KR100213851B1 - 약한 백신 항원에 흉선 의존성 조력을 제공하는 리포좀 - Google Patents

약한 백신 항원에 흉선 의존성 조력을 제공하는 리포좀 Download PDF

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와일러 제임스 에프.
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Abstract

표적 항원에 대한 항체 반응은 항체를, 적어도 하나의 T-헬퍼 임파구 인지 부위를 함유하는 추가의 성분과 함께, 리포좀 내에 혼입시킴으로써 증강시킬 수 있다. 이 리포좀은 다양한 지질 물질을 포함할 수 있다. 항 및 T-헬퍼 임파구인지 부위를 함유하는 성분은 둘다 지질에 대한 소수성적 상호작용 또는 공유적 결합을 사용하여 리포좀과 결합해 있다.

Description

[발명의 명칭]
약한 백신 항원에 흉선 의존성 조력을 제공하는 리포좀
[발명의 상세한 설명]
[발명의 배경]
[발명의 분야]
본 발명은 리포좀내로 하나 이상의 T-헬퍼 임파구 인지 부위를 함유하는 추가의 성분과 함께 항원을 혼입시킴으로써 표적 항원에 대한 항체 반응을 증강시키는 것에 관한 것이다.
[관련기술의 설명]
백신 항원은 유기체가 면역 반응을 나타내도록 유도함으로써 감염에 대한 면역성을 부여한다. 따라서, 항원은 이들이 유도하는 면역 반응의 강도에 따라서 다양한 유용성을 갖는다. 다양한 등급의 선천적으로 강한 항원과 약한 항원이 있다. 또한, 항원은 이들이 T-세포로부터 헬퍼 활성을 도출시킬 수 있느냐의 여부에 따라서 흉선(T로 약칭) 의존성 또는 T-독립성 항원으로 분류할 수 있다. 이 T-세포 활성은 IgG 및 IgA 부류의 항체 생산과 관련되어 있다. T-독립성 항원은 IgM 항체의 생산은 유도하지만, B-세포가 IgG 또는 IgA 항체 합성을 스위칭하도록 유도하지는 않는다. IgM 부류의 면역글로불린 생산은 겨우 수개월만 지속되는 실험용 동물과 사람에서는 일시적인 반응인 반면, IgG 및 IgA 부류 항체의 생산은 일반적으로 수년간 지속된다. 따라서, 특정의 항원에 대해 T-의존성 반응을 도출시키는 것이 유리하다. 탄수화물 또는 다당류계 항원은 T-독립성 항원이고, 어린이에서 백신으로서 제한된 용도만을 갖는다. 유사하게, 항체 인지 부위를 나타내는 다수의 폴리펩티드도 T-독립성 항원이어서 백신에서 요구되는 IgG 및 IgA 항체 반응을 나타낼 수가 없다.
면역 반응을 증강시키는 헬퍼 단백질에 항원을 결합시킴(공유적으로 부착시킴)으로써 약한 항원에 대해 강한 항체 반응을 도출시킬 수 있음이 알려져 있다. 예를 들어, 미합중국 특허 제4,761,283호에서는 특정의 세균성 캡슐 중합체에 대한 약한 면역원성 반응이, 본래 항원 반응을 유도하는 세균성 헬퍼 단백질에 항원을 결합시킴으로써 증강됨을 보이고 있다. 헬퍼 단백질로서, 예를 들어 디프테리아 톡소이드(Diphtheria Toxoid)와 같은 독소를 사용하는 것이 일반적이다. 그러나, 이와 같은 독성 헬퍼 단백질의 사용은 헬퍼 단백질의 본래 독성이 항원-헬퍼 단백질 결합체의 투여를 제한하고 이의 효과를 한정하기 때문에 문제점을 야기시킨다.
또한, 표적 항원에 대한 면역 반응이 헬퍼 단백질에 대한 유기체의 선행 면역작용으로 인해 억제되어 에피토프 억제 효과를 나타낸다는 점은 일반적인 사실이다. 숙주 유기체가 헬퍼 단백질에 반응하도록 준비가 되면, 이 유기체가 표적 항원에 대한 면역학적 반응을 개시할 수 있기 전에 유기체는 표적 항원-헬퍼 단백질 결합을 제거할 것이다.
이러한 앞서 사용된 결합체들은 항원을 담체 헬퍼 단백질에 공유적으로 연결시킴으로써 형성시킨다. 면역 반응 증강은, 하나 이상의 T-헬퍼 세포 인지 부위를 함유하며 그에 따라 T-독립성 항원에 대해 T-의존성 반응을 수득함으로써 펩티드에 결합시킬 수 있는 T-독립성 항원의 경우에 특히 중요하다. 그러나, 현재 사용되는 공유적으로 연결된 결합체는 공유 결합 방법에 기인하는 구조적 제한, 다시 말해서 형태적 변형, 결합부위의 잠재적 비접근성 및 성분의 비율을 다양화할 수 없다는 점 등으로 인해 이들의 효용성에 제한이 있다. 또한, 이들 결합체는 투여 제한 및 에피토프 억제 효과를 나타낼 수도 있다.
리포좀은 수성 매질 중에서 지질의 분산에 의해 형성된 막성 포낭(membranous vesicle)이다. 이 리포좀 제법은 당해 분야의 숙련가에게는 널리 공지되어 있으나, 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조 : 미합중국 특허 제4,565,696 및 제 4,235,871호]에 예시되어 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다. 리포좀은 생체내 담체에 요구되는 여러 가지 특징을 갖고 있다 : 저독성, 저면역성 및 생분해성. 또한, 리포좀이 실험 동물체에서 항원에 대한 항체 반응을 증강시킬 수 있음이 입증되었다. 항원은 리포좀의 수성 구간내에 포획되어 있거나 이중층과 연결되어 있다. 예를 들어, 미합중국 특허 제4,565,696호는 면역원을 리포좀의 표면 이중층에 공유적으로 결합시키고 이에 의해 면역 반응을 유발시키는 방법을 기술하고 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 리포좀내로 하나 이상의 T-세포 인지 부위를 함유하는 헬퍼펩티드와 같은 하나 이상의 헬퍼 펩티드와 함께 항원을 혼입시켜 표적 항원에 대해 증강된 항원성 반응을 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 헤모필루스 인플루엔자, 메닝고코커스, 뉴모코커스 및 스트렙토코커스와 같은 다당류 및 B형 간염 표면 단백질, HIV 표면 단백질, 인플루엔자 바이러스 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 펩티드 또는 헤마글루티닌, 호흡기 합포체 바이러스 표면 당단백질 및 콜레라 표면 당단백질과 같은 펩티드를 포함하나 이로써 제한되지 않는 모든 항원에 대해 증가된 항원성 반응을 도출시키는데 사용할 수 있다.
표적 항원(이에 대해 증가된 면역원성 반응이 요구됨)은 활성 관능기를 함유하는 다양한 지질 물질 중의 하나에 항원을 부착시킴으로써 리포좀 포낭중에 혼입시킬 수 있다. 이런 지질 물질로는 포스파티딜 에테르 또는 포스파티딜 에스테르(예 : 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린), 글리세라이드, 세레브로사이드, 강글리오사이드, 스핑고마이엘린 및 스테로이드류(예 : 콜레스테롤) 등이 있다. 미합중국 특허 제4,565,696호 및 제4,235,871호는 리포좀 제조에 사용하기 위한 추가의 지질 물질을 기술하고 있다.
한편, 항원이 친유성 그룹을 포함하는 경우 표적 항원을 소수성력에 의해 리포점성 포낭에 혼입시키거나(참조 : 미합중국 특허 제4,448,765호), 소수성 그룹을 항원에 부착시킬 수 있다.
또한, 공유 또는 소수성 상호작용을 이용하면 헬퍼 펩티드의 혼입이 발생할 수도 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질은 두 개의 폴리펩티드 쇄(HA1및 HA2)로 구성되어 잇다. HA2폴리펩티드쇄는 폴리펩티드의 카복시-말단 근처에 위치한 소수성 아미노산 서열을 함유하고 있으며, 하나 이상의 T-헬퍼 세포 인지 부위를 포함한다. 그러므로, HA2폴리펩티드 쇄는 막투과 소수성 영역을 통해서 리포좀내로 혼입시킬 수가 있다. 미합중국 특허 제4,448,765호는 본원에서 참고로 인용되고 있으며, 리포좀내로 인플루엔자 바이러스 소단위의 혼입을 기술하고 있다. 달리는 리포좀성 막과의 결합을 촉진시키기 위해 소수성 성분을 헬퍼 펩티드에 가하거나, 또는 이 헬퍼 펩티드를 활성 관능기를 함유하는 지질 물질에 직접 공유적으로 부착시킬 수 있다.
본 발명은, 예를 들어, 미합중국 특허 제4,761,283호에 기술된, 앞서 사용된 항원-담체 결합체에 비해 훨씬 유리하다. 공유적으로 결합된 결합체에서는, 공유결합에 기인한 항원 형태에서의 변화뿐만 아니라, 담체 단백질의 형태 변화가 가능하다. 이러한 단점을 표적 항원 및 헬퍼 펩티드가 리포점과 결합되어 있는 본 발명에서 극복될 수 있다. 본 발명은 선행 기술과 관련된 독성 및 에피토프 억제 효과를 극복한다. 본 발명은 무독성 지질을 사용하며, 바람직하게는 분리된 무독성 T-헬퍼 부위를 함유하는 펩티드와 함께 사용한다.
또한, 본 발명은 본 발명이 항원 밀도, 헬퍼 펩티드에 대한 표적 항원비의 변경 및 헬퍼 펩티드를 함유하는 하나 이상의 T-헬퍼 세포 인지 부위의 혼입을 허용하기 때문에 앞서 사용된 결합체에 비해 장점을 갖는다. 이런 인자들은 표적 항원에 대한 생성된 특정 항체의 양에 영향을 준다. 이들 인자들은 결합체의 합성시에는 용이하게 조절되지 않는데, 이는 두 성분이 반드시 공유적으로 결합되어 한편으로는 인지 부위에 접근할 수 있으면서 동시에 서로 결합될 수 있는 인자의 수 및 형태에 물리적 제한을 만들기 때문이다. 또한, 본 발명은 결합체에 비해 유리한데, 이는 리포좀내로의 항원 혼입이 항체 생성을 증강시킴을 보여주기 때문이다. 그러므로, 본 발명은 주어진 항원, 특히 충분한 항체 생성을 유발시키지 못하는 약한 항원에 대해 항체 생성을 부가적으로 증강시키기 위해 당해 리포좀의 특성을 이용한다.
본 발명의 리포좀성 포낭은 합성 백신의 디자인에 새로운 접근 방법을 제공해 준다. 표적 항원 및 헬퍼 펩티드 또는 펩티드들의 복수 카피물은 신속하고 용이한 방법으로 혼입시킬 수 있다. 또한, 표적 항원에 대해 효과적이고 증강된 면역화를 제공하기 위해 이 새로운 접근 방법은 항원과 헬퍼 펩티드의 용이한 테스트를 가능케 한다. 예를 들어, 본 발명은 다양한 T-헬퍼 펩티드가 주어진 항원에 대한 면역원 반응을 증강시키는 능력을 비교하기 위한 간단한 비히클을 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역 반응의 메카니즘을 탐지하기 위한 유용한 비히클을 또한 제공한다.
다른 추가의 양태, 특징 및 장점들은 본 발명의 바람직한 양태인 다음의 설명으로부터 자명해질 것이다.
[바람직한 양태의 상세한 설명]
본 발명의 백신 조성물은 어떠한 표적 항원 및 가장 바람직하게는 T-독립성 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는데 활용할 수 있다. 본 발명은 T-독립성 항원으로서 잘 연구된 바 있는 DNP-CapPE를 참조로 하여 예시된다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 본 발명이 어떠한 항원에 적용가능한지 자명할 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 합성 백신이 합성되며, 이는 T-독립성 항원에 대한 T-의존성 면역학적 반응을 유도한다. 표적 항원은 헬퍼 펩티드 또는 T-세포 인지 부위를 함유하는 펩티드와 함께 리포좀성 제형중에 혼입시킬 수 있다. T-세포 인지 부위를 함유하는 펩티드라도 헬퍼 펩티드로서 사용할 수 있으며, 예를 들면 인플루엔자, 테타누스, 디프테리아, 슈도모나스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 퍼투시스 및 에스케리키아 콜라이와 같은 톡소이드로부터의 천연 또는 제독처리한 펩티드가 있다. 당해 펩티드가 T-세포 인지 부위를 함유하고 있는지를 알아보기 위해 간단한 테스트를 수행할 수 있다. 이 펩티드는 DNP-CapPE와 같은 항원과 함께 리포좀성 제형중에 혼입시킬 수 있으며, 이 항원은 B-세포 에피토프만을 함유한다. 숙주 유기체 내에서, 생성된 리포좀성 제형에 대한 IgG 반응이 있다면, 이 펩티드는 T-세포 인지 부위를 갖고 있으며 본 발명의 헬퍼 펩티드로서 사용할 수 있다.
인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 HA2소단위는 잘 정의되어 있으며 하나 이상의 T-헬퍼 세포 인지 부위를 가지나 B-세포 인지 부위는 갖지 않는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이는 헬퍼 펩티드로서 바람직하게 사용된다. 따라서, 이 펩티드는 결합된 항원에 대해 T-의존성 면역학적 반응을 유발시키지만 그 자체에 대해서는 항체 반응을 유도하지 않는다. 이런 제한은 본 발명을 수행하는데 요구되지는 않는다; 헬퍼 펩티드에 대한 면역학적 반응이 요구되거나 표적 항원에 대한 반응에 추가로 허용될 경우에 B-세포 인지 부위를 함유하는 어떠한 헬퍼 펩티드라도 사용할 수 있다. 그러나, 헬퍼 펩티드는 순수한 T-헬퍼 세포 에피토프인 것이 바람직하다. 유사하게, 세포독성 반응이 요구되거나 표적 항원에 대한 반응에 추가로 허용될 경우에 T-세포 독성 임파구 인지 부위를 함유하는 어떠한 헬퍼 펩티드라도 사용할 수 있다.
HA2소단위는 바이러스의 지질 외막을 통해 일반적으로 연장된 카복시말단 근처의 소수성 아미노산 서열을 포함하기 때문에 헬퍼 펩티드로서 더욱 적절하다. 이 막 투과성 영역은 리포좀의 지질 이중층과의 결합을 촉진시키며, HA2는 정량적으로 리포좀 소낭과 관련되어 있다. 앞서 논의한 바와 같이, 헬퍼 펩티드를 혼입시키는 다른 방법 또한 가능한데, 예를 들면, 펩티드를 지질에 공유적으로 부착시키거나 또는 소수성 아미노산 서열을 펩티드의 한쪽 말단에 부착시키는 것이다. 당해 분야의 전문가에게는 헬퍼 펩티드를 리포좀내로 혼입시키는 여러 가지 방법이 가능하다는 것이 자명한 사실이다.
DNP-CapPE는 충분히 연구되어져 있고 T-독립성 항원이기 때문에 표적 항원으로서 선택되었다. 그러므로, 다음의 실험에서, DNP-CapPE에 대한 T-의존성 반응은 헬퍼 펩티드의 영향으로부터 유래한 것이다. 본 발명의 리포좀 제형은 개체에 있어서 면역 반응을 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 개체란 용어는 임의의 동물체, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 개, 고양이, 소, 말 또는 사람을 의미한다.
[실시예 1]
[리포좀의 제조]
이로써 제한되는 것은 아니지만 포스파티딜 에테르 또는 포스파티딜에스테르(예 : 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민), 글리세라이드, 세레브로사이드, 강글리오사이드, 스핑고마이엘린 및 스테로이드(예 : 콜레스테롤)를 포함하여 본 발명을 실시하는데는 여러 가지 지질 물질을 사용할 수 있다. 물론 당해 분야에 숙련된 사람은 표적 항원 및 헬퍼 단백질 또는 단백질의 혼입을 가능케 하는 어떠한 리포좀 제조 기술이라도 사용할 수 있음을 인지할 수 있으나, 다음은 포스파티딜콜린을 사용하는 제조예이다. 리포좀 제조에 앞서, 혼입을 촉진시키기 위해 공지된 방법중 하나에 따라서 표적 항원 및/또는 헬퍼 펩티드를 지질 성분중의 하나에 공유적으로 부착시키는 것이 필요하다. 리포좀을 제조하기 위해 난황으로부터 정제한 포스파티딜콜린(EYPC)(PC :알라바마 펠헴 소재의 아반티 폴라 리피즈 제조)을 사용한다. EYPC를 둥근 바닥 플라스크에 목적하는 양만큼 넣고, 회전 증발기(Buchi461) 중에서 클로로포름을 제거한다. 10mM EYPC 용액을 제조하기에 충분한 양으로 멸균수 또는 인산 완충시킨 식염수(PBS) 중에 건조시킨 지질 필름을 재현탁시킨다. DNP-CapPE 항원이 리포좀내에 혼입되게 되면, EYPC의 클로로포름 용액에 N-2(2,4-디니트로페닐 E-아미노카프로일포스파티딜에탄올아민(DNP-CapPE)을 가한다. A/USSR-90/77 H1N1바이러스의 헤마글루티닌으로부터 유래한 정제된 HA2소단위(뉴욕 신니아산맥 도리스 부커 제공)를, 또한 리포좀내에 포함시키기 위한 지질 필름에 가한다. 다음, 멸균 PBS 중에 지질 혼합물을 현탁시키거나, n-옥틸 글루코사이드(PBS중 5% w/vol) 중에 지질 혼합물을 용해시킨 다음, PBS에 대해 16시간 동안 투석시킴으로써 리포좀을 형성시킨다. 개개의 리포좀 제형중에 포함된 DNP-CapPE 및 HA2의 양은 실험의 요구에 부합시키기 위해 달라진다.
[실시예 2]
[리포좀 특징화]
리포좀 구조물과 HA2와의 결합을 분석하기 위해 I125HA2를 사용한다. 리포좀내로 DNP-CapPE의 혼입을 분석하기 위해 최초 현탁액의 분취량 (10μl)을 990μl 메탄올 중에 용해시키고, 360mM의 파장에서의 흡광도를 분광 광도계 상에서 판독한다. PBS로 재조성 및 투석시킨 후 제형중 HA2의 결합 백분율은 HA2의 양을 변화시킴에 따라 현저하게 변화하지 않고 90% 이상이었다. 제형에서 DNP-CapPE의 결합 백분율은 모든 제형에 있어서 95% 이상이었다.
주입물간에 DNP 방출이 전혀 관찰되지 않았다. DNP-CapPE는 리포좀 구조물과 결합한 채로 유지된다.
[실시예 3]
[면역화 프로토콜]
이종교배시킨 6내지 8주 된 암컷 알비노 IRC 마우스(텍사스 휴스턴팀코 제공)를 사용한다. 이 동물에서 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 0.1ml의 위약(placebo)인 PBS, 대조용 리포좀(HA2또는 합텐 없음) 또는 합텐 및/또는 HA2펩티드 지정량을 함유하는 리포좀을 투여한다. 3 내지 4주 후, 마우스의 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 동일한 제형 및 동일한 양으로 최초 접종시와 같이 증폭 접종시킨다. 9 내지 14일 후, 동물의 꼬리 정맥으로부터 다시 채혈한다. 임의로, 마우스에게 8주 후 제3의 최후 접종을 한 후, 2주 후 채혈한다. 모든 접종은 뒷다리에 근육내(IM) 투여한다. 격막 필터를 갖춘 플라스틱 케이지에 이 마우스들을 유지시키고(케이지당 4마리), 이들이 자유로이 음식물과 물에 접근할 수 있게 한다. 4℃에서 5분간 2000xg으로 원심분리시켜 혈청을 분리하고, 시험때까지 -20℃에 보관한다. 각 실험으로부터의 모든 혈청 시료를 1회 시험으로 항체 생성에 대해 분석한다.
[실시예 4]
[항-디니트로페닐(DNP) 혈청 항체 시험]
디니트로페닐화시킨 소혈청 알부민(DNP-BSA)을 항원 시험에 사용한다. 대조용 항원으로서 비유도된 BSA를 사용한다. DNP-BSA는 디니트로플루오로벤젠을 BSA 용액에 10:1의 몰비로 가하여 제조하고 : pH 9 내지 9.5에 도달할때까지 트리에탄올아민을 가한다. 20℃에서 16시간 배양한 후, PBS에 투석시켜 미결합 DNP를 제거한다. 예비 실험은, 이 몰비에서 유도된 BSA가 높거나 낮은 몰비의 DNP를 함유하는 단백질에 비해 보다 효율적으로 혈청 항체가 검출됨을 확증하였다. 혈청 항체 수준은 ELISA 및 SPIRA 방법 모두에 의해 측정된다.
ELISA : 이뮬론 I 플레이트(마이애미 디트로이트, 다이나테크 제조)를 0.05M탄산염 완충액(pH 9.6) 중의 DNP-BSA(10μg/웰)로 피복시키고, 대조군 웰은 웰당 10μg의 BSA로 피복시킨다. 4℃에서 16시간후, 플레이트를 PBS 중의 5%(v/v) FCS로 후피복시킨다. 이 항온처리와 다른 모든 항온처리 후에, 플레이트를 1% FCS 및 0.2% 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척한다. 1% BSA를 두배로 함유하는 PBS 중에서 1:100으로부터 출발한 혈청의 연속 2배 희석액을 제조하고, 각 희석액의 0.1ml 샘플을 항원 및 대조군 웰에 가한다. 20℃에서 5시간 항온처리한 후, 쥐과 IgG 중쇄 알칼리성 포스파타제에 특이적인 염소 항체를 결합시키거나 (펜실바니아 웨스트 체스터 카프펠 래보러토리, Fc 특이성), 또는 염소 항 쥐 IgG 아류를 항체의 최적 검출에 요구되는 양보다 과량으로 예비 실험에서 측정된 농도로 가한다. IgG 아류의 경우, 나중에 염소 IgG에 특이적인 알칼린 포스파타제 결합된 돼지 항체를 가한다. pH 9.8에서 10% 디에탄올아민 완충액중의 P-니트로페닐 포스페이트(1mg/ml)를 가한다(0.1ml/웰). 1/2시간 후 다이나테크 MR 600 분광 광도계 내에서 410nm에서의 흡광도를 측정한다. 항체 역가는 대조군웰보다 0.2 이상의 흡광도를 나타내는 가장 높은 희석 혈청으로서 나타낸다.
SPIRA : SPIRA에 의한 DNP 항체 수준의 평가는 2가지의 변형물을 사용한 ELISA 분석에서 기술한 바와 같이 측정한다. 유연성 폴리비닐클로라이드 미소역가 플레이트를 상용하고, DNP 항원에 결합한 쥐과 항체를 검출하기 위해125I-표지된 친화 정제된(중쇄 특이성) 레빗 항-마우스 IgG를 사용한다. 항체 역가는 전술한 바와 같이 계산하고, 표지된 래빗 항-마우스 항체의 특이성은 전술한 바와 같이 인플루엔자 바이러스의 HA2에 대해 특이성을 갖는 쥐-모노클로날 항체를 사용하여 표준 크로스-헤치 테스트(cross-hatch-test)에 의해 입증되었다.
1회의 실험에 두 그룹의 마우스가 포함되어 있을 경우 항체의 역가 비교는 만-위트니 테스트(Mann-Witney test)에 따라 수행한다. 두 그룹 이상의 비교가 관련될 경우, 크루스달-웰리스법(Krusdall-Wallis method)이 사용된다.
[실시예 5]
[DNP-CapPE 및 /또는 HA2소단위를 함유하는 리포좀의 면역원성]
이종교배시킨 마우스 그룹을 4주 간격으로 EYPC 리포좀(75μg), 또는 HA2(3.7μg), DNP-CapPE(30μg)를 함유하거나 또는 둘다를 함유하는 EYPC 리포좀 제제를 주사한다(표 1). IgG 및 IgM 반응은 간접 ELISA로 분석하고 항체역가의 평균으로서 나타낸다. DNP 및 HA2에 대한 지질의 몰비는 6000 : 200 : 1이다. ELISA 판독은 DNP-CapPE를 함유하는 두가지 제형(HA2존재 또는 부재)이 7마리중 7마리 마우스에서 IgM 반응을 나타냄을 보이고 있다. 그러나, 항 DNP IgG 형청 항체를 역가 측정할 경우, 그 결과는 대조군 그룹과 유사한 역가가 제공된 리포좀 DNP 그룹에서 현저하게 감소하는 반면, DNP/HA2리포좀으로 면역시킨 마우스는 상당히 높은 수준의 혈청 특이적 항 DNP IgG를 유도한다.
면역글로불린 부류에서의 이와 같은 이동은 단지 동일한 리포좀 구조내에서 HA와 DNP의 결합에 기인할 수 있는데, 이것은 마우스를 수성 용액중에서 HA와 DNP-CapPE의 혼합물 또는 DNP-CapPE 리포좀 및 HA리포좀을 함께 주사하면서 면역시켰을 때 IgG 항 DNP 항체가 전혀 생각나지 않았기 때문이다(표 2). 두가지 성분은 IgG 항 DNP 항체의 생성을 촉진하기 위해 동일한 리포좀내에 함께 존재해야 한다.
* DNP-CapPE 및 HA는 별도의 리포좀내에 혼입시키고 함께 투여한다.
** 실험이 실행되지 않음.
[실시예 6]
[리포좀 DNP 및 HA에 대한 투여 반응]
이 실험에서, 세가지 면역 그룹은 연구한다. 주어진 양의 DNP-CapPE(주사당 5, 10, 30μg)에 대해 다양한 양의 HA(1, 3 또는 9μg)가 EYPC로 구성된 리포좀 제제(750μg/주사)중에 혼입한다. 동일한 부수팅 주입 1주일전 및 주사 9일 후에 동물체에서 체혈한다. ELISA 분석으로 항 DNP IgG 및 IgM에 대해 혈청을 분석한다. 또한, 두 그룹의 마우스를 10μg의 DNP-BSA, 또는 DNP-CapPE 및 수성 용액중에서 함께 혼합한 HA로 면역시킨다.
IgM ELISA 값(표 2)을 통계적으로 분석할 경우, 5 및 10μg DNP-CapPE를 나타내는 두 그룹은 HA의 양을 증가시킴에 따라 현저한 차이를 나타내지 않기 때문에, 5μg DNP-CapPE 그룹의 결과는 나타내지 않았다. 그러나, 마우스를 30μg DNP-CapPE 및 1, 3 또는 9μg HA를 함유하는 리포좀으로 면역시켰을 때 현저한 차이를 나타냈으며, 비율이 높을수록 보다 높은 IgM 역가를 나타낸다. 마우스를 10μg DNP-BSA로 면역시켰을 경우 아무런 IgM 반응이 관찰되지 않았으며, 수용액 중의 DNP-CapPE 및 HA로 면역시킨 그룹에서는 6마리 마우스중 2마리만이 IgM 반응을 나타냈다.
IgG ELISA 값(표 2)을 통계적으로 분석할 경우, 주어진 양의 HA(1, 3 또는 9μg)와 증가량의 DNP-CapPE(5, 10 또는 30μg)에 대한 반응은 현저하게 상이함을 나타내어 DNP와 HA모두에 대한 투여 반응 효과를 입증하였다. 이것은 다시 증가된 IgG 생산이 동일한 리포좀 중에 표적 항원 및 헬퍼 펩티드 두가지 모두의 존재로 인한 것임을 나타낸다. DNP-BSA로 면역시킨 마우스는 시험된 리포좀중에서 가장 높은 투여량의 HA및 DNP로 면역시킨 그룹과 비교할 만한 IgG 반응을 나타냈다. 수용액 중의 DNP/HA로 면역시킨 마우스에 대해서는 어떠한 IgG 반응도 검출되지 않았다.
[실시예 7]
[DNP/HA리포좀으로 예비면역시킨 마우스의 항체 반응에 대한 DNP-CapPE 리포좀의 3차 주사 효과]
마우스를 DNP-CapPE/HA리포좀으로 예비면역시켰을 때 DNP 표적 항원에 대한 메모리 반응의 발생을 분석하기 위해, 7마리 마우스의 한 그룹을 DNP-CapPE만을 함유하는 리포좀으로 3차 주사한다(그럼으로써 B세포 부위만을 공급한다.). 이 실험은 최초 리포좀 제제중에 DNP-CapPE 및 HA가 함께 존재할 경우에만 메모리 반응이 나타남을 보여준다. 이는 또한, 본 발명이 진정한 흉선 의존성 면역학적 반응 및 T-세포 인지 부위의 존재에 대한 추가의 요구없이 표적 항원에 대한 반응으로 IgG 항체를 생성할 수 있는 표적 항원에 대한 면역학적 메모리를 생성시킴을 보여준다.
앞서 제시된 바와 같이, DNP-CapPE/HA리포좀으로 면역시킨 마우스는 IgG 항 DNP 반응을 나타낸다. 그후, 동일한 마우스를 DNP-CapPE만을 함유하는 리포좀으로 3차 주사했을 경우(그룹 1), SPIRA 판독은 제1 또는 제2 채혈과 비교할 때 현저히 증가하여 1차 면역에 의해 생성된 것보다 높은 수준으로 특이적 B 세포의 재자극을 보여준다. HA리포좀으로 면역시킨 후 DNP-CapPE 리포좀으로 재자극시킨 마우스(그룹 3)는 어떠한 검출 가능한 항 DNP IgG 항체 역가를 나타내지 않았다. DNP-CapPE/HA리포좀을 1회 주사한 마우스(그룹 2)는 1차 면역에 대한 항 DNP IgG 항체 수준을 나타내었다. 공(empty) EYPC 리포좀을 주입한 대조군(그룹 4)은 전혀 항 DNP IgG 항체 생성을 나나내지 않았다.
[실시예 8]
[면역 반응에서 내막 HA에 대한 외막 HA]
네 그룹의 이종교배 마우스를 30μg의 DNP-CapPE 및 다양한 양의 HA(3, 1, 0.5 및 0μg)로 구성된 EYPC 리포좀으로 면역시킨다. 또한, 리포좀을 브로멜라인(bromelain)(100μg/ml)으로 전처리한 후 한 그룹의 마우스를 DNP-CapPE/HA리포좀으로 면역시킨다(각각 30 및 30μg). 브로멜라인 처리는 표면 단백질을 절단하여 막에 삽입된 꼬리와 완전히 내화된 HA만을 남겨둔된다. ELISA 역가를 통계적으로 분석할 때, HA를 증가시키면서 또다시 투여반응 효과를 관찰한다(표 4). 주사당 DNP-CapPE 리포좀 중의 HA0.5μg에 상응하는 적은 양이라도 DNP-CapPE 리포좀과 통계적으로 구별되는 IgG 반응을 나타내도록 유도하기에 충분한 양이다. 그러나, 마우스를 브로멜라인으로 처리한 리포좀으로 면역시킨 경우 동일한 미처리 리포좀으로부터 수득한 반응과 비교해 볼 때 전혀 통계적인 차이가 관찰되지 않았다. 이같은 결과는 리포좀 외부의 HA는 불필요하며, 면역 적합성 세포에 B 및 T 세포 에피토프의 혼합된 표현을 실현하기 위해서는 리포좀이 프로세싱되어야 함을 나타낸다.
[실시예 9]
[면역 반응 동안 IgG 면역글로불린 아부류의 재분배]
ELISA 판독을 분석해 볼 때, IgG1 항체가 가장 우세한 아부류이다.
DNP에 대한 이종교배 마우스의 IgG1 반응은 상이한 HA농도에서 낮은 투여량의 DNP-CapPE(표 1)와 유사하다. 고농도의 DNP-CapPE(30μg)의 경우, HA의 증가량에 대한 투여 반응 효과도 관찰한다. 각각 750, 30 및 9μg의 EYPC, DNP-CapPE 및 HA의 리포좀 제제는 전형적인 합텐 담체 시스템인 10μg의 DNP-BSA로 면역시킨 마우스 그룹에 필적하는 IgG1 반응을 나타낸다.
IgG2a 및 IgG2b 항체 아부류에 대해서는 현저한 차이가 관찰되지 않았다(표 5). 어떠한 IgG2a 또는 IgG2b 항체도 검출되지 않는 유일한 그룹은 HA1μg 및 DNP-CapPE(IgG2a 및 Ig2b) 10μg 및 HA3μg 및 DNP-CapPE(IgG2b) 10μg을 함유하는 EYPC 리포좀으로 면역시킨 마우스 그룹이다. 높은 투여량의 DNP-CapPE 또는 HA의 경우, 반응상 현저한 차이가 관찰되지 않았다. 이 반응은 마우스를 DNP-BSA로 면역시킨 것과 비견할 만하다.
IgG3 항체 아부류에 대해서는 현저한 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 각각의 그룹에 대해 , 역가가 검출되었으며 6마리의 면역된 마우스중 4마리 이상이 반응을 나타내었다(표 5). 그러나 DNP-BSA 10μg로 면역시킨 2 마리의 마우스만이 리포좀 제제로 면역시킨 마우스 그룹보다 상당히 낮은 역가를 상승시키는 반응을 나타내었다.
본 발명은 이제 충분히 기술되었으며, 당해 분야의 통상의 숙련가에게는, 본원에 기술된 본 발명의 정신 또는 범주에서 벗어나지 않고도 본 발명에 변화 및 변형을 가할 수 있음이 자명할 것이다.

Claims (9)

  1. 리포좀-형성 지질, N'-2(2, 4-디니트로페닐) E-아미노카프로일포스파티딜에탄올아민인 표적 항원, 및 인플루엔자 바이러스의 HA2폴리펩티드 소단위인 헬퍼 펩티드로 이루어지며, 상기 T-헬퍼 세포 인지 부위는 리포좀의 내부 또는 표면에 존재하고, 상기 표적 항원과 헬퍼 펩티드는 서로 결합하지 않는 항원용 리포좀성 면역원 담체.
  2. 제1항에 있어서, 헬퍼 펩티드가 인플루엔자 바이러스의 HA2폴리펩티드 소단위인 리포좀성 면역원 담체.
  3. 제1항에 있어서, 포스파티딜 에테르, 포스파티딜 에스테르, 글리세라이드, 세레브로사이드, 강글리오사이드, 스핑고마이엘린, 스테로이드 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 지질을 포함하는 리포좀성 면역원 담체.
  4. 제1항에 있어서, 헬퍼 펩티드가 소수성적 상호작용에 의해 리포좀과 결합되어 있는 리포좀성 면역원 담체.
  5. 제1항에 있어서, 헬퍼 펩티드가 지질과의 공유 결합에 의해 리포좀과 결합되어 있는 리포좀성 면역원 담체.
  6. 제2항에 있어서, 담체가 120,000 지질 분자당 하나의 HA2를 함유하는 리포좀성 면역원 담체.
  7. 제1항에 있어서, 표적 항원이 T-독립성 항원인 리포좀성 면역원 담체.
  8. 제3항에 있어서, 포스파티딜 에스테르가 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린인 리포좀성 면역원 담체.
  9. 제3항에 있어서, 스테로이드가 콜레스테롤인 리포좀성 면역원 담체.
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