnede serum, som ga en optisk tetthet på 0,2 over kontrollbrønnene.

SPIRA: Angivelser av DNP-antistoffnivåer med SPIRA ble bestemt som beskrevet for ELISA-analysen med to modifikasjo-ner. Fleksible polyvinylklorid mikrotiterplater ble benyttet og <125>i-merkede affinitetsrensede (tungkjedespesifikke) kanin-anti-muse-IgG ble benyttet for å detektere muse-antistoff som var bundet til DNP-antigenet. Antistofftiterne ble beregnet som beskrevet ovenfor, og spesifisiteten til de merkede kanin-anti-muse-antistoffene ble bestemt ved standard kryss-skraverte tester ved bruk av muse-monoklonale antistoffer med spesifisitet overfor HAg fra influensavirus som beskrevet.

Sammenligninger av antistofftitere ble gjort ifølge Mann-Witney-testen, når to grupper mus var inkludert i et enkelt eksperiment. Når sammenligninger mellom mer enn to grupper var involvert, ble metodene ifølge Krusdall-Wallis benyttet.

EKSEMPEL 5 - Immunogenitet av liposomer som inneholder DNP-CapPE og/ eller HA2 subenheter.

Grupper av avlede mus ble injisert to ganger med 4 ukers mellomrom, med preparater av EYPC-1 iposomer (750 jjg) eller EYPC-liposomer som Inneholdt HA2 (3,7 jjg), DNP-CapPE (30 jig) eller begge deler (tabell 1). IgG- og IgM-responser ble analysert ved indirekte ELISA, og uttrykt ved hjelp av antistofftitere. Lipidet til DNP og HA2 molart forhold, var 6000:200:1. ELISA-målinger viste at begge preparatene som inneholder DNP-CapPE (med eller utent HA2), genererte en IgM-respons i 7 av 7 mus. Ved titrering av anti DNP IgG-seruman-tistoffene, var resultatene imidlertid dramatisk redusert i liposom DNP-gruppen, gitt tilsvarende titere på kontrollgrup-pene, mens musene som var immunisert med DNP/HA2-1iposomer, ga betraktelig høyere nivåer av serumspesifikk anti-DNP IgG. Disse skift i immunoglobulinklasser skyldes kun foreningen av HAg og DNP innen den samme liposomstrukturen, siden ingen IgG-anti-DNP-antistoffer ble generert ved immunisering av mus med hverken en blanding av HAg og DNP-CapPE i vandig oppløsning, eller DNP-CapPE-liposomer og HAg-1iposomer injisert sammen (tabell 2). Begge komponentene er nødvendig sammen i det samme liposomet for å stimulere produksjonen av IgG-anti-DNP-antistoffer.

EKSEMPEL 6 - Dose- responser overfor liposomal DNP og HAg

I dette eksperimentet ble tre immuniseringsgrupper studert. For en gitt mengde DNP-CapPE (5, 10, 30 pg pr. injeksjon) ble varierende mengder HAg (1, 3 eller 9 ug) også innlemmet i liposompreparater som var sammensatt av EYPC (750 pg/in-jeksjon). Dyr ble årelatt én dag før og ni dager etter en identisk forsterkningsinjeksjon. Sera ble analysert fra anti-DNP IgG og IgM ved ELISA-analyse. I tillegg ble to grupper mus immunisert med enten 10 ug DNP-BSA, eller DNP-CapPE og HAg, blandet sammen i en vandig oppløsning.

Når IgM ELISA-verdier (tabell 2) ble analysert statistisk, viste ikke de to gruppene som representerte 5 og 10 pg DNP-CapPE, noen signifikante forskjeller med økende mengder HAg, og derfor er resultatene til 5 ug DNP-CapPE-gruppen ikke vist. Signifikante forskjeller ble riktignok observert når mus ble immunisert med liposomer som inneholdt 30 pg DNP-CapPE, og 1, 3, eller 9 pg HAg, hvor høyere forhold ga høyere IgM-titer. Ingen IgM-respons ble observert når mus ble immunisert med 10 pg DNP-BSA, og kun 2 av 6 mus ga en IgM-respons i gruppen som ble immunisert med DNP-CapPE og HAg i vandig oppløsning.

Når IgG ELISA-verdier (tabell 2) ble analysert statistisk, viste responsene for en gitt mengde av HAg (1, 3 eller 9 pg) og økende mengder av DNP-CapPE (5, 10 eller 30 pg) signifikante forskjeller ved dannelsen av en dose responseffekt fra både DNP og HAg. Dette igjen viste at økningen av IgG-produksjonen skyldes nærvær av både målantigenet og hjelpepeptidet i det samme liposomet. Mus som blir immunisert med DNP-BSA, ga en IgG-respons som var sammenlignbar med gruppen som var immunisert med de høyeste dosene HAg og DNP i de testede liposomene. Ingen IgG-respons ble målt for mus som var immunisert med DNP/HAg i vandig oppløsning.

EKSEMPEL 7 - Effekt av en tred. ie in. ieks. jon av DNP- CapPE-liposomer på antistoffresponsen på mus som på forhånd var immunisert med DNP/ HAg- liposomer.

For å analysere forekomsten av en minnerespons mot DNP-målantigen når mus på forhånd var immunisert med DNP-CapPE/HAg-1 iposomer, ble en gruppe på syv mus injisert en tredje gang med liposomer som inneholdt kun DNP-CapPE (som således gir kun B-celle-seter). Dette eksperimentet viser at en minnerespons kun ble produsert når DNP-CapPE og HAg er tilstede sammen i det opprinnelige liposompreparatet. Det viser også at foreliggende oppfinnelse gir en riktig thymus-avhengig immunologisk respons og et immunologisk minne for målantigenet som kan produsere IgG-antistoff som respons på målantigenet uten et ytterligere behov for næva;ret av et T-celle-gjenkjenningssete.

Som vist tidligere, genererte mus som var immunisert med DNP-CapPE/HAg-liposomer en IgG-anti-DNP-respons. Når de samme musene ble injisert en tredje gang med lipsomer som inneholdt kun DNP-CapPE (gruppe 1), økte SPIRA-avlesningene drastisk øket sammenlignet med den første og andre prøven, noe som viser en restimulering av de spesifikke B-cellene på et høyere nivå enn det som ble produsert ved den første immuniseringen. Mus som var immunisert med HAg-1iposomer, og så restimulert med DNP-CapPE-liposomer (gruppe 3), produserte ikke noe detekterbart anti-DNP IgG-antistofftiter. Mus som var injisert med DNP-CapPE/HAg-1iposomer én gang (gruppe 2), ga nivået av anti-DNP IgG-antistoffer for en primær immunisering. En kontrollgruppe (gruppe 4), som var injisert med tomme EYPC-1iposomer, viste ingen anti-DNP IgG--antistof fpro-duksjon.

EKSEMPEL 8 - Ytre membran HAg mot intern HAg i immunresponsen .

Fire grupper avlede mus ble immunisert med EYPC-liposomer som var sammensatt av 30 jjg DNP-CapPE og forskjellige mengder HAg (3, 1, 0,5 og 0 ug). I tillegg ble en gruppe mus immunisert med DNP-CapPE/HAg-liposomer (hhv. 30 og 3 pg) etter tidligere behandling av liposomene med bromelain (100 ug/ml). Behandling med bromelain spalter overflateproteinene som etterlater kun den membraninnsatte halen og intakt internalisert HAg. Når ELISA-titer ble analysert statistisk, ble en dose responseffekt observert mot økende mengder HAg. Tabell 4. Så lite som 0,5 pg HAg i DNP-CapPE-1 iposomer pr. injeksjon var tilstrekkelig for å indusere en IgG-respons som var statistisk forskjellig fra DNP-CapPE-1iposomer. Ingen statistiske forskjeller ble derimot observert når mus ble immunisert med bromelainbehandlede liposomer sammenlignet med responsen som ble oppnådd for de samme ubehandlede liposomene. Disse resultatene indikerer at HAg på utsiden av liposomer ikke var nødvendig, og at liposomene må bli prosessert for å tilkjennegi den kombinerte tilstedeværelsen av B- og T-celle epitoper for de immunokompetente cellene. EKSEMPEL 9 - IgG immunoglobulin- inndel ing under immunresponsen .

Når ELISA-avlesningene ble analysert, var IgG-antistoff den fremtredende subklassen.

IgGl-responsen overfor DNP til avlede mus, var tilsvarende for lave doser av DNP-CapPE (tabell 1) ved forskjellige HAg-konsentrasjoner. For høyere konsentrasjoner av DNP-CapPE (30 pg), ble en dose responseffekt observert for økende mengder HAg. Et liposompreparat av EYPC, DNP-CapPE og HAg, på henholdsvis 750, 30 og 9 pg, ga en IgGl-respons som var sammenlignbar med gruppen av mus som ble immunisert med 10 pg DNP-BSA, et typisk haptenbærersystem.

Ingen signifikante forskjeller ble observert med IgG2a- og IgG2b-antistoffsubklasser (tabell 5). Den eneste gruppen hvor det ikke kunne bli detektert noe IgG2a- eller IgG2b-antistoff, var gruppene av mus som var immunisert med EYPC-1iposomer som inneholdt 1 pg HAg og 10 pg DNP-CapPE (IgG2a og IgG2b) og 3 pg HAg og 10 pg DNP-CapPE (IgG2b). For høyere doser av DNP-CapPE eller HAg, ble ingen signifikante forskjeller i responsen observert. Responsene var sammen-lignbare med disse når mus ble immunisert med DNP-BSA.

Ingen signifikante forskjeller ble observert med IgG3-antistoff-subklassen. For hver gruppe ble titer detektert, og minst 4 av de 6 musene som var immunisert, reagerte (tabell 5). Kun 2 mus som var immunisert med 10 pg DNP-BSA reagerte riktignok med økning av titer som var signifikant lavere enn gruppene av mus som var immunisert med liposompreparater.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer for antigener, karakterisert ved at den omfatter et liposomdannende lipid, et DNP-CapPE-mål-antigen og minst ett hjelpepeptid som har minst ett T-hjelpecelle-gjenkjenningssete, der nevnte T-hjelpecelle-gjenkjenningssete er i eller på liposomet, nevnte antigen og hjelpepeptid er ikke bundet til hverandre, og nevnte hjelpepeptid er HAg-polypeptidsubenhet fra influensavirus.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et lipid valgt fra gruppen bestående av en fosfatidyleter, fosfatidylester, glyserid, cerebrosid, gangliosid, spingomyelin, steroid eller blandinger derav.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte hjelpepeptid er assosiert med liposomet via hydrofobe intraksjoner.

4 . Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at hjelpepeptidet er assosiert med liposomet ved en kovalent kobling til et lipid.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at bæreren omfatter omtrent ett HA2-molekyl pr. 120.000 1ipidmolekyler.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at nevnte mål-antigen er et T-uavhengig antigen.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nevnte hjelpepeptid har et B-celle-gjenkjenningssete.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte fosfatidylestere er fosfatidyletanolamin og fosfatidylcholin.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av en liposomal immunogen bærer ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte steroid er kolesterol.